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特表2024-531430抗原特異的Ｔ細胞受容体とキメラ補助刺激受容体との組合せ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】抗原特異的Ｔ細胞受容体とキメラ補助刺激受容体との組合せ
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240822BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240822BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240822BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20240822BHJP
C07K 14/715 20060101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N15/12
C12N5/0783
C07K14/725
C07K14/715
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024510623
(86)(22)【出願日】2022-08-23
(85)【翻訳文提出日】2024-04-11
(86)【国際出願番号】 EP2022073443
(87)【国際公開番号】W WO2023025779
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】21192987.2
(32)【優先日】2021-08-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517419917
【氏名又は名称】メディジーン イミュノテラピーズ ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100110663
【弁理士】
【氏名又は名称】杉山 共永
(72)【発明者】
【氏名】ビュルデック，マヤ
(72)【発明者】
【氏名】ムッツェ，キャサリン
(72)【発明者】
【氏名】プリンツ，ペトラ
(72)【発明者】
【氏名】ヘルムブレヒト，アンジェリカ
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、多機能である、ＴＣＲおよび補助刺激受容体を発現する、すなわち２種以上のタンパク質を分泌する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞は、（ｉ）ＰＲＡＭＥペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣに特異的なＴＣＲならびに（ｉｉ）ＰＤ－１に由来する細胞外ドメイン（ＣＤ２７９）および４－１ＢＢに由来する細胞内ドメイン（ＣＤ１３７）を含むキメラ補助刺激受容体を発現する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）抗原特異的ＴＣＲ、および（Ｂ）キメラ補助刺激受容体
を発現する細胞を含む細胞集団であって、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞を含む細胞集団。
【請求項2】
前記キメラ補助刺激受容体が、－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含み、
前記細胞集団が、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞を含む、請求項２に記載の細胞集団。
【請求項3】
前記キメラ補助刺激受容体が、－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ ＰＤ－１由来である膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含み、
前記細胞集団が、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞を含む、請求項２に記載の細胞集団。
【請求項4】
（Ａ）－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１特異的ＴＣＲ；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を発現する細胞を含み、
前記細胞集団が、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞を含む、請求項３に記載の細胞集団。
【請求項5】
（Ａ）－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を発現する細胞を含み、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞を含む、請求項１から３に記載の細胞集団。
【請求項6】
少なくとも３種のタンパク質を分泌する細胞を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項7】
少なくとも４種のタンパク質を分泌する細胞を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項8】
少なくとも５種のタンパク質を分泌する細胞を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項9】
前記タンパク質が、エフェクタータンパク質、刺激性サイトカインおよび化学誘引性サイトカインからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項10】
前記エフェクタータンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＭＩＰ－１αからなる群から選択される、請求項９に記載の細胞集団。
【請求項11】
前記エフェクタータンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－βからなる群から選択される、請求項１０に記載の細胞集団。
【請求項12】
前記刺激性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２からなる群から選択される、請求項９から１１に記載の細胞集団。
【請求項13】
前記刺激性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２からなる群から選択される、請求項９から１２に記載の細胞集団。
【請求項14】
前記化学誘引性サイトカインが、ＩＰ－１０およびＭＩＰ－１βから選択される、請求項９から１３に記載の細胞集団。
【請求項15】
前記タンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＭＩＰ－１α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＰ－１０およびＭＩＰ－１βからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項16】
前記タンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＭＩＰ－１βおよびＩＰ－１０からなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項17】
前記タンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＭＩＰ－１βからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項18】
前記タンパク質が、ＩＦＮ－γＧｚｍ－Ｂ、およびＩＰ－１０からなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項19】
前記タンパク質が、ＩＦＮ－γおよびＧｚｍ－Ｂからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項20】
前記ＴＣＲが、配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を有するＮＹ－ＥＳＯペプチドまたはその一部、好ましくはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合することが可能である、請求項４および６から１９のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項21】
前記ＨＬＡ－Ａ２が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０９にコードされる分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊２：０１にコードされる分子である、請求項２０に記載の細胞集団。
【請求項22】
前記ＴＣＲが、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合することが可能である、請求項５から１９のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項23】
前記ＨＬＡ－Ａ２が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０９にコードされる分子である、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項24】
ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する前記細胞外ドメインが配列番号２８の配列を含み、４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する前記細胞内ドメインが、配列番号３２の配列を含む、請求項３から２３のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項25】
前記膜貫通ドメインがＰＤ－１に由来し、好ましくは、ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する前記膜貫通ドメインが配列番号３０の配列を含み、好ましくは、前記キメラ補助刺激受容体が配列番号２６の配列を含む、請求項３から２４のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項26】
がんの処置において使用するための、先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項27】
（Ａ）抗原特異的ＴＣＲ、および（Ｂ）キメラ補助刺激受容体
を発現する標的特異的免疫細胞であって、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する標的特異的免疫細胞。
【請求項28】
前記キメラ補助刺激受容体が、－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含み、
前記標的特異的免疫細胞が、少なくとも２種のタンパク質を分泌する、請求項２７に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項29】
前記キメラ補助刺激受容体が、－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ ＰＤ－１由来である膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含み、
前記標的特異的免疫細胞が、少なくとも２種のタンパク質を分泌する、請求項２８に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項30】
（Ａ）－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳ Ｏ－１／ＬＡＧＥ－１特異的ＴＣ；
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を発現し、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項31】
（Ａ）－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を発現し、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項32】
少なくとも３種のタンパク質を分泌する、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項33】
少なくとも４種のタンパク質を分泌する、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項34】
少なくとも５種のタンパク質を分泌する、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項35】
前記タンパク質が、エフェクタータンパク質、刺激性サイトカインおよび化学誘引性サイトカインからなる群から選択される、請求項２７から３４のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項36】
前記エフェクタータンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＭＩＰ－１αからなる群から選択される、請求項３５に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項37】
前記エフェクタータンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－βからなる群から選択される、請求項３６に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項38】
前記刺激性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２からなる群から選択される、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項39】
前記刺激性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２からなる群から選択される、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項40】
前記化学誘引性サイトカインが、ＩＰ－１０およびＭＩＰ－１βから選択される、請求項３５から３９のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項41】
前記タンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＭＩＰ－１α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＰ－１０およびＭＩＰ－１βからなる群から選択される、請求項２７から４０のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項42】
前記タンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＭＩＰ－１βおよびＩＰ－１０からなる群から選択される、請求項２７から４１のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項43】
前記タンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＭＩＰ－１βからなる群から選択される、請求項２７から４２のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項44】
前記タンパク質が、ＩＦＮ－γ、Ｇｚｍ－Ｂ、およびＩＰ－１０からなる群から選択される、請求項２７から４３のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項45】
前記タンパク質が、ＩＦＮ－γおよびＧｚｍ－Ｂからなる群から選択される、請求項２７から４４のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項46】
前記ＴＣＲが、配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を有するＮＹ－ＥＳＯペプチドまたはその一部、好ましくはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合することが可能である、請求項３０および３２から４５のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項47】
前記ＨＬＡ－Ａ２が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０９にコードされる分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊２：０１にコードされる分子である、請求項４６に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項48】
前記ＴＣＲが、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、好ましくはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合することが可能である、請求項３１から４５のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項49】
前記ＨＬＡ－Ａ２が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０９にコードされる分子である、請求項４８に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項50】
ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する前記細胞外ドメインが、配列番号２８の配列を含み、４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する前記細胞内ドメインが、配列番号３２の配列を含む、請求項２９から４９のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項51】
前記膜貫通ドメインがＰＤ－１に由来し、好ましくは、ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する前記膜貫通ドメインが配列番号３０の配列を含み、好ましくは、前記キメラ補助刺激受容体が配列番号２６の配列を含む、請求項２９から５０のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項52】
リンパ球である、請求項２７から５１のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。
【請求項53】
がんの処置において使用するための、請求項２７から５２のいずれか一項に記載の標的特異的免疫細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多機能である、ＴＣＲおよび補助刺激受容体を発現する、すなわち２種以上のタンパク質を分泌する免疫細胞に関する。例示的な免疫細胞は、（ｉ）ＰＲＡＭＥペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣに特異的なＴＣＲならびに（ｉｉ）ＰＤ－１に由来する細胞外ドメイン（ＣＤ２７９）および４－１ＢＢに由来する細胞内ドメイン（ＣＤ１３７）を含むキメラ補助刺激受容体を発現する。
【背景技術】
【0002】
ＰＲＡＭＥは、様々な腫瘍、好ましくはメラノーマにおいて発現される腫瘍関連抗原である。さらに、ＰＲＡＭＥは、ブドウ膜メラノーマなどの転移に関する独立したバイオマーカーとして（Fiedl et al., Clin Cancer Res 2016 March; 22(5): 1234-1242）、およびＤＬＢＣＬの予後マーカーとして（Mitsuhashi et al., Hematology 2014, 1/2014）記載されている。ＰＲＡＭＥは、精巣を除く正常組織では発現されない。この発現パターンは、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥおよびＧＡＧＥなどの他のがん精巣（ＣＴ）抗原の発現パターンに類似している。コードされたタンパク質は、レチノイン酸受容体のリプレッサーとして作用し、この機能によってがん細胞の成長に有利に働くと考えられる。選択的スプライシングによって複数の転写バリアントが生じる。トリプルネガティブ乳がんにおけるＰＲＡＭＥの過剰発現は、上皮間葉転換の誘導によりがん細胞の運動を促進することも判明している（Al-Khadairi et al., Journal of Translational Medicine 2019; 17: 9）。慢性リンパ性白血病ではＰＲＡＭＥの欠失が報告されているが、この遺伝子はＢ細胞では発現していないので、これに機能的な関連性はなく、欠失は生理的な免疫グロブリン軽鎖の再配列の結果である。ＣＴ抗原ＰＲＡＭＥについて記載された特徴に基づくと、ＴＣＲ指向性細胞ベースの免疫療法を使用することによって様々なタイプのがんの処置に好適な標的となる。そのためには、抗原に対する特異性が高く、細胞産物がサイトカインの放出、細胞毒性および増殖を含む腫瘍クリアランスに必要なエフェクター機能を発揮できるＴＣＲが必要である。
【0003】
ＮＹ－ＥＳＯ－１およびＬＡＧＥ－１は、がん／精巣抗原のファミリーに属する重要な免疫治療標的抗原である。がん／精巣抗原は、様々な悪性腫瘍および精巣の胚細胞で発現されるが、他の成体組織では発現されない。
【0004】
ＴＣＲ改変Ｔ細胞を用いる免疫療法が成功するかどうかは、標的抗原の選択だけでなく、抗原特異性および感受性の高いＴＣＲの選択に応じて変わる。さらなる課題、特に固形腫瘍の処置における課題は、免疫抑制腫瘍微小環境（ＴＭＥ）がＴＣＲ改変Ｔ細胞の有効性、適合性および持続性に悪影響を及ぼすことである。阻害性サイトカインおよび必須代謝因子の欠乏に加え、Ｔ細胞はＴＭＥにおいて阻害性チェックポイントＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸に直面し、Ｔ細胞の浸潤低下と、それらの枯渇がもたらされる。その結果、ＴＣＲ改変Ｔ細胞に、阻害性免疫抑制ＴＭＥを克服する形質をもたせる新たな戦略が必要とされる。より詳細には、特異性が高く、増殖、サイトカイン放出および細胞毒性が増強された、ＮＹ－ＥＳＯ－１またはＰＲＡＭＥなどの特異的抗原を標的とするＴＣＲ改変Ｔ細胞が望まれる。
【発明の概要】
【0005】
これらの必要性を克服するために、本発明は、サイトカイン放出、増殖および細胞毒性が増強された抗原、例えばＰＲＡＭＥまたはＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とする特異性の高いＴ細胞、特に２種以上のサイトカインを分泌する多機能性免疫細胞の生成を可能にする、高アビディティＴＣＲとキメラ補助刺激受容体との組合せを提供する。
【0006】
本発明は、
（Ａ）抗原特異的ＴＣＲ、および
（Ｂ）キメラ補助刺激受容体
を発現する標的特異的免疫細胞であって、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する標的特異的免疫細胞を指す。
（Ａ）抗原特異的ＴＣＲ、および
（Ｂ）キメラ補助刺激受容体
を発現する標的特異的免疫細胞であって、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する標的特異的免疫細胞を指す。
【0007】
よって、本発明の一実施形態は、
（Ａ）
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１特異的ＴＣＲ、
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を含む細胞を提供することである。
（Ａ）
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１特異的ＴＣＲ、
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を含む細胞を提供することである。
【0008】
使用されるＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲは、アミノ酸配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号３４）を有するＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合することが可能である。これは、高い機能的アビディティおよび有利な腫瘍細胞認識および殺傷特性をもたらす。補助刺激受容体は、チェックポイント阻害軸ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を逆転させ、特に抑制性ＴＭＥにおいてＴ細胞の機能を改善する。よって、本発明のＴＣＲとキメラ補助刺激受容体との組合せは、特異性が高く、増殖、サイトカイン放出および細胞毒性が増強されたＮＹ－ＥＳＯ－１の標的化の改良を可能にする。
【0009】
本発明の別の実施形態は、
（Ａ）
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を含む細胞を提供することである。
（Ａ）
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を含む細胞を提供することである。
【0010】
使用されるＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲは、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合することが可能である。これは、高い機能的アビディティおよび有利な腫瘍細胞認識および殺傷特性をもたらす。特に、本発明のＴＣＲは、先行技術で開示されたＴＣＲよりも高い機能的アビディティを有し、試験腫瘍細胞株を最もよく認識し、ＰＲＡＭＥ陽性腫瘍細胞をより効率的に溶解する。補助刺激受容体は、チェックポイント阻害軸ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を逆転させ、特に抑制性ＴＭＥにおいてＴ細胞の機能を改善する。よって、本発明のＴＣＲとキメラ補助刺激受容体との組合せは、特異性が高く、増殖、サイトカイン放出および細胞毒性が増強されたＰＲＡＭＥの標的化の改良を可能にする。
【0011】
一部の実施形態では、ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲは、ＳＬＬＱＨＬＩＧＬのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０９結合形態に結合することが可能である。ＰＲＡＭＥエピトープであるＳＬＬＱＨＬＩＧＬもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態への結合により、とりわけ、ＴＣＲを形質導入またはトランスフェクトした細胞によるＩＦＮ－γ分泌が誘導される。
【0012】
