(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】肝細胞の作製
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240822BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240822BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240822BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240822BHJP
A61K 35/407 20150101ALI20240822BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240822BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071 ZNA
C12N5/10
C12N15/867 Z
C12Q1/02
A61K35/407
A61P1/16
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024514685
(86)(22)【出願日】2022-09-12
(85)【翻訳文提出日】2024-04-19
(86)【国際出願番号】 EP2022075292
(87)【国際公開番号】W WO2023036983
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】2112937.4
(32)【優先日】2021-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510171586
【氏名又は名称】ケンブリッジ エンタープライズ リミテド
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】ルドビック バルリエル
(72)【発明者】
【氏名】ルーテ アレクサンドラ デ コスタ トマズ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QR48
4B063QR72
4B063QR77
4B063QR90
4B063QS36
4B063QS38
4B063QX01
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB52
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZA75
(57)【要約】
本発明は、肝細胞を作製する方法であって、ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；Ｆ０ＸＡ３；ＲＯＲｃ及びＥＲａからなる一組の転写因子をＩＰＳＣ集団に導入すること、及び集団を培養することを含み、そのようにして肝細胞が作製される方法に関する。肝細胞を作製する方法、その方法によって作製された肝細胞並びにその使用及び適用が提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肝細胞を作製する方法であって、（ｉ）ｉＰＳＣ集団を提供すること
（ｉｉ）ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及び任意選択でＥＲαからなる一組の転写因子を前記ｉＰＳＣ集団に導入すること、及び
（ｉｉｉ）前記集団を培養することを含み、そのようにして前記集団中の１つ以上の細胞が肝細胞になるようにプログラミングされる、方法。
【請求項2】
前記一組の転写因子が、ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及びＥＲαからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記一組の転写因子が、ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；及びＲＯＲｃからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記肝細胞が機能的に成熟している、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記転写因子がヒト転写因子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記細胞集団が、好適な条件下で、１つ以上の細胞が肝細胞表現型を呈することが可能となるのに十分な時間にわたって培養される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ステップ（ｉｉｉ）の間、前記集団中の前記細胞が、内胚葉及び肝前駆細胞表現型を呈しない、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記一組の転写因子が、（ａ）前記転写因子の組み合わせをコードする核酸を前記ＰＳＣにおいて発現させること；
