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特表2024-531269増加したトランスフェクション効率を有するメッセンジャーＲＮＡを産生するための、酵素をベースとするシステム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】増加したトランスフェクション効率を有するメッセンジャーＲＮＡを産生するための、酵素をベースとするシステム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240822BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240822BHJP
C12N 15/39 20060101ALN20240822BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240822BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240822BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C12N15/113 Z
C12N15/39
C12N15/54
C12N15/63 Z
C12N9/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508927
(86)(22)【出願日】2022-09-12
(85)【翻訳文提出日】2024-02-14
(86)【国際出願番号】 US2022076290
(87)【国際公開番号】W WO2023044286
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】63/244,990
(32)【優先日】2021-09-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523333870
【氏名又は名称】イミュニティバイオ，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】モリモト，ブレット
(72)【発明者】
【氏名】ニアジ，ケイヴァン
(72)【発明者】
【氏名】シン，アニー
(72)【発明者】
【氏名】ガイサート，リーゼ
(72)【発明者】
【氏名】リウ，フィリップ ティー．
(57)【要約】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のインビトロ転写（ＩＶＴ）で使用されるタンパク質の製造方法であって、そのタンパク質が、合成的にそこから誘導されたｍＲＮＡを続いて細胞にトランスフェクトし、コード化タンパク質が産生される、その効率によって純度及び有効性について評価される、方法。
【選択図】図８
【選択図】図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アラビノースプロモーター及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む第１プラスミドベクターを、第１多数のコンピテント細菌細胞にトランスフェクトする工程；少なくとも１つのアラビノースプロモーター及びワクシニアウイルスキャップ化酵素（ＶＶＣＥ）をコードする核酸配列を含む第２プラスミドベクターを、第２多数のコンピテント細菌細胞にトランスフェクトする工程；
アラビノースプロモーター、ＵＵＧ開始コドン、及びポリアデノシン（ポリ（Ａ））ポリメラーゼをコードする核酸配列を含む第３プラスミドベクターを、第３多数のコンピテント細菌細胞にトランスフェクトする工程；
前記第１多数からＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現し、精製する工程；
前記第２多数からＶＶＣＥを発現し、精製する工程；
前記第３多数からポリ（Ａ）ポリメラーゼを発現し、精製する工程；
前記精製Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む第１組成物に直鎖化プラスミドＤＮＡを添加して、ＲＮＡ転写物を産生する工程；
前記精製ＶＶＣＥを含む第２組成物に前記ＲＮＡ転写物を添加して、キャップ化ＲＮＡ転写物を産生する工程；
前記精製ポリ（Ａ）ポリメラーゼを含む第３組成物に、前記キャップ化ＲＮＡ転写物を添加して、ポリアデニル化キャップ化ｍＲＮＡ転写物を産生する工程；及び
前記第３組成物からｍＲＮＡを精製する工程；
を含む、ｍＲＮＡのインビトロ合成の方法。
【請求項2】
前記第１プラスミドベクターが、配列番号１９と少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１プラスミドベクターが、配列番号１９と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１プラスミドベクターが、配列番号１９と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記第１プラスミドベクターが、配列番号１９を含むヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第２プラスミドベクターが、配列番号２０と少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記第２プラスミドベクターが、配列番号２０と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記第２プラスミドベクターが、配列番号２０と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記第２プラスミドベクターが、配列番号２０を含むヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記第３プラスミドベクターが、配列番号２１と少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記第３プラスミドベクターが、配列番号２１と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記第３プラスミドベクターが、配列番号２１と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記第３プラスミドベクターが、配列番号２１を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記細菌コンピテント細胞がＣｌｅａｒ Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
ＶＶＣＥが１８℃で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
ＶＶＣＥが、１８時間の発酵期間にわたって発現される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月１６日出願の米国仮特許出願第６３／２４４，９９０号への３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下での優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６３／２４４，９９０号の全開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月１６日出願の米国仮特許出願第６３／２４４，９９０号への３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下での優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６３／２４４，９９０号の全開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表の参照
本出願は、ＳＴ．２６ＸＭＬファイル形式として電子的に提出された配列表を含有する。「ＰＡＴ００５２６８＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」という名称のファイルは、６１０００バイトのサイズを有し、２０２２年９月１２日に作製された。ＳＴ．２６ＸＭＬファイルに含まれる情報は、３７ＣＦＲ§１．５２（ｅ）（５）に従って、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＳＴ．２６ＸＭＬファイル形式として電子的に提出された配列表を含有する。「ＰＡＴ００５２６８＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」という名称のファイルは、６１０００バイトのサイズを有し、２０２２年９月１２日に作製された。ＳＴ．２６ＸＭＬファイルに含まれる情報は、３７ＣＦＲ§１．５２（ｅ）（５）に従って、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本開示は、酵素産生の新規な、及び対費用効果が高い方法を用いた、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介した合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の製造に関する。
【背景技術】
【0004】
ＣＯＶＩＤ－１９の世界的流行の根絶におけるメッセンジャーＲＮＡベースのワクチンの最近の成功によって、ＲＮＡ治療薬の有効性が実証され、ｍＲＮＡ製造の効率的方法の必要性が強調されている。ｍＲＮＡ製造の条件の最適化では、ｍＲＮＡ合成に関与するコアタンパク質のより良い収率、ｍＲＮＡ純度の増加、並びにｍＲＮＡの量及び品質を評価するアッセイ法の改善が目標となるだろう。ｍＲＮＡ合成のための最適化されたタンパク質は、ｍＲＮＡの製造効率の増加、及びそのタンパク質自体のコストのために、有益であると考えられ、それは市販されている。ストラテジーの主要な構成要素は、ＩＶＴで使用されるコアタンパク質の組換え発現のための最適化プラスミド構築物、最適化されたタンパク質産生条件、及び最適化タンパク質精製プロトコルを含む。Ｈｏｒｎｂｌｏｗｅｒ＆ａｌ．（２０１５）“Ｍｉｎｄｉｎｇ ｙｏｕｒ ｃａｐｓ ａｎｄ ｔａｉｌｓ－ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｗｈｉｔｅ Ｐａｐｅｒには、ｍＲＮＡの例示的なインビトロ合成スキームが記述されている。治療用ｍＲＮＡ合成で使用される臨床製造グレードの酵素を製造する、最適化された方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