一部の実施形態ではＴＣＲは、配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。より具体的実施形態では、ＴＣＲは、配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。ＴＣＲは、配列番号１０と同一であるかまたは少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲα領域および配列番号１１と同一であるかまたは少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲβ領域を含む。
【0013】
キメラ補助刺激受容体は、ＰＤ－１に由来する膜貫通ドメインを含んでもよい。具体的実施形態では、キメラ補助刺激受容体の配列は、配列番号２６の配列を含んでもよい。
【0014】
したがって、さらなる態様は、
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む組成物に関する。
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む組成物に関する。
【0015】
さらに、一態様は、
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む核酸に関する。
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む核酸に関する。
【0016】
したがって、さらなる態様は、
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む組成物に関する。
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む組成物に関する。
【0017】
さらに、一態様は、
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む核酸に関する。
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む核酸に関する。
【0018】
さらなる態様は、ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲおよびキメラ補助刺激受容体の配列を含む核酸を含むベクターを指す。別の態様は、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲおよびキメラ補助刺激受容体の配列を含む核酸を含むベクターを指す。核酸組成物および／またはベクターを含む細胞も包含される。
【0019】
典型的には、細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。具体的実施形態では、細胞はＴ細胞である。
【0020】
多機能性免疫細胞
よって、本発明の１つの目的は、
（Ａ）抗原特異的ＴＣＲ
（Ｂ）キメラ補助刺激受容体
を発現する細胞を含む細胞集団であって、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する、細胞集団を指す。
よって、本発明の１つの目的は、
（Ａ）抗原特異的ＴＣＲ
（Ｂ）キメラ補助刺激受容体
を発現する細胞を含む細胞集団であって、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する、細胞集団を指す。
【0021】
一部の実施形態では、キメラ補助刺激受容体は、
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ ＰＤ－１由来の膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含み、
細胞集団は、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞を含む。
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ ＰＤ－１由来の膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含み、
細胞集団は、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞を含む。
【0022】
本発明のさらなる態様は、
（Ａ）抗原特異的ＴＣＲ、および
（Ｂ）本明細書に記載されているキメラ補助刺激受容体
を発現する標的特異的免疫細胞であって、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する標的特異的免疫細胞を指す。
（Ａ）抗原特異的ＴＣＲ、および
（Ｂ）本明細書に記載されているキメラ補助刺激受容体
を発現する標的特異的免疫細胞であって、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する標的特異的免疫細胞を指す。
【0023】
一部の実施形態では、細胞は、少なくとも３種のタンパク質、例えば少なくとも４種または少なくとも５種のタンパク質を分泌する。
【0024】
さらなる態様は、本明細書において定義される細胞、組成物、核酸およびベクターを含む医薬組成物を指す。さらなる態様は、がん処置のための本明細書において定義される細胞、組成物、核酸およびベクターを指す。
【0025】
驚くべきことに、本発明者らは、本明細書で定義されているキメラ補助刺激受容体を発現するＴＣＲ－Ｔ細胞が、本明細書で定義されているキメラ補助刺激受容体を欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより高い多機能性を示すことを見出した。トランスジェニックＴ細胞のより高い多機能性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのより高い多機能性および抗腫瘍活性を指し、臨床転帰と相関する。
【0026】
特に、本発明者らは、標的特異的、例えばＰＲＡＭＥ特異的またはＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲと、本明細書で定義されているキメラ補助刺激受容体との両方を発現する細胞集団が、少なくとも２種のタンパク質、例えば少なくとも３種のタンパク質、少なくとも４種のタンパク質、少なくとも５種のタンパク質を分泌する細胞を含むことを示すことができた。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、ＴＣＲ発現レベルを変化させない。 ＣＤ８＋ Ｔ細胞を健康なドナーから単離し、ＩＬ－７およびＩＬ－５の存在下でＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化させた。活性化した細胞に、Ｔ２３．８－２．１－０２７－００４（＝ＴＣＲ）またはＴ２３．８－２．１－０２７－００４とＰＤ１－４１ＢＢ（＝ＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ）との組合せの配列を含有するレトロウイルス粒子を形質導入した。同じ方法で調製した非形質導入（＝ＵＴ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞を対照として使用した。導入遺伝子の形質導入効率および発現レベルをＴＣＲ－β鎖（ＴＲＢＶ０９）およびＰＤ－１の抗体染色と、その後のフローサイトメトリーによる分析によって決定した。
【図2】ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の機能的アビディティは、ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現によって変更されない。 ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞集団の機能的アビディティを漸増量のＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（ＳＬＬ）－ペプチド（１０－５Ｍ～１０－１０Ｍ）を負荷したＰＤ－Ｌ１トランスジェニックＴ２細胞との共培養におけるＩＦＮ－γ放出として測定する。最大半量のＩＦＮ－γ放出をＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞の機能的アビディティに関する尺度とする。左のグラフは共培養の２０時間後にＥＬＩＳＡによって決定したＩＦＮ－γ濃度の絶対値を示し、右のグラフは相対値の非線形回帰を示す。ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現により、ＰＤ－Ｌ１陽性標的細胞に応答するＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によって放出されるＩＦＮ－γレベルが増加し、この同時発現はＴ細胞の機能的アビディティを変更させない。
【図3】ＨＬＡ－Ａ＊０２サブタイプの認識はＰＤ１－４１ＢＢの同時発現によって変更されない。 ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の、選択したＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子陽性リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ； ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞）とのＥ：Ｔ比１：１（２０．０００個のＴ細胞／ウェル）でのｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養。ＩＦＮ－γ濃度を１０－５ＭのＳＬＬ－ペプチドを加えたＬＣＬとの共培養の２０時間後のＥＬＩＳＡによって決定した。ＰＤ１－４１ＢＢを用いて、および用いないで形質導入したＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、Ａ＊０２：０１と比較して同様のレベルでＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子Ａ＊０２：０２、Ａ＊０２：０４およびＡ＊０２：０９によってコードされたＭＨＣ分子によって提示されたＳＬＬ－ペプチドを認識した。
【図4】潜在的ペプチドのオフターゲット毒性のリスク回避の成功。 潜在的オフターゲット毒性のリスクを低下させるために、ＳＬＬ－ペプチドと比較して最大４つのアミノ酸が異なる１９１個の部分的に相同なペプチド（ミスマッチ（ＭＭ）ペプチド）をＥｘｐｉｔｏｐｅ ２．０（登録商標）を使用して選択した。１０－６ＭのＭＭペプチドまたはＳＬＬ－ペプチドを負荷したＰＤ－Ｌ１トランスジェニックＴ２細胞を使用するプレスクリーニング共培養において、ＴＣＲ－形質導入Ｔ細胞によって認識された３３個のＭＭペプチドを同定した（データは示さず）。これらの３３個のＭＭペプチドを、エピトープ（ペプチド）がＰＲＡＭＥ陰性標的細胞株ＳＮＢ－１９のプロテアソームによって内因的に処理された場合に、ＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞によるＩＦＮ－γ放出を誘導するそれらの可能性について調査した。最大５個のＭＭペプチドをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ｉｖｔ）ＲＮＡをＳＮＢ－１９細胞に電気穿孔させた。プレスクリーニング共培養（ＭＭ０１、ＭＭ２６、ＭＭ６６）において、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞中最も多くのＩＦＮ－γ放出を誘導したＭＭペプチドを「ミディジーン」構築物（約４００ｂｐ）として個々に試験した。他のＭＭペプチドすべてを５個のＭＭペプチドをコードするミニジーン構築物（ペプチドあたり約９０ｂｐ）として試験した。ＳＬＬ－ペプチドをコードするミディジーン構築物を陽性対照として使用した。すべてのＲＮＡ構築物は、陽性対照ＴＣＲによって認識されるエピトープを含んだ。ＩＦＮ－γ濃度を、トランスフェクトＳＮＢ－１９細胞のＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞との共培養の２０時間後に決定した。検出されたＩＦＮ－γレベルは、細胞内処理されたＭＭペプチドが認識されていないことを示す。したがって、すべてのＭＭペプチドは、リスク回避が可能であり、潜在的オフターゲット毒性をもたらす可能性はない。さらに、ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、ＴＣＲ単独で見られるＭＭペプチドの認識パターンを変更しなかった。
【図5】頻度の高いＨＬＡを網羅するＬＣＬライブラリーを使用してもオフターゲット毒性は同定されなかった。 潜在的オフターゲット毒性を評価するために、ＰＤ１－４１ＢＢを用いて、および用いないで形質導入したＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を、白色人種の集団において最も頻度の高いＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を網羅する３６種のリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）集団からなるライブラリーと共培養した。これらのＬＣＬは、多種多様な内因的に発現したペプチドを発現し、適合したＨＬＡ－Ａ２分子または最も頻度の高い他のＨＬＡ分子で提示された内因性ペプチドの認識により潜在的交差反応性を同定するのに役立つ。ＩＦＮ－γ濃度をＬＣＬとの共培養の２０時間後のＥＬＩＳＡによって決定した。ＳＬＬ－ペプチドを負荷したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性ＬＣＬを陽性対照とした。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＬＣＬ番号５と共培養した場合に非常に低レベルのＩＦＮ－γのみを分泌し、低レベルのＰＲＡＭＥ発現をｑＰＣＲによって確認することができた。いずれの他のＬＣＬも、トランスジェニックＴＣＲまたはＰＤ１－４１ＢＢと組み合わせてトランスジェニックＴＣＲを発現するエフェクターＴ細胞によって認識されなかった。したがって、オフターゲット毒性はこの安全性モデルにおいて同定することができなかった。
【図6】正常細胞のパネルを使用してもオフターゲット毒性は同定されなかった。 様々な組織を起源とする正常細胞との共培養により、重要な健康組織のオフターゲット認識の可能性を分析した。陽性対照として、正常細胞にＳＬＬ－ペプチドを負荷した。共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を共培養の２０時間後のＥＬＩＳＡによって決定した。健康な細胞のオフターゲット認識は観察されなかった。ＰＲＡＭＥ陽性成熟樹状細胞（ＤＣ）のみが非形質導入Ｔ細胞のバックグラウンドを超えるＴＣＲトランスジェニックＴ細胞におけるＩＦＮ－γ放出を誘発したが、成熟ＤＣの前駆細胞（単球および未成熟ＤＣ）は、Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ放出をもたらさなかった。ＰＤ１－４１ＢＢを添加してもＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞の安全性プロファイルは変化しなかった。（ヒト腎上皮細胞（ＨＲＥｐＣ）、ヒト腎皮質上皮細胞（ＨＲＣＥｐＣ）、腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）、ヒト骨芽細胞（ＨＯＢ）、単球（Ｍｏｎｏ）、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）、成熟ＤＣ（ｍＤＣ）、ｉＣｅｌｌ心筋細胞２（ｉＣａｒｄｉｏ））。
【図7-1】ＰＤ１－４１ＢＢは、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に応答してＩＦＮ－γの特異的放出を増強する。 （Ａ）腫瘍細胞株におけるＰＲＡＭＥ－ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイム定量的ＰＣＲによって決定し、ハウスキーピング遺伝子ＧＵＳＢに対して正規化した。
【図7-2】（Ｂ）ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を異なるレベルのＰＲＡＭＥおよびＰＤ－Ｌ１を発現する様々な適応症のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性腫瘍細胞株と共培養した。ＰＤ－Ｌ１の安定した発現を可能にするため、いくつかの腫瘍細胞にＰＤ－Ｌ１を形質導入した（ＴＤ）。さらに、抗体染色とその後のフローサイトメトリー分析により、一部の細胞株はＩＦＮ－γ処理によりＰＤ－Ｌ１の誘導性発現（ｉｎｄ）を示したが、他の細胞株はＩＦＮ－γ処理なしでもある程度のレベルの内因性ＰＤ－Ｌ１発現（ｅｎｄ）を既に示していたことが決定された。非形質導入Ｔ細胞を対照として使用した。ＩＦＮ－γ濃度を共培養の２０時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に応答したＩＦＮ－γの放出を増強した。
【図8】ＰＤ１－４１ＢＢは、３次元（３Ｄ）腫瘍細胞スフェロイドに対する特異的細胞毒性応答を増強する。 ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、異なるレベルのＰＲＡＭＥおよびＰＤ－Ｌ１を発現するＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性腫瘍細胞株由来の３次元（３Ｄ）腫瘍細胞スフェロイドと共培養した。腫瘍スフェロイドに対する細胞毒性は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ（登録商標）またはＳ３（登録商標）デバイスを使用して、４時間ごとに画像を記録し、２０日間にわたる赤色蛍光の消失によって判定した。新鮮な腫瘍細胞スフェロイドを３、７、１０、１３、および１６日目に共培養プレートに移した。ＰＤ１－４１ＢＢの発現は、腫瘍細胞に繰り返し曝露される困難な環境において、Ｔ細胞のエフェクター機能および適合性に有益な効果をもたらす。腫瘍細胞スフェロイドを複数回負荷する過程で、ＰＤ１－４１ＢＢ発現エフェクターＴ細胞は、トランスジェニックＴＣＲのみを発現するエフェクターＴ細胞と比較して、腫瘍細胞成長をより良好に制御することができる。
【図9】ＰＤ１－４１ＢＢは、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に応答してＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の増殖を増加させる。 ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、エフェクター対標的比が１：１で、異なるレベルのＰＲＡＭＥおよびＰＤ－Ｌ１を発現するＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性腫瘍細胞株と共培養した。未形質導入Ｔ細胞を対照として使用した。７日後に、共培養においてＴ細胞のＸ倍の増殖を総細胞数から計算した。ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に応答した増殖および／または生存を増強した。
【図10】ＰＤ１－４１ＢＢを同時発現するＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍反応性を示す。 ５×１０６個のＰＤ－Ｌ１トランスジェニックＭｅｌＡ３７５腫瘍細胞を１８匹の免疫不全（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ）マウスに皮下注射した。１週間後に、マウスを、それぞれ６匹のマウスを含む３つの処置群に分配した。マウスに、（ＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ）を含むかもしくは（ＴＣＲ）ＰＤ１－４１ＢＢを含まない１０×１０６個のＴＣＲ陽性細胞（細胞総数が１６×１０６個）または等数の非形質導入Ｔ細胞（ＵＴ）を注射した。腫瘍体積を１週間に２～３回測定した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するエフェクターＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞成長を制御することができたが、トランスジェニックＴＣＲのみを発現するエフェクターＴ細胞は非形質導入Ｔ細胞と比較してほとんど効果を有さなかった。
【図11-1】ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＰＲＡＭＥを標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＰＲＡＭＥを標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより高い多機能性を示す。ＰＤ１－４１ＢＢを有するかまたは有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、ＩｓｏＬｉｇｈｔ（登録商標）技術（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）を使用して、それらの単一細胞多機能性（２種以上のサイトカインの放出）に関して分析した。ＰＤ－Ｌ１を過剰発現する、ＰＲＡＭＥ陽性ＭｅｌＡ３７５腫瘍細胞との共培養後に、単一ＣＤ８＋Ｔ細胞を３２Ｔ細胞サイトカイン／タンパク質の分泌について評価し、未刺激ＴＣＲ－Ｔ細胞と比較した。 （Ａ）ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、多機能性Ｔ細胞のより高いパーセンテージを示した。灰色の様々な色調は、単一のＴ細胞によってどれくらい多くのサイトカインが同時に放出されたかを示す。
【図11-2】（Ｂ）多機能性強度指数（ＰＳＩ）は、様々な分泌されたサイトカインの強度と多機能性Ｔ細胞のパーセンテージを乗算することによって計算した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、より高い多機能性強度指数（ＰＳＩ）を示した。放出された様々なサイトカインの分類により、優れたＰＳＩには、エフェクターサイトカイン（Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β）および刺激性サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２）の貢献度が高く、次いで化学誘引性サイトカイン（ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１β）の貢献度が高いことが明らかになった。調節性サイトカイン（ＩＬ－１０、ＩＬ－２２）および炎症性サイトカイン（ＩＬ－６およびＭＣＰ－１）放出の程度はより低かった。
【図11-3】（Ｃ）多機能性ヒートマップを使用する単一細胞ポリサイトカイン放出の詳細な分析により、ＰＤ１－４１ＢＢを有するおよび有さないＴＣＲ－Ｔ細胞ではそれらのポリサイトカインのシグネチャーが異なることが示された。とりわけ、ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、４～１０種のサイトカインを同時に分泌する単一細胞をより高い割合で含有した。
【図12-1】ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより高い多機能性を示す。ＰＤ１－４１ＢＢを有するかまたは有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、ＩｓｏＬｉｇｈｔ（登録商標）技術（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）を使用して、それらの単一細胞多機能性（２種以上のサイトカインの放出）に関して分析した。ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＮＹ－ＥＳＯ－１陽性ＭｅｌＡ３７５およびＭｅｌ６２４．３８腫瘍細胞との共培養後に、単一ＣＤ８＋Ｔ細胞を３２Ｔ細胞サイトカイン／タンパク質の分泌について評価し、非形質導入ＴＣＲ－Ｔ細胞と比較した。 （Ａ）ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、多機能Ｔ細胞のより高いパーセンテージを示した。灰色の様々な色調は、単一のＴ細胞によってどれくらい多くのサイトカインが同時に放出されたかを示す。
【図12-2】（Ｂ）多機能強度指数（ＰＳＩ）は、様々な分泌されたサイトカインの強度と多機能Ｔ細胞のパーセンテージを乗算することによって計算した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、より高い多機能性強度指数（ＰＳＩ）を示した。放出された様々なサイトカイン／溶解性タンパク質の分類により、優れたＰＳＩには、エフェクターサイトカイン（Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ－１α、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β）および刺激性サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２）の貢献度が高く、次いで化学誘引性サイトカイン（ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ）の貢献度が高いことが明らかになった。調節性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－２２、ｓＣＤ１３７、ＴＧＦ－β１）および炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１７ＦおよびＭＣＰ－１）放出の程度はより低かった。
【図12-3】（Ｃ）多機能性ヒートマップを使用する単一細胞ポリサイトカイン放出の詳細な分析により、ＰＤ１－４１ＢＢを有するおよび有さないＴＣＲ－Ｔ細胞ではそれらのポリサイトカインのシグネチャーが異なることが示された。とりわけ、ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、２～６種のサイトカインを同時に分泌する単一細胞をより高い割合で含有した。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本発明の詳細な記載
本発明が、その好ましい実施形態のうちのいくつかについて詳細に説明される前に、以下の一般的定義を提供する。
本発明が、その好ましい実施形態のうちのいくつかについて詳細に説明される前に、以下の一般的定義を提供する。
【0029】
以下に例示的に記載されるように、本発明は、本明細書において具体的に開示されていないいずれかの要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の非存在下で、好適に実践され得る。
【0030】
本発明は、特定の実施形態に関しておよび特定の図を参照して記載されるが、本発明はそれらにではなく特許請求の範囲によってのみ限定される。
【0031】
本記載および特許請求の範囲において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、用語「を構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、群が少なくとも一定数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態だけからなる群を開示するとも理解される。
【0032】
本発明の目的のために用語「得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」は、用語「得ることができる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、例えば抗体が具体的な供給源から得ることができると定義される場合、これはこの供給源から得られる抗体を開示するとも理解される。
