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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】色素体ゲノムを改変するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240822BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240822BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240822BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20240822BHJP
A01H 6/54 20180101ALI20240822BHJP
A01H 6/82 20180101ALI20240822BHJP
A01H 6/60 20180101ALI20240822BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20240822BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/63 Z ZNA
C12N5/10
A01H6/46
A01H6/54
A01H6/82
A01H6/60
C12N5/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509034
(86)(22)【出願日】2022-08-16
(85)【翻訳文提出日】2024-04-12
(86)【国際出願番号】 US2022075022
(87)【国際公開番号】W WO2023023516
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】63/233,921
(32)【優先日】2021-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501231613
【氏名又は名称】モンサント テクノロジー エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】イェ，シュドン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA88X
4B065AA88Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA47
(57)【要約】
色素体ゲノム編集、ならびに編集された色素体ゲノムを含む植物、植物細胞、植物部分、及び種子の開発ための方法が提供される。色素体ゲノムの形質転換のための組成物がさらに提供される。具体的には、色素体ゲノムは、標的化された内在性色素体ゲノム配列の、標的色素体配列の改変形態への置き換えを含むように改変され、ここで、改変色素体ゲノム配列は、標的化された内在性色素体ゲノム配列との相同性を計画的に低下し、場合によっては、１つまたは複数の変異を含有するタンパク質をコードするように設計されている。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
色素体ゲノムを改変する方法であって、ａ．組換え核酸分子を植物細胞に導入することであって、前記組換え核酸分子が、５’から３’に向かって、
ｉ．第１の内在性色素体ゲノム配列と相同な第１の相同配列、
ｉｉ．標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む改変配列、及び
ｉｉｉ．第２の内在性色素体ゲノム配列と相同な第２の相同配列
を含み、前記標的色素体配列が、前記植物細胞の色素体ゲノムにおいて、前記第１の内在性色素体ゲノム配列と前記第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、前記導入することと、
ｂ．前記植物細胞の前記色素体ゲノムにおける前記標的色素体配列を前記改変配列に置き換えるような相同組換えを生じさせることと
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記改変配列が、前記標的色素体配列に対する少なくとも第２のサイレント変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記改変配列が、前記標的色素体配列に対する少なくとも１つの機能変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記改変配列が、前記標的色素体配列に対する少なくとも第２の機能変異を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記改変配列が、前記標的色素体配列と少なくとも３０％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の相同配列が、前記第１の内在性色素体ゲノム配列と同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記第２の相同配列が、前記第２の内在性色素体ゲノム配列と同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記標的色素体配列が、色素体遺伝子の少なくとも一部分、または前記色素体遺伝子の少なくとも一部分と相補的な配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記組換え核酸分子が、前記第１の相同配列と前記第２の相同配列との間に選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記選択マーカー遺伝子が、ｎｐｔＩＩ、ａｐｈ ＩＶ、ａａｄＡ、ａａｃ３、ａａｃＣ４、ｂａｒ、ｐａｔ、ＤＭＯ、ＥＰＳＰＳ、及びａｒｏＡからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記組換え核酸分子が、前記第１の相同配列と前記第２の相同配列との間にターミネーター配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記組換え核酸分子が、前記第１の相同配列と前記第２の相同配列との間にプロモーター配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記単子葉植物細胞が、トウモロコシ細胞、イネ細胞、コムギ細胞、オオムギ細胞、またはサトウキビ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記植物細胞が双子葉植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記双子葉植物細胞が、ダイズ細胞、アルファルファ細胞、ワタ細胞、トマト細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞、またはキャノーラ細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ｃ．前記改変配列を含む形質転換植物細胞を選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記選択するステップが、前記形質転換植物細胞を分子技法に基づいて選択することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記選択するステップが、前記形質転換植物細胞を、前記形質転換植物細胞の前記色素体ゲノムにおける前記改変配列によって引き起こされた表現型変化に基づいて選択することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
ｃ．形質転換植物細胞から形質転換植物を再生することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
植物細胞における標的色素体配列を置き換えるためのベクターであって、前記プラスミドベクターが、５’から３’の順に、ｉ．第１の相同配列であって、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同である、前記第１の相同配列、
ｉｉ．改変配列であって、前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、前記改変配列、及び
ｉｉｉ．第２の相同配列であって、第２の内在性色素体ゲノム配列と相同である、前記第２の相同配列
を含む組換え核酸分子を含み、前記標的色素体配列が、前記植物細胞の色素体ゲノムにおいて、前記第１の内在性色素体ゲノム配列と前記第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、前記ベクター。
【請求項22】
色素体ゲノム中に改変配列を含む、請求項１に記載の方法によって作製されるトランスジェニック植物細胞。
【請求項23】
色素体ゲノムを改変する方法であって、ａ．組換え核酸分子を植物細胞に導入することであって、前記組換え核酸分子が、５’から３’に向かって、
ｉ．第１の内在性色素体ゲノム配列と相同な第１の相同配列、
ｉｉ．１，０００ヌクレオチドごとに標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む改変配列、及び
ｉｉｉ．第２の内在性色素体ゲノム配列と相同な第２の相同配列
を含み、前記標的色素体配列が、前記植物細胞の色素体ゲノムにおいて、前記第１の内在性色素体ゲノム配列と前記第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、前記導入することと、
ｂ．前記植物細胞の前記色素体ゲノムにおける前記標的色素体配列を前記改変配列に置き換えるような相同組換えを生じさせることと
を含む、前記方法。
【請求項24】
前記改変配列が、５００ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記改変配列が、２５０ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
植物細胞における標的色素体配列を置き換えるためのベクターであって、前記プラスミドベクターが、５’から３’の順に、ｉ．第１の相同配列であって、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同である、前記第１の相同配列、
ｉｉ．改変配列であって、１，０００ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、前記改変配列、及び
ｉｉｉ．第２の相同配列であって、第２の内在性色素体ゲノム配列と相同である、前記第２の相同配列
を含む組換え核酸分子を含み、前記標的色素体配列が、前記植物細胞の色素体ゲノムにおいて、前記第１の内在性色素体ゲノム配列と前記第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、前記ベクター。
【請求項27】
前記改変配列が、５００ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項28】
前記改変配列が、２５０ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項29】
色素体ゲノム中に改変配列を含む、請求項２３に記載の方法によって作製されるトランスジェニック植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０２１年８月１７日に出願された米国仮出願第６３／２３３，９２１号の優先権を主張する。
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０２１年８月１７日に出願された米国仮出願第６３／２３３，９２１号の優先権を主張する。
【0002】
本開示は、農業バイオテクノロジーの分野、より具体的には、色素体におけるゲノム編集のための方法及び組成物に関する。
【0003】
配列表の組み込み
２０２２年８月１５日に作成された、３５，９８９バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）の「ＭＯＮＳ４９８ＷＯ．ｘｍｌ」という名前のファイルに含有される配列表は、本明細書と共に電子的に出願され、その全体が参照によって組み込まれる。
２０２２年８月１５日に作成された、３５，９８９バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）の「ＭＯＮＳ４９８ＷＯ．ｘｍｌ」という名前のファイルに含有される配列表は、本明細書と共に電子的に出願され、その全体が参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
遺伝子編集は作物開発における重要なツールとなっており、部位特異的ヌクレアーゼを使用して植物核ゲノムを編集するための方法が開発されている。しかしながら、植物色素体ゲノム上に位置する遺伝子を編集する取り組みは、著しい成功を収めていない。色素体ゲノム編集は、典型的には、２つの所定の色素体ゲノム配列の間への目的の導入遺伝子の挿入を導く相同組換えに依存する。高色素体コピー数及び相同性が高い配列間で生じる広範な組換えと組み合わされた、非常に活性な色素体ＤＮＡ修復系のために、色素体ゲノム配列に点変異を効率的に導入することは、これまで可能ではなかった。このため、色素体ゲノム配列への点変異の効率的な導入を可能にする方法を開発する必要性が当技術分野において存在する。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、色素体ゲノムを改変する方法であって、ａ．組換え核酸分子を植物細胞に導入することであって、組換え核酸分子が、５’から３’に向かって、ｉ．第１の内在性色素体ゲノム配列と相同な第１の相同配列、ｉｉ．標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む改変配列、及びｉｉｉ．第２の内在性色素体ゲノム配列と相同な第２の相同配列を含み、標的色素体配列が、植物細胞の色素体ゲノムにおいて、第１の内在性色素体ゲノム配列と第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、導入することと、ｂ．植物細胞の色素体ゲノムにおける標的色素体配列を改変配列に置き換えるような相同組換えを生じさせることとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、改変配列は、標的色素体配列に対する少なくとも第２、第３、第４、第５、第６、７つ、８つ、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、または第２０のサイレント変異を含む。他の実施形態では、改変配列は、標的色素体配列に対する少なくとも１つの機能変異を含む。ある特定の実施形態では、改変配列は、標的色素体配列に対する少なくとも第２、第３、第４、第５、第６、７つ、８つ、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、または第２０の機能変異を含む。特定の実施形態では、改変配列は、標的色素体配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、改変配列は、標的色素体配列と３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満同一である。
【0006】
一部の実施形態では、第１の相同配列は、第１の内在性色素体ゲノム配列と本質的に同一である。他の実施形態では、第２の相同配列は、第２の内在性色素体ゲノム配列と本質的に同一である。追加の実施形態では、標的色素体配列は、色素体遺伝子の少なくとも一部分、または色素体遺伝子の少なくとも一部分と相補的な配列を含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、第１の相同配列と第２の相同配列との間に選択マーカー遺伝子をさらに含む。ある特定の実施形態では、選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔＩＩ、ａｐｈ ＩＶ、ａａｄＡ、ａａｃ３、ａａｃＣ４、ｂａｒ、ｐａｔ、ＤＭＯ、ＥＰＳＰＳ、及びａｒｏＡからなる群から選択される。他の実施形態では、組換え核酸分子は、第１の相同配列と第２の相同配列との間にターミネーター配列をさらに含む。さらに他の実施形態では、組換え核酸分子は、第１の相同配列と第２の相同配列との間にプロモーター配列をさらに含む。
【0007】
一部の実施形態では、方法の植物細胞は単子葉植物細胞である。ある特定の実施形態では、単子葉植物細胞は、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）細胞、イネ細胞、コムギ細胞、オオムギ細胞、またはサトウキビ細胞である。他の実施形態では、方法の植物細胞は双子葉植物細胞である。特定の実施形態では、双子葉植物細胞は、ダイズ細胞、アルファルファ細胞、ワタ細胞、トマト細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞、またはキャノーラ細胞である。
【0008】
追加の実施形態では、方法は、ｃ．改変配列を含む形質転換植物細胞を選択するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、選択するステップは、形質転換植物細胞を分子技法に基づいて選択することを含む。さらなる実施形態では、選択するステップは、形質転換植物細胞を、形質転換植物細胞の色素体ゲノムにおける改変配列によって引き起こされた表現型変化に基づいて選択することを含む。さらなる実施形態では、選択するステップは、形質転換植物細胞を、形質転換植物細胞の色素体ゲノムにおける改変配列の存在に基づいて選択することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、ｃ．形質転換植物細胞から形質転換植物を再生することをさらに含む。
【0009】
本開示はまた、植物細胞における標的色素体配列を置き換えるためのベクターであって、当該プラスミドベクターが、５’から３’の順に、ｉ．第１の相同配列であって、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同である、第１の相同配列、ｉｉ．改変配列であって、標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、改変配列、及びｉｉｉ．第２の相同配列であって、第２の内在性色素体ゲノム配列と相同である、第２の相同配列を含む組換え核酸分子を含み、標的色素体配列が、植物細胞の色素体ゲノムにおいて、第１の内在性色素体ゲノム配列と第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、ベクターを提供する。
【0010】
本開示は、色素体ゲノムを改変する方法であって、ａ．組換え核酸分子を植物細胞に導入することであって、組換え核酸分子が、５’から３’に向かって、ｉ．第１の内在性色素体ゲノム配列と相同な第１の相同配列、ｉｉ．１，０００ヌクレオチドごとに標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む改変配列、及びｉｉｉ．第２の内在性色素体ゲノム配列と相同な第２の相同配列を含み、標的色素体配列が、植物細胞の色素体ゲノムにおいて、第１の内在性色素体ゲノム配列と第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、導入することと、ｂ．植物細胞の色素体ゲノムにおける標的色素体配列を改変配列に置き換えるような相同組換えを生じさせることとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、改変配列は、５００ヌクレオチドごとに標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む。他の実施形態では、改変配列は、２５０ヌクレオチドごとに標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む。
【0011】
本開示はまた、植物細胞における標的色素体配列を置き換えるためのベクターであって、当該プラスミドベクターが、５’から３’の順に、ｉ．第１の相同配列であって、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同である、第１の相同配列、ｉｉ．改変配列であって、１，０００ヌクレオチドごとに標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、改変配列、及びｉｉｉ．第２の相同配列であって、第２の内在性色素体ゲノム配列と相同である、第２の相同配列を含む組換え核酸分子を含み、標的色素体配列が、植物細胞の色素体ゲノムにおいて、第１の内在性色素体ゲノム配列と第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、ベクターを提供する。ある特定の実施形態では、改変配列は、５００ヌクレオチドごとに標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む。他の実施形態では、改変配列は、２５０ヌクレオチドごとに標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む。他の実施形態では、改変配列は、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、または２４９ヌクレオチドごとに標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む。本明細書に記載される方法によって作製され、色素体ゲノム中に改変配列を含むトランスジェニック植物細胞もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】様々なＲＮＡトリプレットがどのアミノ酸をコードするかを明示するＲＮＡコドン表を示す。コドンの隣の上付き数字は、各コドンが未改変（ｎａｔｉｖｅ）ダイズｒｂｃＬコード配列（配列番号１）に生じる頻度を示す。
【図2】野生型ダイズｒｂｃＬ遺伝子（上）及びコドン改変ダイズｒｂｃＬ遺伝子配列（下）の配列アラインメントを示す。改変ｒｂｃＬ配列と隣接する相同アームは高い相同性を示すが、改変ｒｂｃＬ配列は、コドン改変のために低い相同性を示す。
【図3】相同組換えを介して未改変ダイズｒｂｃＬ遺伝子を置き換えるために使用した組換えＤＮＡ構築物の設計を示す。色素体ゲノムとＤＮＡ構築物との間の相同組換えに関する潜在的な領域は、構築物と野生型（ＷＴ）色素体配列との間の実線の「Ｘ」線によって表される。「ａｐｔＢ」は、未改変ｒｂｃＬ配列の上流に位置するａｐｔＢ遺伝子の連続配列を表す。「Ｐ」は、未改変ｒｂｃＬプロモーター配列を表し、「Ｔ」は、未改変ｒｂｃＬターミネーター配列を表す。「Ｔｒｎｋ－ｍａｔＫ」は、未改変ｒｂｃＬ配列の下流の領域の連続配列を表し、Ｔｒｎｋ－ｍａｔＫをコードする。
【図4】改変ｒｂｃＬ置き換え（ｍｒｂｃＬ）を同定するために使用した様々なＰＣＲプライマーの配置を示す。使用したプライマーとしては、プライマー３６１５（配列番号１２）、プライマー３６２０（配列番号１３）、プライマー２９８０（配列番号１４）、及びプライマー３６２２（配列番号１５）が挙げられる。
【図5A】遺伝子置き換え事象の検出に関するＰＣＲ結果を示す。Ｅ６Ｇ－Ｎ９５Ｑ及びＥ６Ｇ－Ｐ８９Ｇ ｒｂｃＬに関する遺伝子置き換え事象の同定を示す。
