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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】Ｔ細胞製品およびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20150101AFI20240822BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240822BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240822BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240822BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240822BHJP
C12N 15/87 20060101ALN20240822BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20240822BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20240822BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240822BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240822BHJP
C12N 15/19 20060101ALN20240822BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240822BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240822BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17
C12N5/10 ZNA
A61P35/00
C12N5/0783
C12N15/63 Z
C12N15/87 Z
C07K19/00
C07K14/725
C07K16/28
C12N15/12
C12N15/19
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/113 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024512961
(86)(22)【出願日】2022-08-24
(85)【翻訳文提出日】2024-04-17
(86)【国際出願番号】 CN2022114587
(87)【国際公開番号】W WO2023025207
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】202110976183.0
(32)【優先日】2021-08-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523436056
【氏名又は名称】賽斯尓▲チン▼生物技術（上海）有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＳ ＆ ＧＥＮＥＳ ＢＩＯＴＥＣＨ（ＳＨＡＮＧＨＡＩ）ＣＯ．，ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３０５，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １，Ｎｏ．５３８ Ｃａｉｌｕｎ Ｒｏａｄ，Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ，Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ａｒｅａ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000291
【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】李 林紅
(72)【発明者】
【氏名】朱 向陽
(72)【発明者】
【氏名】劉 武青
(72)【発明者】
【氏名】于 世鈞
(72)【発明者】
【氏名】辛 鵬程
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲麗▼
(72)【発明者】
【氏名】楊 星星
(72)【発明者】
【氏名】占 一帆
(72)【発明者】
【氏名】▲韋▼ 小越
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA12
4C087MA66
4C087NA06
4C087ZB26
4H045AA10
4H045DA50
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
被験者に施用するためのＴ細胞製品およびその使用を提供するが、前記製品は少なくとも１種の他家Ｔ細胞を含み、前記他家Ｔ細胞は少なくとも１種の前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現する。前記Ｔ細胞製品はドナーの範囲を拡大し、被験者の免疫反応を活性化させることができる。また、腫瘍を治療する薬物の製造における前記Ｔ細胞製品の使用を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者に施用するためのＴ細胞製品であって、少なくとも１種の他家Ｔ細胞を含み、前記他家Ｔ細胞は少なくとも１種の被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現し、前記被験者の少なくとも１種のＴＣＲが前記ＭＨＣ分子を認識すると同種異系反応（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｏｎ）を起こすＴ細胞製品。
【請求項2】
前記他家Ｔ細胞は免疫拒絶反応を低減または消失させる操作をされていない、請求項１に記載のＴ細胞製品。
【請求項3】
前記免疫拒絶反応を低減または消失させる操作は、他家Ｔ細胞のＣＤ５２遺伝子をノックアウトすること、および／または他家Ｔ細胞のＨＬＡ－Ｉ分子を改変することを含む、請求項２に記載のＴ細胞製品。
【請求項4】
前記他家Ｔ細胞における被験者の同種異系反応を起こしうる分子は修飾されていない、請求項１～３のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項5】
前記被験者の同種異系反応を起こしうる分子は前記他家Ｔ細胞のＭＨＣ分子を含む、請求項４に記載のＴ細胞製品。
【請求項6】
前記被験者は腫瘍患者を含む、請求項１～５のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項7】
前記腫瘍は固形腫瘍および／または非固形腫瘍を含む、請求項６に記載のＴ細胞製品。
【請求項8】
前記他家Ｔ細胞の由来は前記被験者と異なる由来である、請求項１～７のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項9】
前記他家Ｔ細胞は前記被験者と異なる２つ以上のドナー由来のものである、請求項１～８のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項10】
前記他家Ｔ細胞は１種の前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現する、請求項１～９のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項11】
前記他家Ｔ細胞は２種以上の前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現する、請求項１～１０のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項12】
前記ＭＨＣ分子はＭＨＣ Ｉおよび／またはＭＨＣ ＩＩを含む、請求項１～１１のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項13】
前記他家Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）および／または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む、請求項１～１２のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項14】
前記被験者の少なくとも１種の前記ＴＣＲは前記ＭＨＣ分子を認識して前記被験者のＴＨ－１免疫反応を促進させる、請求項１～１３のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項15】
前記他家Ｔ細胞の前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクを低下させる能力を有する、請求項１～１４のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項16】
工学的改造されていない前記他家Ｔ細胞と比較すると、前記工学的改造された前記他家Ｔ細胞では、前記他家Ｔ細胞の前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクが低下した、請求項１～１５のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項17】
前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞におけるＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現および／または活性を下方調節する工程を含む、請求項１６に記載のＴ細胞製品。
【請求項18】
工学的改造されていない前記他家Ｔ細胞と比較すると、前記工学的改造され前記他家Ｔ細胞におけるＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現および／または活性が下方調節された、請求項１６～１７のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項19】
前記工学的改造は遺伝子突然変異および／または遺伝子サイレンシングを含む、請求項１５～１７のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項20】
前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞に、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ＲＮＡ編集系、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓ 、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系およびメガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれる１種または複数種の物質を施用することを含む、請求項１６～１９のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項21】
前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を施用することを含む、請求項１６～２０のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項22】
前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞に前記ＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子のエクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを施用することを含む、請求項１６～２１のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項23】
少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを発現する、請求項１～２２のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項24】
少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインをコードする核酸を含む、請求項１～２３のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項25】
前記修飾は、前記他家Ｔ細胞に前記核酸を形質移入することを含む、請求項２４に記載のＴ細胞製品。
【請求項26】
前記形質移入はウイルス形質移入および／または非ウイルス形質移入を含む、請求項２５に記載のＴ細胞製品。
【請求項27】
前記非ウイルス形質移入はプラスミドを使用する、請求項２６に記載のＴ細胞製品。
【請求項28】
前記プラスミドは環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドである、請求項２７に記載のＴ細胞製品。
【請求項29】
前記プラスミドは抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインをコードする核酸を含む、請求項２７～２８のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項30】
前記核酸はｓｓＤＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡを含む、請求項２４～２９のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項31】
前記プラスミドは細菌から生成するプラスミドを含む、請求項２７～３０のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項32】
前記プラスミドはナノプラスミド（Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ）および／またはミニサークルＤＮＡ（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ）ベクターを含む、請求項２７～３１のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項33】
前記形質移入は安定形質移入および／または一過性形質移入を含む、請求項２５～３２のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項34】
前記一過性形質移入はエレクトロポレーションを含む、請求項３３に記載のＴ細胞製品。
【請求項35】
前記一過性形質移入はｍＲＮＡ形質移入を含む、請求項３３～３４のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項36】
前記安定形質移入はトランスポゾン系の使用および／または遺伝子編集ノックインの使用を含む、請求項３３～３５のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項37】
前記遺伝子編集の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ＲＮＡ編集系ＡＤＡＲ、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびメガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれる１種または複数種である、請求項３６に記載のＴ細胞製品。
【請求項38】
前記トランスポゾン系はＳｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系を含む、請求項３６～３７のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項39】
前記プラスミドは前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとされる、請求項２７～３８のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項40】
前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項２７～３９のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項41】
前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約２％（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項４０に記載のＴ細胞製品。
【請求項42】
前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約５‰（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項４０～４１のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項43】
前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１‰（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項４０～４２のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項44】
前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項２７～４３のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項45】
前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約２％（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項４４に記載のＴ細胞製品。
【請求項46】
前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約５‰（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項４４～４５のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項47】
前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１‰（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項４４～４６のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項48】
前記大きさが少なくも約４８ ｋｂの核酸分子またはその断片の大きさは少なくとも約１０ Ｍｂである、請求項４４～４７のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項49】
前記大きさが少なくも約４８ ｋｂの核酸分子またはその断片の大きさは少なくとも約１０ Ｍｂである、請求項４４～４８のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項50】
前記大きさが少なくも約４８ ｋｂの核酸分子またはその断片は微生物由来のものである、請求項４４～４９のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項51】
前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群から選ばれる１種または複数種である、請求項５０に記載のＴ細胞製品。
【請求項52】
前記微生物はグラム陰性菌を含む、請求項５０～５１のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項53】
前記微生物は大腸菌を含む、請求項５０～５２のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項54】
前記プラスミドはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理されている、請求項２７～５３のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項55】
前記ＤＮａｓｅは非特異的に線形ＤＮＡを切断することができる、請求項５４に記載のＴ細胞製品。
【請求項56】
前記ＤＮａｓｅはエキソヌクレアーゼである、請求項５４～５５のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項57】
前記処理はＭｇ２＋およびＣａ２＋の存在下において前記形質移入混合物を前記ＤＮａｓｅと接触させることを含む、請求項５４～５６のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項58】
前記ＤＮａｓｅ処理を経た後、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項５７に記載のＴ細胞製品。
【請求項59】
前記ＤＮａｓｅ処理を経た後、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項５７に記載のＴ細胞製品。
【請求項60】
前記抗体またはその抗原結合断片は二重特異性抗体を含む、請求項２３～５９のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項61】
前記抗体またはその抗原結合断片は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む、請求項２３～６０のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項62】
前記ＣＡＲは抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む、請求項２３～６１のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項63】
前記抗原結合ドメインは特異的に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する、請求項６２に記載のＴ細胞製品。
【請求項64】
前記抗原結合ドメインは特異的に一つまたは複数の腫瘍関連抗原に結合する、請求項６３に記載のＴ細胞製品。
【請求項65】
前記抗原結合ドメインは特異的にＧＰＣ３およびＣＤ７３に結合する、請求項６２～６４のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項66】
前記抗原結合ドメインは特異的にＧＰＣ３およびＣＤ１４７に結合する、請求項６２～６５のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項67】
前記抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、ナノ抗体およびその抗原結合断片からなる群から選ばれる、請求項６２～６６のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項68】
前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８、Ｆｃ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７およびＰＤ１といったタンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含む、請求項６２～６７のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項69】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４といったタンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含む、請求項６２～６８のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項70】
前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳおよびＣＤ８３のリガンドといったタンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含む、請求項６２～６９のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項71】
前記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、 ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｉｇα受容体、Ｉｇβ受容体、ＢＬＶ ｇｐ３０（ｂｏｖｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｇｐ３０、牛白血病ウイルスｇｐ３０）、ＥＢＶ（Ｅｐ－ｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ、エプスタイン・バール・ウイルス）ＬＭＰ２Ａ 、猴免疫缺陷病毒（Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ、サル免疫不全ウイルス）ＰＢｊ１４ Ｎｅｆおよび免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）といったタンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含む、請求項６２～７０のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項72】
前記サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦα、ＣＸＣＬ１、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＩｇＧ、ＩＰ－１０、Ｌ－１７Ａ、 ＭＣＰ－ｌおよびＰＧＥ２からなる群から選ばれる、請求項２３～７１のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項73】
前記ケモカインは、ＣＣＬ１－ＣＣＬ２８およびＣＸＣＬ１－ＣＸＣＬ１７からなる群から選ばれる、請求項２３～７２のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項74】
少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は、形質移入を経た後、少なくとも１種の前記核酸を含むプラスミドを含む、請求項２４～７３のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項75】
少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は１種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または１種の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を発現する、請求項６１～７４のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項76】