【0033】
不定冠詞または定冠詞が単数名詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を参照して使用される場合、これは、他に具体的に述べられている場合を除いてその名詞の複数を含む。本発明の文脈において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者が問題となる特質の技術的効果をまだ確保すると理解する正確さの区間を記す。用語は、±１０％、好ましくは±５％の示された数値からの偏差を典型的には示す。
【0034】
技術的用語は、それらの一般的な意味または当業者にとっての意味で使用される。具体的な意味が特定の用語によって伝えられる場合、用語の定義は以下にその用語が使用される文脈において与えられる。
【0035】
ＴＣＲバックグラウンド
ＴＣＲは、２つの異なる、別々のタンパク質鎖、すなわちＴＣＲアルファ（α）鎖およびＴＣＲベータ（β）鎖から構成される。ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲβ鎖は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方の再配列Ｖ（Ｄ）Ｊ領域は、超可変領域（ＣＤＲ、相補性決定領域）を含有し、これらの中で、ＣＤＲ３領域は、特異的エピトープ認識を決定する。Ｃ末端領域において、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方は、疎水性膜貫通ドメインを含有し、短い細胞質側末端で終わる。
ＴＣＲは、２つの異なる、別々のタンパク質鎖、すなわちＴＣＲアルファ（α）鎖およびＴＣＲベータ（β）鎖から構成される。ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲβ鎖は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方の再配列Ｖ（Ｄ）Ｊ領域は、超可変領域（ＣＤＲ、相補性決定領域）を含有し、これらの中で、ＣＤＲ３領域は、特異的エピトープ認識を決定する。Ｃ末端領域において、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方は、疎水性膜貫通ドメインを含有し、短い細胞質側末端で終わる。
【0036】
典型的には、ＴＣＲは、１つのα鎖と１つのβ鎖のヘテロ二量体である。このヘテロ二量体は、ペプチドを提示するＭＨＣ分子に結合し得る。
【0037】
本発明の文脈における用語「可変ＴＣＲα領域」または「ＴＣＲα可変鎖」または「可変ドメイン」は、ＴＣＲα鎖可変領域を指す。本発明の文脈における用語「可変ＴＣＲβ領域」または「ＴＣＲβ可変鎖」は、ＴＣＲβ鎖可変領域を指す。
【0038】
ＴＣＲ遺伝子座および遺伝子は、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ学名命名法（ＩＭＧＴデータベース、www. IMGT.org；Giudicelli, V., et al., IMGT/LIGM-DB, the IMGT(登録商標) comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979；T cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12- 441352-8）を使用して命名される。
【0039】
標的
一部の実施形態では、キメラ補助刺激受容体と組み合わせて本発明において提供されるＴＣＲは、（ヒト）ＰＲＡＭＥ（配列番号１）に由来するペプチドに結合することが可能である点が有利である。したがって、前記ＴＣＲは、ＰＲＡＭＥ－ＳＬＬとも呼ばれる、配列番号１に示されているＰＲＡＭＥペプチドに対して特異的である。本発明の文脈において、用語「に対して特異的」は、ＴＣＲが標的に特異的に結合することを意味する。ＰＲＡＭＥ（メラノーマにおいて優先的に発現される抗原（Ｐｒｅｆｅｒｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ）、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ７８３９５）は、ＭＡＰＥ（腫瘍において優先的に発現されるメラノーマ抗原）およびＯＩＰ４（ＯＰＡ相互作用タンパク質４）とも称され、未知の機能を有するＣＴ抗原であることが報告されている。ＰＲＡＭＥは、メラノーマおよび白血病、および慢性骨髄腫に関連するタンパク質コード遺伝子である。この遺伝子に関連するジーンオントロジー（ＧＯ）という注釈は、レチノイン酸受容体結合を含む。ＰＲＡＭＥタンパク質は、転写抑制因子として機能し、レチノイン酸受容体ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢおよびＲＡＲＧを介してレチノイン酸のシグナル伝達を阻害する。ＰＲＡＭＥタンパク質は、レチノイン酸による細胞増殖、分化、アポトーシスの停止を防ぐ。
一部の実施形態では、キメラ補助刺激受容体と組み合わせて本発明において提供されるＴＣＲは、（ヒト）ＰＲＡＭＥ（配列番号１）に由来するペプチドに結合することが可能である点が有利である。したがって、前記ＴＣＲは、ＰＲＡＭＥ－ＳＬＬとも呼ばれる、配列番号１に示されているＰＲＡＭＥペプチドに対して特異的である。本発明の文脈において、用語「に対して特異的」は、ＴＣＲが標的に特異的に結合することを意味する。ＰＲＡＭＥ（メラノーマにおいて優先的に発現される抗原（Ｐｒｅｆｅｒｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ）、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ７８３９５）は、ＭＡＰＥ（腫瘍において優先的に発現されるメラノーマ抗原）およびＯＩＰ４（ＯＰＡ相互作用タンパク質４）とも称され、未知の機能を有するＣＴ抗原であることが報告されている。ＰＲＡＭＥは、メラノーマおよび白血病、および慢性骨髄腫に関連するタンパク質コード遺伝子である。この遺伝子に関連するジーンオントロジー（ＧＯ）という注釈は、レチノイン酸受容体結合を含む。ＰＲＡＭＥタンパク質は、転写抑制因子として機能し、レチノイン酸受容体ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢおよびＲＡＲＧを介してレチノイン酸のシグナル伝達を阻害する。ＰＲＡＭＥタンパク質は、レチノイン酸による細胞増殖、分化、アポトーシスの停止を防ぐ。
【0040】
一部の実施形態では、本発明は、キメラ補助刺激受容体と、配列番号１に示されているＰＲＡＭＥアミノ酸配列内に含まれるペプチドに結合することが可能なＴＣＲ（表１を参照されたい）との組合せを提供する。用語「結合することが可能」は、前記ペプチドに前記ＴＣＲが特異的に結合することを意味する。用語「特異的（に）結合」は、一般に、ＴＣＲが、その抗原結合部位を介して、ランダムな無関係の非標的抗原に対するよりも、意図した抗原標的に結合しやすいことを示す。特に、用語「特異的に結合する」は、ＴＣＲの結合特異性が、その抗原標的に対して、非標的抗原に対する結合特異性よりも少なくとも約５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは２５倍、さらに好ましくは５０倍、最も好ましくは１００倍以上大きいことを示す。配列番号１に示されているアミノ酸配列からなるＰＲＡＭＥペプチドは、本明細書において「抗原性標的」または「ＳＬＬ－ペプチド」とも称される。したがって、配列番号１に示されているアミノ酸配列からなるＰＲＡＭＥペプチドは、本発明のＴＣＲの標的エピトープであるか、またはそれを含む。
【0041】
用語「エピトープ」は、一般に、抗原上の部位、典型的には、結合ドメインが認識する（ポリ）ペプチドを指す。用語「結合ドメイン」は、最も広い意味で、「抗原結合部位」を指し、すなわち、抗原標的上の特異的エピトープに結合し／それと相互作用する分子のドメインを特徴とする。抗原性標的は、単一のエピトープを含んでもよいが、典型的には少なくとも２つのエピトープを含み、抗原のサイズ、立体構造、および型に応じて任意の数のエピトープを含み得る。用語「エピトープ」は、一般に、線状エピトープと立体構造エピトープとを包含する。線状エピトープは、アミノ酸一次配列で構成される連続したエピトープであり、典型的には少なくとも２個またはそれより多いアミノ酸を含む。立体構造エピトープは、標的抗原、特に標的（ポリ）ペプチドのフォールディングによって並置された非連続アミノ酸によって形成されている。
【0042】
本発明者らは、本発明のＴＣＲによって認識される最小のアミノ酸配列が、ＰＲＡＭＥのアミノ酸配列（配列番号１）に相当することを見出した。詳細には、本発明のＴＣＲは、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列、特に添付の実施例に示されているＨＬＡ－Ａ２結合形態を（特異的に）認識することが示されている。この選択的認識は、いくつかの固定位置のみを示す、ＴＣＲの認識モチーフによって得られ得る。配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）のアミノ酸ＬＬＱおよび特にＨＬＩは、この認識モチーフの一部である。
【0043】
一部の実施形態は、
（Ａ）
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を含む細胞を指し、
細胞は、２種を超えるタンパク質を分泌する。
（Ａ）
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を含む細胞を指し、
細胞は、２種を超えるタンパク質を分泌する。
【0044】
他の実施形態は、
（Ａ）
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を含む細胞を指し、
細胞は、２種を超えるタンパク質を分泌する。
（Ａ）
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を含む細胞を指し、
細胞は、２種を超えるタンパク質を分泌する。
【0045】
ＴＣＲ特異的配列
よって、本発明の組合せにおいて使用される例示的なＴＣＲは、
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む。
よって、本発明の組合せにおいて使用される例示的なＴＣＲは、
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む。
【0046】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。
【0047】
「少なくとも８０％同一」、特に「少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列が、示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを含む。
【0048】
複数の配列間のパーセント同一性の決定は、好ましくは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ（商標）１０プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、ＵＳＡ）のＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して達成される。このプログラムは、修正されたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズム（Thompson et al., 1994. Nucl Acids Res. 22: pp. 4673-4680; Invitrogen Corporation; Vector NTI AdvanceTM 10 DNA and protein sequence analysis software. User's Manual, 2004, pp.389-662）を使用する。パーセント同一性の決定は、ＡｌｉｇｎＸアプリケーションの標準パラメーターを用いて実施される。
【0049】
具体的実施形態では、ＴＣＲは、配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。
【0050】
一部の実施形態での実施例を見ると分かるように、ＴＣＲは、ＰＲＡＭＥ、特にＰＲＡＭＥのエピトープＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）に対して特異的であり、他のエピトープまたは抗原に対しては非常に低い交差反応性しか示さない。
【0051】
具体的実施形態では、本明細書に記載されているＴＣＲは、配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲα領域および配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲβ領域を含む。
【0052】
したがって、より詳細には、一部の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域、配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲα領域および配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲβ領域を含んでもよい。
【0053】
さらにより具体的実施形態では、ＴＣＲは、配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域、配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、配列番号１０のアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲα領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲβ領域を含んでもよい。
【0054】
したがって、具体的実施形態では、ＴＣＲは、配列番号２４と同一であるかまたはそれと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖、および配列番号２２と同一であるかまたはそれと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含んでもよい。
【0055】
他の実施形態では、ＴＣＲは、ＮＹ－ＥＳＯ－１、特にＮＹ－ＥＳＯ－１のエピトープＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号３４）に特異的であり、他のエピトープまたは抗原に対して非常に低い交差反応性しか示さない。
【0056】
よって、本発明の組合せにおいて使用される例示的なＴＣＲは、
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む。
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む。
【0057】
一部の実施形態ではＴＣＲは、配列番号４１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号４２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。
【0058】
より具体的な実施形態では、ＴＣＲは、配列番号４１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号４２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。
【0059】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号４３と同一であるかまたは少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号４４と同一であるかまたは少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含む。
【0060】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号４３のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含んでもよい。
【0061】
改変
一部の実施形態では、ＴＣＲのアミノ酸配列および／またはキメラ補助刺激受容体は、１つまたは複数の表現型に影響しない置換を含んでもよい。
一部の実施形態では、ＴＣＲのアミノ酸配列および／またはキメラ補助刺激受容体は、１つまたは複数の表現型に影響しない置換を含んでもよい。
【0062】
「表現型に影響しない置換」は、「保存的アミノ酸置換」とも称される。「保存的アミノ酸置換」の概念は、当業者によって理解されており、好ましくは、正電荷残基（Ｈ、Ｋ、およびＲ）をコードするコドンは、正電荷残基をコードするコドンで置換され、負電荷残基（ＤおよびＥ）をコードするコドンは、負電荷残基をコードするコドンで置換され、中性極性残基（Ｃ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＹ）をコードするコドンは、中性極性残基をコードするコドンで置換され、中性非極性残基（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、およびＷ）をコードするコドンは、中性非極性残基をコードするコドンで置換されることを意味する。これらのバリエーションは、自発的に生じてもよく、ランダム突然変異誘発によって導入されてもよく、または定方向突然変異誘発によって導入されてもよい。これらの変化は、これらのポリペプチドの本質的な特性を破壊することなくなされ得る。当業者は、バリアントアミノ酸および／またはそれらをコードする核酸を容易かつ日常的にスクリーニングし、これらのバリエーションがリガンド結合能を実質的に低下させるかまたは破壊するかどうかを当技術分野で公知の方法によって決定することができる。
【0063】
当業者は、ＴＣＲをコードする核酸および／またはキメラ補助刺激受容体も改変され得ることを理解する。核酸配列全体における有益な改変は、配列のコドン最適化を含む。発現したアミノ酸配列内に保存的置換をもたらす変更がなされ得る。これらのバリエーションは、機能に影響を及ぼさないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定領域および非相補性決定領域においてなされ得る。通常、付加と欠失は、ＣＤＲ３領域において行うべきではない。
【0064】
本発明の一部の実施形態によれば、ＴＣＲおよび／またはキメラ補助刺激受容体のアミノ酸配列は、検出可能な標識、治療剤または薬物動態改変部分を含むように改変される。
【0065】
検出可能な標識に関する非限定的な例は、放射標識、蛍光標識、核酸プローブ、酵素および造影試薬である。ＴＣＲに付随し得る治療剤としては、放射性化合物、免疫調節薬、酵素または化学療法剤が挙げられる。治療剤は、化合物が標的部位でゆっくり放出され得るように、ＴＣＲに連結したリポソームによって封入され得る。このことによって、体内での輸送中の損傷が避けられ、ＴＣＲの関連する抗原提示細胞への結合後に、治療剤、例えば、毒素が最大の効果を有することが保障される。治療剤の他の例は、
【0066】
ペプチド細胞毒素、すなわちリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅなどの、哺乳動物の細胞を殺滅する能力を有するタンパク質またはペプチドである。小分子細胞毒性剤、すなわち７００ダルトン未満の分子量を有する、哺乳動物の細胞を殺滅する能力を有する化合物。このような化合物は、細胞毒性作用を有することが可能な毒性金属を含有し得る。さらに、これらの小分子細胞毒製剤は、プロドラッグ、すなわち細胞毒性剤を放出するために、生理的条件下で、崩壊されるかまたは変換される化合物も含むことが理解されるべきである。このような薬剤としては、例えば、ドセタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラシェルマイシン、カリチアマイシン、エトポシド、イフォスファミド、イリノテカン、ポルフィマーナトリウム フォトフリンＩＩ、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート、ミトキサントロン、オーリスタチンＥ、ビンクリスチンおよびドキソルビシン；放射性核種、例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０および２１３、アクチニウム２２５およびアスタチン２１３が挙げられる。例えば、キレート剤、免疫刺激薬としても知られる免疫賦活剤、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子によって放射性核種をＴＣＲまたはその誘導体に付随させ得る。例示的な免疫賦活剤は、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γなどのサイトカイン、抗Ｔ細胞またはＮＫ細胞決定基抗体（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ１６）を含む抗体またはその断片；抗体様結合特性を有する代替タンパク質足場；スーパー抗原、すなわちポリクローナルＴ細胞活性化および大量のサイトカイン放出をもたらすＴ細胞の非特異的活性化を引き起こす抗原、およびその変異体；ＩＬ－８、血小板因子４、メラノーマ成長刺激タンパク質などのケモカイン、補体活性化因子；異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌ペプチドである。
【0067】
治療剤は、好ましくは、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択され得る。好ましくは、免疫エフェクター分子はサイトカインである。
【0068】
薬物動態改変部分は、例えば、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはそれらの組合せであってもよい。少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基は、当業者に公知のいくつかの方法によって付随させ得る。好ましい実施形態では、ユニットはＴＣＲに共有結合により連結される。本発明によるＴＣＲは、１つまたはいくつかの薬物動態改変部分によって改変されてもよい。特に、ＴＣＲの可溶性形態は、１つまたはいくつかの薬物動態改変部分によって改変される。薬物動態改変部分は、治療薬の薬物動態プロファイルに対する有益な変化、例えば、血漿中半減期の改善、免疫原性の低減または増強、および溶解度の改善を達成し得る。
【0069】
ＴＣＲおよび／またはキメラ補助刺激受容体は、例えば、免疫原性を低下させる、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）溶解度および／もしくは安定性を増加させる（例えば、タンパク質分解に対する保護を増強させることによって）ならびに／または血清中半減期を延長するために、追加の機能性部分を付加することによって改変され得る。
【0070】
他の有用な機能性部分および改変には、患者の体内で本発明のＴＣＲを有するエフェクター宿主細胞を遮断するために使用され得る「自殺」または「安全スイッチ」が含まれる。１つの例は、Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235に記載された誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）「安全スイッチ」である。簡潔には、その二量体化がＡＰ１９０３／ＣＩＰなどの小分子二量体化薬に依存し、改変されたエフェクター細胞においてアポトーシスの急速な誘導をもたらすカスパーゼ９ドメインを発現させるために、エフェクター宿主細胞は周知の方法によって改変される。この系は、例えば、欧州特許第２１７３８６９号明細書に記載されている。他の「自殺」「安全スイッチ」に関する例は、当技術分野において公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、ＣＤ２０の発現とそれに続く抗ＣＤ２０抗体を使用する枯渇、またはｍｙｃタグ（Kieback et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 15;105(2):623-8）がある。
【0071】
グリコシル化パターンが変更されたＴＣＲも本明細書において予想される。当技術分野で公知であるように、グリコシル化パターンは、アミノ酸配列に依存し（例えば、以下で議論される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）および／またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物に依存し得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結またはＯ連結されている。Ｎ連結は、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。結合分子へのＮ連結グリコシル化部位の付加は、アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択される１つまたは複数のトリペプチド配列を含有するように、アミノ酸配列を変更することによって、従来より達成されている。Ｏ連結グリコシル化部位は、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の出発配列への付加またはそれによる置換によって導入され得る。
【0072】
ＴＣＲのグリコシル化の別の手段は、グリコシドのタンパク質への化学的連結または酵素的連結によるものである。使用される連結方式によって、糖類は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのスルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。同様に、脱グリコシル化（すなわち、結合分子上に存在する炭水化物部分の除去）は、例えば、ＴＣＲをトリフルオロメタンスルホン酸に曝露することによって化学的に、またはエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを用いることによって酵素的に達成され得る。
【0073】
小分子化合物などの薬物をＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態に付加することも考えられる。連結は、共有結合、または静電力によるなど非共有結合的相互作用によって達成され得る。当技術分野で公知の様々なリンカーは、薬物コンジュゲートを形成するために用いることができる。
【0074】
ＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態は、それぞれの分子（タグ）の特定、追跡、精製および／または単離を補助する追加のドメインを導入するためにさらに改変され得る。よって、一部の実施形態では、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖は、エピトープタグを含むように改変されてもよい。
【0075】
エピトープタグは、本発明のＴＣＲに組み込むことができるタグの有用な例である。エピトープタグは、特異的抗体の結合を可能にし、したがって、患者の体内の可溶性ＴＣＲもしくは宿主細胞または培養（宿主）細胞の結合および移動の特定および追跡を可能にするアミノ酸の短いストレッチである。エピトープタグと、故にタグ付けされたＴＣＲの検出は、いくつかの異なる技法を使用して達成され得る。
【0076】
