特表 2024-531405 改変された肝臓ステージ核タンパク質（ＬＩＮＵＰ）を有する遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを取り込んだ組成物、および関連する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】改変された肝臓ステージ核タンパク質（ＬＩＮＵＰ）を有する遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを取り込んだ組成物、および関連する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/11 20060101AFI20240822BHJP

   A61K 39/015 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/30 20060101ALN20240822BHJP

【ＦＩ】

C12N1/11 ZNA

A61K39/015

A61P33/06

A61P37/04

C12N15/30

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024510422

(86)(22)【出願日】2022-08-19

(85)【翻訳文提出日】2024-04-16

(86)【国際出願番号】 US2022075238

(87)【国際公開番号】W WO2023023660

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】63/234,872

(32)【優先日】2021-08-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524062962

【氏名又は名称】シアトル チルドレンズ ホスピタル ディー／ビー／エー シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ゴスワミ， デバシュリー

(72)【発明者】

【氏名】カッペ， ステファン エイチ．アイ．

(72)【発明者】

【氏名】ヴォーン， アシュリー マイケル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065CA45

4C085AA03

4C085BA06

4C085EE01

(57)【要約】

本開示は、マラリアを引き起こす寄生生物、具体的には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の寄生生物、より具体的には、後期肝臓ステージまでのみ正常に発達するように遺伝子変更されているが、血液ステージまたは赤血球の感染への移行が完全に阻害される、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の寄生生物を対象とする。具体的には、本発明者らは、肝臓ステージ核タンパク質（ＬＩＮＵＰ）遺伝子の遺伝子機能の破壊により生じる、これらの寄生生物の発達の後期肝臓ステージでの停止をもたらす、遺伝子変更を特定した。この完全な後期肝臓ステージでの停止は、肝臓ステージ発達の間は寄生生物抗原アレイの増強された発現を可能にするが、血液ステージへの進入、赤血球感染、ならびに関連するマラリア疾患の徴候、症状、および病態を予防する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

肝臓ステージ核タンパク質をコードするＬＩＮＵＰ遺伝子を破壊し、それによって、野生型ＬＩＮＵＰ遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的機能を妨げるように遺伝子改変されている、生きたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項2】

哺乳動物中間宿主内で後期肝臓ステージにライフサイクル発達を停止させる、請求項１に記載の生きたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項3】

Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、またはＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉを含む、請求項２に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項4】

前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを含む、請求項３に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項5】

生物が、発達のスポロゾイトステージにある、請求項３に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項6】

遺伝子改変前の機能性ＬＩＮＵＰ遺伝子が、配列番号３５に対して少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有するＬＩＮＵＰである、請求項３に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項7】

遺伝子改変前の機能性ＬＩＮＵＰ遺伝子が、ＰＦ３Ｄ７＿１２４９７００、配列番号１に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有するＬＩＮＵＰポリペプチドをコードする、請求項３に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項8】

請求項５に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物と添加剤とを含むワクチン組成物であって、無菌で調製される、ワクチン組成物。

【請求項9】

前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物が、少なくとも１つの導入遺伝子を含む、請求項２に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項10】

前記導入遺伝子が、発達のスポロゾイトまたは肝臓ステージの間に前記導入遺伝子の転写をもたらすプロモーターの制御下にある、請求項９に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項11】

前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物が、１つまたは複数の追加の遺伝子機能を破壊するように遺伝子改変されており、それぞれの追加の遺伝子機能が、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物のライフサイクルの肝臓ステージから血液ステージへの移行に必要である、請求項２に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項12】

前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物が、ＰｌａｓＭｅｉ２遺伝子機能を破壊するように遺伝子改変されている、請求項１１に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項13】

前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物が、発達のスポロゾイトステージにある、請求項１２に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項14】

遺伝子改変前の機能性ＰｌａｓＭｅｉ２遺伝子が、配列番号３４に記載される核酸配列に対して、少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性である核酸配列を含む、請求項１２に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項15】

ＰｌａｓＭｅｉ２遺伝子によってコードされる機能性ＰｌａｓＭｅｉ２ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号３６に記載される配列に対して、少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性である、を含む、請求項１２に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項16】

請求項１３に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物と添加剤とを含むワクチン組成物であって、無菌で調製される、ワクチン組成物。

【請求項17】

ヒト対象において、１つまたは複数のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ抗原に対する免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、１つまたは複数の用量の請求項８または請求項１６に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。

【請求項18】

前記免疫応答が、後続の野生型Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍチャレンジによる感染を緩和または防御する、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ヒト対象において、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生生物によって引き起こされるマラリアに対する防御免疫を付与する方法であって、前記ヒト対象に、１つまたは複数の用量の請求項８または請求項１６に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物を投与するステップを含む、方法。

【請求項20】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される、請求項５に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【請求項21】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される、請求項１３に記載のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年８月１９日に出願された米国仮出願第６３／２３４，８７２号に基づく利益を主張する。

【0002】

配列表に関する記述
本出願に付随する配列表ＸＭＬは、ＸＭＬ形式で提供され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むＸＭＬファイルの名称は、３３９９－Ｐ３３ＷＯ．ｘｍｌである。ＸＭＬファイルは、３００ＫＢであり、２０２２年８月１９日に作成され、本明細書の出願とともにＰａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを通じて提出されている。

【0003】

政府のライセンスの権利に関する記述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより付与されたＲ０１ ＡＩ１２５７０６のもとに、政府の支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0004】

背景
本発明は、概して、マラリア、ならびに遺伝子変更されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の特定、作製、および使用に関する。より具体的には、本発明は、単一および／または複数の遺伝子座において破壊されており、それにもかかわらず発達の後期肝臓ステージへと進行することができるが、このステージで弱毒化された状態となり、血液ステージへと進行することができない、遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物に関する。

【0005】

マラリアは、ヒトの健康に重大な影響を及ぼし、毎年何十万人もが死亡し、マラリアが風土病である地域、特に、サハラ以下のアフリカ諸国において、社会的および経済的な発展の大きな妨げとなっている［１］。マラリアの原因となる物質であるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の寄生生物は、感染性の咬傷を介して、感染したＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊の唾液で脊椎動物宿主へと伝播される。伝播した後、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物、特に、ライフサイクルのスポロゾイトステージは、咬傷部位を出て、宿主の血流へと進入し、血流から肝臓へとすぐに移動する。スポロゾイトは、肝細胞に感染し、次いで、感染した肝細胞内で肝臓ステージの寄生生物として成長および複製し、初期肝臓ステージから後期肝臓ステージまで成熟し、数万個の血液ステージ感染性メロゾイトを産生し、これが、血流中に放出され、赤血球に感染する。ここで、それらはさらなる発達および複製を受け、その後で、赤血球の破裂を引き起こし、新しいメロゾイトの波が血液中へと放出される。新しいメロゾイトの大半は、さらなる赤血球に侵入することによって、複製サイクルの反復を継続する。この赤血球の感染および破裂の循環は、可能性としてマラリアに関連する重篤な症状、例えば、発熱、悪寒、衰弱、倦怠感、脾臓の肥大、および死亡を引き起こす。循環するメロゾイトのうちのごく少数は、赤血球に侵入した後、雄性または雌性のガメトサイトへと発達し、これが、別の蚊の咬傷を通じて吸血液に取り込まれるまで、身体内で循環し続ける。この蚊がＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ伝播に適合性である（すなわち、別のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊である）と仮定すると、ガメトサイトは、配偶子へ発達するように進行し、融合して二倍体接合子を形成する。接合子は、運動性オーキネート形態へと発達し、これが、蚊の中腸の壁部を貫通し、オーシストを形成する。それぞれのオーシストは、何回もの分裂を受けて、最終的に感染性スポロゾイトを産生し、これが、蚊の唾液腺に蓄積され、次いで、次の宿主へと注入され得、このようにしてライフサイクルが継続していく。

【0006】

Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染症の肝臓ステージは、この疾患について無症候性であり、症候性血液ステージ感染へと進行するため、マラリアの予防的介入の有望な標的である。実際に、ライフサイクルの肝臓ステージを標的とするワクチンは、多数の臨床試験において大きな可能性を示している。これを達成するために、ワクチンは、以下に概説される３つの異なるプロセスによって、発達の肝臓ステージで弱毒化されている。

【0007】

放射線により弱毒化されたワクチン：数十年前に、放射腺照射されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイト（「放射線により弱毒化されたスポロゾイト」またはＲＡＳ）が、実験用ワクチンとして使用した場合に、宿主特異的げっ歯動物およびヒトにおいて無菌（sterile）防御免疫を付与することができることが見出された［２、３］。天然のマラリア感染は、世界の風土病地域において無菌防御免疫を誘導することはないため、これは、驚くべきことであった。このアプローチは、放射線により弱毒化されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐｆ）全寄生生物ワクチンを産生するために使用されており、多数の臨床試験において高度に有効であることが証明されている。Ｓａｎａｒｉａ（登録商標）ＰｆＳＰＺワクチンは、これまでに、９ヶ国で１９の臨床試験において評価されており、極めて安全かつ十分に耐容され、有害事象率に生理食塩水対照との差がない［４～１２］。ＰｆＳＰＺワクチンは、制御されたヒトマラリア感染（ＣＨＭＩ）による同種チャレンジ（ワクチンおよびチャレンジで同じＰｆ株）に対して免疫付与後３～１１週間の時点で９０％を上回るワクチン有効性（ＶＥ）、異種（ワクチンおよびチャレンジで異なるＰｆ株）に対して免疫付与後９．５週間の時点（公開されていない）で８０％のＶＥ、異種に対して８ヶ月の時点で５４％の異種ＶＥを誘導しており［５、７、８］、アフリカにおける４つの実施試験では、強力な天然に伝播したＰｆマラリアに対して無菌ＶＥは少なくとも１８ヶ月間持続可能であり、強力に伝播したＰｆ感染に対するＶＥは、生存時間分析により、６ヶ月間は５２％、５１％、および４７％であり、２年目では５８％であった［９、１３］。放射線照射により弱毒化されたＰｆＳＰＺは、肝臓ステージ発達の間に、ＤＮＡ損傷を誘導し、ＤＮＡ複製を妨げる［２、１４、１５］。ＰｆＳＰＺは、およそ２日目～３日目に初期肝臓ステージの寄生生物へと発達するが、複製はしない。この肝臓ステージの間に産生されるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的免疫原は、主としてＣＤ８＋Ｔ細胞に起因して免疫性を誘起するが、しかしながら、無菌免疫性を生じるためには、比較的多い用量（９×１０^５～１．８×１０^６個のＰｆＳＰＺ）が必要である［４～９、１６、１７］。

【0008】

化学物質により弱毒化されたワクチン：抗マラリア薬のカバー下（化学物質による弱毒化）で投与される、（ｉ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍライフサイクルの肝臓ステージまたは（ｉｉ）最初の波の寄生生物に感染した赤血球を標的とする生きた非弱毒化全寄生生物に基づくワクチンは、臨床試験において優れた有効性を示している。近年の試験において［１８］、３回の用量の２×１０^５個のＰｆＳＰＺのＳａｎａｒｉａ（登録商標）ＰｆＳＰＺ－ＣＶａｃ（ＣＱ）は、最後のワクチン投薬後１２週間の時点において、異種ＣＨＭＩに対する１００％の防御をもたらした。しかしながら、化学物質による弱毒化が、Ｓａｎａｒｉａ（登録商標）ＰｆＳＰＺ ＣＶａｃワクチン－ＣＱのように血液ステージの抗マラリア薬クロロキン（ＣＱ）に依存している場合、ＰｆＳＰＺ非弱毒化全寄生生物の初回注射の７～８日後に、短い期間の一過的な寄生生物血症が存在し得、イブプロフェンを服用しなければ、最大でグレード３のマラリア症状をもたらし得る。加えて、パートナー薬が（なんらかの理由で）服用されなければ、重度のマラリアを発症する危険性が存在する。

【0009】

遺伝子的に弱毒化されたワクチン：遺伝子的に弱毒化された寄生生物（ＧＡＰ）は、完全な肝臓ステージ発達を妨げる特定の遺伝子の欠失によって作製される。ＧＡＰは、げっ歯動物マラリアモデルにおいて広範に研究されている。最初のＧＡＰは、感染力のあるスポロゾイト（ＵＩＳ）において、オーシストスポロゾイトと比較して上方調節されている遺伝子を欠失させることによって産生された［１９～２２］。そのような欠失は、スポロゾイトステージにあるときはＧＡＰの生存性に影響を及ぼさなかったが、発達の肝臓ステージの初期において、活性な肝臓ステージの複製が生じる前に、成長の停止をもたらした。そのようなＧＡＰは、「初期停止型複製欠損」（ＥＡＲＤ）と称される。これらのＧＡＰは、好ましい免疫原性特性を示しただけでなく、時には、不完全な弱毒化を示しており、肝臓ステージから血液ステージへのライフサイクルの進行（「ブレイクスルー」とも称される）を可能にし、活動性感染を引き起こした。１つの初期停止型ＧＡＰであるＳａｎａｒｉａ（登録商標）ＰｆＳＰＺ－ＧＡ１は、ＧＭＰを遵守して製造され、臨床試験において評価された。これは、いずれのブレイクスルー血液ステージ感染も示さなかったため、十分に耐容され、安全であり、完全に弱毒化されていることが示されたが、ＣＨＩＭに対して得られた有効性は低かった［２３］。

【0010】

より最近では、寄生生物ワクチン株の作製を目指し、肝臓内での成長、発達、および複製を受けるが、血液ステージへと進行する直前で発達を停止し、死滅する、次世代ＧＡＰが開発されている［例えば、２４～２７を参照されたい）。これらのＧＡＰは、ＬＡＲＣ（後期停止型複製適合）と称され、これらのＧＡＰは、肝臓における著しいワクチンバイオマス拡大をもたらし、さらに肝臓ライフサイクルへと移行し、したがって、より大きく広範な寄生生物抗原を免疫系に提示して続く免疫応答をより有効なものにするため、ＥＡＲＤ ＧＡＰまたはＲＡＳよりも強力な免疫原である。実際に、げっ歯動物マラリアモデルにおいて、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉのＬＡＲＣ ＧＡＰは、ＥＡＲＤ ＧＡＰおよびＲＡＳと比較して、スポロゾイトチャレンジからの優れた防御を提供することが示されている。［２８］さらに、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＡＲＣ ＧＡＰは、直接的な血液ステージチャレンジからステージを超えた防御も提供することが示されており、後期肝臓ステージＧＡＰにおける抗原の存在を示し、これは、血液ステージの形態の特徴でもある［２９］。しかしながら、公開されているＰ．ｙｏｅｌｉｉ ＧＡＰは、ヒト寄生性ホモログであるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍにおける遺伝子欠失に関する情報を提供しておらず、および／または完全な弱毒化も示していない［２６、３０］。したがって、完全な弱毒化を確実にするために遺伝子欠失のさらなる標的を特定する必要性が存在する。最終的には、マラリア臨床試験において完全に弱毒化されており、マラリアを予防するための安全かつ高度に有効なワクチンとして使用することができる、ヒトマラリアＬＡＲＣ ＧＡＰを作製することが、目標である。しかしながら、ヒトマラリアを引き起こす寄生生物、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍにおける、完全な弱毒化をもたらす欠失の追加の標的遺伝子の特定は、継続的な課題となっている。

【0011】

将来的な感染に対して脊椎動物免疫系を刺激するのに有用である弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を作製することに関する当該技術分野における進歩にもかかわらず、血液ステージ感染へのブレイクスルーを伴うことなく、完全な弱毒化、すなわち、後期肝臓ステージ発達でのライフサイクル進行の完全な停止を提供する、新規な特定の遺伝子に基づく改変または複数の遺伝子に基づく改変の新規な組合せを特定する必要性が残っている。これにより、後続の寄生生物感染に対するより完全な免疫性のためにより多くの様々な抗原を提供する肝臓ステージの寄生生物ワクチン免疫原の安全かつ長期的な開発が可能となるであろう。本開示は、これらおよび関連する必要性に対処する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】World Health O. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. Geneva: World Health Organization2020.

【非特許文献2】Nussenzweig RS, Vanderberg J, Most H, and Orton C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature 216: 160-162, 1967.

【非特許文献3】Clyde DF. Immunity to falciparum and vivax malaria induced by irradiated sporozoites: a review of the University of Maryland studies, 1971-75. Bull World Health Organ 68(Suppl): 9-12, 1990.

