特表 2024-531334 抗原提示細胞／標的細胞ハイブリドーマ由来ワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】抗原提示細胞／標的細胞ハイブリドーマ由来ワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20240822BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 5/078 20100101ALN20240822BHJP

   C12N 5/09 20100101ALN20240822BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240822BHJP

   C07K 14/37 20060101ALN20240822BHJP

   C07K 14/195 20060101ALN20240822BHJP

   C07K 14/005 20060101ALN20240822BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 G

A61K47/46

A61K39/39

A61P31/00

A61P25/00

A61P25/28

A61P37/06

A61P35/00

A61P37/04

A61P31/04

A61P31/10

A61P31/12

A61K39/02

A61K39/00 K

A61K39/12

A61P35/02

C12N5/078

C12N5/09

C07K14/47

C07K14/37

C07K14/195

C07K14/005

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024509346

(86)(22)【出願日】2022-08-19

(85)【翻訳文提出日】2024-03-22

(86)【国際出願番号】 US2022040963

(87)【国際公開番号】W WO2023023377

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】63/235,100

(32)【優先日】2021-08-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】110003007

【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】クオン、ヨン、ジク

(72)【発明者】

【氏名】チュン、ジー、ヨン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA92X

4B065AB05

4B065AC20

4B065BA08

4C076AA95

4C076BB11

4C076BB15

4C076BB16

4C076CC01

4C076CC03

4C076CC06

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC31

4C076CC35

4C076EE57

4C076EE57Q

4C076FF36

4C076FF63

4C085AA03

4C085AA06

4C085AA38

4C085BA01

4C085BB01

4C085BB11

4C085BB12

4C085CC02

4C085CC03

4C085DD51

4C085DD63

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF24

4C085GG01

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA86

4H045EA31

(57)【要約】

本開示は、樹状細胞および標的細胞のハイブリドーマからブレブ形成剤を使用して誘導された細胞由来小胞を含む組成物、製剤、および方法、ならびにそれらの使用（対象の免疫系を調整する手段としてを含む）を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗原提示細胞および標的細胞のハイブリドーマ由来の細胞外ブレブを含むワクチン製剤であって、該ハイブリドーマが、対象の免疫系を調整することができる抗原を発現し、
該細胞外ブレブが、該ハイブリドーマをブレブ形成剤で処置することによって該ハイブリドーマから産生され、
該抗原が、該細胞外ブレブの表面に表示される、ワクチン製剤。

【請求項2】

前記抗原提示細胞が、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞から選択される、請求項１に記載のワクチン製剤。

【請求項3】

前記樹状細胞が成熟樹状細胞である、請求項２に記載のワクチン製剤。

【請求項4】

前記樹状細胞が未熟樹状細胞である、請求項２に記載のワクチン製剤。

【請求項5】

前記樹状細胞が、骨髄由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、または末梢血単核細胞由来樹状細胞である、請求項２に記載のワクチン製剤。

【請求項6】

前記樹状細胞がヒト樹状細胞である、請求項１に記載のワクチン製剤。

【請求項7】

前記標的細胞が、癌細胞、異常もしくは罹患細胞、抗原を表示するよう操作された細胞、または感染性病原体に感染している細胞から選択される、請求項１に記載のワクチン製剤。

【請求項8】

前記標的細胞が、骨髄腫、リンパ腫、癌腫、肉腫、白血病、腺癌、胸腺腫、または悪性腫瘍由来の新生物細胞から選択される癌細胞である、請求項７に記載のワクチン製剤。

【請求項9】

前記標的細胞が、ウイルス、真菌、または細菌によって感染されている細胞である、請求項７に記載のワクチン製剤。

【請求項10】

前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス、アイチウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、バンナウイルス、バーマフォレストウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ブニヤウイルスラクロス、ブニヤウイルスカンジキウサギ、オナガザルヘルペスウイルス、チャンディプラウイルス、チクングニアウイルス、コサウイルスＡ、コロナウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、デングウイルス、ドーリウイルス、ダグベウイルス、デュベンハゲ（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ）ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓａｌｉｔｉｓ）、ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス、ペギウイルス、ハンタンウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、馬痘ウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザ、ヒトパルボウイルスＢ１９、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトスプーマレトロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ヒトトロウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、イスファハン（Ｉｓｆａｈａｎ）ウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンアレナウイルス、ＫＩポリオーマウイルス、クンジンウイルス、ラゴスコウモリウイルス、レイクビクトリアマールブルグウイルス、ランガットウイルス、ラッサウイルス、ローズデール（Ｌｏｒｄｓｄａｌｅ）ウイルス、跳躍病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、マヤロウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、メンゴ脳心筋炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、モコラウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サル痘ウイルス、ムンプスウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、ニューヨークウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、オニョンニョンウイルス、オルフウイルス、オロプーシェウイルス、ピチンデウイルス、ポリオウイルス、プンタトロフレボウイルス、プーマラウイルス、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロザウイルスＡ、ロスリバーウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、風疹ウイルス、鷺山ウイルス、サリウイルスＡ、サシチョウバエ熱シチリアウイルス、サッポロウイルス、セムリキ森林ウイルス、ソウルウイルス、サル泡沫状ウイルス、サルウイルス、シンドビスウイルス、サザンプトンウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介ポワッサンウイルス、トルクテノウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルスＯ、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＷＵポリオーマウイルス、ウエストナイルウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ヤバ様疾患（Ｙａｂａ－ｌｉｋｅ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、黄熱ウイルス、およびジカウイルスからなる群から選択される、請求項９に記載のワクチン製剤。

【請求項11】

前記真菌が、アブシディア・コリンビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、アブシディア・ラモセ（Ａｂｓｉｄｉａ ｒａｍｏｓｅ）、アコリオン・ガリナエ（Ａｃｈｏｒｉｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ）、アクチノマヅラ属種（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐｐ．）、アジェロミセス・デルマチディディス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｄｉｓ）、アレウリスマ・ブラジリエンシス（Ａｌｅｕｒｉｓｍａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アレルシェリア・ボイディイ（Ａｌｌｅｒｓｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ）、アルスロデルマ属種（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガツ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕ）、バシディオボラス属種（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、ブラストミセス属種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、カドフォラ属種（Ｃａｄｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、セルコスポラ・アピイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ａｐｉｉ）、クリソスポリウム属種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、クラドスポリウム属種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、クラドスリクス・アステロイズ（Ｃｌａｄｏｔｈｒｉｘ ａｓｔｅｒｏｉｄｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、クリプトコッカス・アルビヅス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ）、クリプトコッカス・ガッチイ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ）、クリプトコッカス・ラウレンチイ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クニンガメラ・エレガンス（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ）、デマチウム・ウェルネクケ（Ｄｅｍａｔｉｕｍ ｗｅｒｎｅｃｋｅ）、ディスコミセス・イスラエリイ（Ｄｉｓｃｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、エモンシア属種（Ｅｍｍｏｎｓｉａ ｓｐｐ．）、エモンシエラ・カプスラテ（Ｅｍｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｃａｐｓｕｌａｔｅ）、エンドミセス・ゲオトリクム（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、エントモフトラ・コロナテ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｏｒｏｎａｔｅ）、エピデルモフィトン・フロッコスム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、フォンセケア属種（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐｐ．）、ゲオトリカム・カンジヅム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、グレノスポラ・クハルトウメンシス（Ｇｌｅｎｏｓｐｏｒａ ｋｈａｒｔｏｕｍｅｎｓｉｓ）、ギムノアスカス・ギプセウス（Ｇｙｍｎｏａｓｃｕｓ ｇｙｐｓｅｕｓ）、ハプロスポランギウム・パルブム（Ｈａｐｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ホルミシウム・デルマチディディス（Ｈｏｒｍｉｓｃｉｕｍ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｄｉｓ）、ホルモデンドルム属種（Ｈｏｒｍｏｄｅｎｄｒｕｍ ｓｐｐ．）、ケラチノミセス属種（Ｋｅｒａｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ランゲロニア・ソウダネンセ（Ｌａｎｇｅｒｏｎｉａ ｓｏｕｄａｎｅｎｓｅ）、レプトスファエリア・セネガレンシス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）、リクテイミア・コリンビフェラ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、ロブミセス・ロボイ．（Ｌｏｂｍｙｃｅｓ ｌｏｂｏｉ．）、ロボア・ロボイ（Ｌｏｂｏａ ｌｏｂｏｉ）、ロボミコーシス（Ｌｏｂｏｍｙｃｏｓｉｓ）、マヅレラ属種（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、マラセチア・フルフル（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ）、ミクロコッカス・ペレチエリ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｌｌｅｔｉｅｒｉ）、ミクロスポルム属種（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｓｐｐ．）、モニリア属種（Ｍｏｎｉｌｉａ ｓｐｐ．）、ムコール属種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ナンニッツィア属種（Ｎａｎｎｉｚｚｉａ ｓｐｐ．）、ネオテスツディナ・ロサチイ（Ｎｅｏｔｅｓｔｕｄｉｎａ ｒｏｓａｔｉｉ）、ノカルジア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｐ．）、オイディウム・アルビカンス（Ｏｉｄｉｕｍ ａｌｂｉｃａｎｓ）、オスポラ・ラクチス（Ｏｏｓｐｏｒａ ｌａｃｔｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ペトリエリディウム・ボイディイ（Ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｕｍ ｂｏｙｄｉｉ）、フィアロフォラ属種（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ピエドライア・ホルタエ（Ｐｉｅｄｒａｉａ ｈｏｒｔａｅ）、ピチロスポルム・フルフル（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｆｕｒｆｕｒ）、ニューモシスチス・イロベシイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）（またはニューモシスチス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ））、プルラリア・ゴウゲロチイ（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ ｇｏｕｇｅｒｏｔｉｉ）、ピレノカエタ・ロメロイ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｒｏｍｅｒｏｉ）、リノスポリジウム・セーベリ（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｅｂｅｒｉ）、サボウラウディテス属（Ｓａｂｏｕｒａｕｄｉｔｅｓ）（ミクロスポルム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ））、サルトリア・フミガテ（Ｓａｒｔｏｒｙａ ｆｕｍｉｇａｔｅ）、セペドニウム属（Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ）、スポロトリクム属種（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、スタキボトリス属（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）、スタキボトリス・カルタルム（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓｐｐ．）、チネア属種（Ｔｉｎｅａ ｓｐｐ．）、トルラ属種（Ｔｏｒｕｌａ ｓｐｐ．）、トリコフィトン属種（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ．）、トリコスポロン属種（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｓｐｐ．）、およびゾフィア・ロサチイ（Ｚｏｐｆｉａ ｒｏｓａｔｉｉ）から選択される、請求項９に記載のワクチン製剤。

【請求項12】

前記細菌が、アクチノミセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クインターナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ガリニイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ）、ボレリア・レクレンチス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・サンタロサイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓａｎｔａｒｏｓａｉ）、レプトスピラ・ウェイリイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｗｅｉｌｉｉ）、レプトスピラ・ノグチイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｎｏｇｕｃｈｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ソンネ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、および仮性結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）から選択される、請求項９に記載のワクチン製剤。

【請求項13】

前記抗原提示細胞および／または標的細胞が、前記ワクチン製剤で処置されるべき対象由来である、請求項１に記載のワクチン製剤。

【請求項14】

前記抗原が、腫瘍特異的抗原、または腫瘍関連抗原を含む、請求項１に記載のワクチン製剤。

【請求項15】

前記腫瘍特異的抗原、または前記腫瘍関連抗原が、アルファフェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原、ｋ－ｒａｓ、ｐ５３の異常産物、アルファ－アクチニン－４、ＡＲＴＣ１、Ｂ－ＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質、ベータ－カテニン、ＣＡＳＰ－５、ＣＡＳＰ－８、ＣＤｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ－１、ＣＯＡ－２、ＣＳＮＫ１Ａ１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＦＮ１、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＧＡＳ７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ＨＬＡ－Ａ１１、ＨＬＡ－Ａ２、ｈｓｐ７０－２、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＥ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシンクラスＩ、Ｎ－ｒａｓ、ネオ－ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ－９、ｐ５３、ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ－ＳＳＸ１またはＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＧＦ－ベータＲＩＩ、ＴＰ５３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ－１、ＣＴ３７／ＦＭＲ１ＮＢ、サイクリン－Ａ１、Ｄ３９３－ＣＤ２０ｎ、ＧＡＧＥ－１，２，８、ＧＡＧＥ－３，４，５，６，７、ＧｎＴＶ、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＫＫ－ＬＣ－１、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１、ＬＲＰＡＰ１、ＬＹ６Ｋ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２ｍ、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ムチン、ＮＡ８８－Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－４、ＴＡＧ－１、ＴＡＧ－２、ＴＲＡＧ－３、ＴＲＰ２－ＩＮＴ２、ＸＡＧＥ－１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、ＣＥＡ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、マンマグロビン－Ａ、メラン－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ＯＡ１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＲＡＢ３８／ＮＹ－ＭＥＬ－１、ＴＲＰ－１／ｇｐ７５、ＴＲＰ－２、ＢＣＬＸ、ＢＩＮＧ－４、ＣＡＬＣＡ、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ、ｅｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、グリピカン－３、ＨＥＰＡＣＡＭ、ヘプシン、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＳＰＨ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＭＰ－３、ＭＵＣ１、メロー（Ｍｅｌｏｅ）、ミッドカイン、ＷＴ１、ＶＥＧＦ、ＴＰＢＧ、テロメラーゼ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ１、ＲＡＧＥ－１、ＰＳＭＡ、ＰＲＡＭＥ、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＯＸ１０、およびサバイビンから選択される、請求項１４に記載のワクチン製剤。

【請求項16】

前記抗原が、外来抗原または自己抗原である、請求項１に記載のワクチン製剤。

【請求項17】

前記外来抗原が、細菌、真菌またはウイルス由来である、請求項１６に記載のワクチン製剤。

【請求項18】

前記自己抗原が、対象の身体に見出される任意の生体分子またはその一部由来である、請求項１６に記載のワクチン製剤。

【請求項19】

アジュバントをさらに含む、請求項１に記載のワクチン製剤。

【請求項20】

アジュバントを含まない、請求項１に記載のワクチン製剤。

【請求項21】

前記細胞外ブレブが、下記表面および成熟マーカーＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、および／またはＣＤ８６の１つまたは複数を含む、請求項１に記載のワクチン製剤。

【請求項22】

請求項１から２１のいずれか一項に記載のワクチン製剤を作製する方法であって、
細胞外ブレブをハイブリドーマから、該ハイブリドーマを１つまたは複数のスルフヒドリル遮断剤と３０分～２４時間接触させることによって生成させることと、
該細胞外ブレブを単離すること
とを含む、方法。

【請求項23】

前記１つまたは複数のスルフヒドリル遮断剤が、塩化水銀、ｐ－クロロ水銀ベンゼンスルホン酸、塩化第二金、ｐ－クロロ水銀ベンゾエート、クロルメロドリン、メラルリドナトリウム、ヨードアセトミド、パラホルムアルデヒド、ジチオトレイトール、およびＮ－エチルマレイミドからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記１つまたは複数のスルフヒドリル遮断剤が、Ｎ－エチルマレイミドまたはパラホルムアルデヒドである、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記Ｎ－エチルマレイミドが、０．２ｍＭから３０ｍＭの濃度で使用され、パラホルムアルデヒドが、１０ｍＭから１００ｍＭの濃度で使用される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

それを必要とする対象を免疫化する方法であって、治療有効量の請求項１から２１のいずれか一項に記載のワクチン製剤を該対象に投与することを含む、方法。

【請求項27】

前記ワクチン製剤が、筋内、皮下、皮内、または腫瘍内に投与される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記対象が、癌、自己免疫疾患、神経変性障害、または病原体による感染を有する、請求項２６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月１９日に出願された米国仮出願第６３／２３５，１００号の米国特許法第１１９条に基づく利益を主張しており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、抗原提示細胞および標的細胞を含むハイブリドーマから産生された細胞外ブレブを含む組成物、製剤、および方法、ならびにそれらの使用（対象の免疫系を調整するためのものを含む）を提供する。

