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特表2024-531508ＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤を有効成分として含有する癌免疫療法組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】ＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤を有効成分として含有する癌免疫療法組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240822BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240822BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240822BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240822BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240822BHJP
A61K 31/497 20060101ALI20240822BHJP
A61K 31/4965 20060101ALI20240822BHJP
A61K 31/708 20060101ALI20240822BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240822BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240822BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240822BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240822BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240822BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240822BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240822BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/12
C12Q1/02
A61K47/64
A61K31/497
A61K31/4965
A61K31/708
A61K39/395 U
A61P35/00
A61P35/02
A61P37/04
A61P43/00 111
A61P43/00 121
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513371
(86)(22)【出願日】2022-08-30
(85)【翻訳文提出日】2024-04-26
(86)【国際出願番号】 KR2022012938
(87)【国際公開番号】W WO2023033506
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】10-2021-0115253
(32)【優先日】2021-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524003415
【氏名又は名称】スパーク・バイオファーマ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＰＡＲＫ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ， ＩＮＣ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】パク，スンボム
(72)【発明者】
【氏名】チョ，ワンサン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045AA40
2G045CB01
2G045DA36
2G045FB13
4B063QA20
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QS03
4B063QS05
4B063QX02
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA60
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB26
4C084ZB27
4C084ZC41
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC48
4C086EA18
4C086GA02
4C086GA07
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB08
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC41
(57)【要約】
本発明は、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）及び三者モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）の相互作用阻害剤を有効成分として含有する癌免疫療法組成物に関する。具体的には、本発明によるＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤は、ＴＲＩＭ２９によるＳＴＩＮＧの分解を阻害し、ＳＴＩＮＧの細胞内量を増加させることにより、ＳＴＩＮＧアゴニストであるｃＧＡＭＰを介した免疫反応をさらに活性化させる。さらに、前記ＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤は、ＳＴＩＮＧアゴニストであるｃＧＡＭＰ及び免疫チェックポイント阻害剤と併用投与すると、有意な免疫抗癌効能を示すことから、癌免疫療法剤、及び癌免疫療法補助剤として有効に用いることができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）及び三者モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）の相互作用阻害剤を有効成分として含有する癌免疫療法医薬組成物。
【請求項2】
前記相互作用阻害剤が、ＳＴＩＮＧに結合していることを特徴とする請求項１に記載の癌免疫療法医薬組成物。
【請求項3】
前記相互作用阻害剤が、ＴＲＩＭ２９を介したＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化（Ｋ４８結合特異的ポリユビキチン化）を介してＳＴＩＮＧの分解を阻害することを特徴とする請求項１に記載の癌免疫療法医薬組成物。
【請求項4】
前記相互作用阻害剤が、ＳＴＩＮＧを上方調節(upregulation)させることを特徴とする請求項１に記載の癌免疫療法医薬組成物。
【請求項5】
前記相互作用阻害剤が、ＳＴＩＮＧアゴニスト（agonist）の活性を増強させることを特徴とする請求項１に記載の癌免疫療法医薬組成物。
【請求項6】
前記相互作用阻害剤が、細胞殺害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）及びサイトカインからなる群から選択される１つ以上の免疫因子を活性化させることを特徴とする請求項１に記載の癌免疫療法医薬組成物。
【請求項7】
前記癌免疫療法剤が、偽粘液腫、肝内胆管癌、肝芽腫、肝癌、甲状腺癌、結腸癌、精巣癌、骨髄異形成症候群、膠芽細胞腫、口腔癌、口唇癌、菌状息肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、基底細胞癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、男性乳癌、脳腫瘍、下垂体腺腫、多発性骨髄腫、胆嚢癌、胆道癌、大腸癌、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、網膜芽細胞腫、脈絡膜メラノーマ、ファーター膨大部癌、膀胱癌、腹膜癌、副甲状腺癌、副腎癌、副鼻腔癌、非小細胞肺癌、舌癌、星状細胞腫、小細胞肺癌、小児脳腫瘍、小児リンパ腫、小児白血病、小腸癌、髄膜腫、食道癌、神経膠腫、腎盂癌、腎臓癌、心臓癌、十二指腸癌、悪性軟部組織癌、悪性骨肉腫、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、悪性黒色腫、眼癌、外陰癌、尿管癌、尿道癌、原発部位不明の癌、胃リンパ腫、胃癌、胃カルチノイド、消化管間質腫瘍、ウィルムス腫瘍、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、肉腫、陰茎癌、咽頭癌、妊娠性絨毛性疾患、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、転移性骨癌、転移性脳腫瘍、縦隔腫瘍、直膓癌、直腸カルチノイド、膣癌、脊髄癌、聴神経鞘腫、膵臓癌、唾液腺癌、カポジ肉腫、パジェット病、へんとう腺癌、扁平上皮細胞癌、肺腺癌、肺癌、肺扁平上皮細胞癌、皮膚癌、肛門癌、横紋筋肉腫、喉頭癌、胸膜癌、血液癌及び胸腺癌からなる群から選択される１つ以上の癌を予防又は治療することを特徴とする請求項１に記載の癌免疫療法医薬組成物。
【請求項8】
下記式（７）【化1】
［式中、Ｒ1は、シクロアルキル、アリール又はアリール－アルキル（ここで、アリールは、アルコキシで任意に置換されていてもよい）であり；
Ｒ2は、アルキル又はアリール－アルキル（ここで、アリールは、ハロゲンで任意に置換されていてもよい）であり；及び
Ｒ3は、アミノ、アルキルアミノ、ジ－アルキルアミノ又はヘテロシクロアルキル－アルキレン－アミノである。］で示される化合物、その異性体、その溶媒和物、その水和物、又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する癌免疫療法医薬組成物。
【請求項9】
前記式（７）が、下記式（１）～下記式（６）で示される化合物のいずれか１つであることを特徴とする請求項８に記載の癌免疫療法医薬組成物：【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【請求項10】
前記化合物が、ＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９の相互作用を阻害することを特徴とする請求項８に記載の癌免疫療法医薬組成物。
【請求項11】
前記化合物が、ＴＲＩＭ２９を介したＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化を介してＴＩＮＧの分解を阻害し、ＳＴＩＮＧの上方調節又はＳＴＩＮＧタンパク質の量を増加させることを特徴とする請求項８に記載の癌免疫療法医薬組成物。
【請求項12】
前記化合物が、細胞殺害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞及びサイトカインからなる群から選択される１つ以上の免疫因子を活性化させることを特徴とする請求項８に記載の癌免疫療法医薬組成物。
【請求項13】
請求項１に記載の相互作用阻害剤、請求項８に記載の式（７）で示される化合物、その異性体、その溶媒和物、その水和物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する癌免疫療法補助剤。
【請求項14】
前記癌免疫療法補助剤が、癌免疫療法剤の効能を増強させることを特徴とする請求項１３に記載の癌免疫療法補助剤。
【請求項15】
前記癌免疫療法補助剤が、癌免疫療法剤と同時又は逐次投与されることを特徴とする請求項１３に記載の癌免疫療法補助剤。
【請求項16】
前記癌免疫療法剤が、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ（環状グアニレート）、ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰ、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＢＴＬＡ、抗ＴＩＭ３、抗ＨＶＥＭ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０、抗ＣＤ２８、抗ＰＤＬ２、抗ＧＩＴＲ、抗ＩＣＯＳ、抗ＳＩＲＰα、抗ＩＬＴ２、抗ＩＬＴ３、抗ＩＬＴ４、抗ＩＬＴ５、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１９及び抗ＴＩＧＩＴからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１５に記載の癌免疫療法補助剤。
【請求項17】
癌免疫療法剤及び請求項１３に記載の癌免疫療法補助剤を含む抗癌用併用製剤。
【請求項18】
癌免疫療法剤をスクリーニングする方法であって、（１）発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質及び発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターを製造する工程；
（２）前記工程（１）のベクターを細胞に形質転換する工程；
（３）前記工程（２）の形質転換細胞に被検物質を処理する工程；
（４）工程（３）の被検物質で処理した細胞を未処理対照群と比較し、処理細胞からの発光信号を減少させる物質を選択する工程；
を含む癌免疫療法剤のスクリーニング方法。
【請求項19】
工程（１）の発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質が、ＳＴＩＮＧのＣ末端にＬｇＢｉＴが結合させることにより得られることを特徴とする請求項１８に記載の癌免疫療法剤のスクリーニング方法。
【請求項20】
工程（１）の発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質が、ＴＲＩＭ２９のＣ末端にＳｍＢｉＴ又はＮ末端にＳｍＢｉＴが結合させることにより得られることを特徴とする請求項１８に記載の癌免疫療法剤のスクリーニング方法。
【請求項21】
前記癌免疫療法剤が、ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の相互作用を調節することにより、ＳＴＩＮＧを上方調節させることを特徴とする請求項１８に記載の癌免疫療法剤のスクリーニング方法。
【請求項22】
発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質及び発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質を含む癌免疫療法剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）及び三者モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）の相互作用阻害剤を有効成分として含有する癌免疫療法剤及び癌免疫療法補助剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
癌は一般に、ヒトの組職を形成する細胞周期の異常により、細胞が正常に分化せず分裂を続ける疾患であり、開始（initiation）、促進（promotion）及び進行（progression）の３段階を経て発生する。癌の原因は、環境や食品に含まれた発癌物質により正常細胞の遺伝子や癌抑制遺伝子に変異が生じ、これらの細胞が発癌物質によって刺激され続けることで異常に増殖し、癌組織を形成することにあることが知られている。
【0003】
癌の治療の多くは、化学療法とともに外科手術、放射線療法、免疫抗癌剤療法などがあり、癌を治療するための抗癌剤を研究する方法としては、癌細胞に対して直接細胞毒性を示す物質を探索する方法、生体の免疫能力を調節する物質を探索する方法、癌細胞の転移を抑制する物質を探索する方法及び血管新生を抑制する物質を探索する方法などがある。しかし、現在臨床で使用されている抗癌剤の多くは化学的に合成された物質であり、正常細胞への毒性を引き起こすなどの問題があり、最近は、これらの問題を解決するために免疫反応を利用した治療が注目されている。
【0004】
一方、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）は、ＤＮＡを感知する抗ウイルス免疫において中枢的な役割を果たしている。具体的には、異常な細胞質ＤＮＡが感知されると、先天性免疫因子として働くｃＧＡＭＰ（環状ＧＭＰ－ＡＭＰ）がｃＧＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）によって産生され、ｃＧＡＭＰは免疫受容体であるＳＴＩＮＧを活性化させる。さらに、活性かされたＳＴＩＮＧは、Ｉ型インターフェロンと炎症性サイトカインの産生を誘導し、損傷した宿主細胞を除去するために適応免疫細胞を動員する。従って、ＳＴＩＮＧは先天免疫と適応免疫の間の中心的なインターフェースとして働く。実際、最近の研究によれば、ＳＴＩＮＧアゴニスト（agonist）の腫瘍内投与が腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における局所免疫を活性化し、癌を除去するエフェクター細胞を動員することが示されている。
【0005】
また、三者モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）Ｅ３リガーゼは、ＳＴＩＮＧの直接調節因子であり、ＴＲＩＭ２９媒介ＳＴＩＮＧユビキチン化は、Ｋ４８結合特異的に宿主免疫細胞と癌細胞の両方でＳＴＩＮＧを分解する。通常の条件下では、ＴＲＩＭ２９はＳＴＩＮＧの非免疫原性分解を促進し、対照的に、ＴＲＩＭ２９の過発現は免疫反応を妨害し、ＳＴＩＮＧアゴニストによる治療時にサイトカイン産生を減少させる。しかし、多くの研究は、ＴＲＩＭ２９の直接阻害が癌転移を誘発すると報告されている。ＴＲＩＭ２９は、転移性黒色腫において高度に下方調節されている遺伝子であり、ＴＲＩＭ２９の損失はケラチンの分布を崩壊することにより、扁平上皮癌の転移プロファイルを増加させる。しかし、ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の間のタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）の特定摂動（perturbation）が潜在的な転移リスクを伴うことなく細胞ＳＴＩＮＧレベルを増加させることにより、ＳＴＩＮＧアゴニストの効力の弱体化を克服できることはまだ示されていない。
【0006】
そこで、本発明者らは、ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の相互作用を阻害し、ＴＲＩＭ２９によるＳＴＩＮＧの分解を阻止する癌免疫療法剤を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の相互作用を阻害する化合物をスクリーニングできる高効率生理活性検索法を構築し、前記構築したシステムによりオキソピペラジン誘導体を見出した。また、本発明者らは、前記オキソピペラジン誘導体が、ＳＴＩＮＧの細胞内量を増加させることにより、ＳＴＩＮＧアゴニストであるｃＧＡＭＰが媒介する免疫反応をさらに活性化し、ｃＧＡＭＰ療法及び免疫チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ－１療法の免疫癌効果を増強させることができることが確認された。従って、本発明によるＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤が、癌免疫療法剤及び癌免疫療法補助剤の有効成分として有用に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Q. Chen, L. Sun, Z. J. Chen, Regulation and function of the cGAS-STING pathway of cytosolic DNA sensing. Nat. Immunol. 17, 1142-1149 (2016).
