特表 2024-531409 抗ＣＣＲ８抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】抗ＣＣＲ８抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240822BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240822BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240822BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20240822BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P35/00

G01N33/574 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024510434

(86)(22)【出願日】2022-08-19

(85)【翻訳文提出日】2024-04-17

(86)【国際出願番号】 CN2022113739

(87)【国際公開番号】W WO2023020621

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/113913

(32)【優先日】2021-08-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524074633

【氏名又は名称】ハイファイバイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】プリジャン， ジュリー

(72)【発明者】

【氏名】ベルトラミネリ， ニコラ アルトゥーロ アルド

(72)【発明者】

【氏名】エロウズ， サミ

(72)【発明者】

【氏名】エイドリアン， フランシスコ

(72)【発明者】

【氏名】シュヴァイツァー， リアン

(72)【発明者】

【氏名】ルー， ユン－ユエ

(72)【発明者】

【氏名】フルトン， ロス ベイン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4B065AA92X

4B065AB01

4B065AB05

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA08

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

抗ＣＣＲ８抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に記載される。抗ＣＣＲ８抗体およびその抗原結合フラグメントをコードする核酸、抗ＣＣＲ８抗体およびその抗原結合フラグメントを含む組成物、ならびに癌の処置または予防を必要とする対象において癌を処置または予防するために抗ＣＣＲ８抗体およびその抗原結合フラグメントを産生および使用する方法も本明細書に記載される。上記抗ＣＣＲ８抗体およびその抗原結合フラグメントは、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８）に特異的に結合する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（１）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；
（２）それぞれ、配列番号１３、２、１４、４、２８、および６；
（３）それぞれ、配列番号１３、２、１５、４、５、および６；
（４）それぞれ、配列番号１６、１７、１８、２９、３０、および６；
（５）それぞれ、配列番号１９、２０、２１、４、５、および６；
（６）それぞれ、配列番号２２、２３、２４、３１、５、および３２；または
（７）それぞれ、配列番号２５、２６、２７、３３、３４、および３５；
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８）、好ましくはヒトＣＣＲ８に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

配列番号７、３６、３８、４０、４２、４４、もしくは４６と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号８、３７、３９、４１、４３、４５、もしくは４７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

（１）配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号３６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号３８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号４０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４１のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号４２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（６）配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４５のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（７）配列番号４６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ、および／またはヒトであるかもしくはヒト化されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、
（１）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６；
（２）それぞれ、配列番号１、２、４９、４、５、および６；
（３）それぞれ、配列番号１、２、４９、５０、５１、および６；
（４）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；または
（５）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、請求項４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号１０、６１、６２、もしくは６３と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、
（１）配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号５３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号５４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（６）配列番号５９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む、請求項６に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を通じてエフェクター媒介性腫瘍細胞溶解を誘導し；かつ／またはコンジュゲートされた薬物の動員を誘導し；かつ／または癌を死滅させる効果を有する別のｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントと二重特異性抗体を形成することができる、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがカニクイザルＣＣＲ８に特異的に結合する、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸。

【請求項12】

請求項１０に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸。

【請求項13】

請求項１１または１２に記載の単離された核酸を含むベクター。

【請求項14】

請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項15】

請求項１～９のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１０に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。

【請求項16】

癌細胞表面上のＣＣＲ８の標的化し、および／または癌の処置を必要とする対象において、癌を処置する方法であって、請求項１５に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項17】

前記癌が、例えば、固形腫瘍、好ましくは浸潤性Ｔ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくは浸潤性Ｔｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくはＣＣＲ８を発現する非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、最も好ましくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞浸潤が生じたＣＣＲ８を過剰発現する浸潤性の非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記癌が、肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、および黒色腫からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

前記対象がＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇ細胞を含む、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

請求項１～９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１０に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを産生する方法であって、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む細胞を、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを産生する条件下で培養することと、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを前記細胞または培養物から回収することと、を含む、方法。

【請求項21】

請求項１～９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは請求項１０に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を製造する方法であって、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを薬学的に許容され得る担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、方法。

【請求項22】

対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定する方法であって、前記方法は、
ａ．前記対象からサンプルを得ることと、
ｂ．前記サンプルを請求項１～９のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることと、
ｃ．前記対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定することと
を含む、方法。

【請求項23】

前記サンプルが組織サンプルまたは血液サンプルであり、任意選択的に前記組織サンプルが癌組織サンプルである、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記サンプルがＴｒｅｇ細胞を含む、請求項２２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年８月２０日に出願され、現在は取下げられている国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１１３９１３号に基づく米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での優先権の利益を主張している。先の出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされ、参照によりその全体が本出願の開示に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、単離された抗ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８）モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、抗体をコードする核酸および発現ベクター、ベクターを含有する組換え細胞、ならびに抗体を含む組成物に関する。抗体を作製する方法、ならびに癌および／または関連する合併症を含む疾患を処置するために抗体を使用する方法も提供される。

【0003】

電子的に提出された配列表の参照
本出願は、ファイル名が「０６５７９８．６ＷＯ１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」で、作成日が２０２１年８月６日である、４９ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
ＣＣＲ８は、ＣＣＬ１またはＣＣＬ１８勾配下で細胞遊走を媒介するケモカイン受容体である（Ｉｓｌａｍら、ＪＥＭ２１０（１０）：１８８９－１８９８（２０１３））。最近、ＣＣＲ８は、循環中のＴｒｅｇと比較して腫瘍内に存在するＴｒｅｇでかなり高い発現を有しかつ他のＴ細胞集団では発現がないかまたは非常に低い（それぞれ細胞傷害性Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞）、ヒト癌における腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞（ＴＩＴＲ）の非常に特異的な細胞表面マーカーとして同定された。さらに、ＣＣＲ８は、ＦｏｘＰ３ｈｉｇｈ、ＣＤ２５ｈｉｇｈ、ＴＩＧＩＴ＋、ＬＡＧ３＋を発現し、高ＩＬ－１０およびＴＧＦ－βを放出する高免疫抑制性Ｔｒｅｇ上に主に発現される。ＣＣＲ８＋Ｔｒｅｇを枯渇させることは、免疫抑制性サイトカインを減少させ、腫瘍誘発性微小環境を調節して抗腫瘍免疫を回復させるであろう。興味深いことに、乳癌または膵癌を有する患者において、高いＣＣＲ８＋Ｔｒｅｇ数は、疾患のより進行した病期および全生存率がおそらく低下していることと相関していた。したがって、ＣＣＲ８は、ＣＣＲ８陽性癌を処置しかつ潜在的に治癒するための癌免疫療法の理想的な標的である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｉｓｌａｍら、ＪＥＭ２１０（１０）：１８８９－１８９８（２０１３）

【発明の概要】

【0006】

発明の簡単な要旨
一般的な一態様において、本発明は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８）に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（１）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；
（２）それぞれ、配列番号１３、２、１４、４、２８、および６；
（３）それぞれ、配列番号１３、２、１５、４、５、および６；
（４）それぞれ、配列番号１６、１７、１８、２９、３０、および６；
（５）それぞれ、配列番号１９、２０、２１、４、５、および６；
（６）それぞれ、配列番号２２、２３、２４、３１、５、および３２；または
（７）それぞれ、配列番号２５、２６、２７、３３、３４、および３５；
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８）、好ましくはヒトＣＣＲ８に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

【0007】

ある実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７、３６、３８、４０、４２、４４、もしくは４６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号８、３７、３９、４１、４３、４５、もしくは４７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0008】

ある実施形態において、単離された抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（１）配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号３６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号３８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号４０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４１のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号４２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（６）配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４５のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（７）配列番号４６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む。

【0009】

ある実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントはＣＣＲ８に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を通じてエフェクター媒介性腫瘍細胞溶解を誘導し、および／またはコンジュゲートされた薬物の活性を媒介し、および／または癌を死滅させる効果を有する別のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントと二重特異性抗体を形成することができる。

【0010】

ある実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、キメラまたはヒトであるかもしくはヒト化されている。

【0011】

ある実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（１）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６；
（２）それぞれ、配列番号１、２、４９、４、５、および６；
（３）それぞれ、配列番号１、２、４９、５０、５１、および６；
（４）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；または
（５）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。

【0012】

ある実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号１０、６１、６２、もしくは６３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0013】

ある実施形態において、単離された抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（１）配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号５３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号５４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（６）配列番号５９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む。

【0014】

ある実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、カニクイザルＣＣＲ８に特異的に結合する。

【0015】

本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む単離された二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。

【0016】

本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸も提供される。

【0017】

本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸を含むベクターも提供される。

【0018】

本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸を含むベクターを含む宿主細胞も提供される。

【0019】

ある実施形態において、本発明の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは単離された二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が提供される。

【0020】

癌細胞表面上でのＣ－Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）の特異的な標的化を必要とする対象の癌細胞表面上でＣ－Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）を特異的に標的化する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法も提供される。

【0021】

癌の処置を必要とする対象において癌を処置する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法も提供される。癌は、例えば、固形腫瘍、好ましくは浸潤性Ｔ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくは浸潤性Ｔｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくはＣＣＲ８を発現する非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、最も好ましくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞浸潤が生じたＣＣＲ８を過剰発現する浸潤性の非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍であり得る。癌の例は、例えば、肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、肝臓癌、腎臓癌、および黒色腫から選択することができるが、これらに限定されない。ある実施形態において、対象は、例えば、ＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇ細胞を含み得る。

【0022】

本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを産生する方法も提供される。本方法は、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸を含む細胞を、該モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを産生する条件下で培養することと、該モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを該細胞または培養物から回収することとを含む。

【0023】

本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を製造する方法も提供される。本方法は、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを薬学的に許容され得る担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む。

【0024】

対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定する方法も提供される。本方法は、（ａ）対象からサンプルを得ることと、（ｂ）該サンプルを本発明の抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることと、（ｃ）該対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定することとを含む。ある実施形態において、サンプルは組織サンプルである。組織サンプルは、例えば、癌組織サンプルであり得る。ある実施形態において、サンプルは血液サンプルである。ある実施形態において、サンプルはＴｒｅｇ細胞を含む。

【0025】

前述の概要、ならびに本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解されよう。しかしながら、本出願は、図面に示された正確な実施形態に限定されないことを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１Ａ～１Ｃは、抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体がｎＭ未満のＥＣ_５０でＣＣＲ８発現細胞に特異的に結合することを示す。図１Ａは、ＣＣＲ８．ＣＨＯ細胞への親抗体の結合を示す。図１Ｂは、親細胞への親抗体の結合を示す。図１Ｃは、図１Ａおよび１Ｂで測定されたＥＣ５０をまとめた表である。

【0027】

【図2】図２は、抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体が、Ｎ末端エピトープ、ならびにタンパク質立体配座に関与するｈＣＣＲ８ループ１を認識し、ｈＣＣＲ４を認識しないことを示す。上：キメラコンストラクトの図（黒色：ｈＣＣＲ８、灰色：ｈＣＣＲ４）；下：コンストラクトに関連する結合プロファイル。

【0028】

【図3A-B】図３Ａ～３Ｃは、抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体がヒトＣＣＲ８タンパク質に結合し、マウスおよび／またはカニクイザルＣＣＲ８タンパク質と交差反応し得ることを示す。図３Ａは、ヒト、マウスおよびカニクイザルＣＣＲ８タンパク質に結合する抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体を示す。図３Ｂは、ＨＦＢ１１－２１およびＨＦＢ１１－１９のＥＣ５０を示す。図３Ｃは、ＨＦＢ１１－２１およびＨＦＢ１１－２のＥＣ５０を示す。

【図3C】図３Ａ～３Ｃは、抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体がヒトＣＣＲ８タンパク質に結合し、マウスおよび／またはカニクイザルＣＣＲ８タンパク質と交差反応し得ることを示す。図３Ａは、ヒト、マウスおよびカニクイザルＣＣＲ８タンパク質に結合する抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体を示す。図３Ｂは、ＨＦＢ１１－２１およびＨＦＢ１１－１９のＥＣ５０を示す。図３Ｃは、ＨＦＢ１１－２１およびＨＦＢ１１－２のＥＣ５０を示す。

【0029】

【図4】図４Ａ～４Ｂは、抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体についての異なるＣＣＬ１ブロッキングプロファイル（図４Ａ）および関連するＩＣ_５０表（図４Ｂ）を示す。カニクイザル交差反応性抗体はｈＣＣＬ１をブロッキングせず、むしろ強いｈＣＣＲ８結合抗体はｈＣＣＬ１をブロッキングする。

【0030】

【図5A-F】図５Ａ～５Ｇは、抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体が細胞内Ｃａ^２＋フラックスを阻害することを示す。図５Ａは、緩衝液の存在下でのＣａ^２＋変化を示す。図５Ｂは、１ｎＭ ＣＣＬ１の存在下でのＣａ^２＋変化を示す。図５Ｃは、１ｎＭ ＣＣＬ１＋ＨＦＢ１１－３の存在下におけるＣａ^２＋変化を示す。図５Ｄは、１ｎＭ ＣＣＬ１＋ＨＦＢ１１－１０の存在下におけるＣａ^２＋変化を示す。図５Ｅは、緩衝液＋１０ｎＭ ＣＣＬ１の存在下におけるＣａ^２＋変化を示す。図５Ｆは、１０ｎＭ ＣＣＬ１＋ＨＦＢ１１－３の存在下におけるＣａ^２＋変化を示す。図５Ｇは、１０ｎＭ ＣＣＬ１＋ＨＦＢ１１－１０の存在下におけるＣａ^２＋変化を示す。

【図5G】図５Ａ～５Ｇは、抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体が細胞内Ｃａ^２＋フラックスを阻害することを示す。図５Ａは、緩衝液の存在下でのＣａ^２＋変化を示す。図５Ｂは、１ｎＭ ＣＣＬ１の存在下でのＣａ^２＋変化を示す。図５Ｃは、１ｎＭ ＣＣＬ１＋ＨＦＢ１１－３の存在下におけるＣａ^２＋変化を示す。図５Ｄは、１ｎＭ ＣＣＬ１＋ＨＦＢ１１－１０の存在下におけるＣａ^２＋変化を示す。図５Ｅは、緩衝液＋１０ｎＭ ＣＣＬ１の存在下におけるＣａ^２＋変化を示す。図５Ｆは、１０ｎＭ ＣＣＬ１＋ＨＦＢ１１－３の存在下におけるＣａ^２＋変化を示す。図５Ｇは、１０ｎＭ ＣＣＬ１＋ＨＦＢ１１－１０の存在下におけるＣａ^２＋変化を示す。

【0031】

【図6】図６Ａ～６Ｂは、抗ＣＣＲ８抗体が、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにおいてＣＤ１６に強力に関与し、ＣＤ１６改変細胞を通じてＡＤＣＣを媒介することを示す。図６Ａは、ルシフェラーゼ基質との５分間のインキュベーション後のＲＬＵシグナルを示す。図６Ｂは、すべての抗体についてのＥＣ_５０およびＥｍａｘ値の表を示す。