【非特許文献4】Epstein JE, Tewari K, Lyke KE, Sim BK, Billingsley PF, Laurens MB, Gunasekera A, Chakravarty S, James ER, Sedegah M, Richman A, Velmurugan S, Reyes S, Li M, Tucker K, Ahumada A, Ruben AJ, Li T, Stafford R, Eappen AG, Tamminga C, Bennett JW, Ockenhouse CF, Murphy JR, Komisar J, Thomas N, Loyevsky M, Birkett A, Plowe CV, Loucq C, Edelman R, Richie TL, Seder RA, and Hoffman SL. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+T cell immunity. Science 334: 475-480, 2011.

【非特許文献5】Seder RA, Chang LJ, Enama ME, Zephir KL, Sarwar UN, Gordon IJ, Holman LA, James ER, Billingsley PF, Gunasekera A, Richman A, Chakravarty S, Manoj A, Velmurugan S, Li M, Ruben AJ, Li T, Eappen AG, Stafford RE, Plummer SH, Hendel CS, Novik L, Costner PJ, Mendoza FH, Saunders JG, Nason MC, Richardson JH, Murphy J, Davidson SA, Richie TL, Sedegah M, Sutamihardja A, Fahle GA, Lyke KE, Laurens MB, Roederer M, Tewari K, Epstein JE, Sim BK, Ledgerwood JE, Graham BS, Hoffman SL, and for the VRC 312 Study Team. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science 341: 1359-1365, 2013.

【非特許文献6】Ishizuka AS, Lyke KE, DeZure A, Berry AA, Richie TL, Mendoza FH, Enama ME, Gordon IJ, Chang LJ, Sarwar UN, Zephir KL, Holman LA, James ER, Billingsley PF, Gunasekera A, Chakravarty S, Manoj A, Li M, Ruben AJ, Li T, Eappen AG, Stafford RE, K CN, Murshedkar T, DeCederfelt H, Plummer SH, Hendel CS, Novik L, Costner PJ, Saunders JG, Laurens MB, Plowe CV, Flynn B, Whalen WR, Todd JP, Noor J, Rao S, Sierra-Davidson K, Lynn GM, Epstein JE, Kemp MA, Fahle GA, Mikolajczak SA, Fishbaugher M, Sack BK, Kappe SH, Davidson SA, Garver LS, Bjorkstrom NK, Nason MC, Graham BS, Roederer M, Sim BK, Hoffman SL, Ledgerwood JE, and Seder RA. Protection against malaria at 1 year and immune correlates following PfSPZ vaccination. Nat Med 22: 614-623, 2016.

【非特許文献7】Epstein JE, Paolino KM, Richie TL, Sedegah M, Singer A, Ruben AJ, Chakravarty S, Stafford A, Ruck RC, Eappen AG, Li T, Billingsley PF, Manoj A, Silva JC, Moser K, Nielsen R, Tosh D, Cicatelli S, Ganeshan H, Case J, Padilla D, Davidson S, Garver L, Saverino E, Murshedkar T, Gunasekera A, Twomey PS, Reyes S, Moon JE, James ER, Kc N, Li M, Abot E, Belmonte A, Hauns K, Belmonte M, Huang J, Vasquez C, Remich S, Carrington M, Abebe Y, Tillman A, Hickey B, Regules J, Villasante E, Sim BK, and Hoffman SL. Protection against Plasmodium falciparum malaria by PfSPZ Vaccine. JCI Insight 2: e89154, 2017.

【非特許文献8】Lyke KE, Ishizuka AS, Berry AA, Chakravarty S, DeZure A, Enama ME, James ER, Billingsley PF, Gunasekera A, Manoj A, Li M, Ruben AJ, Li T, Eappen AG, Stafford RE, Kc N, Murshedkar T, Mendoza FH, Gordon IJ, Zephir KL, Holman LA, Plummer SH, Hendel CS, Novik L, Costner PJ, Saunders JG, Berkowitz NM, Flynn BJ, Nason MC, Garver LS, Laurens MB, Plowe CV, Richie TL, Graham BS, Roederer M, Sim BK, Ledgerwood JE, Hoffman SL, and Seder RA. Attenuated PfSPZ Vaccine induces strain-transcending T cells and durable protection against heterologous controlled human malaria infection. Proc Natl Acad Sci U S A 114: 2711-2716, 2017.

【非特許文献9】Sissoko MS, Healy SA, Katile A, Omaswa F, Zaidi I, Gabriel EE, Kamate B, Samake Y, Guindo MA, Dolo A, Niangaly A, Niare K, Zeguime A, Sissoko K, Diallo H, Thera I, Ding K, Fay MP, O'Connell EM, Nutman TB, Wong-Madden S, Murshedkar T, Ruben AJ, Li M, Abebe Y, Manoj A, Gunasekera A, Chakravarty S, Sim BK, Billingsley PF, James ER, Walther M, Richie TL, Hoffman SL, Doumbo O, and Duffy PE. Safety and efficacy of PfSPZ Vaccine against Plasmodium falciparum via direct venous inoculation in healthy malaria-exposed adults in Mali: a randomised, double-blind phase 1 trial. Lancet Infect Dis 17: 498-509, 2017.

【非特許文献10】Jongo SA, Shekalage SA, Church LWP, Ruben AJ, Schindler T, Zenklusen I, Rutishauser T, Rothen J, Tumbo A, Mkindi C, Mpina M, Mtoro AT, Ishizuka AS, Ramadhani KK, Milando FA, Qassim M, Juma OA, Mwakasungula S, Simon B, James ER, Abebe Y, K CN, Chakravarty S, Saverino E, Bakari BM, Billingsley PF, Seder RA, Daubenberger C, Sim BKL, Richie TL, Tanner M, Abdulla S, and Hoffman SL. Safety, Immunogenicity, and Protective Efficacy against Controlled Human Malaria Infection of Plasmodium falciparum Sporozoite Vaccine in Tanzanian Adults. Am J Trop Med Hyg 99: 338-349, 2018.

【非特許文献11】Olotu A, Urbano V, Hamad A, Eka M, Chemba M, Nyakarungu E, Raso J, Eburi E, Mandumbi DO, Hergott D, Maas CD, Ayekaba MO, Milang DN, Rivas MR, Schindler T, Embon OM, Ruben AJ, Saverino E, Abebe Y, Kc N, James ER, Murshedkar T, Manoj A, Chakravarty S, Li M, Adams M, Schwabe C, Segura L, Daubenberger C, Tanner M, Richie TL, Billingsley PF, Sim BKL, Abdulla S, and Hoffman SL. Advancing Global Health through Development and Clinical Trials Partnerships: A Randomized, Placebo-Controlled, Double-Blind Assessment of Safety, Tolerability, and Immunogenicity of Plasmodium falciparum Sporozoites Vaccine for Malaria in Healthy Equatoguinean Men. Am J Trop Med Hyg 98: 308-318, 2018.

【非特許文献12】Jongo SA, Church LWP, Mtoro AT, Chakravarty S, Ruben AJ, Swanson PA, Kassim KR, Mpina M, Tumbo AM, Milando FA, Qassim M, Juma OA, Bakari BM, Simon B, James ER, Abebe Y, Kc N, Saverino E, Gondwe L, Studer F, Fink M, Cosi G, El-Khorazaty J, Styers D, Seder RA, Schindler T, Billingsley PF, Daubenberger C, Sim BKL, Tanner M, Richie TL, Abdulla S, and Hoffman SL. Safety and Differential Antibody and T-Cell Responses to the Plasmodium falciparum Sporozoite Malaria Vaccine, PfSPZ Vaccine, by Age in Tanzanian Adults, Adolescents, Children, and Infants. Am J Trop Med Hyg 100: 1433-1444, 2019.

【非特許文献13】Sissoko MS, Healy SA, Katile A, Zaidi I, Hu Z, Kamate B, Samake Y, Sissoko K, Mwakingwe-Omari A, Lane J, Imeru A, Mohan R, Thera I, Guindo CO, Dolo A, Niare K, Koita F, Niangaly A, Rausch KM, Zeguime A, Guindo MA, Bah A, Abebe Y, James ER, Manoj A, Murshedkar T, Kc N, Sim BKL, Billingsley PF, Richie TL, Hoffman SL, Doumbo O, and Duffy PE. Safety and efficacy of a three-dose regimen of Plasmodium falciparum sporozoite vaccine in adults during an intense malaria transmission season in Mali: a randomised, controlled phase 1 trial. Lancet Infect Dis 22: 377-389, 2022.

【非特許文献14】Chattopadhyay R, Conteh S, Li M, James ER, Epstein JE, and Hoffman SL. The Effects of radiation on the safety and protective efficacy of an attenuated Plasmodium yoelii sporozoite malaria vaccine. Vaccine 27: 3675-3680, 2009.

【非特許文献15】Hoffman SL, Billingsley P, James E, Richman A, Loyevsky M, Li T, Charkravarty S, Gunasekera A, Chattopadhyay R, Li M, Stafford R, Ahumada A, Epstein JE, Sedegah M, Reyes S, Richie TL, Lyke KE, Edelman R, Laurens MB, Plowe CV, and Sim BKL. Development of a metabolically active,non-replicating sporozoite vaccine to prevent Plasmodium falciparum malaria. Human Vaccines 6: 97-106, 2010.

【非特許文献16】Hoffman SL, Goh LM, Luke TC, Schneider I, Le TP, Doolan DL, Sacci J, de la Vega P, Dowler M, Paul C, Gordon DM, Stoute JA, Church LW, Sedegah M, Heppner DG, Ballou WR, and Richie TL. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis 185: 1155-1164, 2002.

【非特許文献17】Richie TL, Billingsley PF, Sim BK, Epstein JE, Lyke KE, Mordmuller B, Alonso P, Duffy PE, Doumbo OK, Sauerwein RW, Tanner M, Abdulla S, Kremsner PG, Seder RA, and Hoffman SL. Progress with Plasmodium falciparum sporozoite (PfSPZ)-based malaria vaccines. Vaccine 33: 7452-7461, 2015.

【非特許文献18】Mwakingwe-Omari A, Healy SA, Lane J, Cook DM, Kalhori S, Wyatt C, Kolluri A, Marte-Salcedo O, Imeru A, Nason M, Ding LK, Decederfelt H, Duan J, Neal J, Raiten J, Lee G, Hume JCC, Jeon JE, Ikpeama I, Kc N, Chakravarty S, Murshedkar T, Church LWP, Manoj A, Gunasekera A, Anderson C, Murphy SC, March S, Bhatia SN, James ER, Billingsley PF, Sim BKL, Richie TL, Zaidi I, Hoffman SL, and Duffy PE. Two chemoattenuated PfSPZ malaria vaccines induce sterile hepatic immunity. Nature 595: 289-294, 2021.

【非特許文献19】Aly AS, Mikolajczak SA, Rivera HS, Camargo N, Jacobs-Lorena V, Labaied M, Coppens I, and Kappe SH. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Mol Microbiol 69: 152-163, 2008.

【非特許文献20】Labaied M, Harupa A, Dumpit RF, Coppens I, Mikolajczak SA, and Kappe SH. Plasmodium yoelii sporozoites with simultaneous deletion of P52 and P36 are completely attenuated and confer sterile immunity against infection. Infect Immun 75: 3758-3768, 2007.

【非特許文献21】Mueller AK, Camargo N, Kaiser K, Andorfer C, Frevert U, Matuschewski K, and Kappe SH. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 3022-3027, 2005.

【非特許文献22】Mueller AK, Labaied M, Kappe SH, and Matuschewski K. Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine. Nature 433: 164-167, 2005.

【非特許文献23】Roestenberg M, Walk J, van der Boor SC, Langenberg MCC, Hoogerwerf MA, Janse JJ, Manurung M, Yap XZ, Garcia AF, Koopman JPR, Meij P, Wessels E, Teelen K, van Waardenburg YM, van de Vegte-Bolmer M, van Gemert GJ, Visser LG, van der Ven A, de Mast Q, Natasha KC, Abebe Y, Murshedkar T, Billingsley PF, Richie TL, Sim BKL, Janse CJ, Hoffman SL, Khan SM, and Sauerwein RW. A double-blind, placebo-controlled phase 1/2a trial of the genetically attenuated malaria vaccine PfSPZ-GA1. Sci Transl Med 12: eaaz5629, 2020.

【非特許文献24】Dankwa DA, Davis MJ, Kappe SHI, and Vaughan AM. A Plasmodium yoelii Mei2-Like RNA Binding Protein Is Essential for Completion of Liver Stage Schizogony. Infect Immun 84: 1336-1345, 2016.

【非特許文献25】Goswami D, Betz W, Locham NK, Parthiban C, Brager C, Schaefer C, Camargo N, Nguyen T, Kennedy SY, Murphy SC, Vaughan AM, and Kappe SHI. A replication-competent late liver stage-attenuated human malaria parasite. JCI Insight 5: e135589, 2020.

【非特許文献26】Vaughan AM, Sack BK, Dankwa D, Minkah N, Nguyen T, Cardamone H, and Kappe SHI. A Plasmodium Parasite with Complete Late Liver Stage Arrest Protects against Preerythrocytic and Erythrocytic Stage Infection in Mice. Infect Immun 86: e00088-18, 2018.

【非特許文献27】Vaughan AM, Kappe SH, and Dankwa DA. Doubly attenuated late liver stage malaria parasites and related compositions and methods. U.S. Patent 10,905,753, issued February 2, 2021.

【非特許文献28】Butler NS, Schmidt NW, Vaughan AM, Aly AS, Kappe SH, and Harty JT. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe 9: 451-462, 2011.

【非特許文献29】Sack BK, Keitany GJ, Vaughan AM, Miller JL, Wang R, and Kappe SH. Mechanisms of stage-transcending protection following immunization of mice with late liver stage-arresting genetically attenuated malaria parasites. PLoS Pathog 11: e1004855, 2015.

【非特許文献30】van Schaijk BC, Ploemen IH, Annoura T, Vos MW, Foquet L, van Gemert GJ, Chevalley-Maurel S, van de Vegte-Bolmer M, Sajid M, Franetich JF, Lorthiois A, Leroux-Roels G, Meuleman P, Hermsen CC, Mazier D, Hoffman SL, Janse CJ, Khan SM, and Sauerwein RW. A genetically attenuated malaria vaccine candidate based on P. falciparum b9/slarp gene-deficient sporozoites. Elife: 3, 2014.