ｍＲＮＡのインビトロ転写における装置、システム及び方法が本明細書において開示され、そのプロセスは、ヒトの疾患のための臨床的に関連する作用薬（ａｇｅｎｔ）の効果的及び安価なロットを製造するために最適化される。本明細書に記載の方法は、インビトロ転写（ＩＶＴ）に関与するコアタンパク質の製造の改善に関する。その改善は、タンパク質の細菌タンパク質製造に使用される発現ベクター配列における最適化を含む。この方法はさらに、製造の最適化条件、時間及び温度などの条件を含む。最終的に、この方法は、ｍＲＮＡ品質の評価手段を含み、コード化タンパク質のｍＲＮＡトランスフェクション及び発現は、ＩＶＴプロセスにおいて使用されるタンパク質成分の品質に対して評価される。
【0006】
一実施形態において、最適化細菌発現ベクターは、発現ベクターに個々にクローン化される、３つのＩＶＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。一態様において、第１ＤＮＡ配列又はインサートが第１細菌発現ベクターにクローン化され、第１インサートは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子配列を含む。そのインサートはさらに、ポリメラーゼ配列の上流にアラビノースプロモーター配列を含む。一態様において、インサートは、配列番号１９で構成される。一態様において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのコドン最適化遺伝子配列は、配列番号２２である。
【0007】
別の態様において、第２遺伝子配列が、第２細菌発現ベクターにクローン化され、インサートは、ワクシニアウイルスキャップ化酵素（ＶＶＣＥ）のＤ１及びＤ１２サブユニットに対する遺伝子配列を含む。インサートはさらに、Ｄ１及びＤ１２サブユニットの上流にアラビノースプロモーター配列を含む。インサートはさらに、アラビノースプロモーターのすぐ下流にリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。一態様において、インサートは配列番号２０で構成される。一態様において、ＶＶＣＥのＤ１サブユニットに対するコドン最適化遺伝子配列は配列番号２３である。一態様において、ＶＶＣＥのＤ１２サブユニットに対するコドン最適化遺伝子配列は配列番号２４である。
【0008】
別の態様において、第３インサートが第３細菌発現ベクターにクローン化され、インサートは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの遺伝子配列を含む。インサートはさらに、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ配列の上流にアラビノースプロモーター配列を含む。一態様において、インサートは配列番号２１で構成される。一態様において、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの遺伝子配列は配列番号２５である。
【0009】
別の態様において、細菌は、タンパク質発現及びその後の精製のための発現ベクターを含有する。場合によっては、タンパク質の増殖及び精製の条件は、発現プラスミドにクローン化されるインサートに修飾を加えることによって可能となる。かかる修飾は、タンパク質コード化ヌクレオチド配列の上流にアラビノースプロモーターを置くことを含む。別の修飾は、ＶＶＣＥの上流に２つのアラビノースプロモーター、Ｄ１サブユニットの上流にある１つのプロモーター、及びＤ１２サブユニットの上流にある第２プロモーターを置くことを含む。更なる修飾は、Ｈｉｓタグをコードする核酸配列の付加を含み、ポリマーヒスチジンは、タンパク質配列とインフレームでコード化され、Ｎ又はＣ末端のいずれかに置かれ、それによってタンパク質を発酵後にカラム精製することができる。更なる修飾は、タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ配列の付加を含み、それによって、タンパク精製に続いて、Ｈｉｓタグ配列をタンパク質分解的に除去することができる。
【0010】
一態様において、精製タンパク質は、インビトロ転写反応に逐次、添加される。最初に、対象のｍＲＮＡ転写物をコードする直鎖化されたプラスミドＤＮＡを含む反応に、精製Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを添加する。それによってＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの作用を介して直鎖化ＤＮＡから転写される。第２反応は、第１反応からのＲＮＡ転写物、Ｓ－アデノシルメチオニン、及び精製ＶＶＣＥを含む。それによってＲＮＡ転写物はＮ末端でキャップされ、キャップ０ｍＲＮＡが産生される。第３反応は、ＶＶＣＥ反応からのキャップ化ｍＲＮＡ、精製ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、及びＡＴＰを含み、それによってポリアデニル化テールが、キャップ化ｍＲＮＡ転写物の３’末端に付加される。
【0011】
様々な目的、特徴、態様及び利点は、同様な数字が同様な構成要素を表す、添付の図面と共に、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ｍＲＮＡの構造的特徴を示す。Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０２０）５：１１からの図面。ｍＲＮＡ発現性能を指示する重要な品質特性を示す。対象の遺伝子の効率的発現を示す５つの重要品質特性が同定される。これらの特性のうち３つは、酵素：転写（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）；キャップ化（グアニリルトランスフェラーゼ）；ポリ（Ａ）テール化（ポリ（Ａ）テール化）（ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）の使用を必要とする。今のところ、これら３種のコア酵素は、ＩＶＴ用に購入する必要がある。
【図2】Ｔ７ポリメラーゼ発現コンストラクトを示す。Ｔ７促進システムからの漏出（Ｌｅａｋｙ）発現によって、有害なタンパク質作用が起こり、遺伝子配列の変異が生じる。厳密に調節されたプロモーターに切り替えることによって、遺伝子の提案されたクローニングが可能となった。
【図3A】Ｔ７プロモーターをアラビノースプロモーターで置換することによって、ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｃｌｅａｒ Ｃｏｌｉにおける増殖及びタンパク質発現が可能となる。最適化増殖条件を示す。図３Ａは、使用される発現コンストラクトを示す。Ｔ７促進システムからの漏出発現システムによって、有害なタンパク質作用が起こり、遺伝子配列の変異が生じる。厳密に調節されたプロモーターに切り替えることによって、遺伝子の提案されたクローニングが可能となった。図３Ｂは、４時間発酵でのタンパク質ゲルの結果を示す。図３Ｃは、一晩（Ｏ／Ｎ）発酵でのタンパク質ゲルの結果を示す。各クマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色タンパク質ゲルにおいて：レーン０ タンパク質ラダー；レーン１ 細胞ペレット；レーン２ 上清；レーン３ フロースルー；レーン４ 洗浄；レーン５ 洗浄２；レーン６ イミダゾール洗浄；レーン７ 溶離１；レーン８ 溶離２；レーン９ 溶離３；レーン１０ 溶離４；レーン１１ 溶離５；レーン１２溶離 ６；レーン１３ 溶離７。
【図4A】Ｔ７プロモーターの後ろに発現された場合の低いＶＶＣＥ溶解性の実証。図４Ａは、使用される発現コンストラクを示す。ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｃｌｅａｒ Ｃｏｌｉにおけるタンパク質発現。タンパク質ゲルに示される結果（図４Ｂ）。クマシー染色タンパク質ゲルにおいて：レーン０ タンパク質ラダー；レーン１ 細胞ペレット；レーン２ 上清；レーン３ フロースルー；レーン４ 洗浄；レーン５ イミダゾール洗浄；レーン６ 溶離１；レーン７ 溶離２；レーン８ 溶離３；レーン９ 溶離４、レーン１０ 溶離５。Ｔ７プロモーターの後ろに発現された場合に酵素の溶解性が妨げられた。
【図5A】Ｔ７プロモーターがアラビノースプロモーターで置換された場合の、ＶＶＣＥ Ｄ１及びＤ１２サブユニットの溶解性の向上を示す。図５Ａは、使用される発現コンストラクを示す。ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｃｌｅａｒ Ｃｏｌｉにおけるタンパク質発現（図５Ｃ）。クマシー染色タンパク質ゲルにおいて：レーン０ タンパク質ラダー；レーン１ 細胞ペレット；レーン２ 上清；レーン３ フロースルー；レーン４ 洗浄１；レーン５ 洗浄２；レーン６ イミダゾール洗浄；レーン７ 溶離１；レーン８ 溶離２；レーン９ 溶離３；レーン１０ 溶離４；レーン１１ 溶離５。Ｔ７プロモーターの後ろに発現された場合に酵素の溶解性が妨げられた。厳密に調節されたプロモーターに切り替え、且つ発現を減速する（１８℃）ことによって、溶解性が向上した。
【図6A】アラビノースプロモーターの付加によって、ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｃｌｅａｒ Ｃｏｌｉにおける不溶性ポリ（Ａ）ポリメラーゼの増殖及び発現が可能となる。図６Ａは、使用される発現コンストラクを示す。クマシー染色タンパク質ゲルにおいて（図６Ｂ）：レーン０ タンパク質ラダー；レーン１ 細胞ペレット；レーン２ 上清；レーン３ フロースルー；レーン４ 洗浄１；レーン５ 洗浄２；レーン６ イミダゾール洗浄；レーン７ 溶離１；レーン８ 溶離２；レーン９ 溶離３；レーン１０ 溶離４；レーン１１ 溶離５。過剰発現したタンパク質は約４３ｋＤである。タンパク質発現によって、溶解性のない切断酵素が生じた。
【図7A】ＵＵＧ開始コドンを有するポリ（Ａ）ポリメラーゼ遺伝子によって、適切なサイズ及び良好な溶解性を有するタンパク質の発現が可能となった。ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｃｌｅａｒ Ｃｏｌｉにおける発現。図７Ａは、使用される発現コンストラクを示す。図７Ｂは、抗Ｈｉｓを用いたウェスタンブロットを示す。レーン０ タンパク質ラダー；レーン１ 細胞ペレット；レーン２ 上清；レーン３ フロースルー；レーン４ 洗浄１；レーン５ 洗浄２；レーン６ イミダゾール洗浄；レーン７ 溶離１；レーン８ 溶離２；レーン９ 溶離３。タンパク質発現によって、溶解性のない切断酵素が生じた。異常な開始コドン及び転写調節配列の付加によって、酵素が適切に発現された。
