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▶ コリア アドバンスト インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジーの特許一覧
特表2024-531363Ｃａｖ３．１遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】Ｃａｖ３．１遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240822BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240822BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240822BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240822BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20240822BHJP
A61P 25/24 20060101ALI20240822BHJP
A61P 25/22 20060101ALI20240822BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240822BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/7088
A61P25/08
A61P25/16
A61P25/14
A61P25/24
A61P25/22
A61P25/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509506
(86)(22)【出願日】2022-08-17
(85)【翻訳文提出日】2024-03-14
(86)【国際出願番号】 KR2022012269
(87)【国際公開番号】W WO2023022504
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】10-2021-0108274
(32)【優先日】2021-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】596071752
【氏名又は名称】コリア アドバンスト インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】キム，デス
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジングク
(72)【発明者】
【氏名】イ，イェウォン
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ウンジ
(72)【発明者】
【氏名】パク，ミンソン
(72)【発明者】
【氏名】イ，シンジョン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，スジン
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA06
4C086ZA12
4C086ZA22
4C086ZB21
(57)【要約】
本発明は、多様なＴ型カルシウムチャネルのα１Ｇサブユニット関連疾患を治療するためのものであって、より具体的には、配列番号１を標的とする、Ｃａｖ３．１をコードする遺伝子の発現抑制用アンチセンスオリゴヌクレオチド及びそのパーキンソン病、てんかん、本態性振戦、うつ病、不安障害、及び意識不明を含む多様な神経精神疾患の治療のための用途を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で示される核酸配列を標的とする、Ｃａｖ３．１をコードする遺伝子の発現抑制用アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
配列番号１で示される核酸配列とハイブリダイズ可能な核酸分子であって、１１～３０ｎｔの長さを有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
前記ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ核酸分子である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
配列番号２０または配列番号２１の核酸配列を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
ホスホジエステル（ＰＯ）骨格の一部または全部が、ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホン酸で置換されている、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
糖部分の２’－ＯＨの一部または全部が改変されている、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
糖部分の２’－ＯＨが、－Ｏ－ＣＨ３（－ＯＭｅ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＯＥｔ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３（－ＭＯＥ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ２、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ、－ＯＦまたは－Ｆで置換されている、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
糖部分に追加的な環が形成されたヌクレオチド類似体を少なくとも１つ以上含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
ヌクレオチド類似体がロック核酸（ＬＮＡ）である、請求項８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
ヌクレオチド類似体が、全ヌクレオチドのうち少なくとも３３％である、請求項８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項11】
ギャップマーである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項12】
ギャップマーが、両末端に３－７ｎｔの長さのＲＮＡユニットおよび前記ＲＮＡユニットの間に存在する８－１２ｎｔの長さのＤＮＡを含む核酸分子である、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項13】
ＲＮＡの一部または全部がＬＮＡである、請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項14】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、パーキンソン病治療用薬学的組成物。
【請求項15】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、うつ病治療用薬学的組成物。
【請求項16】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、本態性振戦治療用薬学的組成物。
【請求項17】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、てんかん治療用薬学的組成物。
【請求項18】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、不安障害治療用薬学的組成物。
【請求項19】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、意識不明状態回復用薬学的組成物。
【請求項20】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをパーキンソン病を病んでいる個体に投与する段階を含む、前記個体のパーキンソン病の治療方法。
【請求項21】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをうつ病を病んでいる個体に投与する段階を含む、前記個体のうつ病の治療方法。
【請求項22】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを本態性振戦を病んでいる個体に投与する段階を含む、前記個体の本態性振戦の治療方法。
【請求項23】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをてんかんを病んでいる個体に投与する段階を含む、前記個体のてんかんの治療方法。
【請求項24】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを不安障害を有した個体に投与する段階を含む、前記個体の不安障害の治療方法。
【請求項25】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを意識不明状態の個体に投与する段階を含む、前記個体の意識回復方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用に関し、より具体的には、パーキンソン病、本態性振戦、てんかん、うつ病、意識不明などの疾患の治療に効率的なＣａｖ３．１遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
パーキンソン病は、脳幹の中央に存在する脳黒質のドーパミン系神経が破壊されることにより、動きに障害が表われる疾患を意味する。ドーパミンは、脳の基底核に作用して我々が所望のとおりに体を精巧に動くようにする重要な神経伝達系物質であって、パーキンソン病の症状は、脳黒質緻密部のドーパミン系神経が６０～８０％程度消失された後に明確に表われ、病理検査を施行すれば、脳と末梢神経との多様な部位に発病性αシヌクレインタンパク質が沈着されて生じたレビー小体を確認することができる。パーキンソン病は、アルツハイマー病に次ぐ平凡な退行性脳疾患であって、６０歳以上で１％の有病率を示し、年を取るほど発病率が増加する。
【0003】
パーキンソン病の核心的または古典的運動特性には、運動緩慢症、震え、及び硬直が含まれるが、歩行及び均衡、眼球運動調節、言語及び飲み込み、膀胱調節などの変化など他の多くの運動関連の症状がある。パーキンソン病患者で運動緩慢症は、運動振幅、運動速度及び運動開始の困難の減少として表われる。眼球筋肉（断続運動開始を遅らせる結果）、言語筋肉（さらに柔らかくなり、時には不明な言語に繋がる）、四肢筋肉（手先の器用さ減少に繋がる）を含む多くの筋肉グループの自発的な制御に影響を及ぼしうる。患者は、ボタン押し、書き込み及びツールの使用のような微細運動作業の困難を訴えるが、震えは、可変的である。全部ではないが、ほとんどの患者は、震えの症状を有する（ＭｃＧｒｅｇｏｒ１，２ ａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｒａ Ｂ．Ｎｅｌｓｏｎ１，Ｎｅｕｒｏｎ １０１：１０４２－１０５６，２０１９）。
【0004】
病因と関連して、パーキンソン病は、全体患者の５～１０％のみ遺伝によって発生し、その他のほとんどは、特発性であって、パーキンソン病の環境的要因についての研究では、１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＭＰＴＰ）、殺虫剤（ロテノン、パラコート）、重金属（マンガン、鉛、銅）、一酸化炭素、有機溶媒、微量金属原素などの毒素露出、頭部損傷などの要因をパーキンソン病の発病原因として指摘されている。
【0005】
脳黒質のドーパミン系神経が破壊される原因は、まだ正確に知られていない。
【0006】
１９６０年代の後半から現在までパーキンソン病の治療には、レボドパが利用され始めたが、これは、治療の画期的な開始であるだけではなく、いまだに抗パーキンソンの効果が最も大きな薬物として認められている。現在、適切な薬物治療に助けられて、パーキンソン病患者は、相当期間良質の生を保持することができ、死亡率は減少した。しかし、レボドパの長期治療は、病気の進行と共に多くの問題を起こす。すなわち、レボドパ使用以後、６年以上経過すれば、約７５％の患者は、運動変動（ｍｏｔｏｒ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）、異常運動症及び他の合併症を経験する（Ｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｎｅｕｒｏｌ．Ａｓｓｏｃ．１９（４）：３１５－３３６，２００１）。
【0007】
