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特表2024-531431真核細胞で発現するタンパク質変異体のライブラリーの調製
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】真核細胞で発現するタンパク質変異体のライブラリーの調製
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240822BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20240822BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240822BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240822BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240822BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240822BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C40B40/06 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
C12N15/09 100
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024510636
(86)(22)【出願日】2022-08-24
(85)【翻訳文提出日】2024-03-29
(86)【国際出願番号】 EP2022073549
(87)【国際公開番号】W WO2023025834
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】21193102.7
(32)【優先日】2021-08-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518237439
【氏名又は名称】イオンタス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パルティバン コタイ ナチャル デヴィ
(72)【発明者】
【氏名】マカファーティ ジョン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA11
4B063QQ42
4B063QR80
4B063QX01
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA60
(57)【要約】
真核細胞のゲノムの遺伝子座を同定する方法であって、前記遺伝子座は、バインダー配列の挿入の候補である、方法が本明細書に記載される。バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法も本明細書に記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
真核細胞のゲノムの遺伝子座を同定する方法であって、前記遺伝子座は、バインダー配列の挿入の候補であり、前記方法は、ａ．ランディングパッド配列を提供するステップ；
ｂ．前記ランディングパッド配列を前記真核細胞に導入するステップ；
ｃ．トランスポゾンを介した組み込みにより、前記真核細胞の前記ゲノムに前記ランディングパッド配列をランダムに組み込むステップ；
ｄ．クローンであって、そのゲノムに組み込まれたランディングパッド配列を有するクローンを選択するステップ
を含む、方法。
【請求項2】
ｅ．単一コピーの組み込みについてスクリーニングするさらなるステップ；ｆ．前記遺伝子座を同定するさらなるステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ｇ．バインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含むドナーＤＮＡ配列を前記ランディングパッド配列に組み込む追加のステップ；ｈ．前記ドナーＤＮＡの組み込みについてスクリーニングする追加のステップ
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ランディングパッド配列は、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を含み、好ましくは、前記ヌクレアーゼ認識配列は、メガヌクレアーゼ認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識配列、ＴＡＬＥヌクレアーゼ認識配列又は核酸ガイド付きヌクレアーゼ認識配列、好ましくはメガヌクレアーゼ認識配列、好ましくはＩ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ドナーＤＮＡを前記細胞内に組み込むステップｇは、前記細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含み、前記ヌクレアーゼは、前記ランディングパッドに含まれる前記認識配列を切断する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ドナーＤＮＡの組み込みについてスクリーニングするステップｈは、前記ドナーＤＮＡによってコードされる前記１つ又は複数のバインダーのディスプレイについてスクリーニングすることを含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ドナーＤＮＡは、組み込み効率を高めるために相同性アームをさらに含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ランディングパッド配列及び／又は前記ドナーＤＮＡ配列は、選択可能なマーカーを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを構築するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法で同定された遺伝子座の使用。
【請求項10】
少なくとも１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個又は１０９個の異なるバインダーの多様なレパートリーを発現する真核細胞クローンのインビトロライブラリーであって、各細胞は、組換えＤＮＡを含み、バインダー又はバインダーのサブユニットをコードするドナーＤＮＡは、前記細胞ＤＮＡの少なくとも第１及び／又は第２の固定遺伝子座に組み込まれ、前記１つ又は複数の遺伝子座は、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって同定され、好ましくは、前記１つ又は複数の遺伝子座は、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子から選択される遺伝子内にあり、より好ましくは、前記１つ又は複数の遺伝子座は、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子又はＲＡＢ４０Ｂ遺伝子内、最も好ましくはＮＬＮ遺伝子内にある、真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
【請求項11】
前記１つ又は複数の遺伝子座は、前記遺伝子のイントロン内にあり、好ましくは、前記１つ若しくは複数の遺伝子座は、前記イントロンのオープンクロマチン領域内にあり、及び／又は前記１つ若しくは複数の遺伝子座は、前記イントロンのエンハンサー領域内にある、請求項１０に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
【請求項12】
前記１つ又は複数の遺伝子座は、前記ＮＬＮ遺伝子のＮＬＮ－２０７のイントロン１、２又は６内にある、請求項１０又は１１に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
【請求項13】
請求項１０～１２のいずれか一項に記載のライブラリーから同定されたバインダー。
【請求項14】
バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法であって、前記バインダーをコードするドナーＤＮＡ分子及び真核細胞を提供するステップ；
前記ドナーＤＮＡを前記細胞内に導入し、且つ前記細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、前記ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、前記認識配列は、前記ドナーＤＮＡが前記細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成するために、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子内、好ましくはＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子又はＲＡＢ４０Ｂ遺伝子内、より好ましくはＮＬＮ遺伝子内にあり、組み込みは、前記細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより前記細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ；及び
前記組換え細胞を培養してクローンを作製し、それにより前記バインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供するステップ
を含む方法。
【請求項15】
前記認識配列は、前記遺伝子のイントロン内にあり、好ましくは、前記認識配列は、前記イントロンのオープンクロマチン領域内にあり、及び／又は前記認識配列は、前記イントロンのエンハンサー領域内にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記認識配列は、前記ＮＬＮ遺伝子のＮＬＮ－２０７のイントロン１、２又は６内にある、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、真核細胞クローンのライブラリーの作製、特にバインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーに関する。さらに、本発明は、真核細胞のゲノムの遺伝子座を同定する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットは、バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法を記載している。この方法では、部位特異的ヌクレアーゼを使用して細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、バインダーをコードするドナーＤＮＡを組み込むことができる組み込み部位を作成する。
【0003】
しかしながら、国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットの方法は、バインダーの高度な多様性、及び／又はバインダーの均一な組み込み、及び／又はバインダーの均一な転写を特徴とするライブラリーの生成を可能にするために、真核細胞のゲノムの特定の遺伝子座における適切な認識配列の選択に依存する。国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットは、このような認識配列又は遺伝子座の広範なリストを提供していない。
【0004】
従って、真核細胞のゲノムにおける、バインダー配列の挿入の候補である遺伝子座を同定する方法及びライブラリーを作製する方法に使用され得る適切な認識配列を含む真核生物のゲノムの特定の遺伝子座が当技術分野で継続的に必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
一態様では、真核細胞のゲノムの遺伝子座を同定する方法が提供され、前記遺伝子座は、バインダー配列の挿入の候補であり、前記方法は、
ａ．ランディングパッド配列を提供するステップ；
ｂ．ランディングパッド配列を真核細胞に導入するステップ；
ｃ．トランスポゾンを介した組み込みにより、真核細胞のゲノムにランディングパッド配列をランダムに組み込むステップ；
ｄ．クローンであって、そのゲノムに組み込まれたランディングパッド配列を有するクローンを選択するステップ
を含む。
ａ．ランディングパッド配列を提供するステップ；
ｂ．ランディングパッド配列を真核細胞に導入するステップ；
ｃ．トランスポゾンを介した組み込みにより、真核細胞のゲノムにランディングパッド配列をランダムに組み込むステップ；
ｄ．クローンであって、そのゲノムに組み込まれたランディングパッド配列を有するクローンを選択するステップ
を含む。
【0006】
この態様による方法は、本出願に関連して、「本発明による遺伝子座を同定する方法」又は「遺伝子座を同定する方法」などと呼ばれ得る。
【0007】
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子座を同定する方法は、以下のさらなるステップを含む：
ｅ．単一コピーの組み込みについてスクリーニングするステップ；
ｆ．遺伝子座を同定するステップ。
ｅ．単一コピーの組み込みについてスクリーニングするステップ；
ｆ．遺伝子座を同定するステップ。
【0008】
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子座を同定する方法は、以下の追加のステップを含む：
ｇ．バインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含むドナーＤＮＡ配列をランディングパッド配列に組み込むステップ；
ｈ．ドナーＤＮＡの組み込みについてスクリーニングするステップ。
ｇ．バインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含むドナーＤＮＡ配列をランディングパッド配列に組み込むステップ；
ｈ．ドナーＤＮＡの組み込みについてスクリーニングするステップ。
【0009】
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子座を同定する方法は、ランディングパッド配列が部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を含むようなものである。好ましくは、ヌクレアーゼ認識配列は、メガヌクレアーゼ認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識配列、ＴＡＬＥヌクレアーゼ認識配列又は核酸ガイド付きヌクレアーゼ認識配列、より好ましくはメガヌクレアーゼ認識配列、最も好ましくはＩ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列である。
【0010】
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子座を同定する方法では、ドナーＤＮＡを細胞内に組み込むステップｇは、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含み、ヌクレアーゼは、ランディングパッドに含まれる認識配列を切断する。いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子座を同定する方法では、ドナーＤＮＡの組み込みについてスクリーニングするステップｈは、ドナーＤＮＡによってコードされる１つ又は複数のバインダーのディスプレイについてスクリーニングすることを含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡは、組み込み効率を高めるために相同性アームをさらに含む。いくつかの実施形態では、ランディングパッド配列及び／又はドナーＤＮＡ配列は、選択可能なマーカーを含む。
【0012】
一態様では、バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを構築するための、本発明による遺伝子座を同定する方法で同定された遺伝子座の使用が提供される。この態様による使用は、本出願に関連して、「本発明による遺伝子座の使用」などと呼ばれ得る。
【0013】
一態様では、バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法が提供され、この方法は、
－ バインダーをコードするドナーＤＮＡ分子及び真核細胞を提供するステップ；
－ ドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、認識配列は、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成するために、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子内にあり、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ；及び
－ 組換え細胞を培養してクローンを作製し、それによりバインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供するステップ
を含む。
－ バインダーをコードするドナーＤＮＡ分子及び真核細胞を提供するステップ；
－ ドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、認識配列は、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成するために、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子内にあり、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ；及び
－ 組換え細胞を培養してクローンを作製し、それによりバインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供するステップ
を含む。
【0014】
この態様による方法は、本出願に関連して、「本発明によるライブラリーを生成する方法」、又は「ライブラリーを生成する方法」、又は「ライブラリーを作製する方法」などと呼ばれ得る。「本発明による方法」は、本発明による遺伝子座を同定する方法及び本発明によるライブラリーを生成する方法の両方を指す。
【0015】
いくつかの実施形態では、本発明によるライブラリーを生成する方法では、認識配列は、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子又はＲＡＢ４０Ｂ遺伝子内にある。好ましくは、認識配列は、ＮＬＮ遺伝子内にある。
【0016】
いくつかの実施形態では、本発明によるライブラリーを生成する方法では、認識配列は、遺伝子のイントロン内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、イントロンのオープンクロマチン領域内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、イントロンのエンハンサー領域内にある。
【0017】
少なくとも第１及び第２のサブユニット（即ちＦａｂ又はＩｇＧフォーマット内に提示される抗体ＶＨ及びＶＬドメインなどの別個のポリペプチド鎖）を含む多量体バインダーでは、複数のサブユニットがドナーＤＮＡの同じ分子上にコードされ得る。しかしながら、異なるサブユニットを別々の遺伝子座に組み込むことが望ましい場合があり、その場合、サブユニットは、別個のドナーＤＮＡ分子上に提供され得る。これらは、ヌクレアーゼによる組み込みの同じサイクル内で組み込むか、又は一方若しくは両方の組み込みステップでヌクレアーゼによる組み込みを使用して順次組み込むことができる。
【0018】
多量体バインダーをコードする真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法は、
第１のサブユニットをコードするＤＮＡを含む真核細胞を提供し、且つ第２のバインダーサブユニットをコードするドナーＤＮＡ分子を提供するステップ、
ドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、認識配列は、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成するために、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子内にあり、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ
を含み得る。これらの組換え細胞は、多量体バインダーの第１及び第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含み、これらの組換え細胞を培養して両方のサブユニットを発現させることができる。多量体バインダーは、別々にコードされるサブユニットの発現及び構築によって得られる。
第１のサブユニットをコードするＤＮＡを含む真核細胞を提供し、且つ第２のバインダーサブユニットをコードするドナーＤＮＡ分子を提供するステップ、
ドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、認識配列は、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成するために、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子内にあり、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ
を含み得る。これらの組換え細胞は、多量体バインダーの第１及び第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含み、これらの組換え細胞を培養して両方のサブユニットを発現させることができる。多量体バインダーは、別々にコードされるサブユニットの発現及び構築によって得られる。
【0019】
上記の例では、ヌクレアーゼによる組み込みを使用して、第２のサブユニットをコードするＤＮＡを、第１のサブユニットをコードするＤＮＡを既に含む細胞に組み込む。第１のサブユニットは、本発明の技術又は任意の他の適切なＤＮＡ組み込み法を使用して事前に導入することができる。代替的なアプローチでは、ドナーＤＮＡを導入する第１のサイクルでヌクレアーゼによる組み込みを使用して、第１のサブユニットを組み込み、続いて同じアプローチ又は任意の他の適切な方法のいずれかによって第２のサブユニットを導入する。ヌクレアーゼによるアプローチが複数の組み込みサイクルで使用される場合、異なる部位特異的ヌクレアーゼを任意選択により使用して、異なる認識部位におけるヌクレアーゼによるドナーＤＮＡ組み込みを促進することができる。多量体バインダーをコードする真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法は、
第１のサブユニットをコードする第１のドナーＤＮＡ分子を提供し、且つ真核細胞を提供するステップ、
第１のドナーＤＮＡを細胞に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、認識配列は、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成するために、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子内にあり、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれた第１のドナーＤＮＡを含む組換え細胞の第１のセットを作成する、ステップ、
組換え細胞の第１のセットを培養して、第１のサブユニットをコードするＤＮＡを含むクローンの第１のセットを作製するステップ、
第２のサブユニットをコードする第２のドナーＤＮＡ分子をクローンの第１のセットの細胞に導入するステップであって、第２のドナーＤＮＡは、クローンの第１のセットの細胞ＤＮＡに組み込まれ、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれた第１及び第２のドナーＤＮＡを含む組換え細胞の第２のセットを作成する、ステップ、及び
組換え細胞の第２のセットを培養して、クローンの第２のセットを作製するステップであって、クローンは、多量体バインダーの第１及び第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含み、それにより多量体バインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供する、ステップ
を含み得る。
第１のサブユニットをコードする第１のドナーＤＮＡ分子を提供し、且つ真核細胞を提供するステップ、
第１のドナーＤＮＡを細胞に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、認識配列は、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成するために、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子内にあり、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれた第１のドナーＤＮＡを含む組換え細胞の第１のセットを作成する、ステップ、
組換え細胞の第１のセットを培養して、第１のサブユニットをコードするＤＮＡを含むクローンの第１のセットを作製するステップ、
第２のサブユニットをコードする第２のドナーＤＮＡ分子をクローンの第１のセットの細胞に導入するステップであって、第２のドナーＤＮＡは、クローンの第１のセットの細胞ＤＮＡに組み込まれ、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれた第１及び第２のドナーＤＮＡを含む組換え細胞の第２のセットを作成する、ステップ、及び
組換え細胞の第２のセットを培養して、クローンの第２のセットを作製するステップであって、クローンは、多量体バインダーの第１及び第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含み、それにより多量体バインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供する、ステップ
を含み得る。
【0020】
本明細書で使用される「本発明によるライブラリーを生成する方法」及び「本発明による方法」は、多量体バインダーをコードする真核細胞クローンのライブラリーを作製する上記の方法も指す。
【0021】
ドナーＤＮＡの細胞ＤＮＡへの部位特異的に組み込みにより組換え細胞を作成し、この組換え細胞を培養してクローンを作製することができる。従って、ドナーＤＮＡが組み込まれた個々の組換え細胞は、細胞のクローン集団（「クローン」）を生成するために複製され、各クローンは、１つの元の組換え細胞に由来する。従って、この方法は、ドナーＤＮＡが問題なく組み込まれた細胞の数に対応する数のクローンを生成する。クローンの集合体は、バインダーのレパートリーをコードするライブラリーを構成する（又はバインダーサブユニットが別々の回で組み込まれる中間段階でクローンがバインダーサブユニットのセットをコードし得る）。従って、本発明の方法は、バインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供することができる。
【0022】
従って、一態様では、バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーが提供され、このライブラリーは、本発明による遺伝子座の使用及び／又は本発明によるライブラリーを生成する方法によって得られる。この態様によるこのようなライブラリーは、本出願に関連して、「本発明のライブラリー」などと呼ばれ得る。
【0023】
本発明の方法は、細胞ＤＮＡの固定遺伝子座又は複数の固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含むクローンのライブラリーを生成することができる。「固定」とは、遺伝子座が細胞間で同じであることを意味する。従って、ライブラリーの生成に使用される細胞は、ドナーＤＮＡを組み込むことができる細胞ＤＮＡ内のユニバーサルランディング部位を表す固定遺伝子座にヌクレアーゼ認識配列を含み得る。部位特異的ヌクレアーゼの認識配列は、細胞ＤＮＡの１つ又は複数の位置に存在し得る。従って、一態様では、少なくとも１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個又は１０９個の異なるバインダーの多様なレパートリーを発現する真核細胞クローンのインビトロライブラリーが提供され、各細胞は、組換えＤＮＡを含み、バインダー又はバインダーのサブユニットをコードするドナーＤＮＡは、細胞ＤＮＡの固定遺伝子座に組み込まれ、遺伝子座は、本発明による方法によって同定される。本発明による真核細胞クローンのインビトロライブラリーも提供され、バインダー又はバインダーのサブユニットをコードするドナーＤＮＡは、細胞ＤＮＡの少なくとも第１及び／又は第２の固定遺伝子座に組み込まれ、前記１つ又は複数の固定遺伝子座は、本発明による方法によって同定される。本明細書で使用される「本発明のライブラリー」などは、真核細胞クローンのこのようなインビトロライブラリーも指す。
【0024】
本発明に従って作製されたライブラリーは、様々な方法で利用することができる。ライブラリーを培養してバインダーを発現させ、それによりバインダーの多様なレパートリーを作製することができる。ライブラリーは、所望の表現型の細胞についてスクリーニングされ得、表現型は、細胞によるバインダーの発現から生じる。従って、一態様では、所望の表現型の細胞についてスクリーニングする方法が提供され、表現型は、細胞によるバインダーの発現から生じ、この方法は、
本発明のライブラリーを作製する方法によってライブラリーを提供するか、又は本発明による遺伝子座の使用によってライブラリーを提供するか、又は本発明によるライブラリーを提供するステップ、
ライブラリー細胞を培養してバインダーを発現させるステップ、及び
所望の表現型が示されるか否かを検出するステップ
を含む。
本発明のライブラリーを作製する方法によってライブラリーを提供するか、又は本発明による遺伝子座の使用によってライブラリーを提供するか、又は本発明によるライブラリーを提供するステップ、
ライブラリー細胞を培養してバインダーを発現させるステップ、及び
所望の表現型が示されるか否かを検出するステップ
を含む。
【0025】
この態様による方法は、「本発明による所望の表現型の細胞についてスクリーニングする方法」などと呼ばれ得る。本明細書で使用される「本発明による方法」は、所望の表現型の細胞についてスクリーニングする上記の方法も指す。
【0026】
ライブラリー細胞を培養してバインダーを発現させ、続いて所望の表現型がライブラリーのクローンで示されるかどうかを検出する表現型スクリーニングが可能である。細胞の読み出しは、内因性若しくは外因性のレポーター遺伝子の発現、分化状態、増殖、生存、細胞サイズ、代謝又は他の細胞との相互作用の変化などの細胞挙動の変化に基づき得る。所望の表現型が検出されると、所望の表現型を示すクローンの細胞を回収することができる。次いで、任意選択により、バインダーをコードするＤＮＡを回収したクローンから単離し、細胞内で発現されたときに所望の表現型を生じさせるバインダーをコードするＤＮＡを提供する。
【0027】
真核細胞ライブラリーが使用されている主な目的は、目的の標的を認識するバインダーのスクリーニング方法にある。従って、一態様では、目的の標的に対するバインダーを同定するためのスクリーニング方法が提供され、前記方法は、
本発明のライブラリーを作製する方法によってライブラリーを提供するか、又は本発明による遺伝子座の使用によってライブラリーを提供するか、又は本発明によるライブラリーを提供するステップ、
ライブラリーの細胞を培養してバインダーを発現させるステップ、
バインダーを標的に曝露して、１つ又は複数の同種バインダーが存在する場合、それによる標的の認識を可能にするステップ、
標的が同種バインダーによって認識されるかどうかを検出するステップ
を含む。
本発明のライブラリーを作製する方法によってライブラリーを提供するか、又は本発明による遺伝子座の使用によってライブラリーを提供するか、又は本発明によるライブラリーを提供するステップ、
ライブラリーの細胞を培養してバインダーを発現させるステップ、
バインダーを標的に曝露して、１つ又は複数の同種バインダーが存在する場合、それによる標的の認識を可能にするステップ、
標的が同種バインダーによって認識されるかどうかを検出するステップ
を含む。
【0028】
この態様による方法は、「本発明による目的の標的に対するバインダーを同定するためのスクリーニング方法」又は「バインダーを同定するためのスクリーニング方法」などと呼ばれ得る。本明細書で使用される「本発明による方法」は、目的の標的に対するバインダーを同定するための上記のスクリーニング方法も指す。
【0029】
このような方法では、ライブラリーを培養してバインダーを発現させ、このバインダーを標的に曝露して、１つ又は複数の同種バインダーが存在する場合、それによる標的の認識を可能にし、標的が同種バインダーによって認識されるかどうかを検出する。このような方法では、バインダーを細胞表面にディスプレイすることができ、所望の特性を有するバインダーをディスプレイするライブラリーのクローンを単離することができる。従って、所望の機能的特性又は結合特性を有するバインダーをコードする遺伝子を含む細胞をライブラリー内で同定することができる。遺伝子を回収して、これをバインダーの作製に使用するか又はさらなるエンジニアリングに使用してバインダーの誘導体ライブラリーを作成し、特性が改善されたバインダーを得ることができる。
【0030】
一態様では、本発明は、本発明のライブラリーから同定されたバインダー、例えば本発明による目的の標的に対するバインダーを同定するためのスクリーニング方法を使用して同定されたバインダーも包含する。好ましいバインダーは、本明細書の他の箇所に記載されている。
【0031】
本発明の様々な特徴を以下にさらに説明する。本明細書全体を通して使用される見出しは、案内を補助するためのみのものであり、決定的なものとして解釈されるべきではなく、異なるセクションに記載される特徴は、本発明のすべての態様に関連し得ること及び適宜組み合わされ得ることに留意されたい。
【0032】
実験のパートに示されるように、本発明の新たな遺伝子座などの本発明の態様は、組み込み効率の向上及び安定した抗体発現などの利点と関連する。
【0033】
真核細胞
本発明の方法、使用及びライブラリーを含む本発明の態様で好ましい真核細胞及び真核細胞クローンは、以下に定義される。真核細胞に関するすべての選好は、真核細胞クローンにも適用され得ることを理解されたい。
本発明の方法、使用及びライブラリーを含む本発明の態様で好ましい真核細胞及び真核細胞クローンは、以下に定義される。真核細胞に関するすべての選好は、真核細胞クローンにも適用され得ることを理解されたい。
【0034】
真核細胞は、好ましくは、高等真核細胞であり、１２×１０６個の塩基対（ｂｐ）のゲノムサイズを有する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）よりも大きいゲノムを有する細胞として定義される。高等真核細胞は、例えば、２×１０７個の塩基対を超えるゲノムサイズを有し得る。これには、例えば、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞又は植物細胞が含まれる。真核細胞は、哺乳動物細胞に限定されない。好ましくは、真核細胞は、哺乳動物細胞、例えばマウス又はヒトの細胞である。より好ましくは、真核細胞は、ヒト細胞である。真核細胞は、初代細胞であり得るか又は細胞株であり得る。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、抗体及びタンパク質の発現に一般的に使用されるが、ＨＥＫ２９３細胞などの任意の代替の安定細胞株も本発明に使用することができる。これらの使用を可能にする外来ＤＮＡの初代細胞への効率的な導入の方法が利用可能である（例えば、最大９５％の効率及び生存率が達成されるエレクトロポレーションにより、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｘｃｙｔｅ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｐｒｉｍａｒｙ－ｃｅｌｌｓ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌｓ．ｐｈｐ）。
【0035】
遺伝子座を同定する方法又はライブラリーを生成する方法に含まれるヌクレアーゼによる組み込みの特定の利点は、ヌクレアーゼ切断の非存在下での相同組換えがあまり効果的ではない、より大きいゲノムを有する高等真核細胞へのバインダー遺伝子の組み込みに関する。酵母（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））は、哺乳動物細胞よりもゲノムが小さく、相同性アームによって誘導される相同組換えは（ヌクレアーゼによる切断がない場合）、高等真核細胞と比較して外来ＤＮＡを導入する効果的な方法である。ヌクレアーゼによる組み込みは、例えば、代謝経路のエンジニアリングなど、個々の酵母細胞への複数の遺伝子の効率的な組み込みの問題を解決するために酵母細胞で使用されているが（米国特許出願公開第２０１２／０２７７１２０号明細書）、この研究は、バインダーのライブラリーの導入を取り入れておらず、高等真核細胞のライブラリーの構築の問題にも対処していない。
【0036】
好ましい真核細胞は、Ｔリンパ球系細胞（例えば、初代Ｔ細胞又はＴ細胞株）又はＢリンパ球系細胞である。特に好ましくは、ＴＣＲ発現を欠く細胞株を含むＴＣＲライブラリーで使用するための初代Ｔ細胞又はＴ細胞由来細胞株である［２３、２４、２５］。好ましいＢリンパ球系細胞は、Ｂ細胞、プレＢ細胞又はプロＢ細胞及びこれらのいずれかに由来する細胞株である。
【0037】
初代Ｂ細胞又はＢ細胞株でのライブラリーの構築は、抗体ライブラリーの構築に特に有用であろう。これらの真核細胞は、遺伝子座を同定する方法及びライブラリーを作製する方法において好ましい。Ｂｒｅｏｕｓ－Ｎｙｓｔｒｏｍら［１５］は、マウスプレＢ細胞株（１６２４－５）でライブラリーを生成した。ニワトリＢ細胞由来細胞株ＤＴ４０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２１１１）は、バインダーのライブラリーの構築に特に有望である。ＤＴ４０は、細胞分裂の速度が比較的速い小さい細胞株である。バインダーのレパートリーは、内因性配列を標的とするＺＦＮ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、又はメガヌクレアーゼ認識部位を含み得る事前に組み込まれた異種部位を標的とすることにより、特定の遺伝子座を標的にすることができる。ＤＴ４０細胞は、抗体を発現するため、内因性ニワトリ抗体可変ドメインの破壊の有無にかかわらず、抗体遺伝子座内の抗体遺伝子を標的とすることが有利である。ＤＴ４０細胞は、ニワトリ抗体遺伝子座に生じる内因性の多様化を利用した自律多様化ライブラリー系（ＡＤＬｉｂ系）と呼ばれるニワトリＩｇＭの生成のためのインビトロ系の基礎としても使用されている。この内因性の多様化の結果として、新たな特異性を生成することが可能である。ここで説明するヌクレアーゼによるアプローチは、ＡＤＬｉｂと組み合わせて使用して、さらなる多様化の可能性を秘めた、異種の供給源（例えば、ヒト抗体可変領域のレパートリー又は合成由来の代替足場）からのバインダーの多様なライブラリーをニワトリＩｇＧ遺伝子座と組み合わせることができる。同様の利点を、Ｎａｌｍ６などのヒトＢ細胞株にも適用することができる［２６］。
【0038】
遺伝子座を同定する方法及びライブラリーを作製する方法において好ましい他の好ましいＢ系細胞株には、マウスプレＢ細胞株１６２４－５及びプロＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３などの株が含まれる。Ｂａ／Ｆ３は、ＩＬ－３に依存し［２７］、その使用は、本明細書の他の箇所で論じられている。最後に、「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ」［２８］又は「ＣＯＳＭＩＣ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ」［２９］に列挙されているものを含むいくつかのヒト細胞株が好ましい。
【0039】
本発明によるライブラリーを作製する方法及びライブラリーにおいて、真核細胞は、好ましくは、ドナーＤＮＡのクローン真核細胞の集団への導入、例えばドナーＤＮＡの特定の細胞株の細胞への導入によって作製される単一のタイプの細胞である。異なるライブラリークローン間の主な有意な違いは、ドナーＤＮＡの組み込みによるものである。
【0040】
真核細胞ウイルス系
真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法及び得られたライブラリーなどの本発明の態様の利点は、真核細胞の発現系に基づくウイルスディスプレイ系、例えばバキュロウイルスディスプレイ又はレトロウイルスディスプレイに適用することができる［１、２、３、４］。このアプローチでは、各細胞は、ウイルス粒子に取り込むことができるバインダーをコードする。レトロウイルス系の場合、コードするｍＲＮＡがパッケージ化され、コードされたバインダーが細胞表面に提示されることになる。バキュロウイルス系の場合、遺伝子とコードされたタンパク質との関連を維持するために、バインダーをコードする遺伝子のバキュロウイルス粒子内への封入が必要となるであろう。これは、バキュロウイルスゲノムのエピソームコピーを有する宿主細胞を使用して達成することができる。代わりに、組み込まれたコピーが、特定のヌクレアーゼ（部位特異的組み込みを促進するために使用されるものとは異なる）の作用の後に遊離し得る。多量体バインダー分子の場合、一部のパートナーは、細胞ＤＮＡ内にコードされ、１つ又は複数のパートナーの遺伝子がウイルス内にパッケージされ得る。
真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法及び得られたライブラリーなどの本発明の態様の利点は、真核細胞の発現系に基づくウイルスディスプレイ系、例えばバキュロウイルスディスプレイ又はレトロウイルスディスプレイに適用することができる［１、２、３、４］。このアプローチでは、各細胞は、ウイルス粒子に取り込むことができるバインダーをコードする。レトロウイルス系の場合、コードするｍＲＮＡがパッケージ化され、コードされたバインダーが細胞表面に提示されることになる。バキュロウイルス系の場合、遺伝子とコードされたタンパク質との関連を維持するために、バインダーをコードする遺伝子のバキュロウイルス粒子内への封入が必要となるであろう。これは、バキュロウイルスゲノムのエピソームコピーを有する宿主細胞を使用して達成することができる。代わりに、組み込まれたコピーが、特定のヌクレアーゼ（部位特異的組み込みを促進するために使用されるものとは異なる）の作用の後に遊離し得る。多量体バインダー分子の場合、一部のパートナーは、細胞ＤＮＡ内にコードされ、１つ又は複数のパートナーの遺伝子がウイルス内にパッケージされ得る。
【0041】
核酸の導入
本明細書に記載の方法は、核酸の真核細胞への導入を含む。遺伝子座を同定する方法では、ランディングパッド配列（即ち核酸）が導入され、好ましくはドナーＤＮＡ配列が導入される。ライブラリーを生成する方法では、ドナーＤＮＡ分子が導入される。特段の記載がない限り、核酸の導入は、ＤＮＡ分子の真核細胞への導入を指す。
本明細書に記載の方法は、核酸の真核細胞への導入を含む。遺伝子座を同定する方法では、ランディングパッド配列（即ち核酸）が導入され、好ましくはドナーＤＮＡ配列が導入される。ライブラリーを生成する方法では、ドナーＤＮＡ分子が導入される。特段の記載がない限り、核酸の導入は、ＤＮＡ分子の真核細胞への導入を指す。
【0042】
トランスフェクション、感染又はエレクトロポレーションを含め、核酸を真核細胞に導入するための多くの方法が記載されている。多数の細胞のトランスフェクションは、本明細書に記載されるようにポリエチレンイミン－媒介トランスフェクションを含む標準的な方法によって可能である。加えて、５分で１０１０個の細胞を高効率にエレクトロポレーションする方法も利用可能である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｘｃｙｔｅ．ｃｏｍ）。
【0043】
ライブラリーを生成する方法では、多量体結合対のメンバー（例えば、抗体遺伝子のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子）又は同じバインダー分子の異なる部分でさえも異なるプラスミドに導入されるコンビナトリアルライブラリーを作成することができる。別個のバインダー又はバインダーサブユニットをコードする別個のドナーＤＮＡ分子の導入は、同時に又は順次行うことができる。例えば、抗体軽鎖を、トランスフェクション又は感染によって導入し、細胞を増殖させ、必要に応じて選択することができる。次いで、他の成分をその後の感染又はトランスフェクションステップで導入することができる。一方又は両方のステップには、特定のゲノム遺伝子座へのヌクレアーゼによる組み込みが含まれ得る。
【0044】
核酸の組み込み
遺伝子座を同定する方法又はライブラリーを生成する方法は、真核細胞のゲノムへの核酸の組み込みを含む。これに関連して、ゲノム及び細胞ＤＮＡという用語は、互換的に使用することができる。特に明記されていない限り、組み込みは、真核細胞のゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを指す。核酸は、ゲノム（即ち細胞ＤＮＡ）に組み込まれ、核酸が組み込み部位に挿入された連続したＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡを形成する。本発明では、組み込みは、細胞に内在する天然のＤＮＡ修復機構によって媒介される。
遺伝子座を同定する方法又はライブラリーを生成する方法は、真核細胞のゲノムへの核酸の組み込みを含む。これに関連して、ゲノム及び細胞ＤＮＡという用語は、互換的に使用することができる。特に明記されていない限り、組み込みは、真核細胞のゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを指す。核酸は、ゲノム（即ち細胞ＤＮＡ）に組み込まれ、核酸が組み込み部位に挿入された連続したＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡを形成する。本発明では、組み込みは、細胞に内在する天然のＤＮＡ修復機構によって媒介される。
【0045】
核酸の組み込みは、ランダム又は特異的であり得る。核酸のランダムな組み込みは、好ましくは、トランスポゾンを介した組み込みによる真核細胞のゲノムへの核酸のランダムな組み込みを指す。本明細書では、組み込み部位は、特定の配列によって定義されない。遺伝子座を同定する方法は、ランディングパッド配列の真核細胞へのランダムな組み込みを含む。
【0046】
「トランスポゾン」、又は「トランスポゾンベクター」、又は「転位要素」という用語は、本明細書では、当業者によって慣習的且つ通常の理解で使用される。トランスポゾンは、非部位特異的な方法で細胞ＤＮＡに組み込むことができる遺伝要素であり、ランディングパッド配列を担持する又はそれに隣接するようにエンジニアリングされると、この配列が細胞ＤＮＡのランダムな位置に挿入される。当業者は、適切なトランスポゾンを認識しており、その多くが、ＰｉｇｇｙＢａｃ系などとして市販されており、その一例が本明細書の実験セクションで示される。ＰｉｇｇｙＢａｃ系は、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１５ ｎｏ．１，１３９－１４５ ｊａｎ．２００７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（２０１１）３５４：３０１－３０９）；Ｇａｌｖａｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ Ｏｃｔｏｂｅｒ；３２（８）：８３７－８４４にさらに説明されている。一般に、ＰｉｇｇｙＢａｃ系は、２つのベクターを利用する。ヘルパーＰＢａｓｅベクターと呼ばれる１つのベクターは、トランスポザーゼをコードする。トランスポゾンベクターと呼ばれる他方のベクターは、置き換えられる領域を囲む２つの末端反復（ＴＲ）を含む。宿主細胞に送達されるランディングパッドは、当技術分野で標準的な分子技術を使用してこの領域にクローニングすることができる。ＰＢａｓｅベクター及びＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターが標的細胞に同時トランスフェクトされると、ヘルパーから産生されたトランスポザーゼがトランスポゾン上の２つのＴＲを認識し、２つのＴＲを含む隣接領域を宿主細胞ＤＮＡに挿入する。組み込みは、典型的には、ＴＴＡＡ配列を含む宿主染色体部位で起こり、ＴＴＡＡ配列は、組み込まれた断片の２つの側面に複製される。トランスポゾンは、宿主細胞のゲノムの単一の遺伝子座（単一コピー組み込み）又は複数の遺伝子座（複数コピー組み込み）に組み込むことができる。
【0047】
核酸の特異的組み込みでは、組み込み部位は、特定の配列によって定義される。特異的組み込みに関連して、核酸は、ドナーＤＮＡ、ドナーＤＮＡ分子又はドナーＤＮＡ配列と呼ばれ得る。
【0048】
特異的組み込みは、核酸を細胞に導入することによって起こすことができ、部位特異的ヌクレアーゼが組み込み部位を作成することが可能になり、ドナーＤＮＡを組み込むことが可能になる。これに関連して、特異的組み込みは、ヌクレアーゼによる組み込みと呼ばれ得る。細胞は、ＤＮＡが組み込まれるのに十分な時間培養し続けることができる。これは、通常、（ｉ）ドナーＤＮＡが部位特異的ヌクレアーゼによって形成された組み込み部位に組み込まれた組換え細胞及び任意選択による（ｉｉ）ドナーＤＮＡが所望の組み込み部位以外の部位に組み込まれた細胞及び／又は任意選択による（ｉｉｉ）ドナーＤＮＡが組み込まれていない細胞を含む細胞の混合集団をもたらす。従って、所望の組換え細胞及び得られるクローンは、他の真核細胞をさらに含む混合集団で提供され得る。本明細書の他の箇所に記載の選択方法を使用して、所望の細胞及びクローンを選択するか、又は前記所望の細胞及びクローンの前記混合集団を濃縮することができる。
【0049】
上記で説明したように、組み込みは、細胞に内在する天然のＤＮＡ修復機構によって媒介される。真核細胞における内因性ＤＮＡ修復機構には、相同組換え、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及びマイクロホモロジー誘導末端結合が含まれる。このようなプロセスによる組み込みの効率は、細胞ＤＮＡに二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することで向上させることができ、Ｉ－Ｓｃｅ１などの希少な切断エンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を使用した４０，０００倍の効率向上が報告されている［４８、４９、５０］。
【0050】
Ｆｌｐ－Ｉｎ系などの系に関与する部位特異的組換えとは異なり［１６］、本発明における組み込みは、外因性リコンビナーゼ又はエンジニアリングされたリコンビナーゼ認識部位を必要としない。従って、遺伝子座を同定する方法及びライブラリーを生成する方法は、好ましくは、ＤＮＡ分子のリコンビナーゼによる組み込みのステップを含まない。さらに、遺伝子座を同定する方法及びライブラリーを生成する方法における真核細胞は、好ましくは、部位特異的リコンビナーゼの組換え部位を欠いている。リコンビナーゼ及びヌクレアーゼによるドナーＤＮＡの細胞ＤＮＡへの特異的組み込みの機構及び実用性は、Ｊａｓｉｎ １９９６によって議論されているように極めて明確である［５０］。
【0051】
対照的に、部位特異的ヌクレアーゼの使用を含む特異的組み込みは、ヌクレアーゼ作用を伴い、細胞ＤＮＡ内に切断又はニックを生じさせ、相同組換え又はＮＨＥＪなどの内因性細胞修復機構に曝されて修復される。リコンビナーゼベースのアプローチでは、認識部位の事前組み込みが絶対に必要であるため、このような方法では、前段階として「ホットスポット」組み込み部位を細胞ＤＮＡにエンジニアリングする必要がある。ヌクレアーゼによる組み込みでは、ヌクレアーゼをエンジニアリングするか又はＣＲＩＳＰＲ：Ｃａｓ９の場合にはガイドＲＮＡによって誘導して、内因性認識配列、即ち細胞ＤＮＡに自然に発生する核酸配列を認識することが可能である。最後に、実用的なレベルでは、ヌクレアーゼによるアプローチは、バインダーの大きいライブラリーを作成するのに必要なレベルでの導入遺伝子の特異的組み込みでより効率的である。
【0052】
遺伝子座を同定する方法又はライブラリーを生成する方法においてドナーＤＮＡが組み込まれるＤＮＡ修復機構は、ドナーＤＮＡの設計及び／又は部位特異的ヌクレアーゼ選択により、ある程度まで予め決定するか又はバイアスをかけることができる。
【0053】
相同組換えは、修復の鋳型として相同配列（例えば、別の対立遺伝子からの）を使用して二本鎖切断を修復するために細胞が使用する天然の機構である。相同組換えは、ゲノムへの挿入（導入遺伝子を含む）、欠失及び点突然変異を導入するために細胞工学で利用されてきた。相同組換えは、ドナーＤＮＡ上に相同性アームを提供することによって促進される。従って、ドナーＤＮＡは、好ましくは相同性アームを含む。高等真核細胞をエンジニアリングする当初のアプローチでは、典型的には、ドナープラスミド内の５～１０ｋｂの相同性アームを使用して、目的の部位への標的組み込みの効率を高めた。相同組換えは、ゲノムサイズがわずか１２．５×１０６ｂｐの酵母などの真核生物に特に適しており、より大きいゲノムを有する高等真核細胞、例えば、３０００×１０６ｂｐの哺乳動物細胞と比較してより効果的である。
【0054】
相同組換えは、細胞ＤＮＡのニックによって誘導することもでき［５２］、これは、細胞ＤＮＡへのヌクレアーゼによる組み込みのための経路としても役立ち得る。従って、遺伝子座を同定する方法又はライブラリーを生成する方法に含まれるドナーＤＮＡの組み込みは、好ましくは、細胞ＤＮＡへのニックの導入を含む。２つの異なる経路が、ニックＤＮＡでの相同組換えを促進することが示されている。１つの経路は、Ｒａｄ５１／Ｂｒｃａ２を利用する二本鎖切断での修復に本質的に類似しているのに対して、もう１つの経路は、Ｒａｄ５１／Ｂｒｃａ２によって阻害され、一本鎖ＤＮＡ又はニック二本鎖ドナーＤＮＡを優先的に使用する［５１］。
【0055】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、相同鋳型を必要とせずにＤＮＡの末端が直接再ライゲーションされるゲノムの二本鎖切断を修復する代替機構である。ゲノムＤＮＡのヌクレアーゼによる切断は、非相同性ベースの機構を介して導入遺伝子の組み込みを促進することもできる。ＮＨＥＪは、インフレームエクソンをイントロンに組み込む簡単な手段を提供するか又はプロモーター：遺伝子カセットのゲノムへの組み込みを可能にする。非相同法の使用は、相同性アームを欠くドナーベクターの使用を可能にし、それによりドナーＤＮＡの構築が単純になる。
【0056】
末端相同性の短い領域を使用してＤＮＡ末端を再結合することに注目し、マイクロホモロジーによる末端結合と呼ばれる、４ｂｐのマイクロホモロジーが二本鎖切断での修復を誘導するために利用され得るという仮説が立てられた［５０］。
【0057】
部位特異的ヌクレアーゼ
本発明は、部位特異的ヌクレアーゼ及びそれらの認識配列の使用を含む。一方では、遺伝子座を同定する方法は、ランディングパッド配列を提供することを含み、ランディングパッド配列は、好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を含む。より好ましくは、この方法は、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含み、ヌクレアーゼは、ランディングパッドに含まれる認識配列を切断する。他方では、ライブラリーを生成する方法は、細胞ＤＮＡの認識配列を切断する部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含む。好ましい部位特異的ヌクレアーゼを以下に定義する。部位特異的ヌクレアーゼに関するすべての選好は、対応する認識部位にも準用され得ることを理解されたい。
本発明は、部位特異的ヌクレアーゼ及びそれらの認識配列の使用を含む。一方では、遺伝子座を同定する方法は、ランディングパッド配列を提供することを含み、ランディングパッド配列は、好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を含む。より好ましくは、この方法は、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含み、ヌクレアーゼは、ランディングパッドに含まれる認識配列を切断する。他方では、ライブラリーを生成する方法は、細胞ＤＮＡの認識配列を切断する部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含む。好ましい部位特異的ヌクレアーゼを以下に定義する。部位特異的ヌクレアーゼに関するすべての選好は、対応する認識部位にも準用され得ることを理解されたい。
【0058】
部位特異的ヌクレアーゼは、認識配列への特異的結合に続いて細胞ＤＮＡを切断し、それによりドナーＤＮＡの組み込み部位を作成する。これに関連して、部位、標的部位、認識部位及び認識配列という用語は、互換的に使用することができる。ヌクレアーゼは、二本鎖切断又は一本鎖切断（ニック）を引き起こし得る。ヌクレアーゼ媒介ＤＮＡ切断は、内因性細胞ＤＮＡ修復機構によってバインダー遺伝子の部位特異的組み込みを促進する。