（ｂ）前記ＰＳＣを前記転写因子ｍＲＮＡ又はタンパク質の組み合わせと接触させること；又は
（ｃ）前記ＰＳＣにおける前記転写因子の組み合わせをコードする遺伝子の内因性発現を活性化させること
によって前記ＰＳＣに導入される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記一組の転写因子をコードする核酸が、前記ＰＳＣにおける前記核酸の発現に関する１つ以上の調節エレメントに作動可能に連結された前記核酸を含む１つ以上のベクターを前記ＰＳＣにトランスフェクトすることにより前記ＰＳＣにおいて発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記１つ以上の調節エレメントが誘導性調節エレメントである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＰＳＣ集団が少なくとも７日間にわたって培養される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ステップ（ｉｉｉ）の後、前記集団の少なくとも５％が肝細胞になるようにフォワードプログラミングされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
肝細胞を単離すること及び／又は精製することを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記肝細胞集団を拡大培養することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記肝細胞集団を貯蔵することを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法によって作製される肝細胞集団。
【請求項20】
請求項１９に記載の肝細胞集団と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項21】
ヒト又は動物の身体を治療する方法における使用のための請求項１９に記載の肝細胞集団。
【請求項22】
個体の肝障害を治療する方法における使用のための請求項１９に記載の肝細胞集団。
【請求項23】
肝障害を治療する方法であって、請求項１９に記載の肝細胞集団をそれを必要としている個体に投与すること
を含む方法。
【請求項24】
肝障害の治療における使用のための医薬品の製造における請求項１９に記載の肝細胞集団の使用。
【請求項25】
ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及び任意選択でＥｒαからなる一組の転写因子；又は前記一組の転写因子をコードする１つ以上の核酸の；肝細胞を作製するための使用。
【請求項26】
肝障害の治療において有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１９に記載の肝細胞集団を試験化合物と接触させること、及び；
前記試験化合物が前記肝細胞に及ぼす効果又は前記肝細胞が前記試験化合物に及ぼす効果を決定すること
を含む方法。
【請求項27】
化合物の肝毒性を決定する方法であって、請求項１９に記載の単離された肝細胞の細胞を試験化合物と接触させること、及び；
前記試験化合物が前記肝細胞に及ぼす効果を決定すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
資金提供
本願につながるプロジェクトは、欧州連合のホライズン２０２０（Ｈｏｒｉｚｏｎ ２０２０）研究・イノベーションプログラム（助成金契約第７４１７０７号）に基づく欧州研究会議（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ：ＥＲＣ）からの資金提供を受けている。
本願につながるプロジェクトは、欧州連合のホライズン２０２０（Ｈｏｒｉｚｏｎ ２０２０）研究・イノベーションプログラム（助成金契約第７４１７０７号）に基づく欧州研究会議（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ：ＥＲＣ）からの資金提供を受けている。
【0002】
分野
本発明は、肝細胞の作製方法、そうした方法によって作製された肝細胞並びにそうした肝細胞の使用及び適用に関する。
本発明は、肝細胞の作製方法、そうした方法によって作製された肝細胞並びにそうした肝細胞の使用及び適用に関する。
【背景技術】
【0003】
肝細胞は、肝臓の主要な細胞型であって、その体積の８０％を占め、脂質代謝、多量栄養素の貯蔵、血漿タンパク質の分泌及び生体異物解毒を含めた無数の生体維持機能を果たしている（Ｇｏｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｔｒｅｆｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0004】
これらの機能を冒す疾患は、生命を脅かすものであり、末期形態では肝移植が必要になる。しかしながら、ドナー不足及び免疫抑制の副作用に起因して、この療法から利益を受けることのできる患者の数はごく限られている。