【0032】

【図7】図７Ａ～７Ｂは、ＡＤＣＣ増強フォーマットのヒト化抗ＣＣＲ８抗体がＣＣＲ８発現細胞に特異的に結合することを示す。図７Ａは、ＭＦＩシグナルを示す。図７Ｂは、すべての抗体についてのＥＣ_５０値の表を示す。

【0033】

【図8A】図８Ａ～８Ｂは、ヒト化抗ＣＣＲ８抗体がＣＣＲ８発現細胞へのＣＣＬ１結合をブロッキングすることを示す。図８Ａは、ＣＣＬ１ブロッキングの割合を示す。図８Ｂは、すべての抗体についてのＩＣ_５０値の表を示す。

【図8B】図８Ａ～８Ｂは、ヒト化抗ＣＣＲ８抗体がＣＣＲ８発現細胞へのＣＣＬ１結合をブロッキングすることを示す。図８Ａは、ＣＣＬ１ブロッキングの割合を示す。図８Ｂは、すべての抗体についてのＩＣ_５０値の表を示す。

【0034】

【図9】図９は、ヒト化ＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７抗ＣＣＲ８抗体が、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにおいてＣＤ１６ＦおよびＶバリアントの両方に関与することを示す。

【0035】

【図10A】図１０Ａ～１０Ｂは、ヒト化抗ＣＣＲ８抗体がＣＣＲ８発現細胞上のＡＤＣＣを媒介することを示す。図１０Ａは、特異的溶解の割合を示す。図１０Ｂは、すべての抗体についてのＥＣ_５０値の表を示す。

【図10B】図１０Ａ～１０Ｂは、ヒト化抗ＣＣＲ８抗体がＣＣＲ８発現細胞上のＡＤＣＣを媒介することを示す。図１０Ａは、特異的溶解の割合を示す。図１０Ｂは、すべての抗体についてのＥＣ_５０値の表を示す。

【0036】

【図11A-B】図１１Ａ～１１Ｇは、抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ＨＦＢ１０１１１０のインビトロ特性評価を示す。図１１Ａは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、高コピー（ＣＨＯＫ１－ｈＣＣＲ８、約３０，０００の受容体／細胞、左）または低コピー（Ｍ３００．１９－ｈＣＣＲ８、約２，０００の受容体／細胞、右）細胞へのＨＦＢ１０１１１０の結合を示す。図１１Ｂは、Ｍ３００．１９－ｈＣＣＲ８細胞に対するＨＦＢ１０１１１０のＡＤＣＣ活性を示す。図１１Ｃは、関連するケモカイン受容体ＣＣＲ４へのＨＦＢ１０１１１０の結合をフローサイトメトリーによって評価したことを示す。図１１Ｄは、ＨＦＢ１０１１１０によって認識されたＣＣＲ８の領域を同定するためのドメインスワップ実験を示す。図１１Ｅは、フローサイトメトリーによって測定した、ＨＦＢ１０１１１０によるｈＣＣＲ８へのｈＣＣＬ１結合の遮断を示す。図１１Ｆは、トランスウエル遊走アッセイによって測定した場合の、組換えｈＣＣＬ１によって誘導されたＣＣＲ８＋細胞の走化性のＨＦＢ１０１１１０媒介性遮断を示す。図１１Ｇは、ｈＣＣＬ１のＣＣＲ８＋細胞への添加によって誘導されたカルシウムフラックスのＨＦＢ１０１１１０媒介性遮断を示す。

【図11C-E】図１１Ａ～１１Ｇは、抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ＨＦＢ１０１１１０のインビトロ特性評価を示す。図１１Ａは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、高コピー（ＣＨＯＫ１－ｈＣＣＲ８、約３０，０００の受容体／細胞、左）または低コピー（Ｍ３００．１９－ｈＣＣＲ８、約２，０００の受容体／細胞、右）細胞へのＨＦＢ１０１１１０の結合を示す。図１１Ｂは、Ｍ３００．１９－ｈＣＣＲ８細胞に対するＨＦＢ１０１１１０のＡＤＣＣ活性を示す。図１１Ｃは、関連するケモカイン受容体ＣＣＲ４へのＨＦＢ１０１１１０の結合をフローサイトメトリーによって評価したことを示す。図１１Ｄは、ＨＦＢ１０１１１０によって認識されたＣＣＲ８の領域を同定するためのドメインスワップ実験を示す。図１１Ｅは、フローサイトメトリーによって測定した、ＨＦＢ１０１１１０によるｈＣＣＲ８へのｈＣＣＬ１結合の遮断を示す。図１１Ｆは、トランスウエル遊走アッセイによって測定した場合の、組換えｈＣＣＬ１によって誘導されたＣＣＲ８＋細胞の走化性のＨＦＢ１０１１１０媒介性遮断を示す。図１１Ｇは、ｈＣＣＬ１のＣＣＲ８＋細胞への添加によって誘導されたカルシウムフラックスのＨＦＢ１０１１１０媒介性遮断を示す。

【図11F-G】図１１Ａ～１１Ｇは、抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ＨＦＢ１０１１１０のインビトロ特性評価を示す。図１１Ａは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、高コピー（ＣＨＯＫ１－ｈＣＣＲ８、約３０，０００の受容体／細胞、左）または低コピー（Ｍ３００．１９－ｈＣＣＲ８、約２，０００の受容体／細胞、右）細胞へのＨＦＢ１０１１１０の結合を示す。図１１Ｂは、Ｍ３００．１９－ｈＣＣＲ８細胞に対するＨＦＢ１０１１１０のＡＤＣＣ活性を示す。図１１Ｃは、関連するケモカイン受容体ＣＣＲ４へのＨＦＢ１０１１１０の結合をフローサイトメトリーによって評価したことを示す。図１１Ｄは、ＨＦＢ１０１１１０によって認識されたＣＣＲ８の領域を同定するためのドメインスワップ実験を示す。図１１Ｅは、フローサイトメトリーによって測定した、ＨＦＢ１０１１１０によるｈＣＣＲ８へのｈＣＣＬ１結合の遮断を示す。図１１Ｆは、トランスウエル遊走アッセイによって測定した場合の、組換えｈＣＣＬ１によって誘導されたＣＣＲ８＋細胞の走化性のＨＦＢ１０１１１０媒介性遮断を示す。図１１Ｇは、ｈＣＣＬ１のＣＣＲ８＋細胞への添加によって誘導されたカルシウムフラックスのＨＦＢ１０１１１０媒介性遮断を示す。

【0037】

【図12】図１２は、ヒト化ＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７抗ＣＣＲ８抗体がＣＣＲ８＋発現細胞のＡＤＣＰを媒介することを示す。

【0038】

【図13】図１３Ａ～１３Ｃは、ヒト化抗ＣＣＲ８抗体がｈＣＣＲ８－ＫＩマウスにおいてＭＣ３８細胞に対する抗腫瘍活性を媒介することを示す。図１３Ａは、ＭＧ０５３アイソタイプでの処置後の腫瘍体積を示す。図１３Ｂは、Ｈｚバリアントでの処置後の腫瘍体積を示す。図１３Ｃは、ＭＧ０５３アイソタイプまたはＨｚバリアントによる処置後の腫瘍体積の比較を示す。

【0039】

【図14】図１４Ａ～１４Ｆは、ヒト化抗ＣＣＲ８抗体療法がインビボで腫瘍微小環境を再プログラムすることを示す。図１４Ａは、アイソタイプまたはＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７での処置後のＣＤ４＋中のＴｒｅｇの割合を示す。図１４Ｂは、アイソタイプまたはＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７での処置後のＣＤ４＋中のＣＤ４＋Ｔエフェクターの割合を示す。図１４Ｃは、アイソタイプまたはＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７での処置後のＣＤ３＋中のＣＤ８＋の割合を示す。図１４ Ｄは、アイソタイプまたはＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７での処置後のＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比を示す。図１４Ｅは、アイソタイプまたはＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７での処置後のＣＤ４５＋中のナチュラルキラーの割合を示す。図１４Ｆは、アイソタイプまたはＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７での処置後のＴｒｅｇ中のＣＣＲ８＋の割合を示す。

【0040】

【図15】図１５Ａ～１５Ｂは、腎細胞癌（ＲＣＣ）患者および肺癌患者からのヒト原発腫瘍からのＴ細胞集団におけるＣＣＲ８発現を示す。各点は、個々の患者からのデータを表す（図１５Ａ）。図１５Ｂは、ＲＣＣ患者のＴＩＬからのＣＤ８＋（ＣＤ８＋ＣＤ３＋）、Ｔｅｆｆ（ＦｏｘＰ ３－ＣＤ４＋ＣＤ３＋）、およびＴｒｅｇ（ＦｏｘＰ ３＋ＣＤ４＋ＣＤ３＋）におけるＣＣＲ８発現をオーバーレイしたヒストグラムを示す。

【0041】

【図16】図１６は、健康および悪性ＰＢＭＣにおける循環からのＴ細胞集団におけるＣＣＲ８発現を示す。

【0042】

【図17A-C】図１７Ａ～１７Ｅは、ＲＣＣ患者（ｎ＝１３）からの一次ヒトＴＩＬに対するヒト化ＨＦＢ１１－１０抗体によって媒介されるエクスビボＡＤＣＣ活性を示す。図１７Ａは、サンプル採取およびＡＤＣＣアッセイの概略を示す。図１７Ｂは、異なるＴ細胞サブセットの枯渇を示す。各点は、個々の患者からのデータを表す。図１７Ｃは、代表的なＲＣＣ患者からのＴＩＬにおいて、アイソタイプ群からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ ３＋ＴＩＧＩＴ＋細胞としてゲーティングされたＴｒｅｇ集団対５０ｎＭのＨＦＢ１１－１０Ｈｚ抗体で処理した群を示すドットプロットを示す。図１７Ｄは、ＨＦＢ１０１１１０のＴｒｅｇ枯渇活性の用量応答を示す。図１７Ｅは、添加された外因性ＮＫ細胞の量の関数としてのＡＤＣＣアッセイにおけるＴｒｅｇの枯渇を示す。

【図17D-E】図１７Ａ～１７Ｅは、ＲＣＣ患者（ｎ＝１３）からの一次ヒトＴＩＬに対するヒト化ＨＦＢ１１－１０抗体によって媒介されるエクスビボＡＤＣＣ活性を示す。図１７Ａは、サンプル採取およびＡＤＣＣアッセイの概略を示す。図１７Ｂは、異なるＴ細胞サブセットの枯渇を示す。各点は、個々の患者からのデータを表す。図１７Ｃは、代表的なＲＣＣ患者からのＴＩＬにおいて、アイソタイプ群からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ ３＋ＴＩＧＩＴ＋細胞としてゲーティングされたＴｒｅｇ集団対５０ｎＭのＨＦＢ１１－１０Ｈｚ抗体で処理した群を示すドットプロットを示す。図１７Ｄは、ＨＦＢ１０１１１０のＴｒｅｇ枯渇活性の用量応答を示す。図１７Ｅは、添加された外因性ＮＫ細胞の量の関数としてのＡＤＣＣアッセイにおけるＴｒｅｇの枯渇を示す。

【0043】

【図18A-B】図１８Ａ～１８Ｃは、は、安全性および薬物動態研究を示す。図１８Ａは、カニクイザルにおける単回投与ＰＫ研究の概略図を示す。図１８Ｂは、カニクイザルにおけるＨＦＢ１０１１１０の血清ＰＫプロファイルを示す。図１８Ｃは、可溶性抗体フォーマットを使用したヒトＰＢＭＣからのインビトロサイトカイン放出研究を示す。

【図18C】図１８Ａ～１８Ｃは、は、安全性および薬物動態研究を示す。図１８Ａは、カニクイザルにおける単回投与ＰＫ研究の概略図を示す。図１８Ｂは、カニクイザルにおけるＨＦＢ１０１１１０の血清ＰＫプロファイルを示す。図１８Ｃは、可溶性抗体フォーマットを使用したヒトＰＢＭＣからのインビトロサイトカイン放出研究を示す。

【発明を実施するための形態】

【0044】

発明の詳細な説明
様々な刊行物、論文および特許が、背景および明細書全体を通して引用または記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、行為、材料、デバイス、物品などの議論は、本発明の文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの事項のいずれかまたはすべてが、開示または特許請求される発明に関して先行技術の一部を形成することを認めるものではない。

【0045】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。その他、本明細書で使用されるある用語は、本明細書で規定される意味を有する。

【0046】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数形を含む。

【0047】

別途明記されない限り、本明細書に記載される濃度または濃度範囲などの任意の数値は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、列挙された値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用は、文脈上特に明記されていない限り、すべての可能な部分範囲、その範囲内のすべての個々の数値、そのような範囲内の整数および値の一部を明確に含む。

【0048】

特に明記されない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の要素のすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態に相当する多くの等価物を、日常的な実験だけを使用して認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明に包含されることが意図されている。

【0049】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらの任意の他の変形は、記載された整数または整数群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数群の排除を意味するものではなく、非排他的またはオープンエンドであることを意図している。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されていないかまたはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、明示的に反対の記載がない限り、「または」は、包括的なまたはを指し、排他的なまたはを指すのではない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真（または存在する）、Ｂが偽（または存在しない）、Ａが偽（または存在しない）、Ｂが真（または存在する）、およびＡとＢとの両方が真（または存在する）。

【0050】

本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素間の接続的な用語「および／または」は、個々の選択肢と組み合わされた選択肢との両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「および／または」によって結合されている場合、第１の選択肢は、第２の要素なしの第１の要素の適用可能性を指す。第２の選択肢は、第１の要素なしの第２の要素の適用可能性を指す。第３の選択肢は、第１および第２の要素を一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のいずれか１つは、その意味の範囲内にあり、したがって、本明細書で使用される「および／または」という用語の要件を満たすと理解される。２つ以上の選択肢の同時適用性も、その意味の範囲内に含まれ、したがって、「および／または」という用語の要件を満たすと理解される。

【0051】

本明細書で使用される場合、本明細書および特許請求の範囲を通して使用される「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語、または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」もしくは「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの変形は、列挙された任意の整数または整数群を含むが、指定された方法、構造、または組成物に追加の整数または整数群を追加することはできないことを示す。

【0052】

本明細書で使用される場合、本明細書および特許請求の範囲を通して使用される「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語、または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」もしくは「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの変形は、任意の列挙された整数または整数群を含むこと、および指定された方法、構造または組成物の基本的または新規な特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数または整数群を任意に含むことを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。