タグは、前記タグに対して特異的な結合分子（抗体）の存在下で細胞を培養することによって、本発明のＴＣＲを有する宿主細胞の刺激および増殖のためにさらに用いることができる。
【0077】
一般的に、ＴＣＲは、一部の事例では、ＴＣＲの標的抗原との親和性およびオフレートを改変する様々な変異で改変され得る。特に、変異は、親和性を増加させるおよび／またはオフレートを低下させる場合がある。よって、ＴＣＲの少なくとも１つのＣＤＲおよびその可変ドメインフレームワーク領域が変異し得る。
【0078】
しかし、好ましい実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲは、改変されないかまたは実施例におけるＴＣＲに関するようにｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟を受けない。このことは、ＣＤＲが天然に存在する配列を有することを意味する。これは有利であり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟によって、ＴＣＲ分子に対する免疫原性がもたらされ得るからである。これより、治療効果および処置を低下または不活性化する抗薬物抗体の産生がもたらされ、ならびに／または有害作用が誘導される場合がある。
【0079】
変異は、１つまたは複数の置換、欠失または挿入であってもよい。これらの変異は、当技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、Example in Sambrook, Molecular Cloning - 4th Edition (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている、ポリメラーゼ連鎖反応、制限酵素に基づくクローニング、ライゲーションに依存しないクローニング手順によって導入され得る。
【0080】
交差反応性のリスクを伴う理論的に予測できないＴＣＲ特異性は、内因性ＴＣＲ鎖と外因性ＴＣＲ鎖の間の誤対合に起因して生じ得る。ＴＣＲ配列の誤対合を避けるために、組換えＴＣＲ配列は、マウス化されたまたは最低限にマウス化されたＣα領域およびＣβ領域を含有するように改変されてもよく、これはいくつかの異なる形質導入されたＴＣＲ鎖の正しい対合を効率的に増強することが示された技術である。ＴＣＲのマウス化（すなわち、ヒトＣαおよびＣβ領域をそれらのマウスのカウンターパートによって交換すること）は、宿主細胞におけるＴＣＲの細胞表面での発現を改善するために通常適用される技法である。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、マウス化ＴＣＲは、ＣＤ３共受容体とより効率的に会合する；および／または優先的に互いに対合し、所望の抗原特異性のＴＣＲを発現するようｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変されているが、それらの「オリジナルの」ＴＣＲを依然として保持および発現するヒトＴ細胞上で混合ＴＣＲを形成しにくいと考えられる。
【0081】
マウス化ＴＣＲの発現の改善を代表する９つのアミノ酸が特定されており（Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jun 1; 184(11):6223-31）、ＴＣＲαおよび／またはβ鎖定常領域におけるアミノ酸残基のうちの１つまたはすべてをそれらのマウスのカウンターパート残基で置換することが予測される。この技法は、「最低限のマウス化（minimal murinization）」とも称され、細胞表面の発現を増強するという利点をもたらすが、同時に、アミノ酸配列における「外来の」アミノ酸残基の数を低減し、それによって、免疫原性のリスクを低減する。
【0082】
一部の実施形態は、本明細書に記載されている単離されたＴＣＲを指し、ＴＣＲは、一本鎖タイプのものであり、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、リンカー配列によって連結している。
【0083】
好適な一本鎖ＴＣＲ形態は、可変ＴＣＲα領域に対応するアミノ酸配列によって構成された第１のセグメント、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合した可変ＴＣＲβ領域に対応するアミノ酸配列によって構成された第２のセグメント、および第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含む。あるいは、第１のセグメントは、ＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、第２のセグメントは、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよい。上記一本鎖ＴＣＲは、第１の鎖と第２の鎖の間にジスルフィド結合をさらに含んでもよく、リンカー配列の長さとジスルフィド結合の位置は、第１のセグメントと第２のセグメントの可変ドメイン配列が実質的にネイティブＴ細胞受容体におけるのと同様に変異によって配向されるようなものである。より具体的には、第１のセグメントは、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、第２のセグメントは、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、かつジスルフィド結合は、第１の鎖と第２の鎖の間にもたらされてもよい。リンカー配列は、ＴＣＲの機能を損なわない任意の配列であってもよい。
【0084】
本発明の文脈において、「機能性」ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質は、例えば、少なくとも実質的な生物学的活性を維持する、アミノ酸の付加、欠失または置換によって改変されたＴＣＲまたはＴＣＲバリアントを意味することになる。ＴＣＲのαおよび／またはβ鎖の場合には、このことは、両方の鎖が、その生物学的機能、特に前記ＴＣＲの特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合、および／または特異的ペプチド：ＭＨＣ相互作用の際の機能的シグナル伝達を発揮するＴＣＲ（改変されていないαおよび／もしくはβ鎖を有するかまたは別の発明の融合タンパク質αおよび／またはβ鎖を有する）を形成することが可能なままであることを意味することになる。
【0085】
具体的実施形態では、ＴＣＲは、機能性ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質であるよう改変されてもよく、ここで、前記エピトープタグは、６から１５アミノ酸、好ましくは９から１１アミノ酸の長さを有する。別の実施形態では、ＴＣＲは、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質であるように改変されてもよく、ここで、前記ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質は、いずれも離れて配置されているかまたはタンデムに直接配置されている２つ以上のエピトープタグを含む。融合タンパク質の実施形態は、融合タンパク質がその生物学的活性（単数または複数）（「機能性」）を維持する限り、２、３、４、５またはさらに多くのエピトープタグを含有し得る。
【0086】
好ましいのは、本発明による機能性ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質であり、ここで、前記エピトープタグは、以下に限定されないが、ＣＤ２０もしくはＨｅｒ２／ｎｅｕタグ、または他の従来のタグ、例えば、ｍｙｃ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、Ｔ７－タグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）－タグ、Ｈｉｓ－タグ、Ｓ－タグ、ＧＳＴ－タグ、もしくはＧＦＰ－タグから選択され、ｍｙｃ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰタグは、既存の分子に由来するエピトープである。対照的に、ＦＬＡＧは、高い抗原性のために設計された合成エピトープタグである（例えば、米国特許第４，７０３，００４号明細書および同第４，８５１，３４１号明細書を参照されたい）。高品質の試薬をその検出に使用することが可能であるため、ｍｙｃタグが好ましくは使用され得る。エピトープタグは、当然のことながら、抗体による認識の他に、１つまたは複数の追加の機能を有してもよい。これらのタグの配列は文献に記載されており、当業者に周知である。
【0087】
キメラ補助刺激受容体
抗原特異的ＴＣＲ（例えば、ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲまたはＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲ）と組み合わせて使用されるキメラ補助刺激受容体は、
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含む。
抗原特異的ＴＣＲ（例えば、ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲまたはＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲ）と組み合わせて使用されるキメラ補助刺激受容体は、
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含む。
【0088】
本明細書において、抗原特異的ＴＣＲ、例えばＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲまたはＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲと組み合わせて使用されるキメラ補助刺激受容体は、ＰＤ－１（例えば、ヒトＰＤ－１）由来の細胞外ドメインを含有する細胞外ドメインを特に含んでもよい。この文脈では、用語「由来の」は、細胞外ドメインに含有されるポリペプチドが、それぞれ、ＰＤ－１（例えば、ヒトＰＤ－１）の少なくとも一部、好ましくはＰＤ－１の細胞外ドメインを含むことを特に意味する。ＰＤ－１由来の細胞外ドメインを含むキメラ補助刺激受容体は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２またはＰＤ－１の他の阻害性リガンドに対して結合活性を有する。本明細書で使用される場合、用語ＰＤ－１「由来の」は、ＰＤ－１（例えば、ヒトＰＤ－１）の天然の配列またはその一部（例えば、細胞外ドメイン）と比較して、最大０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多いアミノ酸が、置換、欠失、および／または挿入されていることも可能にする。
【0089】
一実施形態では、ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメインは、配列番号２８に示される配列または配列番号２８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。具体的実施形態では、ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメインは、配列番号２８に示される配列を含む。
【0090】
本発明の一実施形態では、キメラ補助刺激受容体は、ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメインを含み、ヒトまたはマウスのＰＤ－１、例えば、配列番号２８に示されているヒトＰＤ－１の細胞外ドメインのアミノ酸配列と比較して、最大０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換（好ましくは、保存的または高度に保存的な置換）、欠失および／または挿入を有するアミノ酸配列を含む。
【0091】
本明細書において、抗原特異的ＴＣＲ、例えばＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲまたはＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲと組み合わせて使用されるキメラ補助刺激受容体は、細胞外ドメインと細胞内ドメインとの間で作動可能に連結された膜貫通ドメインをさらに含む。一般に、膜貫通ドメインは、特定の膜貫通ドメインに限定されない。好ましくは、膜貫通ドメインは、融合タンパク質を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の膜における融合タンパク質の安定な固定を可能にし、それぞれ細胞外ドメインのＰＤ－Ｌ１への結合をさらに可能にし、ＰＤ－Ｌ１への結合時に、４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメインへのシグナル伝達を可能にする。
【0092】
好ましい実施形態では、キメラ補助刺激受容体の膜貫通ドメインは、ＰＤ－１由来ある。一実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３０に示される配列または配列番号３０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。具体的実施形態では、ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する膜貫通ドメインは、配列番号３０に示される配列を含む。
【0093】
本明細書において、抗原特異的ＴＣＲ、例えばＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲまたはＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲと組み合わせて使用されるキメラ補助刺激受容体は、４－１ＢＢ（例えば、「４１ＢＢ」と称される）由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン、好ましくは４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）の細胞内ドメインを特に含んでもよい。この文脈では、用語「由来の」は、細胞内ドメインに含有されるポリペプチドが、それぞれ、４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）の少なくとも一部、好ましくは４－１ＢＢの細胞内ドメインを含むことを特に意味する。４－１ＢＢ由来の細胞内ドメインを含むキメラ補助刺激受容体は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２もしくはＰＤ－１の別の阻害性リガンドによる刺激により、前記キメラ補助刺激受容体を発現するＴ細胞の増殖率を増加させることが可能であり、および／またはキメラ補助刺激受容体を発現していない対応するＴ細胞と比較して、前記キメラ補助刺激受容体を発現しているＴ細胞のエフェクター機能（ＩＦＮ－γ放出の増加および／または細胞毒性の増加など）を増大させることが可能である。本明細書で使用される場合、用語４－１ＢＢ「由来の」は、４－１ＢＢ（ヒトまたはマウスの、好ましくはヒトの４－１ＢＢ）の天然の配列またはその一部（例えば、細胞内ドメン）と比較して、最大０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多いアミノ酸が、置換、欠失、および／または挿入されていることも可能にする。一実施形態では、４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメインは、配列番号３２に示される配列または配列番号３２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。具体的実施形態では、４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメインは、配列番号３２に示される配列を含む。
【0094】
「少なくとも８０％同一」、特に「少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列が、示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを含む。
【0095】
複数の配列間のパーセント同一性の決定は、好ましくは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ（商標） １０プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、ＵＳＡ）のＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して達成される。このプログラムは、改変Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用する（Thompson et al., 1994. Nucl Acids Res. 22: pp. 4673-4680；Invitrogen Corporation；Vector NTI AdvanceTM10 DNA and protein sequence analysis software. User's Manual, 2004, pp.389-662）。パーセント同一性の決定は、ＡｌｉｇｎＸアプリケーションの標準パラメーターを用いて実施される。
【0096】
核酸、核酸組成物およびベクター
本発明は、抗原特異的ＴＣＲ、特に本明細書に記載されているＮＹ－ＥＳＯ－１またはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲをコードする核酸、ならびに対応する核酸組成物および前記核酸を含むベクターを包含する。
本発明は、抗原特異的ＴＣＲ、特に本明細書に記載されているＮＹ－ＥＳＯ－１またはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲをコードする核酸、ならびに対応する核酸組成物および前記核酸を含むベクターを包含する。
【0097】
ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲの関連する領域およびドメインをコードするヌクレオチド配列は、表１に示されている：
【0098】
【表1】
【0099】
キメラ補助刺激受容体の関連する領域およびドメインをコードするヌクレオチド配列は、表２に示されている：
【0100】
【表2】
【0101】
したがって、さらなる態様は、
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む組成物に関する。
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む組成物に関する。
【0102】
さらに、一態様は、
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む核酸に関する。
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む核酸に関する。
【0103】
さらに、さらなる態様は、
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む組成物に関する。
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む組成物に関する。
【0104】
さらに、一態様は、
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む核酸に関する。
－ 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む核酸に関する。
【0105】
さらなる態様は、ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲおよびキメラ補助刺激受容体の配列を含む核酸を含むベクターを指す。別の態様は、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲおよびキメラ補助刺激受容体の配列を含む核酸を含むベクターを指す。核酸組成物および／またはベクターを含む細胞も包含される。
【0106】
「核酸分子」は、一般的に、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、一本鎖または二本鎖であってもよく、天然源から合成または得られてもよく（例えば、単離および／または精製されてもよく）、天然、非天然または改変されたヌクレオチドを含有してもよく、および天然、非天然または改変されたヌクレオチド間の連結、例えば、未改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりに、ホスホロアミデート連結またはホスホロチオエート連結などを含有してもよい。好ましくは、本明細書に記載の核酸は組換え体である。本明細書で使用される場合、用語「組換え体」は、（ｉ）天然もしくは合成核酸セグメントを、生細胞中で複製し得る核酸分子に連結することによって、生細胞の外側で構築される分子、または（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されたものの複製から得られる分子を指す。本発明の目的として、複製は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製であっても、またはｉｎ ｖｉｖｏ複製であってもよい。核酸は、当技術分野で公知の、または市販の（例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒおよび同様の会社からの）手順を使用して、化学合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Sambrook et al.を参照されたく、核酸は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させるか、またはハイブリダイゼーションの際に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された様々な改変ヌクレオチド（例えば、Sambrook et al. 2001を参照されたい）（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学的に合成され得る。核酸は、組換えＴＣＲおよび／あるいはキメラ補助刺激受容体、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはその機能性部分もしくは機能性バリアントのいずれかをコードする任意のヌクレオチド配列を含み得る。
【0107】
例えば、本開示は、単離または精製された核酸のバリアントであって、バリアント核酸が、本明細書に記載のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なヌクレオチド配列を含む、バリアントも提供する。このようなバリアントヌクレオチド配列は、ＰＲＡＭＥまたはＮＹ－ＥＳＯ－２、特にＰＲＡＭＥのエピトープＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）または配列番号３４のＮＹ－ＥＳＯ－１のエピトープを特異的に認識する機能的ＴＣＲをコードする。
【0108】
例えば、本開示は、単離または精製された核酸のバリアントであって、バリアント核酸が、本明細書に記載のキメラ補助刺激受容体と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なヌクレオチド配列を含む、バリアントも提供する。このようなバリアントヌクレオチド配列は、本明細書に記載されている機能的キメラ補助刺激受容体をコードする。
【0109】
本明細書の他の箇所で既に記載されているように、ＴＣＲおよび／またはキメラ補助刺激受容体をコードする核酸は改変されてもよい。核酸配列全体における有用な改変は、コドン最適化であり得る。翻訳されたアミノ酸配列内に保存的置換をもたらす変更がなされ得る。ＴＣＲに関して、これらのバリエーションは、機能に影響を及ぼさないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定領域および非相補性決定領域においてなされ得る。通常、付加と欠失は、ＣＤＲ３領域において行うべきではない。
【0110】
別の実施形態は、本明細書に記載されているＴＣＲおよびキメラ補助刺激受容体をコードする核酸を含むベクターを指す。
【0111】
ベクターは、好ましくは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくは粒子および／または遺伝子治療において使用されるベクターである。
【0112】
「ベクター」は、核酸配列を、コードされたポリペプチドの合成が起こり得る好適な宿主細胞中に運ぶための能力を有する任意の分子または組成物である。典型的には、および好ましくは、ベクターは、所望の核酸配列（例えば、本発明の核酸）を組み込むために、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法を使用して操作された核酸である。ベクターは、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでもよく、ならびに／またはリポソームおよび／もしくはウイルス粒子を含んでもよい。ベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくは粒子および／または遺伝子治療において使用されるベクターであってもよい。ベクターは、複製開始点として、宿主細胞における複製を可能とする核酸配列を含んでもよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および当業者にとって公知の他の遺伝要素も含んでもよい。ベクターは、好ましくは、前記核酸の発現を可能にする配列に作動可能に連結した本発明による核酸を含む発現ベクターである。
【0113】
好ましくは、ベクターは発現ベクターである。より好ましくは、ベクターは、レトロウイルス、より具体的には、γ－レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクターである。
【0114】
当業者は、キメラ補助刺激受容体配列ならびにＴＣＲ鎖のＴＣＲ－α鎖およびＴＣＲ－β鎖の配列が、１つの核酸、例えば１つのベクターに含まれ得ることを理解する。この場合、配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の配列あるいはブタツェコウイルス（Ｐ２Ａ）由来のまたはＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）もしくは口蹄疫ウイルス２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）のような他の種由来の２Ａペプチド配列と連結されており（Szymczak et al.: Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectorsに記載されている）、形質導入細胞内でウイルスプロモーターの制御下にある単一のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を発現させる。
【0115】
具体的実施形態では、細胞は、本明細書に記載されているＴＣＲおよびキメラ補助刺激受容体をコードする核酸または前記核酸を含むベクターを含んでもよい。
【0116】