【0005】
初代肝細胞を使用した細胞ベースの療法は、全臓器移植に代わる魅力的な治療選択肢であることが既に見出されている（Ｄｈａｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。しかしながら、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）は、それを移植に適さない準最適な肝臓からしか入手できないため、不足している。更には、ＰＨＨは、インビトロでの短命、増殖の欠如及び急速な機能喪失を呈する（Ｍｉｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００２）。同様に、創薬及び薬物スクリーニング検査用の新規プラットフォームの開発も、ロバストな肝細胞供給源が不足している影響を大いに受ける。こうした理由全てから、代替的な肝細胞供給源が喫緊に必要とされている。
【0006】
定方向分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの肝細胞の作製が、ＰＨＨに代わる有利な選択肢であることが示されている（Ｐａｌａｋｋａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｚｋｏｌｎｉｃｋａ ＆ Ｈａｙ，２０１６；Ｓｉｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ ２００８）。これらのプロトコルは、通常、インビトロで主要な肝発生段階をたどり、アルブミン分泌、脂質代謝、グリコーゲン貯蔵、及び尿素サイクル活性を含めた主要な肝機能を呈する肝細胞様細胞（ＨＬＣ）の作製が可能である。しかしながら、ＨＬＣは、成熟肝細胞の完全な機能レパートリーを欠く未熟な／胎児様の表現型を系統的に示す（Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｇｒａｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｙｉａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。インビトロでの完全に機能性の肝細胞の開発は、インビボでの機能的成熟を駆動する分子機構に関して詳細な知識が不足しているため、難題である。実際、この過程は胎児期の間に徐々に起こるが、出生後にも起こり、肝臓が機能性になるまでにはほぼ１２ヵ月かかる。この時系列並びに関連する代謝変化、酸素への曝露、栄養素及びマイクロバイオームの組み合わせを模倣することが、ダイレクト分化プロトコルの大きな課題ということになる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
【0007】
代替法として、転写因子の過剰発現が、インビトロで作成される肝細胞の機能性を向上させる方法として調査されている（Ｂｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｎａｋａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。その上、体細胞から肝臓細胞への分化転換が、マウス及びヒト線維芽細胞において肝臓に豊富に存在する転写因子（ＬＥＴＦ）の過剰発現により実現している（Ｒｏｍｂａｕｔ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。重要なことに、これらのＬＥＴＦは、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３（ＦＯＸＡ）、ＨＮＦ４及びＨＮＦ６（ＯＮＥＣＵＴ）ファミリーを含み、そのいずれもが、肝発生の協調において主要な役割を果たす（Ｇｏｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｓｃｈｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）。しかしながら、体細胞型からの直接的な細胞変換は、完全に分化した細胞に見られる強度のエピジェネティックな制限に起因して効率／収率が低い。更には、体細胞は増殖能が限られているため、癌遺伝子の操作を用いない肝細胞の大規模生産には限界がある（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、ヒト多能性細胞のフォワードプログラミングによって機能的に成熟した肝細胞（本明細書ではＦｏＰ－Ｈｅｐｓと称される）を作製する方法を開発した。これは、例えば、肝障害のモデル化；及び肝障害の治療薬の開発における使用のための、機能性の肝細胞の効率的な作製において、例えば、有用であり得る。
【0009】
本発明の第１の態様は、肝細胞を作製する方法であって、
（ｉ）ｉＰＳＣ集団を提供すること
（ｉｉ）ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及びＥＲαからなる一組の転写因子をｉＰＳＣ集団に導入すること、及び