最近、本発明者らによって、大脳の淡蒼球（ｇｌｏｂｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ）からの抑制性基底核入力（ｂａｓａｌ ｇａｎｇｌｉａ ｉｎｐｕｔ）を光遺伝学的光刺激させる場合、腹側視床ニューロン（ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ ｔｈａｌａｍｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）で活性電位と抑制－後の期間の間に筋肉収縮を誘導し、このような活性電位と筋肉収縮は、Ｔ型カルシウムチャネルの腹側視床での局所的ノックアウトによる抑制－後の反発性撃発（ｒｅｂｏｕｎｄ ｆｉｒｉｎｇ）を示す神経集団の減少によって減少すると確認することにより、Ｔ型カルシウムチャネルとパーキンソン病の病理現象との相関関係を究明した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ９５：１１８１－１１９６，２０１７）。
【0008】
電圧依存性カルシウムチャネルは、神経細胞の活性によって細胞内のカルシウム濃度を増加させる役割を行うが（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４５：３４１－３５８，１９８３）、電圧依存度によって高電圧依存性（ｈｉｇｈ－ｖｏｌｔａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）及び低電圧依存性（ｌｏｗｖｏｌｔａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）チャネルに分類される（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，５２－５４，１９９５）。Ｔ型カルシウムチャネルは、代表的な低電圧依存性カルシウムチャネル（ｌｏｗ ｖｏｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ）であって、哺乳類では、α１サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）に対する遺伝子型によってＣａｖ３．１（α１Ｇ）、Ｃａｖ３．２（α１Ｈ）、及びＣａｖ３．３（α１Ｉ）の３種が存在する（Ｐｅｒｅｚ－Ｒｅｙｅｓ，Ｅ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８３：１１７－１６１，２００３）。そのうち，α１Ｇカルシウムチャネルは、視床核で神経細胞の多発性発火（ｂｕｒｓｔ ｆｉｒｉｎｇｓ）の生成に関与し、最近、重要な病理学的な機能が明らかになった（Ｋｉｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２，１１７－１１９，２００３；Ｋｉｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３１：３５－４５，２００１）。α１Ｇカルシウムチャネルと関連した病理現象としては、腹痛（大韓民国特許第８６８７３５号）、癲癇（大韓民国特許第５３４５５６号）、不安障害（大韓民国特許第９５８２９１号）、ドラベ症候群（大韓民国公開特許公報第１０－２０１９－０１３９３０２号）、非可逆的脳損傷による前頭葉機能障害（大韓民国公開特許公報第１０－２０１３－００３００１１号）、神経因性疼痛（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１１３（８）：２２７０－２２７５，２０１６；ＷＯ２００６０６４９８１Ａ１）、アンジェルマン症候群（Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び／またはプラダー・ウィリ症候群（Ｐｒａｄｅｒ－Ｗｉｌｌｉ ｓｙｎｄｒｏｍ）（ＷＯ２０１７０７０６８０Ａ１）、うつ病（ＣＮ１０８８５３５１０Ａ）、リウマチ性関節炎（ＷＯ２０２０２０３６１０Ａ１）、集中力障害（大韓民国特許第１６２５５７５号）、糖尿病（ＣＮ１０２６４１７２Ａ）及び本態性振戦（大韓民国特許第９５８２８６号）などが存在する。おもしろい点は、Ｃａｖ３．１ Ｔ型カルシウムチャネルがノックアウトされた形質転換マウス（Ｃａｖ３．１－／－）の場合、致死性ではなく、表面上としては、正常に発達するという点である。
【0009】
このような病理学的症状を改善するためには、Ｔ型カルシウムチャネルの機能を遮断する薬物が必要であるが、次のような問題点がある。第１に、エトスクシミドを含む多様なＴ型カルシウムチャネル遮断剤が前述した３種のＴ型カルシウムチャネルの間の高い相同性によってＣａｖ３．１のみ選択的に抑制しにくい。第２に、臨床でＺｒｏｔｉｎという商標で使用中であるエトスクシミドの場合、神経信号を作り出すが、重要な電圧依存性Ｎａ＋チャネル及びＫ＋チャネルも抑制し（Ｌｅｒｅｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（１３）：４８４２－４８５３，１９９８）、頭痛、めまい、嘔吐などの副作用が知られている。第３に、カルシウムチャネルの構造的類似性によってカルシウムチャネル抑制剤がＮタイプ、Ｐ／Ｑタイプのような他種のカルシウムチャネルに対する交差作用が発生するが、Ｎタイプ、Ｐ／Ｑタイプチャネルは、あらゆる神経で神経伝達物質の分泌に重要なので、遮断する場合、脳機能及び生命に重大な支障を招く。第４に、Ｃａｖ３．１チャネルに選択的に作用する遮断剤であるとしても、心臓神経で発現されるＣａｖ３．１の機能を妨害して心臓機能に異常を招く恐れがある（Ｍａｎｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９８：１４２２－１４３０，２００６）。
【0010】
このような理由で、Ｃａｖ３．１遺伝子のみを標的とするｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡのような核酸分子基盤の薬物も開発されているが、これらは、レンチウイルスのような別途のベクターに導入しなければならず、定位注入装置（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）のような非常に侵襲的な装置を用いて局所的に正確に必要とする脳部位に注入を要するなど、実際の臨床に適用するには大きな問題点を有している。
【0011】
これにより、α１Ｇ Ｔ型カルシウムチャネル（Ｃａｖ３．１）のみを選択的に抑制しながら、他の副作用のない新たな種類の薬物を開発する必要性が切実な状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、前述したさまざまな問題点を解決するためのものであって、本発明の目的は、より効率的にα１Ｇ Ｔ型カルシウムチャネルの発現を抑制することにより、パーキンソン病のようなα１Ｇ Ｔ型カルシウムチャネルの抑制によって治療が可能な薬物を提供することである。しかし、このような課題は、例示的なものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明の一観点によれば、配列番号１で示される核酸配列を標的とするＣａｖ３．１遺伝子発現抑制用アンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
【0014】
本発明の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含むパーキンソン病治療用薬学的組成物が提供される。
【0015】
本発明の他の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含むうつ病治療用薬学的組成物が提供される。
【0016】
本発明の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む本態性振戦治療用薬学的組成物が提供される。
【0017】
本発明の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含むてんかん治療用薬学的組成物が提供される。
【0018】
本発明の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む不安障害治療用薬学的組成物が提供される。
【0019】
本発明の他の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む意識不明状態回復用薬学的組成物が提供される。
【0020】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをパーキンソン病を病んでいる個体に投与する段階を含む前記個体のパーキンソン病の治療方法が提供される。
【0021】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをうつ病を病んでいる個体に投与する段階を含む前記個体のうつ病の治療方法が提供される。
【0022】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを本態性振戦を病んでいる個体に投与する段階を含む前記個体の本態性振戦の治療方法が提供される。
【0023】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをてんかんを有した個体に投与する段階を含む前記個体のてんかんの治療方法が提供される。
【0024】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを不安障害を有した個体に投与する段階を含む前記個体の不安障害の治療方法が提供される。
【0025】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを意識不明状態にある個体に投与する段階を含む前記個体の意識回復方法が提供される。
【発明の効果】
【0026】
本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来のＴ型チャネル遮断剤とは異なって、Ｃａｖ３．１遺伝子の発現のみ特異的に抑制するだけではなく、生体内投与時に、副作用がほとんどなくて、Ｃａｖ３．１活性と関連した多様な疾患、例えば、パーキンソン病、神経因性疼痛、集中力障害、不安障害などの疾患の治療に非常に効率的に使われる。しかし、本発明の効果が、前述した内容に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的であるｃａｃｎａ１ｇ遺伝子の同型体１３のゲノムＤＮＡ構造とそれを標的に考案されたアンチセンスオリゴヌクレオチド候補の標的位置とを示すゲノム地図である。
【図2】本発明の一実施例によって製造されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー（gapmer）の構造と使われた改変の種類とを概略的に示す概要図である。
【図3】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド候補を細胞に形質感染させた時、ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子のノックダウン効率を示すグラフである。
【図4】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド候補を細胞に処理時に、処理濃度によるｃａｃｎａ１ｇ遺伝子の発現抑制程度を比較した結果を示すグラフである。
【図5A】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性及び生体内ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子の発現調節能力を分析するための実験スケジュールを概略的に示す概要図である。
【図5B】本発明の一実施例による８種のアンチセンスオリゴヌクレオチド候補を実験動物に投与後、７日経過時までの生存率を示すグラフである。
【図5C】前記実験動物から摘出された脳でのｃａｃｎａ１ｇ遺伝子の発現程度をｑＲＴ－ＰＣＲで測定した結果を示すグラフである。
【図6A】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドのＣａｖ３．２に対する交差反応有無を測定するために行われたｑＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示すグラフである。
【図6B】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドのＣａｖ３．３に対する交差反応有無を測定するために行われたｑＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示すグラフである。
【図7A】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドのパーキンソン病の治療効果を検証するための動物実験スケジュールを示す概要図である。
【図7B】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与１週間経過後、行われた開放場検査で側方回転移動距離を測定した結果を示すグラフである。
【図7C】前記開放場検査で移動距離を測定した結果を示すグラフである。
【図7D】前記開放場検査で移動速度を測定した結果を示すグラフである。
【図7E】前記動物実験で本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与１週間経過後、１日間隔で５日間加速ロータロッド検査を行って測定された墜落時までの経過時間を測定した結果を示すグラフである。
【図7F】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用機序を確認するために行われた組織化学分析の結果を示す一連の図面である。