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

概要
本開示は、マラリアを引き起こす寄生生物、具体的には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生生物、より具体的には、発達の後期肝臓ステージへと正常に発達するように遺伝子変更されているが、肝臓ステージから血液ステージへの移行および後続の赤血球感染が阻止される、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生生物を対象とする。具体的には、本発明者らは、ＬＩＮＵＰ遺伝子産物の破壊をもたらす肝臓ステージ核タンパク質（Ｌｉｖｅｒ Ｓｔａｇｅ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＬＩＮＵＰ）遺伝子の欠失によって、これらの寄生生物が発達の後期肝臓ステージで弱毒化され、この後期肝臓ステージの停止を引き起こす、遺伝子変更を特定した。停止されたＬＩＮＵＰ突然変異体は、肝臓ステージ発達中に広範な寄生生物特異的抗原性アレイの発現を可能にするが、血液ステージへの進入、後続の赤血球感染、ならびに関連するマラリア疾患の兆候、症状、および病態に関して重度に弱毒化される。二重ノックアウトＬＡＲＣ２（ＬＩＮＵＰおよびＰｌａｓＭｅｉ２の両方の遺伝子機能が欠失している）を含め、ＬＩＮＵＰ破壊を含む遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生生物のファミリーは、マラリアワクチンおよび関連する治療薬における生きた免疫原として理想的である。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1A】図１Ａ～１Ｃ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ肝臓ステージ核タンパク質（ＬＩＮＵＰ）（ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００）は、肝臓ステージの寄生生物の核に局在化し、肝臓ステージ核タンパク質（ＬＩＮＵＰ）と称されることになる。 Ａ． Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰ（ＰＦ３Ｄ７＿１２４９７００）（配列番号１）ならびにそのシンテニーオルソログであるＰ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＵＰ（ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００）（配列番号２）およびＰ．ｖｉｖａｘ ＬＩＮＵＰ（ＰＶＰ０１＿１４６６８００）（配列番号３）との間のアミノ酸アライメントは、４０％のアミノ酸配列同一性および６０％の配列類似性を示す。コンセンサス配列（配列番号４）を参照されたく、配列同一性／類似性は、灰色で示される。予測および保存された核局在化配列（ＮＬＳ）は、下線で示し、アミノ酸１３２～１５６にまたがっている。

【図1B】図１Ａ～１Ｃ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ肝臓ステージ核タンパク質（ＬＩＮＵＰ）（ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００）は、肝臓ステージの寄生生物の核に局在化し、肝臓ステージ核タンパク質（ＬＩＮＵＰ）と称されることになる。 Ｂ． Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＵＰの局在化を可視化するために、ｍＣｈｅｒｒｙタグをＬＩＮＵＰのＣ末端に融合することによって、ｍＣｈｅｒｒｙエピトープタグ化寄生生物株Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＵＰ^{ｍＣｈｅｒｒｙ}を生成した。タグ化トランスジェニック寄生生物は、内因性ＬＩＮＵＰをタグ化コピーと置き換える。小胞体マーカーＢｉＰに対する抗体であるｍＣｈｅｒｒｙ抗体およびＤＮＡ株ＤＡＰＩを使用した、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＵＰ^{ｍＣｈｅｒｒｙ}に感染したマウス肝臓に対する免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）は、タンパク質が、２４時間の肝臓ステージ感染後に発現され、３６時間および４８時間の両方の時点で、後期肝臓ステージの核（シゾント）に局在化することを示す。スケールバーのサイズは、５μｍである。

【図1C】図１Ａ～１Ｃ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ肝臓ステージ核タンパク質（ＬＩＮＵＰ）（ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００）は、肝臓ステージの寄生生物の核に局在化し、肝臓ステージ核タンパク質（ＬＩＮＵＰ）と称されることになる。 Ｃ． ４８時間の時点で、ＬＩＮＵＰは、ヒストンＨ３マーカーのアセチル化リシン９およびＤＡＰＩとの部分的な共局在化を示し、スケールバーは５μｍであり、これは、スケールバーのサイズが２μｍである右の拡大画像においてさらに示される。

【0015】

【図2A】図２Ａ～２Ｅ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＮＵＰ遺伝子欠失寄生生物（ｌｉｎｕｐ^－）の作製、および蚊のステージ発達の分析。 Ａ． 概略図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－寄生生物の生成を示す。 Ｂ． 血液ステージ成長を、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＸＮＬ野生型ならびにＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－クローンｃ３およびｃ５について、５匹のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群において比較した。１００万個の感染した赤血球を、それぞれのマウスに静脈内注射し、寄生生物血症を、１日おきに１０日間測定した。成長速度は同程度であり、ＬＩＮＵＰが、血液ステージ複製において重要な役割を有さないことが示唆された。データは、平均±ＳＥＭとして表し、ｎ＝５個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－クローンｃ３およびｃ５は、 Ｃ． オーシスト／中腸、 Ｄ． オーシストの存在度、およびＥ；唾液腺スポロゾイト／蚊の計数が、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ ｃ３（濃い灰色）およびｃ５（薄い灰色）ならびにＰ．ｙｏｅｌｉｉ野生型（黒色）の間で同程度であったため、蚊の感染に欠損を有さなかった。データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。 Ｅ． 唾液腺スポロゾイト／蚊は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ ｃ３（濃い灰色）およびｃ５（薄い灰色）と、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型（黒色）との間で同程度であった。 データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。

【図2B】図２Ａ～２Ｅ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＮＵＰ遺伝子欠失寄生生物（ｌｉｎｕｐ^－）の作製、および蚊のステージ発達の分析。 Ａ． 概略図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－寄生生物の生成を示す。 Ｂ． 血液ステージ成長を、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＸＮＬ野生型ならびにＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－クローンｃ３およびｃ５について、５匹のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群において比較した。１００万個の感染した赤血球を、それぞれのマウスに静脈内注射し、寄生生物血症を、１日おきに１０日間測定した。成長速度は同程度であり、ＬＩＮＵＰが、血液ステージ複製において重要な役割を有さないことが示唆された。データは、平均±ＳＥＭとして表し、ｎ＝５個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－クローンｃ３およびｃ５は、 Ｃ． オーシスト／中腸、 Ｄ． オーシストの存在度、およびＥ；唾液腺スポロゾイト／蚊の計数が、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ ｃ３（濃い灰色）およびｃ５（薄い灰色）ならびにＰ．ｙｏｅｌｉｉ野生型（黒色）の間で同程度であったため、蚊の感染に欠損を有さなかった。データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。 Ｅ． 唾液腺スポロゾイト／蚊は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ ｃ３（濃い灰色）およびｃ５（薄い灰色）と、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型（黒色）との間で同程度であった。 データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。

【図2C】図２Ａ～２Ｅ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＮＵＰ遺伝子欠失寄生生物（ｌｉｎｕｐ^－）の作製、および蚊のステージ発達の分析。 Ａ． 概略図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－寄生生物の生成を示す。 Ｂ． 血液ステージ成長を、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＸＮＬ野生型ならびにＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－クローンｃ３およびｃ５について、５匹のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群において比較した。１００万個の感染した赤血球を、それぞれのマウスに静脈内注射し、寄生生物血症を、１日おきに１０日間測定した。成長速度は同程度であり、ＬＩＮＵＰが、血液ステージ複製において重要な役割を有さないことが示唆された。データは、平均±ＳＥＭとして表し、ｎ＝５個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－クローンｃ３およびｃ５は、 Ｃ． オーシスト／中腸、 Ｄ． オーシストの存在度、およびＥ；唾液腺スポロゾイト／蚊の計数が、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ ｃ３（濃い灰色）およびｃ５（薄い灰色）ならびにＰ．ｙｏｅｌｉｉ野生型（黒色）の間で同程度であったため、蚊の感染に欠損を有さなかった。データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。 Ｅ． 唾液腺スポロゾイト／蚊は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ ｃ３（濃い灰色）およびｃ５（薄い灰色）と、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型（黒色）との間で同程度であった。 データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。

【図2D】図２Ａ～２Ｅ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＮＵＰ遺伝子欠失寄生生物（ｌｉｎｕｐ^－）の作製、および蚊のステージ発達の分析。 Ａ． 概略図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－寄生生物の生成を示す。 Ｂ． 血液ステージ成長を、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＸＮＬ野生型ならびにＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－クローンｃ３およびｃ５について、５匹のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群において比較した。１００万個の感染した赤血球を、それぞれのマウスに静脈内注射し、寄生生物血症を、１日おきに１０日間測定した。成長速度は同程度であり、ＬＩＮＵＰが、血液ステージ複製において重要な役割を有さないことが示唆された。データは、平均±ＳＥＭとして表し、ｎ＝５個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－クローンｃ３およびｃ５は、 Ｃ． オーシスト／中腸、 Ｄ． オーシストの存在度、およびＥ；唾液腺スポロゾイト／蚊の計数が、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ ｃ３（濃い灰色）およびｃ５（薄い灰色）ならびにＰ．ｙｏｅｌｉｉ野生型（黒色）の間で同程度であったため、蚊の感染に欠損を有さなかった。データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。 Ｅ． 唾液腺スポロゾイト／蚊は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ ｃ３（濃い灰色）およびｃ５（薄い灰色）と、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型（黒色）との間で同程度であった。 データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。

【図2E】図２Ａ～２Ｅ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＮＵＰ遺伝子欠失寄生生物（ｌｉｎｕｐ^－）の作製、および蚊のステージ発達の分析。 Ａ． 概略図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－寄生生物の生成を示す。 Ｂ． 血液ステージ成長を、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＸＮＬ野生型ならびにＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－クローンｃ３およびｃ５について、５匹のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群において比較した。１００万個の感染した赤血球を、それぞれのマウスに静脈内注射し、寄生生物血症を、１日おきに１０日間測定した。成長速度は同程度であり、ＬＩＮＵＰが、血液ステージ複製において重要な役割を有さないことが示唆された。データは、平均±ＳＥＭとして表し、ｎ＝５個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－クローンｃ３およびｃ５は、 Ｃ． オーシスト／中腸、 Ｄ． オーシストの存在度、およびＥ；唾液腺スポロゾイト／蚊の計数が、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ ｃ３（濃い灰色）およびｃ５（薄い灰色）ならびにＰ．ｙｏｅｌｉｉ野生型（黒色）の間で同程度であったため、蚊の感染に欠損を有さなかった。データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。 Ｅ． 唾液腺スポロゾイト／蚊は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ ｃ３（濃い灰色）およびｃ５（薄い灰色）と、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型（黒色）との間で同程度であった。 データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。

【0016】

【図3A】図３Ａ～３Ｄ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージ発達の分析。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型またはＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－のいずれかの２５０，０００個のスポロゾイトを感染させたＢＡＬＢ／ｃＪマウスから、感染の２４時間後、３６時間後、および４８時間後に組織切片を調製し、ＩＦＡによって分析した。 （Ａ）． ２４時間、３６時間、および４８時間の時点におけるＰ．ｙｏｅｌｉｉ野生型とＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－との間の肝臓ステージの寄生生物のサイズの比較（寄生生物の最も大きな外周での面積に基づく）は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型の肝臓ステージシゾントが、３６時間および４８時間の時点で、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－よりも有意に大きいことを示す。データは、平均±ＳＤとして表す。それぞれのデータポイントは、それぞれの時点について少なくとも２０個の寄生生物の平均サイズを指す。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。＊＝Ｐ．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、Ｐ＞０．０５は有意差なしと解釈する。肝臓ステージ発達を、 （Ｂ）． 寄生生物ミトコンドリア（ｍＨＳＰ７０）およびアピコプラスト（ＡＣＰ）、 （Ｃ）． 寄生生物形質膜および成熟赤血球外メロゾイトマーカーＭＳＰ１、ならびに （Ｄ）． 内膜複合体タンパク質および成熟赤血球外メロゾイトマーカーｍＴＩＰに対する抗体を使用して、４８時間の時点で比較した。ＤＮＡは、ＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１０μｍ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージ寄生生物は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型と比較して小さく、ミトコンドリアおよびアピコプラストオルガネラの少ない分岐を示す。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－は、後期肝臓ステージタンパク質ＭＳＰ１およびｍＴＩＰを発現するが、しかしながら、サイトメア（cytomere）の異常な分離および成熟赤血球外メロゾイトの不完全な形成がある。

【図3B】図３Ａ～３Ｄ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージ発達の分析。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型またはＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－のいずれかの２５０，０００個のスポロゾイトを感染させたＢＡＬＢ／ｃＪマウスから、感染の２４時間後、３６時間後、および４８時間後に組織切片を調製し、ＩＦＡによって分析した。 （Ａ）． ２４時間、３６時間、および４８時間の時点におけるＰ．ｙｏｅｌｉｉ野生型とＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－との間の肝臓ステージの寄生生物のサイズの比較（寄生生物の最も大きな外周での面積に基づく）は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型の肝臓ステージシゾントが、３６時間および４８時間の時点で、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－よりも有意に大きいことを示す。データは、平均±ＳＤとして表す。それぞれのデータポイントは、それぞれの時点について少なくとも２０個の寄生生物の平均サイズを指す。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。＊＝Ｐ．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、Ｐ＞０．０５は有意差なしと解釈する。肝臓ステージ発達を、 （Ｂ）． 寄生生物ミトコンドリア（ｍＨＳＰ７０）およびアピコプラスト（ＡＣＰ）、 （Ｃ）． 寄生生物形質膜および成熟赤血球外メロゾイトマーカーＭＳＰ１、ならびに （Ｄ）． 内膜複合体タンパク質および成熟赤血球外メロゾイトマーカーｍＴＩＰに対する抗体を使用して、４８時間の時点で比較した。ＤＮＡは、ＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１０μｍ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージ寄生生物は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型と比較して小さく、ミトコンドリアおよびアピコプラストオルガネラの少ない分岐を示す。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－は、後期肝臓ステージタンパク質ＭＳＰ１およびｍＴＩＰを発現するが、しかしながら、サイトメア（cytomere）の異常な分離および成熟赤血球外メロゾイトの不完全な形成がある。

【図3C】図３Ａ～３Ｄ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージ発達の分析。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型またはＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－のいずれかの２５０，０００個のスポロゾイトを感染させたＢＡＬＢ／ｃＪマウスから、感染の２４時間後、３６時間後、および４８時間後に組織切片を調製し、ＩＦＡによって分析した。 （Ａ）． ２４時間、３６時間、および４８時間の時点におけるＰ．ｙｏｅｌｉｉ野生型とＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－との間の肝臓ステージの寄生生物のサイズの比較（寄生生物の最も大きな外周での面積に基づく）は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型の肝臓ステージシゾントが、３６時間および４８時間の時点で、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－よりも有意に大きいことを示す。データは、平均±ＳＤとして表す。それぞれのデータポイントは、それぞれの時点について少なくとも２０個の寄生生物の平均サイズを指す。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。＊＝Ｐ．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、Ｐ＞０．０５は有意差なしと解釈する。肝臓ステージ発達を、 （Ｂ）． 寄生生物ミトコンドリア（ｍＨＳＰ７０）およびアピコプラスト（ＡＣＰ）、 （Ｃ）． 寄生生物形質膜および成熟赤血球外メロゾイトマーカーＭＳＰ１、ならびに （Ｄ）． 内膜複合体タンパク質および成熟赤血球外メロゾイトマーカーｍＴＩＰに対する抗体を使用して、４８時間の時点で比較した。ＤＮＡは、ＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１０μｍ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージ寄生生物は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型と比較して小さく、ミトコンドリアおよびアピコプラストオルガネラの少ない分岐を示す。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－は、後期肝臓ステージタンパク質ＭＳＰ１およびｍＴＩＰを発現するが、しかしながら、サイトメア（cytomere）の異常な分離および成熟赤血球外メロゾイトの不完全な形成がある。

【図3D】図３Ａ～３Ｄ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージ発達の分析。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型またはＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－のいずれかの２５０，０００個のスポロゾイトを感染させたＢＡＬＢ／ｃＪマウスから、感染の２４時間後、３６時間後、および４８時間後に組織切片を調製し、ＩＦＡによって分析した。 （Ａ）． ２４時間、３６時間、および４８時間の時点におけるＰ．ｙｏｅｌｉｉ野生型とＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－との間の肝臓ステージの寄生生物のサイズの比較（寄生生物の最も大きな外周での面積に基づく）は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型の肝臓ステージシゾントが、３６時間および４８時間の時点で、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－よりも有意に大きいことを示す。データは、平均±ＳＤとして表す。それぞれのデータポイントは、それぞれの時点について少なくとも２０個の寄生生物の平均サイズを指す。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。＊＝Ｐ．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、Ｐ＞０．０５は有意差なしと解釈する。肝臓ステージ発達を、 （Ｂ）． 寄生生物ミトコンドリア（ｍＨＳＰ７０）およびアピコプラスト（ＡＣＰ）、 （Ｃ）． 寄生生物形質膜および成熟赤血球外メロゾイトマーカーＭＳＰ１、ならびに （Ｄ）． 内膜複合体タンパク質および成熟赤血球外メロゾイトマーカーｍＴＩＰに対する抗体を使用して、４８時間の時点で比較した。ＤＮＡは、ＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１０μｍ。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージ寄生生物は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型と比較して小さく、ミトコンドリアおよびアピコプラストオルガネラの少ない分岐を示す。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－は、後期肝臓ステージタンパク質ＭＳＰ１およびｍＴＩＰを発現するが、しかしながら、サイトメア（cytomere）の異常な分離および成熟赤血球外メロゾイトの不完全な形成がある。

【0017】

【図4A】図４Ａ～４Ｅ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の作製および蚊のステージ発達の分析。 Ａ． 概略図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－ノックアウト寄生生物の生成を示す。遺伝子欠失を検証するために使用したプライマーが示されており、ＰＣＲアンプリコンのサイズは、キロ塩基で示す。 Ｂ． アガロースゲル電気泳動は、クローンＢ１およびＢ４におけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの遺伝子欠失に対応するＰＣＲ産物を示す。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－は、 Ｃ． オーシスト／中腸、 Ｄ． オーシスト存在度、および Ｅ． 唾液腺スポロゾイト／蚊の計数が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－クローンＢ１（濃い灰色）およびＢ４（薄い灰色）ならびにＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４（黒色）の間で同程度であったため、蚊の感染度における欠損を有さなかった。データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝２個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。