（ｉｉｉ）集団を培養することを含み、そのようにして肝細胞が作製される
方法を提供する。
（ｉ）ｉＰＳＣ集団を提供すること
（ｉｉ）ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及びＥＲαからなる一組の転写因子をｉＰＳＣ集団に導入すること、及び
（ｉｉｉ）集団を培養することを含み、そのようにして肝細胞が作製される
方法を提供する。
【0010】
本発明の第２の態様は、ｉＰＳＣを肝細胞にフォワードプログラミングする方法であって、
ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及びＥＲαからなる一組の転写因子をｉＰＳＣ集団に導入すること、及び
集団を培養することを含み、そのようにして肝細胞が作製される
方法を提供する。
ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及びＥＲαからなる一組の転写因子をｉＰＳＣ集団に導入すること、及び
集団を培養することを含み、そのようにして肝細胞が作製される
方法を提供する。
【0011】
本発明の第３の態様は、肝細胞を作製する方法であって、
（ｉ）ｉＰＳＣ集団を提供すること
（ｉｉ）ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；及びＲＯＲｃからなる一組の転写因子をｉＰＳＣ集団に導入すること、及び
（ｉｉｉ）集団を培養することを含み、そのようにして肝細胞が作製される
方法を提供する。
（ｉ）ｉＰＳＣ集団を提供すること
（ｉｉ）ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；及びＲＯＲｃからなる一組の転写因子をｉＰＳＣ集団に導入すること、及び
（ｉｉｉ）集団を培養することを含み、そのようにして肝細胞が作製される
方法を提供する。
【0012】
本発明の第４の態様は、ｉＰＳＣを肝細胞にフォワードプログラミングする方法であって、
ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；及びＲＯＲｃからなる一組の転写因子をｉＰＳＣ集団に導入すること、及び
集団を培養することを含み、そのようにして肝細胞が作製される
方法を提供する。
ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；及びＲＯＲｃからなる一組の転写因子をｉＰＳＣ集団に導入すること、及び
集団を培養することを含み、そのようにして肝細胞が作製される
方法を提供する。
【0013】
本発明の第５の態様は、第１、第２、第３又は第４の態様に係る方法によって作製された肝細胞集団を提供する。
【0014】
本発明の第６の態様は、第５の態様に係る肝細胞集団と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0015】
本発明の第７の態様は、ヒト又は動物の身体の治療方法における使用のための、例えば個体の肝障害の治療方法における使用のための第５の態様に係る肝細胞集団を提供する。
【0016】
本発明の第８の態様は、肝障害を治療する方法であって、
第５の態様に係る肝細胞集団を、それを必要としている個体に投与すること
を含む方法を提供する。
第５の態様に係る肝細胞集団を、それを必要としている個体に投与すること
を含む方法を提供する。
【0017】
本発明の第９の態様は、肝障害の治療における使用のための医薬品の製造における第５の態様に係る肝細胞集団の使用を提供する。
【0018】
本発明の第１０の態様は、肝障害の治療において有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
第５の態様に係る肝細胞集団を試験化合物と接触させること、及び；
試験化合物が前記肝細胞に及ぼす効果又は肝細胞が試験化合物に及ぼす効果を決定すること
を含む方法を提供する。
第５の態様に係る肝細胞集団を試験化合物と接触させること、及び；
試験化合物が前記肝細胞に及ぼす効果又は肝細胞が試験化合物に及ぼす効果を決定すること
を含む方法を提供する。
【0019】
一部の実施形態において、第１０の態様の方法における使用のための肝細胞は、肝障害表現型など、疾患表現型を有し得る。
【0020】
本発明の第１１の態様は、化合物の肝毒性を決定する方法であって、
第５の態様に係る単離された肝細胞の細胞を試験化合物と接触させること、及び；
試験化合物が前記肝細胞に及ぼす効果を決定すること
を含む方法を提供する。
第５の態様に係る単離された肝細胞の細胞を試験化合物と接触させること、及び；
試験化合物が前記肝細胞に及ぼす効果を決定すること
を含む方法を提供する。
【0021】
本発明の第１２の態様は、肝細胞成熟を促進する転写因子を同定する方法であって、
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）及びインビトロ定方向分化によって作製された肝細胞様細胞（ＨＬＣ）における一組の転写因子の発現を決定すること、
