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特表2024-531426ＣＤ１５５に対する抗体および抗原結合フラグメント、その使用方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】ＣＤ１５５に対する抗体および抗原結合フラグメント、その使用方法

(51)【国際特許分類】

C07K 16/28 20060101AFI20240822BHJP

C12N 15/113 20100101ALI20240822BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20240822BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240822BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240822BHJP

A61K 31/711 20060101ALI20240822BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240822BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/13

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K39/395 Y

A61K48/00

A61K31/711

A61P35/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024510508

(86)(22)【出願日】2021-08-20

(85)【翻訳文提出日】2024-04-17

(86)【国際出願番号】 US2021046855

(87)【国際公開番号】W WO2023022729

(87)【国際公開日】2023-02-23

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524064069

【氏名又は名称】タスリフファーマシューティカル，エルエルシー

【氏名又は名称原語表記】ＴＡＳＲＩＦＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ，ＬＬＣ

【住所又は居所原語表記】３８０ＭａｉｎＳｔｒｅｅｔＢｏｘ３８，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ１１７３５（ＵＳ）

(74)【代理人】

【識別番号】110003487

【氏名又は名称】弁理士法人東海特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カリム，アフタブ，エス．

(72)【発明者】

【氏名】ホルゲイト，ロバート

(72)【発明者】

【氏名】ハーン，アーロン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA55

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB26

4C085AA14

4C085AA25

4C085BB11

4C085BB36

4C085CC23

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA55

4C086MA66

4C086NA05

4C086ZB26

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA54

4H045BA72

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）に特異的なヒト化抗体または抗原結合フラグメントは、核酸、ペプチド、タンパク質、薬物、および放射性医薬品を癌細胞に標的化する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製するために使用される。これらの抗体は、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）への結合によりＰＶＲがＴＩＧＩＴに結合するのを遮断するするチェックポイント遮断に使用され得る。ヒト化抗体は、単独でまたは本分野で知られている他のチェックポイント阻害剤と組み合わせてのいずれかで使用される。ヒト化抗体は、ＰＶＲ－ＤＮＡＭ－１軸を調節してＴ細胞またはＮＫ細胞上のＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）発現を上方制御し、それによって免疫監視メカニズムを回復する。抗体はＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲＮＫ細胞に組み込まれる。二重特異性抗体は、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントを組み込んで、Ｔ細胞またはＮＫ細胞と結合してＣＤ１５５を発現する癌と闘うことによって産生される。抗ＣＤ１５５抗体はネクチン４に結合するため、ネクチン４を発現する癌の標的化が可能になる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の重鎖可変領域および軽鎖可変領域から構成されるポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸配列：
（ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６のうちの１つから選択される重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３のうちの１つから選択される軽鎖可変領域。

【請求項2】

以下を含むポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６のうちの１つから選択される重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３のうちの１つから選択される軽鎖可変領域。

【請求項3】

ＣＤ１５５（ＰＶＲ）を発現する腫瘍の治療のためにヒトに投与されるプロドラッグまたは薬物にコンジュゲートした、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項4】

前記薬物またはプロドラッグが以下のいずれか１つに由来する、請求項３に記載の抗体または抗原結合フラグメント：核酸、ベドンチン（ｖｅｄｏｎｔｉｎ）、ピロロベンゾジアゼピン、リポソーム化ドキソルビシン、トポイソメラーゼ阻害剤、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＤＭ１、パクリタキセル、テモゾロミド、ドキソルビシン、デルクステカン、放射線増感剤、テシリン、ドカクステル（ｄｏｃａｘｔｅｌ）およびＰＡＲＰ阻害剤。

【請求項5】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合し、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）のＴＩＧＩＴへの結合を遮断する、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項6】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合し、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）のＣＤ９６への結合を遮断する、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項7】

ＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合する第１の部分と、以下のうちの少なくとも１つと結合する第２の部分と、を含む二重特異性抗体または抗原結合フラグメントを含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント：（ａ）Ｔ細胞上のＣＤ３、および（ｂ）ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６。

【請求項8】

ＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合する第１の部分と、以下のうちの少なくとも１つと結合する第２の部分とを含む二重特異性抗体または抗原結合フラグメントを含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント：（ａ）トランスフェリン受容体１および（ｂ）トランスフェリン受容体２。

【請求項9】

前記ポリオウイルス受容体に結合する第１の部分と、１型インスリン様増殖因子受容体に結合する第２の部分とを含む二重特異性抗体または抗原結合フラグメントを含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項10】

前記ポリオウイルス受容体に結合する第１の部分と、単一ドメイン抗体ＦＣ５を含む第２の部分とを含む二重特異性抗体または抗原結合フラグメントを含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項11】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト霊長類のＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合する、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項12】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、腫瘍上に発現されるＣＤ１５５に結合し、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して前記腫瘍に対する免疫応答を誘発する、ＩｇＧ１アイソタイプを有する、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項13】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合し、その後、以下のうちの少なくとも１つにおいてＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）が上昇する、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント：（ａ）Ｔ細胞および（ｂ）ＮＫ細胞。

【請求項14】

ＣＤ１５５に対する前記抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトに投与され、前記抗体または抗原結合フラグメントは、前記ヒトにおいてＣＤ１５５に結合し、ポリオウイルスがＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合するのを遮断する、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項15】

ＣＤ１５５に対する前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＤ１１２Ｒ、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＥＡＣＡＭ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、およびＡ２ｒからなる群から選択される免疫チェックポイント分子に対する抗体と組み合わせて、癌の治療のためにヒトに投与される、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項16】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、Ｓ２４１Ｐヒンジ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプを含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項17】

ＣＤ１５５に対する前記抗体または抗原結合フラグメントは、以下（ａ）Ｉ－１２４、（ｂ）ガリウム６８、または（ｃ）ルテチウム１７７、（ｄ）ＣＴスキャン用の造影剤、（ｅ）ＭＲＩスキャン用の造影剤、および（ｆ）ＰＥＴスキャン用の診断剤のいずれかの標識を含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項18】

ＣＤ１５５に対する前記抗体または抗原結合フラグメントは、サイトカインまたは遺伝子編集酵素の以下のｍＲＮＡ（ａ）ＩＬ２をコードするｍＲＮＡ、（ｂ）ＩＬ７をコードするｍＲＮＡ、および（ｃ）ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡ、（ｄ）ＩＬ１５をコードするｍＲＮＡ、（ｅ）ＩＬ２１をコードするｍＲＮＡ、（ｆ）ＩＦＮガンマをコードするｍＲＮＡ、（ｇ）ＩＦＮアルファをコードするｍＲＮＡ、（ｈ）ＧＭＣＳＦをコードするｍＲＮＡ、（ｉ）Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ、（ｊ）Ｃａｓｌ２ａをコードするｍＲＮＡ、および（ｋ）Ｃａｓ１３をコードするｍＲＮＡ、のうちの１つをコードするｍＲＮＡにコンジュゲートされる、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項19】

静脈内、動脈内、腫瘍内、くも膜下腔内、筋肉内、皮下、膀胱内、腹腔内、および対流促進送達を介する、からなる群からの少なくとも１つによって投与される、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項20】

以下の重鎖可変領域および軽鎖可変領域から構成されるポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメントを産生する細胞株：
（ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６のうちの１つから選択される重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３のうちの１つから選択される軽鎖可変領域。

【請求項21】

以下の重鎖可変領域、配列番号２ＣＤＲ１、配列番号２７のＣＤＲ２、および配列番号４のＣＤＲ３、ならびに以下の軽鎖可変領域、配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２、および配列番号２８のＣＤＲ３から構成されるヒト化抗体および抗原結合フラグメント。

【請求項22】

以下の重鎖可変領域、配列番号２のＣＤＲ１、配列番号２９のＣＤＲ２、および配列番号４のＣＤＲ３、ならびに以下の軽鎖可変領域、配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２、および配列番号３０のＣＤＲ３から構成されるヒト化抗体および抗原結合フラグメント。

【請求項23】

以下の重鎖可変領域、配列番号２のＣＤＲ１、配列番号２７のＣＤＲ２、および配列番号４のＣＤＲ３、ならびに以下の軽鎖可変領域、配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２、および配列番号２８のＣＤＲ３から構成されるヒト化抗体および抗原結合フラグメント。

【請求項24】

【請求項25】

【請求項26】

以下の重鎖可変領域、配列番号２のＣＤＲ１、配列番号３１のＣＤＲ２、および配列番号４のＣＤＲ３、ならびに以下の軽鎖可変領域、配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２、および配列番号２８のＣＤＲ３から構成されるヒト化抗体および抗原結合フラグメント。

【請求項27】

以下の重鎖可変領域、配列番号２ＣＤＲ１、配列番号２９のＣＤＲ２、および配列番号４のＣＤＲ３、ならびに以下の軽鎖可変領域、配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２、および配列番号２８のＣＤＲ３から構成されるヒト化抗体および抗原結合フラグメント。

【請求項28】

以下の重鎖可変領域、配列番号２のＣＤＲ１、配列番号２７のＣＤＲ２、および配列番号４のＣＤＲ３、ならびに以下の軽鎖可変領域、配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２、および配列番号３０のＣＤＲ３から構成されるヒト化抗体および抗原結合フラグメント。

【請求項29】

【請求項30】

以下を含むポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３のうちの１つから選択される重鎖可変領域、ここで、前記重鎖可変領域は、以下を含み：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、ここで；
（１）ＣＤＲ２の６位のアスパラギンは、アラニン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリン、もしくはスレオニンのうちの１つで置換される；および／または
（２）ＣＤＲ２の８位のアスパラギン酸は、グルタミン酸、グリシン、もしくはアルギニンのうちの１つで置換される；および／または
（３）ＣＤＲ２の９位のスレオニンは、グルタミン酸またはリジンのうちの１つで置換される；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、
（ｂ）配列番号５、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７のうちの１つから選択される軽鎖可変領域、ここで、前記軽鎖可変領域は、以下を含み：
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン；ここで、ＣＤＲ３の４位のアスパラギンは、アラニン、グルタミン酸、グリシン、リジン、グルタミン、またはセリンのうちの１つで置換される。

【請求項31】

ポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の重鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３のうちの１つから選択され、ここで、前記重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、ここで；
（１）ＣＤＲ２の６位のアスパラギンは、アラニン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリン、もしくはスレオニンのうちの１つで置換される；および／または
（２）ＣＤＲ２の８位のアスパラギン酸は、グルタミン酸、グリシン、もしくはアルギニンのうちの１つで置換される；および／または
（３）ＣＤＲ２の９位のスレオニンは、グルタミン酸またはリジンのうちの１つで置換される；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン。

【請求項32】

ポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の軽鎖可変領域であって、前記軽鎖可変領域は、配列番号５、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７のうちの１つから選択され、ここで、前記軽鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン；ここで、ＣＤＲ３の４位のアスパラギンは、アラニン、グルタミン酸、グリシン、リジン、グルタミン、またはセリンのうちの１つで置換される。

【請求項33】

以下を含むポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、ここで；
（１）ＣＤＲ２の６位のアスパラギンは、アラニン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリン、もしくはスレオニンのうちの１つで置換される；および／または
（２）ＣＤＲ２の８位のアスパラギン酸は、グルタミン酸、グリシン、もしくはアルギニンのうちの１つで置換される；および／または
（３）ＣＤＲ２の９位のスレオニンは、グルタミン酸またはリジンのうちの１つで置換される；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン。
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン；ここで、ＣＤＲ３の４位のアスパラギンは、アラニン、グルタミン酸、グリシン、リジン、グルタミン、またはセリンのうちの１つで置換される。

【請求項34】

以下を含むポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、ここで；
（１）ＣＤＲ２の６位のアスパラギンは、アラニン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリン、もしくはスレオニンのうちの１つで置換される；および／または
（２）ＣＤＲ２の８位のアスパラギン酸は、グルタミン酸、グリシン、もしくはアルギニンのうちの１つで置換される；および／または
（３）ＣＤＲ２の９位のスレオニンは、グルタミン酸またはリジンのうちの１つで置換される；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン。

【請求項35】

以下を含むポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン；ここで、ＣＤＲ３の４位のアスパラギンは、アラニン、グルタミン酸、グリシン、リジン、グルタミン、またはセリンのうちの１つで置換される。

【請求項36】

前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域がそれぞれ、以下のうちの１つである、請求項１に記載のポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ｉ）配列番号１８および配列番号１９；
（ｉｉ）配列番号２０および配列番号２１；
（ｉｉｉ）配列番号１８および配列番号２２；
（ｉｖ）配列番号２０および配列番号２３；
（ｖ）配列番号２４および配列番号２２；
（ｖｉ）配列番号２６および配列番号２２：
（ｖｉｉ）配列番号２５および配列番号２２；
（ｖｉｉｉ）配列番号２４および配列番号２３；または
（ｉｘ）配列番号２５および配列番号２３。

【請求項37】

前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域がそれぞれ、以下のうちの１つである、請求項７に記載のポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ｉ）配列番号２０および配列番号２１；
（ｉｉ）配列番号２０および配列番号２３；または
（ｉｉｉ）配列番号２５および配列番号２３。

【請求項38】

以下の配列番号のうちの１つを含む、ＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の重鎖可変領域：
ｉ）配列番号９；
ｉｉ）配列番号１０；
ｉｉｉ）配列番号１１；
ｉｖ）配列番号１２；または
ｖ）配列番号１３。

【請求項39】

以下の配列番号のうちの１つを含む、ＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の軽鎖可変領域：
ｉ）配列番号１４；
ｉｉ）配列番号１５；
ｉｉｉ）配列番号１６；または
ｉｖ）配列番号１７。

【請求項40】

以下を含むＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）以下のうちの１つからの重鎖可変領域：
ｉ）配列番号９；
ｉｉ）配列番号１０；
ｉｉｉ）配列番号１１；
ｉｖ）配列番号１２；または
ｖ）配列番号１３；および
（ｂ）以下のうちの１つからの軽鎖可変領域：
ｉ）配列番号１４；
ｉｉ）配列番号１５；
ｉｉｉ）配列番号１６；または
ｉｖ）配列番号１７。

【請求項41】

配列番号１の以下の修飾のうちの１つを含む、ＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の重鎖可変領域：
ｉ）５４位のアスパラギンをアラニンで置換すること；
ｉｉ）５４位のアスパラギンをグルタミンで置換すること；
ｉｉｉ）５４位のアスパラギンをセリンで置換すること；
ｉｖ）５６位のアスパラギンをグルタミン酸で置換すること；
ｖ）５６位のアスパラギンをグリシンで置換すること；または
ｖｉ）５７位のスレオニンをグルタミン酸で置換すること。

【請求項42】

配列番号５の以下の修飾のうちの１つを含む、ＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の軽鎖可変領域：
ｉ）９２位のアスパラギンをアラニンで置換すること；
ｉｉ）９２位のアスパラギンをグルタミン酸で置換すること；または
ｉｉｉ）９２位のアスパラギンをグルタミンで置換すること。

【請求項43】

９２位のアスパラギンを（ｉ）アラニン；（ｉｉ）グルタミン酸；またはグルタミンのいずれかで置換することによって形成される配列番号５の修飾のうちの１つを含む、ＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の軽鎖可変領域。

【請求項44】

以下のうちの１つを含む、ＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号２０；または
（ｉｉ）配列番号２５。

【請求項45】

以下のうちの１つを含む、ＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体の軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号２１；または
（ｉｉ）配列番号２３。

【請求項46】

以下を含むＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１９を含む軽鎖可変領域。

【請求項47】

以下を含むＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号２０を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号２１を含む軽鎖可変領域。

【請求項48】

以下を含むＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号２２を含む軽鎖可変領域。

【請求項49】

以下を含むＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号２０を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域。