【図4B】図４Ａ～４Ｅ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の作製および蚊のステージ発達の分析。 Ａ． 概略図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－ノックアウト寄生生物の生成を示す。遺伝子欠失を検証するために使用したプライマーが示されており、ＰＣＲアンプリコンのサイズは、キロ塩基で示す。 Ｂ． アガロースゲル電気泳動は、クローンＢ１およびＢ４におけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの遺伝子欠失に対応するＰＣＲ産物を示す。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－は、 Ｃ． オーシスト／中腸、 Ｄ． オーシスト存在度、および Ｅ． 唾液腺スポロゾイト／蚊の計数が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－クローンＢ１（濃い灰色）およびＢ４（薄い灰色）ならびにＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４（黒色）の間で同程度であったため、蚊の感染度における欠損を有さなかった。データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝２個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。

【図4C-E】図４Ａ～４Ｅ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の作製および蚊のステージ発達の分析。 Ａ． 概略図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－ノックアウト寄生生物の生成を示す。遺伝子欠失を検証するために使用したプライマーが示されており、ＰＣＲアンプリコンのサイズは、キロ塩基で示す。 Ｂ． アガロースゲル電気泳動は、クローンＢ１およびＢ４におけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの遺伝子欠失に対応するＰＣＲ産物を示す。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－は、 Ｃ． オーシスト／中腸、 Ｄ． オーシスト存在度、および Ｅ． 唾液腺スポロゾイト／蚊の計数が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－クローンＢ１（濃い灰色）およびＢ４（薄い灰色）ならびにＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４（黒色）の間で同程度であったため、蚊の感染度における欠損を有さなかった。データは、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝２個の生物学的複製物である。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。Ｐ＞０．０５は、有意差なしと解釈する。

【0018】

【図5A】図５Ａ～５Ｂ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージは、異常な成長および異常な後期肝臓ステージ発達を示す。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の１００万個のスポロゾイトを感染させたＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスから、スポロゾイト感染後５日目および７日目に組織切片を調製し、サイズおよびタンパク質発現について分析した。Ａ． スポロゾイト感染後５日目および７日目における肝臓ステージ寄生生物のサイズの、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４とＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－との間での比較（寄生生物の最も大きな外周での面積に基づく）。５日目に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４とＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージシゾントとの間で成長の欠損は見られなかったが、７日目には、後期肝臓ステージシゾントのサイズに、統計学的に有意な差があった。データは、平均±ＳＤとして表す。それぞれのデータポイントは、それぞれの時点について少なくとも３０～５０個の寄生生物の平均サイズを指す。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、Ｐ＞０．０５は有意差なしと解釈する。 Ｂ． ＩＦＡは、感染から７日間の時点で、野生型ＮＦ５４寄生体胞膜タンパク質ＥＸＰ１が、予測された通り、野生型における外周染色パターンを有することを示す。比較すると、肝臓ステージの７日目における成熟Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－におけるＥＸＰ１発現は、一様ではなく、異常である。

【図5B】図５Ａ～５Ｂ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージは、異常な成長および異常な後期肝臓ステージ発達を示す。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の１００万個のスポロゾイトを感染させたＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスから、スポロゾイト感染後５日目および７日目に組織切片を調製し、サイズおよびタンパク質発現について分析した。Ａ． スポロゾイト感染後５日目および７日目における肝臓ステージ寄生生物のサイズの、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４とＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－との間での比較（寄生生物の最も大きな外周での面積に基づく）。５日目に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４とＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージシゾントとの間で成長の欠損は見られなかったが、７日目には、後期肝臓ステージシゾントのサイズに、統計学的に有意な差があった。データは、平均±ＳＤとして表す。それぞれのデータポイントは、それぞれの時点について少なくとも３０～５０個の寄生生物の平均サイズを指す。統計学的分析は、テューキーの多重比較検定を使用し、二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、Ｐ＞０．０５は有意差なしと解釈する。 Ｂ． ＩＦＡは、感染から７日間の時点で、野生型ＮＦ５４寄生体胞膜タンパク質ＥＸＰ１が、予測された通り、野生型における外周染色パターンを有することを示す。比較すると、肝臓ステージの７日目における成熟Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－におけるＥＸＰ１発現は、一様ではなく、異常である。

【0019】

【図6A】図６Ａ～６Ｃ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－は、感染したＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐヒト化マウスにおいて、肝臓ステージ発達および血液ステージへの移行の重度の弱毒化を示す。 Ａ． 概略図は、ＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスにおける肝臓ステージから血液ステージへの移行実験の実験デザインを示す。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－に由来する１００万個のスポロゾイトを、それぞれ、１匹および３匹のＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスに注射する。示されるように、マウスにヒト赤血球を再増殖させた。すべてのマウスを、７日目に安楽死させ、５０μｌの血液試料を、１８Ｓ ｒＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ試料採取に基づいて寄生生物負荷量のためにすべてのマウスから採取した。残りの血液を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養へと移し、７日間培養液で成長させた。さらに５０μｌの血液試料を、寄生生物１８Ｓ ｒＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ試料の分析のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養への移行後７日間の時点で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養試料から採取した（スポロゾイト感染の１４日目）。 Ｂ． １８Ｓ ｒＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲによる寄生生物負荷量の分析を、予測される肝臓ステージ発達および肝臓ステージから血液ステージへの移行の完了後７日目に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－ Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを感染させたマウスの血液から抽出したＲＮＡに行った（７日目、黒色のバー）。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを感染させた３匹のマウスのうちの１匹は血液において血液ステージを示さなかったが、他の２匹の感染マウスは野生型と比較して寄生生物ＲＮＡ負荷量に１０，０００倍の低減を有したため、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の血液ステージへの移行には重度の欠損が存在していた。血液を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に移し、寄生生物負荷量を、さらに７日間の後に測定した（１４日目、灰色のバー）。野生型ＮＦ５４血液ステージは、培養物において７日間の間に複製されたが、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の血液ステージについては有意な複製は見られなかった。これは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の肝臓ステージから血液ステージへの移行が、血液ステージ複製を開始させることができる生存性血液ステージ寄生生物を放出しなかったことを示す。 Ｃ． １８Ｓ ｒＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲによる寄生生物肝臓負荷量の分析を、感染後７日目に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－に感染させた肝臓から抽出したＲＮＡに行い、抽出した肝臓ＲＮＡ１μｇ当たりのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｒＲＮＡのコピー数として示す。寄生生物肝臓量は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４とＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－との間で同程度である。

【図6B-C】図６Ａ～６Ｃ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－は、感染したＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐヒト化マウスにおいて、肝臓ステージ発達および血液ステージへの移行の重度の弱毒化を示す。 Ａ． 概略図は、ＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスにおける肝臓ステージから血液ステージへの移行実験の実験デザインを示す。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－に由来する１００万個のスポロゾイトを、それぞれ、１匹および３匹のＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスに注射する。示されるように、マウスにヒト赤血球を再増殖させた。すべてのマウスを、７日目に安楽死させ、５０μｌの血液試料を、１８Ｓ ｒＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ試料採取に基づいて寄生生物負荷量のためにすべてのマウスから採取した。残りの血液を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養へと移し、７日間培養液で成長させた。さらに５０μｌの血液試料を、寄生生物１８Ｓ ｒＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ試料の分析のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養への移行後７日間の時点で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養試料から採取した（スポロゾイト感染の１４日目）。 Ｂ． １８Ｓ ｒＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲによる寄生生物負荷量の分析を、予測される肝臓ステージ発達および肝臓ステージから血液ステージへの移行の完了後７日目に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－ Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを感染させたマウスの血液から抽出したＲＮＡに行った（７日目、黒色のバー）。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを感染させた３匹のマウスのうちの１匹は血液において血液ステージを示さなかったが、他の２匹の感染マウスは野生型と比較して寄生生物ＲＮＡ負荷量に１０，０００倍の低減を有したため、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の血液ステージへの移行には重度の欠損が存在していた。血液を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に移し、寄生生物負荷量を、さらに７日間の後に測定した（１４日目、灰色のバー）。野生型ＮＦ５４血液ステージは、培養物において７日間の間に複製されたが、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の血液ステージについては有意な複製は見られなかった。これは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の肝臓ステージから血液ステージへの移行が、血液ステージ複製を開始させることができる生存性血液ステージ寄生生物を放出しなかったことを示す。 Ｃ． １８Ｓ ｒＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲによる寄生生物肝臓負荷量の分析を、感染後７日目に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－に感染させた肝臓から抽出したＲＮＡに行い、抽出した肝臓ＲＮＡ１μｇ当たりのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｒＲＮＡのコピー数として示す。寄生生物肝臓量は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４とＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－との間で同程度である。

【0020】

【図7A-1】図７Ａ～７Ｄ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２／ｌｉｎｕｐ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２）の生成。 Ａ． 図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２寄生生物の生成を示す。組換え寄生生物を、限界希釈によってクローニングした。図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子変編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ寄生生物の生成を示す。（Ａ）からのマーカーを含まないＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２クローンＦ３を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰ ＫＯプラスミドのトランスフェクションに使用した。組換え寄生生物を、限界希釈によってクローニングして、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２／ｌｉｎｕｐ二重ノックアウト（ＬＡＲＣ２）クローンを生成した。遺伝子欠失を検証するために使用したプライマーが示されている。使用したプライマーの組合せおよびＰＣＲ産物のサイズを、表２に示す。４つのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローン － Ｃ１２、Ｆ７、Ｂ７、およびＢ５における、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２の欠如、 Ｂ． Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの欠如 Ｃ． およびプラスミドＤＮＡの欠如 Ｄ． のアガロースゲル電気泳動。

【図7A-2】図７Ａ～７Ｄ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２／ｌｉｎｕｐ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２）の生成。 Ａ． 図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２寄生生物の生成を示す。組換え寄生生物を、限界希釈によってクローニングした。図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子変編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ寄生生物の生成を示す。（Ａ）からのマーカーを含まないＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２クローンＦ３を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰ ＫＯプラスミドのトランスフェクションに使用した。組換え寄生生物を、限界希釈によってクローニングして、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２／ｌｉｎｕｐ二重ノックアウト（ＬＡＲＣ２）クローンを生成した。遺伝子欠失を検証するために使用したプライマーが示されている。使用したプライマーの組合せおよびＰＣＲ産物のサイズを、表２に示す。４つのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローン － Ｃ１２、Ｆ７、Ｂ７、およびＢ５における、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２の欠如、 Ｂ． Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの欠如 Ｃ． およびプラスミドＤＮＡの欠如 Ｄ． のアガロースゲル電気泳動。

【図7B】図７Ａ～７Ｄ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２／ｌｉｎｕｐ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２）の生成。 Ａ． 図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２寄生生物の生成を示す。組換え寄生生物を、限界希釈によってクローニングした。図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子変編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ寄生生物の生成を示す。（Ａ）からのマーカーを含まないＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２クローンＦ３を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰ ＫＯプラスミドのトランスフェクションに使用した。組換え寄生生物を、限界希釈によってクローニングして、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２／ｌｉｎｕｐ二重ノックアウト（ＬＡＲＣ２）クローンを生成した。遺伝子欠失を検証するために使用したプライマーが示されている。使用したプライマーの組合せおよびＰＣＲ産物のサイズを、表２に示す。４つのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローン － Ｃ１２、Ｆ７、Ｂ７、およびＢ５における、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２の欠如、 Ｂ． Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの欠如 Ｃ． およびプラスミドＤＮＡの欠如 Ｄ． のアガロースゲル電気泳動。

【図7C】図７Ａ～７Ｄ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２／ｌｉｎｕｐ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２）の生成。 Ａ． 図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２寄生生物の生成を示す。組換え寄生生物を、限界希釈によってクローニングした。図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子変編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ寄生生物の生成を示す。（Ａ）からのマーカーを含まないＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２クローンＦ３を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰ ＫＯプラスミドのトランスフェクションに使用した。組換え寄生生物を、限界希釈によってクローニングして、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２／ｌｉｎｕｐ二重ノックアウト（ＬＡＲＣ２）クローンを生成した。遺伝子欠失を検証するために使用したプライマーが示されている。使用したプライマーの組合せおよびＰＣＲ産物のサイズを、表２に示す。４つのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローン － Ｃ１２、Ｆ７、Ｂ７、およびＢ５における、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２の欠如、 Ｂ． Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの欠如 Ｃ． およびプラスミドＤＮＡの欠如 Ｄ． のアガロースゲル電気泳動。

【図7D】図７Ａ～７Ｄ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２／ｌｉｎｕｐ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２）の生成。 Ａ． 図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２寄生生物の生成を示す。組換え寄生生物を、限界希釈によってクローニングした。図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される遺伝子変編集を使用したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ寄生生物の生成を示す。（Ａ）からのマーカーを含まないＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２クローンＦ３を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰ ＫＯプラスミドのトランスフェクションに使用した。組換え寄生生物を、限界希釈によってクローニングして、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｌａｓｍｅｉ２／ｌｉｎｕｐ二重ノックアウト（ＬＡＲＣ２）クローンを生成した。遺伝子欠失を検証するために使用したプライマーが示されている。使用したプライマーの組合せおよびＰＣＲ産物のサイズを、表２に示す。４つのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローン － Ｃ１２、Ｆ７、Ｂ７、およびＢ５における、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２の欠如、 Ｂ． Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの欠如 Ｃ． およびプラスミドＤＮＡの欠如 Ｄ． のアガロースゲル電気泳動。

【0021】

【図8A】図８Ａおよび８Ｂ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローンにおけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの欠如。８個のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローンを、全ゲノムシーケンシングによって分析して、 Ａ． 第６染色体におけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２の欠失、および Ｂ． 第１２染色体におけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの欠失を確認した。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローンＢ７、Ｃ１２、Ｄ５、およびＦ７は、さらなる表現型分析に使用されることになる。

【図8B】図８Ａおよび８Ｂ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローンにおけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの欠如。８個のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローンを、全ゲノムシーケンシングによって分析して、 Ａ． 第６染色体におけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＰｌａｓＭｅｉ２の欠失、および Ｂ． 第１２染色体におけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＩＮＵＰの欠失を確認した。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローンＢ７、Ｃ１２、Ｄ５、およびＦ７は、さらなる表現型分析に使用されることになる。

【0022】

【図9A-B】図９Ａ～９Ｄ。Ａ． ４つのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２ＫＯクローンＢ７、Ｃ１２、Ｄ５、およびＦ７の設定後１５日目に、鞭毛放出中心を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２の成熟ガメトサイト培養物において計数し、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４と同程度であることが見出された。これらのガメトサイト培養物を、標準的な膜吸血アッセイにおいて雌性Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊に吸血させ、吸血後８日目に、中腸を解剖した。 Ｂ． オーシスト存在度、 Ｃ． オーシスト／蚊の計数は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２ＫＯクローンＦ７およびＢ７について、野生型と同程度であった。これらの２つのクローンは、さらなる表現型分析に使用されることになる。 Ｄ． スポロゾイト／蚊の計数は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローンＦ７およびＢ７について、野生型と同程度であった。クローンＦ７を、さらなる表現型分析に使用した。

【図9C】図９Ａ～９Ｄ。Ａ． ４つのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２ＫＯクローンＢ７、Ｃ１２、Ｄ５、およびＦ７の設定後１５日目に、鞭毛放出中心を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２の成熟ガメトサイト培養物において計数し、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４と同程度であることが見出された。これらのガメトサイト培養物を、標準的な膜吸血アッセイにおいて雌性Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊に吸血させ、吸血後８日目に、中腸を解剖した。 Ｂ． オーシスト存在度、 Ｃ． オーシスト／蚊の計数は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２ＫＯクローンＦ７およびＢ７について、野生型と同程度であった。これらの２つのクローンは、さらなる表現型分析に使用されることになる。 Ｄ． スポロゾイト／蚊の計数は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローンＦ７およびＢ７について、野生型と同程度であった。クローンＦ７を、さらなる表現型分析に使用した。

【図9D】図９Ａ～９Ｄ。Ａ． ４つのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２ＫＯクローンＢ７、Ｃ１２、Ｄ５、およびＦ７の設定後１５日目に、鞭毛放出中心を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２の成熟ガメトサイト培養物において計数し、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４と同程度であることが見出された。これらのガメトサイト培養物を、標準的な膜吸血アッセイにおいて雌性Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊に吸血させ、吸血後８日目に、中腸を解剖した。 Ｂ． オーシスト存在度、 Ｃ． オーシスト／蚊の計数は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２ＫＯクローンＦ７およびＢ７について、野生型と同程度であった。これらの２つのクローンは、さらなる表現型分析に使用されることになる。 Ｄ． スポロゾイト／蚊の計数は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２クローンＦ７およびＢ７について、野生型と同程度であった。クローンＦ７を、さらなる表現型分析に使用した。