【図8】トランスフェクション対応のｍＲＮＡ製造ワークフローを示す。
【図9-1】フローサイトメトリーヒストグラム分析を示す。市販のインビトロ転写酵素に対する向上したＣｌｅａｒ Ｃｏｌｉ発現の性能比較。ＩＶＴ ＧＦＰ－ｍＲＮＡをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現の検出をプロットで示す。示されるプロットは、三つ組を表す。
【図10A】市販のインビトロ転写酵素に対する向上したＣｌｅａｒ Ｃｏｌｉ発現の性能比較。異なる酵素を用いて得られたＩＶＴ ＧＦＰ－ｍＲＮＡのトランスフェクション結果。図１０Ａは、ＧＦＰポジティブの平均パーセンテージを示す。図１０Ｂは、幾何平均蛍光強度の平均を示す。各グラフにおいて、ＲＮＡ試料は以下の通りである：（１）非トランスフェクト２９３ｔ；（２）修飾を含まないインビトロ転写物；（３）５’キャップを有するインビトロ転写物；（４）テールを有する非キャップＨｉＳｃｒｉｂｅ転写物；（５）ＡＲＣＡでキャップされたＨｉＳｃｒｉｂｅ転写物；（６）ＮＥＢ ＶＶＣＥでキャップされたＨｉＳｃｒｉｂｅ転写物；（７）インハウスの酵素で産生されたｍＲＮＡ転写物（矢印）。
【発明を実施するための形態】
【0013】
開示の成分、組成物、システム、キット、及び方法が、無細胞メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）合成を実施するために用いられ得る。インビトロ転写（ＩＶＴ）を用いた無細胞ｍＲＮＡ合成では、トランスフェクト細菌細胞の溶解産物から製造された触媒タンパク質のアンサンブルを利用する。精製タンパク質は、ＩＶＴ反応の必須成分を含む。無細胞ｍＲＮＡ合成のためのタンパク質成分を製造する、本明細書に記載の方法など、様々な方法が存在する。
【0014】
本明細書において同定されるすべての特許及び公開された出願は、あたかも個々の特許又は出願がそれぞれ、具体的及び個々に参照により組み込まれることが意図されるのと同程度に参照により組み込まれる。組み込まれた参考文献における用語の定義又は使用が、本明細書で提供されるその用語の定義と一致しない、又は反する場合、本明細書において提供されるその用語の定義が該当し、且つ参考文献におけるその用語の定義は該当しない。
【0015】
定義
一部の実施形態において、特定の実施形態を説明し、且つ請求するために使用される、成分の量、特性、例えば濃度、反応条件などを表す数は、一部の場合に「約」という用語によって修飾されると理解されたい。したがって、一部の実施形態において、書面による明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメーターは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて異なり得る近似値である。一部の実施形態において、数値パラメーターは、報告される有意な数字（ｄｉｇｉｔ）の数を考慮に入れて、且つ通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。一部の実施形態の広範な範囲を設定する数値範囲及びパラメーターが近似値であるにもかかわらず、具体的な実施例に記載の数値は、実行可能な数値として正確に報告される。一部の実施形態に示される数値は、それぞれの試験測定値で見出される標準偏差から生じる特定の誤差を必然的に含有し得る。
一部の実施形態において、特定の実施形態を説明し、且つ請求するために使用される、成分の量、特性、例えば濃度、反応条件などを表す数は、一部の場合に「約」という用語によって修飾されると理解されたい。したがって、一部の実施形態において、書面による明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメーターは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて異なり得る近似値である。一部の実施形態において、数値パラメーターは、報告される有意な数字（ｄｉｇｉｔ）の数を考慮に入れて、且つ通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。一部の実施形態の広範な範囲を設定する数値範囲及びパラメーターが近似値であるにもかかわらず、具体的な実施例に記載の数値は、実行可能な数値として正確に報告される。一部の実施形態に示される数値は、それぞれの試験測定値で見出される標準偏差から生じる特定の誤差を必然的に含有し得る。
【0016】
文脈に相反するものが指示されていない限り、本明細書に記載のすべての範囲が、その終点を含んで解釈されるべきであり、オープンエンド範囲は、実用化可能な値のみを含むと解釈されるべきである。同様に、値のすべての一覧は、文脈に相反するものが指示されていない限り、中間の値を含むと解釈されるべきである。
【0017】
以下の本明細書において、及び特許請求の範囲全体を通して使用される、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という意味は、文脈に明確に特別な指示がない限り、複数形を含む。また、本明細書において使用される、「において（ｉｎ）」の意味は、文脈に明確に特別な指示がない限り、「において（ｉｎ）」及び「の上（ｏｎ）」を含む。
【0018】
本明細書における値の範囲の列挙は単に、その範囲内にある別々の値を個々に参照する省略法として役立てることが意図される。本明細書において別段の指定がない限り、個々の各値は、あたかも本明細書に個々に記載されているがごとく、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書において別段の指定がない限り、又は文脈と特に明確に矛盾がない限り、適切ないずれかの順序で実施することができる。本明細書における特定の実施形態に関して提供される、いずれかの、及びすべての実施例、又は例示的な文言（例えば、「～など」）の使用は、明確にすることが単に意図され、且つ請求される本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書における文言は、請求される本発明の実施に必須の、請求項に記載されない要素を示すと解釈すべきではない。
【0019】
本明細書に開示の代替の要素又は実施形態のグループ化は、制限として解釈されるものではない。各グループメンバーは、個々に、又はグループの他のメンバー若しくは本明細書に見出される他の要素とのいずれかの組み合わせで、参照及び請求され得る。グループの１つ又は複数のメンバーが、便宜上及び／又は特許性の理由のために、グループに含まれ得る、又はグループから削除され得る。かかる包含又は削除が生じた場合、本明細書は、修飾されたグループを含有するとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュ群の書面の説明が履行される。
【0020】
発現ベクター
本明細書に記載の１つ又は複数のｍＲＮＡをコードする核酸を含有する発現ベクターが提供される。本明細書で使用される、「ベクター」という用語は、それが連結される別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、更なるＤＮＡセグメントをそれにライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形をとる場合が多い。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は区別なく使用することができる。しかしながら、開示の方法及び組成物は、等しい機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などのかかる他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
本明細書に記載の１つ又は複数のｍＲＮＡをコードする核酸を含有する発現ベクターが提供される。本明細書で使用される、「ベクター」という用語は、それが連結される別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、更なるＤＮＡセグメントをそれにライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形をとる場合が多い。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は区別なく使用することができる。しかしながら、開示の方法及び組成物は、等しい機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などのかかる他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【0021】
メッセンジャーＲＮＡ
購入された酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＶＶＣＥ、及びポリ（Ａ）ポリメラーゼを、ｍＲＮＡ製造プロセスにおいてインハウスで生成された酵素と置き換えた場合に、ｍＲＮＡトランスフェクト細胞において発現されたタンパク質の発現レベルによって決定される、ｍＲＮＡ品質の意外な増加が生じる。酵素の産生は、プラスミド発現ベクターの細菌へのトランスフェクションを含み、対象のタンパク質をコードする遺伝子が、トランスフェクト遺伝子の発現をドライブするプロモーター配列に作動可能に連結される。図１は、ｍＲＮＡの主要な特性を示す。
購入された酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＶＶＣＥ、及びポリ（Ａ）ポリメラーゼを、ｍＲＮＡ製造プロセスにおいてインハウスで生成された酵素と置き換えた場合に、ｍＲＮＡトランスフェクト細胞において発現されたタンパク質の発現レベルによって決定される、ｍＲＮＡ品質の意外な増加が生じる。酵素の産生は、プラスミド発現ベクターの細菌へのトランスフェクションを含み、対象のタンパク質をコードする遺伝子が、トランスフェクト遺伝子の発現をドライブするプロモーター配列に作動可能に連結される。図１は、ｍＲＮＡの主要な特性を示す。
【0022】
プロモーター配列は、細菌においてタンパク質発現をドライブするのに適切ないずれかのプロモーターであり得る。好ましい実施形態において、プロモーターはアラビノースプロモーターである。プラスミド発現ベクターに挿入される遺伝子配列の更なる工学は、タンパク質がそれによって同定及び／又は精製され得る、タグの使用を含む。好ましい実施形態において、対象のタンパク質をコードする遺伝子は、タンパク質の５’又は３’末端のいずれかで、インフレームでポリマーヒスチジン（Ｈｉｓ）タグをコードする配列に連結される。Ｈｉｓタグは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識配列によって対象の遺伝子から分離され得て、それによって、ＴＥＶがタンパク質に付加されて、Ｈｉｓタグが切断除去され得る。