【図5B】遺伝子置き換え事象の検出に関するＰＣＲ結果を示す。コドン最適化（ＣＭ）ｒｂｃＬに関する遺伝子置き換え事象の同定を示す。
【0013】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニットをコードする野生型ダイズｒｂｃＬ遺伝子のＤＮＡ配列である。
配列番号１は、ＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニットをコードする野生型ダイズｒｂｃＬ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【0014】
配列番号２は、配列番号１によってコードされるダイズＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニットのアミノ酸配列である。
【0015】
配列番号３は、コドン改変ｒｂｃＬ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【0016】
配列番号４は、ダイズ色素体ゲノムにおけるｒｂｃＬ遺伝子の上流の領域に対応する５’相同配列のＤＮＡ配列である。
【0017】
配列番号５は、ダイズ色素体ゲノムにおけるｒｂｃＬ遺伝子の下流の領域に対応する３’相同配列のＤＮＡ配列である。
【0018】
配列番号６は、未改変ダイズｒｂｃＬ遺伝子プロモーター配列のＤＮＡ配列である。
【0019】
配列番号７は、未改変ダイズｒｂｃＬ遺伝子ターミネーター配列のＤＮＡ配列である。
【0020】
配列番号８は、変異Ｅ６Ｇ－Ｐ８９Ｇ ＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニットをコードするＤＮＡ配列である。
【0021】
配列番号９は、配列番号８によってコードされる変異Ｅ６Ｇ－Ｐ８９Ｇ ＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニットのアミノ酸配列である。
【0022】
配列番号１０は、変異Ｅ６Ｇ－Ｎ９５Ｑ ＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニットをコードするＤＮＡ配列である。
【0023】
配列番号１１は、配列番号１０によってコードされる変異Ｅ６Ｇ－Ｎ９５Ｑ ＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニットのアミノ酸配列である。
【0024】
配列番号１２～配列番号１５は、形質転換事象の検出のためのＰＣＲプライマー配列である。
【0025】
配列番号１６は、５’及び３’相同配列と隣接する野生型ダイズｒｂｃＬ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【0026】
配列番号１７は、５’及び３’相同配列と隣接するコドン改変ダイズｒｂｃＬ遺伝子配列のＤＮＡ配列である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
近年、遺伝子編集は作物開発における重要なツールとなっている。遺伝子編集は、植物ゲノムに対する正確な標的化された変化を可能にし、その範囲は、一塩基変更から特定のゲノム位置における全外来遺伝子の挿入に及ぶ。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復またはＤＮＡオリゴ／鋳型媒介交換は、核ゲノム編集に効果的に使用されている。
【0028】
しかしながら、植物における呼吸、光合成、及び発育に関与するいくつかの遺伝子は、核ゲノムではなく色素体ゲノム上に見出される。研究者らは、長年かけて、特定の点変異を植物色素体ゲノム上に位置する遺伝子に導入する試みを行っているが、著しい成功を収めていない。これは、改変配列を導入するために使用されるプラスミドベクター内の未改変色素体配列を伴う相同組換えに起因すると考えられる。葉緑体ゲノムは、天然に高いレベルの組換え活性を有し、相同組換え修復を利用する色素体ＤＮＡ修復系は、そのゲノム中に見出される変異の修正に関して厳格であると考えられている。これは、単一植物細胞内における色素体の多くのコピーの存在、及び相同性が高い配列間で生じる広範な組換えに起因する。実際、標的化された点変異を色素体ゲノムに維持するために選択マーカーが利用される場合であっても、組換えによって点変異と導入された選択マーカー遺伝子とが分離し、それによって、成功した形質転換体の選択が困難になる可能性がある。これらの理由の全てのために、色素体ゲノム上に位置する遺伝子への点変異の導入は困難で時間がかかることが証明されている。
【0029】
これらの制限に対処するために、本開示は、色素体ゲノムを編集する改良された方法を提供する。ある特定の実施形態では、色素体ゲノムにおける所望の遺伝子に１つまたは複数の標的化された点変異を確実に生成するための手法が提供される。例えば、本開示は、色素体ゲノムにおける内在性標的色素体配列を、内在性標的色素体配列との相同性を低下するように設計された改変配列に置き換えるための方法を提供する。改変配列は、１つまたは複数のサイレント変異を含むことができ、その結果、改変核酸配列は、同じかまたは類似したアミノ酸配列を依然としてコードする一方で、標的色素体配列に対して低い配列同一性を有する。対応する内在性配列に対する改変配列の低下した相同性は、改変配列が色素体ＤＮＡ修復系によって修復される可能性を低下させ、したがって編集効率を高める。
【0030】
一部の実施形態では、改変配列は、１つまたは複数の同義コドン置換（サイレント変異）を含むことに加えて、１つまたは複数の非同義コドン置換（機能変異）を含んでもよく、したがって、内在性標的配列によってコードされるアミノ酸配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を有するタンパク質をコードし得る。一部の実施形態では、葉緑体形質転換を介した改変配列の送達を容易にするために、改変配列は組換えＤＮＡ分子に含まれる。組換えＤＮＡ分子は、標的細胞の色素体またはプラストミック（ｐｌａｓｔｏｍｉｃ）ＤＮＡ分子またはゲノム中の特定の標的部位または座位における相同組換えを可能にするために、改変配列と隣接する少なくとも第１の相同配列及び第２の相同配列を含み得る。改変配列は、内在性標的色素体配列と比較的低い相同性を有し得るが、相同アームのそれぞれは、対応する色素体ゲノム配列と高い相同性を有することができる。一部の実施形態では、相同アームは、対応する色素体ゲノム配列と完全に相同または１００％同一であり得る。一部の実施形態では、相同アームは、対応する色素体ゲノム配列と実質的に相同または９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、もしくは９９．９％以上同一であり得る。この構成は、色素体形質転換効率を向上させ、内在性標的配列が改変配列で置き換えられる可能性を高めると同時にさらなる変異の導入を回避する。ある特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子はまた、形質転換体の選択を容易にするために選択マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子もまた、左側の相同配列と右側の相同配列との間に位置し得る。２つの隣接領域を介した組換えＤＮＡ分子と色素体ゲノムとの間の相同組換えは、内在性標的配列を改変配列に完全に置き換えると同時に、マーカー遺伝子を色素体ゲノムに導入することができる。開示される方法は、任意の内在性色素体配列の効率的な置き換えを可能にするため、当技術に対する著しい利点を表す。一部の実施形態では、内在性標的配列はコード配列である。一部の実施形態では、内在性標的配列は非コード配列である。一部の実施形態では、内在性標的配列は、エンハンサー配列、イントロン配列、エクソン配列、ターミネーター配列、プロモーター配列、及び／またはエンハンサー配列である。
【0031】
Ｉ．植物におけるゲノム編集
ゲノム編集技法は、改良された作物種の開発における重要なツールとなっている。ゲノム編集は、ゲノムにおける特定の標的に対する正確な改変を可能にし、典型的には、細胞自身のＤＮＡ修復機構を利用して、所望の改変を行う。植物細胞では、内在性ＤＮＡ修復系は、相同組換え及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して機能して、ＤＮＡを修復する。相同組換えは、２つの核酸分子によって共有されている保存領域におけるヌクレオチドの交換を伴い、ＮＨＥＪは、単に２つの核酸を互いに結合する。ＮＨＥＪを介して導入される標的化された改変は、典型的には未成熟終止コドン及び／またはフレームシフト変異である。
ゲノム編集技法は、改良された作物種の開発における重要なツールとなっている。ゲノム編集は、ゲノムにおける特定の標的に対する正確な改変を可能にし、典型的には、細胞自身のＤＮＡ修復機構を利用して、所望の改変を行う。植物細胞では、内在性ＤＮＡ修復系は、相同組換え及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して機能して、ＤＮＡを修復する。相同組換えは、２つの核酸分子によって共有されている保存領域におけるヌクレオチドの交換を伴い、ＮＨＥＪは、単に２つの核酸を互いに結合する。ＮＨＥＪを介して導入される標的化された改変は、典型的には未成熟終止コドン及び／またはフレームシフト変異である。
【0032】
相同組換えは、ドナー配列の使用を介して遺伝子の挿入または置き換えを含有させるようにゲノムを改変するために使用することができる。ドナーポリヌクレオチドを植物ゲノムに導入するかまたは植物のゲノムＤＮＡを改変するための方法の例としては、配列特異的ヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作もしくは未改変メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｉ型の、クラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文繰り返し配列（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓ９システム）、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）システム、Ｃａｓ１２ｂシステム、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）システム、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）システム、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）システム、Ｃａｓ１２ｇシステム、Ｃａｓ１２ｈシステム、Ｃａｓ１２ｉシステム、Ｃ２ｃ１システム、Ｃ２ｃ４システム、Ｃ２ｃ５システム、Ｃ２ｃ８システム、Ｃ２ｃ９システム、Ｃ２ｃ１０システム、Ｃａｓ１４ａシステム、Ｃａｓ１４ｂシステム、Ｃａｓ１４ｃシステムなど）、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）の使用が挙げられる。一部の実施形態は、Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１６ Ａｐｒ；１７０（４）：１９１７－１９２８）に記載されているような、一本鎖オリゴヌクレオチドを使用して正確な塩基対改変を植物ゲノムに導入するゲノム編集の方法に関するが、ゲノム編集を使用してゲノムＤＮＡを改変するか、欠失させるか、または核酸配列をゲノムＤＮＡに挿入する方法は、当技術分野で周知である。ゲノム編集は、植物育種プログラムにおいて貴重なツールとなる可能性を有するが、作物開発におけるその使用は、所望のゲノム改変を含む植物を作製及び同定するために必要とされる時間及び費用によって制限されている。さらに、植物の発育及び光合成プロセスに重要な多数の遺伝子（したがって改変に望ましい標的）は、色素体ゲノムによってコードされている。したがって、色素体ゲノム改変の方法に対する必要性が存在する。具体的には、色素体ゲノムにおける標的化された部位に特定の点変異を導入するための、または内在性色素体配列（例えば遺伝子）を同じ配列の改変形態に置き換えるための効率的な方法は存在しない。このことに対処するために、本開示は、コード配列または標的化された配列によってコードされるアミノ酸に１つまたは複数の点変異を作出するために使用することができる、単一ステップでの、色素体ゲノムにおける効率的な標的化された配列置き換えのための新規方法を提供する。
【0033】
本明細書で使用する場合、「内在性」または「未改変」遺伝子とは、所与の生物、細胞、組織、ゲノム、または染色体内を起源とし、ヒトによる行為によって以前に改変されなかった遺伝子を指す。同様に、「内在性タンパク質」とは、内在性遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
【0034】
本明細書で使用する場合、内在性色素体配列を「置き換えること」は、色素体ゲノムにおいて、特定の内在性色素体配列をその配列の改変形態に交換することを含む。
【0035】
本明細書で使用する場合、植物、種子、植物成分、植物細胞、及び植物ゲノムの文脈における「改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」とは、天然または未改変状態からの変化または変動を含有する状態を指す。例えば、遺伝子の「未改変転写物」とは、改変されていない遺伝子から生成されるＲＮＡ転写物を指す。典型的には、未改変転写物はセンス転写物である。改変植物または種子は、遺伝的または後成的改変のいずれかを含む、それらの遺伝物質における分子変化を含有する。典型的には、改変植物もしくは種子、またはその親もしくは祖先株は、変異誘発、ゲノム編集（例えば、限定されないが、相同組換えを使用する方法を介した）、遺伝子形質転換（例えば、限定されないが、葉緑体形質転換または微粒子銃の方法を介した）、またはそれらの組み合わせに供されている。
【0036】
本明細書で使用する場合、「改変配列（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、色素体ゲノムにおける標的色素体配列を置き換えるポリヌクレオチド配列を含む。ある態様では、改変配列は、内在性標的配列に対する１つまたは複数の同義コドン置換を含む。別の態様では、同義コドンは、コドンが内在性配列に現れる頻度に基づいて選択される。「改変配列」は、内在性配列と比較して１つまたは複数のサイレント変異、機能変異、置換、欠失、または挿入を有する配列を指す場合がある。ある特定の例では、「改変配列」は、内在性色素体ゲノム配列と比較して１つまたは複数のサイレント変異を有する配列を指す。「改変配列」は、内在性色素体ゲノム配列と比較して１つまたは複数の機能変異を有してもよい。「改変配列」はまた、内在性色素体ゲノム配列と比較して１つまたは複数のサイレント変異と１つまたは複数の機能変異とを有してもよい。
【0037】
一態様では、タンパク質をコードする核酸分子に対する改変は、内在性タンパク質と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００の変異を有する改変配列をもたらす。別の態様では、核酸分子に対する改変は、改変されていない核酸分子と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００ヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、核酸分子に対する改変は、改変されていない核酸分子と比較して少なくとも３ヌクレオチドごと、少なくとも６ヌクレオチドごと、少なくとも９ヌクレオチドごと、少なくとも１２ヌクレオチドごと、少なくとも１５ヌクレオチドごと、少なくとも１８ヌクレオチドごと、少なくとも２１ヌクレオチドごと、少なくとも２４ヌクレオチドごと、少なくとも２７ヌクレオチドごと、少なくとも３０ヌクレオチドごと、少なくとも３３ヌクレオチドごと、少なくとも３６ヌクレオチドごと、少なくとも３９ヌクレオチドごと、少なくとも４２ヌクレオチドごと、少なくとも４５ヌクレオチドごと、少なくとも４８ヌクレオチドごと、少なくとも５１ヌクレオチドごと、少なくとも５４ヌクレオチドごと、少なくとも５７ヌクレオチドごと、少なくとも６０ヌクレオチドごと、少なくとも６３ヌクレオチドごと、少なくとも６６ヌクレオチドごと、少なくとも６９ヌクレオチドごと、少なくとも７２ヌクレオチドごと、少なくとも７５ヌクレオチドごと、少なくとも７８ヌクレオチドごと、少なくとも８１ヌクレオチドごと、少なくとも８４ヌクレオチドごと、少なくとも８７ヌクレオチドごと、少なくとも９０ヌクレオチドごと、少なくとも９３ヌクレオチドごと、少なくとも９６ヌクレオチドごと、少なくとも９９ヌクレオチドごと、少なくとも１０２ヌクレオチドごと、少なくとも１０５ヌクレオチドごと、少なくとも１０８ヌクレオチドごと、少なくとも１１１ヌクレオチドごと、少なくとも１１４ヌクレオチドごと、少なくとも１１７ヌクレオチドごと、少なくとも１２０ヌクレオチドごと、少なくとも１２３ヌクレオチドごと、少なくとも１２６ヌクレオチドごと、少なくとも１２９ヌクレオチドごと、少なくとも１３２ヌクレオチドごと、少なくとも１３５ヌクレオチドごと、少なくとも１３８ヌクレオチドごと、少なくとも１４１ヌクレオチドごと、少なくとも１４４ヌクレオチドごと、少なくとも１４７ヌクレオチドごと、少なくとも１５０ヌクレオチドごと、少なくとも１５３ヌクレオチドごと、少なくとも１５６ヌクレオチドごと、少なくとも１５９ヌクレオチドごと、少なくとも１６２ヌクレオチドごと、少なくとも１６５ヌクレオチドごと、少なくとも１６８ヌクレオチドごと、少なくとも１７１ヌクレオチドごと、少なくとも１７４ヌクレオチドごと、少なくとも１７７ヌクレオチドごと、少なくとも１８０ヌクレオチドごと、少なくとも１８３ヌクレオチドごと、少なくとも１８６ヌクレオチドごと、少なくとも１８９ヌクレオチドごと、少なくとも１９２ヌクレオチドごと、少なくとも１９５ヌクレオチドごと、少なくとも１９８ヌクレオチドごと、少なくとも２０１ヌクレオチドごと、少なくとも２０４ヌクレオチドごと、少なくとも２０７ヌクレオチドごと、少なくとも２１０ヌクレオチドごと、少なくとも２１３ヌクレオチドごと、少なくとも２１６ヌクレオチドごと、少なくとも２１９ヌクレオチドごと、少なくとも２２２ヌクレオチドごと、少なくとも２２５ヌクレオチドごと、少なくとも２２８ヌクレオチドごと、少なくとも２３１ヌクレオチドごと、少なくとも２３４ヌクレオチドごと、少なくとも２３７ヌクレオチドごと、少なくとも２４０ヌクレオチドごと、少なくとも２４３ヌクレオチドごと、少なくとも２４６ヌクレオチドごと、または少なくとも２４９ヌクレオチドごとにヌクレオチドの置換を含む。一部の実施形態では、「改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、核酸配列における「Ｃ」、「Ｇ」または「Ｔ」の「Ａ」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列における「Ａ」、「Ｇ」または「Ｔ」の「Ｃ」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列における「Ａ」、「Ｃ」または「Ｔ」の「Ｇ」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列における「Ａ」、「Ｃ」または「Ｇ」の「Ｔ」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列における「Ｕ」の「Ｃ」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列における「Ａ」の「Ｇ」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列における「Ｇ」の「Ａ」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列における「Ｃ」の「Ｔ」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列における１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列への１つまたは複数のヌクレオチドの挿入を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列における１つまたは複数のヌクレオチドの重複を含む。
【0038】
本明細書で使用する場合、「同義」改変とは、同じアミノ酸をコードするコドンをもたらす一塩基変化を指す。本明細書で使用する場合、「非同義」改変とは、異なるアミノ酸をコードするコドンをもたらす一塩基変化を指す。例えば、コドン「ＣＧＵ」は、アルギニンアミノ酸をコードする。同義改変によってＵがＡに変化し、「ＣＧＡ」コドンを生成する場合、このコドンは依然としてアルギニンアミノ酸をコードする。非同義改変によってＧがＵに変化し、「ＣＵＵ」コドンを生成する場合、このコドンは、今度はロイシンアミノ酸をコードする。ある態様では、本明細書に記載される改変配列は、色素体ゲノムにおける内在性標的配列と比較して１つまたは複数の同義改変を含む。
【0039】
いくつかの実施形態は、本明細書に開示される方法によって作製される植物細胞、植物組織、植物種子、及び植物に関する。植物は、単子葉であっても双子葉であってもよく、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、エンバク、ライムギ、ソルガム、メーズ（ｍａｉｚｅ）、グレープ、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、レタス、ブロッコリー、キュウリ、ピーナッツ、メロン、リーキ、タマネギ、ダイズ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、キャノーラ、及びテンサイ植物を挙げることができる。
【0040】
本明細書で使用する場合、「植物」とは、全植物を指す。植物に由来する細胞または組織培養物は、任意の植物部分もしくは植物器官（例えば、葉、茎、根など）、植物組織、種子、植物細胞、及び／またはそれらの子孫を含むことができる。子孫植物は、任意の雑種世代、例えば、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７などであり得る。植物細胞は、植物から取得されたかまたは植物から取得された細胞の培養によって得られた、植物の生体細胞である。
【0041】
一態様では、本明細書において提供される植物部分としては、これらに限定されないが、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、莢、胚、胚乳、外植片、カルス、組織培養物、シュート、細胞、及びプロトプラストが挙げられる。さらなる態様では、本開示は、生殖物質ではなく、植物の自然生殖を媒介しない植物細胞、組織、及び器官を提供する。別の態様では、本開示はまた、生殖物質であり、植物の自然生殖を媒介する植物細胞、組織、及び器官を提供する。別の態様では、本開示は、光合成を介して自らを維持することができない植物細胞、組織、及び器官を提供する。別の態様では、本開示は、植物体細胞を提供する。体細胞は、生殖細胞と異なり、植物の生殖を媒介しない。
【0042】