【0053】

本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられるが、これらに限定されない。

【0054】

「右（ｒｉｇｈｔ）」、「左（ｌｅｆｔ）」、「下（ｌｏｗｅｒ）」、および「上（ｕｐｐｅｒ）」という単語は、参照される図面内の方向を指定する。

【0055】

好ましい発明の構成要素の寸法または特性に言及するときに本明細書で使用される「約」、「およそ」、「一般に」、「実質的に」などの用語は、記載された寸法／特性が厳密な境界またはパラメータではなく、当業者によって理解されるように、機能的に同じまたは同様であるそれらからの小さな変形を排除しないことを示すことも理解されたい。最低限、数値パラメータを含むそのような参照は、当該技術分野で受け入れられている数学的および工業的な原則（例えば、丸め、測定または他の系統誤差、製造公差など）を使用して、最下位桁を変化させないような変形を含む。

【0056】

２つもしくはそれを超える核酸またはポリペプチド配列（例えば、抗ＣＣＲ８抗体およびそれらをコードするポリヌクレオチド、ＣＣＲ８ポリペプチドおよびそれらをコードするＣＣＲ８ポリヌクレオチド）の文脈における「同一」という用語またはパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定されるように、最大対応性のために比較されアラインメントされたときに、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定されたパーセンテージを有する２つもしくはそれを超える配列または部分配列を指す。

【0057】

配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

【0058】

比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８１；２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０；４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８；８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．（ウィスコンシン州マディソン）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。

【0059】

パーセント配列同一性およびパーセント配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３－４１０と、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７；２５：３３８９－３４０２とにそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、クエリ配列中の長さＷの短いワードを識別することによってハイスコアリング配列対（ＨＳＰ）を識別することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされたときにいくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけ出すために検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。

【0060】

累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対のマッチング残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリング行列を使用して累積スコアを計算する。ワードヒットの各方向への伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下したときに停止され、累積スコアは、１つもしくはそれを超える負のスコアリング残基アラインメントの蓄積に起因して０もしくはそれ未満になるか、またはいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８９；８９：１０９１５を参照されたい）を使用する。

【0061】

パーセント配列同一性の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３；９０：５８７３－５７８７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると見なされる。

【0062】

２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。

【0063】

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、生物学的成分（例えば、核酸、ペプチドまたはタンパク質）が、その成分が天然に存在する生物の他の生物学的成分、すなわち他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離されているか、それらとは別に産生されているか、それらから精製されていることを意味する。したがって、「単離された」核酸、ペプチドおよびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチドおよびタンパク質は、組成物の一部であってもよく、組成物が核酸、ペプチド、またはタンパク質の本来の環境の一部でない場合には単離されたままである。この用語はまた、宿主細胞中での組換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸を包含する。

【0064】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」または「核酸」と呼ばれ、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」は、限定されないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１つもしくはそれを超える修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの異常な塩基を含む。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して様々な修飾を行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に見られるような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い比較的短い核酸鎖を包含する。

【0065】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、セグメントの複製または発現をもたらすように別の核酸セグメントが作動可能に挿入され得るレプリコンである。

【0066】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、任意の種類の細胞、例えば、初代細胞、培養中の細胞、または細胞株からの細胞であり得る。一実施形態において、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子でトランスフェクトされた細胞である。別の実施形態において、「宿主細胞」は、そのようなトランスフェクト細胞の子孫または潜在的子孫である。細胞の子孫は、例えば、後続の世代で起こり得る突然変異もしくは環境の影響、または核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組み込みに起因して、親細胞と同一であってもなくてもよい。

【0067】

本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、ＲＮＡへの遺伝子の転写を包含する。この用語はまた、ＲＮＡの１つまたはそれを超えるポリペプチドへの翻訳を包含し、さらに、すべての自然発生の転写後および翻訳後修飾を包含する。発現された抗体は、宿主細胞の細胞質内、細胞培養物の成長培地などの細胞外環境内にあり得、または細胞膜に固定され得る。

【0068】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。アミノ酸残基についての従来の１文字または３文字コードが本明細書で使用される。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用することができる。ポリマーは直鎖または分岐鎖であり得、それは修飾アミノ酸を含み得、それは非アミノ酸によって中断され得る。この用語はまた、天然にまたは介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾が挙げられる。例えば、アミノ酸の１つまたはそれを超える類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ならびに当該技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも定義に含まれる。

【0069】

本明細書に記載されるペプチド配列は、ペプチドのＮ末端領域が左側にあり、Ｃ末端領域が右側にある通常の慣例に従って書かれている。アミノ酸の異性体形態は公知であるが、特に明記されない限り、表されるのはアミノ酸のＬ型である。

【0070】

抗体

【0071】

本発明は、一般に、単離された抗ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体８抗体、抗体をコードする核酸および発現ベクター、ベクターを含有する組換え細胞、抗体を発現する組換え細胞、および抗体を含む組成物に関する。抗体を作製する方法、および癌などの疾患を処置するために抗体を使用する方法も開示される。本発明の抗体は、ＣＣＲ８に対する高親和性結合、ＣＣＲ８に対する高特異性、ＣＣＲ８を発現する細胞に対する抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激する能力、ならびに単独でまたは他の抗癌療法と組み合わせて投与した場合の対象および動物モデルにおける腫瘍成長を阻害する能力を含むがこれらに限定されない１つまたはそれを超える望ましい機能的特性を有する。

【0072】

一般的な態様において、本発明は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８）に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0073】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は広義で使用され、ヒト、ヒト化、複合抗体およびキメラ抗体を含む免疫グロブリンまたは抗体分子、ならびにモノクローナルまたはポリクローナルである抗体フラグメントを含む。一般に、抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質またはペプチド鎖である。抗体構造は周知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）に割り当てることができる。ＩｇＡおよびＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてさらに細分される。したがって、本発明の抗体は、５つの主要なクラスまたは対応するサブクラスのいずれかであり得る。好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。脊椎動物種の抗体軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なる種類、すなわちカッパおよびラムダのうちの１つに割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、カッパ軽鎖定常ドメインまたはラムダ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、ラットまたはヒト抗体からの重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含む。重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域から構成される抗原結合領域を含み、その各々が３つのドメイン（すなわち、相補性決定領域１～３；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含む。軽鎖可変領域ドメインは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３とも呼ばれ、重鎖可変領域ドメインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３とも呼ばれる。

【0074】

本明細書で使用される場合、「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＣＣＲ８に特異的に結合する単離された抗体は、ＣＣＲ８に結合しない抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。

【0075】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る自然発生の突然変異を除いて同一である。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術によって、または組換えＤＮＡ法によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスまたはラットなどのトランスジェニック非ヒト動物から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。

【0076】

本明細書で使用される場合、「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体フラグメント、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つもしくはそれを超えるＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、または抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントなどを指す。抗原結合フラグメントは、親抗体または親抗体フラグメントが結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態によれば、抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＦｄセグメントを含む。他の特定の実施形態によれば、抗原結合フラグメントは、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）を含む。

【0077】

本明細書で使用される場合、「一本鎖抗体」という用語は、約１５～約２０アミノ酸の短いペプチドによって連結された重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、当該分野における従来の一本鎖抗体を指す。本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体」という用語は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含むか、または重鎖可変領域のみを含む、当該分野における従来の単一ドメイン抗体を指す。

【0078】

本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生される抗体、または当該技術分野で公知の任意の技術を使用して作製されたヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義には、インタクトもしくは全長抗体、そのフラグメント、ならびに／または少なくとも１つのヒト重鎖および／もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。

【0079】

本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」および／または「ヒト化抗原結合ドメイン」という用語は、抗体の抗原結合特性は保持されるが、ヒトの体におけるその抗原性は低下するように、ヒト抗体の配列相同性との配列相同性を増加させるように修飾された非ヒト抗体を指す。

【0080】

本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つまたはそれを超える種に由来する抗体を指す。軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、多くの場合、所望の特異性、親和性、および能力を有する哺乳動物の１つの種（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方で、定常領域は、その種における免疫応答の誘発を回避するために、哺乳動物の別の種（例えば、ヒト）に由来する抗体の配列に対応する。

【0081】

本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」という用語は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、複数の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。一実施形態において、第１および第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態において、第１および第２のエピトープは重複するか、または実質的に重複する。一実施形態において、第１および第２のエピトープは重複しないか、または実質的に重複しない。一実施形態において、第１および第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。一実施形態において、多重特異性抗体は、第３、第４または第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、または四重特異性抗体分子である。

【0082】

本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、２つ以下のエピトープまたは２つの抗原に結合する多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。一実施形態において、第１および第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態において、第１および第２のエピトープは重複するか、または実質的に重複する。一実施形態において、第１および第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。一実施形態において、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列とを含む。一実施形態において、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントとを含む。一実施形態において、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ、またはそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ、またはそのフラグメントとを含む。一実施形態において、第１のエピトープはＣＣＲ８に位置し、第２のエピトープはＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３、および／または他の腫瘍関連免疫抑制剤または表面抗原に位置する。

【0083】

本明細書で使用される場合、「ＣＣＲ８に特異的に結合する」抗体は、１×１０^－７Ｍもしくはそれ未満、好ましくは１×１０^－８Ｍもしくはそれ未満、より好ましくは５×１０^－９Ｍもしくはそれ未満、１×１０^－９Ｍもしくはそれ未満、５×１０^－１０Ｍもしくはそれ未満、または１×１０^－１０Ｍもしくはそれ未満のＫＤで、ＣＣＲ８、好ましくはヒトＣＣＲ８に結合する抗体および／または抗原結合ドメインを指す。ある実施形態において、抗体および／または抗原結合ドメインはカニクイザルＣＣＲ８に結合する。「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａ（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）の比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を使用して決定することができる。例えば、抗体のＫＤは、表面プラズモン共鳴を使用することによって、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによって、またはＯｃｔｅｔ ＲＥＤ ９６システムなどのバイオレイヤー干渉法技術を使用することによって決定することができる。

【0084】

抗体のＫＤの値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性が高い。

【0085】

本明細書で使用される場合、「ＩＣ_５０」という用語は、本発明のモノクローナルまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントの最大半量阻害濃度を指す。ＩＣ_５０は、細胞におけるＣＣＲ８へのＣＣＬ１の結合を阻害するかまたはＣＣＲ８の機能を阻害するための本発明のモノクローナルまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効力の尺度である。ある実施形態において、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、約１０^－７Ｍ未満、約１０^－８Ｍ未満、約１０^－９Ｍ未満、約１０^－１０Ｍ未満、約１０^－１１Ｍ未満、約１０^－１２Ｍ未満、または約１０^－１３Ｍ未満のＫＤを有する。

【0086】

本明細書で使用される場合、「ＥＣ_５０」という用語は、本発明のモノクローナルまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントの最大半量有効濃度を指す。ＥＣ_５０は、指定された曝露時間にわたってベースラインと最大値との中間で生物学的応答（すなわち、細胞死）を誘導するためのモノクローナルまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントの濃度を指す。ある実施形態において、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、約１μＭ未満、約１０００ｎＭ～約１００ｎＭ、約１００ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１ｎＭ、約１０００ｐＭ～約５００ｐＭ、約５００ｐＭ～約２００ｐＭ、約２００ｐＭ未満、約２００ｐＭ～約１５０ｐＭ、約２００ｐＭ～約１００ｐＭ、約１００ｐＭ～約１０ｐＭ、または約１０ｐＭ～約１ｐＭのＥＣ_５０を有する。

【0087】

特定の態様によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントまたは抗原結合ドメインは、
（１）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；
（２）それぞれ、配列番号１３、２、１４、４、２８、および６；
（３）それぞれ、配列番号１３、２、１５、４、５、および６；
（４）それぞれ、配列番号１６、１７、１８、２９、３０、および６；
（５）それぞれ、配列番号１９、２０、２１、４、５、および６；
（６）それぞれ、配列番号２２、２３、２４、３１、５、および３２；または
（７）それぞれ、配列番号２５、２６、２７、３３、３４、および３５；
のポリペプチド配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその抗原結合ドメインは、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８）、好ましくはヒトＣＣＲ８に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0088】

別の特定の態様によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７、３６、３８、４０、４２、４４、もしくは４６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号８、３７、３９、４１、４３、４５、もしくは４７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。好ましい一実施形態によれば、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とをそれぞれ含む。

【0089】

特定の実施形態によれば、単離された抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（１）配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号３６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号３８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号４０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４１のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号４２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（６）配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４５のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（７）配列番号４６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む。

【0090】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0091】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１３、２、１４、４、２８、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0092】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１３、２、１５、４、５、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３８と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３９と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0093】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１６、１７、１８、２９、３０、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４０と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４１と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４１のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0094】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１９、２０、２１、４、５、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0095】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号２２、２３、２４、３１、５、および３２のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４５と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４５のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0096】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号２５、２６、２７、３３、３４、および３５のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４７と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0097】

別の特定の態様によれば、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントであって、該モノクローナル抗体または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントはキメラである、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントに関する。

【0098】

別の特定の態様によれば、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントであって、該モノクローナル抗体または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントはヒトであるか、もしくはヒト化されている、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントに関する。

【0099】

別の特定の態様によれば、本発明は、
（１）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６；
（２）それぞれ、配列番号１、２、４９、４、５、および６；
（３）それぞれ、配列番号１、２、４９、５０、５１、および６；
（４）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；または
（５）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0100】

別の特定の態様によれば、本発明は、配列番号９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号１０、６１、６２、もしくは６３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0101】

別の特定の態様によれば、ヒト化抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（１）配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号５３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号５４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（６）配列番号５９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む。

【0102】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0103】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１、２、４９、４、５、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0104】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１、２、４９、５０、５１、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0105】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１、２、４９、５０、５１、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0106】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0107】

一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６のポリペプチド配列を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。別の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５９と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％もしくはそれを超えて、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0108】

別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントおよび／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸に関する。タンパク質のコード配列は、タンパク質のアミノ酸配列を変更することなく変更（例えば、置換、欠失、挿入など）し得ることが当業者によって理解されるであろう。したがって、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列は、タンパク質のアミノ酸配列を変更することなく変更することができることが当業者によって理解されるであろう。

【0109】

別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントおよび／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸を含むベクターに関する。プラスミド、コスミド、ファージベクターまたはウイルスベクターなど、本開示を考慮して当業者に公知の任意のベクターを使用することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意の要素、例えば、プロモーター、リボソーム結合要素、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、および複製起点を含み得る。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または抑制性プロモーターであり得る。細胞に核酸を送達することができるいくつかの発現ベクターは当該技術分野で公知であり、細胞中での抗体またはその抗原結合フラグメントの産生のために本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術または人工遺伝子合成を使用して、本発明の実施形態による組換え発現ベクターを生成することができる。