【0023】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現をドライブするアラビノースプロモーターでのＴ７プロモーターの置換（図２及び図３Ａ～３Ｃ）は、ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｃｌｅａｒ Ｃｏｌｉ細胞の増殖を可能にし、その中で異種タンパク質発現をドライブすることが示された。４時間から一晩（１８時間）に発酵時間を増加すると、タンパク質発現もまた増加した。アラビノースプロモーターで、ＶＶＣＥのＤ１及びＤ１２サブユニットの発現をドライブするＴ７プロモーターを同様に置換することによって、サブユニットの発現が可能となった（図４Ａ～４Ｂ及び図５Ａ～５Ｂ）。１８℃でのタンパク質発現の実施によって、タンパク質発現もまた向上した。
【0024】
ＩＶＴタンパク質の産生のための配列はさらに、タンパク質コード配列に選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）開始コドンを付加することによって修飾され得る。好ましい実施形態において、選択的開始コドンは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの末端に連結される。ポリ（Ａ）ポリメラーゼのこの異常なＵＵＧ開始コドンは、Ｃａｏ ＆ Ｓａｒｋａｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．１０３８０－１０３８４，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９２）において最初に仮定された。ＵＵＧ開始コドンを含むＮ末端配列（配列番号２１）は、配列番号２５の野生型タンパク質配列に関してアミノ酸位置１１にてリジンのすぐ上流にてインフレームでコード化される。
【0025】
ＩＶＴタンパク質の産生のための発現プラスミドインサート配列はさらに、新規なプロモーター配列の使用によって修飾され得る。意外なことに、アラビノースプロモーターは、ＶＶＣＥの溶解性を有意に高め、したがって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたＶＶＣＥの収率を高める。また意外なことには、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びポリ（Ａ）ポリメラーゼの上流にＴ７プロモーターを使用した結果、標準技術によって細菌中でうまく増殖することができるクローン発現プラスミドが産生できなくなるため、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びポリ（Ａ）ポリメラーゼ遺伝子の、発現ベクターへのクローニング自体が、両方のタンパク質の開始コドンの上流にアラビノースプロモーターを置くことによって可能となった。
【0026】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの産生がタンパク質収率に関して最適化される方法が、本明細書において開示される。ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｃｌｅａｒ Ｃｏｌｉに発現プラスミドをトランスフェクトした後、発酵温度を１８℃に下げ、発光時間は１８時間に延長された。図７は、これらの発酵条件が適用された場合の、可溶性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの収率の増加を示す。
【0027】
本明細書に記載の１つ又は複数のｍＲＮＡをコードする核酸を含有する発現ベクターが提供される。本明細書で使用される、「ベクター」という用語は、それが連結されている、別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、更なるＤＮＡセグメントをそれにライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形をとる場合が多い。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は区別なく使用することができる。しかしながら、開示の方法及び組成物は、等しい機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などのかかる他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【0028】
細菌におけるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＶＶＣＥ、及びポリ（Ａ）ポリメラーゼの産生を最適化し、標準法によってタンパク質を精製及び特徴付けたら、タンパク質は、一連の反応に適用され、それによって、対象の遺伝子を含有する直鎖化プラスミドＤＮＡが転写され、キャップ化され、ポリ－アデノシンテールが付加される。そのＤＮＡが挿入されたプラスミドは、ウイルス、原核生物又は真核生物における増殖に適切であり得る。
【0029】
鋳型ＤＮＡは通常、スーパーコイルプラスミドＤＮＡとして増殖され、貯蔵される。プラスミドＤＮＡは、１つ又は複数の制限酵素の作用によって直鎖化され、それによって、対象の遺伝子が、環状プラスミドＤＮＡから取り除かれ、又は切り取られる。一般に、ユニークな制限部位は、対象の遺伝子の５’及び３’末端に生じる。その制限部位は同一であっても、又は異なっていてもよい。対象の遺伝子内の制限部位を認識しないという条件で、いずれかの制限酵素を使用することができる。次いで、エタノール又はイソプロパノール沈殿などの他の標準法を使用してもよいが、直鎖化ＤＮＡは、カラム精製によって単離される。次いで、遺伝子配列を含む精製直鎖化ＤＮＡが、サイズ決定によって単離され、分光光度法で定量化される。次いで、１μＧ鋳型ＤＮＡを、ヌクレオチド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）及び精製Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む反応に添加する。反応は、サーマルサイクラーで３７℃にて一晩進行する。次いで、ＲＮＡ転写物が、カラム精製され、分光光度法によって定量化される。
【0030】
キャップ０ＲＮＡへのＲＮＡ転写物の変換には、３つの酵素的逐次工程：ＲＮＡトリホスファターゼ活性（ＴＰａｓｅ）による５’末端ｇ－リン酸の除去、ＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性（ＧＴａｓｅ）による、得られた二リン酸５’末端へのＧＭＰ基の転移、及びグアニン－Ｎ７メチルトランスフェラーゼ活性（ＭＴａｓｅ）による、グアノシンキャップのＮ７アミンの修飾が必要とされる。ワクシニアウイルスキャップ化酵素は、Ｄ１及びＤ１２サブユニットからなり、３つすべての酵素的工程がＤ１サブユニットによって実施される。次いで、精製及び定量化されたＲＮＡ転写物（１０μｇ）が、ＧＴＰ、ｓ－アデノシルメチオニン、及び精製ＶＶＣＥを含む反応に添加される。次いで、反応は３７℃で１時間進行する。次いで、キャップ化ＲＮＡがカラム精製され、分光光度法で定量化される。
【0031】
ポリアデニル化は、ｍＲＮＡ転写物へのポリ（Ａ）テールの付加である。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの核の輸送、翻訳及び安定性に重要である。ｍＲＮＡのインビトロ製造における最終的な工程は、キャップ化転写物へのポリ（Ａ）テールの付加である。キャップ化ｍＲＮＡ（１０μｇ）転写物が、ＡＴＰ及び精製ポリ（Ａ）ポリメラーゼを含む反応に添加され、反応が３７℃で１時間進行する。次いで、キャップ化、ポリアデニル化ｍＲＮＡ転写物が、カラム精製され、分光光度法で定量化される。精製ｍＲＮＡは即座に使用するか、又は－８０Ｃ以下にて凍結すべきである。
【0032】
ｍＲＮＡワークフローの概要を図８に示す。それによって誘導されたｍＲＮＡが、細胞（インビトロトランスフェクション）又は組織（インビボトランスフェクション）に送達するために製剤化され得る。いずれかの適切な製剤形態が使用され得る。例示的なナノ粒子製剤が、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１６／６２２，９０８号明細書に記載されている。ＨＥＫ２９３細胞がトランスフェクトされ、フローサイトメトリーによって評価される、図９Ａ～９Ｆに示す標準法を用いたｍＲＮＡコード化タンパク質の送達及び発現の評価。図１０Ａ及び１０Ｂは、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）からの市販のＶＶＣＥタンパク質でキャップされた市販のＲＮＡ転写物と比べて、本明細書に記載の方法によって製造されるｍＲＮＡで、向上したタンパク質収率を示す。
【0033】
開示の技術は、ＩＶＴコアタンパク質Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ワクシニアウイルスキャップ化酵素、及びポリ（Ａ）ポリメラーゼの産生の増加、並びにそれによって産生されたｍＲＮＡ転写物に由来するタンパク質産物の収率の増加など、多くの有利な技術的効果を提供することが理解されよう。
【実施例】
【0034】
アラビノースプロモーターインサートの調製。アラビノースプロモーターを増幅するために使用されるＰＣＲの鋳型として、ｐＢＡＤ－ＤＥＳＴ４９ＤＮＡプラスミドを使用した。配列番号１（フォワード）及び配列番号２（リバース）プライマーを使用して、アラビノースプロモーターを増幅した。増幅混合物は（１反応につき）：５×ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ緩衝液１０μＬ；ＤＮＴＰ４μＬ；１０μＭフォワードプライマー１μＬ；１０μＭリバースプライマー１μＬ；ｐＢＡＤ－ＤＥＳＴ４９ ５０ｎｇ；ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ１μＬ；及び最終体積５０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水を含んだ。以下の条件：９８℃で２分間；９８℃で２０秒間（×３０サイクル）；５５℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で９０秒間（×３０サイクル）；及び６８℃で１分間がアラビノースインサートの増幅に用いられた。ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲスピンカラムを使用して、ＰＣＲ産物を精製した。