【非特許文献2】L. Sun, J. Wu, F. Du, X. Chen, Z. J. Chen, Cyclic GMP-AMP Synthase Is a Cytosolic DNA Sensor That Activates the Type I Interferon Pathway. Science. 339, 786-791 (2013).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）及び三者モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）の相互作用阻害剤、並びに癌免疫療法への使用を提供することである。
【0009】
本発明の別の目的は、前記インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）及び三者モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）の相互作用阻害剤を見出すためのスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を達成するために、本発明は、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）及び三者モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）の相互作用阻害剤を有効成分として含有する癌免疫療法医薬組成物を提供する。
【0011】
本発明は、オキソピペラジン誘導体、その異性体、その溶媒和物、その水和物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する癌免疫療法医薬組成物を提供する。
また、本発明は、前記ＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤、その異性体、その溶媒和物、その水和物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する癌免疫療法補助剤を提供する。
また、本発明は、前記ＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤、その異性体、その溶媒和物、その水和物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する癌免疫療法補助剤を提供する。
【0012】
さらに、本発明は、癌免疫療法剤及び前記癌免疫療法補助剤を含む抗癌用併用製剤を提供する。
また、本発明は、
（１）発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質及び発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターを製造する工程；
（２）前記工程（１）のベクターを細胞に形質転換する工程；
（３）前記工程（２）の形質転換細胞に被検物質を処理する工程；
（４）工程（３）の被検物質で処理した細胞を未処理対照群と比較し、処理細胞からの発光信号を減少させる物質を選択する工程；
を含む癌免疫療法剤のスクリーニング方法を提供する。
さらに、本発明は、発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質及び発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質を含む癌免疫療法剤のスクリーニング用キットを提供する。
また、本発明は、
（１）発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質及び発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターを製造する工程；
（２）前記工程（１）のベクターを細胞に形質転換する工程；
（３）前記工程（２）の形質転換細胞に被検物質を処理する工程；
（４）工程（３）の被検物質で処理した細胞を未処理対照群と比較し、処理細胞からの発光信号を減少させる物質を選択する工程；
を含む癌免疫療法剤のスクリーニング方法を提供する。
さらに、本発明は、発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質及び発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質を含む癌免疫療法剤のスクリーニング用キットを提供する。
【発明の効果】
【0013】
本発明によるインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）及び三者モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）の相互作用阻害剤は、ＴＲＩＭ２９によるＳＴＩＮＧの分解を阻害し、ＳＴＩＮＧの細胞内量を増加させることにより、ＳＴＩＮＧアゴニストであるｃＧＡＭＰが媒介する免疫反応をさらに活性化させる。さらに、ＳＴＩＮＧアゴニストであるｃＧＡＭＰ及び免疫チェックポイント阻害剤と併用して投与すると、有意な免疫癌効能を示す。従って、前記ＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤は、癌免疫療法剤、及び癌免疫療法補助剤として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）と三者モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）の相互作用を阻害する化合物をスクリーニンするための本発明のスクリーニング系の概略図である。
【図2】ＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９のＮ末端及びＣ末端のそれぞれにＮａｎｏＢｉＴ（ＬｇＢｉＴとＳｍＢｉＴ）を導入して得られた合計８種類の組み合わせを用いた最適化スクリーニング系の確認する図である： ＮＬ：Ｎ末端にＬｇＢｉＴ導入して得られる基； ＮＳ：Ｎ末端にＳｍＢｉＴ導入して得られる基； ＣＬ：Ｃ末端にＬｇＢｉＴ導入して得られる基；及び ＣＳ：Ｃ末端にＳｍＢｉＴ導入して得られる基。
【図3】ＳＴＩＮＧ－ＴＲＩＭ２９相互作用を阻害することにより、ルシフェラーゼ相補アッセイによる発光信号を減少させるオキソピペラジン誘導体の効果を示す図である： １：本発明の式（１）（以下、本発明の図面において、式（１）の化合物を「１」と表記する）； ２：本発明の式（２）（以下、本発明の図面において、式（２）の化合物を「２」と表記する）； ３：本発明の式（３）（以下、本発明の図面において、式（３）の化合物を「３」と表記する）； ４：本発明の式（４）（以下、本発明の図面において、式（４）の化合物を「４」と表記する）； ５：本発明の式（５）（以下、本発明の図面において、式（５）の化合物を「５」と表記する）；及び ６：本発明の式（６）（以下、本発明の図面において、式（６）の化合物を「６」と表記する）。
【図4】オキソピペラジン誘導体の細胞内ＳＴＩＮＧタンパク質量増加誘導効果を示す図である。
【図5】本発明のオキソピペラジン誘導体とｃＧＡＭＰとの共処理によるＳＴＩＮＧサブサイトカインであるＩＦＮ－βとＩＬ－６の発現増加効果を示す図である。
【図6】ＳＴＩＮＧサブサイトカインであるＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現の増加に対する式（１）の化合物の効果の時間依存的及び用量依存的確認を示す図である。
【図7】ウェスタンブロッティングによるＳＴＩＮＧサブ免疫シグナル伝達経路の活性化の増大に対する式（１）の化合物の効果の確認を示す図である。
【図8】ユビキチンタンパク質中のリシン残基４８以外の全てのリシン残基をアルギニンに置換した形質転換ユビキチンタンパク質を用い、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）法に基づく定量的ＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化の検出の結果、式（１）の化合物によるＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化の用量依存的な減少が確認されたことを示す図である。
【図9】プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２で処理することによりユビキチン化タンパク質の分解を阻止した場合に、式（１）の化合物のＳＴＩＮＧ増加効果が消失するか否かの確認を示す図である。
【図10】式（１）の化合物のＳＴＩＮＧの発現増加効果が、タンパク質転写阻害剤（シクロヘキサミド、ＣＨＸ）と転写阻害剤（アクチンマイシンＤ、ＡｃｔＤ）によって阻害されないことを確認するために、ユビキチン介在性の反応以外の別の細胞機構を介して発現増加作用が示されるか否かの確認を示す図である。
【図11】ヒト細胞株であるＡ４３１におけるＣＥＴＳＡの結果を通じてＳＴＩＮＧのみに選択的に結合することにより、式（１）の化合物が熱不安定化を誘導することの確認を示す図である。
【図12】ヒト細胞株であるＡ４３１におけるＩＴＤＲＦ結果によるＴＲＩＭ２９に影響を与えることなく、高濃度の式（１）の化合物によるＳＴＩＮＧの濃度依存的熱安定性の交差検証を示す図である。
【図13】マウス細胞株であるＲａｗ２６４．７におけるＣＥＴＳＡの結果を通じてＳＴＩＮＧのみに選択的に結合することにより、式（１）の化合物が熱不安定化を誘導することの確認を示す図である。
【図14】マウス細胞株であるＲａｗ２６４．７におけるＩＴＤＲＦ結果によるＴＲＩＭ２９に影響を与えることなく、高濃度の式（１）の化合物によるＳＴＩＮＧの濃度依存的熱安定性の交差検証を示す図である。
【図15】Ｒａｗ２６４．７細胞を式（１）の化合物で処理した場合のフローサイトメトリーによる細胞内ＳＴＩＮＧの蛍光標識強度の確認を示す図である。
【図16】Ｒａｗ２６４．７細胞を式（１）の化合物を処理した場合のウェスタンブロッティング分析によるＳＴＩＮＧの細胞内量の確認を示す図である。
【図17】Ｒａｗ２６４．７細胞を式（１）の化合物を処理した場合のｑＲＴ－ＰＣＲ法によるＳＴＩＮＧの細胞内ｍＲＮＡ発現量の確認を示す図である。
【図18】式（１）の化合物のＳＴＩＮＧアゴニストであるｃＧＡＭＰによるＢＭＤＣの抗原提示能増大効果の確認を示す図である。また、化合物により細胞殺害性Ｔ細胞の増殖が増加することを確認した図である。この化合物のこれらの効果が、ｃＧＡＭＰと併用投与すると、相乗効果が発揮されることが確認された。
【図19】式（１）の化合物及びｃＧＡＭＰの同時処理によるＢＭＤＣの交差抗原提示能の確認を示す図である。
【図21】式（１）の化合物を単独で、又はｃＧＡＭＰとの併用処理する条件下で、細胞殺害性Ｔ細胞の死が誘導又は促進されないことを確認した図である。
【図22】インビボ同種マウスモデル（in vivo syngeneic mouse model）における式（１）の化合物によるｃＧＡＭＰの免疫抗癌効能を確認するための動物実験方法を示す模式図である。
【図23】インビボ同種マウスモデルにおけるｃＧＡＭＰ及び式（１）の化合物の併用処理の実験群における腫瘍成長抑制効果の確認を示す図である。
【図24】インビボ同種マウスモデルにおけるｃＧＡＭＰ及び式（１）の化合物の併用処理の実験群における体重変化及び毒性信号の確認を示す図である。
【図25】腫瘍組織への免疫細胞の浸潤、及び浸潤した免疫細胞の活性化の程度を検証するための実験手順を示す図である。
【図26】ｃＧＡＭＰと式（１）の化合物を単独で、又は併用処理後の腫瘍組織への免疫細胞の浸潤、及び浸潤した免疫細胞の活性化の程度の確認を示す図である。
【図27】腫瘍内部の免疫細胞におけるＳＴＩＮＧの発現レベルを確認するための実験手順を示す図である。
【図28】式（１）の化合物の治療による腫瘍内部の免疫細胞におけるＳＴＩＮＧの発現レベルの確認を示す図である。
【図29】式（１）の化合物の抗癌免疫体系構築効果を確認するための実験手順を示す図である。
【図30】式（１）の化合物の抗癌免疫体系構築促進効果を示す図である。
【図31】式（１）の化合物及び免疫チェックポイント治療剤との併用処理の効果を確認するための実験手順を示す図である。
【図32】式（１）の化合物及び免疫チェックポイント治療剤との併用処理の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0016】
本発明は、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）及び三者モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）の相互作用阻害剤を有効成分として含有する癌免疫療法医薬組成物を提供する。
【0017】
前記相互作用阻害剤は、好ましくは低分子化合物、ペプチド、又は抗体であるが、これらに限定されるものではなく、下記式（７）
（７）
［式中、Ｒ1は、シクロアルキル、具体的には、Ｃ3－Ｃ7シクロアルキル、アリール、具体的にはＣ6－Ｃ10アリール、又はアリール－アルキル、具体的には、Ｃ6－Ｃ10アリール－Ｃ1－Ｃ5アルキル（ここで、アリールは、アルコキシで任意に置換されていてもよい）であり；
Ｒ2は、アルキル又はアリール－アルキル、具体的には、Ｃ6－Ｃ10アリール－Ｃ1－Ｃ5アルキル（ここで、アリールは、ハロゲンで任意に置換されていてもよい）であり；及び
Ｒ3は、アミノ、アルキルアミノ、ジ－アルキルアミノ又はヘテロシクロアルキル－アルキレン－アミノである。］で示される化合物、その異性体、その溶媒和物、その水和物又はその薬学的に許容される塩であってもよい。
【化1】
［式中、Ｒ1は、シクロアルキル、具体的には、Ｃ3－Ｃ7シクロアルキル、アリール、具体的にはＣ6－Ｃ10アリール、又はアリール－アルキル、具体的には、Ｃ6－Ｃ10アリール－Ｃ1－Ｃ5アルキル（ここで、アリールは、アルコキシで任意に置換されていてもよい）であり；
Ｒ2は、アルキル又はアリール－アルキル、具体的には、Ｃ6－Ｃ10アリール－Ｃ1－Ｃ5アルキル（ここで、アリールは、ハロゲンで任意に置換されていてもよい）であり；及び
Ｒ3は、アミノ、アルキルアミノ、ジ－アルキルアミノ又はヘテロシクロアルキル－アルキレン－アミノである。］で示される化合物、その異性体、その溶媒和物、その水和物又はその薬学的に許容される塩であってもよい。
【0018】
また、前記式（７）が、下記式（１）～式（６）で示される化合物であることが好ましいが、これらに限定されるものではない：
（１）
【化2】
【0019】
【化3】
【0020】
【化4】
【0021】
【化5】
【0022】
【化6】
【0023】
【化7】
【0024】
前記相互作用阻害剤は、ＳＴＩＮＧに結合し、ＴＲＩＭ２９を介したＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化（Ｋ４８結合特異的ポリユビキチン化）を介してＳＴＩＮＧの分解を阻害することが好ましいが、これに限定されない。
【0025】
また、前記相互作用阻害剤は、ＳＴＩＮＧを上方調節（upregulation）し、ＳＴＩＮＧアゴニストの活性を増強させることが好ましく、前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ（環状グアニレート）、ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ又は２’３’－ｃＧＡＭＰであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【0026】
また、前記相互作用阻害剤は、細胞殺害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）及びサイトカインからなる群から選択される１つ以上の免疫因子を活性化し、偽粘液腫、肝内胆管癌、肝芽腫、肝癌、甲状腺癌、結腸癌、精巣癌、骨髄異形成症候群、膠芽細胞腫、口腔癌、口唇癌、菌状息肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、基底細胞癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、男性乳癌、脳腫瘍、下垂体腺腫、多発性骨髄腫、胆嚢癌、胆道癌、大腸癌、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、網膜芽細胞腫、脈絡膜メラノーマ、ファーター膨大部癌、膀胱癌、腹膜癌、副甲状腺癌、副腎癌、副鼻腔癌、非小細胞肺癌、舌癌、星状細胞腫、小細胞肺癌、小児脳腫瘍、小児リンパ腫、小児白血病、小腸癌、髄膜腫、食道癌、神経膠腫、腎盂癌、腎臓癌、心臓癌、十二指腸癌、悪性軟部組織癌、悪性骨肉腫、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、悪性黒色腫、眼癌、外陰癌、尿管癌、尿道癌、原発部位不明の癌、胃リンパ腫、胃癌、胃カルチノイド、消化管間質腫瘍、ウィルムス腫瘍、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、肉腫、陰茎癌、咽頭癌、妊娠性絨毛性疾患、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、転移性骨癌、転移性脳腫瘍、縦隔腫瘍、直膓癌、直腸カルチノイド、膣癌、脊髄癌、聴神経鞘腫、膵臓癌、唾液腺癌、カポジ肉腫、パジェット病、へんとう腺癌、扁平上皮細胞癌、肺腺癌、肺癌、肺扁平上皮細胞癌、皮膚癌、肛門癌、横紋筋肉腫、喉頭癌、胸膜癌、血液癌及び胸腺癌からなる群から選択される１つ以上の癌に対して予防又は治療効果を有することが好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0027】