【0110】

別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントおよび／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸を含む宿主細胞に関する。本開示を考慮して当業者に公知の任意の宿主細胞を、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの組換え発現のために使用することができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、大腸菌ＴＧ１またはＢＬ２１細胞（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体の発現のため）、ＣＨＯ－ＤＧ４４またはＣＨＯ－Ｋ１細胞またはＨＥＫ２９３細胞（例えば、全長ＩｇＧ抗体の発現のため）である。特定の実施形態によれば、組換え発現ベクターは、化学トランスフェクション、熱ショック、またはエレクトロポレーションなどの従来の方法によって宿主細胞に形質転換され、組換え核酸が効果的に発現されるように宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれる。

【0111】

別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメントおよび／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを産生する方法であって、該モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸を含む細胞を、本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを産生する条件下で培養することと、該モノクローナル抗体および／または二重特異性抗体もしくはそれらの抗原結合性フラグメントを該細胞または細胞培養物から（例えば、上清から）から回収することと、を含む方法に関する。発現されたモノクローナル抗体および／または二重特異性抗体もしくはそれらの抗原結合フラグメントは、当該分野で公知でありかつ本明細書に記載されるような従来の技術に従って、細胞から採取され、精製され得る。

【0112】

医薬組成物

【0113】

別の一般的な態様において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメント、単離されたポリヌクレオチドおよび／または単離された本発明のポリペプチドと、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物に関する。

【0114】

本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、本発明の単離されたポリヌクレオチド、本発明の単離されたポリペプチド、抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、および／または本発明の二重特異性抗体を薬学的に許容され得る担体と共に含む生成物を意味する。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、および／または二重特異性抗体、ならびにそれらを含む組成物はまた、本明細書で言及される治療適用のための医薬品の製造に有用である。

【0115】

本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、任意の医薬品添加剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、マイクロスフェア、リポソームカプセル化、または医薬製剤に使用するための当該技術分野で周知の他の材料を指す。担体、医薬品添加剤または希釈剤の特性は、特定の用途のための投与経路に依存することが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、本発明による組成物の有効性または本発明による組成物の生物学的活性を妨げない非毒性物質を指す。特定の実施形態によれば、本開示を考慮して、抗体医薬組成物での使用に適した任意の薬学的に許容され得る担体を本発明で使用することができる。

【0116】

薬学的に許容され得る担体を含む薬学的有効成分の製剤は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば、第２１版（２００５）、およびそれより後の版）が挙げられる。更なる成分の非限定的な例としては、緩衝液、希釈剤、溶媒、張度調節剤、保存剤、安定剤、およびキレート剤が挙げられる。１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体を、本発明の医薬組成物の製剤化に使用することができる。

【0117】

本発明の一実施形態において、医薬組成物は液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ゲルなどを含み得る。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０％ｗ／ｗの水、または少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％ｗ／ｗの水を含む。

【0118】

一実施形態において、医薬組成物は、例えば注射用デバイス（例えば、シリンジまたは注入ポンプ）を介して注射することができる注射剤として製剤化することができる。注射は、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、硝子体内、または静脈内に送達することができる。

【0119】

別の実施形態において、医薬組成物は、固体製剤、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥組成物であり、それらは、そのまま使用することができるか、または医師もしくは患者が使用前に溶媒、および／または希釈剤をそれらに添加する。固体剤形は、錠剤、例えば圧縮錠剤、および／またはコーティングされた錠剤、ならびにカプセル剤（例えば、硬質または軟質ゼラチンカプセル）を含み得る。医薬組成物は、例えば、再構成のための小袋、糖衣錠、粉末、顆粒、ロゼンジ、または粉末の形態であってもよい。

【0120】

剤形は即時放出型であってもよく、この場合、剤形は水溶性もしくは分散性担体を含むことができ、または剤形は遅延放出型、持続放出型もしくは修飾放出型であってもよく、この場合、剤形は、剤形の消化管内または皮膚下での溶解速度を調節する水不溶性ポリマーを含むことができる。

【0121】

他の実施形態において、医薬組成物は、鼻腔内、頬内、または舌下に送達することができる。

【0122】

水性製剤中のｐＨは、ｐＨ３～ｐＨ１０であり得る。本発明の一実施形態において、製剤のｐＨは、約７．０～約９．５である。本発明の別の実施形態において、製剤のｐＨは、約３．０～約７．０である。

【0123】

本発明の別の実施形態において、医薬組成物は緩衝液を含む。緩衝液の非限定的な例としては、アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、クエン酸塩、リン酸水素二ナトリウム、フマル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸塩、酒石酸、トリシン、およびトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、ならびにそれらの混合物が挙げられる。緩衝液は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、個々にまたは凝集して存在し得る。これらの特定の緩衝液の各々１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0124】

本発明の別の実施形態において、医薬組成物は保存剤を含む。保存剤の非限定的な例としては、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、４－ヒドロキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロルフェネシン、ｏ－クレゾール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、４－ヒドロキシ安息香酸エチル、イミドウレア、４－ヒドロキシ安息香酸メチル、フェノール、２－フェノキシエタノール、２－フェニルエタノール、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、デヒドロ酢酸ナトリウム、チオメロサール、およびそれらの混合物が挙げられる。保存剤は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、個々にまたは凝集して存在し得る。これらの特定の保存剤の各々１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0125】

本発明の別の実施形態において、医薬組成物は等張剤を含む。等張剤の非限定的な例としては、塩（例えば塩化ナトリウム）、アミノ酸（例えばグリシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびトレオニン）、アルジトール（例えばグリセロール、１，２－プロパンジオールプロピレングリコール）、１，３－プロパンジオール、および１，３－ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）、ならびにそれらの混合物が挙げられる。等張剤の他の例としては、糖が挙げられる。糖の非限定的な例は、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカン（例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファおよびベータ－ＨＰＣＤ、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、およびカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む）であり得る。等張剤の別の例は糖アルコールであり、「糖アルコール」という用語は、少なくとも１つの－ＯＨ基を有するＣ（４～８）炭化水素として定義される。糖アルコールの非限定的な例としては、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールが挙げられる。等張剤は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、個々にまたは凝集して存在し得る。これらの特定の等張剤の各々１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0126】

本発明の別の実施形態において、医薬組成物はキレート剤を含む。キレート剤の非限定的な例としては、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、およびそれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、個々にまたは凝集して存在し得る。これらの特定のキレート剤の各々１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0127】

本発明の別の実施形態において、医薬組成物は安定剤を含む。安定剤の非限定的な例としては、１つもしくはそれを超える凝集阻害剤、１つもしくはそれを超える酸化阻害剤、１つもしくはそれを超える界面活性剤、および／または１つもしくはそれを超えるプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。

【0128】

本発明の別の実施形態において、医薬組成物は、安定剤を含み、前述の安定剤は、カルボキシ－／ヒドロキシセルロースおよびその誘導体（例えばＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、ＨＰＣ－ＬおよびＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、２－メチルチオエタノール、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、塩（例えば塩化ナトリウム）、モノチオグリセロールなどの硫黄含有物質、またはチオグリコール酸である。安定剤は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、個々にまたは凝集して存在し得る。これらの特定の安定剤の各々１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0129】

本発明の更なる実施形態において、医薬組成物は、１つもしくはそれを超える界面活性剤、好ましくは界面活性剤、少なくとも１つの界面活性剤、または２つの異なる界面活性剤を含む。「界面活性剤」という用語は、水溶性（親水性）部分および脂溶性（親油性）部分から構成される任意の分子またはイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および／または双性イオン性界面活性剤からなる群から選択することができる。界面活性剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、個々にまたは凝集して存在し得る。これらの特定の界面活性剤の各々１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0130】

本発明の更なる実施形態において、医薬組成物は、１つもしくはそれを超えるプロテアーゼ阻害剤、例えば、ＥＤＴＡおよび／またはベンズアミジン塩酸（ＨＣｌ）を含む。プロテアーゼ阻害剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、個々にまたは凝集して存在し得る。これらの特異的プロテアーゼ阻害剤の各々１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。

【0131】

別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントおよび／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を製造する方法であって、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントおよび／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを薬学的に許容され得る担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む方法に関する。

【0132】

使用方法

【0133】

別の一般的な態様において、本発明は、癌の処置を必要とする対象において癌を処置する方法であって、本発明の抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体および／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。癌は、例えば、肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、および黒色腫から選択することができるが、これらに限定されない。

【0134】

いくつかの態様において、本発明は、腫瘍浸潤調節性Ｔ細胞（ＴＩＴＣ）枯渇の誘導を必要とする対象において腫瘍浸潤調節性Ｔ細胞（ＴＩＴＣ）枯渇を誘導する方法であって、本発明の抗ＣＣＲ８モノクローナルおよび／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。様々な態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む他のＴ細胞は、誘導された細胞枯渇の影響を受けない。他の態様において、本方法は、腫瘍微小環境の再プログラミングをさらに誘導する。様々な態様において、ＴＩＴＣ枯渇を誘導することは、ＣＣＲ－８発現癌細胞のナチュラルキラー（ＮＫ）媒介性死滅を誘導することを含む。他の態様において、ＮＫ媒介性死滅を誘導することは、ＴＩＴＣ誘導性免疫抑制を阻害することを含む。

【0135】

別の一般的な態様において、本発明は、細胞死滅を達成するために対象の癌細胞表面上のＣＣＲ８を標的化する方法であって、ＣＣＲ８に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントおよび／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本発明の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントおよび／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。ＣＣＲ８への抗ＣＣＲ８モノクローナルまたは二重特異性抗体もしくは抗原結合フラグメントの結合は、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または標的癌細胞の死をもたらす他の効果を媒介することができる。モノクローナルまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、例えば、コンジュゲートされた薬物を動員するのに役立つことができ、および／または別のモノクローナル抗体と二重特異性抗体を形成して、標的癌細胞の死を媒介することができる。

【0136】

ＣＣＲ８に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントの機能的活性は、当該技術分野で公知の方法および本明細書に記載される方法によって特徴付けることができる。ＣＣＲ８に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを特徴付けるための方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、およびＯｃｔｅｔＲｅｄ分析を含む親和性および特異性アッセイ、ならびにＦＡＣＳによる細胞（ＣＣＲ８でトランスフェクトされた細胞またはＣＣＲ８を天然に発現する細胞のいずれか）上のＣＣＲ８への抗体および抗原結合フラグメントの結合の検出を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、ＣＣＲ８に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを特徴付けるための方法は、以下に記載されるものを含む。

【0137】

別の一般的な態様において、本発明は、癌の処置を必要とする対象において癌を処置する方法であって、ＣＣＲ８に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントおよび／または二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。癌は、例えば、固形腫瘍、好ましくは浸潤性Ｔ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくは浸潤性Ｔｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくはＣＣＲ８を発現する非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、最も好ましくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞浸潤が生じたＣＣＲ８を過剰発現する浸潤性の非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍であり得る。癌は、例えば、肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、肝臓癌、腎臓癌、および黒色腫から選択することができるが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、対象は、例えば、ＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇを含み得る。

【0138】

抗ＣＣＲ８抗体またはその抗原結合フラグメントに関して本明細書で使用される場合、治療有効量は、それを必要とする対象において免疫応答を調節する抗ＣＣＲ８抗体またはその抗原結合フラグメントの量を意味する。また、抗ＣＣＲ８抗体またはその抗原結合フラグメントに関して本明細書で使用される場合、治療有効量は、疾患、障害、もしくは症状の処置をもたらす抗ＣＣＲ８抗体またはその抗原結合フラグメントの量を意味し、疾患、障害、もしくは症状の進行を予防もしくは遅延させるか、または疾患、障害、もしくは症状に関連する症候を軽減もしくは完全に緩和する。

【0139】

特定の実施形態によれば、処置される疾患、障害、または症状は癌である。癌は、例えば、固形腫瘍、好ましくは浸潤性Ｔ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくは浸潤性Ｔｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくはＣＣＲ８を発現する非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、最も好ましくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞浸潤が生じたＣＣＲ８を過剰発現する浸潤性の非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍であり得る。癌は、例えば、肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、肝臓癌、腎臓癌、および黒色腫から選択することができるが、これらに限定されない。

【0140】

特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれを超えて達成するのに十分な治療の量を指す：（ｉ）処置される疾患、障害もしくは症状、またはそれに関連する症候の重症度を低減もしくは改善すること；（ｉｉ）処置される疾患、障害もしくは症状、またはそれに関連する症候の持続期間を減少させること；（ｉｉｉ）処置される疾患、障害もしくは症状、またはそれに関連する症候の進行を予防すること；（ｉｖ）処置される疾患、障害もしくは症状、またはそれに関連する症候の後退を引き起こすこと；（ｖ）処置される疾患、障害もしくは症状、またはそれに関連する症候の発病または発症を予防すること；（ｖｉ）処置される疾患、障害もしくは症状、またはそれに関連する症候の再発を予防すること；（ｖｉｉ）処置される疾患、障害もしくは症状、またはそれに関連する症候を有する対象の入院を減少させること；（ｖｉｉｉ）処置される疾患、障害もしくは症状、またはそれに関連する症候を有する対象の入院期間を短縮すること；（ｉｘ）処置される疾患、障害もしくは症状、またはそれに関連する症候を有する対象の生存を増加させること；（ｘｉ）対象における処置される疾患、障害もしくは症状、またはそれに関連する症候を阻害または低減すること；および／または（ｘｉｉ）別の治療の予防効果または治療効果を増強または改善すること。

【0141】

治療有効量または投与量は、様々な要因、例えば、処置される疾患、障害または症状、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康を含む）、対象がヒトまたは動物であるか、投与される他の薬物、および処置が予防的または治療的であるかに応じて変化し得る。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するために最適に滴定される。

【0142】

特定の実施形態によれば、本明細書に記載される組成物は、対象への意図された投与経路に適しているように製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、静脈内、皮下、または筋肉内投与に適しているように製剤化することができる。

【0143】

本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語はすべて、癌に関連する少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善または逆転を指すことを意図しており、これは必ずしも対象において識別可能ではないが、対象において識別可能であり得る。「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語はまた、退縮を引き起こすこと、進行を妨げること、または疾患、障害、もしくは症状の進行を少なくとも遅らせることを指すことができる。特定の実施形態において、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、腫瘍またはより好ましくは癌などの疾患、障害、または症状に関連する１つもしくはそれを超える症候の緩和、発病もしくは発症の予防、または持続期間の短縮を指す。特定の実施形態において、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、疾患、障害、または症状の再発の予防を指す。特定の実施形態において、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、疾患、障害、または症状を有する対象の生存の増加を指す。特定の実施形態において、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、対象における疾患、障害、または症状の排除を指す。