【請求項50】

以下を含むＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号２４を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号２２を含む軽鎖可変領域。

【請求項51】

【請求項52】

以下を含むＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号２５を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号２２を含む軽鎖可変領域。

【請求項53】

以下を含むＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号２４を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域。

【請求項54】

以下を含むＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号２５を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域。

【請求項55】

以下を含むポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１の重鎖可変領域、ここで、少なくとも７個のアミノ酸残基は、５、９、１２、２０、２４、３８、４０、４１、４４、６７、６８、７０、７６、８４、８７、９１、１１１、１１２、および１１６位；からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基の位置で改変される、
（ｂ）配列番号５の軽鎖可変領域、ここで、少なくとも７個のアミノ酸残基は、３、９、１０、１３、２０、２１、４３、６３、７７、７８、８０、８７、および１００位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基の位置で改変される。

【請求項56】

前記重鎖可変領域において改変された前記少なくとも７個のアミノ酸残基は、１２、４０、４４、６７、７６、１１２、および１１６位にある、請求項５５に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項57】

前記軽鎖可変領域において改変された前記少なくとも７個のアミノ酸残基は、９、２０、２１、４３、７７、７８、および１００位にある、請求項５５に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項58】

前記重鎖可変領域のＣＤＲ２は、５５、５７、または５８位で改変された少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、請求項５５に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項59】

前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、９２位で改変された少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、請求項５８に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項60】

以下を含むポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１の重鎖可変領域、ここで、６～２０個のアミノ酸残基がＣＤＲドメインの外側で改変され、
（ｂ）配列番号５の軽鎖可変領域、ここで、６～１４個のアミノ酸残基が前記ＣＤＲドメインの外側で改変される。

【請求項61】

（ａ）前記重鎖可変領域において改変された前記アミノ酸残基は、５、９、１２、２０、２４、３８、４０、４１、４４、６７、６８、７０、８３、８４、８７、９１、１１１、１１２、および１１６位からなる群から選択される位置であり、
（ｂ）前記軽鎖可変領域において改変された前記アミノ酸残基は、３、９、１０、１３、２０、２１、４３、６３、７７、７８、８０、８７、および１００位からなる群から選択される位置である、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項62】

３位の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸残基は、バリンまたはグルタミンのいずれかである、請求項６１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項63】

６３位の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸残基は、スレオニンまたはセリンのいずれかである、請求項６１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項64】

３位の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸残基は、バリンまたはグルタミンのいずれかであり、６３位の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸残基はスレオニンまたはセリンのいずれかである、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項65】

以下を含むポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１の重鎖可変領域、ここで、アミノ酸残基が以下の位置で改変され：
（ｉ）１２位のＶがリジンまたはアルギニンに変更される、
（ｉｉ）４０位のＳがプロリンまたはアラニンに変更される、
（ｂ）配列番号５の軽鎖可変領域、ここで、アミノ酸残基が以下の位置で改変され：
（ｉ）９位のＫがセリンに変更される、
（ｉｉ）４３位のＳがアラニンに変更される。

【請求項66】

請求項１～３６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸ポリヌクレオチド酸またはプラスミド。

【請求項67】

少なくとも１つのマーカー化合物にコンジュゲートされた、請求項１～６６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項68】

前記少なくとも１つのマーカー化合物は、Ｉ－１２４、フルオロフォア、またはＩＲ８００色素である、請求項６７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項69】

少なくとも１つの薬物にコンジュゲートされた、請求項１～６６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項70】

前記少なくとも１つの薬物は、パクリタキセル、ドキソルビシン、またはテモゾロミドである、請求項６９に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項71】

少なくとも１つの治療用核酸にコンジュゲートされた、請求項１～６６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項72】

前記少なくとも１つの治療用核酸は、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、長ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、メッセンジャーＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または非プラスミド二本鎖ＤＮＡである、請求項７１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項73】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧアイソタイプのものである、請求項１～６６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項74】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプのものであり、ＩＬ－１２にコンジュゲートされる、請求項７３に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項75】

請求項１～６６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含むキメラ抗原受容体Ｔ細胞。

【請求項76】

請求項１～３６のいずれか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、または抗体もしくは抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡを患者に注射するステップを含む、癌を治療する方法であって、前記注射は、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射、髄腔内注射、脳室内注射、腫瘍内注射、皮下注射、またはリンパ管内注射のうちの少なくとも１つである、方法。

【請求項77】

前記注射は、脳脊髄液への注射である、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記注射は、カテーテルを介した脳腫瘍への注射である、請求項７６に記載の方法。

【請求項79】

前記抗体または抗原結合フラグメントの注射が薬物にコンジュゲートされ、腫瘍に注射される、請求項７６に記載の方法。

【請求項80】

ａ）請求項１～６６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント；およびｂ）成分であって、前記成分は、生物標識、放射性標識、蛍光プローブ、抗腫瘍薬、サイトカイン、アジュバント、毒素、放射性医薬品または核酸である成分を含む、コンジュゲート。

【請求項81】

以下を含むポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３のうちの１つから選択される重鎖可変領域、ここで、前記重鎖可変領域は、以下を含み：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、ここで；
（１）ＣＤＲ２の６位のアスパラギンが、アラニン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリン、もしくはスレオニンのうちの１つで置換される；および／または
（２）ＣＤＲ２の８位のアスパラギン酸が、グルタミン酸、グリシン、もしくはアルギニンのうちの１つで置換される；および／または
（３）ＣＤＲ２の９位のスレオニンが、グルタミン酸またはリジンのうちの１つで置換される；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン。
（ｂ）配列番号５、配列番号１４、配列番号１５のうちの１つから選択される軽鎖可変領域、ここで、前記軽鎖可変領域は、以下を含み：
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン；ここで、ＣＤＲ３の４位のアスパラギンは、アラニン、グルタミン酸、グリシン、リジン、グルタミン、またはセリンのうちの１つで置換される、
（ｉｖ）３位の前記軽鎖可変領域のアミノ酸残基は、バリンまたはグルタミンのいずれかであり、６３位の前記軽鎖可変領域のアミノ酸残基はスレオニンまたはセリンのいずれかである。

【請求項82】

以下からの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗原結合フラグメントを含むキメラ抗原受容体Ｔ細胞またはキメラ抗原受容体ＮＫ細胞：（ａ）配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６の１つから選択される重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３のうちの１つから選択される軽鎖可変領域。

【請求項83】

配列番号１、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６のうちの１つから選択される重鎖可変領域および配列番号５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３のうちの１つから選択される軽鎖可変領域を含む、ネクチン４およびＣＤ１５５（ＰＶＲ）の両方に結合する抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項84】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、ネクチン４のＴＩＧＩＴへの結合を遮断する、請求項８３に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項85】

ネクチン４に結合する第１の部分とＴ細胞上のＣＤ３に結合する第２の部分とを含む二重特異性抗体または抗原結合フラグメントを含む、請求項８３に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項86】

ネクチン４に結合する第１の部分とＮＫ細胞上の受容体に結合する第２の部分とを含む二重特異性抗体または抗原結合フラグメントを含む、請求項８３に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項87】

フルオロフォアにコンジュゲートされ、哺乳類に投与され、抗体コンジュゲートは、以下の少なくとも１つを発現する腫瘍に結合して蓄積する、請求項８３に記載の抗体または抗原結合フラグメント：ＣＤ１５５（ＰＶＲ）またはネクチン４。

【請求項88】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＰＶＲに結合し、Ｔ細胞またはＮＫ細胞上のＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）の上昇を引き起こす、請求項８３に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項89】

Ｄ１７１抗体コンジュゲートが腫瘍によって内在化される、前記Ｄ１７１抗体コンジュゲート。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表の参照
本出願には、２０２１年８月１９日に作成され、２７ＫＢを含むＣＤ１５５ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５という名前のファイルに電子配列表が含まれており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は概して、モノクローナル抗体を利用した疾患の治療に関する。本開示は、特に、本明細書に開示される抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメント（抗体フラグメント）を用いて、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）またはネクチン４（または両方）のいずれかを発現する細胞を標的化することに関する。本出願で開示されるＣＤ１５５に対する抗体は、ポリオウイルス受容体に結合し、さらにネクチン４にも結合する。ＣＤ１５５およびネクチン４は、多くの原発腫瘍および転移腫瘍で過剰発現される受容体である。ＣＤ１５５およびネクチン４は、チェックポイント分子、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）のリガンドとしても特定されている。

【背景技術】

【0003】

ＣＤ１５５／ＰＶＲおよび受容体のファミリーは、ヒトおよびその他の動物のさまざまな組織に存在する。マウスでは、ＣＤ１５５のマウスオルソログは、Ｔａｇｅ４として知られている。ＣＤ１５５およびネクチン４は、新規チェックポイントとして記載されている。ＣＤ１５５／ＰＶＲ受容体は正常な発達において役割を果たして得るが、この受容体は、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌、白血病（ＡＭＬを含む）、肉腫、卵巣癌、結腸癌、膵臓癌、肺癌、および悪性末梢神経鞘腫瘍などの稀ではあるが致死性の高い癌などの悪性腫瘍を含む特定の病理学的状態で過剰発現される。ＣＤ１５５／ＰＶＲは、細胞接着、運動性、アポトーシス、増殖、および転移において役割を果たす。修飾ポリオウイルスは、腫瘍への直接局所投与により、ＣＤ１５５／ＰＶＲを過剰発現する癌を治療するためのベクターとして利用されている。

【0004】

世界中の人口の大多数がポリオウイルスに対するワクチン接種を受けており、ポリオウイルスベースの治療薬は全身投与すると免疫系によって無力化される可能性が高いため、癌に対する修飾ポリオウイルス治療薬の全身投与は実現不可能である。

【0005】

ＣＮＳ癌および全身癌を治療できる、ＣＤ１５５に対する抗体ベースの治療薬があれば有利である。このようなＣＤ１５５抗体は、血液脳関門を通過することによって、またはそれ自体の治療薬として、もしくは別の治療薬の送達剤としてのいずれかの他の経路のいずれかを通じて中枢神経系に侵入することもできる。本開示では、マウスＣＤ１５５／ＰＶＲを標的とするモノクローナル抗体が、全身投与により中枢神経系に進入し得、インビボで脳にＧＬ２６１腫瘍を有するマウスにおいて血液脳関門を通過できることが示される。実施形態では、ヒトおよびマウスのＣＤ１５５／ＰＶＲを標的とするモノクローナル抗体は、内部移行可能であり、ｍＲＮＡなどのペイロードを送達および発現するために利用されることも示されている。ヒトの血液脳関門を通過する抗体およびペプチドが知られている。例えば、トランスフェリン受容体に対する抗体または抗原結合フラグメントは、動物モデルおよびさらに最近ではヒトにおいて血液脳関門を通過することが示されている。ＦＣ５およびＦＣ４４などの単一ドメイン抗体またはポリペプチドの配列も本分野で公知であり、ＦＣ５およびＦＣ４４は血液脳関門を通過する。血液脳関門通過分子を組み込んだ治療薬が臨床試験に入っているか、臨床試験に入ることになる。インスリン受容体およびインスリン成長因子１受容体に対する抗体またはリガンドは、血液脳関門を通過し、本発明に記載の抗ＣＤ１５５抗体に融合できるペプチドおよびタンパク質のさらに他の例である。実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体は、抗ＣＤ１５５抗体が血液脳関門を通過できるようにするために、化学的に、または組換え分子生物学のいずれかを通じてタンパク質またはペプチドと融合される。Ｄ１７１、Ａｂ８２５、およびその任意のヒト化バージョンを含む抗ＣＤ１５５抗体は、ＦＣ５、ＦＣ４４、抗１型インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、ならびに（トランスフェリン受容体１またはトランスフェリン受容体２に対する）抗トランスフェリン受容体抗体、および抗原結合フラグメントなどのペプチドまたはタンパク質（または抗体）に融合もしくは化学的にライゲーションするか、または組換え技術で生成することができる。このような構築物は、抗ＣＤ１５５抗体の血液脳関門の通過を促進する。

【発明の概要】

【0006】

ＣＤ１５５およびネクチン４は、新規チェックポイントとして記載されており、これらの新規チェックポイントの役割は免疫腫瘍学において非常に重要である。ＣＤ１５５がＴ細胞免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）に結合すると、Ｔ細胞およびＮＫ細胞が阻害される。最近、ネクチン４がＴＩＧＩＴに結合することも示されており、それによって、ネクチン４を発現する腫瘍は免疫細胞、特にＴ細胞を阻害すると考えられている。さらに、可溶性ＣＤ１５５レベルは概して、ＣＤ１５５を過剰発現する腫瘍患者の方が高くなる。膜性ＣＤ１５５および可溶性ＣＤ１５５（ｓＣＤ１５５）のレベルの上昇は、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）を下方制御することによって少なくとも部分的に免疫抑制効果を有し得る。ＣＤ１５５に対する本発明に記載の抗体は、ＣＤ１５５（膜性または可溶性ＣＤ１５５）に結合することができ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）の上方制御をもたらす。また、ＣＤ１５５およびネクチン４の両方に結合する抗体を使用して、ＣＤ１５５またはネクチン４のいずれかを過剰発現する癌（またはＣＤ１５５とネクチン４の両方を発現する癌）を標的にし得る。抗ＣＤ１５５抗体は、チェックポイント経路を遮断するために使用することもできるし、またはそれらは、ＣＤ１５５（またはネクチン４）に結合し、さらにＴ細胞またはＮＫ細胞にも結合する二重特異性抗体を産生するために使用することもでき、これにより、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が関与して腫瘍細胞を死滅させることができる。現在までに、ＣＤ１５５を標的とするＡＤＣは臨床試験中ではなく、ＦＤＡによって承認されたものはない。しかし、ネクチン４を標的とするエンフォルツマブベドンチン（ＥｎｆｏｒｔｕｍａｂＶｅｄｏｎｔｉｎ）は、膀胱癌の治療用としてＦＤＡに承認されたＡＤＣである。抗体薬物コンジュゲートは、ＣＤ１５５（またはネクチン４）を過剰発現する癌患者を治療するために、本明細書に記載のヒト化抗体を使用して調製され得る。この開示の一部として、ＣＤ１５５に対する抗体がペイロードを送達することが示されている。この場合、ＣＤ１５５を過剰発現する癌細胞にｍＲＮＡが送達され、発現された。さらに、ＣＤ１５５またはネクチン４に結合する抗原結合フラグメントは、ネクチン４またはＣＤ１５５のいずれかを発現する腫瘍の治療のために免疫細胞（すなわち、ＣＡＲＴ細胞およびＣＡＲＮＫ細胞）のキメラ抗原受容体に組み込むことができる。ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、チロシンキナーゼ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤などの他の小分子治療薬と組み合わせて使用したり、ならびに既知のチェックポイント標的に対する抗体と組み合わせて使用したりすることもできる。本開示の抗体は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＤ１１２Ｒ、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＥＡＣＡＭ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ｒ、ならびに本分野でよく知られている他のチェックポイントを標的とする１つ以上のチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され得る。

【0007】

実施形態では、本明細書で説明されるＣＤ１５５およびネクチン４に対する抗体および抗原結合フラグメントは、セラノスティクスとして開発され得、ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、癌の診断または治療のいずれかために、以下の（ａ）Ｉ－１２４、（ｂ）ガリウム６８または（ｃ）ルテチウム１７７のうちの１つの放射性標識を含む。