従って、式（１）～式（６）で示されるオキソピペラジン誘導体は、ＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９の相互作用を阻害し、ＳＴＩＮＧタンパク質の量を増加させ、ＴＲＩＭ２９を介したＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化によるＳＴＩＮＧの分解を阻害することが好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0028】
本発明の具体的な実施形態において、ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の相互作用を阻害する化合物をスクリーニングするために、本発明者らは、ＳＴＩＮＧのＣ末端にＬｇＢｉＴ、ＴＲＩＭ２９のＮ末端又はＣ末端にＳｍＢｉＴ発光タンパク質を結合させる、タンパク質間相互作用戦略（ＵＰＰＲＩＳ）による標的タンパク質の新規な上方調節を確立した（図１及び図２参照）。
【0029】
また、本発明者らは、前記確立したスクリーニング系を用いて、ＳＴＩＮＧ－ＴＲＩＭ２９相互作用を阻害する式（１）～式（６）で示されるオキソピペラジン誘導体を確認した（図３参照）。
【0030】
さらに、本発明者らは、前記オキソピペラジン誘導体が細胞内ＳＴＩＮＧタンパク質量の増加を誘導する効果を検討した結果、全てのオキソピペラジン誘導体が細胞内ＳＴＩＮＧ量を有意に増加させることを確認した（図４参照）。
【0031】
また、本発明者らは、ＳＴＩＮＧアゴニスト（ｃＧＡＭＰ）の免疫活性化効能の増加に対するオキソピペラジン誘導体の効果を調べた結果、全てのオキソピペラジン誘導体が、ｃＧＡＭＰとの共処理下で、ＳＴＩＮＧサブサイトカインの発現を増加させ、下流のシグナル伝達タンパク質のリン酸化を増加させることを確認した（図６及び図７参照）。
【0032】
また、本発明者らは、オキソピペラジン誘導体によるＳＴＩＮＧの分解阻害のメカニズムを検討した結果、オキソピペラジン誘導体が、ＴＲＩＭ２９を介したＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化（Ｋ４８結合特異的ポリユビキチン化）を介してＳＴＩＮＧの分解を阻害し、細胞内量を増加させることを確認した（図８～図１０参照）。
【0033】
そこで、本発明者らは、オキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧに結合するか否かを検討した結果、オキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９のうちＳＴＩＮＧに結合し、ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９相互作用を阻害することを確認した（図１１～図１３参照）。
【0034】
また、本発明者らは、オキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧアゴニストやその他の癌免疫療法の効能を高める効果を有することを確認するために、まず、オキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧの量を増加させる否かを検討した結果、オキソピペラジン誘導体で処理した群では細胞内ＳＴＩＮＧ量が有意に増加することを確認した（図１５参照）。
【0035】
さらに、本発明者らは、ＳＴＩＮＧアゴニストによる骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の抗原提示能の増大に対するオキソピペラジン誘導体の効果を検討し、これにより、オキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧアゴニストのＢＭＤＣの細胞殺害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）に対する抗原提示能を増大させることを確認した（図１８参照）。
【0036】
また、本発明者らは、オキソピペラジン誘導体及びｃＧＡＭＰの同時処理によるＢＭＤＣの交差抗原提示能を確認した結果、ＯＶＡ抗原を持続的に発現するＭＣ３８細胞株（ＭＣ３８－ＯＶＡ）と対照群のＭＣ３８細胞株を死滅処理する際に、式（１）の化合物が、濃度依存的にｃＧＡＭＰによるＢＭＤＣの活性化及びＢＭＤＣからＯＴ－１Ｔ細胞への抗原提示能を増強させることにより細胞増殖を促進すること（図１９参照）、及びＯＴ－１Ｔ細胞がＯＶＡを発現する細胞株のみを選択的に死滅させることを確認した（図２０参照）。
【0037】
また、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞をｃＧＡＭＰ及び／又はオキソピペラジン誘導体で処理する場合のＴ細胞死分析を行った結果、オキソピペラジン誘導体単独又はｃＧＡＭＰとの併用で処理した場合、ｃＧＡＭＰで処理した場合と比較して、細胞殺害性Ｔ細胞の死滅を誘導も促進もされないことを確認した（図２１参照）。
【0038】
さらに、本発明者らは、インビボ同種マウスモデルにおけるオキソピペラジン誘導体によるｃＧＡＭＰの免疫抗癌効能を高める効果を確認するために、まず、腫瘍成長抑制効果を検討した結果、ｃＧＡＭＰとオキソピペラジン誘導体との併用処理実験群では、実験群では腫瘍成長が抑制され、毒性信号が観察されないことを確認した（図２３及び図２４参照）。
【0039】
また、本発明者らは、オキソピペラジン誘導体の免疫活性化作用及び免疫抗癌効能増大作用を検討した結果、ｃＧＡＭＰとオキソピペラジン誘導体の併用処理した条件下で、腫瘍内へのＴ細胞及び細胞殺害性Ｔ細胞の浸潤が増加し、免疫反応を抑制する細胞である骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の総比率が低下することを確認することにより、免疫反応環境全体が活性化されることを確認した（図２５及び図２６参照）。
【0040】
さらに、本発明者らは、オキソピペラジン誘導体による腫瘍内部免疫細胞におけるＳＴＩＮＧ増加が、免疫活性化及び免疫抗癌効能の増大の基準であることを検証した結果、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び樹状細胞（ＤＣ）に代表される抗原提示細胞においてＳＴＩＮＧの量が増加していることを確認した（図２７及び図２８参照）。
【0041】
また、本発明者らは、抗癌免疫体系構築効果を検討した結果、ｃＧＡＭＰの単独投与と比較して、オキソピペラジン誘導体との併用処理では、原発性腫瘍において濃度依存的に腫瘍成長が抑制され、最終的な腫瘍質量が減少することが確認された。さらに、本発明者らは、薬剤を直接注射しない二次癌においても腫瘍死滅が効果的に起こることを最終的に確認した（図２９及び図３０参照）。
【0042】
さらに、本発明者らは、免疫チェックポイント治療剤との併用効果を検討した結果、ＰＤ－１抗体とオキソピペラジン誘導体を併用処理した場合、ＰＤ－１抗体単独処理した場合と比較して、腫瘍成長及び最終腫瘍重量が濃度依存的に減少することを確認した（図３１及び図３２参照）。
【0043】
従って、本発明によるＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤は、ＳＴＩＮＧ－ＴＲＩＭ２９相互作用を阻害することにより、ＴＲＩＭ２９によるＳＴＩＮＧの分解を阻害し、ＳＴＩＮＧの細胞内量を増加させることにより、ＳＴＩＮＧアゴニストであるｃＧＡＭＰ媒介の免疫反応をさらに活性化し、また、ＳＴＩＮＧアゴニストであるｃＧＡＭＰ及び免疫チェックポイント阻害剤と併用処理することにより、有意な免疫抗癌効能を示すことから、前記ＳＴＩＮＧ及びＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤は、癌免疫療法剤、及び癌免疫療法補助剤として有用に使用することができる。
【0044】
本発明の前記式（７）で示される化合物は、薬学的に許容される塩の形態で使用することができ、薬学的に許容可能な遊離酸によって形成される酸付加塩は、塩として有用である。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜窒酸、亜燐酸などの無機酸、脂肪族モノ及びジカルボン酸塩、フェニル置換アルカン酸塩、ヒドロキシアルカン酸塩、アルカンジオ酸塩、芳香族酸塩、脂肪族及び芳香族スルホン酸塩などの無毒性有機酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、酒石酸、フマル酸などの有機酸から得られる。これらの薬学的に無毒な塩には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩化物、臭化物 ヨウ化物、フッ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオリン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン－１，４－ジオエート、ヘキサン－１，６－ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、安息香酸メチル、安息香酸ジニトロ、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、クエン酸塩、乳酸塩、β－ヒドロキシブチレート、グリコール酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、マンデル酸塩などを含む。
【0045】
本発明による酸付加塩は、当該分野の通方法によって製造することができ、例えば、式（７）のオキソピペラジン誘導体をメタノール、エタノール、アセトン、塩化メチレン、アセトニトリルなどの有機溶媒に溶解し、そこに有機酸又は無機酸を加えて得られた沈殿物をろ過し、乾燥することによって製造できるか、溶媒と過剰の酸を減圧下で蒸留し、乾燥して得られたものを有機溶媒中で結晶化して製造することができる。
【0046】
さらに、薬学的に許容される金属塩は、塩基を用いて製造することができる。アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過剰のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物溶液に溶解し、不溶性の化合物塩をろ過し、ろ液を蒸発、乾燥することにより得られる。このとき、金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩を製造することが薬学的に適切である。さらに、対応する塩は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩を適切な陰性塩（例えば、硝酸銀）と反応させることにより得られる。
【0047】
さらに、本発明は、前記式（７）で示される化合物及びその薬学的に許容される塩だけでなく、それから製造され得る溶媒和物、光学異性体、水和物なども含まれる。
【0048】
本発明における用語「水和物」は、非共有分子間力（non-covalent intermolecular force）によって結合した化学量論的又は非化学量論的量の水を含む本発明の化合物又はその塩を意味する。本発明の前記式（７）で示される化合物の水和物は、非共有分子間力によって結合した化学量論的又は非化学量論的量の水を含んでもよい。前記水和物は、１当量以上、好ましくは、１当量～５当量の水を含んでもよい。このような水和物は、本発明の前記式（７）で示される化合物、その異性体又はその薬学的に許容される塩を水又は水を含有する溶媒から結晶化させることによって製造することができる。
【0049】
また、本発明における用語「溶媒和物」は、非共有分子間力によって結合した化学量論的又は非化学量論的量の溶媒を含む本発明の化合物又はその塩を意味する。そのための好ましい溶媒には、揮発性、非毒性、及び／又はヒトへの投与に適した溶媒が含まれる。
また、本発明における用語「異性体」は、化学式又は分子式が同じであるが、構造的又は立体的に異なる本発明の化合物又はそれの塩を意味する。これらの異性体には、互変異性体などの構造異性体と、不斉炭素中心を有するＲ又はＳ異性体、幾何異性体（トランス、シース）などの立体異性体、光学異性体（エナンチオマー）の全てが含まれる。これら全ての異性体及びそれらの混合物も本発明の範囲内に含まれる。
また、本発明における用語「異性体」は、化学式又は分子式が同じであるが、構造的又は立体的に異なる本発明の化合物又はそれの塩を意味する。これらの異性体には、互変異性体などの構造異性体と、不斉炭素中心を有するＲ又はＳ異性体、幾何異性体（トランス、シース）などの立体異性体、光学異性体（エナンチオマー）の全てが含まれる。これら全ての異性体及びそれらの混合物も本発明の範囲内に含まれる。
【0050】
本発明による前記癌免疫療法医薬組成物において、前記式（７）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩は、臨床投与時に様々な経口及び非経口の剤形で投与され得る。製剤化される場合、一般に使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、粉末、顆粒、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどと混合することにより調製される。また、単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口投与のための液剤には、懸濁剤、内服剤、乳剤、シロップ剤などがある。一般に使用される単純な希釈剤である水、流動パラフィンに加えて、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁化剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用することができる。
【0051】
前記式（７）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する癌免疫療法医薬組成物は、非経口投与することができ、非経口投与は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射又は胸腔内注射などの注射法により行うことができる。
【0052】
このとき、非経口投与用製剤を製剤化するために、前記式（７）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を安定剤又は緩衝剤とともに水と混合して溶液又は懸濁液を製造し、この溶液又は懸濁液をアンプル又はバイアル単位剤形にして投与することができる。前記組成物は滅菌することができ、及び／又は防腐剤、安定化剤、水和剤又は乳化促進剤、浸潤圧調節のための塩及び／又は緩衝剤などの補助剤、及び他の治療上有用な物質を含むことができ、通常の方法である混合、造粒又はコーティング方法によって製剤化することができる。
【0053】
経口投与用製剤のさらなる例としては、錠剤、丸剤、硬質／軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒、エリキシル剤、トローチ剤などがあるが、これら製剤は、有効成分に加えて、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール）を含有している。錠剤は、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリジンなどの結合剤を含むことができ、場合によっては、デンプン、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩などの崩壊剤又は沸騰混合物及び／又は吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤を含むことができる。
【0054】
また、本発明は、ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤、式（７）で示される化合物、その異性体、その溶媒和物、その水和物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する癌免疫療法補助剤を提供する。
【0055】
また、本発明は、前記癌免疫療法補助剤及び癌免疫療法剤を含む抗癌用併用製剤を提供する。
【0056】
前記癌免疫療法補助剤は、癌免疫療法剤の効能を高め、細胞殺害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）及びサイトカインからなる群から選択される１つ以上の免疫因子を活性化することが好ましい。
【0057】
また、前記癌免疫療法補助剤は、癌免疫療法剤と同時又は逐次投与されることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【0058】