少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は２種以上のタンパク質を発現する、請求項１～７５のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項77】
少なくとも２種の異なる前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはサイトカインを発現する前記他家Ｔ細胞が所定の比率で混合される、請求項２３～７６のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項78】
さらに、前記被験者の自家由来のＴ細胞を含む、請求項１～７７のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項79】
前記Ｔ細胞製品は、さらに、１種または複数種のほかの修飾されたＴ細胞を含み、前記ほかの修飾されたＴ細胞は相応する修飾されていないＴ細胞と比較すると、生体の同種異系反応を起こす能力が低下した、請求項１～７８のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項80】
前記ほかの修飾されたＴ細胞は相応する修飾されていないＴ細胞と比較すると、ＭＨＣ分子の発現および／または活性が低下した、請求項１～７９のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項81】
請求項１～８０のいずれかに記載のＴ細胞製品と、薬学的に許容される補助剤とを含む薬物組成物。
【請求項82】
前記補助剤は注射に適する、請求項８１に記載の薬物組成物。
【請求項83】
前記補助剤は腫瘍内注射に適する、請求項８１～８２のいずれかに記載の薬物組成物。
【請求項84】
請求項１～８０のいずれかに記載のＴ細胞製品と、注射用器材とを含むキット。
【請求項85】
薬物の製造における請求項１～８０のいずれかに記載のＴ細胞製品、請求項８１～８３のいずれかに記載の薬物組成物および／または請求項８４に記載のキットの使用であって、前記薬物は腫瘍の予防、緩和、治療に用いられる使用。
【請求項86】
前記腫瘍は固形腫瘍を含む、請求項８５に記載の使用。
【請求項87】
前記薬物は注射に適するように調製される、請求項８５～８６のいずれかに記載の使用。
【請求項88】
前記薬物は腫瘍内注射に適するように調製される、請求項８５～８７のいずれかに記載の使用。
【請求項89】
腫瘍微環境を改善する方法であって、被験者に請求項１～８０のいずれかに記載のＴ細胞製品、請求項８１～８３のいずれかに記載の薬物組成物および／または請求項８４に記載のキットを施用する工程を含む方法。
【請求項90】
腫瘍を予防、緩和、治療する方法であって、被験者に請求項１～８０のいずれかに記載のＴ細胞製品、請求項８１～８３のいずれかに記載の薬物組成物および／または請求項８４に記載のキットを施用する工程を含む方法。
【請求項91】
前記施用は注射を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記施用は腫瘍内注射を含む、請求項９０～９１のいずれかに記載の方法。
【請求項93】
前記施用は１回以上の腫瘍内注射を含む、請求項９０～９２のいずれかに記載の方法。
【請求項94】
腫瘍の予防、緩和、治療に用いられる、請求項１～８０のいずれかに記載のＴ細胞製品、請求項８１～８３のいずれかに記載の薬物組成物および／または請求項８４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、生物医薬の分野に関し、具体的に、Ｔ細胞製品およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
現在の汎用型ＣＡＲＴ細胞（ＵＣＡＲＴ）の主な設計の考え方は、標的細胞の殺傷を目的とするものである。このような考え方の下、ＣＡＲＴは体内において長期間生存することが必要である。よって、ＵＣＡＲＴの実際の応用において、二つの主要な問題、すなわち、ＵＣＡＲＴの施用を受ける被験者の生体に対する殺傷（ＧＶＨＤ）、およびＵＣＡＲＴの同種異系反応（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｏｎ）による被験者の生体からの拒絶を同時に解決する必要がある。現在のＵＣＡＲＴの設計の考え方は、生体から拒絶されるという問題を避けるために、主にＧＶＨＤおよび同種異系反応の排除に集中しているが、このような設計は腫瘍の治療効率に影響することがある。
【0003】
同時にこの二つの問題を解決し、そして有効に腫瘍の微環境を改善するというのは、現在のＵＣＡＲＴの細胞治療には挑戦的なことである。
【0004】
そのため、有効に治療効果を向上させる、新規な「汎用型」Ｔ細胞製品の獲得が期待されている。
【発明の概要】
【0005】
本出願は、被験者に施用するための少なくとも一つの機能分子を工学的に発現させてＧＶＨＤの可能性を大幅に低下させたＴ細胞製品およびその使用を提供する。同時に、前記Ｔ細胞製品には、少なくとも１種の同種異系免疫反応を起こしうる他家Ｔ細胞が含まれ、当該細胞は少なくとも１種のＭＨＣ分子を発現し、前記ＭＨＣ分子は被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識される。本出願において、前記Ｔ細胞製品は、以下の特性のうちの少なくとも一つを有する：（１）他家Ｔ細胞の由来に対する要求が低くなるか無く、場合によって異なるドナー由来の他家Ｔ細胞を混合して使用することができる；（２）他家Ｔ細胞によって発現されるＭＨＣ分子（たとえば、ヒトＨＬＡ遺伝子型）の種類に対する要求が低くなるか無い；（３）他家Ｔ細胞による被験者の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生のリスクを低下させる；（４）有効に被験者の腫瘍内における免疫反応を向上させるために特異的に他家Ｔ細胞の同種異系反応を起こしうる機能を残す；（５）より有効に被験者の腫瘍内における免疫反応（たとえば、ＴＨ－１免疫反応）を向上させるために特異的に複数のドナー由来のものを混合することによって他家Ｔ細胞の同種異系反応を起こしうる機能を残す；（６）さらに１種または複数種の必要なタンパク質を発現する（たとえば、非ウイルスの方法によって形質移入して発現させる）；（７）有効に被験者の体内腫瘍微環境を改善する；（８）腫瘍内注射が可能である；（９）顕著に製造コストを低下させる。また、本出願は、薬物組成物の製造、腫瘍を治療する薬物の製造および／または腫瘍微環境の改善における前記Ｔ細胞製品の使用を提供する。
【0006】
一つの側面では、本出願は、被験者に施用するためのＴ細胞製品であって、少なくとも１種の他家Ｔ細胞を含み、前記他家Ｔ細胞は少なくとも１種の前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現し、前記被験者の少なくとも１種のＴＣＲが前記ＭＨＣ分子を認識すると同種異系反応（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｏｎ）を起こすＴ細胞製品を提供する。
【0007】
ある実施形態において、前記少なくとも１種の他家Ｔ細胞は免疫拒絶反応を低減または消失させる操作をされていない。
【0008】
ある実施形態において、前記免疫拒絶反応を低減または消失させる操作は、他家Ｔ細胞のＣＤ５２遺伝子をノックアウトすること、および／または他家Ｔ細胞のＨＬＡ－Ｉ分子を改変することを含む。
【0009】
ある実施形態において、前記少なくとも１種の他家Ｔ細胞における被験者の同種異系反応を起こしうる分子は修飾されていない。
【0010】
ある実施形態において、前記被験者の同種異系反応を起こしうる分子は前記他家Ｔ細胞のＭＨＣ分子を含む。
【0011】
ある実施形態において、前記被験者は腫瘍患者を含む。
【0012】
ある実施形態において、前記腫瘍は固形腫瘍および／または非固形腫瘍を含む。
【0013】
ある実施形態において、前記他家Ｔ細胞の由来は前記被験者と異なる由来である。
【0014】
ある実施形態において、前記他家Ｔ細胞は前記被験者と異なる２つ以上のドナー由来のものである。
【0015】
ある実施形態において、前記他家Ｔ細胞は１種の前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現する。
【0016】
ある実施形態において、前記他家Ｔ細胞は２種以上の前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現する。
【0017】
ある実施形態において、前記ＭＨＣ分子はＭＨＣ Ｉおよび／またはＭＨＣ ＩＩを含む。
【0018】
ある実施形態において、前記他家Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）および／または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む。
【0019】
ある実施形態において、前記被験者の少なくとも１種の前記ＴＣＲは前記ＭＨＣ分子を認識して前記被験者のＴＨ－１免疫反応を促進させる。
【0020】
ある実施形態において、前記のＴ細胞製品は前記他家Ｔ細胞の前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクを低下させる能力を有する。
【0021】
ある実施形態において、工学的改造されていない前記他家Ｔ細胞と比較すると、前記工学的改造された前記他家Ｔ細胞では、前記他家Ｔ細胞の前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクが低下した。
【0022】
ある実施形態において、前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞におけるＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現および／または活性を下方調節する工程を含む。
【0023】
ある実施形態において、工学的改造されていない前記他家Ｔ細胞と比較すると、前記工学的改造され前記他家Ｔ細胞におけるＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現および／または活性が下方調節された。
【0024】
ある実施形態において、前記工学的改造は遺伝子突然変異および／または遺伝子サイレンシングを含む。
【0025】
ある実施形態において、前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞に、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ＲＮＡ編集系、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓ 、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系およびメガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれる１種または複数種の物質を施用することを含む。
【0026】
ある実施形態において、前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を施用することを含む。
【0027】
ある実施形態において、前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞に前記ＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子のエクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを施用することを含む。
【0028】
ある実施形態において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを発現する。
【0029】
ある実施形態において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインをコードする核酸を含む。
【0030】
ある実施形態において、前記修飾は前記他家Ｔ細胞に前記核酸を形質移入することを含む。
【0031】
ある実施形態において、前記形質移入はウイルス形質移入および／または非ウイルス形質移入を含む。
【0032】
ある実施形態において、前記非ウイルス形質移入はプラスミドを使用する。
【0033】
ある実施形態において、前記プラスミドは環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドである。
【0034】
ある実施形態において、前記プラスミドは抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインをコードする核酸を含む。
【0035】
ある実施形態において、前記核酸はｓｓＤＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡを含む。
【0036】
ある実施形態において、前記プラスミドは細菌から生成するプラスミドを含む。
【0037】
ある実施形態において、前記プラスミドはナノプラスミド（Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ）および／またはミニサークルＤＮＡ（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ）ベクターを含む。
【0038】
ある実施形態において、前記形質移入は安定形質移入および／または一過性形質移入を含む。
【0039】
ある実施形態において、前記一過性形質移入はエレクトロポレーションを含む。
【0040】
ある実施形態において、前記一過性形質移入はｍＲＮＡ形質移入を含む。
【0041】
ある実施形態において、前記安定形質移入はトランスポゾン系および／または遺伝子編集ノックインを使用する。
【0042】
ある実施形態において、前記遺伝子編集の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ＲＮＡ編集系ＡＤＡＲ、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびメガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれる１種または複数種である。
【0043】
ある実施形態において、前記トランスポゾン系はＳｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系を含む。
【0044】
ある実施形態において、前記プラスミドは前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとされる。
【0045】
ある実施形態において、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める。
【0046】
ある実施形態において、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約２％（ｗ／ｗ）以下を占める。
【0047】
ある実施形態において、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約５‰（ｗ／ｗ）以下を占める。
【0048】
ある実施形態において、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１‰（ｗ／ｗ）以下を占める。
【0049】
ある実施形態において、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める。
【0050】
ある実施形態において、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約２％（ｗ／ｗ）以下を占める。
【0051】
ある実施形態において、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約５‰（ｗ／ｗ）以下を占める。
【0052】
ある実施形態において、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１‰（ｗ／ｗ）以下を占める。
【0053】
ある実施形態において、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片の大きさは少なくとも約１Ｍｂである。
【0054】
ある実施形態において、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片の大きさは少なくとも約１０Ｍｂである。
【0055】
ある実施形態において、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片は微生物由来のものである。
【0056】
ある実施形態において、前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群から選ばれる１種または複数種である。
【0057】
ある実施形態において、前記微生物はグラム陰性菌を含む。
【0058】
ある実施形態において、前記微生物は大腸菌を含む。
【0059】
ある実施形態において、前記プラスミドはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理されている。
【0060】
ある実施形態において、前記ＤＮａｓｅは非特異的に線形ＤＮＡを切断することができる。
【0061】
ある実施形態において、前記ＤＮａｓｅはエクソヌクレアーゼである。
【0062】
ある実施形態において、前記処理はＭｇ２＋およびＣａ２＋の存在下において前記形質移入混合物を前記ＤＮａｓｅと接触させることを含む。
【0063】
ある実施形態において、前記ＤＮａｓｅ処理を経た後、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める。
【0064】
ある実施形態において、前記ＤＮａｓｅ処理を経た後、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める。
【0065】
ある実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は二重特異性抗体を含む。
【0066】
ある実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む。
【0067】
ある実施形態において、前記ＣＡＲは抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む。
【0068】
ある実施形態において、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは特異的に一つまたは複数の腫瘍関連抗原に結合することができる。
【0069】
ある実施形態において、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは特異的にＧＰＣ３およびＣＤ７３に結合することができる。
【0070】
ある実施形態において、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは特異的にＧＰＣ３およびＣＤ１４７に結合することができる。
【0071】
ある実施形態において、前記抗原結合ドメインは特異的に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する。
【0072】
ある実施形態において、前記抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、ナノ抗体およびその抗原結合断片からなる群から選ばれる。
【0073】
ある実施形態において、前記ヒンジ領域は下記タンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含む：ＣＤ２８、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８、Ｆｃ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７およびＰＤ１。
【0074】
ある実施形態において、前記膜貫通ドメインは下記タンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含む：ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４。
【0075】
ある実施形態において、前記共刺激ドメインは下記タンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含む：ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳおよびＣＤ８３のリガンド。
【0076】
ある実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは下記タンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含む：ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、 ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｉｇα受容体、Ｉｇβ受容体、ＢＬＶ ｇｐ３０（ｂｏｖｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｇｐ３０、牛白血病ウイルスｇｐ３０）、ＥＢＶ（Ｅｐ－ｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ、エプスタイン・バール・ウイルス）ＬＭＰ２Ａ 、サル免疫不全ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）、ＰＢｊ１４ Ｎｅｆおよび免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）。
【0077】
ある実施形態において、前記サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦα、ＣＸＣＬ１、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＩｇＧ、ＩＰ－１０、Ｌ－１７Ａ、 ＭＣＰ－ｌおよびＰＧＥ２からなる群から選ばれる。
【0078】
ある実施形態において、前記ケモカインは、ＣＣＬ１－ＣＣＬ２８およびＣＸＣＬ１－ＣＸＣＬ１７からなる群から選ばれる。
【0079】
ある実施形態において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は、形質移入を経た後、少なくとも１種の前記核酸を含むプラスミドを含む。
【0080】
ある実施形態において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は１種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または１種の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を発現する。
【0081】
ある実施形態において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は２種以上のタンパク質を発現する。
【0082】
ある実施形態において、前記ＣＡＲをコードする遺伝子は配列番号２あるいは配列番号１１または１２で示される配列を含む。
【0083】
ある実施形態において、前記ＣＡＲは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む。
【0084】
ある実施形態において、少なくとも２種の異なる前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはサイトカインを発現する前記他家Ｔ細胞が所定の比率で混合される。
【0085】
ある実施形態において、前記Ｔ細胞製品は、さらに、前記被験者の自家由来のＴ細胞を含む。
【0086】
ある実施形態において、前記Ｔ細胞製品は、さらに、１種または複数種のほかの修飾されたＴ細胞を含み、前記ほかの修飾されたＴ細胞は相応する修飾されていないＴ細胞と比較すると、生体の同種異系反応を起こす能力が低下した。
【0087】
ある実施形態において、前記ほかの修飾されたＴ細胞は相応する修飾されていないＴ細胞と比較すると、ＭＨＣ分子の発現および／または活性が低下した。
【0088】
もう一つの側面では、本出願は、本出願に記載のＴ細胞製品と、薬学的に許容される補助剤とを含む薬物組成物を提供する。
【0089】
ある実施形態において、前記補助剤は注射に適する。
【0090】
ある実施形態において、前記補助剤は腫瘍内注射に適する。
【0091】
もう一つの側面では、本出願は、本出願に記載のＴ細胞製品と、注射用器材とを含むキットを提供する。
【0092】
もう一つの側面では、本出願は、薬物の製造における本出願に記載のＴ細胞製品、本出願に記載の薬物組成物および／または本出願に記載のキットの使用であって、前記薬物は腫瘍の予防、緩和、治療に用いられる使用を提供する。
【0093】
ある実施形態において、前記腫瘍は固形腫瘍を含む。
【0094】
ある実施形態において、前記薬物は注射に適するように調製される。
【0095】
ある実施形態において、前記薬物は腫瘍内注射に適するように調製される。
【0096】
もう一つの側面では、本出願は、腫瘍微環境を改善する方法であって、被験者に本出願に記載のＴ細胞製品、本出願に記載の薬物組成物および／または本出願に記載のキットを施用する工程を含む方法を提供する。
【0097】
もう一つの側面では、本出願は、腫瘍を予防、緩和、治療する方法であって、被験者に本出願に記載のＴ細胞製品、本出願に記載の薬物組成物および／または本出願に記載のキットを施用する工程を含む方法を提供する。
【0098】
ある実施形態において、前記施用は注射を含む。
【0099】
ある実施形態において、前記施用は腫瘍内注射を含む。
【0100】
ある実施形態において、前記施用は１回以上の腫瘍内注射を含む。
【0101】
もう一つの側面では、本出願は、腫瘍の予防、緩和、治療に用いられる、本出願に記載のＴ細胞製品、本出願に記載の薬物組成物および／または本出願に記載のキットを提供する。
【0102】
当業者は下記の詳細な記述から容易に本出願のほかの側面および優勢を洞察することができる。下記の詳細な記述には、本出願の例示的な実施形態しか提示および記述されていない。当業者に認識できるように、本出願の内容は、当業者が本出願に係る発明の趣旨および範囲を逸脱しないように公開された具体的な実施形態を変更することができるようになっている。相応的に、本出願の図面および明細書における記述は例示的なものに過ぎず、制限的なものではない。
【0103】
本出願に係る発明の具体的な特徴は添付された請求の範囲で示される通りである。下記で詳細に記述された例示的な実施形態および図面を参照すると、本出願に係る発明の特徴および優勢をよりよく理解することができる。図面に対する簡単な説明は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0104】
【図1A】異なる個体由来のＴ細胞が特異的な一つの他家ＰＢＭＣと異なるレベルの同種異系反応が生じることを示す。しかし、複数のドナー由来のものを混合した本出願に係る他家Ｔ細胞が前記の特異的な他家ＰＢＭＣと強烈な同種異系反応が生じることが保証される。
【図1B】異なる個体由来のＴ細胞が特異的な一つの他家ＰＢＭＣと異なるレベルの同種異系反応が生じることを示す。しかし、複数のドナー由来のものを混合した本出願に係る他家Ｔ細胞が前記の特異的な他家ＰＢＭＣと強烈な同種異系反応が生じることが保証される。