提供される細胞、組織及び器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、分裂組織、胚、胚乳、根、シュート、茎、莢、花、花房、花柄、小花柄、花柱、柱頭、花托、花弁、萼片、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、師部、及び維管束組織由来のものであり得る。別の態様では、本開示は、植物葉緑体を提供する。別の態様では、本開示は、植物有色体を提供する。別の態様では、本開示は、植物原色素体を提供する。別の態様では、本開示は、植物エチオプラストを提供する。別の態様では、本開示は、植物白色体を提供する。別の態様では、本開示は、植物アミロプラストを提供する。別の態様では、本開示は、植物エライオプラストを提供する。別の態様では、本開示は、植物プロテイノプラストを提供する。さらなる態様では、本開示は、表皮細胞、小孔細胞、トリコーム細胞、根毛、または貯蔵根を提供する。別の態様では、本開示は、プロトプラストを提供する。
【0043】
ある態様では、本明細書において提供される植物細胞は、トウモロコシ細胞である。別の態様では、本明細書において提供される植物細胞は、イネ細胞である。さらなる態様では、本明細書において提供される植物細胞は、コムギ細胞である。別の態様では、本明細書において提供される植物細胞は、オオムギ細胞である。さらに別の態様では、本明細書において提供される植物細胞は、サトウキビ細胞である。ある態様では、本明細書において提供される植物細胞は、トウモロコシ細胞、イネ細胞、コムギ細胞、オオムギ細胞、及びサトウキビ細胞からなる群から選択される。
【0044】
ある態様では、本明細書において提供される植物細胞は、ダイズ細胞である。別の態様では、本明細書において提供される植物細胞は、アルファルファ細胞である。さらに別の態様では、本明細書において提供される植物細胞は、ワタ細胞である。ある態様では、本明細書において提供される植物細胞は、トマト細胞である。別の態様では、本明細書において提供される植物細胞は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞である。別の態様では、本明細書において提供される植物細胞は、キャノーラ細胞である。ある態様では、本明細書において提供される植物細胞は、ダイズ細胞、アルファルファ細胞、ワタ細胞、トマト細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞、及びキャノーラ細胞からなる群から選択される。
【0045】
ある態様では、本明細書において提供される植物細胞は、被子植物細胞である。別の態様では、本明細書において提供される植物細胞は、裸子植物細胞である。別の態様では、本明細書において提供される植物細胞は、双子葉植物細胞である。さらに別の態様では、本明細書において提供される植物細胞は、単子葉植物細胞である。
【0046】
一態様では、本開示は、改変トウモロコシ細胞を提供する。別の態様では、本開示は、改変イネ細胞を提供する。さらなる態様では、本開示は、改変コムギ細胞を提供する。別の態様では、本開示は、改変オオムギ細胞を提供する。さらに別の態様では、本開示は、改変サトウキビ細胞を提供する。ある態様では、本開示は、改変ダイズ細胞を提供する。別の態様では、本開示は、改変アルファルファ細胞を提供する。さらに別の態様では、本開示は、改変ワタ細胞を提供する。ある態様では、本開示は、改変トマト細胞を提供する。別の態様では、本開示は、改変Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞を提供する。別の態様では、本開示は、改変キャノーラ細胞を提供する。ある態様では、本開示は、改変被子植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、改変裸子植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、改変双子葉植物細胞を提供する。さらに別の態様では、本開示は、改変単子葉植物細胞を提供する。
【0047】
一態様では、本開示は、改変トウモロコシ植物を提供する。別の態様では、本開示は、改変イネ植物を提供する。さらなる態様では、本開示は、改変コムギ植物を提供する。別の態様では、本開示は、改変オオムギ植物を提供する。さらに別の態様では、本開示は、改変サトウキビ植物を提供する。ある態様では、本開示は、改変ダイズ植物を提供する。別の態様では、本開示は、改変アルファルファ植物を提供する。さらに別の態様では、本開示は、改変ワタ植物を提供する。ある態様では、本開示は、改変トマト植物を提供する。別の態様では、本開示は、改変Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を提供する。別の態様では、本開示は、改変キャノーラ植物を提供する。ある態様では、本開示は、改変被子植物を提供する。別の態様では、本開示は、改変裸子植物を提供する。別の態様では、本開示は、改変双子葉植物を提供する。さらに別の態様では、本開示は、改変単子葉植物を提供する。
【0048】
一態様では、本開示は、形質転換トウモロコシ細胞を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換イネ細胞を提供する。さらなる態様では、本開示は、形質転換コムギ細胞を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換オオムギ細胞を提供する。さらに別の態様では、本開示は、形質転換サトウキビ細胞を提供する。ある態様では、本開示は、形質転換ダイズ細胞を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換アルファルファ細胞を提供する。さらに別の態様では、本開示は、形質転換ワタ細胞を提供する。ある態様では、本開示は、形質転換トマト細胞を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換キャノーラ細胞を提供する。ある態様では、本開示は、形質転換被子植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換裸子植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換双子葉植物細胞を提供する。さらに別の態様では、本開示は、形質転換単子葉植物細胞を提供する。
【0049】
一態様では、本開示は、形質転換トウモロコシ植物を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換イネ植物を提供する。さらなる態様では、本開示は、形質転換コムギ植物を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換オオムギ植物を提供する。さらに別の態様では、本開示は、形質転換サトウキビ植物を提供する。ある態様では、本開示は、形質転換ダイズ植物を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換アルファルファ植物を提供する。さらに別の態様では、本開示は、形質転換ワタ植物を提供する。ある態様では、本開示は、形質転換トマト植物を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換キャノーラ植物を提供する。ある態様では、本開示は、形質転換被子植物を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換裸子植物を提供する。別の態様では、本開示は、形質転換双子葉植物を提供する。さらに別の態様では、本開示は、形質転換単子葉植物を提供する。
【0050】
ＩＩ．色素体ゲノム編集のための構築物
色素体ゲノムのゲノム編集は、色素体形質転換法及びこれらの方法に特異的なベクターを利用する。提供される方法による色素体形質転換のためのベクター及び構築物は、選択マーカー遺伝子及び／または農学目的の遺伝子を含み得る、植物細胞または組織に導入される１つまたは複数の改変配列、遺伝子エレメント及び／または導入遺伝子を含み得る。これらの改変配列、遺伝子エレメント（複数可）及び／または導入遺伝子（複数可）は、概して少なくとも以下の成分：（ａ）少なくとも１つの改変配列と、（ｂ）改変配列と隣接する２つの相同アーム（形質転換される植物種の内在性標的配列と隣接する色素体ゲノム配列に由来し、それに対応する）とを含み得る組換え二本鎖プラスミドまたはベクターＤＮＡ分子に組み込まれ得る。ベクターは、（ｉ）植物細胞、より詳細には植物色素体において機能して、プロモーターに作動可能に連結している転写可能核酸配列（例えば、改変配列、選択マーカーなど）の発現を引き起こすかまたは駆動する少なくとも１つのプロモーターまたは調節エレメント、及び（ｉｉ）選択マーカーをコードする転写可能ＤＮＡ配列（すなわち選択マーカー遺伝子）をさらに含み得る。各発現カセットは、植物細胞色素体形質転換事象からの遺伝子発現のための、５’及び３’非翻訳領域配列、イントロン配列、追加の調節または発現エレメントなどをさらに含み得る。
色素体ゲノムのゲノム編集は、色素体形質転換法及びこれらの方法に特異的なベクターを利用する。提供される方法による色素体形質転換のためのベクター及び構築物は、選択マーカー遺伝子及び／または農学目的の遺伝子を含み得る、植物細胞または組織に導入される１つまたは複数の改変配列、遺伝子エレメント及び／または導入遺伝子を含み得る。これらの改変配列、遺伝子エレメント（複数可）及び／または導入遺伝子（複数可）は、概して少なくとも以下の成分：（ａ）少なくとも１つの改変配列と、（ｂ）改変配列と隣接する２つの相同アーム（形質転換される植物種の内在性標的配列と隣接する色素体ゲノム配列に由来し、それに対応する）とを含み得る組換え二本鎖プラスミドまたはベクターＤＮＡ分子に組み込まれ得る。ベクターは、（ｉ）植物細胞、より詳細には植物色素体において機能して、プロモーターに作動可能に連結している転写可能核酸配列（例えば、改変配列、選択マーカーなど）の発現を引き起こすかまたは駆動する少なくとも１つのプロモーターまたは調節エレメント、及び（ｉｉ）選択マーカーをコードする転写可能ＤＮＡ配列（すなわち選択マーカー遺伝子）をさらに含み得る。各発現カセットは、植物細胞色素体形質転換事象からの遺伝子発現のための、５’及び３’非翻訳領域配列、イントロン配列、追加の調節または発現エレメントなどをさらに含み得る。
【0051】
本明細書で使用する場合、ＤＮＡ分子、構築物、ベクターなどとの関連における「組換え」という用語は、天然には見出されない、及び／または天然には見出されない状況において存在するＤＮＡ分子または配列を指し、ヒトの介入なしに天然において互いに連続しても非常に近接しても存在し得ないＤＮＡ配列の組み合わせを含むＤＮＡ分子、構築物など、及び／または互いに対して異種である少なくとも２つのＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、構築物などを含む。組換えＤＮＡ分子、構築物などは、ＤＮＡ配列（複数可）であって、そのようなＤＮＡ配列（複数可）に天然では近接して存在する他のポリヌクレオチド配列（複数可）から分離されている、ＤＮＡ配列（複数可）、及び／または天然では互いに近接していない他のポリヌクレオチド配列（複数可）に隣接している（かまたはそれと連続している）ＤＮＡ配列を含み得る。組換えＤＮＡ分子、構築物などはまた、細胞外で遺伝子操作され構築されたＤＮＡ分子または配列を指す場合がある。例えば、組換えＤＮＡ分子は、任意の好適なプラスミド、ベクターなどを含み得、直鎖状または環状ＤＮＡ分子を含み得る。そのようなプラスミド、ベクターなどは、原核生物の複製起点及び選択マーカーを含む様々な維持エレメント、ならびに場合により植物選択マーカー遺伝子などに加えて導入遺伝子または発現カセットを含有し得る。
【0052】
一態様では、植物細胞の標的色素体配列を置き換えるための方法であって、組換え核酸分子を植物細胞に導入することであって、組換え核酸分子が、５’から３’の順に、第１の相同配列であって、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同である、第１の相同配列、改変配列であって、標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、改変配列、及び第２の相同配列であって、第２の内在性色素体ゲノム配列と相同である、第２の相同配列を含み、標的色素体配列が、植物細胞の色素体ゲノムにおいて、第１の内在性色素体ゲノム配列と第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、導入することと、相同組換えを介して植物細胞の色素体ゲノムにおける標的色素体配列を改変配列に置き換えるように植物細胞を培養することとを含む、方法が提供される。ある態様では、５’から３’の順に、第１の相同配列であって、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同である、第１の相同配列、改変配列であって、標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、改変配列、及び第２の相同配列であって、第２の内在性色素体ゲノム配列と相同である、第２の相同配列を含み、標的色素体配列が、植物細胞の色素体ゲノムにおいて、第１の内在性色素体ゲノム配列と第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、組換え核酸分子が提供される。
【0053】
本明細書で使用する場合、「内在性標的配列」または「標的色素体配列」とは、色素体ゲノムにおける配列と同一の核酸配列を指す。ある態様では、本明細書において提供される方法は、標的色素体配列を改変配列に置き換える。標的色素体配列は、野生型色素体ゲノム配列または以前に改変されたトランスジェニック色素体ゲノム配列であり得る。ある態様では、標的色素体配列は、タンパク質コード配列を含む。別の態様では、標的色素体配列は、ＲＮＡコード配列を含む。さらなる態様では、標的色素体配列は、非タンパク質コード配列をコードする。ある態様では、標的色素体配列は、転写配列を含む。さらなる態様では、標的色素体配列は、非転写配列を含む。ある態様では、標的色素体配列は、色素体遺伝子イントロン配列の少なくとも一部分、またはその相補配列を含む。ある態様では、標的色素体配列は、色素体遺伝子のスプライシングまたは発現を変化させる少なくとも１つの機能変異をイントロン配列に含む。さらなる態様では、標的色素体配列は、色素体遺伝子のプロモーターもしくは調節配列の少なくとも一部分、またはその相補配列を含む。さらなる態様では、標的色素体配列は、プロモーターの少なくとも一部分、またはその相補配列を含む。別の態様では、標的色素体配列は、色素体遺伝子の発現を変化させる少なくとも１つの機能変異を含む。ある態様では、標的色素体配列は、色素体遺伝子エクソン配列の少なくとも一部分、またはその相補配列を含む。ある態様では、標的色素体配列は、色素体遺伝子のスプライシングまたは発現を変化させる少なくとも１つの機能変異をエクソン配列に含む。ある態様では、標的色素体配列は、色素体ゲノムに単一コピーとして存在する。
【0054】
一態様では、標的色素体配列は、少なくとも２５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも３０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも３５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも４０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも４５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも６０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも７０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも８０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも９０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも１００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも１２５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも１５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも２００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも２５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも３００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも３５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも４００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも４５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも５００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも７５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも１０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも１５００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも２０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも３０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも４０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、標的色素体配列は、少なくとも５０００ヌクレオチド長を含む。ある態様では、本明細書において提供される標的色素体配列は、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、または少なくとも５０００ヌクレオチド長を含む。
【0055】
ある態様では、改変配列と内在性標的色素体配列との間の同一性パーセントは、少なくとも３０％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも４０％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも５０％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも６０％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも７０％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも７５％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも８０％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも８５％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも９０％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも９５％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも９６％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも９７％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも９８％である。ある態様では、改変配列と内在性標的配列との間の同一性パーセントは、少なくとも９９％である。
【0056】
別の態様では、改変配列は、少なくとも１０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも１５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長を含む。一態様では、改変配列は、少なくとも２５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも３０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも３５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも４０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも４５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも６０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも７０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも８０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも９０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも１００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも１２５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも１５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも２００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも２５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも３００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも３５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも４００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも４５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも５００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも７５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも１０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも１５００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも２０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも３０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも４０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、改変配列は、少なくとも５０００ヌクレオチド長を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、または少なくとも５０００ヌクレオチド長を含む。