【0144】

特定の実施形態によれば、癌の処置に使用される組成物が提供される。癌治療のために、提供される組成物は、化学療法、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ、抗ＨＥＲ－２ ｍＡｂ、抗ＣＤ１９ ｍＡｂ、抗ＣＤ３３ ｍＡｂ、抗ＣＤ４７ ｍＡｂ、抗ＣＤ７３ ｍＡｂ、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ、抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ、抗ＣＴＬＡ ｍＡｂ、抗ＴＮＦＲ２ ｍＡｂ、抗ＯＸ４０ ｍＡｂ、他の免疫腫瘍薬、抗血管新生剤、放射線療法、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、標的療法、他の抗癌薬、および／またはＰＤ１およびＰＤ－Ｌ１を含むがこれらに限定されない免疫調節標的を標的とする処置を含むがこれらに限定されない別の処置と組み合わせて使用することができる。ＣＣＲ８に対する抗体を使用して、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＬＡ、ＴＮＦＲ２、ＯＸ４０、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７３、ＣＤ４７、および／またはＣＤ３に対するパートナーｍＡｂを有する二重特異性抗体を構築することができる。ＣＣＲ８上の２つの異なるエピトープを認識する２つの抗体を使用して、ＣＣＲ８を発現する癌／腫瘍を処置するための二重特異性抗体を構築することもできる。

【0145】

本明細書で使用される場合、対象への２つ以上の治療の投与の文脈における「組み合わせて」という用語は、２つまたはそれを超える治療の使用を指す。「組み合わせて」という用語の使用は、治療が対象に投与される順序を制限しない。例えば、第１の治療（例えば、本明細書に記載される組成物）は、対象への第２の治療の投与の前に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、それと同時に、またはそれに続いて（例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、１６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後、または１２週間後）投与することができる。

【0146】

別の一般的な態様において、本発明は、対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定する方法に関する。本方法は、（ａ）対象からサンプルを得ることと、（ｂ）該サンプルを本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることと、（ｃ）該対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定することとを含む。

【0147】

本明細書で使用される場合、「サンプル」は、対象から単離された生物学的サンプルを指し、全血、血清、血漿、血球、内皮細胞、組織生検（例えば、癌組織）、リンパ液、腹水液、間質液、骨髄、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、汗、尿、または任意の他の分泌物、排泄物、または他の体液を含み得るが、これらに限定されない。「血液サンプル」は、血球、血清、および血漿を含む、全血またはその任意の画分を指す。サンプルは、例えば、Ｔｒｅｇ細胞を含み得る。

【0148】

ある実施形態において、対象におけるＣＣＲ８のレベルは、ウェスタンブロットアッセイ、免疫組織化学（ＩＨＣ）およびＥＬＩＳＡから選択されるアッセイを利用して決定することができるが、これらに限定されない。相対タンパク質レベルは、ウエスタンブロット分析およびＩＨＣを利用することによって決定することができ、絶対タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡを利用することによって決定することができる。ＣＣＲ８の相対レベルを決定する場合、ＣＣＲ８のレベルは、少なくとも２つのサンプル間、例えば、異なる時点での同じ対象からのサンプル間、同じ対象の異なる組織からのサンプル間、および／または異なる対象からのサンプル間で決定することができる。代替的に、ＥＬＩＳＡなどによってＣＣＲ８の絶対レベルを決定する場合、サンプルを試験する前にＥＬＩＳＡの標準を作製することによって、サンプル中のＣＣＲ８の絶対レベルを決定することができる。当業者は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを利用して対象からのサンプル中のＣＣＲ８のレベルを決定するためにどの分析技術を利用するかを理解するであろう。

【0149】

対象からのサンプル中のＣＣＲ８のレベルを決定する方法を利用することは、疾患における異常な（上昇、低下、または不十分な）ＣＣＲ８レベルを診断し、適切な治療決定をもたらすことができる。そのような疾患は癌であり得る。さらに、対象におけるＣＣＲ８のレベルを監視することによって、上で示した疾患を発病するリスクは、特定の疾患におけるおよび／または特定の疾患の進行中のＣＣＲ８のレベルの知識に基づいて決定することができる。
実施形態

【0150】

本発明はまた、以下の非限定的な実施形態を提供する。

【0151】

実施形態１は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（１）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；
（２）それぞれ、配列番号１３、２、１４、４、２８、および６；
（３）それぞれ、配列番号１３、２、１５、４、５、および６；
（４）それぞれ、配列番号１６、１７、１８、２９、３０、および６；
（５）それぞれ、配列番号１９、２０、２１、４、５、および６；
（６）それぞれ、配列番号２２、２３、２４、３１、５、および３２；または
（７）それぞれ、配列番号２５、２６、２７、３３、３４、および３５；
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ８、好ましくはヒトＣＣＲ８に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0152】

実施形態２は、配列番号７、３６、３８、４０、４２、４４、もしくは４６と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号８、３７、３９、４１、４３、４５、もしくは４７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態１の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0153】

実施形態３は、実施形態１または２の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（１）配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号３６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号３８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号４０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４１のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号４２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（６）配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４５のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（７）配列番号４６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0154】

実施形態４は、実施形態１～３のいずれか１つの単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体またはその抗原結合フラグメントはキメラ、および／またはヒトであるか、もしくはヒト化されている、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0155】

実施形態５は、実施形態４の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（１）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６；
（２）それぞれ、配列番号１、２、４９、４、５、および６；
（３）それぞれ、配列番号１、２、４９、５０、５１、および６；
（４）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；または
（５）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0156】

実施形態６は、実施形態５の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号１０、６１、６２、もしくは６３と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0157】

実施形態７は、実施形態６の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（１）配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号５３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号５４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（６）配列番号５９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0158】

実施形態８は、実施形態１～７のいずれか１つの単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を通じてエフェクター媒介性腫瘍細胞溶解を誘導し；かつ／またはコンジュゲートされた薬物の動員を誘導し；かつ／または癌を死滅させる効果を有する別のｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントと二重特異性抗体を形成することができる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0159】

実施形態９は、実施形態１～８のいずれか１つの単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントはカニクイザルＣＣＲ８に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0160】

実施形態１０は、実施形態１～９のいずれか１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、単離された二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0161】

実施形態１１は、実施形態１～９のいずれか１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸である。

【0162】

実施形態１２は、実施形態１０の二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸である。

【0163】

実施形態１３は、実施形態１１または１２の単離された核酸を含むベクターである。

【0164】

実施形態１４は、実施形態１３のベクターを含む宿主細胞である。

【0165】

実施形態１５は、実施形態１～９のいずれか１つの単離されたモノクローナル抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは実施形態１０の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物である。

【0166】

実施形態１６は、実施形態１５の医薬組成物を対象に投与することを含む、癌細胞表面上のＣＣＲ８を標的化し、および／または癌を処置する方法である。

【0167】

実施形態１７は、癌が、例えば、固形腫瘍、好ましくは浸潤性Ｔ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくは浸潤性Ｔｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくはＣＣＲ８を発現する非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、最も好ましくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞浸潤が生じたＣＣＲ８を過剰発現する浸潤性の非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍である、実施形態１６の方法である。

【0168】

実施形態１８は、癌が、肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、および黒色腫からなる群から選択される、実施形態１６または１７の方法である。

【0169】

実施形態１９は、対象がＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇ細胞を含む、実施形態１６から１８のいずれか１つの方法である。

【0170】

実施形態２０は、実施形態１～９のいずれか１つのモノクローナル抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは実施形態１０の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを産生する方法であって、該モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む細胞を、該モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを産生する条件下で培養することと、該モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを該細胞または培養物から回収することと、を含む方法である。

【0171】

実施形態２１は、実施形態１～９のいずれか１つのモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは実施形態１０の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を製造する方法であって、該モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを薬学的に許容され得る担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む方法である。

【0172】

実施形態２２は、対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定する方法であって、該方法は、
ａ．対象からサンプルを得ることと、
ｂ．サンプルを実施形態１～９のいずれか１つの単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることと、
ｃ．対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定することと
を含む方法である。

【0173】

実施形態２３は、サンプルが組織サンプルまたは血液サンプルであり、任意選択的に組織サンプルが癌組織サンプルである、実施形態２２の方法である。

【0174】

実施形態２４は、サンプルがＴｒｅｇ細胞を含む、実施形態２２の方法である。

【実施例】

【0175】

実施例１：抗体調製

【0176】

免疫：

【0177】

抗ＣＣＲ抗体を、Ｂａｌｂ／ｃマウスにＤＮＡを４回注射し、続いてｈＣＣＲ８受容体を発現する安定なＭ３００．１９細胞を２～４回ブーストして免疫することによって開発した。高い特異的力価（＞１０，０００）を示すマウスを、ＣｅｌｌｉＧｏ（商標）プラットフォームで単一Ｂ細胞選別に処理した。

【0178】

ＣｅｌｌｉＧｏプラットフォームによるＢ細胞選別：

【0179】

免疫したマウスからの脾細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で５日間、インビトロＸ－ｖｉｖｏ １５培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２×Ｌ－グルタミン、１０％低ＩｇＧ血清、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２および２．５μｇ／ｍＬ Ｒ８４８を補充）で活性化した。Ｂ細胞を、Ｐａｎ Ｂ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社；ドイツ国ノルトライン＝ヴェストファーレン州ベルギッシュグラートバハ）を使用して濃縮し、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社；マサチューセッツ州ウォルサム）で標識した後、ＨｉＦｉＢｉｏ Ｃｅｌｌｉｇｏプラットフォーム（ＨｉＦｉＢｉｏ社；マサチューセッツ州ケンブリッジ）を使用して選別した。細胞ベースのスクリーニングアッセイを、液滴中の標的細胞に結合する特異的Ｂ細胞を検出および選別するためにＨｉＦｉＢｉｏマイクロ流体技術を使用して開発した。

【0180】

ＶＨ／ＶＬを、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲによって液滴中の単一Ｂ細胞から増幅し、Ａｂｓｏｌｕｔｉｏｎ ＨｉＦｉｂｉｏソフトウェア（ＨｉＦｉｂｉｏ社）を使用して配列を分析した。

【0181】

キメラ抗体をヒトＩｇＧ１足場で産生し、親細胞と比較してＣＣＲ８高コピー細胞（安定なＣＣＲ８ ＣＨＯ－Ｋ１細胞株、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社；マサチューセッツ州ウォルサム）上の特異的結合について蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってスクリーニングした。

【0182】

２５の特異的抗ｈＣＣＲ８抗体の中で、可変の生物学的特性を有する抗体のパネルを同定した（図１～６）。

【0183】

抗体の配列を下記に提供する。

【0184】

【表1-1】

【表1-2】

【0185】

【表2】

【0186】

【表3】

【0187】

【表4】

【0188】

実施例２：抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体はＣＣＲ８発現細胞に特異的に結合する

【0189】

簡潔には、精製抗体（ＰＢＳ中３０ｍＭからの範囲、３倍希釈）を１×１０^５個の安定なＣＣＲ８発現ＣＨＯＫ１細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社；マサチューセッツ州ウォルサム）と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社；ドイツ国ベルギッシュグラートバハ）で洗浄した後、二次抗ヒトＡＦ６４７抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社；ペンシルバニア州ウェスト・グローブ）をＰＢＳ中１２ｎＭで３０分間インキュベートした。ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞ペレットを５０μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｆｏｒｅｃｙｔソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ社；ミシガン州アナーバー）を使用してｉＱｕｅサイトメータ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ社；ドイツ国ゲッティンゲン）でサンプルを分析した。単一細胞からのＡＦ６４７チャネルの蛍光の平均を図１に示す。

【0190】

親ＣＨＯＫ１細胞ではシグナルは検出されず、したがって、試験した抗体はｈＣＣＲ８に特異的であった（図１Ｂ）。図１Ａに示す滴定曲線から得られたＥＣ_５０値は、０．５～９ｎＭの範囲であった（図１Ｃ）。

【0191】

実施例３：抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体は、Ｎ末端ならびにタンパク質コンフォメーションに関与するループ１を認識した

【0192】

ＣＣＲ８のエピトープをマッピングするために、最も近いケモカイン受容体ＣＣＲ４（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ５１６７９（配列番号１２））に融合したヒトＣＣＲ８（Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ５１６８５（配列番号１１））の部分を含むキメラタンパク質を発現するコンストラクトを生成した。結果生じるタンパク質は、ヒトＣＣＲ４からのＮ末端ドメイン（配列番号１２のアミノ酸１～４０）、細胞外ドメイン１（（ＥＣＬ１）配列番号１２のアミノ酸１００～１１２）、細胞外ドメイン２（（ＥＣＬ２）配列番号１２のアミノ酸１７７～２０５）、または細胞外ドメイン３（（ＥＣＬ３）配列番号１２のアミノ酸２６９～２８６）を含み、残りの配列はヒトＣＣＲ８（配列番号１１）からのものである。コンストラクトを、切断可能な細胞内ＧＦＰタグを含むｐｃＤＮＡ３．１ベクター中で作製し、コンストラクトをＥｘｐｉＨＥＫ２９３細胞の表面に一過性に発現させた。精製抗体（５０ｎＭ）を、ヒト、マウス、またはカニクイザルＣＣＲ８－ＧＦＰタンパク質のいずれかで一過性にトランスフェクトした１×１０^５個のＥｘｐｉＨＥＫ２９３細胞と４℃で３０分間インキュベートした。洗浄した後、二次抗ヒトＡＦ６４７抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社；ペンシルバニア州ウェスト・グローブ）をＰＢＳ中１２ｎＭで３０分間インキュベートした。洗浄した後、細胞ペレットを５０μＬのＰＢＳに再懸濁し、Ｆｏｒｅｃｙｔソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ社；ミシガン州アナーバー）を使用してｉＱｕｅサイトメータ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ社；ドイツ国ゲッティンゲン）でサンプルを分析した。特異的シグナルの蛍光強度の平均を、図２のＧＦＰ＋細胞間で表す。

【0193】

すべての抗体はヒトＣＣＲ８に特異的であり、最も近いファミリーメンバーであるＣＣＲ４と交差反応しなかった。抗体は、ＣＣＲ８／ＣＣＲ４変異体に対して同様のプロファイルを示した。Ｎ末端ドメインがＣＣＲ４によって置き換えられると、抗ＣＣＲ８抗体は反応性を失った。結合活性は、細胞外ドメイン１（ＥＣＬ１）の置換時に強く減少した。しかしながら、抗体の大部分はカニクイザルＣＣＲ８と交差反応せず（図３）、ＥＣＬ１はヒトＣＣＲ８のものと１００％同一であることから、ＥＣＬ１ループはタンパク質コンフォメーションにおいて重要な役割を果たしたが、抗体のエピトープではない可能性があることが示唆された。

【0194】

ＥＣＬ２および３の置換による影響はなかったことから、生成された抗ＣＣＲ８抗体は、Ｎ末端ドメインに位置するエピトープを含むことが決定された。

【0195】

実施例４：抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体は、ヒトＣＣＲ８タンパク質に特異的であり、マウスおよび／またはカニクイザルＣＣＲ８受容体と交差反応することができる。