用語「トランスフェクション」と「形質導入」は交換可能であり、外因性核酸配列が、宿主細胞、例えば、真核宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸配列の導入または移入は、上述の方法に限定されないが、電気穿孔、微量注射、遺伝子銃送達、リポフェクション、スーパーフェクションおよびレトロウイルスまたは形質導入もしくはトランスフェクションに好適な他のウイルスによる上述の感染を含む任意の数の手段よって達成され得る。ＴＣＲのクローニングおよび外因性発現の方法は、例えば、Engels et al.（Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013）に記載されている。一次ヒトＴ細胞のレンチウイルスベクターによる形質導入は、例えば、Cribbs "simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells" BMC Biotechnol. 2013; 13: 98に記載されている。
【0117】
本明細書で記載および提供されている核酸分子またはベクターを含む本発明に関連して記載および提供される細胞は、本発明の抗原特異的ＴＣＲ、例えばＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲまたはＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲ、およびキメラ補助刺激受容体を安定してまたは一過的に（例えば、安定して）発現する（構成的にまたは状況的に）ことができるのが好ましい。宿主細胞には、一般に、任意の好適な核酸分子またはベクターによって形質導入または形質転換され得る。一実施形態では、宿主細胞には、上記のように、本発明の融合タンパク質またはその一部（例えば、ＥＣＤ、ＴＭＤ、および／またはＩＣＤ）をコードする核酸分子を含むレトロウイルスまたはレンチウイルス（例えば、レトロウイルス）ベクターにより形質導入される。
【0118】
一部の実施形態では、細胞（例えば、標的特異的免疫細胞または本明細書において言及されている細胞もしくは細胞の集団を含む）は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。細胞は、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞であってもよい。好ましくは、細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞様メモリーＴ細胞である。
【0119】
幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、自己再生能および長期間存続する能力によって特徴付けられる、分化の程度の低いＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団である。ｉｎ ｖｉｖｏでこれらの細胞がそれらの抗原に遭遇すると、これらは、一部の静止したままのＴＳＣＭと共に、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）および最終分化エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ）へとさらに分化する（Flynn et al., Clinical & Translational Immunology (2014)）。これらの残っているＴＳＣＭ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで耐性免疫記憶を構築する能力を示し、したがって、養子Ｔ細胞療法に関する重要なＴ細胞亜集団であると考えられる（Lugli et al., Nature Protocols 8, 33-42 (2013) Gattinoni et al., Nat. Med. 2011 Oct; 17(10): 1290-1297）。幹細胞メモリーＴ細胞亜集団にＴ細胞プールを限定するために、免疫磁気選択を使用することができる。（Riddell et al. 2014, Cancer Journal 20(2): 141-44）を参照されたい。
【0120】
医薬組成物、医学的処置およびキット
本発明の別の態様は、抗原特異的ＴＣＲ、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲもしくはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲ、およびキメラ補助刺激受容体を含むか、または本明細書に記載されている前記分子をコードする核酸分子を含む細胞を含む医薬組成物、抗原特異的ＴＣＲ、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲもしくはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲ、およびキメラ補助刺激受容体をコードする核酸、抗原特異的ＴＣＲ、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲもしくはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲをコードする核酸、およびキメラ補助刺激受容体をコードする核酸を含む組成物、本明細書に記載されている対応するベクターを指す。
本発明の別の態様は、抗原特異的ＴＣＲ、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲもしくはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲ、およびキメラ補助刺激受容体を含むか、または本明細書に記載されている前記分子をコードする核酸分子を含む細胞を含む医薬組成物、抗原特異的ＴＣＲ、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲもしくはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲ、およびキメラ補助刺激受容体をコードする核酸、抗原特異的ＴＣＲ、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲもしくはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲをコードする核酸、およびキメラ補助刺激受容体をコードする核酸を含む組成物、本明細書に記載されている対応するベクターを指す。
【0121】
本発明のこれらの活性成分は、好ましくは、許容される担体または担体材料と混合した用量で、このような医薬組成物によって、疾患が処置されるかまたは少なくとも緩和され得るように使用される。このような組成物は、（活性成分および担体に加えて）、当技術分野の公知の状態である充填材料、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤および他の材料を含み得る。
【0122】
用語「薬学的に許容される」は、活性成分の生体活性の有効性を妨げない、非毒性材料を定義する。担体の選択は、適用に依存する。
【0123】
医薬組成物は、活性成分の活性を増強するかまたは処置を補う追加の成分を含有してもよい。このような追加の成分および／または因子は、相乗効果を達成するかまたは有害もしくは望ましくない作用を最小限にするための、医薬組成物の一部であり得る。
【0124】
本発明の活性成分の製剤化または調製および適用／薬物治療のための技法は、"Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, latest editionに公開されている。適当な適用は、非経口適用、例えば、筋肉内、皮下、髄内注射および髄腔内、直接脳室内、静脈内、節内、腹腔内または腫瘍内注射である。静脈内注射は、患者にとって好ましい処置である。
【0125】
好ましい実施形態によれば、医薬組成物は、注入または注射である。
【0126】
注射用組成物は、少なくとも１つの有効成分、例えば、抗原特異的ＴＣＲ、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲまたはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲ、およびキメラ補助刺激受容体を含む増殖Ｔ細胞集団（例えば、処置される患者に対して自己であるかまたは同種間である）を含む薬学的に許容される流体組成物である。有効成分は、通常、生理的に許容される担体中に溶解されるかまたは懸濁され、さらに、組成物は、乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤などの少量の１つまたは複数の非毒性補助剤を含んでもよい。本開示の融合タンパク質と共に使用するのに有用な、このような注射用組成物は従来的なものであり、適当な製剤は、当業者に周知である。
【0127】
典型的には、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。
【0128】
したがって、本発明の別の態様は、医薬として使用するための、本明細書に記載されている細胞、本明細書に記載されている組成物、本明細書に記載されている核酸、および／または本明細書に記載されているベクターを指す。
【0129】
一部の実施形態は、がんの処置において使用するための、本明細書に記載されている細胞、本明細書に記載されている組成物、本明細書に記載されている核酸、および／または本明細書に記載されているベクターを指す。
【0130】
一実施形態では、がんは、血液がんまたは固形腫瘍である。
【0131】
血液がんは、固形腫瘍を形成せず、したがって、体内に主に分散される血液のがんとも言われる。血液がんの例は、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫である。固形腫瘍には２つの主要なタイプ、すなわち肉腫および癌が存在する。肉腫は、例えば、血管、骨、脂肪組織、靭帯、リンパ管、筋肉または腱の腫瘍である。具体的実施形態では、がんは固形腫瘍である。
【0132】
一実施形態では、がんは、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵臓がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、扁平上皮癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌、頭頚部がん、胃がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、胃腺癌、胆管細胞癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病、癌、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される。
【0133】
本明細書に記載されている改変Ｔ細胞を含む組成物は、公知の技法に従って、養子免疫療法のための方法および組成物において、または本開示に基づいて、当業者に明らかとなるそのバリエーションにおいて利用することができる。
【0134】
一部の実施形態では、細胞は、最初に、それらを培養培地から回収し、次いで、細胞を洗浄し、培地および投与に好適な容器系（「薬学的に許容される」担体）において、治療有効量で濃縮することによって製剤化される。好適な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には、通常生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であってもよいが、水中５％のデキストロースまたは乳酸リンゲル液も利用することができる。注入培地にヒト血清アルブミンを補充してもよい。
【0135】
組成物中の有効治療のための細胞数は、典型的には、１０より多い細胞、かつ最大１０６、１０８または１０９以下の細胞であり、１０１０より多い細胞でもよい。細胞数は、組成物が、その中に含まれる細胞の種類に応じて意図される最終的用途に応じて変わることになる。本発明において提供される用途では、細胞は、一般的には１リットル以下の体積中にあり、５００ｍｌ以下、さらには２５０ｍｌまたは１００ｍｌ以下であってもよい。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には１ｍｌ当たり１０６を超える細胞であり、一般的には１ｍｌ当たり１０７を超え、一般的には１ｍｌ当たり１０８を超える。臨床的に関連する数の免疫細胞は、１０９、１０１０または１０１１の細胞に累積的に等しいかまたはそれを超える複数の注入物中に配分され得る。本発明において提供される医薬組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、粉体、水性、または凍結乾燥形態であってもよい。好適な医薬担体の例は、当技術分野において公知である。このような担体および／または添加剤は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。安定化剤、例えば、脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマーおよびキレート剤は、組成物を体内での分解から保護することができる。注射による投与が意図される組成物中には、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤および等張剤のうちの１つまたは複数が含まれてもよい。
【0136】
本発明において提供される抗原特異的ＴＣＲ、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲまたはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲ、およびキメラ補助刺激受容体をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター粒子は、キットとしてパッケージングされ得る。キットは、任意選択で、１つまたは複数の成分、例えば、使用説明書、デバイス、および追加の試薬、ならびに本方法を実践するためのコンポーネント、例えば、チューブ、容器およびシリンジを含んでもよい。例示的なキットは、組換えＴＣＲおよびキメラ補助刺激受容体をコードする核酸、組換えポリペプチド、または本発明において提供されるウイルスを含んでもよく、任意選択で、使用説明書、対象においてウイルスを検出するためのデバイス、組成物を対象に投与するためのデバイス、および組成物を対象に投与するためのデバイスを含んでもよい。
【0137】
抗原特異的ＴＣＲ、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲまたはＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲ、およびキメラ補助刺激受容体をコードするヌクレオチドを含むキットも本発明において企図される。目的の配列（例えば、組換えＴＣＲ）をコードするウイルスベクターおよび任意選択で免疫チェックポイント阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットも、本明細書において企図されている。
【0138】
本明細書において企図されるキットは、本明細書に開示されたＴＣＲおよび／またはキメラ補助刺激受容体のうちのいずれか１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するための方法を実行するためのキットも含む。特に、このような診断キットは、適当な増幅プライマーおよび検出プライマーならびに本明細書に開示されたＴＣＲおよび／またはキメラ補助刺激受容体をコードするポリヌクレオチドを検出するために、ディープシーケンシングを実施するための他の関連試薬のセットを含んでもよい。さらなる実施形態では、本発明におけるキットは、抗体または他の結合分子などの、本明細書に開示されたＴＣＲおよび／またはキメラ補助刺激受容体を検出するための試薬を含んでもよい。診断キットは、本明細書に開示されたＴＣＲおよび／またはキメラ補助刺激受容体をコードするポリヌクレオチドの存在を決定するため、または本明細書に開示されたＴＣＲおよび／またはキメラ補助刺激受容体の存在を決定するための説明書も含有し得る。キットは、説明書を含有してもよい。説明書は、典型的には、キットに含まれる成分、対象の適切な状態を決定するための方法を含む投与のための方法、適切な投薬量、および適切な投与方法を説明する有形の表現を含む。説明書は、処置時間の持続期間にわたって対象をモニタリングするためのガイダンスも含み得る。
【0139】
本発明において提供されるキットは、本明細書に記載の組成物を対象に投与するためのデバイスも含み得る。医薬またはワクチンを投与するための、当技術分野で公知の種々のデバイスのいずれかが、本発明において提供されるキットに含まれてもよい。例示的なデバイスとしては、以下に限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば、点眼器が挙げられる。典型的には、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスに対応するものであり、例えば、高圧注射用デバイスなどの無針注射用デバイスは、高圧注射によって損傷を受けなかったウイルスと共に、キット中に含まれてもよいが、典型的には、高圧注射によって損傷を受けたウイルスと共に、キット中に含まれることはない。
【0140】
サイトカイン放出
ＴＣＲと補助刺激分子、例えばＰＤ１－４ＢＢとの両方を発現する細胞は、サイトカイン放出の増強を示す。集団によって多量に分泌されるサイトカイン／溶解性タンパク質は、とりわけ、ＩＦＮ－γ、Ｇｚｍ－Ｂ、およびＩＰ－１０、ＭＩＰ－１βである。
ＴＣＲと補助刺激分子、例えばＰＤ１－４ＢＢとの両方を発現する細胞は、サイトカイン放出の増強を示す。集団によって多量に分泌されるサイトカイン／溶解性タンパク質は、とりわけ、ＩＦＮ－γ、Ｇｚｍ－Ｂ、およびＩＰ－１０、ＭＩＰ－１βである。
【0141】
驚くべきことに、免疫細胞、特に本明細書で定義されているキメラ補助刺激受容体を発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、本明細書で定義されているキメラ補助刺激受容体を欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより高い多機能性を示す。
【0142】
トランスジェニックＴ細胞のより高い多機能性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのより高い多機能性および抗腫瘍活性を指し、臨床転帰と相関する。
【0143】
用語「多機能性」は、タンパク質が、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種のタンパク質を分泌することを意味する。
【0144】
当業者は、細胞が抗原特異的な刺激を受けた後、例えば、ＭＨＣ分子中に抗原を提示する抗原提示細胞と接触した場合に、細胞がタンパク質を分泌することを理解する。
【0145】
特に、細胞集団は、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、３％、４％、４．５％の多機能性細胞のような、かなりのパーセンテージの細胞を含む。
【0146】
特に、細胞集団は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも１．５％、より好ましくは１．７５％の３種以上のタンパク質を発現するかなりのパーセンテージの細胞を含む。
【0147】
一部の実施形態では、多機能性強度指数は、８０以上、好ましくは９０以上、より好ましくは１００以上である。
【0148】
多機能性強度指数（ＰＳＩ）は、様々な分泌されたサイトカインの強度と多機能性Ｔ細胞のパーセンテージを乗算することによって計算した。
【0149】
特に、本発明者らは、標的特異的、例えばＰＲＡＭＥ特異的またはＮＹ－ＥＳＯ－１特異的な、ＴＣＲと、本明細書で定義されているキメラ補助刺激受容体との両方を発現する細胞集団が、少なくとも２種のタンパク質、例えば少なくとも３種のタンパク質、少なくとも４種のタンパク質、少なくとも５種のタンパク質を分泌する細胞を含むことを示すことができた。
【0150】
したがって、本発明の別の態様は、Ｔ細胞の集団が本明細書で定義されているかなりの割合の多機能性Ｔ細胞を含むかどうかを示すことによって、Ｔ細胞の集団の効力を示すｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを指す。
【0151】
よって、一般に、エフェクタータンパク質、刺激性サイトカインおよび化学誘引性サイトカインの群から選択される少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種のタンパク質を分泌する、非常に強力な標的特異的Ｔ細胞が望まれる。
【0152】
特に、本発明は、免疫細胞の集団の効力を示すｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイであって、
－ 細胞の第１の集団のうちの多機能性免疫細胞の割合を測定するステップと、
－ 免疫細胞の第１の集団の効力を評価するステップと、Ｔ細胞の第２の集団の効力を評価するステップ
とを含み、第２の集団と比較して、第１の集団における多機能性細胞の割合の増加が、第１の集団が第２の集団より高い効力を有することを示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを指す。
－ 細胞の第１の集団のうちの多機能性免疫細胞の割合を測定するステップと、
－ 免疫細胞の第１の集団の効力を評価するステップと、Ｔ細胞の第２の集団の効力を評価するステップ
とを含み、第２の集団と比較して、第１の集団における多機能性細胞の割合の増加が、第１の集団が第２の集団より高い効力を有することを示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを指す。
【0153】
多機能性免疫細胞の集団の測定は、ＩｓｏＬｉｇｈｔ（登録商標）技術（Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓ）によって行うことができる。
【0154】
したがって、エフェクタータンパク質、刺激性サイトカインおよび化学誘引性サイトカインの群から選択される少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種のタンパク質を分泌する標的特異的Ｔ細胞を含むＴ細胞集団が望まれる。
【0155】
エフェクタータンパク質は、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＭＩＰ－１αからなる群から選択することができる。
【0156】
一実施形態では、刺激性サイトカインは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２からなる群から選択することができる。一実施形態では、刺激性タンパク質は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２およびＩＬ－８から選択される。一実施形態では、刺激性タンパク質はＧＭ－ＣＳＦである。
【0157】
化学誘引性サイトカインは、ＩＰ－１０およびＭＩＰ－１βから選択することができる。
【0158】
一部の実施形態では、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞は各々、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＭＩＰ－１α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＰ－１０およびＭＩＰ－１βからなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１種を分泌する。一部の実施形態では、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞は各々、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＭＩＰ－１βおよびＩＰ－１０からなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１種を分泌する。一部の実施形態では、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞は各々、ＩＦＮ－γ、Ｇｚｍ－Ｂ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１βおよびＩＰ－１０からなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１種を分泌する。一部の実施形態では、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞は各々、ＩＦＮ－γ、Ｇｚｍ－Ｂ、ＧＭ－ＣＳＦからなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１種を分泌する。一部の実施形態では、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞は各々、ＩＦＮ－γ、Ｇｚｍ－Ｂ、およびＩＰ－１０からなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１種を分泌する。一部の実施形態では、少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞は各々、ＩＦＮ－γおよびＧｚｍ－Ｂからなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１種を分泌する。
【0159】
典型的には、細胞集団は、かなりの量のＩＬ－６および／またはＩＬ－１０を分泌する細胞を含まない。
【0160】
よって、一部の実施形態は、（Ａ）本明細書で定義されているＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲおよび（Ｂ）本明細書で定義されているキメラ補助刺激受容体を発現するＴ細胞であって、エフェクタータンパク質、刺激性サイトカインおよび化学誘引性サイトカインからなる群から選択される少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種のタンパク質を分泌する、Ｔ細胞を指す。
【0161】
したがって、一部の実施形態は、（Ａ）本明細書で定義されているＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲおよび（Ｂ）本明細書で定義されているキメラ補助刺激受容体を発現するＴ細胞を含む細胞集団であって、エフェクタータンパク質、刺激性サイトカインおよび化学誘引性サイトカインからなる群から選択される少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種のタンパク質を分泌するＴ細胞を含む細胞集団を指す。
【0162】
他の実施形態は、（Ａ）本明細書で定義されているＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲおよび（Ｂ）本明細書で定義されているキメラ補助刺激受容体を発現するＴ細胞であって、エフェクタータンパク質、刺激性サイトカインおよび化学誘引性サイトカインからなる群から選択される少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種のタンパク質を分泌する、Ｔ細胞を指す。
【0163】
したがって、一部の実施形態は、（Ａ）本明細書で定義されているＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲおよび（Ｂ）本明細書で定義されているキメラ補助刺激受容体を発現するＴ細胞を含む細胞集団であって、エフェクタータンパク質、刺激性サイトカインおよび化学誘引性サイトカインからなる群から選択される少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種のタンパク質を分泌するＴ細胞を含む細胞集団を指す。