【図8A】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの本態性振戦の治療効果を検証するための動物実験スケジュールを示す概要図である。
【図8B】本態性振戦による震えの症状の測定のための装置を概略的に示す概要図である。
【図8C】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与時に、震え症の程度をスペクトログラム（ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ）の形態で測定した結果を示す図面である。
【図9A】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの慢性的・持続的ストレスによるうつ病に対する治療効果を検証するための社会的ストレスによるうつ病動物実験スケジュールを示す概要図である。
【図9B】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与後、５日目から１０日間の社会的ストレスを与える過程と１７日経過後、行われた慢性社会的うつ病（ｓｏｃｉａｌ ｄｅｆｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）の検査方法を概略的に示す概要図である。
【図9C】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与時に、慢性うつ病の尺度を定量化して示す一連のグラフであって、左側は、Ｃａｖ３．１ ｍＲＮＡ発現程度をｑＲＴ－ＰＣＲで定量化して示したものであり、中央は、社会的相互作用時間を測定して示したものであり、右側は、社会性指数を測定して示したものである。
【図10A】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの短期間急性ストレスによるうつ病に対する治療効果を検証するための強制水泳動物実験スケジュールの概要図である。
【図10B】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与時に、強制水泳による急性うつ病の尺度を定量して示すグラフであって、左側は、Ｃａｖ３．１ ｍＲＮＡ発現程度をｑＲＴ－ＰＣＲで定量化して示したものであり、右側は、ストレス程度の尺度である不動時間（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ ｔｉｍｅ）を測定した結果を示す。
【図11A】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドのてんかんの治療効果を検証するための動物実験スケジュールを示す概要図であって、アンチセンスオリゴヌクレオチド投与１２日経過後、脳電図（ＥＥＧ）探針挿入術を行い、１４日目に欠神発作を誘導するＧＢＬ（７０ｍｇ／ｋｇ）を処理前後３０分間ＥＥＧを測定する実験過程を示す。
【図11B】前記実験動物で本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与時に、ＥＥＧ測定結果、欠神発作－特異的なＥＥＧ波長帯でＳｐｉｋｅ ａｎｄ ｗａｖｅ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ（ＳＷＤｓ）の減少程度を定量化して示す一連のグラフであって、左側は、ＳＷＤの持続期間を示し、ＳＷＤ総時間を示し、右側は、ＳＷＤの回数を示す。
【図12A】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの麻酔剤であるアバチンによる意識喪失に対する治療効果を検証するための動物実験スケジュールを示す概要図である。
【図12B】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与時に、アバチンによる意識消失後、回復までの時間（ＬＯＲＲ：Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｒｉｇｈｔｉｎｇ Ｒｅｆｌｅｘ）を測定して意識消失の治療効果を検証した結果を示すグラフである。
【図12C】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドのエタノール処理後、覚醒効果を検証するためのさらに他の動物実験スケジュールを示す概要図である。
【図12D】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与時に、低濃度のエタノールによる覚醒程度を測定して意識消失の治療効果を検証した結果を示す一連のグラフであって、左側は、実験動物の速度を測定した結果であり、中央は、実験動物の移動距離を測定した結果を示し、右側は、実験動物の回転頻度を測定した結果を示す。
【図12E】高濃度（３．５ｇ／ｋｇ）のエタノールを処理した後，意識消失に至るまでかかる時間（ＬＯＲＲ ｌａｔｅｎｃｙ）を測定して示すグラフである。
【図13A】本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）の標的配列近隣を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用した動物実験スケジュールを概略的に示す概要図である。
【図13B】本発明の一実施例による多様なアンチセンスオリゴヌクレオチド投与後、７日経過時まで実験動物の生存率を測定して示すグラフである。
【図13C】本発明の一実施例による多様なアンチセンスオリゴヌクレオチド投与後、７日経過時に、実験動物を犠牲にして摘出した脳でＣａｖ３．１の発現程度を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0028】
用語の定義：
本明細書で使われた用語「オリゴヌクレオチド」は、天然ホスホジエステル連結によって共に連結される天然核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）及びペンタフラノシル基（糖）形成ヌクレオシドから形成されるポリヌクレオチドを意味する。したがって、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然種または天然亜単位またはこれらの密接な相同体から形成される合成種を称する。
本明細書で使われた用語「オリゴヌクレオチド」は、天然ホスホジエステル連結によって共に連結される天然核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）及びペンタフラノシル基（糖）形成ヌクレオシドから形成されるポリヌクレオチドを意味する。したがって、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然種または天然亜単位またはこれらの密接な相同体から形成される合成種を称する。
【0029】
本明細書で使われる用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド、望ましくは、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡとが混在されたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸分子をいずれも含む概念である。本用語は、単に分子の１次構造に関するものである。したがって、この用語は、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖または一本鎖ＲＮＡを含む。
【0030】
また、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然型ではない人工型であって、天然オリゴヌクレオチドの機能と類似した機能を行う部分を含む。オリゴヌクレオチドは、糖部分、核酸塩基部分または改変されたヌクレオチド間の連結を有しうる。可能な改変のうち、望ましい改変は、糖部分の２’－Ｏ－アルキル誘導体、特に、２’－Ｏ－エチルオキシメチルまたは２’－Ｏ－メチル、及び／またはヌクレオチド間の骨格に対するホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホン酸である。
【0031】
本明細書で使われる用語「ヌクレオシド間結合基」という用語は、２個のヌクレオシド、例えば、ＤＮＡユニット間、ＤＮＡユニットとヌクレオチド類似体間、２個の非ＬＮＡユニット間、非ＬＮＡユニットとＬＮＡユニット間、２個のＬＮＡユニット間など２個のヌクレオシドを共有結合させることができる基を意味する。天然型核酸分子には、このようなヌクレオシド間結合基としてホスホジエステルが使われるが、このようなホスホジエステルは、前述したように、ホスホロチオエートのような類似した結合で置換が可能である。このような結合基は、下記のような構成の群から選択される何れか１つまたはそれ以上である：－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）２－Ｓ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｒ）－Ｏ－、Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＲ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ－Ｒ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＢＨ３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＲ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－ＮＲ－、－ＮＲ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－ＮＲ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ－、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＲ－、－ＮＲ－ＣＯ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＲ－、－ＣＯ－ＮＲ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＮＲ－ＣＯ－、－ＯＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－、－ＣＨ２－ＳＯ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＲ－ＣＯ－、－ＣＨ２－ＮＣＨ３－Ｏ－ＣＨ２－（ここで、Ｒは、水素または炭素数１～４のアルキル基である）。
【0032】
本明細書で使われる用語「標的とする」は、特定の核酸配列と相補的にハイブリダイズすることができるということを意味する。
【0033】
本明細書で使われる用語「ハイブリダイズすることができる」、「ハイブリッド化することができる」、「ハイブリダイズ」または「ハイブリッド化」は、通常、二重螺旋デュープレックスまたはトリプレックス（オリゴヌクレオチドが二本鎖からなる場合）を形成するように２本の鎖の核酸に、相補的塩基の間のワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）結合としても公知された、水素結合の形成を意味するために使われる。
【0034】
本明細書で使われる用語「Ｃａｖ３．１をコードする遺伝子」は、Ｔ型カルシウムチャネルのα１Ｇサブタイプをコードする遺伝子のイントロンとエキソンとを含むｃａｃｎａ１ｇのゲノム配列を意味する。前記ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子は、ヒトの場合、染色体１７上に存在し、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００００１７．１１基準に６６，７６０ｂｐのサイズを有すると知られている。
【0035】
本明細書で使われる用語「Ｃａｖ３．１をコードする遺伝子の生成物」は、ｃａｃｎａ１ｇゲノム配列で転写されて生成されるｍＲＮＡ配列を意味する。前記ｍＲＮＡは、スプライシングが起こる前、そして、スプライシングが起こった後、いずれもを含みうる。
【0036】
本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましくは、Ｃａｖ３．１をコードする遺伝子またはその生成物と特異的にハイブリダイズする。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｃａｖ３．１をコーディングする遺伝子のＤＮＡ及び／またはこれらの遺伝子から誘導されるｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる。特に、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｃａｖ３．１をコードするｍＲＮＡでイントロン３７及びエキソン３８部位を含む配列番号１で示される核酸配列を標的とする。すなわち、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、位置のみ適切であれば、スプライシング前またはスプライシング後のＣａｖ３．１をコードするｍＲＮＡのいずれもとハイブリダイズすることにより、Ｃａｖ３．１の発現を抑制することができる。本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするのに十分に同じヌクレオチドを含む。