【0059】
遺伝子座を同定する方法又はライブラリーを生成する方法では、使用される真核細胞は、部位特異的ヌクレアーゼによって認識される内因性配列を含み得るか、又は認識配列が細胞ＤＮＡにエンジニアリングされ得る。さらに、部位特異的ヌクレアーゼは、細胞に対して外因性、即ち選択されたタイプの細胞では自然に発生し得ない。
【0060】
遺伝子座を同定する方法又はライブラリーを生成する方法では、部位特異的ヌクレアーゼは、ドナーＤＮＡの導入前、導入後又は導入と同時に導入することができる。ドナーＤＮＡが、バインダーに加えてヌクレアーゼをコードするか、又はドナーＤＮＡと同時に同時トランスフェクト若しくは別の方法で導入される別個の核酸にコードすることが便利であり得る。ライブラリーのクローンは、任意選択により、部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を保持し得るか、又はこのような核酸は、細胞に単に一過性にトランスフェクトされ得る。
【0061】
実施形態では、本発明による遺伝子座を同定する方法は、本明細書の他の箇所で定義されるように、ドナーＤＮＡを細胞内に組み込むステップを含み、前記ステップは、部位特異的ヌクレアーゼを細胞内に提供することを含み、ヌクレアーゼは、ランディングパッドに含まれる認識配列を切断する。
【0062】
任意の適切な部位特異的ヌクレアーゼを本発明と共に使用することができる。部位特異的ヌクレアーゼは、天然に存在する酵素又はエンジニアリングされた変異体であり得る。細胞ＤＮＡで稀にのみ生じる配列を認識するか又は認識するようにエンジニアリングできるヌクレアーゼなどの特に適したいくつかの既知のヌクレアーゼが存在する。
【0063】
好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼは、１つ又は２つの異なる認識配列のみを認識する。これは、細胞ごとに１つ又は２つのドナーＤＮＡ分子のみが組み込まれるようにするはずであるために有利である。
【0064】
部位特異的ヌクレアーゼによって認識される配列の希少性は、認識配列が比較的長い場合により高い。好ましくは、認識配列は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、認識配列は、１０から４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１若しくは２０ヌクレオチド又は１２から４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１若しくは２０ヌクレオチドの長さを有する。
【0065】
好ましい部位特異的ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などの核酸誘導（例えば、ＲＮＡ誘導）ヌクレアーゼである。一本鎖切断を生じさせるエンジニアリングされた形態が知られているが、これらのそれぞれは二本鎖切断を生じさせる。実施形態では、ランディングパッド配列は、対応するヌクレアーゼ認識配列を含む。
【0066】
メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られる）は、すべての生物界に存在し、且つ比較的長い配列（１２～４０ｂｐ）を認識するヌクレアーゼである。長い認識配列を考慮すると、真核細胞のゲノムに存在しないか又は比較的希にのみ存在する。メガヌクレアーゼは、配列／構造に基づいて５つのファミリー（ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７６）、ＧＩＹ－ＹＩＧ（配列番号７７）、ＨＮＨ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓ ｂｏｘ及びＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫファミリー）に分類される。最もよく研究されているファミリーは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のよく特徴付けられたＩ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼを含むＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーである。Ｉ－ＳｃｅＩは、１８ｂｐの認識配列（５’ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ、配列番号７０）を認識して切断し、４ｂｐの３’オーバーハングが残る。別の一般的に使用される例は、クラミドモナス・ラインハルティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の単細胞緑藻類の葉緑体に由来し、２２ｂｐの配列を認識するＩ－ＣｒｅＩである［３０］。認識配列が変更されたいくつかのエンジニアリングされた変異体が形成されている［３１］。メガヌクレアーゼは、ゲノム工学における部位特異的ヌクレアーゼの使用の最初の例を表す［４９、５０］。リコンビナーゼベースのアプローチと同様に、Ｉ－ＳｃｅＩ及びその他のメガヌクレアーゼの使用には、標的とする適切な認識配列のゲノム内への事前の挿入又は内因性認識配列を認識するためのメガヌクレアーゼのエンジニアリングが必要である［３０］。このアプローチにより、ＨＥＫ２９３細胞の目標の効率（組み込まれた欠陥ＧＦＰ遺伝子の相同性による「修復」によって判断される）が、Ｉ－ＳｃｅＩの使用により細胞の１０～２０％で達成された［３２］。
【0067】
メガヌクレアーゼの好ましいクラスは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼである。これらには、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－Ｃｒｅ Ｉ、ＣｓｍＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴＩｉＩ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩｌｌ、ＨＯ、Ｐｉ－ＣｉｖＩ、ＰＩ－ＣｔｒＩ、ＰＩ－ＡａｅＩ、ＰＩ－ＢｓｕＩ、ＰＩ－ＤｈａＩ、ＰＩ－ＤｒａＩ、ＰＩ－ＭａｖＩ、ＰＩ－ＭｃｈＩ、ＰＩ－Ｍｆｕ、ＰＩ－ＭｆｌＩ、ＰＩ－ＭｇａＩ、ＰＩ－ＭｇｏＩ、ＰＩ－ＭｉｎＩ、ＰＩ－ＭｋａＩ、ＰＩ－ＭｌｅＩ、ＰＩ－ＭｒｎａＩ、ＰＩ－ＭｓｈＩ、ＰＩ－ＭｓｍＩ、ＰＩ－ＭｔｈＩ、ＰＩ－Ｍｔｕ、ＰＩ－ＭｘｅＩ、ＰＩ－ＮｐｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＲｍａＩ、ＰＩ－ＳｐｂＩ、ＰＩ－ＳｓｐＩ、ＰＩ－ＦａｃＩ、ＰＩ－ＭｊａＩ、ＰＩ－ＰｈｏＩ、Ｐｉ－ＴａｇＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－Ｔｋｏ Ｉ、Ｉ－Ｍｓｏｌ及びＰＩ－ＴｓｐＩ；好ましくはＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、ｌ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＭｔｕＩ及びＩ－Ｃｅｕｌが含まれる。実施形態では、ランディングパッド配列は、対応するヌクレアーゼ認識配列を含む。
【0068】
近年、配列特異的なＤＮＡ結合ドメインを非特異的なヌクレアーゼに融合させて特注のＤＮＡ結合ドメインを介して誘導された、設計された配列特異的なヌクレアーゼを形成することにより、新規な配列特異的なヌクレアーゼの設計を可能にするいくつかの方法が開発されている。結合特異性は、ジンクフィンガードメインなどのエンジニアリングされた結合ドメインによって誘導することができる。これらは、分子の認識に関与し、ＤＮＡ配列を認識するために自然界で使用される、亜鉛イオンによって安定化された小さいモジュラードメインである。ジンクフィンガードメインのアレイは、配列特異的結合のためにエンジニアリングされ、ＩＩ型制限酵素Ｆｏｋ１の非特異的ＤＮＡ切断ドメインに連結させてジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成する。このようなＺＦＮは、本明細書では、好ましい部位特異的ヌクレアーゼである。ＺＦＮを使用して、ゲノム内の特定の部位に二本鎖切断を形成することができる。Ｆｏｋ１は、偏性二量体であり、切断を生じさせるために２つのＺＦＮを近接して結合する必要がある。エンジニアリングされたヌクレアーゼの特異性は、互いにヘテロ二量体のみを形成するようにエンジニアリングされた２つの異なるＦｏｋ１変異体を形成することによって強化され、それらの毒性が低下した［３３］。このような偏性ヘテロ二量体ＺＦＮは、薬物選択を必要とせずに標的細胞の５～１８％で相同性による組み込みを達成することが示されている［２１、３４、３５］。５％超の周波数で最大８ｋｂのインサートの組み込みが、選択なしで実証されている。
【0069】
規定の特異性のＤＮＡ結合ドメインをエンジニアリングする能力は、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）分子のキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌での発見によってさらに単純化された。これらのＴＡＬＥ分子は、３３～３５個のアミノ酸の単量体のアレイからなり、各単量体は、標的配列内の単一の塩基を認識する［３７］。このモジュールの１：１の関係により、目的のどのＤＮＡ標的にも結合するようにエンジニアリングされたＴＡＬＥ分子を設計することが比較的容易になった。これらの設計されたＴＡＬＥをＦｏｋ１に結合させることにより、新規の配列特異的ＴＡＬＥヌクレアーゼを形成することが可能になった。ＴＡＬＥＮとしても知られるＴＡＬＥヌクレアーゼは、本出願において好ましい部位特異的ヌクレアーゼであり、多数の部位（即ち認識配列）に対して設計され、効率的な遺伝子改変活性の高い成功率を示す［３８］。ＴＡＬＥヌクレアーゼ技術の他のバリエーション及び強化版が開発されており、これらを、遺伝子座を同定する方法又はライブラリーを生成する方法で部位特異的ヌクレアーゼとして使用することができる。これらには、ＴＡＬＥヌクレアーゼ結合ドメインがメガヌクレアーゼに融合された「メガＴＡＬＥＮ」［３９］及び単一のＴＡＬＥヌクレアーゼ認識ドメインが切断を行うために使用される「コンパクトＴＡＬＥＮ」［４０］が含まれる。
【0070】
近年、ゲノム中の特定の配列に二本鎖切断又は一本鎖切断を誘導する別の系が記述されている。「クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）」系と呼ばれるこの系は、細菌の防御機構に基づいている［４１］。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子座を同定する方法又はライブラリーを生成する方法において好ましい部位特異的ヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、短いパリンドロームリピートに隣接する短い相補的な一本鎖ＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）を介してＤＮＡの切断を標的とする。一般的に使用される「タイプＩＩ」系では、ＲＮＡを標的とするプロセシングは、パリンドロームリピートと相補的な配列を有するトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の存在に依存する。ｔｒａｃｒＲＮＡのパリンドロームリピート配列へのハイブリダイゼーションはプロセシングを引き起こす。プロセシングされたＲＮＡは、Ｃａｓ９ドメインを活性化し、その活性をＤＮＡ内の相補配列に誘導する。この系は、単一のＲＮＡ転写産物からＣａｓ９切断を誘導するように単純化され、ゲノム内の多くの異なる配列に誘導されている［４２、４３］。ゲノム切断に対するこのアプローチは、短いＲＮＡ配列を介した誘導により、切断特異性のエンジニアリングを比較的単純にするという利点を有する。従って、ゲノムＤＮＡの部位特異的切断を達成するためのいくつかの異なる方法が存在する。上記のように、これにより、内因性細胞ＤＮＡ修復機構によるドナープラスミドの組み込み率が向上する。
【0071】
ライブラリーを生成する方法では、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系などの核酸ガイド系の部位特異的ヌクレアーゼとしての使用により、ゲノム内の内因性遺伝子座の標的化が可能になる。
【0072】
代わりに、遺伝子座を同定する方法及びライブラリーを生成する方法では、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ及びＴＡＬＥヌクレアーゼを含む部位特異的ヌクレアーゼの異種認識部位（即ち認識配列）を予め導入することができる。ヌクレアーゼによる標的化を使用して、ベクターＤＮＡを用いて又は二本鎖オリゴヌクレオチドを用いてさえ、相同組換え又はＮＨＥＪによる認識配列の挿入を促進することができる［４５］。別法として、非特異的標的化法を使用して、トランスポゾンによる組み込みの使用によって部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を導入することができる［４６］。低力価で適用されるレンチウイルスなどのウイルスベースの系を使用して、認識配列を導入することもできる。
【0073】
部位特異的ヌクレアーゼは、１つのプラスミドに導入される単一の遺伝子によってコードされ得るのに対して、ドナーＤＮＡは、第２のプラスミド上に存在する。当然のことながら、これらの要素の２つ以上を同じプラスミドに組み込む組み合わせを使用することができ、それにより遺伝子座を同定する方法又はライブラリーを生成する方法で導入されるプラスミドの数を減らすことによって標的化の効率を高めることができる。加えて、ヌクレアーゼを事前に組み込むことも可能であり得、トランスポザーゼで実証されているように、ヌクレアーゼ活性の時間的制御を可能にするために誘導することもできる［４６］。最後に、ヌクレアーゼは、組換えタンパク質又はタンパク質：ＲＮＡ複合体として導入することができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ：Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの場合）。
【0074】
認識配列
前述したように、ライブラリーを生成する方法は、細胞ＤＮＡ中の認識配列を切断する部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含む。
前述したように、ライブラリーを生成する方法は、細胞ＤＮＡ中の認識配列を切断する部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン（ＮＬＮ）遺伝子内にある。使用される真核細胞は、部位特異的ヌクレアーゼによって認識される内因性配列を含み得るか、又は認識配列は、本明細書で前述したように細胞ＤＮＡ内にエンジニアリングされ得る。ノイロリシン遺伝子（ヒト配列：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＢＹＴ８、ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子ｉｄ ＥＮＳＧ０００００１２３２１３）は、Ｐｒｏ１０－Ｔｙｒ１１結合でニューロテンシンを切断して、ニューロテンシン（１～１０）及びニューロテンシン（１１～１３）の形成をもたらすメタロペプチダーゼＭ３タンパク質ファミリーのメンバーをコードする。ノイロリシン遺伝子の例示的な配列は、配列番号１で表される。いくつかの実施形態では、認識配列は、配列番号１を含む、それから本質的になるか若しくはそれからなるヌクレオチド配列又は配列番号１と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列で表される核酸分子内にある。
【0076】
いくつかの実施形態では、認識配列は、ＴＲＡＦ２及びＮＣＫ相互作用キナーゼ（ＴＮＩＫ）遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＫＥ５、ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子ｉｄ ＥＮＳＧ０００００１５４３１０）内にある。ＴＮＩＫ遺伝子の例示的な配列は、配列番号２で表される。いくつかの実施形態では、認識配列は、タンパク質モノ－ＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ１１（ＰＡＲＰ１１）遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＲ２１、ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子ｉｄ ＥＮＳＧ０００００１１１２２４）にある。ＰＡＲＰ１１遺伝子の例示的な配列は、配列番号３で表される。いくつかの実施形態では、認識配列は、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子（メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１２８２９、ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子ｉｄ ＥＮＳＧ０００００１４１５４２）内にある。ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子の例示的な配列は、配列番号４で表される。いくつかの実施形態では、認識配列は、ａｂｌインタラクター２（ＡＢＩ２）遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＹＢ９、ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子ｉｄ ＥＮＳＧ０００００１３８４４３）内にある。ＡＢＩ２遺伝子の例示的な配列は、配列番号５で表される。いくつかの実施形態では、認識配列は、リングフィンガータンパク質１９Ｂ（ＲＮＦ１９Ｂ）遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６ＺＭＺ０、ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子ｉｄ ＥＮＳＧ０００００１１６５１４）内にある。ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子の例示的な配列は、配列番号６で表される。いくつかの実施形態では、認識配列は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ阻害剤α（ＰＫＩＡ）遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ６１９２５、ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子ｉｄ ＥＮＳＧ０００００１７１０３３）内にある。ＰＫＩＡ遺伝子の例示的な配列は、配列番号７で表される。いくつかの実施形態では、認識配列は、ホルミミドイルトランスフェラーゼシクロデアミナーゼ（ＦＴＣＤ）遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ９５９５４、ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子ｉｄ ＥＮＳＧ０００００１６０２８２）内にある。ＦＴＣＤ遺伝子の例示的な配列は、配列番号８で表される。
【0077】
いくつかの実施形態では、認識配列は、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子又はＲＡＢ４０Ｂ遺伝子内にある。
【0078】
いくつかの実施形態では、認識配列は、配列番号１～８を含む、それから本質的になるか若しくはそれからなるヌクレオチド配列又は配列番号１～８と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列で表される核酸分子内にある。
【0079】
いくつかの実施形態では、認識配列は、ＮＬＮ、ＴＮＩＫ、ＰＡＲＰ１１、ＲＡＢ４０Ｂ、ＡＢＩ２、ＲＮＦ１９Ｂ、ＰＫＩＡ又はＦＴＣＤ遺伝子、好ましくはＮＬＮ、ＴＮＩＫ又はＲＡＢ４０Ｂ遺伝子から選択される遺伝子のイントロン内にある。イントロンは、本明細書では、当業者によって慣習的に且つ通常理解されるものとして使用される。
【0080】
ＮＬＮのイントロン内の認識配列は、好ましくは、ＮＬＮ－２０７のイントロン１（イントロン１～２）のイントロン２（イントロン２～３）又はイントロン６（イントロン６～７）内にある。ＴＮＩＫのイントロン内の認識配列は、好ましくは、ＴＮＩＫ－０４（Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００４３６６３６．７）のイントロン２（イントロン２～３）内にある。ＰＡＲＰ１１のイントロン内の認識配列は、好ましくは、ＰＡＲＰ１１－２０５（Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００４５０７３７．２）のイントロン１（イントロン１～２）内にある。ＲＡＢ４０Ｂのイントロン内の認識配列は、好ましくは、ＲＡＢ４０Ｂ－２０６（Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００５７１９９５．６）のイントロン１（イントロン１～２）内にある。ＡＢＩ２のイントロン内の認識配列は、好ましくは、ＡＢＩ２－２０３（Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００２６１０１８．１２）のイントロン１（イントロン１～２）内にある。ＲＮＦ１９Ｂのイントロン内の認識配列は、好ましくは、ＲＮＦ１９Ｂ－２０１（Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００２３５１５０．５）のイントロン１（イントロン１～２）内にある。ＰＫＩＡのイントロン内の認識配列は、好ましくは、ＰＫＩＡ－２０２（Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００３９６４１８．７）のイントロン１（イントロン１～２）内にある。ＦＴＣＤのイントロン内の認識配列は、好ましくは、ＦＴＣＤＮＬ１－２０１（Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００４１６６６８．５）のイントロン３（イントロン３～４）内にある。
【0081】
好ましい実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のイントロン内にある。ヒトノイロリシン（ＮＬＮ）遺伝子の標準的な転写産物は、１３個のエクソンを含むＮＬＮ－２０１（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物ＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８０９８５．１０）である。代替転写産物は、７個のエクソンを含むＮＬＮ－２０７（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物ＩＤ：ＥＮＳＴ０００００５０９９３５．２）である。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン１（ＮＬＮ－２０１のイントロン１～２；例示的な配列：配列番号９）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン２（ＮＬＮ－２０１のイントロン２～３；例示的な配列：配列番号１０）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン３（ＮＬＮ－２０１のイントロン３～４；例示的な配列：配列番号１１）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン４（ＮＬＮ－２０１のイントロン４～５；例示的な配列：配列番号１２）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン５（ＮＬＮ－２０１のイントロン５～６；例示的な配列：配列番号１３）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン６（ＮＬＮ－２０１のイントロン６～７；例示的な配列：配列番号１４）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン７（ＮＬＮ－２０１のイントロン７～８；例示的な配列：配列番号１５）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン８又はＮＬＮ－２０７のイントロン１（ＮＬＮ－２０１のイントロン８～９又はＮＬＮ－２０７のイントロン１～２；例示的な配列：配列番号１６）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン９又はＮＬＮ－２０７のイントロン２（ＮＬＮ－２０１のイントロン９～１０又はＮＬＮ－２０７のイントロン２～３；例示的な配列：配列番号１７）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン１０又はＮＬＮ－２０７のイントロン３（ＮＬＮ－２０１のイントロン１０～１１又はＮＬＮ－２０７のイントロン３－４；例示的な配列：配列番号１８）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ノイロリシン遺伝子のＮＬＮ－２０１のイントロン１１又はＮＬＮ－２０７のイントロン４（ＮＬＮ－２０１のイントロン１１～１２又はＮＬＮ－２０７のイントロン４～５；例示的な配列：配列番号１９）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ＮＬＮ－２０１ノイロリシン遺伝子のイントロン１２（ＮＬＮ－２０１のイントロン１２～１３；例示的な配列：配列番号２０）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ＮＬＮ－２０７ノイロリシン遺伝子のイントロン５（ＮＬＮ－２０７のイントロン５～６；例示的な配列：配列番号２１）内にある。いくつかの実施形態では、認識配列は、ＮＬＮ－２０７ノイロリシン遺伝子のイントロン６（ＮＬＮ－２０７のイントロン６～７；例示的な配列：配列番号２２）内にある。
【0082】
好ましいイントロンは、ＮＬＮ遺伝子のＮＬＮ－２０７のイントロン１、２及び６である。いくつかの実施形態では、認識配列は、配列番号１６、１７、２２を含む、本質的にそれらからなるか若しくはそれらからなるヌクレオチド配列又は配列番号は１６、１７、２２と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列で表される核酸分子内にある。
【0083】
好ましくは、認識配列は、配列番号１５又は配列番号２３と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する塩基配列を含むか、それから本質的になるか又はそれらからなる。
【0084】
いくつかの実施形態では、特に、認識配列が、上記のようにＮＬＮ、ＴＮＩＫ、ＰＡＲＰ１１、ＲＡＢ４０Ｂ、ＡＢＩ２、ＲＮＦ１９Ｂ、ＰＫＩＡ又はＦＴＣＤ遺伝子から選択される遺伝子のイントロン内にある場合、認識配列は、イントロンのオープンクロマチン領域内にある。
【0085】
いくつかの実施形態では、特に、認識配列が、上記のようにＮＬＮ、ＴＮＩＫ、ＰＡＲＰ１１、ＲＡＢ４０Ｂ、ＡＢＩ２、ＲＮＦ１９Ｂ、ＰＫＩＡ又はＦＴＣＤ遺伝子から選択される遺伝子のイントロン内にある場合、認識配列は、イントロンのエンハンサー領域内にある。
【0086】
本明細書で使用される「オープンクロマチン」、又は「ユークロマチン」、又は「ルーズクロマチン」は、転写が許容可能である構造を指すのに対して、「ヘテロクロマチン」又は「タイト」若しくは「クローズド」クロマチンは、よりコンパクトであり、且つＤＮＡ鋳型へのアクセスを得る必要がある因子に対してより反応しない。
【0087】
認識配列の分布
本発明による方法における部位特異的ヌクレアーゼの認識配列は、ゲノムＤＮＡ又は細胞内で安定に受け継がれるエピソームＤＮＡ内に存在し得る。従って、ドナーＤＮＡは、細胞ＤＮＡのゲノム遺伝子座又はエピソーム遺伝子座に組み込まれ得る。好ましくは、ゲノム遺伝子座は、遺伝子座を同定する方法によって同定される。
本発明による方法における部位特異的ヌクレアーゼの認識配列は、ゲノムＤＮＡ又は細胞内で安定に受け継がれるエピソームＤＮＡ内に存在し得る。従って、ドナーＤＮＡは、細胞ＤＮＡのゲノム遺伝子座又はエピソーム遺伝子座に組み込まれ得る。好ましくは、ゲノム遺伝子座は、遺伝子座を同定する方法によって同定される。
【0088】
その最も単純な形態では、バインダーをコードする単一の遺伝子（バインダー遺伝子）は、真核細胞ゲノム内の単一の部位を標的とする。特定の結合活性又は細胞表現型を実証する細胞の同定は、所望の特性をコードする遺伝子の直接の単離を可能にする（例えば、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって）。これは、細胞ＤＮＡで一度発生する、部位特異的ヌクレアーゼの固有の認識配列を使用することによって促進される。従って、ライブラリーの形成に使用される細胞は、単一の固定遺伝子座、即ちすべての細胞における１つの同一遺伝子座にヌクレアーゼ認識配列を含み得る。このような細胞から作製されたライブラリーは、固定遺伝子座に組み込まれた、即ちライブラリーのすべてのクローンの細胞ＤＮＡ内の同じ遺伝子座に発生するドナーＤＮＡを含む。
【0089】
任意選択により、認識配列は、細胞ＤＮＡに複数回発生し得るため、細胞は、ドナーＤＮＡの２つ以上の潜在的な組み込み部位を有する。これは、二倍体細胞又は倍数体細胞の典型的な状態であり、認識配列は、一対の染色体の対応する位置、即ち複製遺伝子座に存在する。このような細胞から作製されたライブラリーは、複製固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含み得る。例えば、二倍体細胞から作製されたライブラリーは、二重固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを有し得、三倍体細胞から作製されたライブラリーは、三重固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを有し得る。多くの適切な哺乳動物細胞は二倍体であり、本発明による哺乳動物細胞ライブラリーのクローンは、二重固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを有し得る。
【0090】
部位特異的ヌクレアーゼによって認識される配列は、細胞ＤＮＡの２つ以上の独立した遺伝子座に発生し得る。従って、ドナーＤＮＡは、複数の独立した遺伝子座に組み込むことができる。二倍体細胞又は倍数体細胞のライブラリーは、複数の独立した固定遺伝子座及び／又は複製固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含み得る。
【0091】
複数の遺伝子座（複製遺伝子座又は独立した遺伝子座）に認識配列を含む細胞では、各遺伝子座は、ドナーＤＮＡの分子の潜在的な組み込み部位を表す。ドナーＤＮＡを細胞に導入すると、細胞内に存在するヌクレアーゼ認識配列の全数で組み込みが起こり得るか、又はドナーＤＮＡがこれらの潜在的な部位のすべてではないが一部に組み込まれ得る。例えば、第１及び第２の固定遺伝子座（例えば、二重固定遺伝子座）に認識配列を含む二倍体細胞からライブラリーを作製する場合、得られるライブラリーは、ドナーＤＮＡが第１の固定遺伝子座に組み込まれたクローン、ドナーＤＮＡが第２の固定遺伝子座に組み込まれたクローン及びドナーＤＮＡが第１及び第２の固定遺伝子座の両方に組み込まれたクローンを含み得る。
【0092】
従って、ライブラリーを作製する方法には、細胞内の複数の固定遺伝子座の部位特異的ヌクレアーゼ切断及び複数の固定遺伝子座でのドナーＤＮＡの組み込みが含まれ得る。上記のように、同じ認識配列の複数のコピーが存在する場合（例えば、二倍体細胞又は倍数体細胞の内因性遺伝子座を標的とするときに生じる）では、特に効率的な標的化機構が使用される場合、２つのバインダー遺伝子が組み込まれ、１つの遺伝子のみが標的に特異的であり得る。これは、バインダー遺伝子が単離されると、続くスクリーニングで解決することができる。
【0093】
場合により、細胞ごとに２つ以上のバインダーを導入することが望ましいであろう。例えば、二重特異性バインダーは、２つの異なる抗体が一緒になって生成することができ、これらは、個々のバインダーには存在しない特性を有し得る［４７］。これは、二重固定遺伝子座の両方の対立遺伝子に異なる抗体遺伝子を導入するか、又は本明細書に記載の方法を使用して異なる抗体集団を独立した固定遺伝子座に標的化することによって達成することができる。さらに、バインダー自体を複数鎖（例えば、Ｆａｂ又はＩｇＧフォーマット内に提示される抗体ＶＨ及びＶＬドメイン）から構成することができる。この場合、異なるサブユニットを異なる遺伝子座に組み込むことが望ましいであろう。これらは、ヌクレアーゼによる組み込みの同じサイクル内で組み込むことができ、一方又は両方の組み込みステップでヌクレアーゼによる組み込みを使用して順次組み込むことができる。
【0094】
ランディングパッド配列
遺伝子座を同定する方法のステップ（ａ）では、ランディングパッド配列が提供される。本明細書で使用される「ランディングパッド配列」は、特定のゲノム遺伝子座におけるドナーＤＮＡ分子の組み込み又は「ランディング」を誘導するヌクレオチド配列を指すと解釈することができる。ランディングパッド配列は、一般に、部位特異的リコンビナーゼ又は部位特異的ヌクレアーゼによって認識されるヌクレオチド配列（「認識配列」）を含み、目的の１つ又は複数の導入遺伝子、例えば本明細書で後述するバインダー又は選択可能なマーカーをコードする導入遺伝子を含むドナーＤＮＡ分子の部位特異的リコンビナーゼによる組み込み又はヌクレアーゼによる組み込みを可能にする。実施形態では、ランディングパッド配列は、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を含む。好ましい認識配列は、本明細書の他の箇所で定義される。
遺伝子座を同定する方法のステップ（ａ）では、ランディングパッド配列が提供される。本明細書で使用される「ランディングパッド配列」は、特定のゲノム遺伝子座におけるドナーＤＮＡ分子の組み込み又は「ランディング」を誘導するヌクレオチド配列を指すと解釈することができる。ランディングパッド配列は、一般に、部位特異的リコンビナーゼ又は部位特異的ヌクレアーゼによって認識されるヌクレオチド配列（「認識配列」）を含み、目的の１つ又は複数の導入遺伝子、例えば本明細書で後述するバインダー又は選択可能なマーカーをコードする導入遺伝子を含むドナーＤＮＡ分子の部位特異的リコンビナーゼによる組み込み又はヌクレアーゼによる組み込みを可能にする。実施形態では、ランディングパッド配列は、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を含む。好ましい認識配列は、本明細書の他の箇所で定義される。
【0095】
任意選択により、ランディングパッド配列は、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子のような選択可能なマーカーなどの、ランディングパッド配列がそれらのゲノムに組み込まれたクローンのスクリーニング及び／又は選択を容易にする追加のヌクレオチド配列を含み得る。ランディングパッド配列は、任意選択により、プロモーター又は他の調節領域などの、ドナーＤＮＡ配列がランディングパッド配列に組み込まれたクローンのスクリーニング及び／又は選択を容易にするヌクレオチド配列をさらに含み得る。非限定的な例として、ランディングパッド配列の部位特異的ヌクレアーゼ認識部位に隣接するプロモーターは、部位特異的ヌクレアーゼによる細胞ＤＮＡ切断後の導入遺伝子のゲノム組み込みに続いて、プロモーターを有していない目的の導入遺伝子に機能的に連結することができる。次いで、得られた導入遺伝子の発現を、スクリーニング及び／又は選択の目的で使用することができる。
【0096】
ランディングパッド配列が組み込まれたクローンの選択
遺伝子座を同定する方法のステップ（ｄ）は、クローンであって、そのゲノムに組み込まれたランディングパッド配列を有するクローンを選択するステップを含む。ランディングパッド配列が、抗生物質（ブラストサイジン又はピューロマイシンなど）に対する耐性を付与する遺伝子のような選択可能なマーカーを含む場合、抗生物質の存在下で細胞を培養することによってクローンを選択することができる。代わりに、クローンは、サザンブロッティング又はＰＣＲなどの当技術分野における標準的な分子ツールボックス法を使用してスクリーニング及び／又は選択することができる。クローンの選択は、クローンのスクリーニングを含み得る。例えば、Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １４：２２７－２３８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている逆ＰＣＲ（ｉＰＣＲ）を、転位要素の挿入部位のマッピングに使用することができる。代わりに、Ｐｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｌｕｏ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（４）：ｅ１０１６（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているスプリンケレットＰＣＲ（ｓｐＰＣＲ：スプリンケレット）を使用し得る。スプリンケレットＰＣＲは、オーバーハング粘着性末端をもたらすゲノムＤＮＡの消化を含む。制限酵素は、ランディングパッド配列内での切断には必要ない。粘着性末端には、リン酸化されておらず、安定したヘアピンループ及び互換性のある粘着性末端を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（スプリンケレット）が連結されている。次いで、２回のネストＰＣＲを行って、トランスポゾン挿入部位とアニールスプリンケレットとの間のゲノム配列を増幅する。これに続いて、例えば別のネスト化プライマーを用いたサンガー配列決定又は当業者に公知の任意の他の核酸配列決定方法を使用して、ＰＣＲ産物の配列決定が行われる。例としては、サンガー配列決定、単一分子リアルタイム配列決定、イオントレント配列決定、パイロ配列決定、イルミナ配列決定、コンビナトリアルプローブアンカー合成、ライゲーションによる配列決定（ＳＯＬｉＤ配列決定）、Ｎａｎｏｐｏｒｅ配列決定及びＧｅｎａｐＳｙｓ配列決定などが挙げられる。配列決定のサンプル調製、装置及びプロトコルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅａｄ，Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ ａｎｄ Ｓａｌｏｍｏｎ（Ｅｄｓ），Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡ（２０１８）のような標準ハンドブックで論じられ、その多くは、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＣＡ，ＵＳＡ）及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ，ＵＳＡ）などから市販されている。
遺伝子座を同定する方法のステップ（ｄ）は、クローンであって、そのゲノムに組み込まれたランディングパッド配列を有するクローンを選択するステップを含む。ランディングパッド配列が、抗生物質（ブラストサイジン又はピューロマイシンなど）に対する耐性を付与する遺伝子のような選択可能なマーカーを含む場合、抗生物質の存在下で細胞を培養することによってクローンを選択することができる。代わりに、クローンは、サザンブロッティング又はＰＣＲなどの当技術分野における標準的な分子ツールボックス法を使用してスクリーニング及び／又は選択することができる。クローンの選択は、クローンのスクリーニングを含み得る。例えば、Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １４：２２７－２３８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている逆ＰＣＲ（ｉＰＣＲ）を、転位要素の挿入部位のマッピングに使用することができる。代わりに、Ｐｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｌｕｏ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（４）：ｅ１０１６（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているスプリンケレットＰＣＲ（ｓｐＰＣＲ：スプリンケレット）を使用し得る。スプリンケレットＰＣＲは、オーバーハング粘着性末端をもたらすゲノムＤＮＡの消化を含む。制限酵素は、ランディングパッド配列内での切断には必要ない。粘着性末端には、リン酸化されておらず、安定したヘアピンループ及び互換性のある粘着性末端を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（スプリンケレット）が連結されている。次いで、２回のネストＰＣＲを行って、トランスポゾン挿入部位とアニールスプリンケレットとの間のゲノム配列を増幅する。これに続いて、例えば別のネスト化プライマーを用いたサンガー配列決定又は当業者に公知の任意の他の核酸配列決定方法を使用して、ＰＣＲ産物の配列決定が行われる。例としては、サンガー配列決定、単一分子リアルタイム配列決定、イオントレント配列決定、パイロ配列決定、イルミナ配列決定、コンビナトリアルプローブアンカー合成、ライゲーションによる配列決定（ＳＯＬｉＤ配列決定）、Ｎａｎｏｐｏｒｅ配列決定及びＧｅｎａｐＳｙｓ配列決定などが挙げられる。配列決定のサンプル調製、装置及びプロトコルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅａｄ，Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ ａｎｄ Ｓａｌｏｍｏｎ（Ｅｄｓ），Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡ（２０１８）のような標準ハンドブックで論じられ、その多くは、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＣＡ，ＵＳＡ）及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ，ＵＳＡ）などから市販されている。
【0097】
上記のスクリーニング及び／又は選択方法を使用して、トランスポゾン要素の単一のコピーのみを有するクローン及びこれによりそれらのゲノムに組み込まれたランディングパッド配列を選択することができる。
【0098】
代わりに、単一コピー組み込みについてのスクリーニングを、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）を使用して実施し、続いて当技術分野で利用可能な標準的なバイオインフォマティクスツールを使用してゲノム構築を行うことができる。代わりに、単一コピー組み込みについてのスクリーニングは、ランディングパッド配列へのその組み込みの後に目的の導入遺伝子の発現の定量化によって行うことができる。発現は、当業者に公知の標準アッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ）によってｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルで評価することができる。発現は、市販のデバイスを使用する蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などの分光法を使用して評価することもできる。非限定的な例として、細胞膜結合バインダーをコードする導入遺伝子は、ランディングパッドの細胞ＤＮＡへの組み込みの後、ランディングパッドに組み込むことができる。次いで、バインダーに対する蛍光標識抗体をＦＡＣＳと共に使用して発現レベルを定量化し、バインダーの単一コピー組み込みでクローンを選択することができる。ＦＡＣＳベースの単一コピー組み込みスクリーニング及び選択の例は、本明細書の実験セクションにさらに示される。
【0099】
これらのクローンは、本明細書の他の箇所に記載されるように、バインダーの均一な組み込み及び／又は均一な転写によって特徴付けられるライブラリーの構築に使用できるため特に有用である。
【0100】
実施形態では、遺伝子座を同定する方法は、（ｅ）（ランディングパッド配列の）単一コピー組み込みについてスクリーニングするステップ、及び（ｆ）遺伝子座（ランディングパッド配列が組み込まれた）遺伝子座を同定するステップをさらに含む。ステップ（ｆ）は、上記の配列決定方法のいずれかによって行うことができる。
【0101】
遺伝子座及び使用
真核細胞のゲノムの遺伝子座を同定する方法に関連して、「遺伝子座」は、バインダー配列の挿入の候補であるゲノム遺伝子座を指す。従って、このような方法によって同定される遺伝子座を使用して、遺伝子座でバインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含むドナーＤＮＡ配列を組み込むことによって本発明によるライブラリーを構築することができる。好ましくは、このような使用では、ドナーＤＮＡは、この遺伝子座でランディングパッド配列に組み込まれる。
真核細胞のゲノムの遺伝子座を同定する方法に関連して、「遺伝子座」は、バインダー配列の挿入の候補であるゲノム遺伝子座を指す。従って、このような方法によって同定される遺伝子座を使用して、遺伝子座でバインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含むドナーＤＮＡ配列を組み込むことによって本発明によるライブラリーを構築することができる。好ましくは、このような使用では、ドナーＤＮＡは、この遺伝子座でランディングパッド配列に組み込まれる。
【0102】
好ましい実施形態では、本発明による遺伝子座の使用は、
－ 本発明による遺伝子座を同定する方法によって遺伝子座を同定するステップ；
－ バインダーをコードするドナーＤＮＡ分子及び真核細胞を提供するステップ；
－ ドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、認識配列は、前記遺伝子座において、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成し、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ；及び
－ 組換え細胞を培養してクローンを作製し、それによりバインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供するステップ
を含む。
－ 本発明による遺伝子座を同定する方法によって遺伝子座を同定するステップ；
－ バインダーをコードするドナーＤＮＡ分子及び真核細胞を提供するステップ；
－ ドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、認識配列は、前記遺伝子座において、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成し、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ；及び
－ 組換え細胞を培養してクローンを作製し、それによりバインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供するステップ
を含む。
【0103】
本発明によるライブラリーを作製する方法に関連するすべての好ましい実施形態は、この好ましい実施形態による方法に準用される。
【0104】
ドナーＤＮＡ
ライブラリーを生成する方法及び好ましくは遺伝子座を同定する方法も、ドナーＤＮＡを組み込むことを含む。好ましいドナーＤＮＡは、このセクションに記載される。
ライブラリーを生成する方法及び好ましくは遺伝子座を同定する方法も、ドナーＤＮＡを組み込むことを含む。好ましいドナーＤＮＡは、このセクションに記載される。
【0105】
ドナーＤＮＡは、通常、環状ＤＮＡであり、プラスミド又はベクターとして提供することができる。もう１つの可能性としては、線状ＤＮＡである。ドナーＤＮＡ分子は、細胞ＤＮＡに組み込まれる１つ又は複数のドナーＤＮＡ配列に加えて、細胞ＤＮＡに組み込まれない領域を含み得る。ＤＮＡは、典型的には二本鎖であるが、場合により一本鎖ＤＮＡを使用することもできる。ドナーＤＮＡは、バインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含み、例えばプロモーター：遺伝子カセットを含み得る。
【0106】
最も単純なフォーマットでは、二本鎖環状プラスミドＤＮＡを使用して相同組換えを促進することができる。これには、ゲノムＤＮＡの切断部位に隣接するＤＮＡ配列と相同な導入遺伝子に隣接するＤＮＡ領域が必要である。線状化二本鎖プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物又は合成遺伝子を使用して、相同組換え及びＮＨＥＪ修復経路の両方を促進するできる。二本鎖ＤＮＡの代替として、一本鎖ＤＮＡを使用して相同組換えを促進することが可能である［５２］。一本鎖ＤＮＡを生成するための一般的なアプローチは、糸状バクテリオファージからプラスミドへの一本鎖複製起点を含めることである。
【0107】
効率的な相同組換えを促進するためにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの一本鎖ＤＮＡウイルスを使用され、効率が数桁向上することが示されている［５３、５４］。ＡＡＶ系などの系は、遺伝子座を同定する方法及びライブラリーを生成する方法では、ヌクレアーゼによる切断と共に使用することができる。両方の系の利点を、遺伝子座を同定する方法及びライブラリーを生成する方法に適用することができる。ＡＡＶベクターのパッケージング限界は４．７ｋｂであるが、標的ゲノムＤＮＡのヌクレアーゼ消化の使用により、これを低減し、より大きい導入遺伝子構築物を組み込むことが可能になる。
【0108】
ドナーＤＮＡの分子は、単一のバインダー又は複数のバインダーをコードすることができる。任意選択により、バインダーの複数のサブユニットは、ドナーＤＮＡの分子ごとにコードすることができる。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡは、多量体バインダーのサブユニットをコードする。
【0109】
実施形態では、本発明による遺伝子座を同定する方法は、（ｇ）ランディングパッド配列にバインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含むドナーＤＮＡ配列を組み込むステップ、及び（ｈ）ドナーＤＮＡの組み込みについてスクリーニングするステップをさらに含む。追加の実施形態では、ステップ（ｇ）は、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップを含み、ヌクレアーゼは、ランディングパッドに含まれる認識配列を切断する。より好ましい実施形態では、ステップ（ｈ）は、ドナーＤＮＡによってコードされる１つ又は複数のバインダーのディスプレイについてスクリーニングすることを含む。
【0110】
ドナーＤＮＡのプロモーター及びドナーＤＮＡが組み込まれたクローンの選択
遺伝子座を同定する方法及びライブラリーを生成する方法では、ドナーＤＮＡは、バインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含む。ドナーＤＮＡをコードすることによるバインダーの転写は、通常、バインダーをコードする配列をプロモーターの制御下及び任意選択により転写のための１つ又は複数のエンハンサー要素の制御下に置くことによって達成される。プロモーター（及び任意選択により他の遺伝子制御要素）は、ドナーＤＮＡ分子自体に含まれ得る。代わりに、バインダーをコードする配列は、ドナーＤＮＡ上のプロモーターを欠き得、代わりに部位特異的ヌクレアーゼによって生成される組み込み部位へのその挿入の結果として、細胞ＤＮＡ上のプロモーター、例えば内因性プロモーター又は事前に組み込まれた外因性プロモーターと機能的に連結した状態に置くこともできる。
遺伝子座を同定する方法及びライブラリーを生成する方法では、ドナーＤＮＡは、バインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含む。ドナーＤＮＡをコードすることによるバインダーの転写は、通常、バインダーをコードする配列をプロモーターの制御下及び任意選択により転写のための１つ又は複数のエンハンサー要素の制御下に置くことによって達成される。プロモーター（及び任意選択により他の遺伝子制御要素）は、ドナーＤＮＡ分子自体に含まれ得る。代わりに、バインダーをコードする配列は、ドナーＤＮＡ上のプロモーターを欠き得、代わりに部位特異的ヌクレアーゼによって生成される組み込み部位へのその挿入の結果として、細胞ＤＮＡ上のプロモーター、例えば内因性プロモーター又は事前に組み込まれた外因性プロモーターと機能的に連結した状態に置くこともできる。
【0111】
ドナーＤＮＡは、ドナーＤＮＡを含む又は発現する細胞の選択を可能にする遺伝要素などの、１つ又は複数のさらなるコード配列をさらに含み得る。このような要素は、選択可能なマーカーと呼ばれ得る。上述したバインダーをコードする配列と同様に、このような要素は、ドナーＤＮＡ上のプロモーターと会合され得るか、又は固定遺伝子座でのドナーＤＮＡの組み込みの結果としてプロモーターの制御下に置かれ得る。後者の配置は、これらの細胞が選択のための遺伝要素を発現するはずであるため、所望の部位にドナーＤＮＡが組み込まれた細胞を特異的に選択する便利な手段を提供する。これは、例えば、ブラストサイジン又はピューロマイシンなどの負の選択剤に対する耐性を付与する遺伝子であり得る。１つ又は複数の選択ステップを適用して、ドナーＤＮＡが欠損している細胞又はドナーＤＮＡが正しい位置に組み込まれていない細胞などの不要な細胞を除去することができる。
【0112】
膜固定バインダーの発現自体を、選択可能なマーカーの形態として使用できる。例えば、ＩｇＧ又はｓｃＦｖ－Ｆｃ融合としてフォーマットされた抗体遺伝子のライブラリーが導入される場合、抗体を発現する細胞を、本明細書に記載の方法を使用して表面発現Ｆｃを認識する二次試薬を使用して選択することができる。外因性プロモーターの制御下での、導入遺伝子をコードするドナーＤＮＡを用いた最初のトランスフェクションで、バインダーの一過性発現（及び細胞表面発現）が起こり、（例えば、１～２個の抗体遺伝子／細胞の標的組み込みを達成するために）一過性発現が弱まるのを待つ必要がある。
【0113】
代替として、膜係留要素（例えば、ＰＤＧＦ受容体膜貫通ドメインに融合した本例のＦｃドメイン）をコードする構築物を、バインダー配列が導入される前に予め組み込むことができる。この膜係留要素が、プロモーターを欠いてるか、又は先行するエクソンと共にフレーム外のエクソン内にコードされている場合、表面発現が損なわれる。次いで、新しいドナー分子の標的組み込みが、（例えば、欠陥のある係留要素の上流にあるイントロンにプロモーター又は「インフレーム」エクソンを標的とすることによって）この欠陥を修正することができる。フレームの「修正エクソン」もバインダーをコードする場合、バインダーと膜係留要素との間に融合が生じ、両方の表面発現が起こる。従って、正しく標的化された組み込みにより、膜係留要素のインフレーム単独の発現又は新しいバインダーとの融合の一部としての発現が起こる。さらに、新しいバインダーのライブラリーが膜係留要素を欠き、これらが正しく組み込まれていない場合、それらは選択されない。従って、細胞表面でのバインダー自体の発現を使用して、正しく標的化されて組み込まれた細胞集団を選択することができる。
【0114】
クローンの数及びライブラリーの多様性
遺伝子座を同定する方法によって同定された遺伝子座は、バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーの構築に使用することができる。同様に、ライブラリーを生成する方法は、バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを生成するためのものである。本出願に関連して、ライブラリーは、特段の記載がない限り、これらの方法の１つによって得ることができるバインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを指す。好ましいライブラリー及びその特性は、このセクションで定義される。
遺伝子座を同定する方法によって同定された遺伝子座は、バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーの構築に使用することができる。同様に、ライブラリーを生成する方法は、バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを生成するためのものである。本出願に関連して、ライブラリーは、特段の記載がない限り、これらの方法の１つによって得ることができるバインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを指す。好ましいライブラリー及びその特性は、このセクションで定義される。
【0115】