【0008】

本開示は、ＣＤ１５５およびネクチン４に対するモノクローナル抗体を用いた様々な疾患の治療に関する。本開示の実施形態は、治療薬；ＣＤ１５５に結合できる非ウイルスリガンドを含む組成物を患者に投与することを含む哺乳類における全身性障害または神経障害を治療する方法であり、リガンドは、神経障害または全身性障害を治療するために治療薬にコンジュゲートされる。実施形態では、神経障害は原発性または転移性脳腫瘍である。実施形態では、神経障害または全身性障害は、以下の原発性または転移性癌（ｉ）多形神経膠芽腫；（ｉｉ）神経芽腫；（ｉｉｉ）希突起膠腫、（ｉｖ）神経膠腫、（ｖ）星状細胞腫、（ｖｉ）未分化星状細胞腫、ならびに（ｖｉｉ）髄膜腫、ならびに（ｖｉｉｉ）乳癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌および転移性黒色腫の原発性または転移性癌からなる群からの少なくとも１つである。実施形態では、障害は、（ｉ）乳癌（ＴＮＢＣを含む）；（ｉｉ）肺腺癌；（ｉｉｉ）黒色腫；（ｉｖ）卵巣癌；（ｖ）ＡＭＬ；（ｖｉ）肉腫；（ｖｉｉ）白血病；（ｖｉｉｉ）膀胱癌；（ｉｘ）膵臓癌；（ｘ）子宮頸癌；（ｘｉ）結腸直腸癌；（ｘｉｉ）類表皮癌；（ｘｉｉｉ）肝細胞癌；（ｘｉｖ）悪性神経膠腫；（ｘｖ）悪性末梢神経鞘腫瘍および黒色腫からなる群からの少なくとも１つであり、実施形態では、腫瘍はＣＤ１５５を過剰発現する。実施形態では、腫瘍はネクチン４を過剰発現する。実施形態では、腫瘍はＣＤ１５５とネクチン４の両方を発現する。

【0009】

実施形態では、リガンドは、以下からなる群からの少なくとも１つである：（ｉ）ＣＤ１５５またはネクチン４に対する抗体；（ｉｉ）ＣＤ１５５またはネクチン４に対する抗原結合フラグメント。実施形態では、リガンドは血液脳関門を通過するものである。実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ１５５に結合する第１のセグメントと、治療薬である第２のセグメントとを含む。実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは治療薬にコンジュゲートされており、治療薬は、（ｉｉ）プロドラッグ；（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡ；（ｉｖ）アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ；（ｖ）メッセンジャーＲＮＡ；および（ｖｉ）ＣＲＩＳＰＲ用のガイドＲＮＡ；（ｖｉｉ）プラスミド；（ｖｉｉ）一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）；（ｖｉｉｉ）ペプチド；（ｉｘ）タンパク質；（ｘ）遺伝子および（ｘｉ）毒素からなる群からの少なくとも１つである。実施形態では、リガンドは、ネクチン、ネクチン２（ＣＤ１１２）、ネクチン４、Ｎｅｅｌ、ＰＶＲＬ１、Ｎｅｃｌ－１、Ｎｅｃｌ－４、ポリオウイルス受容体関連１タンパク質、またはポリオウイルス受容体関連２タンパク質に結合できる。実施形態では、抗体または抗原結合フラグメント薬物コンジュゲートは、治療薬を封入するリポソームまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をさらに含む。実施形態では、リポソームは、リガンドに架橋されたペグ化リポソームである。実施形態では、リガンドは、Ｄ１７１抗体、またはＤ１７１重鎖可変領域の配列もしくはＤ１７１軽鎖可変領域の配列に対して７５％超の相同性を有する重鎖可変領域配列もしくは軽鎖可変領域配列を有する抗体である。

【0010】

実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体は、ＣＤ１５５の細胞内、膜貫通、または細胞外エピトープに特異的に結合する。実施形態では、Ｄ１７１はＣＤ１５５のアミノ酸３５～５０に特異的に結合する。実施形態では、ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは腫瘍に結合し、癌性増殖または腫瘍に対する免疫応答を誘発する。実施形態では、完全抗体、抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｃ、ならびにｓｃＦｖ、軽鎖および／または重鎖の可変領域からなる群から選択される少なくとも１つの抗体は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞または他の免疫細胞と結合するため、あるいは抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を刺激するために、ＣＤ１５５に結合する第１の成分を含み、第２の成分がエフェクター細胞に結合する。実施形態では、少なくとも１つは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体から選択される。実施形態では、エフェクター細胞は、ナチュラルキラー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含むリンパ球からなる群からの少なくとも１つである。実施形態では、抗体は、静脈内、動脈内、腫瘍内、くも膜下腔内、筋肉内、皮下、膀胱内（つまり、膀胱）、腹腔内、および対流促進送達を介する、からなる群からの少なくとも１つの方法によって投与される。

【0011】

実施形態では、完全抗体、抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｃ、およびｓｃＦｖ、またはＣＤ１５５に結合する第１の成分を含む他の抗原結合フラグメントならびに抗体依存性細胞媒介性細胞毒性または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を刺激するためのエフェクター細胞に結合する第２の成分からなる群から選択される少なくとも１つの抗体。本開示の実施形態は、全身投与または局所投与のいずれかによって中枢神経系に治療薬を送達する方法である。一実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントは、哺乳類の血液脳関門を通過することができ、ＣＤ１５５を標的とする非ウイルスリガンドを哺乳類の血流に投与することを含み、非ウイルスリガンドは治療薬とコンジュゲートされる。実施形態では、哺乳類は脳腫瘍を有する。実施形態では、哺乳類は、腫瘍ではない脳の有害な症状に苦しむ。一実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントは、それ自体が治療薬であるか、またはそれは、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、および悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）などの肉腫などの全身性疾患の治療のための治療薬を送達する。

【0012】

実施形態では、核酸ベースの薬物は、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる。実施形態では、核酸ベースの薬物は、ＣＤ１５５にも結合する抗ネクチン４抗体にコンジュゲートされる。本開示の実施形態は、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５を含む組成物である。本開示の実施形態は、Ｃ末端から１０アミノ酸を超えるセレノシステイン残基を含むヒト化Ａｂ８２５などのヒト化抗ＣＤ１５５抗体である。

【0013】

本開示の実施形態は、ＡＤＣＣを増強するために最適化されたＦｃ領域を含むヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体である。本開示の実施形態は、ＣＤＣに対して最適化されたヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体である。本開示の実施形態は、ＭＲＩ／ＣＴ用の造影剤にコンジュゲートされたヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体である。本開示の実施形態は、ＰＥＴスキャン用の診断薬にコンジュゲートされたヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体である。本開示の実施形態は、ＩＲ８００などの蛍光プローブにコンジュゲートされたヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体である。本開示の実施形態は、放射線増感剤にコンジュゲートされたヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体である。本開示の実施形態は、キレーターにコンジュゲートされたヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体である。本開示の実施形態は、放射性同位体にコンジュゲートされたヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体である。本開示の実施形態は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖または二本鎖ＤＮＡなどの核酸治療薬にコンジュゲートされたヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａ８ｂ２５抗体である。本開示の実施形態は、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体であり、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体は治療薬である。本開示の実施形態は、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体であり、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５は、ＴＩＧＩＴへのＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体）の結合を遮断する。本開示の実施形態は、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体であり、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体は、ＴＩＧＩＴへのネクチン４の結合を遮断する。

【0014】

本開示の実施形態は、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体であり、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５は、ＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体）を遮断し、その後、ＮＫ細胞またはＴ細胞（または両方）上のＤＮＡＭ１の発現を上方制御する。本開示の実施形態は、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５抗体であり、ヒト化Ｄ１７１抗体またはヒト化Ａｂ８２５は、ＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体）を遮断し、その後、Ｔ細胞上のＤＮＡＭ１の発現を上方制御する。上記のすべては、ＣＤ１５５およびネクチン４に対する抗原結合フラグメントにも当てはまる。

【0015】

本開示の実施形態は、ＣＤ１５５に結合する抗体または抗原結合フラグメントを投与するステップを含む、ＣＤ１５５を過剰発現する哺乳類における腫瘍の範囲を特定する方法であり、抗体または抗原結合フラグメントは標識とコンジュゲートされている。実施形態では、標識は、放射性同位体、発色団、フルオロフォア、および酵素からなる群から選択される少なくとも１つである。実施形態では、標識は、ガンマ線または陽電子放出放射性同位体、磁気共鳴画像造影剤、Ｘ線造影剤、および超音波造影剤からなる群から選択される。実施形態では、セレノシステイン残基は、標識をＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントとコンジュゲートさせるために利用される。実施形態では、イメージング（画像化）は、ＣＴ、超音波、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴからなる群から選択される少なくとも１つの技術によって行われる。実施形態では、イメージングは、術前、術中、および術後からなる群から選択される少なくとも１つの期間中に実行される。本開示の実施形態は、血液脳関門を越えて治療薬を送達する方法であり、治療薬は抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる。上記は、以下の詳細な説明がより良く理解できるように、本開示の特徴をかなり広範に概説した。本開示の追加の特徴および利点を以下に説明し、これらは特許請求の範囲の主題を形成する。実施形態では、原発腫瘍または転移腫瘍はＣＤ１５５を過剰発現する。実施形態では、原発腫瘍または転移腫瘍はネクチン４を過剰発現する。

【0016】

実施形態では、本開示に記載される抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ１５５陽性腫瘍の治療のための治療用キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）または治療用キメラ抗原受容体ＮＫ細胞の一部として発現される。実施形態では、本開示に記載されるヒト化抗体または抗原結合フラグメントは、ネクチン４陽性腫瘍の治療のための治療用キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）または治療用キメラ抗原受容体ＮＫ細胞の一部として発現される。

【0017】

実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントは血液脳関門を通過することができる。実施形態では、融合タンパク質は少なくとも２つのセグメントを含み、第１のセグメントはＣＤ１５５またはネクチン４に結合し、第２のセグメントは血液脳関門の通過を促進する。実施形態では、細胞治療薬は、ＣＤ１５５および／またはネクチン４に結合する抗原結合フラグメントを発現するＴ細胞を含む。実施形態では、方法はさらに、リポソームまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマーまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。実施形態では、ヒト化Ｄ１７１抗体またはＤ１７１抗体に対して少なくとも９０％の相同性を有する抗体は、ＣＤ１５５のアミノ酸３５～５０に特異的に結合する。実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ１５５および／またはネクチン４を発現する原発または転移腫瘍に結合し、結合後、原発または転移腫瘍に対する免疫応答を誘発する。

【0018】

実施形態では、完全抗体、抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｃ、ｓｃＦｖからなる群から選択される少なくとも１つの抗体またはフラグメントは、ＣＤ１５５に結合する第１の成分およびエフェクター細胞に結合する第２の成分を含む。実施形態では、完全抗体、抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｃ、ｓｃＦｖからなる群から選択される少なくとも１つは、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体から選択される。実施形態では、患者は、抗体もしくは抗原結合フラグメント、または上記の抗体のいずれか１つの抗体（もしくは抗原結合フラグメント）をコードするＤＮＡを患者に注射することによって治療され得、注射は、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、脳室内注射、腫瘍内注射、皮下注射、またはリンパ管内注射、小胞内注射（すなわち、膀胱癌またはＣＮＳの心室腫瘍）および腫瘍内注射および対流促進送達を介するのうちの少なくとも１つである。

【0019】

本開示の実施形態は、ＣＤ１５５を標的とする非ウイルスリガンドを哺乳類の血流に投与することを含む、哺乳類の血液脳関門を越えて治療薬を送達する方法であり、非ウイルスリガンドは治療薬とコンジュゲートされる。実施形態では、非ウイルスリガンドは、本出願に記載されるモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントである。実施形態では、治療薬はリポソームに封入され、リポソームは、ＣＤ１５５および／またはネクチン４に結合するモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる。実施形態では、哺乳類は脳腫瘍を有する。実施形態では、哺乳類は脳の有害な症状を有しており、脳の有害な症状は腫瘍ではない。実施形態では、治療薬は抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる。実施形態では、治療薬は抗ＣＤ１５５抗体または抗ＣＤ１５５抗原結合フラグメントにコンジュゲートされ、脳、脳幹、脊髄、または脳内の他のＣＤ１５５発現細胞の運動ニューロンの治療のために哺乳動物に投与される。本開示の実施形態は、別の治療用抗体の抗体または抗原結合フラグメントを抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントに融合させることによって、哺乳類の脳に抗体を送達する方法である。実施形態では、治療用抗体または治療用抗原結合フラグメントは、化学的、抗体操作、またはアビジン－ビオチンベースの架橋からなる群から選択される方法によって、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントに融合される。

【0020】

実施形態では、ＣＤ１５５に結合する抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントは、それ自体が治療薬である。実施形態では、抗ネクチン４抗体または抗原結合フラグメントは、それ自体が治療薬である。本開示の実施形態は、標識とコンジュゲートしたＣＤ１５５を標的とする非ウイルスリガンドを投与するステップ；および脳腫瘍をイメージングするステップを含む、ＣＤ１５５を過剰発現する哺乳類における腫瘍の範囲を特定する方法である。実施形態では、標識は、放射性同位体、発色団、フルオロフォア、および酵素からなる群から選択される少なくとも１つである。実施形態では、標識は、ガンマ線または陽電子放出放射性同位体、磁気共鳴画像造影剤、Ｘ線造影剤、および超音波造影剤からなる群から選択される。実施形態では、抗体または抗原結合フラグメント内のセレノシステイン残基は、標識を非ウイルスリガンドとコンジュゲートさせるために利用される。実施形態では、イメージング（画像化）は、ＣＴ、超音波、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴからなる群から選択される少なくとも１つの技術によって行われる。実施形態では、イメージングは、術前、術中、および術後からなる群から選択される少なくとも１つの期間中に実行される。

【0021】

実施形態では、ヒトポリオウイルス受容体に対するヒト抗体またはヒト化抗体は、一実施形態として、疾患の診断または治療のための治療薬としてレポーター分子への化学量論的コンジュゲートを促進するためにセレノシステイン残基で修飾される。実施形態では、ヒトポリオウイルス受容体に対するヒト抗体またはヒト化抗体は、腫瘍細胞などのＣＤ１５５を過剰発現する標的細胞に送達されるナノ粒子に直接結合または封入されたいずれかの小薬物分子などの治療薬とコンジュゲートされる。実施形態では、ヒトポリオウイルス受容体に対するヒト抗体またはヒト化抗体は、腫瘍細胞などのＣＤ１５５受容体を過剰発現する標的細胞の非手術時、術前、術中または術後の診断または治療のために、フルオロフォアまたは他のレポーター分子にコンジュゲートされる。

【0022】

実施形態では、ヒトポリオウイルス受容体に対するヒト抗体またはヒト化抗体は、抗体操作または化学結合のいずれかを通じて治療用ペプチドと融合される。実施形態では、ヒトポリオウイルス受容体に対するヒト抗体またはヒト化抗体は、二重特異性抗体を産生するために、化学的または抗体操作のいずれかによって別の治療用抗体（または抗原結合フラグメント）と融合され、１つの成分は、ヒトポリオウイルス受容体に対するヒト抗体またはヒト化抗体（または抗原結合フラグメント）である。実施形態では、ヒトポリオウイルス受容体に対するヒト抗体またはヒト化抗体は、ＣＤ１５５を過剰発現する腫瘍細胞に結合する。