前記癌免疫療法剤は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達（signaling）を活性化し得るｃ－ｄｉ－ＧＭＰ（環状グアニレート）、ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰ、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＢＴＬＡ、抗ＴＩＭ３、抗ＨＶＥＭ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０、抗ＣＤ２８、抗ＰＤＬ２、抗ＧＩＴＲ、抗ＩＣＯＳ、抗ＳＩＲＰα、抗ＩＬＴ２、抗ＩＬＴ３、抗ＩＬＴ４、抗ＩＬＴ５、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１９及び抗ＴＩＧＩＴからなる群から選択される１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0059】
前記癌免疫療法補助剤又は併用製剤は、偽粘液腫、肝内胆管癌、肝芽腫、肝癌、甲状腺癌、結腸癌、精巣癌、骨髄異形成症候群、膠芽細胞腫、口腔癌、口唇癌、菌状息肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、基底細胞癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、男性乳癌、脳腫瘍、下垂体腺腫、多発性骨髄腫、胆嚢癌、胆道癌、大腸癌、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、網膜芽細胞腫、脈絡膜メラノーマ、ファーター膨大部癌、膀胱癌、腹膜癌、副甲状腺癌、副腎癌、副鼻腔癌、非小細胞肺癌、舌癌、星状細胞腫、小細胞肺癌、小児脳腫瘍、小児リンパ腫、小児白血病、小腸癌、髄膜腫、食道癌、神経膠腫、腎盂癌、腎臓癌、心臓癌、十二指腸癌、悪性軟部組織癌、悪性骨肉腫、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、悪性黒色腫、眼癌、外陰癌、尿管癌、尿道癌、原発部位不明の癌、胃リンパ腫、胃癌、胃カルチノイド、消化管間質腫瘍、ウィルムス腫瘍、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、肉腫、陰茎癌、咽頭癌、妊娠性絨毛性疾患、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、転移性骨癌、転移性脳腫瘍、縦隔腫瘍、直膓癌、直腸カルチノイド、膣癌、脊髄癌、聴神経鞘腫、膵臓癌、唾液腺癌、カポジ肉腫、パジェット病、へんとう腺癌、扁平上皮細胞癌、肺腺癌、肺癌、肺扁平上皮細胞癌、皮膚癌、肛門癌、横紋筋肉腫、喉頭癌、胸膜癌、血液癌及び胸腺癌からなる群から選択される１つ以上に対して抗癌活性を有することが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【0060】
また、本発明による癌免疫療法補助剤及び併用製剤の具体的な説明は、本発明による「癌免疫療法用医薬組成物」の説明と同様である。
【0061】
さらに、本発明は、
（１）発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質及び発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターを製造する工程；
（２）前記工程（１）のベクターを細胞に形質転換する工程；
（３）前記工程（２）の形質転換細胞に被検物質を処理する工程；
（４）工程（３）の被検物質で処理した細胞を未処理対照群と比較し、処理細胞からの発光信号を減少させる物質を選択する工程；
を含む癌免疫療法剤のスクリーニング方法を提供する。
（１）発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質及び発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターを製造する工程；
（２）前記工程（１）のベクターを細胞に形質転換する工程；
（３）前記工程（２）の形質転換細胞に被検物質を処理する工程；
（４）工程（３）の被検物質で処理した細胞を未処理対照群と比較し、処理細胞からの発光信号を減少させる物質を選択する工程；
を含む癌免疫療法剤のスクリーニング方法を提供する。
【0062】
また、本発明は、発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質及び発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質を含む癌免疫療法剤のスクリーニング用キットを提供する。
【0063】
前記工程（１）の発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質は、ＳＴＩＮＧのＣ末端にＬｇＢｉＴが結合させることによって得られ、発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質は、ＴＲＩＭ２９のＣ末端又はＮ末端にＳｍＢｉＴが結合させることによって得られる。ＬｇＢｉＴとＳｍＢｉＴは直接相互作用することはなく、結合したタンパク質間の相互作用を介してのみ結合し、発光酵素の機能を行う。
【0064】
前記工程（１）のベクターは、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。前記ベクターは、目的遺伝子発現のためのエレメントを含み、複製起点、プロモーター、オペレータ遺伝子（operator）、転写終結配列（terminator）などを含み、さらに、宿主細胞のゲノムへの導入及び／又は宿主細胞への導入の成功に適切な酵素部位（例えば、制限酵素部位）を確認するための選択マーカー、及び／又はタンパク質への翻訳のためのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）などを含むことができる。前記ベクターはさらに、前記プロモーター以外の転写調節配列（例えば、エンハンサー）を含むことができる。
【0065】
さらに、前記ベクターは、プラスミドＤＮＡ、組換えベクター又はその他の当該技術分野で公知の担体であってもよく、具体的には、直鎖状ＤＮＡプラスミドＤＮＡ、組換え非ウイルス性ベクター、組換えウイルス性ベクター又は遺伝子発現誘導ベクター系であってもよく、前記組換えウイルス性ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルパー－依存性アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス又はワクシニアウイルスベクターであってもよいが、本発明はこれらに限定されない。
さらに、前記形質転換細胞は、幹細胞、前駆細胞又は動物細胞であってもよいが、これらに限定されるものではない。
さらに、前記形質転換細胞は、幹細胞、前駆細胞又は動物細胞であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0066】
また、前記キットの構成要素としては、発光タンパク質に結合したＳＴＩＮＧタンパク質及び発光タンパク質に結合したＴＲＩＭ２９タンパク質をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターが導入された宿主細胞、前記宿主細胞培養用培地、前記宿主細胞培養容器、蛍光レベルを分析するためのソフトウェア、前記ソフトウェアが備えられたハードウェアシステムなどを挙げることができる。
【0067】
一方、本発明の癌免疫療法剤のスクリーニング方法及びキドの具体的な説明は、本発明による「癌免疫療法用医薬組成物」の説明と同様である。
【実施例】
【0068】
以下、本発明を実施例及び実験例を参照して詳細に説明する。
【0069】
ただし、以下の実施例及び実験例は本発明を具体的に説明するものであり、本発明の内容が実施例及び実験例によって限定されるものではない。
【0070】
＜実施例１＞キット及び試薬の準備
ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（１１９９５－０６５）、ＭＥＭ（最小必須培地）（１１０９５－０８０）、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５－０９３）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（３１９８５－０７０）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）（１６００００４４）、抗生物質抗真菌溶液（１５２４００６２）、及びＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（１２６０５－０１０）は、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社［カリフォルニア州カールズバッド］から購入した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）バッファーはＷＥＬＧＥＮＥ社［韓国］から購入した。化合物としては、生物学的評価のためにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解した化合物を準備した。ＤＭＳＯ、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ＭＧ１３２、デオキシコール酸ナトリウム、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｎａ３ＶＯ４、ＮａＦ、トリトン－Ｘ－１００、過硫酸アンモニウム、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミンはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社［Ｓｔ．ミズーリ州ルイス］から購入した。
ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（１１９９５－０６５）、ＭＥＭ（最小必須培地）（１１０９５－０８０）、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５－０９３）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（３１９８５－０７０）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）（１６００００４４）、抗生物質抗真菌溶液（１５２４００６２）、及びＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（１２６０５－０１０）は、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社［カリフォルニア州カールズバッド］から購入した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）バッファーはＷＥＬＧＥＮＥ社［韓国］から購入した。化合物としては、生物学的評価のためにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解した化合物を準備した。ＤＭＳＯ、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ＭＧ１３２、デオキシコール酸ナトリウム、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｎａ３ＶＯ４、ＮａＦ、トリトン－Ｘ－１００、過硫酸アンモニウム、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミンはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社［Ｓｔ．ミズーリ州ルイス］から購入した。
【0071】
また、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンは、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社［マサチューセッツ州ウォルサム］から購入し、ＮａＣｌはＳａｍｃｈｕｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社［韓国］から購入し、完全な錠剤ＥＤＴＡ－フリー プロテアーゼ阻害剤カクテル（０４６９３１３２００１）は、Ｒｏｃｈｅ社［バーゼル、スイス］から購入した。２’，３’－環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社［Pak Shek Kok, Hong Kong］又はＡＰＥｘＢＩＯ社［Houston, TX］から購入し、ＮａｎｏＢｉＴＴＭ ＰＰＩ ＭＣスターター キット（Ｎ２０１４）及びＮａｎｏ－Ｇｌｏ生細胞アッセイ試薬（Ｎ２０１２）はＰｒｏｍｅｇａ社［ウィスコンシン州マディソン］から購入し、Ｅｚ－Ｃｙｔｏｘ ＷＳＴアッセイ試薬はＤａｅｉｌ Ｂｉｏ社［韓国］から購入した。
【0072】
細胞溶解物中のタンパク質濃度を測定するために、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイキットはＰＩＥＲＣＥ社［マサチューセッツ州ウォルサム］から購入し、ＥＬＩＳＡ用の３，３’，５，５’ ’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社［カリフォルニア州カールズバッド］から購入し、３０％アクリルアミド－Ｂｉｓ溶液（３７．５：１、ＡＣ４００４－０５０－００）及びラメリ サンプリング バッファー（５×ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー、ＳＦ２００２－１１０－００）はＢｉｏｓｅｓａｎｇ社［韓国］で購入した。ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を含むタンパク質ゲルキャスター及びウェスタンブロッティング装置はＢｉｏＲａｄ社［カリフォルニア州ハーキュリーズ］から購入し、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ ｐｒｉｍｅウェスタンブロッティング検出システム（ＲＰＮ２２３２）及びパーコールはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ［イリノイ州シカゴ］から購入し、ＲＮＡ抽出のためのＲＮｅａｓｙミニキットはＱＩＡＧＥＮ社［ドイツ、ヒルデン］から購入した。
【0073】
リポフェクタミンＬＴＸ、Ｐｌｕｓ試薬及びリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社［マサチューセッツ州ウォルサム］から購入し、逆転写のためのすべてのｑＰＣＲプライマー、ｓｉＲＮＡｓ、及びＡｃｃｕｐｏｗｅｒ Ｃｙｃｌｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴプレミックス（ｄＴ２０）はＢｉｏｎｅｅｒ社［韓国］から購入し、ｑＰＣＲのためのＫａｐａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ２×ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ試薬はＫＡＰＡｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。また、ＲＢＣ溶解バッファーはＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社［カリフォルニア州サンディエゴ］から購入し、Ｆｏｘｐ３／転写因子染色バッファーはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社［カリフォルニア州サンディエゴ］から購入し、１００ｍｍ／１５０ｍｍ細胞培養ディッシュ、透明９６ウェルプレート、透明１２ウェルフレート、透明６ウェルフレート、９６－ウェル白色平低ＴＣ処理マイクロテストプレート（３５３２９６）、及び通気性シーリングフィルム（Ａｘｙｇｅｎ ＢＦ－４００－Ｓ）はＣＯＲＮＩＮＧ社［アリゾナ州グレンデール］から購入した。
【0074】
さらに、ＮａｎｏＢｉＴスクリーニング用の６ピン マルチブロット レプリケーター（ＶＰ４０８）はＶ＆ＰＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社［カリフォルニア州サンディエゴ］から購入し、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（４３９４５４）はＣｏｓｔａｒ社から購入し、ＴＲＩＭ２９過発現後、ウェスタンブロッティングのためにｐＣＭＶ６－ＴＲＩＭ２９－Ｍｙｃ－ＦＬＡＧプラスミドはＯｒｉｇｅｎｅ社［メリーランド州ロックビル］から購入し、ＥＬＩＳＡのためのＦＬＡＧ－又はＭｙｃタグ付きプラスミドはｐｃＤＮＡ３．１ベクターで製造（（ｐｃＤＮＡ３．１－ＦＬＡＧ－ＳＴＩＮＧ及びｐｃＤＮＡ３．１－ＴＲＩＭ２９－Ｍｙｃ）され、ｐＲＫ５－ＨＡ－ユビキチン（ＷＴ及びＫ４８）プラスミドはＡｄｄｇｅｎｅ社から入手した。
【0075】
＜実施例２＞抗体の作製