【0035】
次いで、プライマー配列番号３及び４を用いた別のＰＣＲにおいて、精製されたＰＣＲ産物が使用された。増幅混合物は（１反応につき）：５×ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ緩衝液１０μＬ；ＤＮＴＰ４μＬ；１０μＭフォワードプライマー１μＬ；１０μＭリバースプライマー１μＬ；ｐＢＡＤ－ＤＥＳＴ４９ ５０ｎｇ；ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ１μＬ；及び最終体積５０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水を含んだ。以下の条件：９８℃で２分間；９８℃で２０秒間（×３０サイクル）；６０℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で９０秒間（×３０サイクル）；及び６８℃で１分間がアラビノースインサートの増幅に用いられた。次いで、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲル抽出キットを用いて、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙハンドル（ｈａｎｄｌｅ）を有するアラビノースプロモーターインサートをゲル抽出し、精製した。
【0036】
ＢｇｌＩＩＩ制限消化プロトコル。ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）から購入されたＢｇｌＩＩＩ制限酵素を使用して、ｐＥＴ２２ｂラクトース誘発発現系を消化した。２つの別々の反応をｐＥＴ２２ｂ及びＢｇｌＩＩＩ制限消化に関して、以下の通りに（１反応につき）完了した：緩衝液３．１ １０μＬ；ＢｇｌＩＩＩ制限酵素３μＬ；ｐＥＴ２２ｂ ＤＮＡ４６μＬ；ＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水４１μＬ。次いで、各反応をサーマルサイクラー内で３７℃にて２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、緩衝液ＰＢ５００μＬを各反応に添加した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）から購入された、別々の２つのミニプレップカラムに、緩衝液ＰＢ及び制限消化混合物を添加した。１５０００×ｇにてカラムを１分間遠心し、フロースルーを廃棄した。エタノールを含有する緩衝液ＰＥ１ｍＬを各カラムに添加した。カラムを再び、１５０００×ｇで１分間遠心し、フロースルーを廃棄した。カラムを１５０００×ｇにて２分間遠心脱水した。次いで、カラムを新たなマイクロ遠心チューブに移した。ＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水５０μＬを各カラムに添加し、１５０００×ｇにて２分間遠心した。
【0037】
Ｘｂａ１制限消化プロトコル。精製及び消化された物質５０μＬが、以下のプロトコル（１反応につき）：ＣＵＴＳＭＡＲＴ（登録商標）緩衝液９μＬ；Ｘｂａ１ ３μＬ；ＢｇｌＩＩＩ消化物質５０μＬ；及びＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水２８μＬ；を用いた消化において使用された。反応をサーマルサイクラー内で３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼを添加した（１０μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液の反応＆２μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼの反応）。次いで、反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲル抽出精製キットを使用して、消化されたベクターをゲル抽出し、精製した。
【0038】
ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）プロトコル。消化及び精製されたベクター１００ｎｇを反応のために調製した。増殖及び精製されたプロモーター７０ｎｇもまた、反応のために調製した。各反応は、ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）で使用される総ＤＮＡ０．１ｐｍｏｌのみ含有した。ベクターＤＮＡ及びインサートＤＮＡをＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水と混合し、最終体積１０μにした。２×ＮＥＢ ＨＩＦＩ ＡＳＳＥＭＢＬＹ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）から入手）１０μＬを次いで、反応混合物に添加した。次いで、準備されたＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応をサーマルサイクラー内で５０℃にて１５分間インキュベートした。インキュベーション期間に続いて、ＮＥＢ５αウルトラコンピテント細胞を使用して、次いで反応混合物８μＬを形質転換した。ｐＥＴ２２ｂ発現プラスミドにクローン化されたアラビノースプロモーターでの形質転換細胞を使用して、プラスミドＤＮＡを増幅し、次いでＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ精製システムを使用して、それを収集した。
【0039】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現系を作製するためのｐＢＭ１００のクローニング。Ｇｉｂｓｏｎハンドル並び組み込まれた６×Ｈｉｓタグを有するＲＮＡポリメラーゼを、プライマーとして配列番号５及び６を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応混合物は（１反応につき）：５×ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ緩衝液１０μＬ；ＤＮＴＰ４μＬ；１０μＭフォワードプライマー１μＬ；１０μＭリバースプライマー１μＬ；ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ５０ｎｇ；及びＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ１μＬを含んだ。ＲＮＡポリメラーゼインサートを増幅するためのＰＣＲを以下の通りに完了した：９８℃で２分間；９８℃で２０秒間（×３０サイクル）；６０℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で１２０秒間（×３０サイクル）；及び６８℃で１分間。次いで、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲスピンカラムを使用して、完了したＰＣＲを精製した。酵素：Ｎｄｅ１及びＮｃｏ１－ＨＦを使用して、以下の反応レシピ（１反応につき）：ＣＵＴＳＭＡＲＴ（登録商標）緩衝液９０μＬ；Ｎｃｏ１－ＨＦ１μＬ；Ｎｄｅ１ １μＬ；ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ２０μｇ；及び最終体積９０μＬにする水を用いて、二重制限消化においてｐＢＭ９８ ２０μｇを使用した。次いで、制限消化をサーマルサイクラー内で３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼを添加した（１０μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液の反応及び２μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼの反応）。次いで、反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲル抽出精製キットを使用して、消化されたベクターをゲル抽出し、精製した。
【0040】
ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応のために、消化及び精製されたベクター１００ｎｇを調製した。増幅及び精製されたＲＮＡポリメラーゼインサート１２６ｎｇもまた、反応のために調製した。各ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応において、０．１ｐｍｏｌ以下の総ＤＮＡを使用した。ベクターＤＮＡ及びインサートＤＮＡをＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水と混合し、最終体積１０μにした。２×ＮＥＢ ＨＩＦＩ ＡＳＳＥＭＢＬＹ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）から入手）１０μＬを次いで、反応混合物に添加した。次いで、準備されたＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応をサーマルサイクラー内で５０℃にて１５分間インキュベートした。インキュベーション期間に続いて、ＮＥＢ５αウルトラコンピテント細胞を使用して、次いで反応混合物８μＬを形質転換した。アラビノース促進発現プラスミドにクローニングされたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼでの形質転換細胞を使用して、プラスミドＤＮＡを増幅し、次いでＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ精製システムを使用して、それを収集した。
【0041】