【背景技術】

【0003】

樹状細胞（ＤＣ）は、ワクチンおよび免疫療法の開発に広く使用されている強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＤＣは、臨床試験で安全であることが歴史的に証明されており、個別化医療のために、同種異系供給源から、または患者自身の細胞から操作することができる。証明された免疫原性および好適な安全性プロファイルにもかかわらず、ＤＣベースの免疫療法は、有意な客観的臨床応答を達成していない。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、抗原提示細胞および標的細胞（例えば、癌細胞）を含むハイブリドーマから産生された細胞外ブレブ（ＥＢ）を含む組成物、製剤（例えば、ワクチン製剤）、および方法を提供する。本明細書において開示されるＥＢを含む製剤および組成物は、細胞様であるが、無細胞である。ＥＢは、迅速で、効率的で、かつコストおよび労力にとって都合のよい化学的にまたは物理的に誘導されたブレブ形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）プロセスを介して、本明細書において開示されるハイブリドーマから産生される。本明細書において提示される研究において示されるように、樹状細胞および癌細胞のハイブリドーマから産生されたＥＢは、抗原タンパク質をＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子と複合して提示して、ｉｎ ｖｉｖｏで完全に最適化された分子機構でＴ細胞を活性化することがわかった。

【0005】

特定の実施形態では、本開示は、抗原提示細胞および標的細胞のハイブリドーマ由来の細胞外ブレブを含むワクチン製剤を提供し、ここで、ハイブリドーマは、対象の免疫系を調整することができる抗原を発現し、ここで、細胞外ブレブは、ハイブリドーマをブレブ形成剤で処置することによってハイブリドーマから産生され、ここで、抗原は、細胞外ブレブの表面に表示される。さらなる実施形態では、抗原提示細胞は、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞から選択される。さらなる実施形態では、樹状細胞は成熟樹状細胞である。別の実施形態では、樹状細胞は未熟樹状細胞である。さらに別の実施形態では、樹状細胞は、骨髄由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、または末梢血単核細胞由来樹状細胞である。さらなる実施形態では、樹状細胞はヒト樹状細胞である。さらなる実施形態では、標的細胞は、癌細胞、異常もしくは罹患細胞、抗原を表示するよう操作された細胞、または感染性病原体に感染している細胞から選択される。特定の実施形態では、標的細胞は、骨髄腫、リンパ腫、癌腫、肉腫、白血病、腺癌、胸腺腫、または悪性腫瘍由来の新生物細胞から選択される癌細胞である。別の実施形態では、標的細胞は、ウイルス、真菌、または細菌によって感染されている細胞である。ウイルスの例として、アイチウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、バンナウイルス、バーマフォレストウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ブニヤウイルスラクロス、ブニヤウイルスカンジキウサギ（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ ｓｎｏｗｓｈｏｅ ｈａｒｅ）、オナガザルヘルペスウイルス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、チャンディプラウイルス、チクングニアウイルス、コサウイルスＡ、コロナウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、デングウイルス、ドーリウイルス、ダグベウイルス、デュベンハゲ（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ）ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓａｌｉｔｉｓ）、ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス、ペギウイルス、ハンタンウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、馬痘ウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザ、ヒトパルボウイルスＢ１９、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトスプーマレトロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ヒトトロウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、イスファハン（Ｉｓｆａｈａｎ）ウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンアレナウイルス、ＫＩポリオーマウイルス、クンジンウイルス、ラゴスコウモリウイルス、レイクビクトリアマールブルグウイルス、ランガットウイルス、ラッサウイルス、ローズデール（Ｌｏｒｄｓｄａｌｅ）ウイルス、跳躍病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、マヤロウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、メンゴ脳心筋炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、モコラウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サル痘ウイルス、ムンプスウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、ニューヨークウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、オニョンニョンウイルス、オルフウイルス、オロプーシェウイルス、ピチンデウイルス、ポリオウイルス、プンタトロフレボウイルス、プーマラウイルス、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロザウイルスＡ、ロスリバーウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、風疹ウイルス、鷺山ウイルス、サリウイルスＡ、サシチョウバエ熱シチリアウイルス、サッポロウイルス、セムリキ森林ウイルス、ソウルウイルス、サル泡沫状ウイルス、サルウイルス、シンドビスウイルス、サザンプトンウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介ポワッサンウイルス、トルクテノウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルスＯ、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＷＵポリオーマウイルス、ウエストナイルウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ヤバ様疾患ウイルス、黄熱ウイルス、およびジカウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。真菌の例として、アブシディア・コリンビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、アブシディア・ラモセ（Ａｂｓｉｄｉａ ｒａｍｏｓｅ）、アコリオン・ガリナエ（Ａｃｈｏｒｉｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ）、アクチノマヅラ属種（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐｐ．）、アジェロミセス・デルマチディディス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｄｉｓ）、アレウリスマ・ブラジリエンシス（Ａｌｅｕｒｉｓｍａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アレルシェリア・ボイディイ（Ａｌｌｅｒｓｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ）、アルスロデルマ属種（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガツ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕ）、バシディオボラス属種（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、ブラストミセス属種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、カドフォラ属種（Ｃａｄｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、セルコスポラ・アピイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ａｐｉｉ）、クリソスポリウム属種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、クラドスポリウム属種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、クラドスリクス・アステロイズ（Ｃｌａｄｏｔｈｒｉｘ ａｓｔｅｒｏｉｄｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、クリプトコッカス・アルビヅス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ）、クリプトコッカス・ガッチイ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ）、クリプトコッカス・ラウレンチイ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クニンガメラ・エレガンス（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ）、デマチウム・ウェルネクケ（Ｄｅｍａｔｉｕｍ ｗｅｒｎｅｃｋｅ）、ディスコミセス・イスラエリイ（Ｄｉｓｃｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、エモンシア属種（Ｅｍｍｏｎｓｉａ ｓｐｐ．）、エモンシエラ・カプスラテ（Ｅｍｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｃａｐｓｕｌａｔｅ）、エンドミセス・ゲオトリクム（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、エントモフトラ・コロナテ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｏｒｏｎａｔｅ）、エピデルモフィトン・フロッコスム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、フォンセケア属種（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐｐ．）、ゲオトリカム・カンジヅム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、グレノスポラ・クハルトウメンシス（Ｇｌｅｎｏｓｐｏｒａ ｋｈａｒｔｏｕｍｅｎｓｉｓ）、ギムノアスカス・ギプセウス（Ｇｙｍｎｏａｓｃｕｓ ｇｙｐｓｅｕｓ）、ハプロスポランギウム・パルブム（Ｈａｐｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ホルミシウム・デルマチディディス（Ｈｏｒｍｉｓｃｉｕｍ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｄｉｓ）、ホルモデンドルム属種（Ｈｏｒｍｏｄｅｎｄｒｕｍ ｓｐｐ．）、ケラチノミセス属種（Ｋｅｒａｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ランゲロニア・ソウダネンセ（Ｌａｎｇｅｒｏｎｉａ ｓｏｕｄａｎｅｎｓｅ）、レプトスファエリア・セネガレンシス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）、リクテイミア・コリンビフェラ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、ロブミセス・ロボイ．（Ｌｏｂｍｙｃｅｓ ｌｏｂｏｉ．）、ロボア・ロボイ（Ｌｏｂｏａ ｌｏｂｏｉ）、ロボミコーシス（Ｌｏｂｏｍｙｃｏｓｉｓ）、マヅレラ属種（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、マラセチア・フルフル（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ）、ミクロコッカス・ペレチエリ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｌｌｅｔｉｅｒｉ）、ミクロスポルム属種（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｓｐｐ．）、モニリア属種（Ｍｏｎｉｌｉａ ｓｐｐ．）、ムコール属種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ナンニッツィア属種（Ｎａｎｎｉｚｚｉａ ｓｐｐ．）、ネオテスツディナ・ロサチイ（Ｎｅｏｔｅｓｔｕｄｉｎａ ｒｏｓａｔｉｉ）、ノカルジア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｐ．）、オイディウム・アルビカンス（Ｏｉｄｉｕｍ ａｌｂｉｃａｎｓ）、オスポラ・ラクチス（Ｏｏｓｐｏｒａ ｌａｃｔｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ペトリエリディウム・ボイディイ（Ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｕｍ ｂｏｙｄｉｉ）、フィアロフォラ属種（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ピエドライア・ホルタエ（Ｐｉｅｄｒａｉａ ｈｏｒｔａｅ）、ピチロスポルム・フルフル（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｆｕｒｆｕｒ）、ニューモシスチス・イロベシイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）（またはニューモシスチス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ））、プルラリア・ゴウゲロチイ（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ ｇｏｕｇｅｒｏｔｉｉ）、ピレノカエタ・ロメロイ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｒｏｍｅｒｏｉ）、リノスポリジウム・セーベリ（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｅｂｅｒｉ）、サボウラウディテス属（Ｓａｂｏｕｒａｕｄｉｔｅｓ）（ミクロスポルム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ））、サルトリア・フミガテ（Ｓａｒｔｏｒｙａ ｆｕｍｉｇａｔｅ）、セペドニウム属（Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ）、スポロトリクム属種（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、スタキボトリス属（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）、スタキボトリス・カルタルム（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓｐｐ．）、チネア属種（Ｔｉｎｅａ ｓｐｐ．）、トルラ属種（Ｔｏｒｕｌａ ｓｐｐ．）、トリコフィトン属種（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ．）、トリコスポロン属種（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｓｐｐ．）、およびゾフィア・ロサチイ（Ｚｏｐｆｉａ ｒｏｓａｔｉｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。細菌の例として、アクチノミセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クインターナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ガリニイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ）、ボレリア・レクレンチス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・サンタロサイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓａｎｔａｒｏｓａｉ）、レプトスピラ・ウェイリイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｗｅｉｌｉｉ）、レプトスピラ・ノグチイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｎｏｇｕｃｈｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ソンネ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、および仮性結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、抗原提示細胞および／または標的細胞は、ワクチン製剤で処置されるべき対象由来である。さらに別の実施形態では、抗原は、腫瘍特異的抗原、または腫瘍関連抗原を含む。腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原の例として、アルファフェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原、ｋ－ｒａｓ、ｐ５３の異常産物、アルファ－アクチニン－４、ＡＲＴＣ１、Ｂ－ＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質、ベータ－カテニン、ＣＡＳＰ－５、ＣＡＳＰ－８、ＣＤｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ－１、ＣＯＡ－２、ＣＳＮＫ１Ａ１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＦＮ１、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＧＡＳ７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ＨＬＡ－Ａ１１、ＨＬＡ－Ａ２、ｈｓｐ７０－２、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＥ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシンクラスＩ、Ｎ－ｒａｓ、ネオ－ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ－９、ｐ５３、ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ－ＳＳＸ１またはＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＧＦ－ベータＲＩＩ、ＴＰ５３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ－１、ＣＴ３７／ＦＭＲ１ＮＢ、サイクリン－Ａ１、Ｄ３９３－ＣＤ２０ｎ、ＧＡＧＥ－１，２，８、ＧＡＧＥ－３，４，５，６，７、ＧｎＴＶ、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＫＫ－ＬＣ－１、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１、ＬＲＰＡＰ１、ＬＹ６Ｋ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２ｍ、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ムチン、ＮＡ８８－Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－４、ＴＡＧ－１、ＴＡＧ－２、ＴＲＡＧ－３、ＴＲＰ２－ＩＮＴ２、ＸＡＧＥ－１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、ＣＥＡ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、マンマグロビン－Ａ、メラン－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ＯＡ１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＲＡＢ３８／ＮＹ－ＭＥＬ－１、ＴＲＰ－１／ｇｐ７５、ＴＲＰ－２、ＢＣＬＸ、ＢＩＮＧ－４、ＣＡＬＣＡ、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ、ｅｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、グリピカン－３、ＨＥＰＡＣＡＭ、ヘプシン、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＳＰＨ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＭＰ－３、ＭＵＣ１、メロー（Ｍｅｌｏｅ）、ミッドカイン、ＷＴ１、ＶＥＧＦ、ＴＰＢＧ、テロメラーゼ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ１、ＲＡＧＥ－１、ＰＳＭＡ、ＰＲＡＭＥ、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＯＸ１０、およびサバイビンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、抗原は、外来抗原または自己抗原である。さらなる実施形態では、外来抗原は、細菌、真菌またはウイルス由来である。別の実施形態では、ワクチン製剤はアジュバントをさらに含む。アジュバントの例として、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、ＡＳ０４、ＭＦ５９、ＡＳ０１_Ｂ、ＣｐＧ １０１８、およびＩＶＡＸ－１が挙げられるが、これらに限定されない。代替的な実施形態では、ワクチン製剤はアジュバントを含まない。別の実施形態では、細胞外ブレブは、下記の表面および成熟マーカーＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、および／またはＣＤ８６の１つまたは複数を含む。

【0006】

本開示はさらに、本開示のワクチン製剤を作製する方法であって、細胞外ブレブをハイブリドーマから、該ハイブリドーマを１つまたは複数のスルフヒドリル遮断剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と３０分～２４時間接触させることによって生成させることと、該細胞外ブレブを単離することとを含む、方法を提供する。さらなる実施形態では、１つまたは複数のスルフヒドリル遮断剤は、塩化水銀、ｐ－クロロ水銀ベンゼンスルホン酸、塩化第二金、ｐ－クロロ水銀ベンゾエート、クロルメロドリン、メラルリドナトリウム、ヨードアセトミド、パラホルムアルデヒド、ジチオトレイトール、およびＮ－エチルマレイミドからなる群から選択される。さらなる実施形態では、１つまたは複数のスルフヒドリル遮断剤は、Ｎ－エチルマレイミドまたはパラホルムアルデヒドである。別の実施形態では、Ｎ－エチルマレイミドは、０．２ｍＭから３０ｍＭの濃度で使用され、あるいはパラホルムアルデヒドは、１０ｍＭから１００ｍＭの濃度で使用される。

【0007】

本開示はまた、それを必要とする対象を免疫化する方法であって、治療有効量の本明細書において開示されるワクチン製剤を投与することを含む、方法を提供する。さらなる実施形態では、ワクチン製剤は、筋内、皮下、皮内、または腫瘍内に投与される。さらなる実施形態では、対象は、癌、自己免疫疾患、神経変性障害、または病原体による感染を有する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】所望の成熟状態にある骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）、および特徴的な抗原を有するか、または有さないＴリンパ腫細胞のハイブリドーマに由来するＥＢを調製する概要図を示す図である。簡潔に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した骨髄をＢＭＤＣに分化させ、ＬＰＳとのインキュベーションによってさらに成熟させた。次に、未熟および成熟ＢＭＤＣの両方（それぞれｉＤＣおよびｍＤＣ）を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介して、それぞれ特徴的な抗原（即ち、ＯＶＡ）を有するか、または有さないＥ．Ｇ７－ＯＶＡ－ＧＦＰ（Ｅ７ＯＧ）またはＥＬ４（Ｅ４）Ｔ細胞リンパ腫細胞と融合させた。得られたハイブリドーマ細胞をフローサイトメトリーで選別し、９６ウェルプレートにおいてクローニングして、純粋な集団を得た。最終的に、ＯＶＡ抗原を有するか、または有さない様々なＤＣ成熟状態を有するハイブリドーマ由来のＥＢを、化学的に誘導されたブレブ形成および一連の遠心分離によって調製した。

【図2】培地および半固形培地中で成長させたＢＭＤＣ－ＥＧ７－Ｏｖａ－ＧＦＰハイブリドーマ細胞の画像を提供する図である。得られたクローンを、フローサイトメトリーを使用してＣＤ１１ｃ（樹状細胞マーカー）およびＧＦＰによって分析した。

【図3A】～

【図3B】純粋なＤＣ／腫瘍ハイブリドーマの調製および継代を越えて表面分子を提示する際のそれらの安定性を提供する図である。（Ａ）ＰＥＧ媒介性融合は、およそ４０％のｍＤＣ／Ｅ７ＯＧハイブリドーマ細胞を生じ、それらを、フローサイトメトリーによって定量化されるような純粋な集団となるようにさらに選別およびクローニングした。得られたハイブリドーマは、選別前（左）および選別後（右）に顕微鏡を使用してそれらのＧＦＰ発現について分析した。（Ｂ）ｉｍＤＣ／Ｅ７ＯＧおよびｍＤＣ／Ｅ７ＯＧを最大４０継代まで増殖させ、それらの生物学的安定性を、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、およびＭＨＣ Ｉ／ＳＩＩＮＦＥＫＬについてフローサイトメトリーによって分析した。ハイブリドーマは、継代に関係なく、親ＤＣに由来する免疫賦活状態を維持した。

【図4】抗ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、またはＭＨＣ ＩＩ抗体で標識し、フローサイトメトリーを使用して分析した未熟および成熟ハイブリドーマを提供する図である。