【0023】

【図10A】図１０Ａ～１０Ｃ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２寄生生物は、肝臓ステージ発達で重度に弱毒化され、感染性赤血球外メロゾイトを生成することができない。 Ａ． 概略図は、実験デザインを示す。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２スポロゾイトを、感染したＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊の唾液腺から単離した。ＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスにおいて、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２の血液ステージ移行を評価するために、１×１０^６個の無菌凍結保存Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４（ＰＦＳＰＺ）および無菌凍結保存Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２（ＰＦＳＰＺ ＬＡＲＣ２）のスポロゾイトを、それぞれ、１群当たり４匹および６匹のＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスに静脈内注射した。６日目および７日目に、４００μｌの７０％ＲＢＣを、静脈内注射して、肝臓ステージ寄生生物の血液への移行を可能にした。７日目にヒトＲＢＣ再増殖の４時間後に、マウスを安楽死させ、心臓穿刺によって血液を採取し、それぞれのマウスから５０μｌの血液をｑＲＴ－ＰＣＲ分析に使用して、寄生生物１８Ｓ ＲＮＡを検出した。血液を、無性別培地において３回洗浄し、パックされたＲＢＣ体積と同等の体積のヒトＲＢＣを添加し、血液をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に移した。毎日新しい培地を置き換え、培養物を、最大６週間、２～３日ごとに重層スメアによって寄生生物の存在について分析した。

【図10B】図１０Ａ～１０Ｃ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２寄生生物は、肝臓ステージ発達で重度に弱毒化され、感染性赤血球外メロゾイトを生成することができない。 Ｂ． ７日目に、ＰｆＳＰＺを感染させたマウスの寄生生物密度は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｑＲＴ－ＰＣＲにより、１０^３～１０^５個の寄生生物同等物／ｍｌの範囲に及び、これは、７日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後に１０^９個の寄生生物同等物／ｍｌまでさらに増加した。対照的に、ＰＦＳＰＺ ＬＡＲＣ２を感染させたマウスでは、０～１０^３個の寄生生物同等物／ｍｌが、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｑＲＴ－ＰＣＲによって検出され、７日間の培養後に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｒＲＮＡシグナルに劇的な低下があり、生存性赤血球外メロゾイトが、ＰＦＳＰＺ ＬＡＲＣ２肝臓ステージシゾントから放出されなかったことが示された。これを、薄層血液スメアによってさらに確認した。血液ステージ寄生生物は、ＰｆＳＰＺを感染させた４匹すべてのマウスにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養への移行から１～３日以内に、ギムザ染色した薄層血液スメアによって検出された（表５を参照されたい）。対照的に、ＰｆＳＰＺ ＬＡＲＣ２を感染させた６匹すべてのマウスにおいて、ギムザ染色した薄層血液スメアによって血液ステージ寄生生物は検出されなかった。

【図10C】図１０Ａ～１０Ｃ。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２寄生生物は、肝臓ステージ発達で重度に弱毒化され、感染性赤血球外メロゾイトを生成することができない。 （Ｃ）感染したマウスの肝臓もまた、ＲＮＡを抽出するため、およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｑＲＴ－ＰＣＲによる寄生生物肝臓量の分析のために、７日目に摘出した。寄生生物肝臓負荷量を、総肝臓ＲＮＡ１μｇ当たりのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｒＲＮＡのｌｏｇ１０コピー数として示す。寄生生物肝臓量は、ＰｆＳＰＺとＰｆＳＰＺ ＬＡＲＣ２との間で同程度であり、ＬＡＲＣ２が、７日目まで肝臓で存続し、有意なバイオマス拡大を受けることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

詳細な説明
定義
「添加剤」は、本明細書において名詞として使用される場合、スポロゾイト調製物に添加される化合物または組成物である。添加剤としては、希釈剤、担体、賦形剤、凍結保護剤などが挙げられる。

【0025】

「無菌」は、本明細書において使用される場合、他の微生物、例えば、細菌、真菌、病原性ウイルスなどの検出可能な混入物質の導入がないことを意味する。無菌スポロゾイト調製物は、任意の他の種類の微生物または感染性物質を含まないスポロゾイトの滅菌調製物をもたらす。無菌手法をモニタリングするために使用される微生物学アッセイは、混入物質の存在または不在を評価する。それらとしては、Microbial Limits Test, current USP <61>が挙げられるがこれに限定されず、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0026】

「弱毒化する」とは、本明細書において使用される場合、生きた生物を、それを致死させることなくそのライフサイクルを完了することができないようにすることを意味する。生物は、複製する、タンパク質を発現する、およびいくつかのライフサイクルステージを通じて発達する限定された能力を有し得るが、特定のライフサイクルステージで発達を停止し、そのステージを越えて発達を進行させることができない。本明細書に開示される弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物に関して、それらは、宿主肝細胞に感染し、ステージ特異的タンパク質を発現する能力を保持するが、肝臓ステージを越えて発達することができず、肝臓ステージ発達後に感染した宿主の血流において血液ステージ感染へと移行することができず、マラリアの疾患病態を引き起こすことができない。

【0027】

「チャレンジ」とは、本明細書において使用される場合、チャレンジする病原体によって引き起こされる感染／疾患に対する防御免疫を付与することが意図されるワクチンを事前に提供されている対象への感染性病原体の提示を指す。マラリアに関しては、チャレンジは、（ＣＨＭＩ）［３１、３２］、感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト接種によって、感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを有するＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊への曝露によって、またはマラリア寄生生物が感染した蚊の咬傷によって天然に伝播される地域においてワクチン接種した対象をモニタリングする実施試験によって、行われ得る。

【0028】

「防御免疫を付与すること」とは、本明細書において使用される場合、宿主における疾患の臨床症状、病態、もしくは症状が、未処置宿主と比較して低減されるように、または集団内で感染症、もしくは疾患の臨床症状、病態、もしくは症状が出現する割合が、未処置集団と比較して低減されるように、集団または宿主（すなわち、個体）に、病原体（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）によって引き起こされる感染症／疾患（例えば、マラリア）に対して防御するための免疫応答を生成する能力を提供することを指す。

【0029】

本明細書において使用される場合、遺伝子機能に関する「破壊する」という用語は、遺伝子の機能を妨害すること、例えば、遺伝子機能またはコードされる遺伝子産物の機能を阻害、不活性化、弱毒化、または阻止することを意味する。妨害または破壊は、例えば、翻訳されたタンパク質が存在する場合に、その野生型機能を行えなくなるような様式および／または程度で、遺伝子配列を変更すること（例えば、置換、改変、欠失、付加、ノックダウン、ノックアウト、またはノックイン）によって達成することができる。あるいは、遺伝子配列は、欠失させてもよい。

【0030】

本明細書において使用される場合、「遺伝子改変された」という用語は、野生型ゲノム配列とは決定的な違いをもたらす、野生型Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物のゲノムに対する改変を指す。遺伝子改変は、ヒトの操作によって、例えば、遺伝子操作によって、もたらされる。本明細書に開示される本発明に関して、遺伝子改変は、遺伝子の１つもしくは複数の挿入もしくは欠失、遺伝子のノックアウト、または他の改変であり得る。これらの発明において、遺伝子改変は、ＬＩＮＵＰ遺伝子、ならびにある特定の実施形態ではＬＩＮＵＰ遺伝子およびＰｌａｓＭｅｉ２遺伝子の機能的破壊をもたらす。

【0031】

「免疫応答」とは、本明細書において使用される場合、一般的には抗体および／またはＴ細胞の産生によって特徴付けられるがこれらに限定されない、弱毒化されたスポロゾイトの導入に対するレシピエントの応答を意味する。一般的に、免疫応答は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種エピトープに特異的な細胞性応答、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋ Ｔ細胞の誘導もしくは活性化、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗体の産生の増加である体液性応答、または細胞性応答および体液性応答の両方であり得る。マラリアワクチンに関して、生きたスポロゾイトを含むワクチンによって構築される免疫応答としては、細胞外スポロゾイト、細胞内肝臓ステージ、または他のステージの寄生生物によって発現されるタンパク質に対する応答が挙げられるが、これらに限定されない。単核細胞、例えば、樹状細胞は、前記寄生生物の成分を得、関連する免疫細胞にこれらの抗原を提示すると予想される。本発明において、感染性生物による後続のチャレンジを行うと、免疫応答により、疾患を引き起こす無性別赤血球ステージへの病原性寄生生物の発達が妨げられる。

【0032】

本明細書において使用される場合、「生きた」という用語は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物における代謝活性の継続を指す。一部の実施形態では、「生きた」とは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物が、例えば、肝細胞（培養またはｉｎ ｖｉｖｏ）内で少なくとも一過的な感染を最終的に構築することができることを指す。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物は、遺伝子的弱毒化を考慮して現実的であれば任意の関連する発達ステージにあってもよい。したがって、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物は、蚊内の発達ステージにあってもよく、感染力のあるスポロゾイトステージにあってもよく、または肝細胞内（肝臓）ステージにあってもよい。

【0033】

「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」で産生されたスポロゾイト、または「ｉＳＰＺ」は、本明細書において使用される場合、蚊に対して外部で発生したスポロゾイトを意味し、すなわち、ガメトサイトステージから成熟した感染性スポロゾイトステージへのスポロゴニーが、蚊に対して外部である［３３］。

【0034】

「代謝的に活性な」とは、本明細書において使用される場合、生きており、持続性機能およびいくつかのライフサイクルプロセスを行うことができることを意味する。弱毒化されたスポロゾイトに関して、これには、培養中およびｉｎ ｖｉｖｏの肝細胞に侵入することができ、可能性として分裂し、いくつかの発達ステージへと進行する実質的な能力を有し、ステージ特異的タンパク質をｄｅ ｎｏｖｏで発現することができる、スポロゾイトが含まれるが、これらに限定されない。

【0035】

本明細書において使用される場合、「Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物」または「Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種」という用語は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属に属する任意の寄生生物を指す。一部の実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物は、ヒト宿主範囲、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、およびＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉを有する。一部の実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである。

【0036】

「プロモーター」とは、本明細書において使用される場合、関連するタンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子）が結合する遺伝子の上流にあり、その遺伝子の転写の開始および調節を行う、ＤＮＡの領域である。

【0037】

「導入遺伝子」とは、本明細書において使用される場合、導入遺伝子が導入されている生物において通常存在しない遺伝子である。本発明の一部の実施形態では、導入遺伝子またはコードされるポリペプチドの発現は、生物の１つまたは複数の遺伝子機能を破壊するように機能する。他の実施形態では、導入遺伝子は、外来抗原をコードし、その発現が、免疫応答を誘起する。

【0038】

「ワクチン」とは、本明細書において使用される場合、免疫原性物質と、薬学的に許容される添加剤、例えば、賦形剤、アジュバント、および／または添加剤または保護剤とを含む、調製物である。免疫原は、感染性物質全体、または感染性物質の分子サブセット（感染性物質によって、合成もしくは組換えで産生される）から構成され得る。ワクチンが対象に投与されると、免疫原が、免疫応答を刺激し、これが、感染性物質による後続のチャレンジの際に、疾病から対象を防御するか、またはその物質によって引き起こされる病態、症状、もしくは臨床症状を軽減すると予想される。治療用（処置）ワクチンは、感染後に提供され、疾患の進行を低減または停止させることを意図する。防止用（予防用）ワクチンは、初回感染を予防するか、または感染率もしくは感染量を低減させることを意図する。

【0039】

本開示は、後期肝臓ステージへと発達するが、赤血球感染の血液ステージへの移行が阻止される、遺伝子的に弱毒化されたマラリア寄生生物を対象とする。具体的には、弱毒化されたマラリア寄生生物は、肝臓ステージ核タンパク質（ＬＩＮＵＰ）遺伝子の機能性を破壊する遺伝子変更を含む。一部の実施形態では、マラリア寄生生物は、ヒト宿主範囲のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉを含む。一部の実施形態では、マラリア寄生生物は、肝臓から血液ステージへの移行に極めて重要な他の遺伝子が遮断される、追加の遺伝子改変を含む。非限定的な例として、ある実施形態のマラリア寄生生物は、追加として、ＬＩＮＵＰおよびＰｌａｓＭｅｉ２の両方の遺伝子機能が破壊される遺伝子改変を含む（この二重ノックアウトは、「ｌｉｎｕｐ／ｐｌａｓｍｅｉ２二重ノックアウト（ＫＯ）」、「ＬＡＲＣ２」、「ＬＡＲＣ２ ＫＯ」など様々に称され、これらの用語は、同等である）。開示される弱毒化されたマラリア寄生生物は、添加剤、マラリアの予防および緩和のためのワクチン、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗原に対してヒト免疫系を誘導および／もしくは刺激するための方法、ヒト対象において１つもしくは複数のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ抗原に対する免疫応答を誘導するための方法、またはヒト対象においてＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生生物によって引き起こされるマラリアに対する防御免疫を付与するための方法に有用であり、これらもまた、本開示によって包含される。一部の実施形態では、開示される弱毒化されたマラリア寄生生物は、マラリア感染症を緩和する、低減する、予防する、処置する、および／または防御するための組成物および方法に有用である。

【0040】

以下により詳細に記載されるように、本発明者らは、寄生生物の核に局在化する肝臓ステージ核タンパク質または肝臓ステージ特異的タンパク質として記載される新規なタンパク質（ＬＩＮＵＰ）を発見した。このタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子機能のノックアウトにより、肝臓ステージ発達段階の後期でライフサイクルの停止が生じる。加えて、本発明者らは、ＰｌａｓＭｅｉ２［２７］およびＬＩＮＵＰの両方の遺伝子の機能的欠失を含むＬＡＲＣ２（後期停止型複製適合二重ＫＯ）と称される二重ノックアウトを開発した。この二重ノックアウトは、以前の複製欠損の寄生生物全体に基づくワクチンの生成と比較して、優れた免疫原であるが、それは、これが肝臓において後期肝臓ステージへのほぼ完全な発達を受け、寄生生物抗原のバイオマスおよび多様性の拡大をもたらすためである。加えて、ＬＡＲＣ２は、血液ステージへの移行に必要とされる２つの遺伝子の遺伝子操作に起因してより強固に弱毒化されており、バッチごとの均一性も確保され、薬物でのカバー下での生きた非弱毒化スポロゾイトワクチンでの免疫付与、すなわち、化学物質により弱毒化されたワクチン接種に伴う主要な制限である、抗マラリア薬でのカバー（上述の別の後期肝臓ステージアプローチ）の必要性を克服する。ＬＩＮＵＰ、および別の実施形態では別の肝臓ステージ特異的遺伝子、例えば、ＰｌａｓＭｅｉ２、またはなおも他の実施形態では肝臓ステージから血液ステージへの移行に必要なタンパク質をコードする他の遺伝子の遺伝子ノックアウトを有する遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は、対象、特に、ヒト対象において、１つもしくは複数のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種抗原に対する免疫応答を誘導するため、対象、特に、ヒト対象において、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生生物によって引き起こされるマラリアに対する防御免疫を付与するため、再感染に対する免疫性を提供するかもしくはブーストする赤血球前ステージのワクチンとして対象、特に、ヒト対象に免疫付与するため、および／またはマラリア感染を処置、予防、もしくは緩和するために、使用することができる。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生生物のライフサイクルの肝臓ステージでの完全な遮断はまた、他の個体への寄生生物の伝播の防止ももたらす。これは、マラリアを根絶するための撲滅キャンペーンにおいて肝要である。

【0041】

ある実施形態では、生きたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物は、肝臓ステージ核タンパク質をコードするＬＩＮＵＰ遺伝子を破壊し、それによって、野生型ＬＩＮＵＰ遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的機能を妨げるように遺伝子改変されている。

【0042】

ある実施形態では、生きたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ｌｉｎｕｐ^－寄生生物は、哺乳動物中間宿主内において、後期肝臓ステージでライフサイクル発達を停止する。

【0043】

他の実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ｌｉｎｕｐ^－またはＬＡＲＣ２寄生生物は、少なくとも１つの導入遺伝子を含み、なおも他の実施形態では、導入遺伝子は、発達のスポロゾイトまたは肝臓ステージの間に導入遺伝子の転写をもたらすプロモーターの制御下にある。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の導入遺伝子は、血液ステージまたはガメトサイト関連抗原をコードする。１つまたは複数の血液ステージまたはガメトサイト関連抗原の発現を提供することによって、ＧＡＰは、追加の免疫原性を有し、血液ステージ寄生生物（無性別および有性別）に対する防御を提供する。したがって、ＧＡＰが、血液ステージへの発達前に完全に停止したとしても、それは、血液ステージ寄生生物の特徴である抗原に対して免疫細胞を刺激することが依然として可能であると予想される。これは、血液ステージ寄生生物に対するさらなる防御を提供し、臨床症状の危険性ならびにガメトサイト抗原における感染の伝播を低減させる。他の実施形態では、１つまたは複数の導入遺伝子は、他の病原体に由来する抗原をコードし、したがって、これらの追加の病原体に対する免疫応答を提供する。