【図2】異なるドナー由来のものを混合した本出願に係る他家Ｔ細胞が他家ＰＢＭＣと同種異系反応が生じられることを示す。
【図3】一つまたは複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞がＣＡＲ分子を発現できることを示す。
【図4】本出願に係るＴ細胞が長期間ＣＡＲ分子を発現できることを示す。
【図5A】本出願に係る他家Ｔ細胞が同時に２種類以上の分子を発現できることを示す。
【図5B】本出願に係る他家Ｔ細胞が同時に２種類以上の分子を発現できることを示す。
【図6】工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞が同時に複数の分子を発現し、そして腫瘍細胞を殺傷した後、特異的に発現する分子以外、別のサイトカインを放出することができることを示す。
【図7】Ａ－Ｆは工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞が特異的に腫瘍細胞を殺傷できることを示す。
【図8】一つまたは複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の腫瘍細胞を殺傷する能力が同等であることを示す。
【図9A】一つまたは複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の腫瘍細胞を殺傷した後の上清が同等の免疫細胞を動員する能力を有することを示す。
【図9B】一つまたは複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の腫瘍細胞を殺傷した後の上清が同等の免疫細胞を動員する能力を有することを示す。
【図10A】一つまたは複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の腫瘍細胞を殺傷した後の上清が有する免疫細胞を活性化させる能力が同等で（９Ａ）、活性化したＰＢＭＣがＫ５６２細胞を殺傷する能力を有することを示す。
【図10B】一つまたは複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の腫瘍細胞を殺傷した後の上清が有する免疫細胞を活性化させる能力が同等で（９Ａ）、活性化したＰＢＭＣがＫ５６２細胞を殺傷する能力を有することを示す。
【図11】Ａ－Ｂは複数のドナー由来の工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞が分子を発現する能力を示す。
【図12】工学的改造および／または修飾された複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の混合物が有効に腫瘍細胞を殺傷できることを示す。
【図13】工学的改造および／または修飾された複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の混合物の上清がＰＢＭＣと協同して有効に腫瘍細胞を殺傷できることを示す。
【図14】工学的改造および／または修飾された複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の混合物の標的細胞を殺傷した後の上清が有効にＴ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化させることができることを示す。
【図15】Ａ－Ｃは工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞の腫瘍細胞を殺傷した後の上清がＴ／ＮＫ細胞を活性化させることができることを示す。
【図16】工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞が標的細胞によって複数回活性化増幅、再生および／または凍結保存することができることを示す。
【図17】工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞が有効に腫瘍細胞を殺傷できることを示す。
【図18】工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞の腫瘍細胞を殺傷した後の細胞上清液がＢｙ－ＳｔａｎｄでＰＢＭＣにおけるＴ細胞を活性化させることができることを示す。
【図19】工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞が複数回活性化して増幅した後、腫瘍細胞を殺傷した後の細胞上清がＢｙ－ＳｔａｎｄでＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞を活性化させることができることを示す。
【図20】工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞が有効に体内の腫瘍体積を減少させることができることを示す。
【図21】工学的改造および／または修飾された複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の混合物の標的細胞を殺傷した後の上清液におけるＸＣＬの発現量が上昇したことを示す。
【図22】工学的改造および／または修飾された複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の混合物の標的細胞を殺傷した後の上清液が有効にｃＤＣ１細胞を動員することができることを示す。
【図23】工学的改造および／または修飾された複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の混合物の標的細胞を殺傷した後の上清液が有効にＴ／ＮＫ細胞を動員することができることを示す。
【図24A】工学的改造および／または修飾された複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の標的細胞を殺傷した後の細胞上清液がＢｙ－ＳｔａｎｄでＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞を活性化させることができることを示す。
【図24B】工学的改造および／または修飾された複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の標的細胞を殺傷した後の細胞上清液がＢｙ－ＳｔａｎｄでＰＢＭＣにおけるＴ細胞を活性化させることができることを示す。
【図25】工学的改造および／または修飾された複数のドナー由来の本出願に係る他家Ｔ細胞の標的細胞を殺傷した後の細胞上清液によって活性化されたＰＢＭＣが顕著にＫ５６２細胞を殺傷する効率を向上させることができることを示す。
【図26】工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞が明らかに腫瘍の生長を抑制する効果を示す。
【図27】工学的改造および／または修飾された本出願に係る他家Ｔ細胞が腫瘍内の複数回の注射によって有効に体内の腫瘍を殺傷して腫瘍体積を減少させることができることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0105】
以下、特定の具体的な実施例で本願の発明の実施形態を説明するが、当業者は本明細書で公開された内容から容易に本願の発明のほかの利点および効果がわかる。
【0106】
用語の定義
本出願において、用語「Ｔ細胞製品」とは、通常、被験者に施用できる、Ｔ細胞を含む治療用製品である。本出願において、前記Ｔ細胞製品は細胞治療に使用することができる。たとえば、前記Ｔ細胞製品は治療効果のあるタンパク質（たとえば、キメラ抗原受容体、抗体またはその抗原結合タンパク質、サイトカインおよび／またはケモカイン）を発現できるＴ細胞を含んでもよい。本出願において、前記Ｔ細胞製品は腫瘍の治療に使用することができる。ある場合、前記Ｔ細胞製品は注射（たとえば、腫瘍内注射）などの投与手段により、被験者に施用することができる。本出願において、前記Ｔ細胞製品は個別化のものでもよく、たとえば、必要な被験者の実際のニーズに応じて設計することができる。
本出願において、用語「Ｔ細胞製品」とは、通常、被験者に施用できる、Ｔ細胞を含む治療用製品である。本出願において、前記Ｔ細胞製品は細胞治療に使用することができる。たとえば、前記Ｔ細胞製品は治療効果のあるタンパク質（たとえば、キメラ抗原受容体、抗体またはその抗原結合タンパク質、サイトカインおよび／またはケモカイン）を発現できるＴ細胞を含んでもよい。本出願において、前記Ｔ細胞製品は腫瘍の治療に使用することができる。ある場合、前記Ｔ細胞製品は注射（たとえば、腫瘍内注射）などの投与手段により、被験者に施用することができる。本出願において、前記Ｔ細胞製品は個別化のものでもよく、たとえば、必要な被験者の実際のニーズに応じて設計することができる。
【0107】
本出願において、用語「Ｔ細胞」とは、通常、胸腺から生成する細胞である。前記Ｔ細胞は様々な細胞が仲介する免疫反応に関与することができる。本出願において、前記Ｔ細胞は胸腺細胞、ナイーブＴ細胞、未熟なＴ細胞、成熟したＴ細胞、静止Ｔ細胞または活性化したＴ細胞を含んでもよい。ある場合、いくつかのマーカーで前記Ｔ細胞を分類することができる。たとえば、前記Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞を含む。たとえば、前記Ｔ細胞は以下のマーカーのうちの１種または複数種を発現してもよい：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７およびＨＬＡ－ＤＲ。
【0108】
本出願において、用語「ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）」とは、通常、エフェクターＴ細胞で、前記ヘルパーＴ細胞はほかのＢとＴ細胞および／またはマクロファージの活性化および機能を促進させることができる。本出願において、前記ヘルパーＴ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞でもよい。前記ヘルパーＴ細胞は、活性化の場合、生体の適応性免疫反応を促進させることができる。ある場合、前記ヘルパーＴ細胞は抗原特異的な免疫反応に関与することができる。前記ヘルパーＴ細胞は、さらに、たとえば、異なる転写因子、分泌するサイトカインおよび／またはケモカインによって異なるサブタイプに分化しうる。たとえば、異なる免疫細胞の動員および／または異なる免疫反応機序の協調が可能である。前記ヘルパーＴ細胞は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含んでもよい。
【0109】
本出願において、用語「ＴＨ－１免疫反応」とは、通常、Ｔｈ１細胞が関与する免疫反応である。Ｔｈ１細胞は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩ分子によって提示される抗原を認識することができる。Ｔｈ１細胞は細胞内の病原体（たとえば、マクロファージにおけるファゴソームに存在する病原体）の認識および／または除去に関与することができる。本出願において、前記ＴＨ－１免疫反応はＴｈ１細胞（たとえば、Ｔｈ１細胞の表面のＣＤ４０Ｌとマクロファージ、Ｂ細胞または樹状細胞の表面に発現されるＣＤ４０が生じる相互作用）および／またはそれによって分泌される物質（たとえば、ＩＦＮγ）により、ほかの免疫細胞（たとえば、マクロファージ、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞）を活性化させる機能（たとえば、殺傷溶解機能）を含んでもよい。本出願において、前記ＴＨ－１免疫反応は腫瘍の殺傷作用に関与することもできる。たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させ、腫瘍細胞を標的として殺傷することができる。たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞の生存能力および／または記憶能力を増強させることができる。
【0110】
本出願において、用語「細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）」とは、通常、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。前記細胞傷害性Ｔ細胞は適応性免疫反応に関与し、細胞内の病原体の免疫防御および腫瘍の殺傷において作用を発揮することができる前記細胞傷害性Ｔ細胞の表面はＣＤ８＋共受容体を発現することができる。前記細胞傷害性Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩ分子によって提示される抗原に対して免疫反応することができる。たとえば、前記細胞傷害性Ｔ細胞はリンパ球および／または感染された標的細胞に発現されたＦａｓ受容体および／またはＦａｓリガンドに結合して後者のアポトーシスを誘導することができる。たとえば、前記細胞傷害性Ｔ細胞は多くのサイトカイン（たとえば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）を生成することができる。たとえば、腫瘍微環境における前記細胞傷害性Ｔ細胞はサイトカインの細胞傷害性によって腫瘍細胞を殺傷することができる。本出願において、前記細胞傷害性Ｔ細胞はＴｃ１、Ｔｃ２、Ｔｃ９、Ｔｃ１７および／またはＣＤ８＋Ｔｒｅｇを含んでもよい。
【0111】
本出願において、用語「他家Ｔ細胞」とは、通常、被験者と異なる由来のＴ細胞である。たとえば、前記他家Ｔ細胞は一つの前記被験者と異なるドナー由来のものでもよい。ある場合、前記他家Ｔ細胞は二つ以上（たとえば、二つ、三つ、四つまたはそれ以上）の前記被験者と異なるドナー由来のものでもよい。本出願において、前記他家Ｔ細胞はＭＨＣ分子を発現することができる。ある場合、前記ＭＨＣ分子のうちの少なくとも１種は前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に「外来」の（たとえば、前記被験者の生体によって生成するものに属しない）ＭＨＣ分子と認識されることができる。本出願において、前記他家Ｔ細胞は直接ドナーから得られるＴ細胞でもよい。ある場合、前記他家Ｔ細胞は改造されたものでもよい。たとえば、工学的改造によって前記他家Ｔ細胞の前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクを低下させることができる。たとえば、修飾によって前記他家Ｔ細胞が少なくとも１種の前記被験者の疾患の治療に必要なタンパク質を発現できるようにさせることができる。
【0112】
本出願において、用語「被験者」は、通常、哺乳動物、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類動物（たとえば、サル、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、アカゲザル）、家畜（たとえば、イヌやネコ）、農場動物（たとえば、ニワトリやカモのような家禽、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を指す。ヒトの被験者は胎児、新生児、嬰児、青少年および成人の被験者を含んでもよい。被験者は、動物疾患モデル、たとえば、マウスモデル、および当業者に既知のほかの動物モデルを含んでもよい。本出願において、必要な被験者は患者、たとえば、腫瘍患者を含んでもよい。
【0113】
本出願において、用語「外来」とは、通常、任意の生体、細胞、組織または系から導入された物質あるいは生体、細胞、組織または系の外で生成した物質である。たとえば、前記他家Ｔ細胞によって発現される少なくとも１種のＭＨＣ分子は、前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に前記外来のもの（たとえば、前記被験者の外で生成したＭＨＣ分子）と認識されることができる。
【0114】
本出願において、用語「ＭＨＣ分子」とは、通常、主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）で、一組の動物の主要組織適合抗原をコードする遺伝子群の総称である。ヒトのＭＨＣはＨＬＡ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＬＡ、ヒト白血球抗原）複合体とも呼ばれる。ＭＨＣの多型性のため、それによってコードされる分子の構造、組織分布および機能の違いにより、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＨＣクラスＩＩＩの遺伝子に分かれ、それぞれＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩＩ分子をコードする。本出願において、前記ＭＨＣ分子は抗原をＭＨＣ提示に伝送するタンパク質も含んでもよい。ＭＨＣクラスＩ分子は前記有核細胞の表面に分布してもよい。ＭＨＣクラスＩ分子はＣＤ８＋Ｔ細胞に抗原を提示する過程に関与してもよい。ＭＨＣクラスＩＩ分子はＢ細胞、単核球／マクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞の表面に分布してもよい。ＭＨＣクラスＩＩ分子は処理された抗原断片をＣＤ４＋Ｔ細胞に提示することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子は移植拒絶反応を起こす可能性がある。
【0115】
本出願において、用語「ＴＣＲ」とは、通常、Ｔ細胞の表面の特異的受容体である。前記Ｔ細胞受容体はヘテロ二量体で、二つの異なるサブユニットで構成されてもよい。Ｔ細胞受容体の大半（たとえば、９５％以上、９６％以上、９７％以上など）はαサブユニットおよびβサブユニットで構成され、各ペプチド鎖は、また、可変領域（Ｖ領域）、定常領域（Ｃ領域）、膜貫通領域および細胞内領域などの部分に分かれる。本出願において、前記ＴＣＲは任意のＴＣＲまたは機能性断片、たとえば、ＭＨＣ分子に結合した特異的抗原性ペプチド、すなわち、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分を含んでもよい。入れ替えて使用できるＴＣＲの「抗原結合部分」または「抗原結合断片」とは、ＴＣＲのドメインの部分を含有するが、全長ＴＣＲが結合する抗原（たとえば、ＭＨＣ－ペプチド複合体）に結合する分子である。ある場合、抗原結合部分はＴＣＲの可変ドメイン、たとえば、ＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖を含有してもよいが、それは特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分で、たとえば、一般的に、各鎖が３つの相補性決定領域を含有する場合である。
【0116】
本出願において、用語「ドナー」とは、通常、移植物の由来となる種である。たとえば、前記ドナーは死亡状態にあるものでもよく、生存状態にあるものでもよい。本出願において、前記ドナーは健康状態のものでもよい。たとえば、前記ドナーは腫瘍に罹患しなくてもよい。前記ドナーは、哺乳動物、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類動物（たとえば、サル、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、アカゲザル）、家畜（たとえば、イヌやネコ）、農場動物（たとえば、ニワトリやカモのような家禽、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）でもよい。本出願において、前記被験者および前記ドナーは同時に同様の種、たとえば、同時にヒトでもよい。たとえば、前記ドナーは前記被験者と遺伝的に類似しないドナー、前記被験者とクロスマッチが不適合のドナー、および／または前記被験者とクロスマッチが適合のドナーも含んでもよい。
【0117】
本出願において、用語「同種異系反応（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｏｎ）」とは、通常、ドナー由来の臓器、組織および／または細胞による免疫反応である。前記同種異系反応は免疫系が同種抗原または「同種異系抗原」または異なるＨＬＡハプロタイプを発現する細胞に応答して生じる刺激および反応を含んでもよい。本出願において、前記同種異系反応は、ドナー由来の臓器、組織および／または細胞が被験者に対して生じる刺激および反応を含んでもよく、被験者がドナー由来の臓器、組織および／または細胞に対して生じる刺激および反応を含んでもよい。たとえば、前記同種異系反応は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含んでもよい。たとえば、前記同種異系反応は移植拒絶反応を含んでもよい。
【0118】
本出願において、用語「移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）」とは、通常、外来の（たとえば、ドナー由来の）臓器、組織および／または細胞が被験者に対して生じる急性または慢性の免疫反応である。たとえば、同一の種のほかの個体（ある場合、ひいてはＨＬＡ適合のもの）から得られる臓器、組織および／または細胞は被験者に前記移植片対宿主病をさせてもよい。前記ＧＶＨＤは被験者の腸の表皮および／または肝臓に症状が生じてもよい。ある場合、前記ＧＶＨＤは皮膚、肝臓、胃および／または腸の炎症反応を起こしてもよい。ある場合、前記ＧＶＨＤは慢性のもので、よく見られる症状が皮疹および／または口腔潰瘍を含んでもよい。前記ＧＶＨＤは、現在、治癒できないことが多い。
【0119】
本出願において、用語「腫瘍内注射」とは、通常、直接腫瘍細胞団および／または腫瘍微環境に施用することである。本出願において、前記腫瘍微環境は腫瘍形成環境を含んでもよく、それは腫瘍の生存、発展または拡散に構造および／または機能上の環境を提供する。腫瘍微環境は細胞、分子、線維芽細胞、細胞外基質および血管で構成されてもよく、これらは腫瘍を形成する一つまたは複数の腫瘍細胞を囲んでフィードする。腫瘍微環境における細胞または組織の実例は、腫瘍脈管系、腫瘍浸潤リンパ球、細網線維芽細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、癌関連線維芽細胞、周皮細胞、ほかの基質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、好中球およびほかの腫瘍に近い免疫細胞を含むが、これらに限定されない。腫瘍微環境の細胞機能に影響する例は、サイトカインおよび／またはケモカインの生成、サイトカインに対する反応、抗原の加工およびペプチド抗原の提示、白血球の走化性および遷移の調節、遺伝子発現の調節、補体活性化、シグナル経路の調節、細胞が仲介する細胞傷害性、細胞が仲介する免疫、体液免疫応答およびほかの先天性または適応性免疫応答を含むが、これらに限定されない。これらの細胞機能を調節する効果を測定する。
【0120】
本出願において、用語「薬物組成物」とは、通常、患者、たとえば、ヒト患者への施用に適する組成物である。本出願における薬物組成物は治療有効量の１種または複数種の本出願の抗体構築体を含む。薬物組成物は、さらに、１種または複数種の（薬学的に有効な）ビヒクル、安定化剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤および／または助剤の適切な製剤を含んでもよい。たとえば、組成物の許容される成分は使用される投与量および濃度において受け手に毒性がない。本出願の薬物組成物は液体、冷凍および凍結乾燥の組成物を含むが、これらに限定されない。
【0121】
本出願において、用語「腫瘍」とは、通常、悪性転換前および悪性の癌である。前記腫瘍は、原発性腫瘍（たとえば、その細胞が対象の体内の元の腫瘍の部位以外の部位に遷移していないもの）および続発性腫瘍（たとえば、転移、腫瘍細胞の元の腫瘍の部位と異なる続発部位への遷移による腫瘍）、再発性癌および難治性癌を含んでもよい。前記腫瘍は固形腫瘍および非固形腫瘍を含んでもよい。
【0122】
本出願において、用語「デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）」とは、通常、ＤＮＡ骨格におけるホスホジエステル結合を切断できる酵素である。前記ＤＮａｓｅはヌクレアーゼの１種でもよい。前記ＤＮａｓｅは（たとえば、弱塩基性の条件において）二本鎖ＤＮＡをデオキシヌクレオチドに消化することができる。たとえば、前記ＤＮａｓｅは環状またはスーパーコイルの核酸分子またはその断片（たとえば、閉環の二本鎖ＤＮＡおよび／またはスーパーコイルのＤＮＡ）に基本的に活性がなくてもよい（たとえば、切断できない）。たとえば、前記ＤＮａｓｅは線形二本鎖ＤＮＡを切断することができる。たとえば、前記ＤＮａｓｅはＤＮＡエクソヌクレアーゼでもよい。たとえば、前記ＤＮａｓｅはエクソヌクレアーゼＶでもよい。たとえば、前記ＤＮａｓｅはＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅ、たとえば、Ｐｌａｓｍｉｄ－ＳａｆｅTM ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅでもよい。
【0123】
本出願において、用語「一過性形質移入」とは、通常、細胞に形質移入された外因性遺伝子が前記細胞自身のゲノムに組み込まれない形質移入の手段である。前記一過性形質移入は外因性遺伝子の短期間（たとえば、少なくとも約１日、少なくとも約２日）の快速発現を実現させることができる。前記一過性形質移入で細胞に形質移入される外因性遺伝子は前記細胞の生長および／または分裂につれて段々失われることがある。前記一過性形質移入は、操作が簡便、試験周期が短い、発現効率が高い、安全および遺伝子のスクリーニングが不要な群から選ばれる優勢を有することが可能である。前記一過性形質移入の操作工程は当業者によく知られているものでもよい。たとえば、前記一過性形質移入はリポフェクション法によるものでもよい。たとえば、前記一過性形質移入はエレクトロポレーション法によるものでもよい。前記一過性形質移入は形質移入試薬、たとえば、ＦｕＧＥＮＥ６を使用してもよい。
【0124】
本出願において、用語「安定形質移入」とは、通常、外来の核酸分子を導入して形質移入された細胞のゲノムに組み込むことである。たとえば、前記外因性遺伝子を形質移入された細胞のゲノムに組み込む。
【0125】
本出願において、用語「形質移入混合物」とは、通常、形質移入に必要な混合物である。本出願において、前記形質移入混合物は導入しようとする１種または複数種の材料（たとえば、ポリヌクレオチド）を含んでもよい。たとえば、前記形質移入混合物は形質移入される外因性遺伝子をコードする核酸分子を含んでもよい。たとえば、前記形質移入混合物は前記核酸分子を含むベクターを含んでもよい。たとえば、前記形質移入混合物は、さらに、不純物（ある場合、前記不純物は核酸分子またはその断片）を含んでもよい。本出願において、前記不純物は微生物由来の核酸分子またはその断片を含んでもよい。前記ベクターが持つ不純物は前記ベクターが持つ不純物（たとえば、前記ベクターの骨格と相同もしくは非相同の核酸分子またはその断片）を含んでもよい。
【0126】
本出願において、用語「核酸分子の合計含有量」とは、通常、前記形質移入混合物における、すべてのヌクレオチドを有する物質の合計質量である。たとえば、前記ヌクレオチドを有する物質は前記核酸分子またはその断片および前記材料を含んでもよい。
【0127】
本出願において、用語「微生物」とは、通常、古細菌ドメイン（Ａｒｃｈａｅａ）、細菌ドメイン（Ｂａｃｔｅｒｉａ）および／または真核生物ドメイン （Ｅｕｃａｒｙａ）からの真核および原核の微生物の種である。たとえば、前記微生物は、細菌、ウイルス、真菌、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、クラミジアおよび／またはスピロヘータを含んでもよい。本出願において、用語「細菌」とは、通常、任意の種類の原核生物で、原核生物界のうちのすべての門における原核生物を含む。前記細胞は、球菌、桿菌、螺旋菌、スフェロプラスト、プロトプラストを含んでもよい。前記細菌は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を含んでもよい。「グラム陽性」および「グラム陰性」とは、グラム染色法による染色パターンで、本分野でよく知られている（たとえば、ＦｉｎｅｇｏｌｄおよびＭａｒｔｉｎ， ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （診断微生物学），第六版，ＣＶ Ｍｏｓｂｙ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，第１３－１５頁（１９８２）を参照する）。