【0057】
本明細書で使用する場合、「サイレント変異」とは、それが生じる細胞または生物の表現型を変化させないポリヌクレオチドに対する変異を指す。サイレント変異は、ゲノムの非コード領域またはゲノムのコード領域において生じ得る。サイレント変異がゲノムのコード領域において生じる場合、それはイントロンまたはエクソンにおいて生じ得る。遺伝暗号の縮重のために大半のアミノ酸が複数のコドンによってコードされ得ることは当技術分野で公知である。本明細書で使用する場合、「コドン」とは、特定のアミノ酸をコードする３つのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド（「トリプレット」）を指す。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするＤＮＡにおけるサイレント変異は、ｍＲＮＡ配列を変化させ得るが、変更されたコドンによってコードされるアミノ酸は変化しない。エクソンにおいて生じ、コードされるアミノ酸を変化させないサイレント変異は、「同義変異」と考えられる。あるいは、ｍＲＮＡにおけるサイレント変異は、新たなアミノ酸がコードされるタンパク質の機能性を変化させない場合、または内在性アミノ酸の特性が保存される場合、コードされるアミノ酸を変化させてもよい。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的内在性配列に対する１つまたは複数のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子のコードされるタンパク質配列を変化させない、標的内在性配列に対する１つまたは複数のサイレント変異を含む。
【0058】
一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する１つまたは複数のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する１つまたは複数のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する２つ以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する２つ以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する３つ以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する３つ以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する４つ以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する４つ以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する５つ以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する５つ以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する６つ以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する６つ以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する７つ以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する７つ以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する８つ以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する８つ以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する９つ以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する９つ以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する１０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する１０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する１５以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する１５以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する２０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する２０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する２５以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する２５以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する３０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する３０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する３５以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する３５以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する４０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する４０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する５０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する５０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する６０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する６０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する７０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する７０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する８０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する８０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する９０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する９０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する１００以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する１００以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する１５０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する１５０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する２００以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する２００以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する２５０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する２５０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する３００以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する３００以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する３５０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する３５０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する４００以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する４００以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する４５０以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する４５０以上のサイレント変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する５００以上のサイレント変異を含む。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する５００以上のサイレント変異を含む。
【0059】
一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子の発現もコードされるタンパク質配列も変化させない、標的化された内在性配列に対する少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００のサイレント変異を含む。
【0060】
ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、１０００ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、９００ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、８００ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、７００ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、６００ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、５００ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、４００ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、３００ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、２５０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、２００ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、１７５ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、１５０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、１２５ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、１００ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、９９ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、９６ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、９３ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、９０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、８７ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、８４ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、８１ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、８０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、７８ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、７５ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、７２ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、７０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、６９ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、６６ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、６３ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、６０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、５７ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、５４ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、５１ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、５０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、４８ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、４５ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、４２ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、４０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、３９ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、３９ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、３３ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、３０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、２７ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、２４ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、２１ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、２０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、１８ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、１５ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、１２ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、１０ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、９ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、６ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、５ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、３ヌクレオチドごとに平均して少なくとも１つのサイレント変異を含む。
【0061】
本明細書で使用する場合、「機能変異」とは、標的ペプチドのアミノ酸配列または発現を変化させる変異を指す。機能変異は、「非同義変異」としても公知である。別の態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも２つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも３つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも４つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも５つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも６つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも７つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも８つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも９つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１０の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１１の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１２の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１３の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１４の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１５の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１６の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１７の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１８の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも１９の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも２０の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも２５の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも３０の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも４０の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された内在性配列に対する少なくとも５０の機能変異を含む。
【0062】
さらなる態様では、改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１つのアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも２つのアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも２つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも３つのアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも３つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも４つのアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも４つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも５つのアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも５つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも６つのアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも６つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも７つのアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも７つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも８つのアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも８つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも９つのアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも９つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１０のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１０の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１１のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１１の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１２のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１２の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１３のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１３の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１４のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１４の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１５のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１５の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１６のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１６の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１７のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１７の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１８のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１８の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも１９のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも１９の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも２０のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも２０の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも２５のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも２５の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも３０のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも３０の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも４０のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも４０の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも５０のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも５０の機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された色素体遺伝子のスプライシングに影響を及ぼす、標的化された内在性配列に対する少なくとも１つの機能変異を含む。一態様では、本明細書において提供される改変配列は、標的化された色素体遺伝子によってコードされるタンパク質の短縮をもたらす、標的化された内在性配列に対する少なくとも１つの機能変異を含む。