【0023】

実施形態では、ヒトポリオウイルス受容体に対するヒト抗体またはヒト化抗体は、ネクチン４を過剰発現している腫瘍細胞にも結合する。本開示の実施形態は、Ｃ末端から１０個のアミノ酸を超えるセレノシステイン残基；ＡＤＣＣを強化するために最適化されたＦｃ領域；ＣＤＣの最適化；ＭＲＩ／ＣＴ用の造影剤との結合；ＰＥＴスキャン用の診断薬との結合；蛍光プローブとの結合；放射線増感剤との結合；キレート剤との結合；放射性同位体との結合；治療薬との結合；からなる群から選択される少なくとも１つを含む、ヒト化Ｄ１７１抗体もしくはヒト化Ａｂ８２５、またはＤ１７１抗体と同様の配列を有する抗体であり、ヒト化抗ＣＤ１５５抗体は治療薬である。本開示の実施形態は、ポリオウイルス受容体に結合し、ポリオウイルス受容体のＴＩＧＩＴへの結合を阻害する、本明細書に開示されるヒト化抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントを含む。別の実施形態は、ネクチン４に結合し、ネクチン４がＴＩＧＩＴに結合するのを阻害する、本明細書に開示されるヒト化抗ＣＤ１５５抗体および抗原結合フラグメントを含む。

【0024】

上記は、以下の詳細な説明がより良く理解できるように、本開示の特徴をかなり広範に概説した。本開示の追加の特徴および利点を以下に説明し、これらは特許請求の範囲の主題を形成する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

本開示の上記および他の強化および目的が達成される方法を得るために、添付の図面に示されるその特定の実施形態を参照して、上で簡単に説明した本開示のより具体的な説明を行う。これらの図面は本開示の典型的な実施形態のみを示しており、したがって本開示の範囲を限定するものとみなされないことを理解されたい。

【0026】

【図1】マウス抗ＩＬ１３アルファ２抗体およびマウス抗ＣＤ１５５抗体が、インビボでＧＬ２６１腫瘍内のＢＢＢを通過し、マウスＩＬ１３アルファ２（ｍＩＬ１３アルファ２）およびマウスＣＤ１５５（ｍＣＤ１５５）に結合することを示す。フルオロフォア標識マウス抗ＩＬ１３アルファ２受容体抗体およびフルオロフォア標識抗ＣＤ１５５抗体を試験マウスに注射した。フルオロフォア標識抗体は血液脳関門を通過し、Ｃ５７Ｂ１６マウスのＧＬ２６１腫瘍に蓄積した。ＧＬ２６１腫瘍は、マウスＣＤ１５５およびマウスＩＬ１３アルファ２受容体の両方の受容体を発現する。

【図2】インビトロでリポソームに封入されたｅＧＦＰｍＲＮＡにコンジュゲートしたＤ１７１モノクローナル抗体が内在化し、ＧＦＰがＵ８７腫瘍内で発現されることを示す。Ｕ８７腫瘍はヒトＣＤ１５５を過剰発現する。ヒトＣＤ１５５に対するＤ１７１モノクローナル抗体がリポソームに封入されたｅＧＦＰｍＲＮＡとコンジュゲートされ、Ｄ１７１抗体で機能化されたリポソームを含有する１０ｎｇ／ウェルのｅＧＦＰコードＲＮＡに２４時間曝露した後、Ｕ８７細胞におけるｅＧＦＰ蛍光を記録した。３つの細胞密度を調査した。

【図3】リポソームに封入されたフルオレセイン標識ｍＲＮＡおよびフルオレセインとコンジュゲートしたヒトＣＤ１５５に対するＤ１７１抗体が、Ｕ８７細胞の約８０％で検出されたことを示す。Ｄ１７１コンジュゲートは、インビトロでＵ８７細胞に内在化する。Ｕ８７細胞はＣＤ１５５を過剰発現することが知られている。

【図4】Ｕ８７ＭＧ腫瘍を有するマウスにおけるＡｂ８２５－ＶＴ６８０および対照ＶＴ６８０の注射後７２時間の腫瘍生物発光および色素蛍光イメージングの比較を示す。Ａｂ８２５－ＶＴ６８０コンジュゲートは、インビボでＵ８７ＭＧ腫瘍に結合し、蓄積する。対照マウスは未処理か、またはＶＴ６８０色素のみのいずれかで処理された。蛍光イメージングで実証されたように、蛍光標識抗ＣＤ１５５抗体で処理したマウスは腫瘍内に蓄積を示した。生物発光により、蛍光蓄積領域が生物発光イメージングで見られる腫瘍領域と相関していることが示された。

【図5】抗ＣＤ１５５抗体および抗原結合フラグメントの潜在的な作用のメカニズムを示す。ＣＤ１５５－ＴＩＧＩＴ相互作用およびＣＤ１５５－ＣＤ９６相互作用（図示せず）は、チェックポイント遮断の標的である。抗ＣＤ１５５抗体および抗原結合フラグメントは、（ａ）ＡＤＣＣ、（ｃ）チェックポイント遮断、（ｄ）放射線免疫療法、（ｅ）抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、（ｆ）一方がＣＤ１５５に結合し、他方がＴ細胞上のＣＤ３などの第２の受容体に結合する二重特異性抗体のために、および（ｇ）抗ＣＤ１５５ＣＡＲＴまたはＣＡＲＮＫ細胞を調製するために使用され得る。抗ＣＤ１５５抗体および抗原結合フラグメントはネクチン４にも結合し、本明細書で説明される構築物はネクチン４を標的にすることもできる。

【図6】ヒト化モノクローナル抗体ＶＨ３Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ／Ｖｋ２Ｎ９２Ｑ（サンプル２）およびＶＨ３Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ／Ｖｋ３Ｎ９２Ｑ（サンプル３）およびＶＨ４Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ／Ｖｋ３Ｎ９２Ｑ（サンプル４）を用いた５０人の患者サンプルにおけるＤＣＴ細胞アッセイを示す。試験した抗体および対照ごとの増殖の頻度（増殖のある患者サンプルの％）および刺激指数（ＳＩ）が表示されている。

【図7】ＣＤ１５５（ＰＶＲ）に対するヒト化抗体と細胞膜受容体ＰＶＲおよびネクチン４との強力かつ特異的な結合を実証する結合アッセイの結果を示す。細胞固定はない。インバースヒット（ＩｎｖｅｒｓｅＨｉｔ）は、ＰＶＲの天然リガンドであるＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）およびＴＩＧＩＴで見られる。アッセイは５０００超の膜受容体で行われた。ＰＶＲとネクチン４には強く特異的な結合が見られた。ＴＩＧＩＴおよびＣＤ２２６では、これらの受容体がＰＶＲのリガンドであり、アッセイ内で内因性ＰＶＲに結合してインバースヒットスポットが生成されるため、インバースヒット（白いスポット）が見られた。

【図8】ＨＡＰ１細胞、ベロ細胞およびＵ８７細胞を用いた、ＣＤ１５５に対するヒト化モノクローナル抗体のＥＣ５０による細胞結合研究。ＨＣＶＲのＮ５４ＱＤ５６ＥまたはＮ５４ＳＤ５６ＥまたはＬＣＶＲのＮ９２Ｅを備えたバリアントと比較した場合、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）にＮ５４ＳＤ５６Ｇを有するバリアントおよび軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）にＮ９２Ｑを有するバリアントは、ＣＤ１５５との結合親和性がより高かった。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本明細書に示される詳細は、例として、本開示の好ましい実施形態を例示的に説明することのみを目的とするものであり、かつ本開示のさまざまな実施形態の原理および概念的な態様について、最も有用で容易に理解できると考えられる説明を提供する目的で提示されている。この点について、本開示の基本的な理解に必要以上に詳細に本開示の構造的詳細を示す試みは行われておらず、図面を伴う説明により、本開示のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかとなる。

【0028】

以下の定義と説明は、以下の例で明確かつ曖昧なく変更されない限り、または意味の適用によって構成が無意味になるか本質的に無意味になる場合を除き、任意の将来の構成を制御することを意図している、または意図される。用語の構成によって意味がなくなったり、本質的に意味がなくなったりする場合、その定義はＷｅｂｓｔｅｒ’ｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ第３版から引用する必要がある。

【0029】

本明細書で使用される場合、「コンジュゲートした」とは、リガンドが、化学的、静電気的、または分子生物学のあらゆるツールを使用してリガンドと治療薬の融合構築物を作成することによって行われるが、これらに限定されないことを含む、治療薬に結合するあらゆる様式を指す。「分子生物学のすべてのツール」という記述には、慣習のキメラ抗原受容体の製造を含むが、これに限定されず、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、癌を含むがこれに限定されない疾患を排除するためのＣＡＲＴ細胞療法においてキメラ抗原受容体に組み込まれる。

【0030】

免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる抗体（Ａｂ）は、形質細胞によって産生される大きなＹ字型のタンパク質で、細菌およびウイルスなどの異物を識別して中和するために免疫系によって使用される。抗体は、抗原と呼ばれる外来標的の固有の部分を認識する。抗体の「Ｙ」の各先端には、抗原上の１つの特定のエピトープ（鍵に類似した構造）に特異的なパラトープ（錠に類似した構造）が含まれており、これら２つの構造が正確に結合できるようになる。

【0031】

二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡｂ、ＢｓＡｂ）は、２つの異なるモノクローナル抗体のフラグメントで構成され、結果的に２つの異なるタイプの抗原に結合する人工タンパク質である。このアプローチの最も広く使用されている用途は癌免疫療法であり、ＢｓＭＡｂは細胞傷害性細胞（Ｔ細胞上のＣＤ３のような受容体など）と腫瘍細胞上の受容体に同時に結合して腫瘍細胞を死滅させるように設計されている。

【0032】

血液脳関門（ＢＢＢ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）において循環血液を脳細胞外液（ＢＥＣＦ）から分離する高度に選択的な透過性関門である。血液脳関門は毛細血管内皮細胞によって形成されており、これらは少なくとも０．１Ｄｍという極めて高い電気抵抗率を持つ密着結合によって接続されている。血液脳関門は、受動拡散によって水、一部のガス、脂溶性分子の通過を可能にするだけでなく、神経機能に重要なグルコースおよびアミノ酸などの分子の選択的輸送も可能にする。

【0033】

コンジュゲートしたには、分子結合、化学結合、および静電結合が含まれますが、これらに限定されない。分子結合の例は抗体エンジニアリングである。化学結合の例は共有結合である。静電結合の例はビオチンおよびストレプトアビジンである。

【0034】

ＣＤ１５５は、免疫グロブリンスーパーファミリーのＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１５５は霊長類の細胞ポリオウイルス感染に関与しているため、一般にポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）として知られており、ＣＤ１５５の正常な細胞機能は上皮細胞間の細胞間接着結合の確立にある。ＣＤ１５５は３つの細胞外免疫グロブリン様ドメインＤ１～Ｄ３を持つ膜貫通タンパク質であり、Ｄ１はウイルスによって認識される。同義語にはＰＶＲ；ＣＤ１５５；ＨＶＥＤ；ＮＥＣＬ５；Ｎｅｃｌ－５；ＰＶＳ；およびＴＡＧＥ４が含まれる。

【0035】

融合タンパク質またはキメラタンパク質は、もともと別々のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子の結合によって生成されたタンパク質である。この融合遺伝子の翻訳により、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を備えた単一または複数のポリペプチドがもたらされる。

【0036】

融合タンパク質は、分子生物学技術、または２つの抗体もしくは抗原結合フラグメントの化学的結合を通じて生成される。

【0037】

実施形態では、抗体は、標識、架橋剤、または共有結合修飾による修飾に利用可能な官能基を有する。実施形態では、抗体上の官能基は、第一級アミン、スルフヒドリル基、炭水化物、セレノシステイン、または非天然アミノ酸の組み込みである。

【0038】

実施形態では、架橋剤を使用して、遺伝子、ポリペプチド、または小分子を抗体に連結することができる。実施形態では、架橋剤はヘテロ二官能性架橋剤であり得る。実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は、スクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、スクシンイミジルトランス－４－（マレイミジルメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、Ｎ－（（２－ピニルジチオ）エチル）－４－アジドサシルアミド（ＰＥＡＳ；ＡＥＴ）、４－アジド－２，３，５，６－テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル（ＡＴＦＢ、ＳＥ）、ベンゾフェノン－４－マレイミド、ベンゾフェノン－４－イソチオシアネート、４－ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステル、ヨードアセトアミドアジド、ヨードアセトアミドアルキン、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴマレイミドＤＩＢＯアルキン、アジド（ＰＥＯ）４プロピオン酸、スクシンイミジルエステル、アルキン、スクシンイミジルエステル、またはＣｌｉｃｋ－ｉＴスクシンイミジルエステルＤＩＢＯアルキンである。別の実施形態では、架橋剤は、ペプチド架橋剤感受性のカテプシン切断であり得る。別の実施形態では、架橋剤は、クリックケミストリー用のＢＣＮを有するアジド架橋剤などの部位特異的架橋に使用されるものであり得る。利用可能なリンカーを使用して、アジド（Ｎ３）を使用したクリックケミストリーに基づいて抗体をペイロードに架橋することができる。反応性官能基は各末端で同じである。反応性末端は、多くの場合、第一級アミンおよびスルフヒドリル基を標的とする。実施形態では、アジドは、銅触媒によるアジド－アルキン付加環化反応を介してアルキンと反応する。別の実施形態では、金属を含まないアジド－アルキン反応をコンジュゲートに使用することができる。実施形態では、架橋剤は、ＵＶ照射時に利用可能な部位と非特異的に反応する。

【0039】

ヒト抗体は、ヒト系もしくは他の哺乳類系で、または酵母もしくはファージ技術を使用して生成される抗体である。ヒト化抗体は、ヒトで自然に産生される抗体変異体との類似性を高めるためにタンパク質配列が修飾された非ヒト種からの抗体である。「ヒト化」のプロセスは通常、ヒトへの投与用に開発されたモノクローナル抗体（例えば、抗癌剤として開発された抗体）に適用される。特定の抗体を開発するプロセスに非ヒト免疫系（マウスにおけるそれなど）での生成が含まれる場合、ヒト化が必要になる場合がある。この方法で産生された抗体のタンパク質配列は、ヒトに自然に存在する相同抗体とは部分的に異なるため、ヒト患者に投与すると免疫原性を示す可能性がある。

【0040】

抗体のヒト化には、非ヒト抗体内の潜在的な免疫原性配列の除去が含まれる。免疫原性配列の代わりに、ヒトに対する免疫原性の低い配列が挿入され得る。特定の抗体をヒト化するには多くの方法がある。実施形態では、特定の非ヒト抗体をヒト化するには１年超かかる場合がある。実施形態では、ヒト抗体は、１）構造を検討してどの配列がヒトに対して免疫原性となるかを決定する、２）ヒトに対して免疫原性となる配列を除去する、３）抗体がその標的受容体に結合する能力を維持または改善する、４）標的受容体への抗体の結合を評価する、５）悪い免疫原性応答をスクリーニングする、６）悪い免疫原性応答の原因となる配列を除去するによってヒト化される。実施形態では、ソフトウェアを使用して、除去される可能性のある免疫原性配列を特定する。実施形態では、ソフトウェアで特定された配列を除去した後でも依然として悪い免疫原性応答があり、ソフトウェアは正確ではない。実施形態では、どの配列を除去するかを決定するためにインビトロ研究が行われる。異なる当事者が特定の抗体をヒト化する場合、特定の抗体の配列は異なる可能性がある。潜在的なアスパラギン酸異性化部位および脱アミド化を受けやすい部位を除去するには、ＣＤＲの変異が必要になる場合がある。ＣＤＲの変異は結合に影響を与える可能性があるため、抗体のヒト化はフレームワーク残基に限定されることがよくある。不安定な部位のヒト化と変異の目標は、注入反応のリスクと免疫原性のリスクを低く抑え、ＣＤＲ内の潜在的な脱アミド化および異性化部位を安定化することである。ヒト化後でも、異なるヒト化抗体は、異なる解離定数（Ｋｄ）、サイトカイン放出アッセイでの異なるプロファイル、ＥｐｉｓｃｒｅｅｎおよびＤＣＴＣｅｌｌＥｐｉｓｃｒｅｅｎアッセイに基づく異なる免疫原性プロファイルを有し得る。抗体Ｄ１７１またはＡｂ８２５のヒト化はこれまで教示されておらず、本発明で初めて教示される。Ａｂ８２５は、ヒト化変異体と比較した場合、注入反応のリスクが最も高いことが判明した。