【0128】
本出願において、用語「微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片」とは、通常、前記微生物のゲノム由来の核酸分子または核酸分子の断片である。微生物のゲノム由来の情報はＡ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｅａｒｔｈ’ｓ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （２０２０）を参照する。
【0129】
本出願において、用語「グラム陰性菌」とは、通常、グラム染色において使用される一次染料が残らないが、二次染色剤に染色される細菌である。そのため、グラム陰性菌は、通常、グラム染色法において赤色を示す。前記グラム陰性菌の細胞壁におけるペプチドグリカンの含有量が低いが、脂質の含有量が高い。たとえば、前記グラム陰性菌の細胞壁はリポ多糖層を有してもよい。たとえば、前記グラム陰性菌は、大腸菌、緑膿菌、プロテウス菌、赤痢菌、肺炎桿菌、ブルセラ菌、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌、カタル球菌、アシネトバクター属、エルシニア属、レジオネラ・ニューモフィラ、百日咳菌、パラ百日咳菌、赤痢菌属、パスツレラ属、コレラ菌、ビブリオ・パラヘモリティカスおよび／またはプレジオモナス・シゲロイデスを含んでもよい。
【0130】
本出願において、用語「大腸菌」とは、通常、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。大腸菌は腸内細菌科エスケリキア属に属する。
【0131】
本出願において、用語「プラスミド」とは、通常、遺伝物質を含む構築体である。前記プラスミドは遺伝物質（たとえば、一つまたは複数の核酸配列）を細胞内へ送れるように設計されている。前記プラスミドは任意の由来の一本鎖または二本鎖核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の自律複製配列を含んでもよい。前記プラスミドは本出願において用語「ベクター」と入れ替えて使用することができる。前記プラスミドは様々な配置を有してもよく、たとえば、線形プラスミド、環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドでもよい。前記線形プラスミドは線状のＤＮＡ分子でもよい。前記スーパーコイルプラスミドは２本の完全な構造を維持する核酸鎖（たとえば、共有結合閉環ＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ）を含み、そしてスーパーコイルの配置をしてもよい。前記環状プラスミドは少なくとも１本の核酸鎖が完全な環状構造を維持しているものでもよい。前記プラスミドは細胞のゲノムに組み込まれていないものでもよい。
【0132】
本出願において、用語「遺伝子編集」とは、通常、ゲノムに対して核酸の挿入、欠失および／または置換の操作を行うことである。前記遺伝子編集は相同組換修復（ＨＤＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または一塩基改変によって実現させることができる。前記遺伝子編集は当業者によく知られている遺伝子編集ツール、たとえば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、ＴＡＬＥＮシステムおよび／またはＣＲＩＳＰＲ技術を利用することができる。
【0133】
本出願において、用語「遺伝子編集ノックイン」とは、通常、一つの遺伝子工学の過程で（たとえば、ｋｎｏｃｋ－ｉｎと呼んでもよい）、当該過程は遺伝部位におけるＤＮＡ配列情報に対する一対一の内因性部位に見られない配列情報の置換または挿入に関する。前記遺伝子編集は遺伝子相同組換えを利用することができる。たとえば、遺伝子相同組換えを利用し、外因性機能的遺伝子（ゲノムに存在しなかったか、失活した遺伝子）を細胞に導入してゲノムにおける相同配列と相同組換えをすることで、それをゲノムに挿入して細胞内で発現させる。たとえば、前記遺伝子編集ノックインは外因性遺伝子が細胞のゲノムの少なくとも一部を置換できるようにさせることができる。前記遺伝子編集ノックインはＣＲＩＳＰＲ技術を利用し、部位特異的「標的ノックイン」を実現させることができる。
【0134】
本出願において、用語「トランスポゾン系」とは、通常、ドナーのポリヌクレオチド（たとえば、プラスミド）から切り出して標的（たとえば、細胞のゲノムＤＮＡ）に組み込むことができるシステムである。前記ポリヌクレオチドはトランスポザーゼによって標的に組み込まれてもよい。前記トランスポゾン系はトランスポザーゼを含んでもよい。前記トランスポザーゼは転移して転移の機能的核酸－タンパク質複合体を仲介することができる。前記トランスポゾン系はトランスポゾン末端を含んでもよい。前記トランスポゾン末端はトランスポザーゼまたはインテグラーゼとの複合体の形成に必要なヌクレオチド配列のみを示すものでもよい。前記トランスポゾン末端は二本鎖核酸ＤＮＡでもよい。ある場合、前記トランスポゾン末端は転移反応において、トランスポゾンと機能的核酸－タンパク質複合体を形成してもよい。
【0135】
本出願において、用語「ナノプラスミド」とは、通常、ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄで、すなわち、一つまたは複数の脂質に基づいたナノベクター、重合ナノ粒子、金属ナノ粒子、界面活性剤に基づいた乳液、樹状重合体、バッキーボール（ｂｕｃｋｙｂａｌｌ）、ナノ糸、ウイルス様粒子、ペプチドまたはタンパク質に基づいた粒子（たとえば、アルブミンナノ粒子）および／またはナノ材料を用いた組成物（たとえば、脂質－重合体ナノ粒子）から生成するナノ粒子である。ある場合、前記ナノプラスミドの大きさは約１００ナノメートル以下である。
【0136】
本出願において、用語「ミニサークルＤＮＡベクター」とは、通常、親プラスミド（Ｐａｒｅｎｔａｌ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＰＰ）が部位特異的組み換えをした産物である。前記ミニサークルＤＮＡベクターは超螺旋ＤＮＡ分子である。組み換え酵素の作用下において、親プラスミドは二つの環状ＤＮＡに転換し、一方は大量の細菌骨格配列を含有し、ミニプラスミド（Ｍｉｎｉｐｌａｓｍｉｄ、ＭＰ）と呼び、もう一方は標的遺伝子のみを含有する真核発現フレームワークで、すなわち、ミニサークルＤＮＡ（Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ、ＭＣ）である。前記ミニサークルＤＮＡベクターは真核発現カセットからなるものでもよい。
【0137】
本出願において、用語「抗体」とは、通常、所定のタンパク質またはペプチドもしくはその断片に反応性のある免疫グロブリンである。抗体は任意の種類からの抗体でもよく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含むが、これらに限定されず、そして任意のサブタイプ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）からの抗体でもよい。抗体はたとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選ばれる重鎖定常領域を有してもよい。抗体は、さらに、たとえばκまたはλから選ばれる軽鎖を有してもよい。本出願の抗体は任意の種由来のものでもよい。
【0138】
本出願において、用語「抗原結合断片」とは、通常、抗体分子のある部分で、当該部分はアミノ酸残基を含み、当該アミノ酸残基は抗原と相互作用して抗体に抗原に対する特異性および親和力を付与する。抗原結合断片の実例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含んでもよいが、これらに限定されない。本出願において、用語「Ｆａｂ」とは、通常、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有する断片で、そして軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。用語「Ｆａｂ’」とは、通常、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ基末端に少量の残基（一つまたは複数のヒンジ領域からのシステインを含む）が付加してＦａｂと異なる断片である。用語「Ｆ（ａｂ’）２」とは、通常、Ｆａｂ’二量体で、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋で連結した２つのＦａｂ断片を含む抗体断片である。用語「Ｆｖ」とは、通常、完全な抗原認識と結合部位を含有する最小抗体断片である。ある場合、当該断片は一つの重鎖可変領域と一つの軽鎖可変領域が近接に非共有結合した二量体からなるものでもよい。用語「ｄｓＦｖ」とは、通常、ジスルフィド結合が安定したＦｖ断片で、単一の軽鎖可変領域と単一の重鎖可変領域の間の結合がジスルフィド結合である。用語「ａＡｂ断片」とは、ＶＨドメインからなる抗体断片である。本出願において、用語「ｓｃＦｖ」とは、通常、抗体の一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインが柔軟性ペプチドリンカーを介して共有結合してマッチしてなる１価分子である。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨのような一般的な構造を有してもよい。
【0139】
本出願において、用語「キメラ抗原受容体」とは、通常、抗原に結合できる細胞外ドメインおよび少なくとも一つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質である。ＣＡＲはキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）の核心パートで、抗原（たとえば、腫瘍特異的抗原および／または腫瘍関連抗原）結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナルドメインを含んでもよい。本出願において、前記ＣＡＲは抗体の抗原（たとえば、ＣＤ１９）特異性に基づいてＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせることができる。遺伝修飾によってＣＡＲを発現するＴ細胞は標的抗原を発現する悪性細胞を特異的に認識および消滅することができる。ＣＡＲおよびＣＡＲ－Ｔ細胞の記述は、たとえば、Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ， Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ Ｒ， Ｒｉｖｉ ｀ｅｒｅ Ｉ． Ｔｈｅ ｂａｓｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１３；３（４）：３８８－３９８；Ｔｕｒｔｌｅ ＣＪ， Ｈｕｄｅｃｅｋ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＭＣ， Ｒｉｄｄｅｌｌ ＳＲ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１２；２４（５）：６３３－６３９；Ｄｏｔｔｉ Ｇ，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｓ， Ｓａｖｏｌｄｏ Ｂ， Ｂｒｅｎｎｅｒ ＭＫ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２０１４；２５７（１）：１０７－１２６ ；およびＷＯ２０１３１５４７６０、ＷＯ２０１６０１４７８９を参照する。
【0140】
本出願において、用語「汎用型」とは、通常、本出願に記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の問題を解決した細胞である。たとえば、前記汎用型Ｔ細胞（Ｕ－Ｔ細胞）は被験者の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすことがない。たとえば、前記汎用型Ｔ細胞（Ｕ－Ｔ細胞）はすべての被験者（またはホスト、宿主）に使用することができる。たとえば、前記汎用型Ｔ細胞（Ｕ－Ｔ細胞）は前記被験者にとって他家のＴ細胞でもよい。
【0141】
本出願において、用語「二重特異性抗体」とは、通常、１種または複数種の抗原における一つ以上のエピトープを認識する可変領域を有する抗体である。二重特異性抗体は、全長抗体、二つまたはそれ以上のＶＬおよびＶＨドメインを有する抗体、抗体断片、たとえば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、共有結合または非共有結合を介して連結した抗体断片を含むが、これらに限定されない。ある場合、前記二重特異性抗体は同様または異なる抗原における２種の異なるエピトープを認識することができる。ある場合、前記二重特異性抗体は２種の異なる抗原を認識することができる。
【0142】
本出願において、用語「抗原結合ドメイン」とは、通常、標的抗原に結合できるドメインである。抗原結合ドメインは特異的に抗原に結合できる部位と抗原受容体およびその断片、抗体またはその抗原結合断片を含んでもよい。抗原結合ドメインは腫瘍関連抗原に結合できるドメインでもよく、前記腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、Ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＥＡ、 Ｈｅｒ２、ＧＤ２、ＭＡＧ３、ＧＰＣ３およびＮＹ－ＥＳＯ－１を含むが、これらに限定されない。
【0143】
本出願において、用語「ＢｉＴＥ」とは、通常、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）である。前記ＢｉＴＥは二つの抗原結合ドメインを有する単一のポリペプチド鎖分子でもよく、この二つの抗原結合ドメインの一方はＴ細胞抗原に結合し、かつもう一方は標的細胞の表面に存在する抗原に結合する（Ｗ００５／０６１５４７；Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐら（２００８）“ＢｉＴＥ（登録商標）：Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｃｒｕｉｔ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ３３：１３７－１４７； またはＢａｒｇｏｕら（２００８） “Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ Ｔ Ｃｅｌｌ－Ｅｎｇａｇｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ／’Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９７４－９７７を参照する）。
【0144】
本出願において、用語「約」とは、通常、本出願に係る指定値または数値範囲の３０％以内、２５％以内、２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、０．５％以内または０．０５％以内である。本出願において、前記「約」が二つ以上の数値のうちの一つ目の数値の前に置かれた場合、当該シリーズにおける各数値に適用される。
【0145】
発明の詳述
Ｔ細胞製品および他家Ｔ細胞
一つの側面では、本出願は、被験者（たとえば、必要な被験者）に施用するためのＴ細胞製品であって、少なくとも１種の他家Ｔ細胞を含み、前記他家Ｔ細胞は少なくとも１種の前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現し、前記被験者の少なくとも１種の前記ＴＣＲが前記ＭＨＣ分子を認識すると同種異系反応（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｏｎ）を起こすＴ細胞製品を提供する。
Ｔ細胞製品および他家Ｔ細胞
一つの側面では、本出願は、被験者（たとえば、必要な被験者）に施用するためのＴ細胞製品であって、少なくとも１種の他家Ｔ細胞を含み、前記他家Ｔ細胞は少なくとも１種の前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現し、前記被験者の少なくとも１種の前記ＴＣＲが前記ＭＨＣ分子を認識すると同種異系反応（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｏｎ）を起こすＴ細胞製品を提供する。
【0146】
本出願において、前記少なくとも１種の他家Ｔ細胞の被験者の同種異系反応を起こす能力は除去または降下されていない。たとえば、前記Ｔ細胞製品において、少なくとも１種の被験者の同種異系反応を起こす能力を維持する他家Ｔ細胞を含んでもよい。
【0147】
本出願において、前記少なくとも１種の他家Ｔ細胞は免疫拒絶反応を低減または消失させる操作をされていない。
【0148】
本出願において、前記免疫拒絶反応を低減または消失させる操作は、他家Ｔ細胞のＣＤ５２遺伝子をノックアウトすることを含んでもよい。本出願において、前記免疫拒絶反応を低減または消失させる操作は、他家Ｔ細胞のＨＬＡ－Ｉ分子を改変することを含んでもよい。
【0149】
本出願において、前記少なくとも１種の他家Ｔ細胞における被験者の同種異系反応を起こしうる分子は修飾されていない。
【0150】
本出願において、前記被験者の同種異系反応を起こしうる分子は前記他家Ｔ細胞のＭＨＣ分子をできる含む。
【0151】
本出願において、前記被験者は腫瘍患者を含んでもよい。たとえば、前記腫瘍患者は本出願に係るＴ細胞製品によって腫瘍を治療すること（たとえば、腫瘍細胞の増殖を抑止すること、および／または腫瘍の疾患経過を緩和すること）、および／または、腫瘍の症状を緩和することができる。たとえば、本出願に係るＴ細胞製品は前記被験者に必要な細胞治療製品として有用である。
【0152】
本出願において、前記腫瘍は固形腫瘍および／または非固形腫瘍を含んでもよい。たとえば、前記腫瘍は肝臓癌を含んでもよい。
【0153】
本出願において、前記Ｔ細胞製品は前記被験者の自家由来のＴ細胞を含んでもよい。
【0154】
本出願において、前記被験者のＴ細胞はエフェクターＴ細胞、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）および／または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含んでもよい。
【0155】
本出願において、前記被験者のＴ細胞はＴＣＲを発現することができる。たとえば、前記Ｔ細胞はＴＣＲを発現することができ、前記ＴＣＲはＭＨＣ分子の認識に関与することができる。ある場合、前記被験者のＴ細胞はＭＨＣ分子を認識する能力を有してもよい。
【0156】
本出願において、前記他家Ｔ細胞の由来は前記被験者と異なる由来でもよい。本出願において、前記由来は同一の種の異なる個体を含んでもよい。たとえば、前記ドナーは健康なヒトでもよい。たとえば、前記ドナーは腫瘍疾患に罹患していないヒトでもよい。ある場合、前記ドナーは前記被験者と近縁関係がなくてもよい。ある場合、前記ドナーは前記被験者のＨＬＡとマッチしなくてもよい。たとえば、前記由来は前記被験者と同一の種の別の異なる個体を含んでもよい。
【0157】
本出願において、前記他家Ｔ細胞は前記被験者と異なる２つ以上のドナー由来のものでもよい。たとえば、前記被験者と同一の種の異なる少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはそれ以上のドナー由来のものでもよい。
【0158】
本出願において、前記他家Ｔ細胞は１種の前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現してもよい。本出願において、前記Ｔ細胞製品は前記他家Ｔ細胞のＭＨＣ（ヒトＨＬＡ）マッチに何ら要求もない。ある場合、前記Ｔ細胞製品は前記他家Ｔ細胞の前記ドナーのＭＨＣ（ヒトＨＬＡ）マッチの状況および／またはドナーの数に何ら要求もない。本出願に係るＴ細胞製品は前記ドナーの由来を拡大することができる。
【0159】
本出願において、前記他家Ｔ細胞は下記群から選ばれるバイオマーカー（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）を有してもよい：約０．５％以下（たとえば、約０．４％以下、約０．３％以下、約０．２％以下、約０．１％以下、約０．０５％以下またはそれ以下でもよい）のＣＤ３、約５０％－約１００％のＣＤ８（たとえば、約５０％－約９５％、約５０％－約９０％、約５０％－約８５％、約５０％－約８０％、約５５％－約１００％、約６０％－約１００％または約５５％－約９５％でもよい）、および約０％－約４０％のＣＤ４（たとえば、約０％－約４０％、約０％－約３５％、約０％－約３０％、約０％－約２５％、約５％－約４０％または約１０％－約４０％でもよい）。本出願において、前記の比率はフローサイトメトリーによって検出される比率の範囲でもよい。本出願において、前記他家Ｔ細胞は基本的にＣＤ３を発現しなくてもよい。たとえば、前記他家Ｔ細胞において、約０．５％以下（たとえば、約０．４％以下、約０．３％以下、約０．２％以下、約０．１％以下、約０．０５％以下またはそれ以下）の比率の細胞がＣＤ３を発現してもよい。
【0160】
本出願において、前記他家Ｔ細胞は２種以上（たとえば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０またはそれ以上でもよい）の前記被験者の少なくとも１種（たとえば、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種またはそれ以上）のＴ細胞に外来と認識されるＭＨＣ分子を発現してもよい。
【0161】
本出願において、前記ＭＨＣ分子はＭＨＣ Ｉおよび／またはＭＨＣ ＩＩを含んでもよい。
【0162】
本出願において、前記他家Ｔ細胞はエフェクターＴ細胞、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）および／または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含んでもよい。本出願において、前記他家Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）および／または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含んでもよい。
【0163】
本出願において、前記被験者の少なくとも１種の前記ＴＣＲは前記ＭＨＣ分子を認識すると同種異系反応（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｏｎ）を起こすことができる。たとえば、前記被験者の少なくとも１種の前記ＴＣＲは前記他家Ｔ細胞における少なくとも１つの分子を本出願に係る「外来」のＭＨＣ分子に属すると認識することができる。たとえば、前記外来と認識されると、前記被験者は前記の外来のＭＨＣ分子の存在によって前記同種異系反応が生じる。
【0164】
本出願において、前記同種異系反応は前記被験者の免疫反応の活性化を含んでもよい。たとえば、前記同種異系反応はＴＨ－１免疫反応を含んでもよい。本出願において、前記被験者の少なくとも１種の前記ＴＣＲは前記ＭＨＣ分子を認識して前記被験者のＴＨ－１免疫反応を促進させることができる。前記ＴＨ－１免疫反応は前記被験者における腫瘍細胞の増殖の抑制、および／または腫瘍の疾患経過の緩和を促進させることができる。
【0165】
本出願において、前記同種異系反応は前記他家Ｔ細胞の前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクを含んでもよい。たとえば、前記他家Ｔ細胞は外来の細胞として前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクがある。しかしながら、前記他家Ｔ細胞は改造によって当該リスクを低下させることができる。
【0166】
たとえば、前記のＴ細胞製品は前記他家Ｔ細胞の前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクを低下させる能力を有することが可能である。
【0167】
本出願において、工学的改造されていない前記他家Ｔ細胞と比較すると、前記工学的改造された前記他家Ｔ細胞では、前記他家Ｔ細胞の前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクが低下してもよい。たとえば、前記工学的改造は前記他家Ｔ細胞におけるＴＣＲの構造および／または活性を破壊することで、前記他家Ｔ細胞の前記被験者において前記ＧＶＨＤを起こすリスクを低下させることができる。
【0168】
本出願において、前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞におけるＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現および／または活性を下方調節する工程を含んでもよい。
【0169】
本出願において、前記ＣＤ３に関連する遺伝子は、ＣＤ３のγ鎖、ＣＤ３のδ鎖、ＣＤ３のε鎖、ＣＤ３のζ鎖およびＣＤ３のη鎖からなる群から選ばれるタンパク質をコードできる遺伝子を含んでもよい。
【0170】
本出願において、野生型の前記他家Ｔ細胞と比較すると、前記工学的改造され前記他家Ｔ細胞におけるＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現および／または活性が下方調節されてもよい。
【0171】
本出願において、前記ＣＤ３に関連する遺伝子の発現および／または活性の工学的改造により、ＣＤ３複合体の形成を抑止することおよび／またはＣＤ３複合体の活性を下方調節することができる。
【0172】
本出願において、前記工学的改造は遺伝子突然変異および／または遺伝子サイレンシングを含んでもよい。たとえば、遺伝子突然変異および／または遺伝子サイレンシング（たとえば、遺伝子編集）によって前記他家Ｔ細胞におけるＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現が下方調節されるようにさせることができる。
【0173】
本出願において、前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞に、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ＲＮＡ編集系、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓ 、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系およびメガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれる１種または複数種の物質を施用することを含んでもよい。
【0174】
本出願において、前記工学的改造はヌクレアーゼを使用してもよく、当該ヌクレアーゼが本出願に係る工学的改造を実現させればよい。
【0175】
本出願において、前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を施用することを含んでもよい。