【図5A】～

【図5C】ＥＬ４ Ｔリンパ腫細胞と融合した様々な成熟状態の骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）のハイブリドーマの分析を示す図である。簡潔に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した骨髄を、ＧＭ－ＣＳＦの存在下でＢＭＤＣに分化させ、ＬＰＳとのインキュベーションによってさらに成熟させた。（Ａ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性細胞融合を介して、特徴的な抗原を有さないＥＬ４（Ｅ４）Ｔ細胞リンパ腫細胞と融合した未熟および成熟ＢＭＤＣの両方（それぞれ、ｉＤＣおよびｍＤＣ）。得られたハイブリドーマは、ＤＣマーカーであるＣＤ１１ｃマーカーを保持した。（Ｂ）ＣＤ１１ｃ（ＤＣマーカー）およびＣＤ９０．２（ＥＬ４細胞に関するマーカー）の両方を発現する比較的純粋な集団を得るために、ＤＣ／Ｅ４ハイブリドーマを９６ウェルプレートにおいて選別およびクローニングした。（Ｃ）ｉｍＤＣ／Ｅ４およびｍＤＣ／Ｅ４ハイブリドーマはともに、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、およびＭＨＣ ＩＩを有することによって親ＤＣの成熟特性を示した。

【図6】凍結保存され、解凍され、特殊なハイブリッド培地中で成長させた未熟および成熟ハイブリドーマ細胞系を示す図である。ハイブリドーマを、３日間培養し、ＣＤ１１ｃおよびＧＦＰを使用して陽性クローンについて分析した。

【図7】１０継代毎にＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、およびＭＨＣ Ｉ－ＳＩＩＮＦＥＫＬについて分析した未熟ハイブリドーマ細胞を示す図である。

【図8】１０継代毎にＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、およびＭＨＣ Ｉ－ＳＩＩＮＦＥＫＬについて分析した成熟ハイブリドーマ細胞を示す図である。

【図9】フローサイトメトリーを使用して表面分子提示について分析した未熟ハイブリドーマおよびそこから誘導されたブレブを示す図である。

【図10】フローサイトメトリーを使用して表面分子提示について分析した未熟ハイブリドーマおよびそこから誘導されたブレブを示す図である。

【図11】β－ｇａｌ分泌によって定量化される、未熟および成熟ハイブリドーマならびにそこから誘導されたＥＢによるＣＤ８ Ｔ Ｂ３Ｚ細胞の活性化を示す図である。

【図12A】～

【図12C】樹状細胞の表面分子プロファイルの保持および相当するＥＢによる生じたＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ）ＮＥＭとの８時間インキュベーション、続く細胞砕片を差次的に除去し、精製されたＥＢを収集するための一連の遠心分離を介したｉｍＤＣ／Ｅ７ＯＧおよびｍＤＣ／Ｅ７ＯＧに由来するＥＢの形態。（Ｂ）ｉｍＤＣ／Ｅ７ＯＧおよびｍＤＣ／Ｅ７ＯＧハイブリドーマに由来するＥＢは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、およびＭＨＣ ＩＩについてのフローサイトメトリーによって確認されるように、相当する親ハイブリドーマの同じ表面分子を運搬するように適合された。（Ｃ）親ＤＣのＴ細胞刺激能は、活性化されたＢ３Ｚ ＣＤ８ Ｔハイブリドーマ細胞のＭＨＣ Ｉ／ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＣＰＲＧアッセイについてフローサイトメトリーによって確認されるように、相当するＥＢに厳密に置き換えられた。相対的なＴ細胞の活性化は、様々な濃度でＳＩＩＬＦＥＫＬとともにインキュベートしたＢＭＤＣによって生成された同じ比色シグナルに必要なＳＩＩＮＦＥＫＬ濃度で比較した。

【図13】ＰＢＳ、Ｏｖａ、ｉＢＭＤＣ、ｍＢＭＤＣ、または未熟および成熟ＥＢハイブリドーマをワクチン接種したマウスの体重を示す図である。

【図14】ＰＢＳ、Ｏｖａ、ｉＢＭＤＣ、ｍＢＭＤＣ、または未熟および成熟ＥＢハイブリドーマをワクチン接種したマウスの腫瘍体積を示す図である。

【図15A】～

【図15B】ＤＣ／Ｅ７ＯＧ ＥＢをワクチン接種した場合の腫瘍からのマウスの防御を示す図である。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１４日間隔で２回、２回目の注射の１０日後にＥ７ＯＧまたはＥ４腫瘍の樹立前に、ＯＶＡを有するか、または有さない様々な免疫刺激のＥＢおよび／またはＤＣをワクチン接種した。腫瘍体積は２日毎に測定し、直径１．５ｃｍに達するか、またはそれよりも大きい腫瘍を保有するマウスを安楽死させた。（Ｂ）Ａに示されるようにワクチン接種したマウスの生存率プロット。データは、平均値±ＳＤとして表す（ｎ＝６）。生存率グラフは、ログランク（マンテル・コックス）検定によって解析した。^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１は有意であるとみなした。生存率統計値は、表１および表２に見出すことができる。

【図16A】～

【図16B】ＤＣ／Ｅ４ ＥＢをワクチン接種した場合の腫瘍からのマウスの防御を示す図である。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１４日間隔で２回、２回目の注射の１０日後にＥ７ＯＧまたはＥ４腫瘍の樹立前に、ＯＶＡを有するか、または有さない様々な免疫刺激のＥＢおよび／またはＤＣをワクチン接種した。腫瘍体積は２日毎に測定し、直径１．５ｃｍに達するか、またはそれよりも大きい腫瘍を保有するマウスを安楽死させた。（Ｂ）Ａに示されるようにワクチン接種したマウスの生存率プロット。データは、平均値±ＳＤとして表す（ｎ＝６）。生存率グラフは、ログランク（マンテル・コックス）検定によって解析した。^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１は有意であるとみなした。生存率統計値は、表３および表４に見出すことができる。

【図17A】～

【図17B】Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡおよびＥＬ４腫瘍由来ＥＢをワクチン接種した場合の腫瘍からのマウスの防御を示す図である。（Ａ）１４日間隔で２回、２回目の注射の１０日後に相当する腫瘍の樹立前に、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ－ＧＦＰおよびＥＬ４腫瘍に由来するＥＢをワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける腫瘍成長。（Ｂ）Ａにおけるマウスの生存率プロット。データは、平均値±ＳＤとして表す（ｎ＝６）。

【図18A】～

【図18B】Ｅ７ＯＧまたはＥ４腫瘍に対するＤＣ／Ｅ７ＯＧ ＥＢをワクチン接種したマウスにおける代表的なＣＴＬ活性化プロットを提供する図である。（Ａ）様々な成熟状態のＤＣ／Ｅ７ＯＧ ＥＢまたはＤＣをワクチン接種したマウスから採取した脾細胞によるＥ７ＯＧ腫瘍の特異的溶解。（Ｂ）様々な成熟状態のＤＣ／Ｅ７ＯＧ ＥＢまたはＤＣをワクチン接種したマウスから採取した脾細胞によるＥ４腫瘍の特異的溶解。脾細胞を、２回目の注射の１０日後にマウス（ｎ＝５）から採取し、エフェクター（脾細胞）対標的（腫瘍）比２５：１で腫瘍細胞とともに４時間インキュベートし、特異的溶解は、フローサイトメトリーによるＹＯ－ＰＲＯ－１陽性細胞のパーセントによって決定した。図２１の棒グラフは、特異的溶解の平均パーセントを示す。

【図19A】～

【図19B】Ｅ７ＯＧまたはＥ４腫瘍に対するＤＣ／Ｅ４ ＥＢをワクチン接種したマウスにおける代表的なＣＴＬ活性化プロットを提供する図である。（Ａ）様々な成熟状態のＤＣ／Ｅ４ ＥＢまたはＤＣをワクチン接種したマウスから採取した脾細胞によるＥ７ＯＧ腫瘍の特異的溶解。（Ｂ）様々な成熟状態のＤＣ／Ｅ４ ＥＢまたはＤＣをワクチン接種したマウスから採取した脾細胞によるＥ４腫瘍の特異的溶解。脾細胞を、２回目の注射の１０日後にマウス（ｎ＝５）から採取し、エフェクター（脾細胞）対標的（腫瘍）比２５：１で腫瘍細胞とともに４時間インキュベートし、特異的溶解は、フローサイトメトリーによるＹＯ－ＰＲＯ－１陽性細胞のパーセントによって決定した。図２１の棒グラフは、特異的溶解の平均パーセントを示す。

【図20】１００：１、５０：１、２５：１、１２．５：１、および６．２５：１の範囲の比のＥＬ４およびＥ．Ｇ７－ＯＶＡ癌細胞の特異的溶解を示す図である。

【図21A】～

【図21B】Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡまたはＥＬ４腫瘍に対するＤＣおよびＤＣ／腫瘍ＥＢをワクチン接種したマウスから採取した脾細胞の活性化の定量化を示す図である。（Ａ）様々な成熟状態のＤＣおよびＤＣ／Ｅ７ＯＧ ＥＢをワクチン接種したマウスから採取した脾細胞によるＥ．Ｇ７－ＯＶＡおよびＥＬ４細胞の特異的溶解。（Ｂ）様々な成熟状態のＤＣおよびＤＣ／Ｅ４ ＥＢをワクチン接種したマウスから採取した脾細胞によるＥ．Ｇ７－ＯＶＡおよびＥＬ４細胞の特異的溶解。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１４日間隔で２回、ＤＣおよびＥＢをワクチン接種し、２回目の注射後に脾細胞を採取した後、エフェクター（脾細胞）対標的（腫瘍細胞）比２５：１で腫瘍細胞とともに４時間インキュベートした。続いて、腫瘍細胞の特異的溶解は、フローサイトメトリーによるＹＯ－ＰＲＯ－１染色細胞の比によって決定し、データは、平均値±ＳＤとして示す（ｎ＝６）。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他の状況を指示しない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞外ブレブ」に対する言及は、複数のそのような細胞外ブレブを包含し、「ワクチン」に対する言及は、１つまたは複数のワクチンおよび当業者に公知のそれらの等価物に対する言及を包含する。

【0010】

また、「または」の使用は、別記されない限り、「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「包含している」は交換可能であり、限定すると意図されるものではない。

【0011】

様々な実施形態の記載が「含んでいる」という用語を使用する場合、いくつかの具体例において、一実施形態が「本質的にからなる」または「からなる」という言語を使用して代替的に記載され得ることが当業者に理解されることは、さらに理解されよう。

【0012】

別記されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は全て、本開示が属する技術分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。多くの方法および試薬は、本明細書に記載されるものと同様または等価であるが、例示的な方法および材料が本明細書において開示されている。

【0013】

本明細書で言及される刊行物は全て、方法論を記載および開示する目的で、参照により本明細書に完全に組み込まれ、それらは本明細書における記載に関連して使用され得る。さらに、本開示において明確に定義された用語に類似しているか、またはそれと同一である１つまたは複数の刊行物において提示される任意の用語に関しては、本開示において明確に提供されるような用語の定義が、全ての点で優先される。

【0014】

本開示は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されるものではなく、したがって多様であり得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態について記載することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0015】

実用例におけるもの、または別記される場合を除いて、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表す数は全て、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、パーセントに関連して本発明について記載するのに使用される場合、±１％を意味する。

【0016】

「ブレブ形成」、「原形質膜ブレブ形成」または「細胞膜ブレブ形成」という用語は、本明細書において使用される場合、全てが、細胞外ブレブ（ＥＢ）の産生をもたらす細胞内において原形質膜ブレブ形成を誘導する本明細書において開示される方法を指す。ブレブは、細胞骨格が原形質膜から局所的に分断することによって引き起こされる細胞の原形質膜における不規則なバルジである。バルジは最終的に、ともに細胞質に関わる親原形質膜から分離して、小胞、即ち、細胞外ブレブを形成する。ブレブ形成はまた、細胞の移動運動および細胞分裂を含むいくつかの正常な細胞プロセスに関与している。原形質膜の典型的なブレブ形成は、後期アポトーシスを経験した細胞の形態学的特徴であるのに対して、化学的または物理的に誘導されたブレブ形成は、細胞および分子プロファイルが保存され、一貫して高収率の任意の細胞段階での原形質膜を変換する能動的な方法である。したがって、細胞ブレブ形成は、物理的または化学的処置によって操作することができる。細胞ブレブ形成は、微小管の分解後、アクチン重合の阻害、膜の剛性の増加またはミオシン運動の不活性化によって、および細胞内圧力を調整することによって誘導することができる。ＥＢはまた、スルフヒドリル基を結合する薬剤（即ち、スルフヒドリル遮断剤）への曝露などの様々な細胞外化学刺激に応答して産生され得る。

【0017】

「ブレブ形成剤」という用語は、本明細書において使用される場合、細胞に投与されると、細胞が原形質膜ブレブ形成を経験するよう誘導するスルフヒドリル遮断剤などの化学剤を指す。

【0018】

「細胞外ブレブ」または「ＥＢ」という用語は、本明細書において使用される場合、「誘導細胞由来小胞」または「ＩＣＶ」と同義であり、細胞とブレブ形成剤との接触からの直接的な結果として形成される細胞外小胞を指す。したがって、ＥＢは、天然に存在する細胞外小胞と同義ではない。というのは、後者はブレブ形成剤の存在なしで形成されるのに対して、前者は産生されるのにブレブ形成剤の使用を必要とするためである。本明細書において記載される方法および組成物は、全てのサイズのＥＢに適用することができる。特定の実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物は、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍ、１０００ｎｍ、１１００ｎｍ、１２００ｎｍ、１３００ｎｍ、１４００ｎｍ、１５００ｎｍ、１６００ｎｍ、１７００ｎｍ、１８００ｎｍ、１９００ｎｍ、２０００ｎｍ、２５００ｎｍ、３０００ｎｍ、３５００ｎｍ、４０００ｎｍ、５０００ｎｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、または前述の値のいずれか２つを含むか、もしくはその間に存在する任意の範囲（その小数増分を含む）の平均直径を有するＥＢを含む。さらに、本明細書において開示されるＥＢは、対象の免疫系を調整することができる抗原を発現する目的の細胞から産生される。本開示のＥＢは、核酸、タンパク質、ペプチド、脂質、オリゴ糖などの生体分子；抗ウイルス薬、抗生物質、および抗真菌薬のような医薬品などの治療剤；プロドラッグ；遺伝子サイレンシング剤；化学療法；診断剤；ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＣＲＩＳＰＲｉ系、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系などの遺伝子編集系の構成成分などをさらに封入してもよい。特定の実施形態では、本明細書において開示されるＥＢは、本明細書において開示されるような外来抗原を発現する遺伝子操作された抗原性提示細胞または感染された細胞から産生され、ここでＥＢは、封入された抗ウイルス剤、抗生物質、および／または化学療法剤をさらに含む。

【0019】

「ナノメートルサイズの細胞外ブレブ」、「ｎＥＢ」または「ｎＩＣＶ」という用語は、本明細書において使用される場合、ナノメートルサイズ範囲の直径を有する本明細書において記載されるようなブレブ形成剤を使用して細胞から産生されたＥＢを指す。特定の実施形態では、ｎＥＢは、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、最大１０００ｎｍの直径を有するか、または前述の値のいずれか２つを含むか、もしくはその間に存在する範囲（その小数増分を含む）である。

【0020】

「マイクロメートルサイズの細胞外ブレブ」、または「ｍＥＢ」または「ｍＩＣＶ」という用語は、本明細書において使用される場合、全てがマイクロメートルサイズ範囲の直径を有する本明細書において記載されるようなブレブ形成剤を使用して目的の細胞から産生された細胞外ブレブを指す。特定の実施形態では、ｍＥＢは、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、または前述の値のいずれか２つを含むか、もしくはその間に存在する範囲（その小数増分を含む）の直径を有する。

【0021】

「外来抗原」という用語は、本明細書において使用される場合、体外に由来する抗原を指す。外来抗原の例として、ウイルスもしくは微生物（細菌および原生動物など）の一部またはそれらによって産生された物質、ならびにヘビ毒中の物質、食品中のある特定のタンパク質、および他の個体由来の血清および赤血球の構成成分が挙げられる。

【0022】

「内因性抗原」という用語は、対象自体の細胞に由来する抗原を指す。内因性抗原の例として、癌または腫瘍抗原、ならびに病原体（例えば、細菌、ウイルス、または真菌）による感染の結果で産生された細胞抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