二重（Ｄｕａｌ）アラビノース促進発現プラスミドの作製。ワクシニアウイルスキャップ化酵素Ｄ１及びＤ１２サブユニットのクローニングのために、二重発現（ｄｕａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）アラビノース促進システムを作製した。以下のプロトコル（１反応につき）：ＣＵＴＳＭＡＲＴ（登録商標）緩衝液９μＬ；Ｘｂａ１ ３μＬ；ｐＥＴ－Ｄｕｅｔプラスミド１０μｇ；最終体積９０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水を用いて、ｐＥＴ－Ｄｕｅｔ精製プラスミドをＸｂａ１で消化した。反応をサーマルサイクラー内で３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼを添加した（１０μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液の反応＆２μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼの反応）。次いで、反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
【0042】
次いで、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲル抽出精製キットを使用して、消化されたベクターをゲル抽出し、精製した。次いで、プライマーとして配列番号１及び配列番号２を用いて、以下の反応混合物（１反応につき）：５×ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ緩衝液１０μＬ；ＤＮＴＰ４μＬ；１０μＭフォワードプライマー１μＬ；１０μＭリバースプライマー１μＬ；ｐＢＭ９８ ５０ｎｇ；ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ１μＬ；及び最終体積５０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水で、アラビノースプロモーターインサートをｐＢＭ９８から増幅した。以下の条件：９８℃で２分間；９８℃で２０秒間（×３０サイクル）；５５℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で９０秒間（×３０サイクル）；及び６８℃で１分間がアラビノースインサートの増幅に用いられた。ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲスピンカラムを使用して、ＰＣＲ産物を精製した。
【0043】
次いで、プライマーとして配列番号７及び８を用いた別のＰＣＲにおいて、精製ＰＣＲ産物が使用された。このＰＣＲ産物は、アラビノース促進システムでマルチクローニングサイト＃１を形成するためにＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）に使用された。消化及び精製されたベクター１００ｎｇをＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応のために調製した。増殖及び精製されたプロモーター７０ｎｇもまた、反応のために調製した。０．１ｐｍｏｌ以下の総ＤＮＡが、ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）で使用された。ベクターＤＮＡ及びインサートＤＮＡをＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水と混合し、最終体積１０μにした。２×ＮＥＢ ＨＩＦＩ ＡＳＳＥＭＢＬＹ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）から入手）１０μＬを次いで、反応混合物に添加した。次いで、準備されたＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応をサーマルサイクラー内で５０℃にて１５分間インキュベートした。インキュベーション期間に続いて、ＮＥＢ５αウルトラコンピテント細胞を使用して、次いで反応混合物８μＬを形質転換した。ｐＥＴ－Ｄｕｅｔ二重発現プラスミドにクローン化されたアラビノースプロモーターでの形質転換細胞を使用して、プラスミドＤＮＡを増幅し、次いでＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ精製システムを使用して、それを収集した。得られたプラスミドをｐＢＭ１２２として標識化して、ＭＣＳ１におけるアラビノースプロモーター及びＭＣＳ２におけるＴ７プロモーターの存在を示した。
【0044】
次いで、新たに作製されたプラスミドを使用して、下流Ｔ７プロモーターを別のプラスミド促進インサートと置き換えた。酵素Ｂｓｒｇ１－ＨＦ及びＮｄｅ１を使用して、以下の反応混合物（１反応につき）：ＣＵＴＳＭＡＲＴ（登録商標）緩衝液９μＬ；Ｂｓｒｇ１－ＨＦ１．５μＬ；Ｎｄｅ１ １．５μＬ；ｐＢＭ１２２ ３０μｇ；及び最終体積９０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水を用いて、調製されたプラスミドで二重制限消化が完了した。
【0045】
制限消化を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼを添加した（１０μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液の反応＆２μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼの反応）。次いで、反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲル抽出精製キットを使用して、消化されたベクターをゲル抽出し、精製した。プライマーとして配列番号１及び配列番号２を用いて、アラビノースプロモーターを調製した。以下のプロトコル（１反応につき）：５×ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ緩衝液１０μＬ；ＤＮＴＰ４μＬ；１０μＭフォワードプライマー１μＬ；１０μＭリバースプライマー１μＬ；ｐＢＭ９８ ５０ｎｇ；ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ１μＬ；及び最終体積５０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水を用い、ＰＣＲが完了した。以下の条件：９８℃で２分間；９８℃で２０秒間（×３０サイクル）；５５℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で９０秒間（×３０サイクル）；及び６８℃で１分間がアラビノースインサートの増幅に用いられた。ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲスピンカラムを使用して、ＰＣＲ産物を精製した。
【0046】
次いで、プライマー配列番号９及び１０を用いて、別のＰＣＲ増幅において、精製ＰＣＲ産物を使用した。各ＰＣＲ反応は：５×ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ緩衝液１０μＬ；ＤＮＴＰ４μＬ；１０μＭフォワードプライマー１μＬ；１０μＭリバースプライマー１μＬ；作製されたＰＣＲ産物５０ｎｇ；ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ１μＬ；及び最終体積５０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水を含んだ。以下の条件：９８℃で２分間；９８℃で２０秒間（×３０サイクル）；６０℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で９０秒間（×３０サイクル）；及び６８℃で１分間がアラビノースインサートの増幅に用いられた。ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲスピンカラムを使用して、ＰＣＲ産物を精製した。
【0047】
次いで、プライマーとして配列番号９及び１０を用いた別のＰＣＲにおいて、以下（１反応につき）：５×ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ緩衝液１０μＬ；ＤＮＴＰ４μＬ；１０μＭフォワードプライマー１μ；１０μＭリバースプライマー１μＬ；作製されたＰＣＲ産物５０ｎｇ；ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ１μＬ；及び最終体積５０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水を含む反応混合物中で精製ＰＣＲ産物を使用した。以下の条件：９８℃で２分間；９８℃で２０秒間（×３０サイクル）；６０℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で９０秒間（×３０サイクル）；及び６８℃で１分間がアラビノースインサートの増幅に用いられた。ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲスピンカラムを使用して、ＰＣＲ産物を精製した。
【0048】
消化及び精製されたベクター１００ｎｇをＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応のために調製した。増殖及び精製されたプロモーター５８ｎｇもまた、反応のために調製した。０．１ｐｍｏｌ以下の総ＤＮＡが、ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）で使用された。ベクターＤＮＡ及びインサートＤＮＡをＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水と混合し、最終体積１０μにした。２×ＮＥＢ ＨＩＦＩ ＡＳＳＥＭＢＬＹ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）から入手）１０μＬを次いで、反応混合物に添加した。次いで、準備されたＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応をサーマルサイクラー内で５０℃にて１時間インキュベートした。インキュベーション期間に続いて、ＮＥＢ５αウルトラコンピテント細胞を使用して、次いで反応混合物８μＬを形質転換した。
【0049】
ｐＥＴ－Ｄｕｅｔ二重発現プラスミドにクローン化されたアラビノースプロモーターでの形質転換細胞を使用して、プラスミドＤＮＡを増幅し、次いでＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ精製システムを使用して、それを収集した。得られたプラスミドを、クローニングで使用されるｐＢＭ１２３として標識化した。
【0050】