【0063】
ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、色素体遺伝子によってコードされるタンパク質における少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０のアミノ酸変化をコードする、標的化された内在性配列に対する少なくとも２つの機能変異を含む。
【0064】
ある態様では、改変配列は、色素体遺伝子イントロン配列の少なくとも一部分、またはその相補配列を含む。ある態様では、改変配列は、色素体遺伝子のスプライシングまたは発現を変化させる少なくとも１つの機能変異をイントロン配列に含む。改変配列はまた、内在性配列に対する改変配列の配列同一性を低下させるが、イントロン配列の機能は変化させない少なくとも１つの変異をイントロン配列に含む。さらなる態様では、改変配列は、色素体遺伝子のプロモーターもしくは調節配列の少なくとも一部分、またはその相補配列を含む。調節配列の非限定的な例としては、エンハンサー、５’－ＵＴＲ、イントロン領域、３’－ＵＴＲ、転写領域、及び他の機能配列領域が挙げられる。さらなる態様では、改変配列は、プロモーターの少なくとも一部分、またはその相補配列を含む。別の態様では、改変配列は、色素体遺伝子の発現を変化させる少なくとも１つの機能変異、または色素体遺伝子の発現を変化させない少なくとも１つの変異を含む。改変配列はまた、内在性配列に対する改変配列の配列同一性を低下させるが、プロモーターまたは調節配列の機能は変化させない少なくとも１つの変異をプロモーターまたは調節配列に含む。ある態様では、改変配列は、色素体遺伝子エクソン配列の少なくとも一部分、またはその相補配列を含む。ある態様では、改変配列は、色素体遺伝子のスプライシングまたは発現を変化させる少なくとも１つの機能変異をエクソン配列に含む。改変配列はまた、内在性配列に対する改変配列の配列同一性を低下させるが、エクソン配列の機能は変化させない少なくとも１つの変異をエクソン配列に含む。
【0065】
ある態様では、本明細書において提供される改変配列は、配列番号１、３、８、または１０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。別の態様では、改変配列は、配列番号２、９、または１１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。
【0066】
色素体ゲノムは、典型的には、およそ３０～５０のＲＮＡ遺伝子及び最大２００のタンパク質コード遺伝子を含み、その多くは光合成に必要とされる。本明細書で使用する場合、「色素体遺伝子」とは、色素体ゲノムにおける任意のタンパク質コード配列を指す。一態様では、標的化された内在性配列は、色素体遺伝子の少なくとも一部分、または色素体遺伝子の少なくとも一部分と相補的な配列を含む。別の態様では、標的色素体配列は、色素体遺伝子のコード配列の少なくとも一部分、または色素体遺伝子のコード配列の少なくとも一部分と相補的な配列を含む。さらに別の態様では、本明細書において提供される標的色素体配列は、色素体遺伝子の発現または活性を変化させる少なくとも１つの機能変異を含む。
【0067】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」とは、機能単位（例えば、限定されないが、例えばタンパク質）を産生することができるポリヌクレオチドを指す。遺伝子は、プロモーター、エンハンサー配列、リーダー配列、転写開始部位、転写終結部位、ポリアデニル化部位、１つもしくは複数のエクソン、１つもしくは複数のイントロン、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。「遺伝子配列」は、プロモーター、エンハンサー配列、リーダー配列、転写開始部位、転写終結部位、ポリアデニル化部位、１つもしくは複数のエクソン、１つもしくは複数のイントロン、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、またはそれらの任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。一態様では、遺伝子は、ＲＮＡ分子またはその前駆体をコードする。別の態様では、遺伝子は、タンパク質をコードする。「コード配列」とは、タンパク質（例えば、エクソン配列）またはＲＮＡ分子をコードする配列である。
【0068】
ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はａｔｐＥである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＣである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＪである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ４である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ１４である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＺである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＤである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｅｔＮである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ２である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はａｔｐＩである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はａｔｐＨである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＩである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＫである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓａＩである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｃｅｍＡである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｅｔＡである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＪである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＬである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＦである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＥである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｅｔＬである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｅｔＧである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓａＪである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｌ３３である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ１８である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＴである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＮである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＨである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｅｔＢである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｅｔＤである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｏＡである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ１１である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｌ３６である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ８である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｌ１４である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ３である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ１９である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ１５である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＨである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＩである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＧである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＥである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓａＣである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｃｃｓＡである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｌ３２である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｙｃｆ１である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｌ２３である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＡである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｍａｔＫである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｂｃＬである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はａｔｐＢである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＫである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｙｃｆ３である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓａＡである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓａＢである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＣである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＭである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｏＢである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｏＣ１である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｏＣ２である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はａｔｐＦである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はａｔｐＡである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ１６である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はａｃｃＤである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｌ２０である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｃｌｐＰである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｐｓｂＢである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｌ１６である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｌ２である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＢである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｒｐｓ７である。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＡである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＤである。ある態様では、本明細書において提供される色素体遺伝子はｎｄｈＦである。さらなる態様では、色素体遺伝子は、ａｔｐＥ、ｎｄｈＣ、ｎｄｈＪ、ｒｐｓ４、ｒｐｓ１４、ｐｓｂＺ、ｐｓｂＤ、ｐｅｔＮ、ｒｐｓ２、ａｔｐＩ、ａｔｐＨ、ｐｓｂＩ、ｐｓｂＫ、ｐｓａＩ、ｃｅｍＡ、ｐｅｔＡ、ｐｓｂＪ、ｐｓｂＬ、ｐｓｂＦ、ｐｓｂＥ、ｐｅｔＬ、ｐｅｔＧ、ｐｓａＪ、ｒｐｌ３３、ｒｐｓ１８、ｐｓｂＴ、ｐｓｂＮ、ｐｓｂＨ、ｐｅｔＢ、ｐｅｔＤ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓ１１、ｒｐｌ３６、ｒｐｓ８、ｒｐｌ１４、ｒｐｓ３、ｒｐｓ１９、ｒｐｌ２３、ｒｐｓ１５、ｎｄｈＨ、ｎｄｈＩ、ｎｄｈＧ、ｎｄｈＥ、ｐｓａＣ、ｃｃｓＡ、ｒｐｌ３２、ｙｃｆ１、ｒｐｌ２３、ｐｓｂＡ、ｍａｔＫ、ｒｂｃＬ、ａｔｐＢ、ｎｄｈＫ、ｙｃｆ３、ｐｓａＡ、ｐｓａＢ、ｐｓｂＣ、ｐｓｂＭ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ１、ｒｐｏＣ２、ａｔｐＦ、ａｔｐＡ、ｒｐｓ１６、ａｃｃＤ、ｒｐｌ２０、ｃｌｐＰ、ｐｓｂＢ、ｒｐｌ１６、ｒｐｌ２、ｎｄｈＢ、ｒｐｓ７、ｎｄｈＡ、ｎｄｈＤ、ｎｄｈＦ、及びｒｐｌ２からなる群から選択される。
【0069】
ある態様では、標的色素体配列は、ａｔｐＥ、ｎｄｈＣ、ｎｄｈＪ、ｒｐｓ４、ｒｐｓ１４、ｐｓｂＺ、ｐｓｂＤ、ｐｅｔＮ、ｒｐｓ２、ａｔｐＩ、ａｔｐＨ、ｐｓｂＩ、ｐｓｂＫ、ｐｓａＩ、ｃｅｍＡ、ｐｅｔＡ、ｐｓｂＪ、ｐｓｂＬ、ｐｓｂＦ、ｐｓｂＥ、ｐｅｔＬ、ｐｅｔＧ、ｐｓａＪ、ｒｐｌ３３、ｒｐｓ１８、ｐｓｂＴ、ｐｓｂＮ、ｐｓｂＨ、ｐｅｔＢ、ｐｅｔＤ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓ１１、ｒｐｌ３６、ｒｐｓ８、ｒｐｌ１４、ｒｐｓ３、ｒｐｓ１９、ｒｐｌ２３、ｒｐｓ１５、ｎｄｈＨ、ｎｄｈＩ、ｎｄｈＧ、ｎｄｈＥ、ｐｓａＣ、ｃｃｓＡ、ｒｐｌ３２、ｙｃｆ１、ｒｐｌ２３、ｐｓｂＡ、ｍａｔＫ、ｒｂｃＬ、ａｔｐＢ、ｎｄｈＫ、ｙｃｆ３、ｐｓａＡ、ｐｓａＢ、ｐｓｂＣ、ｐｓｂＭ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ１、ｒｐｏＣ２、ａｔｐＦ、ａｔｐＡ、ｒｐｓ１６、ａｃｃＤ、ｒｐｌ２０、ｃｌｐＰ、ｐｓｂＢ、ｒｐｌ１６、ｒｐｌ２、ｎｄｈＢ、ｒｐｓ７、ｎｄｈＡ、ｎｄｈＤ、ｎｄｈＦ、及びｒｐｌ２からなる群から選択される色素体遺伝子の配列または配列の一部分を含む。
【0070】
ある態様では、第１の相同セグメントは、ａｔｐＥ、ｎｄｈＣ、ｎｄｈＪ、ｒｐｓ４、ｒｐｓ１４、ｐｓｂＺ、ｐｓｂＤ、ｐｅｔＮ、ｒｐｓ２、ａｔｐＩ、ａｔｐＨ、ｐｓｂＩ、ｐｓｂＫ、ｐｓａＩ、ｃｅｍＡ、ｐｅｔＡ、ｐｓｂＪ、ｐｓｂＬ、ｐｓｂＦ、ｐｓｂＥ、ｐｅｔＬ、ｐｅｔＧ、ｐｓａＪ、ｒｐｌ３３、ｒｐｓ１８、ｐｓｂＴ、ｐｓｂＮ、ｐｓｂＨ、ｐｅｔＢ、ｐｅｔＤ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓ１１、ｒｐｌ３６、ｒｐｓ８、ｒｐｌ１４、ｒｐｓ３、ｒｐｓ１９、ｒｐｌ２３、ｒｐｓ１５、ｎｄｈＨ、ｎｄｈＩ、ｎｄｈＧ、ｎｄｈＥ、ｐｓａＣ、ｃｃｓＡ、ｒｐｌ３２、ｙｃｆ１、ｒｐｌ２３、ｐｓｂＡ、ｍａｔＫ、ｒｂｃＬ、ａｔｐＢ、ｎｄｈＫ、ｙｃｆ３、ｐｓａＡ、ｐｓａＢ、ｐｓｂＣ、ｐｓｂＭ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ１、ｒｐｏＣ２、ａｔｐＦ、ａｔｐＡ、ｒｐｓ１６、ａｃｃＤ、ｒｐｌ２０、ｃｌｐＰ、ｐｓｂＢ、ｒｐｌ１６、ｒｐｌ２、ｎｄｈＢ、ｒｐｓ７、ｎｄｈＡ、ｎｄｈＤ、ｎｄｈＦ、及びｒｐｌ２からなる群から選択される色素体遺伝子の配列または配列の一部分を含む。
【0071】
ある態様では、第２の相同セグメントは、ａｔｐＥ、ｎｄｈＣ、ｎｄｈＪ、ｒｐｓ４、ｒｐｓ１４、ｐｓｂＺ、ｐｓｂＤ、ｐｅｔＮ、ｒｐｓ２、ａｔｐＩ、ａｔｐＨ、ｐｓｂＩ、ｐｓｂＫ、ｐｓａＩ、ｃｅｍＡ、ｐｅｔＡ、ｐｓｂＪ、ｐｓｂＬ、ｐｓｂＦ、ｐｓｂＥ、ｐｅｔＬ、ｐｅｔＧ、ｐｓａＪ、ｒｐｌ３３、ｒｐｓ１８、ｐｓｂＴ、ｐｓｂＮ、ｐｓｂＨ、ｐｅｔＢ、ｐｅｔＤ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓ１１、ｒｐｌ３６、ｒｐｓ８、ｒｐｌ１４、ｒｐｓ３、ｒｐｓ１９、ｒｐｌ２３、ｒｐｓ１５、ｎｄｈＨ、ｎｄｈＩ、ｎｄｈＧ、ｎｄｈＥ、ｐｓａＣ、ｃｃｓＡ、ｒｐｌ３２、ｙｃｆ１、ｒｐｌ２３、ｐｓｂＡ、ｍａｔＫ、ｒｂｃＬ、ａｔｐＢ、ｎｄｈＫ、ｙｃｆ３、ｐｓａＡ、ｐｓａＢ、ｐｓｂＣ、ｐｓｂＭ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ１、ｒｐｏＣ２、ａｔｐＦ、ａｔｐＡ、ｒｐｓ１６、ａｃｃＤ、ｒｐｌ２０、ｃｌｐＰ、ｐｓｂＢ、ｒｐｌ１６、ｒｐｌ２、ｎｄｈＢ、ｒｐｓ７、ｎｄｈＡ、ｎｄｈＤ、ｎｄｈＦ、及びｒｐｌ２からなる群から選択される色素体遺伝子の配列または配列の一部分を含む。
【0072】
一態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも２５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも３０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも３５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも４０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも４５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも６０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも７０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも８０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも９０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも１００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも１２５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも１５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも２００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも２５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも３００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも３５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも４００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも４５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも５００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも７５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも１０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも１５００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも２０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも３０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも４０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、色素体ゲノムセグメントは、少なくとも５０００ヌクレオチド長を含む。ある態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムセグメントは、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、または少なくとも５０００ヌクレオチド長を含む。