【0023】

「スルフヒドリル遮断剤」という用語は、本明細書において使用される場合、スルフヒドリル基が、通常アルキル化もしくはジスルフィド交換反応を介してスルフヒドリル遮断剤によって遮断または結合されるように細胞のスルフヒドリル基と相互作用する化合物または試薬を指す。スルフヒドリル基を遮断もしくは結合する本明細書において開示される方法または組成物において使用することができる化学剤として、塩化水銀、ｐ－クロロ水銀ベンゼンスルホン酸、塩化第二金、ｐ－クロロ水銀ベンゾエート、クロルメロドリン、メラルリドナトリウム、ヨードアセトアミド、パラホルムアルデヒド、ジチオトレイトール、およびＮ－エチルマレイミドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0024】

本開示の目的で「癌」という用語は、別記されない限り、細胞増殖性障害、新生物、前癌細胞障害および癌を包含するのに使用される。したがって、「癌」は、転移または腫瘍成長につながる可能性のある異常な細胞増殖を経験する任意の細胞を指す。例示的な癌として、副腎皮質癌、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、肛門直腸癌、肛門管の癌、虫垂癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳脳星細胞腫、基底細胞癌、皮膚癌（非メラノーマ）、胆道癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、泌尿器の膀胱癌、骨および関節癌、骨肉腫および悪性線維性組織球腫、脳癌、脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視経路および視床下部神経膠腫、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、消化管癌、神経系癌、神経系リンパ腫、中枢神経系癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ系新生物、菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮内膜癌、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃の（胃）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍神経膠腫、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、眼球癌、膵島細胞腫瘍（膵内分泌）、カポジ肉腫、腎臓癌、腎癌、喉頭癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、口唇および口腔の癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、エイズ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、髄芽腫、メラノーマ、眼内（眼）メラノーマ、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、中皮腫、転移性頸部扁平上皮癌、口の癌、舌の癌、多発性内分泌腫瘍症候群、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性障害、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口腔の癌、中咽頭癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎盂および尿管癌、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、軟部組織肉腫、子宮癌、子宮肉腫、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌（メラノーマ）、乳頭腫、光線性角化症およびケラトアカントーマ、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃（胃の）癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、喉の癌、胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管および他の泌尿器の移行上皮癌、妊娠性絨毛性腫瘍、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、子宮体癌、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

「有効量」という用語は、本明細書において使用される場合、所望の結果または効果の少なくとも再現可能に検出可能な量を生じるのに十分な量を指す。有効量は、特定の状態および状況によって異なる。そのような量は、所与の状況に対して当業者によって決定され得る。

【0026】

「患者」、「対象」および「個体」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、予防処置（例えば、ワクチン接種）を含む処置が提供される動物、特にヒトを指す。これには、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語は、本明細書において使用される場合、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシなどの哺乳動物およびニワトリ、両生類、爬虫類などの非哺乳動物を含む。１つの実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は、実験動物または疾患モデルとしての動物代用である。「哺乳動物」は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜動物および農場動物、動物園の動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。患者または対象には、前述の任意のサブセット、例えば、上記の全てが含まれるが、ヒト、霊長類もしくは齧歯類などの１つまたは複数の群または種は排除される。対象は、雄または雌であり得る。対象は、完全に発達した対象（例えば、成体）または発達過程を経験している対象（例えば、子供、乳児または胎児）であり得る。

【0027】

「単離された」という用語は、本明細書において開示されるＥＢに関連して使用される場合、ＥＢが、それが生成されたか、またはそれが通常自然に存在するたいていの他の細胞構成成分から分離されているという事実を指す。本明細書において開示されるＥＢは通常、それらが、たいていの他の細胞構成成分および細胞砕片から実質的に単離されている状態乃至完全に単離されている状態に調製されている。

【0028】

「治療有効量」という用語は、本明細書において使用される場合、状態を有する典型的な対象に投与された場合に、状態の１つまたは複数の症状における治療上有意な低減に影響を及ぼすのに十分な量を指す。症状における治療上有意な低減は、例えば、対照または非処置対象と比較した場合に例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、またはそれ以上である。

【0029】

「処置する」または「処置」という用語は、本明細書において使用される場合、症状を排除または減少することが目的である治療的処置を指す。有益な、または所望の臨床結果として、症状の排除、症状の軽減、状態の程度の減少、状態の安定化（即ち、悪化しないこと）状況、状態の進行の遅延または緩徐化が挙げられるが、これらに限定されない。

【0030】

免疫療法は、広い範囲の感染性疾患および癌に対する最も有望で多様な治療戦略の１つとして大きな関心が持たれている。一般にワクチンと呼ばれる免疫学的に活性な材料（例えば、抗原）を送達することによる免疫系の活性化は、ヒトの健康と福祉の向上に多大な貢献をしている。ワクチン接種の成功は、標的抗原ペプチドを、免疫賦活性シグナルを有するＴ細胞に提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって中心的に果たされている。樹状細胞（ＤＣ）は、Ｔ細胞を活性化する極めて強力な能力を有するプロフェッショナルＡＰＣであり、それにより特に癌に対する細胞ベースのワクチン接種の主要な標的となっている。

【0031】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはアクセサリー細胞は、その表面に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって結合された抗原を表示する細胞であり、このプロセスは、抗原提示として既知である。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは、抗原をプロセシングし、それらをＴ細胞に提示する。Ｔ細胞の活性化に関与するＡＰＣは通常、樹状細胞である。Ｔ細胞は、「遊離」または可溶性抗原を認識することができない（したがって、それらに応答することができない）。Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子のような担体分子を介して細胞によってプロセシングおよび提示された抗原を認識して応答することができるのみである。ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩに提示される外因性抗原を認識することができ、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩに提示される内因性抗原を認識することができる。体内のたいていの細胞は、抗原を、ＭＨＣクラスＩを介してＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に提示することができるが、「抗原提示細胞」という用語は、プロフェッショナルＡＰＣについて記載するのに具体的に使用される場合が多い。そのような細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を発現し、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞ならびに細胞傷害性Ｔ細胞を刺激することができる。

【0032】

プロフェッショナルＡＰＣは、Ｔ細胞へ抗原を提示することを専門としている。プロフェッショナルＡＰＣは、食作用（例えば、マクロファージ）、マクロピノサイトーシス、または受容体媒介性エンドサイトーシス（Ｂ細胞）のいずれかによって抗原を内部移行し、抗原をペプチド断片へとプロセシングし、続いてそれらのペプチド（クラスＩ ＭＨＣ分子にまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合されている）をそれらの膜上に表示するのに非常に効率的である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原－クラスＩ ＭＨＣ分子複合体または抗原－クラスＩＩ ＭＨＣ分子複合体を認識し、それと相互作用する。次に、さらなる共刺激シグナルが、抗原提示細胞によって産生され、Ｔ細胞の活性化につながる。共刺激分子およびＭＨＣクラスＩＩの発現は、プロフェッショナルＡＰＣの決定的な特徴である。また、プロフェッショナルＡＰＣは全て、同様にＭＨＣクラスＩ分子を発現する。

【0033】

プロフェッショナル抗原提示細胞の主なタイプは、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞である。

【0034】

樹状細胞は、最も広範囲の抗原提示を有し、ナイーブＴ細胞の活性化に必要である。ＤＣは、ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞の両方に抗原を提示する。また、ＤＣは、それらがＭＨＣクラスＩ分子上の外因性抗原を細胞傷害性Ｔ細胞に提示するプロセスである交差提示を遂行することができる。交差提示は、これらのＴ細胞の活性化を可能にする。樹状細胞はまた、末梢性トレランスにおいて役割を果たし、それは自己免疫疾患の防止に寄与する。

【0035】

外来抗原に遭遇する前、樹状細胞は、それらの細胞表面に非常に低レベルのＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子を発現する。これらの未熟樹状細胞は、ヘルパーＴ細胞へ抗原を提示する際に効果がない。樹状細胞のパターン認識受容体が、病原体関連分子パターンを認識すると、抗原は貪食され、樹状細胞は活性化されるようになり、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現をアップレギュレートする。また、それがＣＤ４０およびＢ７を含むＴ細胞活性化に要されるいくつかの共刺激分子をアップレギュレートする。後者は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面にあるＣＤ２８と相互作用することができる。続いて、樹状細胞は、完全に成熟したプロフェッショナルＡＰＣである。樹状細胞は、組織からリンパ節に移動し、そこで樹状細胞は、Ｔ細胞に遭遇して活性化する。

【0036】

樹状細胞（ＤＣ）は、実質的に全ての組織において見出すことができ、そこで樹状細胞は恒常性の不均衡を検出し、Ｔ細胞への提示のために抗原をプロセシングして、自然免疫応答と適応免疫応答との関連性を確立させる。さらに、ＤＣは、進行中の免疫応答を改変するサイトカインおよび増殖因子を分泌し、ナチュラルキラー細胞および自然リンパ球（ＩＬＣ）のような他の免疫細胞とのそれらの相互作用に影響される。樹状細胞は、「成熟」および「未熟」の２つの異なる機能性状態で見出される。これらは、多くの特徴によって区別されるが、二次リンパ器官において抗原特異的ナイーブＴ細胞を活性化する能力は、成熟樹状細胞の特質である。樹状細胞の成熟は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の認識によって検出される組織恒常性の攪乱によって誘発される。成熟は、代謝、細胞、および遺伝子転写プログラムをオンにし、樹状細胞が、二次リンパ器官において末梢組織からＴ依存性領域まで遊走することが可能となり、そこでＴリンパ球活性化抗原提示が行われ得る。

【0037】

成熟中、ＤＣは接着構造を損失し、細胞骨格を再編成し、それらの運動性を高める。ＤＣ成熟はまた、それらのエンドサイトーシス活性の減少につながるが、ＭＨＣ－ＩＩおよび共刺激分子の発現の増加を引き起こす。成熟ＤＣは、より高レベルのケモカイン受容体であるＣＣＲ７を発現し、Ｔ細胞の活性化に必須なサイトカインを分泌する。したがって、成熟ＤＣ細胞と抗原特異的Ｔ細胞との間の相互作用は、抗原特異的免疫応答のトリガーとなる。ＣＤ４＋Ｔ細胞と相互作用すると、ＤＣは、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、または他のＣＤ４＋Ｔ細胞サブタイプなどの種々のヘルパーＴ（Ｔｈ）サブセットへのそれらの分化を誘導し得る。未熟ＤＣは、それらが共刺激分子の低い表面発現、ケモカイン受容体の低い発現を有し、免疫賦活性サイトカインを放出しないため、ナイーブリンパ球エフェクター応答の乏しい誘導物質である。しかし、これらの「未熟」細胞は、レクチン、Ｔｏｌｌ様、ＦＣおよび補体受容体を含む受容体媒介性エンドサイトーシスならびにマクロピノサイトーシスを介して、その高いエンドサイトーシス能に起因して、抗原捕捉に非常に効率的である。したがって、未熟ＤＣは、実際に、侵入する病原体に対するセンチネルとして作用するだけでなく、組織スカベンジャーとしても作用し、アポトーシス細胞および壊死細胞を捕捉する。

【0038】

一次免疫応答を開始するというそれらの特有の役割を考慮して、患者由来培養ＤＣから調製されたワクチン製品は、広い範囲のワクチン用途向けに開発中であり、末梢血から、または骨髄から調製される。そのような個別化ＤＣベースのワクチンは、安全で十分な耐容性を示すことがわかっており、それらは抗原特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する。しかしながら、そのようなワクチン製品の有効性は、限られた患者数においてのみ実証されており、一貫した臨床的成果を示していない。これは、患者ベースの製品の効力を標準化することが不可能であるという事実に主に起因している。血液または骨髄から樹状細胞を採取し、機能的樹状細胞を生成するための標準的な操作手順を開発することは可能であるが、完全な再現性は、患者間の変動性によって常に妨げられている。さらに、大規模な実施に関してかなりのハードルがあり、時間を消費し、高価である。さらに、ＤＣは多くの場合、病理学的微小環境に順応している（例えば、腫瘍組織において抑制されるようになっている）。

【0039】

需要の高い免疫療法の例の１つは、癌ワクチンである。多くの戦略は、腫瘍ワクチン用に腫瘍抗原をＤＣに負荷するよう開発されている。腫瘍関連ペプチドまたはタンパク質でパルスされたＤＣは、抗腫瘍免疫の誘導をもたらす（腫瘍特異的遺伝子をコードするウイルスベクターによるか、もしくはリポソームＤＮＡもしくはＲＮＡを用いたトランスフェクションによる腫瘍抗原のＤＣへの導入）。これらの戦略は、ある程度は有効であるが、ある特定の欠点を共有している。例えば、腫瘍抗原は、ほとんど同定されておらず、腫瘍細胞は、腫瘍抗原のダウンレギュレーションにより認識を回避する可能性がある。代替戦略として、化学的、物理的、または生物学的方法により癌細胞に融合されたＤＣは、ＤＣ由来共刺激分子、および特定腫瘍由来抗原の存在を組み合わせるヘテロカリオンを創出する。したがって、ＤＣ癌融合細胞は、腫瘍抗原を発達させて、免疫細胞に提示するのに、また有効な抗腫瘍応答を誘導するのに必須な要素を組み合わせている。しかしながら、ＤＣ癌細胞融合の使用に対する主な制限は、十分な量の自家ＤＣ細胞の利用可能性、生癌試料の利用可能性の制限、および低い臨床応答である。融合技術は、癌ワクチンの設計において万能なアプローチであり、ほぼ全てのタイプの癌細胞に適用可能であり得るが、そのような万能性および幅広い適用性は、ワクチンを標準化するのをより困難にする変動につながる。最も重要なことは、ＤＣ癌細胞融合は、かなりの安全性の懸念を有している。

【0040】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をｅｘ ｖｉｖｏで負荷したＤＣは、多くの前臨床研究ならびにいくつかの初期臨床試験において主に予防有効性およびいくらかの治療有効性を示している。ＤＣは従来、腫瘍細胞溶解物、腫瘍由来アポトーシス小体、精製されたＴＡＡタンパク質によるインキュベーション、またはＴＡＡ由来ペプチド、あるいはＴＡＡコードｃＤＮＡまたはｍＲＮＡによる形質導入を介して、予め決められたＴＡＡを負荷される。しかしながら、癌ワクチン接種のために既知の抗原を用いるこのアプローチは、多くの形態の癌における特徴的な抗原の欠如、免疫系に提供されるべき抗原分子プロファイルの制限、ならびに時間および労働集約型の同定および調製によって課題とされている。あるいは、ＤＣおよび腫瘍細胞のハイブリダイゼーションは、各種動物モデルおよび進行期の癌患者において実証されるように、未同定抗原を含む完全なＴＡＡレパートリーの、Ｔナイーブ細胞への確実な提示の利点を提供する。融合性化学剤（例えば、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］）、電場（電気融合）、またはウイルスを使用してＤＣを腫瘍細胞と融合させると、非融合細胞ならびに同じ種類の融合細胞を必然的に産生し、多くの場合、有効性の改善ためにさらなる精製を要する。

【0041】

安全性および免疫原性が確認されたにもかかわらず、癌に対する細胞ベースのワクチン接種に関する臨床試験の結果は、非常に失望的なものであった。これは主に、患者由来材料の厄介な効力の標準化、再現性、および調製のスケーラビリティの事実に起因している。さらに、免疫抑制性腫瘍微小環境への適応および不安定な保管は、ＤＣベースのワクチンおよびＣＡＲ－Ｔ細胞療法などの細胞ベースの癌免疫療法にとって共通の課題であることが知られている。細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞ベースの免疫療法に代わる無細胞代替法として研究されていたが、ＥＶベースの治療薬（例えば、ＤＣ由来エクソソーム、デクソソーム）は、構造および機能の両方において高い不均一性、低収量および純度、乏しい品質管理、ならびにスケーラビリティの制限に起因して、臨床的置き換えに向けてゆっくりと進行している。

【0042】

本開示は、安定なハイブリドーマを産生するためのＡＰＣおよび標的細胞の融合によって癌に対する免疫原性を増強する組成物、製剤ならびに方法を提供する。次に、最適に免疫活性化されたハイブリドーマは、迅速で、効率的で、かつコストおよび労力にとって都合のよい化学的におよび物理的に誘導されたプロセスを介して、無細胞の細胞様小胞に変換される。ＡＰＣ－標的細胞ハイブリドーマから産生された得られた細胞外ブレブは、抗原性タンパク質を提示および送達し、それらをＭＨＣ ＩおよびＩＩ分子と複合して提示して、完全に最適化された分子機構で所望の免疫活性化（または抑制）モードでＴ細胞を活性化することができる。