１０７～１０１０の酵母ディスプレイライブラリーは、以前に構築されており、集団の免疫化又は事前の選択なしでバインダーが得られることが実証されている［９、５５、５６、５７］。以前に公表された哺乳動物ディスプレイライブラリーの多くは、高等真核生物由来の細胞を使用する場合のライブラリーのサイズ及び変動性の制限を考慮して、免疫ドナーに由来する抗体遺伝子又は高濃度抗原特異的Ｂリンパ球さえも使用していた。本発明の方法における遺伝子標的化の効率の結果、酵母などのより単純な真核生物について記載されたものと一致する、哺乳動物細胞などの高等真核細胞において大きいナイーブライブラリーを構築することができる。
【0116】
ドナーＤＮＡを細胞ＤＮＡに組み込んだ後、得られた組換え細胞を培養してそれらの複製を可能にし、最初に作製された各組換え細胞から細胞のクローンを生成する。従って、各クローンは、部位特異的ヌクレアーゼによって形成された組み込み部位にドナーＤＮＡが組み込まれた１つの元の細胞に由来する。本発明による方法は、高効率及び高忠実度のドナーＤＮＡの組み込みに関連し、本発明によるライブラリーは、少なくとも１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９又は１０１０個のクローンを含み得る。
【0117】
この理論に拘束されることなく、ヌクレアーゼによる組み込みを使用することにより、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の１０％以上を標的にすることが可能である。１０１０個を超える細胞（例えば、２×１０６個の細胞／ｍｌで増殖する５リットルの細胞から）を増殖及び形質転換することも実行可能である。このような多数の細胞のトランスフェクションは、本明細書に記載されるポリエチレンイミン媒介トランスフェクションを含む標準的な方法を使用して行うことができる。加えて、方法は、１０１０個の細胞の５分での高効率なエレクトロポレーションに利用可能である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｘｃｙｔｅ．ｃｏｍ）。従って、本発明のアプローチを使用して、１０９個を超えるクローンのライブラリーを形成することが可能である。
【0118】
ライブラリーを形成するために使用されるドナーＤＮＡ分子の集団が、同じ配列の複数のコピーを含む場合、同じバインダーをコードするＤＮＡを含む２つ以上のクローンを得ることができる。例えば、本明細書の他の箇所で詳述するように、部位特異的ヌクレアーゼの２つ以上の認識配列が存在する場合、クローンが、２つ以上の異なるバインダーをコードするドナーＤＮＡを含み得る場合もあり得る。従って、ライブラリーの多様性は、コード又は発現される異なるバインダーの数に関して、得られるクローンの数と異なり得る。
【0119】
ライブラリー中のクローンは、好ましくは、バインダーのレパートリーの１つ又は２つのメンバーをコードするドナーＤＮＡを含み、且つ／又は好ましくはバインダーのレパートリーの１つ又は２つのメンバーのみを発現する。細胞ごとの異なるバインダーの数が限られていることは、所与の標的に対してライブラリーをスクリーニングする場合に同定された特定のバインダーをコードするクローン及び／又はＤＮＡを同定する際に有利である。これは、クローンがバインダーのレパートリーの単一のメンバーをコードする場合に最も簡単である。しかしながら、ライブラリーから選択されたクローンが少数の異なるバインダーをコードする場合、例えばクローンがバインダーのレパートリーの２つのメンバーをコードし得る場合、所望のバインダーの適切なコードＤＮＡを同定することも容易である。本明細書の他の箇所で論じられるように、二倍体細胞が各染色体コピー上に１つの二重固定遺伝子座を含み、ドナーＤＮＡを一方又は両方の固定遺伝子座に組み込むことができるため、１つ又は２つのバインダーをコードするクローンを、二倍体ゲノムの染色体コピーごとに１回発生する部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を選択することによって生成することが特に便利である。従って、ライブラリーのクローンは、それぞれバインダーのレパートリーの１つ又は２つのメンバーのみを発現し得る。
【0120】
ライブラリーの細胞の表面にディスプレイされるバインダーは、同じ細胞にディスプレイされた他のバインダーと同一（同じアミノ酸配列を有する）であり得る。ライブラリーは、それぞれがバインダーのレパートリーの単一のメンバーをディスプレイする細胞のクローン又は細胞ごとにバインダーのレパートリーの複数のメンバーをディスプレイするクローンから構成され得る。代わりに、ライブラリーは、バインダーのレパートリーの単一のメンバーをディスプレイするいくつかのクローン及びバインダーのレパートリーの複数（例えば、２つ）のメンバーをディスプレイするいくつかのクローンを含み得る。
【0121】
従って、本発明によるライブラリーは、バインダーのレパートリーの２つ以上のメンバーをコードするクローンを含み得、ドナーＤＮＡは、二重固定遺伝子座又は複数の独立した固定遺伝子座に組み込まれる。
【0122】
上記のように、対応するクローンが１つのバインダーのみを発現する場合、バインダーの対応するコードＤＮＡを同定するのが最も容易である。典型的には、ドナーＤＮＡの分子は、単一のバインダーをコードする。バインダーは、ドナーＤＮＡの分子が、多量体バインダーの様々なサブユニットに対応する複数の遺伝子又はオープンリーディングフレームを含むように多量体であり得る。
【0123】
本発明によるライブラリーは、少なくとも１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９又は１０１０の異なるバインダーをコードし得る。バインダーが多量体である場合、多様性は、バインダーの１つ又は複数のサブユニットによって提供され得る。多量体バインダーは、１つ又は複数の可変サブユニットを１つ又は複数の定常サブユニットと組み合わせることができ、定常サブユニットは、ライブラリーのすべてのクローンにわたって同一である（又はより限定された多様性である）。多量体バインダーのライブラリーの生成では、バインダーサブユニットの第１のレパートリーがバインダーサブユニットの第２のレパートリーのいずれかと対を形成できる場合、組み合わせ多様性が可能である。
【0124】
ライブラリーの特徴及び形態
本発明による方法は、多くの有利な特性を有する真核細胞ライブラリーの構築を可能にする。ライブラリーは、好ましくは、以下の特徴のいずれか１つ又は複数を有する：
１．多様性。ライブラリーは、少なくとも１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９個の異なるバインダーをコード及び／又は発現し得る。
２．均一な組み込み。ライブラリーは、固定遺伝子座又は細胞ＤＮＡの限られた数の固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含むクローンから構成され得る。従って、ライブラリー中の各クローンは、固定遺伝子座又は複数の固定遺伝子座の少なくとも１つにドナーＤＮＡを含む。好ましくは、クローンは、細胞ＤＮＡの１つ又は２つの固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含む。本明細書の他の箇所で説明されるように、組み込み部位は、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列にある。組換えＤＮＡを作製するためのドナーＤＮＡの組み込みは、本明細書の他の箇所で詳細に説明されており、組み込み部位の数に応じて異なる結果が生じ得る。ライブラリーの生成に使用される細胞内に単一の潜在的な組み込み部位が存在する場合、ライブラリーは、単一の固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含むクローンのライブラリーになる。従って、ライブラリーのすべてのクローンは、細胞ＤＮＡの同じ位置にバインダー遺伝子を含む。代わりに、複数の潜在的な組み込み部位が存在する場合、ライブラリーは、複数の固定遺伝子座及び／又は異なる固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含むクローンのライブラリーであり得る。好ましくは、ライブラリーの各クローンは、第１及び／又は第２の固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含む。例えば、ライブラリーは、ドナーＤＮＡが第１の固定遺伝子座に組み込まれているクローン、ドナーＤＮＡが第２の固定遺伝子座に組み込まれているクローン及びドナーＤＮＡが第１及び第２の固定遺伝子座の両方に組み込まれているクローンを含み得る。好ましい実施形態では、ライブラリー中のクローンに１つ又は２つの固定遺伝子座のみ存在するが、特定の用途で望ましい場合、複数の遺伝子座にドナーＤＮＡを組み込むことが可能である。従って、いくつかのライブラリーでは、各クローンは、いくつかの固定遺伝子座、例えば３つ、４つ、５つ又は６つの固定遺伝子座のいずれか１つ又は複数に組み込まれたドナーＤＮＡを含み得る。別々の部位に組み込まれたバインダーサブユニットを含むライブラリーの場合、ライブラリーのクローンは、第１の固定遺伝子座に組み込まれた第１のバインダーサブユニットをコードするＤＮＡ、第２の固定遺伝子座に組み込まれた第２のバインダーサブユニットをコードするＤＮＡを含み得、クローンは、第１及び第２のサブユニットを含む多量体バインダーを発現する。
３．均一な転写。ライブラリーの異なるクローン間のバインダーの転写の相対レベルは、ドナーＤＮＡが制御された数の遺伝子座及び異なるクローンの同じ遺伝子座（固定遺伝子座）に組み込まれるため、制御された限度内に維持される。バインダー遺伝子の比較的均一な転写は、ライブラリー中のクローン上又はクローンからのバインダーの発現に匹敵するレベルをもたらす。ライブラリーの細胞の表面にディスプレイされるバインダーは、同じ細胞にディスプレイされた他のバインダーと同一であり得る（同じアミノ酸配列を有する）。ライブラリーは、それぞれがバインダーのレパートリーの単一のメンバーをディスプレイする細胞のクローン又は細胞ごとにバインダーのレパートリーの複数のメンバーをディスプレイするクローンから構成され得る。代わりに、ライブラリーは、バインダーのレパートリーの単一のメンバーをディスプレイするいくつかのクローン及びバインダーのレパートリーの複数（例えば、２つ）のメンバーをディスプレイするいくつかのクローンを含み得る。好ましくは、ライブラリーのクローンは、バインダーのレパートリーの１つ又は２つのメンバーを発現する。例えば、本発明による真核細胞クローンのライブラリーは、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９の異なるバインダー、例えばＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片のレパートリーを発現することができ、各細胞は、細胞ＤＮＡの固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含む。ドナーＤＮＡは、バインダーをコードし、ドナーＤＮＡが固定遺伝子座に組み込まれた細胞の選択のための遺伝要素をさらに含み得る。ライブラリーの細胞は、外因性部位特異的ヌクレアーゼをコードするＤＮＡを含み得る。
本発明による方法は、多くの有利な特性を有する真核細胞ライブラリーの構築を可能にする。ライブラリーは、好ましくは、以下の特徴のいずれか１つ又は複数を有する：
１．多様性。ライブラリーは、少なくとも１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９個の異なるバインダーをコード及び／又は発現し得る。
２．均一な組み込み。ライブラリーは、固定遺伝子座又は細胞ＤＮＡの限られた数の固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含むクローンから構成され得る。従って、ライブラリー中の各クローンは、固定遺伝子座又は複数の固定遺伝子座の少なくとも１つにドナーＤＮＡを含む。好ましくは、クローンは、細胞ＤＮＡの１つ又は２つの固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含む。本明細書の他の箇所で説明されるように、組み込み部位は、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列にある。組換えＤＮＡを作製するためのドナーＤＮＡの組み込みは、本明細書の他の箇所で詳細に説明されており、組み込み部位の数に応じて異なる結果が生じ得る。ライブラリーの生成に使用される細胞内に単一の潜在的な組み込み部位が存在する場合、ライブラリーは、単一の固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含むクローンのライブラリーになる。従って、ライブラリーのすべてのクローンは、細胞ＤＮＡの同じ位置にバインダー遺伝子を含む。代わりに、複数の潜在的な組み込み部位が存在する場合、ライブラリーは、複数の固定遺伝子座及び／又は異なる固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含むクローンのライブラリーであり得る。好ましくは、ライブラリーの各クローンは、第１及び／又は第２の固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含む。例えば、ライブラリーは、ドナーＤＮＡが第１の固定遺伝子座に組み込まれているクローン、ドナーＤＮＡが第２の固定遺伝子座に組み込まれているクローン及びドナーＤＮＡが第１及び第２の固定遺伝子座の両方に組み込まれているクローンを含み得る。好ましい実施形態では、ライブラリー中のクローンに１つ又は２つの固定遺伝子座のみ存在するが、特定の用途で望ましい場合、複数の遺伝子座にドナーＤＮＡを組み込むことが可能である。従って、いくつかのライブラリーでは、各クローンは、いくつかの固定遺伝子座、例えば３つ、４つ、５つ又は６つの固定遺伝子座のいずれか１つ又は複数に組み込まれたドナーＤＮＡを含み得る。別々の部位に組み込まれたバインダーサブユニットを含むライブラリーの場合、ライブラリーのクローンは、第１の固定遺伝子座に組み込まれた第１のバインダーサブユニットをコードするＤＮＡ、第２の固定遺伝子座に組み込まれた第２のバインダーサブユニットをコードするＤＮＡを含み得、クローンは、第１及び第２のサブユニットを含む多量体バインダーを発現する。
３．均一な転写。ライブラリーの異なるクローン間のバインダーの転写の相対レベルは、ドナーＤＮＡが制御された数の遺伝子座及び異なるクローンの同じ遺伝子座（固定遺伝子座）に組み込まれるため、制御された限度内に維持される。バインダー遺伝子の比較的均一な転写は、ライブラリー中のクローン上又はクローンからのバインダーの発現に匹敵するレベルをもたらす。ライブラリーの細胞の表面にディスプレイされるバインダーは、同じ細胞にディスプレイされた他のバインダーと同一であり得る（同じアミノ酸配列を有する）。ライブラリーは、それぞれがバインダーのレパートリーの単一のメンバーをディスプレイする細胞のクローン又は細胞ごとにバインダーのレパートリーの複数のメンバーをディスプレイするクローンから構成され得る。代わりに、ライブラリーは、バインダーのレパートリーの単一のメンバーをディスプレイするいくつかのクローン及びバインダーのレパートリーの複数（例えば、２つ）のメンバーをディスプレイするいくつかのクローンを含み得る。好ましくは、ライブラリーのクローンは、バインダーのレパートリーの１つ又は２つのメンバーを発現する。例えば、本発明による真核細胞クローンのライブラリーは、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９の異なるバインダー、例えばＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片のレパートリーを発現することができ、各細胞は、細胞ＤＮＡの固定遺伝子座に組み込まれたドナーＤＮＡを含む。ドナーＤＮＡは、バインダーをコードし、ドナーＤＮＡが固定遺伝子座に組み込まれた細胞の選択のための遺伝要素をさらに含み得る。ライブラリーの細胞は、外因性部位特異的ヌクレアーゼをコードするＤＮＡを含み得る。
【0125】
ライブラリーのこれら及び他の特徴は、本明細書の他の箇所にさらに記載される。
【0126】
本発明は、他の真核細胞の非存在下でのライブラリークローンの集団としての純粋な形態のライブラリー又は他の真核細胞と混合されたライブラリーのいずれかに拡張される。他の細胞は、同じタイプ（例えば、同じ細胞株）の真核細胞又は異なる細胞であり得る。さらなる利点は、スクリーニングを促進又は拡大するため又は本明細書に記載される若しくは当業者に明らかであろう他の用途のために、本発明による２つ以上のライブラリーを組み合わせるか、又は本発明によるライブラリーを第２のライブラリー若しくは第２の細胞集団と組み合わせることによって得ることができる。
【0127】
本発明によるライブラリー、ライブラリーから得られた１つ又は複数のクローン又はライブラリーからバインダーをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞を、細胞培養培地に提供することができる。細胞を培養し、次いで、濃縮して、輸送又は保管に便利な細胞ペレットを形成することができる。
【0128】
ライブラリーは、通常、インビトロで提供される。ライブラリーは、培養培地に懸濁したライブラリーの細胞を含む細胞培養フラスコなどの容器又はライブラリーを含む真核細胞のペレット若しくは濃縮懸濁液を含む容器に入れられ得る。ライブラリーは、容器内の真核細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％又は９０％を構成し得る。
【0129】
本発明のライブラリーのためにドナーＤＮＡが組み込まれる固定遺伝子座は、本発明によるライブラリーを生成する方法の認識配列の位置に対応することを理解されたい。従って、本明細書に記載される認識配列の位置に関するすべての選好は、本発明のライブラリーの固定遺伝子座にも適用可能である。
【0130】
バインダー
本発明による「バインダー」は、バインダー分子であり、別の分子に対する特異的結合パートナーを表す。特異的結合パートナーの典型的な例は、抗体－抗原及び受容体－リガンドである。
本発明による「バインダー」は、バインダー分子であり、別の分子に対する特異的結合パートナーを表す。特異的結合パートナーの典型的な例は、抗体－抗原及び受容体－リガンドである。
【0131】
ライブラリーによってコードされるバインダーのレパートリーは、通常、共通の構造を共有し、１つ又は複数の多様性の領域を有する。従って、ライブラリーは、ペプチド又はｓｃＦｖ抗体分子などの所望の分子構造クラスのメンバーの選択を可能にする。例えば、バインダーは、共通の構造を共有し、且つ１つ又は複数のアミノ酸配列多様性の領域を有するポリペプチドであり得る。
【0132】
これは、抗体分子のレパートリーを考慮することで説明することができる。これらは、それらの配列の１つ又は複数の領域が異なる共通の構造クラスの抗体分子、例えばＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はｓｃＦｖであり得る。抗体分子は、典型的には、主に抗原認識に関与する領域であるそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）に配列変化を有する。本発明のバインダーのレパートリーは、１つ又は複数のＣＤＲで異なる抗体分子のレパートリーであり得、例えば６つすべてのＣＤＲにおいて又は重鎖ＣＤＲ３及び／若しくは軽鎖ＣＤＲ３などの１つ又は複数の特定のＣＤＲにおいて配列多様性が存在し得る。
【0133】
抗体分子及び他のバインダーは、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されている。しかしながら、本発明の可能性は、抗体ディスプレイを超えて、受容体、リガンド、個々のタンパク質ドメイン及び代替タンパク質足場を含むペプチド又はエンジニアリングされたタンパク質のライブラリーのディスプレイを含むように拡張される［５８、５９］。ヌクレアーゼによる部位特異的組み込みを使用して、他のディスプレイ系を用いて以前にエンジニアリングされた他のタイプのバインダーのライブラリーを作成することができる。これらの多くは、ＤＡＲＰｉｎ及びリポカリン、アフィボディ及びアドヒロンなどの単量体結合ドメインに関与する［５８、５９、１５２］。真核細胞、特に哺乳動物細胞でのディスプレイは、より複雑な多量体標的を含むバインダー又は標的を単離してエンジニアリングする可能性も開く。例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞上で発現し、抗原提示細胞上のＭＨＣ分子との複合体で提示されるペプチドを認識するように進化してきた。ＴＣＲのレパートリーをコード及び発現するライブラリーを生成することができ、このライブラリーをスクリーニングして、本明細書の他の箇所でさらに記載されるように、ＭＨＣペプチド複合体への結合を同定することができる。
【0134】
多量体バインダーの場合、バインダーをコードするドナーＤＮＡは、１つ又は複数のＤＮＡ分子として提供することができる。例えば、個々の抗体ＶＨドメイン及びＶＬドメインが別々に発現される場合、これらは、ドナーＤＮＡの別々の分子にコードされ得る。ドナーＤＮＡは、複数の組み込み部位で細胞ＤＮＡに組み込まれ、例えばＶＨのバインダー遺伝子が１つの遺伝子座に組み込まれ、ＶＬのバインダー遺伝子が第２の遺伝子座に組み込まれる。別個のバインダーサブユニットをコードするドナーＤＮＡを導入する方法は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載される。代わりに、多量体バインダーの両方のサブユニット又は一部が、固定遺伝子座に組み込まれるドナーＤＮＡの同じ分子上にコードされ得る。
【0135】
バインダーは、抗体分子又は抗原結合部位を含む非抗体タンパク質であり得る。抗原結合部位は、フィブロネクチン若しくはシトクロムＢなどのような非抗体タンパク質足場上のペプチドループの配置により又はタンパク質足場内のループのアミノ酸残基をランダム化又は突然変異させて所望の標的に結合させることにより提供することができる［６０、６１、６２］。抗体模倣体のタンパク質足場は、少なくとも１つのランダム化ループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体模倣体）が記載されている国際公開第００３４７８４号パンフレットに開示されている。１つ又は複数のペプチドループ、例えば抗体ＶＨ ＣＤＲループのセットが移植される適切な足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーによって提供することができる。足場は、ヒト又は非ヒトタンパク質であり得る。
【0136】
非抗体タンパク質足場の抗原結合部位の使用は、以前に再考察されている［６３］。典型は、安定な骨格及び１つ又は複数の可変ループを有するタンパク質であり、１つ又は複数のループのアミノ酸配列が特異的又はランダムに突然変異されて、標的抗原を結合させる抗原結合部位が形成される。このようなタンパク質には、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）及びリポカリンが含まれる。他のアプローチには、例えば「ノッチン」又はサイクロチド足場に基づく小さい拘束ペプチドが含まれる［６４］。特にジスルフィド結合の正しい形成に関連して、それらのサイズが小さく、複雑であることを考えると、これらの足場に基づく新規バインダーの選択での真核細胞の使用には利点があり得る。自然界におけるこれらのペプチドの共通の機能を考えると、これらの足場に基づくバインダーのライブラリーは、イオンチャネル及びプロテアーゼの遮断における特定の用途の小さい高親和性バインダーの生成において有利であり得る。
【0137】
抗体配列及び／若しくは抗原結合部位に加えて、バインダーは、例えば折り畳まれたドメインなどのペプチド若しくはポリペプチドを形成する他のアミノ酸を含むか、又は抗原に結合する能力に加えて別の機能的特性を分子に付与することができる。バインダーは、検出可能な標識を担持し得るか、又は毒素若しくは標的化部分若しくは酵素に（例えば、ペプチジル結合又はリンカーを介して）コンジュゲートし得る。例えば、バインダーは、触媒部位（例えば、酵素ドメイン内）及び抗原結合部位を含み得、抗原結合部位は抗原に結合し、従って触媒部位が抗原を標的とする。触媒部位は、例えば、切断によって抗原の生物学的機能を阻害し得る。
【0138】
抗体分子
抗体分子は好ましいバインダーである。抗体分子は、全抗体又は免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得、４つのポリペプチド鎖（２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖）を有する。重鎖と軽鎖は対を形成し、それぞれが、抗原結合部位を含むＶＨ－ＶＬドメイン対を有する。重鎖及び軽鎖は、定常ドメイン：軽鎖ＣＬ並びに重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びときにＣＨ４（第５のドメインＣＨ４は、ヒトＩｇＭ及びＩｇＥに存在する）も含む。２つの重鎖は、柔軟なヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合されている。抗体分子は、ＶＨ及び／又はＶＬドメインを含み得る。
抗体分子は好ましいバインダーである。抗体分子は、全抗体又は免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得、４つのポリペプチド鎖（２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖）を有する。重鎖と軽鎖は対を形成し、それぞれが、抗原結合部位を含むＶＨ－ＶＬドメイン対を有する。重鎖及び軽鎖は、定常ドメイン：軽鎖ＣＬ並びに重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びときにＣＨ４（第５のドメインＣＨ４は、ヒトＩｇＭ及びＩｇＥに存在する）も含む。２つの重鎖は、柔軟なヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合されている。抗体分子は、ＶＨ及び／又はＶＬドメインを含み得る。
【0139】
抗体分子の最も一般的な天然フォーマットは、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖からなるヘテロ四量体であるＩｇＧである。重鎖及び軽鎖は、４本鎖の逆平行ベータシート及び３本鎖の逆平行ベータシートからなる保存された二次構造を有するモジュラードメインから構成され、単一のジスルフィド結合によって安定化されている。抗体の重鎖は、それぞれＮ末端可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの比較的保存された「定常」免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有するの対して、軽鎖は、１つのＮ末端可変ドメイン（ＶＬ）及び１つの定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ジスルフィド結合は、個々のドメインを安定化させ、共有結合を形成して４本の鎖を安定した複合体に結合する。軽鎖のＶＬ及びＣＬは、重鎖のＶＨとＣＨ１と会合し、これらの要素を単独で発現してＦａｂ断片を形成することができる。ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（「Ｆｃドメイン」とも呼ばれる）は、別のＣＨ２：ＣＨ３対と会合して、「Ｙ」の先端にある重鎖及び軽鎖の可変ドメインを有する四量体Ｙ字型分子を形成する。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、免疫系内のエフェクター細胞及び補体成分との相互作用に関与する。組み換え抗体は、ＩｇＧフォーマットで又はＦａｂ（ＶＨ：ＣＨ１の二量体と軽鎖からなる）として以前から発現されている。加えて、柔軟なリンカーをコードするＤＮＡと遺伝的に融合したＶＨ及びＶＬ断片をコードするＤＮＡからなる、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる人工構築物を使用することができる。
【0140】
バインダーは、ヒト抗体分子であり得る。従って、定常ドメインが存在する場合、これらは、好ましくはヒト定常ドメインである。
【0141】
バインダーは、抗体断片又は一本鎖抗体分子などのより小さい抗体分子フォーマットであり得る。例えば、抗体分子は、リンカーペプチドによって結合されたＶＨドメイン及びＶＬドメインからなるｓｃＦｖ分子であり得る。ｓｃＦｖ分子では、ＶＨドメインとＶＬドメインがＶＨ－ＶＬ対を形成し、ＶＨ及びＶＬの相補性決定領域が一緒になって抗原結合部位を形成する。
【0142】
抗体抗原結合部位を構成する他の抗体断片には、限定されないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨ又はＶＬドメインからなるｄＡｂ断片［６５、６６、６７］；（ｖ）分離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインがペプチドリンカーによって連結され、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするｓｃＦｖ［６８、６９］；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号明細書）；及び（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価又は多重特異的断片である「ダイアボディ」（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット）［７０］が含まれる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の取り込みによって安定させることができる［７１］。
【0143】
例えば、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びミニボディ（低分子免疫タンパク質）を含め、１つ又は複数の抗体抗原結合部位を含む様々な他の抗体分子がエンジニアリングされている。抗体分子及びそれらの構築及び使用の方法が記載されている［７２］。
【0144】
結合断片の他の例としては、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む少数の残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されている点でＦａｂ断片とは異なるＦａｂ’及び定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片であるＦａｂ’－ＳＨが挙げられる。
【0145】
ｄＡｂ（ドメイン抗体）は、抗体の小さい単量体抗原結合断片、即ち抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域である。ＶＨ ｄＡｂは、ラクダ科動物（ラクダ、ラマなど）に自然に発生し、標的抗原でラクダ科動物を免疫し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞由来のｄＡｂ遺伝子を直接クローニングすることにって作製することができる。ｄＡｂは、細胞培養でも作製可能である。それらの小さいサイズ、良好な溶解性及び温度安定性により、特に生理学的に有用であり、選択及び親和性成熟に適している。ラクダ科動物ＶＨ ｄＡｂは、「ナノボディＴＭ」という名称で治療用に開発された。
【0146】
合成抗体分子は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら［７３］又はＫｒｅｂｓら［７４］によって記載されているように、適切な発現ベクター内で合成されて構築されたオリゴヌクレオチドによって生成された遺伝子からの発現によって形成することができる。
【0147】
二重特異性抗体又は二官能性抗体は、２つの異なる可変領域が同じ分子内で組み合わされた第２世代のモノクローナル抗体を形成する［７５］。それらの使用は、新しいエフェクター機能を動員する能力又は腫瘍細胞の表面にあるいくつかの分子を標的にする能力から、診断分野及び治療分野の両方で実証されている。二重特異性抗体が使用される場合、これらは、様々な方法［７６］で製造できる、例えば化学的に又はハイブリッドハイブリドーマから調製できる従来の二重特異性抗体であり得るか、又は上述の二重特異性抗体断片のいずれかであり得る。これらの抗体は、化学的方法［７７、７８］又は体細胞法［７９、８０］によって得ることができるが、同様に、ヘテロ二量体化が強制されるのを可能にし、従って求められている抗体の精製プロセスを容易にする遺伝子工学技術によって優先的に得ることができる［８１］。二重特異性抗体の例としては、特異性の異なる２つの抗体の結合ドメインを使用し、短い柔軟なペプチドを介して直接連結することができるＢｉＴＥＴＭ技術による抗体が挙げられる。これは、短い１本のポリペプチド鎖上の２つの抗体を結合させる。ダイアボディ及びｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用してＦｃ領域なしで構築することができ、抗イディオタイプ反応の影響を潜在的に低減し得る。
【0148】
二重特異性抗体は、ＩｇＧ全体として、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、ダイアボディとして又は二重特異性ｓｃＦｖとして構築することができる。さらに、２つの二重特異性抗体を、当技術分野で公知の常法を使用して連結し、４価抗体を形成することができる。
【0149】
二重特異性全抗体とは対照的に、二重特異性ダイアボディも特に有用であり得る。適切な結合特異性のダイアボディ（及び抗体断片などの他の多くのポリペプチド）を容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームが一定のままであり、例えば目的の抗原に対する特異性を有する場合、もう一方のアームが様々であり、且つ適切な特異性の抗体が選択されるライブラリーを作成することができる。二重特異性全抗体は、Ｒｉｄｇｅｗａｙら、１９９６年［８２］に記載されているような代替の工学的方法によって作製することができる。
【0150】
本発明によるライブラリーを使用して、目的の１つ又は複数の抗原に結合する抗体分子を選択することができる。ライブラリーからの選択については、以下に詳細に記載する。選択後、抗体分子を異なるフォーマットに、且つ／又は追加の特徴を含むようにエンジニアリングすることができる。例えば、選択された抗体分子を、上記の抗体フォーマットの１つなどの異なるフォーマットに変換することができる。選択された抗体分子及び選択された抗体分子のＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲを含む抗体分子は本発明の態様である。抗体分子及びそれらをコードする核酸は、単離された形態で提供することができる。
【0151】
抗体断片は、酵素、例えばペプシン若しくはパパインによる消化などの方法によって且つ／又は化学還元によるジスルフィド架橋の切断によって抗体分子から出発して得ることができる。別の方法では、抗体断片は、当業者に周知の遺伝子組換え技術、又は例えば自動ペプチド合成装置によるペプチド合成、又は核酸合成及び発現によって得ることができる。
【0152】
モノクローナル抗体及びその他の抗体を得て、組換えＤＮＡ技術の技術を使用して、標的抗原に結合する他の抗体又はキメラ分子を作製することが可能である。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域又はＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域とフレームワーク領域に導入することを含み得る。例えば、欧州特許出願公開第Ａ－１８４１８７号明細書、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号明細書、欧州特許出願公開第Ａ－２３９４００号明細書及びこれらに続く多くの文献を参照されたい。
【0153】
抗体分子は、ライブラリーから選択し、次いで修飾することができ、例えば、抗体分子のインビボ半減期は、化学修飾、例えばＰＥＧ化又はリポソームへの取り込みによって増加させることができる。
【0154】
バインダー遺伝子の供給源
モノクローナル抗体の生成の従来の経路は、マウスやウサギのような実験動物の免疫系を利用して高親和性抗体のプールを生成し、次いで、高親和性抗体を、ハイブリドーマ技術を使用して単離する。本発明のライブラリーは、免疫から生じる抗体を同定するための代替経路を提供する。ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子は、免疫された動物のＢ細胞から増幅し、真核細胞ライブラリーへの導入のための適切なベクターにクローニングし、続いてこれらのライブラリーから選択することができる。ファージディスプレイ及びリボソームディスプレイにより、非常に大きいライブラリー（１０９個を超えるクローン）を構築することができ、免疫化なしでもヒト抗体の単離が可能となる。本発明によるライブラリーの作製は、このような方法と共に使用することもできる。一連のファージディスプレイ選択に続いて、バインダーの選択された集団を、本明細書に記載されるようにヌクレアーゼによる組み込みによって真核細胞に導入することができる。これにより、他の系（例えば、ファージディスプレイ）に基づく非常に大きいライブラリーの最初の使用によってバインダーの集団を濃縮することが可能になる一方、上記のように真核細胞を使用する効率的なスクリーニングが可能になる。従って、本発明は、ファージディスプレイ及び真核細胞ディスプレイの両方の最良の特徴を組み合わせて、定量的スクリーニング及び選別でのハイスループット系を提供することができる。
モノクローナル抗体の生成の従来の経路は、マウスやウサギのような実験動物の免疫系を利用して高親和性抗体のプールを生成し、次いで、高親和性抗体を、ハイブリドーマ技術を使用して単離する。本発明のライブラリーは、免疫から生じる抗体を同定するための代替経路を提供する。ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子は、免疫された動物のＢ細胞から増幅し、真核細胞ライブラリーへの導入のための適切なベクターにクローニングし、続いてこれらのライブラリーから選択することができる。ファージディスプレイ及びリボソームディスプレイにより、非常に大きいライブラリー（１０９個を超えるクローン）を構築することができ、免疫化なしでもヒト抗体の単離が可能となる。本発明によるライブラリーの作製は、このような方法と共に使用することもできる。一連のファージディスプレイ選択に続いて、バインダーの選択された集団を、本明細書に記載されるようにヌクレアーゼによる組み込みによって真核細胞に導入することができる。これにより、他の系（例えば、ファージディスプレイ）に基づく非常に大きいライブラリーの最初の使用によってバインダーの集団を濃縮することが可能になる一方、上記のように真核細胞を使用する効率的なスクリーニングが可能になる。従って、本発明は、ファージディスプレイ及び真核細胞ディスプレイの両方の最良の特徴を組み合わせて、定量的スクリーニング及び選別でのハイスループット系を提供することができる。
【0155】
ファージディスプレイ及び酵母ディスプレイを使用して、十分なサイズのディスプレイライブラリーが使用されれば、免疫化に頼らずにバインダーを生成することも可能であることが以前に実証された。例えば、１０７個を超えるクローンの非免疫抗体ライブラリーから複数のバインダーが生成された［８３］。これにより、従来の免疫経路では困難であった標的に対するバインダーの生成、例えば種間で保存されている「自己抗原」又はエピトープに対する抗体の生成が可能になる。例えば、ヒト／マウスの交差反応性バインダーは、同じ標的のヒトバージョン、続いてマウスバージョンの連続的な選択によって濃縮することができる。ほとんどの目的の標的に対してヒトを特異的に免疫化することは不可能であるため、この容易さは、治療アプローチに好まれるヒト抗体の生成を可能にする上で特に重要である。
【0156】
これまでの哺乳動物ディスプレイの例では、ライブラリーのサイズ及び質が限定されていて、バインダーは、例えば、免疫化又は既存のバインダーのエンジニアリングから、バインダー用に事前に濃縮されたレパートリーを使用してのみ生成されてきた。真核細胞、特に高等真核細胞で大きいライブラリーを作製する能力により、非免疫バインダー又は以前に別の系内で選択されていなかったバインダーから出発して、これらのライブラリーから直接バインダーを単離する可能性がもたらされる。本発明によるライブラリーを作製することにより、非免疫源からバインダーを生成することが可能である。これにより、複数の供給源からのバインダー遺伝子を使用する可能性が開かれる。バインダー遺伝子は、抗体遺伝子などの天然供給源のＰＣＲに由来し得る。バインダー遺伝子は、抗体ファージディスプレイライブラリーなどの既存のライブラリーから再クローニングして、標的細胞へのヌクレアーゼによる組み込みに適したドナーベクターにクローニングすることもできる。バインダーは、元来は完全に又は部分的に合成することができる。さらに、様々なタイプのバインダーが、本明細書の他の箇所に記載されており、例えば、バインダー遺伝子は、抗体をコードし得るか、又は代替の足場［５８、５９］、ペプチド、若しくはエンジニアリングされたタンパク質、若しくはタンパク質ドメインをコードし得る。
【0157】
バインダーディスプレイ
本発明に関連して構築されたライブラリーを培養して、可溶性分泌型又は膜貫通型のいずれかでバインダーを発現させることができる。発現したバインダーは、それらをコードする細胞の表面に保持される場合に「ディスプレイ」されたと言われる。これに関連して、「バインダーディスプレイ」、「表面上／表面でのディスプレイ」、「細胞上のディスプレイ」及び「バインダーのディスプレイ」などのような用語を互換的に使用することができる。これに関連して、ライブラリーは、ディスプレイ又はディスプレイライブラリーと呼ばれることもある。
本発明に関連して構築されたライブラリーを培養して、可溶性分泌型又は膜貫通型のいずれかでバインダーを発現させることができる。発現したバインダーは、それらをコードする細胞の表面に保持される場合に「ディスプレイ」されたと言われる。これに関連して、「バインダーディスプレイ」、「表面上／表面でのディスプレイ」、「細胞上のディスプレイ」及び「バインダーのディスプレイ」などのような用語を互換的に使用することができる。これに関連して、ライブラリーは、ディスプレイ又はディスプレイライブラリーと呼ばれることもある。
【0158】
好ましくは、発現されたバインダーがディスプレイされるライブラリーは、目的の標的に対するスクリーニングのためのバインダーのレパートリーを提供することになる。
【0159】
バインダーは、細胞表面におけるバインダーの細胞外ディスプレイのために、膜貫通ドメインなどの膜固定を含むか、又はそれに連結することができる。これには、ＧＰＩ認識配列などの膜局在シグナル又はＰＤＧＦ受容体の膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインへのバインダーの直接融合が含まれ得る［８４］。細胞表面におけるバインダーの保持は、同じ細胞内で発現する別の細胞表面に保持された分子との会合によって間接的に行うこともできる。この会合した分子自体は、直接係留されていない軽鎖パートナーと会合した係留抗体重鎖などのヘテロ二量体バインダーの一部であり得る。
【0160】
細胞表面固定化は、バインダーの選択を容易にするが、多くの適用例では、無細胞の分泌型バインダーを調製する必要がある。分泌型バインダーを細胞表面受容体に付着させる再捕捉法を使用して、膜係留と可溶性分泌を組み合わせることが可能になる。１つのアプローチは、バインダーのライブラリーを、分泌型バインダーを捕捉するように機能し得る同じ細胞内で発現する膜固定分子と会合できる分泌型分子としてフォーマットすることである。例えば、抗体又は抗体Ｆｃドメインに融合したバインダー分子の場合、膜係留Ｆｃは、同じ細胞内で発現している分泌型バインダー分子を「サンプリング」することができ、その結果、発現しているバインダー分子の単量体画分がディスプレイされ、残りが二価の形で分泌される（米国特許第８，５５１，７１５号明細書）。代替は、プロテインＡなどの係留ＩｇＧ結合ドメインを使用することである。
【0161】
分泌型抗体を、それらを産生する細胞で保持する他の方法は、Ｋｕｍａｒら（２０１２）［８５］で再考察されており、マイクロドロップ内での細胞のカプセル化、マトリックス支援捕捉、親和性捕捉表面ディスプレイ（ＡＣＳＤ）、分泌及び捕捉技術（ＳＥＣＡＮＴ）並びに「コールド捕捉」［８５］を含む。ＡＣＳＤ及びＳＥＣＡＮＴ［８５］の例では、ビオチン化を使用して、細胞表面のストレプトアビジン又は捕捉抗体の固定化が促進される。捕捉された分子は、分泌型抗体を捕捉する。ＳＥＣＡＮＴの例では、インビボでの分泌型分子のビオチン化が起こる。「コールド捕捉」技術を使用すると、分泌型抗体を、分泌型分子に対する抗体を使用して産生細胞で検出することができる。これは、分泌型抗体と細胞のグリコカリックスとの会合によるものであると提案されている［８６］。代わりに、分泌産物は、エンドサイトーシスされる前に細胞表面の抗体を染色することによって捕捉されることが示唆されている［８７］。上記の方法は、集団内の高発現クローンの同定に使用されているが、会合が細胞表面で十分に長持ちすれば、結合特異性の同定に潜在的に適応させ得る。
【0162】
バインダーが細胞表面に直接係留されている場合でも、可溶性産物を生成することが可能である。例えば、選択されたバインダーをコードする遺伝子を回収して、膜固定配列を欠く発現ベクターにクローニングすることができる。代わりに、膜貫通ドメインが、組換え部位、例えばＯｒｅリコンビナーゼのＲＯＸ認識部位に挟まれたエクソン内にコードされる発現構造を使用することができる［８８］。膜貫通ドメインをコードするエクソンは、Ｄｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子でのトランスフェクションによって除去して、発現を分泌型に切り替えることができる。
【0163】
上記の方法のいずれか又は他の適切なアプローチを使用して、ライブラリーのクローンによって発現されるバインダーがそれらの発現細胞の表面にディスプレイされるようにすることができる。
【0164】
Ｆｃドメインに融合した哺乳動物細胞の表面でのｓｃＦｖｓのディスプレイ
多くの抗体ファージディスプレイライブラリーは、ｓｃＦｖをディスプレイするようにフォーマットされているが、真核細胞ディスプレイ系では、Ｆａｂ又はＩｇＧフォーマットでの提示を可能にする。ＩｇＧ／Ｆａｂ発現の可能性を最大限に活用するために、特に他のディスプレイ系からのｓｃＦｖを使用する場合、細菌発現系内の選択された連結ＶＨ及びＶＬドメインを得て、適切な定常ドメインに融合した真核細胞系内でそれらを発現させる必要がある。元のＶＨ鎖とＶＬ鎖の対が維持されるように、ｓｃＦｖ集団を免疫グロブリン（Ｉｇ）又は断片抗原結合（Ｆａｂ）フォーマットに変換する方法を本明細書で説明する。本発明では、ＶＨ鎖とＶＬ鎖の元の対を維持しながら、ｓｃＦｖとしてフォーマットされた個々のクローン、オリゴクローナルミックス又は全集団を使用する変換が可能である。この方法は、新しい「スタッファー」ＤＮＡ断片をもたらす中間体の非複製性「ミニサークル」ＤＮＡの生成によって進む。環状ＤＮＡは、（例えば、制限消化又はＰＣＲによって）線状化され、元のＶＨ及びＶＬ断片の相対位置を変化させて、それらの間に「スタッフド」ＤＮＡを配置する。線状にした後、生成物を、選択したベクター、例えば哺乳動物発現ベクターにクローニングすることができる。このようにして、ＶＨとＶＬ以外のすべての要素を置き換えることができる。細菌発現のための要素は、哺乳動物の発現及び代替パートナーへの融合のための要素に置き換えることができる。完全な変換プロセスでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換ステップを１回行うのみで、それぞれが固有のｌｇ又はＦａｂフォーマットされた組換え抗体をコードするプラスミドを有する細菌コロニーの集団が生成される。ｓｃＦｖからＩｇＧ／Ｆａｂへの変換を超えて、この方法を利用して、任意の２つの連結されたＤＮＡ要素を再フォーマットしてベクターにクローニングし、再フォーマット後に各ＤＮＡ要素が元の対を維持しながら異なるＤＮＡ制御機構に囲まれるようにすることができる。中間体の非複製性環状中間体を介して進む本方法とは対照的に、これらの要素を置き換えるために２つの連続したクローニングステップが使用される以前の方法が記載されている［１１７］。
多くの抗体ファージディスプレイライブラリーは、ｓｃＦｖをディスプレイするようにフォーマットされているが、真核細胞ディスプレイ系では、Ｆａｂ又はＩｇＧフォーマットでの提示を可能にする。ＩｇＧ／Ｆａｂ発現の可能性を最大限に活用するために、特に他のディスプレイ系からのｓｃＦｖを使用する場合、細菌発現系内の選択された連結ＶＨ及びＶＬドメインを得て、適切な定常ドメインに融合した真核細胞系内でそれらを発現させる必要がある。元のＶＨ鎖とＶＬ鎖の対が維持されるように、ｓｃＦｖ集団を免疫グロブリン（Ｉｇ）又は断片抗原結合（Ｆａｂ）フォーマットに変換する方法を本明細書で説明する。本発明では、ＶＨ鎖とＶＬ鎖の元の対を維持しながら、ｓｃＦｖとしてフォーマットされた個々のクローン、オリゴクローナルミックス又は全集団を使用する変換が可能である。この方法は、新しい「スタッファー」ＤＮＡ断片をもたらす中間体の非複製性「ミニサークル」ＤＮＡの生成によって進む。環状ＤＮＡは、（例えば、制限消化又はＰＣＲによって）線状化され、元のＶＨ及びＶＬ断片の相対位置を変化させて、それらの間に「スタッフド」ＤＮＡを配置する。線状にした後、生成物を、選択したベクター、例えば哺乳動物発現ベクターにクローニングすることができる。このようにして、ＶＨとＶＬ以外のすべての要素を置き換えることができる。細菌発現のための要素は、哺乳動物の発現及び代替パートナーへの融合のための要素に置き換えることができる。完全な変換プロセスでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換ステップを１回行うのみで、それぞれが固有のｌｇ又はＦａｂフォーマットされた組換え抗体をコードするプラスミドを有する細菌コロニーの集団が生成される。ｓｃＦｖからＩｇＧ／Ｆａｂへの変換を超えて、この方法を利用して、任意の２つの連結されたＤＮＡ要素を再フォーマットしてベクターにクローニングし、再フォーマット後に各ＤＮＡ要素が元の対を維持しながら異なるＤＮＡ制御機構に囲まれるようにすることができる。中間体の非複製性環状中間体を介して進む本方法とは対照的に、これらの要素を置き換えるために２つの連続したクローニングステップが使用される以前の方法が記載されている［１１７］。
【0165】
バインダー又はバインダーの集団を再構築する方法は、ｓｃＦｖをＩｇ又はその断片、例えばＦａｂに変換することを含み得る。この方法は、ｓｃＦｖをコードする核酸を、元の可変ＶＨ及びＶＬ鎖の対が維持されるように、免疫グロブリン（Ｉｇ）又はＦａｂフォーマットなどのその断片をコードするＤＮＡに変換することを含み得る。好ましくは、この変換は、非複製性「ミニサークル」ＤＮＡであり得る環状ＤＮＡ中間体を介して進む。この方法では、Ｉｇ又はＦａｂ ＤＮＡをコードするプラスミドを有する細菌形質転換体を直接生成するために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の１回の形質転換が必要である。
【0166】
この方法は、モノクローナルクローン、オリゴクローナルクローン又はポリクローナルクローンの再フォーマット化に使用することができる。この方法を使用して、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ又はリボソームディスプレイを含む一般的に使用される任意のディスプレイ技術から出力集団全体を「まとめて」変換することができる。
【0167】
より一般的には、この方法は、任意の２つの接続されたＤＮＡ要素をベクターに再フォーマットすることを可能にし、この再フォーマットでは、ＤＮＡ要素が別々のプロモーターの制御下でクローニングされるか、又は代替の制御要素によって分離されるが、元のＤＮＡ対が維持される。
【0168】
バインダーをコードするＤＮＡの単離及び任意選択の再構築に続いて、そのＤＮＡをさらなる細胞に導入して、本明細書の他の箇所に記載されるような誘導体ライブラリーを形成し得るか、又は目的の１つ若しくは複数の特定のバインダーをコードするＤＮＡを発現のために宿主細胞に導入し得る。宿主細胞は、ライブラリーが得られたライブラリーの細胞と比較して異なるタイプであり得る。一般に、ＤＮＡはベクターで提供される。宿主細胞に導入されたＤＮＡは、宿主細胞の細胞ＤＮＡに組み込むことができる。次いで、分泌型可溶性抗体分子を発現する宿主細胞を選択することができる。
【0169】
１つ又は複数のバインダーをコードする宿主細胞を培地に入れ、培養して１つ又は複数のバインダーを発現させることができる。
【0170】
誘導体ライブラリー
ライブラリーを作製する方法に続いて、１つ又は複数のライブラリークローンを選択し、これを使用してさらなる第２世代のライブラリーを作製することができる。本明細書に記載されるように真核細胞にＤＮＡを導入することによってライブラリーが生成される場合、このライブラリーを培養してバインダーを発現させることができ、目的のバインダーを発現する１つ又は複数のクローンを、例えば標的に対するバインダーを同定する方法によって標的に対してバインダーを選択することによって回収することができる。その後、これらのクローンを使用して、好ましくはライブラリーを作製する方法により、バインダーの第２のレパートリーをコードするＤＮＡを含む誘導体ライブラリーを生成することができる。
ライブラリーを作製する方法に続いて、１つ又は複数のライブラリークローンを選択し、これを使用してさらなる第２世代のライブラリーを作製することができる。本明細書に記載されるように真核細胞にＤＮＡを導入することによってライブラリーが生成される場合、このライブラリーを培養してバインダーを発現させることができ、目的のバインダーを発現する１つ又は複数のクローンを、例えば標的に対するバインダーを同定する方法によって標的に対してバインダーを選択することによって回収することができる。その後、これらのクローンを使用して、好ましくはライブラリーを作製する方法により、バインダーの第２のレパートリーをコードするＤＮＡを含む誘導体ライブラリーを生成することができる。
【0171】
誘導体ライブラリーを生成するために、１つ又は複数の回収したクローンのドナーＤＮＡを突然変異させて、バインダーの第２のレパートリーを提供する。突然変異は、１つ又は複数のヌクレオチドの付加、置換又は欠失であり得る。バインダーがポリペプチドである場合、突然変異は、１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換又は欠失により、コードされたバインダーの配列を変化させることである。突然変異は、抗体分子の１つ又は複数のＣＤＲなどの１つ又は複数の領域に焦点を当てることができ、本明細書の他の箇所に記載されるように、１つ又は複数の多様性の領域において異なる共通の構造クラスのバインダーのレパートリーを提供する。
【0172】
誘導体ライブラリーを生成することは、１つ又は複数の回収したクローンからドナーＤＮＡを単離し、ＤＮＡに突然変異を導入して、バインダーの第２のレパートリーをコードするドナーＤＮＡ分子の誘導体集団を提供し、且つドナーＤＮＡ分子の誘導体集団を細胞に導入して、バインダーの第２のレパートリーをコードするＤＮＡを含む細胞の誘導体ライブラリーを形成することを含み得る。
【0173】
ドナーＤＮＡの単離は、クローンからＤＮＡを得、且つ／又はそのＤＮＡを同定することを含み得る。このような方法は、例えば、ＰＣＲにより、回収したクローンからバインダーをコードするＤＮＡを増幅すること及び突然変異を導入することを包含し得る。ＤＮＡを配列決定し、突然変異ＤＮＡを合成することができる。
【0174】
代わりに、突然変異を、クローン内のＤＮＡに突然変異を誘発することによって１つ又は複数の回収したクローンのドナーＤＮＡに導入することができる。従って、誘導体ライブラリーは、例えば、トリＤＴ４０細胞における内因性突然変異により、ＤＮＡの単離を必要とせずに１つ又は複数のクローンから形成することができる。
【0175】
抗体のディスプレイ自体が誘導体ライブラリーの形成に特に適している。抗体遺伝子が単離されると、様々な突然変異誘発アプローチ（例えば、エラーが起こりやすいＰＣＲ、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発、鎖シャッフル）を使用して、改良された変異体を選択することができる関連するクローンのディスプレイライブラリーを形成することが可能である。例えば、選択されたＶＨクローンの集団、オリゴクローナルミックス又は集団をコードするＤＮＡを鎖シャッフルすることで、適切な抗体フォーマットをコードし、且つＶＬ鎖の適切にフォーマットされたレパートリーをコードするベクターにサブクローニングすることができる［１１８］。代わりに、ＶＨの例を再び使用して、ＶＨクローン、オリゴミックス又は集団を、適切にフォーマットされた軽鎖パートナー（例えば、ＩｇＧ又はＦａｂフォーマットされた重鎖と会合のためのＶＬ－ＣＬ鎖）の集団をコードして発現する真核細胞の集団に導入することができる。ＶＨ集団は、免疫された動物のＢ細胞又は選択されたファージ集団からのｓｃＦｖ遺伝子を含む、上記の任意の供給源から生じ得る。後者の例では、選択されたＶＨを軽鎖のレパートリーにクローニングすることにより、１つのステップで鎖シャッフルと（例えば、ＩｇＧフォーマットに）再フォーマットすることとを組み合わせることができる。
【0176】
真核細胞におけるディスプレイの特別な利点は、選択／スクリーニングステップの厳密性を制御する能力である。抗原濃度を下げることにより、集団内で最も高い親和性バインダーを発現する細胞を、親和性の低いクローンと区別することができる。フローサイトメトリーを使用する親和性成熟プロセスの可視化及び定量化は、ナイーブライブラリーの陽性率を早期に示し、選別中の選択したクローンと親集団の親和性の直接比較が可能となるため、真核細胞ディスプレイの大きい利点である。選別後、個々のクローンの親和性を、様々な抗原濃度でのプレインキュベーション及びフローサイトメトリーでの分析により、又は均質な時間分解蛍光（ＴＲＦ）アッセイで、又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して決定することができる。