【0044】

ある実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、またはＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉである。

【0045】

ある実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生物は、発達のスポロゾイトステージにある。

【0046】

ある実施形態では、遺伝子改変前の生きたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ｌｉｎｕｐ^－の機能性ＬＩＮＵＰ遺伝子は、配列番号３５に対して少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のヌクレオチド配列同一性を有する。

【0047】

ある実施形態では、生きたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ｌｉｎｕｐ^－寄生生物において、遺伝子改変前の機能性ＬＩＮＵＰ遺伝子は、ＰＦ３Ｄ７＿１２４９７００、配列番号１に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有するＬＩＮＵＰポリペプチドをコードする。

【0048】

ある実施形態では、ワクチン組成物は、スポロゾイトステージにあるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ｌｉｎｕｐ^－寄生生物と、添加剤とを含み、ここで、ワクチン組成物は、無菌で調製される。

【0049】

ある実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ｌｉｎｕｐ^－寄生生物は、１つまたは複数の追加の遺伝子機能を破壊するように遺伝子改変されており、それぞれの追加の遺伝子機能は、肝臓ステージから血液ステージへの移行に必要とされ、別の実施形態では、追加の遺伝子機能は、ＰｌａｓＭｅｉ２である。ある特定の実施形態では、遺伝子改変前の機能性ＰｌａｓＭｅｉ２遺伝子は、配列番号３４に記載される核酸配列に対して、少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性である核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＰｌａｓＭｅｉ２遺伝子によってコードされる機能性ＰｌａｓＭｅｉ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３６に記載される配列に対して、少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性である、を含む（comprises is）。

【0050】

ある実施形態では、ワクチン組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ＬＡＲＣ２（ｌｉｎｕｐ－／ｐｌａｓｍｅｉ２－）と、添加剤とを含む。ある特定の実施形態では、このワクチン組成物は、無菌で調製される。

【0051】

他の実施形態は、ヒト対象において、１つまたは複数のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ抗原に対する免疫応答を誘導するための方法であって、１つまたは複数の用量のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ｌｉｎｕｐ^－ワクチン組成物を対象に投与することを含む、方法に関し、なおも他の実施形態は、ヒト対象において、１つまたは複数のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ抗原に対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象に、１つまたは複数の用量のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ＬＡＲＣ２^－ワクチン組成物を投与することを含む、方法に関する。なおも他の実施形態は、これらのワクチンの投与によって生成される免疫応答が、後続の野生型Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍチャレンジによる感染を緩和または防御する、方法に関する。なおも他の実施形態は、ヒト対象において、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生生物によって引き起こされるマラリアに対する防御免疫の付与を、これらのワクチンの投与によって行う方法に関する。

【0052】

ある実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ＬＩＮＵＰ^－スポロゾイトは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され、ある実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ＬＡＲＣ２^－スポロゾイトは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトは、開示されており［３４］、具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトが、開示されており［３５］、これらの参考文献のいずれも、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0053】

精製方法
約１０ミクロンのサイズの生きた生物、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイト、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＳＰＺ、特に、遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ＳＰＺ［３７］を精製する方法は、［３６］によって例証されるように、当該技術分野において公知である。これらの方法は、非直感的な様式でアセンブルされた異なる細孔サイズを有する一連の異なる種類のサイズ排除フィルターを利用する。この手法は、生きた運動性寄生生物の調製物から、付随材料を排除する。この方法の固有な態様は、並んでいるサイズ排除フィルターの細孔サイズが、必ずしもその前のサイズ排除フィルターの細孔サイズよりも小さいわけではないことである。別の発明的な態様は、いくつかのフィルターが、公称細孔サイズのマトリックスを提供し、少なくとも１つのフィルターが、正確な細孔径を有するトラックエッチドフィルターを提供することである。少なくとも１つのフィルターは、寄生生物の直径に近いかまたはそれよりもわずかに小さい細孔サイズを有する。

【0054】

精製のための調製物では典型的に、１５０～４００匹の蚊に由来する唾液腺を解剖する。スポロゾイトを、ニードルおよびシリンジを出入りさせること（粉砕）によって唾液腺から放出させ、これらの腺に由来するスポロゾイトを、集合的に精製する。しかしながら、規模拡大した調製物においては、数倍多くの蚊、ある実施形態では最大１，０００匹の蚊、別の実施形態では最大５，０００匹の蚊、別の実施形態では最大１０，０００匹の蚊を、解剖してもよい。スポロゾイトは、粉砕によって唾液腺から放出され、粉砕した唾液腺調製物（精製前調製物）を、本明細書に開示されるサイズ排除濾過プロセスによって精製する。スポロゾイトは、精製プロセスの間、賦形剤、典型的には、アール塩含有１９９培地（Ｅ－１９９）中の１パーセントヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）中で維持される。

【0055】

Ａ － 精製のための材料の調製
粉砕した解剖産物（精製前調製物）は、まとめて一度に単一のチューブに入れられる。これが、蚊唾液腺材料（ＳＧＭ）精製前調製物である。これは、約１００，０００～１０億個のスポロゾイト、好ましくは、少なくとも１００万個のスポロゾイト、より好ましくは少なくとも２５００万個のスポロゾイトを表す。精製前調製物中の測定されるＳＧＭの量は、通常、スポロゾイト２５，０００個当たり３００ｎｇ～１２，０００ｎｇ、より典型的には、スポロゾイト２５，０００個当たり４００ｎｇ～１，１００ｎｇである。精製前調製物を、次いで、賦形剤で１０ｍｌに希釈した。溶液および試料は、精製の期間、１５～３０℃に保持した。

【0056】

Ｂ － 精製手順
蠕動ポンプを使用して、希釈した精製前調製物を、少なくとも１ｍｌ／分であるが１０００ｍｌ／分を超えない、好ましくは、少なくとも２ｍｌ／分であるが５００ｍｌ／分を超えない流速、より好ましくは、少なくとも３ｍｌ／分かつ２００ｍｌ／を超えない流速で、一連のサイズ排除フィルターにポンプ注入する。それぞれのフィルターの対応する流動は、少なくとも１Ｌ／時間／ｍ^２であるが２０００Ｌ／時間／ｍ^２を超えない、好ましくは、３Ｌ／時間／ｍ^２～１５００Ｌ／時間／ｍ^２、最も好ましくは、少なくとも１２５Ｌ／時間／ｍ^２であるが２５０Ｌ／時間／ｍ^２を超えない。フィルターは、通常、医療グレードのシリコーンチュービングで直列に接続されている。好ましくは、最初のフィルター（フィルター番号１）または最初の２つのフィルター（フィルター番号１および番号２）は、マトリックスフィルターであり、ポリプロピレンで作製されているが、しかしながら、ナイロン、混合セルロースエステル、およびホウケイ酸ガラス、または当業者に公知の他の材料を、使用してもよい。好ましくは、最後から２つ目のフィルター（フィルター番号３）は、膜フィルターであり、最も好ましくは、トラックエッチドポリカーボネートフィルターであるが、当業者に公知の類似の特性を有する他のフィルターを使用してもよい。無菌手順については、フィルターは、滅菌である。ある実施形態では、３つのフィルター（フィルター番号１、フィルター番号２、およびフィルター番号３）は、直列に接続されており、スポロゾイトは、デッドエンド濾過によってフィルター番号４で捕捉される。追加のフィルターを使用してもよい。ある実施形態では、フィルター番号１は、少なくとも約２．５ミクロンであるが約３０ミクロンを超えない、好ましくは少なくとも約５ミクロンであるが２０ミクロンを超えない公称細孔サイズを有する膜マトリックスである。一実施形態では、使用されるフィルターは、約１０ミクロンの公称細孔サイズを有し、１７．５ｃｍ^２の濾過面積を有する。（Ｐｏｌｙｇａｒｄ（登録商標）－ＣＮ Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ － Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＳＮ１ＨＡ４７ＨＨ３）。規模拡大した実施形態では、濾過面積は、１８００ｃｍ^２である。フィルター番号２（これもまた膜マトリックスである）の公称細孔サイズは、少なくとも約０．３ミクロンであるが、約１．２ミクロンを上回らない。一実施形態では、公称細孔サイズは、約０．６ミクロンであり、１７．５ｃｍ^２の濾過面積を有し（Ｐｏｌｙｇａｒｄ（登録商標）－ＣＮ Ｏｐｔｉｓｃａｌｅフィルター － Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＳＮ０６Ａ４７ＨＨ３）、これはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの直径よりも小さい。規模拡大した実施形態では、濾過面積は、１８００ｃｍ^２である。一実施形態では、フィルター番号３は、正確な細孔径および一定の細孔サイズを有するトラックエッチド膜フィルターであり、少なくとも１．２ミクロンであるが３ミクロンを上回らない細孔サイズを有し、先行するフィルターの公称細孔サイズよりも大きい。一実施形態では、使用されるフィルターは、１．２ミクロンの細孔サイズを有し、１１．３ｃｍ^２の濾過面積を有する。（Ｉｓｏｐｏｒｅ膜、直径４７ｍｍ － Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＲＴＴＰ０４７００）、Ｓｗｉｎ－Ｌｏｃフィルターホルダ（Ｗｈａｔｍａｎカタログ番号４２０４００）に保持される。規模拡大した実施形態では、濾過面積は、１２７ｃｍ^２である。濾過された材料は、２８．７ｃｍ^２の濾過面積および０．８ミクロンを超えない、好ましくは０．６ミクロンを超えない、好ましくは０．２ミクロンを超えないトラックエッチド細孔サイズを有する直径９０ｍｍのＩｓｏｐｏｒｅ膜を備えた撹拌式限外濾過セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、モデル８２００）において、フィルター番号４で捕捉される。一実施形態では、細孔サイズは、０．４ミクロンである（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＨＴＴＰ０９０３０）。規模拡大した実施形態では、濾過面積は、１６２ｃｍ^２である。別の規模拡大した実施形態では、濾過面積は、６３ｃｍ^２である。この系を、培地で複数回洗浄する。保持液の体積が撹拌式セルにおいて約４０ｍｌに達した場合には、撹拌式セル容器の排出口を開放し、残留保持液を約５～１０ｍｌ残して重力で排出させるが、保持液の体積は、他の方法、例えば、窒素などの圧縮ガスによる圧力を印加すること、またはピストンなどの機械的デバイスによって低減させることもできるが、重力が好ましい方法である。この残留保持液は、精製培地を使用した３回分の洗浄と一緒に収集し、合計約３５ｍｌまで、典型的には滅菌３５ｍｌ Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅまたは類似の遠心分離チューブに移した（チューブのサイズは、調製物の体積に応じて変動することになる）。３５ｍｌのＯａｋ Ｒｉｄｇｅチューブの培地内の精製したスポロゾイトを、５，０００ｇ～２５，０００ｇ、好ましくは、１６，３００ｇで、２分間～１２分間、好ましくは、５分間遠心分離して、スポロゾイトをペレットにした。上清培地を、デカンテーションした。このステップは、上清中に残留しているより小さくより浮力のある材料および可溶性材料を除去することによって、スポロゾイト調製物をさらに精製する。

【0057】

３サイズ排除フィルターの手法を使用することで、この手順は、精製前調製物中の付随材料と比べて、精製されたスポロゾイト調製物中の付随材料の２００～１０，０００分の１（低減係数）というより大きい実質的な低減を提供する。滅菌精製されたスポロゾイトの精製された調製物中の残留ＳＧＭの量は、慣例的に、２５，０００個のスポロゾイト当たり２５ｎｇ未満の付随材料（最初のＳＧＭ量と比べて９７％を上回る低減）、好ましくは、２５，０００個のスポロゾイト当たり１５ｎｇ未満（９８％の低減）、より好ましくは、２５，０００個のスポロゾイト当たり１ｎｇ未満（９９．９％）である。本明細書に記載されるそれぞれの精製された調製物中の混入ＳＧＭは、通常、それぞれの精製された調製物が由来する最初の粉砕処理した精製前の唾液腺材料中のＳＧＭと比べて数千分の１に低減される。好ましくは、精製低減係数は、少なくとも１５分の１であり、より好ましくは、精製係数は、少なくとも１，５００分の１、最も好ましくは、少なくとも３，５００分の１である。実施例１に記載される１０回のキャンペーンにおける低減係数の幾何平均は、１６２５であり、これは精製プロセス中のＳＧＭにおける９９．９３％である。

【0058】

この方法は、粗スポロゾイト調製物中の混入物質および付随する蚊唾液腺材料を低減させるのに有効である。スポロゾイトは、次いで、当該技術分野において公知のように、凍結保存され得る。

【0059】

ワクチン組成物および使用の方法
一部の実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイト、および特に、精製されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトは、無菌で調製される。この手法は、［３８］によって例証されるように当該技術分野において公知であり、以下の実施例７における無菌の精製されたＰｆ－ＬＡＲＣ２のＧＭＰ製造の説明においてさらに例証されている。

【0060】

免疫原がＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ－およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ－ＬＡＲＣ２であるワクチンを含め、遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトは、一般的に、１回から３回の用量のレジメンで投与され、通常、皮下、皮内、および静脈内投与を含む非経口で、好ましくは、当該技術分野において公知の静脈内直接静脈接種（ＤＶＩ）手法によって、投与される。接種１回当たりの遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの遺伝子的に弱毒化されたスポロゾイトの好適な用量は、約１０，０００～約１０００万個のスポロゾイト、好ましくは、１００，０００～１，０００，０００個のスポロゾイトであり得る。本発明の一部の実施形態では、ワクチンは、アジュバント、例えば、［３９］に記載される７ＤＷ８－５とともに投与され、アジュバントと併用したそのような投与は、１用量当たりの必要とされるスポロゾイトの数を低減させる可能性が高いと予想される。

【0061】

そのようなワクチンは、マラリア、その臨床症状、症状、またはその病態の予防または重症度の低減に有用である。ある実施形態では、無菌で調製された遺伝子的に弱毒化された精製されたスポロゾイトを含む組成物およびワクチンは、マラリアを引き起こす病原体に以前に曝露されていないか、または曝露されたが完全に防御されていない、ヒトおよび他の哺乳動物対象において、部分的、増強された、または完全な防御を提供する。これらの組成物およびワクチンは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの種、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍまたはＰ．ｖｉｖａｘなどを含む、マラリアを引き起こす寄生生物による疾患をもたらす感染症を発症する可能性を低減させ、感染した場合に疾病になる可能性を低減させ、感染した場合に疾病、例えば、発熱の重症度を低減させる、感染した人物における寄生生物の濃度を低減させる、またはマラリア寄生生物に曝露された集団におけるマラリアによる死亡率を低減させるのに、同様に有用である。多数の事例では、部分的な防御、または非免疫付与個体と比較して免疫付与した個体が寄生生物に感染するかもしくは感染により疾病となるまでの時間の遅延であっても、有益である。同様に、集団の約３０％においてこれらの利益のうちのいずれかをもたらすワクチン処置戦略は、地域社会およびその地域社会に属する個体の健康状態に対して、大きな影響を有し得る。一般的に、本発明の方法に従って、対象に、１つのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを接種することが、同じ種の野生型Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物でのチャレンジに対する防御免疫が誘導すると予想されることが、企図される。しかしながら、１つのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のスポロゾイトでの免疫付与により、別のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のスポロゾイトでのチャレンジに対して防御することができることが示されており、したがって、この様式で交差種防御を誘起することもまた、本発明の範囲内である。

【0062】

対象におけるマラリアの予防のための方法もまた、提供される。本方法は、対象に、ＬＩＮＵＰ遺伝子機能が欠如した遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ワクチンを投与するステップを含み、このワクチンは、無菌で調製されており、実質的に精製された生きた遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを、マラリアを予防するのに有効な量で含む。

【0063】

マラリアの予防および／または処置は、当業者であれば、マラリア感染症と関連する臨床または病理症状、例えば、体温の上昇、頭痛、疲労、昏睡状態、または寄生赤血球のパーセントの評価によって容易に確認することができる。したがって、本発明の方法によると、対象は、精製された生きた弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含むワクチンの投与後に、マラリアの臨床兆候、症状、または病理症状の改善または不在を示す。