【0196】

簡潔には、精製抗体（５０ｎＭの飽和濃度、図３Ａ、または１００ｎＭからの濃度範囲、３倍希釈、図３Ｂ～３Ｃ）を、切断可能なリンカーを介してＧＦＰタンパク質に融合したヒト（配列番号１１；Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ５１６８５）、マウスＣＣＲ８（配列番号６４；Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ５６４８４）、またはカニクイザルＣＣＲ８（配列番号６５；Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｇ７ＮＹＪ２）のいずれかで一過性にトランスフェクトした１×１０^５個のＥｘｐｉＨＥＫ ２９３細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄した後、二次抗ヒトＡＦ６４７抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社；ペンシルバニア州ウェスト・グローブ）をＰＢＳ中１２ｎＭで３０分間インキュベートした。洗浄した後、細胞ペレットを５０μＬのＰＢＳに再懸濁し、Ｆｏｒｅｃｙｔソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ社、ミシガン州アナーバー）を使用してｉＱｕｅサイトメータ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ社、ドイツ国ゲッティンゲン）でフローサイトメトリーによってサンプルを分析した。ＧＦＰ＋細胞間の特異的シグナルについての蛍光強度の平均を図３Ａ～３Ｃに表す。飽和濃度で試験したすべての抗体を図３Ａに示す。マウスＣＣＲ８およびカニクイザルＣＣＲ８に対する交差反応性抗体の滴定曲線をそれぞれ図３Ｂおよび３Ｃに示す。

【0197】

抗ＣＣＲ８抗体間で異なる交差反応性プロファイルが観察された：ＨＦＢ１１－３、ＨＦＢ１１－５、ＨＦＢ１１－８およびＨＦＢ１１－１０を含む１つの主要なグループは、ヒトタンパク質にのみ特異的であり、他の種と交差反応しなかった。ＨＦＢ１１－２は、マウスＣＣＲ８タンパク質に対して交差反応性であった；ＨＦＢ１１－１９はカニクイザルＣＣＲ８タンパク質を認識した；ＨＦＢ１１－２１は、マウスＣＣＲ８タンパク質およびカニクイザルＣＣＲ８タンパク質の両方に結合することができた。これらの抗体は、Ｎ末端ドメイン間で異なるエピトープを認識すると考えられる。マウスＣＣＲ８抗体の滴定曲線は、サブナノモルのＥＣ_５０を有するＨＦＢ１１－２について同様の結合特性を実証したが、５３ｎＭのＥＣ_５０を有するＨＦＢ１１－２１についてはより低い結合効力を実証した（図３Ｂ）。一方、この抗体は、カニクイザルＣＣＲ８受容体に対するより高い結合特性を実証し、ＥＣ_５０は１５．８ｎＭであった。ＨＦＢ１１－１９は、カニクイザルＣＣＲ８に対するより強力なバインダーであり、ＥＣ_５０は１．８ｎＭである（図３Ｃ）。

【0198】

実施例５：抗ＣＣＲ８抗体はＣＣＲ８発現細胞へのＣＣＬ１結合をブロックする

【0199】

ヒトＣＣＲ８発現細胞へのＣＣＬ１結合をブロックする能力を評価した。いくつかの濃度（１００ｎＭから始まる希釈範囲）の抗ＣＣＲ８抗体を、安定なＣＣＲ８発現細胞（ＣＨＯＫ１、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）に４℃で３０分間添加した。ＭＡＣＳ緩衝液中で洗浄した後、３０ｎＭのｈＣＣＬ１－ＡＦ６４７（Ａｌｍａｃ社）を添加し、４℃で４５分間インキュベートした。ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、ペレット化した細胞を５０μＬに再懸濁した後、ｉＱｕｅサイトメータ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ社、ドイツ国ゲッティンゲン）およびＦｏｒｅｃｙｔソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ社、ミシガン州アナーバー）を使用してフローサイトメトリーによって読み取った。最大平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＣＣＬ１結合の１００％を反映するように抗体なしで得られた。ＡＦ６４７チャネルのＭＦＩを使用して、％ＣＣＬ１ブロッキングを計算した（式＝１００－（ＭＦＩ_サンプル＊１００／ＭＦＩ_{ＣＣＬ１単独}））。図４は、５／７抗ＣＣＲ８抗体がＣＣＲ８へのＣＣＬ１結合をブロックすることを実証する結果を示す。

【0200】

両方ともカニクイザル交差反応性であったＨＦＢ１１－１９およびＨＦＢ－２１は、細胞表面に発現したｈＣＣＲ８へのｈＣＣＬ１の結合をブロックすることができなかったが、他のすべての抗体はｈＣＣＬ１を効率的にブロックし、ＩＣ_５０値は約０．４～１．４ｎＭの範囲であった（図４Ｂ）。これは、ＨＦＢ１１－１９およびＨＦＢ１１－２１が、Ｎ末端ドメイン上の他の抗体と比較して異なるエピトープを共有することを示唆している。

【0201】

実施例６：抗ＣＣＲ８抗体は細胞内Ｃａ^２＋フラックスを阻害する

【0202】

ＣＣＲ８低コピー細胞（Ｍ３００．１９マウスプレＢ細胞）を、時間０秒で１００ｎＭのＨＦＢ１１－１０抗体（灰色の矢印、図５Ｄおよび５Ｇ）、ＨＦＢ１１－３抗体（灰色の矢印、図５または緩衝液（図５Ｅ））で処理し、続いて９０秒間インキュベートし、１ｎＭのＣＣＬ１（明瞭な矢印、図５Ｂ～５Ｄ）または１０ｎＭのＣＣＬ１（明瞭な矢印、図５Ｅ～５Ｇ）を添加した。緩衝液のみの陰性対照を図５Ａに示す（明瞭な矢印）。図５Ｃおよび５Ｄは、両方の抗体がＣＣＲ８－Ｍ３００．１９細胞のＣＣＬ１誘導性Ｃａ^２＋スパイクを妨害し、１ｎＭのＣＣＬで完全なシグナル阻害を示すことを実証している。ＣＣＬ１濃度が１０ｎＭに増加すると、ＨＦＢ１１－３およびＨＦＢ１１－１０について、それぞれ６１および７７．５％の部分阻害が観察された（図５Ｆおよび５Ｇ）。ＣＣＬ１結合をブロックした抗ＣＣＲ８抗体も、ケモカインによって誘導される細胞内シグナル伝達をブロックすることが実証された。

【0203】

実施例７：抗ＣＣＲ８抗体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）レポーターバイオアッセイにおいてＣＤ１６に関与することができた

【0204】

ＣＣＲ８発現ＣＨＯＫ１細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）における標的細胞として使用した。簡潔には、抗ＣＣＲ８抗体（３０ｎＭからの範囲、３倍希釈）、標的細胞（２５０００個／ウェル）を、Ｅ／Ｔ＝３：１で、ＣＤ１６およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ操作細胞と共培養した。３７℃、５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした後、Ｂｉｏ－ｇｌｏ試薬を添加し、室温で５分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎプレートリーダーを使用して生物発光を読み取った。ＲＬＵシグナルをグラフに示す（図６Ａ）。

【0205】

すべての抗ＣＣＲ８抗体は、可変の有効性でもってＣＤ１６に関与することができた。非ブロッキング抗体であるＨＦＢ１１－１９およびＨＦＢ１１－２１は、他の抗体と比較してより低い効力（より低いＥ_ｍａｘおよびＥＣ_５０）を示した。ＨＦＢ１１－２、ＨＦＢ１１－３、ＨＦＢ１１－５、ＨＦＢ１１－８およびＨＦＢ１１－１０は、高い効力を示し、ＥＣ_５０値は０．１ｎＭ～０．３ｎＭの範囲であり、Ｅｍａｘは＞２５０００および＞４００００ＲＬＵの間であった（図６Ｂ）。

【0206】

実施例８：ヒト化抗ＣＣＲ８抗体はＣＣＲ８発現細胞に強く結合する

【0207】

精製抗体（ＡＤＣＣ増強フォーマットで産生された）を１×１０^５個のｈＣＣＲ８－ＣＨＯＫ１安定細胞または親ＣＨＯＫ１細胞（ＭＡＣＳ緩衝液中５０ｎＭからの範囲、３倍希釈）と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄した後、二次抗ヒトＡＦ６４７抗体をＭＡＣＳ緩衝液中１２ｎＭで３０分間インキュベートした。洗浄した後、細胞ペレットを５０μＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Ｆｏｒｅｃｙｔソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ社、ミシガン州アナーバー）を使用してｉＱｕｅサイトメータ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ社、ドイツ国ゲッティンゲン）でサイトメトリーによってサンプルを分析した。ゲーティングされた単一細胞間のＡＦ６４７チャネルの蛍光の平均を図７に示す。

【0208】

滴定曲線は、ヒト化抗ＣＣＲ８抗体候補がすべて、アイソタイプ抗体のバックグラウンドなしで、ヒト化バリアントＨｚ２５、Ｈｚ２８、Ｈｚ２９、Ｈｚ３５、Ｈｚ３７およびＨｚ４について、それぞれ０．４０、０．３０、０．３７、０．２１、０．５８および０．１０ｎＭの非常に低いＥＣ_５０でＣＣＲ８発現細胞に結合することができることを示した（図７Ａおよび７Ｂ）。

【0209】

ヒト化抗体配列を下記に提供する：

【0210】

【表5】

【0211】

【表6】

【0212】

【表7】

【0213】

【表8】

【0214】

実施例９：ヒト化抗ＣＣＲ８抗体はＣＣＲ８へのＣＣＬ１結合をブロックした

【0215】

１×１０^５個の安定なＣＨＯＫ１．ｈＣＣＲ８細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を、ある範囲のヒト化抗ＣＣＲ８抗体（ＡＤＣＣ増強フォーマットで産生）またはアイソタイプ抗体（３３ｎＭからの濃度範囲、３倍希釈）と４℃で３０分間インキュベートした。３００ｇで３分間遠心分離した後、細胞をＡＦ６４７で標識した３０ｎＭのヒトＣＣＬ１リガンド（５０μＬ）（Ａｌｍａｃ社）で再懸濁し、４℃で４５分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞を、Ｆｏｒｅｃｙｔソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ社、ミシガン州アナーバー）を使用してｉＱｕｅサイトメータ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ社、ドイツ国ゲッティンゲン）を使用するフローサイトメトリーによって分析した。％ブロッキングは、実施例５に記載したように計算し、図８に示した。

【0216】

ＡＤＣＣ増強フォーマットのヒト化抗ＣＣＲ８抗体は、ＣＣＲ８発現細胞へのヒトＣＣＬ１結合を、ＨＦＢ１１－１０Ｈｚ４、ＨＦＢ１１－１０Ｈｚ２５、ＨＦＢ１１－１０Ｈｚ２８、ＨＦＢ１１－１０Ｈｚ２９、ＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３５およびＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７抗体について、それぞれ０．０９、１．０９、０．３９、０．６８、０．４９および０．８１ｎＭの強力なＩＣ_５０でブロックすることができた（図８）。

【0217】

実施例１０：ヒト化ＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７抗ＣＣＲ８抗体は、ＡＤＣＣレポーターアッセイでＣＤ１６ＦおよびＶアロタイプに関与した

【0218】

安定なｈＣＣＲ８－ＣＨＯＫ１細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を標的細胞として使用し、ＣＤ１６（ＦＦまたはＶＶ表現型）を発現する操作された安定なＪｕｒｋａｔ細胞およびＡＤＣＣレポーターバイオアッセイキットからのレポーターＮＦＡＴ遺伝子と３：１のＥ／Ｔ比（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で共培養した。一連のＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７抗体も３０ｎＭから培養物に添加した（３倍連続希釈）。３７℃および５％ＣＯ_２での６時間のインキュベーションの後、ＢｉｏＧｌｏルシフェラーゼ基質を供給元の推奨に従って添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーを使用して５分間のインキュベーションの後に発光シグナルを読み取った。生物発光シグナルは、グラフ中のＲＬＵとしてのレポーターである（図９）。

【0219】

ヒト化抗ｈＣＣＲ８抗体は、標的細胞死滅を媒介するＡＤＣＣレポーターアッセイにおいてＣＤ１６ＦおよびＶアロタイプの両方に関与することができた。予想されたように、高親和性Ｆｃγ受容体（ＶＶアロタイプ）でのより高い効力が０．０１４ｎＭのＥＣ_５０で観察され、低親和性Ｆｃγ受容体（ＦＦアロタイプ）では０．０８０ｎＭに増加した（図９）。

【0220】

実施例１１：ＣＣＲ８の低コピーを発現する細胞上のヒト化抗ＣＣＲ８抗体媒介性ＡＤＣＣ

【0221】

ＮＫ細胞を、健康なヒトＰＢＭＣからＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を使用して単離した。２４ウェルプレート中のウェルあたり２００万個のＮＫ細胞を、ＩＬ２ ＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ_２で約３０時間活性化した。

【0222】

低コピー数のＣＣＲ８を発現する細胞（安定にトランスフェクトされたＭ３００．１９マウスプレＢ細胞）をＣｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）ＦａｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；マサチューセッツ州ウォルサム）で標識した後、Ｕ底９６ウェルプレート中３７℃で１６時間、ＮＫ細胞（Ｅ／Ｔ比２：１）および一連のＨＦＢ１１－１０抗体濃度（ＡＤＣＣ増強フォーマットでヒト化および非ヒト化）と共培養した。死細胞をＮｕｃｇｒｅｅｎで標識した後、ｃｙｔｏｆｌｅｘサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用して蛍光を読み取った。死標的細胞のパーセンテージを二重陽性細胞として評価し、特異的標的細胞溶解のパーセンテージを（％抗体ありの標的死細胞－％抗体なしの標的死細胞）×１００／（１００－％抗体なしの標的死細胞）として評価した。自然細胞死を、抗体なしのＮＫ細胞と共培養した状態で評価した。

【0223】

図１０は、ヒト化抗ＣＣＲ８抗体によって媒介される特異的ＡＤＣＣ ＮＫ死滅を示す。ヒト化バリアントおよび親抗体（ＡＤＣＣ増強フォーマット）は、アッセイにおいて、ＣＣＲ８発現低コピー細胞のＡＤＣＣ ＮＫ死滅を媒介する高い効力を示した（Ｅ：Ｔ比３：１）。ＥＣ_５０は低く、（Ｈｚ２９、Ｈｚ３５、親Ａｂについては）０．００３ｎＭ～Ｈｚ２５抗体については０．００７ｎＭの範囲であった（ｎ＝３のドナーからの平均）。すべてのヒト化抗体が、初代ＮＫ細胞を使用するＡＤＣＣアッセイにおいて非常に強力な活性を示した。