【0041】

実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体は、血液脳関門を越えて治療抗体をナビゲートするために、別の治療抗体に融合され得る。実施形態では、承認された治療用抗体は、単独では血液脳関門を通過することができない。実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体は神経を通って逆行してＣＮＳに進入する。実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体は血液－ＣＳＦ関門を通って移動する。

【0042】

リガンドは、生物学的目的を果たすために生体分子と複合体を形成する物質（通常は小分子）である。タンパク質とリガンドの結合では、通常、リガンドはシグナルトリガー分子であり、標的タンパク質上の部位に結合する。本明細書に記載される多くの例において、リガンドが結合する標的タンパク質は細胞上の受容体である。ＣＤ１５５に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ１５５のリガンドとみなされる。

【0043】

非ウイルスとは、ウイルスとみなされるのに十分な構造を欠く、ＤＮＡ／ＲＮＡセグメントおよびタンパク質を含む任意のポリペプチドを意味する。非ウイルスにはさらに、ウイルスで始まりウイルスの一部を切断してポリペプチドを生成するプロセスを通じて生成される任意の複雑なポリペプチドを除外する。

【0044】

ポリペプチドは、アミノ酸残基が直鎖状に連なったものであり、ポリペプチドと呼ばれる。タンパク質には少なくとも１つの長いポリペプチドが含まれる。約２０～３０未満の残基を含む短いポリペプチドは、タンパク質とはほとんどみなされず、一般にペプチド、または場合によってはオリゴペプチドと呼ばれる。個々のアミノ酸残基は、ペプチド結合および隣接するアミノ酸残基によって結合される。

【0045】

タンパク質は、１つ以上のアミノ酸残基の長鎖からなる大きな生体分子、つまり高分子である。タンパク質は主にそれらのアミノ酸配列が互いに異なり、アミノ酸配列はそれらの遺伝子のヌクレオチド配列によって決定され、そして通常、アミノ酸配列によってタンパク質が特定の三次元構造に折りたたまれ、その活性が決定される。

【0046】

受容体は、通常、細胞の細胞膜表面内に埋め込まれており、細胞の外部から化学シグナルを受け取るタンパク質分子である。このような化学シグナルが受容体に結合すると、何らかの形の細胞／組織反応、例えば細胞の電気活動の変化が引き起こされる。この意味で、受容体は内因性の化学シグナルを認識して応答するタンパク質分子である。ＣＤ１５５はポリオウイルス受容体としても知られている。

【0047】

「治療有効量」とは、患者の腫瘍量を排除もしくは軽減するか、または転移を予防、遅延もしくは阻害する量である。用量は、腫瘍の性質、患者の病歴、患者の状態、細胞傷害性薬物の併用の可能性、および投与方法など、多くのパラメータによって異なる。投与方法には、注射（例えば、非経口、皮下、静脈内、腹腔内、くも膜下腔内、対流促進など）が含まれ、その場合、ＰＶＲに結合する分子または複合体は、非毒性の薬学的に許容される担体中で提供される。

【0048】

マウス（マウスＣＤ１５５に対する）細胞株とヒト（ヒトＣＤ１５５に対する）細胞株の両方において、これらの細胞株のそれぞれのポリオウイルス受容体に対するモノクローナル抗体を使用して、（例として）レポーター分子ＥＧＦＰのｍＲＮＡまたは遺伝子の送達は、核酸を封入したリポソームにコンジュゲートした抗ＣＤ１５５を介してＣＤ１５５を発現する細胞に送達された。Ｄ１７１抗体を使用して、ＣＤ１５５を発現するＵ８７腫瘍にリポソームに封入されたｍＲＮＡを送達した。Ｄ１７１のｍＲＮＡコンジュゲートを送達すると、ＧＦＰのｍＲＮＡが発現した。この送達システムは、結果に基づいて他の核酸および薬物にも拡張可能である。抗ＣＤ１５５モノクローナル抗体は予期せず中枢神経系に入り、腫瘍をコーティングした。この発見の潜在的な応用には、血液脳関門またはＣＮＳへの侵入を妨げる他の関門を通過するリガンドおよびリガンドコンジュゲートのトランスサイトーシスを促進するためのＣＤ１５５の利用が含まれ、トランスフェリン受容体の潜在的な代替手段を提供する。治療用ペプチドまたはタンパク質と、ＣＤ１５５に対する抗体またはＣＤ１５５に対する抗原結合フラグメントとの融合は、血液脳関門またはＣＮＳへの侵入を妨げる他の関門を通過する経路を提供し得る。ＣＤ１５５に対する抗体は、ヒトおよびマウス細胞株のＣＤ１５５に結合し、インビトロでマウスおよびヒト細胞により内在化される。マウスＣＤ１５５に対する抗体は、インビボで腫瘍に結合し、血液脳関門を通過する。抗ＣＤ１５５抗体は、ＣＤ１５５腫瘍を診断し、術前、術中、および術後にＣＤ１５５腫瘍の境界を定めるためのインビボでの診断可能性を有する。抗ＣＤ１５５抗体は、抗体指向性細胞傷害性などの免疫系の誘導を単独で、または他のペプチド、ポリペプチド、もしくは抗体と融合した抗ＣＤ１５５抗体のいずれかとして、治療の可能性を有し得る。毒素、タンパク質、ペプチド、薬物小分子、遺伝子、メッセンジャーＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドなどのＲＮＡまたはＤＮＡベースの薬物などのさまざまなカーゴ。上記のそれぞれを抗ＣＤ１５５抗体に直接結合することもでき、または、ＣＤ１５５に対する抗体は、毒素、タンパク質、ペプチド、薬物小分子、遺伝子、メッセンジャーＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなどのＲＮＡまたはＤＮＡベースの薬物を封入するナノ粒子／リポソームに結合させることができる。抗ＣＤ１５５抗体－ＰＶＲなどのリガンド－ＰＶＲ相互作用は、血液脳関門を通過する巨大分子のトランスサイトーシス経路として機能し得、トランスフェリンの代替となることが証明され得る。血液脳関門を通過する抗ＣＤ１５５抗体またはＰＶＲに結合する任意のリガンドは、抗ＣＤ１５５抗体または他のＰＶＲリガンドに融合またはコンジュゲートした薬物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドのトランスポーターとしても機能し得る。

【0049】

本開示で使用され得るリガンドは、抗ＣＤ１５５ＡＢを含むがこれに限定されず、さらに、ＣＤ１５５（および／またはネクチン４）に結合する抗体および抗原結合フラグメントの融合タンパク質、ならびにそのような抗体および抗原結合フラグメントの融合タンパク質が含まれる。なおもさらに、リポソームのリガンドコンジュゲートおよびＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾核酸もしくは他の治療薬の封入化、ならびにリポソームを含まない核酸または他の治療薬のリガンドコンジュゲートが含まれる。

【0050】

実施形態では、血液脳関門を通過することができる、ＣＤ１５５に対する抗体は、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、ＦｃＶ）、ヒト化抗ＣＤ１５５抗体、結合リポソーム／ナノ粒子を標的とする抗ＣＤ１５５抗体、および毒素、遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡベースの薬物または他の治療薬を含む封入されたまたは封入されていない治療薬；腫瘍の診断のため、または非手術時、術前、術中もしくは術後の腫瘍の輪郭を描くのに役立つ腫瘍もしくは腫瘍縁の特定のための、蛍光プローブまたは造影剤と結合した抗ＣＤ１５５抗体；を含むがこれらに限定されない群から選択され；抗ＣＤ１５５抗体は、タンパク質、ペプチド、毒素、または他の抗体もしくは抗原結合フラグメントに融合させて、トランスサイトーシスのためにＣＤ１５５を利用して血液脳関門を通って送達することができ、通過すると、ＣＤ１５５もしくは融合タンパク質のいずれか、またはその両方がＣＮＳ内の標的細胞に結合することができ；ＣＤ１５５に対する非コンジュゲート抗体は、それがＣＮＳおよびＣＤ１５５発現が高い非ＣＮＳ腫瘍において、抗体指向性細胞傷害性または補体指向性細胞傷害性を誘発する場合、治療薬として機能し得る。

【0051】

マウスの抗ＣＤ１５５抗体は予想外に血液脳関門を通過し、腫瘍に結合した。抗体は通常、ＢＢＢを通過しない。ポリオウイルス自体は、ＣＮＳに侵入するための他の経路を有する。実施形態では、抗体は神経疾患の治療に使用される。実施形態では、腫瘍がない場合に血液脳関門を越えて物質を送達することが有益であり得る。実施形態では、神経疾患は脳腫瘍ではない。抗体は、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆｃ、ｓｃＦｖ、炭水化物、可変領域、および定常領域を含むがこれらに限定されない様々な部分から構成される。

【0052】

抗体は、糖修飾、定常領域のアミノ酸の変更、異なるヒトｍＡｈアイソタイプ（ＩｇＧ４など）の使用、安定なリンカーを使用して同位体をｍＡｈに連結、切断可能なリンカーを使用して薬物をｍＡｈに連結、シグナル伝達ペプチドと融合したｍＡｂ可変領域のＤＮＡをＴ細胞に挿入してＣＡＲの発現を誘導すること、および２つのｍＡｂの領域を架橋すること、を含むがこれらに限定されない方法で修飾され得る。

【0053】

モノクローナル抗体ベース（ｍＡｂベース）の治療薬は、抗腫瘍ｍＡｂ、血管新生阻害、Ｔ細胞チェックポイント遮断、放射線免疫療法、抗体薬物コンジュゲート、二重特異性抗体、およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞を含む多くの機能を有するが、これらに限定されない。本発明の一実施形態には二重特異性抗体が含まれ、ここで、１つの抗体または抗原結合フラグメントは腫瘍細胞上に発現するＣＤ１５５（またはネクチン４）に結合し、抗体または抗原結合フラグメントは、Ｔ細胞上のＣＤ３（Ｔ細胞受容体）に結合し、それによってＴ細胞を腫瘍細胞に近づけて、Ｔ細胞媒介による腫瘍の死滅を強化する。別の実施形態には二重特異性抗体が含まれ、ここで、１つの抗体または抗原結合フラグメントが腫瘍細胞上のＣＤ１５５（またはネクチン４）に結合し、別の抗体または抗原結合フラグメントは、（すなわち、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭ受容体、またはＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、もしくはＮＫｐ３０などの天然の細胞傷害性受容体など）ＮＫ細胞上の受容体に結合し、それによりＮＫ細胞を腫瘍細胞に近づけて、ＮＫ細胞媒介による腫瘍の死滅を強化する。腫瘍特異的ＩｇＧの免疫媒介効果には、ＡＤＣＣ、オプソニン化、およびＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。腫瘍特異的ＩｇＧの直接的な効果は、リガンドを遮断し、受容体の二量体化を阻害し、そしてアポトーシスシグナル伝達を誘導することである。抗ＣＤ１５５抗体および抗原結合フラグメントを、増殖因子受容体またはＦＣ５もしくはＦＣ４４またはトランスフェリン受容体（Ｔｆｒ１またはＴｆｒ２）などの１型インスリンに結合する抗体または抗原結合フラグメントとともに組み込んだ二重特異性製剤は、血液脳関門を通過しやすくするために調製され得る。

【0054】

神経腫瘍学用のモノクローナル抗体の開発に対する潜在的な制限は、ＢＢＢを通過できないことである。脳腫瘍を標的とするモノクローナル抗体は、まず（抗体が血管内腔からＢＢＢを通過して脳および中枢神経系に入る場合）ＢＢＢを通って、腫瘍に直接注射して（対流促進療法）、または髄腔内（髄液中）に直接注射してのいずれかで中枢神経系に入る必要がある。筋肉または神経を通る逆行性など、ＣＮＳへの侵入のための他のメカニズムが提案される必要がある。モノクローナル抗体がＣＮＳに進入した後でのみ、原発性頭蓋内脳腫瘍にそれが結合できる（脳腫瘍が末梢に転移している場合、抗体はＣＮＳに進入せずに腫瘍に結合できる）。

【0055】

実施形態では、ｍＲＮＡは、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントにコンジュゲートしたリポソーム内に封入される場合、細胞内に内在化され得る。抗ＣＤ１５５抗体Ｄ１７１は、ポリオウイルス受容体のアミノ酸残基３５～５０でポリオウイルス受容体に結合する。実施形態では、ヒトＣＤ１５５に対するヒト化抗体は、アンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ、または天然もしくは化学的に修飾された残基を有するプラスミドもしくは遺伝子を含むリポソームにコンジュゲートされる。別の実施形態では、リポソームは、天然の残基または化学的に修飾された残基を有するｍＲＮＡを含む。ヒトＣＤ１５５に対するヒト化抗体および結合リポソームは、血液脳関門を通過し、ｍＲＮＡまたは核酸治療薬をＣＤ１５５発現細胞に送達することができる。

【0056】

本開示は、リガンドコンジュゲートを介したｍＲＮＡおよび遺伝子を含む治療薬のウイルス送達を含み、モノクローナル抗体などのリガンドがＣＤ１５５／ＰＶＲに結合し、薬物またはｍＲＮＡ／遺伝子の発現（ｍＲＮＡ／遺伝子）の機能を可能にする治療薬の内在化およびその後の放出をもたらす。リポソームに封入されたｍＲＮＡにコンジュゲートしたＤ１７１抗体は、内在化可能であり、ｍＲＮＡがインビトロで腫瘍細胞で発現されたＣＤ１５５発現細胞にペイロードを送達できることが本明細書で示されている。この概念実証は、ヒト化抗ＣＤ１５５抗体薬物コンジュゲートを用いて核酸治療薬およびその他の薬物を細胞に送達するための基礎を築く。

【0057】

実施形態では、リガンドは、１）ＰＶＲ／ＣＤ１５５に対する抗体、２）ＰＶＲ／ＣＤ１５５に結合する抗体または抗原結合フラグメント、一部がＣＤ１５５／ＰＶＲに結合し、他の部分がジフテリアなどの毒素である、ＰＶＲ／ＣＤ１５５に結合する融合タンパク質、３）抗体または抗原結合フラグメントがＣＤ１５５／ＰＶＲに結合する、核酸または遺伝子などの治療薬またはプロドラッグにコンジュゲートした抗体または抗原結合フラグメント、であり得る。治療薬またはプロドラッグ、例えばドキソルビシン、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡもしくは他のアンチセンス分子、タンパク質もしくは酵素もしくはペプチドもしくはサイトカインをコードするメッセンジャーＲＮＡ、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ａｍＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ用のガイドＲＮＡ、または裸のＤＮＡ遺伝子もしくはプラスミド。ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、サイトカインの以下のｍＲＮＡ（ａ）ＩＬ２をコードするｍＲＮＡ、および（ｂ）ＩＬ７をコードするｍＲＮＡ、および（ｃ）ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡ、（ｄ）ＩＬ１５をコードするｍＲＮＡ、（ｅ）ＩＬ２１をコードするｍＲＮＡ、（ｆ）ＩＦＮガンマをコードするｍＲＮＡ、および（ｇ）ＩＦＮアルファをコードするｍＲＮＡ、および（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦをコードするｍＲＮＡのうちの１つをコードするｍＲＮＡにコンジュゲートされ得る。