抗β－アクチン（#４９７０）、抗ＳＴＩＮＧ（#１３６４７、ウェスタンブロッティング用）、抗ホスホ－ＳＴＩＮＧ（S３６５）（#７２９７１）、抗ＴＢＫ１／ＮＡＫ１（#３５０４）、抗ホスホ－ＴＢＫ１／ＮＡＫ１（Ｓ１７２）（#５４８３）、抗ＩＲＦ３（#４３０２）、抗ホスホ－ＩＲＦ３（Ｓ３９６）（#２９０４７）、ＨＲＰ－結合抗マウスＩｇＧ［#７０７４］、及びＨＲＰ－結合抗マウスＩｇＧ［#７０７６］抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社［マサチューセッツ州ダンバーズ］から購入し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２（Ｆ１８０４）抗体はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社［Ｓｔ．ミズーリ州ルイス］から購入し、抗ＴＲＩＭ２９／ＡＴＤＣ（Ｂ－２）（ｓｃ－１６６７０７、ヒトＴＲＩＭ２９検出用）、抗ＴＲＩＭ２９／ＡＴＤＣ（Ｃ－２）（ｓｃ－３７６１２５、マウスＴＲＩＭ２９検出用）、及びタンパク質A－アガロース ビーズ（ｓｃ－２００１）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社［テキサス州ダラス］から購入した。また、抗ユビキチン（ａｂ１３４９５３）抗体はＡｂｃａｍ社［ケンブリッジ、英国］から購入し、抗ＨＡ－ｔａｇ（５１６４２－２－ＡＰ、ＥＬＩＳＡ用）及び抗ＳＴＩＮＧ（１９８５１－１－ＡＰ、ＦＡＣＳ用）抗体はＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社［イリノイ州ローズモント］から購入した。
抗β－アクチン（#４９７０）、抗ＳＴＩＮＧ（#１３６４７、ウェスタンブロッティング用）、抗ホスホ－ＳＴＩＮＧ（S３６５）（#７２９７１）、抗ＴＢＫ１／ＮＡＫ１（#３５０４）、抗ホスホ－ＴＢＫ１／ＮＡＫ１（Ｓ１７２）（#５４８３）、抗ＩＲＦ３（#４３０２）、抗ホスホ－ＩＲＦ３（Ｓ３９６）（#２９０４７）、ＨＲＰ－結合抗マウスＩｇＧ［#７０７４］、及びＨＲＰ－結合抗マウスＩｇＧ［#７０７６］抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社［マサチューセッツ州ダンバーズ］から購入し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２（Ｆ１８０４）抗体はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社［Ｓｔ．ミズーリ州ルイス］から購入し、抗ＴＲＩＭ２９／ＡＴＤＣ（Ｂ－２）（ｓｃ－１６６７０７、ヒトＴＲＩＭ２９検出用）、抗ＴＲＩＭ２９／ＡＴＤＣ（Ｃ－２）（ｓｃ－３７６１２５、マウスＴＲＩＭ２９検出用）、及びタンパク質A－アガロース ビーズ（ｓｃ－２００１）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社［テキサス州ダラス］から購入した。また、抗ユビキチン（ａｂ１３４９５３）抗体はＡｂｃａｍ社［ケンブリッジ、英国］から購入し、抗ＨＡ－ｔａｇ（５１６４２－２－ＡＰ、ＥＬＩＳＡ用）及び抗ＳＴＩＮＧ（１９８５１－１－ＡＰ、ＦＡＣＳ用）抗体はＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社［イリノイ州ローズモント］から購入した。
【0076】
さらに、フローサイトメトリーのための抗体であるＣＤ２７４（Ｂ７－Ｈ１、ＰＤ－L１）－ＡＰＣ、ＣＤ３（１７Ａ．２）－ＰＥ、ＣＤ４（ＲＭ４５）－ＦＩＴＣ、ＣＤ８α（５３－６．７）－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ１９（６Ｄ５）－ＢＶ６５０、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）－ＢＶ７８６、Ｌｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）－ＰＥ－Ｃｙ７、Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８）－ＡＰＣ、ＣＤ４５．２（１０４）－PｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）－ＡＰＣ、ＣＤ２７９（２９Ｆ．１Ａ１２）－ＡＰＣ、グランザイムB（ＱＡ１６Ａ０２）－ＦＩＴＣ、及びパーフォリン（Ｓ１６００９Ａ）－ＰＥはＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社［カリフォルニア州サンディエゴ］から購入し、Ｇｒ１（ＲＢ６－８Ｃ５）－ＢＶ５１０、ＣＤ４９ｂ（ＨＭａ２）－ＢＶ６０５、Ｆ４／８０（Ｔ４５－２３４２）－ＢＶ７１１、Ｆｏｘｐ３（Ｒ1６－７１５）－ＰＥ、ＴＮＦ－α（ＭＰ６－ＸＴ２２）－ＰＥ、及びＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ（Ｍ５／１１）－ＢＶ６０５はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社［カリフォルニア州サンノゼ］から購入した。
【0077】
＜実施例３＞細胞株及び動物モデルの作製
Ａ４３１ヒト皮膚扁平上皮癌細胞及びＣＴ２６マウス結腸癌細胞は、韓国細胞株バンクから入手した。Ｒａｗ２６４．７マウスマクロファージ及びＨＥＫ２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞はＡＴＣＣ（American Type Culture Collections）から入手した。マウス骨髄由来細胞は、８週齢の雌、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから取得し、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＴ－ＩＴ細胞）は８週齢ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ＴＣＲ形質転換マウス（ＯＴ－Ｉマウス）から取得した。さらに、ＢＡＬＢ／ｃマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［メイン州バーハーバー］から入手した。なお、実験には生後８～１２週の雌マウスを使用し、野生型ＢＡＬＢ／ｃを含むすべてのマウスをソウル大学医科大学の動物施設で飼育・管理された。すべての動物実験は、ソウル大学校動物資源研究所の動物管理委員会の承認を得て実施された（承認番号：ＳＮＵ－１９０６２１－３－１３）。
Ａ４３１ヒト皮膚扁平上皮癌細胞及びＣＴ２６マウス結腸癌細胞は、韓国細胞株バンクから入手した。Ｒａｗ２６４．７マウスマクロファージ及びＨＥＫ２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞はＡＴＣＣ（American Type Culture Collections）から入手した。マウス骨髄由来細胞は、８週齢の雌、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから取得し、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＴ－ＩＴ細胞）は８週齢ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ＴＣＲ形質転換マウス（ＯＴ－Ｉマウス）から取得した。さらに、ＢＡＬＢ／ｃマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［メイン州バーハーバー］から入手した。なお、実験には生後８～１２週の雌マウスを使用し、野生型ＢＡＬＢ／ｃを含むすべてのマウスをソウル大学医科大学の動物施設で飼育・管理された。すべての動物実験は、ソウル大学校動物資源研究所の動物管理委員会の承認を得て実施された（承認番号：ＳＮＵ－１９０６２１－３－１３）。
【0078】
＜実施例４＞細胞培養
Ｒａｗ２６４．７細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％（v／v）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）抗生物質抗真菌溶液が含まれたＤＭＥＭで培養し、Ａ４３１細胞は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）抗生物質抗真菌薬溶液が含まれたＭＥＭで培養した。また、ＣＴ２６細胞は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）抗生物質抗真菌溶液が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。一方、細胞は、３７℃、加湿条件に設定された５％ＣＯ2インキュベーター内の１００ｍｍ細胞培養ディッシュ内で維持させた。
Ｒａｗ２６４．７細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％（v／v）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）抗生物質抗真菌溶液が含まれたＤＭＥＭで培養し、Ａ４３１細胞は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）抗生物質抗真菌薬溶液が含まれたＭＥＭで培養した。また、ＣＴ２６細胞は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）抗生物質抗真菌溶液が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。一方、細胞は、３７℃、加湿条件に設定された５％ＣＯ2インキュベーター内の１００ｍｍ細胞培養ディッシュ内で維持させた。
【0079】
＜実施例５＞実験装置及びプログラム
ＥＬＩＳＡ分析のための９６ウェルプレートでの吸光度測定及びＢＣＡ分析は、Ｂｉｏ Ｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダー［バーモント州ウィヌースキ］を使用して行った。Ｎａｎｏ ＢｉＴスクリーニングのための白色底９６ウェルプレートの発光測定はＢｉｏＴｅＫ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸマイクロプレートリーダー［バーモント州ウィヌースキ］で行った。ＢｉｏＲａｄ社製のＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＭＰイメージングシステムはウェスタンプルロッティン分析のための化学発光信号分析に使用した。
ＥＬＩＳＡ分析のための９６ウェルプレートでの吸光度測定及びＢＣＡ分析は、Ｂｉｏ Ｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダー［バーモント州ウィヌースキ］を使用して行った。Ｎａｎｏ ＢｉＴスクリーニングのための白色底９６ウェルプレートの発光測定はＢｉｏＴｅＫ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸマイクロプレートリーダー［バーモント州ウィヌースキ］で行った。ＢｉｏＲａｄ社製のＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＭＰイメージングシステムはウェスタンプルロッティン分析のための化学発光信号分析に使用した。
【0080】
また、化学発光信号の定量化は、ＢｉｏＲａｄ社［カリフォルニア州ハーキュリーズ］で提供するＩｍａｇｅＬａｂ６．０プログラムで行った。ＲＮＡ定量化は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社［イリノイ州シカゴ］のＮａｎｏＶｉｅｗで行った。定量的リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ［カリフォルニア州フォスターシティ］のＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムで行った。グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８［カリフォルニア州ラホーヤ］を使用して分析した。
さらに、フローサイトメトリー実験では、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社［カリフォルニア州サンノゼ］のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＮＣＩＲＦ）とＴｒｅｅ Ｓｔａｒ［オレゴン州アシュランド］のＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して細胞を分析した。
さらに、フローサイトメトリー実験では、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社［カリフォルニア州サンノゼ］のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＮＣＩＲＦ）とＴｒｅｅ Ｓｔａｒ［オレゴン州アシュランド］のＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して細胞を分析した。
【0081】
＜実験例１＞ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の相互作用を阻害する化合物のスクリーニング
＜１－１＞高効率生理活性検索手法の構築
タンパク質間相互作用を観察するために、二分子発光相補性アッセイに基づく高効率生理活性検索手法を構築した。図１に示すよう、発光タンパク質ルシフェラーゼを構成する２つのタンパク質ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴを、それぞれＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の末端部分に導入した。ＬｇＢｉＴとＳｍＢｉＴは互いに直接相互作用せず、結合されたタンパク質間の相互作用を通じてのみ結合し、発光酵素の機能を果たす。
＜１－１＞高効率生理活性検索手法の構築
タンパク質間相互作用を観察するために、二分子発光相補性アッセイに基づく高効率生理活性検索手法を構築した。図１に示すよう、発光タンパク質ルシフェラーゼを構成する２つのタンパク質ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴを、それぞれＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の末端部分に導入した。ＬｇＢｉＴとＳｍＢｉＴは互いに直接相互作用せず、結合されたタンパク質間の相互作用を通じてのみ結合し、発光酵素の機能を果たす。
【0082】
ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９にＬｇＢｉＴとＳｍＢｉＴを導入してＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の相互作用発光信号を得るために、図２に示すように、ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９のＮ末端及びＣ末端にそれぞれＬｇＢｉＴとＳｍＢｉＴを導入した合計８種類の組み合わせを試みた。そのため、ＳＴＩＮＧのＣ末端にＬｇＢｉＴ、ＴＲＩＭ２９のＮ末端にＳｍＢｉＴを導入した場合と、ＳＴＩＮＧのＣ末端にＬｇＢｉＴ、ＴＲＩＭ２９のＣ末端にＳｍＢｉＴを導入した場合の組み合わせでは、Ｈａｌｏ Ｔａｇと名付けたＳＴＩＮＧと相互作用しないタンパク質を一緒に導入した場合と比較して、高い発光信号が確認された。
【0083】
＜１－２＞ＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９の相互作用阻害剤の発見
前記実験例＜１－１＞で確立したシステムを使用して、以下のようにしてスクリーニングを行った。
前記実験例＜１－１＞で確立したシステムを使用して、以下のようにしてスクリーニングを行った。
【0084】
具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を１００ｍｍ培養ディッシュに接種し、１日間培養した。その後、ＳＴＩＮＧ－ＬｇＢｉＴとＳｍＢｉＴ－ＴＲＩＭ２９をそれぞれ含有するプラスミドの組み合わせ、又はネガティブコントロールとしてＳＴＩＮＧ－ＬｇＢｉＴとＨａｌｏ Ｔａｇ－ＳｍＢｉＴを含有するプラスミドの組み合わせを細胞に導入し、さらに１日間培養した。プラスミドの導入は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸをメーカーのプロトコルに従って行った。培養後、プラスミドが導入された細胞を白色底９６ウェルフレートに移し接種し、さらに１日間培養した。各ウェルをＰｒｏｍｅｇａ社製のＮａｎｏ－Ｇｌｏｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｒｅａｇｅｎｔでメーカーのプロトコルに従って処理した後、５分ごとに振とうしながら発光信号を得た。信号が安定化した時点で各ウェルを化合物で処理し、発光信号を得た。ＳＴＩＮＧ－ＴＲＩＭ２９相互作用阻害が阻害されているかどうかは、この得られた発光信号を安定化時の各ウェルの発光信号に標準化して得られた値で観察した。