【0164】
実験
【0165】
[実施例１]
ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、ＴＣＲ発現レベルを変化させない。
トランスジェニックＴＣＲ Ｔ２３．８－２．１－０２７－００４（＝ＴＣＲ）およびＰＤ１－４１ＢＢと組み合わせたＴＣＲ（＝ＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ）の試験および特徴付けのためのエフェクターＴ細胞を調製するために、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を健康なドナーから単離し、ＩＬ－７およびＩＬ－５の存在下でＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化させた。活性化細胞に、ＴＣＲの配列またはＰＤ１－４１ＢＢに連結したＴＣＲの配列のいずれかを含有するレトロウイルス粒子を形質導入した。同じ方法で調製した非形質導入（＝ＵＴ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞を対照として使用した。導入遺伝子の形質導入効率および発現レベルをＴＣＲ－β鎖（ＴＲＢＶ０９）およびＰＤ－１の抗体染色と、その後のフローサイトメトリーによる分析によって、１４日目に決定した。
ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、ＴＣＲ発現レベルを変化させない。
トランスジェニックＴＣＲ Ｔ２３．８－２．１－０２７－００４（＝ＴＣＲ）およびＰＤ１－４１ＢＢと組み合わせたＴＣＲ（＝ＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ）の試験および特徴付けのためのエフェクターＴ細胞を調製するために、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を健康なドナーから単離し、ＩＬ－７およびＩＬ－５の存在下でＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化させた。活性化細胞に、ＴＣＲの配列またはＰＤ１－４１ＢＢに連結したＴＣＲの配列のいずれかを含有するレトロウイルス粒子を形質導入した。同じ方法で調製した非形質導入（＝ＵＴ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞を対照として使用した。導入遺伝子の形質導入効率および発現レベルをＴＣＲ－β鎖（ＴＲＢＶ０９）およびＰＤ－１の抗体染色と、その後のフローサイトメトリーによる分析によって、１４日目に決定した。
【0166】
分析により、構築物ＴＣＲ（９０．２％）とＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ（８２％）の両方で高い形質導入率が達成され得ることが実証される（図１）。ＰＤ－１発現は、非形質導入（ＵＴ）エフェクターＴ細胞およびＴＣＲ形質導入エフェクターＴ細胞において検出することができない。しかしながら、ＰＤ－１抗体のＴＣＲ ＰＤ１－４１ＢＢ形質導入Ｔ細胞への結合は、トランスジェニックＴＣＲの発現と相関するＰＤ１－４１ＢＢの発現レベルが高いことを示す。ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、トランスジェニックＴＣＲのみを発現するエフェクターＴ細胞において測定されたレベルに匹敵するＴＣＲ発現レベルをもたらす。これにより、ＰＤ１－４１ＢＢスイッチ受容体とトランスジェニックＴＣＲの同時発現がＴ細胞において可能であり、細胞表面で等モル発現になることを実証する。
【0167】
[実施例２]
ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の機能的アビディティは、ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現によって変更されない。
機能的アビディティは、トランスジェニックＴＣＲおよびペプチド－ＭＨＣ複合体などの個々の非共有結合性相互作用の複数の親和性の強さの蓄積を指す。このように、エフェクターＴ細胞の機能的アビディティは、ペプチド感受性の尺度となる。高いペプチド感受性を付与するＴＣＲは、より少ない量のペプチドを認識することができる。ＰＤ１－４１ＢＢ受容体の同時発現がＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞のペプチド感受性に影響を及ぼすかどうかを調査するために、これらを、必要とされるＨＬＡ（ＨＬＡ－Ａ２：０１）を有し、ＰＤ１－４１ＢＢとのライゲーションを可能にするためにＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＰＤ－Ｌ１トランスジェニックＴ２細胞（Ｔ２＿ＰＤ－Ｌ１）と共培養した。
ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の機能的アビディティは、ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現によって変更されない。
機能的アビディティは、トランスジェニックＴＣＲおよびペプチド－ＭＨＣ複合体などの個々の非共有結合性相互作用の複数の親和性の強さの蓄積を指す。このように、エフェクターＴ細胞の機能的アビディティは、ペプチド感受性の尺度となる。高いペプチド感受性を付与するＴＣＲは、より少ない量のペプチドを認識することができる。ＰＤ１－４１ＢＢ受容体の同時発現がＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞のペプチド感受性に影響を及ぼすかどうかを調査するために、これらを、必要とされるＨＬＡ（ＨＬＡ－Ａ２：０１）を有し、ＰＤ１－４１ＢＢとのライゲーションを可能にするためにＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＰＤ－Ｌ１トランスジェニックＴ２細胞（Ｔ２＿ＰＤ－Ｌ１）と共培養した。
【0168】
Ｔ２＿ＰＤ－Ｌ１細胞に漸増量のＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（ＳＬＬ）－ペプチド（１０－５Ｍ～１０－１０Ｍ）を負荷し、トランスジェニックＴＣＲなし（ＵＴ）、トランスジェニックＴＣＲのみ（ＴＣＲ）またはＴＣＲとＰＤ１－４１ＢＢとの組合せ（ＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ）のいずれかを発現するエフェクターＴ細胞と、１：１のＥ：Ｔで（２０．０００個の細胞）共培養した。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡを共培養の２０時間後に実施し、Ｔ２＿ＰＤ－Ｌ１細胞が提示した異なる濃度のペプチドを負荷した場合のエフェクターＴ細胞の反応性を評価した（図２）。最大半量のＩＦＮ－γ放出をＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞の機能的アビディティに関する尺度とする。左のグラフでは、ＩＦＮ－γの絶対レベルが示され、一方、右のグラフは、相対値について計算された非線形回帰曲線を示す。ＩＦＮ－γの絶対値を通して示されているように、ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、トランスジェニックＴＣＲのみを発現するエフェクターと比較して、Ｔ細胞によって分泌されるＩＦＮ－γの総量を増加させる。しかしながら、非線形回帰曲線は、ＰＤ１－４１ＢＢの発現に関わらず、全体的な機能的活性が同等であることを示している。したがって、ＴＣＲ－トランスジェニックＴ細胞のペプチド感受性は、リガンドＰＤ－Ｌ１の存在下でもＰＤ１－４１ＢＢスイッチ受容体の同時発現によって変更されない。
【0169】
[実施例３]
ＨＬＡ－Ａ＊０２サブタイプの認識はＰＤ１－４１ＢＢの同時発現によって変更されない。
ＨＬＡ－Ａ２タンパク質は、わずかに異なるアミノ酸配列をもたらす異なるＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子によってコードされ得る。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に関連してその同族ペプチドを認識する特異的ＴＣＲは、別のＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子によって提示されるペプチドを必ずしも認識しない。ＴＣＲに基づく細胞療法を成功させるために必要とされる遺伝形質を定義し、患者コホートの拡大を可能にするために、ＴＣＲを最も一般的なＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子に関連して特徴付ける（図３）。
ＨＬＡ－Ａ＊０２サブタイプの認識はＰＤ１－４１ＢＢの同時発現によって変更されない。
ＨＬＡ－Ａ２タンパク質は、わずかに異なるアミノ酸配列をもたらす異なるＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子によってコードされ得る。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に関連してその同族ペプチドを認識する特異的ＴＣＲは、別のＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子によって提示されるペプチドを必ずしも認識しない。ＴＣＲに基づく細胞療法を成功させるために必要とされる遺伝形質を定義し、患者コホートの拡大を可能にするために、ＴＣＲを最も一般的なＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子に関連して特徴付ける（図３）。
【0170】
トランスジェニックＴＣＲなし（ＵＴ）、トランスジェニックＴＣＲのみ（ＴＣＲ）、またはＴＣＲとＰＤ１－４１ＢＢとの組合せ（ＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ）のいずれかを発現するＴ細胞を、選択されたＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ＊０２：ＸＸ）を有するリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ；ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞）とＥ：Ｔ比１：１（２０．０００個の細胞／ウェル）で共培養した。トランスジェニックＴＣＲによる認識を可能にするために、ＬＣＬに１０－５ＭのＳＬＬ－ペプチドを負荷した。ＩＦＮ－γ濃度を共培養の２０時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。
【0171】
ＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞は、Ａ＊０２：０１と比較して同様のレベルでＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子Ａ＊０２：０２、Ａ＊０２：０４およびＡ＊０２：０９によってコードされるＭＨＣ分子によって提示されたＳＬＬ－ペプチドを認識した。この認識パターンは、ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現によって変更されず、以前の結果と一致している。ＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現とは無関係に、４つの異なるＨＬＡ－Ａ＊０２下位対立遺伝子に関連してＳＬＬ－ペプチドを認識する。
【0172】
[実施例４]
潜在的ペプチドのオフターゲット毒性のリスク回避の成功。
ＴＣＲが特定のペプチド（例えばＳＬＬ－ペプチド）だけでなく、元のペプチドと高い配列相同性を共有する他のペプチドも認識する場合、オフターゲット毒性が生じる可能性がある。特定のペプチドと高い配列類似性を示し、ＴＣＲに認識される可能性のある適当なペプチド候補を同定するために、Ｅｘｐｉｔｏｐｅ ２．０（登録商標）［Jaravine V, Mosch A, Raffegerst S, et al. Expitope 2.0: a tool to assess immunotherapeutic antigens for their potential cross-reactivity against naturally expressed proteins in human tissues. BMC Cancer 2017;17(1):892.］のような計算ツールを使用することができる。このツールは、ゲノムデータ、トランスクリプトームデータおよびプロテオミクスデータに基づいて、ミスマッチ（ＭＭ）の可能性が最も高いペプチドを予測する。Ｅｘｐｉｔｏｐｅ ２．０（登録商標）検索を適用することによって、特定のＳＬＬ－ペプチドと比較して最大４個のアミノ酸の相違を示す１９１個のＭＭペプチドを同定することができた。１０－６ＭのＭＭペプチドまたはＳＬＬ－ペプチドを負荷したＰＤ－Ｌ１トランスジェニックＴ２細胞を使用するプレスクリーニング共培養において、ＴＣＲ－形質導入Ｔ細胞によって認識された３３個のＭＭペプチドを同定した。高濃度のペプチドを外因的に負荷しても、内因的にプロセシングされ提示されたペプチドが必ずしも生理的に認識されるとは限らないため、３３個のＭＭペプチドを、エピトープ（ペプチド）がｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）から翻訳され、ＰＲＡＭＥ陰性標的細胞株ＳＮＢ－１９において内因的にプロセシングされた場合に、ＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞によるＩＦＮ－γ放出を誘導する可能性について調査した。最大５個のＭＭペプチドをコードするＩｖｔＲＮＡをＳＮＢ－１９細胞に電気穿孔させた。プレスクリーニング共培養（ＭＭ０１、ＭＭ２６、ＭＭ６６）において、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞中最も多くのＩＦＮ－γ放出を誘導したＭＭペプチドを「ミディジーン」構築物（約４００ｂｐ）として個々に試験した。他のＭＭペプチドすべてを５個のＭＭペプチドをコードするミニジーン構築物（ペプチドあたり約９０ｂｐ）として試験した。ＳＬＬ－ペプチドをコードするミディジーン構築物を陽性対照として使用した。ｉｖｔＲＮＡトランスフェクションの成功を確認するために、すべてのＲＮＡ構築物は、陽性対照ＴＣＲによって認識されるエピトープを含んだ。ＩＦＮ－γ濃度を、トランスフェクトＳＮＢ－１９細胞のＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞との共培養の２０時間後に決定した。すべてのトランスフェクトＳＮＢ－１９細胞は、陽性対照ＴＣＲによって認識され、トランスフェクションの成功を確認した（図４）。ＳＬＬ－ペプチドをコードするｉｖｔＲＮＡ構築物でトランスフェクトしたＳＮＢ－１９細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によって認識されたが、細胞内でプロセシングされたＭＭペプチドはいずれも認識されなかった。したがって、すべてのＭＭペプチドは、リスク回避が可能であり、オフターゲット毒性をもたらす可能性はない。
潜在的ペプチドのオフターゲット毒性のリスク回避の成功。
ＴＣＲが特定のペプチド（例えばＳＬＬ－ペプチド）だけでなく、元のペプチドと高い配列相同性を共有する他のペプチドも認識する場合、オフターゲット毒性が生じる可能性がある。特定のペプチドと高い配列類似性を示し、ＴＣＲに認識される可能性のある適当なペプチド候補を同定するために、Ｅｘｐｉｔｏｐｅ ２．０（登録商標）［Jaravine V, Mosch A, Raffegerst S, et al. Expitope 2.0: a tool to assess immunotherapeutic antigens for their potential cross-reactivity against naturally expressed proteins in human tissues. BMC Cancer 2017;17(1):892.］のような計算ツールを使用することができる。このツールは、ゲノムデータ、トランスクリプトームデータおよびプロテオミクスデータに基づいて、ミスマッチ（ＭＭ）の可能性が最も高いペプチドを予測する。Ｅｘｐｉｔｏｐｅ ２．０（登録商標）検索を適用することによって、特定のＳＬＬ－ペプチドと比較して最大４個のアミノ酸の相違を示す１９１個のＭＭペプチドを同定することができた。１０－６ＭのＭＭペプチドまたはＳＬＬ－ペプチドを負荷したＰＤ－Ｌ１トランスジェニックＴ２細胞を使用するプレスクリーニング共培養において、ＴＣＲ－形質導入Ｔ細胞によって認識された３３個のＭＭペプチドを同定した。高濃度のペプチドを外因的に負荷しても、内因的にプロセシングされ提示されたペプチドが必ずしも生理的に認識されるとは限らないため、３３個のＭＭペプチドを、エピトープ（ペプチド）がｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）から翻訳され、ＰＲＡＭＥ陰性標的細胞株ＳＮＢ－１９において内因的にプロセシングされた場合に、ＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞によるＩＦＮ－γ放出を誘導する可能性について調査した。最大５個のＭＭペプチドをコードするＩｖｔＲＮＡをＳＮＢ－１９細胞に電気穿孔させた。プレスクリーニング共培養（ＭＭ０１、ＭＭ２６、ＭＭ６６）において、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞中最も多くのＩＦＮ－γ放出を誘導したＭＭペプチドを「ミディジーン」構築物（約４００ｂｐ）として個々に試験した。他のＭＭペプチドすべてを５個のＭＭペプチドをコードするミニジーン構築物（ペプチドあたり約９０ｂｐ）として試験した。ＳＬＬ－ペプチドをコードするミディジーン構築物を陽性対照として使用した。ｉｖｔＲＮＡトランスフェクションの成功を確認するために、すべてのＲＮＡ構築物は、陽性対照ＴＣＲによって認識されるエピトープを含んだ。ＩＦＮ－γ濃度を、トランスフェクトＳＮＢ－１９細胞のＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞との共培養の２０時間後に決定した。すべてのトランスフェクトＳＮＢ－１９細胞は、陽性対照ＴＣＲによって認識され、トランスフェクションの成功を確認した（図４）。ＳＬＬ－ペプチドをコードするｉｖｔＲＮＡ構築物でトランスフェクトしたＳＮＢ－１９細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によって認識されたが、細胞内でプロセシングされたＭＭペプチドはいずれも認識されなかった。したがって、すべてのＭＭペプチドは、リスク回避が可能であり、オフターゲット毒性をもたらす可能性はない。
【0173】
[実施例５]
頻度の高いＨＬＡを網羅するＬＣＬライブラリーを使用してもオフターゲット毒性は同定されなかった。
ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の他のＨＬＡアロタイプとの交差反応性の可能性に関する情報を得るために、白色人種の集団で最も頻度の高いＨＬＡ－Ａ、－Ｂおよび－Ｃ対立遺伝子を網羅するリンパ芽球系細胞株（ＬＣＬ）のライブラリーを標的細胞として使用した。これらのＬＣＬは、多種多様な内因的に発現したペプチドを発現し、適合したＨＬＡ－Ａ２分子または最も頻度の高い他のＨＬＡ分子で提示された内因性ペプチドの認識により潜在的交差反応性を同定するのに役立つ。特定のＨＬＡアロタイプの交差認識が検出されると、それぞれのＨＬＡ対立遺伝子を有する患者は臨床研究から除外されることになる。トランスジェニックＴＣＲなし（ＵＴ）、トランスジェニックＴＣＲのみ（ＴＣＲ）またはＴＣＲとＰＤ１－４１ＢＢとの組合せ（ＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ）のいずれかを発現するＴ細胞を、３６種類のＬＣＬとＥ：Ｔ比１：１で共培養した。ＩＦＮ－γ濃度を共培養の２０時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、陽性対照としての役割を果たすＳＬＬ－ペプチドを負荷したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性ＬＣＬを認識した（図５）。いずれの外因性ペプチドも有さない１つのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＬＣＬとの共培養でのみ、ＩＦＮ－γが放出された。この細胞株では、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって低レベルのＰＲＡＭＥ－ＲＮＡが検出されたため、わずかな認識は、ＨＬＡ－Ａ２が提示するＳＬＬ－ペプチドのオンターゲット認識であった可能性が高い。他のＬＣＬはいずれも、トランスジェニックＴＣＲまたはＰＤ１－４１ＢＢと組み合わせたトランスジェニックＴＣＲを発現するエフェクターＴ細胞によって認識されなかった。したがって、適合したＨＬＡ－Ａ２分子または最も頻度の高い他のＨＬＡ分子に提示された内因性ペプチドの認識に起因するオフターゲット毒性は検出できなかった。
頻度の高いＨＬＡを網羅するＬＣＬライブラリーを使用してもオフターゲット毒性は同定されなかった。
ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の他のＨＬＡアロタイプとの交差反応性の可能性に関する情報を得るために、白色人種の集団で最も頻度の高いＨＬＡ－Ａ、－Ｂおよび－Ｃ対立遺伝子を網羅するリンパ芽球系細胞株（ＬＣＬ）のライブラリーを標的細胞として使用した。これらのＬＣＬは、多種多様な内因的に発現したペプチドを発現し、適合したＨＬＡ－Ａ２分子または最も頻度の高い他のＨＬＡ分子で提示された内因性ペプチドの認識により潜在的交差反応性を同定するのに役立つ。特定のＨＬＡアロタイプの交差認識が検出されると、それぞれのＨＬＡ対立遺伝子を有する患者は臨床研究から除外されることになる。トランスジェニックＴＣＲなし（ＵＴ）、トランスジェニックＴＣＲのみ（ＴＣＲ）またはＴＣＲとＰＤ１－４１ＢＢとの組合せ（ＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ）のいずれかを発現するＴ細胞を、３６種類のＬＣＬとＥ：Ｔ比１：１で共培養した。ＩＦＮ－γ濃度を共培養の２０時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、陽性対照としての役割を果たすＳＬＬ－ペプチドを負荷したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性ＬＣＬを認識した（図５）。いずれの外因性ペプチドも有さない１つのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＬＣＬとの共培養でのみ、ＩＦＮ－γが放出された。この細胞株では、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって低レベルのＰＲＡＭＥ－ＲＮＡが検出されたため、わずかな認識は、ＨＬＡ－Ａ２が提示するＳＬＬ－ペプチドのオンターゲット認識であった可能性が高い。他のＬＣＬはいずれも、トランスジェニックＴＣＲまたはＰＤ１－４１ＢＢと組み合わせたトランスジェニックＴＣＲを発現するエフェクターＴ細胞によって認識されなかった。したがって、適合したＨＬＡ－Ａ２分子または最も頻度の高い他のＨＬＡ分子に提示された内因性ペプチドの認識に起因するオフターゲット毒性は検出できなかった。
【0174】
[実施例６]
正常細胞のパネルを使用してもオフターゲット毒性は同定されなかった。
この実験の目的は、ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さない、ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によって引き起こされる可能性のあるオンターゲット／オフ腫瘍およびオフターゲットの毒性を評価することである。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性の初代正常細胞および必須組織または器官を代表する人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来の細胞株を、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による認識について試験した。個々の標的の特性に合わせ、細胞を共培養開始の１～７日前に、製造業者の使用説明書に従った細胞密度で播種し、平底ウェルで単層培養した。オンターゲット／オフ腫瘍と潜在的なオフターゲット毒性とを区別するために、試験したすべての正常細胞のＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ発現を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって解析した。１０－５Ｍのペプチドを負荷した標的細胞は、内部陽性対照（ＳＬＬ－ペプチド）としての役割を果たした。ＩＦＮ－γ濃度を共培養の２０時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。特異的ＳＬＬ－ペプチドを負荷した正常細胞はすべて、ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さない、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によって認識された（図６）。ペプチドを負荷しなかった場合、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）のみが、非形質導入細胞のバックグラウンドを超えるＩＦＮ－γレベルをもたらした。ｍＤＣはＰＲＡＭＥを発現するので、この認識はＨＬＡ－Ａ２によって提示されたＳＬＬ－ペプチドのオンターゲット認識によるものである。他の標的細胞はいずれも、トランスジェニックＴＣＲまたはＰＤ１－４１ＢＢと組み合わせたトランスジェニックＴＣＲを発現するエフェクターＴ細胞によって認識されなかった。したがって、内因性ペプチドの認識に起因するオフターゲット毒性は観察されなかった。
正常細胞のパネルを使用してもオフターゲット毒性は同定されなかった。