【0224】

実施例１２：ヒト化抗ＣＣＲ８抗体ＨＦＢ１０１１１０のインビトロ特性評価

【0225】

ＨＦＢ１１－１０に関連する脱フコシル化ヒト化抗ＣＣＲ８抗体ＨＦＢ１０１１１０をさらに研究した。以下の実施例では、抗ＣＣＲ８抗体ＨＦＢ１０１１１０およびＨＦＢ１１－１０を代替的に使用することができる。

【0226】

図１１Ａ～１１Ｇに示すように、抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ＨＦＢ１０１１１０をさらに詳細に評価した。抗体は、フローサイトメトリーによって測定した場合、高コピー（ＣＨＯＫ１－ｈＣＣＲ８、約３０，０００個の受容体／細胞、左）および低コピー（Ｍ３００．１９－ｈＣＣＲ８、約２，０００個の受容体／細胞、右）細胞の両方でＣＣＲ８に強く結合し、ＥＣ_５０はそれぞれ０．２３ｎＭおよび０．２６ｎＭであることが確認された（図１１Ａ）。正常なグリコシル化およびＡＤＣＣ活性を増強するためのＦｃ領域におけるＤＥ変異を有するｈＩｇＧ１抗体としてフォーマットされたＨＦＢ１０１１１０に対する親抗体（ＨＦＢ１０１１１０－ｈＩｇＧ１－ＤＥ）を、脱フコシル化ＨＦＢ１０１１１０の陽性対照として使用した。ＨＦＢ１０１１１０は、高コピーおよび低コピーｈＣＣＲ８発現細胞の両方に、同様のサブｎＭ ＥＣ５０値で結合することができた。

【0227】

抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ＨＦＢ１０１１１０は、Ｍ３００．１９－ｈＣＣＲ８細胞に対してＡＤＣＣ活性を誘導した。ＰＢＭＣから単離された外因性初代ＮＫ細胞をエフェクター：標的比３：１で添加し、１６時間の共培養後にＮｕｃＧｒｅｅｎ染色を使用してフローサイトメトリーによって死細胞を定量化した。３つの異なるドナーからのＮＫ細胞を使用した実験の平均値を示す。ＨＦＢ１０１１１０－ｈＩｇＧ１－ＤＥおよび別の抗ｈＣＣＲ８ ＤＥフォーマットｈＩｇＧ１抗体を比較対象として使用した（図１１Ｂ）。

【0228】

関連するケモカイン受容体ＣＣＲ４へのＨＦＢ１０１１１０の結合をフローサイトメトリーによって評価し、抗ＣＣＲ４抗体モガムリズマブを陽性対照として使用した。ＨＦＢ１０１１１０はｈＣＣＲ４への結合を示さず、この抗体によるｈＣＣＲ８の特異的認識を示した（図１１Ｃ）。

【0229】

ＨＦＢ１０１１１０によって認識されたＣＣＲ８の領域を同定するためのドメインスワップ実験を行った。ｈＣＣＲ８の一部を関連するケモカイン受容体ＣＣＲ４の相同ドメインで置き換え、結果生じるキメラタンパク質を２９３個の細胞で発現させ、ＨＦＢ１０１１１０の結合をフローサイトメトリーによって評価した（図１１Ｄ）。これらの実験に基づいて、ＨＦＢ１０１１１０がｈＣＣＲ８のＮ末端細胞外ドメインを認識することが決定された。

【0230】

図１１Ｅに示すように、ＨＦＢ１０１１１０によるｈＣＣＲ８へのｈＣＣＬ１結合の遮断をフローサイトメトリーによって測定した。組換えｈＣＣＬ１によって誘導されたＣＣＲ８＋細胞の走化性のＨＦＢ１０１１１０媒介性遮断をトランスウエル遊走アッセイによって測定した。ＣＣＬ１は、存在する抗体の量を変化させながら、３０ｎＭの濃度で存在した。ＨＦＢ１０１１１０－ｈＩｇＧ１－ＤＥならびに別のヒト化バリアントを比較対象として使用した（図１１Ｆ）。

【0231】

図１１Ｇに示すように、ｈＣＣＬ１のＣＣＲ８＋細胞への添加によって誘導されたカルシウムフラックスのＨＦＢ１０１１１０媒介性遮断を評価した。ＣＣＲ８＋細胞に、矢印で示す時間に、１０ｕｇ／ｍＬのＨＦＢ１０１１１０の存在下または非存在下で、１０ｎＭのｈＣＣＬ１を添加した。

【0232】

実施例１３：ヒト化抗ＣＣＲ８抗体は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を実証した

【0233】

初代マクロファージを、ＣＤ１４＋ビーズ単離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）後にヒトＰＢＭＣから単離した。２Ｍ細胞／ウェルを、無血清ＲＰＭＩ １６４０培地を含む６ウェルプレートに３７℃、５％ＣＯ_２で１時間播種した。次いで、培地を活性化培地（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ）で置き換え、１週間にわたって２日ごとにリフレッシュした。ＩＬ１３を活性化の最後の２日間活性化培地に添加した。標的細胞（安定なｈＣＣＣＲ８．Ｍ３００．１９細胞）をＣｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（３７℃、５％ＣＯ_２で２０分間のインキュベーション）で標識した。完全培地で洗浄した後、ＣＣＲ８細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で１５分間、ヒト化抗ＣＣＲ８抗体と飽和濃度（１００ｎＭ）でインキュベートし、次いで活性化マクロファージと４時間共培養した。マクロファージを抗ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で染色した後、Ｃｙｔｏｆｌｅｘサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用したフローサイトメトリーによって分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、貪食細胞を二重陽性細胞として同定した。

【0234】

図１２に示すように、細胞の約１５％が、４時間のインキュベーション後にマクロファージによって貪食されたか、または貪食のプロセスにあった（図１２）。ヒト化抗ＣＣＲ８抗体ＨＦＢ１１－１０Ｈｚ３７は、初代マクロファージ細胞を使用するＡＤＣＰ機構を通じてＣＣＲ８＋細胞食作用を特異的に媒介した。

【0235】

実施例１４：ｈＣＣＲ８－ＫＩマウスにおけるＭＣ３８細胞に対するヒト化抗ＣＣＲ８抗体媒介性抗腫瘍活性

【0236】

マウスおよび腫瘍細胞株：

【0237】

雌の８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＢｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｃｏ．，Ｌｔｄ社（中国江西省）から購入した。ＭＣ３８マウス結腸癌腫細胞株をインビボ腫瘍有効性研究に使用した（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｃｏ．，Ｌｔｄ社）。ＭＣ３８細胞株を貯蔵前に２回継代し、解凍し、記載されたすべての腫瘍実験のために移植前に２回継代した。細胞はマイコプラズマを含まないと判定された。

【0238】

研究は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）のガイドラインに従って、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ社のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によってレビューおよび承認されたプロトコルに従って行った。

【0239】

ｈＣＣＲ８ ＫＩ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、１５～２１グラム）の右前側腹部に、ＰＢＳ０．１ｍＬ中ＭＣ３８腫瘍細胞（５×１０^５個）を皮下注射した。腫瘍移植の１週間後、１０ｍｇ／ｋｇのヒト化ＨＦＢ１１－１０またはアイソタイプ抗体を３週間にわたって隔週で腹腔内注射した（ｎ＝８／群）。腫瘍体積（ｍｍ^３）および体重を週に２回測定した（ｈＣＣＲ８ノックインマウスにおけるインビボ有効性研究の概略図を示す図１３Ａを参照されたい）。この研究のために、マウスＦｃ受容体との関与を促進するために、ｍＩｇＧ２ａ抗体としてフォーマットされたＨＦＢ１０１１１０の非脱フコシル化バージョンを使用した。

【0240】

図１３Ｂ～１３Ｄは、ｈＣＣＲ８－ＫＩマウスにおける結腸直腸癌由来のＭＣ３８細胞を使用したヒト化抗ＣＣＲ８抗体（図１３Ｃ～１３Ｄ）またはアイソタイプｍＩｇＧ２ａ（図１３Ｂ～１３Ｄ）の投与による抗腫瘍活性の評価を示す。処置開始後９日目から開始して、腫瘍成長は、アイソタイプ対照と比較して、抗ヒトＣＣＲ８処置群で有意に減少した（ｐ＜０．０１、＊＊）。さらに、８匹中３匹のマウスにおいて、腫瘍移植後１１日目から腫瘍退縮が観察された。まとめると、これらの結果は、抗ＣＣＲ８抗体が腫瘍成長を有意に減少させたことを実証した。

【0241】

実施例１５：ヒト化抗ＣＣＲ８抗体療法は腫瘍微小環境を再プログラムした

【0242】

作用機序をより明確にするために、抗ＣＣＲ８抗体療法によって誘発されるＭＣ３８腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の変化を調べた。図５に示すように。１４Ａ～１４Ｆ、抗ＣＣＲ８抗体処置は、処置マウスにおける腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成を変化させた。

【0243】

抗ＣＣＲ８抗体投与は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋のパーセンテージを有意に増加させることが観察された（＊、ｐ値＝０．０２６２、図１４Ｃ）。さらに、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の有意な増加が観察され（＊、ｐ値＝０．０２４０、図１４Ｄ）、抗腫瘍免疫に有利な免疫バランスの傾きがさらに示唆された。処置はまた、ＴＭＥ中のＮＫ細胞およびＣＤ４＋エフェクターＴ細胞のパーセンテージをわずかに増加させた（図１４Ｅおよび１４Ｂ）。

【0244】

さらに、抗ＣＣＲ８抗体処置は、最終エンドポイントでＦｏｘｐ ３＋ＣＤ４＋を有意に減少させなかったが（図１４Ａ）、抗ＣＣＲ８抗体処置はＣＣＲ８＋Ｔｒｅｇ集団を有意に減少させ（図１４Ｆ）、この薬剤の標的特異的効果を実証した。アイソタイプ群と比較して観察された５８％のＣＣＲ８＋Ｔｒｅｇの減少は、ＦＡＣパネルで使用されたヒト化抗体による標的占有率が同じエピトープについて競合していることを反映していた。

【0245】

実施例１６：腎細胞癌（ＲＣＣ）患者および肺癌患者からのヒト原発腫瘍からのＴ細胞集団におけるＣＣＲ８発現

【0246】

新鮮な腫瘍浸潤リンパ球を消化し、単一細胞懸濁液に解離させ、計数し、分析前に凍結した。簡潔には、穏やかなＭＡＣＳ腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を最初に使用した。腫瘍を小片に切断し、酵素ミックスとインキュベートし、穏やかなＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を使用して組織を消化した。次いで、サンプルを３００ｇで５分間遠心分離し、１０ｍＬの低温培地で２回洗浄した。次いで、サンプルを３０μＭで濾過し、更なる分析の前に低温凍結培地（９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ）に再懸濁した。１つのアリコートを解凍し、ＣＣＲ８表現型決定のために抗体パネルとインキュベートした。サンプルを最初に生／死色素およびＦｃＢｌｏｃｋで染色した。次いで、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ５６、抗ＴＩＧＩＴ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）および抗ＣＣＲ８（ＢＤ）による細胞外染色を行った。最後に、サンプルを透過処理し、細胞内染色のためにＦｏｘＰ３で染色した。サンプルを、ＦＬＯＷＪｏソフトウェアを使用してフローサイトメトリーによって分析した。

【0247】

ＣＣＲ８発現は、５５～９５％の腎細胞癌腫患者（ｎ＝１３）のＴｒｅｇで観察され、平均は７２．８±１２．８％（図１５Ａ）であった。逆に、ＦｏｘＰ３－ＣＤ４＋Ｔエフェクター細胞上のＣＣＲ８発現は２０％未満（平均７．９±５．６％）であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞については０に近かった（１．２±０．８％の平均、図１４Ａ）。図１５Ｂに示すヒストグラムでは、ドナー＃７２６についてサイトメトリデータが報告され、Ｔｒｅｇの９６％が減少した。ＣＣＲ８は、ＲＣＣ腫瘍内の他のＴ細胞集団に影響を及ぼすことなく、Ｔｒｅｇの枯渇のための目的の標的であることが確認された。

【0248】

実施例１７：健康および悪性ＰＢＭＣにおける循環からのＴ細胞集団におけるＣＣＲ８発現。

【0249】

ＣＣＲ８表現型決定を実施例１５に記載されるように行った。簡潔には、健康（ｎ＝４）または悪性（ｎ＝５）ドナーからのＰＢＭＣを新鮮な血液から単離した。１／３体積のＦｉｃｏｌｌを血液サンプルに添加し、続いて室温で３０分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。免疫細胞を含有するホワイトリングを収集し、ＦＡＣＳ分析の前に室温で１０分間１２５０ｒｐｍで遠心分離することによってＰＢＳで２回洗浄した。Ｔ細胞集団中のＣＣＲ８＋のパーセンテージを図１６に示す。

【0250】

健康または悪性患者の循環で観察されたＣＣＲ８発現は、すべてのＴ細胞集団で非常に低かった（＜４％）（図１６）。ＴｒｅｇまたはＴｅｆｆとＣＤ８＋Ｔ細胞との間に差はない。この分析により、腫瘍部位に限定された標的の特異性が確認され、循環中の副作用は予想されず、毒性および自己免疫のリスクは制限される。

【0251】

実施例１８：ＲＣＣ患者からの初代ヒト腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）に及ぼすヒト化抗ＣＣＲ８抗体媒介性ＡＤＣＣ ＮＫ死滅活性

【0252】

図１７Ａは、ＨＦＢ１０１１１０によって媒介される原発腫瘍浸潤リンパ球のエクスビボ死滅のために行われたサンプル収集およびＡＤＣＣアッセイの概略図を示す。ＲＣＣ患者（ｎ＝１３）からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の単一細胞懸濁液を解凍し、ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩデバイスでＡＯ／ＰＩ蛍光を使用して生存率を評価した。ＴＩＬを、ＡＤＣＣ ＮＫ死滅アッセイのために１００μＬ／ウェルの９６ウェルＵ底プレートに分割した。５０μＬの抗体をＴＩＬに添加した後、２０：１のＥ／Ｔ比で同種異系初代ＮＫ細胞を添加した。

【0253】

健康なドナーからのＮＫ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＮＫ単離および増殖キットを使用して事前に増殖させた。アリコートを解凍し、ＴＩＬ調製まで１０^７個の細胞／ｍＬでＴＩＬ培地中３７℃で保存した。実験に必要なＮＫ細胞の量は、表現型決定実験中に事前に評価された標的細胞（Ｔｒｅｇ）の数に基づいて計算した。最終体積を２００ｍＬに調整した後、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間共培養した。実施例１５に記載されているように、免疫細胞集団を同定するためにＦＡＣＳ染色を行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用したフローサイトメトリーによってサンプルを分析した：Ｂ細胞をＡｌｉｖｅ＋／ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋としてゲーティングした；ＣＤ８＋細胞をＡｌｉｖｅ＋／ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ８＋としてゲーティングした；Ｔｅｆｆ細胞をＡｌｉｖｅ＋／ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３－としてゲーティングし、ＴｒｅｇをＡｌｉｖｅ＋／ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋／ＴＩＧＩＴ＋としてゲーティングした。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡ検定（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）を使用して行った。