【0085】
＜１－３＞ＳＴＩＮＧ－ＴＲＩＭ２９相互作用阻害の確認
前記実験例＜１－２＞のスクリーニングにより、図３に示すように、ＳＴＩＮＧ－ＴＲＩＭ２９相互作用を阻害することにより、発濃度依存的に光信号を減少させるオキソピペラジン誘導体が確認された（図３）。
前記実験例＜１－２＞のスクリーニングにより、図３に示すように、ＳＴＩＮＧ－ＴＲＩＭ２９相互作用を阻害することにより、発濃度依存的に光信号を減少させるオキソピペラジン誘導体が確認された（図３）。
【0086】
さらに、前記オキソピペラジン誘導体は、下記式（１）～式（６）で示した。
式（１）
４－（（Ｒ）－４－（４－ヒドロキシベンジル）－２－イソプロピル－５－（４－メトキシベンジル）－３－オキソ－３，４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－３－ニトロ－Ｎ－（（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イル）メチル）ベンズアミド
（１）
式（１）
４－（（Ｒ）－４－（４－ヒドロキシベンジル）－２－イソプロピル－５－（４－メトキシベンジル）－３－オキソ－３，４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－３－ニトロ－Ｎ－（（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イル）メチル）ベンズアミド
【化8】
【0087】
式（２）
４－（（Ｒ）－５－シクロペンチル－４－（４－ヒドロキシベンジル）－２－イソプロピル－３－オキソ－３,４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－３－ニトロ－Ｎ－（（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イル）メチル）ベンズアミド
（２）
４－（（Ｒ）－５－シクロペンチル－４－（４－ヒドロキシベンジル）－２－イソプロピル－３－オキソ－３,４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－３－ニトロ－Ｎ－（（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イル）メチル）ベンズアミド
【化9】
【0088】
式（３）
（Ｒ）－４－（５－シクロペンチル－４－（４－ヒドロキシベンジル）－２－イソプロピル－３－オキソ－３，４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－Ｎ，Ｎ－ジエチル－３－ニトロベンズアミド
（３）
（Ｒ）－４－（５－シクロペンチル－４－（４－ヒドロキシベンジル）－２－イソプロピル－３－オキソ－３，４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－Ｎ，Ｎ－ジエチル－３－ニトロベンズアミド
【化10】
【0089】
式（４）
（Ｒ）－４－（５－シクロペンチル－４－（４－ヒドロキシベンジル）－２－イソプロピル－３－オキソ－３，４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－Ｎ－イソブチル－３－ニトロベンズアミド
（４）
（Ｒ）－４－（５－シクロペンチル－４－（４－ヒドロキシベンジル）－２－イソプロピル－３－オキソ－３，４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－Ｎ－イソブチル－３－ニトロベンズアミド
【化11】
【0090】
式（５）
４－（（Ｓ）－５－シクロペンチル－２－（４－フルオロベンジル）－４－（４－ヒドロキシベンジル）－３－オキソ－３，４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－３－ニトロ－Ｎ－（（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イル）メチル）ベンズアミド
（５）
４－（（Ｓ）－５－シクロペンチル－２－（４－フルオロベンジル）－４－（４－ヒドロキシベンジル）－３－オキソ－３，４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－３－ニトロ－Ｎ－（（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イル）メチル）ベンズアミド
【化12】
【0091】
式（６）
４－（（Ｒ）－５－ベンジル－４－（４－ヒドロキシベンジル）－２－イソプロピル－３－オキソ－３，４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－３－ニトロ－Ｎ－（（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イル）メチル）ベンズアミド
（６）
４－（（Ｒ）－５－ベンジル－４－（４－ヒドロキシベンジル）－２－イソプロピル－３－オキソ－３，４－ジヒドロピラジン－１（２Ｈ）－イル）－３－ニトロ－Ｎ－（（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イル）メチル）ベンズアミド
【化13】
【0092】
＜実験例２＞オキソピペラジン誘導体によるＳＴＩＮＧタンパク質の細胞内量増加誘導の確認
前記＜実験例１＞で発見された式（１）～（６）のオキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧ－ＴＲＩＭ２９相互作用を阻害することにより、ＳＴＩＮＧの細胞内量を増加させるかどうかを確認するために、ウェスタンブロッティング実験を繰り返して化合物処理後のＳＴＩＮＧの細胞内量を確認した。
前記＜実験例１＞で発見された式（１）～（６）のオキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧ－ＴＲＩＭ２９相互作用を阻害することにより、ＳＴＩＮＧの細胞内量を増加させるかどうかを確認するために、ウェスタンブロッティング実験を繰り返して化合物処理後のＳＴＩＮＧの細胞内量を確認した。
【0093】
まず、Ａ４３１細胞株を透明な１２ウェルフレートに接種し、１日間培養した。その後、細胞をそれぞれ式（１）～（６）の化学で処理した、さらに２４時間培養した。最後に、細胞の上層培養液を除去した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で残余上清を希釈除去し、ウェスタンブロッティング試料を準備した。ウェスタンブロッティング試料の準備はすべて４℃で行った。細胞をＲＩＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５ｍＭ ＮａＦ、プロテアーゼインヒビターカクテル、１％（ｖ／ｖ）ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０）で１５分間処理した後、溶液を回収し、１３０００ｇで１５分間遠心分離して上清を得た。上清のタンパク質濃度は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて、メーカーのプロトコルに従って測定した。各試料の濃度はＲＩＰＡ溶解バッファーを用いて同じになるように調整した後、５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ社製）をメーカーの比率に従って添加し、５℃で５分間処理した。処理試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した後、ＰＶＤＦ膜に移し、４％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ溶液で３０分間培養した。一次抗体は４℃で１日間、又は室温で１時間の間培養した後、室温のＴＢＳＴ溶液で４回洗浄した。二次抗体は室温で１時間培養した。各抗体のメーカーのプロトコルに従い、抗体溶液を１％ＢＳＡが含まれたＴＢＳＴ溶液で希釈した。最後に、４回のＴＢＳＴ洗浄過程後、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製のＥＣＬ（強化化学発光）プライム溶液で展開し、化学発光信号をＢｉｏ－Ｒａｄ社製のＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰを使用して測定し、得られた結果をＩｍａｇｅＬａｂ６．０プログラムで定量化し、Ｐｒｉｓｍ８．０プログラムを使用して結果を図示した。
【0094】
その結果、前記分析の結果得られたバンド強度を定量化した値を図４に示すが、式（１）～（６）のオキソピペラジン誘導体はいずれもＳＴＩＮＧの細胞内量を増加させることが確認された。
【0095】
＜実験例３＞オキソピペラジン誘導体のＳＴＩＮＧアゴニストの免疫活性化効能の増加の確認
＜３－１＞ｑＲＴ－ＰＣＲを用いたｃＧＡＭＰの免疫活性化効能の増加の確認
式（１）～（６）のオキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧ量を増加させることによってＳＴＩＮＧアゴニストであるｃＧＡＭＰの免疫活性化効能を増強させるかどうかを確認するために、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）実験によって、ＳＴＩＮＧサブサイトカインインターフェロン－β（ＩＦＮ－β）とインターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、そしてインターロイキン－１５受容体α（ＩＬ－１５Rα）の遺伝子発現レベルを確認した。
＜３－１＞ｑＲＴ－ＰＣＲを用いたｃＧＡＭＰの免疫活性化効能の増加の確認
式（１）～（６）のオキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧ量を増加させることによってＳＴＩＮＧアゴニストであるｃＧＡＭＰの免疫活性化効能を増強させるかどうかを確認するために、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）実験によって、ＳＴＩＮＧサブサイトカインインターフェロン－β（ＩＦＮ－β）とインターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、そしてインターロイキン－１５受容体α（ＩＬ－１５Rα）の遺伝子発現レベルを確認した。
【0096】
具体的には、Ｒａｗ２６４．７細胞を透明な１２ウェルフレートに接種し、１日間培養した。その後、細胞をｃＧＡＭＰと式（１）～（６）のオキソピペラジン誘導体でそれぞれ処理した後、６時間培養した。最後に、細胞の上層培養液を除去した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で残余上清を希釈して除去し、ｑＲＴ－ＰＣＲ試料を準備した。ＱＩＡＧＥＮ社製のＲＮｅａｓｙミニキットを用いてメーカーのプロトコルに従って細胞からｍＲＮＡを抽出した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＮａｎｏｖｉｅｗ装置でＲＮＡの濃度を測定した後、１μｇのＲＮＡを定量し、Ａｃｃｕｐｏｗｅｒｃｙｃｌｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴプレミックスｄＴ２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製）を用いてメーカーのプロトコルに従って相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。得られたｃＤＮＡはＧＡＰＤＨ（対照群）、ＩＦＮ－βとＩＬ－６遺伝子を検出可能なプライマーＤＮＡとともに、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のＫａｐａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ２Ｘ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ溶液中でメーカーのプロトコルに従って混合した。混合試料をＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して分析し、その結果を、Ｐｒｉｓｍ８．０プログラムを使用して図示した。
【0097】
一方、該当分析に使用されたプライマーのＤＮＡ塩基配列は下記表１に示した。
【表1】
【0098】
その結果、図５に示すように、式（１）～（６）の全てのオキソピペラジン誘導体は、ｃＧＡＭＰとの共処理下でＳＴＩＮＧサブサイトカインＩＦＮ－βとＩＬ－６の発現を増加させることが確認された。
【0099】
また、図６に示すように、式（１）の化合物は、ＩＦＮ－βとＩＬ－６に加えて、ＳＴＩＮＧの下流で発現することが知られている他のサイトカインＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαの発現も、時間依存的及び濃度依存的に増加させることが確認された。
【0100】
＜３－２＞ウェスタンブロッティングによるｃＧＡＭＰの免疫活性化効能の増加の確認
式（１）のオキソピペラジン誘導体が、ｃＧＡＭＰのＳＴＩＮＧサブ免疫シグナル伝達経路活性化効果を増大させることを、前記＜実施例２＞と同様にウェスタンブロッティングにより検証した。
式（１）のオキソピペラジン誘導体が、ｃＧＡＭＰのＳＴＩＮＧサブ免疫シグナル伝達経路活性化効果を増大させることを、前記＜実施例２＞と同様にウェスタンブロッティングにより検証した。
【0101】
その結果、図７に示すように、ｃＧＡＭＰによりＳＴＩＮＧが活性化されると、下流シグナル伝達タンパク質ＴＢＫ１、ＩＲＦ３のリン酸化が増加し、免疫サイトカインの発現が増加することが確認され、また、式（１）のオキソピペラジン誘導体と併用処理することで、さらにリン酸化の程度が増加することが確認された。
【0102】
＜実験例４＞オキソピペラジン誘導体のＴＲＩＭ２９を介したＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化による分解阻害の確認
式（１）～（６）のオキソピペラジン誘導体が、ＴＲＩＭ２９を介したＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化（Ｋ４８結合特異的ポリユビキチン化）を介してＳＴＩＮＧの分解を阻止することにより、細胞内量を増加させるかどうかを確認した。このため、式（１）の化合物を代表化合物として選択し、図８に示すように、ユビキチンタンパク質のリシン残基４８以外のすべてのリシン残基をアルギニンに置換した形質転換ユビキチンタンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）法に基づいて、ＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化の定量的検出を行った。
式（１）～（６）のオキソピペラジン誘導体が、ＴＲＩＭ２９を介したＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化（Ｋ４８結合特異的ポリユビキチン化）を介してＳＴＩＮＧの分解を阻止することにより、細胞内量を増加させるかどうかを確認した。このため、式（１）の化合物を代表化合物として選択し、図８に示すように、ユビキチンタンパク質のリシン残基４８以外のすべてのリシン残基をアルギニンに置換した形質転換ユビキチンタンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）法に基づいて、ＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化の定量的検出を行った。
【0103】
具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を透明な６ウェルフレートに接種し、１日間培養した。その後、ｐｃＤＮＡ３．１－ＦＬＡＧ－ＳＴＩＮＧ（ＦＬＡＧ標識で連結したＳＴＩＮＧを発現するプラスミド）、ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＲＩＭ２９－Ｍｙｃ（Ｍｙｃ標識で連結したＴＲＩＭ２９を発現するプラスミド）、ｐＲＫ５－ＨＡ－ユビキチン－Ｋ４８（リジン残基４８以外のリジン残基をアルギニンに置換したユビキチンにＨＡ標識で連結したタンパク質を発現するプラスミ）を導入し、１日間培養した。このとき、各実験条件で導入されるＤＮＡの総量はｐＵＣ１９空ベクターを用いて標準化した。プラスミドの導入は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸをメーカーのプロトコルに従って行った。１日間培養後、上層培養液を除去し、ＭＧ１３２と式（１）の化合物が含まれた培養液を処理してさらに３時間培養した。このとき、ユビキチン化タンパク質の除去を防ぐプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を処理しなかった試料の分析値を対照群にとし、ＭＧ１３２で処理した試料の分析値から差し引く方法で、化合物の効果のみを定量的に検出した。最後に、細胞の上層培養液を除去した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で残余上清を希釈除去して、ＥＬＩＳＡ処理試料を準備した。細胞にＥＬＩＳＡ溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、プロテアーゼインヒビターカクテル、１％（ｖ／ｖ）トリトン－Ｘ－１００）を１５分間処理した後、溶液を回収し、１３０００ｇで１５分間遠心分離して上清を得た。上清のタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイアッセイを使用して測定した。各試料の濃度は、ＥＬＩＳＡ溶解バッファーを用いて４００μｇ／ｍＬに均等に設定した。定量濃度を確認のために、試料の一部分を５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ社製）をメーカーの比率で添加し、得られたものを９５℃で５分間処理した後、前記のウェスタンブロッティング方法で分析した。