【0176】
本出願において、前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞に前記ＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子のエクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを施用することを含んでもよい。
【0177】
本出願において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は汎用型Ｔ細胞（Ｕ－Ｔ細胞）でもよい。たとえば、前記他家Ｔ細胞は汎用型Ｔ細胞として異なる前記必要な被験者への施用に適用されてもよい。たとえば、前記他家Ｔ細胞は汎用型Ｔ細胞として、前記必要な被験者と異なる任意のほかの由来のものでもよい。ある場合、前記他家Ｔ細胞は汎用型Ｔ細胞として、さらに汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞に製造されてもよい。
【0178】
本出願において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを発現することができる。
【0179】
本出願において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインをコードする核酸を含んでもよい。
【0180】
本出願において、前記修飾は前記他家Ｔ細胞に前記核酸を形質移入することを含んでもよい。
【0181】
本出願において、前記形質移入はウイルス形質移入および／または非ウイルス形質移入を含んでもよい。たとえば、ウイルスで本出願に係る他家Ｔ細胞の修飾を行うことができる。たとえば、前記非ウイルス形質移入はプラスミドを使用してもよい。
【0182】
本出願において、前記プラスミドは環状プラスミド、スーパーコイルプラスミドまたは線形プラスミドでもよい。たとえば、前記プラスミドは環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドでもよい。
【0183】
本出願において、前記プラスミドはＤＮＡプラスミドでもよい。たとえば、前記ＤＮＡプラスミドは二本鎖で閉環のＤＮＡ分子でもよい。たとえば、前記ＤＮＡプラスミドは二本鎖で線形のＤＮＡ分子でもよい。本出願において、前記プラスミドは人工的に合成されたものでもよい。
【0184】
本出願において、前記プラスミドは細菌から生成するプラスミドを含んでもよい。本出願において、前記プラスミドはナノプラスミド（Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ）および／またはミニサークルＤＮＡ（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ）ベクターを含んでもよい。
【0185】
本出願において、前記プラスミドはｓｓＤＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡを含んでもよい。本出願において、前記ｓｓＤＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡは人工的に合成されたものでもよい。
【0186】
本出願において、前記プラスミドは抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインをコードする核酸を含んでもよい。前記核酸はｓｓＤＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡを含んでもよい。本出願において、前記核酸分子は人工的に合成されたものでもよい。
【0187】
本出願において、前記形質移入は安定形質移入および／または一過性形質移入を含んでもよい。
【0188】
本出願において、前記一過性形質移入はエレクトロポレーションを含んでもよい。たとえば、前記一過性形質移入は前記核酸が前記他家Ｔ細胞に入って発現されるようにさせることができる。本出願において、前記一過性形質移入はｍＲＮＡ形質移入を含んでもよい。たとえば、前記一過性形質移入は前記核酸（ｍＲＮＡ）がエレクトロポレーションによって前記他家Ｔ細胞に導入されて発現されるようにさせることができる。
【0189】
本出願において、前記安定形質移入はトランスポゾン系を使用するものおよび／または遺伝子編集ノックインを使用するものを含む。
【0190】
本出願において、前記遺伝子編集の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ＲＮＡ編集系ＡＤＡＲ、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびメガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれる１種または複数種でもよい。
【0191】
本出願において、前記遺伝子編集の方法は当業者に既知のものでもよく、遺伝子編集の目的が達成できれば、ある具体的な方法に限定されない。本出願において、前記遺伝子編集の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ＲＮＡ編集系ＡＤＡＲ、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびメガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれる１種または複数種でもよい。たとえば、前記遺伝子編集の方法はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してもよい。
【0192】
本出願において、前記遺伝子編集は遺伝子編集ノックアウトおよび／または遺伝子編集ノックインを含んでもよい。たとえば、前記遺伝子編集は遺伝子編集ノックインを含んでもよい。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって前記遺伝子編集ノックインを行うことができる。
【0193】
たとえば、前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ系は一種類のクラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し配列（ＣＲＩＳＰＲｓ）およびいくつかの機能関連タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、Ｃａｓ）を含んでもよい。ここで、前記Ｃａｓタンパク質のコード遺伝子はＣａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２およびＣｓｎ２を含んでもよい。たとえば、Ｃａｓ９でもよい。前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ系（たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）はＤＮＡ分子に標的への切断の特異性を有することが可能である。
【0194】
たとえば、前記遺伝子編集はＣａｓタンパク質を細胞における特異的なＤＮＡ配列にターゲッティングさせることによってＤＮＡ配列の挿入を行う過程でもよい。前記遺伝子編集ノックインは、Ｃａｓタンパク質（たとえば、Ｃａｓ ９タンパク質）が仲介する前記ドナープラスミドにおける前記ノックインしようとする外因性遺伝子をその標的となる細胞における特異的なＤＮＡ配列と相同組換えをさせる過程でもよい。
【0195】
本出願において、前記プラスミドは前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとされてもよい。たとえば、前記ドナープラスミドは二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ分子でもよい。前記ドナープラスミドはＨＤＲ修復機構のドナーの鋳型としてもよい。
【0196】
本出願において、前記ドナープラスミドはホモロジーアームを含んでもよい。たとえば、前記ホモロジーアームは遺伝子編集ノックインしようとする外因性遺伝子またはその断片の末端と相同でもよい。たとえば、前記ドナープラスミドは５’ホモロジーアームおよび／または３’ホモロジーアームを含んでもよい。たとえば、前記外因性遺伝子の核酸分子またはその断片の５’末端および／または３’末端はそれぞれ形質移入しようとする細胞のゲノムＤＮＡにおけるノックインしようとする位置の５’末端および／または３’末端の核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を有する核酸配列でもよい。たとえば、前記ホモロジーアームは１００－１０００ｂｐの大きさでもよい。たとえば、前記ホモロジーアームは約１００ｂｐ－１０００ｂｐでもよく、約１５０ｂｐ－１０００ｂｐでもよく、約２００ｂｐ－１０００ｂｐでもよく、約３００ｂｐ－１０００ｂｐでもよく、約４００ｂｐ－１０００ｂｐでもよく、約８００ｂｐ－１０００ｂｐでもよい。
【0197】
本出願において、前記プラスミドを含む形質移入混合物では、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量は前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（たとえば、約１０％（ｗ／ｗ）以下、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下でもよい）を占めてもよい。
【0198】
本出願において、前記微生物のゲノム由来の核酸分子の断片の大きさは少なくとも約４８ｋｂの大きさ（たとえば、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上）でもよい。
【0199】
本出願において、前記プラスミドを含む形質移入混合物では、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさ（たとえば、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上）の核酸分子またはその断片の含有量は形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（たとえば、約１０％（ｗ／ｗ）以下、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下でもよい）を占めてもよい。
【0200】
本出願において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約‰以下、約６‰以下、約５‰以下、約４‰以下、約３‰以下、約２‰以下、約１‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下を占めてもよい。たとえば、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約２％以下を占めてもよく、形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約５‰以下を占めてもよく、形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１‰以下を占めてもよい。
【0201】
本出願において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさ（たとえば、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上）の核酸分子またはその断片は前記プラスミドと異なる核酸分子に存在する。たとえば、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は形質移入混合物（前記形質移入混合物はプラスミドを含んでもよい）において遊離している。たとえば、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は前記プラスミドから遊離している。前記遊離は分離して、前記プラスミドに依存しない様態で存在してもよい。
【0202】
本出願において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は微生物由来のものでもよい。たとえば、前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群から選ばれる１種または複数種でもよい。
【0203】
本出願において、前記微生物はグラム陰性菌を含んでもよい。たとえば、前記微生物はベクターの骨格ベクターの製造に適する微生物でもよい。たとえば、前記微生物は大腸菌を含んでもよい。
【0204】
本出願において、前記プラスミド（たとえば、線形プラスミド）は、本出願の前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片（たとえば、線形の核酸分子またはその断片でもよい）の含有量および／または本出願の前記微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片（たとえば、線形の核酸分子またはその断片でもよい）の含有量が本出願に記載の条件に満足するように、（たとえば、デオキシリボヌクレアーゼ、たとえば、ＤＮＡエクソヌクレアーゼ、たとえばＤＮＡエクソヌクレアーゼＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖで）処理してもよい。本出願において、前記処理は環状構造を有する核酸分子に影響しなくてもよい。
【0205】
本出願において、前記プラスミドはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理されていてもよい。たとえば、前記ＤＮａｓｅ処理を経た後、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％以下を占めてもよい。また、たとえば、前記ＤＮａｓｅ処理を経た後、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％以下を占めてもよい。
【0206】
本出願において、前記形質移入混合物における前記核酸分子またはその断片の含有量は降下されてもよい。本出願において、前記降下とは前記形質移入混合物における前記核酸分子またはその断片の含有量を本出願に係る方法の要求に合うように降下させることでもよい。
【0207】
本出願において、前記降下は前記形質移入混合物を精製することを含んでもよい。すなわち、前記精製により、前記形質移入混合物における前記核酸分子またはその断片の含有量を本出願に係る方法の要求に合うように降下させることができる。
【0208】
本出願において、前記精製により、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片、ならびに／あるいは、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片を除去してもよい。たとえば、前記精製は、当業者によく知られているＤＮＡを精製する方法を利用し、前記形質移入混合物における前記核酸分子またはその断片の含有量を降下させることを含んでもよい。本出願において、前記精製は前記プラスミドのＤＮＡの完全性および／または活性に影響しなくてもよい。本出願において、前記降下は、ＤＮＡ酵素、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選ばれる試薬で前記形質移入混合物を精製することを含んでもよい。たとえば、前記降下はＤＮＡ酵素を使用してもよい。たとえば、ＤＮＡ酵素により、前記形質移入混合物における前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量を本出願に係る方法の要求に合うように降下させること、ならびに／あるいは、前記微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量を本出願に係る方法の要求に合うように降下させることができる。たとえば、前記ＤＮＡ酵素は前記環状プラスミドのＤＮＡの完全性および／または活性に影響しなくてもよい。
【0209】
本出願において、前記降下は、本出願に係るプラスミドのＤＮＡ人工合成およびＨＰＬＣによる本出願に係る形質移入混合物の検出からなる群から選ばれる方法を使用することを含んでもよい。たとえば、プラスミドのヌクレオチド配列からＤＮＡ人工合成を行うことで、得られるプラスミドが当該プラスミドのヌクレオチド配列のみを含むようにさせることができる。たとえば、ＨＰＬＣによって本出願に係る形質移入混合物を検出し、ＨＰＬＣの検出結果から、前記プラスミドの相応する特徴ピークを選択し、当該特徴ピークの相応する画分を収集し、得られるプラスミドが当該プラスミドのヌクレオチド配列のみを含むようにさせることができる。
【0210】
本出願において、前記抗体またはその抗原結合断片は二重特異性抗体を含んでもよい。
【0211】
本出願において、前記抗体またはその抗原結合断片は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含んでもよい。
【0212】
本出願において、前記ＣＡＲは抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含んでもよい。たとえば、前記ＣＡＲは抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインからなるものでもよい。
【0213】
本出願において、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは特異的に一つまたは複数の腫瘍関連抗原に結合することができる。
【0214】
本出願において、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは特異的にＧＰＣ３およびＣＤ７３に結合することができる。
【0215】
本出願において、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは特異的にＧＰＣ３およびＣＤ１４７に結合することができる。
【0216】
本出願において、前記抗原結合ドメインは特異的に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合することができる。
【0217】
本出願において、前記抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、ナノ抗体およびその抗原結合断片からなる群から選ばれてもよい。
【0218】
本出願において、前記ヒンジ領域は下記タンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含んでもよい：ＣＤ２８、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８、Ｆｃ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７およびＰＤ１。
【0219】
本出願において、前記膜貫通ドメインは下記タンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含んでもよい：ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４。
【0220】
本出願において、前記共刺激ドメインは下記タンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含んでもよい：ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳおよびＣＤ８３のリガンド。
【0221】
本出願において、前記シグナル伝達ドメインは下記タンパク質から選ばれるポリペプチド由来のものを含んでもよい：ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、 ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｉｇα受容体、Ｉｇβ受容体、ＢＬＶ ｇｐ３０（ｂｏｖｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｇｐ３０、牛白血病ウイルスｇｐ３０）、ＥＢＶ（Ｅｐ－ｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ、エプスタイン・バール・ウイルス）ＬＭＰ２Ａ 、サル免疫不全ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）、ＰＢｊ１４ Ｎｅｆおよび免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）。
【0222】
本出願において、前記サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦα、ＣＸＣＬ１、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＩｇＧ、ＩＰ－１０、Ｌ－１７Ａ、 ＭＣＰ－ｌおよびＰＧＥ２からなる群から選ばれてもよい。ある場合、前記他家Ｔ細胞は標的細胞（たとえば、腫瘍細胞）とともにインキュベートした後、サイトカイン（たとえば、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８および／またはＩＬ－１０）を生成してもよい。たとえば、前記修飾された他家Ｔ細胞は上記自己発現できるサイトカインの種類以外のサイトカインを発現することができる。
【0223】
本出願において、前記ケモカインは、ＣＣＬ１－ＣＣＬ２８およびＣＸＣＬ１－ＣＸＣＬ１７からなる群から選ばれてもよい。
【0224】
本出願において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は形質移入された後、１種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現および／または含有することができる。本出願において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は形質移入された後、１種の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を発現および／または含有することができる。
【0225】
本出願において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は形質移入を経た後、少なくとも１種（たとえば、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種またはそれ以上）の前記核酸を含むプラスミドを含んでもよい。
【0226】
本出願において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は２種以上のタンパク質を発現してもよい。
【0227】
本出願において、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は形質移入された後、１種のキメラ抗原受容体、ならびに１種または複数種のサイトカインを発現および／または含有することができる。たとえば、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は形質移入された後、１種のキメラ抗原受容体、ならびにＩＬ１５およびＩＬ－２１を発現および／または含有することができる。
【0228】
たとえば、前記ＣＡＲをコードする核酸分子は配列番号２で示される核酸配列を含んでもよい。
【0229】
たとえば、前記ＣＡＲをコードする核酸分子は配列番号１１または１２で示される核酸配列を含んでもよい。
【0230】
本出願において、前記少なくとも１種の他家Ｔ細胞の前記Ｔ細胞製品における含有量は約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約１００％でもよい。
【0231】
本出願において、少なくとも２種の異なる前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはサイトカインを発現する前記他家Ｔ細胞が所定の比率で混合されてもよい。
【0232】
ある場合、前記必要な被験者の治療目的により、前記Ｔ細胞製品は前記他家Ｔ細胞の混合物でもよい。たとえば、一つの側面では、前記他家Ｔ細胞は少なくとも一つの前記ドナー由来のものでもよい。
【0233】
たとえば、もう一つの側面では、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、前記被験者に必要な少なくとも１種のタンパク質を発現することができる。ある場合、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、１種のタンパク質、たとえば、１種のキメラ抗原受容体を発現することができる。ある場合、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、同種の前記他家Ｔ細胞が少なくとも２種（たとえば、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種またはそれ以上）のタンパク質を発現するようにさせることができる。たとえば、１種の前記他家Ｔ細胞は１種のキメラ抗原受容体を発現すると同時に、１種のサイトカインを発現することができる。また、たとえば、１種の前記他家Ｔ細胞種は１種のキメラ抗原受容体を発現すると同時に、１種のサイトカインおよび１種の二重特異性抗体を発現することができる。ある場合、前記Ｔ細胞製品はこれらの異なる種類の、異なる数のタンパク質を発現する前記他家Ｔ細胞を含んでもよい。たとえば、前記被験者の目的に応じ、前記Ｔ細胞製品において、これらの異なる前記ドナー由来の、異なる種類の、異なる数のタンパク質を発現できる前記他家Ｔ細胞を、所定の比率で混合することができる。ある場合、前記被験者の目的に応じ、異なる種類の、異なる由来の前記他家Ｔ細胞を「カスタマイズ」し、そしてこれらを必要な比率で混合することができる。
【0234】
ある場合、前記他家Ｔ細胞は本出願に係る工学的改造を経て、前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクが低下した。これに基づき、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞はさらに修飾された後、少なくとも１種のタンパク質、たとえば、１種のキメラ抗原受容体を発現することができる。前記他家Ｔ細胞が汎用型Ｔ細胞であることに基づき、ある場合、少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、同種の前記他家Ｔ細胞が少なくとも２種（たとえば、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種またはそれ以上）のタンパク質を発現するようにさせることができる。たとえば、１種の汎用型前記他家Ｔ細胞は１種のキメラ抗原受容体を発現すると同時に、１種のサイトカインを発現することができる。また、たとえば、１種の汎用型前記他家Ｔ細胞種は１種のキメラ抗原受容体を発現すると同時に、１種のサイトカインおよび１種の二重特異性抗体を発現することができる。ある場合、前記Ｔ細胞製品はこれらの異なる種類の、異なる数のタンパク質を発現する汎用型前記他家Ｔ細胞を含んでもよい。たとえば、前記被験者の目的に応じ、前記Ｔ細胞製品において、これらの異なる前記ドナー由来の、異なる種類の、異なる数のタンパク質を発現できる汎用型前記他家Ｔ細胞を、所定の比率で混合することができる。ある場合、前記被験者の目的に応じ、異なる種類の、異なる由来の汎用型前記他家Ｔ細胞を「カスタマイズ」し、そしてこれらを必要な比率で混合してもよい。
【0235】