【0177】
目的の標的に対するバインダーを同定するスクリーニング。上記のように、真核細胞ライブラリーは、標的を認識するバインダーのスクリーニング方法で使用することができる。このような方法は、
本発明のライブラリーを作製する方法によってライブラリーを提供するか、又は本発明による遺伝子座の使用によってライブラリーを提供するか、又は本発明によるライブラリーを提供するステップ、
ライブラリーの細胞を培養してバインダーを発現させるステップ、
バインダーを標的に曝露し、１つ又は複数の同種バインダーが存在する場合、それによる標的の認識を可能にするステップ、及び
標的が同種バインダーによって認識されるかどうかを検出するステップ
を含み得る。
本発明のライブラリーを作製する方法によってライブラリーを提供するか、又は本発明による遺伝子座の使用によってライブラリーを提供するか、又は本発明によるライブラリーを提供するステップ、
ライブラリーの細胞を培養してバインダーを発現させるステップ、
バインダーを標的に曝露し、１つ又は複数の同種バインダーが存在する場合、それによる標的の認識を可能にするステップ、及び
標的が同種バインダーによって認識されるかどうかを検出するステップ
を含み得る。
【0178】
この態様による方法は、本出願に関連して、標的に対するバインダーを同定する方法と呼ばれ得る。これに関連して、バインダーの選択又はバインダーのスクリーニングもこのような方法を指す。
【0179】
標的に対するバインダーを同定する方法は、様々な標的分子クラス、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、小分子を使用して実施することができる。標的は、可溶性の形態で提供することができる。標的は、検出を容易にするために標識することができ、例えば蛍光標識を担持し得るか又はビオチン化され得る。標的特異的バインダーを発現する細胞は、直接的又は間接的に標識された標的分子を使用して単離することができ、バインダーは、標識された分子を捕捉する。例えば、バインダーと標的の相互作用を介して、蛍光標識された標的に結合した細胞を、フローサイトメトリー又はＦＡＣＳによって検出して選別し、所望の細胞を単離することができる。サイトメトリーを含む選択には、直接的に蛍光標識された標的分子又は二次試薬で検出できる分子で標識された標的分子が必要であり、例えばビオチン化標的を細胞に添加し、細胞表面への結合をストレプトアビジン－フィコエリトリンなどの蛍光標識ストレプトアビジンで検出することができる。さらなる可能性は、磁気ビーズ若しくはアガロースビーズなどの固体表面の標的に結合する標的分子又は二次試薬を固定して、標的に結合する細胞の濃縮を可能にすることである。例えば、バインダーと標的の相互作用を介してビオチン化標的に結合する細胞は、ストレプトアビジンでコーティングされた基質、例えばストレプトアビジンでコーティングされたビーズ上に単離することができる。
【0180】
標的に対するバインダーを同定する方法で使用されるライブラリーでは、ライブラリーの効果的な提示を確実にするために、オーバーサンプリング、即ちライブラリー内に存在する独立したクローンの数よりも多くのクローンをスクリーニングすることが好ましい。本発明によって提供される非常に大きいライブラリーからのバインダーの同定は、流動選別によって行うことができるが、これは、特にライブラリーをオーバーサンプリングする場合、数日かかるであろう。代替として、最初の選択は、回収可能な抗原、例えばストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに回収されるビオチン化抗原の使用に基づき得る。従って、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを使用して、ビオチン化抗原に結合した細胞を捕捉することができる。磁気ビーズによる選択は、唯一の選択方法として使用することができるか、又はこれは、例えば、発現レベルの高いクローンと親和性の高いクローンを区別する、優れた分解能を達成できるフローサイトメトリーと共に行うこともできる［５６、５７］。
【0181】
ディスプレイ技術アプローチのインビトロでの性質は、免疫化では不可能である方法での選択、例えば標的の特定の立体配座状態での選択を制御することを可能にする［９０、９１］。標的は、化学修飾（フルオレセイン、ビオチン）又は遺伝子融合（例えば、ＦＬＡＧタグなどのエピトープタグ、若しくは別のタンパク質ドメイン、若しくはタンパク質全体に融合したタンパク質）によってタグ付けすることができる。タグは、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は非生物学的核酸）であり得、タグは、標的核酸に融合した部分であるか、又はタンパク質などの別のタイプの分子に化学的に結合することができる。これは、化学的コンジュゲーション又は酵素的付着によるものであり得る［９２］。核酸は、リボソームディスプレイなどの翻訳プロセスによって標的に融合させることもできる。「タグ」は、細胞内で生じる別の修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、アルキル化、ＰＡＳ化、ＳＵＭＯ化及びｈｔｔｐ：／／ｄｂｐｔｍ．ｍｂｃ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｐｈｐの翻訳後データベース（ｄｂ－ＰＴＭ）に記載されているその他の修飾）であり得、二次試薬によって検出することができる。これにより、特定の修飾に基づいて未知の標的タンパク質に結合するバインダーが得られることになる。
【0182】
標的は、その標的分子に結合する既存のバインダー、例えば標的特異的抗体を使用して検出することができる。検出での既存のバインダーの使用は、検出に使用したバインダーとは異なるエピトープを認識するバインダーのライブラリー内でバインダーを同定するというさらなる利点を有する。このようにして、サンドイッチＥＬＩＳＡなどの適用例で使用するためのバインダーの対を同定することができた。可能な場合、精製された標的分子が好ましいであろう。代わりに、標的を標的細胞の集団の表面にディスプレイすることができ、バインダーは、ライブラリー細胞の表面にディスプレイされ、この方法は、ライブラリー細胞を標的細胞と接触させることによってバインダーを標的に曝露することを含む。標的を発現する細胞の回収（例えば、標的を発現するビオチン化細胞の使用）により、それらに対するバインダーを発現する細胞の濃縮を可能にする。このアプローチは、強いアビディティ効果の可能性があるため、親和性の低い相互作用が関与する場合に有用となる。
【0183】
標的分子は、検出された分子が（上記したように）細胞結合の同定に利用可能である場合、未精製の組換え体又は未精製の天然標的でもあり得る。加えて、バインダーを発現する細胞への標的分子の結合は、標的分子の検出されている別の分子への会合によって間接的に検出することができ、例えばタグ付き分子を含む細胞溶解物をバインダーのライブラリーと共にインキュベートして、タグ付き分子に対するバインダーだけでなく、その関連パートナータンパク質に対するバインダーも同定することができる。これにより、（例えば、質量分析を使用した）パートナーの検出又は同定に使用できるこれらのパートナーに対する抗体のパネルが得られることになる。細胞分別を使用して、特定の細胞内位置からの標的を濃縮することができる。代わりに、表面又は細胞質画分のビオチン化の差を、真核細胞のディスプレイ用のストレプトアビジン検出試薬と共に使用することもできる［９３、９４］。界面活性剤で可溶化した標的調製物の使用は、他の方法では調製が困難なＧＰＣＲ及びイオンチャネルなどの無傷の膜タンパク質に特に有用なアプローチである。界面活性剤の存在は、選択された細胞の追加の増殖なしでのバインダー遺伝子の回収を必要とするバインダーをディスプレイする真核細胞に対して有害な影響を及ぼし得る。
【0184】
同種バインダーによる標的認識の検出に続いて、同種バインダーをコードするＤＮＡを含むクローンの細胞を回収することができる。次いで、バインダーをコードするＤＮＡを回収したクローンから単離（例えば、同定又は増幅）し、それにより標的を認識するバインダーをコードするＤＮＡを得ることができる。
【0185】
例示的なバインダー及び標的は、本明細書の他の箇所で詳述される。典型的な例は、抗体分子のライブラリーであり、このライブラリーを目的の標的抗原への結合についてスクリーニングすることができる。他の例としては、標的ＭＨＣ：ペプチド複合体に対するＴＣＲのライブラリーのスクリーニング又は標的ＴＣＲに対するＭＨＣ：ペプチド複合体のライブラリーのスクリーニングが含まれる。
【0186】
ＴＣＲ：ＭＨＣと他の受容体の相互作用
上記で説明したように、標的に対するバインダーを同定する方法におけるバインダー及び標的は、それぞれＴＣＲ及びＭＨＣ：ペプチド複合体であり得るか又はその逆であり得る。従って、ディスプレイライブラリーは、酵母細胞及び哺乳動物細胞の表面のＴＣＲのライブラリーであり得る。このようなライブラリーを使用して、認識特性が変更されたＴＣＲを選択することができる。代わりに、ディスプレイライブラリーは、ＴＣＲによる認識のためのペプチド又はＭＨＣ変異体のライブラリーであり得る。
上記で説明したように、標的に対するバインダーを同定する方法におけるバインダー及び標的は、それぞれＴＣＲ及びＭＨＣ：ペプチド複合体であり得るか又はその逆であり得る。従って、ディスプレイライブラリーは、酵母細胞及び哺乳動物細胞の表面のＴＣＲのライブラリーであり得る。このようなライブラリーを使用して、認識特性が変更されたＴＣＲを選択することができる。代わりに、ディスプレイライブラリーは、ＴＣＲによる認識のためのペプチド又はＭＨＣ変異体のライブラリーであり得る。
【0187】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞上に発現し、抗原提示細胞上のＭＨＣ分子との複合体で提示されるペプチドを認識するように進化してきた。ＴＣＲは、９５％のα及びβヘテロ二量体と、５％のγ及びδヘテロ二量体とからなるヘテロ二量体である。両方の単量体ユニットは、標的との相互作用の促進に関与する３つの可変相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するＮ末端免疫グロブリンドメインを有する。機能性ＴＣＲは、他のサブユニットの複合体内に存在し、シグナル伝達は、ＣＤ４及びＣＤ８分子（それぞれクラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子に特異的）との共刺激によって増強される。抗原提示細胞では、タンパク質が処理され、それ自体、多量体タンパク質複合体の一部であるＭＨＣ分子と複合体を形成した細胞表面に提示される。「自己」に由来するペプチドを認識するＴＣＲは、発生中に除去され、この系は、抗原提示細胞上に提示された外来ペプチドを認識して免疫応答を引き起こす準備ができている。ペプチド：ＭＨＣ複合体の認識の結果は、Ｔ細胞の同一性及びその相互作用の親和性に依存する。
【0188】
例えば、自己免疫疾患で生じる病的状態に関与する相互作用を促進するＴＣＲ又はＭＨＣ：ペプチド複合体をコードする遺伝子を同定することは有用である。例えば、癌のＴ細胞の再標的化又は既存のＴ細胞の効果の強化において、結合を変化させる、例えば目的の標的に対する親和性を高めるためにＴＣＲをエンジニアリングすることが望ましいであろう［９５］。代わりに、制御性又は抑制性Ｔ細胞の挙動は、例えば、特異的なＴＣＲのＴ細胞への導入又は発現したＴＣＲタンパク質の治療実体としての使用により、癌の免疫療法を指示又は強化するための治療法として変更され得る［９６］。
【0189】
酵母細胞及び哺乳動物細胞の表面でのＴＣＲのライブラリーのディスプレイは以前に実証されている。酵母細胞の場合、ＴＣＲをエンジニアリングして、それを一本鎖フォーマットで提示する必要があった。ＴＣＲとペプチド：ＭＨＣ複合体との間の相互作用の親和性は低いため、可溶性成分（例えば、この場合にはペプチド：ＭＨＣ）は、通常、多量体フォーマットで表される。ＴＣＲ特異性は、ＭＨＣクラスＩ［９７］及びＭＨＣクラスＩＩ［９８］との複合体のペプチド用にエンジニアリングされている。ＴＣＲは、変異マウスＴ細胞（ＴＣＲα及びβ鎖を欠く）の表面でも発現しており、結合特性が改善された変異ＴＣＲが単離されている［９９］。例えば、Ｃｈｅｒｖｉｎらは、レトロウイルス感染によってＴＣＲを導入し、１０４個のクローンの有効ライブラリーサイズを生成した［１００］。ここで提案されるようにバインダーのヌクレアーゼによる組み込みを使用して、同様のアプローチを使用してＴ細胞をエンジニアリングすることができる。ディスプレイライブラリーは、認識特性が変化したＴＣＲを選択するだけでなく、ＴＣＲによる認識のためのペプチド又はＭＨＣ変異体のライブラリーのスクリーニングに使用することができる。例えば、ペプチド：ＭＨＣ複合体は、昆虫細胞にディスプレイされ、多量体フォーマットで提示されるＴＣＲをエピトープマッピングするために使用されている［１０１］。
【0190】
上記のように、スクリーニング方法は、細胞表面のバインダーのレパートリーをディスプレイし、且つ多量体標的であり得る、可溶性分子として提示される標的を用いてプロービングすることを含み得る。多量体標的に特に有用であり得る代替は、バインダー及び標的が異なる細胞の表面に提示される細胞間相互作用を直接スクリーニングすることである。例えば、目的のＴＣＲの活性化がレポーター遺伝子の発現をもたらした場合、これを使用して、ペプチド：ＭＨＣライブラリー内に提示される活性化ペプチド又は活性化ＭＨＣ分子を同定することができる。この特定の例では、レポーター細胞は、ライブラリーメンバーをコードしないが、ライブラリーメンバーをコードする細胞を識別するために使用することができる。このアプローチは、「ライブラリー対ライブラリー」のアプローチに潜在的に拡張し得る。例えば、上記の例を拡張して、ＴＣＲライブラリーをペプチド：ＭＨＣライブラリーに対してスクリーニングすることができる。より広い意味では、ある細胞表面に提示されたバインダーのライブラリーを、別の細胞上の結合パートナーを使用してスクリーニングする例は、他のタイプの細胞間相互作用、例えばＮｏｔｃｈ又はＷｎｔ経路内のシグナル伝達を阻害又は活性化するバインダーの同定に拡張することができる。従って、本発明は、細胞間相互作用に基づく認識系を含む代替の細胞ベースのスクリーニング系に使用することができる。
【0191】
一例として、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲＳ」）は、抗体結合ドメイン（通常、ｓｃＦｖとしてフォーマットされる）とシグナル伝達ドメインとの間の融合を表す。これらは、抗体認識及び腫瘍特異的抗原への結合により、腫瘍細胞を攻撃するようにインビボでＴ細胞をリダイレクトすることを目的としてＴ細胞に導入されている。抗体の特異性、フォーマット、抗体親和性、リンカー長、融合シグナル伝達モジュール、Ｔ細胞での発現レベル、Ｔ細胞のサブタイプ及びＣＡＲと他のシグナル伝達分子との相互作用の組み合わせを含むいくつかの異なる因子がこの戦略の成功に影響を与え得る［１０２、１０３］。上記の変数を個別に又は組み合わせて取り込んだ初代Ｔ細胞のＣＡＲの大きいライブラリーを形成する能力は、効果的で最適なＣＡＲ構築についての機能的な検索を可能にするであろう。この機能的な「検索」は、インビトロ又はインビボで行うことができる。例えば、Ａｌｏｎｓｏ－Ｃａｍｉｎｏ（２００９）は、ＣＥＡを認識するｓｃＦｖをＴＣＲ：ＣＤ３複合体の鎖に融合し、この遺伝子構築物をヒトＪｕｒｋａｔ細胞株に導入した［１０４］。ＨｅＬａ細胞又は腫瘍細胞のいずれかに存在するＣＥＡと相互作用すると、これらは、初期Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９のアップレギュレーションを示した。このアプローチを使用して、培養細胞又は初代細胞を用いて、適切な活性化又は阻害特性を有するＣＡＲ融合構築物を同定することができる。
【0192】
ＣＡＲ構築物のさらなる機能をインビボで評価することができる。例えば、初代マウスＴ細胞で構築されたＣＡＲのライブラリーを腫瘍担持マウスに導入して、腫瘍との接触によって増殖するように刺激されたＴ細胞クローンを同定することができる。必要に応じて、このＴ細胞ライブラリーは、上記の方法を使用して、抗原結合特異性に基づいて予め選択することができる。いずれの場合も、バインダーの新しいライブラリーを使用して、既存のバインダー分子（例えば、ＭＨＣ又はＴＣＲ又は抗体可変ドメイン）を置き換えることができる。
【0193】
表現型のスクリーニング
標的に対するバインダーを同定する好ましい方法では、バインダーは、標的に対するバインダーの作用の結果として、細胞シグナル伝達及び／又は細胞挙動を上手に変更する。より好ましい方法では、バインダーは抗体である。
標的に対するバインダーを同定する好ましい方法では、バインダーは、標的に対するバインダーの作用の結果として、細胞シグナル伝達及び／又は細胞挙動を上手に変更する。より好ましい方法では、バインダーは抗体である。
【0194】
リガンド又は受容体に結合することによって細胞シグナル伝達を変更する抗体は、医薬品開発において実績があり、このような治療用抗体の需要は増大し続けている。このような抗体及び他のクラスの機能性バインダーは、インビボ及びインビトロで細胞挙動を制御する可能性も秘めている。しかしながら、細胞挙動を制御して誘導する能力は、特定のシグナル伝達経路を制御する天然リガンドの利用可能性に依存する。残念ながら、幹細胞の分化を制御するリガンド（例えば、ＦＧＦ、ＴＧＦ－β、Ｗｎｔ、Ｎｏｔｃｈスーパーファミリーのメンバー）などの多くの天然リガンドは、多くの場合、無差別な相互作用を示し、発現／安定性プロファイルが不十分なため、利用可能性が限定されている。抗体は、その特異性から、細胞挙動の制御において大きい可能性を秘めている。
【0195】
細胞シグナル伝達を変更する機能性抗体の同定は、クローンの選別、抗体の発現、配列及び結合特性による特性評価、哺乳動物発現系への変換及び機能性細胞ベースのアッセイへの追加を含め、従来、比較的多くの時間と労力を要していた。本明細書に記載の真核細胞ディスプレイのアプローチは、この労力を減少させるが、抗体の作製及び別のレポーター細胞培養物への添加は依然として必要である。従って、好ましい代替は、産生細胞自体をレポーター細胞として使用することにより、細胞シグナル伝達又は細胞挙動に対する結合の影響について、真核細胞で発現されたバインダーのライブラリーを直接スクリーニングすることであり得る。抗体遺伝子の導入後、レポーター遺伝子発現の変化又は表現型の変化を示す得られた細胞集団内のクローンを同定することができる。
【0196】
いくつかの最近の出版物に、抗体遺伝子のレパートリーをレポーター細胞にクローニングすることによる抗体ライブラリーの構築が記載されている［４７、１０５、１０６］。これらの系は、１つの細胞内で発現とレポーティングを組み合わせ、典型的には、所定の標的に対して選択された抗体の集団を（例えば、ファージディスプレイを使用して）導入する。
【0197】
抗体遺伝子の集団をレポーター細胞に導入して、本明細書に記載の方法によってライブラリーを作製することができ、表現型における抗体による変化（例えば、遺伝子発現又は生存の変化）を有する集団内のクローンを同定することができる。この表現型誘導選択を機能させるために、発現細胞内に存在する抗体遺伝子（遺伝子型）と抗体発現の結果（表現型）との間の連鎖を維持する必要がある。これは、抗体ディスプレイについて記載したように、抗体を細胞表面に係留する［４７］か、又は半固体培地を使用して分泌型抗体を産生細胞の近傍に保持する［１０５］ことによって既に達成されている。代わりに、抗体及び他のバインダーを細胞内に保持することができる［１０７］。細胞表面又は周囲の培地中に保持されたバインダーは、細胞表面の内因性又は外因性受容体と相互作用して、受容体の活性化を引き起こし得る。これにより、レポーター遺伝子の発現の変化又は細胞の表現型の変化が引き起こされ得る。代替として、抗体は、受容体又はリガンドをブロックして、受容体の活性化を減少させることができる。次いで、細胞の挙動を変化させるバインダーをコードする遺伝子を、作製又はさらなるエンジニアリングのために回収することができる。
【0198】
この「標的による」アプローチの代替として、特定の標的に対して事前に選択されていない「ナイーブ」抗体集団を導入することが可能である［１０８］。細胞レポーティング系を使用して、挙動が変化した集団のメンバーを同定する。標的に関する事前の知識がないため、この非標的アプローチでは、標的に対する抗体集団の事前濃縮が不可能であるため、大きい抗体のレパートリーが特に必要とされる。このアプローチは、本発明に記載されるヌクレアーゼによる導入遺伝子組み込みの使用から恩恵を受けることになる。
【0199】
「機能的選択」アプローチを、真核細胞、特に哺乳動物細胞などの高等真核細胞のライブラリーを必要とする他の適用例に使用することができる。抗体は、標的への結合が受容体の活性化を引き起こすようなシグナル伝達ドメインに融合させることができる。Ｋａｗａｈａｒａらは、フルオレセインを標的とする細胞外ｓｃＦｖがスペーサードメイン（Ｅｐｏ受容体のＤ２ドメイン）と、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）受容体、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ－２受容体及びＥＧＦ受容体を含む様々な細胞内サイトカイン受容体ドメインに融合されたキメラ受容体を構築した［１０９、１１０、１１１］。これらを、ＩＬ－３依存性ｐｒｏＢ細胞株（ＢａＦ３）［２７］に導入し、キメラ受容体は、ＩＬ－３非依存性増殖をもたらす、キメラ受容体の抗原依存性活性化を呈することが示された。これと同じアプローチがモデル実験で使用され、ＢａＦ３細胞［１１０］の抗原媒介化学誘引が実証された。このアプローチは、安定培養細胞を超えて、Ｔｐｏ応答性造血幹細胞［１１２］又はＩＬ２依存性初代Ｔ細胞の生存及び増殖によって例示される初代細胞まで拡張され、Ｔｐｏ及びＩＬ－２による正常な刺激は、それぞれｓｃＦｖキメラ受容体のフルオレセインよる刺激に置き換えられた。従って、キメラ抗体－受容体キメラに基づく系を使用して、初代細胞又は安定レポーター細胞における標的依存性遺伝子発現又は表現型の変化を促進することができる。この能力を使用して、シグナル伝達応答を促進する融合バインダー又はこの応答を阻害するバインダーを同定することができる。
【0200】
上記のアプローチの修正版では、抗リゾチーム抗体からの別々のＶＨ及びＶＬドメインをＥｐｏ細胞内ドメインに融合させた［１１３］。細胞は、リゾチームの添加に応答して増殖し、抗原誘導二量体化又は別々のＶＨ及びＶＬ融合パートナーの安定化を示した。従って、３つの相互作用する要素が、この系での最適な応答のために一緒になる。
【0201】
本明細書では抗体分子を参照して説明するが、標的に対するバインダー（即ち抗体分子）を同定する上記の方法は、他のタイプのバインダーのライブラリーを用いて適合させ、実施することもできる。
【0202】
タンパク質断片の相補性は、哺乳動物細胞におけるタンパク質間相互作用を研究し、且つそれを選択するための代替の系を表す［１１４、１１５］。これは、タンパク質間相互作用によるスプリットレポータータンパク質の機能を回復させることを含む。使用されているレポータータンパク質には、ユビキチン、ＤＮＡＥインテイン、β－ガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＧＦＰ、ホタルルシフェラーゼ、β－ラクタマーゼ、ＴＥＶプロテアーゼが含まれる。例えば、このアプローチの最近の例は、哺乳動物膜ツーハイブリッド（ＭａＭＴＨ）アプローチであり、ベイトタンパク質：スプリットユビキチン：パートナータンパク質と融合した転写因子：スプリットユビキチンの会合により、ユビキチン認識が回復し、転写因子が遊離してレポーター遺伝子発現が起こる［１１６］。この場合も同様に、この相互作用を妨害又は増強するバインダーは、摂動シグナル伝達によって同定することができる。
【0203】
バインダー及びコードＤＮＡの回収及び再フォーマット
バインダーが、標的に対するバインダーを同定する方法によって同定された後、一般的な次のステップでは、バインダーをコードするＤＮＡを単離（例えば、同定又は増幅）する。任意選択により、例えばバインダーを再構成し、且つ／又はコード配列を異なるベクターに挿入するために、バインダーをコードする核酸を修飾することが望ましいであろう。従って、標的に対するバインダーを同定する好ましい方法は、標的を認識するバインダーをコードするＤＮＡを単離することを含む。より好ましい方法を以下に記載する。
バインダーが、標的に対するバインダーを同定する方法によって同定された後、一般的な次のステップでは、バインダーをコードするＤＮＡを単離（例えば、同定又は増幅）する。任意選択により、例えばバインダーを再構成し、且つ／又はコード配列を異なるベクターに挿入するために、バインダーをコードする核酸を修飾することが望ましいであろう。従って、標的に対するバインダーを同定する好ましい方法は、標的を認識するバインダーをコードするＤＮＡを単離することを含む。より好ましい方法を以下に記載する。
【0204】
バインダーが抗体分子である場合、標的に対するバインダーを同定する好ましい方法は、抗体分子をコードするＤＮＡをクローンの細胞から単離するステップ、少なくとも１つの抗体可変領域、好ましくはＶＨ及びＶＬドメインの両方をコードするＤＮＡを増幅するステップ及びＤＮＡをベクターに挿入して抗体分子をコードするベクターを提供するステップを含む。定常ドメインを有する多量体抗体分子は、可溶性分泌型で発現するために一本鎖抗体分子に変換することができる。
【0205】
抗体は、様々なフォーマットで提示され得るが、抗体がどんなフォーマットで選択されても、抗体遺伝子が単離されると、いくつかの異なるフォーマットで再構成することが可能である。ＶＨ又はＶＬドメインが単離されると、必要なパートナードメインを含む発現ベクターに再クローニングすることができる。
【0206】
標的に対するバインダーを同定するより好ましい方法は、一対のサブユニット（例えば、ｓｃＦｖ分子）からなるバインダーを、サブユニットの元の対が維持される異なる分子バインダーフォーマット（例えば、Ｉｇ又はＦａｂ）に再フォーマットすることを含む再フォーマットステップを含む。このような方法は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載され、モノクローナルクローン、オリゴクローナルクローン又はポリクローナルクローンの再フォーマットに使用することができる。この方法を使用して、ファージ、酵母又はリボソームディスプレイを含む一般的に使用される任意のディスプレイ技術から、出力集団全体を「まとめて」変換することができる。
【0207】
本発明の追加の実施形態は、記載の一部を構成する以下の番号付きの項に記載される。
１．真核細胞のゲノムの遺伝子座を同定する方法であって、前記遺伝子座は、バインダー配列の挿入の候補であり、前記方法は、
ａ．ランディングパッド配列を提供するステップ；
ｂ．ランディングパッド配列を真核細胞に導入するステップ；
ｃ．トランスポゾンを介した組み込みにより、真核細胞のゲノムにランディングパッド配列をランダムに組み込むステップ；
ｄ．クローンであって、そのゲノムに組み込まれたランディングパッド配列を有するクローンを選択するステップ
を含む、方法。
２．ｅ．単一コピーの組み込みについてスクリーニングするさらなるステップ；
ｆ．遺伝子座を同定するさらなるステップ
をさらに含む、第１項に記載の方法。
３．ｇ．バインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含むドナーＤＮＡ配列をランディングパッド配列に組み込む追加のステップ；
ｈ．ドナーＤＮＡの組み込みについてスクリーニングする追加のステップ
をさらに含む、第２項に記載の方法。
４．ランディングパッド配列は、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を含む、第１項～第３項のいずれか一項に記載の方法。
５．ヌクレアーゼ認識配列は、メガヌクレアーゼ認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識配列、ＴＡＬＥヌクレアーゼ認識配列又は核酸ガイド付きヌクレアーゼ認識配列、より好ましくはメガヌクレアーゼ認識配列である、第４項に記載の方法。
６．ヌクレアーゼ認識配列は、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列である、第５項に記載の方法。
７．ドナーＤＮＡを細胞内に組み込むステップｇは、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含み、ヌクレアーゼは、ランディングパッドに含まれる認識配列を切断する、第４項～第６項のいずれか一項に記載の方法。
８．ドナーＤＮＡの組み込みについてスクリーニングするステップｈは、ドナーＤＮＡによってコードされる１つ又は複数のバインダーのディスプレイについてスクリーニングすることを含む、第３項～第７項のいずれか一項に記載の方法。
９．ドナーＤＮＡは、組み込み効率を高めるために相同性アームをさらに含む、第３項～第８項のいずれか一項に記載の方法。
１０．ランディングパッド配列及び／又はドナーＤＮＡ配列は、選択可能なマーカーを含む、第１項～第９項のいずれか一項に記載の方法。
１１．バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを構築するための、第１項～第１０項のいずれか一項に記載の方法で同定された遺伝子座の使用。
１２．少なくとも１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個又は１０９個の異なるバインダーの多様なレパートリーを発現する真核細胞クローンのインビトロライブラリーであって、各細胞は、組換えＤＮＡを含み、バインダー又はバインダーのサブユニットをコードするドナーＤＮＡは、細胞ＤＮＡの固定遺伝子座に組み込まれ、遺伝子座は、第１項～第１０項のいずれか一項に記載の方法によって同定される、真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１３．バインダー又はバインダーのサブユニットをコードするドナーＤＮＡは、細胞ＤＮＡの少なくとも第１及び／又は第２の固定遺伝子座に組み込まれ、前記１つ又は複数の固定遺伝子座は、項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって同定される、第１２項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー
１４．１つ又は複数の遺伝子座は、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子から選択される遺伝子内にある、第１２項又は第１３項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１５．１つ又は複数の遺伝子座は、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子又はＲＡＢ４０Ｂ遺伝子内、好ましくはＮＬＮ遺伝子内にある、第１２項～第１４項のいずれか一項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１６．１つ又は複数の遺伝子座は、遺伝子のイントロン内にある、第１２項～第１５項のいずれか一項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１７．１つ又は複数の遺伝子座は、イントロンのオープンクロマチン領域内にある、第１２項～第１６項のいずれか一項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１８．１つ又は複数の遺伝子座は、イントロンのエンハンサー領域内にある、第１２項～第１７項のいずれか一項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１９．１つ又は複数の遺伝子座は、ＮＬＮ遺伝子のＮＬＮ－２０７のイントロン１、２又は６内にある、第１２項～第１８項のいずれか一項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
２０．第１２項～第１９項のいずれか一項に記載のライブラリーから同定されたバインダー。
２１．バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法であって、
バインダーをコードするドナーＤＮＡ分子及び真核細胞を提供するステップ；
ドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、認識配列は、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成するために、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子内にあり、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ；及び
組換え細胞を培養してクローンを作製し、それによりバインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供するステップ
を含む方法。
２２．認識配列は、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子又はＲＡＢ４０Ｂ遺伝子内にある、第２１項に記載の方法。
２３．認識配列は、ＮＬＮ遺伝子内にある、第２１項又は第２２項に記載の方法。
２４．認識配列は、遺伝子のイントロン内にある、第２１項～第２３項のいずれか一項に記載の方法。
２５．認識配列は、イントロンのオープンクロマチン領域内にある、第２４項に記載の方法。
２６．認識配列は、イントロンのエンハンサー領域内にある、第２４項又は第２５項に記載の方法。
２７．認識配列は、ＮＬＮ遺伝子のＮＬＮ－２０７のイントロン１、２又は６内にある、第２４項～第２６項のいずれか一項に記載の方法。
２８．バインダーは、抗体分子である、第２１項～第２７項のいずれか一項に記載の方法。
２９．抗体分子は、完全長免疫グロブリン、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はｓｃＦｖである、第２８項に記載の方法。
３０．バインダーは、多量体であり、少なくとも第１及び第２のサブユニットを含む、第２１項～第２９項のいずれか一項に記載の方法。
３１．多量体バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法であって、各バインダーは、第１及び第２のサブユニットを含み、この方法は、
第１のサブユニットをコードするＤＮＡを含む真核細胞を提供し、且つ第２のバインダーサブユニットをコードするドナーＤＮＡ分子を提供するステップ、
ドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、第１２項～第１８項のいずれか一項で定義された細胞ＤＮＡの認識配列を切断して、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成し、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ、及び
組換え細胞を培養して、多量体バインダーの第１及び第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含むクローンを作製するステップ
を含む、方法。
３２．多量体バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法であって、各バインダーは、少なくとも第１及び第２のサブユニットを含み、この方法は、
第１のサブユニットをコードする第１のドナーＤＮＡ分子を提供し、且つ真核細胞を提供するステップ、
第１のドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、第１２項～第１８項のいずれか一項で定義された細胞ＤＮＡの認識配列を切断して、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成し、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれた第１のドナーＤＮＡを含む組換え細胞の第１のセットを作成する、ステップ、
組換え細胞の第１のセットを培養して、第１サブユニットをコードするＤＮＡを含むクローンの第１のセットを作製するステップ、
第２のサブユニットをコードする第２のドナーＤＮＡ分子をクローンの第１のセットの細胞に導入するステップであって、第２のドナーＤＮＡは、クローンの第１のセットの細胞ＤＮＡに組み込まれ、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれた第１及び第２のドナーＤＮＡを含む組換え細胞の第２のセットを作成する、ステップ、及び
組換え細胞の第２のセットを培養して、クローンの第２のセットを作製するステップであって、クローンは、多量体バインダーの第１及び第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含み、それにより多量体バインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供する、ステップ
を含む、方法。
３３．第２のドナーＤＮＡ分子は、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップを含む方法によって組み込まれ、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断して、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成し、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こる、第３２項に記載の方法。
３４．バインダーのレパートリーは、共通の構造を共有する複数のポリペプチドであり、これらのポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸配列多様性の領域を有する、第２１項～第３３項のいずれか一項に記載の方法。
３５．バインダーのレパートリーは、１つ又は複数の相補性決定領域の異なる抗体分子のレパートリーである、第２１項～第３４項のいずれか一項に記載の方法。
３６．多量体バインダーは、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを別個のサブユニットとして含む抗体分子である、第２９項～第３５項のいずれか一項に記載の方法。
３７．多量体バインダーは、全免疫グロブリンである、第３６項に記載の方法。
３８．多量体バインダーは、ＩｇＧである、第３６項に記載の方法。
３９．多量体バインダーは、Ｆａｂである、第３６項に記載の方法。
４０．第１のサブユニットは、ＶＨドメインを含み、第２のサブユニットは、ＶＬドメインを含む、第３６項～第３９項のいずれか一項に記載の方法。
４１．第１のサブユニットは、ＶＬドメインを含み、第２のサブユニットは、ＶＨドメインを含む、第３６項～第３９項のいずれか一項に記載の方法。
４２．抗体分子は、１つ又は複数の追加のサブユニットをさらに含み、これらのサブユニットは、第１又は第２のサブユニットと同じドナーＤＮＡに導入され得るか、又は細胞ＤＮＡ内の別々の部位に組み込まれ得る、第３６項～第４１項のいずれか一項に記載の方法。
４３．細胞は、２×１０７個を超える塩基対のゲノムサイズを有する高等真核細胞である、第２１項～第４２項のいずれか一項に記載の方法。
４４．細胞は、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫又は植物細胞である、第２１項～第４３項のいずれか一項に記載の方法。
４５．細胞は、哺乳動物であり、好ましくは、細胞は、ヒト細胞である、第４４項に記載の方法。
４６．細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｔリンパ球系細胞若しくはＢリンパ球系細胞又は「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ」若しくは「ＣＯＳＭＩＣ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ」に記載されている細胞株のいずれかの１つである、第４５項に記載の方法。
４７．細胞は、初代Ｔ細胞又はＴ細胞株である、第４６項に記載の方法。
４８．細胞は、初代Ｂ細胞、Ｂ細胞株、プレＢ細胞株又はプロＢ細胞株である、第４６項に記載の方法。
４９．細胞は、マウスプレＢ細胞株１６２４－５、ＩＬ－３依存性プロＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３又はニワトリＤＴ４０ Ｂ細胞である、第４８項に記載の方法。
５０．部位特異的ヌクレアーゼの認識配列は、細胞ＤＮＡで１回又は２回のみ発生する、第２１項～第４９項のいずれか一項に記載の方法。
５１．部位特異的ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡを切断して、組み込み部位として機能する二本鎖切断を作成する、第２１項～第５０項のいずれか一項に記載の方法。
５２．ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである、第２１項～第５１項のいずれか一項に記載の方法。
５３．ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、第２１項～第５１項のいずれか一項に記載の方法。
５４．ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである、第２１項～第５１項のいずれか一項に記載の方法。
５５．ヌクレアーゼは、核酸ガイドヌクレアーゼである、第２１項～第５１項のいずれか一項に記載の方法。
５６．ＤＮＡ切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって誘導される、第５５項に記載の方法。
５７．ドナーＤＮＡは、相同組換えによって細胞ＤＮＡに組み込まれる、第２１項～第５６項のいずれか一項に記載の方法。
５８．ドナーＤＮＡは、非相同末端結合又はマイクロホモロジーによる末端結合によってゲノムＤＮＡに組み込まれる、第２１項～第５６項のいずれか一項に記載の方法。
５９．ドナーＤＮＡは、ドナーＤＮＡが組み込まれる細胞の選択のための遺伝要素を含む、第２１項～第５８項のいずれか一項に記載の方法。
６０．ドナーＤＮＡの細胞ＤＮＡへの組み込みは、バインダーの発現及び／又は遺伝子選択要素の発現を、細胞ＤＮＡ内に存在するプロモーターの制御下に置く、第２１項～第５９項のいずれか一項に記載の方法。
６１．ドナーＤＮＡは、プロモーターに機能的に連結されたバインダーをコードする配列を含む、第２１項～第５８項のいずれか一項に記載の方法。
６２．ライブラリーは、少なくとも１００個、１０３個、１０４個、１０５個又は１０６個のクローンを含み、各クローンは、ドナーＤＮＡの組み込みによって作製された個々の組換え細胞に由来する、第２１項～第６１項のいずれか一項に記載の方法。
６３．ライブラリーは、少なくとも１００個、１０３個、１０４個、１０５個又は１０６個の異なるバインダーをコードする、第２１項～第６２項のいずれか一項に記載の方法。
６４．各クローンは、バインダーのレパートリーの１つ又は２つのメンバーのみをコードする組み込まれたドナーＤＮＡを含む、第２１項～第６３項のいずれか一項に記載の方法。
６５．真核細胞は、二倍体であり、且つ細胞ＤＮＡの二重固定遺伝子座における部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を含む、第２１項～第６４項のいずれか一項に記載の方法。
６６．各クローンは、バインダーのレパートリーの単一のメンバーをコードする組み込まれたドナーＤＮＡを含む、第２１項～第６３項のいずれか一項に記載の方法。
６７．ドナーＤＮＡ分子は、それぞれ単一のバインダー又はバインダーサブユニットをコードする、第２１項～第６６項のいずれか一項に記載の方法。
６８．バインダーは、細胞表面にディスプレイされる、第２１項～第６７項のいずれか一項に記載の方法。
６９．バインダーは、細胞から分泌される、第２１項～第６８項のいずれか一項に記載の方法。
７０．ライブラリーを培養してバインダーを発現させるステップ、
目的のバインダーを発現する１つ又は複数のクローンを回収するステップ、及び
１つ又は複数の回収したクローンから誘導体ライブラリーを生成するステップであって、誘導体ライブラリーは、バインダーの第２のレパートリーをコードするＤＮＡを含む、ステップ
をさらに含む、第２１項～第６９項のいずれか一項に記載の方法。
７１．誘導体ライブラリーを生成するステップは、１つ又は複数の回収したクローンからドナーＤＮＡを単離することと、ＤＮＡに変異を導入して、バインダーの第２のレパートリーをコードするドナーＤＮＡ分子の誘導体集団を提供することと、ドナーＤＮＡ分子の誘導体集団を細胞に導入して、バインダーの第２のレパートリーをコードするＤＮＡを含む細胞の誘導体ライブラリーを形成することとを含む、第７０項に記載の方法。
７２．誘導体ライブラリーを生成するステップは、クローン内にＤＮＡの変異を誘導することにより、１つ又は複数の回収したクローンのドナーＤＮＡに変異を導入することを含む、第７０項に記載の方法。
７３．第２１項～第７２項のいずれか一項に記載の方法によってライブラリーを作製するステップと、ライブラリー細胞を培養してバインダーを発現させるステップとを含む、バインダーの多様なレパートリーを作製する方法。
７４．第２１項～第７２項のいずれか一項に記載の方法によって作製されたライブラリー。
７５．所望の表現型の細胞についてスクリーニングする方法であって、表現型は、細胞によるバインダーの発現から生じ、この方法は、
第２１項～第７２項のいずれか一項に記載のライブラリーを作製する方法によってライブラリーを提供するか、又は第１１項に記載の使用によってライブラリーを提供するか、又は第１２項～第１９項若しくは第７４項のいずれか一項に記載のライブラリーを提供するステップ、
ライブラリー細胞を培養してバインダーを発現させるステップ、及び
所望の表現型が示されているかどうかを検出するステップ
を含む、方法。
７６．表現型は、バインダーを発現する細胞におけるレポーター遺伝子の発現である、第７５項に記載の方法。
７７．所望の表現型を作製するバインダーを発現するクローンの細胞を回収するステップをさらに含む、第７５項又は第７６項に記載の方法。
７８．回収したクローンからバインダーをコードするＤＮＡを単離し、それにより所望の表現型を作製するバインダーをコードするＤＮＡを得るステップをさらに含む、第７７項に記載の方法。
７９．目的の標的に対するバインダーを同定するスクリーニング方法であって、
第２１項～第７２項のいずれか一項に記載のライブラリーを作製する方法によってライブラリーを提供するか、又は第１１項に記載の使用によってライブラリーを提供するか、又は第１２項～第１９項若しくは第７４項のいずれか一項に記載のライブラリーを提供するステップ、
ライブラリーの細胞を培養してバインダーを発現させるステップ、
バインダーを標的に曝露し、１つ又は複数の同種バインダーが存在する場合、それによる標的の認識を可能にするステップ、及び
標的が同種バインダーによって認識されるかどうかを検出するステップ
を含む方法。
８０．標的は、可溶性の形態で提供される、第７５項又は第７９項に記載の方法。
８１．標的は、標的細胞の集団の表面にディスプレイされ、バインダーは、ライブラリー細胞の表面にディスプレイされ、この方法は、ライブラリー細胞を標的細胞に接触させることによってバインダーを標的に曝露するステップを含む、第７５項又は第７９項に記載の方法。
８２．バインダーは、抗体分子であり、及び標的は、抗原である、第７５項～第８１項のいずれか一項に記載の方法。
８３．バインダーは、ＴＣＲであり、及び標的は、ＭＨＣ：ペプチド複合体である、第７５項～第８１項のいずれか一項に記載の方法。
８４．同種バインダーによる標的認識を検出するステップと、同種バインダーをコードするＤＮＡを含むクローンの細胞を回収するステップとをさらに含む、第７９項～第８３項のいずれか一項に記載の方法。
８５．バインダーをコードするＤＮＡを回収したクローンから単離し、それにより標的を認識するバインダーをコードするＤＮＡを得るステップをさらに含む、第８４項に記載の方法。
８６．変異を導入するか、又はＤＮＡを変換して、再構成バインダーをコードする改変ＤＮＡにするステップを含む、第７８項又は第８５項に記載の方法。
８７．バインダーは、ｓｃＦｖであり、この方法は、元の可変ＶＨ及びＶＬ鎖の対を維持しながら、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＩｇ又はその断片をコードするＤＮＡに変換するステップを含む、第８６項に記載の方法。
８８．ＤＮＡを宿主細胞に導入するステップをさらに含む、第７８項、第８５項、第８６項又は第８７項に記載の方法。
１．真核細胞のゲノムの遺伝子座を同定する方法であって、前記遺伝子座は、バインダー配列の挿入の候補であり、前記方法は、
ａ．ランディングパッド配列を提供するステップ；
ｂ．ランディングパッド配列を真核細胞に導入するステップ；
ｃ．トランスポゾンを介した組み込みにより、真核細胞のゲノムにランディングパッド配列をランダムに組み込むステップ；
ｄ．クローンであって、そのゲノムに組み込まれたランディングパッド配列を有するクローンを選択するステップ
を含む、方法。
２．ｅ．単一コピーの組み込みについてスクリーニングするさらなるステップ；
ｆ．遺伝子座を同定するさらなるステップ
をさらに含む、第１項に記載の方法。
３．ｇ．バインダーをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含むドナーＤＮＡ配列をランディングパッド配列に組み込む追加のステップ；
ｈ．ドナーＤＮＡの組み込みについてスクリーニングする追加のステップ
をさらに含む、第２項に記載の方法。
４．ランディングパッド配列は、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を含む、第１項～第３項のいずれか一項に記載の方法。
５．ヌクレアーゼ認識配列は、メガヌクレアーゼ認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識配列、ＴＡＬＥヌクレアーゼ認識配列又は核酸ガイド付きヌクレアーゼ認識配列、より好ましくはメガヌクレアーゼ認識配列である、第４項に記載の方法。
６．ヌクレアーゼ認識配列は、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列である、第５項に記載の方法。
７．ドナーＤＮＡを細胞内に組み込むステップｇは、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含み、ヌクレアーゼは、ランディングパッドに含まれる認識配列を切断する、第４項～第６項のいずれか一項に記載の方法。
８．ドナーＤＮＡの組み込みについてスクリーニングするステップｈは、ドナーＤＮＡによってコードされる１つ又は複数のバインダーのディスプレイについてスクリーニングすることを含む、第３項～第７項のいずれか一項に記載の方法。
９．ドナーＤＮＡは、組み込み効率を高めるために相同性アームをさらに含む、第３項～第８項のいずれか一項に記載の方法。
１０．ランディングパッド配列及び／又はドナーＤＮＡ配列は、選択可能なマーカーを含む、第１項～第９項のいずれか一項に記載の方法。
１１．バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを構築するための、第１項～第１０項のいずれか一項に記載の方法で同定された遺伝子座の使用。
１２．少なくとも１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個又は１０９個の異なるバインダーの多様なレパートリーを発現する真核細胞クローンのインビトロライブラリーであって、各細胞は、組換えＤＮＡを含み、バインダー又はバインダーのサブユニットをコードするドナーＤＮＡは、細胞ＤＮＡの固定遺伝子座に組み込まれ、遺伝子座は、第１項～第１０項のいずれか一項に記載の方法によって同定される、真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１３．バインダー又はバインダーのサブユニットをコードするドナーＤＮＡは、細胞ＤＮＡの少なくとも第１及び／又は第２の固定遺伝子座に組み込まれ、前記１つ又は複数の固定遺伝子座は、項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって同定される、第１２項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー
１４．１つ又は複数の遺伝子座は、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子から選択される遺伝子内にある、第１２項又は第１３項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１５．１つ又は複数の遺伝子座は、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子又はＲＡＢ４０Ｂ遺伝子内、好ましくはＮＬＮ遺伝子内にある、第１２項～第１４項のいずれか一項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１６．１つ又は複数の遺伝子座は、遺伝子のイントロン内にある、第１２項～第１５項のいずれか一項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１７．１つ又は複数の遺伝子座は、イントロンのオープンクロマチン領域内にある、第１２項～第１６項のいずれか一項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１８．１つ又は複数の遺伝子座は、イントロンのエンハンサー領域内にある、第１２項～第１７項のいずれか一項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
１９．１つ又は複数の遺伝子座は、ＮＬＮ遺伝子のＮＬＮ－２０７のイントロン１、２又は６内にある、第１２項～第１８項のいずれか一項に記載の真核細胞クローンのインビトロライブラリー。
２０．第１２項～第１９項のいずれか一項に記載のライブラリーから同定されたバインダー。
２１．バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法であって、
バインダーをコードするドナーＤＮＡ分子及び真核細胞を提供するステップ；
ドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断し、認識配列は、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成するために、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子、ＰＡＲＰ１１遺伝子、ＲＡＢ４０Ｂ遺伝子、ＡＢＩ２遺伝子、ＲＮＦ１９Ｂ遺伝子、ＰＫＩＡ遺伝子又はＦＴＣＤ遺伝子内にあり、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ；及び
組換え細胞を培養してクローンを作製し、それによりバインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供するステップ
を含む方法。
２２．認識配列は、ＮＬＮ遺伝子、ＴＮＩＫ遺伝子又はＲＡＢ４０Ｂ遺伝子内にある、第２１項に記載の方法。
２３．認識配列は、ＮＬＮ遺伝子内にある、第２１項又は第２２項に記載の方法。
２４．認識配列は、遺伝子のイントロン内にある、第２１項～第２３項のいずれか一項に記載の方法。
２５．認識配列は、イントロンのオープンクロマチン領域内にある、第２４項に記載の方法。
２６．認識配列は、イントロンのエンハンサー領域内にある、第２４項又は第２５項に記載の方法。
２７．認識配列は、ＮＬＮ遺伝子のＮＬＮ－２０７のイントロン１、２又は６内にある、第２４項～第２６項のいずれか一項に記載の方法。
２８．バインダーは、抗体分子である、第２１項～第２７項のいずれか一項に記載の方法。
２９．抗体分子は、完全長免疫グロブリン、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はｓｃＦｖである、第２８項に記載の方法。
３０．バインダーは、多量体であり、少なくとも第１及び第２のサブユニットを含む、第２１項～第２９項のいずれか一項に記載の方法。
３１．多量体バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法であって、各バインダーは、第１及び第２のサブユニットを含み、この方法は、
第１のサブユニットをコードするＤＮＡを含む真核細胞を提供し、且つ第２のバインダーサブユニットをコードするドナーＤＮＡ分子を提供するステップ、
ドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、第１２項～第１８項のいずれか一項で定義された細胞ＤＮＡの認識配列を切断して、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成し、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を作成する、ステップ、及び
組換え細胞を培養して、多量体バインダーの第１及び第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含むクローンを作製するステップ
を含む、方法。
３２．多量体バインダーの多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを作製する方法であって、各バインダーは、少なくとも第１及び第２のサブユニットを含み、この方法は、