二重アラビノース促進発現系におけるｐＢＭ１２７、ワクシニアウイルスキャップ化酵素のクローニング。以下の反応混合物（１反応につき）：５×ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ緩衝液１０μＬ；ＤＮＴＰ４μＬ；１０μＭフォワードプライマー１μＬ；１０μＭリバースプライマー１μＬ；Ｄ１２サブユニット鋳型５０ｎｇ；ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ１μＬ；及び最終体積５０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水中で、アラビノース促進システムの第２マルチクローニングサイトにクローン化する目的のために、配列番号１１及び１２プライマーを使用して、Ｄ１２サブユニットを増幅した。以下の条件：９８℃で２分間；９８℃で２０秒間（×３０サイクル）；５５℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で９０秒間（×３０サイクル）；５５℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で１２０秒間（×３０サイクル）；及び６８℃で１分間が、Ｄ１２ ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）インサートの増幅に用いられた。ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲスピンカラムを使用して、ＰＣＲ産物を精製した。
【0051】
以下の反応混合物（１反応につき）：ＣＵＴＳＭＡＲＴ（登録商標）緩衝液９μＬ；Ｎｃｏ１－ＨＦ２μＬ；ｐＢＭ１２５ １０μｇ；及び最終体積９０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水を用いて、Ｎｃｏ１－ＨＦ制限酵素を使用して、ｐＢＭ１２５プラスミド１０μｇを消化した。サーマルサイクラー内で３７℃にて１時間、インキュベーションを完了した。次いで、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼを添加した（１０μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液の反応＆２μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼの反応）。次いで、反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲル抽出精製キットを使用して、消化されたベクターをゲル抽出し、精製した。
【0052】
消化及び精製されたベクター１００ｎｇをＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応のために調製した。増殖及び精製されたサブユニット１２５ｎｇもまた、反応のために調製した。０．１ｐｍｏｌ以下の総ＤＮＡが、ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）で使用された。ベクターＤＮＡ及びインサートＤＮＡをＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水と混合し、最終体積１０μＬにした。２×ＮＥＢ ＨＩＦＩ ＡＳＳＥＭＢＬＹ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）から入手）１０μＬを次いで、反応混合物に添加した。次いで、準備されたＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応をサーマルサイクラー内で５０℃にて１５分間インキュベートした。インキュベーション期間に続いて、ＮＥＢ５αウルトラコンピテント細胞を使用して、次いで反応混合物８μＬを形質転換した。クローン化されたＤ１２サブユニットでの形質転換細胞を使用して、プラスミドＤＮＡを増幅し、次いでＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ精製システムを使用して、それを収集した。得られたＤＮＡをｐＢＭ１２７として標識化して、タンパク質発現用のＣＬＥＡＲＣＯＬＩ（商標）コンピテント細胞への形質転換に使用した。
【0053】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ発現系を作製するためのｐＢＭ１３５のクローニング。プライマーとして配列番号１５及び１６を用いて、ＰＣＲ反応混合物を以下の通りに調製した（１反応当たりの体積）：５×ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ緩衝液１０μＬ；ＤＮＴＰ４μＬ；１０μＭフォワードプライマー１μＬ；１０μＭリバースプライマー１μＬ；ポリ（Ａ）ポリメラーゼＤＮＡ５０ｎｇ；ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ１μＬ。ポリ（Ａ）ポリメラーゼインサートを増幅するためのＰＣＲを以下の通りに完了した：９８℃で２分間；９８℃で２０秒間（×３０サイクル）；５５℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で９０秒間（×３０サイクル）；及び６８℃で１分間。次いで、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲスピンカラムを使用して、完了したＰＣＲ産物を精製した。
【0054】
次いで、プライマーとして配列番号１７及び１８を用いた別のＰＣＲにおいて、精製ＰＣＲ産物を使用した。ＰＣＲ反応を以下の通りに調製した（１反応につき）：５×ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ緩衝液１０μＬ；ＤＮＴＰ４μＬ；１０μＭフォワードプライマー１μＬ；１０μＭリバースプライマー１μＬ；製造されたＰＣＲ産物５０ｎｇ；ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ１μＬ；及び最終体積５０μＬにするＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水。以下の条件：９８℃で２分間；９８℃で２０秒間（×３０サイクル）；５５℃で１５秒間（×３０サイクル）；６８℃で６０秒間（×３０サイクル）；６８℃で１分間が、ポリ（Ａ）ポリメラーゼインサートの増幅に用いられた。ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲスピンカラムを使用して、ＰＣＲ産物を精製した。
【0055】
酵素：Ｎｄｅ１及びＮｃｏ１－ＨＦを使用して、以下の反応レシピ（１反応につき）：ＣＵＴＳＭＡＲＴ（登録商標）緩衝液９０μＬ；Ｎｃｏ１－ＨＦ １μＬ；Ｎｄｅ１ １μＬ；ｐＢＭ９８ ２０μｇ；及び最終体積９０μＬにする水を用いて、二重制限消化においてｐＢＭ９８ ２０μｇを使用した。制限消化をサーマルサイクラー内で３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼを添加した（１０μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液の反応＆２μＬ／Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼの反応）。次いで、反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲル抽出精製キットを使用して、消化されたベクターをゲル抽出し、精製した。
【0056】
消化及び精製されたベクター１００ｎｇをＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応のために調製した。増殖及び精製されたポリ（Ａ）ポリメラーゼインサート６３ｎｇもまた、反応のために調製した。０．１ｐｍｏｌ以下の総ＤＮＡが、ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）で使用された。ベクターＤＮＡ及びインサートＤＮＡをＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）水と混合し、最終体積１０μＬにした。２×ＮＥＢ ＨＩＦＩ ＡＳＳＥＭＢＬＹ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）から入手）１０μＬを次いで、反応混合物に添加した。次いで、準備されたＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）反応をサーマルサイクラー内で５０℃にて１５分間インキュベートした。インキュベーション期間に続いて、ＮＥＢ５αウルトラコンピテント細胞を使用して、次いで反応混合物８μＬを形質転換した。
【0057】
アラビノース促進発現プラスミドにクローン化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼでの形質転換細胞を使用して、プラスミドＤＮＡを増幅し、次いでＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ精製システムを使用して、それを収集した。
【0058】
直鎖化ＤＮＡからのＲＮＡ転写物の産生。この手順は、更なる下流の修飾用の対象の所望の遺伝子をコードする、インビトロＲＮＡ転写物の産生の反応を調製するために用いられる。そのプロセスで使用される装置のリストは：９６ウェルのサーマルサイクラー；１０×転写緩衝液；マイクロピペット；ＮＴＰ（１００ｍＭ）；８連ＰＣＲチューブ；無機ピロホスファターゼ；ＲＮＡｓｅ阻害剤（マウス）；Ｎｏｔ１－ＨＦ酵素；インハウス精製Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ；及びＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを含む。
【0059】