ある場合、まず、異なるドナー由来の前記他家Ｔ細胞（たとえば、本出願に係る工学的改造された他家Ｔ細胞）を混合し、これらの混合した細胞にそれぞれ少なくとも１種のタンパク質をコードする核酸を形質移入（たとえば、エレクトロポレーション、たとえば、ｍＲＮＡエレクトロポレーション）してもよい。たとえば、これらの混合した細胞にキメラ抗原受容体をコードする核酸分子、および／またはサイトカインをコードする核酸を形質移入でもよい。その後、これらの形質移入した細胞を、前記被験者の目的に応じ、必要な比率で混合してもよい。
【0236】
ある場合、まず、前記他家Ｔ細胞（たとえば、本出願に係る工学的改造された他家Ｔ細胞）にそれぞれ少なくとも１種のタンパク質をコードする核酸分子を形質移入（たとえば、エレクトロポレーション、たとえば、ｍＲＮＡエレクトロポレーション）してもよい。たとえば、前記他家Ｔ細胞にキメラ抗原受容体をコードする核酸分子、および／またはサイトカインをコードする核酸分子を形質移入でもよい。その後、これらの形質移入した細胞（たとえば、少なくとも２つのドナー由来のものでもよい）を、前記被験者の目的に応じ、必要な比率で混合してもよい。
【0237】
本出願において、前記Ｔ細胞製品は前記被験者由来のＴ細胞（すなわち、「自家」Ｔ細胞）を含んでもよい。ある場合、前記被験者由来のＴ細胞は修飾され、前記被験者に必要な少なくとも１種のタンパク質を発現することができる（たとえば、前記キメラ抗原受容体を発現することができる）。
【0238】
前記被験者由来の自家Ｔ細胞と比較すると、本出願に係るＴ細胞製品は前記被験者においてより激しい免疫反応を起こすことができる。
【0239】
本出願において、前記Ｔ細胞製品の前記他家Ｔ細胞が修飾された後のタンパク質を発現するレベルは前記他家Ｔ細胞の由来によって影響されることがない。
【0240】
本出願において、前記Ｔ細胞製品は、さらに、ほかの種類のＴ細胞を含んでもよい。本出願において、前記Ｔ細胞製品は前記被験者の自家由来のＴ細胞を含んでもよい。本出願において、前記Ｔ細胞製品は、さらに、１種または複数種のほかのＴ細胞を含んでもよい。たとえば、前記ほかのＴ細胞は修飾されたＴ細胞でもよい。たとえば、前記ほかの修飾されたＴ細胞は相応する修飾されていないＴ細胞と比較すると、生体の同種異系反応を起こす能力が低下した。たとえば、前記ほかの修飾されたＴ細胞は相応する修飾されていないＴ細胞と比較すると、ＭＨＣ分子の発現および／または活性が低下した。たとえば、前記ほかのＴ細胞は他家のものでもよい。
【0241】
たとえば、前記修飾された他家Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩを突然変異させたＴ細胞を含んでもよい。たとえば、前記修飾されたＴ細胞はＭＨＣクラスＩがノックアウトされたＴ細胞を含んでもよい。たとえば、前記修飾されたＴ細胞はＭＨＣクラスＩがノックアウトされたが、同時にＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇを発現するＴ細胞を含んでもよい。たとえば、前記修飾されたＴ細胞は任意の既存技術で既知のＵＣＡＲＴを含んでもよい。たとえば、前記修飾されたＴ細胞はＣＤ５２遺伝子がノックアウトされたＴ細胞を含んでもよい。
【0242】
薬物組成物およびその使用
もう一つの側面では、本出願は、本出願に記載のＴ細胞製品と、薬学的に許容される補助剤とを含む薬物組成物を提供する。
もう一つの側面では、本出願は、本出願に記載のＴ細胞製品と、薬学的に許容される補助剤とを含む薬物組成物を提供する。
【0243】
本出願において、前記補助剤は担体を含んでもよく、たとえば、前記担体はリン酸塩緩衝塩溶液、水、乳剤（たとえば、油／水乳剤）、様々な保湿剤、無菌溶液、リポソームを含んでもよい。
【0244】
本出願において、前記補助剤は注射に適するものでもよい。
【0245】
本出願において、前記補助剤は腫瘍内注射および／または全身注射に適するものでもよい。たとえば、前記補助剤は無菌の水含有または水非含有溶液、懸濁液、および乳剤を含んでもよい。水非含有溶媒は、たとえば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（たとえば、オリーブオイル）、および注射可能な有機エステル（たとえば、オレイン酸エチル）でもよい。
【0246】
本出願において、前記補助剤は、防腐剤およびほかの添加剤、たとえば、抗微生物、抗酸化、キレート剤および／または不活性ガスなどを含んでもよい。
【0247】
本出願において、前記薬物組成物の投与量は関与する医者および臨床の要素によって決まる。既存の医学技術で公知のように、任意の患者に対する投与量は、患者の体格、身体の表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与時間および経路、総合的な健康状況、ならびに投与するほかの薬物を含む多くの要素によって決まる。
【0248】
ある場合、前記薬物組成物はほかの薬物活性成分を含んでもよい。前記薬物活性成分の種類および／または含有量は前記被験者の状況によって決まる。
【0249】
もう一つの側面では、本出願は、本出願に記載のＴ細胞製品と、注射用器材とを含むキットを提供する。
【0250】
たとえば、前記注射用器材は注射器を含んでもよい。前記腫瘍内注射は、まず、注射器の針を腫瘍外の皮下に入れ、さらに腫瘍内に入れてもよい。前記腫瘍内注射は多点注射を含んでもよい。
【0251】
もう一つの側面では、本出願は、薬物の製造における本出願に記載のＴ細胞製品、本出願に記載の薬物組成物および／または本出願に記載のキットの使用であって、前記薬物は腫瘍の予防、緩和、治療に用いられる使用を提供する。
【0252】
本出願において、前記腫瘍は固形腫瘍を含む。たとえば、前記腫瘍は肺癌を含んでもよい。
【0253】
本出願において、前記薬物は注射に適するように調製される。
【0254】
本出願において、前記薬物は腫瘍内注射に適するように調製される。
【0255】
もう一つの側面では、本出願は、腫瘍微環境を改善する方法であって、被験者に本出願に記載のＴ細胞製品、本出願に記載の薬物組成物および／または本出願に記載のキットを施用する工程を含む方法を提供する。
【0256】
もう一つの側面では、本出願は、腫瘍を予防、緩和、治療する方法であって、被験者に本出願に記載のＴ細胞製品、本出願に記載の薬物組成物および／または本出願に記載のキットを施用する工程を含む方法を提供する。
【0257】
本出願において、前記施用は注射を含む。
【0258】
本出願において、前記施用は腫瘍内注射を含む。
【0259】
本出願において、前記施用は１回以上の腫瘍内注射を含む。前記腫瘍内注射の回数は前記被験者の状況によって決まる。
【0260】
もう一つの側面では、本出願は、腫瘍の予防、緩和、治療に用いられる、本出願に記載のＴ細胞製品、本出願に記載の薬物組成物および／または本出願に記載のキットを提供する。
【0261】
何らの理論にも制限されず、下記における実施例は本出願の発明の各技術方案を説明するためのものに過ぎず、本出願の発明の範囲を制限するためのものではない。
実施例
実施例
【実施例1】
【0262】
他家Ｔ細胞を工学的改造および修飾することによって有効にＣＤ３陽性細胞をノックアウトすることができる。
【0263】
１．１ 他家Ｔ細胞を工学的改造する
（１）Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄｓとＣＤ３陽性細胞をＸ－ｖｉｖｏ１５＋２０Ｕ／ｍｌ培養液において１：１の比率で活性化させた。異なるドナー（ドナー１－ドナー３）由来のＴ細胞を収集し、それぞれドナー１－Ｔ細胞、ドナー２－Ｔ細胞およびドナー３－Ｔ細胞と名付けた。ここで、Ｔ細胞を収集する工程は：
（２）２－３日活性化させた後、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ／ｓｇＲＮＡ系を使用し、それぞれドナー１－Ｔ細胞、ドナー２－Ｔ細胞およびドナー３－Ｔ細胞におけるＣＤ３をノックアウトした（ヒトＣＤ３関連遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１で示され、かつ５’末端および３’末端にそれぞれ３つのチオおよびオキシメチル修飾があり、南京ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から購入された）。
（３）ＣＤ３をノックアウトして２日後、ＣＤ３＋免疫磁気ビーズ（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ （カタログ番号１７８５１、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された））で工程（２）でノックアウトされた細胞に対してさらにＣＤ３陽性細胞を除去するスクリーニングを行った。
（１）Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄｓとＣＤ３陽性細胞をＸ－ｖｉｖｏ１５＋２０Ｕ／ｍｌ培養液において１：１の比率で活性化させた。異なるドナー（ドナー１－ドナー３）由来のＴ細胞を収集し、それぞれドナー１－Ｔ細胞、ドナー２－Ｔ細胞およびドナー３－Ｔ細胞と名付けた。ここで、Ｔ細胞を収集する工程は：
（２）２－３日活性化させた後、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ／ｓｇＲＮＡ系を使用し、それぞれドナー１－Ｔ細胞、ドナー２－Ｔ細胞およびドナー３－Ｔ細胞におけるＣＤ３をノックアウトした（ヒトＣＤ３関連遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１で示され、かつ５’末端および３’末端にそれぞれ３つのチオおよびオキシメチル修飾があり、南京ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から購入された）。
（３）ＣＤ３をノックアウトして２日後、ＣＤ３＋免疫磁気ビーズ（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ （カタログ番号１７８５１、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された））で工程（２）でノックアウトされた細胞に対してさらにＣＤ３陽性細胞を除去するスクリーニングを行った。
【0264】
工程（２）、（３）の処理後、それぞれフローサイトメトリーによってＣＤ３陽性細胞の比率を検出した。結果は表１に示す。細胞を続いて５－７日培養した後、さらなる遺伝子修飾の使用に供した。
【表1】
【0265】
１．２
ｍＲＮＡの調製は、Ｈｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡ ｋｉｔ （ＮＥＢ、＃Ｅ２０６０５）および製品に付いた調製プロトコールで実現させた。プラスミドをｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。プラスミドの線形化はＸｈｏＩによって実現させた。
ｍＲＮＡの調製は、Ｈｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡ ｋｉｔ （ＮＥＢ、＃Ｅ２０６０５）および製品に付いた調製プロトコールで実現させた。プラスミドをｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。プラスミドの線形化はＸｈｏＩによって実現させた。
【0266】
ＣＡＲをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）を、エレクトロポレーションによってそれぞれ実施例１．１で製造されたＣＤ３陽性細胞をノックアウトして除去したドナー１－Ｔ細胞、ドナー２－Ｔ細胞およびドナー３－Ｔ細胞に形質移入した。
【0267】
ここで、ＣＡＲはＧＰＣ３を標的とし、ＣＡＲをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号２で示されるものである。これらの修飾された細胞をそれぞれＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔと呼ぶ。
【0268】
１．３
ＧＰＣ ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１プラスミドの骨格プラスミドはｐＵＣ５７－ｍｉｎｉ－ＡｍｐまたはｐＵＣ５７－ｍｉｎｉ－Ｋａｎで、ＧＰＣ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１をコードする核酸分子をクローニングした（ここで、ＧＰＣ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１をコードするヌクレオチド配列は配列番号１１で示される）。同時に、これらのプラスミドにヒトＴＲＡＣ遺伝子の一部の遺伝子と相同性を有する核酸配列を含ませた。ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成のｓｇＲＮＡを設計した（５’、そのヌクレオチド配列は配列番号１で示され、かつ５’末端および３’末端にそれぞれ３つのチオおよびオキシメチル修飾があり、南京ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から購入された）。Ｃａｓ９タンパク質はＳｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入された（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。
ＧＰＣ ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１プラスミドの骨格プラスミドはｐＵＣ５７－ｍｉｎｉ－ＡｍｐまたはｐＵＣ５７－ｍｉｎｉ－Ｋａｎで、ＧＰＣ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１をコードする核酸分子をクローニングした（ここで、ＧＰＣ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１をコードするヌクレオチド配列は配列番号１１で示される）。同時に、これらのプラスミドにヒトＴＲＡＣ遺伝子の一部の遺伝子と相同性を有する核酸配列を含ませた。ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成のｓｇＲＮＡを設計した（５’、そのヌクレオチド配列は配列番号１で示され、かつ５’末端および３’末端にそれぞれ３つのチオおよびオキシメチル修飾があり、南京ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から購入された）。Ｃａｓ９タンパク質はＳｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入された（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。
【0269】
ＣＲＩＳＰＲ／ｓｇＲＮＡ系を使用し、調製されたプラスミドをＤｙｎａｌ ｂｅａｄで２－３日活性化されたヒトＴ細胞にエレクトロポレーションし、３つのドナーＤ１、Ｄ２、Ｄ３にＧＰＣ－３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１をノックインしたＣＡＲＴ細胞（Ｄ５－ＣＡＲＴ、Ｄ６－ＣＡＲＴ、Ｄ７－ＣＡＲＴ）を得たが、ここで、ＣＤ３陽性率は表２におけるノックイン後で示され、そして凍結保存した。再生した後、ＣＤ３＋免疫磁気ビーズ（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ （カタログ番号１７８５１、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された））でＣＡＲをノックインした細胞に対してさらにＣＤ３陽性細胞を除去するスクリーニングを行い、ノックイン／ＣＤ３除去後に残ったＣＤ３陽性細胞を得たが、表２に示す。
【表2】
【実施例2】
【0270】
他家Ｔ細胞が同種異系反応を起こす。
Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識され、未照射の、４つの異なるドナー由来のＰＢＭＣで他家Ｔ細胞の同種異系反応を研究した。
Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識され、未照射の、４つの異なるドナー由来のＰＢＭＣで他家Ｔ細胞の同種異系反応を研究した。
【0271】
２．１
実施例１．２で調製されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔを照射し（照射条件：６０ Ｇｙ Ｘ線、ＲＳ２０００ Ｐｒｏ、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ、米国）、そしてそれぞれ各由来に相応する自家ＰＢＭＣ（すなわち、Ｄ１－ＰＢＭＣ、Ｄ２－ＰＢＭＣ、Ｄ３－ＰＢＭＣ）または他家Ｄ４－ＰＢＭＣとともにインキュベートした。
実施例１．２で調製されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔを照射し（照射条件：６０ Ｇｙ Ｘ線、ＲＳ２０００ Ｐｒｏ、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ、米国）、そしてそれぞれ各由来に相応する自家ＰＢＭＣ（すなわち、Ｄ１－ＰＢＭＣ、Ｄ２－ＰＢＭＣ、Ｄ３－ＰＢＭＣ）または他家Ｄ４－ＰＢＭＣとともにインキュベートした。
【0272】
また、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔを混合し、そして混合した細胞をＤ４－ＰＢＭＣとともにインキュベートすることで、最大限に同種異系反応が生じるように保証した。
【0273】
一晩共にインキュベートした後、フローサイトメトリーによってＰＢＭＣにおけるＴ細胞ＣＤ６９のＭＦＩ値を検出した。結果は図１Ａに示す（図においてＰはＰＢＭＣ細胞を表す）。ここで、Ｄ１－Ｐはドナー１からのＰＢＭＣ細胞を表す。Ｄ１－Ｔは実施例１で製造されたＧＰＣ３ ＣＡＲを発現するドナー１由来のＣＡＲＴ細胞である。Ｄ１－Ｐ＋Ｄ１－Ｔは同様の数のＤ１－ＴとＤ１－Ｐを混合して得られた結果を表し、そしてＤ１－Ｐ＋Ｄ１－Ｔの合計数は左側のＤ１－Ｐの数と同様である。同様に、Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ３（１／３）－Ｔは同様の数のＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔを混合して得られた結果を表し、中では、三者はそれぞれ１／３を占め、そしてＤ１＋Ｄ２＋Ｄ３（１／３）－ＴとＤ４－Ｐの合計数はその左側のＤ４－Ｐの数と同様である。同様に、Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ３－ＴはＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔを混合して得られた結果を表し、そしてＤ１＋Ｄ２＋Ｄ３－ＴとＤ４－Ｐの合計数はその左側のＤ４－Ｐの数と同様である。図１Ａにおいて、ほかの横座標の意味は類似する。
【0274】
図１Ａの結果から、異系間の細胞（たとえば、Ｄ１－Ｔ＋Ｄ４－ＰＢＭＣ）の相互作用によるＣＤ６９のＭＦＩは同系間の細胞（たとえば、Ｄ１－Ｔ＋Ｄ１－ＰＢＭＣ）の相互作用によるＣＤ６９のＭＦＩよりも顕著に向上したことが示された。この３つの異なるドナー由来のＣＡＲＴ細胞の混合物と４つ目のドナー（すなわち、この３つのドナーにとっての他家）のＰＢＭＣの混合培養によるＴ／ＮＫ細胞の活性化の程度から、複数の異系ドナー由来のＣＡＲＴはより多く本出願に係る同種異系反応が生じることを保証できることがわかる。
【0275】
２．２
実施例１．２で調製されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔを照射し（照射条件：６０ Ｇｙ Ｘ線、ＲＳ２０００ Ｐｒｏ、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ、米国）、そしてそれぞれ各由来に相応するＰＢＭＣ（すなわち、Ｄ１－ＰＢＭＣ、Ｄ２－ＰＢＭＣ、Ｄ３－ＰＢＭＣ）または他家Ｄ４－ＰＢＭＣとともにインキュベートした。
実施例１．２で調製されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔを照射し（照射条件：６０ Ｇｙ Ｘ線、ＲＳ２０００ Ｐｒｏ、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ、米国）、そしてそれぞれ各由来に相応するＰＢＭＣ（すなわち、Ｄ１－ＰＢＭＣ、Ｄ２－ＰＢＭＣ、Ｄ３－ＰＢＭＣ）または他家Ｄ４－ＰＢＭＣとともにインキュベートした。
【0276】
また、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔを混合し、そして混合した細胞をＤ４－ＰＢＭＣとともにインキュベートした。
【0277】
一晩共にインキュベートした後、ＣＢＡによって細胞培養上清液におけるＩＦＮ－γの含有量を検出した。検出工程は製品に付いたプロトコールに従った。結果は図１Ｂに示す（図においてＰはＰＢＭＣ細胞を表す）。図１Ｂにおいて、横座標の意味は図１Ａと同様でする。
【0278】
図１Ｂの結果から、異系間の細胞（たとえば、Ｄ１－Ｔ＋Ｄ４－ＰＢＭＣ）の相互作用によるＩＦＮ－γの含有量は同系間の細胞（たとえば、Ｄ１－Ｔ＋Ｄ１－ＰＢＭＣ）の相互作用によるＩＦＮ－γの含有量よりも顕著に向上したことが示された。この３つの異なるドナー由来のＣＡＲＴ細胞の混合物と４つ目のドナー（すなわち、この３つのドナーにとっての他家）のＰＢＭＣの混合培養によるＩＦＮ－γの発現の顕著な向上から、複数の異系ドナー由来のＣＡＲＴはより多く本出願に係る同種異系反応が生じることを保証できることがわかる。
【0279】
２．３
実施例１．３で調製されたＤ５－ＣＡＲＴ、Ｄ６－ＣＡＲＴおよびＤ７－ＣＡＲＴを照射し（照射条件：６０ Ｇｙ Ｘ線、ＲＳ２０００ Ｐｒｏ、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ、米国）、そしてそれぞれ単独でまたは混合した後、他家Ｄ８－ＰＢＭＣとともに一晩インキュベートしたことで異系反応を生じさせた。フローサイトメトリーによってＤ８－ＰＢＭＣにおけるＴ細胞のＣＤ６９のＭＦＩを測定した。結果は図２に示すように、Ｄ８－ＰＢＭＣのみの場合、Ｄ８－ＰＢＭＣにおけるＴ細胞のＣＤ６９の平均蛍光値が最も低かったことが示された。Ｄ８－ＰＢＭＣを照射されたＤ５－ＣＡＲＴ、Ｄ６－ＣＡＲＴ、Ｄ７－ＣＡＲＴ、またはＤ５－ＣＡＲＴ＋Ｄ６－ＣＡＲＴ＋Ｄ７－ＣＡＲＴと一晩インキュベートし、Ｄ８－ＰＢＭＣのＣＤ６９の平均蛍光強度がいずれも顕著に増強し、異系反応がＴ細胞を活性化させたことを意味する。
実施例１．３で調製されたＤ５－ＣＡＲＴ、Ｄ６－ＣＡＲＴおよびＤ７－ＣＡＲＴを照射し（照射条件：６０ Ｇｙ Ｘ線、ＲＳ２０００ Ｐｒｏ、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ、米国）、そしてそれぞれ単独でまたは混合した後、他家Ｄ８－ＰＢＭＣとともに一晩インキュベートしたことで異系反応を生じさせた。フローサイトメトリーによってＤ８－ＰＢＭＣにおけるＴ細胞のＣＤ６９のＭＦＩを測定した。結果は図２に示すように、Ｄ８－ＰＢＭＣのみの場合、Ｄ８－ＰＢＭＣにおけるＴ細胞のＣＤ６９の平均蛍光値が最も低かったことが示された。Ｄ８－ＰＢＭＣを照射されたＤ５－ＣＡＲＴ、Ｄ６－ＣＡＲＴ、Ｄ７－ＣＡＲＴ、またはＤ５－ＣＡＲＴ＋Ｄ６－ＣＡＲＴ＋Ｄ７－ＣＡＲＴと一晩インキュベートし、Ｄ８－ＰＢＭＣのＣＤ６９の平均蛍光強度がいずれも顕著に増強し、異系反応がＴ細胞を活性化させたことを意味する。
【実施例3】
【0280】
異なるドナー由来のＴ細胞の混合物がエレクトロポレーションによる分子を発現する能力に影響しない。
【0281】
３．１
フローサイトメトリーによってそれぞれ実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ、ならびにＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞におけるＣＡＲの発現状況を検出した。
フローサイトメトリーによってそれぞれ実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ、ならびにＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞におけるＣＡＲの発現状況を検出した。
【0282】
結果を図３に示す。ここで、ＮｏＥＰは対照群として、エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞を表す。
【0283】
図３の結果から、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－Ｔ、Ｄ３－ＴならびにＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞におけるＣＡＲの発現量に明らかな差がなかったことがわかる。
【0284】
３．２ 非ウイルス部位特異的ノックイン方法によってＣＡＲ分子の長期間発現を実現させる。
【0285】
ＧＰＣ－３ ＣＡＲプラスミドの骨格プラスミドはｐＵＣ５７－ｍｉｎｉ－ＡｍｐまたはｐＵＣ５７－ｍｉｎｉ－Ｋａｎである。ＧＰＣ－３ＣＡＲを標的とするようにコードされる核酸分子をクローニングした。同時に、これらのプラスミドにヒトＴＲＡＣ遺伝子の一部の遺伝子と相同性を有する核酸配列を含ませた。ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成のｓｇＲＮＡを設計した（５’、そのヌクレオチド配列は配列番号１で示され、かつ５’末端および３’末端にそれぞれ３つのチオおよびオキシメチル修飾があり、南京ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から購入された）。Ｃａｓ９タンパク質はＳｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入された（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。当該プラスミドをプラスミド抗ＧＰＣ－３ＣＡＲプラスミドと呼び、配列番号２で示される核酸配列を含む。
【0286】
製造されたＧＰＣ－３ＣＡＲプラスミドをＤｙｎａｌ ｂｅａｄで２－３日活性化させたヒトＴ細胞にエレクトロポレーションによって導入し、抗ＧＰＣ－３ ＣＡＲがノックインされたＧＰＣ－３ ＣＡＲＴ細胞を得た。
【0287】
当該ＧＰＣ－３ ＣＡＲＴ細胞はＨｕｈ－７標的細胞で活性化して体外で６０日超と長期間生存することができる。６０日体外で増幅したＣＡＲＴのＣＡＲの発現量は図４に示す。
【0288】
図４の結果から、ＧＰＣ－３ ＣＡＲＴ細胞は体外で６０日培養した後も高い発現量を有することがわかる。
【0289】
３．３ Ｔ細胞は同時にＣＡＲおよびほかの分子を発現することができる
ＣＡＲをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）およびサイトカインまたはケモカインをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）を含むものは、いずれもエレクトロポレーションによってそれぞれＤｙｎａｌ Ｂｅａｄ：細胞＝１：１で５－９日活性化させたＴ細胞に形質移入した。
ＣＡＲをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）およびサイトカインまたはケモカインをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）を含むものは、いずれもエレクトロポレーションによってそれぞれＤｙｎａｌ Ｂｅａｄ：細胞＝１：１で５－９日活性化させたＴ細胞に形質移入した。