【0037】
本明細書で使われる用語「特異的ハイブリダイゼーション」は、特に、特異的固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）が必要な条件下で非標的された配列にオリゴヌクレオチドの非特異的固定を避けるように十分な程度の相補性があるということを意味する。オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズする標的核酸配列と１００％相補的である必要はない。特に、少なくとも約８０％の相補性程度を有するオリゴヌクレオチドが、標的物として選択された核酸と特異的にハイブリダイズすることができる。
【0038】
本明細書で使われる場合、「ＬＮＡユニット」、または「ＬＮＡモノマー」、「ＬＮＡ残基」、「ロック核酸ユニット」、「ロック核酸モノマー」または「ロック核酸残基」という用語は、二重環ヌクレオシド類似体を意味する。ＬＮＡユニットは、ＷＯ１９９９０１４２２６Ａ、ＷＯ２００００５６７４６Ａ、ＷＯ２００００５６７４８Ａ、ＷＯ２００１２５２４８Ａ、ＷＯ２００２０２８８７５Ａ、ＷＯ２００３００６４７５Ａ及びＷＯ２００３０９５４６７Ａに詳しく記載されている。ＬＮＡユニットは、またその化学式と定義されうる。したがって、本発明に使われたような「ＬＮＡユニット」は、その化学式が下記の構造式で表われる化合物を意味する：
（構造式１ａ）または
（構造式１ｂ）
（前記構造式において、Ｘは、Ｏ、Ｓ及びＮＲで構成される群から選択され、前記Ｒは、Ｈまたは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｙは、ＣＨ２である）。
前記構造式１ａ及び構造式１ｂにおいて、Ｘが、Ｓである場合、「チオＬＮＡユニット」と称され、Ｘが、ＮＲである場合、「アミノＬＮＡユニット」と称され、Ｘが、Ｏである場合、「オキシＬＮＡユニット」と称される。
【化1】
【化2】
（前記構造式において、Ｘは、Ｏ、Ｓ及びＮＲで構成される群から選択され、前記Ｒは、Ｈまたは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｙは、ＣＨ２である）。
前記構造式１ａ及び構造式１ｂにおいて、Ｘが、Ｓである場合、「チオＬＮＡユニット」と称され、Ｘが、ＮＲである場合、「アミノＬＮＡユニット」と称され、Ｘが、Ｏである場合、「オキシＬＮＡユニット」と称される。
【0039】
本明細書で使われる用語「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、ジムノシス（ｇｙｍｎｏｓｉｓ）と称される過程によって形質感染製剤なしにも、細胞内に吸収されてＲＮａｓｅ Ｈ活性化誘導によって標的ｍＲＮＡ発現を妨害する、両末端のＬＮＡ配列の間に中央ＤＮＡ配列を含む短い一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する（Ｈｖａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５：１７１０－１７１７，２０１７）。したがって、一種のＲＮＡであるＬＮＡとＤＮＡとが連結された一種のハイブリッド核酸分子である。両末端のＬＮＡは、ヌクレアーゼに対する抵抗性と標的配列に対する高い親和度とを有させ、内部のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）でＲＮＡ特異的分解を誘導するＲＮａｓｅ Ｈ活性化部位として作用する。通常、両末端のＬＮＡは、３～５ｎｔの長さを有し、中央のＤＮＡは、１０ｎｔ程度の長さを有する。但し、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端のＲＮＡは、塩基としてウラシル（Ｕ）の代わりに、チミン（Ｔ）を使用することができる。
【0040】
発明の詳細な説明：
本発明の一観点によれば、配列番号１を標的とする、Ｃａｖ３．１をコードする遺伝子の発現抑制用アンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明の一観点によれば、配列番号１を標的とする、Ｃａｖ３．１をコードする遺伝子の発現抑制用アンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
【0041】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１で示される核酸配列とハイブリダイズ可能な核酸分子であって、例えば、１１～３０ｎｔまたは１２～２９ｎｔの長さを有しうる。望ましい実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１３～２８ｎｔの長さを有するが、さらに望ましくは、１４～２７ｎｔ、１５～２６ｎｔ、１６～２５ｎｔ、１７～２４ｎｔ、１８～２３ｎｔまたは１９～２２ｎｔの長さを有しうる。さらに具体的には、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｔの長さを有しうる。
【0042】
本発明の一実施例による前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７～３０ｎｔの長さを有する核酸分子である。前記配列番号１で示される核酸配列は、Ｃａｖ３．１をコードする遺伝子のエキソン３８とこれと隣接したイントロン３７の３’末端の一部とを含む。望ましくは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２０または配列番号２１で示される核酸配列を含み得る。
【0043】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸分子であり、ホスホジエステル（ＰＯ）骨格の一部または全部が他の形態、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ、ＰＳ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏ ｄｉｔｈｉｏａｔｅ）またはメチルホスホン酸（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）で置換されたものであり、糖部分の２’－ＯＨの一部または全部が改変されていてもよく、このような２’－ＯＨの改変の例としては、－Ｏ－ＣＨ３（－ＯＭｅ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＯＥｔ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３（－ＭＯＥ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ２、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ、－ＯＦまたは－Ｆで置換されたヌクレオチド類似体が含まれる。
【0044】
選択的に、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖部分が改変されたヌクレオチド類似体、例えば、また、糖部分に追加的な環が形成された、いわゆるＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）ユニットを含みうる。前記ＬＮＡは、前述した通りである。全体ヌクレオチドのうち少なくとも約３０％は、ヌクレオチド類似体であり、例えば、少なくとも約３３％、例えば、少なくとも約４０％、例えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約６６％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％がヌクレオチド類似体である。本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体配列のみからなるヌクレオチド塩基配列からなりうる。
【0045】
このようなオリゴヌクレオチドの骨格及び糖部分の改質は、標的配列とのハイブリダイゼーションの安定性を高めるか、体内で核酸分解酵素などによって分解されることにより、体内半減期が顕著に減少する現象を抑制して薬物安定性及び薬物動態学的特性を改善するためである。
【0046】
本発明の望ましい改変にはキメラオリゴヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個の化学的に異なる領域（それぞれ１つ以上のヌクレオチドを含む）を含む。特に、これらは、１つ以上の有利な特性、例として、より優れた生物学的安定性、増加した生物学的利用性、増加した細胞耐火または標的ＲＮＡに対する親和性の増加を付与する改変されたヌクレオチドを含む１つまたは数個の領域からなる。
【0047】
同じ長さを有する２個の配列の核酸の間の相補性の程度は、２個の配列を整列した後、第１配列と第２配列とに相補的な配列を比較することで決定される。相補性の程度は、ヌクレオチドが比較される２個の配列の間で同じ位置の数を決定し、同じ位置の数を位置の総数で割り、得た結果に１００を乗算して、これらの２個の配列間の相補性の程度を得るように計算される。
【0048】
本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーであり、前記ギャップマーは、両末端に３～５ｎｔの長さのＲＮＡユニットとＬＮＡとの間に存在する８～１２ｎｔの長さのＤＮＡを含む核酸分子である。この際、前記ＲＮＡユニットは、少なくとも１つ以上のＬＮＡを含みうる。
【0049】
本発明の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含むパーキンソン病治療用薬学的組成物が提供される。
【0050】
パーキンソン病とＣａｖ３．１との相関関係は、先行文献によく記述されている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ，７：１７２，２０１３；Ｒｕｂｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３６（２）：２２１３－２２２８，２０１２；Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＳＣ Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２（１２）：７３０－７４２，２０１２）。その上に、本発明者らは、Ｃａｖ３．１、特に、イントロン３７－エキソン３８を含む領域に特異的に結合してＣａｖ３．１の発現を抑制しながらも、他の副作用のない本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、パーキンソン病モデル動物の異常筋肉症状を顕著に緩和させることができるということを実験的に立証した。したがって、Ｃａｖ３．１の発現を特異的に抑制することができる本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、パーキンソン病の治療において、非常に効率的な治療剤になりうる。
【0051】
本発明の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含むうつ病治療用薬学的組成物が提供される。
【0052】
最近の研究結果によれば、Ｔ型カルシウムチャネルが不安－関連行動と相関関係があるという報告がある。具体的に、Ｔ型カルシウムチャネルが開かれる場合、不安－関連行動が誘導され、逆に、Ｔ型カルシウムチャネル遮断体の投与時に、不安症状が減少すると報告された（Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３１（３）：２０１９００６７，２０２０）。それだけではなく、本発明者らは、Ｃａｖ３．１遺伝子が的中された形質転換マウスでうつ病関連症状が緩和されるということを実験的に確認した。したがって、Ｃａｖ３．１遺伝子を標的とする本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、うつ病の治療にも使用が可能である。それだけではなく、本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、うつ病の治療に効果的であるということを動物実験を通じて立証した。
【0053】
本発明の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む本態性振戦治療用薬学的組成物が提供される。
【0054】
本発明者らは、Ｃａｖ３．１（Ｔ型カルシウムチャネルのα１Ｇサブユニット）を特異的に抑制することにより、本態性振戦を治療することができるということを究明した（大韓民国特許第９５８２８６号）。したがって、本発明の一実施例によるＣａｖ３．１の発現を特異的に抑制することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本態性振戦の治療に使われる。また、本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本態性振戦の治療に使用可能であるということを動物実験を通じて立証した。
【0055】
本発明の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含むてんかん治療用薬学的組成物が提供される。