【0043】

本開示の組成物、製剤および方法は、分子的に調整可能な免疫応答、所望の様式における保証された免疫応答、抗原の完全なライブラリーに対する包括的な免疫活性化、適正な量の樹状細胞の利用可能性、品質管理、安全性、および有効性を含む、タンパク質、核酸、および樹状細胞の現在のワクチン配合物に関連した主要な制限を克服している。ＤＣおよび標的細胞の融合は、抗原提示においてより効率的かつ包括的であり、強力な免疫を誘導する免疫原性細胞を創出する。さらに、ＤＣおよび標的細胞の操作は、独立して実施することができる一方で、各細胞特性は長期間持続することができる。無細胞ベースのＡＰＣ標的細胞ワクチン接種の使用は、細胞ベースのワクチンを含む従来のワクチンよりも安全でより効果的なワクチン分子の産生に関して優れた制御メカニズムを提供する。さらに、細胞とは異なり、細胞様の無細胞ＥＢは、保管に対して安定であり、様々な配合物に対して高度に修正可能であり、長期間にわたって持続性のＴ細胞の活性化が可能である。

【0044】

癌免疫療法の重要な概念は、免疫系の操作により癌の制御が達成され、理想的には治癒することができるということである。多くの研究により、細菌産物およびＴＬＲアゴニストなどの一般的な免疫系活性化因子を使用した場合の臨床的有益性が示されている。これらのアプローチの抗腫瘍活性は、それが行われた場合、これらの化合物の、免疫系を活性化する能力に起因し、それは次に、腫瘍細胞を死滅させる能力を獲得する。この効果の多くは、ＤＣ活性化、続くＴ細胞応答の生成に起因するものであることがわかった。樹状細胞は、適応免疫応答の重要な活性化因子として、抗腫瘍免疫応答の誘導において中心的な役割を果たすと予想され、これらの細胞が癌患者において示す多くの機能的逸脱は、それらが実際に抗腫瘍免疫応答において果たし得る関連する役割を強調している。これらのデータに直面して、ＤＣの免疫活性化力を利用して、癌患者において抗腫瘍応答を誘導することは、直観的である。しかしながら、多数のこれらの細胞を非侵襲的な方法で得ることは困難であるため、ＤＣを使用する治療アプローチは縮小されてきた。

【0045】

本開示は、大量に成長し得るＤＣベースのハイブリドーマを提供することによって、ＤＣ産生の問題点を防ぐことができる組成物、製剤および方法を提供し、さらに、本開示の方法を使用して、ほぼ無制限の量のＥＢを生成することができる。特に、本開示のハイブリドーマは、免疫系を活性化（例えば、癌ワクチン）または抑制（例えば、自己免疫疾患）するために、抗原提示細胞および標的細胞（例えば、癌細胞）から生成されている。ハイブリドーマ形成に使用される抗原提示細胞は、任意の供給源、理想的にはヒトに由来されてもよく；任意のサブタイプの抗原提示細胞（例えば、骨髄由来樹状細胞）を含むことができ；および／または任意の成熟状態の抗原提示細胞（例えば、未熟ＤＣまたは成熟ＤＣ）を含むことができる。さらに、ハイブリドーマに関する抗原提示細胞の供給源は、処置されるべき対象に由来し得る（即ち、個別化処置）。標的細胞に関して、標的細胞は通常、癌細胞である。ほとんどのタイプの癌細胞は、本明細書において記載される方法および当該技術分野において記載される方法を使用して、樹状細胞と融合させることができるため、癌細胞のタイプは限定的ではない。本開示のハイブリドーマを作製するのに使用され得る癌細胞の例として、骨髄腫、リンパ腫、癌腫、肉腫、白血病、腺癌、胸腺腫、または他のタイプの癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0046】

本明細書において開示されるＥＢ生産技術は、工業的および医学適用性を有するハイブリドーマ由来の細胞様の無細胞ベースのワクチンを産生するためのスケーラブルな選択肢を提示する。さらに、本明細書において記載されるブレブ形成剤を使用することによって、ハイブリドーマを誘導して、ワクチンとして使用することができるナノスケールおよびマイクロスケールのＥＢを産生することができる。ハイブリドーマの生理活性特性を維持することによって、ＥＢは投与時に免疫応答を誘発することができる。本発明において提示される研究において、ＥＢは、アジュバントの非存在下でさえ、強力な免疫応答を誘発することができる。さらに、本明細書において開示されるＥＢは、そのように所望であれば、他の治療剤（例えば、化学療法薬）またはアジュバントを負荷することができる。

【0047】

本明細書において提示される研究において示されるように、ハイブリドーマから産生されたＥＢは、ハイブリドーマ自体と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで改善された抗癌効果を有していた。これらの結果に基づいて、本開示の組成物、方法、およびキットは、抗原性タンパク質を提示および送達して、それらをＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子と複合して提示するものとして利用され、Ｔ細胞を活性化する。本開示の組成物、方法およびキットの潜在的な利点として、免疫応答の調整により、保管に対して安定であり、様々な配合物に対して高度に修正可能であり、また体内で長期間にわたって持続性のＴ細胞の活性化が可能な、癌および外来抗原に対してより有効なタイプの免疫を生じることが可能となることが挙げられるが、これに限定されない。

【0048】

特に、本開示は、ハイブリドーマからわずか数時間で高収率のＥＢを提供し、マイクロスケールおよびナノスケールサイズのＥＢの両方を産生する技法ならびに方法を規定する。例えば、本明細書において記載されるブレブ形成剤の使用は、本明細書において提示される研究において、早ければ３０分程度で、８時間に最適化されて、ＥＢの産生を誘導することができる。

【0049】

さらなる実施形態では、ブレブ形成を誘導する化学剤は、スルフヒドリル遮断剤である。スルフヒドリル遮断剤の例として、塩化水銀、ｐ－クロロ水銀ベンゼンスルホン酸、塩化第二金、ｐ－クロロ水銀ベンゾエート、クロルメロドリン、メラルリドナトリウム、ヨードアセトミド、パラホルムアルデヒド、ジチオトレイトール、およびＮ－エチルマレイミドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＥＢは、（１）パラホルムアルデヒド、（２）パラホルムアルデヒドおよびジチオトレイトール、または（３）Ｎ－エチルマレイミドによって、ハイブリドーマにおいて誘導されるブレブ形成から産生される。さらなる実施形態では、ＥＢは、ハイブリドーマを、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、または１０ｍＭと１００ｍＭから、および２０ｍＭから５０ｍＭを含む、前述の濃度のいずれか２つを含む範囲のパラホルムアルデヒドを含む溶液と接触させることによって、ハイブリドーマにおいて誘導されるブレブ形成から産生される。

【0050】

さらなる実施形態では、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含む溶液は、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．４５ｍＭ、１．５ｍＭ、１．５５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．６５ｍＭ、１．７ｍＭ、１．７５ｍＭ、１．８ｍＭ、１．８５ｍＭ、１．９ｍＭ、１．９５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．３ｍＭ、２．４ｍＭ、２．４５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．５５ｍＭ、２．６ｍＭ、２．６５ｍＭ、２．７ｍＭ、２．７５ｍＭ、２．８ｍＭ、２．８５ｍＭ、２．９ｍＭ、２．９５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．１ｍＭ、３．２ｍＭ、３．３ｍＭ、３．４ｍＭ、３．４５ｍＭ、３．５ｍＭ、３．５５ｍＭ、３．６ｍＭ、３．６５ｍＭ、３．７ｍＭ、３．７５ｍＭ、３．８ｍＭ、３．８５ｍＭ、３．９ｍＭ、３．９５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、６．０ｍＭ、６．５ｍＭ、７．０ｍＭ、７．５ｍＭ、８．０ｍＭ、８．５ｍＭ、９．０ｍＭ、９．５ｍＭ、１０ｍＭ、または１．０ｍＭから３ｍＭ、および１．５ｍＭから２．５ｍＭを含む、前述の濃度のいずれか２つを含むか、またはその間に存在する任意の範囲の濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）をさらに含む。代替的な実施形態では、ＩＣＶは、ハイブリドーマを、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、６．０ｍＭ、６．５ｍＭ、７．０ｍＭ、７．５ｍＭ、８．０ｍＭ、８．５ｍＭ、９．０ｍＭ、９．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、１０．５ｍＭ、１１．０ｍＭ、１１．５ｍＭ、１２ｍＭ、１２．５ｍＭ、１３．０ｍＭ、１３．５ｍＭ、１４．０ｍＭ、１４．５ｍＭ、１５．０ｍＭ、１５．５ｍＭ、１６．０ｍＭ、１６．５ｍＭ、１７．０ｍＭ、１７．５ｍＭ、１８．０ｍＭ、１８．５ｍＭ、１９．０ｍＭ、１９．５ｍＭ、２０ｍＭ、または２．０ｍＭから２０．０ｍＭ、および２．０ｍＭから５．０ｍＭを含む、前述の濃度のいずれか２つを含むか、またはその間に存在する任意の範囲の濃度のＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含む溶液と接触させることによって、ハイブリドーマにおいて誘導されたブレブ形成から産生される。さらなる実施形態では、ＰＦＡ；ＰＦＡおよびＤＴＴ；またはＮＥＭを含む溶液は、緩衝平衡塩溶液を含む。緩衝生理食塩水の例として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＩＣＶＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、およびリンゲル平衡塩溶液（ＲＢＳＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、ＰＦＡ；ＰＦＡおよびＤＴＴ；またはＮＥＭを含む溶液は、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、および１０倍、または前述の濃度／希釈のいずれか２つを含むか、もしくはその間に存在する任意の範囲（それらの小数値を含む）の濃度／希釈の緩衝平衡塩溶液を含む。

【0051】

ある特定の実施形態では、本開示はまた、ＥＢが任意の適切な手段によって収集されて、ＥＢをハイブリドーマまたはハイブリドーマの細胞砕片と分離し得ることを提供する。一部の実施形態では、ＥＢを単離するために、細胞および細胞砕片は、１０００から１５００ｒｐｍで１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０分間の遠心分離、続くハイブリドーマおよびハイブリドーマの細胞砕片の除去によって除去することができる。続いて、ｍＥＢおよびｎＥＢは、１０，０００×ｇから１８，０００×ｇで５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５分間の遠心分離によって回収することができる。ＥＢは、濃縮器を使用してさらに濃縮され得る。本明細書において開示されるＥＢのサイズは、本明細書において提示される単離方法を使用することによって制御することができる。

【0052】

本開示はさらに、本明細書において開示されるＥＢが、（１）他の薬剤もしくは分子と組み合わせて、および／または（２）生体分子、治療剤、プロドラッグ、アジュバント、診断剤、および／または遺伝子編集系の構成要素などの他の薬剤または分子を負荷して使用され得ることを提供する。特定の実施形態では、ＩＣＶは、１つまたは複数の化学療法薬と組み合わせて、またはそれらを含むカーゴを負荷して使用される。

【0053】

本開示の実施形態に従って産生されたＥＢはまた、直接的な膜透過、化学的標識およびコンジュゲーション、静電コーティング、吸着、吸収、エレクトロポレーション、またはそれらの任意の組合せを介してカーゴを負荷され得る。さらに、本開示のある特定の実施形態に従って産生されたＥＢは、一部のカーゴがブレブ形成に先立ってハイブリドーマに導入され得るのに対して、さらなるカーゴがブレブ形成中またはブレブ形成後に負荷され得るように、複数の負荷工程を経験してもよい。さらに、ＥＢは、ブレブ形成中にカーゴが負荷され、ブレブ形成後に別のカーゴがさらに負荷されてもよい。さらなる実施形態では、ＥＢは、ハイブリドーマまたはＥＢを、２５ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、２００ｐｇ／ｍＬ、３００ｐｇ／ｍＬ、４００ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、６００ｐｇ／ｍＬ、７００ｐｇ／ｍＬ、８００ｐｇ／ｍＬ、９００ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、または前述の濃度の任意の２つを含むか、もしくはその間に存在する任意の範囲の濃度を有するカーゴとともにインキュベートすることによって、上記で規定されるようなカーゴで負荷され得る。さらに、インキュベーションは、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、または前述の時点のいずれか２つを含むか、もしくはその間に存在する任意の範囲で行われ得る。あるいは、負荷条件は、ＩＣＶと化合物の比１：２０～２０：１、１：１５～１５：１、１２：１～１：１２、１１：１～１：１１、１０：１～１：１０、９：１～１：９、８：１～１：８、７：１～１：７、６：１～１：６、５：１～１：５、４：１～１：４、３：１～１：３、２：１～１：２、１．５：１～１：１．５、または１：１で行われ得る。さらに、カーゴ負荷されたＥＢの多分散性は、無負荷のＩＣＶと類似した多分散性指数（ＰＤＩ）を有し得る。したがって、カーゴ負荷されたＥＢは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、または前述の値のいずれか２つを含むか、またはその間に存在する任意の範囲のＰＤＩを有し得る。

【0054】

本開示はさらに、指定の投与様式用の本明細書に記載されるＥＢを含む医薬組成物および配合物を提供する。１つの実施形態では、医薬組成物は、ＥＢおよび薬学的に許容可能な担体を含む。「薬学的に許容可能な担体」という用語は、本明細書において使用される場合、対象薬剤を身体の臓器の１つ、もしくは一部から、身体の別の臓器、もしくは一部に運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、組成物の他の成分と適合性であるという意味で「許容可能」でなければならず、対象、例えばヒトへの投与と適合性である。そのような組成物は、本明細書において記載される投与経路などの多数の経路のうちの１つまたは複数を介した投与用に特異的に製剤化され得る。補足的な有効成分も、組成物に組み込むことができる。

【0055】

本開示はさらに、癌、感染性疾患、および自己免疫疾患用の無細胞ワクチンとしての本開示のＥＢを含む医薬組成物の使用を提供する。さらなる実施形態では、本開示はまた、ある量の本開示のＥＢを投与して、対象において免疫応答を誘発することを含む、対象を免疫化する方法を提供する。本明細書に記載されるＥＢ製剤を患者に投与する適切な方法として、ＥＢを患者に送達するのに適したｉｎ ｖｉｖｏ投与の任意の経路によるものが挙げられる。好ましい投与経路は、使用されるワクチンのＥＢの製剤のタイプ、および標的細胞集団に応じて、当業者に明らかである。ｉｎ ｖｉｖｏ投与の好ましい方法として、静脈内投与、腫瘍間投与、腹腔内投与、筋内投与、冠動脈内投与、動脈内投与（例えば、頸動脈への）、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、心室内投与、吸入（例：エアロゾル）、脳内投与、鼻腔投与、経口投与、肺投与、カテーテルの含浸、および組織への直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、好ましい投与経路は、ＥＢの筋内注射によるものである。さらなる実施形態では、好ましい投与経路は、ＥＢの腫瘍内注射によるものである。さらなる実施形態では、好ましい投与経路は、ＥＢの皮下注射によるものである。

【0056】

静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与および筋内投与は、当該技術分野において標準的な方法を使用して実施することができる。エアロゾル（吸入）送達も、当該技術分野において標準的な方法を使用して実施することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７～１１２８１ページ、１９９２を参照）。経口送達は、本発明のＥＢ製剤を、動物の腸における消化酵素による分解に抵抗することが可能な担体に複合体形成させることによって実施することができる。そのような担体の例として、当該技術分野において公知のものなどのプラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。

【0057】

本明細書において記載されるワクチン接種方法に関する適切な投薬および処置レジメンは、送達されるＥＢおよび対象の特定の状態に関して多様である。１つの実施形態では、投与は、所望の効果が達成される（例えば、感染性病原体に対する強力な免疫応答）まで、一定期間にわたる。

【0058】

本明細書において記載される治療用途における使用のために、キットおよび製造品も、本明細書において記載される。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器を受け入れるように区画化されているキャリア、パッケージ、または容器を含むことができ、容器はそれぞれ、本明細書において記載される方法において使用されるべき別個の要素のうちの１つを含む。適切な容器として、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料で形成され得る。

【0059】

例えば、容器は、任意選択で組成物中に、または本明細書において開示されるような別の薬剤と組み合わせて、本明細書において記載される１つまたは複数のＥＢを含むことができる。容器は任意選択で、滅菌アクセスポートを有する（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈溶液バッグまたはバイアルであり得る）。そのようなキットは任意選択で、本明細書において開示される化合物を、本明細書において記載される方法におけるその使用に関する識別説明またはラベルまたは説明書とともに含む。