第１のサブユニットをコードする第１のドナーＤＮＡ分子を提供し、且つ真核細胞を提供するステップ、
第１のドナーＤＮＡを細胞内に導入し、且つ細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップであって、ヌクレアーゼは、第１２項～第１８項のいずれか一項で定義された細胞ＤＮＡの認識配列を切断して、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成し、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こり、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれた第１のドナーＤＮＡを含む組換え細胞の第１のセットを作成する、ステップ、
組換え細胞の第１のセットを培養して、第１サブユニットをコードするＤＮＡを含むクローンの第１のセットを作製するステップ、
第２のサブユニットをコードする第２のドナーＤＮＡ分子をクローンの第１のセットの細胞に導入するステップであって、第２のドナーＤＮＡは、クローンの第１のセットの細胞ＤＮＡに組み込まれ、それにより細胞ＤＮＡに組み込まれた第１及び第２のドナーＤＮＡを含む組換え細胞の第２のセットを作成する、ステップ、及び
組換え細胞の第２のセットを培養して、クローンの第２のセットを作製するステップであって、クローンは、多量体バインダーの第１及び第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含み、それにより多量体バインダーのレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーを提供する、ステップ
を含む、方法。
３３．第２のドナーＤＮＡ分子は、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供するステップを含む方法によって組み込まれ、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡの認識配列を切断して、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み込まれることになる組み込み部位を作成し、組み込みは、細胞に内在するＤＮＡ修復機構を通して起こる、第３２項に記載の方法。
３４．バインダーのレパートリーは、共通の構造を共有する複数のポリペプチドであり、これらのポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸配列多様性の領域を有する、第２１項～第３３項のいずれか一項に記載の方法。
３５．バインダーのレパートリーは、１つ又は複数の相補性決定領域の異なる抗体分子のレパートリーである、第２１項～第３４項のいずれか一項に記載の方法。
３６．多量体バインダーは、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを別個のサブユニットとして含む抗体分子である、第２９項～第３５項のいずれか一項に記載の方法。
３７．多量体バインダーは、全免疫グロブリンである、第３６項に記載の方法。
３８．多量体バインダーは、ＩｇＧである、第３６項に記載の方法。
３９．多量体バインダーは、Ｆａｂである、第３６項に記載の方法。
４０．第１のサブユニットは、ＶＨドメインを含み、第２のサブユニットは、ＶＬドメインを含む、第３６項～第３９項のいずれか一項に記載の方法。
４１．第１のサブユニットは、ＶＬドメインを含み、第２のサブユニットは、ＶＨドメインを含む、第３６項～第３９項のいずれか一項に記載の方法。
４２．抗体分子は、１つ又は複数の追加のサブユニットをさらに含み、これらのサブユニットは、第１又は第２のサブユニットと同じドナーＤＮＡに導入され得るか、又は細胞ＤＮＡ内の別々の部位に組み込まれ得る、第３６項～第４１項のいずれか一項に記載の方法。
４３．細胞は、２×１０７個を超える塩基対のゲノムサイズを有する高等真核細胞である、第２１項～第４２項のいずれか一項に記載の方法。
４４．細胞は、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫又は植物細胞である、第２１項～第４３項のいずれか一項に記載の方法。
４５．細胞は、哺乳動物であり、好ましくは、細胞は、ヒト細胞である、第４４項に記載の方法。
４６．細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｔリンパ球系細胞若しくはＢリンパ球系細胞又は「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ」若しくは「ＣＯＳＭＩＣ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ」に記載されている細胞株のいずれかの１つである、第４５項に記載の方法。
４７．細胞は、初代Ｔ細胞又はＴ細胞株である、第４６項に記載の方法。
４８．細胞は、初代Ｂ細胞、Ｂ細胞株、プレＢ細胞株又はプロＢ細胞株である、第４６項に記載の方法。
４９．細胞は、マウスプレＢ細胞株１６２４－５、ＩＬ－３依存性プロＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３又はニワトリＤＴ４０ Ｂ細胞である、第４８項に記載の方法。
５０．部位特異的ヌクレアーゼの認識配列は、細胞ＤＮＡで１回又は２回のみ発生する、第２１項～第４９項のいずれか一項に記載の方法。
５１．部位特異的ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡを切断して、組み込み部位として機能する二本鎖切断を作成する、第２１項～第５０項のいずれか一項に記載の方法。
５２．ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである、第２１項～第５１項のいずれか一項に記載の方法。
５３．ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、第２１項～第５１項のいずれか一項に記載の方法。
５４．ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである、第２１項～第５１項のいずれか一項に記載の方法。
５５．ヌクレアーゼは、核酸ガイドヌクレアーゼである、第２１項～第５１項のいずれか一項に記載の方法。
５６．ＤＮＡ切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって誘導される、第５５項に記載の方法。
５７．ドナーＤＮＡは、相同組換えによって細胞ＤＮＡに組み込まれる、第２１項～第５６項のいずれか一項に記載の方法。
５８．ドナーＤＮＡは、非相同末端結合又はマイクロホモロジーによる末端結合によってゲノムＤＮＡに組み込まれる、第２１項～第５６項のいずれか一項に記載の方法。
５９．ドナーＤＮＡは、ドナーＤＮＡが組み込まれる細胞の選択のための遺伝要素を含む、第２１項～第５８項のいずれか一項に記載の方法。
６０．ドナーＤＮＡの細胞ＤＮＡへの組み込みは、バインダーの発現及び／又は遺伝子選択要素の発現を、細胞ＤＮＡ内に存在するプロモーターの制御下に置く、第２１項～第５９項のいずれか一項に記載の方法。
６１．ドナーＤＮＡは、プロモーターに機能的に連結されたバインダーをコードする配列を含む、第２１項～第５８項のいずれか一項に記載の方法。
６２．ライブラリーは、少なくとも１００個、１０３個、１０４個、１０５個又は１０６個のクローンを含み、各クローンは、ドナーＤＮＡの組み込みによって作製された個々の組換え細胞に由来する、第２１項～第６１項のいずれか一項に記載の方法。
６３．ライブラリーは、少なくとも１００個、１０３個、１０４個、１０５個又は１０６個の異なるバインダーをコードする、第２１項～第６２項のいずれか一項に記載の方法。
６４．各クローンは、バインダーのレパートリーの１つ又は２つのメンバーのみをコードする組み込まれたドナーＤＮＡを含む、第２１項～第６３項のいずれか一項に記載の方法。
６５．真核細胞は、二倍体であり、且つ細胞ＤＮＡの二重固定遺伝子座における部位特異的ヌクレアーゼの認識配列を含む、第２１項～第６４項のいずれか一項に記載の方法。
６６．各クローンは、バインダーのレパートリーの単一のメンバーをコードする組み込まれたドナーＤＮＡを含む、第２１項～第６３項のいずれか一項に記載の方法。
６７．ドナーＤＮＡ分子は、それぞれ単一のバインダー又はバインダーサブユニットをコードする、第２１項～第６６項のいずれか一項に記載の方法。
６８．バインダーは、細胞表面にディスプレイされる、第２１項～第６７項のいずれか一項に記載の方法。
６９．バインダーは、細胞から分泌される、第２１項～第６８項のいずれか一項に記載の方法。
７０．ライブラリーを培養してバインダーを発現させるステップ、
目的のバインダーを発現する１つ又は複数のクローンを回収するステップ、及び
１つ又は複数の回収したクローンから誘導体ライブラリーを生成するステップであって、誘導体ライブラリーは、バインダーの第２のレパートリーをコードするＤＮＡを含む、ステップ
をさらに含む、第２１項～第６９項のいずれか一項に記載の方法。
７１．誘導体ライブラリーを生成するステップは、１つ又は複数の回収したクローンからドナーＤＮＡを単離することと、ＤＮＡに変異を導入して、バインダーの第２のレパートリーをコードするドナーＤＮＡ分子の誘導体集団を提供することと、ドナーＤＮＡ分子の誘導体集団を細胞に導入して、バインダーの第２のレパートリーをコードするＤＮＡを含む細胞の誘導体ライブラリーを形成することとを含む、第７０項に記載の方法。
７２．誘導体ライブラリーを生成するステップは、クローン内にＤＮＡの変異を誘導することにより、１つ又は複数の回収したクローンのドナーＤＮＡに変異を導入することを含む、第７０項に記載の方法。
７３．第２１項～第７２項のいずれか一項に記載の方法によってライブラリーを作製するステップと、ライブラリー細胞を培養してバインダーを発現させるステップとを含む、バインダーの多様なレパートリーを作製する方法。
７４．第２１項～第７２項のいずれか一項に記載の方法によって作製されたライブラリー。
７５．所望の表現型の細胞についてスクリーニングする方法であって、表現型は、細胞によるバインダーの発現から生じ、この方法は、
第２１項～第７２項のいずれか一項に記載のライブラリーを作製する方法によってライブラリーを提供するか、又は第１１項に記載の使用によってライブラリーを提供するか、又は第１２項～第１９項若しくは第７４項のいずれか一項に記載のライブラリーを提供するステップ、
ライブラリー細胞を培養してバインダーを発現させるステップ、及び
所望の表現型が示されているかどうかを検出するステップ
を含む、方法。
７６．表現型は、バインダーを発現する細胞におけるレポーター遺伝子の発現である、第７５項に記載の方法。
７７．所望の表現型を作製するバインダーを発現するクローンの細胞を回収するステップをさらに含む、第７５項又は第７６項に記載の方法。
７８．回収したクローンからバインダーをコードするＤＮＡを単離し、それにより所望の表現型を作製するバインダーをコードするＤＮＡを得るステップをさらに含む、第７７項に記載の方法。
７９．目的の標的に対するバインダーを同定するスクリーニング方法であって、
第２１項～第７２項のいずれか一項に記載のライブラリーを作製する方法によってライブラリーを提供するか、又は第１１項に記載の使用によってライブラリーを提供するか、又は第１２項～第１９項若しくは第７４項のいずれか一項に記載のライブラリーを提供するステップ、
ライブラリーの細胞を培養してバインダーを発現させるステップ、
バインダーを標的に曝露し、１つ又は複数の同種バインダーが存在する場合、それによる標的の認識を可能にするステップ、及び
標的が同種バインダーによって認識されるかどうかを検出するステップ
を含む方法。
８０．標的は、可溶性の形態で提供される、第７５項又は第７９項に記載の方法。
８１．標的は、標的細胞の集団の表面にディスプレイされ、バインダーは、ライブラリー細胞の表面にディスプレイされ、この方法は、ライブラリー細胞を標的細胞に接触させることによってバインダーを標的に曝露するステップを含む、第７５項又は第７９項に記載の方法。
８２．バインダーは、抗体分子であり、及び標的は、抗原である、第７５項～第８１項のいずれか一項に記載の方法。
８３．バインダーは、ＴＣＲであり、及び標的は、ＭＨＣ：ペプチド複合体である、第７５項～第８１項のいずれか一項に記載の方法。
８４．同種バインダーによる標的認識を検出するステップと、同種バインダーをコードするＤＮＡを含むクローンの細胞を回収するステップとをさらに含む、第７９項～第８３項のいずれか一項に記載の方法。
８５．バインダーをコードするＤＮＡを回収したクローンから単離し、それにより標的を認識するバインダーをコードするＤＮＡを得るステップをさらに含む、第８４項に記載の方法。
８６．変異を導入するか、又はＤＮＡを変換して、再構成バインダーをコードする改変ＤＮＡにするステップを含む、第７８項又は第８５項に記載の方法。
８７．バインダーは、ｓｃＦｖであり、この方法は、元の可変ＶＨ及びＶＬ鎖の対を維持しながら、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＩｇ又はその断片をコードするＤＮＡに変換するステップを含む、第８６項に記載の方法。
８８．ＤＮＡを宿主細胞に導入するステップをさらに含む、第７８項、第８５項、第８６項又は第８７項に記載の方法。
【0208】
一般情報
特段の記載がない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって慣習的且つ通常理解されるのと同じ意味を有し、本開示を考慮して読まれる。
特段の記載がない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって慣習的且つ通常理解されるのと同じ意味を有し、本開示を考慮して読まれる。
【0209】
配列同一性
所与の配列識別番号（配列番号）によって本明細書で同定される各核酸分子、又はタンパク質断片、又はポリペプチド、又はペプチド、又は誘導ペプチド、又は構築物は、開示されるこの特定の配列に限定されないことを理解されたい。本明細書で同定される各コード配列は、所与のタンパク質断片、若しくはポリペプチド、若しくはペプチド、若しくは誘導ペプチド、若しくは構築物をコードするか、又はそれ自体、タンパク質断片、若しくはポリペプチド、若しくは構築物、若しくはペプチド、若しくは誘導ペプチドである。
所与の配列識別番号（配列番号）によって本明細書で同定される各核酸分子、又はタンパク質断片、又はポリペプチド、又はペプチド、又は誘導ペプチド、又は構築物は、開示されるこの特定の配列に限定されないことを理解されたい。本明細書で同定される各コード配列は、所与のタンパク質断片、若しくはポリペプチド、若しくはペプチド、若しくは誘導ペプチド、若しくは構築物をコードするか、又はそれ自体、タンパク質断片、若しくはポリペプチド、若しくは構築物、若しくはペプチド、若しくは誘導ペプチドである。
【0210】
本出願全体を通して、所与のタンパク質断片、又はポリペプチド、又はペプチド、又は誘導ペプチドをコードする特定のヌクレオチド配列の配列番号（配列番号Ｘを例にとる）に言及するたびに、それを以下に置き換えることができる：
ｉ．配列番号Ｘと少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｉ．その配列が、遺伝子コードの縮重により、（ｉ）の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列；又は
ｉｉｉ．ヌクレオチド配列の配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性又は類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
ｉ．配列番号Ｘと少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｉ．その配列が、遺伝子コードの縮重により、（ｉ）の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列；又は
ｉｉｉ．ヌクレオチド配列の配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性又は類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【0211】
配列同一性又は類似性の別の好ましいレベルは７０％である。配列同一性又は類似性の別の好ましいレベルは８０％である。配列同一性又は類似性の別の好ましいレベルは９０％である。配列同一性又は類似性の別の好ましいレベルは９５％である。配列同一性又は類似性の別の好ましいレベルは９９％である。
【0212】
本出願全体を通して、特定のアミノ酸配列の配列番号（配列番号Ｙを例にとる）に言及するたびに、それを、アミノ酸配列の配列番号Ｙと少なくとも６０％の配列同一性又は類似性を有する配列を含むアミノ酸配列で表されるポリペプチドに置き換えることができる。配列同一性又は類似性の別の好ましいレベルは７０％である。配列同一性又は類似性の別の好ましいレベルは８０％である。配列同一性又は類似性の別の好ましいレベルは９０％である。配列同一性又は類似性の別の好ましいレベルは９５％である。配列同一性又は類似性の別の好ましいレベルは９９％である。
【0213】
所与のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列とのその同一性又は類似性のパーセンテージによって本明細書に記載される各ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列のそれぞれは、さらに好ましい実施形態では、所与のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列とそれぞれ少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性又は類似性を有する。
【0214】
各非コード（即ちプロモーター又は別の調節領域の）ヌクレオチド配列は、特定のヌクレオチド配列の配列番号（配列番号Ａを例にとる）と少なくとも６０％の配列同一性又は類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えることができる。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号Ａと、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有する。好ましい実施形態では、プロモーターなどのこのような非コードヌクレオチド配列は、少なくとも、当業者に公知であるプロモーターの活性などのこのような非コードヌクレオチド配列の活性を示すか又は発揮する。
【0215】
「相同性」及び「配列同一性」などの用語は、本明細書では互換的に使用される。配列同一性は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列間又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として本明細書に記載される。好ましい実施形態では、配列同一性は、２つの所与の配列番号の全長又はその一部に基づいて計算される。その一部は、好ましくは、両方の配列番号の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を意味する。当技術分野では、「同一性」は、場合により、このような配列の文字列間の一致によって決定されるアミノ酸配列間又は核酸配列間の配列関連性の程度も指す。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、限定されないが、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ：Ｍｏｄｅｒｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ，Ｘｉａ Ｘ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１８；及びＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍｏｕｎｔ Ｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００４に記載されるものを含む、公知の方法によって容易に計算することができる。
【0216】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じてグローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。類似した長さの配列は、配列を全長にわたって最適に整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して整列させることが好ましい一方、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列させることが好ましい。その結果、配列が、（例えば、デフォルトパラメータを使用するプログラムＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅ又はＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒによって最適に整列された場合に）少なくとも特定の最小パーセンテージ（以下に記載）の配列同一性を共有している場合、これらの配列を、「実質的に同一である」又は「本質的に類似している」と呼ぶことができる。
【0217】
２つの配列が同様の長さを有する場合、グローバルアラインメントを適切に使用して配列同一性が決定される。配列の全長が実質的に異なる場合、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するアラインメントなどのローカルアラインメントが好ましい。ＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列を全長（完全長）にわたって整列させ、一致の数を最大限にし、ギャップの数を最小限にする。ＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒは、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎローカルアラインメントアルゴリズムを使用する。一般的には、ＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅ及びＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒのデフォルトパラメータには、ギャップオープンペナルティー＝１０（ヌクレオチド配列）／１０（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティー＝０．５（ヌクレオチド配列）／０．５（タンパク質）が使用される。ヌクレオチド配列の場合、使用されるデフォルトのスコアリングマトリックスはＤＮＡｆｕｌｌであり、タンパク質の場合、デフォルトのスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ ８９，９１５－９１９）。
【0218】
代わりに、パーセンテージ類似性又は同一性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して公開データベースで検索することによって決定することもできる。従って、本発明のいくつかの実施形態の核酸配列及びタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公開データベースで検索を実施するための「問い合わせ配列」としてさらに使用することができる。このような検索は、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムを使用して、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で実施して、本発明の酸化還元酵素核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｘプログラムを使用して、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ワールドワイドウェブｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／でアクセス可能な米国立生物工学情報センターのホームページを参照されたい。
【0219】
本明細書及びその特許請求の範囲では、「含む」という動詞及びその活用形は、その非限定的な意味で使用され、その語に続く項目が含まれ、具体的に言及されていない項目も除外されないことを意味する。加えて、「からなる」という動詞は、「から本質的になる」に置き換えられ得、本明細書に記載される組成物が、具体的に特定したものとは別の追加の成分を含み得、前記追加の成分は、本発明の固有の特性を変化させないことを意味する。加えて、「からなる」という動詞は、「から本質的になる」に置き換えられ得、これは、本明細書に記載される方法が、具体的に特定したものとは別の追加のステップを含み得、前記追加のステップが本発明の固有の特性を変化させないことを意味する。
【0220】
不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、文脈上、要素が１つのみであることが明確に求められない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を排除するものではない。従って、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【0221】
本明細書で使用される場合、「少なくとも」特定の値は、特定の値以上を意味する。例えば、「少なくとも２つ」は、「２つ以上」、即ち２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、．．．などと同じであると解釈される。
【0222】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲における第１、第２及び第３などの用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも順番又は時系列を説明するものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載又は例示される以外の順序で機能可能であることを理解されたい。
【0223】
「約」又は「およそ」という語は、数値（例えば、約１０）に関連して使用される場合、好ましくはその値がその値（１０）の±１％の所与の値であり得ることを意味する。
【0224】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、記載例の１つ又は複数が、単独で又は記載例の少なくとも１つ、最大で記載例のすべてと一緒に存在し得ることを示す。
【0225】
様々な実施形態が本明細書に記載される。本明細書で明らかにされる各実施形態は、特段の記載がない限り、組み合わせて１つにされ得る。
【0226】
本明細書で引用されるすべての特許出願、特許及び刊行物は、すべての定義、主題の放棄又は否認を除いて、且つ組み込まれた材料が本明細書の明示的な開示と矛盾する範囲を除いて（その場合には本開示の言語が優先される）、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0227】
当業者は、本発明の実施で使用することができる、本明細書に記載のものと類似の又は均等な多くの方法及び材料を認識するであろう。実際に、本発明は、記載の方法及び材料に決して限定されない。
【0228】
本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない以下の実施例によって本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【0229】
【図1】トランスポゾン（ＴＲ）隣接Ｉ－ｓｃｅＩランディングパッドカセットを含むｐＩｎｔ１０５ベクターの概略図。ランディングパッドは、短い第１のエクソン（Ｅ×１）のプロモーター（ｍＰＧＫ）駆動発現、それに続くＩ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列を含むイントロン配列を含む。注釈：ＴＲ － ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの逆末端反復；ｍＰＧＫ － マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター；Ｅｘ１ － マウスホスホグリセリン酸キナーゼのエクソン１；ＬＨＡ － 左相同性アーム；Ｉ－ＳｃｅＩ － メガヌクレアーゼ切断部位；ＲＨＡ － 右相同性アーム；Ｕｂｉ － ユビキチンプロモーター；Ｐｕｒｏ － ピューロマイシン遺伝子；ＬｏｘＰ － クロスオーバー遺伝子座（ＬｏｘＰ及びＬｏｘ２２７２は、ＣＲＥリコンビナーゼ部位である）。
【図2A-2B】ブラストサイジン選択なしでのトランスフェクションの６日後のＦｃ発現を示すドットプロット。ＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮヌクレアーゼの存在下又は非存在下、ｐＩＮＴ１７－ボコシズマブ及びｐＩＮＴ１７－５Ａ１０ｉでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を図２Ａに示す。ＮＬＮ ＣＲＩＳＰＲの存在下又は非存在下、ｐＩＮＴ７４－ボコシズマブ及びｐＩＮＴ７４－５Ａ１０ｉでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を図２Ｂに示す。
【図3A-3B】ＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮヌクレアーゼの存在下、ｐＩＮＴ１７－ボコシズマブ及び５Ａ１０ｉでトランスフェクトした細胞及びＮＬＮ ＣＲＩＳＰＲの存在下、ｐＩＮＴ７４－ボコシズマブ及びｐＩＮＴ７４－５Ａ１０ｉでトランスフェクトした細胞におけるトランスフェクションの１５日後（ＢＳＤ耐性集団）（図３Ａ）及びトランスフェクションの２８日後（図３Ｂ）のＦｃ発現を示すヒストグラムオーバーレイプロット。矢印は、ＡＡＶＳ組み込みのヒストグラムプロットを示す。
【図6】抗ヒトＦｃ抗体で染色することによるフローサイトメトリーベースの分析を使用して測定した、トランスフェクションの２日後の抗体発現プロファイル。左：ＡＡＶＳ遺伝子座に組み込まれた８８４＿０１＿Ｇ０１；中央：ＮＬＮイントロン１に組み込まれた５Ａ１０ｉ；右：ＮＬＮイントロン１に組み込まれたボコシズマブ。ＰｃＤＮＡは、ヌクレアーゼなしでのトランスフェクションの略語である。
【図7A-7B】抗ヒトＦｃ抗体で染色することによるフローサイトメトリーベースの分析を使用して測定した、ＢＳＤに耐性のある細胞におけるトランスフェクションの８日後（図７Ａ）及びトランスフェクションの１４日後（図７Ｂ）の抗体発現プロファイル。左：ＡＡＶＳ遺伝子座に組み込まれた８８４＿０１＿Ｇ０１；中央：ＮＬＮイントロン１に組み込まれた５Ａ１０ｉ；右：ＮＬＮイントロン１に組み込まれたボコシズマブ。示されているパーセンテージは、抗ヒトＦｃ抗体染色細胞集団を示し、示されている数値は、細胞数を示す。ＰｃＤＮＡは、ヌクレアーゼなしでのトランスフェクションの略語である。
【図8】抗ヒトＦｃ抗体で染色することによるフローサイトメトリーベースの分析を使用して測定した、ＢＳＤに耐性のある細胞におけるトランスフェクションの１日後（左）、トランスフェクションの７日後（中央）及びトランスフェクションの１４日後（右）の抗体発現プロファイル。５Ａ１０ｉ及びボコシズマブをＮＬＮイントロン１に組み込んだ（ｐＩＮＴ５８－５Ａ１０ｉ及びｐＩＮＴ５８－ボコシズマブ）。ＰｃＤＮＡは、ヌクレアーゼなしでのトランスフェクションの略語である。
【図9】ブラストサイジン選択なしでのトランスフェクションの７日後（左）及び１４日後（中央）に抗ヒトＦｃ抗体で染色することによるフローサイトメトリーベースの分析を使用して測定した組み込み効率（％）。５Ａ１０ｉ及びボコシズマブをＮＬＮイントロン１に組み込んだ（ｐＩＮＴ５８－５Ａ１０ｉ及びｐＩＮＴ５８－ボコシズマブ）。右図は、ヌクレアーゼを使用しない場合の組み込み効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【0230】
【表1】
【0231】
【表2】
【0232】
【表3】
【実施例】
【0233】
実施例１：トランスポゾン媒介組み込みを介してＩ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識部位が組み込まれたＨｅｋ２９３細胞株の生成
１×１０７個のＨｅｋ２９３細胞を、ＯＣ１００キュベットを用いて、製造者のプロトコルに従ってＭａｘＣｙｔｅ（ＭＤ、ＵＳＡ）エレクトロポレーションを使用して、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの認識配列とユビキチンプロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子（図１；配列番号５９）を含むランディングパッドに隣接するＰｉｇｇｙｂａｃ（ＰＢ）トランスポゾン末端反復（ＴＲ）を含むｐＩＮＴ１０５ベクター、ＰＣＤＮＡ ３．０ベクター及びＰＢａｓｅベクター（ｍＰＢトランスポザーゼをコードする）で同時トランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ ３．０ベクターは、トランスフェクション中のＤＮＡ濃度を標準化するためのキャリアとして使用される空ベクターである。ＰＢａｓｅベクターを用いない対照のトランスフェクションも行った。使用したＤＮＡの量を表１に示す。２４時間後、トランスフェクトした細胞を、１０％ＤＭＥＭ寒天プレートに播種した。プレーティングの２４時間後、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを細胞に添加した。ピューロマイシン選択の２週間後、４８個のコロニーを採取して増殖させた。細胞ペレットを、ゲノムＤＮＡ抽出のために凍結した。１クローンにつき１０７個の細胞のバイアル１本を凍結し、液体窒素中で保存した。
１×１０７個のＨｅｋ２９３細胞を、ＯＣ１００キュベットを用いて、製造者のプロトコルに従ってＭａｘＣｙｔｅ（ＭＤ、ＵＳＡ）エレクトロポレーションを使用して、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの認識配列とユビキチンプロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子（図１；配列番号５９）を含むランディングパッドに隣接するＰｉｇｇｙｂａｃ（ＰＢ）トランスポゾン末端反復（ＴＲ）を含むｐＩＮＴ１０５ベクター、ＰＣＤＮＡ ３．０ベクター及びＰＢａｓｅベクター（ｍＰＢトランスポザーゼをコードする）で同時トランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ ３．０ベクターは、トランスフェクション中のＤＮＡ濃度を標準化するためのキャリアとして使用される空ベクターである。ＰＢａｓｅベクターを用いない対照のトランスフェクションも行った。使用したＤＮＡの量を表１に示す。２４時間後、トランスフェクトした細胞を、１０％ＤＭＥＭ寒天プレートに播種した。プレーティングの２４時間後、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを細胞に添加した。ピューロマイシン選択の２週間後、４８個のコロニーを採取して増殖させた。細胞ペレットを、ゲノムＤＮＡ抽出のために凍結した。１クローンにつき１０７個の細胞のバイアル１本を凍結し、液体窒素中で保存した。
【0234】
【表4】
【0235】
Ｐｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｌｕｏ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（４）：ｅ１０１６に記載されているように、２０個のクローンを、スプリンケレットＰＣＲを使用してランディングパッド組み込みのゲノム位置にマッピングした。１クローンにつき１μｇのゲノムＤＮＡをＳａｕ３ａで消化した。次いで、スプリンケレットＰＣＲを以下のように行った。
【0236】
ステップ１：スプリンケレットオリゴヌクレオチドをアニーリングするための反応条件
成分の量
ＳＰＬＮＫ－ＢＯＴ（１５０ｎｇ／μｌ）５０μｌ
ＳＰＬＮＫ－ＧＡＴＣ－ＴＯＰ（１５０ｎｇ／μｌ）５０μｌ
１０×ＮＥＢ緩衝液２ １００μｌ
Ｈ２Ｏ ８００μｌ
合計１０００μｌ
９５℃で３分間加熱する。ベンチで室温まで放冷する（約３０分間）。２００μｌのアリコートを－２０℃で保存した。
成分の量
ＳＰＬＮＫ－ＢＯＴ（１５０ｎｇ／μｌ）５０μｌ
ＳＰＬＮＫ－ＧＡＴＣ－ＴＯＰ（１５０ｎｇ／μｌ）５０μｌ
１０×ＮＥＢ緩衝液２ １００μｌ
Ｈ２Ｏ ８００μｌ
合計１０００μｌ
９５℃で３分間加熱する。ベンチで室温まで放冷する（約３０分間）。２００μｌのアリコートを－２０℃で保存した。
【0237】
ステップ２：消化されたゲノムＤＮＡをアニールされたスプリンケレットオリゴヌクレオチドにライゲーションするためのスプリンケレットオリゴヌクレオチドへのライゲーション条件
成分の量
消化されたゲノムＤＮＡ ３５μｌ
Ｈ２Ｏ ２．５μｌ
１０×ＮＥＢ リガーゼ緩衝液５μｌ
アニールされたスプリンケレットオリゴヌクレオチド（ステップ１から）６μｌ
ＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μｌ）１．５μｌ
合計５０μｌ
室温で２時間以上インキュベートした。１回目のＰＣＲに直接進んだ。
成分の量
消化されたゲノムＤＮＡ ３５μｌ
Ｈ２Ｏ ２．５μｌ
１０×ＮＥＢ リガーゼ緩衝液５μｌ
アニールされたスプリンケレットオリゴヌクレオチド（ステップ１から）６μｌ
ＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μｌ）１．５μｌ
合計５０μｌ
室温で２時間以上インキュベートした。１回目のＰＣＲに直接進んだ。
【0238】
ステップ３．１回目のスプリンケレットＰＣＲ
１回目のＰＣＲ反応
成分の量
ライゲーションされたゲノムＤＮＡ １０μｌ
Ｈ２Ｏ ８．２５μｌ
５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液５μｌ
１０ｍｍ ｄＮＴＰ ０．５μｌ
ＳＰＬＮＫ＃１．１０μＭ ０．５μｌ
プライマーＰＢ＃１、１０μＭ（表２を参照されたい）０．５μｌ
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，ＦＬ）０．２５μｌ
合計２５μｌ
１回目のＰＣＲのＰＣＲ条件
９８℃で７５秒間
９８℃で２０秒間→６４℃で１５秒間（×２サイクル）
９８℃で２０秒間→５８℃又は６４℃で１５秒間（３’ＳＰＬＮＫ－ＰＢ＃１は５８℃、５’ＳＰＬＮＫ－ＰＢ＃１は６４℃、表２）→７２℃２分間（×３０サイクル）
７２℃で７分間
４℃に保持
１回目のＰＣＲ反応
成分の量
ライゲーションされたゲノムＤＮＡ １０μｌ
Ｈ２Ｏ ８．２５μｌ
５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液５μｌ
１０ｍｍ ｄＮＴＰ ０．５μｌ
ＳＰＬＮＫ＃１．１０μＭ ０．５μｌ
プライマーＰＢ＃１、１０μＭ（表２を参照されたい）０．５μｌ
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，ＦＬ）０．２５μｌ
合計２５μｌ
１回目のＰＣＲのＰＣＲ条件
９８℃で７５秒間
９８℃で２０秒間→６４℃で１５秒間（×２サイクル）
９８℃で２０秒間→５８℃又は６４℃で１５秒間（３’ＳＰＬＮＫ－ＰＢ＃１は５８℃、５’ＳＰＬＮＫ－ＰＢ＃１は６４℃、表２）→７２℃２分間（×３０サイクル）
７２℃で７分間
４℃に保持
【0239】
ステップ４．２回目のスプリンケレットＰＣＲ
２回目のＰＣＲ反応
成分の量
１回目のＰＣＲ産物１μｌ（２倍希釈）
Ｈ２Ｏ ３１．５μｌ
５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液１０μｌ
１０ｍｍ ｄＮＴＰ １μｌ
ＳＰＬＮＫ＃２、１０μＭ １μｌ
プライマーＰＢ＃２、１０μＭ（表２を参照されたい）１μｌ
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ ０．５μｌ
合計５０μｌ
２回目のＰＣＲのＰＣＲ条件
９８℃で７５秒間
９８℃で２０秒間→５９℃又は６６℃で１５秒間（３’ＳＰＬＮＫ－ＰＢ＃２は５９℃、５’ＳＰＬＮＫ－ＰＢ＃２は６６℃、表２）→７２℃で９０秒間（×３０サイクル）
７２℃で７分間
４℃に保持
２回目のＰＣＲ反応
成分の量
１回目のＰＣＲ産物１μｌ（２倍希釈）
Ｈ２Ｏ ３１．５μｌ
５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液１０μｌ
１０ｍｍ ｄＮＴＰ １μｌ
ＳＰＬＮＫ＃２、１０μＭ １μｌ
プライマーＰＢ＃２、１０μＭ（表２を参照されたい）１μｌ
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ ０．５μｌ
合計５０μｌ
２回目のＰＣＲのＰＣＲ条件
９８℃で７５秒間
９８℃で２０秒間→５９℃又は６６℃で１５秒間（３’ＳＰＬＮＫ－ＰＢ＃２は５９℃、５’ＳＰＬＮＫ－ＰＢ＃２は６６℃、表２）→７２℃で９０秒間（×３０サイクル）
７２℃で７分間
４℃に保持
【0240】
ステップ５．南極ホスファターゼ／エキソヌクレアーゼＩ処理ＡｎｔＰｈｏ／ＥｘｏＩ反応条件
成分の量
２回目のスプリンケレットＰＣＲ産物 ２０μｌ
１０×ＮＥＢ ＡＰ緩衝液３．０μｌ
Ｈ２Ｏ ３．０μｌ
ＮＥＢ 南極ホスファターゼ２．０μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）
ＮＥＢエキソヌクレアーゼＩ ２．０μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）
合計３０μｌ
成分の量
２回目のスプリンケレットＰＣＲ産物 ２０μｌ
１０×ＮＥＢ ＡＰ緩衝液３．０μｌ
Ｈ２Ｏ ３．０μｌ
ＮＥＢ 南極ホスファターゼ２．０μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）
ＮＥＢエキソヌクレアーゼＩ ２．０μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）
合計３０μｌ
【0241】
反応液を３７℃で２時間インキュベートし、続いて８０℃で１５分間インキュベートした。１５μｌの反応液を、適切な配列決定プライマー（配列番号１７、配列番号１８、表２）を用いた配列決定に使用した。
【0242】
【表5】
【0243】
転移因子の５’末端のＰＣＲを実行し、０．８％アガロースゲルでチェックして配列決定した。得られた配列をＮＣＢＩ－ｂｌａｓｔｎを使用してブラストし、各細胞株のゲノム遺伝子座を同定した（表３）。
【0244】
【表6】
【0245】
【表7】
【0246】
クローンごとの配列決定結果は、以下の通りである：クローンＡ０２－Ｃｈｒ．７（配列番号３４）、クローンＡ０４－Ｃｈｒ．５（配列番号３５）、クローンＡ０５－Ｃｈｒ．３（配列番号３６）、クローンＡ０６－Ｃｈｒ．１２（配列番号３７）、クローンＡ０７－Ｃｈｒ．１７（配列番号３８）、クローンＡ０８－複数ヒット（配列番号３９）、クローンＡ０９－Ｃｈｒ．７（配列番号４０）、クローンＡ１０－Ｃｈｒ．１１（配列番号４１）、クローンＢ０４－Ｃｈｒ．２（配列番号４２）、クローンＢ０６－Ｃｈｒ．３（配列番号４３）、クローンＢ０７－Ｃｈｒ．１（配列番号４４）、クローンＢ１１－Ｃｈｒ．８（配列番号４５）、クローンＢ１２－Ｃｈｒ．１５（配列番号４６）、クローンＣ０１－Ｃｈｒ．１７（配列番号４７）、クローンＣ０２－Ｃｈｒ．２（配列番号４８）、クローンＣ０３－Ｃｈｒ．９（配列番号４９）。
【0247】
実施例２：ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ及びＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２をドナーＤＮＡとしてトランスフェクトすることによる細胞株のバリデーション
ＰＢトランスポゾン媒介組み込みによって生成されたクローンを、組み込み効率、単一コピーの組み込み分析及び抗体発現について検証した。この目的のために、クローンに、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼプラスミドの存在下又は非存在下で、Ｆｃフォーマットの抗ＦＧＦＲ１ ｓｃＦｖ及び抗ＦＧＦＲ２ ｓｃＦｖを含む２つのドナープラスミドを等しい割合で同時トランスフェクトした。抗ＦＧＦＲ１抗体とａ－ＦＧＦＲ２抗体の混合物でのトランスフェクションは、複数の組み込みイベントを含む細胞の割合を調べる機会を提供する。カセット（抗ＦＧＦＲ１など）が正しく組み込まれた個々の細胞では、２回目の組み込みが代替の特異性（即ち抗ＦＧＦＲ２）となる確率が約５０：５０である。複数の組み込みが頻繁であると、二重陽性クローンの割合が高くなる。ドナープラスミドは、国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットに記載されている。
ＰＢトランスポゾン媒介組み込みによって生成されたクローンを、組み込み効率、単一コピーの組み込み分析及び抗体発現について検証した。この目的のために、クローンに、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼプラスミドの存在下又は非存在下で、Ｆｃフォーマットの抗ＦＧＦＲ１ ｓｃＦｖ及び抗ＦＧＦＲ２ ｓｃＦｖを含む２つのドナープラスミドを等しい割合で同時トランスフェクトした。抗ＦＧＦＲ１抗体とａ－ＦＧＦＲ２抗体の混合物でのトランスフェクションは、複数の組み込みイベントを含む細胞の割合を調べる機会を提供する。カセット（抗ＦＧＦＲ１など）が正しく組み込まれた個々の細胞では、２回目の組み込みが代替の特異性（即ち抗ＦＧＦＲ２）となる確率が約５０：５０である。複数の組み込みが頻繁であると、二重陽性クローンの割合が高くなる。ドナープラスミドは、国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットに記載されている。
【0248】
トランスフェクションを２つのバッチで行った：バッチ１にはクローンＡ０９、Ａ１０、Ｂ０３、Ｂ０５、Ｂ０７、Ｂ０９及びＢ１２が含まれていた。バッチ２には、Ａ０２、Ａ０４、Ａ０５、Ａ０６、Ａ０７、Ａ０８、Ａ１１、Ｂ０１、Ｂ０４、Ｂ０６、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｃ０１、Ｃ０２及びＣ０３が含まれていた。トランスフェクションの前日に、細胞又はＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を０．５×１０６個の細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクション当日に、製造者のプロトコルに従ってＭａｘｃｙｔｅ（ＭＤ，ＵＳＡ）エレクトロポレーションを使用して細胞をトランスフェクトした。ドナーＤＮＡ（抗ＦＧＦＲ１及び抗ＦＧＦＲ２）は、すべてのトランスフェクション（対照を含む）のそれぞれで１μｇであった。メガヌクレアーゼＤＮＡは２０μｇであった。ＨＥＫ２９３Ｆ ＴＡＬＥＮ細胞を両方のバッチの対照として使用した（国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットに記載）。対照細胞に、ＴＡＬＥＮを介した組み込みによってＡＡＶＳ遺伝子座にバインダーを組み込むことができるＡＡＶＳ ＴＡＬＥヌクレアーゼプラスミドの存在下又は非存在下で、Ｆｃフォーマットの抗ＦＧＦＲ１ ｓｃＦｖ及び抗ＦＧＦＲ２ ｓｃＦｖを含む２つのドナープラスミドを等しい割合でトランスフェクトした。使用したＴＡＬＥＮ ＤＮＡは、１０μｇ（ＴＡＬ Ｌ）及び１０μｇ（ＴＡＬ Ｒ）であった。
【0249】
トランスフェクトした細胞を１０ｃｍのペトリ皿にプレーティングし、トランスフェクションの２日後にブラストサイジン選択を行った。プレート内の培地に、２０日目まで３～４日ごとにブラストサイジンを含む新鮮な培地を補充した。ブラストサイジン耐性コロニーをスコアリングして、組み込み効率を計算した。組み込み効率は、０～１％の範囲であり、ヌクレアーゼの存在下と非存在下での倍数差はクローン間で異なっていた。クローンＡ０９、Ｂ１２及びＣ０３は、他のクローンと比較して、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの存在下と非存在下での倍数差が大きいことを示した。これら３つのクローンの中で、Ｃ０３が最も高い組み込み効率（１％）を示した。残りのクローンの組み込み効率を見ると、Ａ０４及びＢ０１は、それぞれ０．５％及び０．６％であった。
【0250】
並行して、トランスフェクトした細胞を懸濁液で培養し、３～４日ごとに培地を交換して、２日目から２０日目までＢＳＤ選択も行った。２０日目に、細胞をＦＧＦＲ１－Ｄｙ６３３及びＦＧＦＲ２－Ｄｙ４８８で二重染色した。フローサイトメトリーベースの分析を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＩＱＵＥスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ，ＧＥ）を使用して行った。サイトメーターには、４８８ｎｍ（青色）及び６４０ｎｍ（赤色）レーザー及びＰＥ（ＬＰ：－、ＢＰ：５７２／２８）とＴｏ－Ｐｒｏ３（ＬＰ：－、ＢＰ：６７５／３０）用の発光フィルターが装備されていた。ＦＧＲ１／２染色では、１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｄｙ６３３及びＦＧＦＲ２－Ｄｙ４８８を１００μＬの細胞に添加した。これらを、４℃の暗所で３０分間インキュベートした。次いで、９００μｌの０．１％ＰＢＳを添加した後、６００×ｇで２．５分間遠心分離した。細胞を１ｍｌの０．１％ＢＳＡで洗浄し、５００μｌの０．１％ＢＳＡに再懸濁した。５０μＬを取り出して、その後の分析のために９６ウェルプレートのウェルに添加した。抗原による細胞の二重染色は、複数コピーの組み込み（細胞ごとに２つ以上の抗体遺伝子が組み込まれている）を示し得る。抗体陰性集団が、トランスフェクトされたすべてのクローンで観察された。これらの母集団を、単一コピー及び複数コピーの組み込み分析の計算から除外した。その結果を表４に示す。
【0251】
【表8】
【0252】
実施例３：バインダーの発現のためのノイロリシン（ＮＬＮ）遺伝子の評価
ＮＬＮ遺伝子座のバインダー発現能力を評価するために、プロモーターのないブラストサイジン遺伝子及びＮＬＮにおいて抗ＰＣＳＫ９抗体５Ａ１０ｉ又はボコシズマブ（Ｂｏｃｏ）を発現する遺伝子を含むカセットのゲノム組み込みのための設計を行った。ベクターｐＩＮＴ１７－５Ａ１０ｉ及びｐＩＮＴ１７－ボコシズマブは、国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットに記載のｐＤ２ベクターの誘導体である第２世代ディスプレイベクターであり、ｐＩＮＴ１７－ＢＳＤベクター（Ｐａｒｔｈｉｂａｎ ｅｔ ａｌ．２０１９ ｍＡｂｓ，１１：５，８８４－８９８に記載）に由来し、ｐＩＮＴ１７－ＢＳＤベクターは、５Ａ１０ｉ及びボコシズマブそれぞれを発現する遺伝子を含むカセットが挿入されたＡＡＶＳ遺伝子座への構成された遺伝子の組み込みを誘導する。
ＮＬＮ遺伝子座のバインダー発現能力を評価するために、プロモーターのないブラストサイジン遺伝子及びＮＬＮにおいて抗ＰＣＳＫ９抗体５Ａ１０ｉ又はボコシズマブ（Ｂｏｃｏ）を発現する遺伝子を含むカセットのゲノム組み込みのための設計を行った。ベクターｐＩＮＴ１７－５Ａ１０ｉ及びｐＩＮＴ１７－ボコシズマブは、国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットに記載のｐＤ２ベクターの誘導体である第２世代ディスプレイベクターであり、ｐＩＮＴ１７－ＢＳＤベクター（Ｐａｒｔｈｉｂａｎ ｅｔ ａｌ．２０１９ ｍＡｂｓ，１１：５，８８４－８９８に記載）に由来し、ｐＩＮＴ１７－ＢＳＤベクターは、５Ａ１０ｉ及びボコシズマブそれぞれを発現する遺伝子を含むカセットが挿入されたＡＡＶＳ遺伝子座への構成された遺伝子の組み込みを誘導する。
【0253】
カセットの組み込みは、ノイロリシン遺伝子のイントロン２（ＮＬＮ－２０７）を標的とするｇＲＮＡ（ＴＣＡＣＴＣＧＴＡＴＴＡＣＧＴＴＴＡＣＡ、配列番号５０）をカセットに含めることにより、ＣＲＩＳＰＲを介した組み込みによって達成した。相同組換えを容易にするために、８００ｂｐの相同性アームを両端のカセットに含めた。左相同性アーム（ＬＨＡ）の両側には、５’末端のＡｓｉＳＩ認識部位及び３’末端のＮｓｉＩ認識部位が配置されていた。右相同性アーム（ＲＨＡ）の両側には、５’末端のＢｓｔＺ１７１認識部位及び３’末端のＳｂｆＩ認識部位が配置されていた。左相同性アームを、プライマーＬＨＡ＿ＡｓｉＳＩ－Ｆｏｒｗ（配列番号６０）及びＮＬＮ＿ＬＨＡ－ＮｓｉＩ－Ｒｅｖ（配列番号６１）を使用してＰＣＲによって増幅し、右相同性アームを、プライマーＮＬＮ－ＲＨＡ－ＢｓｔＺ１７１＿Ｆｏｒｗ（配列番号６２）及びＲＨＡ＿ＳｂｆＩ－Ｒｅｖ（配列番号６３）（プライマーは表５に示す）を使用して増幅し、カセットにライゲーションした後、上述の酵素及びライゲーションを使用して、ＰＣＲ産物並びにベクターｐＩＮＴ１７－５Ａ１０ｉ及びｐＩＮＴ１７－ボコシズマブの制限消化を行った。これにより、ｐＩＮＴ７４－５Ａ１０ｉ（配列番号６４）及びｐＩＮＴ７４－ボコシズマブ（配列番号６５）ベクターが得られ、これらのベクターは、ＮＬＮのイントロン２（ＮＬＮ－２０７）への構成された遺伝子の組み込みを誘導した。
【0254】
【表9】
【0255】
使用した鋳型配列：ＮＬＮ Ｉｎｔｒｏｎ ２－ＣＲＩＳＰＲ－１－ｇＢｌｏｃｋ（配列番号５７）、ＮＬＮ Ｉｎｔｒｏｎ ２－ＬＨＡ及びＲＨＡ－ｇＢｌｏｃｋ（配列番号５８）。
【0256】
標的遺伝子座へのカセットの正しい組み込みは、ブラストサイジン耐性遺伝子の発現をもたらし、国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットに記載されているように、抗生物質の存在下で、正しく組み込まれたクローンを増殖させることを可能にする。国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットに記載されているように、ＮＬＮイントロン２（ＮＬＮ－２０７）への組み込み用に設計されたカセットの組み込み効率を、ＴＡＬＥＮを介した組み込みによるＡＡＶＳ遺伝子座への組み込み用に設計されたカセットの組み込み効率と比較した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、製造者のプロトコルに従って、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーション（ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してトランスフェクトした。ＴＡＬＥＮベクター又はＣＲＩＳＰＲベクターを使用しない対照のトランスフェクションも行った。表６にトランスフェクション条件を示す。
【0257】
【表10】
【0258】
トランスフェクション後、細胞をブラストサイジンの存在下又は非存在下でプレーティングした。ブラストサイジン耐性コロニーを、トランスフェクションの１２日後にメチレンブルーで染色し、カウントして組み込み効率を測定した。ＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮをトランスフェクトした細胞の組み込み効率は、ｐＩＮＴ１７－Ｂｏｃｏで０．２６％、ｐＩＮＴ１７－５Ａ１０ｉで０．３５％であり、ＮＬＮ ＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトした細胞の組み込み効率は、ｐＩＮＴ７４－ボコシズマブで０．２３％、ｐＩＮＴ７４－５Ａ１０ｉで０．５３％であった（表７）。
【0259】
【表11】
【0260】
組み込み効率も、抗ヒトＦｃ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃４０９３０４）で染色することによりフローサイトメトリーベースの分析を使用して、ＢＳＤ選択なしでの細胞のトランスフェクションの６日後にＦｃ発現を測定することによって定量した。フローサイトメトリーベースの分析は、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＩＱＵＥスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ，ＧＥ）を使用して行った。サイトメーターには、４８８ｎｍ（青色）及び６４０ｎｍ（赤色）レーザーと、ＰＥ（ＬＰ：－、ＢＰ：５７２／２８）及びＴｏ－Ｐｒｏ３（ＬＰ：－、ＢＰ：６７５／３０）用の発光フィルターが装備されていた。抗ヒトＦｃ抗体染色では、１×１０６個の細胞を０．１％ ＢＳＡ ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬの１％ ＢＳＡ ＰＢＳ（７．５％ ＢＳＡ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ－Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｔ．Ｎｏ：１５２６００３７）中の１μｌの標識抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、光から保護し、ＰＢＳで再度洗浄し、分析した。ヌクレアーゼの存在下と非存在下でのＦｃ陽性細胞数の差は、組み込み効率を測定する手段である。ヌクレアーゼ存在下で５Ａ１０ｉをトランスフェクトした細胞は、ＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮ及びＮＬＮ ＣＲＩＳＰＲでそれぞれ３．９９％及び３．３８％を示す（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【0261】