【0056】
Ｔ型カルシウムチャネルを特異的に抑制するＴ型カルシウムチャネル遮断剤が視床の急発火を減少させ、それにより、発作症状を抑制すると知られている（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７７：７２９－７３９，２０１４；Ｃａｓｉｌｌａｓ－Ｅｓｐｉｎｏｓａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１０：３０１３００１２，２０１５）。したがって、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、てんかんの治療に使用が可能である。それだけではなく、本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、癲癇、すなわち、てんかんの治療に使用可能であるということを動物実験を通じて立証した。
【0057】
前記薬学的組成物において、前記てんかんは、欠神発作である。
【0058】
本発明の他の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む不安障害治療用薬学的組成物が提供される。
【0059】
本発明者らは、不安障害モデル動物であるホスホリパーゼβ４（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅβ４、ＰＬＣβ４）の遺伝子がノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）されたマウスにＴ型カルシウムチャネル選択的遮断剤であるミベフラジルを投与する場合、前記マウスで低下した記憶消滅能力が正常に戻り、ミベフラジル及びエホニジピン（ｅｆｏｎｉｄｉｐｉｎｅ）を正常マウスのＭＤに投与すれば、前記マウスで恐怖記憶が早く消滅し、前記消滅した記憶の回想能力が減少することを確認した（大韓民国特許第９５８２９１号）。したがって、本発明の一実施例によるＣａｖ３．１の発現を特異的に抑制することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、不安障害の治療に使われる。
【0060】
本発明の他の一観点によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む意識不明状態回復用薬学的組成物が提供される。本発明の発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを意識不明が誘導された実験動物に投与する場合、意識回復が促進されるということを実験的に立証した。したがって、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、昏睡状態を含めた意識不明状態にある患者の意識の回復のための薬物として使用が可能である。
【0061】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをパーキンソン病を病んでいる個体に投与する段階を含む前記個体のパーキンソン病の治療方法が提供される。
【0062】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをうつ病を病んでいる個体に投与する段階を含む前記個体のうつ病の治療方法が提供される。
【0063】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを本態性振戦を病んでいる個体に投与する段階を含む前記個体の本態性振戦の治療方法が提供される。
【0064】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをてんかんを病んでいる個体に投与する段階を含む前記個体のてんかんの治療方法が提供される。
【0065】
前記方法において、前記てんかんは、欠神発作である。
【0066】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを不安障害を有した個体に投与する段階を含む前記個体の不安障害の治療方法が提供される。
【0067】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを意識不明状態の個体に投与する段階を含む前記個体の意識回復方法が提供される。
【0068】
前記組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができ、前記担体以外に薬学的に許容可能な補助剤、賦形剤または希釈剤をさらに含みうる。
【0069】
本明細書で使われる用語「薬学的に許容可能な」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される時、通常の胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはそれと類似した反応を起こさない組成物を言う。前記担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含みうる。
【0070】
また、本発明の一実施例による薬学的組成物は、哺乳動物に投与時に、活性成分の迅速な放出、または持続または遅延された放出が可能に当業者に公知の方法を使用して製剤される。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態を含む。
【0071】
本発明の一実施例による組成物は、多様な経路に投与されるが、望ましくは、脊椎腔内注射（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、頭蓋内注射（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、またはオンマヤリザーバー（Ｏｍｍａｙａ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を通じた脳室内注射（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＩＣＶ）を通じて投与される。投与方法が多少侵襲的であるという点を考慮して投与地点に挿入されたカテーテルに適切に連結された貯蔵庫とポンプとを含む投与装置を通じて所定の間隔で自動投与も可能である。選択的に自動投与装置の代わりに、手動で適切な間隔で１日１回または数回に分けて投与することができ、週１回、週２回、月１回などの間隔で投与され、投与期間も、特に限定されるものではない。
【0072】
本発明の一実施例による組成物は、一般的に使われる薬学的に許容可能な担体と共に適した形態に製剤される。薬学的に許容される担体としては、例えば、水、適したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールのような非経口投与用担体などがあり、安定化剤及び保存剤をさらに含みうる。適した安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適した保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチル－またはプロピル－パラベン及びクロロブタノールがある。また、本発明による組成物は、その投与方法や剤形によって必要な場合、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、酸化防止剤などを適切に含みうる。前記に例示されたものを含めて、本発明に適した薬学的に許容される担体及び製剤は、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版］に詳しく記載されている。
【0073】
前記組成物の患者に対する投与量は、患者の身長、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び経路、一般的な健康、及び同時に投与される他の薬物を含む多くの要素によって異なる。薬学的に活性であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１００ｎｇ／体重（ｋｇ）～１０ｍｇ／体重（ｋｇ）の量で投与され、さらに望ましくは、１～５００μｇ／ｋｇ（体重）で投与され、最も望ましくは、５～５０μｇ／ｋｇ（体重）で投与されるが、前記要素を考慮して投与量が調節される。
【0074】
本明細書で使われる用語「治療的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、医学的治療に適用可能な合理的な恵み／危険の比率で疾患の治療に十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使われる薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定されうる。本発明の組成物の治療的に有効な量は、０．５μｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇ、さらに望ましくは、１０μｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇであるが、有効投与量は、患者の年齢、性別及び状態によって適切に調節される。
【0075】
本明細書で使われる用語「治療」は、ある疾病、障害、または問題を治療、治癒、緩和するために計画された体系的過程と活動とを意味する。根本的には、疾病の病因を除去するか、病巣を発病以前の状態に修復することが最終的な目標であるが、たとえ、疾病の病因を除去するか、病巣を原状への修復することができないとしても、疾病の症状を除去または緩和する症状の軽減も、治療の範疇に含まれる。また、本発明の一実施例による薬物を症状が発現されて前に投与することにより、当該症状が表われないようにするか、表われても、緩和されて表われることにより、患者が日常生活を営むのに大きな支障がないようにする予防的行為も、治療の範疇に属する。したがって、本発明の一実施例による薬学的組成物は、疾病予防の用途として使われ、本発明の一実施例による治療方法は、疾病の症状の予防方法を含む。
【0076】
以下、実施例及び実験例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例及び実験例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態として具現可能なものであって、以下の実施例及び実験例は、本発明の開示を完全にし、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。
【実施例】
【0077】
実施例：Ｃａｃｎａ１ｇ標的アンチセンスオリゴヌクレオチドの考案
本発明者らは、Ｔ型カルシウムチャネルの３種の同型のうち、α１Ｇサブユニット（Ｃａｖ３．１）をコードする遺伝子であるｃａｃｎａ１ｇを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）候補２０種を標的特異性及び安定性などを考慮して考案した（図１及び表１）。また、本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチド構造で従来に安定的でありながらも、効果的であると知られた、内部の１０ｎｔのＤＮＡ配列及び５’末端及び３’末端にそれぞれ２’－ＭＯＥ改変骨格を有する各５ｎｔのＲＮＡ配列を含むギャップマーを使用した。前記ギャップマーのうち、ＤＮＡ部分は、糖どうしで連結する結合で通常のホスホジエステル結合（ＰＯ ｂｏｎｄ）の代わりに、ホスホロチオエート結合（ＰＳ ｂｏｎｄ）が使われ、ＲＮＡ部分は、最後の配列の両先端のみＰＳ結合が使われ、残りのＲＮＡ部分は、ＰＯ結合が使われた（図２）。一方、ＲＮＡ部分に含まれるウラシル（Ｕ）は、いずれもチミン（Ｔ）に代替し、あらゆるシトシン（Ｃ）は、メチル化シトシンで置換され、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性をさらに高めるためである。
本発明者らは、Ｔ型カルシウムチャネルの３種の同型のうち、α１Ｇサブユニット（Ｃａｖ３．１）をコードする遺伝子であるｃａｃｎａ１ｇを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）候補２０種を標的特異性及び安定性などを考慮して考案した（図１及び表１）。また、本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチド構造で従来に安定的でありながらも、効果的であると知られた、内部の１０ｎｔのＤＮＡ配列及び５’末端及び３’末端にそれぞれ２’－ＭＯＥ改変骨格を有する各５ｎｔのＲＮＡ配列を含むギャップマーを使用した。前記ギャップマーのうち、ＤＮＡ部分は、糖どうしで連結する結合で通常のホスホジエステル結合（ＰＯ ｂｏｎｄ）の代わりに、ホスホロチオエート結合（ＰＳ ｂｏｎｄ）が使われ、ＲＮＡ部分は、最後の配列の両先端のみＰＳ結合が使われ、残りのＲＮＡ部分は、ＰＯ結合が使われた（図２）。一方、ＲＮＡ部分に含まれるウラシル（Ｕ）は、いずれもチミン（Ｔ）に代替し、あらゆるシトシン（Ｃ）は、メチル化シトシンで置換され、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性をさらに高めるためである。
【0078】
【表1】
【0079】
実験例１：１次スクリーニング