【0060】

キットは通常、１つまたは複数のさらなる容器を含み、それぞれが、本明細書において記載される化合物の使用のための商業的観点およびユーザの観点から望ましい各種材料（任意選択で濃縮形態の試薬、および／またはデバイスなど）のうちの１つまたは複数を有する。そのような材料の非限定的な例としては、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ；使用のための内容物および／または説明書を列挙しているキャリア、パッケージ、容器、バイアルおよび／またはチューブのラベル、ならびに使用説明書を備えた添付文書が挙げられるが、これらに限定されない。説明書一式も、通常含まれる。

【0061】

ラベルは、容器上に、または容器に付随して存在し得る。ラベルを形成する文字、数字、またはその他の文字が容器自体に取り付けられているか、成形されているか、またはエッチングされている場合、ラベルは容器上に存在することができ、ラベルが例えば添付文書として、容器も保持するレセプタクルまたはキャリア内に存在する場合、ラベルは、容器に付随させることができる。ラベルは、内容物が特定用途に使用されるべきであることを示すのに使用することができる。ラベルはまた、本明細書において記載される方法におけるような、内容物の使用法を示すことができる。

【0062】

本開示は、本明細書において記載される方法、製剤および組成物が下記の態様（態様１から態様２８）によってさらに規定され得ることをさらに提供する。

【0063】

１．抗原提示細胞および標的細胞のハイブリドーマ由来の細胞外ブレブを含むワクチン製剤であって、該ハイブリドーマが、対象の免疫系を調整することができる抗原を発現し、該細胞外ブレブが、該ハイブリドーマをブレブ形成剤で処置することによって該ハイブリドーマから産生され、該抗原が、該細胞外ブレブの表面に表示され、好ましくは、該抗原が、該抗原に対する該対象の免疫系を活性化するか、あるいは該抗原が、該抗原に対する該対象の免疫系を不活性化し、好ましくは、該ワクチン製剤が、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、および／または希釈剤をさらに含み、好ましくは、該細胞外ブレブが、単離された細胞外ブレブであり、好ましくは、該細胞外ブレブが、１μｍから５００μｍのサイズである、ワクチン製剤。

【0064】

２．前記抗原提示細胞が、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞から選択され、好ましくは樹状細胞である、態様１のワクチン製剤。

【0065】

３．前記樹状細胞が成熟樹状細胞である、態様２のワクチン製剤。

【0066】

４．前記樹状細胞が未熟樹状細胞である、態様２のワクチン製剤。

【0067】

５．前記樹状細胞が、骨髄由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、または末梢血単核細胞由来樹状細胞である、態様２から４のいずれか１つのワクチン製剤。

【0068】

６．前記樹状細胞が、哺乳動物樹状細胞、好ましくはヒト樹状細胞である、態様２から５のいずれか１つのワクチン製剤。

【0069】

７．前記標的細胞が、癌細胞、異常もしくは罹患細胞、抗原を表示するよう操作された細胞、または感染性病原体に感染している細胞から選択され、好ましくは、前記標的細胞が哺乳動物細胞であり、より好ましくは、前記標的細胞がヒト細胞である、先述の態様のいずれか１つのワクチン製剤。

【0070】

８．前記標的細胞が、骨髄腫、リンパ腫、癌腫、肉腫、白血病、腺癌、胸腺腫、または悪性腫瘍由来の新生物細胞から選択される癌細胞である、先述の態様のいずれか１つのワクチン製剤。

【0071】

９．前記標的細胞が、ウイルス、真菌、または細菌によって感染されている細胞である、先述の態様のいずれか１つのワクチン製剤。

【0072】

１０．前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス、アイチウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、バンナウイルス、バーマフォレストウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ブニヤウイルスラクロス、ブニヤウイルスカンジキウサギ、オナガザルヘルペスウイルス、チャンディプラウイルス、チクングニアウイルス、コサウイルスＡ、コロナウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、デングウイルス、ドーリウイルス、ダグベウイルス、デュベンハゲウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス、ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス、ペギウイルス、ハンタンウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、馬痘ウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザ、ヒトパルボウイルスＢ１９、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトスプーマレトロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ヒトトロウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、イスファハンウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンアレナウイルス、ＫＩポリオーマウイルス、クンジンウイルス、ラゴスコウモリウイルス、レイクビクトリアマールブルグウイルス、ランガットウイルス、ラッサウイルス、ローズデールウイルス、跳躍病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、マヤロウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、メンゴ脳心筋炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、モコラウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サル痘ウイルス、ムンプスウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、ニューヨークウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、オニョンニョンウイルス、オルフウイルス、オロプーシェウイルス、ピチンデウイルス、ポリオウイルス、プンタトロフレボウイルス、プーマラウイルス、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロザウイルスＡ、ロスリバーウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、風疹ウイルス、鷺山ウイルス、サリウイルスＡ、サシチョウバエ熱シチリアウイルス、サッポロウイルス、セムリキ森林ウイルス、ソウルウイルス、サル泡沫状ウイルス、サルウイルス、シンドビスウイルス、サザンプトンウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介ポワッサンウイルス、トルクテノウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルスＯ、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＷＵポリオーマウイルス、ウエストナイルウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ヤバ様疾患ウイルス、黄熱ウイルス、およびジカウイルスから選択される、態様９のワクチン製剤。

【0073】

１１．前記真菌が、アブシディア・コリンビフェラ、アブシディア・ラモセ、アコリオン・ガリナエ、アクチノマヅラ属種、アジェロミセス・デルマチディディス、アレウリスマ・ブラジリエンシス、アレルシェリア・ボイディイ、アルスロデルマ属種、アスペルギルス・フラブス、アスペルギルス・フミガツ、バシディオボラス属種、ブラストミセス属種、カドフォラ属種、カンジダ・アルビカンス、セルコスポラ・アピイ、クリソスポリウム属種、クラドスポリウム属種、クラドスリクス・アステロイズ、コクシジオイデス・イミチス、クリプトコッカス・アルビヅス、クリプトコッカス・ガッチイ、クリプトコッカス・ラウレンチイ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クニンガメラ・エレガンス、デマチウム・ウェルネクケ、ディスコミセス・イスラエリイ、エモンシア属種、エモンシエラ・カプスラテ、エンドミセス・ゲオトリクム、エントモフトラ・コロナテ、エピデルモフィトン・フロッコスム、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス、フォンセケア属種、ゲオトリカム・カンジヅム、グレノスポラ・クハルトウメンシス、ギムノアスカス・ギプセウス、ハプロスポランギウム・パルブム、ヒストプラズマ属、ヒストプラズマ・カプスラツム、ホルミシウム・デルマチディディス、ホルモデンドルム属種、ケラチノミセス属種、ランゲロニア・ソウダネンセ、レプトスファエリア・セネガレンシス、リクテイミア・コリンビフェラ、ロブミセス・ロボイ．、ロボア・ロボイ、ロボミコーシス、マヅレラ属種、マラセチア・フルフル、ミクロコッカス・ペレチエリ、ミクロスポルム属種、モニリア属種、ムコール属種、結核菌、ナンニッツィア属種、ネオテスツディナ・ロサチイ、ノカルジア属種、オイディウム・アルビカンス、オスポラ・ラクチス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、ペトリエリディウム・ボイディイ、フィアロフォラ属種、ピエドライア・ホルタエ、ピチロスポルム・フルフル、ニューモシスチス・イロベシイ（またはニューモシスチス・カリニイ）、プルラリア・ゴウゲロチイ、ピレノカエタ・ロメロイ、リノスポリジウム・セーベリ、サボウラウディテス属（ミクロスポルム属）、サルトリア・フミガテ、セペドニウム属、スポロトリクム属種、スタキボトリス属、スタキボトリス・カルタルム、ストレプトミセス属種、チネア属種、トルラ属種、トリコフィトン属種、トリコスポロン属種、およびゾフィア・ロサチイから選択される、態様９のワクチン製剤。

【0074】

１２．前記細菌が、アクチノミセス・イスラエリイ、炭疽菌、セレウス菌、バルトネラ・ヘンセラ、バルトネラ・クインターナ、百日咳菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・ガリニイ、ボレリア・アフゼリ、ボレリア・レクレンチス、ブルセラ・アボルツス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマチス、オウム病クラミジア、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、ウェルシュ菌、破傷風菌、ジフテリア菌、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、野兎病菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・サンタロサイ、レプトスピラ・ウェイリイ、レプトスピラ・ノグチイ、リステリア・モノサイトゲネス、らい菌、結核菌、マイコバクテリウム・ウルセランス、マイコプラズマ・ニューモニエ、淋菌、髄膜炎菌、緑膿菌、リケッチア・リケッチア、チフス菌、ネズミチフス菌、ソンネ菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、ストレプトコッカス・アガラクチア、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌、梅毒トレポネーマ、ウレアプラズマ・ウレアリチカム、コレラ菌、ペスト菌、エルシニア・エンテロコリチカ、および仮性結核菌から選択される、態様９のワクチン製剤。

【0075】

１３．前記抗原提示細胞および／または標的細胞が、前記ワクチン製剤で処置されるべき対象由来である、先述の態様のいずれか１つのワクチン製剤。

【0076】

１４．前記抗原が、腫瘍特異的抗原、または腫瘍関連抗原を含む、先述の態様のいずれか１つのワクチン製剤。

【0077】

１５．前記腫瘍特異的抗原、または前記腫瘍関連抗原が、アルファフェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原、ｋ－ｒａｓ、ｐ５３の異常産物、アルファ－アクチニン－４、ＡＲＴＣ１、Ｂ－ＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質、ベータ－カテニン、ＣＡＳＰ－５、ＣＡＳＰ－８、ＣＤｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ－１、ＣＯＡ－２、ＣＳＮＫ１Ａ１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＦＮ１、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＧＡＳ７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ＨＬＡ－Ａ１１、ＨＬＡ－Ａ２、ｈｓｐ７０－２、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＥ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシンクラスＩ、Ｎ－ｒａｓ、ネオ－ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ－９、ｐ５３、ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ－ＳＳＸ１またはＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＧＦ－ベータＲＩＩ、ＴＰ５３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ－１、ＣＴ３７／ＦＭＲ１ＮＢ、サイクリン－Ａ１、Ｄ３９３－ＣＤ２０ｎ、ＧＡＧＥ－１，２，８、ＧＡＧＥ－３，４，５，６，７、ＧｎＴＶ、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＫＫ－ＬＣ－１、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１、ＬＲＰＡＰ１、ＬＹ６Ｋ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２ｍ、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ムチン、ＮＡ８８－Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－４、ＴＡＧ－１、ＴＡＧ－２、ＴＲＡＧ－３、ＴＲＰ２－ＩＮＴ２、ＸＡＧＥ－１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、ＣＥＡ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、マンマグロビン－Ａ、メラン－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ＯＡ１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＲＡＢ３８／ＮＹ－ＭＥＬ－１、ＴＲＰ－１／ｇｐ７５、ＴＲＰ－２、ＢＣＬＸ、ＢＩＮＧ－４、ＣＡＬＣＡ、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ、ｅｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、グリピカン－３、ＨＥＰＡＣＡＭ、ヘプシン、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＳＰＨ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＭＰ－３、ＭＵＣ１、メロー、ミッドカイン、ＷＴ１、ＶＥＧＦ、ＴＰＢＧ、テロメラーゼ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ１、ＲＡＧＥ－１、ＰＳＭＡ、ＰＲＡＭＥ、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＯＸ１０、およびサバイビンから選択される、態様１４のワクチン製剤。

【0078】

１６．前記抗原が、外来抗原または自己抗原である、先述の態様のいずれか１つのワクチン製剤。

【0079】

１７．前記外来抗原が、細菌、真菌またはウイルス由来である、態様１６のワクチン製剤。

【0080】

１８．前記自己抗原が、対象の身体に見出される任意の生体分子またはその一部から選択され、好ましくは、前記自己抗原が、対象の身体において見出されるタンパク質、ペプチドまたはその一部を含み、好ましくは、前記対象がヒト対象である、態様１６のワクチン製剤。

【0081】

１９．アジュバントをさらに含む、先述の態様のいずれか１つのワクチン製剤。

【0082】

２０．アジュバントを含まない、先述の態様のいずれか１つのワクチン製剤。

【0083】

２１．前記細胞外ブレブが、下記表面および成熟マーカーＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、および／またはＣＤ８６の１つまたは複数を含み、好ましくは、前記細胞外ブレブが、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６表面および成熟マーカーを含む、先述の態様のいずれか１つのワクチン製剤。

【0084】

２２．先述の態様のいずれか１つのワクチン製剤を作製する方法であって、
細胞外ブレブをハイブリドーマから、該ハイブリドーマを１つまたは複数のスルフヒドリル遮断剤と３０分～２４時間接触させることによって生成させることと、
該細胞外ブレブを単離すること
とを含む、方法。

【0085】

２３．前記１つまたは複数のスルフヒドリル遮断剤が、塩化水銀、ｐ－クロロ水銀ベンゼンスルホン酸、塩化第二金、ｐ－クロロ水銀ベンゾエート、クロルメロドリン、メラルリドナトリウム、ヨードアセトミド、パラホルムアルデヒド、ジチオトレイトール、およびＮ－エチルマレイミドからなる群から選択される、態様２２の方法。

【0086】

２４．前記１つまたは複数のスルフヒドリル遮断剤が、Ｎ－エチルマレイミドまたはパラホルムアルデヒドである、態様２３の方法。

【0087】

２５．前記Ｎ－エチルマレイミドが、０．２ｍＭから３０ｍＭの濃度で使用され、パラホルムアルデヒドが、１０ｍＭから１００ｍＭの濃度で使用される、態様２４の方法。

【0088】

２６．それを必要とする対象を免疫化する方法であって、治療有効量の態様１から２１のいずれか１つのワクチン製剤を該対象に投与することを含む、方法。

【0089】

２７．前記ワクチン製剤が、筋内、皮下、皮内、または腫瘍内に投与される、態様２６の方法。

【0090】

２８．前記対象が、癌、自己免疫疾患、神経変性障害、または病原体による感染を有する、態様２６の方法。

【0091】

下記の実施例は、本開示を説明するものと意図されるが、本開示を限定するものではない。実施例は使用され得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順が代替的に使用されてもよい。

【実施例】

【0092】

細胞および動物。ＥＬ４マウスＴリンパ腫細胞をＡＴＣＣ（マナッサス、ＶＡ）から購入し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、および１％（ｗ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（全てＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡから）を補充したＧｉｂｃｏ（商標）ＤＭＥＭ中で培養した。オボアルブミン由来ペプチドを提示するようＥＬ４細胞から改変されたＥ．Ｇ７－ＯＶＡ Ｔリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ）を、全てＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５５μＭ ２－メルカプトエタノール、および０．４ｍｇ／ｍＬのジェネティシンを含有するＲＰＭＩハイブリッド培地中で培養した。Ｓｈｉｎら（Ｉｍｍｕｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ １６：１３４～１３９ページ（２０１６））によって記載されるように、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞をさらにＧＦＰを発現するようにレトロウイルスで形質導入し、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ－ＧＦＰ細胞を作製した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ負荷ＭＨＣ Ｉ（Ｈ－２Ｋ^ｂ）に応答してβ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）を産生するよう操作されたＢ３Ｚ ＣＤ８ Ｔハイブリドーマ細胞を、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞を培養するのに使用されるのと同じ培地中で培養した。細胞を２または３日毎に継代し、マイコプラズマＰＣＲテストキット（ＡＢＭ、リッチモンド、カナダ）を使用してマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）混入に関して検査した。細胞は全て、３７℃、５％ＣＯ_２、湿度１００％で培養した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢、雌、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウィルミントン、ＭＡ）は、ＵＣ ＩｒｖｉｎｅのＩＡＣＵＣによって承認された動物使用プロトコル（ＡＵＰ－２０－１１６）に従って、全ての動物研究で使用された。