【0073】
本明細書で使用する場合、「相同配列」または「相同アーム」とは、未改変または内在性色素体ゲノム配列との相同組換えを受けることができる任意の配列を指す。組換えＤＮＡ分子は、色素体内の特定の標的部位または座位における相同組換えのために少なくとも２つの相同配列を含み得る。相同配列は、色素体またはプラストミックＤＮＡ分子またはゲノムへの組み入れのために、配列（複数可）の両側に位置する。組換えＤＮＡ分子は、改変配列と隣接する第１の相同配列及び第２の相同配列を含み得る。これらの相同配列のそれぞれは、典型的には、最大約５キロベース（ｋｂ）、例えば約０．１ｋｂ～約５ｋｂ長（すなわち、約１００～約５０００ヌクレオチド長）の範囲、または約０．５ｋｂ～約２ｋｂ長の範囲、または約１ｋｂ～約１．５ｋｂ長の範囲の塩基対（ｂｐ）長を有し得る。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される相同配列は、対応する内在性色素体ゲノム配列と１００％相同性またはそれと完全に相同であり得る。
【0074】
一態様では、第１の相同配列は、少なくとも５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、第１の相同配列は、少なくとも１０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、第１の相同配列は、少なくとも１５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、第１の相同配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、第１の相同配列は、少なくとも２５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、第１の相同配列は、少なくとも３０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、第１の相同配列は、少なくとも３５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、第１の相同配列は、少なくとも４０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも４５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも６０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも７０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも８０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも９０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも１００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも１２５ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも１５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも２００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも２５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも３００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも３５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも４００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも４５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも５００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも７５０ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも１０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも１５００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも２０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも３０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも４０００ヌクレオチド長を含む。別の態様では、相同配列は、少なくとも５０００ヌクレオチド長を含む。
【0075】
別の態様では、本開示は、５’から３’の順に、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同な第１の相同配列、内在性標的配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する改変配列、及び第２の内在性色素体ゲノム配列と相同な第２の相同配列を含む組換え核酸分子であって、標的色素体配列が、植物細胞の色素体ゲノムにおいて、第１の色素体ゲノムセグメントと第２の色素体ゲノムセグメントとの間に位置する、組換え核酸分子を提供する。
【0076】
別の態様では、本開示は、５’から３’の順に、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同な第１の相同配列、内在性標的配列に対して３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満の同一性を有する改変配列、及び第２の内在性色素体ゲノム配列と相同な第２の相同配列を含む組換え核酸分子であって、標的色素体配列が、植物細胞の色素体ゲノムにおいて、第１の色素体ゲノムセグメントと第２の色素体ゲノムセグメントとの間に位置する、組換え核酸分子を提供する。
【0077】
２つ以上のヌクレオチドまたはタンパク質配列との関連において本明細書で使用される「同一性パーセント」または「パーセント同一」という用語は、（ｉ）２つの最適にアラインメントされた配列（ヌクレオチドまたはタンパク質）を比較ウィンドウにわたって比較し、（ｉｉ）両方の配列において同一の核酸塩基（ヌクレオチド配列の場合）またはアミノ酸残基（タンパク質の場合）が生じている位置の数を決定して、一致した位置の数を取得し、（ｉｉｉ）一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、次いで（ｉｖ）この商に１００％を掛けて同一性パーセントを取得することによって算出される。「同一性パーセント」が、特定の比較ウィンドウを指定せずに参照配列に対して算出される場合、同一性パーセントは、アラインメントの領域にわたる一致した位置の数を参照配列の全長で割ることによって決定される。したがって、本出願の目的において、２つの配列（クエリ及びサブジェクト）が最適にアラインメントされる（それらのアラインメントにおけるギャップを許容する）場合、クエリ配列に対する「同一性パーセント」は、２つの配列間で同一の位置の数を、クエリ配列における、その長さ（または比較ウィンドウ）にわたる位置の総数で割り、次いでそれに１００％を掛けたものに等しい。配列同一性の百分率がタンパク質に関して使用される場合、同一ではない残基位置は、アミノ酸残基が類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって分子の機能特性を変化させない保存的アミノ酸置換によって異なっている場合が多いと認識される。配列が保存的置換において異なっている場合、配列同一性パーセントは、上方調整して、置換の保存的性質を補正してもよい。そのような保存的置換によって異なっている配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。
【0078】
配列の同一性パーセントを算出する配列の最適なアラインメントに関して、２つ以上のヌクレオチドまたはタンパク質配列間の配列同一性または類似性を比較するために使用することができる、様々なペアワイズまたはマルチプル配列アラインメントアルゴリズム及びプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌＷまたはＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（登録商標）（ＢＬＡＳＴ）などが当技術分野で公知である。他のアラインメント及び比較方法が当技術分野で公知であるが、２つの配列間のアラインメント及び同一性パーセント（上に記載した同一性パーセント範囲を含む）は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムによって決定されるように決定され得る。例えば、その内容及び開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎｎａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，”Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃｌｕｓｔａｌ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：３４９７－３５００（２００３）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３－４６８０（１９９４）、Ｌａｒｋｉｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０，”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：２９４７－４８（２００７）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）”Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）を参照されたい。
【0079】
本明細書で使用する場合、「本質的に同一」な配列とは、第２の配列と少なくとも９５％同一の配列を指す。一部の実施形態では、本質的に同一な配列は、第２の配列と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【0080】
ある態様では、本明細書において提供される組換え核酸分子は、選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、組換え核酸分子において、例えば第１の相同配列または第２の相同配列の間に位置し得る。植物選択マーカー遺伝子または導入遺伝子としては、植物選択マーカー導入遺伝子により形質転換された植物細胞が、選択剤によって課される選択圧に耐性となり、耐えられるようになるような、対応する選択剤に対する耐性を付与する任意の遺伝子を挙げることができる。結果として、改変プラストミック細胞は、選択下での成長、増殖、発育などに好ましい。当技術分野で公知の有用な植物選択マーカー遺伝子としては、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシン（例えば、ａａｄＡ、ｓｐｅｃ／ｓｔｒｅｐ）、カナマイシン（例えば、ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンＢ（例えば、ａｐｈ ＩＶ）、ゲンタマイシン（例えば、ａａｃ３及びａａｃＣ４）、及びクロラムフェニコール（例えば、ＣＡＴ）に対する抵抗性または耐性を付与するタンパク質をコードするものを挙げることができる。除草剤または他の選択剤に対する抵抗性または耐性を付与するタンパク質をコードする公知の植物選択マーカー遺伝子のさらなる例。例えば、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼをコードする転写可能ＤＮＡ分子（ＥＰＳＰＳ、グリホサート耐性用；例えば、これらの全てが参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，６２７，０６１号、同第５，６３３，４３５号、同第６，０４０，４９７号、及び同第５，０９４，９４５号に記載）；グリホサートオキシドレダクターゼ及びグリホサート－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードする転写可能ＤＮＡ分子（ＧＯＸ；例えば、米国特許第５，４６３，１７５号に記載；ＧＡＴ、米国特許公開第２００３００８３４８０号に記載）；フィトエンデサチュラーゼをコードする転写可能ＤＮＡ分子（ｃｒｔＩ；例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＭｉｓａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，４：８３３－８４０（１９９３）及びＭｉｓａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，６：４８１－４８９（１９９４）に記載、ノルフルラゾン耐性用）；ならびにｂａｒ遺伝子（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＤｅＢｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，６：２５１３－２５１９（１９８７）に記載、グルホシネート及びビアラホス耐性用）。例えば、その内容及び開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｂｏｃｋ，Ｒ．，”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｌａｓｔｉｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｏｏｌｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，６６：３．１－３．３１（２０１５）、及びＺｉｅｍｉｅｎｏｗｉｃｚ，Ａ．，”Ｐｌａｎｔ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅｓ，”Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａｅ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２３（３）：３６３－３７４（２００１）もまた参照されたい。
【0081】
本明細書で使用する場合、「ターミネーター配列」とは、転写中の遺伝子の終端を示す任意の核酸配列を指す。ある態様では、本明細書において提供される組換え核酸分子は、ターミネーター配列を含む。別の態様では、本明細書において提供される組換え核酸分子は、ターミネーター配列を含み、ターミネーター配列は、組換え核酸分子において、改変配列と第１の相同配列または第２の相同配列のいずれかとの間に位置する。さらなる態様では、組換え核酸分子は、選択マーカー遺伝子とターミネーター配列の両方を含む。さらなる態様では、組換え核酸分子は、ターミネーター配列を含み、ターミネーター配列は、組換え核酸分子において、改変配列と選択マーカー遺伝子との間に位置する。ある態様では、本明細書において提供されるターミネーター配列は、色素体ゲノムと異種である。別の態様では、本明細書において提供されるターミネーター配列は、植物細胞と異種である。「異種」という用語は、２つ以上のＤＮＡ分子または配列の組み合わせが人工的であり、天然には通常見出されない場合における、そのような組み合わせ、例えば、プロモーターと、関連する転写可能なＤＮＡの配列、コード配列または遺伝子との組み合わせを指すことがある。
【0082】
ある態様では、本明細書において提供される組換え核酸分子は、プロモーター配列を含み、プロモーター配列は、組換え核酸分子において、改変配列と第１の相同配列または第２の相同配列のいずれかとの間に位置する。「プロモーター」とは、本明細書で使用する場合、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び／または転写開始部位を含有し、関連する転写可能ポリヌクレオチド配列及び／または遺伝子（もしくは導入遺伝子）の転写及び発現を支援または促進するＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、公知の、もしくは天然に存在するプロモーター配列または他のプロモーター配列から合成により作製しても、そこから変更しても、それに由来してもよい。プロモーターとしては、２つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターも挙げることができる。したがって、本出願のプロモーターとしては、公知であるかまたは本明細書において提供される他のプロモーター配列（複数可）と組成の点では類似しているが、同一ではない、プロモーター配列のバリアントを挙げることができる。プロモーターは、プロモーターに作動可能に連結している関連するコードまたは転写可能配列または遺伝子（導入遺伝子を含む）の発現パターンに関する様々な基準に従って、例えば、構成的、発生、組織特異的、誘導性などに分類することができる。植物の全てのまたは大半の組織において発現を駆動するプロモーターは「構成的」プロモーターと称される。発生のある特定の期間または段階中に発現を駆動するプロモーターは、「発生」プロモーターと称される。生物のある特定の組織において、その生物の他の組織と比べて増強した発現を駆動するプロモーターは、「組織優先（ｔｉｓｓｕｅ－ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）」プロモーターと称される。したがって、「組織優先」プロモーターは、植物の特定の組織（複数可）においては比較的高いかまたは優先的な発現を引き起こすが、その植物の他の組織（複数可）における発現のレベルはより低くなる。生物の特定の組織（複数可）内で発現し、他の組織ではほとんどまたは全く発現しないプロモーターは、「組織特異的」プロモーターと称される。「誘導性」プロモーターとは、環境刺激、例えば、熱、冷気、渇水、光、または他の刺激、例えば創傷もしくは化学物質の適用に応答して転写を開始するプロモーターである。プロモーターは、例えば、異種、同種、キメラ、合成など、その起源の点で分類することもできる。
【0083】
一態様では、本明細書において提供される組換え核酸分子は、１つまたは複数のプロモーター配列を含む。別の態様では、本明細書において提供される組換え核酸分子は、少なくとも２つのプロモーター配列を含む。別の態様では、本明細書において提供される組換え核酸分子は、少なくとも３つのプロモーター配列を含む。ある態様では、本明細書において提供される組換え核酸分子は、プロモーター配列及びターミネーター配列を含む。ある態様では、本明細書において提供される組換え核酸分子は、プロモーター配列及び選択マーカー遺伝子を含む。ある態様では、本明細書において提供される組換え核酸分子は、プロモーター配列、選択マーカー遺伝子、及びターミネーター配列を含む。一態様では、本明細書において提供されるプロモーターは、色素体ゲノムと異種である。別の態様では、本明細書において提供されるプロモーターは、植物細胞と異種である。ある態様では、本明細書において提供されるプロモーターは、構成的プロモーターである。別の態様では、本明細書において提供されるプロモーターは、組織優先プロモーターである。ある態様では、本明細書において提供されるプロモーターは、組織特異的プロモーターである。さらなる態様では、本明細書において提供されるプロモーターは、誘導性プロモーターである。別の態様では、本明細書において提供されるプロモーターは、キメラプロモーターである。さらに別の態様では、本明細書において提供されるプロモーターは、色素体遺伝子の未改変プロモーター配列である。さらに別の態様では、本明細書において提供されるプロモーターは、植物細胞における色素体遺伝子の未改変プロモーター配列である。ある態様では、本明細書において提供されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、及び誘導性プロモーターからなる群から選択される。
【0084】
組換えＤＮＡ分子は、トランスプラストミック植物（複数可）の首尾よい作製及び／または確認後、とりわけ導入遺伝子または発現カセットがもはや必要ではなくなった後に、１つまたは複数の導入遺伝子または発現カセット、例えば、植物選択マーカー導入遺伝子またはその任意の部分もしくは配列を除去するための配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、これは、除去される配列を、内在性であるかまたは外因的に提供されるリコンビナーゼ酵素（例えば、Ｃｒｅ、Ｆｌｐなど）によって認識及び除去することができる、後に発生する公知の組換え部位（例えば、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位など）と隣接させることによって達成することができる。リコンビナーゼ酵素は、導入遺伝子の切り出しを達成するために、例えば、トランスプラストミック植物を、リコンビナーゼ導入遺伝子を有する別の植物と交配させることによってトランスで導入及び発現させることができる。したがって、望まれない配列エレメントまたは導入遺伝子は、その使用または目的が終了したら除去することができ、したがって、生殖系列におけるそれのさらなる発現または伝達を防止することができる。
【0085】
ＩＩＩ．色素体形質転換のための方法