本発明者らは、前記表１に記載のように、ｃａｃｎａ１ｇ ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド候補物質を考案した後、それをＭｙｃｒｏｓｙｎｔｈ社（Ｇｅｒｍａｎｙ）に依頼して製造した。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをＡ５４９細胞にリポフェクタミン試薬を用いて２００ｎＭの濃度で処理して形質感染させた後、４８時間経過後、細胞をｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＲＴ ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ、Ｊａｐａｎ）で溶解させ、逆転写反応を行った。その後、Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅとｑＲＴ－ＰＣＲプリミックス（ＴＯＹＯＢＯ、Ｊａｐａｎ）とを利用したｑＲＴ－ＰＣＲを行って、ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子発現レベルを測定した。具体的なｑＲＴ－ＰＣＲのためのプローブ及びプライマー情報は、下記表１に記載の通りである。その結果、図３から確認されるように、繰り返して５０％以上遺伝子発現がノックダウンされるａ８０、ａ８２、ａ９１、ａ９２などアンチセンスオリゴヌクレオチド８種を選別した。
本発明者らは、前記表１に記載のように、ｃａｃｎａ１ｇ ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド候補物質を考案した後、それをＭｙｃｒｏｓｙｎｔｈ社（Ｇｅｒｍａｎｙ）に依頼して製造した。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをＡ５４９細胞にリポフェクタミン試薬を用いて２００ｎＭの濃度で処理して形質感染させた後、４８時間経過後、細胞をｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＲＴ ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ、Ｊａｐａｎ）で溶解させ、逆転写反応を行った。その後、Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅとｑＲＴ－ＰＣＲプリミックス（ＴＯＹＯＢＯ、Ｊａｐａｎ）とを利用したｑＲＴ－ＰＣＲを行って、ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子発現レベルを測定した。具体的なｑＲＴ－ＰＣＲのためのプローブ及びプライマー情報は、下記表１に記載の通りである。その結果、図３から確認されるように、繰り返して５０％以上遺伝子発現がノックダウンされるａ８０、ａ８２、ａ９１、ａ９２などアンチセンスオリゴヌクレオチド８種を選別した。
【0080】
実験例２：２次スクリーニング
引き続き、本発明者らは、前記実験例１から選定された８種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象にしてリポフェクタミン試薬を用いて、２種の濃度（１００ｎＭ及び４００ｎＭ）で細胞内吸収及びｃａｃｎａ１ｇ遺伝子のノックダウンが可能であるかを調査した。
引き続き、本発明者らは、前記実験例１から選定された８種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象にしてリポフェクタミン試薬を用いて、２種の濃度（１００ｎＭ及び４００ｎＭ）で細胞内吸収及びｃａｃｎａ１ｇ遺伝子のノックダウンが可能であるかを調査した。
【0081】
その結果、図４から確認されるように、８種のアンチセンスオリゴヌクレオチドいずれも４００ｎＭの濃度では、非常に優れたノックダウン効率を示した。但し、ａ８０、ａ８２及びａ８４の場合、１００ｎＭの濃度では、ノックダウン効率が他のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも低く表われた。
【0082】
実験例３：毒性分析及び生体内遺伝子発現調節分析
本発明者らは、実験例１及び実験例２の細胞実験結果に基づいて本発明の一実施例による８種のアンチセンスオリゴヌクレオチド候補の安定性及び薬理効果を検証するために動物実験を行った。
本発明者らは、実験例１及び実験例２の細胞実験結果に基づいて本発明の一実施例による８種のアンチセンスオリゴヌクレオチド候補の安定性及び薬理効果を検証するために動物実験を行った。
【0083】
具体的に、本発明者らは、Ｐ０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスを各グループ当たり４～６頭ずつ分けた後、各実施例のアンチセンスオリゴヌクレオチド（１ｍＭ）を頭脳の両側半球にそれぞれ２μｌずつ総４μｌ（２５μｇ）を脳室内（ＩＣＶ）注射で投与した後、７日経過後、生存率を測定し、生き残ったマウスの脳組織を摘出して、脳組織でのｃａｃｎａ１ｇ遺伝子の発現レベルを前述した実験例１に記載のｑＲＴ－ＰＣＲを用いて測定した（図５Ａ）。
【0084】
その結果、図５Ｂから確認されるように、ａ８８を投与したマウスは、６時間内にいずれも斃死し、ａ８６の場合、総６頭のうち、４頭が斃死し、ａ８２の場合、５頭のうち、２頭が斃死し、ａ８４は、６頭のうち、２頭が斃死して、相当な毒性があるということが確認された。一方、ａ８９、ａ９１及び９２は、６頭のうち、１頭が斃死するか、最初から斃死した実験動物がないと確認されて相対的に安全なアンチセンスオリゴヌクレオチド候補物質であるということが確認された。一方、ＡＳ－Ｃａｖ３．１＿２０ｍｅｒの場合、先行文献でＣａｖ３．１をノックダウンさせるために使われた陽性対照群であるが（Ｂｏｕｒｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２４：３１５－３２４，２００５）、マウスとラットのみで配列が相補的であり、猿とヒトとを含む霊長類遺伝子とは相補的ではなく、その他の遺伝子と交差反応を起こす確率が高い関係で最初のスクリーニング実験のみで陽性対照群として使用し、以後、ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングでは排除した。
【0085】
また、実際の動物実験での遺伝子発現阻害効果を確認した結果、図５Ｃから確認されるように、ａ８２及びａ８４の場合、細胞実験とは異なって、生体内条件では、ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子発現抑制効率が低く表われ、ａ８６、ａ８９、ａ９１、及びａ９２の遺伝子発現抑制効率に優れていると確認された。
【0086】
【0087】
実験例４：交差反応の分析
Ｔ型カルシウムチャネルのαサブユニットは、３種の同型体（ｉｓｏｔｙｐｅ）が存在し、これらの間の相同性は非常に高い。特に、これらの３種の同型体のαサブユニットは、発現される器官及び組織が異なって、これらに対する非差別的な遮断剤は、全身投与時に、標的器官ではない場所のＴ型カルシウムチャネルまで遮断することにより、多様な副作用が表われると知られている。このような交差反応性のために、現在まで開発されたＴ型カルシウムチャネル遮断剤は、実際の臨床使用時に、深刻な副作用を示していると知られている。
Ｔ型カルシウムチャネルのαサブユニットは、３種の同型体（ｉｓｏｔｙｐｅ）が存在し、これらの間の相同性は非常に高い。特に、これらの３種の同型体のαサブユニットは、発現される器官及び組織が異なって、これらに対する非差別的な遮断剤は、全身投与時に、標的器官ではない場所のＴ型カルシウムチャネルまで遮断することにより、多様な副作用が表われると知られている。このような交差反応性のために、現在まで開発されたＴ型カルシウムチャネル遮断剤は、実際の臨床使用時に、深刻な副作用を示していると知られている。
【0088】
したがって、他の同型体の発現は抑制せずとも、αサブユニット（Ｃａｖ３．１）のみの発現を選択的に抑制することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発することがより安全な薬物の開発での先行要件となる。
【0089】
これにより、本発明者らは、前記最終候補物質として選別されたａ９１及びａ９２がＣａｖ３．１のみを選択的に抑制するか否かを動物実験を通じて調査した。
【0090】
このために、具体的に、本発明者らは、Ｐ０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスにａ９１及びａ９２（１ｍＭ）をそれぞれ頭脳の両側半球にそれぞれ２μｌずつ総４μｌ（２５μｇ）を脳室内（ＩＣＶ）注射で投与した後、７日経過後、マウスの脳組織を摘出して、脳組織でのｃａｃｎａ１ｇ（Ｃａｖ３．１）、ｃａｃｎａ１ｈ（Ｃａｖ３．２）及びｃａｃｎａ１ｉ（Ｃａｖ３．３）遺伝子の発現レベルを表１に記載のプライマー及びプローブを用いて、前述した実験例１に記載のｑＲＴ－ＰＣＲを用いて測定した（図５Ａ）。
【0091】
【表2】
【0092】
その結果、図６Ａ及び図６Ｂから確認されるように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１及びａ９２）は、他の同型体をコードする遺伝子の発現は抑制せずとも、ｃａｃｎａ１ｇの発現のみを特異的に抑制するということを確認することができた。したがって、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、他の同型体の発現には影響を及ぼさず、単にα１Ｇサブユニットの発現のみを選択的に抑制することにより、α１Ｇサブユニットが関与した多様な疾患の治療に効率的に使われるということが分かる。
【0093】
実験例５：パーキンソン病の治療効果の分析
前記実験例１ないし実験例４の結果から、本発明者らは、ｃａｃａｎａ１ｇ関連疾患のうち、代表的な疾患として知られたパーキンソン病に対して、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが治療効果を示すか否を調査した。
前記実験例１ないし実験例４の結果から、本発明者らは、ｃａｃａｎａ１ｇ関連疾患のうち、代表的な疾患として知られたパーキンソン病に対して、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが治療効果を示すか否を調査した。
【0094】
５－１：治療効果の検証
このために、具体的に、本発明者らは、６－ＯＨＤＡ（６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ）を投与したマウスをパーキンソン病モデル動物として製造した後、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）２００μｇを７～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに脳室内注射を通じて投与し、１週間経過後、開放場の分析を行った（図７Ａ）。
このために、具体的に、本発明者らは、６－ＯＨＤＡ（６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ）を投与したマウスをパーキンソン病モデル動物として製造した後、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）２００μｇを７～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに脳室内注射を通じて投与し、１週間経過後、開放場の分析を行った（図７Ａ）。
【0095】
その結果、図７Ｂから確認されるように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド注入１週間経過後、開放場の分析結果、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）投与時に、減少した同側回転を示した。
【0096】
６－ＯＨＤＡを線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）に一側の半球のみに（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ）注射して誘導したパーキンソン病モデルマウスの場合には、注射した方向に繰り返して回転する表現型を特徴的に示した（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，６０：ｅ３２３４，２０１２）。図７Ｂ及び図７Ｃの実験に使用したラットの場合、左側半球に位置した線条体に６－ＯＨＤＡを注射したために、左側方向に回転する表現型を見せる。このように注射した方向のような方向に回転する態様を同側回転（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ ｒｏｔａｔｉｏｎ）と言う。図７Ｂの場合、６－ＯＨＤＡのみを注射したマウスグループの場合には、移動距離に比べて、同軸回転の比率が増加し、６－ＯＨＤＡモデルに追加的にＣａｖ３．１－ＡＳＯ（ａ９１）を２００μｇ脳室内注射したマウスの場合、同側回転の比率が減少した。これは、Ｃａｖ３．１－ＡＳＯ ２００μｇ注射を通じて６－ＯＨＤＡによるパーキンソン病関連病的表現型が減った態様を示すということを意味する。
【0097】