【0064】

一部の実施形態では、投与するステップは、対象の肝細胞の感染をもたらし、遺伝子的に弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の肝臓ステージへと発達し、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗原のアレイを提供し、免疫応答が生成されて、後続の野生型Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍチャレンジによる感染を緩和または防御する。したがって、一部の実施形態では、開示される方法は、野生型Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍへの曝露の後に、対象のうちの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または対象のうちの少なくとも９９％においてマラリアの症状を低減または予防するのに十分な防御免疫を付与する。

【0065】

ワクチンおよび免疫原の有効かつ最適な投薬量範囲は、当該技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。抗マラリア作用を達成するのに適切な投薬量に関する案内は、本明細書に開示される例証されているアッセイから提供される。より具体的には、本明細書および引用される参考文献に記載される免疫付与パターンから得られた結果は、必要とされる分野の当業者によって外挿されて、試験ワクチン接種スケジュールを得ることができる。志願者対象に、予定された間隔で、様々な投薬量を接種し、試験血液試料を、後続の感染性寄生生物でチャレンジしたときのマラリアに対する防御のレベルについて評価する。そのような結果を使用して、哺乳動物対象、具体的にはヒト対象の有効な免疫付与のための最適化された免疫付与用量および投薬レジメン（スケジュール）を精査することができる。

【0066】

対象における免疫応答は、体液性および細胞性免疫応答の評価を含むがこれらに限定されない標準的な試験によって測定することができ、これには、抗原特異的または寄生生物ステージ特異的抗体応答の測定、当該技術分野において公知の手段による末梢血リンパ球の直接的な測定、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性アッセイ［４０］、細胞増殖アッセイ［４１］、免疫細胞およびサブセットのイムノアッセイ［４２、４３］、ならびに細胞媒介型免疫に関する皮膚試験［４４］が挙げられるが、これらに限定されない。免疫系の強度を測定するための様々な方法および分析が、説明されており、例えば［４５］がある。

【0067】

提供されるワクチンは、付随材料を実質的に含まない精製された生きた弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの無菌および非無菌組成物（好ましくは、無菌）、ならびに薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体を有する組成物を含む。これらのワクチンは、後続の感染性寄生生物でチャレンジしたときに、マラリアを予防または軽減するのに有効である。医薬組成物およびワクチンを製剤化する方法は、当業者に周知である［例えば、４６を参照されたい］。

【0068】

精製された生きた弱毒化されたかまたは弱毒化されていないＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを、適切な希釈剤および緩衝液とともに含む、無菌で調製されたかまたはそれ以外の、ワクチン組成物が、本発明によって包含される。希釈剤、一般的には、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または生理食塩水（ＮＳ）は、様々な緩衝液内容物ｐＨおよびイオン強度のものである。そのような組成物はまた、賦形剤、例えば、血清アルブミン、特に、ヒト血清アルブミンを含み得る。血清アルブミンは、天然に存在する供給源、例えば、ヒト血液から精製されてもよく、または組換えＤＮＡもしくは合成技術によって産生されてもよい。そのような組成物はまた、添加剤、例えば、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または保存剤もしくは凍結保存剤も含み得る。ポリ乳酸、ポリグリコール酸など、ポリマー化合物の粒子調製物またはリポソームへの材料の組込みもまた、使用され得る。（例えば、［４６］１４３５～１７１２ページを参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0069】

ワクチンの有効量を判定するために、当業者であれば、レシピエントの治療の状況、年齢および全般的な健康状態を考慮して、適正な投薬を確認することができるであろう。選択される投薬量は、所望される治療作用、投与の経路、および所望される処置の期間に依存する。投薬量のレベルを決定するための実験は、当業者により、様々な投薬量レジメンがマラリアに対する防御を誘起するそれらの能力に関して評価される適切なヒト臨床試験によって確認され得る。

【0070】

開示されるワクチンおよびこれらのワクチンを使用する開示される方法は、ワクチンレジメンにおける１つの成分として有用であり得、それぞれの成分は、対象に別個に投与しようとする異なるワクチンを含む。レジメンは、弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトおよび他の種類のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍワクチンでの逐次的な免疫付与、いわゆるプライム－ブースト戦略を含み得る。これは、プライムとして弱毒化されたスポロゾイト、およびブーストとしてアジュバントにおけるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ関連組換えタンパク質（単数または複数）を含み得るか、または逆も同様である。これはまた、プライムとしてＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ関連ＤＮＡワクチンまたはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ関連タンパク質を発現する組換えウイルス、例えば、アデノウイルス、およびブーストとして精製された弱毒化されたスポロゾイトワクチンを含み得るか、または逆も同様である。これにはまた、弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトと、死滅したおよび生きた弱毒化されたものを含む赤血球ステージの寄生生物のなんらかの形態とを用いた逐次的または混合免疫付与も含まれ得る。別個の成分を含むワクチン複合体は、別個のワクチン成分を含むワクチンレジメン、プライム／ブーストレジメン、成分ワクチン、成分ワクチンキット、または成分ワクチンパッケージと称され得る。例えば、ワクチン複合体は、精製された無菌の生きた弱毒化されたスポロゾイトを含むワクチンを、成分として含み得る。複合体は、追加として、組換えタンパク質、合成ポリペプチド、これらのエレメントをコードするＤＮＡそのもの、または組換えウイルス、組換え細菌、もしくは組換え寄生生物に機能的に組み込まれたものを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の組換えまたは合成サブユニットワクチン成分を含み得る。ワクチン成分はまた、細胞外で初期肝臓ステージへと発達することが可能な無菌の弱毒化された無菌（axenic）スポロゾイトを含み得る。

【0071】

以下は、遺伝子的弱毒化の実現可能な標的としてのＬＩＮＵＰの発見および分析、ならびに二重ノックアウト弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの開発の実験的開示である。

【0072】

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されるかまたは代替物が互いに排他的である場合を除き、「および／または」を意味するが、本開示は、代替物のみならびに「および／または」に言及する定義を支持することが、一般的に留意される。

【0073】

長く続いている特許の法則に従い、「１つの（a）」および「１つの（an）」という言葉は、特許請求の範囲または明細書において「含む（comprising）」という言葉と併せて使用される場合、別途示されない限り、１つまたは複数を指す。

【0074】

文脈により別途明確に示されない限り、本明細書および特許請求の範囲全体を通じて、「含む（comprise）」、「含む（comprising）」などの言葉は、排他的または徹底的な意味とは対照的な包含の意味で、例えば、「含むがそれらに限定されない」という意味で解釈されるものとする。単数形および複数形を使用した言葉はまた、それぞれ、複数形および単数形を包含する。加えて、「本明細書において」、「上記」、および「以下」という言葉、ならびに類似の意味の言葉は、本出願において使用される場合、本出願の任意の特定の部分ではなく、全体として本出願に言及するものとする。「約」および「およそ」などの言葉は、通常、標準的な誤差の範囲、例えば、言及された値の１０％または５％以内の、言及された値のわずかな変動を意味する。

【0075】

開示される方法および組成物に、それと併用して、およびその調製物において使用することができる、材料、組成物、および成分が、開示される。これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、様々な個別および集合的な組合せのそれぞれは、これらの化合物のそれぞれおよび個々の単一の組合せおよび順列への具体的な言及が明示的に開示されていなくとも、具体的に企図されることを理解されたい。この概念は、記載される方法におけるステップを含むがこれらに限定されない、本開示のすべての態様に適用される。したがって、任意の前述の実施形態の特定の要素が、他の実施形態における要素と組み合わされてもよく、または置き換えられてもよい。例えば、行われ得る様々な追加のステップが存在する場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示される方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組合せを用いて行われてもよいこと、ならびにそれぞれのそのような組合せまたは組合せのサブセットが、具体的に企図され、開示されるとみなされるべきであることが、理解される。加えて、本明細書に記載される実施形態は、任意の好適な材料、例えば、本明細書の他の箇所に記載されているかまたは当該技術分野において公知のものを使用して、実装することができることが、理解される。

【0076】

本明細書に引用される刊行物およびそれらが引用される主題は、参照によりそれらの全体が具体的に本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0077】

（実施例１）
Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＵＰは、肝臓ステージ発達の間に排他的に発現される。
肝臓ステージ発達の間にのみ弱毒化が生じる新規な遺伝子を特定するために、ヒト肝臓キメラＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスの感染した肝臓から単離した後期肝臓ステージＰ．ｖｉｖａｘトランスクリプトームを利用した。マウスに、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｄｉｒｕｓ蚊から単離した１００万個のＰ．ｖｉｖａｘタイ地域株のスポロゾイトを感染させた。マウスを、感染後８日目、肝臓ステージ発達の後期に安楽死させ、肝臓を、ＲＮＡ抽出のために処理した。Ｐ．ｖｉｖａｘエクソームに特異的なプローブを、精製したＲＮＡにハイブリダイズさせ、ｃＤＮＡに変換して、バルクシーケンシングした。リードを正規化し、１００万個のマッピングリード当たりの転写産物１キロ塩基当たりのリード数（ＲＰＫＭ）として表した。これは、４３９７個の固有の遺伝子転写産物の捕捉をもたらし、ＲＰＫＭ値は２を上回った。肝臓ステージ特異的リードを濃縮するために、Ｐ．ｖｉｖａｘのＲＰＫＭリードを、ライフサイクルの血液ステージの間に発現されるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍオルソログ遺伝子の最大ＲＰＫＭリード数に対する変化倍数として表した。これにより、無性別Ｐ．ｖｉｖａｘの肝臓ステージ発達と、無性別Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ血液ステージ発達との比較および対比、ならびに肝臓ステージ発達の間にのみ高度に発現される遺伝子を特異的に単離することが可能となった。この分析から得られた上位１０個の遺伝子（表１）には、肝臓ステージ発達の間に発現され血液ステージ発達の間には発現されないことがすでに知られている遺伝子または代謝経路が含まれた。

【0078】

【表1-1】

【表1-2】

【0079】

公知の遺伝子には、ＬＩＳＰ１（３０）、ＬＩＳＰ２（３１～３３）、ＰＡＬＭ（３４）、およびＳＩＡＰ２（３５）が含まれた。ＩＩ型脂肪酸生合成の前駆体であるマロニルＣｏＡ－アシル担体タンパク質トランスアシラーゼもまた検出され、これは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの肝臓ステージ発達の間に発現されることが知られており、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉおよびＰ．ｂｅｒｇｈｅｉの肝臓ステージ発達に重要である、経路である（３６～３９）。この結果により、肝臓ステージ特異的転写産物を発見するための本発明者らの手法が健全であったという確信が得られた。本発明者らはまた、オルソログが、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉゲノムに存在していたという要件も有していたため、本発明者らは、このげっ歯動物マラリアモデルを使用して、空間的および時間的発現ならびに必須性について効率的に分析することができた。上位１０個のうちの残りの５個の遺伝子のなかで、４個が、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉゲノムにオルソログを有しており、これには、推定上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＹ１７Ｘ＿０５１３３００、ならびに３つの仮説遺伝子ＰＹ１７Ｘ＿１００３７００、ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００、およびＰＹ１７Ｘ＿１３６９８００が含まれた。ＰｌａｓｍｏＤＢを使用したＰ．ｙｏｅｌｉｉ遺伝子およびそれらのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍオルソログの両方のタンパク質発現（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉおよびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ならびに血液ステージ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）における必須性についての分析は、ＰＹ１７Ｘ＿０５１３００／ＰＦ３Ｄ７＿１０２８００がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ無性別血液ステージにおいて欠失可能であったが、このタンパク質はＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ血液ステージガメトサイトおよびＰ．ｙｏｅｌｉｉオーシストスポロゾイトにおいて発現されていたことを示唆し、したがって、この遺伝子はさらに研究しなかった。ＰＹ１７Ｘ＿１３６９８００／ＰＦ３Ｄ７＿１３５１３００の分析は、この遺伝子が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ無性別血液ステージ複製に必須であったことを示唆し、したがって、さらに研究しなかった。ＰＹ１７Ｘ＿１００３７００／ＰＦ３Ｄ７＿０４０４６００の分析は、この遺伝子が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ無性別血液ステージにおいて欠失可能であったが、このタンパク質はＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ血液ステージのメロゾイトおよびスポロゾイトの両方において発現されていたことを示唆し、したがって、この遺伝子はさらに研究しなかった。注目すべきことに、ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００／ＰＦ３Ｄ７＿１２４９７００の分析は、この遺伝子が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ無性別血液ステージ複製に関して欠失可能であったことを示唆した。さらに、発達の４０時間の時点で、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍにおけるタンパク質発現およびＰ．ｙｏｅｌｉｉの肝臓ステージにおける発現の根拠はなかった。したがって、ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００／ＰＦ３Ｄ７＿１２４９７００を、さらなる研究に進めた。

【0080】

ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００は、公知のタンパク質特性を有さない７４６個のアミノ酸のタンパク質をコードする単一エクソン遺伝子であり、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種全体で保存されている（図１Ａ）。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉおよびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＰ．ｖｉｖａｘの合成オルソログ間での全体的なアミノ酸同一性は、４０％であり、一方でアミノ酸類似性は６０％であった。Ｎ末端に近い１２２個のアミノ酸のストレッチ（アミノ酸４４～１６１）における同一性は、８９％であった。加えて、この遺伝子は、他のＡｐｉｃｏｍｐｌｅｘａまたは任意の他の真核生物においてオルソログを有さず、したがって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍに固有である。ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００の空間的－時間的発現パターンを判定するために、ｍＣｈｅｒｒｙタグを内因性ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００のＣ末端に結合させたトランスジェニックＰ．ｙｏｅｌｉｉ寄生生物を作製した（図１Ｂ、上部パネルの図）。標準的なトランスフェクション手順により、二重交差相同組換えが成功し、トランスジェニック寄生生物をクローニングし、ｍＣｈｅｒｒｙタグの組込みを、導入遺伝子特異的ＰＣＲによって確認した。ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００ ｍＣｈｅｒｒｙタグ化寄生生物クローンと、野生型寄生生物との比較により、ライフサイクル進行に統計学的に有意な差は判明しなかった。具体的には、Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス群への野生型およびタグ化の両方の寄生生物に由来する１０，０００個の唾液腺スポロゾイトの静脈内注射により、すべてのマウスが、ギムザ染色した薄層血液スメアに基づいて、スポロゾイト注射後３日目に血液ステージ感染を示したため、ライフサイクルの蚊ステージおよび肝臓ステージは、同程度であった。タグ化した寄生生物が、ライフサイクルを正常に完了させたことが判明しているため、ｍＣｈｅｒｒｙタグの発現を、感染した組織の免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって、完全なライフサイクル全体にわたってモニタリングした。興味深いことに、ｍＣｈｅｒｒｙ発現は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉの場合はおよそ５２時間の期間を有する肝臓ステージ発達の間にのみ見られた。発現は、２４時間の時点では検出されなかったが（図１Ｂ）、赤血球外メロゾイトが形成される時点である３６時間および４８時間の両方の時点で検出された（図１Ｂ）。発現は、点状であり、小胞体マーカーＢｉＰの点状発現とオーバーラップしなかった（図１Ｂ）。しかしながら、発現は、核染色ＤＡＰＩ、ならびに活動性ヒストンマーカーであるヒストン３アセチル化リシン９と部分的にオーバーラップした（図１Ｃ）。したがって、本発明者らは、ＰＹ１７Ｘ＿１４６５２００が、中期から後期の肝臓ステージ発達の間のみの核発現パターンを有すると結論付けた。本発明者らは、したがって、この遺伝子およびそのタンパク質産物をＬＩＮＵＰ、肝臓ステージ核タンパク質と命名し、タグ化寄生生物をＰ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＵＰ^{ｍＣｈｅｒｒｙ}と命名した。ＬＩＮＵＰアミノ酸配列のさらなる分析により、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、およびＰ．ｖｉｖａｘにおける保存されたＮ末端の２５個のアミノ酸の核局在化配列（ＮＬＳ）が判明し、これは、３つの種にまたがってほぼ同一であった（図１Ａ）。ＮＬＳの存在は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＵＰの核局在化を説明する。肝臓ステージ発達におけるＬＩＮＵＰの重要性をさらに研究するために、遺伝子ノックアウトアプローチを使用した。