一組の中でＣＬＣと比べてＰＨＨにおいて発現が増加している転写因子を同定すること
を含み、
同定された転写因子が、肝細胞成熟を促進するための転写因子候補である、
方法を提供する。
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）及びインビトロ定方向分化によって作製された肝細胞様細胞（ＨＬＣ）における一組の転写因子の発現を決定すること、
一組の中でＣＬＣと比べてＰＨＨにおいて発現が増加している転写因子を同定すること
を含み、
同定された転写因子が、肝細胞成熟を促進するための転写因子候補である、
方法を提供する。
【0022】
本発明の第１３の態様は、肝障害に関連する遺伝子突然変異を同定する方法であって、
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、各々遺伝子突然変異を含むこと；
表現型について試験肝細胞集団を対照肝細胞集団と比較することであって、対照集団が遺伝子突然変異を含まないこと；及び
試験集団の中で、肝障害表現型など、疾患表現型を呈する肝細胞を同定すること
を含み、
同定された肝細胞の遺伝子突然変異が、肝障害に関連する遺伝子突然変異候補である、
方法を提供する。
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、各々遺伝子突然変異を含むこと；
表現型について試験肝細胞集団を対照肝細胞集団と比較することであって、対照集団が遺伝子突然変異を含まないこと；及び
試験集団の中で、肝障害表現型など、疾患表現型を呈する肝細胞を同定すること
を含み、
同定された肝細胞の遺伝子突然変異が、肝障害に関連する遺伝子突然変異候補である、
方法を提供する。
【0023】
本発明の第１４の態様は、肝障害に関連する遺伝子突然変異を同定する方法であって、
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、肝障害表現型など、疾患表現型を呈すること；及び
ゲノム配列について試験肝細胞集団を対照肝細胞集団と比較することであって、対照集団中の肝細胞が疾患表現型を呈しないこと；及び
対照集団と比べて試験集団のゲノム配列にある１つ以上の遺伝子突然変異を同定すること
を含み、
同定された１つ以上の遺伝子突然変異が、肝障害に関連する遺伝子突然変異候補である、
方法を提供する。
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、肝障害表現型など、疾患表現型を呈すること；及び
ゲノム配列について試験肝細胞集団を対照肝細胞集団と比較することであって、対照集団中の肝細胞が疾患表現型を呈しないこと；及び
対照集団と比べて試験集団のゲノム配列にある１つ以上の遺伝子突然変異を同定すること
を含み、
同定された１つ以上の遺伝子突然変異が、肝障害に関連する遺伝子突然変異候補である、
方法を提供する。
【0024】
本発明の第１５の態様は、肝障害に関連する遺伝子を同定する方法であって、
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、肝障害表現型など、疾患表現型を呈すること；及び
試験肝細胞集団における１つ以上の遺伝子の発現を、対照肝細胞集団における１つ以上の遺伝子の発現と比較すること
を含み、
対照集団と比べた試験集団におけるある遺伝子の発現の差が、その遺伝子が肝障害に関連することを指し示している、
方法を提供する。
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、肝障害表現型など、疾患表現型を呈すること；及び
試験肝細胞集団における１つ以上の遺伝子の発現を、対照肝細胞集団における１つ以上の遺伝子の発現と比較すること
を含み、
対照集団と比べた試験集団におけるある遺伝子の発現の差が、その遺伝子が肝障害に関連することを指し示している、
方法を提供する。
【0025】
第１３～第１５の態様の方法における使用に好適な試験肝細胞集団は、肝障害を有する個体に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から第１～第４の態様の方法によって作製されてもよい。
【0026】
本発明の第１６の態様は、肝細胞を作製するためのキットであって、
（ｉ）ｉＰＳＣ供給源細胞及び少なくとも３つ又はそれ以上の転写因子を活性化させる、又はその発現若しくは量を増加させる薬剤；及び／又は
（ｉｉ）ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及び任意選択でＥｒαからなる一組の転写因子をコードする１つ以上の核酸
を含むキットを提供する。
（ｉ）ｉＰＳＣ供給源細胞及び少なくとも３つ又はそれ以上の転写因子を活性化させる、又はその発現若しくは量を増加させる薬剤；及び／又は
（ｉｉ）ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及び任意選択でＥｒαからなる一組の転写因子をコードする１つ以上の核酸
を含むキットを提供する。
【0027】