【0058】

実施形態では、ヒト化抗ＣＤ１５５抗体は、ニューロン、星状細胞、再生中の筋肉、および脊髄を標的とするために使用され得る。ＣＤ１５５に対する抗体またはフラグメントまたは融合構築物に対する抗体は、単独またはコンジュゲートのいずれかとして、腫瘍の全範囲または腫瘍切除範囲の特定において、術前、術中、または術後の診断的役割を果たす。実施形態では、ＧＢＭ患者は、血液脳関門を通過するか、または腫瘍に直接注射される、ＣＤ１５５に対する蛍光標識抗体で術前に治療され、抗体蛍光の輪郭は、腫瘍切除に関して術中の外科医をガイドする。

【0059】

可溶性ＣＤ１５５は、可溶性ＣＤ１５５を添加して抗ＣＤ１５５抗体に結合させることにより、抗ＣＤ１５５抗体コンジュゲートの過剰摂取に対する解毒剤として機能させ得る。さらに、一実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体の抗体薬物コンジュゲートによる患者の治療に先立って、最初に非コンジュゲート抗ＣＤ１５５抗体を投与して正常細胞上のＣＤ１５５を遮断する。その後、抗ＣＤ１５５抗体薬物コンジュゲートを追加すると、ＣＤ１５５を過剰発現する腫瘍に向けられる。ＣＤ１５５に対する抗体またはフラグメントまたは融合構築物は、単独またはコンジュゲートのいずれかとして、脳内の腫瘍を、ＰＥＴスキャン、ＭＲＩ、核スキャン、ＣＴスキャン、超音波、および本分野で標準的な他のイメージング様式などのイメージングメカニズムによって、脳内の腫瘍の範囲で、特定するための診断用途を有する。

【0060】

ＩＶ．結論
ＣＤ１５５の機能は完全にはわかっていないが、ＣＤ１５５はＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを持つＴ細胞免疫受容体）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、およびＣＤ９６に結合することが示された。腫瘍の予後バイオマーカーである可溶性ＣＤ１５５は、ＣＤ１５５陽性腫瘍から分泌されることが多く、ＤＮＡＭ１との結合において機能し得る。膜性ＣＤ１５５および可溶性ＣＤ１５５は免疫系を抑制するように機能し得、その結果、ＣＤ１５５陽性腫瘍の増殖を可能にする。抗ＣＤ１５５抗体で可溶性ＣＤ１５５または膜性ＣＤ１５５を遮断すると、免疫抑制を逆転させることができる。抗ＣＤ１５５抗体によるＣＤ１５５の遮断は、ＣＤ１５５のＴＩＧＩＴへの結合も遮断し、したがってＣＤ１５５－ＴＩＧＩＴ結合によって伝達される阻害シグナルを減少させることができる。したがって、ＣＤ１５５は新規チェックポイントであり、抗ＣＤ１５５抗体によるＣＤ１５５調節は、複数の作用のメカニズムを使用して癌を治療するための新規経路を提供する。ＣＤ１５５は筋肉および腎臓などの正常組織では低レベルで見られるが、ＣＤ１５５は多くの異なる癌で過剰発現しているため、ＣＤ１５５は多種多様な悪性腫瘍の治療における新規でありながら一般的な標的となっている。同様に、本発明に記載されているように、本発明のモノクローナル抗体は、ＣＤ１５５だけでなく、別の腫瘍マーカーであるネクチン４にも結合した。本発明のモノクローナル抗体がネクチン４に結合することが初めて示された。本発明のヒト化抗体に関連するモノクローナル抗体Ｄ１７１およびＡＢ８２５（Ａｂ８２５およびＡＢ８２５は、本明細書および図および特許請求の範囲では互換的に使用される）は、ネクチン４に結合することがこれまで示されたことはなかった。最近、ネクチン４がＴＩＧＩＴに結合することが示された。一実施形態では、本発明の抗体は、ネクチン４およびＰＶＲの両方のＴＩＧＩＴとの結合を遮断し、それによってＴ細胞などの免疫細胞への阻害シグナルを遮断する。別の実施形態では、ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、追加の薬物、細胞療法、またはチェックポイント分子に対する抗体から構成される免疫調節剤と組み合わせて、癌の治療のためにヒトに投与される。ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＤ１１２Ｒ、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＥＡＣＡＭ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ｒ．からなる群から選択される免疫チェックポイント分子に対する抗体から構成される追加の免疫調節剤と組み合わせてヒトに投与される。

【0061】

実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントは、抗トランスフェリン受容体抗体または抗原結合フラグメントなどの血液脳関門を通過することが知られている抗体または抗原結合フラグメント（または血液脳関門を通過するＦＣ５抗体もしくは抗原結合フラグメント）に融合される。抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントは、化学的または組換え技術のいずれかによって血液脳関門を通過する抗体（または抗原結合フラグメント）に結合させることができ、それにより抗ＣＤ１５５抗体が血液脳関門を通過できるようにする。別の実施形態では、本発明に記載の抗体を含む二重特異性抗体は、腫瘍上のＣＤ１５５（またはネクチン４）およびＴ細胞上のＣＤ３に結合する。別の実施形態では、本発明に記載の抗体の１つ以上を含む二重特異性抗体は腫瘍上のＣＤ１５５（またはネクチン４）に結合し、二重特異性抗体の別の部分はＮＫ細胞上の受容体（すなわち、ＮＫ細胞上のＣｄ１６、ＳＬＡＭ受容体、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ３０）に結合する。実施形態では、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントは、抗トランスフェリン受容体抗体または抗原結合フラグメントなどの血液脳関門を通過することが知られている抗体または抗原結合フラグメント（または血液脳関門を通過するＦＣ５抗体もしくは抗原結合フラグメント）に融合される。抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントは、化学的または組換え技術のいずれかによって血液脳関門を通過する抗体（または抗原結合フラグメント）に結合させることができ、それにより抗ＣＤ１５５抗体が血液脳関門を通過できるようにする。本発明の抗体は、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）に結合して遮断する。本発明のヒト化モノクローナル抗体は、ポリオウイルス受容体を遮断し、ポリオウイルスがポリオウイルス受容体（ＰＶＲ；ＣＤ１５５）に結合するのを妨げることにより、ポリオウイルスに曝露された患者を治療するために使用され得る。

【0062】

一実施形態では、本発明の抗体をヒトを含む哺乳類に投与して、Ｔ細胞上のＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）の発現を上昇させることによってＨＩＶなどの感染症を治療することもできる。同様に、別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｔ細胞およびＮｋ細胞上のＤＮＡＭ１の発現を上昇させることによって敗血症を治療するために使用され得る。本発明のＣＤ１５５に対するヒト化抗体の過剰摂取は、可溶性ＣＤ１５５を投与してヒト化抗体に結合し、その効果を中和することによって治療できると考えられる。本発明の別の実施形態では、ＡＢ８２５、Ｄ１７１、または任意のヒト化抗体は、ヒトＰＶＲを発現する動物においてインビボでＰＶＲ（ＣＤ１５５）に結合する。ヒトＰＶＲは、発現されたトランスジーンであってもよく、またはヒトＰＶＲは、マウスに移植されたＵ８７腫瘍細胞などのヒト細胞上で発現されてもよい。この研究以前には、Ａｂ８２５または本発明のヒト化抗体のいずれかは、生きた動物にインビボで注射されることはなかった。別の実施形態では、本発明に記載されるＡｂ８２５およびＣＤ１５５に対するヒト化抗体は、アフリカミドリザル由来のベロ細胞に結合することが示されており、したがって、これらの抗体は、非ヒト霊長類のＰＶＲ（ＣＤ１５５）に結合する（図８）。

【0063】

Ｄ１７１抗体は、リポソームに封入されたｍＲＮＡにコンジュゲートされ、ヒトＵ８７ＭＧ腫瘍内にうまく送達され、発現された抗ＣＤ１５５抗体である。抗ＣＤ１５５抗体（Ｄ１７１）が内在化し、Ｄ１７１にコンジュゲートしたリポソームｍＲＮＡが内在化して発現されたことが初めて示された。この研究は、本発明におけるＤ１７１、ＡＢ８２５および関連するヒト化抗体の抗体薬物コンジュゲートを作製するための基礎的なサポートを提供した。Ｄ１７１の内在化およびヒト腫瘍細胞にペイロードを運ぶその能力もまた、本発明の実施形態である。ｅＧＦＰ－ＲＮＡ含有リポソームおよびフルオレセインＲＮＡ含有リポソームを用いた取り込み実験では、試験した他のすべてのコンジュゲートよりも抗ＣＤ１５５抗体コンジュゲートの明らかな優位性が示されたが、これは入手可能な少量で試験が可能な低濃度でのみであった。さらに、これらの結果は、コンジュゲート内のヒト特異的またはマウス特異的の両方のタイプのＣＤ１５５抗体で得られたため、この結果の堅牢性が強化されている。ｍＲＮＡは、Ｕ８７腫瘍内に内在化された後に発現された。別の実験では、Ｄ１７１抗体にコンジュゲートしたリポソームに封入されたフルオレセイン標識ｍＲＮＡを投与すると、Ｕ８７細胞の８０％超がフルオレセインで標識化された。この研究は、Ｄ１７１、Ａｂ８２５、および本発明のヒト化抗体などの他の関連抗体の抗体薬物コンジュゲートを作製するための基礎的な裏付けを初めて提供した。本発明におけるＤ１７１、Ａｂ８２５およびヒト化抗体の内在化能、ならびにヒト腫瘍にペイロードを運ぶその能力もまた、本発明の実施形態である。これらの結果の他に、抗ＩＬ－１３アルファ２コンジュゲートリポソームのみが、マウスバージョン（ＧＬ２６１）またはヒトバージョン（Ｕ８７ＭＧ）のさまざまな実験において、穏やかではあるが反復的な取り込みを示した。フルオレセインによるＲＮＡ蛍光標識は、ハイコンテンツイメージング（ＨｉｇｈＣｏｎｔｅｎｔＩｍａｇｉｎｇ）画像取得の場合、蛍光色素退色に対する感度が低い別のより強力な蛍光色素に置き換えることができる。機能性リポソームの取り込みは、インビボ条件に近い条件である（１０％血清を含む）完全培地中で調査された。機能化リポソーム中のｅＧＦＰコードＲＮＡの１０、５０または１００ｎｇ／ウェルを、３つの密度のＧＬ２６１またはＵ８７ＭＧ細胞に適用した。抗ＣＤ１５５抗体コンジュゲートは、入手可能な量が非常に多いため、１０ｎｇＲＮＡ／ウェルでしか試験できなかった。結果は、マウスおよびヒト抗体コンジュゲートについて、試験したすべての細胞密度で抗ＣＤ１５５抗体コンジュゲートリポソームの１０ｎｇＲＮＡ／ウェルを適用した後、細胞蛍光が繰り返し増加することを示す。

【0064】

抗ＣＤ１５５抗体のヒト化
Ａｂ８２５は、抗ＣＤ１５５抗体Ｄ１７１と配列を共有する抗体である。Ｄ１７１は、１９８５年にＮｏｂｉｓら（ＪＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ）によって初めて記載された。配列データは、Ｄ１７１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）が、Ａｂ８２５の重鎖可変領域（ＶＨ）配列と９０％超の同一の配列を有することを示した。Ｄ１７１抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）およびＤ１７１のＣＤＲも、Ａｂ８２５と配列において顕著な重複を持っている。Ｄ１７１とＡｂ８２５の配列におけるこのような高度な相同性を考慮すると、両方の抗体を別々にヒト化する必要はなかった。Ａｂ８２５配列は、潜在的な免疫原性配列を除去することによってヒト化された。Ａｂ８２５は、潜在的な脱アミド化および異性化部位についても分析され、そのうちの３つはＡｂ８２５のＣＤＲ内にあった。ヒト化に加えて、潜在的に不安定な部位が変異され、その後、抗体のパネルの結合特性が試験された。

【0065】

次に、最も最適な結合特性を持つヒト化抗ＣＤ１５５抗体をサイトカイン放出アッセイで、注入反応のリスク、増殖反応についてのＥｐｉｓｃｒｅｅｎＤＣＴ細胞アッセイ、５，０００を超える既知の膜受容体のパネルとのオフターゲットおよびオンターゲット結合、ならびにＰＶＲの結合部位のエピトープマッピングについて、試験した。抗体はまた、サルＣＤ１５５（アフリカミドリザル－ベロ細胞）に結合する能力に基づいて選択された。免疫原性配列の代わりに、ヒトに対する免疫原性の低い配列が挿入された。抗体は最初にフレームワーク領域で変異し、バリアントの結合および安定性について試験された。抗体がＰＶＲ受容体に結合する能力を評価した。ＰＶＲ受容体への結合は、多数の変異体において維持または改善または悪化した。実施形態では、ソフトウェアを使用して、除去される可能性のある免疫原性配列を特定する。ソフトウェアで特定された配列を削除した後でも、不良な免疫原性反応が残る可能性がある。ヒト化した後でも、さまざまな変異がヒト化抗体の結合または免疫原性に予測できない影響を与える。Ａｂ８２５配列を、免疫原性およびＣＤＲの不安定性／易罹病性（アスパラギン酸異性化部位または高リスクもしくは中リスクの脱アミド化部位など）について分析し、これらのいずれかがＣＤＲの立体構造、ひいては抗原結合（つまり、ＣＤ１５５への結合）に影響を与える可能性がある。無差別の中親和性および高親和性のＭＨＣクラス２結合配列も、ヒト化のために同定された。ＣＤＲ内の不安定な配列の変更の予測不可能な性質と、ＣＤ１５５への結合に対するフレームワーク残基の影響により、生成されたＣＤ１５５に対するヒト化抗体および易罹病性低下抗体を、ＣＤ１５５陽性ＨＡＰ細胞およびＣＤ１５５ノックアウトＨＡＰ細胞株で試験した。

【0066】

上記のように、ＣＤ１５５としても知られるポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）は、神経膠芽腫、悪性髄膜腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、膵臓癌、肺癌、および結腸直腸癌を含むＧＩ悪性腫瘍、トリプルネガティブ（ＴＮＢＣ）を含む乳癌を含む多くの癌で過剰発現される。ポリオウイルス受容体は、受容体密度は低いものの、脳および脊髄の運動ニューロンなどの細胞の健康な組織にも自然に存在する。さまざまな程度の効率でＣＤ１５５に結合できる抗体が知られている。このような既知の抗体の一例は、重鎖および軽鎖が本明細書においてＡｂ８２５と称されるヒトＩｇＧ１キメラ抗体に組み込まれたマウス抗体である。Ａｂ８２５は、ヒトＣＤ１５５に対するマウス抗体であるＤ１７１に由来する。Ａｂ８２５の重鎖可変領域（本明細書ではＶＨ０と称する）および軽鎖可変領域（本明細書ではＶＫ０と称する）は、ヒトおよび非ヒト霊長類のポリオウイルス受容体に結合する。重鎖可変領域ＶＨ０は配列番号１として開示され、軽鎖可変領域ＶＫ０は配列番号５として開示される。ＶＨ０、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、それぞれ配列番号２、配列番号３、および配列番号４として開示される。ＶＫ０、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のＣＤＲは、それぞれ配列番号６、配列番号７、および配列番号８として開示される。配列番号１～配列番号３１に列挙されるアミノ酸配列、ＣＤＲ定義およびタンパク質配列決定はＫａｂａｔによる。

【0067】

抗体をより安定にし、抗体を生きた人間の治療および診断目的に使用する場合の免疫原性と毒性を最小限に抑えるために、本発明の一態様は、この重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＫ）領域の修飾およびヒト化を含む。このような抗体または抗原結合フラグメントを形成するために、設計された可変領域遺伝子を、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常ドメインおよびヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードするベクターにクローニングした。キメラ抗体およびヒト化抗体（ＩｇＧ４Ｓ２４１Ｐを含む）をＣＨＯ細胞で一時的に発現させ、プロテインＡで精製し、Ｂｉａｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴）を使用してＰＶＲへの結合を試験した。