【0093】

骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）。ＢＭＤＣを、Ｍａｄａａｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １（１）：ｅ１（２０１４））およびＯｎａｉ ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４２３：５３～９ページ（２０１６））において報告された通りに調製した。簡潔に述べると、安楽死させたマウスから単離した骨髄を、ＲＰＭＩ培地を充填した２７ゲージの針（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して大腿骨後四半部から流し出した。続いて、骨髄を４０μｍの滅菌セルストレーナー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に通して均質化し、続いて、収集した細胞を３００×ｇで室温にて１０分間遠心分離した。上清を吸引した後、細胞ペレットを再懸濁し、１×ＲＢＣ溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）１ｍＬ中で室温にて１０分間インキュベートした。ＲＢＣ溶解をクエンチした後、ＲＰＭＩ培地１０ｍＬを混合物に添加し、３００×ｇで１０分間遠心分離し、細胞ペレットは、それをＲＰＭＩに再懸濁することによって１回すすいだ。遠心分離後、細胞ペレットを、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、および２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ培地からなるＤＣ分化培地中に再懸濁し、大腿骨から採取した懸濁細胞を、１００ｃｍ^２細胞培養皿（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に播種した。培地に、初回接種から２日後に２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含有する新たに調製した培地１０ｍＬを補充した。さらに３日のうちに、ＤＣ集団を、抗マウスＣＤ１１ｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、ＣＡ）で染色した細胞のフローサイトメトリーによって評価した。ＧＭ－ＣＳＦの存在下でのＤＣへの５日間の分化後、血清ピペットを用いてプレートを穏やかにすすぎ、３００×ｇで１０分間遠心分離することによって、緩く接着した細胞を収集した。成熟ＤＣを得るために、収集したＤＣを、２０ｎｇ／ｍＬのリポ多糖類（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）を補充した１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地とともに２４時間インキュベートした。未熟および成熟ＤＣはともに、フローサイトメトリーによって表面分子の発現について特徴付けた。

【0094】

ＢＭＤＣおよびＴ細胞リンパ腫細胞のハイブリドーマ。ＢＭＤＣを、５：１の比でＥＬ４またはＥ．Ｇ７－ＯＶＡ－ＧＦＰ細胞と混合し、無血清ＲＰＭＩ培地を使用して３００×ｇで１０分間、２回洗浄し、製造業者の手順に従って、ＣｌｏｎａｌＣｅｌｌ（商標）ＨＹ－Ｈｙｂｒｉｄｏｍａキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）を使用して融合させた。室温で５分間のインキュベーション後、無血清ＲＰＭＩ １０ｍＬを融合溶液にゆっくりと添加し、細胞を３００×ｇで１０分間の遠心分離によって洗浄した後、３７℃でインキュベートした２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ培地中でそれらを６日間インキュベートした。ＢＭＤＣおよびＴリンパ腫細胞のハイブリドーマを、６日間でフローサイトメトリーによってＣＤ１１ｃ（ＤＣマーカー）、ＧＦＰ（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ－ＧＦＰ細胞）、およびＣＤ９０．２（ＥＬ４細胞）に関して二重陽性集団によって定量し、さらにＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ）を使用して選別した。細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、樹状細胞の特徴を有する細胞表面分子について分析した。簡単に述べると、１×１０^６個の細胞を、蛍光標識した抗マウスＣＤ１１ｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とともに氷上で２０分間インキュベートし、非結合抗体を、３００×ｇで１０分間の遠心分離によって除去した。選別したハイブリドーマ細胞を、９６ウェル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において細胞１００個（ウェル１つあたりおよそ１個の細胞）を１４日間インキュベートすることによってさらにクローニングした。上述するように、ＣＤ１１ｃ染色とともに、９０％もしくはそれよりも高い割合の同時ＧＦＰ発現またはＦＩＴＣ－ＣＤ９０．２を有するクローンを収集し、ハイブリッド培養培地中で培養した。ハイブリドーマ細胞を、１：２０の比で３日毎に継代し、液体窒素中での保管用に９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存した。ハイブリドーマの安定的に維持された抗原提示および成熟状態は、継代４０まで細胞継代１０回毎に、前述のように相当する蛍光標識抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）による染色した後に、それらをＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、およびＭＨＣ ＩＩ、ならびにＭＨＣ Ｉ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体についてフローサイトメトリーにより分析することによって確認した。

【0095】

骨髄由来樹状細胞とＥＧ７－Ｏｏｖａ Ｔ細胞リンパ腫とのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性融合。ＢＭＤＣは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス大腿骨由来の骨髄細胞を２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦとともに５日間インキュベートすることによって得られた。次に、得られたＢＭＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋およそ８０％）を２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを伴い、または伴わずに２４時間インキュベートし、それぞれｍＢＭＤＣおよび未熟ＤＣ（ｉＢＭＤＣ）を調製した。ＢＭＤＣを、無血清培地中で５：１の比でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用してＥ．Ｇ７－ＯＶＡ－ＧＦＰ Ｔリンパ腫細胞と融合させた。融合細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。ＰＥＧを、無血清培地を使用して３００×ｇで１０分間、合計２回の洗浄で洗浄した。融合細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦの存在下で１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ培地中に配置し、６日間培養した後、フローサイトメトリーによってＣＤ１１ｃ（樹状細胞マーカー）およびＧＦＰを使用して単一細胞選別した。ＤＣ－ＥＧ７－ｏｖａ－ＧＦＰハイブリドーマを、０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、および０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を補充した１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを有するＲＰＭＩ中での成長のために維持した。得られたハイブリドーマは、代表的なＤＣマーカーであるＣＤ１１ｃおよびＥ．Ｇ７－ＯＶＡ Ｔリンパ腫細胞がＧＦＰを発現する場合にはＧＦＰに関して陽性クローンを示した。

【0096】

ＥＧ７－ｏｖａハイブリドーマ系の細胞表面分子発現。ＤＣ成熟は、高レベルの共刺激分子および免疫賦活性サイトカインを発現し、それにより、ＤＣが表現型的におよび機能的に成熟した状態であることが示される。ハイブリドーマが樹状細胞マーカーおよび共刺激分子を発現するかどうかを決定するために、１×１０^６個のハイブリドーマ細胞を収集し、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩおよびＭＨＣ Ｉ－ＳＩＩＮＦＥＫＬに対する蛍光抗体で標識した。染色した試料を、フローサイトメトリーを使用して分析した。未熟および成熟ハイブリドーマ細胞系はともに、安定で類似したレベルのＣＤ１１ｃを示した一方で、成熟ハイブリドーマは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の増加および安定した蛍光を示した。両方の細胞系についてＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩレベルも観察され、より高い蛍光が、成熟ハイブリドーマ（ｍＢＭＤＣ－ＥＧ７－ｏｖａ－ＧＦＰ）細胞系で観察された。

【0097】

１０継代毎のＥＧ７－ｏｖａハイブリドーマ系の安定性。未熟および成熟ハイブリドーマ細胞系を、１０細胞継代毎にＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、およびＭＨＣ Ｉ－ＳＩＩＮＦＥＫＬに対する蛍光標識抗体を使用して、細胞表面分子発現について分析した。未熟および成熟ハイブリドーマ細胞系はともに、安定で類似したレベルのＣＤ１１ｃを発現したのに対して、成熟ハイブリドーマは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の増加および安定した蛍光を示した。両方の細胞系についてＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩレベルも観察され、より高い蛍光が、成熟ハイブリドーマ細胞系で観察された。ＥＧ７－ｏｖａ細胞は、オボアルブミンを発現するが、ＥＧ７－ｏｖａ細胞中に存在するＳＩＩＮＦＥＫＬの量は決定されておらず、未熟および成熟ハイブリドーマ細胞系はともに、ＭＨＣ Ｉ－ＳＩＩＮＦＥＫＬのいくらかの発現を示す。結果により、ハイブリドーマ細胞系は、それらの樹状細胞機能を損失せずに、培養条件下で安定であることが証明されていることが示される。

【0098】

凍結保存後のＥＧ７－ｏｖａハイブリドーマ系の安定性。未熟および成熟ハイブリドーマ細胞を９０％ＦＢＳ中に凍結保存し、細胞を解凍し、ハイブリッド培地中で成長させた。陽性クローンを、フローサイトメトリーを使用して、樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃおよびＧＦＰを使用して分析した。未熟および成熟ハイブリドーマ細胞系はともに、およそ５８．８％および７５．９％の陽性クローンを示した。

【0099】

ハイブリドーマ細胞の化学的に誘導されたブレブ形成。スケーラビリティおよび保管が増強された細胞の生理活性特性を維持する無細胞ワクチンは、細胞ベースのワクチンに関連する制限を克服することができる。未熟および成熟ハイブリドーマの両方を、１×ＤＰＢＳ中で３７℃にて８時間、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を使用して化学的に誘導した。ブレブを含有する上清を収集した後、３００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞および砕片の除去を行い、続いて１６，１００×ｇで１０分間の遠心分離によってマイクロスケールのＥＢ単離を行った。ＥＢを１×ＤＰＢＳで３回すすぎ、化学的ブレブ形成緩衝液のいかなる要素も除去した。ブレブは、フローサイトメトリーを使用してブレブを分析することによって、その細胞表面分子の発現について分析した。ブレブをＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、およびＭＨＣ Ｉ－ＳＩＩＮＦＥＫＬに対する蛍光抗体で標識し、フローサイトメトリーを使用して分析した。未熟ＥＢおよび成熟ＥＢハイブリドーマはともに、類似したレベルのＤＣマーカーであるＣＤ１１ｃを発現し、それらの共刺激マーカー発現レベルは、親ハイブリドーマ細胞の発現レベルに相当していた。

【0100】

ＢＭＤＣおよびＴリンパ腫細胞のハイブリドーマに由来するＥＢの調製および特徴付け。２ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のストック溶液は、濃度でＤＩ水１０ｍＬ中に０．２７５ｇを溶解し、滅菌０．２２μｍシリンジフィルターを使用して溶液を濾過することによって調製した。０．２２ｍＭ ＮＥＭを含有するブレブ形成緩衝液は、使用直前にＮＥＭストッキング溶液９０μＬを、ＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）１０ｍＬに希釈することによって調製した。ブレブ形成について、ＢＭＤＣ細胞およびＴリンパ腫細胞のハイブリドーマを、ブレブ形成緩衝液中で３７℃および５％ＣＯ_２にて６時間インキュベートし、マイクロサイズのＥＢを産生した。次に、上清を１，０００×ｇで５分間遠心分離し、ブレブ形成されていない細胞および細胞砕片をペレット化し、残りの上清を１６，１００×ｇで１５分間遠心分離した。収集したＥＢをさらに、ＤＰＢＳで３回すすぎ、１６，１００×ｇで１０分間の遠心分離の繰り返しにより、いかなる残留ブレブ形成試薬も除去した。最終的に、得られたＥＢをＤＰＢＳ中に再懸濁し、顕微鏡下で細胞または細胞砕片がないことを確認した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として使用して細胞、ハイブリドーマ、およびＥＢにおける等価なタンパク質量を決定した。簡潔に述べると、細胞、ハイブリドーマ、およびＥＢを１×ＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を用いて溶解し、試料２５μＬをＢＣＡ作業試薬（２００μＬ）と組み合わせた。試料を９６ウェルプレートにおいて３７℃で３０分間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）を使用して５６２ｎｍで読み取った。ＢＣＡ作業試薬は、製造業者の仕様に従って、ＢＣＡストック溶液対試料５０：１の容量比で混合することによって調製した。

【0101】

ＢＭＤＣおよびＴリンパ腫細胞のハイブリドーマに由来するＥＢによるＣＤ８ Ｔ細胞への抗原提示。９６ウェルプレートのウェル１つあたり３×１０^４個から段階希釈したＢＭＤＣおよびＴリンパ腫細胞のハイブリドーマ、または等価な表面積のＥＢを、９×１０^４個のＣＤ８ Ｂ３Ｚハイブリドーマ細胞とともにＲＰＭＩハイブリッド培地中で２４時間、インキュベートした。３００×ｇで１０分間の遠心分離後、上清をピペッターで慎重に除去し、１ウェルあたり１００μＬの、ＤＰＢＳ中１０％（ｖ／ｖ）ＮＰ－４０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．６ｍｇ／ｍＬのクロロフェノールレッド－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる緩衝液を添加した後、３７℃および５％ＣＯ_２で最大３時間インキュベートした。相対的なＴ細胞活性化を、ＢｉｏＴＥＫ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１プレートリーダーを使用してβ－ガラクトシダーゼによって、触媒されたＣＰＲＧの５８５ｎｍでの吸光度によって測定し、培地１００μＬ中で０～０．１ｍｇ／ｍＬの範囲の様々なＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７－２６４、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）濃度で３×１０^４個のＢＭＤＣとともにインキュベートしたＢ３Ｚ細胞のものと比較した。

【0102】

ＢＭＤＣおよびＴリンパ腫細胞のハイブリドーマに由来するＥＢによるワクチン接種。マウスの右脇腹に、ＤＰＢＳ ５０μＬ、５０μＭ ＯＶＡタンパク質、２．５×１０^４個の未熟または成熟ＢＭＤＣ、または等価なタンパク質量のＢＭＤＣおよびＴリンパ腫細胞のハイブリドーマに由来するＥＢを、２週間のうちに２回皮下注射した（プライム注射およびブースター注射）。ブースター注射から１０日のうちに、ＧＦＰフリーであり、その抗原性特性が回避される１×１０^６個のＥ．Ｇ７－ＯＶＡまたはＥＬ４細胞を、ワクチン接種したマウスの右脇腹に皮下注射し、腫瘍サイズを、デジタルノギスを使用して２日毎に測定し、Ｖ＝０．５ＬＷ^２（式中、ＬおよびＷは、それぞれある方向の最長の長さ、および別の方向の最短の幅を表す）で算出した。マウスを、動物使用プロトコルに従って、腫瘍が任意の測定方向で１５ｍｍを上回ったら、ＣＯ_２窒息および頸椎脱臼によって屠殺した。処置群１つにつき合計６匹のマウスを統計的有意性のために使用し、検出力は０．９であり、アルファは０．０５に等しかった。対照と比較して、最低１０％の増加が最終的な生存率にとって有意義であるとみなされ、０．０５未満のｐ値は、統計学的に有意であるとみなした。

【0103】

ワクチン接種時の細胞傷害性Ｔリンパ球（ｔａＣＴＬ）の活性化を評価するために、前述のようにワクチン接種したマウスを、ブースターワクチン接種の１０日後に屠殺し、脾臓を採取した。脾細胞は、脾細胞培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、および０．１％β－メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地）５ｍＬ中の５ｃｍ^２細胞培養皿における４０μｍ滅菌組織ストレーナーに通した解離（ｍａｃｅｒａｔｉｏｎ）、３５０×ｇで１０分間の遠心分離、および冷１×ＲＢＣ溶解緩衝液１ｍＬを使用したＲＢＣ枯渇によって得られ、トリパンブルー排除アッセイで確認されたように、脾臓１つあたりおよそ１×１０^８個の生脾細胞を生じた。製造業者が推奨するようにＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｂｌｕｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識したＥ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞を、Ｅ：Ｔ（脾細胞：Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）比２５：１で脾細胞とともに丸底９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において４時間インキュベートした。３００×ｇで１０分間の遠心分離後、細胞をＰＢＳで１回すすぎ、１μＬ／ｍＬのＹｏ－Ｐｒｏ－１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とともに氷上で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回、さらにすすいだ後、フローサイトメトリーを使用して、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＢｌｕｅおよびＹｏ－Ｐｒｏ－１に関する二重陽性細胞対ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｂｌｕｅのみに関する陽性細胞の比として、特異的溶解を決定した（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ）。

【0104】

統計学的解析。全てのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究について、三重反復データを解析し、平均値±標準偏差として提示した。ｉｎ ｖｉｖｏ研究において統計学的有意性を達成するために、処置群１つあたり６匹の動物（ｎ＝６）を使用した。両側スチューデントｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒ．８．０．１）を使用して、２つの群間の比較の統計学的有意性を算出し、０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。カプラン・マイヤー曲線およびマンテル・コックス検定を使用して、群間の生存率を解析した。

【0105】

ハイブリドーマ細胞のＴ細胞活性化能力。未熟および成熟ハイブリドーマ細胞系ならびにそれらそれぞれのＥＢを、ＳＩＩＮＦＥＫＬ提示応答性Ｔ細胞ハイブリドーマを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞刺激能力について検査した。等価な表面積で投薬した場合、ＥＢは、親細胞と比較して類似したＴ細胞刺激を示し、成熟ハイブリドーマおよびＥＢは、未熟表現型よりも２倍多くＴ細胞を刺激した。

【0106】

ＯＶＡ発現腫瘍からの防御のためのＥＧ７－ｏｖａハイブリドーマブレブのワクチン接種。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１４日のうちに２回免疫化し（プライムおよびブースト）、ブースターショットの１０日後に、１×１０^６個のＥ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞を右脇腹に皮下注射した。体重、腫瘍体積、および生存率を記録した。全体として、体重は減少しなかった。腫瘍体積は、３日毎に測定した。ＰＢＳおよびＯＶＡワクチンは、腫瘍成長を防止するのに有効ではなく、全てのマウスが、それぞれ１８日および２７日以内に腫瘍成長および死亡を示した。未熟ＢＭＤＣおよび未熟ハイブリドーマＥＢに関しては、腫瘍成長の遅延がみられたのに対して、成熟ＢＭＤＣおよび成熟ＥＢハイブリドーマは、一貫した腫瘍成長を示した。