複数の実施形態は、少なくとも１個の植物細胞において、色素体形質転換を介して色素体ゲノムにおける１つまたは複数の内在性標的配列を改変配列に置き換える方法を提供する。色素体とは、植物、藻類、及び一部の原生動物種に見出される、環状二本鎖ゲノムを含む細胞小器官である。色素体は、その機能に応じて種々の形態に分化することができる。本明細書で使用する場合、「原色素体」とは、未分化色素体を指す。原色素体は、エチオプラスト、葉緑体、及び白色体に分化することができる。エチオプラストは、葉緑体に分化することができる。葉緑体は、有色体に分化することができる。白色体は、アミロプラスト、エライオプラスト、及びプロテイノプラストに分化することができる。多くの場合、逆分化もまた可能である（例えば、葉緑体はエチオプラストに分化する）。
複数の実施形態は、少なくとも１個の植物細胞において、色素体形質転換を介して色素体ゲノムにおける１つまたは複数の内在性標的配列を改変配列に置き換える方法を提供する。色素体とは、植物、藻類、及び一部の原生動物種に見出される、環状二本鎖ゲノムを含む細胞小器官である。色素体は、その機能に応じて種々の形態に分化することができる。本明細書で使用する場合、「原色素体」とは、未分化色素体を指す。原色素体は、エチオプラスト、葉緑体、及び白色体に分化することができる。エチオプラストは、葉緑体に分化することができる。葉緑体は、有色体に分化することができる。白色体は、アミロプラスト、エライオプラスト、及びプロテイノプラストに分化することができる。多くの場合、逆分化もまた可能である（例えば、葉緑体はエチオプラストに分化する）。
【0086】
限定されないが、色素体は、光合成を行うこと（例えば、葉緑体）、色素を合成及び貯蔵すること（例えば、有色体）、光合成装置を分解すること（例えば、ゲロントプラスト）、モノテルペン合成（例えば、白色体）、デンプン貯蔵（例えば、アミロプラスト）、脂肪貯蔵（例えば、エライオプラスト）、タンパク質の貯蔵及び改変（例えば、プロテイノプラスト）、タンニン及びポリフェノールを合成すること（例えば、タンノソーム（ｔａｎｎｏｓｏｍｅ））、重力検出、アミノ酸合成、ヌクレオチド合成、脂肪酸合成、植物ホルモン合成、ビタミン合成、硫黄同化、ならびに窒素同化を含む多数の機能を行うことが公知である。
【0087】
ある態様では、本明細書において提供される色素体は、原色素体である。別の態様では、本明細書において提供される色素体は、エチオプラストである。一態様では、本明細書において提供される色素体は、葉緑体である。別の態様では、本明細書において提供される色素体は、有色体である。別の態様では、本明細書において提供される色素体は、ゲロントプラストである。ある態様では、本明細書において提供される色素体は、白色体である。さらなる態様では、本明細書において提供される色素体は、アミロプラストである。別の態様では、本明細書において提供される色素体は、エライオプラストである。ある態様では、本明細書において提供される色素体は、プロテイノプラストである。さらなる態様では、本明細書において提供される色素体は、タンノソームである。別の態様では、本明細書において提供される色素体は、原色素体、エチオプラスト、葉緑体、有色体、ゲロントプラスト、白色体、アミロプラスト、エライオプラスト、プロテイノプラスト、及びタンノソームからなる群から選択される。
【0088】
ある態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、原色素体ゲノムである。別の態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、エチオプラストゲノムである。ある態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、葉緑体ゲノムである。別の態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、有色体ゲノムである。別の態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、ゲロントプラストゲノムである。ある態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、白色体ゲノムである。さらなる態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、アミロプラストゲノムである。別の態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、エライオプラストゲノムである。ある態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、プロテイノプラストゲノムである。さらなる態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、タンノソームゲノムである。別の態様では、本明細書において提供される色素体ゲノムは、原色素体ゲノム、エチオプラストゲノム、葉緑体ゲノム、有色体ゲノム、ゲロントプラストゲノム、白色体ゲノム、アミロプラストゲノム、エライオプラストゲノム、プロテイノプラストゲノム、及びタンノソームゲノムからなる群から選択される。
【0089】
色素体ゲノムは、約１４０キロベース（ｋｂ）～約２１８ｋｂの範囲のサイズである。例えば、トウモロコシ色素体ゲノムは約１４０ｋｂであり、ダイズ色素体ゲノムは約１５２ｋｂであり、ワタ色素体ゲノムは約１６０ｋｂである。８００超の色素体ゲノムが配列決定されており、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎの細胞小器官ゲノムデータベースからオンラインで入手可能である。共にその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｄａｎｉｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：１３４、及びｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｏｒｇａｎｅｌｌｅを参照されたい。植物色素体ゲノムの編成は高度に保存されており、大半の植物色素体ゲノムは、大きな単一コピー領域と小さな単一コピー領域とを分離する２つの同一コピーの２０ｋｂ～３０ｋｂの逆向き反復配列を有する。
【0090】
一態様では、提供される方法は、標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含まない対照構築物よりも高い頻度の、植物細胞の色素体ゲノムへの改変配列の形質転換を可能にする。ある態様では、本明細書において提供される方法は、色素体ゲノムに改変配列を有する形質転換植物細胞を選択することを含む。別の態様では、本明細書において提供される方法は、色素体ゲノムに改変配列を有する形質転換植物細胞から形質転換植物を発生または再生することを含む。さらに別の態様では、本明細書において提供される方法は、形質転換植物の少なくとも１個の細胞の色素体ゲノムに改変配列を有する形質転換植物を選択することを含む。さらなる態様では、本明細書において提供される選択する方法は、植物細胞の色素体ゲノムにおける改変配列の存在を、分子技法を介して検出することを含む。さらなる態様では、本明細書において提供される方法は、植物細胞の色素体ゲノムにおける改変配列の存在を、分子技法を介して検出することを含む。ある態様では、本明細書において提供される方法は、植物の色素体ゲノムにおける改変配列の存在を、分子技法を介して検出することを含む。別の態様では、本明細書において提供される選択する方法は、植物の色素体ゲノムにおける改変配列の存在を、分子技法を介して検出することを含む。
【0091】
ある態様では、本明細書において提供される方法は、選択剤を用いて形質転換植物を処理することと、形質転換植物の選択剤に対する抵抗性または耐性に基づいて選択することとを含む。別の態様では、本明細書において提供される方法は、選択剤を用いて形質転換植物細胞を処理することと、形質転換植物細胞の選択剤に対する抵抗性または耐性に基づいて選択することとを含む。ある態様では、本明細書において提供される方法は、選択剤に対する抵抗性または耐性をもたらす選択マーカー遺伝子を含む組換え核酸分子を含み、ここで、形質転換植物は、選択マーカー遺伝子を形質転換植物の色素体ゲノムに有し、選択するステップは、選択剤を用いて形質転換植物を処理することと、形質転換植物の選択剤に対する抵抗性または耐性に基づいて選択することとを含む。ある態様では、本明細書において提供される選択するステップを含む方法は、形質転換植物を、形質転換植物の色素体ゲノムにおける改変配列によって引き起こされた表現型変化に基づいて選択することを含む。表現型変化の非限定的な例としては、葉色の変化（例えば、緑色の葉ではなく白色の葉）、デンプン産生または貯蔵の変化、糖産生または貯蔵の変化、光合成速度の変化が挙げられる。
【0092】
本明細書で使用する場合、「分子技法」とは、核酸、タンパク質、または脂質の使用、操作または解析を伴う、分子生物学、生化学、遺伝子学、植物生物学、または生物物理学の分野で公知の任意の方法を指す。限定されないが、色素体ゲノムにおける改変配列の存在を検出するのに有用な分子技法としては、表現型スクリーニング；ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＩｌｌｕｍｉｎａ／Ｉｎｆｉｎｉｕｍ技術による一塩基多型（ＳＮＰ）解析などの分子マーカー技術；サザンブロット；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；及び配列決定（例えば、サンガー、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、４５４、Ｐａｃ－Ｂｉｏ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標））が挙げられる。一態様では、本明細書において提供される検出方法は、表現型スクリーニングを含む。別の態様では、本明細書において提供される検出方法は、ＳＮＰ解析を含む。さらなる態様では、本明細書において提供される検出方法は、サザンブロットを含む。さらなる態様では、本明細書において提供される検出方法は、ＰＣＲを含む。ある態様では、本明細書において提供される検出方法は、ＥＬＩＳＡを含む。さらなる態様では、本明細書において提供される検出方法は、核酸またはタンパク質の配列を決定することを含む。限定されないが、核酸は、ハイブリダイゼーションを使用して検出することができる。核酸間のハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）において詳細に論じられている。
【0093】
核酸は、当技術分野で慣例的な技法を使用して単離することができる。例えば、核酸は、限定されないが、組換え核酸技術及び／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む任意の方法を使用して単離することができる。一般的なＰＣＲ技法は、例えばＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。組換え核酸技法は、例えば、制限酵素消化及びライゲーションを含み、これを使用して核酸を単離することができる。単離された核酸は、単一核酸分子または一連のオリゴヌクレオチドのいずれかとして、化学的に合成することもできる。ポリペプチドは、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの公知の方法によって、天然源（例えば、生体試料）から精製することができる。ポリペプチドは、例えば発現ベクターにおいて核酸を発現させることによって精製することもできる。さらに、精製されたポリペプチドは、化学合成によって得ることができる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析を使用して測定することができる。
【0094】
本明細書で使用する場合、核酸分子との関連における「相補的」という用語は、ヌクレオチド塩基の対合を指し、それゆえ、ＡはＴ（またはＵ）と相補的であり、ＧはＣと相補的である。２つの相補的な核酸分子は、互いにハイブリダイズすることができる。非限定的な例として、二本鎖ＤＮＡの２本の鎖（例えば、センス及びアンチセンス）は互いに相補的である。
【0095】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸の鎖を指す。ポリペプチドは、本明細書において提供されるポリヌクレオチドによってコードされ得る。ポリペプチドの一例はタンパク質である。本明細書において提供されるタンパク質は、本明細書において提供される核酸分子によってコードされ得る。
【0096】
ポリペプチドは、抗体を使用して検出することができる。抗体を使用してポリペプチドを検出するための技法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光が挙げられる。本明細書において提供される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本明細書において提供されるポリペプチドに対して特異的な結合親和性を有する抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。本明細書において提供される抗体は、当技術分野で公知の方法を使用してマイクロタイタープレートなどの固体支持体に結合させることができる。
【0097】
一態様では、改変色素体ゲノム配列を検出するための方法であって、本明細書に記載される改変配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して、改変色素体ゲノム配列を検出することを含む、方法が提供される。ある態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＣＲプライマーである。ある態様では、ＰＣＲプライマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ連鎖反応中のＤＮＡ合成の出発点として機能する。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列の少なくとも１つのサイレント変異にハイブリダイズすることができる。ある態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、フルオロフォアを含む。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、ロックド核酸を含む。さらなる態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、放射性同位元素を含む。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、エピトープを含む。さらに別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、ビオチンを含む。
【0098】
ある態様では、本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドプローブは、本明細書において提供される配列番号１２～１７と少なくとも７０％同一もしくは相補的、少なくとも７５％同一もしくは相補的、少なくとも８０％同一もしくは相補的、少なくとも８５％同一もしくは相補的、少なくとも９０％同一もしくは相補的、少なくとも９５％同一もしくは相補的、少なくとも９７％同一もしくは相補的、少なくとも９９％同一もしくは相補的、または１００％同一もしくは相補的な配列を含む。
【0099】
別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列の少なくとも２つのサイレント変異にハイブリダイズすることができる。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列の少なくとも３つのサイレント変異にハイブリダイズすることができる。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列の少なくとも４つのサイレント変異にハイブリダイズすることができる。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列の少なくとも５つのサイレント変異にハイブリダイズすることができる。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列の少なくとも６つのサイレント変異にハイブリダイズすることができる。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列の少なくとも７つのサイレント変異にハイブリダイズすることができる。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列の少なくとも８つのサイレント変異にハイブリダイズすることができる。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列の少なくとも９つのサイレント変異にハイブリダイズすることができる。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列の少なくとも１０のサイレント変異にハイブリダイズすることができる。さらなる態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列及び第１の色素体ゲノムセグメントにハイブリダイズすることができる。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、改変配列及び第２の色素体ゲノムセグメントにハイブリダイズすることができる。
【0100】
本明細書において提供される方法は、色素体ゲノムＤＮＡ（すなわち、「プラストーム」）における標的化された内在性配列の、組換えＤＮＡ分子由来の標的化された配列の改変形態への部位特異的置き換えを達成するために相同組換えを用いる。上に記載したように、組換えＤＮＡ分子は、概して、標的配列の改変形態と隣接する２つのアーム領域を含み得、２つのアーム領域のそれぞれは、それぞれの標的色素体ゲノム配列と相同であり、色素体ゲノムの標的部位での内在性配列の組換え及び置き換えを駆動する。相同組換えを介した植物細胞の色素体ゲノムへの部位特異的組み入れは、核ゲノム全体にわたる種々の位置に導入遺伝子挿入を有する核形質転換事象と一般的に関連する事象のばらつきを低減する。結果として、色素体における発現レベルは、（その挿入部位に応じてばらつきのある予測不能なレベルの発現を示す核形質転換事象と異なり）同じ品質のトランスプラストミック事象間で概ね一貫するはずである。そのような一貫した予測可能な発現は、トランスプラストミック事象を引き起こすための開発コストを低減する。
【0101】
植物細胞を形質転換する方法は当業者によって周知である。例えば、組換えＤＮＡをコーティングした粒子を用いる粒子銃（例えば、遺伝子銃形質転換）によって植物細胞を形質転換するための具体的な指示は、米国特許第５，０１５，５８０号（ダイズ）；同第５，５５０，３１８号（トウモロコシ）；同第５，５３８，８８０号（トウモロコシ）；同第５，９１４，４５１号（ダイズ）；同第６，１６０，２０８号（トウモロコシ）；同第６，３９９，８６１号（トウモロコシ）及び同第６，１５３，８１２号（コムギ）；同第６，００２，０７０号（イネ）；同第７，１２２，７２２号（ワタ）；同第６，０５１，７５６号（Ｂｒａｓｓｉｃａ）；同第６，２９７，０５６号（Ｂｒａｓｓｉｃａ）；米国特許公開第２００４／０１２３３４２号（サトウキビ）に見出される。他の植物を形質転換するための方法は、例えば、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃｒｏｐ Ｐｌａｎｔｓ（２００９）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに見出すことができる。遺伝子銃形質転換及びＰＥＧ媒介形質転換技法を使用する色素体ゲノムの形質転換に特異的な方法もまた当技術分野で公知である。例えば、Ｖｅｒｍａｎｄ Ｄａｎｉｅｌｌ，２００７，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１４５：１１２９－１１４３、Ｄａｎｉｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：８８－９２、Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：４８３－５０９、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，３：７２９－７３８、及びＧｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：９５－９７（これらは全て、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。当業者に公知のいかなる適切な方法も、本明細書において提供される核酸分子のいずれかを用いて植物細胞を形質転換するために使用することができる。
【0102】
一態様では、本明細書において提供される方法は、植物細胞を安定に形質転換する。別の態様では、本明細書において提供される方法は、植物細胞を一過性に形質転換する。ある態様では、植物細胞を形質転換する方法は、遺伝子銃形質転換を含む。ある態様では、植物細胞を形質転換する方法は、ＰＥＧ媒介形質転換を含む。
【0103】
本明細書において提供される安定に組み入れられた核酸分子を含有するトランスプラストミック植物細胞及びトランスプラストミック植物をもたらす形質転換法は、好ましくは、培地における組織培養及び制御環境において実施される。
【0104】
一態様では、本開示は、生殖物質ではなく、植物の自然生殖を媒介しない植物細胞を提供する。別の態様では、本開示はまた、生殖物質であり、植物の自然生殖を媒介する植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、光合成を介して自らを維持することができない植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、植物体細胞を提供する。体細胞は、生殖細胞と異なり、植物の生殖を媒介しない。
【0105】
形質転換のレシピエント細胞標的としては、これらに限定されないが、種子細胞、果実細胞、葉細胞、子葉細胞、胚軸細胞、分裂組織細胞、胚細胞、胚乳細胞、根細胞、シュート細胞、幹細胞、莢細胞、花細胞、花房細胞、花柄細胞、小花柄細胞、花柱細胞、柱頭細胞、花托細胞、花弁細胞、萼片細胞、花粉細胞、葯細胞、花糸細胞、子房細胞、胚珠細胞、果皮細胞、師部細胞、出芽細胞、または維管束組織細胞が挙げられる。別の態様では、本開示は、色素体を含む細胞を提供する。別の態様では、本開示は、葉緑体を含む細胞を提供する。さらなる態様では、本開示は、表皮細胞、小孔細胞、トリコーム細胞、根毛細胞、貯蔵根細胞、または塊茎細胞を提供する。別の態様では、本開示は、プロトプラストを提供する。別の態様では、本開示は、植物カルス細胞を提供する。稔性植物が再生され得るいかなる細胞も、本開示の実施に有用なレシピエント細胞として企図される。カルスは、未熟胚または胚の一部、実生頂端分裂組織、及び小胞子などを含むがこれらに限定されない様々な組織源から開始させることができる。カルスとして増殖することができる細胞は、形質転換のレシピエント細胞として機能することができる。本開示のトランスジェニック植物を作製するための実際的な形質転換法及び材料（例えば、様々な培地及びレシピエント標的細胞、未熟胚の形質転換、ならびにその後の稔性トランスジェニック植物の再生）は、例えば、米国特許第６，１９４，６３６号及び同第６，２３２，５２６号、ならびに米国特許出願公開第２００４／０２１６１８９号に開示されている。