【0068】

抗体の結合特性に必須であると考えられる可変領域内の重要な制約アミノ酸を同定するために、Ａｂ８２５抗体可変領域の構造モデルを作成および分析した。この構造分析に基づいて、Ａｂ８２５ヒト化バリアントの生成に使用できる配列セグメントの大規模な予備セットが同定された。これらのセグメントは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に結合するペプチドのインシリコ分析のために選択および分析され、既知の抗体配列関連Ｔ細胞エピトープと比較された。ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する重要な非ヒト生殖細胞結合因子として同定された配列セグメント、または我々の分析で有意なヒットを記録した配列セグメントは廃棄された。これにより、セグメントのセットが減少し、セグメント間の接合部に潜在的なＴ細胞エピトープが含まれていないことを確認するために、上記と同様にこれらの組み合わせが再度分析された。選択された配列セグメントは、重要なＴ細胞エピトープを欠いた完全な可変領域配列に組み立てられた。ヒト化抗体の熱安定性と凍結融解安定性も測定した。

【0069】

上記の分析を利用して、５つの可変領域重鎖（ＶＨ１～ＶＨ５と指定）および４つの可変領域軽鎖（ＶＫ１～ＶＫ４と指定）が結合特性が強化されたものとして同定された。これらの領域は、以下の配列番号によって開示される：

【表1-1】

【表1-2】

【0070】

一実施形態では、本発明は、ＩｇＧアイソタイプのポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメントである。この抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２のＣＤＲ１および配列番号４のＣＤＲ３を有する、配列番号１、９、１０、１１、１２、または１３のいずれか１つからの重鎖可変領域を有する。ＣＤＲ２は配列番号３になるが、以下の修飾が１つ以上ある：
（１）ＣＤＲ２の６位のアスパラギンが、アラニン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリン、もしくはスレオニンのうちの１つで置換される；および／または
（２）ＣＤＲ２の８位のアスパラギン酸が、グルタミン酸、グリシン、もしくはアルギニンのうちの１つで置換される；および／または
（３）ＣＤＲ２の９位のスレオニンが、グルタミン酸またはリジンのうちの１つで置換される。

【0071】

軽鎖可変領域は、配列番号６のＣＤＲ１および配列番号７のＣＤＲ２を有する配列番号５、１４、１５、１６、または１７のいずれか１つである。ＣＤＲ３は配列番号８であるが、ＣＤＲ３の４番目の位置のアスパラギンが、アラニン、グルタミン酸、グリシン、リジン、グルタミン、またはセリンの１つで置換されている。

【0072】

別の実施形態では、ポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧアイソタイプである。しかしながら、この実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それらのＣＤＲに関して定義される。例えば、重鎖可変領域には、配列番号２のＶＨ０ＣＤＲ１および配列番号４のＶＨ０ＣＤＲ３が含まれる。繰り返すが、ＶＨ０ＣＤＲ２は配列番号３になるが、以下の修飾が１つ以上ある：
（１）ＣＤＲ２の６位のアスパラギンが、アラニン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリン、もしくはスレオニンのうちの１つで置換される；および／または
（２）ＣＤＲ２の８位のアスパラギン酸が、グルタミン酸、グリシン、もしくはアルギニンのうちの１つで置換される；および／または
（３）ＣＤＲ２の９位のスレオニンが、グルタミン酸またはリジンのうちの１つで置換される。

【0073】

軽鎖可変領域は、配列番号６のＶＫ０ＣＤＲ１および配列番号７のＶＫ０ＣＤＲ２を有する。ＶＫ０ＣＤＲ３は配列番号８であるが、ＣＤＲ３の４番目の位置のアスパラギンが、アラニン、グルタミン酸、グリシン、リジン、グルタミン、またはセリンの１つで置換されている。より好ましい抗体の実施形態は、前述の重鎖可変領域ＶＨ１～ＶＨ５（配列番号９～１３）および軽鎖可変領域ＶＫ１～ＶＫ４（配列番号１４～１７）の特定の組み合わせから開発された。ＶＨ３およびＶＨ４は、ＶＫ２およびＶＫ３とともに、Ｔ細胞エピトーププロファイルに基づいて最良の可変重鎖および軽鎖ヒト化バリアントの一つであると考えられた。ＶＫまたはＶｋは交換できるように使用される。ここでは、ＶＨおよびＶｈも交換できるように使用される。

【0074】

ＶＨＮ５４およびＶＫＮ９２（一文字のアミノ酸記号とアミノ酸位置番号を使用）で同定された潜在的な脱アミド部位、およびＶＨＤ５６に関連する潜在的な異性化部位に対処するために、まず、ＶＨ０／ＶＫ０キメラ抗体の変異によって一連のアミノ酸置換（ＶＨＮ５４およびＶＫＮ９２の潜在的なシーケンス易罹病性については６件、ＶＨＤ５６については５件）をＶＨおよびＶＫ領域に個別に導入した。ＶＨ０／ＶＫ０における置換の易罹病性減少には、ＶＨＮ５４Ｑ、Ｎ５４Ｓ、Ｄ５６ＥおよびＤ５６ＧとＶＫＮ９２ＥおよびＮ９２Ｑの変異が含まれ、ＶＨ０／ＶＫ０のこれらのバリアントは、ポリオウイルス受容体への結合について試験され、結合の分析の結果、次いで、ＶＨ３／ＶＫ２、ＶＨ３／ＶＫ３およびＶＨ４／ＶＫ３の特定の好ましいヒト化バリアントに組み合わせて組み込まれるように選択された。これらの修飾されたＶＨおよびＶＫ領域には、次の配列と名称がある：

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【0075】

これらのＶＨおよびＶＫ領域を使用して、ポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する９つの好ましい抗体（または抗原結合フラグメント）が同定され、それぞれ以下の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する：
（ｉ）ＶＨ３Ｎ５４ＱＤ５６Ｅ［配列番号１８］およびＶＫ２Ｎ９２Ｅ［配列番号１９］；
（ｉｉ）ＶＨ３Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ［配列番号２０］およびＶＫ２Ｎ９２Ｑ［配列番号２１］；
（ｉｉｉ）ＶＨ３Ｎ５４ＱＤ５６Ｅ［配列番号１８］およびＶＫ３Ｎ９２Ｅ［配列番号２２］；
（ｉｖ）ＶＨ３Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ［配列番号２０］およびＶＫ３Ｎ９２Ｑ［配列番号２３］；
（ｖ）ＶＨ４Ｎ５４ＱＤ５６Ｅ［配列番号２４］およびＶＫ３Ｎ９２Ｅ［配列番号２２］；
（ｖｉ）ＶＨ４Ｎ５４ＳＤ５６Ｅ［配列番号２６］およびＶＫ３Ｎ９２Ｅ［配列番号２２］：
（ｖｉｉ）ＶＨ４Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ［配列番号２５］およびＶＫ３Ｎ９２Ｅ［配列番号２２］；
（ｖｉｉｉ）ＶＨ４Ｎ５４ＱＤ５６Ｅ［配列番号２４］およびＶＫ３Ｎ９２Ｑ［配列番号２３］；
（ｉｘ）ＶＨ４Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ［配列番号２５］およびＶＫ３Ｎ９２Ｑ［配列番号２３］。

【0076】

これら９つの抗体をさらに試験したところ、最も好ましい結合プロファイルが、抗体（ｉｉ）ＶＨ３Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ［配列番号２０］およびＶＫ２Ｎ９２Ｑ［配列番号２１］；（ｉｖ）ＶＨ３Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ［配列番号２０］およびＶＫ３Ｎ９２Ｑ［配列番号２３］；および（ｉｘ）ＶＨ４Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ［配列番号２５］およびＶＫ３Ｎ９２Ｑ［配列番号２３］で見つかったことが示唆された。

【0077】

上記の抗体に加えて、本発明は、抗体を構成する新規な重鎖可変領域および軽鎖可変領域を包含することを意図している。例えば、配列番号９～１３および１８、２０、および２４～２６で特定されるＶＨ領域、ならびに配列番号１４～１７、１９、および２１～２３で特定されるＶＫ領域は、それぞれ、別個の発明とみなされる。本発明におけるヒト化抗体は、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）だけでなくネクチン４（ＰＶＲＬ４）にも結合することが示された。この抗体と本発明に記載の抗原結合フラグメントの二重特異性により、本発明に記載の抗体で治療できる腫瘍の範囲が広がる。Ｄ１７１およびＡｂ８２５に関連する本発明のヒト化抗体は、ＰＶＲに結合することに加えてネクチン４にも結合することが初めて示された。Ｄ１７１およびＡＢ８２５、またはそれらのバリアントのいずれかがネクチン４に結合することはこれまで示されていませんでした。

【0078】

別の実施形態は、以下を含む、ポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に対する抗体または抗原結合フラグメントを含む：
（ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６のうちの１つから選択される重鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３のうちの１つから選択される軽鎖可変領域。

【0079】

以下は、上記の抗体および抗原結合フラグメントを含むいくつかの実施形態である。上記の抗体または抗原結合フラグメントは、ネクチン４を発現する腫瘍の治療のためのプロドラッグまたは薬物にコンジュゲートされ得る。上記の抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）を発現する腫瘍の治療のためのプロドラッグまたは薬物に結合され得る。別の実施形態は上記の抗体薬物コンジュゲートを含み、薬物またはプロドラッグが以下：核酸、ベドンチン（ｖｅｄｏｎｔｉｎ）、ピロロベンゾジアゼピン、リポソーム化ドキソルビシン、トポイソメラーゼ阻害剤、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＤＭ１、パクリタキセル、テモゾロミド、ドキソルビシン、デルクステカン、放射線増感剤、テシリン、ドカクステル（ｄｏｃａｘｔｅｌ）およびＰＡＲＰ阻害剤のいずれか１つに由来する。一実施形態は、上記の抗体または抗原結合フラグメントを含み、抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合し、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）のＴＩＧＩＴへの結合を遮断する。一実施形態は、上記の抗体または抗原結合フラグメントを含み、抗体または抗原結合フラグメントはネクチン４に結合し、Ｔネクチン４のＩＧＩＴへの結合を遮断する。一実施形態は、非ヒト霊長類のＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合する上記の抗体または抗原結合フラグメントを含む。一実施形態は、上記の抗体または抗原結合フラグメントを含み、抗体または抗原結合フラグメントはネクチン４に結合する。別の実施形態は、上記の抗体または抗原結合フラグメントを含み、抗体または抗原結合フラグメントは、以下の（ａ）Ｔ細胞および（ｂ）ＮＫ細胞の少なくとも１つのＤＮＡＭイオンの上昇をもたらすＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合する。別の実施形態は、ポリオウイルス受容体またはネクチン４のいずれかに結合する抗体または抗原結合フラグメントと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する二重特異性抗体または抗原結合フラグメントの第２の部分とから構成される二重特異性抗体または抗原結合フラグメントを含む。別の実施形態は、ポリオウイルス受容体またはネクチン４のいずれかに結合する上記の抗体または抗原結合フラグメントと、ＮＫ細胞上の受容体に結合する二重特異性抗体または抗原結合フラグメントの第２の部分とから構成される二重特異性抗体または抗原結合フラグメントを含む。別の実施形態は、ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトに投与され、抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトにおいてＣＤ１５５に結合し、ポリオウイルスがＣＤ１５５に結合するのを防止する抗体または抗原結合フラグメントを含む。

【0080】

別の実施形態は、請求項６３に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含み、ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＤ１１２Ｒ、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＥＡＣＡＭ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、およびＡ２ｒからなる群から選択される免疫チェックポイント分子に対する抗体と組み合わせて、癌の治療のためにヒトに投与される。別の実施形態は、請求項６３に記載の抗体を含み、ＣＤ１５５に対する抗体は、Ｓ２４１Ｐヒンジ変異またはＳ２２８Ｐヒンジ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプを含む。別の実施形態は、請求項６３に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含み、ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、以下（ａ）Ｉ－１２４、（ｂ）ガリウム６８、または（ｃ）ルテチウム１７７、（ｄ）ＣＴスキャン用の造影剤、（ｅ）ＭＲＩスキャン用の造影剤、および（ｆ）ＰＥＴスキャン用の診断剤のいずれかの標識を含む。別の実施形態は、請求項６３に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含み、ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、以下のサイトカインのｍＲＮＡまたは遺伝子編集酵素のｍＲＮＡ（ａ）ＩＬ２をコードするｍＲＮＡ、（ｂ）ＩＬ７をコードするｍＲＮＡ、および（ｃ）ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡ、（ｄ）ＩＬ１５をコードするｍＲＮＡ、（ｅ）ＩＬ２１をコードするｍＲＮＡ、（ｆ）ＩＦＮガンマをコードするｍＲＮＡ、（ｇ）ＩＦＮアルファをコードするｍＲＮＡ、（ｈ）ＧＭＣＳＦをコードするｍＲＮＡ、（ｉ）Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ、（ｊ）Ｃａｓｌ２ａをコードするｍＲＮＡ、または（ｋ）Ｃａｓ１３をコードするｍＲＮＡ、のうちの１つをコードするｍＲＮＡにコンジュゲートされる。別の実施形態は、上記の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲＮＫ細胞を含む。別の実施形態は、上記の抗体または抗原結合フラグメントを含み、ＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、腫瘍上に発現されたＣＤ１５５に結合し、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して腫瘍に対する免疫応答を誘発する。実施形態は、Ｄ１７１抗体コンジュゲートが含まれ、Ｄ１７１抗体コンジュゲートは、ＣＤ１５５を発現する腫瘍に結合し、Ｄ１７１抗体コンジュゲートは腫瘍によって内在化される。

【0081】

別の実施形態は、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号５の軽鎖可変領域を有する抗体または抗原結合フラグメントを含み、抗体または抗原結合フラグメントはネクチン４に結合する。本発明のこの抗体または抗原結合フラグメントは、ネクチン４のＴＩＧＩＴへの結合を遮断する。この抗体または抗原結合フラグメントは、ネクチン４を発現する腫瘍の治療用のプロドラッグまたは薬物にコンジュゲートされ得る。配列番号１の重鎖可変領域および配列番号５の軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合フラグメントであって、抗体または抗原結合フラグメントはＰＶＲに結合し、ＤＮＡＭイオンＴ細胞またはＮＫ細胞の上昇を引き起こす。

【実施例】

【0082】

ＣＤ１５５およびネクチン４に対するヒト化抗体および抗原結合フラグメントの発明

【0083】

実施例１．チェックポイント遮断
ＣＤ１５５およびネクチン４はそれぞれＴＩＧＩＴのリガンドとして記載されている。ＴＩＧＩＴは免疫細胞上で発現されるため、ＣＤ１５５とＴＩＧＩＴの結合、またはネクチン４とＴＩＧＩＴの結合は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の阻害につながる。本発明の抗体によるＣＤ１５５またはネクチン４の遮断は、ＣＤ１５５またはネクチン４（または両方）のいずれかがＴＩＧＩＴに結合することを妨げる。ＰＶＲはＴＩＧＩＴの天然リガンドである（ＡｌｔｅｂｅｒｅｔａｌｉｎＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖｅｒｙｉｎＭａｙ２０２１）。ＰＶＲはＣＤ２２６およびＣＤ９６の天然リガンドでもある。Ｄ１７１は、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）がＴＩＧＩＴに結合するのを遮断することが示されている（Ｙｕｅｔａｌｉｎ２００９ｉｎＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｕｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅ１０（９）ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＦｉｇｕｒｅ４ｂａｎｄ４ｃ）。Ｒｅｃｈｅｓら（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒｉｎ２０２０）は、ネクチン４がＴＩＧＩＴのリガンドであることを示した。Ｄ１７１抗体はＰＶＲにも結合し、ＰＶＲがＣＤ９６に結合するのを遮断する（ＭｅｙｅｒｅｔａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ２８４（４）ｐａｇｅｓ２２３５－２２４４ｓｅｅａｌｓｏｐａｇｅ２２４２）。