図７Ｃの場合には、当該マウスが３０分間移動した距離を測定したものである。Ｃａｖ３．１－ＡＳＯ ２００μｇをさらに投与したラットの場合、陰性対照群レベルに動きが減少したと見られるが、統計的にあらゆるグループでの移動距離が有意な差を示さなかった。また、図７Ｄは、当該マウスの移動速度を測定したものである。移動速度も、前記移動距離と類似にＣａｖ３．１－ＡＳＯ ２００μｇをさらに投与したラットの場合、陰性対照群レベルに動きが減少したと見られるが、統計的にあらゆるグループで移動速度が有意な差はなかった。
【0098】
本発明者らは、引き続き、運動能力に対する評価指標として加速ロータロッド検査を行った。前記実験動物に対してアンチセンスオリゴヌクレオチド注入１週間経過後、１日間隔で加速ロータロッド検査を行った。
【0099】
その結果、図７Ｅから確認されるように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、濃度－依存的に、そして、試験日数が増加するほど運動能力が向上するということを示した。一方、６－ＯＨＤＡのみ投与された陰性対照群の場合、運動能力失調現象は、時間が経過しても、全く改善されなかった。
【0100】
５－２：機序の確認
本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド作用機序が、実際にドーパミンニューロンの死滅以後に作用したか否かを確認した。
本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド作用機序が、実際にドーパミンニューロンの死滅以後に作用したか否かを確認した。
【0101】
このために、本発明者らは、具体的に、前記実験例５－１の実験動物でパーキンソン病誘発薬物とした知られた６－ＯＨＤＡ薬物を脳の線条体に投与し、投与当日、アンチセンスオリゴヌクレオチドを共に投与した。６－ＯＨＤＡ投与は、一週間以内に細胞死を誘導し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用は、一週間程度の時間が必要なので、本実験方法としてはドーパミンニューロンの死滅抑制効果を期待しにくい。ドーパミンニューロンの死滅を測定するために、５週経過後、実験動物を犠牲にさせた後、脳を摘出して冷凍薄片機（ｃｒｙｏｔｏｍｅ）で組織薄片を製造した後、ドーパミン性神経細胞特異的マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に特異的に結合する抗体を用いて線条体及び黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ）に対する組織化学分析を行った。その結果、図７Ｆで示すように、何の薬物を投与していない対照群のドーパミンニューロンは、正常に表われたが、６－ＯＨＤＡ投与したあらゆるグループでドーパミンニューロンの死滅が観察された。これは、本実施例で使われた実験方法では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがドーパミンニューロンの死滅に影響を与えなかったが、ドーパミンニューロンが死滅した後、ドーパミンニューロンの消失によって発生する異常な運動ニューロンの信号伝達を遮断することにより、作動するということを示す。
【0102】
実験例６：本態性振戦の治療効果の分析
本発明者らは、引き続き、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本態性振戦の治療に効果があるか否かをｈａｒｍａｌｉｎｅ－誘導本態性振戦モデルマウスを対象とした動物実験を行うことで調査した。
本発明者らは、引き続き、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本態性振戦の治療に効果があるか否かをｈａｒｍａｌｉｎｅ－誘導本態性振戦モデルマウスを対象とした動物実験を行うことで調査した。
【0103】
このために、具体的に、図８Ａに示したように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）２００μｇを７～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに脳室内投与した後、２週経過後、振戦誘導物質であるｈａｒｍａｌｉｎｅを９ｍｇ／ｋｇの容量で腹腔投与し、８～１０分経過後、図８Ｂに示されたような装置を用いて震え症（ｔｒｅｍｏｒ）検査を行った。
【0104】
【0105】
前記結果は、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本態性振戦の治療に効果的であるということを示すものである。
【0106】
実験例７：うつ病の治療効果の分析
本発明者らは、引き続き、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、うつ病の治療に効果があるか否かをストレス－誘導うつ病モデルマウスを対象とした動物実験を行うことで調査した。
本発明者らは、引き続き、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、うつ病の治療に効果があるか否かをストレス－誘導うつ病モデルマウスを対象とした動物実験を行うことで調査した。
【0107】
７－１：慢性社会的ストレスモデルでの効果
まず、本発明者らは、図９Ａに示された実験スケジュールと図９Ｂに示された具体的な方法とを用いてうつ病の尺度を調査したが、具体的に、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）２００μｇを７～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに脳室内注入した後、５日目から１０日間、他の攻撃性個体を実験動物が留まっているケージに合飼することにより、社会的敗北ストレス（ｓｏｃｉａｌ ｄｅｆｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ）を加えた後、１７日目に社会的相互作用を測定することにより、ストレスによるうつ病の程度を測定した。
まず、本発明者らは、図９Ａに示された実験スケジュールと図９Ｂに示された具体的な方法とを用いてうつ病の尺度を調査したが、具体的に、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）２００μｇを７～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに脳室内注入した後、５日目から１０日間、他の攻撃性個体を実験動物が留まっているケージに合飼することにより、社会的敗北ストレス（ｓｏｃｉａｌ ｄｅｆｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ）を加えた後、１７日目に社会的相互作用を測定することにより、ストレスによるうつ病の程度を測定した。
【0108】
その結果、図９Ｃで示すように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与された実験動物は、Ｃａｖ３．１発現が減少する一方、社会的相互作用は、ほぼ対照群レベルに回復された。これは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、社会的ストレスの減少に非常に効果的な物質であるということを示すものである。
【0109】
７－２：短期急性ストレスモデルでの効果
引き続き、本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、急性うつ病に対する治療効果があるかを確認するために、強制水泳検査（ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｅｓｔ）を行った。
引き続き、本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、急性うつ病に対する治療効果があるかを確認するために、強制水泳検査（ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｅｓｔ）を行った。
【0110】
具体的に、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）２００μｇを７～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに脳室内投与し、３週経過後、図１０Ａに示したように、水槽に落とし、ストレスによって表われる不動時間を測定することにより、ストレス指数を把握した。
【0111】
その結果、図１０Ｂから確認されるように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、脳でＣａｖ３．１の発現を顕著に下げただけではなく、ストレスの徴候である不動時間が顕著に減少するということを確認した。これは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、慢性ストレスはもとより、短期ストレスに対する耐性を有させる物質であるということを示す結果である。
【0112】
実施例８：てんかんの治療効果
本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、てんかんの治療にも使用が可能であるか否かを調査した。
本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、てんかんの治療にも使用が可能であるか否かを調査した。
【0113】
具体的に、本発明者らは、図１１Ａに示したように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）を２００μｇを７～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに脳室内投与し、１２日経過後、ＥＥＧ探針挿入施術を行い、１４日経過後、欠神発作（ａｂｓｅｎｃｅ ｓｅｉｚｕｒｅ）を誘発するγ－ブチロラクトン（ＧＢＬ）を７０ｍｇ／ｋｇ投与した。ＧＢＬ投与後、３０分前と後とに、それぞれ脳電図（ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｍ、ＥＥＧ）を測定し、アンチセンスオリゴヌクレオチド投与から４２日経過時に、実験動物を犠牲にさせ、脳を摘出してＣａｖ３．１ ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。
【0114】
その結果、図１１Ｂから確認されるように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、スパイク及び波長放電（ｓｐｉｋｅ ａｎｄ ｗａｖｅ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ、ＳＷＤ）の頻度及び１０分当たり回数いずれも有意に減少させた。
【0115】
これは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、てんかん、特に、欠神発作の治療に効果的であるということを示す結果である。
【0116】
実験例９：意識回復の効果
昏睡状態またはコーマ（ｃｏｍａ）は、医学で深い意識不明状態を意味する。いわゆる、「植物人間」と呼ばれる昏睡状態にあるヒトは覚ますことができず、苦痛や光、音など外部の刺激にも反応しない。昏睡状態の原因としては、薬物などの中毒、物質代謝異常、中枢神経系疾病、低酸素症や脳卒中のような疾患などが知られているが、昏睡状態は、自動車事故や墜落など、脳に加えられた外傷よって発生する。残念ながら、このような昏睡状態の患者の意識を回復させる薬物は報告されていない。
昏睡状態またはコーマ（ｃｏｍａ）は、医学で深い意識不明状態を意味する。いわゆる、「植物人間」と呼ばれる昏睡状態にあるヒトは覚ますことができず、苦痛や光、音など外部の刺激にも反応しない。昏睡状態の原因としては、薬物などの中毒、物質代謝異常、中枢神経系疾病、低酸素症や脳卒中のような疾患などが知られているが、昏睡状態は、自動車事故や墜落など、脳に加えられた外傷よって発生する。残念ながら、このような昏睡状態の患者の意識を回復させる薬物は報告されていない。
【0117】
前記実験例８で考察したてんかんの主要症状は、意識の喪失である。また、てんかんとＴ型カルシウムチャネルと欠神発作との相関関係がよく知られており、Ｔ型カルシウムチャネルのα１Ｇサブユニットの発現抑制を通じて欠神発作の症状が緩和されるということを立証した前記実験例８の結果から、本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、意識回復に効果的であるか否かを確認しようとした。
【0118】
このために、具体的に、本発明者らは、図１２Ａに示したように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）２００μｇを７～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに脳室内投与し、１１日経過後、麻酔剤であるＡｖｅｒｔｉｎ ４００ｍｇ／ｇｋを腹腔投与して意識喪失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｒｉｇｈｔｉｎｇ ｒｅｆｌｅｘ、ＬＯＲＲ）を誘導した。以後、意識喪失時間（ｌｏｓｓ ｏｆ ｒｉｇｈｔｉｎｇ ｒｅｆｌｅｘ、ＬＯＲＲ ｄｕｒａｔｉｏｎ）を測定した。その結果、図１２Ｂから確認されるように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）投与群では、意識喪失時間が有意に減少した。