【0106】
形質転換または銃による打ち込みの後、植物組織を、選択剤を含有する１種または複数種の選択培地と接触させて、形質転換のために使用した組換えＤＮＡ分子由来の、色素体ゲノムに組み入れられた選択マーカー遺伝子の発現を有するトランスプラストミック細胞の生存、成長、増殖及び／または発生を付勢（ｂｉａｓ）してもよい。選択マーカー遺伝子は、概して、選択のために使用される選択剤と対合し、その結果、選択マーカー遺伝子は、選択剤による選択に対する耐性を付与する。一般的に使用される選択マーカー遺伝子としては、限定されないが、抗生物質、例えばカナマイシン及びパロモマイシン（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンＢ（ａｐｈ ＩＶ）、ストレプトマイシンもしくはスペクチノマイシン（ａａｄＡ）ならびにゲンタマイシン（ａａｃ３及びａａｃＣ４）に対する耐性もしくは抵抗性を付与するもの、または除草剤、例えばグルホシネート（ｂａｒまたはｐａｔ）、ジカンバ（ＤＭＯ）、及びグリホサート（ａｒｏＡまたはＥＰＳＰＳ）に対する耐性もしくは抵抗性を付与するものが挙げられる。形質転換体を視覚的にスクリーニングすることを可能にする選択マーカー遺伝子もまた使用することができる。非限定的な例としては、ルシフェラーゼもしくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または様々な発色基質が公知であるベータグルクロニダーゼを発現する遺伝子もしくはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）が挙げられる。
【0107】
本明細書に別段の定義がない限り、用語は、関連する技術分野の当業者による従来の用法に従って理解されるべきである。本明細書で使用される分子生物学に関連する用語の多くを記載している資料の例は、Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７、Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２、及びＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７に見出すことができる。米国特許法施行規則第１．８２２条に記載のＤＮＡ塩基の命名法が使用される。
【0108】
以下は本開示の非限定的かつ例示的な実施形態である。
【0109】
第１の実施形態は、色素体ゲノムを改変する方法であって、組換え核酸分子を植物細胞に導入することであって、前記組換え核酸分子が、５’から３’に向かって、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同な第１の相同配列、標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む改変配列、及び第２の内在性色素体ゲノム配列と相同な第２の相同配列を含み、前記標的色素体配列が、前記植物細胞の色素体ゲノムにおいて、前記第１の内在性色素体ゲノム配列と前記第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、前記導入することと、前記植物細胞の前記色素体ゲノムにおける前記標的色素体配列を前記改変配列に置き換えるような相同組換えを生じさせることとを含む、前記方法に関する。
【0110】
第２の実施形態は、前記改変配列が、前記標的色素体配列に対する少なくとも第２、第３、第４、第５、第６、第７、８つ、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、または第２０のサイレント変異を含む、実施形態１に記載の方法に関する。
【0111】
第３の実施形態は、前記改変配列が、前記標的色素体配列に対する少なくとも１つの機能変異を含む、実施形態１に記載の方法に関する。
【0112】
第４の実施形態は、前記改変配列が、前記標的色素体配列に対する少なくとも第２の機能変異を含む、実施形態３に記載の方法に関する。
【0113】
第５の実施形態は、前記改変配列が、前記標的色素体配列と少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、実施形態１に記載の方法に関する。
【0114】
第６の実施形態は、前記第１の相同配列が、前記第１の内在性色素体ゲノム配列と本質的に同一である、実施形態１に記載の方法に関する。
【0115】
第７の実施形態は、前記第２の相同配列が、前記第２の内在性色素体ゲノム配列と本質的に同一である、実施形態１に記載の方法に関する。
【0116】
第８の実施形態は、前記標的色素体配列が、色素体遺伝子の少なくとも一部分、または前記色素体遺伝子の少なくとも一部分と相補的な配列を含む、実施形態１に記載の方法に関する。
【0117】
第９の実施形態は、前記組換え核酸分子が、前記第１の相同配列と前記第２の相同配列との間に選択マーカー遺伝子をさらに含む、実施形態１に記載の方法に関する。
【0118】
第１０の実施形態は、前記選択マーカー遺伝子が、ｎｐｔＩＩ、ａｐｈ ＩＶ、ａａｄＡ、ａａｃ３、ａａｃＣ４、ｂａｒ、ｐａｔ、ＤＭＯ、ＥＰＳＰＳ、及びａｒｏＡからなる群から選択される、実施形態９に記載の方法に関する。
【0119】
第１１の実施形態は、前記組換え核酸分子が、前記第１の相同配列と前記第２の相同配列との間にターミネーター配列をさらに含む、実施形態１に記載の方法に関する。
【0120】
第１２の実施形態は、前記組換え核酸分子が、前記第１の相同配列と前記第２の相同配列との間にプロモーター配列をさらに含む、実施形態１に記載の方法に関する。
【0121】
第１３の実施形態は、前記植物細胞が単子葉植物細胞である、実施形態１に記載の方法に関する。
【0122】
第１４の実施形態は、前記単子葉植物細胞が、トウモロコシ細胞、イネ細胞、コムギ細胞、オオムギ細胞、またはサトウキビ細胞である、実施形態１３に記載の方法に関する。
【0123】
第１５の実施形態は、前記植物細胞が双子葉植物細胞である、実施形態１に記載の方法に関する。
【0124】
第１６の実施形態は、前記双子葉植物細胞が、ダイズ細胞、アルファルファ細胞、ワタ細胞、トマト細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞、またはキャノーラ細胞である、実施形態１５に記載の方法に関する。
【0125】
第１７の実施形態は、前記改変配列を含む形質転換植物細胞を選択するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法に関する。
【0126】
第１８の実施形態は、前記選択するステップが、前記形質転換植物細胞を分子技法に基づいて選択することを含む、実施形態１７に記載の方法に関する。
【0127】
第１９の実施形態は、前記選択するステップが、前記形質転換植物細胞を、前記形質転換植物細胞の前記色素体ゲノムにおける前記改変配列によって引き起こされた表現型変化に基づいて選択することを含む、実施形態１７に記載の方法に関する。
【0128】
第２０の実施形態は、前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生することをさらに含む、実施形態１に記載の方法に関する。
【0129】
第２１の実施形態は、植物細胞における標的色素体配列を置き換えるためのベクターであって、前記プラスミドベクターが、５’から３’の順に、第１の相同配列であって、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同である、前記第１の相同配列、改変配列であって、前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、前記改変配列、及び第２の相同配列であって、第２の内在性色素体ゲノム配列と相同である、前記第２の相同配列を含む組換え核酸分子を含み、前記標的色素体配列が、前記植物細胞の色素体ゲノムにおいて、前記第１の内在性色素体ゲノム配列と前記第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、前記ベクターに関する。
【0130】
第２２の実施形態は、色素体ゲノム中に改変配列を含む、実施形態１に記載の方法によって作製されるトランスジェニック植物細胞に関する。
【0131】
第２３の実施形態は、色素体ゲノムを改変する方法であって、組換え核酸分子を植物細胞に導入することであって、前記組換え核酸分子が、５’から３’に向かって、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同な第１の相同配列、１，０００ヌクレオチドごとに標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む改変配列、及び第２の内在性色素体ゲノム配列と相同な第２の相同配列を含み、前記標的色素体配列が、前記植物細胞の色素体ゲノムにおいて、前記第１の内在性色素体ゲノム配列と前記第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、前記導入することと、前記植物細胞の前記色素体ゲノムにおける前記標的色素体配列を前記改変配列に置き換えるような相同組換えを生じさせることとを含む、前記方法に関する。
【0132】
第２４の実施形態は、前記改変配列が、５００ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、実施形態２３に記載の方法に関する。
【0133】
第２５の実施形態は、前記改変配列が、２５０ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、実施形態２３に記載の方法に関する。
【0134】
第２６の実施形態は、植物細胞における標的色素体配列を置き換えるためのベクターであって、前記プラスミドベクターが、５’から３’の順に、第１の相同配列であって、第１の内在性色素体ゲノム配列と相同である、前記第１の相同配列、改変配列であって、１，０００ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、前記改変配列、及び第２の相同配列であって、第２の内在性色素体ゲノム配列と相同である、前記第２の相同配列を含む組換え核酸分子を含み、前記標的色素体配列が、前記植物細胞の色素体ゲノムにおいて、前記第１の内在性色素体ゲノム配列と前記第２の内在性色素体ゲノム配列との間に位置する、前記ベクターに関する。
【0135】
第２７の実施形態は、前記改変配列が、５００ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、実施形態２６に記載のベクターに関する。
【0136】
第２８の実施形態は、前記改変配列が、２５０ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、実施形態２６に記載のベクターに関する。
【0137】
第２９の実施形態は、前記改変配列が、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６４、２６７、２７０、２７３、２７６、２７９、２８２、２８５、２８８、２９１、２９４、２９７、または３００ヌクレオチドごとに前記標的色素体配列に対する少なくとも１つのサイレント変異を含む、実施形態２６に記載のベクターに関する。
【0138】
第３０の実施形態は、色素体ゲノム中に改変配列を含む、実施形態２３に記載の方法によって作製されるトランスジェニック植物細胞に関する。
【実施例】
【0139】
実施例１．ダイズ色素体において野生型ｒｂｃＬ遺伝子をコドン改変ｒｂｃＬ遺伝子に完全に置き換える組換えＤＮＡ構築物の作出
葉緑体ゲノムは、植物における呼吸及び光合成の調節に関与するいくつかの遺伝子を含有することが公知である。これらの遺伝子は、作物種の改良において特に興味深い。そのような遺伝子の１つは、リブロース１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の大サブユニットをコードするリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ大鎖（ｒｂｃＬ）遺伝子である。Ｒｕｂｉｓｃｏは、植物光合成における重要な酵素であるが、いくつかの作物植物種を含むＣ３植物では比較的非効率的であると考えられている。あるいは、Ｃ４植物におけるＲｕｂｉｓｃｏは、Ｃ３の対応物とは異なる動態特性を有していると考えられ、結果として、これはより効率的な光合成プロセスを有するＣ４植物をもたらす。このことを考慮すると、Ｃ３及びＣ４植物におけるＲｕｂｉｓｃｏならびにその構造及び機能の研究は、農業バイオテクノロジーの分野において興味深いものとなる。作物植物を操作して、向上した動態特性を有するＲｕｂｉｓｃｏを発現させることは、未だ成功を収めていない。野生型ｒｂｃＬ遺伝子を、より効率的なＲｕｂｉｓｃｏを有する種由来のｒｂｃＬ遺伝子に置き換えることは、光合成経路に関与する他のタンパク質との適合性の問題を生じる傾向がある。ゲノム編集を介して未改変Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットに対する特定の改変を導入することは、典型的には、所望の改変を有する非常に少数の形質転換体をもたらす。加えて、野生型遺伝子と改変遺伝子との間の高い配列相同性のために、改変は、細胞自身のＤＮＡ修復機構によって除去される場合がある。
葉緑体ゲノムは、植物における呼吸及び光合成の調節に関与するいくつかの遺伝子を含有することが公知である。これらの遺伝子は、作物種の改良において特に興味深い。そのような遺伝子の１つは、リブロース１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の大サブユニットをコードするリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ大鎖（ｒｂｃＬ）遺伝子である。Ｒｕｂｉｓｃｏは、植物光合成における重要な酵素であるが、いくつかの作物植物種を含むＣ３植物では比較的非効率的であると考えられている。あるいは、Ｃ４植物におけるＲｕｂｉｓｃｏは、Ｃ３の対応物とは異なる動態特性を有していると考えられ、結果として、これはより効率的な光合成プロセスを有するＣ４植物をもたらす。このことを考慮すると、Ｃ３及びＣ４植物におけるＲｕｂｉｓｃｏならびにその構造及び機能の研究は、農業バイオテクノロジーの分野において興味深いものとなる。作物植物を操作して、向上した動態特性を有するＲｕｂｉｓｃｏを発現させることは、未だ成功を収めていない。野生型ｒｂｃＬ遺伝子を、より効率的なＲｕｂｉｓｃｏを有する種由来のｒｂｃＬ遺伝子に置き換えることは、光合成経路に関与する他のタンパク質との適合性の問題を生じる傾向がある。ゲノム編集を介して未改変Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットに対する特定の改変を導入することは、典型的には、所望の改変を有する非常に少数の形質転換体をもたらす。加えて、野生型遺伝子と改変遺伝子との間の高い配列相同性のために、改変は、細胞自身のＤＮＡ修復機構によって除去される場合がある。
【0140】
野生型ダイズｒｂｃＬ遺伝子（配列番号１）が効率的に置き換えられ得るかどうかを決定するために、改変ダイズｒｂｃＬ遺伝子配列を、改変ｒｂｃＬ配列と内在性ｒｂｃＬ配列との間での組換えの可能性を低下させるように設計した。葉緑体における組換えは、高い配列相同性の領域にわたって生じるため、改変ｒｂｃＬ配列は、同じタンパク質を依然としてコードする一方で、核酸レベルにおいて野生型ｒｂｃＬ配列と比較的低い配列相同性を有するように設計した。これは、アミノ酸をコードするコドンの縮重を利用することによって達成された。野生型ダイズｒｂｃＬ遺伝子コード配列を評価して、各アミノ酸をコードするコドン及び各コドンの頻度を配列の全長にわたって決定した（図１）。改変ｒｂｃＬ配列をコドン使用頻度に基づいて生成した。野生型配列における各コドンについて、既存のコドンがそれぞれのコドンファミリー内で最も頻繁に生じるコドンではない場合、改変配列では、それを、最も頻繁な使用を有する同義コドンに置き換えた。結果として得られたコドン改変ダイズｒｂｃＬ配列（配列番号３）は、野生型ダイズｒｂｃＬ配列と約６７％の配列相同性を有するに過ぎないが、両方によってコードされたアミノ酸配列は１００％の配列相同性を共有する（図２）。
【0141】
コドン改変ｒｂｃＬ配列を含む組換えＤＮＡ構築物を色素体形質転換のために設計した。コドン改変ｒｂｃＬ配列（配列番号３）を、未改変ダイズｒｂｃＬプロモーター（配列番号６）配列と未改変ダイズｒｂｃＬターミネーター（配列番号７）配列との間に挿入した。ダイズ色素体ゲノムにおいて、ｒｂｃＬ遺伝子は、ｍａｔＫ及びｔＲＮＡ－Ｌｙｓ遺伝子とａｔｐＢ遺伝子との間に位置する。したがって、構築物には、完全ｒｂｃＬ配列と隣接する５’相同配列（配列番号４）及び３’相同配列（配列番号５）を含有させて、ダイズ色素体ゲノムとの組換えを導き、それによって野生型ｒｂｃＬ配列（配列番号１）をコドン改変ｒｂｃＬ配列（配列番号３）に置き換えた。色素体特異的選択マーカー遺伝子であるストレプトマイシン／スペクチノマイシンアデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子は、形質転換体の選択に使用するために、２つの隣接相同領域の間に存在した。ａａｄＡ発現カセットは１対のｌｏｘＰ部位と隣接させた。結果として得られた組換えＤＮＡ構築物の図を図３に示す。
【0142】
実施例２．改変ＲｕＢｉｓＣＯタンパク質をコードする組換えＤＮＡ構築物の作出
上の実施例１に記載したように、コドン改変ｒｂｃＬ配列は、その野生型対応物と比較して複数の同義コドン変化を含有するが、両方の配列は同じアミノ酸配列をコードする。コドン改変ｒｂｃＬ配列を鋳型として使用して、コードされるアミノ酸配列中に特異的変異を含有する改変ｒｂｃＬ配列を生成した。
上の実施例１に記載したように、コドン改変ｒｂｃＬ配列は、その野生型対応物と比較して複数の同義コドン変化を含有するが、両方の配列は同じアミノ酸配列をコードする。コドン改変ｒｂｃＬ配列を鋳型として使用して、コードされるアミノ酸配列中に特異的変異を含有する改変ｒｂｃＬ配列を生成した。
【0143】
コードされるアミノ酸配列が野生型／コドン改変ｒｂｃＬアミノ酸配列（配列番号２）と比較して少なくとも２つのアミノ酸置換を含むように、コドン改変ｒｂｃＬ配列を改変した。変異Ｅ６Ｇ－Ｐ８９Ｇコード配列（配列番号８）は、配列番号２の残基６に対応する位置における第１のアミノ酸置換であって、この位置におけるグルタミン酸をグリシンに置換する、第１のアミノ酸置換と、配列番号２の残基８９に対応する位置における第２のアミノ酸置換であって、この位置におけるプロリンをグリシンに置換する、第２のアミノ酸置換とを含むバリアントアミノ酸配列（配列番号９）をコードする。変異Ｅ６Ｇ－Ｎ９５Ｑコード配列（配列番号１０）は、配列番号２の残基６に対応する位置における第１のアミノ酸置換であって、この位置におけるグルタミン酸をグリシンに置換する、第１のアミノ酸置換と、配列番号２の残基９５に対応する位置における第２のアミノ酸置換であって、この位置におけるアスパラギンをグルタミンに置換する、第２のアミノ酸置換とを含むバリアントアミノ酸配列（配列番号１１）をコードする。Ｅ６Ｇ－Ｐ８９Ｇ及びＥ６Ｇ－Ｎ９５Ｑ変異コード配列をそれぞれ、未改変ダイズｒｂｃＬプロモーター及びターミネーター配列、５’相同配列、３’相同配列、ならびにａａｄＡ遺伝子と共に形質転換プラスミドにクローニングして、実施例１に記載したものと類似した組換えＤＮＡ構築物を作製した。ａａｄＡ発現カセットは、１対のＬｏｘＰ部位と隣接させ、これにより、トランスプラストミック植物を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する植物と交配させた場合に、トランスプラストミック植物における選択マーカー遺伝子を除去することが可能になる。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００５／０１６６２８８号に記載されているように、様々な方法をａａｄＡマーカー遺伝子の切り出しのために用いることができる。
【0144】
実施例３．色素体形質転換
実施例１及び２に記載した組換えＤＮＡ構築物のそれぞれを、ダイズ色素体に形質転換した。ダイズ分裂組織外植片の色素体形質転換のための方法は、当技術分野で公知であり、ここでは、原則として、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０２６４９８３号に記載されているように実施した。
実施例１及び２に記載した組換えＤＮＡ構築物のそれぞれを、ダイズ色素体に形質転換した。ダイズ分裂組織外植片の色素体形質転換のための方法は、当技術分野で公知であり、ここでは、原則として、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０２６４９８３号に記載されているように実施した。
【0145】
組換えＤＮＡ構築物を金粒子にコーティングし、１日または２日齢の前培養ダイズ外植片に打ち込んだ。打ち込まれた外植片を静置培地に一晩移した後、外植片を、明期１６時間及び暗期８時間の光周期の下で２～３か月間、１５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含む選択培地に移した。５’及び３’隣接相同領域を介した色素体ゲノムとＤＮＡ構築物との間の相同組換えは、野生型ｒｂｃＬ遺伝子を改変ｒｂｃＬ遺伝子に置き換え、また、ａａｄＡ遺伝子を色素体ゲノムに導入し、それによって形質転換体の選択を可能にするはずである。緑色のシュートが出現したら、それらを発根のために継代培養したか、または温室に移して、再生ダイズ植物を確立した。
【0146】
実施例４．ｒｂｃＬ遺伝子置き換えを含む植物の同定
葉先端部試料を、実施例３から得た再生ダイズ植物から採取した。各試料からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲの鋳型として使用した。図４は、使用したＰＣＲプライマーの位置を示し、プライマー３６１５（配列番号１２）及びプライマー３６２０（配列番号１３）は５’相同アームを含有する領域を増幅し、プライマー２９８０（配列番号１４）及びプライマー３６２２（配列番号１５）は３’相同アームを含有する領域を増幅する。再生植物をスクリーニングして、野生型ｒｂｃＬ遺伝子の、コドン改変ｒｂｃＬ遺伝子、Ｅ６Ｇ－Ｐ８９Ｇ変異ｒｂｃＬ遺伝子、またはＥ６Ｇ－Ｎ９５Ｑ変異ｒｂｃＬ遺伝子への置き換えを確認した。スクリーニングの結果を以下の表１に示す。
葉先端部試料を、実施例３から得た再生ダイズ植物から採取した。各試料からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲの鋳型として使用した。図４は、使用したＰＣＲプライマーの位置を示し、プライマー３６１５（配列番号１２）及びプライマー３６２０（配列番号１３）は５’相同アームを含有する領域を増幅し、プライマー２９８０（配列番号１４）及びプライマー３６２２（配列番号１５）は３’相同アームを含有する領域を増幅する。再生植物をスクリーニングして、野生型ｒｂｃＬ遺伝子の、コドン改変ｒｂｃＬ遺伝子、Ｅ６Ｇ－Ｐ８９Ｇ変異ｒｂｃＬ遺伝子、またはＥ６Ｇ－Ｎ９５Ｑ変異ｒｂｃＬ遺伝子への置き換えを確認した。スクリーニングの結果を以下の表１に示す。
【表1】
【0147】
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【配列表】
【国際調査報告】