並行して、トランスフェクトした細胞を懸濁液で培養し、ＢＳＤ選択も行った。トランスフェクションの１５日後、細胞を抗ヒトＦｃ抗体で染色し、フローサイトメトリーベースの分析を行った。ＢＳＤ耐性集団は、細胞表面でのＦｃ発現を示し、その発現レベルは、ＡＡＶＳ遺伝子座に組み込まれた細胞とＮＬＮ遺伝子座に組み込まれた細胞で類似していた（図３Ａ）。
【0262】
さらに、トランスフェクションの２８日後、Ｆｃ発現の安定性を、ＢＳＤ耐性集団を抗ヒトＦｃ抗体で染色することによって試験した。ＮＬＮ遺伝子座に組み込まれた抗体は、均一な発現を示す（図３Ｂ）。
【0263】
実施例４：ＣＨＯ細胞におけるＮＬＮ遺伝子座のバリデーション
この実施例の目的は、ＣＨＯ－ｓ細胞のノイロリシン（ＮＬＮ）のイントロン１遺伝子座からの安定した表面抗体の提示を試験することであった。
この実施例の目的は、ＣＨＯ－ｓ細胞のノイロリシン（ＮＬＮ）のイントロン１遺伝子座からの安定した表面抗体の提示を試験することであった。
【0264】
実験手順
抗体遺伝子の組み込みを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（国際公開第２０１９／１１０６９１号パンフレットに記載）を使用してＡＡＶＳ遺伝子座で又はＴＡＬＥＮ（配列番号６６）を使用してＮＬＮイントロン１で行った。ＣＨＯ－ｓ細胞に、ＡＡＶＳ標的化のための、Ｄｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０２０ ｍＡｂｓ，１２：１，１８２９３３５に記載されている変異ボコシズマブ抗体遺伝子（ｐＩＮＴ１５７－８８４＿０１＿Ｇ０１（配列番号６７）を有する標的プラスミドを同時トランスフェクトした。ＣＨＯ－ｓ細胞に、ＮＬＮイントロン１を標的とするボコシズマブ及び５Ａ１０ｉ（ｐＩＮＴ１５８－ボコシズマブ（配列番号６８）及びｐＩＮＴ１５８－５Ａ１０ｉ（配列番号６９）を有する標的プラスミドを同時トランスフェクトした。５Ａ１０ｉ及びボコシズマブは、それぞれ十分に機能する抗体及び十分に機能しない抗体であるため、抗体の異なるディスプレイが予想された。これは、ディスプレイされた抗体（実施例３に記載の抗ヒトＦｃ抗体）のＦｃ領域に向けられた二次蛍光抗体によって検出されるシグナル（例えば、ＭＦＩ）の大きさの変化によって評価することができる。実験は、ＴＡＬＥＮ ｐＤＮＡを用いたトランスフェクションの場合に二連で行った（表８及び表１０を参照されたい）。図４Ａ及び図４Ｂは、ＣＨＯ細胞におけるＮＬＮ遺伝子構造を示し、図５Ａ及び図５Ｂは、ＮＬＮイントロン１ ＴＡＬＥＮ標的化の設計を示す。
抗体遺伝子の組み込みを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（国際公開第２０１９／１１０６９１号パンフレットに記載）を使用してＡＡＶＳ遺伝子座で又はＴＡＬＥＮ（配列番号６６）を使用してＮＬＮイントロン１で行った。ＣＨＯ－ｓ細胞に、ＡＡＶＳ標的化のための、Ｄｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０２０ ｍＡｂｓ，１２：１，１８２９３３５に記載されている変異ボコシズマブ抗体遺伝子（ｐＩＮＴ１５７－８８４＿０１＿Ｇ０１（配列番号６７）を有する標的プラスミドを同時トランスフェクトした。ＣＨＯ－ｓ細胞に、ＮＬＮイントロン１を標的とするボコシズマブ及び５Ａ１０ｉ（ｐＩＮＴ１５８－ボコシズマブ（配列番号６８）及びｐＩＮＴ１５８－５Ａ１０ｉ（配列番号６９）を有する標的プラスミドを同時トランスフェクトした。５Ａ１０ｉ及びボコシズマブは、それぞれ十分に機能する抗体及び十分に機能しない抗体であるため、抗体の異なるディスプレイが予想された。これは、ディスプレイされた抗体（実施例３に記載の抗ヒトＦｃ抗体）のＦｃ領域に向けられた二次蛍光抗体によって検出されるシグナル（例えば、ＭＦＩ）の大きさの変化によって評価することができる。実験は、ＴＡＬＥＮ ｐＤＮＡを用いたトランスフェクションの場合に二連で行った（表８及び表１０を参照されたい）。図４Ａ及び図４Ｂは、ＣＨＯ細胞におけるＮＬＮ遺伝子構造を示し、図５Ａ及び図５Ｂは、ＮＬＮイントロン１ ＴＡＬＥＮ標的化の設計を示す。
【0265】
細胞培養、フローサイトメトリー及び染色
すべてのＣＨＯ－Ｓ細胞株を、８ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕｔ（カタログ番号２５０３０－０２４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を添加したＣＤ Ｏｐｔｉｃｈｏ培地（ＣＨＯ－Ｆ細胞用、カタログ番号１２６８１－０１１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で培養し、典型的には、７２／９６時間ごとに継代した２５ｍＬの培養液中に維持した。選択のためのＢＳＤ（ブラストサイジン）濃度は３μｇ／ｍｌであった。導入遺伝子の組み込み効率を推定するために、ＢＳＤ選択を行わない重複培養も維持した。
すべてのＣＨＯ－Ｓ細胞株を、８ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕｔ（カタログ番号２５０３０－０２４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を添加したＣＤ Ｏｐｔｉｃｈｏ培地（ＣＨＯ－Ｆ細胞用、カタログ番号１２６８１－０１１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で培養し、典型的には、７２／９６時間ごとに継代した２５ｍＬの培養液中に維持した。選択のためのＢＳＤ（ブラストサイジン）濃度は３μｇ／ｍｌであった。導入遺伝子の組み込み効率を推定するために、ＢＳＤ選択を行わない重複培養も維持した。
【0266】
抗ヒトＦｃ抗体細胞染色及びフローサイトメトリー分析を、実施例３に記載されているように行った。
【0267】
トランスフェクション
トランスフェクションは、製造者のプロトコルに従ってＭａｘｃｙｔｅ（ＭＤ，ＵＳＡ）トランスフェクションを使用して行った（表６も参照されたい）。ＴＡＬＥＮを介した組み込みは、国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットに記載されているように行った。トランスフェクション計画を以下の表８にまとめた。
トランスフェクションは、製造者のプロトコルに従ってＭａｘｃｙｔｅ（ＭＤ，ＵＳＡ）トランスフェクションを使用して行った（表６も参照されたい）。ＴＡＬＥＮを介した組み込みは、国際公開第２０１５／１６６２７２号パンフレットに記載されているように行った。トランスフェクション計画を以下の表８にまとめた。
【0268】
【表12】
【0269】
結果
トランスフェクションの２日後の抗ヒトＦｃ抗体染色
トランスフェクションの２日後、サンプルを、一過性の抗体発現を検出するために抗ヒトＦｃ抗体で染色した。ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたサンプルでは、ｐｃＤＮＡとＴＡＬＥＮ ｐＤＮＡの両方で発現が増加し、抗体遺伝子カセットの早期組み込み／発現を示唆している。５Ａ１０ｉとボコシズマブとの発現プロファイルの差異もそれぞれ抗体の「良好」及び「不良」提示プロファイルによって予想通り観察された（図６）。
トランスフェクションの２日後の抗ヒトＦｃ抗体染色
トランスフェクションの２日後、サンプルを、一過性の抗体発現を検出するために抗ヒトＦｃ抗体で染色した。ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたサンプルでは、ｐｃＤＮＡとＴＡＬＥＮ ｐＤＮＡの両方で発現が増加し、抗体遺伝子カセットの早期組み込み／発現を示唆している。５Ａ１０ｉとボコシズマブとの発現プロファイルの差異もそれぞれ抗体の「良好」及び「不良」提示プロファイルによって予想通り観察された（図６）。
【0270】
トランスフェクションの８日後の抗ヒトＦｃ抗体染色（ＢＳＤ耐性細胞）
トランスフェクションの８日後、ＢＳＤの存在下で培養した細胞から採取したサンプルを、抗体細胞表面の発現を検出のために抗ヒトＦｃ抗体で染色した。トランスフェクションの８日後は、細胞が依然として抗生物質選択下にあるため、安定して発現するクリーンな細胞株産生の早期の時点である。これにもかかわらず、５Ａ１０ｉがＮＬＮイントロン１に組み込まれた細胞では、抗ヒトＦｃ抗体陽性細胞が７８％を超えるかなりクリーンな集団が観察されたが、おそらく抗体の固有のディスプレイ特性が不十分であることが原因で７％未満のみディスプレイされたボコシズマブが組み込まれた細胞とは対照的である（図７Ａ）。予想通り、ｐｃＤＮＡを使用したトランスフェクションから採取したサンプルは、ヌクレアーゼを介した遺伝子組み込みの非存在下では、ほとんど発現を示さなかった。
トランスフェクションの８日後、ＢＳＤの存在下で培養した細胞から採取したサンプルを、抗体細胞表面の発現を検出のために抗ヒトＦｃ抗体で染色した。トランスフェクションの８日後は、細胞が依然として抗生物質選択下にあるため、安定して発現するクリーンな細胞株産生の早期の時点である。これにもかかわらず、５Ａ１０ｉがＮＬＮイントロン１に組み込まれた細胞では、抗ヒトＦｃ抗体陽性細胞が７８％を超えるかなりクリーンな集団が観察されたが、おそらく抗体の固有のディスプレイ特性が不十分であることが原因で７％未満のみディスプレイされたボコシズマブが組み込まれた細胞とは対照的である（図７Ａ）。予想通り、ｐｃＤＮＡを使用したトランスフェクションから採取したサンプルは、ヌクレアーゼを介した遺伝子組み込みの非存在下では、ほとんど発現を示さなかった。
【0271】
トランスフェクションの１４日後の抗ヒトＦｃ抗体染色（ＢＳＤ耐性細胞）
トランスフェクションの１４日後、ＢＳＤの存在下で培養した細胞から採取したサンプルを、抗体の細胞表面での発現の検出のために抗ヒトＦｃ抗体で染色した。５Ａ１０ｉがＮＬＮイントロン１に組み込まれた細胞では、集団全体の明確なシフトが観察された（図７Ｂ）。これにより、ＮＬＮイントロン１に対する抗体発現の標的化の有用性が確認された。５Ａ１０ｉとボコシズマブとの間には明らかな発現差があり、抗体の生物物理学的特性に基づく細胞表面ディスプレイの発現可能性が確認された。
トランスフェクションの１４日後、ＢＳＤの存在下で培養した細胞から採取したサンプルを、抗体の細胞表面での発現の検出のために抗ヒトＦｃ抗体で染色した。５Ａ１０ｉがＮＬＮイントロン１に組み込まれた細胞では、集団全体の明確なシフトが観察された（図７Ｂ）。これにより、ＮＬＮイントロン１に対する抗体発現の標的化の有用性が確認された。５Ａ１０ｉとボコシズマブとの間には明らかな発現差があり、抗体の生物物理学的特性に基づく細胞表面ディスプレイの発現可能性が確認された。
【0272】
トランスフェクションの８日後及び１４日後の組み込み効率（ＢＳＤ選択なし）
ＢＳＤなしで培養した細胞から採取したサンプルを、トランスフェクションの８日後及び１４日後の組み込み効率の測定のために抗ヒトＦｃ抗体で染色した。その結果を以下の表９に示す。
ＢＳＤなしで培養した細胞から採取したサンプルを、トランスフェクションの８日後及び１４日後の組み込み効率の測定のために抗ヒトＦｃ抗体で染色した。その結果を以下の表９に示す。
【0273】
【表13】
【0274】
トランスフェクションの８日後、抗ヒトＦｃ抗体で染色した、ＢＳＤなしで培養した細胞から採取したサンプルの測定値は、抗体－遺伝子組み込み効率のおおよその数値を表している。ＮＬＮのイントロン１を標的とする設計の場合、５Ａ１０ｉ抗体に基づくと、ＴＡＬＥＮプラスミドＤＮＡ及びＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡの両方で約２．５％の組み込み効率が達成された。
【0275】
反復トランスフェクション実験：
以下のトランスフェクションを反復して、ＮＬＮのイントロン１の標的化の再現性を確認した（表１０）。
以下のトランスフェクションを反復して、ＮＬＮのイントロン１の標的化の再現性を確認した（表１０）。
【0276】
【表14】
【0277】
ＢＳＤ耐性細胞
ＢＳＤが存在する細胞培養物から採取したサンプルを、トランスフェクションの１日後、７日後及び１４日後に抗ヒトＦｃ抗体を使用して染色した。ボコシズマブ及び５Ａ１０ｉの発現プロファイルは、２つの抗体の固有の生物物理学的特性に基づく発現の差を示している。この結果は、哺乳動物ディスプレイのための抗体発現の標的化の再現性と有用性を裏付けている（図８）。
ＢＳＤが存在する細胞培養物から採取したサンプルを、トランスフェクションの１日後、７日後及び１４日後に抗ヒトＦｃ抗体を使用して染色した。ボコシズマブ及び５Ａ１０ｉの発現プロファイルは、２つの抗体の固有の生物物理学的特性に基づく発現の差を示している。この結果は、哺乳動物ディスプレイのための抗体発現の標的化の再現性と有用性を裏付けている（図８）。
【0278】
トランスフェクションの７日後及びトランスフェクションの１４日後に測定した組み込み効率（ＢＳＤ選択なし）
ＢＳＤが存在しない細胞培養物から採取したサンプルを、抗ヒトＦｃ抗体でのトランスフェクションの７日後及び１４日後に組み込み効率の測定のために染色した。数値は、ゲート内の陽性細胞の割合（％）を示す。トランスフェクション７日後には最大４．６％の組み込み効率が達成され、トランスフェクションの１４日後でもなお３．３％で検出可能であった（図９）。これらの数値は、ＮＬＮのイントロン１を標的とする設計で以前に観察された組み込み効率を裏付けている。
ＢＳＤが存在しない細胞培養物から採取したサンプルを、抗ヒトＦｃ抗体でのトランスフェクションの７日後及び１４日後に組み込み効率の測定のために染色した。数値は、ゲート内の陽性細胞の割合（％）を示す。トランスフェクション７日後には最大４．６％の組み込み効率が達成され、トランスフェクションの１４日後でもなお３．３％で検出可能であった（図９）。これらの数値は、ＮＬＮのイントロン１を標的とする設計で以前に観察された組み込み効率を裏付けている。
【0279】
参考文献
下記及び本開示の任意の箇所に記載されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
１ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２１（５），１０８１－１０８５．
２ Ｂｏｕｂｌｉｋ，Ｙｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｐｌａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３（１０），１０７９－１０８４．
３ Ｍｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ（２０００）．Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃＦｖ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＩｇＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２７５（１），８４－９０．
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１０ Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆＨｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏＨｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２（２），１９３－２０４．
１１ Ｈｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ２２ Ｆｖ ｗｉｔｈＨｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｙ Ｆｖ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎＨｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０３（２５），９６３７－９６４２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６０３６５３１０３
１２ Ｈｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｃＦｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎＨＥＫ－２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，５６２，９９－１１３．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６０３２７－３０２－２ ８
１３ Ａｋａｍａｔｓｕ，Ｙ．，Ｐａｋａｂｕｎｔｏ，Ｋ．，Ｘｕ，Ｚ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ，Ｎ．（２００７）．Ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ－ＩＬ－１２ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３２７（１－２），４０－５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２００７．０７．００７
１４ Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｂａｕｅｒ，Ｍ．，Ｂｕｓｅｒ，Ｒ．Ｂ．，Ｇｗｅｒｄｅｒ，Ｍ．，Ｍｕｎｔｗｉｌｅｒ，Ｓ．，Ｍａｕｒｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００８ Ｓｅｐ ２３；１０５（３８）：１４３３６－４１．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０５９４２１０５
１５ Ｂｒｅｏｕｓ－Ｎｙｓｔｒｏｍ，Ｅ．，Ｓｃｈｕｌｔｚｅ，Ｋ．，Ｍｅｉｅｒ，Ｍ．，Ｆｌｕｅｃｋ，Ｌ．，Ｈｏｌｚｅｒ，Ｃ．，Ｂｏｌｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｒｅｔｒｏｃｙｔｅ Ｄｉｓｐｌａｙ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａＨｉｇｈ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１－１１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１３．０９．００３
１６ Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，Ｗｈｉｔｅｓｏｎ＆Ｒｉｃｅ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００６ ７５：５６７－６０５
１７ Ｚｈｏｕ，Ｃ．，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｆ．Ｗ．，Ｃａｉ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｑ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．Ｄ．（２０１０）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ．ｍＡｂｓ，２（５），５０８－５１８
１８ Ｌｉ，Ｃ．Ｚ．，Ｌｉａｎｇ，Ｚ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｒ．，Ｌｏｕ，Ｈ．Ｂ．，Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆＨＢｓＡｇ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆＨｅａｌｔｈｙ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｄｏｎｏｒ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９（２），１８４－１９０．
１９ Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．，Ｒｉｎｇｒｏｓｅ，Ｌ．，Ａｎｇｒａｎｄ，Ｐ．Ｏ．，Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．，＆Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．（１９９６）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ＦＬＰ ａｎｄ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｅｄ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２４（２１），４２５６－４２６２．
２０ Ｓｃｈａｆｔ，Ｊ．，Ａｓｈｅｒｙ－Ｐａｄａｎ，Ｒ．，ＶａｎＨｏｅｖｅｎ，Ｆ．Ｄ．，Ｇｒｕｓｓ，Ｐ．，＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．（２００１）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＦＬＰ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｏｃｙｔｅｓ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，３７（１），６－１０．
２１ Ｍｏｅｈｌｅ，Ｅ．Ａ．，Ｍｏｅｈｌｅ，Ｅ．Ａ．，Ｒｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｙ．－Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｙ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅＨｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０４（９），３０５５－３０６０．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６１１４７８１０４
２２ Ｃｒｉｓｔｅａ，Ｓ．，Ｆｒｅｙｖｅｒｔ，Ｙ．，Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｙ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｐ．Ｄ．，Ｃｏｓｔ，Ｇ．Ｊ．（２０１３）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｄｏｎｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，／１０（３），８７１－８８０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２４７３３
２３ Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ，Ｆ．，Ｍａｌｉｓｓｅｎ，Ｂ．（１９８９）．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａ ｖａｒｉａｎｔ ｄｅｐｒｉｖｅｄ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｐｈａ－ｍＲＮＡ ｏｆ ＢＷ５１４７ ｏｒｉｇｉｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９（１２），２２６９－２２７４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｊｉ．１８３０１９１２１４
２４ Ｋａｎａｙａｍａ，Ｎ．，Ｔｏｄｏ，Ｋ．，Ｒｅｔｈ，Ｍ．，Ｏｈｍｏｒｉ，Ｈ．（２００５）．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＨｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｉｎ ａ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３２７（１），７０－７５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２００４．１１．１４３
２５ Ｌｉｎ，Ｗ．，Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｋ．，Ｍｕｒａｙａｍａ，Ａ．，Ｋａｇａｙａ，Ｅ．，８ Ｏｈｔａ，Ｋ．（２０１１）．Ｂ－ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙ－ｂａｓｅｄ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃＨｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（３），ｅ１４－ｅ１４．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ１１２２
２６ Ａｄａｃｈｉ，Ｎ．，Ｓｏ，Ｓ．，ｌｉｉｚｕｍｉ，Ｓ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｙ．，Ｍｕｒａｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｋａｗａ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）．ＴｈｅＨｕｍａｎ ｐｒｅ－Ｂ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｎａｌｍ－６ ｉｓＨｉｇｈｌｙ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５（１），１９－２４．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｄｎａ．２００６．２５．１９
２７ Ｐａｌａｃｉｏｓ，Ｒ．，８ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，Ｍ．（１９８５）．ＩＬ３－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ｃｌｏｎｅｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ Ｂ－２２０ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ｃｏｎｔａｉｎ Ｉｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｅｌｌ，４１（３），７２７－７３４
２８ Ｂａｒｒｅｔｉｎａ，Ｊ．，Ｃａｐｏｎｉｇｒｏ，Ｇ．，Ｓｔｒａｎｓｋｙ，Ｎ．，Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ｋ．，Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ａ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｅｎａｂｌｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ，４８３（７３９１），６０３－６０７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１００３
２９ Ｆｏｒｂｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｂｉｎｄａｌ，Ｎ．，Ｂａｍｆｏｒｄ，Ｓ．，Ｃｏｌｅ，Ｃ．，Ｋｏｋ，Ｃ．Ｙ．，Ｂｅａｒｅ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．ＣＯＳＭＩＣ：ｍｉｎｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ），Ｄ９４５－５０．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ９２９
３０ Ｓｉｌｖａ，Ｇ．，Ｐｏｉｒｏｔ，Ｌ．，Ｇａｌｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．，Ｍｏｎｔｏｙａ，Ｇ．，Ｄｕｃｈａｔｅａｕ，Ｐ．，Ｐａｑｕｅｓ，Ｆ．（２０１１）．Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１’／（１），１１－２７
３１ Ｅｐｉｎａｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｉｌｖａ，Ｇ．Ｈ．，Ｐａｑｕｅｓ，Ｆ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．，Ｄｕｃｈａｔｅａｕ，Ｐ．（２０１３）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｕｒｐｏｓｅｓ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｖｏｌ．２３，ｐｐ．１４７－１８５）．
３２ Ｓｚｃｚｅｐｅｋ，Ｍ．，Ｂｒｏｎｄａｎｉ，Ｖ．，Ｂｕｃｈｅｌ，Ｊ．，Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｌ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．（２００７）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（７），７８６－７９３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１３１７
３３ Ｄｏｙｏｎ，Ｙ．，Ｖｏ，Ｔ．Ｄ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｍ．Ｃ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｘｉａ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ－ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｂｌｉｇａｔｅＨｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８（１），７４－７９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１５３９
３４ Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｃ．Ａ．（２０１２）．Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＲＯＳＡ２６ ｌｏｃｕｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０（８），３７４１－３７５２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ１ ２１４
３５ Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｙ．－Ｌ．，Ｂｅａｕｓｅｊｏｕｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｒｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ａｕｇｕｓｔｕｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＨｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４３５（７０４２），６４６－６５１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３５５６
３６ Ｍａｒｅｓｃａ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｖ．Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｎ．，＆Ｙａｎｇ，Ｙ．（２０１３）．Ｏｂｌｉｇａｔｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｇａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＯｂＬｉＧａＲｅ）：ｃｕｓｔｏｍ－ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（３），５３９－５４６．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１４５４４１．１１２
３７ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．，＆Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．（２０１１）．ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３（６０５１），１８４３－１８４６．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０４０９４
３８ Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．，Ｋｈｇａｙｔｅｒ，Ｃ．，Ｆｏｄｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，８ Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．（２０１２）．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒＨｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０（５），４６０－４６５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２１７０
３９ Ｂｏｉｓｓｅｌ，Ｓ．，Ｊａｒｊｏｕｒ，Ｊ．，Ａｓｔｒａｋｈａｎ，Ａ．，Ａｄｅｙ，Ａ．，Ｇｏｕｂｌｅ，Ａ．，Ｄｕｃｈａｔｅａｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．ｍｅｇａＴＡＬｓ：ａ ｒａｒｅ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４
４０ Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ，Ｍ．，Ｂｉｅｔｚ，Ｆ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．，Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｔ．，Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｃｏｍｐａｃｔ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４，１７６２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２
４１ Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｄ．Ｓ．（２０１４）．Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ：Ｎｅｗｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａ／Ｂｉｏｌｏｇｙ，３６（１），３４－３８．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｅｓ．２０１３００１３５
４２ Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１６６），８４－８７．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４７００５
４３ Ｗａｎｇ，Ｔ．，Ｗｅｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．（２０１４）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１６６），８０－８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．２４６９８１
４４ Ｂｅａｒｄ，Ｃ．，Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｐｌａｔｈ，Ｋ．，Ｗｕｔｚ，Ａ．，＆Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２００６）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｐｙ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，４４（１），２３－２８．
４５ Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｓ．Ｊ．，Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｙ．，ＤｅＫｅｌｖｅｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｆｒｅｙｖｅｒｔ，Ｙ．，Ｂｏｙｄｓｔｏｎ，Ｅ．Ａ．，Ｍｏｅｈｌｅ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｄｒｉｖｅｎ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ｄｏｎｏｒｓ ｗｉｔｈ ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＨｏｍｏｌｏｇｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１５），ｅ１５２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ ５１２
４６ Ｃａｄｉｎａｎｏｓ ２００７
４７ Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｙｅａ，Ｋ．，Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｒｕｉｚ，Ｄ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０（５），７３４－７４１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０１３．０４．０１２
４８ Ｐｏｒｔｅｕｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．（２００３）．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００（５６２０），７６３．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０７８３９５
４９ Ｒｏｕｅｔ，Ｐ．，Ｓｍｉｈ，Ｆ．，＆Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（１９９４）．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４（１２），８０９６－８１０６．
５０ Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（１９９６）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２（６），２２４－２２８
５１ Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，＆Ｍａｉｚｅｌｓ，Ｎ．（２０１１）．ＤＮＡ ｎｉｃｋｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓａｆｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，６（９），ｅ２３９８１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２３９８１
５２ Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｋ．，Ａｒａｔａｎｉ，Ｙ．，Ｋｕｓａｎｏ，Ｋ．，Ｋｏｙａｍａ，Ｈ．（１９９３）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２１（３），４０７－４１２
５３ Ｋｈａｎ，Ｉ．Ｆ．，Ｈｉｒａｔａ，Ｒ．Ｋ．，＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２０１１）．ＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒＨｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，６（４），４８２－５０１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．３０１
５４ Ｄｅｙｌｅ，Ｄ．Ｒ．，８ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００９）．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１（４），４４２－４４７
５５ Ｂｅｎａｔｕｉｌ，Ｌ．，Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｅｌｋ，Ｊ．，Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．Ｍ．（２０１０）．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅＨｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２３（４），１５５－１５９．
５６ Ｆｅｌｄｈａｕｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ｗ．，Ｏｐｒｅｓｋｏ，Ｌ．Ｋ．，Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｆｅｌｄｈａｕｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｆｌｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆＨｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
５７ Ｚｈａｏ，Ａ．，Ｎｕｎｅｚ－Ｃｒｕｚ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｃ．，Ｃｏｕｋｏｓ，Ｇ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｄ．Ｌ．，８ Ｓｃｈｏｌｌｅｒ，Ｎ．（２０１１）．Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆＨｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙＨｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ Ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ／ＴＥＭ１，ｕｓｉｎｇ ａ ｐａｉｒｅｄ ｙｅａｓｔ－ｄｉｓｐｌａｙ／ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｓｃＦｖ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６３（２），２２１－２３２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１０．０９．００１
５８ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（２００７）．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８（４），２９５－３０４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｐｂｉｏ．２００７．０４．０１０
５９ Ｇｅｂａｕｅｒ，Ｍ．，＆Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（２００９）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（３），２４５－２５５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｂｐａ．２００９．０４．６２７
６０ Ｈａａｎ＆Ｍａｇｇｏｓ（２００４）ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）：Ａ１－Ａ６
６１ Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８４：１１４１－１１５１．
６２ Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３－４６９
６３ Ｗｅｓｓ，Ｌ．Ｉｎ：ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１－Ａ７，２００４
６４ Ｃｈａｎｇ，Ｈ．－Ｊ．，Ｈｓｕ，Ｈ．－Ｊ．，Ｃｈａｎｇ，Ｃ．－Ｆ．，Ｐｅｎｇ，Ｈ．－Ｐ．，Ｓｕｎ，Ｙ．－Ｋ．，Ｙｕ，Ｈ．－Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｓｔｉｎｅ－Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ Ｂｉｎｄｅｒｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１７（４），６２０－６３１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｒ．２００９．０１．０１１
６５ Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９）
６６ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２－５５４（１９９０）
６７ Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１，４８４－４９０（２００３）
６８ Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３－４２６，（１９８８） ６９ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９－５８８３，（１９８８）
７０ Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０ ６４４４－６４４８，（１９９３）
７１ Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９－１２４５，（１９９６）
７２ Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１２６－１１３６（２００５）
７３ Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６，５７－８６（２０００）
７４ Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４，６７－８４（２００１）
７５ Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｌｅｎ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｒｅｖ．１８：４１１－４１９（１９９９）
７６ Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４，４４６－４４９（１９９３）
７７ Ｇｌｅｎｎｉｅ Ｍ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，２３６７－２３７５（１９８７）
７８ Ｒｅｐｐ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔ．３７７－３８２（１９９５）
７９ Ｓｔａｅｒｚ Ｕ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｅｖａｎ Ｍ．Ｊ．ＰＮＡＳ ８３（１９８６）
８０ Ｓｕｒｅｓｈ Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０－２２８（１９８６）
８１ Ｍｅｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７－６８１（１９９８）
８２ Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９，６１６－６２１，（１９９６）
８３ Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，Ｂｏｎｎｅｒｔ，Ｔ．Ｐ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９１）．Ｂｙ－ｐａｓｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ－ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｐｈａｇｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２２２（３），５８１－５９７．
８４ Ｇｒｏｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｇ．Ｋ．，Ｇｒａｎｔ，Ｆ．Ｊ．，Ｈａｌｄｅｍａｎ，Ｂ．Ａ．，Ｈａｒｔ，Ｃ．Ｅ．，Ｏ’Ｈａｒａ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｇｅｎ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅＨｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ（Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．３４３５－３４３９）．Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．
８５ Ｋｕｍａｒ，Ｎ．，＆Ｂｏｒｔｈ，Ｎ．（２０１２）．Ｆｌｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５６（３），３６６－３７４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１２．０３．００４
８６ Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ，Ｓ．Ｃ．Ｇ．，Ｃｈｉａｎｇ，Ｇ．Ｇ．，Ｓｚｉｌｖａｓｉ，Ａ．，Ｍｏｈａｎ，Ｓ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｒ．Ｉ．，ＭａｃＬｅａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｓ ｏｆＨｉｇｈｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ／Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７７（１－２），１４１－１５５．
８７ Ｐｉｃｈｌｅｒ，Ｊ．，Ｈｅｓｓｅ，Ｆ．，Ｗｉｅｓｅｒ，Ｍ．，Ｋｕｎｅｒｔ，Ｒ．，Ｇａｌｏｓｙ，Ｓ．Ｓ．，Ｍｏｔｔ，Ｊ．Ｅ．，＆Ｂｏｒｔｈ，Ｎ．（２００９）．Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｄ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｓｓａｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４１（１－２），８０－８３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２００９．０３．００１
８８ Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ，Ｋ．，Ｆｕ，Ｊ．，Ｐａｔｓｃｈ，Ｃ．，Ｈｕ，Ｓ．，Ｗｅｉｄｌｉｃｈ，Ｓ．，Ｄｕｅｒｓｃｈｋｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｄｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ，ｌｉｋｅ Ｃｒｅ，ｉｓ ａＨｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ．Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，２（９－１０），５０８－５１５．ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｍｍ．００３０８７
８９ Ｈｏｒｌｉｃｋ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｃｏｍｂｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｏｗｅｒｓ，Ｐ．Ｍ．，Ｎｅｂｅｎ，Ｔ．Ｙ．，Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｋｒａｐｆ，Ｉ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８８（２７），１９８６１－１９８６９．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１３．４５２４８２
９０ Ｂｉｆｆｉ，Ｇ．，Ｔａｎｎａｈｉｌｌ，Ｄ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，＆Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．（２０１３）．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５（３），１８２－１８６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍ．１５４８
９１ Ｇａｏ，Ｊ．，Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．，＆Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（２００９）．Ｔｗｏ－ｓｔａｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０６（９），３０７１－３０７６．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８１２９５２１０６
９２ Ｇｕ，Ｇ．Ｊ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｍ．，Ｊｏｓｔ，Ｃ．，Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｋ．，Ｋａｍａｌｉ－Ｍｏｇｈａｄｄａｍ，Ｍ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｅｒｓ ｆｏｒ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ／，３０（２），１４４－１５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｂｔ．２０１２．０５．００５
９３ Ｃｈｏ，Ｙ．Ｋ．，＆Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．（２０１０）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ－ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ．Ｐｒｏｆｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｉ，２３（７），５６７－５７７．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｑ ０２９
９４ Ｔｉｌｌｏｔｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｈｏ，Ｙ．Ｋ．，＆Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．（２０１３）．Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ：ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６０（１），２７－３７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１２．０３．０１０
９５ Ｋｕｎｅｒｔ，Ａ．，Ｓｔｒａｅｔｅｍａｎｓ，Ｔ．，Ｇｏｖｅｒｓ，Ｃ．，Ｌａｍｅｒｓ，Ｃ．，Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎ，Ｒ．，Ｓｌｅｉｊｆｅｒ，Ｓ．，Ｄｅｂｅｔｓ，Ｒ．（２０１３）．ＴＣＲ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｅｔ Ｎｅｗ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｔｏ Ｔｒｅａｔ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ：Ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｔ Ｃｅｌｌ Ｆｉｔｎｅｓｓ，ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｌｉｅｕ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４，３６３．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００３６３
９６ Ｌｉｄｄｙ，Ｎ．，Ｂｏｓｓｉ，Ｇ．，Ａｄａｍｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｌｉｓｓｉｎａ，Ａ．，Ｍａｈｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｈａｓｓａｎ，Ｎ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＴＣＲ－ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８（６），９８０－９８７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．２７６４
９７ Ｈｏｌｌｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｈｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｏ．，Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．，Ｏ’Ｈｅｒｒｉｎ，Ｓ．，Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．，８ Ｋｒａｎｚ，Ｄ．Ｍ．（２０００）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈＨｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７（１０），５３８７－５３９２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８００７８２９７
９８ Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．Ｓ．，Ｄｏｎｅｒｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ａｌｌｅｎ，Ｐ．Ｍ．，８ Ｋｒａｎｚ，Ｄ．Ｍ．（２００５）．Ｃｌａｓｓ ＩＩ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｏｒＨｉｇｈｅｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｉｎｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０２（５２），１９０３３－１９０３８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５０７５５４１０２
９９ Ｋｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｗ．，ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｏｏｍ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｐｉｔｓ，Ｈ．，Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ，Ｅ．，８ Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ．Ｎ．（２０００）．Ｃｈａｎｇｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｂｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７（２６），１４５７８－１４５８３．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．９７．２６．１４５７８
１００ Ｃｈｅｒｖｉｎ，Ａ．Ｓ．，Ａｇｇｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｒａｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｍ．，８ Ｋｒａｎｚ，Ｄ．Ｍ．（２００８）．ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＨｉｇｈｅｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３９（２），１７５－１８４．
１０１ Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｆ．，Ｊｏｒｄａｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｓｔａｄｉｎｓｋｉ，Ｂ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｈｕｓｅｂｙ，Ｅ．，Ｍａｒｒａｃｋ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＭＨＣ／ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２１０，１５６－１７０．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．０１０５－２８９６．２００６．００３６５．ｘ
１０２ Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｋ Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．（２０１３）．Ｒｅａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１（１１），９９９－１００８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２７２５
１０３ Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｒ．，８ Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｉ．（２０１３）．Ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，３（４），３８８－３９８．ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９－８２９０．ＣＤ－１２－０５４８
１０４ Ａｌｏｎｓｏ－Ｃａｍｉｎｏ，Ｖ．，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ．，Ｃｏｍｐｔｅ，Ｍ．，Ｓａｎｚ，Ｌ．，８ Ａｌｖａｒｅｚ－Ｖａｌｌｉｎａ，Ｌ．（２００９）．Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，４（９），ｅ７１７４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００７１７４
１０５ Ｍｅｌｉｄｏｎｉ，Ａ．Ｎ．，Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｗｏｒｍａｌｄ，Ｓ．，８ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（２０１３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１１０（４４），１７８０２－１７８０７．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３１２０６２１１０
１０６ Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．，＆Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（２０１２）．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｆｒｏｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０９（３９），１５７２８－１ ５７３３．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１４２７５１０９
１０７ Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｙｅａ，Ｋ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｍｏｌｄｔ，Ｂ．，Ｈｅ，Ｌ．，Ｚｈｕ，Ｊ．，８ Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（２０１４）．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，２／（２），２７４－２８３．
１０８ Ｙｅａ，Ｋ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｇ．，Ｓｏｎｇ，Ｂ．Ｄ．，８ Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｇｏｎｉｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｕｎｂｉａｓｅｄ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ（Ｖｏｌ．１１０，ｐｐ．１４９６６－１４９７１）．Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３１３６７１１１０
１０９ Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ｕｅｄａ，Ｈ．，８ Ｎａｇａｍｕｎｅ，Ｔ．（２００４）．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇＨａｐｔｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｈｉｍｅｒａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３’／５（１），１３２－１３８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２００４．０１．０３０
１１０ Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｏ，Ｙ．，Ｓｏｇｏ，Ｔ．，Ｈｉｔｏｍｉ，Ａ．，Ｕｅｄａ，Ｈ．，８ Ｎａｇａｍｕｎｅ，Ｔ．（２００８）．Ａｎｔｉｇｅｎｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｐｒｏ－Ｂ Ｂａ／Ｆ３ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｈｉｍｅｒａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ／ｏｇｙ，１３３（１），１５４－１６１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２００７．０９．００９
１１１ Ｓｏｇｏ，Ｔ．，Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ｕｅｄａ，Ｈ．，Ｏｔｓｕ，Ｍ．，Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｍ．，Ｎａｋａｕｃｈｉ，Ｈ．，８ Ｎａｇａｍｕｎｅ，Ｔ．（２００９）．Ｔ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｕｓｉｎｇＨａｐｔｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｈｉｍｅｒａ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，４６（１），１２７－１ ３６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｙｔｏ．２００８．１２．０２０
１１２ Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｓｏｇｏ，Ｔ．，Ｔｅｎｇ，Ｊ．，Ｏｔｓｕ，Ｍ．，Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｃ－Ｍｐｌ ｃｈｉｍｅｒａ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５５（３），４０２－４０８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｙｔｏ．２０１１．０５．０２４
１１３ Ｕｅｄａ，Ｈ．，Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ａｂｕｒａｔａｎｉ，Ｔ．，Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｔｏｄｏｋｏｒｏ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃｅｌｌ－ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｙ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｇ Ｖｄｏｍａｉｎｓ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｅｐｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ／Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４１（１－２），１５９－１７０．
１１４ Ｋｅｒｐｐｏｌａ，Ｔ．Ｋ．（２００９）．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，３８（１０），２８７６－２８８６．
１１５ Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．，Ｅａｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｍａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．，Ｒｅｍｙ，Ｉ．，８ Ｓｔｅｆａｎ，Ｅ．（２００７）．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，６（７），５６９－５８２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ２３１
１１６ Ｐｅｔｓｃｈｎｉｇｇ，Ｊ．，Ｇｒｏｉｓｍａｎ，Ｂ．，Ｋｏｔｌｙａｒ，Ｍ．，Ｔａｉｐａｌｅ，Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｋｕｒａｔ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ（ＭａＭＴＨ）ｆｏｒ ｐｒｏｂｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８９５
１１７ Ｒｅｎａｕｔ，Ｌ．，Ｍｏｎｎｅｔ，Ｃ．，Ｄｕｂｒｅｕｉｌ，Ｏ．，Ｚａｋｉ，Ｏ．，Ｃｒｏｚｅｔ，Ｆ．，Ｂｏｕａｙａｄｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅＨｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｆｖ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅ ｉｇｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｂｙＨｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．９０７，ｐｐ．４５１－４６１）
１１８ Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，Ｃｏｌｗｉｌｌ，Ｋ．，Ｐｅｒｓｈａｄ，Ｋ．，Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｍａｐｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，４１７（１），２５－３５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１１．０５．００５
１１９ ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ Ｐ（２００２）Ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２：３５５－３７８．ｄｏｉ：１０．２１７４／１５６６５２３０２３３４７７４２．
１２０ Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９２）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅＨｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２２４（２），４８７－４９９．
１２１ Ｍａｓｓｉｅ，Ｂ．，Ｄｉｏｎｎｅ，Ｊ．，Ｌａｍａｒｃｈｅ，Ｎ．，Ｆｌｅｕｒｅｎｔ，Ｊ．，Ｌａｎｇｅｌｉｅｒ，Ｙ．（１９９５）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｖｉｄｅｓＨｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｒ１ ａｎｄ Ｒ２ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３（６），６０２－６０８．
１２２ Ｋｉｍ，Ｄ．Ｗ．，Ｕｅｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｋａｚｉｒｏ，Ｙ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，８ Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．（１９９０）．Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅＨｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ，９１（２），２１７－２２３．
１２３ Ｈｏｌｄｅｎ，Ｐ．，Ｋｅｅｎｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｌｕｎｓｔｒｕｍ，Ｇ．Ｐ．，Ｂａｃｈｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｐ．，８Ｈｏｒｔｏｎ，Ｗ．Ａ．（２００５）．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８０（１７），１７１７２－１７１７９．
１２４ Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，Ｅ．Ｐ．，８ Ｂｕｓｈｍａｎ，Ｆ．Ｄ．（２０１２）．ＳａｆｅＨａｒｂｏｕｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅＨｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，１２（１），５１－５８．
１２５ Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｃｕｎｎｉｆｆ，Ｍ．Ｍ．，Ｆｅｎｇ，Ｇ．，８ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．（２０１２）．Ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，７（１），１７１－１９２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎ ｐｒｏｔ．２０１１．４３１
１２６ Ｆａｌｋ，Ｒ．，Ｆａｌｋ，Ａ．，Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｍｅｌｉｄｏｎｉ，Ａ．Ｎ．，Ｐａｒｔｈｉｂａｎ，Ｋ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－Ｎｏｔｃｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５８（１），６９－７８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１２．０７．００８
１２７ Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｒｏｊａｓ，Ｇ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｎ．，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｋ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｊ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｊ．（２００６）．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４６．
１２８ Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．，Ｋｈｇａｙｔｅｒ，Ｃ．，Ｆｏｄｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．（２０１２）．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒＨｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０（５），４６０－４６５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２１７０
１２９ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｗｅｙｄｅｎ，Ｌ．，Ａｄａｍｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｗ．，Ｔａｎｎａｈｉｌｌ，Ｄ．，Ａｒｅｎｄｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（２００５）．Ｎｕｌｌ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ｂ ａｌｌｅｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｐｕｒｏｈｔｋ ＬｏｘＰ／ＦＲＴ ｖｅｃｔｏｒ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，４４（４），１７１－１７８
１３０ ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ．，８ Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｄ．（２００４）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅｌｆ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８），６１６－６２６．
１３１ Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｃ．Ｓ．，＆Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ．（２００７）．Ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＦＬＰ ａｎｄ ＰｈｉＣ３１ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２（１），ｅ１６２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００００１６２
１３２ Ｋｒａｎｚ，Ａ．，Ｆｕ，Ｊ．，Ｄｕｅｒｓｃｈｋｅ，Ｋ．，Ｗｅｉｄｌｉｃｈ，Ｓ．，Ｎａｕｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．，Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ，Ｋ．（２０１０）．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｌｐ ｄｅｌｅｔｅｒ ｍｏｕｓｅ ｉｎ Ｃ５７ＢＩ／６ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｆｌｐｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，４８（８），５１２－５２０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｄｖｇ．２０６４１
１３３ Ｓｚｙｍｃｚａｋ ＡＬ，Ｖｉｇｎａｌｉ ＤＡ（２００５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６２７－６３８．ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７１２５９８．５．５．６２７
１３４ Ｃｈａｐｐｌｅ，Ｓ．Ｄ．，Ｃｒａｆｔｓ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈａｄｂｏｌｔ，Ｓ．Ｐ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，ａｎｄ Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．（２００６）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，４９．
１３５．Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＨｕｍａｎ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７０，９０５３－９０６１（２０１０）．
１３６ Ｓｚｙｍｃｚａｋ，Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｇｅｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ’ｓｅｌｆｃｌｅａｖｉｎｇ’ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ －ｂａｓｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２，５８９－５９４（２００４）．
１３７．Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆＨｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｐｉｃｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，３４９－３５４（２００５）．
１３８．Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＴＣＲｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｒｏｖｉｄｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａｎｄ ｋｉｌｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９，５８４５－５８５４（２００７）．
１３９．Ｍａｄｕｒａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｂｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８８，１８７６６－１８７７５（２０１３）．
１４０．Ｐｉｅｒｃｅ，Ｂ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １０，ｅ１００３４７８（２０１４）．
１４１．Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ＴＣＲ ｔｈａｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ ＣＤ３ｚｅｔａ ｉｎｄｕｃｅＨｉｇｈｌｙ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｐａｉｒｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ＴＣＲａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｃｈａｉｎｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０，７７３６－７７４６（２００８）．
１４２．Ｒｏｓｚｉｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｙｎａｐｓｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ＣＤ３ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ＴＣＲ：（，ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｆｏｒ ＴＣＲ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１，１２８８－１２９７（２０１１）．
１４３．Ｃｏｈｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｚ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ－ｈｕｍａｎＨｙｂｒｉｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＣＲ）ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐａｉｒｉｎｇ ａｎｄ ＴＣＲＩＣＤ３ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６，８８７８－８８８６（２００６）．
１４４．Ｈｕｏｖｉｎｅｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｏｗｅｒｅｄ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７，ｅ３１８１７（２０１２）．
１４５．Ｃｒｉｂｂｓ，Ａ．Ｐ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｂ．＆Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｆ．Ｍ．Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅＨｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙＨｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，９８（２０１３）．
１４６．Ｏｅｌｋｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘ ｖｉｖｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙＨＬＡ－Ｉｇ－ｃｏａｔｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，６１９－６２４（２００３）．
１４７．Ｗｏｌｆ ｌ，Ｍ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｄ．Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｉｖｅ，Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ９，９５０－９６６（２０１４）．
１４８．Ｌｉｐｏｗｓｋａ－Ｂｈａｌｌａ，Ｇ．，Ｇｉｌｈａｍ，Ｄ．Ｅ．，Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．＆Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，Ｄ．Ｇ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ａ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４，３８１－３９１（２０１３）．
１４９．Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｈａｒｏｎ，Ｅ．，Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．Ｈａｓｓａｎ，Ｒ．Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ａｎｄ ｉｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１１，５１７－５２５（２０１２）．
１５０．Ａｔａｎａｃｋｏｖｉｃ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＣＤ２２９ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９６，１５１２－１５２０（２０１１）．
１５１．Ｂｕｎｄ，Ｄ．，Ｍａｙｒ，Ｃ．，Ｋｏｆｌｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｌｌｅｋ，Ｍ．＆Ｗｅｎｄｔｎｅｒ，Ｃ．－Ｍ．Ｈｕｍａｎ Ｌｙ９（ＣＤ２２９）ａｓ ｎｏｖｅｌ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＡＡ）ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｂ－ＣＬＬ）ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４，８６０－８６９（２００６）．
１５２．Ｔｉｅｄｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｄｈｉｒｏｎ：ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２７，１４５－１５５（２０１４）．
１５３．Ｍａｒｅｓｃａ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｖ．Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｎ．＆Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｏｂｌｉｇａｔｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｇａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＯｂＬｉＧａＲｅ）：ｃｕｓｔｏｍ－ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３，５３９－５４６（２０１３）．
１５４．ＭｃＶｅｙ，Ｍ．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｅ．ＭＭＥＪ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ（ｄｉｒｅｃｔｏｒ’ｓ ｃｕｔ）：ｄｅｌｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｅｎｄｉｎｇｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２４，５２９－５３８（２００８）．
１５５．Ｎａｋａｄｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ ｕｓｉｎｇ ＴＡＬＥＮｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲＩＣａｓ９．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５，５５６０（２０１４）．
１５６．Ｃｈｉｃｈｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｑｕａｓｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｔｉｆｓ ｔｏ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ ｋｎｏｔｔｉｎｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ８ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５，３４１－３４９．
下記及び本開示の任意の箇所に記載されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
１ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２１（５），１０８１－１０８５．
２ Ｂｏｕｂｌｉｋ，Ｙｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｐｌａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３（１０），１０７９－１０８４．
３ Ｍｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ（２０００）．Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃＦｖ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＩｇＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２７５（１），８４－９０．
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１０ Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆＨｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏＨｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２（２），１９３－２０４．
１１ Ｈｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ２２ Ｆｖ ｗｉｔｈＨｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｙ Ｆｖ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎＨｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０３（２５），９６３７－９６４２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６０３６５３１０３
１２ Ｈｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｃＦｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎＨＥＫ－２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，５６２，９９－１１３．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６０３２７－３０２－２ ８
１３ Ａｋａｍａｔｓｕ，Ｙ．，Ｐａｋａｂｕｎｔｏ，Ｋ．，Ｘｕ，Ｚ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ，Ｎ．（２００７）．Ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ－ＩＬ－１２ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３２７（１－２），４０－５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２００７．０７．００７
１４ Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｂａｕｅｒ，Ｍ．，Ｂｕｓｅｒ，Ｒ．Ｂ．，Ｇｗｅｒｄｅｒ，Ｍ．，Ｍｕｎｔｗｉｌｅｒ，Ｓ．，Ｍａｕｒｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００８ Ｓｅｐ ２３；１０５（３８）：１４３３６－４１．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０５９４２１０５
１５ Ｂｒｅｏｕｓ－Ｎｙｓｔｒｏｍ，Ｅ．，Ｓｃｈｕｌｔｚｅ，Ｋ．，Ｍｅｉｅｒ，Ｍ．，Ｆｌｕｅｃｋ，Ｌ．，Ｈｏｌｚｅｒ，Ｃ．，Ｂｏｌｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｒｅｔｒｏｃｙｔｅ Ｄｉｓｐｌａｙ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａＨｉｇｈ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１－１１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１３．０９．００３
１６ Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，Ｗｈｉｔｅｓｏｎ＆Ｒｉｃｅ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００６ ７５：５６７－６０５
１７ Ｚｈｏｕ，Ｃ．，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｆ．Ｗ．，Ｃａｉ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｑ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．Ｄ．（２０１０）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ．ｍＡｂｓ，２（５），５０８－５１８
１８ Ｌｉ，Ｃ．Ｚ．，Ｌｉａｎｇ，Ｚ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｒ．，Ｌｏｕ，Ｈ．Ｂ．，Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆＨＢｓＡｇ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆＨｅａｌｔｈｙ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｄｏｎｏｒ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９（２），１８４－１９０．
１９ Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．，Ｒｉｎｇｒｏｓｅ，Ｌ．，Ａｎｇｒａｎｄ，Ｐ．Ｏ．，Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．，＆Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．（１９９６）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ＦＬＰ ａｎｄ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｅｄ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２４（２１），４２５６－４２６２．
２０ Ｓｃｈａｆｔ，Ｊ．，Ａｓｈｅｒｙ－Ｐａｄａｎ，Ｒ．，ＶａｎＨｏｅｖｅｎ，Ｆ．Ｄ．，Ｇｒｕｓｓ，Ｐ．，＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．（２００１）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＦＬＰ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｏｃｙｔｅｓ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，３７（１），６－１０．
２１ Ｍｏｅｈｌｅ，Ｅ．Ａ．，Ｍｏｅｈｌｅ，Ｅ．Ａ．，Ｒｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｙ．－Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｙ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅＨｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０４（９），３０５５－３０６０．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６１１４７８１０４
２２ Ｃｒｉｓｔｅａ，Ｓ．，Ｆｒｅｙｖｅｒｔ，Ｙ．，Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｙ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｐ．Ｄ．，Ｃｏｓｔ，Ｇ．Ｊ．（２０１３）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｄｏｎｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，／１０（３），８７１－８８０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２４７３３
２３ Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ，Ｆ．，Ｍａｌｉｓｓｅｎ，Ｂ．（１９８９）．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａ ｖａｒｉａｎｔ ｄｅｐｒｉｖｅｄ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｐｈａ－ｍＲＮＡ ｏｆ ＢＷ５１４７ ｏｒｉｇｉｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９（１２），２２６９－２２７４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｊｉ．１８３０１９１２１４
２４ Ｋａｎａｙａｍａ，Ｎ．，Ｔｏｄｏ，Ｋ．，Ｒｅｔｈ，Ｍ．，Ｏｈｍｏｒｉ，Ｈ．（２００５）．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＨｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｉｎ ａ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３２７（１），７０－７５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２００４．１１．１４３
２５ Ｌｉｎ，Ｗ．，Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｋ．，Ｍｕｒａｙａｍａ，Ａ．，Ｋａｇａｙａ，Ｅ．，８ Ｏｈｔａ，Ｋ．（２０１１）．Ｂ－ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙ－ｂａｓｅｄ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃＨｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（３），ｅ１４－ｅ１４．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ１１２２
２６ Ａｄａｃｈｉ，Ｎ．，Ｓｏ，Ｓ．，ｌｉｉｚｕｍｉ，Ｓ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｙ．，Ｍｕｒａｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｋａｗａ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）．ＴｈｅＨｕｍａｎ ｐｒｅ－Ｂ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｎａｌｍ－６ ｉｓＨｉｇｈｌｙ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５（１），１９－２４．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｄｎａ．２００６．２５．１９
２７ Ｐａｌａｃｉｏｓ，Ｒ．，８ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，Ｍ．（１９８５）．ＩＬ３－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ｃｌｏｎｅｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ Ｂ－２２０ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ｃｏｎｔａｉｎ Ｉｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｅｌｌ，４１（３），７２７－７３４
２８ Ｂａｒｒｅｔｉｎａ，Ｊ．，Ｃａｐｏｎｉｇｒｏ，Ｇ．，Ｓｔｒａｎｓｋｙ，Ｎ．，Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ｋ．，Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ａ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｅｎａｂｌｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ，４８３（７３９１），６０３－６０７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１００３
２９ Ｆｏｒｂｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｂｉｎｄａｌ，Ｎ．，Ｂａｍｆｏｒｄ，Ｓ．，Ｃｏｌｅ，Ｃ．，Ｋｏｋ，Ｃ．Ｙ．，Ｂｅａｒｅ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．ＣＯＳＭＩＣ：ｍｉｎｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ），Ｄ９４５－５０．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ９２９
３０ Ｓｉｌｖａ，Ｇ．，Ｐｏｉｒｏｔ，Ｌ．，Ｇａｌｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．，Ｍｏｎｔｏｙａ，Ｇ．，Ｄｕｃｈａｔｅａｕ，Ｐ．，Ｐａｑｕｅｓ，Ｆ．（２０１１）．Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１’／（１），１１－２７
３１ Ｅｐｉｎａｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｉｌｖａ，Ｇ．Ｈ．，Ｐａｑｕｅｓ，Ｆ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．，Ｄｕｃｈａｔｅａｕ，Ｐ．（２０１３）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｕｒｐｏｓｅｓ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｖｏｌ．２３，ｐｐ．１４７－１８５）．
３２ Ｓｚｃｚｅｐｅｋ，Ｍ．，Ｂｒｏｎｄａｎｉ，Ｖ．，Ｂｕｃｈｅｌ，Ｊ．，Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｌ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．（２００７）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（７），７８６－７９３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１３１７
３３ Ｄｏｙｏｎ，Ｙ．，Ｖｏ，Ｔ．Ｄ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｍ．Ｃ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｘｉａ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ－ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｂｌｉｇａｔｅＨｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８（１），７４－７９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１５３９
３４ Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｃ．Ａ．（２０１２）．Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＲＯＳＡ２６ ｌｏｃｕｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０（８），３７４１－３７５２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ１ ２１４