【0081】

（実施例２）
Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ＬＩＮＵＰは、肝臓ステージ発達に極めて重要である。
Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ肝臓ステージ発達におけるＬＩＮＵＰ発現の必須性を研究するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、ＬＩＮＵＰ遺伝子をＰ．ｙｏｅｌｉｉゲノムから欠失させた（図２Ａ）。シゾントのトランスフェクション、マウスにおけるピリメタミンでのｉｎ ｖｉｖｏ陽性薬物選択、および薬物耐性寄生生物の単離の後に、遺伝子ノックアウトを、特異的プライマーを使用して、単離したゲノムＤＮＡにおけるＰＣＲによって確認した。

【0082】

【表2】

【0083】

Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－寄生生物をクローニングし、ｃ３およびｃ５の２つのクローンを、まず、下流表現型分析に使用した。２つのクローンを、まず、発達の血液ステージ成長（図２Ｂ）および蚊ステージの間に野生型親と比較し、生物学的複製物実験において、全体的なオーシスト数（図２Ｃ）、ならびにオーシスト存在度（図２Ｄ）、および蚊１匹当たりの唾液腺スポロゾイト（図２Ｅ）に統計学的差はなく、ＬＩＮＵＰの欠失が、ライフサイクルの蚊ステージに影響を及ぼさなかったことが示唆された。これは、ＬＩＮＵＰの発現が、中期から後期の肝臓ステージになるまで見られなかったため、予測されていた。

【0084】

肝臓ステージ発達が、ＬＩＮＵＰの欠失によって影響を受けるかどうかを判定するために、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ野生型およびｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを、感染したＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊の唾液腺から単離し、アウトブレッドＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス、ならびに感受性インブレッド株ＢＡＬＢ／ｃＪおよびＢＡＬＢ／ｃＢｙＪを含む実験室マウスの群に静脈内注射した（表３）。

【0085】

【表3】

【0086】

日数単位での血液ステージ感染までの時間を、次いで、ギムザ染色した薄層血液スメアから判定した。５０，０００個の野生型スポロゾイトを感染させたすべてのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、すべてが、３日目に血液ステージ感染を示したが、一方で、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを感染させた場合には、１０匹中９匹のマウスが血液ステージ感染を示し、マウスは感染後８日目および１０日目に感染状態となり、顕在性（patency）までに大きな遅延があったため、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージは、重度に弱毒化されていることが示唆された（図３）。同様に、５０，０００個の野生型スポロゾイトを感染させたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスは、すべてが、３日目に血液ステージ感染を示し、一方でＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを感染させた２０匹のマウスのうち９匹だけが、血液ステージ感染を示し、感染までの日数は、８～１０日目の範囲に及んだ（表３）。ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける用量漸増研究により、肝臓ステージ弱毒化のさらなる根拠が判明した。マウスに、１，０００、１０，０００、および５０，０００個のスポロゾイトを感染させた。野生型スポロゾイトを感染させたマウスは、すべてが、４日目（１，０００）、３～４日目（１０，０００）、および３日目（５０，０００）に血液ステージ感染を示したが、一方で、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイト感染については、１０匹中１匹のマウスだけが、１２日目に血液ステージ感染を示し（１，０００）、２０匹中７匹が、７～１２日目に血液ステージ感染を示し（１０，０００）、１０匹中５匹が、７～９日目に顕在となった（５０，０００）（表３）。したがって、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－寄生生物は、肝臓ステージ発達の間に重度に弱毒化される。

【0087】

（実施例３）
Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージ成長は低減され、赤血球外メロゾイト形成は弱毒化される。
Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージの弱毒化をさらに研究するために、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに、２５０，０００個のＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを静脈内感染させた。マウスを、感染後（２４時間、３６時間、および４８時間）の時点で安楽死させ、肝臓を摘出し、灌流させ、固定し、切片にし、ＩＦＡに供して、サイズおよびタンパク質／ＤＮＡ発現パターンの両方を、野生型感染と比較して判定した（図３）。２４時間の時点では、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージは、野生型とサイズが同程度であると見られた（図３Ａ）。しかしながら、３６時間の時点では、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージは、野生型よりも統計学的に小さかった（図３Ａ）。サイズの減少は、４８時間の時点ではさらに顕著であり（図３Ａ）、この時点で、タンパク質／ＤＮＡ発現における明白な差もまた確認された。４８時間の時点では、ミトコンドリアおよびアピコプラストの分岐は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージでは、野生型と比較して低減されていた（図３Ｂ）。加えて、赤血球外メロゾイトを表す寄生生物形質膜マーカーＭＳＰ１の発現パターンもまた、異常であり（図３Ｃ）、不完全なサイトメア形成を示した。さらに、完全に成熟したメロゾイトの内膜複合体の一部であるＭＴＩＰの発現は、野生型肝臓ステージの１７％に見られたが、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージでは７％にしか見られず、ＭＴＩＰ発現を示したＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージではその発現は異常であった（図３Ｄ）。また、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージでは赤血球外メロゾイトの形成の間に生じる大規模な核分裂の根拠もなかった。とはいえ、一部のマウスはＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイト注射後に肝臓ステージ感染を示しているため、メロゾイトはＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージから放出される可能性がある。したがって、わずかな事例において、生存性赤血球外メロゾイトが形成される可能性がある。

【0088】

（実施例４）
Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトでのマウスの免疫付与により、野生型チャレンジから防御される。
肝臓ステージ発達の間に停止するげっ歯動物マラリアＧＡＰは、野生型スポロゾイトチャレンジから防御することができる強力な免疫原である［２６～２８］。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトでの感受性ＢＡＬＣ／ｃＪマウスの免疫付与が、チャレンジから防御し得るかどうかを判定するために、マウスの群を、１，０００または１０，０００個のいずれかのＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトで静脈内免疫付与したか、または未感染の蚊に由来する同等の体積の唾液腺抽出物で疑似免疫付与した（表４）。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイト感染後に肝臓ステージ感染を示さなかったマウスのみを、最終的に、野生型スポロゾイトでチャレンジした。マウスは、およそ３３日間離して２回免疫付与し、次いで、さらに３４日後に、１０，０００個の野生型スポロゾイトの静脈内注射でチャレンジした。唾液腺抽出物で免疫付与したマウスは、すべてが、チャレンジ後３～４日で血液ステージの感染状態となった（表４）。

【0089】

【表4】

【0090】

１，０００個のＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトで２回免疫付与した９匹のマウスのうち６匹は、チャレンジから防御され、残りの３匹のマウスは、血液ステージ感染までの有意な遅延が示され、チャレンジ後８～１０日目に感染状態となった（表４）。１０，０００個のＰ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトで２回免疫付与したすべてのマウス（１３匹）は、チャレンジ後に防御された。この結果は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｎｕｐ^－ＧＡＰでの免疫付与が、有意な野生型スポロゾイトチャレンジからマウスを防御する高度に有効な免疫応答をもたらすことを示す。

【0091】

（実施例５）
ＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスにおけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－寄生生物の表現型ブレイクスルー分析：
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを、感染したＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊の唾液腺から単離した。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージの分析のために、１×１０^６個のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４および１×１０^６個のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを、１群当たり４匹のＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスに、静脈内（後眼窩）注射した。肝臓を、５日目および７日目に摘出し、ＩＦＡに使用した（図６Ａ）。ＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスにおいてＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－の血液ステージへの移行を評価するために、クローンに由来する１×１０^６個のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを、それぞれ、１群当たり１匹および３匹のＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスに、静脈内注射した。６日目および７日目に、４００μｌの７０％ ＲＢＣを、静脈内注射して、肝臓ステージ寄生生物の血液への移行を可能にした。７日目にヒトＲＢＣ再増殖の４時間後に、マウスを安楽死させ、心臓穿刺によって血液を採取し、それぞれのマウスから５０μｌの血液を、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析に使用して、寄生生物１８Ｓ ＲＮＡを検出した。血液を、無性別培地において３回洗浄し、パックされたＲＢＣ体積と同等の体積のヒトＲＢＣを添加し、血液をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に移した。毎日新しい培地を置き換え、培養物を、最大１０日間、２～３日ごとに重層スメアによって寄生生物の存在について分析した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物由来の試料を、１０日後に、ｑＲＴ－ＰＣＲによって１８Ｓ ｒＲＮＡの存在について分析した。

【0092】

Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを注射した３匹のマウスの値は、０から１×１０^４の範囲に及び、移行における重度の弱毒化を示した（図６Ｂ）。瀉血した動物から得られた血液を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に入れ、７日後、スポロゾイト注射後１４日目に試料採取した。この期間におけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４野生型寄生生物複製は著しく、血液１ｍｌ当たり７×１０^８個の１８Ｓ ｒＲＮＡのコピーをもたらし、これは１００倍を上回る増加であり（図６Ｂ）、寄生生物は、ギムザ染色した薄層血液スメアの評価によって示された。対照的に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを注射したマウスに由来する血液の培養では、寄生生物バイオマスに有意な増加は示されず、血液１ｍｌ当たり０～２×１０^４個の１８Ｓ ｒＲＮＡのコピーであった（図６Ｂ）。この結果は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－スポロゾイトを注射したマウスに由来する血液中の寄生生物バイオマスの初期定量が、生存性赤血球外メロゾイトではなく、弱毒化されたおよび非生存性肝臓ステージの寄生生物に由来する寄生生物ｒＲＮＡのマウスの血流中への放出に起因していたことを示唆する。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－肝臓ステージ弱毒化をさらに評価するために、肝臓ＲＮＡ１ｎｇ当たりの１８Ｓ ｒＲＮＡのコピー数として測定される寄生生物バイオマスを、移行実験に使用したマウスにおいて判定した（図６Ｃ）。これは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｌｉｎｕｐ^－により、肝臓ステージバイオマスが、野生型と比較して低減されており、これが、ＩＦＡによって見られる赤血球外メロゾイトの異常な成熟に起因する可能性が高いことを示唆した（図５Ｂ）。

【0093】

（実施例６）
ＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスにおけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２寄生生物の表現型ブレイクスルー分析
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２スポロゾイトを、感染したＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊の唾液腺から単離した。ＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスにおいてＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２の血液ステージへの移行を評価するために、１×１０^６個の無菌凍結保存Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＮＦ５４（ＰＦＳＰＺ）および無菌凍結保存Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２（ＰＦＳＰＺ ＬＡＲＣ２）のスポロゾイトを、それぞれ、４匹および６匹のＦＲＧ ＮＯＤ ｈｕＨｅｐマウスに静脈内注射した（図１０Ａ）。６日目および７日目に、４００μｌの７０％ ＲＢＣを、静脈内注射して、肝臓ステージ寄生生物の血液への移行を可能にした。７日目にヒトＲＢＣ再増殖の４時間後に、マウスを安楽死させ、心臓穿刺によって血液を採取し、それぞれのマウスから５０μｌの血液をｑＲＴ－ＰＣＲ分析に使用して、寄生生物１８Ｓ ＲＮＡを検出した。血液を、無性別培地において３回洗浄し、パックされたＲＢＣ体積と同等の体積のヒトＲＢＣを添加し、血液をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に移した。毎日新しい培地を置き換え、培養物を、最大６週間、２～３日ごとに重層スメアによって寄生生物の存在について分析した。

【0094】

７日目に、ＰｆＳＰＺを感染させたマウスの寄生生物密度は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｑＲＴ－ＰＣＲにより、１０^３～１０^６個の寄生生物同等物／ｍｌの範囲に及んだ（図１０Ｂおよび表５）。

【0095】

【表5】

【0096】

血液ステージ寄生生物は、ＰＦＳＰＺを感染させた４匹すべてのマウスにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養への移行から１～３日以内に、ギムザ染色したスメアによって検出された（表５）。対照的に、ＰｆＳＰＺ ＬＡＲＣ２を感染させた６匹すべてのマウスにおいて、ギムザ染色した薄層スメアによって寄生生物は検出されなかった。７日目に、ＰｆＳＰＺ ＬＡＲＣ２を感染させたマウスの寄生生物密度は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｑＲＴ－ＰＣＲにより０～１０^３個の寄生生物同等物／ｍｌの範囲に及び、これにより、寄生生物１８Ｓ ｒＲＮＡが、非生存性および弱毒化されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２の肝臓ステージ寄生生物から血流中に放出されることが示唆される。しかしながら、生存性赤血球外メロゾイトは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＬＡＲＣ２において形成されない。感染したマウスの肝臓もまた、ＲＮＡを抽出するため、およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｑＲＴ－ＰＣＲによる寄生生物肝臓量の分析のために、７日目に摘出した。寄生生物肝臓負荷量を、総肝臓ＲＮＡ１μｇ当たりのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ １８Ｓ ｒＲＮＡのｌｏｇ１０コピー数として示す（図１０）。

【0097】

（実施例７）
ＧＭＰ製造と適合性となるように成長パラメーターを最適化し、無菌ＰｆＳＰＺ－ＬＡＲＣ２ワクチンの産生、精製、および凍結保存を示す。
生きた無菌の精製および凍結保存されたＧＭＰ品質のＰｆＳＰＺ－ＬＡＲＣ２ワクチンの産生が達成されており、これは遺伝子的に弱毒化されたＰｆ寄生生物のライフサイクルステップに従い、ここで、スポロゾイトは、生物学的系、インタクトな無菌蚊の唾液腺において産生される。これは、マスターセルバンクからのＰｆガメトサイトおよびＡ．ｓｔｅｐｈｅｎｓｉのコロニーからの無菌蚊の同時産生を必要とする。Ｐｆを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、ガメトサイトを産生させた。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを感染させたＲＢＣを、未感染のＲＢＣおよび補充済ＲＰＭＩと混合した。これらを、次いで、補充済ＲＰＭＩを含む（６ウェルの）培養プレートのウェルに入れ、培養物を拡大させた。培養物中でガメトサイトの産生を開始させるために、完全成長培地（１０％ヒトＯ＋血清および３６７μＭのヒポキサンチンを補充したＲＰＭＩ１６４０）を添加し、毎日交換した。誘導培養試料からのギムザ染色した薄層血液スメアを、ガメトサイト成長をモニタリングするために調べた。ステージＶのガメトサイトの数を、ガメトサイト産生開始後１４日目から１９日目に評価した。培養物を、蚊に吸血させるための感染性吸血液の調製に選択した。感染性吸血液中のガメトサイトを、無菌卵、幼虫、および蛹から培養した無菌成虫蚊に吸血させた。

【0098】

無菌蚊産生は、蚊ライフサイクルのすべてのステージを含み、卵の殺菌および溶液の調製で開始され、蚊の吸血準備が整ったときに終了する（米国特許第８，８０２，９１９号）。人工膜を、容器の口全体に設置し、オートクレーブした。容器を、およそ３５～３７℃に保ち、成虫蚊を導入した。Ｐｆガメトサイトに感染した血液を膜に添加し、蚊に、ガメトサイトに感染した吸血液を３０分間吸血させた。吸血後に、蚊を、インキュベーターに戻し、２６℃、７７％相対湿度、１２時間の明：暗サイクルで維持した。

【0099】

感染した無菌成虫蚊を、次いで、解剖し、唾液腺を摘出し、スポロゾイトを抽出し、記載されるように精製した。製剤化した無菌の精製されたＰｆＳＰＦワクチンを、次いで、凍結保存した。凍結保存は、２×ＣＰＡを１：１の比で添加することにより開始した。調製物を、２０μＬのアリコートで低温バイアルに分注した。バイアルを－１５０℃よりも低い凍結温度に冷却する複数ステップのプロセスである定速凍結（rate freezing）によって、バイアルを凍結保存のために調製した。低温バイアルを、最終的に、－１５０℃～－１９６℃である液体窒素蒸気相（ＬＮＶＰ）における保管に移した。

【0100】

ＰｆＳＰＺ－ＬＡＲＣ２ワクチンの２つの別個の調製物の評価を、表６に示す。

【0101】

【表6】

２億個の無菌の精製されたＰｆＳＰＺ－ＬＡＲＣ２を、バイアル１つ当たり１０^６個のＰｆＳＰＺ－ＬＡＲＣ２でバイアルに入れた。

【0102】

【表7-1】

【表7-2】

【表7-3】

【0103】

【表8】

【0104】

【表9】

【0105】

【表10-1】

【表10-2】

【表10-3】

【0106】

【表11】

【0107】

例示的な実施形態が、例示され記載されているが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な変更がそこに行われてもよいことが理解されるであろう。

【0108】

参考文献
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排他的所有権または特権が主張される本発明の実施形態は、以下のとおりに定義される：

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C-E】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B-C】

【図7A-1】

【図7A-2】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図9A-B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【配列表】

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【国際調査報告】