【0104】
ＥＬＩＳＡ分析では、ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）をＰＢＳに１：３０００（体積比）に希釈し、Ｎｕｎｃ Ａ-Ｓ社製のＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート上にウェル当たり１００μＬずつ、４℃で１日間処理した。その後、上清を除去し、ＥＬＩＳＡ清浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ溶液）でウェル当たり２００μＬずつ３回洗浄した。その後、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液をウェル当たり３００μＬずつ室温で２時間処理した。得られたものをＥＬＩＳＡ清浄液で５回洗浄した後、先に準備した試料をウェル当たり１００μＬずつ室温で３時間処理した。得られたものをＥＬＩＳＡ清浄液で１０回洗浄した後、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１：２０００（体積比）に希釈したＨＡ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）で１ウェル当たり１００μＬずつを室温で１時間処理した。得られたものをＥＬＩＳＡ清浄液で５回洗浄した後、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１：２０００（体積比）に希釈したＨＲＰ－重合ウサギＩｇＧ抗体（ＣＳＴ）で１ウェル当たり１００μＬずつを室温で１時間処理した。ＥＬＩＳＡ清浄液で５回洗浄した後、ＨＲＰ酵素の基質である３，３'，５，５''－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を１ウェル当たり１００μＬずつ、室温で１０分処理して発色させた。発色反応は２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を１ウェル当たり５０μＬずつ分注することにより完了し、ＢｉｏＴｅｋ社製のＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダーデバイスを使用して４５０ｎｍで吸光度を測定し、その結果をＰｒｉｓｍ８．０プログラムを使用して図示した。
【0105】
その結果、図８に示すように、ＦＬＡＧ標識ＳＴＩＮＧを捕捉し、リジン４８重合マルチユビキチン化のみを選択的に標識するＨＡ標識を抗体で検出することにより、ＳＴＩＮＧのＬｙｓ４８重合マルチユビキチン化の程度を検出することができた。式（１）の代表的な化合物で処理した結果、ＴＲＩＭ２９を介したＳＴＩＮＧのリジン４８重合マルチユビキチン化が阻害されることが確認された。また、ウェスタンブロッティングにより、各対照群及び式（１）の化合物の試料の濃度定量が良好に定量されていることが確認された。
【0106】
また、ＥＬＩＳＡ実験結果を交差検証するために、ＭＧ１３２を処理してユビキチン化タンパク質の分解が防止されると、式（１）の化合物のＳＴＩＮＧ増加効果が消失されるかどうかを確認した。
【0107】
その結果、図９に示すように、ウェスタンブロッティング法を用いて、ＭＧ１３２を式（１）の化合物で処理した場合、ＳＴＩＮＧが増加しないことが確認された。
【0108】
さらに、式（１）の化合物によるＳＴＩＮＧの発現の増加がユビキチン介在性の反応以外の細胞機構を通じて起こり得る可能性を排除するために、転写阻害剤であるアクチンマイシンＤ（ＡｃｔＤ）とリボソーム翻訳阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を式（１）の化合物と共処理し、ＳＴＩＮＧ増加効果が相変らず維持されているかどうかをウェスタンブロッティング法を使用して確認した。
【0109】
その結果、図１０に示すように、細胞の転写・翻訳機構が阻害された条件下においても、式（１）の化合物は依然としてＳＴＩＮＧの細胞内量を増加させることが確認された。
【0110】
＜実験例５＞オキソピペラジン誘導体のＳＴＩＮＧへの結合の確認
本発明のオキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９のうちＳＴＩＮＧに結合してその相互作用を阻害するかどうかを、式（１）の化合物に基づいて、低分子化合物と標的タンパク質との相互作用を検証する主要技術である細胞シフトアッセイ（ＣＥＴＳＡ）及び等温用量反応フィンガープリント（ＩＴＤＲＦ）により検証した（D. M. Molina et al., Science2013, 341, 84-87.）。
本発明のオキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧとＴＲＩＭ２９のうちＳＴＩＮＧに結合してその相互作用を阻害するかどうかを、式（１）の化合物に基づいて、低分子化合物と標的タンパク質との相互作用を検証する主要技術である細胞シフトアッセイ（ＣＥＴＳＡ）及び等温用量反応フィンガープリント（ＩＴＤＲＦ）により検証した（D. M. Molina et al., Science2013, 341, 84-87.）。
【0111】
ＣＥＴＳＡ技法を使用して式（１）の化合物の標的を検証するために、ヒトＡ４３１細胞株とマウスＲａｗ２６４．７細胞株を１００ｍｍ又は１５０ｍｍの培養ディッシュに接種し、１日間培養した。その後、５０ｍＬのチューブに細胞を集め、１．５６２５μＭ、３．１２５μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭの式（１）の化合物を含む培養液を２時間に処理した。次に、細胞を同量ずつ分注し、それぞれ図１１（Ａ４３１）又は図１３（Ｒａｗ２６４．７）に示す温度で３分間処理し、２５℃で３分間安定化させた。前記温度で処理した細胞を１０００ｇで３分間遠心分離し、上清を除去した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、さらに遠心分離して上清を全て除去した。洗浄した細胞にＰＢＳ－Ｎ溶液（０．４％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０を含むＰＢＳ）で処理して均一にした後、液体窒素を用いて急速凍結融解を計３回繰り返して細胞を溶解した。その後、４℃、２００００ｇ、２０分間遠心分離し、上清を新しい容器に移し、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭプロテインアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を使用してメーカーのプロトコルに従って各濃度を測定した。各試料の濃度をＲＩＰＡ溶解バッファーを用いて均等に調整し、５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ社製）をメーカーの比率で添加し、９５℃で５分間処理し、前記のウェスタンブロッティング法で分析した。
【0112】
その結果、図１１に示すように、ヒト細胞株であるＡ４３１におけるＣＥＴＳＡ結果を通じて、式（１）の化合物がＳＴＩＮＧのみに選択的に結合して熱不安定化を誘導することが確認された。また、図１２に示すように、式（１）の化合物が、ＴＲＩＭ２９に影響を与えることなく、高濃度で濃度依存的にＳＴＩＮＧの熱安定性を低下させることが、ＩＴＤＲＦの結果を通じて交差検証された。
【0113】
また、図１３に示すように、マウス細胞株であるＲａｗ２６４．７におけるＣＥＴＳＡの結果を通じて、式（１）の化合物がＳＴＩＮＧのみに選択的に結合して熱不安定化を誘導することが確認された。また、図１４に示すように、式（１）の化合物が、ＴＲＩＭ２９に影響を与えることなく、高濃度で濃度依存的にＳＴＩＮＧの熱安定性を低下させることが、ＩＴＤＲＦの結果を通じて交差検証された。
【0114】
＜実験例６＞オキソピペラジン誘導体の細胞内ＳＴＩＮＧ量増加に対する効果の確認
オキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧアゴニストや免疫チェックポイント阻害剤を含む他の癌免疫療法の効能を高めるかどうかを検証した。まず、オキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧの量を増加させるかどうかをフローサイトメトリー及びウェスタンブロッティングによって検証した。
オキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧアゴニストや免疫チェックポイント阻害剤を含む他の癌免疫療法の効能を高めるかどうかを検証した。まず、オキソピペラジン誘導体がＳＴＩＮＧの量を増加させるかどうかをフローサイトメトリー及びウェスタンブロッティングによって検証した。
【0115】
フローサイトメトリーを通じて細胞内のＳＴＩＮＧ 量を測定するために、Ｒａｗ２６４．７細胞を透明な６ウェルフレートに接種し、１日間培養した。その後、細胞を、ＦＢＳを含まない培養液で式（１）の化合物を希釈した溶液で処理し、２４時間培養した。最後に、細胞の上層培養液を除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で残余上清を希釈除去し、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液で５分間処理して細胞を分離し、さらに培養液で処理して回収した。回収した細胞は遠心分離後、上清を除去し、ＦＡＣＳ溶液（２％ウマ血清、０．０５％ＮａＮ3を含むハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ））に再分配し、細胞数を測定した。各試料につき当たり１×１０6個の細胞を収集し、遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液を室温で１０分間処理して細胞を固定し、トリトン溶液（０．１％ＢＳＡ、０．５％トリトン－Ｘ－１００を含むＰＢＳ溶液）を処理し、遠心分離し、上清を除去した。ＳＴＩＮＧ一次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）を室温で２時間処理した。その後、追加的にトリトン溶液を加え、遠心分離し、上清を除去し、ＦＩＴＣ重合二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製、ＦＩＴＣ標識ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ）又はアイソタイプの対照群（Ｚｙｍｅｄ）で１時間、室温で処理した。最後にトリトン溶液を加え、遠心分離し、上清を除去し、細胞を２００μＬのトリトン溶液に再分配し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置を使用して分析し、その結果をＴｒｅｅＳｔａｒ社製のＦｌｏｗＪｏプログラムで定量分析した。
【0116】
その結果、図１５に示すように、式（１）の化合物で処理すると、アイソタイプ対照群では変化がなく、細胞内ＳＴＩＮＧの蛍光標識強度が濃度依存的に増加した。また、図１６に示すように、Ｒａｗ２６４．７細胞におけるＳＴＩＮＧの細胞内量は、式1の化合物により濃度依存的に増加することがウェスタンブロッティング法を用いて交差検証された。また、図１７に示すように、Ｒａｗ２６４．７細胞におけるＳＴＩＮＧの増加は、ＲＮＡ転写とは無関係であることもｑＲＴ－ＰＣＲ法により確認された。
【0117】
＜実験例７＞オキソピペラジン誘導体のＳＴＩＮＧアゴニストによるＢＭＤＣの抗原提示能増大効果の確認
式（１）の化合物は、ＳＴＩＮＧアゴニストによる骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の細胞殺害性Ｔ細胞（細胞殺害性Ｔ細胞；ＣＤ８＋Ｔ細胞）に対する抗原提示能を増大させることが確認された。
式（１）の化合物は、ＳＴＩＮＧアゴニストによる骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の細胞殺害性Ｔ細胞（細胞殺害性Ｔ細胞；ＣＤ８＋Ｔ細胞）に対する抗原提示能を増大させることが確認された。
【0118】
具体的には、生後８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨及び脛骨からマウス骨髄由来細胞を得た。２×１０6個の細胞を、１０ｎｇ／ｍＬ ｍＧＭＣＳＦ及び５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４を添加した２ｍＬのＭＬＲ培地（１０％ＦＢＳ、１％１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１％グルタミン及び１％抗生物質抗真菌薬が添加したＲＰＭＩ １６４０培地）で培養し、樹状細胞（ＢＭＤＣ）に分化させた。細胞培養開始から３日目に、２ｍＬのＭＬＲ培地を添加した。さらに、６日目に、２×１０6個の樹状細胞を、５０μｇ／ｍＬのＯＶＡタンパク質及び／又は１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）、並びにｃＧＡＭＰ及び／又は式（１）で示される化合物で、様々な濃度で処理した。その後、前記細胞を３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養し、樹状細胞活性化マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ＩＩ）のフローサイトメトリーを行った。次に、５×１０4個の樹状細胞を２×１０5個のＣＦＳＥ標識ＯＴ－１Ｔ細胞（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）と培養し、ＯＴ－１Ｔ細胞の増殖を観察した。
【0119】
その結果、図１８に示すように、ＯＶＡ抗原を直接処理した場合、ｃＧＡＭＰによるＢＭＤＣの活性化及びＢＭＤＣからＯＴ－１Ｔ細胞への抗原提示能を増強させることにより、式（１）の化合物が濃度依存的に細胞増殖を促進することが確認された。
【0120】
＜実験例８＞オキソピペラジン誘導体及びｃＧＡＭＰの同時処理によるＢＭＤＣの交差抗原提示能の確認
前記＜実験例７＞と同様にして、マウス骨髄由来細胞を取得し、分化させた。６日目に、２×１０6個の樹状細胞（ＢＭＤＣ）を３回凍結解凍したＭＣ３８又はＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞の２×１０6個と共培養し、様々な濃度のｃＧＡＭＰ及び／又は式（１）の化合物で処理した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した後、樹状細胞活性化マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ＩＩ）のフローサイトメトリーを行った。その後、５×１０4個の細胞を２×１０5個のＣＦＳＥ標識ＯＴ－１ Ｔ細胞（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）と培養し、ＯＴ－１ Ｔ細胞の増殖を観察した。
前記＜実験例７＞と同様にして、マウス骨髄由来細胞を取得し、分化させた。６日目に、２×１０6個の樹状細胞（ＢＭＤＣ）を３回凍結解凍したＭＣ３８又はＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞の２×１０6個と共培養し、様々な濃度のｃＧＡＭＰ及び／又は式（１）の化合物で処理した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した後、樹状細胞活性化マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ＩＩ）のフローサイトメトリーを行った。その後、５×１０4個の細胞を２×１０5個のＣＦＳＥ標識ＯＴ－１ Ｔ細胞（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）と培養し、ＯＴ－１ Ｔ細胞の増殖を観察した。
【0121】