【0290】
ここで、ＣＡＲはＧＰＣ３を標的とし、ＣＡＲをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号２で示されるものである。
【0291】
サイトカインＩＬ１２ａをコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号８で示される。
【0292】
サイトカインＩＬ１２ｂをコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号９で示される。
【0293】
サイトカインＩＬ１ｂをコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号５で示される。
【0294】
ケモカインＣＣＬ５をコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号６で示される。
【0295】
ケモカインＣＸＣＬ１０をコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号７で示される。
【0296】
中では、同時にＧＰＣ３ ＣＡＲならびにＩＬ１２ａ、ＩＬ１２ｂ、ＩＬ１ｂ、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０を発現するものは、ＧＰＣ３＋サイトカイン細胞と呼ぶ。
【0297】
【0298】
図５Ａの１－３はそれぞれエレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞、実施例１で製造されたエレクトロポレーションによってＧＰＣ３ ＣＡＲのみが形質移入されたＴ細胞、実施例３で製造されたＧＰＣ３＋サイトカイン細胞におけるＣＡＲの発現量を示す。
【0299】
図５Ｂの１－３はそれぞれエレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞、実施例１で製造されたエレクトロポレーションによってＧＰＣ３ ＣＡＲのみが形質移入されたＴ細胞、実施例３で製造されたＧＰＣ３＋サイトカイン細胞の細胞培養上清液におけるサイトカイの発現量を示す。
【0300】
３．４
エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞、実施例１．２で製造されたエレクトロポレーションによってＧＰＣ３ ＣＡＲのみが形質移入されたＴ細胞、実施例３で製造されたＧＰＣ３＋サイトカイン細胞はそれぞれＨｅｐＧ２標的細胞とエフェクター標的比が２：１の比率で混合してインキュベートした。一晩後、ＣＢＡによって各細胞の培養上清液におけるサイトカインまたはケモカインの発現量を検出した。結果は図５に示す。図６の１－３はそれぞれ１：エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞、２：実施例１で製造されたエレクトロポレーションによってＧＰＣ３ ＣＡＲのみが形質移入されたＴ細胞、３：実施例３で製造されたＧＰＣ３＋サイトカイン細胞を示す。
エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞、実施例１．２で製造されたエレクトロポレーションによってＧＰＣ３ ＣＡＲのみが形質移入されたＴ細胞、実施例３で製造されたＧＰＣ３＋サイトカイン細胞はそれぞれＨｅｐＧ２標的細胞とエフェクター標的比が２：１の比率で混合してインキュベートした。一晩後、ＣＢＡによって各細胞の培養上清液におけるサイトカインまたはケモカインの発現量を検出した。結果は図５に示す。図６の１－３はそれぞれ１：エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞、２：実施例１で製造されたエレクトロポレーションによってＧＰＣ３ ＣＡＲのみが形質移入されたＴ細胞、３：実施例３で製造されたＧＰＣ３＋サイトカイン細胞を示す。
【実施例4】
【0301】
腫瘍細胞に対する特異的殺傷機能を検出する
【0302】
４．１
ＣＡＲをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）を含み、ここで、ＣＡＲはＧＰＣ３を標的とし、ＣＡＲをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号２で示されるものである。エレクトロポレーションによってそれぞれＤｙｎａｌ Ｂｅａｄ：細胞＝１：１の比率で５－９日活性化させたＴ細胞に形質移入した。エレクトロポレーションされた細胞を所定のエフェクター標的比でそれぞれ標的細胞ＳＫ－ＨＥＰ－１、Ｈｕｈ７またはＨｅｐＧ２と混合した。それぞれこれらの殺傷効率を検出し、そしてフローサイトメトリーによって標的細胞の表面のＧＰＣ３の発現状況を検出した。
ＣＡＲをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）を含み、ここで、ＣＡＲはＧＰＣ３を標的とし、ＣＡＲをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号２で示されるものである。エレクトロポレーションによってそれぞれＤｙｎａｌ Ｂｅａｄ：細胞＝１：１の比率で５－９日活性化させたＴ細胞に形質移入した。エレクトロポレーションされた細胞を所定のエフェクター標的比でそれぞれ標的細胞ＳＫ－ＨＥＰ－１、Ｈｕｈ７またはＨｅｐＧ２と混合した。それぞれこれらの殺傷効率を検出し、そしてフローサイトメトリーによって標的細胞の表面のＧＰＣ３の発現状況を検出した。
【0303】
結果はそれぞれ図７Ａ－７Ｆに示すように、ここで、図７Ａ－７Ｃはそれぞれ標的細胞ＳＫ－ＨＥＰ－１、Ｈｕｈ７またはＨｅｐＧ２に対する殺傷効率を示し、図７Ｄ－７Ｆはそれぞれ標的細胞ＳＫ－ＨＥＰ－１、Ｈｕｈ７またはＨｅｐＧ２の表面のＧＰＣ３の発現状況を示す。ここで、１－２はそれぞれ１：エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞、２：エレクトロポレーションによってＣＡＲ－ｍＲＮＡが形質移入されたＴ細胞を示す。
【0304】
図７の結果から、エレクトロポレーションによって得られたＣＡＲＴ細胞はＣＡＲを発現することで特異的に腫瘍細胞を殺傷することができることがわかる。
【0305】
４．２ 異なるドナー由来のＣＡＲＴ細胞またはその混合物が類似する標的細胞殺傷機能を有する
それぞれ実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ、ならびにＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞を所定のエフェクター標的比でそれぞれ標的細胞ＨｅｐＧ２と混合した。ここで、標的細胞ＨｅｐＧ２はＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識した。
それぞれ実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ、ならびにＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞を所定のエフェクター標的比でそれぞれ標的細胞ＨｅｐＧ２と混合した。ここで、標的細胞ＨｅｐＧ２はＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識した。
【0306】
フローサイトメトリーによってこれらの殺傷効率を検出した。
【0307】
結果を図８に示す。図８において、１－５はそれぞれ１：エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞、２：Ｄ１－Ｔ、３：Ｄ２－Ｔ、４：Ｄ３－Ｔ、５：Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ的混合細胞を示す。
【0308】
図８の結果から、エレクトロポレーションによる単一のドナー由来の他家Ｔ細胞およびエレクトロポレーションによる複数のドナーの混合由来の他家Ｔ細胞は同様の標的細胞を殺傷する機能が得られることがわかる。
【実施例5】
【0309】
腫瘍細胞を殺傷した後に免疫反応を活性化させる能力を検出する
【0310】
５．１ 免疫細胞を動員する
それぞれ実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ、ならびにＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞、対照細胞である、エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞、および陽性対照細胞である、エレクトロポレーションによって過剰量のＧＰＣ３ ＣＡＲを形質移入したＴ細胞を、それぞれエフェクター標的比６：１で標的細胞ＨｅｐＧ２とともにインキュベートした。
それぞれ実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ、ならびにＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞、対照細胞である、エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞、および陽性対照細胞である、エレクトロポレーションによって過剰量のＧＰＣ３ ＣＡＲを形質移入したＴ細胞を、それぞれエフェクター標的比６：１で標的細胞ＨｅｐＧ２とともにインキュベートした。
【0311】
次の日に上清液を収集し、各群の５００μＬ上清液をＴｒａｎｗｅｌｌの下のチャンバーに入れた。新鮮なＰＢＭＣをＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識し、同時に濃度を１ｅ７／ｍＬに調整した。１００μＬ取ってＴｒａｎｗｅｌｌの上のチャンバーに入れ、インキュベーターに１．５時間置いて下のチャンバーにおける走化作用によって下に流れた細胞の数を検出し、そして各種類の百分率を検出した。
【0312】
結果はそれぞれ図９Ａ－９Ｂに示すように、ここで、１－６はそれぞれ、対照細胞、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－Ｔ、Ｄ３－Ｔ、 Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞ならびに陽性対照細胞の結果を示す。
【0313】
図９の結果から、単一ドナー由来のエレクトロポレーションによって得られたＣＡＲＴ細胞および複数のドナーの混合由来のエレクトロポレーションによって得られたＣＡＲＴ細胞を標的細胞とともにインキュベートした後、腫瘍細胞を殺傷した後に得られた上清液（当該上清液に複数のサイトカインが含まれてもよい）はいずれも免疫細胞を動員し、そしてこれらの免疫細胞を動員する能力が近いことがわかる。
【0314】
５．２ 免疫細胞を活性化させる能力
実施例５．１と同様の工程である。
実施例５．１と同様の工程である。
【0315】
次の日に上清を収集した。２ｅ５のＣａｌｃｅｉｎ－ ＡＭで標識されたＰＢＭＣ細胞にそれぞれ１００μＬの各群の上清液を入れ、一晩培養した後、フローサイトメトリーによってＰＢＭＣにおけるＴ細胞およびＮＫ細胞のＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を検出した。
【0316】
結果を図１０Ａに示す。ここで、１－５はそれぞれ、対照細胞、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－Ｔ、Ｄ３－Ｔ、 Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞を示す。ここで、対照細胞は、エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞である。
【0317】
図１０Ａの結果から、単一ドナー由来のエレクトロポレーションによって得られたＣＡＲＴ細胞および複数のドナーの混合由来のエレクトロポレーションによって得られたＣＡＲＴ細胞を標的細胞とともにインキュベートした後、腫瘍細胞を殺傷した後に得られた上清液（当該上清液に複数のサイトカインが含まれてもよい）はいずれも同等レベルの免疫細胞を活性化させる能力を有することがわかる。
【0318】
５．３ 腫瘍細胞を殺傷する
それぞれ実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ、ならびにＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞、対照細胞を、それぞれエフェクター標的比６：１で標的細胞ＨｅｐＧ２とともにインキュベートした。一晩後、上清を収集した。ここで、対照群細胞は、エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞である。
それぞれ実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ、ならびにＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞、対照細胞を、それぞれエフェクター標的比６：１で標的細胞ＨｅｐＧ２とともにインキュベートした。一晩後、上清を収集した。ここで、対照群細胞は、エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞である。
【0319】
１．２ｅ６のＰＢＭＣ細胞を取ってそれぞれ６００μＬの各群で収集された上清液を入れた。一晩培養した後、ＰＢＭＣを収集し、そしてＰＢＭＣでＫ５６２殺傷試験を行ってＰＢＭＣが収集された上清液において活性化されたか検証した。
【0320】
結果は図１０Ｂに示すように、ここで、１－５はそれぞれ、対照細胞、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－Ｔ、Ｄ３－Ｔ、 Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔの混合細胞を示す。
【0321】
図１０Ｂの結果から、単一ドナー由来のエレクトロポレーションによって得られたＣＡＲＴ細胞および複数のドナーの混合由来のエレクトロポレーションによって得られたＣＡＲＴ細胞を標的細胞とともにインキュベートした後、腫瘍細胞を殺傷した後に得られた上清液（当該上清液に複数のサイトカインが含まれてもよい）で培養されたＰＢＭＣは類似するＫ５６２を殺傷する能力を有することが示され、これらの上清液がＰＢＭＣを活性化させる能力を有することが証明された。
【実施例6】
【0322】
「武装化」（Ａｒｍｅｄ）他家Ｔ細胞の製造および特徴付け
６．１ 製造
ＣＡＲをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）およびサイトカインをコードするものを、いずれもエレクトロポレーションによって実施例１．１で製造されたＣＤ３をノックアウトされたドナー１－Ｔ細胞、ドナー２－Ｔ細胞およびドナー３－Ｔ細胞の混合物に形質移入した。
６．１ 製造
ＣＡＲをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）およびサイトカインをコードするものを、いずれもエレクトロポレーションによって実施例１．１で製造されたＣＤ３をノックアウトされたドナー１－Ｔ細胞、ドナー２－Ｔ細胞およびドナー３－Ｔ細胞の混合物に形質移入した。
【0323】
ここで、ＣＡＲはＧＰＣ３を標的とし、ＣＡＲをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号２で示されるものである。
【0324】
サイトカインＩＬ１２ａをコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号８示される。
【0325】
サイトカインＩＬ１２ｂをコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号９で示される。
【0326】
サイトカインＩＬ１ｂをコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号５で示される。
【0327】
ＢｉＴＥをコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号３で示される。
【0328】
形質移入した後、同時にＧＰＣ３ ＣＡＲおよびＩＬ１２、ＩＬ１ｂ、ＢｉＴＥを発現し、ＣＤ３をノックアウトされた細胞を得たが、ＧＰＣ３＋ＩＬ１２＋ＩＬ１ｂ＋ＢｉＴＥ－１－Ｔ細胞、または「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞と呼ぶ。
【0329】
フローサイトメトリーによって実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞、ならびに実施例６．１で製造された「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現量を検出した。結果はそれぞれ図１１Ａと図１１Ｂに示す。ここで、図１１Ａにおいて、１－４は順に対照細胞、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞のエレクトロポレーション２時間、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞のエレクトロポレーション１日、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞のエレクトロポレーション３日後のＣＡＲの発現量を示す。図１１Ｂにおいて、１－４は順に対照細胞、実施例６．１で製造された「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞のエレクトロポレーション２時間、実施例６．１で製造された「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞のエレクトロポレーション１日および実施例６．１で製造された「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞のエレクトロポレーション３日後のＣＡＲの発現量を示す。ここで、対照群細胞は、エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞である。
【0330】
図１１の結果から、前記「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞はＧＰＣ３ ＣＡＲのみを発現する細胞に近いＣＡＲを発現する能力を有することが示された。
【0331】
６．２ 腫瘍殺傷能力
実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞、ならびに実施例６．１で製造された「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞をそれぞれ異なるエフェクター標的比でＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識された標的細胞と混合してインキュベートし、標的細胞の殺傷状況をチェックした。
実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞、ならびに実施例６．１で製造された「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞をそれぞれ異なるエフェクター標的比でＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識された標的細胞と混合してインキュベートし、標的細胞の殺傷状況をチェックした。
【0332】
一晩インキュベートした後、フローサイトメトリーによって標的細胞の殺傷の程度を検出した。結果を図１２に示す。ここで、１－６はそれぞれ対照細胞が標的細胞と１日インキュベートした場合、対照細胞が標的細胞と２日インキュベートした場合、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞が標的細胞と１日インキュベートした場合、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞が標的細胞と２日インキュベートした場合、「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞が標的細胞と１日インキュベートした場合、「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞が標的細胞と２日インキュベートした場合の標的細胞に対する殺傷の状況を示す。ここで、対照細胞は、エレクトロポレーションを経ておらず、ＧＰＣ３ ＣＡＲを含まないＴ細胞である。
【0333】
図１２の結果から、「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞は非武装化のＣＡＲＴと類似する体外で特異的に腫瘍細胞を殺傷する能力を有することが示された。
【0334】
６．３ 上清において分泌される分子の腫瘍に対する殺傷能力
実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞、ならびに実施例６．１で製造された「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞を一晩培養した後の上清液をＰＢＭＣおよびＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識された異なるエフェクター標的比のＨｅｐＧ２標的細胞インキュベート系に入れ、標的細胞の殺傷状況をチェックした。
実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞、ならびに実施例６．１で製造された「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞を一晩培養した後の上清液をＰＢＭＣおよびＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識された異なるエフェクター標的比のＨｅｐＧ２標的細胞インキュベート系に入れ、標的細胞の殺傷状況をチェックした。
【0335】
フローサイトメトリーによって標的細胞に対する殺傷効率を検出した。結果を図１３に示す。１－４はそれぞれ対照細胞が標的細胞と１日インキュベートした場合、対照細胞が標的細胞と２日インキュベートした場合、「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞が標的細胞と１日インキュベートした場合、「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞が標的細胞と２日インキュベートした場合の標的細胞に対する殺傷の状況を示す。
【0336】
図１３の結果から、「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞の細胞上清液はＰＢＭＣの標的細胞に対する殺傷を手伝うことができることが示された。中では、２日インキュベートした場合の殺傷能力は１日インキュベートした場合の殺傷能力よりも強かった。
【0337】
６．４ 免疫細胞を活性化させるの能力
実施例１．１で製造されたドナー１－Ｔ細胞、ドナー２－Ｔ細胞およびドナー３－Ｔ細胞の混合細胞、実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞、ならびに実施例６．１で製造された「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞をそれぞれエフェクター標的比６：１で標的細胞ＨｅｐＧ２と一晩インキュベートした。インキュベートした後に収集された細胞上清液１００μＬを２ｅ５のＰＢＭＣ細胞と混合して培養した。一晩培養した後、ＰＢＭＣにおけるＴ細胞およびＮＫ細胞のＣＤ６９の陽性率およびＭＦＩを検出した。
実施例１．１で製造されたドナー１－Ｔ細胞、ドナー２－Ｔ細胞およびドナー３－Ｔ細胞の混合細胞、実施例１．２で製造されたＤ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞、ならびに実施例６．１で製造された「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞をそれぞれエフェクター標的比６：１で標的細胞ＨｅｐＧ２と一晩インキュベートした。インキュベートした後に収集された細胞上清液１００μＬを２ｅ５のＰＢＭＣ細胞と混合して培養した。一晩培養した後、ＰＢＭＣにおけるＴ細胞およびＮＫ細胞のＣＤ６９の陽性率およびＭＦＩを検出した。
【0338】
結果を図１４に示す。ここで、１－３はそれぞれドナー１－Ｔ細胞、ドナー２－Ｔ細胞およびドナー３－Ｔ細胞の混合細胞、Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－ＴおよびＤ３－Ｔ細胞の混合細胞、「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞の発現するＣＡＲＴ細胞の結果を示す。図１４の結果から、「武装化」（Ａｒｍｅｄ）－Ｔ細胞はよりＴ細胞およびＮＫ細胞を活性化させる能力を有することが説明された。
【0339】
６．５ 腫瘍殺傷能力および免疫細胞を活性化させる能力
ＣＡＲおよびＢｉＴＥをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）（それに相応するＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号４で示される）を含むものを、エレクトロポレーションによってそれぞれＤｙｎａｌ Ｂｅａｄ：細胞＝１：１の比率で５－９日活性化させたＴ細胞に形質移入してＣＡＲＴおよびＢｉＴＥ Ｔにした。エレクトロポレーションを行っていないＴ細胞を対照細胞とした。対照細胞ならびにＣＡＲＴおよびＢｉＴＥ Ｔ細胞をそれぞれエフェクター標的比６：１で標的細胞ＨｅｐＧ２とインキュベートした。インキュベートした後、細胞上清液Ａを収集した。
ＣＡＲおよびＢｉＴＥをコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）（それに相応するＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号４で示される）を含むものを、エレクトロポレーションによってそれぞれＤｙｎａｌ Ｂｅａｄ：細胞＝１：１の比率で５－９日活性化させたＴ細胞に形質移入してＣＡＲＴおよびＢｉＴＥ Ｔにした。エレクトロポレーションを行っていないＴ細胞を対照細胞とした。対照細胞ならびにＣＡＲＴおよびＢｉＴＥ Ｔ細胞をそれぞれエフェクター標的比６：１で標的細胞ＨｅｐＧ２とインキュベートした。インキュベートした後、細胞上清液Ａを収集した。
【0340】
ＣＡＲＴおよびＢｉＴＥ Ｔ細胞をそれぞれ単独で一晩培養し、それぞれ相応する上清液Ｂを収集した。計１５０μＬのＰＢＭＣと標的細胞のエフェクター標的比が１５：１の混合細胞に、５０μＬの上清液Ｂを入れた。一晩インキュベートした後、上清液Ｄを収集した。
【0341】
１５０μＬの収集された上清液Ａおよび上清液ＤをそれぞれＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識された２Ｅ５のＰＢＭＣと９６ウェルプレートにおいて混合してインキュベートした。一晩後、フローサイトメトリーによってＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識されたＰＢＭＣにおけるＴおよびＮＫ細胞の代表分子ＣＤ６９を活性化させる陽性率および平均蛍光強度ＭＦＩを検出した。
【0342】
結果は図１５Ａ－１５Ｃに示す。図１４Ａ－１４ＣはそれぞれＣＤ６９陽性率、ＣＤ６９ ＭＦＩおよびＣＤ６９の総合的な変化（すなわち、陽性率とＭＦＩ値の積）を示す。ここで、１－３はそれぞれ対照細胞、ＣＡＲＴ細胞およびＢｉＴＥ－Ｔ細胞に相応する上清の結果を示す。
【0343】