【0119】
また、本発明者らは、意識喪失モデルのうち、アルコール－誘導意識喪失モデル動物を用いて、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アルコール－誘導意識喪失を迅速に回復させるか否かを調査した。
【0120】
具体的に、図１２Ｃに示された実験スケジュールどおりに、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）２００μｇを７～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに脳室内投与し、１２～１３日経過後、２０％エタノール水溶液をエタノール基準に０．６ｇ／ｋｇ投与量で腹腔投与後、３０分間開放場で実験動物の行動を動画で撮影した後、コンピュータソフトウェア（ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ、Ｎｏｌｄｕｓ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）を用いて実験動物の移動速度、移動距離及び回転頻度を測定した。また、二日経過後、高濃度（３．５ｇ／ｋｇ）のエタノールを腹腔投与して意識喪失を誘導し、意識喪失までかかる遅延時間（ＬＯＲＲ ｌａｔｅｎｃｙ）を測定した。また、本発明の一実施例によるオリゴヌクレオチド（ａ９１）投与から２１日経過後、実験動物の犠牲にさせた後、脳を摘出してＣａｖ３．１遺伝子発現程度を測定した。
【0121】
その結果、図１２Ｄで示すように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与群では、さらに活発な動きが観察され、意識喪失遅延時間の場合、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与群が、対照群に比べて、さらに長い時間を示した。
【0122】
これは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ｃａｖ３．１遺伝子の発現を特異的に抑制することにより、意識喪失状態の患者の意識回復を促進することができるということを意味するものであって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、既存に適切な治療剤が存在しなかった昏睡状態に置かれている患者の意識回復誘導剤として開発が可能な有望な物質であるということを示す結果である。
【0123】
実施例２１－２３：ＡＳＯ標的部位の確認
前記実施例及び実験例の結果から、本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的位置をさらに正確に特定しようとした。
前記実施例及び実験例の結果から、本発明者らは、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的位置をさらに正確に特定しようとした。
【0124】
このために、下記表４のように、ｃａｃｎａ１ｇゲノム遺伝子の位置を考慮して配列番号１内から選択され、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）近隣位置の標的配列を複数で定めた後（ａ４、ａ７、及びａ１１）、これらの安全性及びＣａｖ３．１発現抑制率を調査した。
【0125】
【表3】
【0126】
前記表３でゲノム上の位置は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＣ＿００００１７．１１ ＲＥＧＩＯＮ：５０５６０７１５．．５０６２７４７４に記載のｃａｃｎａ１ｇ遺伝子のゲノム核酸配列を基準としたものである。
【0127】
具体的に、本発明者らは、Ｐ０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスを各グループ当たり４～６頭ずつ分けた後、前記表３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（１ｍＭ）を頭脳の両側半球にそれぞれ２μｌずつ総４μｌ（２５μｇ）を脳室内（ＩＣＶ）注射で投与した後、７日経過後、生存率を測定し、生き残ったマウスの脳組織を摘出して、脳組織でのｃａｃｎａ１ｇ遺伝子の発現レベルを前述した実験例１に記載のｑＲＴ－ＰＣＲを用いて測定した（図１３Ａ）。
【0128】
その結果、図１３Ｂで示すように、本発明で新たに考案したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ４を除いては、対照群及び本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａ９１）と比較して類似しているか、優れた生存率を示して安全性が高いと確認された。
【0129】
また、Ｃａｖ３．１発現に及ぼす影響を調査した結果、図１３Ｃで示すように、新たに考案されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、ａ１１は、ａ９１よりは多少弱いが、有意なＣａｖ３．１ ｍＲＮＡ発現抑制能を示し、ａ４及びａ７の場合も、たとえ統計的に有意ではなかったが、Ｃａｖ３．１ ｍＲＮＡ発現を抑制する態様を示した。統計的に有意ではない原因は、各実験群別に一個体ずつ対照群に比べてむしろさらに高い遺伝子発現率を示すことによるものであって、これは、実験上のエラーによるものと判断され、実験頭数を増加させる場合、統計的に有意なレベルの遺伝子発現の減少を示すと判断される。
【0130】
以上の結果から確認されるように、本発明で選定したｃａｃｎａ１ｇゲノム遺伝子上の位置は、予想とは異なって、スプライシングされる前、ｍＲＮＡの３’末端に近い位置であって、イントロン３７及びエキソン３８を含む配列番号１内の位置であれば、如何なる部位を選択しても、Ｃａｖ３．１ ｍＲＮＡの発現を効率的に減少させて、α１Ｇ Ｔ型カルシウムチャネルと関連した神経疾患の治療に有用に使われるということが分かる。
【0131】
前述したように、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、他の同型体Ｔ型カルシウムチャネルの発現には影響を与えないながらも、α１Ｇサブユニットの発現を選択的に抑制するだけではなく、他の副作用なしにα１Ｇサブユニットと関連した疾患、特に、パーキンソン病の治療において、非常に驚くべき効果を示した。したがって、本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、パーキンソン病はもとより、うつ病、本態性振戦、てんかん、不安障害、意識不明など多様な退行性神経疾患などのＴ型カルシウムチャネルのα１Ｇサブユニットと関連した多様な疾患の治療剤として使用が可能である。
【0132】
本発明は、前述した実施例及び実験例を参考にして説明されたが、これは、例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これより多様な改変及び均等な他実施例が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲の技術的思想によって決定されねばならない。
【0133】
本発明の一実施例によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α１Ｇ Ｔ型カルシウムチャネルの発現を選択的に抑制することにより、パーキンソン病、うつ病、本態性振戦、てんかん、意識喪失などの神経精神疾患はもとより、意識不明状態の患者の意識回復のための医薬として使用が可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で示される核酸配列を標的とする、Ｃａｖ３．１をコードする遺伝子の発現抑制用アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
配列番号１で示される核酸配列とハイブリダイズ可能な核酸分子であって、１１～３０ｎｔの長さを有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
前記ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ核酸分子である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
配列番号２０または配列番号２１の核酸配列を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
ホスホジエステル（ＰＯ）骨格の一部または全部が、ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホン酸で置換されている、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
糖部分の２’－ＯＨの一部または全部が改変されている、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
糖部分の２’－ＯＨが、－Ｏ－ＣＨ３（－ＯＭｅ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＯＥｔ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３（－ＭＯＥ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ２、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ、－ＯＦまたは－Ｆで置換されている、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
糖部分に追加的な環が形成されたヌクレオチド類似体を少なくとも１つ以上含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
ヌクレオチド類似体がロック核酸（ＬＮＡ）である、請求項８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
ヌクレオチド類似体が、全ヌクレオチドのうち少なくとも３３％である、請求項８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項11】
ギャップマーである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項12】
ギャップマーが、両末端に３－７ｎｔの長さのＲＮＡユニットおよび前記ＲＮＡユニットの間に存在する８－１２ｎｔの長さのＤＮＡを含む核酸分子である、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項13】
ＲＮＡの一部または全部がＬＮＡである、請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項14】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、パーキンソン病治療用薬学的組成物。
【請求項15】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、うつ病治療用薬学的組成物。
【請求項16】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、本態性振戦治療用薬学的組成物。
【請求項17】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、てんかん治療用薬学的組成物。
【請求項18】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、不安障害治療用薬学的組成物。
【請求項19】
請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、意識不明状態回復用薬学的組成物。
【請求項20】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをパーキンソン病を病んでいる非ヒト哺乳動物個体に投与する段階を含む、前記個体のパーキンソン病の治療方法。
【請求項21】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをうつ病を病んでいる非ヒト哺乳動物個体に投与する段階を含む、前記個体のうつ病の治療方法。
【請求項22】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを本態性振戦を病んでいる非ヒト哺乳動物個体に投与する段階を含む、前記個体の本態性振戦の治療方法。
【請求項23】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをてんかんを病んでいる非ヒト哺乳動物個体に投与する段階を含む、前記個体のてんかんの治療方法。
【請求項24】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを不安障害を有した非ヒト哺乳動物個体に投与する段階を含む、前記個体の不安障害の治療方法。
【請求項25】
治療的に有効な量の請求項１から請求項１３のうち何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを意識不明状態の非ヒト哺乳動物個体に投与する段階を含む、前記個体の意識回復方法。
【国際調査報告】