【0084】

実施例２．Ｔ細胞およびＮＫ細胞エンゲージャー
ＣＤ１５５およびネクチン４に結合する本発明の抗体または抗原結合フラグメントを使用して、二重特異性抗体または二重特異性抗原結合フラグメントを作製することができる。二重特異性抗体または二重特異性抗原結合フラグメントは、二重特異性分子がＣＤ１５５およびＣＤ３（またはネクチン４およびＣＤ３）に結合する本発明の実施形態である。ｔｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒｉｎ２０１９Ｖｏｌ１０ｐａｇｅ５１５３のＭａらは、ＣＤ３およびＣＤ１５５を標的とする二重特異性抗体を作製した。これらの二重特異性は膀胱癌に対して活性があることが示された。さらなる例は、ＣＤ１５５（またはネクチン４）とＮＫ細胞上の受容体と結合して免疫細胞を関与させ、ＣＤ１５５（またはネクチン４）を発現する腫瘍を破壊する二重特異性を含む。本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントは、二重特異性抗体に組み込むことができる。

【0085】

実施例３．抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は本発明の実施形態であり、ここで、記載された抗体は、ベドンチン（Ｖｅｄｏｎｔｉｎ）、デルクステカン、およびテシリンなどの薬物にコンジュゲートされ、これらの薬物は本発明の抗体にコンジュゲートされ、ＣＤ１５５またはネクチン４（または両方）を発現する腫瘍に送達される。ＣＤ１５５を標的とするＡＤＣは、治療薬の送達に組み込まれ得る。標的受容体もチェックポイント分子であることを考慮すると、ＣＤ１５５に対するこれらのＡＤＣは複数の作用のメカニズムを有する。抗体薬物コンジュゲートは、カテプシン感受性ペプチド架橋剤を含むがこれに限定されない、本分野で知られている様々なリンカーを介してコンジュゲートされ得る。抗体または抗原結合フラグメントは、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、パクリタキセル、テモゾロミド、ドキソルビシン（リポソームドキソルビシンを含む）、デルクステカン、トポイソメラーゼ阻害剤、放射線増感剤、放射性標識抗体または抗原結合フラグメント、テシリン、任意のピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＤＭ１、ベドンチンおよびドカクステルならびにルカパリブなどのＰＡＲＰ阻害剤のような少なくとも１つの薬物とコンジュゲートしてもよい（抗体薬物コンジュゲート）。配列番号１の重鎖可変領域および配列番号５の軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合フラグメントは、フルオロフォアにコンジュゲートされ、そして、哺乳類に投与すると、抗体コンジュゲートが哺乳類のＣＤ１５５（ＰＶＲ）を発現する腫瘍に結合して蓄積した（図４）。

【0086】

実施例４．ＡＤＣ。
ｍＲＮＡを含む核酸送達を備えたＡＤＣ。ＣＤ１５５発現癌におけるｍＲＮＡの送達および発現を伴う、レポーター分子ＥＧＦＰのｍＲＮＡを封入するリポソームの抗ＣＤ１５５コンジュゲート。抗体または抗原結合フラグメントは、抗体または抗原結合フラグメントを介して送達される１つ以上の治療用核酸にコンジュゲートされることもでき、ここで、治療用核酸は、サイレンシングＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、長ＲＮＡ、リボザイム、メッセンジャーＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または非プラスミド二本鎖ＤＮＡ、ならびに短い一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡのうちのいずれか１つ以上である。抗体薬物コンジュゲートはまた、本発明の抗体または抗原結合フラグメントをｍＲＮＡとコンジュゲートする（リポソームに封入されるか、またはポリマーと複合体化される）ことによって調製され得、ここで、ｍＲＮＡは、ペプチド、タンパク質（ＩＬ１２、ＩＬ１５、またはＩＬ２など）および酵素（遺伝子編集酵素Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ、およびＣａｓ１３などの他のＣａｓ酵素など）をコードする。Ｄ１７１抗体コンジュゲートは、Ｄ１７１抗体コンジュゲートがＣＤ１５５を発現する腫瘍に結合し、Ｄ１７１抗体コンジュゲートが腫瘍によって内在化される場合に形成された（図２および図３）。ｍＲＮＡペイロードは、抗ＣＤ１５５抗体にコンジュゲートされて、ワクチンを含むポリペプチドおよびタンパク質をコードするｍＲＮＡを送達することができる。

【0087】

実施例５．ＤＮＡＭ１－ＣＤ１５５軸。
ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）の上昇は、ＣＤ１５５の遮断（膜性ＣＤ１５５または可溶性ＣＤ１５５の遮断）を伴う抗ＣＤ１５５抗体を投与することによって達成され得る。ＤＮＡＭ１－ＣＤ１５５軸は、細胞膜上でのＣＤ１５５の発現、または可溶性ＣＤ１５５として分泌されたＣＤ１５５の発現がＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）発現を下方制御する場合に記載される。ＣＤ１５５に対するヒト化モノクローナル抗体を用いた治療的介入は、抗ＣＤ１５５抗体が癌またはＨＩＶ感染症（またはＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）が下方制御される他の疾患）の患者に投与される本発明の実施形態である。本発明のヒト化抗ＣＤ１５５抗体による膜性ＣＤ１５５または可溶性ＣＤ１５５の遮断は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上のＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）の発現を増加させる。ＤＮＡＭ１の上昇により免疫監視メカニズムが再確立される。Ｃａｒｌｓｔｅｎら（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙｉｎ２００９Ｖｏｌｕｍｅ１８３ｐａｇｅ４９２１）は、ＣＤ１５５腫瘍がＮＫ細胞上のＣＤ１５５を下方制御することを示した。Ｓｅｔｈらは、２０１１年のｔｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙで、抗ＣＤ１５５抗体がＴ細胞内のＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）を上方制御することを示した。ＣＤ１５５に対する本出願に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、敗血症の治療に使用され得る。

【0088】

実施例６．ＣＡＲＴおよびＣＡＲＮＫ。
ＣＡＲＴ細胞およびＣＡＲＮＫ細胞。キメラ抗原受容体Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体ＮＫ細胞は、本発明に記載のヒト化抗原結合フラグメントを用いて調製され得る。ＣＡＲＴ細胞およびＣＡＲＮＫ細胞は、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）またはネクチン４のいずれかを過剰発現する癌（またはＣＤ１５５とネクチン４の両方を発現する腫瘍）を標的とするために使用され得る。例えば、配列番号２５などのＨＣＶＲおよび配列番号２３などのＬＣＶＲから構成されるヒト化抗原結合フラグメントを、ＣＡＲＴ細胞およびＣＡＲＮＫ細胞に組み込むことができる。

【0089】

実施例７．ＡＤＣＣおよびＣＤＣ。
ＡＤＣＣおよびＣＤＣは、抗体が腫瘍細胞に結合し、次いでエフェクター細胞が抗体でコーティングされた癌細胞を破壊するメカニズムである。ＣＤ１５５に対する抗体は、癌細胞に結合してコーティングすると、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを促進することができる。抗ＣＤ１５５抗体のＦｃ領域は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ用にさらに最適化され得る。

【0090】

実施例８．セラノスティクス（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）。
本明細書に記載するＣＤ１５５に対する抗体または抗原結合フラグメントは、フルオロフォア、ＩＲ８００色素などの少なくとも１つのマーカー化合物にコンジュゲートされ得る。抗体および抗原結合フラグメントは、診断用のＩ－１２４またはガリウム６８または治療用のルテチウム１７７などの放射性標識で簡単に放射性標識され得る。本開示に記載される抗体または抗原結合フラグメントは、フルオロフォア、ＩＲ８００色素などの少なくとも１つのマーカー化合物にコンジュゲートされ得る。

【0091】

実施例９．ＩｇＧ４Ｓ２４１Ｐアイソタイプ。
本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭアイソタイプであり得る。一実施形態では、ＣＤ１５５に対するヒト化抗体は、Ｓ２４１Ｐヒンジ変異またはＳ２２８Ｐヒンジ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプを含む。

【0092】

実施例１０．ＰＶＲを遮断する受動的免疫。
本明細書で開示される抗体は、ポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に結合し、ポリオウイルスがポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）に結合するのを遮断することが知られているＤ１７１に関連している（Ｎｏｂｉｓｅｔａｌ１９８５ｉｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙＶｏｌ６６ｐａｇｅ２５６３）。本明細書に開示されるヒト化抗体は、ポリオウイルス受容体を遮断し、ヒトにおいてポリオウイルスがポリオウイルス受容体に結合するのを遮断することができる。本発明の抗体は、ポリオウイルスに曝露された感受性のある個体に受動免疫を提供するために患者に投与することができる。

【0093】

実施例１１．エピトープマッピング。
ＣＤ１５５およびネクチン４に結合するヒト化モノクローナル抗体を使用したＰＶＲおよびネクチン４の線形および３Ｄエピトープマッピングは、ペプチド切除アプローチを使用して実行され、ここで、ＣＤ１５５またはネクチン４抗原の親和性は、固定化されたテストモノクローナル抗体で捕捉される。未結合ペプチドの洗浄による免疫複合体のタンパク質分解を制限する（ＧｌｕＣおよびＬｙｓＣ消化）。次いで、親和性結合ペプチドの溶出を高分解能質量分析法で分析する。次に、抗体の有無による抗原ペプチドプロファイルの比較によるペプチドの同定が分析される。

【0094】

実施例１２．ヒト化Ａｂ８２５およびＤ１７１
Ａｂ８２５の配列分析により、欠陥のあるさまざまな部位が特定されたことが示された。Ａｂ８２５（配列番号１）の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、１８位（バリン）および６４位（フェニルアラニン）に潜在的な高親和性無差別ＭＨＣクラス２アンカー残基を有する。Ａｂ８２５（配列番号５）の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は、２位（イソロイシン）および５３位（チロシン）に潜在的な高親和性無差別ＭＨＣクラス２アンカー残基を有する。Ａｂ８２５のＨＣＶＲ（配列番号１）はまた、３２位（チロシン）、４８位（イソロイシン）および９３位（バリン）に潜在的なＰ１中親和性無差別ＭＨＣクラス２アンカー残基を有する。Ａｂ８２５（配列番号５）のＬＣＶＲはまた、３位（バリン）、４位（メチオニン）、２９位（バリン）、４７位（ロイシン）に潜在的なＰ１中親和性無差別ＭＨＣクラス２アンカー残基を有する。Ｄ１７１またはＡｂ８２５の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヒト化は、本発明以前には記載も教示もされていなかった。さらに、抗ＣＤ１５５抗体または抗原結合フラグメントを安定化する変異を有するＣＤＲにおけるＡｂ８２５の潜在的な脱アミド部位および潜在的な異性化部位の安定化は、本発明の重要な部分である。ＣＤＲの変異は結合に影響を与える可能性が高く、実際、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のＮ５４およびＤ５６の変異、ならびに軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＮ９２の変異で試験されたヒト化バリアントの多くは、ＥＣ５０によって証明されるように、ベロ細胞、Ｈａｐ細胞およびＵ８７細胞では結合が著しく減少した（図８）。ＨＣＶＲのＮ５４ＳＤ５６ＧおよびＬＣＶＲのＮ９２Ｑは最も最適な結合特性を有しており、これらの変異はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲ配列内にあった。脱アミド化を受けやすいと同定された配列番号１のＶＨ（Ａｓｎ）５４の位置は、とりわけアミノ酸アラニン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリンおよびトレオニンで変異され得る。異性化を受けやすいと同定された配列番号１のＶＨＡｓｐ５６は、とりわけアミノ酸グルタミン酸、アルギニンまたはトレオニンで変異され得、配列番号１のＶＨＴ５７は、とりわけグルタミン酸またはリジンで変異され得る。配列番号５のＶｋＮ９２も潜在的な脱アミド部位として同定されており、とりわけアミノ酸、アラニン、グルタミン酸、グリシン、リジン、グルタミンまたはセリンで変異され得る。

【0095】

ＤＣＴ細胞アッセイは、ヒト化抗ＣＤ１５５抗体の異なるバリアントが異なる程度の免疫原性を有することを示した。図６のデータは、９日目、１０日目、および１１日目における５０人のドナーからの増殖反応の頻度パーセントを示す。ＨＣＶＲＶＨ４Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ（配列番号２５）およびＬＣＶＲＶｋ３Ｎ９２Ｑ（配列番号２３）を有する抗体は、免疫原性が最も低く、増殖頻度が最も低く、そして平均刺激指数（ＳＩ）が最も低く、ＦＤＡ承認のハーセプチンで観察されたものよりも免疫原性がさらに低かった。サイトカイン放出アッセイは、ＨＣＶＲＶＨ４Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ（配列番号２５）およびＬＣＶＲＶｋ３Ｎ９２Ｑ（配列番号２３）を有する抗体が、対照アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）と同様のプロファイルで注入反応のリスクが最も低いことも示した。ＨＣＶＲＶＨ４Ｎ５４ＳＤ５６Ｇ（配列番号２５）およびＬＣＶＲＶｋ３Ｎ９２Ｑ（配列番号２３）を有する抗体は、サイトカイン放出アッセイにおいてＡｂ８２５（ＶＨ０／Ｖｋ０）よりも注入反応のリスクがはるかに低い。さらに、ヒト化変異体は、５０００を超える細胞膜受容体に対して試験した場合、ＰＶＲおよびネクチン４に結合することが判明した（図７）。本明細書に開示されるＡｂ８２５およびＡｂ８２５のヒト化バリアントは、本発明以前にはネクチン４に結合することは知られていなかった。結果に基づいて、ヒト化Ａｂ８２５、Ｄ１７１、およびＡｂ８２５はネクチン４に結合すると予想される。さらに、ＣＤ１５５に対する主要なヒト化モノクローナル抗体は、ｎＭ未満の解離定数を有しており、したがって高い親和性が確認された。配列番号２３（ＬＣＶＲ）および配列番号２５（ＨＣＶＲ）によって定義されるＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）を有するモノクローナル抗体は、表面プラズモン共鳴においてＫｄ＝０．３ｎＭを有した。

【0096】

実施例１３．ヒト化マウスでの試験。
一時的にヒト化したマウスに、ＣＤ１５５を発現する（ルシフェラーゼを含む）ヒト腫瘍が移植され、ＣＤ１５５に対するヒト化ＩｇＧ４Ｓ２４１Ｐ抗体を、１組のマウスに単独で、または他のチェックポイント阻害剤と組み合わせてマウスにＩＶ投与し、腫瘍のサイズを生物発光イメージングで記録する。同様に、ヒト化抗ＣＤ１５５抗体および抗ＣＤ３抗体を有する二重特異性抗体を、マウスの１つのグループで試験する。別のマウスグループは、ヒト化抗ＣＤ１５５マウスとカテプシン感受性ペプチド架橋剤とコンジュゲートしたデルクステカンを用いて調製されたＡＤＣを用いて試験される。マウスの１つの対照グループは、未処理のマウスである。一時的にヒト化したマウスは本分野でよく知られており、ヒト腫瘍をヒト血液を用いて短期間研究することができる。

【0097】

同様に、本発明は、抗体および抗原結合フラグメントだけでなく、抗体または抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡ、および抗体または抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む任意の他のポリヌクレオチドまたはプラスミドも企図する。本発明はまた、本出願に開示される抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを産生する任意の細胞株を含む。本明細書に開示され特許請求される組成物および方法はすべて、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、添付の特許請求の範囲によってさらに定義される本発明の概念精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および方法に変形を適用できることは、当業者には明らかであろう。

【図1】