その結果、図１９に示すように、ＯＶＡ抗原を持続的に発現するＭＣ３８細胞株（ＭＣ３８－ＯＶＡ）と対照群のＭＣ３８細胞株を死滅させた後に処理した場合において、式（１）の化合物が濃度依存的にｃＧＡＭＰによるＢＭＤＣの活性化及びＢＭＤＣでＯＴ－１ Ｔ細胞への抗原提示能を増強させることにより細胞増殖を促進し、このような効果がＭＣ３８対照群の処理条件ではそのような効果が全く生じないことが示され、選択性が確認された。
【0122】
＜実験例９＞ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の抗原特異的細胞殺害性の確認
前記＜実験例７＞と同様にして、マウス骨髄由来細胞を取得し、分化させた。６日目に、２×１０6個の樹状細胞を、５０μｇ／ｍＬのＯＶＡタンパク質の存在下で、様残な濃度のｃＧＡＭＰ及び／又は式（１）の化合物で処理した。３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した後、５×１０4個の細胞を２×１０5個のＣＦＳＥ標識ＯＴ－１ Ｔ細胞と１日間培養し、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を活性化した。エフェクター細胞、すなわち活性化ＯＴ－１ Ｔ細胞は２×１０5個の標的細胞、すなわち１００Ｇｙを照射したＭＣ３８及びＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞（１×１０5のＭＣ３８腫瘍細胞及びＲＦＰ発現する１×１０5個のＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞）と、様々な「エフェクター：：標的」比（１：１又は３：１）で共培養した。次に、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、ＯＴ－１ Ｔ細胞のＯＶＡ特異的細胞毒性を確認した。
前記＜実験例７＞と同様にして、マウス骨髄由来細胞を取得し、分化させた。６日目に、２×１０6個の樹状細胞を、５０μｇ／ｍＬのＯＶＡタンパク質の存在下で、様残な濃度のｃＧＡＭＰ及び／又は式（１）の化合物で処理した。３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した後、５×１０4個の細胞を２×１０5個のＣＦＳＥ標識ＯＴ－１ Ｔ細胞と１日間培養し、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を活性化した。エフェクター細胞、すなわち活性化ＯＴ－１ Ｔ細胞は２×１０5個の標的細胞、すなわち１００Ｇｙを照射したＭＣ３８及びＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞（１×１０5のＭＣ３８腫瘍細胞及びＲＦＰ発現する１×１０5個のＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞）と、様々な「エフェクター：：標的」比（１：１又は３：１）で共培養した。次に、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、ＯＴ－１ Ｔ細胞のＯＶＡ特異的細胞毒性を確認した。
【0123】
【0124】
＜実験例１０＞ＣＤ８＋Ｔ細胞をｃＧＡＭＰ及び／又はオキソピペラジン誘導体で処理した場合のＴ細胞死の分析
ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスのリンパ節から取得し、ＭＡＣＳを使用して分離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を５nｇ／ｍＬのＩＬ－２の存在下、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３及び０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８でプレコートしたプレート上で活性化させた。３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した後、活性化Ｄ８＋Ｔ細胞を、様々ン濃度のｃＧＡＭＰ及び／又は式（１）の化合物で処理し、さらに２４時間培養した。細胞を採取し、アネキシンＶ／７－ＡＡＤで染色して細胞死を観察した。示されたデータは最小３つの独立した実験を示した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスのリンパ節から取得し、ＭＡＣＳを使用して分離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を５nｇ／ｍＬのＩＬ－２の存在下、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３及び０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８でプレコートしたプレート上で活性化させた。３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した後、活性化Ｄ８＋Ｔ細胞を、様々ン濃度のｃＧＡＭＰ及び／又は式（１）の化合物で処理し、さらに２４時間培養した。細胞を採取し、アネキシンＶ／７－ＡＡＤで染色して細胞死を観察した。示されたデータは最小３つの独立した実験を示した。
【0125】
その結果、図２１に示すように、式（１）の化合物を単独で処理した場合、又はｃＧＡＭＰとの併用処理した場合のいずれの条件においても、ＧＡＭＰで処理した場合と比較して、式（１）の化合物が細胞殺害性Ｔ細胞の細胞死を誘導又は促進しないことが確認された。
【0126】
＜実施例１１＞インビボ同種マウスモデルにおける式（１）の化合物によるｃＧＡＭＰの免疫抗癌効能の増大効果の確認
＜１１－１＞腫瘍成長抑制効果の確認
２×１０5個のＣＴ２６細胞株を５０μＬの培養液で調製し、皮下注射した。その後、図２２に示すように、注射した腫瘍の大きさが１００ｍｍ3に達した時点で、ｃＧＡＭＰと式（１）の化合物を腫瘍に直接注入した。ｃＧＡＭＰ溶液は、最終的にＰＥＧ４００：蒸溜水＝４０：６０の組成で製造し、毎回２０μＬを注入した。式（１）の化合物の溶液は、ＤＭＳＯ：ＰＥＧ４００：蒸溜水＝２：４０：５８の組成で製造し、毎回２０μＬを注入した。ｃＧＡＭＰ溶液は２日に１回、合計４回注射し、式（１）の化合物溶液は４日に１回、合計２回注射した。腫瘍の大きさは毎２日ごとにノギスで測定し、その容積を（縦×横×高さ／２）として算出した。マウスの体重も２日ごとに測定した。
＜１１－１＞腫瘍成長抑制効果の確認
２×１０5個のＣＴ２６細胞株を５０μＬの培養液で調製し、皮下注射した。その後、図２２に示すように、注射した腫瘍の大きさが１００ｍｍ3に達した時点で、ｃＧＡＭＰと式（１）の化合物を腫瘍に直接注入した。ｃＧＡＭＰ溶液は、最終的にＰＥＧ４００：蒸溜水＝４０：６０の組成で製造し、毎回２０μＬを注入した。式（１）の化合物の溶液は、ＤＭＳＯ：ＰＥＧ４００：蒸溜水＝２：４０：５８の組成で製造し、毎回２０μＬを注入した。ｃＧＡＭＰ溶液は２日に１回、合計４回注射し、式（１）の化合物溶液は４日に１回、合計２回注射した。腫瘍の大きさは毎２日ごとにノギスで測定し、その容積を（縦×横×高さ／２）として算出した。マウスの体重も２日ごとに測定した。
【0127】
その結果、図２３に示すように、ｃＧＡＭＰ（ｃＧ）及び式（１）の化合物を併用処理した実験群では、対照群と比較して、腫瘍成長が抑制され、最終日に摘出した腫瘍の重量が減少することが確認され、また、ｃＧＡＭＰを単独処理した実験群と比較して、式（１）の化合物を併用処理した場合に、濃度依存的に腫瘍成長が抑制されることが確認された。
【0128】
また、図２４に示すように、ｃＧＡＭＰと式（１）の化合物を単独又は併用処理した場合にかかわらず、体重の有意な変化や毒性の信号が観察されないことが確認された。
【0129】
＜１１－２＞免疫活性化及び免疫抗癌効能の増大効果の確認
腫瘍組織内部への免疫細胞の浸潤、及び浸潤した免疫細胞の活性化の程度を検証するために、図２５に示すように、ｃＧＡＭＰ（ｃＧ）と式（１）の化合物を単独又は併用処理し、最終処理から２日後に腫瘍を摘出し、フローサイトメトリーを行った。マウスを二酸化炭素で安楽死させた後、腫瘍を摘出した。腫瘍組織をカミソリの刃で小片に分割し、２％ウマ血清、０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ、４０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉを含むＤＭＥＭ溶液で３７℃、１時間処理した後、４０μｍフィルターで透過させ、個々の細胞に分離した。分離された細胞からｐｅｒｃｏｌｌ濃度こう配遠心分離により、腫瘍浸潤白血球細胞（ＴＩＬｓ）を分離し、赤血球溶解溶液による処理により赤血球除去した。得られた細胞は前記ＦＡＣＳ溶液に再分配し、各免疫細胞のＦｃγＲＩＩ／３ＩＩＩ受容体を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ Ａｂｓ（ｃｌｏｎｅ２．４Ｇ２）抗体で４℃、１０分間処理して中性化した。個々の細胞分化のための一次抗体による処理は、４℃で３０分間行った。処理した細胞を遠心分離後にＰＢＳ溶液に再分配し、さらに遠心分離して上清を除去した。細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液で室温、１０分間処理して固定し、トリトン溶液（０．１％ＢＳＡ、０．５％トリトン－Ｘ－１００を含むＰＢＳ溶液）で処理し、遠心分離し、上清を除去した。サイトカイン（ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）－ＡＰＣ、パーフォリン（Ｓ１６００９Ａ）－ＰＥ、グランザイムＢ（ＱＡ１６Ａ０２）－ＦＩＴＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）一次抗体を室温で２時間処理した。最後に、トリトン溶液を加えて遠心分離し、上清を除去し、２００μＬのトリトン溶液に再分配し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を使用して分析し、その結果をＴｒｅｅＳｔａｒ社製のＦｌｏｗＪｏプログラムで定量分析した。
腫瘍組織内部への免疫細胞の浸潤、及び浸潤した免疫細胞の活性化の程度を検証するために、図２５に示すように、ｃＧＡＭＰ（ｃＧ）と式（１）の化合物を単独又は併用処理し、最終処理から２日後に腫瘍を摘出し、フローサイトメトリーを行った。マウスを二酸化炭素で安楽死させた後、腫瘍を摘出した。腫瘍組織をカミソリの刃で小片に分割し、２％ウマ血清、０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ、４０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉを含むＤＭＥＭ溶液で３７℃、１時間処理した後、４０μｍフィルターで透過させ、個々の細胞に分離した。分離された細胞からｐｅｒｃｏｌｌ濃度こう配遠心分離により、腫瘍浸潤白血球細胞（ＴＩＬｓ）を分離し、赤血球溶解溶液による処理により赤血球除去した。得られた細胞は前記ＦＡＣＳ溶液に再分配し、各免疫細胞のＦｃγＲＩＩ／３ＩＩＩ受容体を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ Ａｂｓ（ｃｌｏｎｅ２．４Ｇ２）抗体で４℃、１０分間処理して中性化した。個々の細胞分化のための一次抗体による処理は、４℃で３０分間行った。処理した細胞を遠心分離後にＰＢＳ溶液に再分配し、さらに遠心分離して上清を除去した。細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液で室温、１０分間処理して固定し、トリトン溶液（０．１％ＢＳＡ、０．５％トリトン－Ｘ－１００を含むＰＢＳ溶液）で処理し、遠心分離し、上清を除去した。サイトカイン（ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）－ＡＰＣ、パーフォリン（Ｓ１６００９Ａ）－ＰＥ、グランザイムＢ（ＱＡ１６Ａ０２）－ＦＩＴＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）一次抗体を室温で２時間処理した。最後に、トリトン溶液を加えて遠心分離し、上清を除去し、２００μＬのトリトン溶液に再分配し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を使用して分析し、その結果をＴｒｅｅＳｔａｒ社製のＦｌｏｗＪｏプログラムで定量分析した。
【0130】
その結果、図２６に示すように、造血幹細胞由来細胞、すなわち総ＴＩＬを示すＣＤ４５陽性（ＣＤ４５＋）細胞の比率において、ｃＧＡＭＰと式（１）の化合物の併用処理条件では、総Ｔ細胞及び細胞殺害性Ｔ細胞の腫瘍への浸潤が増加し、免疫反応を抑制する細胞である骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の総比率が低下していることが確認され、免疫反応全体の環境が活性化されていることが確認された。また、サイトカイン（ＴＮＦ－α）及び活性化因子（グランザイムＢ、パーフォリン）の比率の増加から、浸潤した細胞殺害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）の活性が増大していることが確認された。
【0131】
＜１１－３＞腫瘍内部の免疫細胞におけるＳＴＩＮＧの発現レベル確認
式（１）の化合物による腫瘍内部免疫細胞におけるＳＴＩＮＧ増加が、免疫活性化及び免疫抗癌効能の増大の基礎であることを調べるために、図２７に示すように、式（１）の化合物を単独で腫瘍を処理し、最終処理から１日後に腫瘍を摘出し、その内部のＳＴＩＮＧの量をフローサイトメトリーで確認した。前記のように、二酸化炭素による安楽死後、＜実施例６＞と同様に腫瘍を摘出し、ＴＩＬを分離し、細胞内ＳＴＩＮＧ染色は行った。
式（１）の化合物による腫瘍内部免疫細胞におけるＳＴＩＮＧ増加が、免疫活性化及び免疫抗癌効能の増大の基礎であることを調べるために、図２７に示すように、式（１）の化合物を単独で腫瘍を処理し、最終処理から１日後に腫瘍を摘出し、その内部のＳＴＩＮＧの量をフローサイトメトリーで確認した。前記のように、二酸化炭素による安楽死後、＜実施例６＞と同様に腫瘍を摘出し、ＴＩＬを分離し、細胞内ＳＴＩＮＧ染色は行った。
【0132】
その結果、図２８に示すように、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び樹状細胞（ＤＣ）に代表される抗原提示細胞においてＳＴＩＮＧの量が増加していることが確認された。また、ＳＴＩＮＧ増加の効果は、全腫瘍由来マクロファージのうちＭ２マクロファージに比べ、免疫反応を直接活性化するＭ１マクロファージで顕著に現れることが確認された。
【0133】
＜１１－４＞抗癌免疫系の構築効果の確認
ｃＧＡＭＰと式（１）の化合物併用処理した場合、図１８～２１で確認された抗原提示効果の増強の結果に加えて、動物モデルにおいても生体全体に抗癌免疫系が構築され、活性化された細胞殺害性Ｔ細胞が、薬物を注射しない他の場所の癌細胞を除去できるかを検証した。このため、図２９に示すように、まず、一次腫瘍を移植し、４日後に二次腫瘍を移植し、それぞれの腫瘍の大きさが１００ｍｍ3と２０ｍｍ3に達した時点で一次腫瘍のみに薬物投与を行った。
ｃＧＡＭＰと式（１）の化合物併用処理した場合、図１８～２１で確認された抗原提示効果の増強の結果に加えて、動物モデルにおいても生体全体に抗癌免疫系が構築され、活性化された細胞殺害性Ｔ細胞が、薬物を注射しない他の場所の癌細胞を除去できるかを検証した。このため、図２９に示すように、まず、一次腫瘍を移植し、４日後に二次腫瘍を移植し、それぞれの腫瘍の大きさが１００ｍｍ3と２０ｍｍ3に達した時点で一次腫瘍のみに薬物投与を行った。
【0134】
その結果、図３０に示すように、図２３の結果と同様に、ｃＧＡＭＰ（ｃＧ）単独投与と比較して、式（１）の化合物との併用処理により、一次腫瘍において腫瘍成長が抑制され、最終腫瘍質量が減少することが確認された。さらに、薬物を直接注入しなかった二次癌においても腫瘍死が効果的に起こることが最終的に確認した。従って、この結果から、式（１）の化合物は、生体全体の抗癌免疫系の構築を効果的に促進させることが確認された。
【0135】
＜１１－５＞式（１）の化合物及び免疫チェックポイント治療剤との併用による処理効果の確認
式（１）の化合物の全身性抗癌免疫系の構築効能から、既存の免疫チェックポイント治療剤と併用して処理した場合にその効能が増大するかどうかを確認した。このため、図３１に示すように、免疫チェックポイント治療剤であるＰＤ－１抗体を３日に１回静脈内投与し、式（１）の化合物は４日に１回癌に直接注入した後、腫瘍の成長及び重量を測定した。
式（１）の化合物の全身性抗癌免疫系の構築効能から、既存の免疫チェックポイント治療剤と併用して処理した場合にその効能が増大するかどうかを確認した。このため、図３１に示すように、免疫チェックポイント治療剤であるＰＤ－１抗体を３日に１回静脈内投与し、式（１）の化合物は４日に１回癌に直接注入した後、腫瘍の成長及び重量を測定した。
【0136】
その結果、図３２に示すように、ＰＤ－１抗体と式（１）の化合物を併用処理した場合、ＰＤ－１抗体を単独で処理した場合と比較して、濃度依存的に腫瘍成長及び最終腫瘍重量が減少することが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【配列表】
【国際調査報告】