インビトロ転写（ＩＶＴ）鋳型を作製するため、制限消化の準備のためにｐＲＮＩ－ＧＦＰのアリコートを入手する。以下のレシピ：（１反応当たりの体積）：ＣＵＴＳＭＡＲＴ（登録商標）緩衝液５μＬ；Ｎｏｔ１－ＨＦ制限酵素２μＬ；ｐＲＮＩ－ＧＦＰ１０μｇ；最終体積１００μＬにするヌクレアーゼ不含水を用いて調製される３つすべてのＩＶＴ反応に対して、鋳型ＤＮＡ１０μｇを消化した。「ｐＲＮＩ－ＧＦＰ消化物」の名称でラベルが付けられた１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに上記の内容物を添加する。３７℃インキュベータ内で２時間インキュベートする。インキュベーションに続いて、消化されたＤＮＡを除去し、緩衝液ＰＢ５００μＬを添加した。緩衝液ＰＢと消化ＤＮＡとの混合物を、紫色のＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製カラムに移した。卓上型遠心機でカラムを最高速度で１分間遠心し、フロースルーを廃棄した。緩衝液ＰＥ７５０μＬを直接、カラムに通し、続いて遠心機で最高速度にて１分間遠心した。再び、フロースルーを廃棄した。次いで、最高速度でカラムを３分間、遠心脱水した。１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに「消化ｐＲＮＩ－ＧＦＰ」とラベルを付けた。新たにラベル付けされたマイクロ遠心チューブにカラムを入れた。ヌクレアーゼ不含水４０μＬを膜に直接置いた。３７℃で２分間インキュベートした後、遠心機でカラムを最高速度にて２分間遠心した。製造元の説明書に従って、分光光度計を使用して、溶離画分を分析した。
【0060】
ＩＶＴ反応を調製するために、以下の名称：「ＩＶＴ反応」でＰＣＲチューブをラベル付けする。以下のチューブ：インハウス精製Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのバイアル；無機ピロホスファターゼのバイアル；ＲＮＡｓｅ阻害剤（マウス）のバイアル；「ｐＲＮＩ－ＧＦＰ消化物」のチューブを得て、常に氷上に維持した。以下の試薬：１０×反応バッファー；ＡＴＰ；ＣＴＰ；ＵＴＰ；及びＧＴＰを室温で解凍した。以下の順序で以下の試薬：ＲＮＡｓｅ不含水（≦２０μＬ）；１０×反応バッファー（２μＬ）；１００ｍＭ ＡＴＰ（２μＬ）；１００ｍＭ ＣＴＰ（２μＬ）；１００ｍＭ ＧＴＰ（２μＬ）；１００ｍＭ ＵＴＰ（２μＬ）；鋳型ＤＮＡ（１μｇ）；Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ混合物（２μＬ）；ＲＮＡｓｅ阻害剤（１μＬ）；無機ピロホスファターゼ（２μＬ）を、ラベル付けされたＰＣＲチューブに添加する。１反応の最終体積は２０μＬとなる。調製されたＰＣＲチューブを簡単に遠心し、次いでサーマルサイクラーで３７℃にて一晩インキュベートした。
【0061】
ＩＶＴ ＲＮＡ転写物の精製。一晩インキュベートした後、チューブをサーマルサイクラーから取り出し、濾過ｐ２００マイクロピペットを使用して、緩衝液ＰＢ１００μＬを反応に添加した。一晩のインキュベーション後に反応容器が混濁するのは、このプロセスのこの時点では一般的である。緩衝液ＰＢを添加した際に、半透明の固体が存在し、それはピペットを使用して、穏やかに混合すべきである。
【0062】
紫色のＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製カラムの膜に、混合物を直接添加した。カラムを最高速度で１分間遠心し、フロースルーを廃棄した。緩衝液ＰＥ７５０μＬを各カラムに添加し、最高速度で１分間遠心した。フロースルーは廃棄した。カラムを最高速度で３分間遠心脱水した。新たな１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに「インビトロ転写物」とラベルを付けた。ラベル付けされたマイクロ遠心チューブにカラムを移動し、ＲＮＡｓｅ不含水３５μＬを膜に直接添加した。カラムを最高速度で２分間遠心した。次いで、製造元の説明書に従って、溶離された転写物を分光光度計において分析した。分光光度計による分析後、精製ＲＮＡ転写物は氷上で維持すべきである。
【0063】
精製直後にキャッピング反応を完了することができない場合、ＲＮＡ転写物を－８０℃で保管すべきである。最良の結果のためには、凍結されたＲＮＡを１週間を超えて保管すべきではない。
【0064】
キャップ化ＲＮＡ転写物の産生。作業開始前に以下の成分：１０×キャップ化緩衝液、３２ｍＭ Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、１０ｍＭグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ＲＮＡｓｅ阻害剤（マウス）、インハウスの精製ワクシニアウイルスキャップ化酵素（ＶＶＣＥ）を－２０℃で保管し、反応アセンブリ中に氷上に維持した。マイクロ遠心チューブに「２ｍＭ ＳＡＭ」とラベルを付けた。ラベル付きマイクロ遠心チューブに、ＲＮＡｓｅ不含水３０μＬ及び３２ｍＭストック２μＬを添加することによって、ＳＡＭを１：１６で希釈した。最も高いキャッピング効率には、反応直前にＳＡＭを希釈することが最善である。２本の新たなＰＣＲストリップチューブに「ＶＶＣＥキャッピング反応」とラベルを付けた。収集された精製ＲＮＡを使用して、ラベル付けされた各チューブにＲＮＡ１０μｇを添加した。ＲＮＡｓｅ不含水を、各チューブで最終体積１４μＬとなるまで添加した。ＲＮＡと水の混合物をサーマルサイクラー内で６５℃にて５分間変性させた。変性直後に、ＲＮＡを氷上に５分間置いた。試薬を各反応に、以下の順序（１反応当たりの体積）：１０×キャップ化緩衝液２μＬ；１０ｍＭ ＧＴＰ１μＬ；２ｍＭ ＳＡＭ１μＬ；ＶＶＣＥ１μＬ；及びＲＮＡｓｅ阻害剤１μＬ；で添加した。ピペットを使用して、内容物を穏やかに混合し、遠心沈殿した。反応をサーマルサイクラーで３７℃にて１時間インキュベートした。
【0065】
３７℃でのインキュベーション後に、チューブをサーマルサイクラーから取り出し、濾過ｐ２００マイクロピペットを用いて、緩衝液ＰＢ１００μＬを各反応に添加した。各反応チューブの内容物を、紫色のＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製カラムの膜上に注意深く移動した。カラムを最高速度で１分間遠心し、フロースルーを廃棄した。緩衝液ＰＥ７５０μＬを各カラムに添加し、最高速度で１分間遠心した。フロースルーを廃棄した後、最高速度で３分間遠心することによって、カラムを脱水した。２本の新たな１．５ｍＬマイクロ遠心チューブを「キャップ化ＲＮＡ転写物」とラベル付けした。ラベル付けされたマイクロ遠心チューブにカラムを入れ、ＲＮＡｓｅ不含水３５μＬを膜に直接添加し、２分間インキュベートした。最高速度で２分間遠心することによって、産物を収集した。製造元の説明書に従って分光光度計を使用して、調製されたＲＮＡ転写物を分析した。ＳＰＥＣに続いて、精製ＲＮＡ転写物を氷上に維持し、テール化反応に直接、移動した。精製直後にテール化反応を完了することができない場合には、ＲＮＡ転写物を（最良の結果のためには１週間以下）の期間、－８０℃で保管すべきである。
【0066】
ポリアデニル化ｍＲＮＡの産生。以下の成分：１０×テール化緩衝液；１０ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）；ＲＮＡｓｅ阻害剤（マウス）；及びインハウスの精製ポリ（Ａ）ポリメラーゼを作業開始前に２０℃で保管し、反応アセンブリ中に氷上で維持した。２本の新たなＰＣＲストリップチューブに「ポリ（Ａ）ポリメラーゼテール化反応」とラベル付けした。収集された精製ＲＮＡを使用して、ＲＮＡ１０μｇをラベル付けされた各チューブに添加した。ＲＮＡｓｅ不含水を、各チューブで最終体積１４μＬとなるまで添加した。試薬を各反応に、以下の順序：１０×テール化緩衝液２μＬ；１０ｍＭ ＡＴＰ２μＬ；ポリ（Ａ）ポリメラーゼ１μＬ；及びＲＮＡｓｅ阻害剤１μＬで添加した。ピペットを使用して、内容物を穏やかに混合し、遠心沈殿した。反応をサーマルサイクラーで３７℃にて１時間インキュベートした。
【0067】
インキュベーション期間後に、チューブをサーマルサイクラーから取り出し、濾過ｐ２００マイクロピペットを用いて、緩衝液ＰＢ１００μＬを各反応に添加した。紫色のＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製カラムの膜上に混合物を直接添加した。カラムを最高速度で１分間遠心し、フロースルーを廃棄した。緩衝液ＰＥ７５０μＬを各カラムに添加し、続いて最高速度で１分間遠心した。フロースルーを廃棄した後、最高速度で３分間遠心脱水した。新たな１．５ｍＬマイクロ遠心チューブにカラムを入れ、ＲＮＡｓｅ不含水３５μＬを膜に直接添加した。カラムを２分間静置し、次いで最高速度で２分間遠心した。製造元の説明書に従って分光光度計を使用して、調製されたＲＮＡ転写物を分析した。ＳＰＥＣに続いて、精製ＲＮＡ転写物を氷上に維持すべきであり、トランスフェクション反応に直接進むべきである。精製直後にトランスフェクションを完了することができない場合には、ＲＮＡ転写物を－８０℃で保管すべきである。
【0068】
以下の考察は多くの実施例の実施形態を提供する。各実施形態は、本発明の要素の１つの組み合わせを表すが、本発明の主題は、開示の要素の可能性のあるすべての組み合わせを包含するとみなされる。したがって、１つの実施形態が要素Ａ、Ｂ、及びＣを含み、且つ第２実施形態が要素Ｂ及びＤを含む場合には、本発明の主題はまた、たとえ明確に開示されていないとしても、Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤの残りの他の組み合わせを包含するとみなされる。
【0069】
本明細書で使用され、且つ文脈に特に指定されていない限り、「～に結合された」という用語は、直接的結合（互いに結合された２つの要素が互いに接触する）と間接的結合（少なくとも１つの更なる要素が２つの要素間に位置する）の両方を包含することが意図される。したがって、「～に結合された」及び「～と結合された」という用語は同義で使用される。
【0070】
既に記載の修飾に加えて、より多くの修飾が、本明細書の概念から逸脱することなく可能であることは当業者には明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の精神において以外は、本発明の開示内容は制限されない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の両方の解釈において、すべての用語は、文脈と一致する最も広範な可能性のある様式で解釈されるべきである。特に、「含む」及び「含んでいる」という用語は、非排他的形式で要素、成分、又は工程を意味すると解釈すべきであり、言及される要素、成分、又は工程は、明確に言及されていない他の要素、成分、又は工程と共に存在し得る、或いは用いられ得る、或いは組み合わせられ得ることが示される。本明細書又は特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ…及びＮからなる群から選択される何かの少なくとも１つを意味する場合、書かれた文章は、Ａ＋Ｎ、又はＢ＋Ｎ等ではなく、その群からの要素を１つのみ必要とすると解釈すべきである。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10A】
【図10B】
【配列表】
【国際調査報告】