３５ Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｙ．－Ｌ．，Ｂｅａｕｓｅｊｏｕｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｒｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ａｕｇｕｓｔｕｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＨｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４３５（７０４２），６４６－６５１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３５５６
３６ Ｍａｒｅｓｃａ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｖ．Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｎ．，＆Ｙａｎｇ，Ｙ．（２０１３）．Ｏｂｌｉｇａｔｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｇａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＯｂＬｉＧａＲｅ）：ｃｕｓｔｏｍ－ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（３），５３９－５４６．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１４５４４１．１１２
３７ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．，＆Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．（２０１１）．ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３（６０５１），１８４３－１８４６．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０４０９４
３８ Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．，Ｋｈｇａｙｔｅｒ，Ｃ．，Ｆｏｄｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，８ Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．（２０１２）．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒＨｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０（５），４６０－４６５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２１７０
３９ Ｂｏｉｓｓｅｌ，Ｓ．，Ｊａｒｊｏｕｒ，Ｊ．，Ａｓｔｒａｋｈａｎ，Ａ．，Ａｄｅｙ，Ａ．，Ｇｏｕｂｌｅ，Ａ．，Ｄｕｃｈａｔｅａｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．ｍｅｇａＴＡＬｓ：ａ ｒａｒｅ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４
４０ Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ，Ｍ．，Ｂｉｅｔｚ，Ｆ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．，Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｔ．，Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｃｏｍｐａｃｔ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４，１７６２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２
４１ Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｄ．Ｓ．（２０１４）．Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ：Ｎｅｗｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａ／Ｂｉｏｌｏｇｙ，３６（１），３４－３８．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｅｓ．２０１３００１３５
４２ Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１６６），８４－８７．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４７００５
４３ Ｗａｎｇ，Ｔ．，Ｗｅｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．（２０１４）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１６６），８０－８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．２４６９８１
４４ Ｂｅａｒｄ，Ｃ．，Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｐｌａｔｈ，Ｋ．，Ｗｕｔｚ，Ａ．，＆Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２００６）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｐｙ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，４４（１），２３－２８．
４５ Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｓ．Ｊ．，Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｙ．，ＤｅＫｅｌｖｅｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｆｒｅｙｖｅｒｔ，Ｙ．，Ｂｏｙｄｓｔｏｎ，Ｅ．Ａ．，Ｍｏｅｈｌｅ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｄｒｉｖｅｎ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ｄｏｎｏｒｓ ｗｉｔｈ ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＨｏｍｏｌｏｇｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１５），ｅ１５２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ ５１２
４６ Ｃａｄｉｎａｎｏｓ ２００７
４７ Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｙｅａ，Ｋ．，Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｒｕｉｚ，Ｄ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０（５），７３４－７４１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０１３．０４．０１２
４８ Ｐｏｒｔｅｕｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．（２００３）．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００（５６２０），７６３．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０７８３９５
４９ Ｒｏｕｅｔ，Ｐ．，Ｓｍｉｈ，Ｆ．，＆Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（１９９４）．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４（１２），８０９６－８１０６．
５０ Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（１９９６）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２（６），２２４－２２８
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５７ Ｚｈａｏ，Ａ．，Ｎｕｎｅｚ－Ｃｒｕｚ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｃ．，Ｃｏｕｋｏｓ，Ｇ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｄ．Ｌ．，８ Ｓｃｈｏｌｌｅｒ，Ｎ．（２０１１）．Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆＨｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙＨｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ Ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ／ＴＥＭ１，ｕｓｉｎｇ ａ ｐａｉｒｅｄ ｙｅａｓｔ－ｄｉｓｐｌａｙ／ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｓｃＦｖ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６３（２），２２１－２３２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１０．０９．００１
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６４ Ｃｈａｎｇ，Ｈ．－Ｊ．，Ｈｓｕ，Ｈ．－Ｊ．，Ｃｈａｎｇ，Ｃ．－Ｆ．，Ｐｅｎｇ，Ｈ．－Ｐ．，Ｓｕｎ，Ｙ．－Ｋ．，Ｙｕ，Ｈ．－Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｓｔｉｎｅ－Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ Ｂｉｎｄｅｒｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１７（４），６２０－６３１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｒ．２００９．０１．０１１
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８４ Ｇｒｏｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｇ．Ｋ．，Ｇｒａｎｔ，Ｆ．Ｊ．，Ｈａｌｄｅｍａｎ，Ｂ．Ａ．，Ｈａｒｔ，Ｃ．Ｅ．，Ｏ’Ｈａｒａ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｇｅｎ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅＨｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ（Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．３４３５－３４３９）．Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．
８５ Ｋｕｍａｒ，Ｎ．，＆Ｂｏｒｔｈ，Ｎ．（２０１２）．Ｆｌｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５６（３），３６６－３７４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１２．０３．００４
８６ Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ，Ｓ．Ｃ．Ｇ．，Ｃｈｉａｎｇ，Ｇ．Ｇ．，Ｓｚｉｌｖａｓｉ，Ａ．，Ｍｏｈａｎ，Ｓ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｒ．Ｉ．，ＭａｃＬｅａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｓ ｏｆＨｉｇｈｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ／Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７７（１－２），１４１－１５５．
８７ Ｐｉｃｈｌｅｒ，Ｊ．，Ｈｅｓｓｅ，Ｆ．，Ｗｉｅｓｅｒ，Ｍ．，Ｋｕｎｅｒｔ，Ｒ．，Ｇａｌｏｓｙ，Ｓ．Ｓ．，Ｍｏｔｔ，Ｊ．Ｅ．，＆Ｂｏｒｔｈ，Ｎ．（２００９）．Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｄ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｓｓａｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４１（１－２），８０－８３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２００９．０３．００１
８８ Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ，Ｋ．，Ｆｕ，Ｊ．，Ｐａｔｓｃｈ，Ｃ．，Ｈｕ，Ｓ．，Ｗｅｉｄｌｉｃｈ，Ｓ．，Ｄｕｅｒｓｃｈｋｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｄｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ，ｌｉｋｅ Ｃｒｅ，ｉｓ ａＨｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ．Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，２（９－１０），５０８－５１５．ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｍｍ．００３０８７
８９ Ｈｏｒｌｉｃｋ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｃｏｍｂｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｏｗｅｒｓ，Ｐ．Ｍ．，Ｎｅｂｅｎ，Ｔ．Ｙ．，Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｋｒａｐｆ，Ｉ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８８（２７），１９８６１－１９８６９．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１３．４５２４８２
９０ Ｂｉｆｆｉ，Ｇ．，Ｔａｎｎａｈｉｌｌ，Ｄ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，＆Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．（２０１３）．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５（３），１８２－１８６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍ．１５４８
９１ Ｇａｏ，Ｊ．，Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．，＆Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（２００９）．Ｔｗｏ－ｓｔａｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０６（９），３０７１－３０７６．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８１２９５２１０６
９２ Ｇｕ，Ｇ．Ｊ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｍ．，Ｊｏｓｔ，Ｃ．，Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｋ．，Ｋａｍａｌｉ－Ｍｏｇｈａｄｄａｍ，Ｍ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｅｒｓ ｆｏｒ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ／，３０（２），１４４－１５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｂｔ．２０１２．０５．００５
９３ Ｃｈｏ，Ｙ．Ｋ．，＆Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．（２０１０）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ－ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ．Ｐｒｏｆｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｉ，２３（７），５６７－５７７．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｑ ０２９
９４ Ｔｉｌｌｏｔｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｈｏ，Ｙ．Ｋ．，＆Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．（２０１３）．Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ：ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６０（１），２７－３７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１２．０３．０１０
９５ Ｋｕｎｅｒｔ，Ａ．，Ｓｔｒａｅｔｅｍａｎｓ，Ｔ．，Ｇｏｖｅｒｓ，Ｃ．，Ｌａｍｅｒｓ，Ｃ．，Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎ，Ｒ．，Ｓｌｅｉｊｆｅｒ，Ｓ．，Ｄｅｂｅｔｓ，Ｒ．（２０１３）．ＴＣＲ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｅｔ Ｎｅｗ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｔｏ Ｔｒｅａｔ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ：Ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｔ Ｃｅｌｌ Ｆｉｔｎｅｓｓ，ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｌｉｅｕ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４，３６３．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００３６３
９６ Ｌｉｄｄｙ，Ｎ．，Ｂｏｓｓｉ，Ｇ．，Ａｄａｍｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｌｉｓｓｉｎａ，Ａ．，Ｍａｈｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｈａｓｓａｎ，Ｎ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＴＣＲ－ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８（６），９８０－９８７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．２７６４
９７ Ｈｏｌｌｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｈｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｏ．，Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．，Ｏ’Ｈｅｒｒｉｎ，Ｓ．，Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．，８ Ｋｒａｎｚ，Ｄ．Ｍ．（２０００）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈＨｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７（１０），５３８７－５３９２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８００７８２９７
９８ Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．Ｓ．，Ｄｏｎｅｒｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ａｌｌｅｎ，Ｐ．Ｍ．，８ Ｋｒａｎｚ，Ｄ．Ｍ．（２００５）．Ｃｌａｓｓ ＩＩ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｏｒＨｉｇｈｅｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｉｎｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０２（５２），１９０３３－１９０３８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５０７５５４１０２
９９ Ｋｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｗ．，ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｏｏｍ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｐｉｔｓ，Ｈ．，Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ，Ｅ．，８ Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ．Ｎ．（２０００）．Ｃｈａｎｇｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｂｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７（２６），１４５７８－１４５８３．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．９７．２６．１４５７８
１００ Ｃｈｅｒｖｉｎ，Ａ．Ｓ．，Ａｇｇｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｒａｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｍ．，８ Ｋｒａｎｚ，Ｄ．Ｍ．（２００８）．ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＨｉｇｈｅｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３９（２），１７５－１８４．
１０１ Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｆ．，Ｊｏｒｄａｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｓｔａｄｉｎｓｋｉ，Ｂ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｈｕｓｅｂｙ，Ｅ．，Ｍａｒｒａｃｋ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＭＨＣ／ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２１０，１５６－１７０．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．０１０５－２８９６．２００６．００３６５．ｘ
１０２ Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｋ Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．（２０１３）．Ｒｅａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１（１１），９９９－１００８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２７２５
１０３ Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｒ．，８ Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｉ．（２０１３）．Ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，３（４），３８８－３９８．ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９－８２９０．ＣＤ－１２－０５４８
１０４ Ａｌｏｎｓｏ－Ｃａｍｉｎｏ，Ｖ．，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ．，Ｃｏｍｐｔｅ，Ｍ．，Ｓａｎｚ，Ｌ．，８ Ａｌｖａｒｅｚ－Ｖａｌｌｉｎａ，Ｌ．（２００９）．Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，４（９），ｅ７１７４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００７１７４
１０５ Ｍｅｌｉｄｏｎｉ，Ａ．Ｎ．，Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｗｏｒｍａｌｄ，Ｓ．，８ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（２０１３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１１０（４４），１７８０２－１７８０７．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３１２０６２１１０
１０６ Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．，＆Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（２０１２）．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｆｒｏｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０９（３９），１５７２８－１ ５７３３．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１４２７５１０９
１０７ Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｙｅａ，Ｋ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｍｏｌｄｔ，Ｂ．，Ｈｅ，Ｌ．，Ｚｈｕ，Ｊ．，８ Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（２０１４）．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，２／（２），２７４－２８３．
１０８ Ｙｅａ，Ｋ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｇ．，Ｓｏｎｇ，Ｂ．Ｄ．，８ Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｇｏｎｉｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｕｎｂｉａｓｅｄ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ（Ｖｏｌ．１１０，ｐｐ．１４９６６－１４９７１）．Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３１３６７１１１０
１０９ Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ｕｅｄａ，Ｈ．，８ Ｎａｇａｍｕｎｅ，Ｔ．（２００４）．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇＨａｐｔｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｈｉｍｅｒａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３’／５（１），１３２－１３８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２００４．０１．０３０
１１０ Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｏ，Ｙ．，Ｓｏｇｏ，Ｔ．，Ｈｉｔｏｍｉ，Ａ．，Ｕｅｄａ，Ｈ．，８ Ｎａｇａｍｕｎｅ，Ｔ．（２００８）．Ａｎｔｉｇｅｎｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｐｒｏ－Ｂ Ｂａ／Ｆ３ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｈｉｍｅｒａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ／ｏｇｙ，１３３（１），１５４－１６１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２００７．０９．００９
１１１ Ｓｏｇｏ，Ｔ．，Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ｕｅｄａ，Ｈ．，Ｏｔｓｕ，Ｍ．，Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｍ．，Ｎａｋａｕｃｈｉ，Ｈ．，８ Ｎａｇａｍｕｎｅ，Ｔ．（２００９）．Ｔ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｕｓｉｎｇＨａｐｔｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｈｉｍｅｒａ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，４６（１），１２７－１ ３６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｙｔｏ．２００８．１２．０２０
１１２ Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｓｏｇｏ，Ｔ．，Ｔｅｎｇ，Ｊ．，Ｏｔｓｕ，Ｍ．，Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｃ－Ｍｐｌ ｃｈｉｍｅｒａ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５５（３），４０２－４０８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｙｔｏ．２０１１．０５．０２４
１１３ Ｕｅｄａ，Ｈ．，Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ａｂｕｒａｔａｎｉ，Ｔ．，Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｔｏｄｏｋｏｒｏ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃｅｌｌ－ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｙ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｇ Ｖｄｏｍａｉｎｓ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｅｐｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ／Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４１（１－２），１５９－１７０．
１１４ Ｋｅｒｐｐｏｌａ，Ｔ．Ｋ．（２００９）．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，３８（１０），２８７６－２８８６．
１１５ Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．，Ｅａｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｍａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．，Ｒｅｍｙ，Ｉ．，８ Ｓｔｅｆａｎ，Ｅ．（２００７）．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，６（７），５６９－５８２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ２３１
１１６ Ｐｅｔｓｃｈｎｉｇｇ，Ｊ．，Ｇｒｏｉｓｍａｎ，Ｂ．，Ｋｏｔｌｙａｒ，Ｍ．，Ｔａｉｐａｌｅ，Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｋｕｒａｔ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ（ＭａＭＴＨ）ｆｏｒ ｐｒｏｂｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８９５
１１７ Ｒｅｎａｕｔ，Ｌ．，Ｍｏｎｎｅｔ，Ｃ．，Ｄｕｂｒｅｕｉｌ，Ｏ．，Ｚａｋｉ，Ｏ．，Ｃｒｏｚｅｔ，Ｆ．，Ｂｏｕａｙａｄｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅＨｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｆｖ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅ ｉｇｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｂｙＨｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．９０７，ｐｐ．４５１－４６１）
１１８ Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，Ｃｏｌｗｉｌｌ，Ｋ．，Ｐｅｒｓｈａｄ，Ｋ．，Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｍａｐｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，４１７（１），２５－３５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１１．０５．００５
１１９ ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ Ｐ（２００２）Ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２：３５５－３７８．ｄｏｉ：１０．２１７４／１５６６５２３０２３３４７７４２．
１２０ Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９２）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅＨｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２２４（２），４８７－４９９．
１２１ Ｍａｓｓｉｅ，Ｂ．，Ｄｉｏｎｎｅ，Ｊ．，Ｌａｍａｒｃｈｅ，Ｎ．，Ｆｌｅｕｒｅｎｔ，Ｊ．，Ｌａｎｇｅｌｉｅｒ，Ｙ．（１９９５）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｖｉｄｅｓＨｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｒ１ ａｎｄ Ｒ２ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３（６），６０２－６０８．
１２２ Ｋｉｍ，Ｄ．Ｗ．，Ｕｅｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｋａｚｉｒｏ，Ｙ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，８ Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．（１９９０）．Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅＨｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ，９１（２），２１７－２２３．
１２３ Ｈｏｌｄｅｎ，Ｐ．，Ｋｅｅｎｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｌｕｎｓｔｒｕｍ，Ｇ．Ｐ．，Ｂａｃｈｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｐ．，８Ｈｏｒｔｏｎ，Ｗ．Ａ．（２００５）．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８０（１７），１７１７２－１７１７９．
１２４ Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，Ｅ．Ｐ．，８ Ｂｕｓｈｍａｎ，Ｆ．Ｄ．（２０１２）．ＳａｆｅＨａｒｂｏｕｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅＨｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，１２（１），５１－５８．
１２５ Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｃｕｎｎｉｆｆ，Ｍ．Ｍ．，Ｆｅｎｇ，Ｇ．，８ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．（２０１２）．Ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，７（１），１７１－１９２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎ ｐｒｏｔ．２０１１．４３１
１２６ Ｆａｌｋ，Ｒ．，Ｆａｌｋ，Ａ．，Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｍｅｌｉｄｏｎｉ，Ａ．Ｎ．，Ｐａｒｔｈｉｂａｎ，Ｋ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－Ｎｏｔｃｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５８（１），６９－７８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１２．０７．００８
１２７ Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｒｏｊａｓ，Ｇ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｎ．，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｋ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｊ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｊ．（２００６）．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４６．
１２８ Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．，Ｋｈｇａｙｔｅｒ，Ｃ．，Ｆｏｄｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．（２０１２）．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒＨｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０（５），４６０－４６５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２１７０
１２９ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｗｅｙｄｅｎ，Ｌ．，Ａｄａｍｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｗ．，Ｔａｎｎａｈｉｌｌ，Ｄ．，Ａｒｅｎｄｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（２００５）．Ｎｕｌｌ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ｂ ａｌｌｅｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｐｕｒｏｈｔｋ ＬｏｘＰ／ＦＲＴ ｖｅｃｔｏｒ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，４４（４），１７１－１７８
１３０ ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ．，８ Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｄ．（２００４）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅｌｆ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８），６１６－６２６．
１３１ Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｃ．Ｓ．，＆Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ．（２００７）．Ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＦＬＰ ａｎｄ ＰｈｉＣ３１ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２（１），ｅ１６２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００００１６２
１３２ Ｋｒａｎｚ，Ａ．，Ｆｕ，Ｊ．，Ｄｕｅｒｓｃｈｋｅ，Ｋ．，Ｗｅｉｄｌｉｃｈ，Ｓ．，Ｎａｕｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．，Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ，Ｋ．（２０１０）．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｌｐ ｄｅｌｅｔｅｒ ｍｏｕｓｅ ｉｎ Ｃ５７ＢＩ／６ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｆｌｐｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，４８（８），５１２－５２０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｄｖｇ．２０６４１
１３３ Ｓｚｙｍｃｚａｋ ＡＬ，Ｖｉｇｎａｌｉ ＤＡ（２００５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６２７－６３８．ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７１２５９８．５．５．６２７
１３４ Ｃｈａｐｐｌｅ，Ｓ．Ｄ．，Ｃｒａｆｔｓ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈａｄｂｏｌｔ，Ｓ．Ｐ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，ａｎｄ Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．（２００６）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，４９．
１３５．Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＨｕｍａｎ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７０，９０５３－９０６１（２０１０）．
１３６ Ｓｚｙｍｃｚａｋ，Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｇｅｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ’ｓｅｌｆｃｌｅａｖｉｎｇ’ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ －ｂａｓｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２，５８９－５９４（２００４）．
１３７．Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆＨｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｐｉｃｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，３４９－３５４（２００５）．
１３８．Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＴＣＲｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｒｏｖｉｄｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａｎｄ ｋｉｌｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９，５８４５－５８５４（２００７）．
１３９．Ｍａｄｕｒａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｂｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８８，１８７６６－１８７７５（２０１３）．
１４０．Ｐｉｅｒｃｅ，Ｂ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １０，ｅ１００３４７８（２０１４）．
１４１．Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ＴＣＲ ｔｈａｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ ＣＤ３ｚｅｔａ ｉｎｄｕｃｅＨｉｇｈｌｙ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｐａｉｒｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ＴＣＲａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｃｈａｉｎｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０，７７３６－７７４６（２００８）．
１４２．Ｒｏｓｚｉｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｙｎａｐｓｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ＣＤ３ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ＴＣＲ：（，ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｆｏｒ ＴＣＲ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１，１２８８－１２９７（２０１１）．
１４３．Ｃｏｈｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｚ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ－ｈｕｍａｎＨｙｂｒｉｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＣＲ）ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐａｉｒｉｎｇ ａｎｄ ＴＣＲＩＣＤ３ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６，８８７８－８８８６（２００６）．
１４４．Ｈｕｏｖｉｎｅｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｏｗｅｒｅｄ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７，ｅ３１８１７（２０１２）．
１４５．Ｃｒｉｂｂｓ，Ａ．Ｐ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ａ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｂ．＆Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｆ．Ｍ．Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅＨｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙＨｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，９８（２０１３）．
１４６．Ｏｅｌｋｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘ ｖｉｖｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙＨＬＡ－Ｉｇ－ｃｏａｔｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，６１９－６２４（２００３）．
１４７．Ｗｏｌｆ ｌ，Ｍ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｄ．Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｉｖｅ，Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ９，９５０－９６６（２０１４）．
１４８．Ｌｉｐｏｗｓｋａ－Ｂｈａｌｌａ，Ｇ．，Ｇｉｌｈａｍ，Ｄ．Ｅ．，Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．＆Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，Ｄ．Ｇ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ａ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４，３８１－３９１（２０１３）．
１４９．Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｈａｒｏｎ，Ｅ．，Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．Ｈａｓｓａｎ，Ｒ．Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ａｎｄ ｉｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１１，５１７－５２５（２０１２）．
１５０．Ａｔａｎａｃｋｏｖｉｃ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＣＤ２２９ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９６，１５１２－１５２０（２０１１）．
１５１．Ｂｕｎｄ，Ｄ．，Ｍａｙｒ，Ｃ．，Ｋｏｆｌｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｌｌｅｋ，Ｍ．＆Ｗｅｎｄｔｎｅｒ，Ｃ．－Ｍ．Ｈｕｍａｎ Ｌｙ９（ＣＤ２２９）ａｓ ｎｏｖｅｌ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＡＡ）ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｂ－ＣＬＬ）ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４，８６０－８６９（２００６）．
１５２．Ｔｉｅｄｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｄｈｉｒｏｎ：ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２７，１４５－１５５（２０１４）．
１５３．Ｍａｒｅｓｃａ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｖ．Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｎ．＆Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｏｂｌｉｇａｔｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｇａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＯｂＬｉＧａＲｅ）：ｃｕｓｔｏｍ－ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３，５３９－５４６（２０１３）．
１５４．ＭｃＶｅｙ，Ｍ．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｅ．ＭＭＥＪ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ（ｄｉｒｅｃｔｏｒ’ｓ ｃｕｔ）：ｄｅｌｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｅｎｄｉｎｇｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２４，５２９－５３８（２００８）．
１５５．Ｎａｋａｄｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ ｕｓｉｎｇ ＴＡＬＥＮｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲＩＣａｓ９．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５，５５６０（２０１４）．
１５６．Ｃｈｉｃｈｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｑｕａｓｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｔｉｆｓ ｔｏ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ ｋｎｏｔｔｉｎｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ８ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５，３４１－３４９．
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】