第１６の態様のキットは、例えば第１～第４の態様の方法において有用であり得る。
【0028】
本発明の他の態様及び実施形態について、以下に更に詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】４つ及び３つの肝臓に豊富に存在する転写因子（ＬＥＴＦ）と併せた肝細胞へのｈＰＳＣのフォワードプログラミングを示す。（Ａ）２つの順次標的化される遺伝子座の概略表現。ヒトＲＯＳＡ２６は、構成的に発現するリバーステトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）で標的化した。ＡＡＶＳ１遺伝子座は、Ｔｅｔ応答エレメント（ＴＥＴ）の下流にあるＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ４Ａの４つのＬＥＴＦで標的化した。（Ｂ）ｄｏｘで２４時間刺激した、非標的（Ｕｎｔａｒｇ）ｈＥＳＣと比べた標的ｈＥＳＣ（Ｔａｒｇ）における４つの因子のｍＲＮＡ誘導レベル（ｎ＝３）。データは、非標的対照に対する相対で示す。（Ｃ）トランス遺伝子の誘導を確認するｄｏｘによる２４時間の誘導性過剰発現（ｉＯＸ）後の標的及び非標的ｈＥＳＣにおける４つのＬＥＴＦの免疫蛍光染色。ＤＡＰＩ（青色）で核を対比染色した。スケールバー、２００μｍ。（Ｄ）フォワードプログラミングのためのｉＯＸ培養条件の概略表現。１０及び１５日間のフォワードプログラミング後の４つのＬＥＴＦで標的化したｈＥＳＣの位相差画像。（Ｅ）１０及び１５日間のフォワードプログラミング後の４つのＬＥＴＦで標的化したｈＥＳＣにおける肝細胞マーカー（ＡＬＢ、ＳＥＲＰＩＮＡ１及びＡＦＰ）のｍＲＮＡレベル。（Ｄ）にあるのと同じプロトコルで処理した非標的ｈＥＳＣを対照として使用した（ｎ＝４）。統計学的差異は、非標的に対する対応のないｔ検定で計算したものであり、各比較についてｐ値を表示する。（Ｆ）１５日間のフォワードプログラミング後の４つのＬＥＴＦによる非標的及び標的ｈＥＳＣ（ｎ＝５）及びダイレクト分化によって作成したＨＬＣ（ｎ＝６）における細胞数（１００万）で正規化したＣＹＰ３Ａ４活性レベル。標的細胞と非標的細胞との間の統計学的差異は、対応のないｔ検定で計算した。（Ｇ、Ｈ、Ｉ）４つのＬＥＴＦ及び３つのＬＥＴＦの組み合わせで標的化したｈＥＳＣにおける肝細胞マーカー（ＡＬＢ、ＳＥＲＰＩＮＡ１及びＡＦＰ）のｍＲＮＡレベル（ｎ＝４）。各構築物から取り除いた因子を指示する。発現レベルは、１０、１５、２０及び２５日間のフォワードプログラミング後に決定した。統計学的差異は、４つのＬＥＴＦと比較した多重比較の補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡで計算した。各時点における有意なｐ値を示す。ｍＲＮＡレベルは全て、２つのハウスキーピング遺伝子（ＰＢＧＤ及びＲＰＬＰ０）の平均で正規化した。（Ｊ）１０、１５、２０及び２５日間のフォワードプログラミング後の４つのＬＥＴＦ及び３つのＬＥＴＦの組み合わせで標的化したｈＥＳＣにおける細胞数（１００万）で正規化したＣＹＰ３Ａ４活性レベル（ｎ＝３～５）。統計学的差異は、４つのＬＥＴＦと比較した多重比較の補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡで計算した。各時点における有意なｐ値を示す。全てのプロットにおいて、バーは平均値とＳＤを表し、全てのバイオロジカルレプリケートについて、個々のデータ点が示される。
【図2】ＨＬＣ及びＰＨＨが、その成熟状態に関連したトランスクリプトームの差異を呈することを示す。（Ａ）３０日間分化させたＨＬＣにおけるアルブミン（黄色）及びＨＮＦ４Ａ（赤色）の免疫蛍光染色。ＤＡＰＩ（青色）で核を対比染色した。スケールバー、１００μｍ。（Ｂ）３０日間分化させたＨＬＣ（ｎ＝６）及びＰＨＨ（ｎ＝４）における細胞数（１００万）で正規化したＣＹＰ３Ａ４活性レベル。バーは平均値とＳＤを表し、個々のデータ点は、異なるバイオロジカルレプリケートを表す。統計学的差異は、対応のないｔ検定で計算した。（Ｃ）未分化ｈｉＰＳＣ、ｈＥＳＣ（ｈＥＳＣ＿ＨＬＣ）及びｈｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ＿ＨＬＣ）に由来するＨＬＣ、回収直後のＰＨＨ（ｆＰＨＨ）又はプレーティング後のＰＨＨ（ｐＰＨＨ）のＰＣＡ。（Ｄ）各細胞型（クラスター１－ＰＨＨ、クラスター２－ＨＬＣ、クラスター４－ｈｉＰＳＣ）並びに未分化ｈｉＰＳＣに対するＨｅｐ（ＨＬＣ及びＰＨＨ）（クラスター３）における発現差のある遺伝子の比率を示すヒートマップ。（Ｅ、Ｆ）（Ｄ）に示されるとおりのクラスター１及びクラスター３に結び付けられる遺伝子に関する遺伝子オントロジーエンリッチメント解析での上位１５ヒットを示すドットプロット。各ドットのサイズが、各タームに結び付けられる遺伝子の数を表し、色が調整ｐ値を表す。（Ｇ）ＰＨＨ（直後、又はプレーティング後）及びＨＬＣ（ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来）の間で差のある転写因子遺伝子発現を示すヒートマップ。（Ｈ）（Ｇ）で同定された転写因子に関するリアクトームパスウェイエンリッチメント解析。差のある遺伝子発現は、２より大きいｌｏｇ２（変化倍数）及び調整ｐ値０．０５未満で計算した。試料に関する階層クラスタリングは、ユークリッド距離によって作成した。