【0107】

ＥＧ７－ｏｖａハイブリドーマの脾細胞特異的溶解。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１４日のうちに２回免疫化し（プライムおよびブースト）、ブースターショットの１０日後に、脾臓を収集し、特異的溶解について分析した。マウスから単離した脾細胞を、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ Ｔ細胞リンパ腫とともに４時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを使用して分析を行った。癌細胞を細胞トレースブルーで標識し、フローサイトメトリーによってＹＯ－ＰＲＯ－１陽性細胞のパーセントに対して分析した。Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比５０：１で、ＯＶＡワクチン接種したマウスではＥ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞のおよそ２７％、ｉＢＭＤＣワクチン接種したマウスではおよそ６５％、ｍＢＭＤＣマウスではおよそ８０％、未熟ハイブリドーマＥＢワクチン接種したマウスではおよそ６８％、および成熟ハイブリドーマＥＢではおよそ９０％が、特異的に死滅した。これらの結果に基づいて、ハイブリドーマＥＢは、Ｔ細胞活性化にとって効率的である。

【0108】

骨髄樹状細胞とのＥＬ４ Ｔリンパ腫細胞融合。ＥＧ７－ｏｖａハイブリドーマの効果を比較するために、ＥＬ４細胞を対照細胞として使用し、ハイブリドーマブレブの機能を決定した。ＢＭＤＣは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス大腿骨由来の骨髄細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦとともに５日間インキュベートすることによって得られた。次に、得られたＢＭＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋およそ８０％）を、２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを伴い、または伴わずに２４時間インキュベートし、それぞれｍＢＭＤＣおよび未熟ＤＣ（ｉＢＭＤＣ）を調製した。ＢＭＤＣを、無血清培地中で５：１の比でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用してＥＬ４ Ｔリンパ腫細胞と融合させた。融合細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。ＰＥＧを、無血清培地を使用して３００×ｇで１０分間、合計２回の洗浄で洗浄した。融合細胞を、ＧＭ－ＣＳＦの存在下で１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ培地中に配置し、６日間培養した後、フローサイトメトリーによってＣＤ１１ｃ（樹状細胞マーカー）およびＲＦＰを使用して単一細胞選別した。ＤＣ－Ｔ細胞ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐを有するＲＰＭＩ中での成長のために維持した。得られたハイブリドーマは、代表的なＤＣマーカーであるＤ１１ｃに関して陽性クローンを示した。

【0109】

ＥＬ４ハイブリドーマの安定性。未熟および成熟ハイブリドーマ細胞系を、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、およびＭＨＣ ＩＩに対する蛍光標識抗体を使用して細胞表面分子発現について分析した。未熟および成熟ハイブリドーマ細胞系はともに、安定で類似したレベルのＣＤ１１ｃを発現したのに対して、成熟ハイブリドーマは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の増加および安定した蛍光を示した。両方の細胞系についてＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩレベルも観察され、より高い蛍光が、成熟ハイブリドーマ細胞系で観察された。

【0110】

抗腫瘍防御のためのＥＬ４ハイブリドーマブレブのワクチン接種。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１４日のうちに２回免疫化し（プライムおよびブースト）、ブースターショットの１０日後に、１×１０^６個のＥＬ４ Ｔリンパ腫細胞を右脇腹に皮下注射した。体重、腫瘍体積、および生存率を記録した。全体として、体重は減少しなかった。腫瘍体積は、３日毎に測定し、ＰＢＳおよびｉＢＭＤＣワクチンは、腫瘍成長を防止するのに有効ではなく、全てのマウスが、それぞれ１２日および１５日以内に腫瘍成長および死亡を示した。未熟ＢＭＤＣおよび未熟ハイブリドーマＥＢに関しては、腫瘍成長の遅延がみられたのに対して、成熟ＢＭＤＣおよび成熟ＥＢハイブリドーマは、一貫した腫瘍成長を示す。

【0111】

ＥＬ４ハイブリドーマブレブの脾細胞特異的溶解。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１４日のうちに２回免疫化し（プライムおよびブースト）、ブースターショットの１０日後に、脾臓を収集し、特異的溶解について分析した。マウスから単離した脾細胞を、ＥＬ４ Ｔ細胞リンパ腫とともに４時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを使用して分析を行った。癌細胞を細胞トレースブルーで標識し、フローサイトメトリーによってＹＯ－ＰＲＯ－１陽性細胞のパーセントに対して分析した。Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比５０：１で、それぞれＥＬ４およびＥ．Ｇ７－ＯＶＡ癌細胞のおよそ５５％および３０％を、成熟ハイブリドーマＥＢ群における脾細胞によって溶解し、他の群と比較した場合に最も高い特異的溶解を示した。未熟ＢＭＤＣおよびＥＢはともに、癌細胞に対して類似した特異的溶解を示した。Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡハイブリドーマワクチン系を使用したこれまでのデータから、ハイブリドーマワクチン系は、特定癌細胞を溶解するという点で抗原特異的であることが示されている。

【0112】

ＢＭＤＣ細胞およびＴリンパ腫細胞の安定的に保存された機能を有するハイブリドーマ。細胞ベースのワクチンの開発における極めて重要な問題の１つは、持続的な抗原提示および共刺激などの免疫学的機能の寿命である。この研究は、制御された成熟のＢＭＤＣを、既知の抗原を有するか、または有さないＴリンパ腫細胞と融合させた（図１を参照）。簡潔に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取した骨髄を、リポ多糖（ＬＰＳ）とのインキュベーションによって、さらなる成熟を伴い、または伴わずにＧＭ－ＣＳＦの存在下でＢＭＤＣに分化させ、未熟および成熟ＢＭＤＣ（ｉｍＤＣおよびｍＤＣ）を調製した。次に、オボアルブミン（ＯＶＡ）、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡおよびＥＬ４細胞の発現のためのさらなる改変を伴うか、または伴わないＣ５７ＢＬ／６に由来するＴリンパ腫細胞を、簡素なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性細胞融合を介してｉｍＤＣまたはｍＤＣとハイブリダイズした。明快な選択のために、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡを、ＧＦＰ発現用のレトロウイルスベクターによってトランスフェクトし、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ－ＧＦＰ（Ｅ７ＯＧ）を生じたのに対して、既知の抗原を有さないモデル腫瘍としてＥＬ４に改変を行わなかった（Ｅ４細胞）。４つの異なるハイブリドーマｉｍＤＣ／Ｅ７ＯＧ、ｉｍＤＣ／Ｅ４、ｍＤＣ／Ｅ７ＯＧ、およびｍＤＣ／Ｅ４を、フローサイトメトリーによってそれぞれＤＣおよびＥ７ＯＧ細胞のマーカーとして、二重染色したＣＤ１１ｃおよびＧＦＰについて分析した（図３Ａおよび図５Ａを参照）。ＢＭＤＣおよびＥ４細胞のハイブリダイゼーションは、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ９０．２の二重染色によって確認された。ハイブリドーマは、細胞凝集塊として１日で目立つようになった（図３Ａを参照）。純粋なｍＤＣ／Ｅ７ＯＧハイブリドーマは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、ＣＤ１１ｃおよびＧＦＰを共発現させ、続いてコンフルエンシーになるまで成長させることによって同定された生細胞集団において選別した後に得られた。フローサイトメトリーおよび一様なＧＦＰ発現によって確認されるように、選別により、ハイブリドーマの集団がおよそ４０％からほぼ１００％まで増加した（図３Ａおよび５Ｂを参照）。首尾よい細胞融合を介して調製されたハイブリドーマは、それらの生物学的安定性の拡張が示されている。抗原提示および共刺激に対するＤＣ／Ｔリンパ腫細胞ハイブリドーマの持続能は、１０継代毎にＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ（ＯＶＡ由来ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示するものを含む）、およびＭＨＣ ＩＩについてそれらを分析することによって評価した（図３Ｂを参照）。ＣＤ１１ｃ発現は、親ＤＣの成熟状態にかかわらず、全ての継代で一貫して維持された一方で、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６ならびにＭＨＣ ＩＩを含む共刺激および成熟マーカーは、ｉＤＣ由来のものよりもｍＤＣ由来のハイブリドーマにおいて高く、相当するハイブリドーマにおいて親ＤＣの保存された免疫学的機能を示していた。ＤＣ／ＥＬ４ハイブリドーマも、親ＤＣの保存された成熟状態を示した（図５Ｃを参照）。図３および図５における結果により、様々なＤＣ成熟状態および抗原プロファイルを有するハイブリドーマの首尾よい生成が実証された後、無細胞の細胞模倣性細胞外ブレブ（ＥＢ）ワクチンを調製した。

【0113】

ハイブリドーマおよびそれらのＥＢによる保存された抗原提示ならびに共刺激。主要抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、ＤＣは、高度に編成された細胞性および液性免疫応答を誘発する際に共刺激シグナルとともに抗原をＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に提示することが可能であり、それらを癌に対するワクチンなどの有望な細胞ベースの免疫療法薬としている。自家および同種異系ＤＣを使用した臨床研究から証明された免疫原性ならびに好適な安全性プロファイルにもかかわらず、ＤＣベースの免疫療法は、測定可能な臨床的有益性を保証することにまだ成功していない。ＣＡＲ－Ｔ細胞などの多くの形態の細胞療法に共通して、ＤＣも、抑制性微小環境に適応し、免疫活性化機能を損失することが知られている。さらに、腫瘍抗原は、望ましい抗原プロセシングおよび提示のために、ＤＣによって取り込まれてプロセシングされなくてはならず、これは多次元的なハードルである。無細胞のＤＣ模倣性ワクチンを創出することによってＤＣベースのワクチンに打ち勝つために、ＤＣ／Ｔリンパ腫ハイブリドーマは、細胞内小器官および細胞骨格を有さない可溶性細胞質内容物を含む膜小胞を生成する化学的に誘導されたブレブ形成を介してマイクロサイズのＥＢに変換された（図１２Ａを参照）。ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ（ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示するものを含む）、およびＭＨＣ ＩＩを含むハイブリドーマおよび相当するＥＢ上の表面マーカーの分析により、親ＤＣの成熟状態に応じて、化学的に誘導されたブレブ形成中の正確な保存が確認された（図１２Ｂを参照）。抗原を提示して、Ｔ細胞を活性化するＥＢの能力は、それらをＣＤ８ Ｔ細胞ハイブリドーマ、Ｂ３Ｚ細胞とともにインキュベートすることによって測定した。Ｂ３Ｚ細胞は、ＡＰＣのＭＨＣ（Ｈ－２Ｋ^ｂ）に提示されたＳＩＩＮＦＥＫＬを受容すると、ＬａｃＺを分泌するよう操作されている。Ｔ細胞を活性化するＤＣの抗原提示能は、ＤＣの成熟状態依存的な様式で、相当するＥＢに同等に置き換えられることが示された（図１２Ｃを参照）。結果により、無細胞ＥＢは、表面分子だけでなく、Ｔ細胞との相互作用も厳密に模倣し、それらをＤＣベースのワクチンに対する有望な代替品とさせていることが明らかに実証された。

【0114】

ＥＢワクチンによる腫瘍曝露動物の防御。ＤＣ／Ｔリンパ腫細胞の相当するハイブリドーマに由来するＥＢによる保存された抗原提示およびＴ活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏでの確認に基づいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＰＢＳ、ＯＶＡ（タンパク質ワクチン）、ｉｍＤＣまたはｍＤＣ（抗原を含まない細胞ベースのワクチン）、またはＤＣ／Ｔリンパ腫細胞の様々なハイブリドーマに由来するＥＢを、等価なタンパク質濃度に基づいて皮下注射を介して１４日間隔で２回ワクチン接種した後、２回目の（ブースター）注射の１０日後に、動物にＥ．Ｇ７－ＯＶＡ（Ｅ７ＯＧ、その免疫原性を回避するためにＧＦＰを含まない）またはＥＬ４（Ｅ４）細胞を曝露した。ＰＢＳまたはＯＶＡをワクチン接種したマウスにおける腫瘍は急速に進行した一方で、ＤＣまたはＥＢによるワクチン接種は、腫瘍成長を効率的に抑制し、動物の生存率を伸ばした（図１５および１６；ならびに表１～表４を参照）。ワクチンおよび曝露した腫瘍タイプにかかわらず、ｍＤＣおよびｍＤＣ／Ｔリンパ腫細胞由来ＥＢの成熟状態は、未熟な対応物よりも効率的であった。さらに、ＥＢは、ＤＣとは異なり、免疫抑制環境に適応されずにおそらくそれらの拡張された安定性に起因して、動物を防御するのに相当するＤＣよりも効率的であった。予想通り、ｍＤＣ／Ｅ７ＯＧ ＥＢは、抗原を有する腫瘍に対するそれらの共刺激能に起因して、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ腫瘍に対して最も効率的であった（図１５を参照）。さらに注目すべきことに、ｍＤＣ／Ｅ４ ＥＢはまた、ＥＬ４腫瘍に対しても有効であった（図１６を参照）。これは、癌細胞の正確な分子プロファイルを提示することが、特徴的な抗原の非存在下で免疫系が標的を認識するのに特異的である可能性があることを含蓄している。しかしながら、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡおよびＥＬ４細胞に由来するＥＢは、腫瘍成長に影響を及ぼすことが不可能であり（図１７を参照）、癌細胞をｍＤＣと統合させることによって達成された、適切な免疫学的シグナルとともに癌細胞の分子プロファイルを提供することが重要であることを示している。結果により、ｍＤＣ／Ｔリンパ腫細胞のハイブリドーマに由来するＥＢによる腫瘍曝露された動物の効率的な防御が実証される。

【0115】

【表1】

【0116】

【表2】

【0117】

【表3】

【0118】

【表4】

【0119】

ＥＢによる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介性応答の誘発。概して、ＣＴＬは、癌細胞を根絶するのに効率的な役割を果たし、直接的なＣＤ８ Ｔ細胞活性化にはＭＨＣ Ｉ、およびヘルパーＴ細胞生成にはＭＨＣ ＩＩによる抗原提示を要する。腫瘍曝露したマウスの有効な防御が、ＤＣ／Ｔリンパ腫細胞のハイブリドーマに由来するＥＢによるＣＴＬ活性化に起因するかどうかを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに腫瘍曝露研究と同様にワクチン接種し、続いてブースター注射の１０日後に脾細胞を採取した。活性化Ｔ細胞を含む脾細胞を、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡまたはＥＬ４細胞とともにインキュベートした後、これまでに報告されたようにフローサイトメトリーによって癌細胞の特異的溶解を定量化した。エフェクター／脾細胞対腫瘍細胞比（Ｅ：Ｔ）２５にて、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞のおよそ９２％（図１８Ａおよび図２１Ａを参照）およびＥＬ４細胞の４９％（図１８Ｂおよび図２１Ｂを参照）が、ｍＤＣ／Ｅ７ＯＧ ＥＢをワクチン接種したマウスから採取した脾細胞によって特異的に溶解された。腫瘍－曝露研究から予測されるように（図１６を参照）、ｍＤＣ／Ｅ４ ＥＢをワクチン接種したマウスから採取した脾細胞（即ち、標的抗原なし）は、それぞれＥ．Ｇ７－ＯＶＡおよびＥＬ４細胞のおよそ３８％ならびにおよそ５５％の特異的溶解を示した（図１９および図２１を参照）。これらの見解から、既知の抗原に対するワクチン接種は、図１５において同様に観察されるように、相当する抗原を有する癌に対する最も効率的なＣＴＬ活性化を保証することが明らかである。注目すべきことに、特徴的でない標的に対するワクチン接種は、腫瘍曝露研究（図１６参照）と一致して、適合する腫瘍に対するＣＴＬ活性化において依然として有効であった。ｍＤＣ／Ｅ４ ＥＢをワクチン接種したマウスから採取した脾細胞によるＥ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞の特異的溶解が、ＥＬ４細胞の特異的溶解よりも低かったという事実は、抗腫瘍免疫応答を活性化する際に、単一の特徴的な抗原よりも完全な分子プロファイルを標的とするというより重要な役割を含蓄し得る。図１５、図１６、図１８および図１９に示される結果はまとめて、特異的ＣＴＬ活性化に寄与される、相当する腫瘍に対するＤＣ／Ｔリンパ腫ＥＢワクチンの有効性を実証した。

【0120】

本開示の主旨および範囲から逸脱することなく、様々な修正が行われ得ることが理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【国際調査報告】