【0254】

アイソタイプ群（５０％～９０％、平均７１．３±１３％、ｐ値＜０．０００１）と比較して、強いＴｒｅｇ減少（ＣＤ３＋に対する％として）が観察された（図１７ Ｂ）。この集団は、図１７Ｃの１名の代表的な患者のドットプロットでは消失した。図１７Ｂに示すように、他の細胞集団では減少が観察されなかったことから、この枯渇はＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に特異的であった。逆に、ＣＤ８＋細胞の有意な増加が観察され（ＣＤ３＋細胞に対するＣＤ８＋）、平均＋９．８±９％、＊＊ｐ＝０．００６７であった。さらに、Ｂ細胞集団は、＋１６．７±１９．６％での処置群において有意に増加した（ｐ＜０．０３１７）。抗ＣＣＲ８抗体は、エクスビボでの特異的Ｔｒｅｇ枯渇によってＴＭＥを調節し、ＲＣＣ患者からのＴＩＬにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢ細胞を増加させることによって抗腫瘍免疫を回復させることができた。

【0255】

図１７Ｄにさらに示されるように、２０：１のエフェクター：標的比での初代腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と初代ＮＫ細胞との一晩の共培養後のＴｒｅｇの枯渇を用量応答実験において評価した。残りの細胞をフローサイトメトリーによって定量化した。添加された外因性ＮＫ細胞の量の関数としてのＡＤＣＣアッセイにおけるＴｒｅｇの枯渇も評価した（図１７Ｅ）。プロファイリングされた９つのサンプルのうちの２つは、外因性ＮＫ細胞の非存在下でさえ実質的なＴｒｅｇ枯渇を示し、腫瘍サンプル中に存在する内因性ＮＫ細胞がＡＤＣＣを媒介することができることを示唆した。

【0256】

実施例１９：安全性および薬物動態評価

【0257】

ＨＦＢ１０１１１０の薬物動態および安全性研究をカニクイザルで行った（単回投与ＰＫ研究の概略については図１８Ａを参照されたい）。

【0258】

カニクイザルにおけるＨＦＢ１０１１１０の血清ＰＫプロファイルは、１５日後に抗薬物抗体が検出されなかったこと（図１８Ｂを参照されたい）、および可溶性抗体フォーマットを使用したヒトＰＢＭＣからのインビトロサイトカイン放出研究では有意なサイトカイン放出が観察されなかったこと（図１８Ｃを参照されたい）を明らかにした。

【0259】

参考文献

【0260】

Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ，Ｄ．Ｏ．，Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ，Ａ．，Ａｒｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．，Ｍｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ，Ｃ．，Ｆｉｌｉｐｐｏｖａ，Ｅ．Ｖ．，Ｃｏｄｅｒ，Ｂ．Ｄ．，Ｐｅｔｉｔ，Ｒ．Ｇ．＆Ｐｒｉｎｃｉｏｔｔａ，Ｍ．Ｆ．（２０１８）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＣＲ８ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｖａｃｃｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７８，５３４０－５３４８。

【0261】

Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ，Ｈ．，Ｄｏｍｂｒｅｃｈｔ，Ｂ．，Ｋｉｓｓ，Ｍ．，Ｒｏｏｓｅ，Ｈ．，Ａｌｌｅｎ，Ｅ．，Ｖａｎ Ｏｖｅｒｍｅｉｒｅ，Ｅ．，Ｋａｎｃｈｅｖａ，Ｄ．，Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｌ．，Ｍｕｒｇａｓｋｉ，Ａ．，Ｂａｒｄｅｔ，Ｐ．Ｍ．Ｒ．，Ｂｌａｎｃｋｅ，Ｇ．，Ｊａｎｓ，Ｍ．，Ｂｏｌｌｉ，Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｍ．Ｓ．，Ｅｌｋｒｉｍ，Ｙ．，Ｄｏｏｌｅｙ，Ｊ．，Ｂｏｏｎ，Ｌ．，Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｔａｃｋｅ，Ｆ．，Ｍｏｖａｈｅｄｉ，Ｋ．，Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ｎ．，Ｎｅｙｎｓ，Ｂ．，Ｏｃａｋ，Ｓ．，Ｓｃｈｅｙｌｔｊｅｎｓ，Ｉ．，Ｖｅｒｅｅｃｋｅ，Ｌ．，Ｎａｎａ，Ｆ．Ａ．，Ｍｅｒｃｈｉｅｒｓ，Ｐ．，Ｌａｏｕｉ，Ｄ．＆Ｖａｎ Ｇｉｎｄｅｒａｃｈｔｅｒ，Ｊ．Ａ．（２０２１）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＣＣＲ８（＋）ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．９，ｅ００１７４９。

【0262】

Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｂ．Ｒ．，Ｍｅｓｋｏ，Ｐ．Ｂ．，Ｓｉｅｍｅｒｓ，Ｎ．Ｏ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．Ｂ．，Ｓｅｌｂｙ，Ｍ．，Ｓｐｒｏｕｌ，Ｔ．Ｗ．，Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｖｌａｃｈ，Ｌ．Ｍ．，Ｈｏｕｓｅｒ，Ｊ．，Ｓａｍｂａｎｔｈａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｓ．，Ｌｕ，Ｋ．，Ｈａｔｃｈｅｒ，Ｓ．Ｖ．，Ｌｏｈｒｅ，Ｊ．，Ｊａｉｎ，Ｒ．＆Ｌａｎ，Ｒ．Ｙ．（２０２１）Ｆｃ－Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ａｎｔｉ－ＣＣＲ８ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｐｌｅｔｅｓ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８１，２９８３－２９９４。

【0263】

Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｒａｎｔ，Ｆ．Ｍ．，Ｇｙｏｒｉ，Ｄ．Ｓ．，Ｃｏｎｔｉ，Ａ．Ｇ．，Ｉｍｉａｎｏｗｓｋｉ，Ｃ．Ｊ．，Ｋｕｏ，Ｐ．，Ｎａｓｒａｌｌａｈ，Ｒ．，Ｓａｄｉｙａｈ，Ｆ．，Ｌｉｒａ，Ｓ．Ａ．，Ｔａｃｋｅ，Ｆ．，Ｅｉｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｂｕｒｔｏｎ，Ｏ．Ｔ．，Ｄｏｏｌｅｙ，Ｊ．，Ｌｉｓｔｏｎ，Ａ．，Ｏｋｋｅｎｈａｕｇ，Ｋ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．＆Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｉ，Ｒ．（２０２１）ＣＣＲ８ ｍａｒｋｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｕｍｏｕｒｓ ｂｕｔ ｉｓ ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６３，５１２－５２０。

【0264】

Ｂｈａｔｔ，Ｄ．，Ｋａｎｇ，Ｂ．，Ｓａｗａｎｔ，Ｄ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｐｅｒｅｚ，Ｋ．，Ｈｕａｎｇ，Ｚ．，Ｓｅｋｉｒｏｖ，Ｌ．，Ｗｏｌａｋ，Ｄ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，ＤｅＶｏｓｓ，Ｊ．，Ｍａｎｚａｎｉｌｌｏ，Ｐ．Ｓ．，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｎ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｓｙｍｏｎｓ，Ａ．＆Ｏｕｙａｎｇ，Ｗ．（２０２１）ＳＴＡＲＴＲＡＣ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｓｃＲＮＡｓｅｑ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ ｒｅｖｅａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２１８．ｅ２０２０１３２９。

【0265】

当業者であれば、その広範な発明概念から逸脱することなく、上記の実施形態に変更を加えることができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されず、本明細書によって定義される本発明の精神および範囲内の修正を包含することが意図されていることが理解される。

【図1】

【図2】

【図3A-B】

【図3C】

【図4】

【図5A-F】

【図5G】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A-B】

【図11C-E】

【図11F-G】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A-C】

【図17D-E】

【図18A-B】

【図18C】

【手続補正書】

【提出日】2024-04-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（１）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６；
（２）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；
（３）それぞれ、配列番号１３、２、１４、４、２８、および６；
（４）それぞれ、配列番号１３、２、１５、４、５、および６；
（５）それぞれ、配列番号１６、１７、１８、２９、３０、および６；
（６）それぞれ、配列番号１９、２０、２１、４、５、および６；
（７）それぞれ、配列番号２２、２３、２４、３１、５、および３２；
（８）それぞれ、配列番号２５、２６、２７、３３、３４、および３５；
（９）それぞれ、配列番号１、２、４９、４、５、および６；または
（１０）それぞれ、配列番号１、２、４９、５０、５１、および６；
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８）、好ましくはヒトＣＣＲ８に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項２に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号９と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域とを含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

配列番号７、９、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号８、１０、３７、３９、４１、４３、４５、４７、６１、６２、もしくは６３と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

（１）配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号３６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号３８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号４０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４１のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号４２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（６）配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４５のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（７）配列番号４６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（８）配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（９）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（１０）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（１１）配列番号５３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（１２）配列番号５４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（１３）配列番号５９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む、請求項１または５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を通じてエフェクター媒介性腫瘍細胞溶解を誘導し；かつ／またはコンジュゲートされた薬物の動員を誘導し；かつ／または癌を死滅させる効果を有する別のｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントと二重特異性抗体を形成することができる、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがカニクイザルＣＣＲ８に特異的に結合する、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項10】

請求項１～８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸。

【請求項11】

請求項９に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸。

【請求項12】

請求項１０または１１に記載の単離された核酸を含むベクター。

【請求項13】

請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項14】

請求項１～８のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項９に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。

【請求項15】

癌細胞表面上のＣＣＲ８の標的化し、および／または癌の処置を必要とする対象において、癌を処置するための、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記癌が、例えば、固形腫瘍、好ましくは浸潤性Ｔ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくは浸潤性Ｔｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくはＣＣＲ８を発現する非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、最も好ましくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞浸潤が生じたＣＣＲ８を過剰発現する浸潤性の非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍である、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記癌が、肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、および黒色腫からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記対象がＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇ細胞を含む、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

請求項１～８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項９に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを産生する方法であって、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む細胞を、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを産生する条件下で培養することと、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを前記細胞または培養物から回収することと、を含む、方法。

【請求項20】

請求項１～８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは請求項９に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を製造する方法であって、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを薬学的に許容され得る担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、方法。

【請求項21】

対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定する方法であって、前記方法は、
ａ．サンプルを請求項１～８のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることであって、前記サンプルが前記対象から得られることと、
ｂ．前記対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定することと
を含む、方法。

【請求項22】

前記サンプルが組織サンプルまたは血液サンプルであり、任意選択的に前記組織サンプルが癌組織サンプルである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記サンプルがＴｒｅｇ細胞を含む、請求項２１または２２に記載の方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２６５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0265】

当業者であれば、その広範な発明概念から逸脱することなく、上記の実施形態に変更を加えることができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されず、本明細書によって定義される本発明の精神および範囲内の修正を包含することが意図されていることが理解される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（１）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；
（２）それぞれ、配列番号１３、２、１４、４、２８、および６；
（３）それぞれ、配列番号１３、２、１５、４、５、および６；
（４）それぞれ、配列番号１６、１７、１８、２９、３０、および６；
（５）それぞれ、配列番号１９、２０、２１、４、５、および６；
（６）それぞれ、配列番号２２、２３、２４、３１、５、および３２；または
（７）それぞれ、配列番号２５、２６、２７、３３、３４、および３５；
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８）、好ましくはヒトＣＣＲ８に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２）
配列番号７、３６、３８、４０、４２、４４、もしくは４６と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号８、３７、３９、４１、４３、４５、もしくは４７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、項目１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３）
（１）配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号３６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号３８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号４０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４１のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号４２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（６）配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４５のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（７）配列番号４６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む、項目１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目４）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ、および／またはヒトであるかもしくはヒト化されている、項目１～３のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目５）
前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、
（１）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６；
（２）それぞれ、配列番号１、２、４９、４、５、および６；
（３）それぞれ、配列番号１、２、４９、５０、５１、および６；
（４）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；または
（５）それぞれ、配列番号１、４８、４９、５０、５１、および６
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、項目４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目６）
前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、または配列番号１０、６１、６２、もしくは６３と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、項目５に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目７）
前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、
（１）配列番号９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（２）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（３）配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（４）配列番号５３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；
（５）配列番号５４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と；または
（６）配列番号５９のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と
を含む、項目６に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目８）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を通じてエフェクター媒介性腫瘍細胞溶解を誘導し；かつ／またはコンジュゲートされた薬物の動員を誘導し；かつ／または癌を死滅させる効果を有する別のｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントと二重特異性抗体を形成することができる、項目１～７のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目９）
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントがカニクイザルＣＣＲ８に特異的に結合する、項目１～８のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１０）
項目１～９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１１）
項目１～９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸。
（項目１２）
項目１０に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸。
（項目１３）
項目１１または１２に記載の単離された核酸を含むベクター。
（項目１４）
項目１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目１５）
項目１～９のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは項目１０に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
（項目１６）
癌細胞表面上のＣＣＲ８の標的化し、および／または癌の処置を必要とする対象において、癌を処置する方法であって、項目１５に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目１７）
前記癌が、例えば、固形腫瘍、好ましくは浸潤性Ｔ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくは浸潤性Ｔｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、より好ましくはＣＣＲ８を発現する非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍、最も好ましくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞浸潤が生じたＣＣＲ８を過剰発現する浸潤性の非常に抑制性のＴｒｅｇ細胞を有する固形腫瘍である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記癌が、肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、および黒色腫からなる群から選択される、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１９）
前記対象がＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇ細胞を含む、項目１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
項目１～９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは項目１０に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを産生する方法であって、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む細胞を、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを産生する条件下で培養することと、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを前記細胞または培養物から回収することと、を含む、方法。
（項目２１）
項目１～９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは項目１０に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を製造する方法であって、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメントを薬学的に許容され得る担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、方法。
（項目２２）
対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定する方法であって、前記方法は、
ａ．前記対象からサンプルを得ることと、
ｂ．前記サンプルを項目１～９のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることと、
ｃ．前記対象におけるＣＣＲ８のレベルを決定することと
を含む、方法。
（項目２３）
前記サンプルが組織サンプルまたは血液サンプルであり、任意選択的に前記組織サンプルが癌組織サンプルである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記サンプルがＴｒｅｇ細胞を含む、項目２２に記載の方法。

【国際調査報告】