図１５の結果から、ＢｉＴＥ Ｔは腫瘍細胞殺傷能力を有すると同時に、より良いＢｙ－ＳｔａｎｄでＰＢＭＣにおけるＴ／ＮＫ細胞を活性化させる能力を有することが説明された。
【実施例7】
【0344】
凍結保存および再生の能力を検出する
７．１
製造されたＧＰＣ ３ ＣＡＲプラスミド（中では、ＧＰＣ３ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は配列番号２で示される）を、ＣＲＩＳＰＲ／ｓｇＲＮＡ系を使用し、エレクトロポレーションによってＤｙｎａｌ ｂｅａｄで２－３日活性化させたヒトＴ細胞に形質移入し、抗ＧＰＣ－３ＣＡＲをノックインされたＣＡＲＴ細胞Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－Ｔ、Ｄ３－Ｔを得た。
７．１
製造されたＧＰＣ ３ ＣＡＲプラスミド（中では、ＧＰＣ３ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は配列番号２で示される）を、ＣＲＩＳＰＲ／ｓｇＲＮＡ系を使用し、エレクトロポレーションによってＤｙｎａｌ ｂｅａｄで２－３日活性化させたヒトＴ細胞に形質移入し、抗ＧＰＣ－３ＣＡＲをノックインされたＣＡＲＴ細胞Ｄ１－Ｔ、Ｄ２－Ｔ、Ｄ３－Ｔを得た。
【0345】
標的細胞ＨｅｐＧ２で当該ＣＡＲＴ細胞を活性化させた。４－７日ごとに一回刺激させ、刺激後、４－７日凍結保存した。
【0346】
凍結保存した細胞を再生させた後、細胞の生存率および増殖の状況を検出した。
【0347】
結果を図１６に示す。図１６において、１－４はそれぞれ１：標的細胞で活性化させていないＣＡＲＴ細胞、２：標的細胞で１回活性化させたＣＡＲＴ細胞、３：標的細胞で２回活性化させたＣＡＲＴ細胞、４：標的細胞で３回活性化させたＣＡＲＴ細胞を示す。
【0348】
図１６の結果から、本出願に係る他家Ｔ細胞は複数回活性化増幅、再生および／または凍結保存することができることが説明された。
【0349】
７．２
標的細胞ＨｅｐＧ２で実施例７．１で製造されたＣＡＲＴ細胞を刺激し（Ｅ：Ｔ＝２：１）、４－７日一回刺激させ、刺激後、４－７日凍結保存した。細胞の殺傷力を測定する時、エフェクター細胞を図に示されたエフェクター標的比で標的細胞と混合し、一晩インキュベートした後、殺傷効率を検出した。特別に説明しない限り、細胞はいずれも凍結保存して再生させた後の細胞である。
標的細胞ＨｅｐＧ２で実施例７．１で製造されたＣＡＲＴ細胞を刺激し（Ｅ：Ｔ＝２：１）、４－７日一回刺激させ、刺激後、４－７日凍結保存した。細胞の殺傷力を測定する時、エフェクター細胞を図に示されたエフェクター標的比で標的細胞と混合し、一晩インキュベートした後、殺傷効率を検出した。特別に説明しない限り、細胞はいずれも凍結保存して再生させた後の細胞である。
【0350】
結果を図１７に示す。図１７は腫瘍細胞に対する殺傷効率を示す。図１７において、１－８はそれぞれ１：対照細胞、２：実施例４．１で製造されたＣＡＲＴ細胞、３：標的細胞で活性化させていないＣＡＲＴ細胞、４：標的細胞で１回活性化させたＣＡＲＴ細胞、５：標的細胞で２回活性化させたＣＡＲＴ細胞、６：標的細胞で３回活性化させたＣＡＲＴ細胞、７：標的細胞で３回活性化させた（凍結保存しなかった）ＣＡＲＴ細胞、８：標的細胞で４回活性化させた（凍結保存しなかった）ＣＡＲＴ細胞を示す。ここで、前記対照細胞は、エレクトロポレーションを経ておらず、ＣＡＲを発現しないＴ細胞である。
【0351】
上記群１－８におけるエフェクター標的比２：１で標的細胞と混合して一晩インキュベートした後に収集した上清液を取った。２ｅ５のＰＢＭＣ細胞を取ってそれぞれ１５０μＬ各群の上清液を入れ、一晩培養した後、フローサイトメトリーによってＴ細胞およびＮＫ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を検出した。
【0352】
図１８および図１９はそれぞれＴ細胞およびＮＫ細胞に対する活性化効果を示す。ここで、細胞の活性化は標的細胞ＨｅｐＧ２でＣＡＲＴ細胞を刺激する（Ｅ：Ｔ＝２：１）ことで実現した。４－７日ごとに一回刺激させ、刺激後、４－７日凍結保存した。図において、１－９はそれぞれ以下の細胞がＨｅｐＧ２標的細胞とインキュベートした後の上清液に相応する結果を示す：１：対照細胞、２：実施例４．１で製造されたＣＡＲＴ細胞、３：陽性対照（内部コントロールの陽性対照サンプルで、すなわち、分けて凍結保存したが標的細胞とともにインキュベートした後の上清液で、そしてＰＢＭＣにおけるＴ／ＮＫ細胞を活性化できることが検証された）、４：標的細胞で活性化させていない実施例７．１で製造されたＣＡＲＴ細胞、５：標的細胞で１回活性化させた実施例７．１で製造されたＣＡＲＴ細胞、６：標的細胞で２回活性化させた実施例７．１で製造されたＣＡＲＴ細胞、７：標的細胞で３回活性化させた実施例７．１で製造されたＣＡＲＴ細胞、８：標的細胞で３回活性化させた（凍結保存しなかった）実施例７．１で製造されたＣＡＲＴ細胞、９：標的細胞で４回活性化させた（凍結保存しなかった）実施例７．１で製造されたＣＡＲＴ細胞。ここで、前記対照細胞は、エレクトロポレーションを経ておらず、ＣＡＲを発現しないＴ細胞である。
【0353】
図１７－１９の結果から、本出願に係るＣＡＲをノックインされた他家ＣＡＲＴ細胞は、１）強い腫瘍殺傷能力およびＢｙ－ＳｔａｎｄでＰＢＭＣにおけるＴ／ＮＫ細胞を活性化させる能力、２）Ｔ／ＮＫ細胞を活性化させる能力が標的細胞３回から低下することが説明された。
【実施例8】
【0354】
体内腫瘍に対する殺傷能力を検出する
８．１ ＣＡＲ－Ｂｉｔｅ Ｔ細胞を製造する
製造されたＧＰＣ ３ ＣＡＲ－ＢＩＴＥプラスミド（中では、ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＢＩＴＥをコードするヌクレオチド配列は配列番号４で示される）を、ＣＲＩＳＰＲ／ｓｇＲＮＡ系を使用し、エレクトロポレーションによってＤｙｎａｌ ｂｅａｄで２－３日活性化させたヒトＴ細胞に形質移入し、抗ＧＰＣ－３ＣＡＲ－ＢＩＴＥをノックインされたＣＡＲ－ＢＩＴＥ細胞を得た。
８．１ ＣＡＲ－Ｂｉｔｅ Ｔ細胞を製造する
製造されたＧＰＣ ３ ＣＡＲ－ＢＩＴＥプラスミド（中では、ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＢＩＴＥをコードするヌクレオチド配列は配列番号４で示される）を、ＣＲＩＳＰＲ／ｓｇＲＮＡ系を使用し、エレクトロポレーションによってＤｙｎａｌ ｂｅａｄで２－３日活性化させたヒトＴ細胞に形質移入し、抗ＧＰＣ－３ＣＡＲ－ＢＩＴＥをノックインされたＣＡＲ－ＢＩＴＥ細胞を得た。
【0355】
８．２ 動物モデルを構築して体内腫瘍に対する殺傷能力を検出する
ＮＣＧマウスの皮下にＨｅｐＧ２細胞を担持させた。腫瘍が１００ｍｍ３に生長すると、各群に４匹のマウス、ランダムに群分けした。３ｅ６の再生した８．１で製造された細胞を腫瘍内注射した。
ＮＣＧマウスの皮下にＨｅｐＧ２細胞を担持させた。腫瘍が１００ｍｍ３に生長すると、各群に４匹のマウス、ランダムに群分けした。３ｅ６の再生した８．１で製造された細胞を腫瘍内注射した。
【0356】
体内腫瘍に対する殺傷能力を検出し、結果は図２０に示す。図２０において、１－５はそれぞれＭｏｃｋ－ＣＡＲＴ（抗ＣＤ１９のＣＡＲ Ｔ細胞）で処理された４匹のマウスの腫瘍増殖の平均値、ＣＡＲ－ＢｉＴＥ Ｔで処理された一匹目のマウス、ＣＡＲ－ＢｉＴＥ Ｔで処理された二匹目のマウス、ＣＡＲ－ＢｉＴＥ Ｔで処理された三匹目のマウス、およびＣＡＲ－ＢｉＴＥ Ｔで処理された四匹目のマウスの腫瘍体積（ｍｍ３）の増加値を示す。
【0357】
図２０の結果から、本出願に係る他家Ｔ細胞が腫瘍内注射によって有効に体内腫瘍を殺傷して腫瘍体積を減少させることができることが説明された。
【実施例9】
【0358】
腫瘍を殺傷した後に免疫反応を活性化させる能力を検出する
９．１ 標的細胞を殺傷した後の上清液におけるＸＣＬ－１の発現量の検出
実施例１．３で製造された３つのドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ標的細胞Ｈｕｈ－７とともに一晩インキュベートした後、それぞれの上清液を収集してＸＣＬ－１を測定した。図２１に示すように、ＣＡＲＴが標的細胞を殺傷した後の上清液において、ＸＣＬ－１の発現が明らかに培養液におけるＸＣＬ－１の量よりも高かった。
９．１ 標的細胞を殺傷した後の上清液におけるＸＣＬ－１の発現量の検出
実施例１．３で製造された３つのドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ標的細胞Ｈｕｈ－７とともに一晩インキュベートした後、それぞれの上清液を収集してＸＣＬ－１を測定した。図２１に示すように、ＣＡＲＴが標的細胞を殺傷した後の上清液において、ＸＣＬ－１の発現が明らかに培養液におけるＸＣＬ－１の量よりも高かった。
【0359】
９．２ 標的細胞を殺傷した後の上清液のｃＤＣ１細胞を動員する効果の検出
実施例１．３で製造された３つのドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ標的細胞Ｈｕｈ－７とともに一晩インキュベートした後、それぞれの上清液を収集した。各群の５００μＬ上清液をＴｒａｎｗｅｌｌの下のチャンバーに入れた。ＣＤ３およびＣＤ１４を除去した新鮮なＰＢＭＣをＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識し、同時に濃度を１ｅ７／ｍＬに調整した。１００μＬ取ってＴｒａｎｗｅｌｌの上のチャンバーに入れ、インキュベーターに１．５時間置いて下のチャンバーにおける走化作用によって下に流れたｃＤＣ１（ＸＣＲ １とＣＤ１４１二重陽性）細胞の数を検出した。図２２に示すように、標的細胞を殺傷した後の上清液は明らかにｃＤＣ１細胞をより多く動員した。
実施例１．３で製造された３つのドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ標的細胞Ｈｕｈ－７とともに一晩インキュベートした後、それぞれの上清液を収集した。各群の５００μＬ上清液をＴｒａｎｗｅｌｌの下のチャンバーに入れた。ＣＤ３およびＣＤ１４を除去した新鮮なＰＢＭＣをＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識し、同時に濃度を１ｅ７／ｍＬに調整した。１００μＬ取ってＴｒａｎｗｅｌｌの上のチャンバーに入れ、インキュベーターに１．５時間置いて下のチャンバーにおける走化作用によって下に流れたｃＤＣ１（ＸＣＲ １とＣＤ１４１二重陽性）細胞の数を検出した。図２２に示すように、標的細胞を殺傷した後の上清液は明らかにｃＤＣ１細胞をより多く動員した。
【0360】
９．３ 標的細胞を殺傷した後の上清液のＴ／ＮＫ細胞を動員する効果の検出
実施例１．３で製造された３つのドナーのＣＡＲＴをそれぞれ標的細胞Ｈｕｈ－７とともに一晩インキュベートした後、それぞれの上清液を収集した。各群の５００μＬ上清液をＴｒａｎｗｅｌｌの下のチャンバーに入れた。新鮮なＰＢＭＣをＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識し、同時に濃度を１ｅ７／ｍＬに調整した。１００μＬ取ってＴｒａｎｗｅｌｌの上のチャンバーに入れ、インキュベーターに１．５時間置いて下のチャンバーにおける走化作用によって下に流れたＴ／ＮＫ 細胞の数を検出した。図２３に示すように、各ドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞を殺傷した後の上清液は明らかにＴ／ＮＫ細胞をより多く動員した。
実施例１．３で製造された３つのドナーのＣＡＲＴをそれぞれ標的細胞Ｈｕｈ－７とともに一晩インキュベートした後、それぞれの上清液を収集した。各群の５００μＬ上清液をＴｒａｎｗｅｌｌの下のチャンバーに入れた。新鮮なＰＢＭＣをＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで標識し、同時に濃度を１ｅ７／ｍＬに調整した。１００μＬ取ってＴｒａｎｗｅｌｌの上のチャンバーに入れ、インキュベーターに１．５時間置いて下のチャンバーにおける走化作用によって下に流れたＴ／ＮＫ 細胞の数を検出した。図２３に示すように、各ドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞を殺傷した後の上清液は明らかにＴ／ＮＫ細胞をより多く動員した。
【0361】
９．４ 標的細胞を殺傷した後の上清液のＴ／ＮＫ細胞に対する活性化機能の検出
実施例１．３で製造された３つのドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ標的細胞Ｈｕｈ－７および無関連標的細胞ＳＫ－Ｈｅｐ１とともに一晩インキュベートした後、それぞれの上清液を収集した。２ｅ５のＣａｌｃｅｉｎ－ ＡＭで標識されたＰＢＭＣ細胞にそれぞれ１００μＬの各群の上清液を入れ、一晩培養した後、フローサイトメトリーによってＰＢＭＣにおけるＴ細胞およびＮＫ細胞のＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を検出した。
実施例１．３で製造された３つのドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ標的細胞Ｈｕｈ－７および無関連標的細胞ＳＫ－Ｈｅｐ１とともに一晩インキュベートした後、それぞれの上清液を収集した。２ｅ５のＣａｌｃｅｉｎ－ ＡＭで標識されたＰＢＭＣ細胞にそれぞれ１００μＬの各群の上清液を入れ、一晩培養した後、フローサイトメトリーによってＰＢＭＣにおけるＴ細胞およびＮＫ細胞のＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を検出した。
【0362】
結果は図２４Ａと２４Ｂに示すように、標的細胞Ｈｕｈ－７とインキュベートした上清液はＣＤ３ Ｔ細胞およびＣＤ５６ ＮＫ細胞のＣＤ６９ＭＦＩを向上させた。
【0363】
９．５ 標的細胞を殺傷した後の上清液のＰＢＭＣにおける免疫細胞に対する活性化効果の検出
実施例１．３で製造された３つのドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ標的細胞Ｈｕｈ－７および無関連標的細胞ＳＫ－Ｈｅｐ１とともに一晩インキュベートした後、それぞれの上清液を収集した。上清液をＰＢＭＣと一晩インキュベートした後、収集されたＰＢＭＣをＫ５６２とインキュベートすることで、ＰＢＭＣが収集された上清液において活性化されたか検証した。図２５に示すように、ＣＡＲＴがＨｕｈ－７とインキュベートした上清のＫ５６２に対する殺傷は、明らかにＣＡＲ－Ｔ細胞が無関連標的細胞ＳＫ－Ｈｅｐ１とインキュベートした後の上清よりも高かった。標的細胞を殺傷した後の上清液はＰＢＭＣにおける免疫細胞を活性化できることが説明された。
実施例１．３で製造された３つのドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ標的細胞Ｈｕｈ－７および無関連標的細胞ＳＫ－Ｈｅｐ１とともに一晩インキュベートした後、それぞれの上清液を収集した。上清液をＰＢＭＣと一晩インキュベートした後、収集されたＰＢＭＣをＫ５６２とインキュベートすることで、ＰＢＭＣが収集された上清液において活性化されたか検証した。図２５に示すように、ＣＡＲＴがＨｕｈ－７とインキュベートした上清のＫ５６２に対する殺傷は、明らかにＣＡＲ－Ｔ細胞が無関連標的細胞ＳＫ－Ｈｅｐ１とインキュベートした後の上清よりも高かった。標的細胞を殺傷した後の上清液はＰＢＭＣにおける免疫細胞を活性化できることが説明された。
【実施例10】
【0364】
体内腫瘍に対する殺傷能力を検出する
１０．１
実施例１．２で製造されたＧＰＣ ３ ｍＲＮＡ－ＣＡＲおよび同時にＩＬ－１２とＩＬ－１ｂを発現するＧＰＣ ３ ｍＲＮＡ－ＡｒｍｅｄＣＡＲ （ここで、ＧＰＣ３ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は配列番号２で示される）を、エレクトロポレーションによってＤｙｎａｌ ｂｅａｄで活性化させたヒトＴ細胞に形質移入し、抗ＧＰＣ－３ ｍＲＮＡ－ＣＡＲＴおよびＧＰＣ ３ ｍＲＮＡ－Ａｒｍｅｄ－ＣＡＲＴ細胞を得た。
１０．１
実施例１．２で製造されたＧＰＣ ３ ｍＲＮＡ－ＣＡＲおよび同時にＩＬ－１２とＩＬ－１ｂを発現するＧＰＣ ３ ｍＲＮＡ－ＡｒｍｅｄＣＡＲ （ここで、ＧＰＣ３ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は配列番号２で示される）を、エレクトロポレーションによってＤｙｎａｌ ｂｅａｄで活性化させたヒトＴ細胞に形質移入し、抗ＧＰＣ－３ ｍＲＮＡ－ＣＡＲＴおよびＧＰＣ ３ ｍＲＮＡ－Ａｒｍｅｄ－ＣＡＲＴ細胞を得た。
【0365】
ＮＣＧマウスの皮下にＨｅｐＧ２細胞を担持させ、腫瘍が１００ ｍｍ３に生長すると、各群に４匹のマウス、ランダムに群分けした。週に２回腫瘍内注射し、計４回３ｅ６の再生した後のＧＰＣ－３ ｍＲＮＡ－ＣＡＲＴおよびＧＰＣ ３ ｍＲＮＡ－Ａｒｍｅｄ－ＣＡＲＴ細胞を注射した。
【0366】
サイトカインＩＬ１２ａをコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号８示される。
【0367】
サイトカインＩＬ１２ｂをコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号９で示される。
【0368】
サイトカインＩＬ１ｂをコードする核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号５で示される。
【0369】
結果は図２６に示すように、図に示されたのは４匹のマウスの腫瘍体積の平均値である。結果から、無関連ＣＡＲＴ対照（抗ＣＤ１９のＣＡＲ Ｔ細胞）、ＧＰＣ－３－ｍＲＮＡ－ＣＡＲＴおよびＧＰＣ ３ ｍＲＮＡ－Ａｒｍｅｄ－ＣＡＲＴを注射した後、ＧＰＣ ３ ｍＲＮＡ－Ａｒｍｅｄ－ＣＡＲＴ群では、明らかに腫瘍生長を抑制する薬効があったことが示された。
【0370】
１０．２
実施例１．３で製造されたＧＰＣ ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１プラスミドを、ＣＲＩＳＰＲ／ｓｇＲＮＡ系を使用し、エレクトロポレーションによってＤｙｎａｌ ｂｅａｄで２－３日活性化させたヒトＴ細胞に導入し、抗ＧＰＣ－３をノックインされたＣＡＲＴ細胞を得た。抗ＧＰＣ－３ ＣＡＲＴ細胞は標的細胞Ｈｕｈ－７でエフェクター標的比Ｅ：Ｔ＝２：１で活性化増幅して維持した新鮮な細胞である。ここで、ＣＡＲはＧＰＣ３を標的とし、ＧＰＣ ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号１１で示されるものである。
実施例１．３で製造されたＧＰＣ ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１プラスミドを、ＣＲＩＳＰＲ／ｓｇＲＮＡ系を使用し、エレクトロポレーションによってＤｙｎａｌ ｂｅａｄで２－３日活性化させたヒトＴ細胞に導入し、抗ＧＰＣ－３をノックインされたＣＡＲＴ細胞を得た。抗ＧＰＣ－３ ＣＡＲＴ細胞は標的細胞Ｈｕｈ－７でエフェクター標的比Ｅ：Ｔ＝２：１で活性化増幅して維持した新鮮な細胞である。ここで、ＣＡＲはＧＰＣ３を標的とし、ＧＰＣ ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５－２Ａ－ＩＬ２１をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号１１で示されるものである。
【0371】
ヌードマウスの皮下にＨｅｐＧ２細胞を担持させ、腫瘍が１００ｍｍ３に生長すると、ランダムに群分けし、ＣＡＲＴ群、溶媒対照群、延長注射ＣＡＲＴ群に分けた。ＣＡＲＴ群では、７日で一回腫瘍内注射し、ＣＡＲＴ細胞を計５回注射した。延長注射ＣＡＲＴ群では、腫瘍が７００ｍｍ３の体積に生長してから注射を開始し、週に一回、計２回注射した。
【0372】
結果は図２７に示すように、結果の統計は４匹の実験マウスの腫瘍生長の平均値である。結果から、本出願に係る残留した免疫機能のあるヌードマウスに対する他家ＣＡＲＴ細胞は、マウスにおける生存時間がＮＣＧマウスよりも大幅に低下したが、まだ複数回の腫瘍内注射によって有効に体内腫瘍を殺傷して腫瘍体積を減少させることができたことが示され、同時に腫瘍を殺傷した後に放出される新生の抗原を提供することが期待される。
【0373】
前記詳細な説明は解釈および例示の形として提供されたもので、添付された請求の範囲を制限するものではない。現在本出願で挙げられた実施形態の様々な変化は当業者にとって容易に想到できるもので、かつ添付された請求項およびその同等の手段の範囲内に留まる。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者に施用するためのＴ細胞製品であって、少なくとも１種の他家Ｔ細胞を含み、前記他家Ｔ細胞は少なくとも１種の被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現し、前記被験者の少なくとも１種のＴＣＲが前記ＭＨＣ分子を認識すると同種異系反応（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｏｎ）を起こすＴ細胞製品。
【請求項2】
前記他家Ｔ細胞は免疫拒絶反応を低減または消失させる操作をされていない、請求項１に記載のＴ細胞製品。
【請求項3】
前記他家Ｔ細胞における被験者の同種異系反応を起こしうる分子は修飾されていない、請求項１に記載のＴ細胞製品。
【請求項4】
前記被験者の同種異系反応を起こしうる分子は前記他家Ｔ細胞のＭＨＣ分子を含む、請求項３に記載のＴ細胞製品。
【請求項5】
前記被験者は腫瘍患者を含み、前記腫瘍は固形腫瘍を含む、請求項１に記載のＴ細胞製品。
【請求項6】
前記他家Ｔ細胞は前記被験者と異なる２つ以上のドナー由来のものである、請求項１に記載のＴ細胞製品。
【請求項7】
前記他家Ｔ細胞は１種以上の前記被験者の少なくとも１種のＴ細胞に外来のものと認識されるＭＨＣ分子を発現する、請求項１～６のいずれかに記載のＴ細胞製品。
【請求項8】
前記被験者の少なくとも１種の前記ＴＣＲは前記ＭＨＣ分子を認識して前記被験者のＴＨ－１免疫反応を促進させる、請求項１に記載のＴ細胞製品。
【請求項9】
工学的改造されていない前記他家Ｔ細胞と比較すると、前記工学的改造された前記他家Ｔ細胞では、前記他家Ｔ細胞の前記被験者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすリスクが低下し、前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞におけるＣＤ３に関連する遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子および／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現および／または活性を下方調節する工程を含む、請求項１に記載のＴ細胞製品。
【請求項10】
前記工学的改造は、前記他家Ｔ細胞に、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ＲＮＡ編集系、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓ 、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系およびメガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれる１種または複数種の物質を施用することを含む、請求項９に記載のＴ細胞製品。
【請求項11】
少なくとも１種の前記他家Ｔ細胞は修飾された後、抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを発現する、請求項１に記載のＴ細胞製品。
【請求項12】
前記修飾は、前記他家Ｔ細胞に前記核酸を形質移入することを含み、前記形質移入はウイルス形質移入および／または非ウイルス形質移入を含む、請求項１１に記載のＴ細胞製品。
【請求項13】
前記非ウイルス形質移入はプラスミドを使用し、前記プラスミドは環状プラスミド、スーパーコイルプラスミド、ナノプラスミド（Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ）またはミニサークルＤＮＡ（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ）であり、前記プラスミドは抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインをコードする核酸を含む、請求項１２に記載のＴ細胞製品。
【請求項14】
前記形質移入は一過性形質移入を含み、前記一過性形質移入はエレクトロポレーションを含む、請求項１２に記載のＴ細胞製品。
【請求項15】
前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）または１％（ｗ／ｗ）以下を占め、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片の含有量が形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ、２％（ｗ／ｗ）または１％（ｗ／ｗ））以下を占め、前記大きさが少なくも約４８ｋｂの核酸分子またはその断片は大腸菌を含む微生物由来のものである、請求項１３に記載のＴ細胞製品。
【請求項16】
前記プラスミドはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理され、前記ＤＮａｓｅは非特異的に線形ＤＮＡを切断することができ、前記ＤＮａｓｅ処理を経た後、前記プラスミドを含む形質移入混合物のうち、微生物のゲノム由来の核酸分子またはその断片の含有量が前記形質移入混合物の核酸分子の合計含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める、請求項１３に記載のＴ細胞製品。
【請求項17】
前記ＣＡＲは抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合ドメインは特異的に一つまたは複数の腫瘍関連抗原に結合する、請求項１３に記載のＴ細胞製品。
【請求項18】
前記抗原結合ドメインは特異的にＧＰＣ３に結合し、または、前記抗原結合ドメインは特異的にＧＰＣ３およびＣＤ１４７に結合し、前記抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、ナノ抗体およびその抗原結合断片からなる群から選ばれる、請求項１７に記載のＴ細胞製品。
【請求項19】
前記サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦα、ＣＸＣＬ１、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＩｇＧ、ＩＰ－１０、Ｌ－１７Ａ、 ＭＣＰ－ｌおよびＰＧＥ２からなる群から選ばれ、および／または、前記ケモカインは、ＣＣＬ１－ＣＣＬ２８およびＣＸＣＬ１－ＣＸＣＬ１７からなる群から選ばれる、請求項１３に記載のＴ細胞製品。
【請求項20】
さらに、前記被験者の自家由来のＴ細胞を含む、請求項１に記載のＴ細胞製品。
【請求項21】
前記Ｔ細胞製品は、さらに、１種または複数種のほかの修飾されたＴ細胞を含み、前記ほかの修飾されたＴ細胞は相応する修飾されていないＴ細胞と比較すると、生体の同種異系反応を起こす能力が低下した、請求項１に記載のＴ細胞製品。
【請求項22】
請求項１に記載のＴ細胞製品と、薬学的に許容される補助剤とを含み、前記補助剤は腫瘍内注射に適する、薬物組成物。
【請求項23】
薬物の製造における請求項１に記載のＴ細胞製品、および、請求項２２に記載の薬物組成物の使用であって、前記薬物は腫瘍の予防、緩和、治療に用いられる使用。
【手続補正2】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図1A】
【手続補正3】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図1B】
【国際調査報告】