この実験の目的は、ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さない、ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によって引き起こされる可能性のあるオンターゲット／オフ腫瘍およびオフターゲットの毒性を評価することである。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性の初代正常細胞および必須組織または器官を代表する人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来の細胞株を、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による認識について試験した。個々の標的の特性に合わせ、細胞を共培養開始の１～７日前に、製造業者の使用説明書に従った細胞密度で播種し、平底ウェルで単層培養した。オンターゲット／オフ腫瘍と潜在的なオフターゲット毒性とを区別するために、試験したすべての正常細胞のＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ発現を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって解析した。１０－５Ｍのペプチドを負荷した標的細胞は、内部陽性対照（ＳＬＬ－ペプチド）としての役割を果たした。ＩＦＮ－γ濃度を共培養の２０時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。特異的ＳＬＬ－ペプチドを負荷した正常細胞はすべて、ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さない、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によって認識された（図６）。ペプチドを負荷しなかった場合、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）のみが、非形質導入細胞のバックグラウンドを超えるＩＦＮ－γレベルをもたらした。ｍＤＣはＰＲＡＭＥを発現するので、この認識はＨＬＡ－Ａ２によって提示されたＳＬＬ－ペプチドのオンターゲット認識によるものである。他の標的細胞はいずれも、トランスジェニックＴＣＲまたはＰＤ１－４１ＢＢと組み合わせたトランスジェニックＴＣＲを発現するエフェクターＴ細胞によって認識されなかった。したがって、内因性ペプチドの認識に起因するオフターゲット毒性は観察されなかった。
【0175】
[実施例７]
ＰＤ１－４１ＢＢは、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に応答してＩＦＮ－γの特異的放出を増強する。
腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１とＴ細胞上のＰＤ－１との相互作用は通常、Ｔ細胞の活性を低下させる阻害シグナルをもたらす。ＰＤ１－４１ＢＢはこのシグナルを逆転させ、トランスジェニックＴＣＲがその同族ペプチド－ＭＨＣ複合体と結合した場合にＴ細胞反応性を増大させる。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の反応性に及ぼすＰＤ１－４１ＢＢ同時発現の影響を試験するために、ＰＤ１－４１ＢＢを有するかまたは有さないエフェクターＴ細胞を、リガンドＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞と共培養した。この共培養には、特異的抗原ＰＲＡＭＥを異なるレベルで発現する様々な適応症由来の腫瘍細胞を選択した（図７Ａ）。腫瘍細胞株におけるＰＲＡＭＥ－ＲＮＡ発現レベルをリアルタイム定量的ＰＣＲによって決定し、ハウスキーピング遺伝子ＧＵＳＢに対して正規化した。１０個の腫瘍細胞株はＰＲＡＭＥ発現を示したが、４個の腫瘍細胞株ではＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡの発現を検出することができなかった。しかし、これら４個のＰＲＡＭＥ陰性腫瘍細胞株はＰＤ１－４１ＢＢリガンドＰＤ－Ｌ１を発現し、ＰＤ１－４１ＢＢがトランスジェニックＴＣＲ－Ｔ細胞の特異性に悪影響を及ぼさないことを確認するための陰性コントロールとして機能した。ＰＤ－Ｌ１の発現レベルは抗体染色とその後のフローサイトメトリー分析によって決定した。安定した発現を可能にするため、いくつかの腫瘍細胞にＰＤ－Ｌ１を形質導入した（ＴＤ）。一部の腫瘍細胞株ではＰＤ－Ｌ１の内因性（ｅｎｄ）発現が示されたが、他の細胞株ではＩＦＮ－γで処理することによりＰＤ－Ｌ１の発現を誘導することができた（ｉｎｄ）。発現を誘導するのに使用したＩＦＮ－γレベルは、抗原を認識する特異的Ｔ細胞との共培養実験において生じたレベルに匹敵した。腫瘍細胞における内因性ＰＤ－Ｌ１発現レベルは、一般に、ＩＦＮ－γ処理によってさらに上昇させることができた（ｅｎｄ、ｉｎｄ）。
ＰＤ１－４１ＢＢは、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に応答してＩＦＮ－γの特異的放出を増強する。
腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１とＴ細胞上のＰＤ－１との相互作用は通常、Ｔ細胞の活性を低下させる阻害シグナルをもたらす。ＰＤ１－４１ＢＢはこのシグナルを逆転させ、トランスジェニックＴＣＲがその同族ペプチド－ＭＨＣ複合体と結合した場合にＴ細胞反応性を増大させる。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の反応性に及ぼすＰＤ１－４１ＢＢ同時発現の影響を試験するために、ＰＤ１－４１ＢＢを有するかまたは有さないエフェクターＴ細胞を、リガンドＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞と共培養した。この共培養には、特異的抗原ＰＲＡＭＥを異なるレベルで発現する様々な適応症由来の腫瘍細胞を選択した（図７Ａ）。腫瘍細胞株におけるＰＲＡＭＥ－ＲＮＡ発現レベルをリアルタイム定量的ＰＣＲによって決定し、ハウスキーピング遺伝子ＧＵＳＢに対して正規化した。１０個の腫瘍細胞株はＰＲＡＭＥ発現を示したが、４個の腫瘍細胞株ではＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡの発現を検出することができなかった。しかし、これら４個のＰＲＡＭＥ陰性腫瘍細胞株はＰＤ１－４１ＢＢリガンドＰＤ－Ｌ１を発現し、ＰＤ１－４１ＢＢがトランスジェニックＴＣＲ－Ｔ細胞の特異性に悪影響を及ぼさないことを確認するための陰性コントロールとして機能した。ＰＤ－Ｌ１の発現レベルは抗体染色とその後のフローサイトメトリー分析によって決定した。安定した発現を可能にするため、いくつかの腫瘍細胞にＰＤ－Ｌ１を形質導入した（ＴＤ）。一部の腫瘍細胞株ではＰＤ－Ｌ１の内因性（ｅｎｄ）発現が示されたが、他の細胞株ではＩＦＮ－γで処理することによりＰＤ－Ｌ１の発現を誘導することができた（ｉｎｄ）。発現を誘導するのに使用したＩＦＮ－γレベルは、抗原を認識する特異的Ｔ細胞との共培養実験において生じたレベルに匹敵した。腫瘍細胞における内因性ＰＤ－Ｌ１発現レベルは、一般に、ＩＦＮ－γ処理によってさらに上昇させることができた（ｅｎｄ、ｉｎｄ）。
【0176】
ＰＤ１－４１ＢＢ同時発現がサイトカイン放出に及ぼす影響を決定するために、ＰＤ１－４１ＢＢを有する、および有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、異なるレベルのＰＲＡＭＥおよびＰＤ－Ｌ１を発現する選択したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性腫瘍細胞株と共培養した（図７Ｂ）。非形質導入（ＵＴ）Ｔ細胞を対照として使用した。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と腫瘍細胞とをＥ：Ｔ比１：１（２０．０００個の細胞）で共培養し、共培養の２０時間後にＥＬＩＳＡでＩＦＮ－γ濃度を測定した。ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に応答したＩＦＮ－γの放出を増強させ、ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現が、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に応答したＴ細胞反応性を改善させることを示した。同時に、ＰＤ－Ｌ１発現を示すＰＲＡＭＥ陰性腫瘍細胞は認識されないことから、ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現はＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の特異性に影響を及ぼさないことが実証された。サイトカイン放出の増加は、トランスジェニックＴＣＲ Ｔ細胞が特異的ＰＲＡＭＥ抗原を認識した場合にのみ観察される。
【0177】
[実施例８]
ＰＤ１－４１ＢＢは、３Ｄ腫瘍細胞スフェロイドに対する特異的細胞毒性応答を増強する。
ＰＤ１－４１ＢＢの同時共発現が細胞毒性に有益な影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をＰＤ－Ｌ１陽性３Ｄ腫瘍細胞スフェロイドと共培養した（図８）。この３次元腫瘍細胞スフェロイドは固形腫瘍のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして役立つはずである。実施例７で導入した腫瘍細胞パネルから、異なるレベルのＰＲＡＭＥ発現を示し、赤色蛍光タンパク質（ＮｕｃＬｉｇｈｔ－Ｒｅｄ）を発現した３つのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性腫瘍細胞株を選択した。腫瘍スフェロイドに対する細胞毒性は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ（登録商標）またはＳ３（登録商標）デバイスを使用して、４時間ごとに画像を記録し、２０日間にわたる赤色蛍光の消失によって判定した。ＰＤ１－４１ＢＢの同時共発現がＴ細胞適合と回復力に及ぼす影響を調査するために、新鮮な腫瘍細胞スフェロイドを３日目、７日目、１０日目、１３日目および１６日目に共培養プレートに移した。腫瘍細胞に繰り返し曝露されるこの厳しい環境において、ＰＤ１－４１ＢＢの発現は、Ｔ細胞のエフェクター機能および適合性に有益な効果を有する。腫瘍細胞スフェロイドを複数回負荷する過程で、ＰＤ１－４１ＢＢ発現エフェクターＴ細胞は、トランスジェニックＴＣＲのみを発現するエフェクターＴ細胞と比較して、腫瘍細胞成長をより良好に制御することができる。さらに、ＰＲＡＭＥ陰性ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢの発現とは無関係にトランスジェニックＴＣＲ Ｔ細胞によって標的とされなかった。したがって、ＰＤ１－４１ＢＢを同時発現するＴ細胞は完全に抗原依存性のままであるが、ＰＤ－Ｌ１陽性３Ｄ腫瘍細胞スフェロイドに対する特異的細胞毒性応答は増強される。
ＰＤ１－４１ＢＢは、３Ｄ腫瘍細胞スフェロイドに対する特異的細胞毒性応答を増強する。
ＰＤ１－４１ＢＢの同時共発現が細胞毒性に有益な影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をＰＤ－Ｌ１陽性３Ｄ腫瘍細胞スフェロイドと共培養した（図８）。この３次元腫瘍細胞スフェロイドは固形腫瘍のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして役立つはずである。実施例７で導入した腫瘍細胞パネルから、異なるレベルのＰＲＡＭＥ発現を示し、赤色蛍光タンパク質（ＮｕｃＬｉｇｈｔ－Ｒｅｄ）を発現した３つのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性腫瘍細胞株を選択した。腫瘍スフェロイドに対する細胞毒性は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ（登録商標）またはＳ３（登録商標）デバイスを使用して、４時間ごとに画像を記録し、２０日間にわたる赤色蛍光の消失によって判定した。ＰＤ１－４１ＢＢの同時共発現がＴ細胞適合と回復力に及ぼす影響を調査するために、新鮮な腫瘍細胞スフェロイドを３日目、７日目、１０日目、１３日目および１６日目に共培養プレートに移した。腫瘍細胞に繰り返し曝露されるこの厳しい環境において、ＰＤ１－４１ＢＢの発現は、Ｔ細胞のエフェクター機能および適合性に有益な効果を有する。腫瘍細胞スフェロイドを複数回負荷する過程で、ＰＤ１－４１ＢＢ発現エフェクターＴ細胞は、トランスジェニックＴＣＲのみを発現するエフェクターＴ細胞と比較して、腫瘍細胞成長をより良好に制御することができる。さらに、ＰＲＡＭＥ陰性ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢの発現とは無関係にトランスジェニックＴＣＲ Ｔ細胞によって標的とされなかった。したがって、ＰＤ１－４１ＢＢを同時発現するＴ細胞は完全に抗原依存性のままであるが、ＰＤ－Ｌ１陽性３Ｄ腫瘍細胞スフェロイドに対する特異的細胞毒性応答は増強される。
【0178】
[実施例９]
ＰＤ１－４１ＢＢは、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に応答してＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の増殖を増加させる。
ＰＤ１－４１ＢＢを同時発現するＴＣＲトランスジェニックＴ細胞のエフェクター機能および回復力の増加は、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に応答したサイトカイン放出および細胞毒性の増強によって決定された（実施例７、８）。特に、腫瘍細胞スフェロイドを複数回負荷した後でも、腫瘍細胞の制御がより良好であることは、抑制的な腫瘍細胞環境におけるＴ細胞適合性の増加を示しており、Ｔ細胞のより良好な生存または増殖とも関連している可能性がある。ＰＤ１－４１ＢＢスイッチ受容体に含まれる４－１ＢＢシグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞の増殖率を高める補助刺激をもたらすことが知られている（Choi et al., 4-1BB signaling activates glucose and fatty acidmetabolism to enhance CD8+T cell proliferation; 2017）。ＰＤ１－４１ＢＢがそのリガンドＰＤ－Ｌ１と相互作用する場合にも、このＴ細胞増殖の増加を観察することができるかどうかを調査するために、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、異なるレベルのＰＲＡＭＥ抗原を発現するＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞と共培養した（図９）。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性腫瘍細胞株をＥ：Ｔが１：１で共培養し、非形質導入Ｔ細胞（ＵＴ）を対照として使用した。ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞との共培養におけるＴ細胞のＸ倍増殖を測定するために、細胞を７日目に回収し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ｘ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して総細胞数を決定した。フローサイトメトリーベースの細胞計数により、共培養中に依然として存在する可能性のあるＴ細胞と腫瘍細胞とを容易に区別することが可能であった。予測されたように、非形質導入Ｔ細胞は、増殖に必要とされる特異的ＴＣＲ刺激が存在しないため、ＰＲＡＭＥ陽性腫瘍細胞に応答して増殖しなかった。トランスジェニックＴＣＲ－Ｔ細胞は、特異的抗原ＰＲＡＭＥのレベルに依存すると思われる方法で、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に応答して増殖した。ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、トランスジェニックＴＣＲのみを発現するＴ細胞と比較して、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に応答して増殖と生存を、抗原レベル依存的に増強した。したがって、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞におけるＰＤ１－４１ＢＢの発現は、増殖率を改善し、阻害性ＰＤ－Ｌ１受容体を含有する困難な腫瘍細胞環境における細胞の生存率向上に寄与する。
ＰＤ１－４１ＢＢは、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に応答してＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の増殖を増加させる。
ＰＤ１－４１ＢＢを同時発現するＴＣＲトランスジェニックＴ細胞のエフェクター機能および回復力の増加は、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に応答したサイトカイン放出および細胞毒性の増強によって決定された（実施例７、８）。特に、腫瘍細胞スフェロイドを複数回負荷した後でも、腫瘍細胞の制御がより良好であることは、抑制的な腫瘍細胞環境におけるＴ細胞適合性の増加を示しており、Ｔ細胞のより良好な生存または増殖とも関連している可能性がある。ＰＤ１－４１ＢＢスイッチ受容体に含まれる４－１ＢＢシグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞の増殖率を高める補助刺激をもたらすことが知られている（Choi et al., 4-1BB signaling activates glucose and fatty acidmetabolism to enhance CD8+T cell proliferation; 2017）。ＰＤ１－４１ＢＢがそのリガンドＰＤ－Ｌ１と相互作用する場合にも、このＴ細胞増殖の増加を観察することができるかどうかを調査するために、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、異なるレベルのＰＲＡＭＥ抗原を発現するＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞と共培養した（図９）。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性腫瘍細胞株をＥ：Ｔが１：１で共培養し、非形質導入Ｔ細胞（ＵＴ）を対照として使用した。ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞との共培養におけるＴ細胞のＸ倍増殖を測定するために、細胞を７日目に回収し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ｘ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して総細胞数を決定した。フローサイトメトリーベースの細胞計数により、共培養中に依然として存在する可能性のあるＴ細胞と腫瘍細胞とを容易に区別することが可能であった。予測されたように、非形質導入Ｔ細胞は、増殖に必要とされる特異的ＴＣＲ刺激が存在しないため、ＰＲＡＭＥ陽性腫瘍細胞に応答して増殖しなかった。トランスジェニックＴＣＲ－Ｔ細胞は、特異的抗原ＰＲＡＭＥのレベルに依存すると思われる方法で、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に応答して増殖した。ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、トランスジェニックＴＣＲのみを発現するＴ細胞と比較して、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に応答して増殖と生存を、抗原レベル依存的に増強した。したがって、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞におけるＰＤ１－４１ＢＢの発現は、増殖率を改善し、阻害性ＰＤ－Ｌ１受容体を含有する困難な腫瘍細胞環境における細胞の生存率向上に寄与する。
【0179】
[実施例１０]
ＰＤ１－４１ＢＢを同時発現するＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍反応性を示す。
ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の抗腫瘍エフェクター機能を増加させた。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞へのＰＤ１－４１ＢＢのこの正の効果をｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、本発明者らは、免疫不全（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ）マウスおよびＰＲＡＭＥ／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性メラノーマ細胞株ＭｅｌＡ３７５を使用するマウスモデルを開発した。固形腫瘍の免疫抑制環境を模倣するために、ＭｅｌＡ３７５細胞にＰＤ－Ｌ１を形質導入した。５×１０６個のＰＤ－Ｌ１トランスジェニックＭｅｌＡ３７５を皮下注射した１週間後に、マウスは触知可能な腫瘍を発症した。この時点で、マウスを、それぞれ６匹含む処置群に分配した。マウスに、（ＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ）を含むかもしくは（ＴＣＲ）ＰＤ１－４１ＢＢを含まない１０×１０６個のＴＣＲ陽性細胞（細胞総数が１６×１０６個）または等量の非形質導入Ｔ細胞（ＵＴ）を注射した。腫瘍体積を１週間に２～３回測定した。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えたマウスを屠殺した。非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍は急速に成長し、Ｔ細胞注射後２～４週間以内に最大腫瘍体積に達した（図１０）。トランスジェニックＴＣＲのみを発現するエフェクターＴ細胞は腫瘍成長にほとんど影響を与えなかった。ＰＤ１－４１ＢＢを同時発現するＴ細胞のみが腫瘍を拒絶することができ、処置の３．５週間後に腫瘍が消失した。これらのデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強力な抗腫瘍反応性を示すＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲとＰＤ１－４１ＢＢとを組み合わせることで、ｉｎ ｖｉｖｏモデルで侵襲的に増殖する腫瘍細胞を排除できる高効率のＴ細胞が得られることを示している。
ＰＤ１－４１ＢＢを同時発現するＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍反応性を示す。
ＰＤ１－４１ＢＢの同時発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の抗腫瘍エフェクター機能を増加させた。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞へのＰＤ１－４１ＢＢのこの正の効果をｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、本発明者らは、免疫不全（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ）マウスおよびＰＲＡＭＥ／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性メラノーマ細胞株ＭｅｌＡ３７５を使用するマウスモデルを開発した。固形腫瘍の免疫抑制環境を模倣するために、ＭｅｌＡ３７５細胞にＰＤ－Ｌ１を形質導入した。５×１０６個のＰＤ－Ｌ１トランスジェニックＭｅｌＡ３７５を皮下注射した１週間後に、マウスは触知可能な腫瘍を発症した。この時点で、マウスを、それぞれ６匹含む処置群に分配した。マウスに、（ＴＣＲ＿ＰＤ１－４１ＢＢ）を含むかもしくは（ＴＣＲ）ＰＤ１－４１ＢＢを含まない１０×１０６個のＴＣＲ陽性細胞（細胞総数が１６×１０６個）または等量の非形質導入Ｔ細胞（ＵＴ）を注射した。腫瘍体積を１週間に２～３回測定した。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えたマウスを屠殺した。非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍は急速に成長し、Ｔ細胞注射後２～４週間以内に最大腫瘍体積に達した（図１０）。トランスジェニックＴＣＲのみを発現するエフェクターＴ細胞は腫瘍成長にほとんど影響を与えなかった。ＰＤ１－４１ＢＢを同時発現するＴ細胞のみが腫瘍を拒絶することができ、処置の３．５週間後に腫瘍が消失した。これらのデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強力な抗腫瘍反応性を示すＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲとＰＤ１－４１ＢＢとを組み合わせることで、ｉｎ ｖｉｖｏモデルで侵襲的に増殖する腫瘍細胞を排除できる高効率のＴ細胞が得られることを示している。
【0180】
[実施例１１]
ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＰＲＡＭＥを標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＰＲＡＭＥを標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより高い多機能性を示す。
ＰＤ１－４１ＢＢを有するかまたは有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、ＩｓｏＬｉｇｈｔ（登録商標）技術（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）を使用して、それらの単一細胞多機能性（２種以上のサイトカインの放出）に関して分析した。いわゆる「多機能性」Ｔ細胞は、複数のタンパク質（特に、サイトカインおよびＧｚｍ－Ｂなどの他のエフェクタータンパク質）を分泌し、それによって、多種多様なエフェクター機能および非常に有効な免疫応答を可能にする。ＰＤ－Ｌ１を過剰発現する、ＰＲＡＭＥ陽性のＭｅｌＡ３７５腫瘍細胞株と共に２４時間共培養した後、ＣＤ８ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して腫瘍細胞から単一のＣＤ８＋ Ｔ細胞を分離し、ＩｓｏＣｏｄｅチップ（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）にロードした。３２種類のＴ細胞サイトカイン／タンパク質の分泌を、ＩｓｏＬｉｇｈｔのデバイスおよびＩｓｏＳｐｅａｋソフトウェア（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）を使用して分析した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、２種以上のタンパク質を分泌するＴ細胞を意味する多機能性Ｔ細胞のより高いパーセンテージを示した（図１１Ａ）。様々な分泌されたタンパク質／サイトカインの強度と多機能性Ｔ細胞の割合を乗算することによって、多機能性強度指数（ＰＳＩ）を計算した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、より高いＰＳＩを示した（図１１Ｂ）。放出された様々なタンパク質／サイトカインの分類により、優れたＰＳＩには、エフェクタータンパク質サイトカイン（Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β）および刺激性サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２）の貢献度が高く、次いで化学誘引性サイトカイン（ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１β）の貢献度が高いことが明らかになった。調節性サイトカイン（ＩＬ－１０、ＩＬ－２２）および炎症性サイトカイン（ＩＬ－６およびＭＣＰ－１）放出の程度はより低かった。多機能性ヒートマップを使用する単一細胞ポリタンパク質／サイトカイン放出の詳細な分析により、ＰＤ１－４１ＢＢを有するおよび有さないＴＣＲ－Ｔ細胞ではそれらのポリタンパク質／サイトカインのシグネチャーが異なることが示された（図１１Ｃ）。とりわけ、ＰＤ１－４ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、４～１０種のタンパク質／サイトカインを同時に分泌するより高い割合の単一細胞を含有し、ＰＤ１－４ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより優れた機能性を示した。ＰＤ１－４ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞によって放出された主なタンパク質／サイトカインは、エフェクタータンパク質および化学誘引性サイトカインのファミリーに属するＧｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、ＩＰ－１０およびＭＩＰ－１βであり、よって、高いＴＣＲ－Ｔ細胞の機能性および強力な抗腫瘍活性を示し、これは実際に、同じ主要細胞株（ＭｅｌＡ３７５＿ＰＤ－Ｌ１）を使用するｉｎ ｖｉｖｏ実験においても観察された（図１０）。
ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＰＲＡＭＥを標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＰＲＡＭＥを標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより高い多機能性を示す。
ＰＤ１－４１ＢＢを有するかまたは有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、ＩｓｏＬｉｇｈｔ（登録商標）技術（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）を使用して、それらの単一細胞多機能性（２種以上のサイトカインの放出）に関して分析した。いわゆる「多機能性」Ｔ細胞は、複数のタンパク質（特に、サイトカインおよびＧｚｍ－Ｂなどの他のエフェクタータンパク質）を分泌し、それによって、多種多様なエフェクター機能および非常に有効な免疫応答を可能にする。ＰＤ－Ｌ１を過剰発現する、ＰＲＡＭＥ陽性のＭｅｌＡ３７５腫瘍細胞株と共に２４時間共培養した後、ＣＤ８ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して腫瘍細胞から単一のＣＤ８＋ Ｔ細胞を分離し、ＩｓｏＣｏｄｅチップ（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）にロードした。３２種類のＴ細胞サイトカイン／タンパク質の分泌を、ＩｓｏＬｉｇｈｔのデバイスおよびＩｓｏＳｐｅａｋソフトウェア（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）を使用して分析した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、２種以上のタンパク質を分泌するＴ細胞を意味する多機能性Ｔ細胞のより高いパーセンテージを示した（図１１Ａ）。様々な分泌されたタンパク質／サイトカインの強度と多機能性Ｔ細胞の割合を乗算することによって、多機能性強度指数（ＰＳＩ）を計算した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、より高いＰＳＩを示した（図１１Ｂ）。放出された様々なタンパク質／サイトカインの分類により、優れたＰＳＩには、エフェクタータンパク質サイトカイン（Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β）および刺激性サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２）の貢献度が高く、次いで化学誘引性サイトカイン（ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１β）の貢献度が高いことが明らかになった。調節性サイトカイン（ＩＬ－１０、ＩＬ－２２）および炎症性サイトカイン（ＩＬ－６およびＭＣＰ－１）放出の程度はより低かった。多機能性ヒートマップを使用する単一細胞ポリタンパク質／サイトカイン放出の詳細な分析により、ＰＤ１－４１ＢＢを有するおよび有さないＴＣＲ－Ｔ細胞ではそれらのポリタンパク質／サイトカインのシグネチャーが異なることが示された（図１１Ｃ）。とりわけ、ＰＤ１－４ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、４～１０種のタンパク質／サイトカインを同時に分泌するより高い割合の単一細胞を含有し、ＰＤ１－４ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより優れた機能性を示した。ＰＤ１－４ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞によって放出された主なタンパク質／サイトカインは、エフェクタータンパク質および化学誘引性サイトカインのファミリーに属するＧｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、ＩＰ－１０およびＭＩＰ－１βであり、よって、高いＴＣＲ－Ｔ細胞の機能性および強力な抗腫瘍活性を示し、これは実際に、同じ主要細胞株（ＭｅｌＡ３７５＿ＰＤ－Ｌ１）を使用するｉｎ ｖｉｖｏ実験においても観察された（図１０）。
【0181】
[実施例１２]
ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより高い多機能性を示す。
ＰＤ１－４１ＢＢを有するかまたは有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、ＩｓｏＬｉｇｈｔ（登録商標）技術（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）を使用して、それらの単一細胞多機能性（２種以上のサイトカインの放出）に関して分析した。いわゆる「多機能性」Ｔ細胞は、複数のタンパク質（特に、サイトカインおよびＧｚｍ－Ｂなどの他のエフェクタータンパク質）を分泌し、それによって、多種多様なエフェクター機能および非常に有効な免疫応答を可能にする。ＰＤ－Ｌ１を過剰発現する、ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性のＭｅｌＡ３７５またはＭｅｌ６２４．３８腫瘍細胞株と共に２０時間共培養した後、ＣＤ８ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して腫瘍細胞から単一のＣＤ８＋ Ｔ細胞を分離し、ＩｓｏＣｏｄｅチップ（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）にロードした。３２種類のＴ細胞サイトカイン／タンパク質の分泌を、ＩｓｏＬｉｇｈｔのデバイスおよびＩｓｏＳｐｅａｋソフトウェア（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）を使用して分析した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、２種以上のタンパク質を分泌するＴ細胞を意味する多機能性Ｔ細胞のより高いパーセンテージを示した（図１２Ａ）。様々な分泌されたタンパク質／サイトカインの強度と多機能性Ｔ細胞の割合を乗算することによって、多機能性強度指数（ＰＳＩ）を計算した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、より高いＰＳＩを示した（図１２Ｂ）。
ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより高い多機能性を示す。
ＰＤ１－４１ＢＢを有するかまたは有さないＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、ＩｓｏＬｉｇｈｔ（登録商標）技術（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）を使用して、それらの単一細胞多機能性（２種以上のサイトカインの放出）に関して分析した。いわゆる「多機能性」Ｔ細胞は、複数のタンパク質（特に、サイトカインおよびＧｚｍ－Ｂなどの他のエフェクタータンパク質）を分泌し、それによって、多種多様なエフェクター機能および非常に有効な免疫応答を可能にする。ＰＤ－Ｌ１を過剰発現する、ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性のＭｅｌＡ３７５またはＭｅｌ６２４．３８腫瘍細胞株と共に２０時間共培養した後、ＣＤ８ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して腫瘍細胞から単一のＣＤ８＋ Ｔ細胞を分離し、ＩｓｏＣｏｄｅチップ（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）にロードした。３２種類のＴ細胞サイトカイン／タンパク質の分泌を、ＩｓｏＬｉｇｈｔのデバイスおよびＩｓｏＳｐｅａｋソフトウェア（ＩｓｏＰｌｅｘｉｓ）を使用して分析した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、２種以上のタンパク質を分泌するＴ細胞を意味する多機能性Ｔ細胞のより高いパーセンテージを示した（図１２Ａ）。様々な分泌されたタンパク質／サイトカインの強度と多機能性Ｔ細胞の割合を乗算することによって、多機能性強度指数（ＰＳＩ）を計算した。ＰＤ１－４１ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ１－４１ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較して、より高いＰＳＩを示した（図１２Ｂ）。
【0182】
放出された様々なタンパク質／サイトカインの分類により、優れたＰＳＩには、エフェクタータンパク質サイトカイン（Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ－１ａ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β）および刺激性サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－９）の貢献度が高く、次いで化学誘引性サイトカイン（ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ）の貢献度が高いことが明らかになった。調節性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－２２、ｓＣＤ１３７、ＴＧＦ－β１）および炎症性サイトカイン（ＣＰ－１、ＩＬ－１７ＦおよびＩＬ８）放出の程度はより低かった。多機能性ヒートマップを使用する単一細胞ポリタンパク質／サイトカイン放出の詳細な分析により、ＰＤ１－４１ＢＢを有するおよび有さないＴＣＲ－Ｔ細胞ではそれらのポリタンパク質／サイトカインのシグネチャーが異なることが示された（図１Ｃ）。とりわけ、ＰＤ１－４ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞は、２～６種のタンパク質／サイトカインを同時に分泌するより高い割合の単一細胞を含有し、ＰＤ１－４ＢＢを欠くＴＣＲ－Ｔ細胞と比較してより優れた機能性を示した。ＰＤ１－４ＢＢを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞によって放出された主なタンパク質／サイトカインは、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭＩＰ－１βであり、これらは、エフェクタータンパク質および刺激性サイトカインのファミリーに属し、よって、高いＴＣＲ－Ｔ細胞の機能性および強力な抗腫瘍活性を示した。
【0183】
本出願は、以下の項目について記載する：
項目１：
（Ａ）
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を含む細胞。
項目１：
（Ａ）
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を含む細胞。
【0184】
項目２：ＴＣＲが、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合することが可能である、項目１に記載の細胞。
【0185】
項目３：ＨＬＡ－Ａ２が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０９にコードされる分子である、項目２に記載の細胞。
【0186】
項目４：配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）もしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態への結合により、ＴＣＲを形質導入またはトランスフェクトした細胞によるＩＦＮ－γ分泌が誘導される、項目１～３のいずれか１つに記載の細胞。
【0187】
項目５：ＴＣＲが、配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
【0188】
項目６：ＴＣＲが、配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
【0189】
項目７：ＴＣＲが、
配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲα領域および配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲβ領域を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲα領域および配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲβ領域を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
【0190】
項目８：ＴＣＲが、
配列番号１０のアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲα領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲβ領域を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
配列番号１０のアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲα領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲβ領域を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
【0191】
項目９：ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメインが、配列番号２８の配列を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
【0192】
項目１０：４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメインが、配列番号３２の配列を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
【0193】
項目１１：膜貫通ドメインがＰＤ－１に由来する、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
【0194】
項目１２：ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する膜貫通ドメインが、配列番号３０の配列を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
【0195】
項目１３：キメラ補助刺激受容体が、配列番号２６の配列を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞。
【0196】
項目１４：－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲをコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む組成物。
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲをコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む組成物。
【0197】
項目１５：－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲをコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む核酸。
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲをコードする核酸；ならびに
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体をコードする核酸
を含む核酸。
【0198】
項目１６：ＴＣＲが、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合することが可能である、項目１４に記載の組成物または項目１５に記載の核酸。
【0199】
項目１７：ＨＬＡ－Ａ２が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０９にコードされる分子である、項目１６に記載の組成物または核酸。
【0200】
項目１８：配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）もしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態への結合により、ＴＣＲを形質導入またはトランスフェクトした細胞によるＩＦＮ－γ分泌が誘導される、項目１４および１６～１７に記載の組成物または項目１５～１７に記載の核酸。
【0201】
項目１９：ＴＣＲが、配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、項目１４および１６～１８に記載の組成物または項目１５～１８に記載の核酸。
【0202】
項目２０：ＴＣＲが、配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、項目１４および１５～１９に記載の組成物または項目１５～１９に記載の核酸。
【0203】
項目２１：ＴＣＲが、配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲα領域および配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲβ領域を含む、項目１４および１５～２０に記載の組成物または項目１５～２０に記載の核酸。
【0204】
項目２２：ＴＣＲが、配列番号１０のアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲα領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する定常ＴＣＲβ領域を含む、項目１４および１６～２１に記載の組成物または項目１５～２１に記載の核酸。
【0205】
項目２３：Ｐｄ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメインが、配列番号２８の配列を含む、項目１４および１６～２２に記載の組成物または項目１５～２２に記載の核酸。
【0206】
項目２４：４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメインが、配列番号３２の配列を含む、項目１４および１６～２３に記載の組成物または項目１５～２３に記載の核酸。
【0207】
項目２５：膜貫通ドメインがＰＤ－１に由来する、項目１４および１６～２４に記載の組成物または項目１５～２４に記載の核酸。
【0208】
項目２６：ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する膜貫通ドメインが、配列番号３０の配列を含む、項目１４および１６～２５に記載の組成物または項目１５～２５に記載の核酸。
【0209】
項目２７：キメラ補助刺激受容体が配列番号２６の配列を含む、項目１４および１６～２６に記載の組成物または項目１５～２６に記載の核酸。
【0210】
項目２８：項目１５～２７に記載の核酸を含むベクター。
【0211】
項目２９：項目１４および１６～２７に記載の組成物、項目１５～２７に記載の核酸または項目２８に記載のベクターを含む細胞。
【0212】
項目３０：末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、項目１～１３および項目２９に記載の細胞。
【0213】
項目３１：Ｔ細胞である、項目１～１３および項目２９～３０のいずれか１つに記載の細胞。
【0214】
項目３２：項目１～１３に記載の細胞、項目２９～３１に記載の細胞、項目１４および１６～２７に記載の組成物、項目１５～２７に記載の核酸および／または項目２８に記載のベクターを含む医薬組成物。
【0215】
項目３３：少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、項目２０に記載の医薬組成物。
【0216】
項目３４：医薬として使用するための、項目１～１３に記載の細胞、項目２９～３１に記載の細胞、項目１４および１６～２７に記載の組成物、項目１５～２７に記載の核酸および／または項目２８に記載のベクター。
【0217】
項目３５：がんの処置において使用するための、項目１～１３に記載の細胞、項目２９～３１に記載の細胞、項目１４および１６～２７に記載の組成物、項目１５～２７に記載の核酸および／または項目２８に記載のベクター。
【0218】
項目３６：がんが、好ましくは、メラノーマ、膀胱癌、結腸癌、および乳腺癌、肉腫、前立腺がん、子宮がん、ぶどう膜がん、ぶどう膜メラノーマ、頭頸部扁平上皮がん、滑膜がん、ユーイング肉腫、トリプルネガティブ乳がん、甲状腺がん、精巣がん、腎臓がん、膵臓がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌、頭頸部がん、胃がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胆管癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択され、好ましくは、がんが、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、乳がん、卵巣がんまたは結腸直腸がん、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される、がんの処置において使用するための、項目１～１３に記載の細胞、項目２９～３１に記載の細胞、項目１４および１６～２７に記載の組成物、項目１５～２７に記載の核酸および／または項目２８に記載のベクター。
【0219】
項目３７：
（Ａ）
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を発現する細胞を含む細胞集団であって、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞を含む細胞集団。
（Ａ）
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、ならびに
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含むＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびに
（Ｂ）
－ ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメイン
を含むキメラ補助刺激受容体
を発現する細胞を含む細胞集団であって、
少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞を含む細胞集団。
【0220】
項目３８：少なくとも３種のタンパク質を分泌する細胞を含む、項目３７に記載の細胞集団。
【0221】
項目３９：少なくとも４種のタンパク質を分泌する細胞を含む、項目３８に記載の細胞集団。
【0222】
項目４０：少なくとも５種のタンパク質を分泌する細胞を含む、項目３９に記載の細胞集団。
【0223】
項目４１：タンパク質が、エフェクタータンパク質、刺激性サイトカインおよび化学誘引性サイトカインからなる群から選択される、項目４０に記載の細胞集団。
【0224】
項目４２：エフェクタータンパク質が、Ｇｚｍ－Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－βからなる群から選択される、項目４１に記載の細胞集団。
【0225】
項目４３：刺激性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２からなる群から選択される、項目４１または４２に記載の細胞集団。
【0226】
項目４４：化学誘引性サイトカインが、ＩＰ－１０およびＭＩＰ－１βから選択される、項目４１から４３に記載の細胞集団。
【0227】
項目４５：少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞が各々、ＩＦＮ－γ、Ｇｚｍ－Ｂ、およびＩＰ－１０からなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１種を分泌する、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞集団。
【0228】
項目４６：少なくとも２種のタンパク質を分泌する細胞が各々、ＩＦＮ－γおよびＧｚｍ－Ｂからなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１種を分泌する、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞集団。
【0229】
項目４７：ＴＣＲが、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合することが可能である、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞集団。
【0230】
項目４８：ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する細胞外ドメインが、配列番号２８の配列を含み、
４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメインが、配列番号３２の配列を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞集団。
４－１ＢＢ由来のポリペプチドを含有する細胞内ドメインが、配列番号３２の配列を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞集団。
【0231】
項目４９：膜貫通ドメインがＰＤ－１に由来し、好ましくは、ＰＤ－１由来のポリペプチドを含有する膜貫通ドメインが配列番号３０の配列を含み、好ましくは、キメラ補助刺激受容体が配列番号２６の配列を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞集団。
【0232】
項目５０：がんの処置において使用するための、先行する項目のいずれか１つに記載の細胞集団。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【配列表】
【国際調査報告】