【図3】調節領域のエピジェネティック状態がＨＬＣ及びＰＨＨの成熟状態間で異なることを示す。（Ａ）未分化ｈｉＰＳＣ、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来のＨＬＣ、並びにＰＨＨの２レプリケートにわたるＨ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３のグローバルエンリッチメントプロファイルのＰＣＡ。ゲノム全体について１０００ｂｐのゲノム領域の平均スコアを計算した。（Ｂ）Ｈ３Ｋ２７ａｃ ＰＨＨにユニークな領域（青色）又はＨＬＣにユニークな領域（緑色）を中心とする１０Ｋｂウィンドウの範囲内でのＨ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３のエンリッチメントレベルを示す平均密度プロット及びヒートマップ。スケールは、各データセットの最大ピーク強度で調整する。（Ｃ）ＵＧＴ１Ａ遺伝子座にわたるＨ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３のエンリッチメントプロファイル。プロファイルは、未分化ｈｉＰＳＣ、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来のＨＬＣ、並びにＰＨＨの１レプリケートについて示す。赤色のバーは、ＰＨＨにユニークなＨ３Ｋ２７ａｃピークを表す。（Ｄ）Ｈ３Ｋ２７ａｃ ＰＨＨにユニークな領域に過剰に出現する結合部位として同定された核内受容体モチーフ。
【図4】肝細胞への核内受容体を伴うｈＥＳＣのフォワードプログラミングを示す。３ＴＦ単独で、又は核内受容体ＲＯＲｃ、ＥＲａ及びＡＲと組み合わせて２０日間フォワードプログラミングしたｈＥＳＣにおける（Ａ）位相差画像及び（Ｂ）アルブミン（黄色）及び（Ｃ）Ａ１ＡＴ（緑色）に関する免疫蛍光染色。ＤＡＰＩ（青色）で核を対比染色した。スケールバー、２００μｍ。（Ｄ）２０及び３０日間にわたって３ＴＦ単独で、又は核内受容体と組み合わせて作成したＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおける肝細胞マーカー（ＡＬＢ、ＳＥＲＰＩＮＡ１及びＡＦＰ）のｍＲＮＡレベル（ｎ＝４）。発現データは、２つのハウスキーピング遺伝子（ＰＢＧＤ及びＲＰＬＰ０）の平均で正規化した。（Ｅ）２０日間にわたって３ＴＦ単独で、又は核内受容体と組み合わせて作成したｈＥＳＣ由来のＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおけるアルブミン、Ａ１ＡＴ及びＡＦＰのタンパク質分泌レベル（ｎ＝４）。データは総細胞数（１００万）で正規化した。（Ｆ）２０及び３０日間のフォワードプログラミング後の、核内受容体と共に及びそれ無しで３ＴＦによって標的化したＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおける細胞数（１００万）で正規化したＣＹＰ３Ａ４活性レベル（ｎ＝３～６）。統計学的差異は、３ＴＦ（２０日目）と比較した多重比較の補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡで計算した。有意なｐ値を示す。（Ｇ）２日目から指示されるとおりの１００ｎＭのリガンドで処理したＦｏＰ－ＨｅｐｓにおけるＣＹＰ３Ａ４誘導倍数レベル。データはフォワードプログラミング２０日目の未処理対照で正規化する（ｎ＝３）。対応のあるｔ検定についての有意なｐ値を示す。全てのプロットにおいて、バーは平均値とＳＤを表し、全てのバイオロジカルレプリケートについて、個々のデータ点が示される。
【図5】４ＴＦによる肝細胞へのｈｉＰＳＣのフォワードプログラミングを示す。３ＴＦ単独で、又は加えてＲＯＲｃと共に２０日間フォワードプログラミングしたｈｉＰＳＣにおける（Ａ）位相差画像及び（Ｂ）アルブミン（黄色）及び（Ｃ）Ａ１ＡＴ（緑色）に関する免疫蛍光染色。ＤＡＰＩ（青色）で核を対比染色した。スケールバー、２００μｍ。（Ｄ）２０及び３０日間にわたって３ＴＦ単独で、又は加えてＲＯＲｃと共に２０及び３０日間にわたって作成したｈｉＰＳＣ由来のＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおける肝細胞マーカー（ＡＬＢ、ＳＥＲＰＩＮＡ１及びＡＦＰ）のｍＲＮＡレベル（ｎ＝４）。統計学的差異は、対応のないｔ検定で計算したものであり、有意なｐ値を示す。発現データは全て、２つのハウスキーピング遺伝子（ＰＢＧＤ及びＲＰＬＰ０）の平均で正規化した。（Ｅ）２０日間にわたって３ＴＦ単独で、又は加えてＲＯＲｃと共に作成したｈｉＰＳＣ由来のＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおけるアルブミン、Ａ１ＡＴ及びＡＦＰのタンパク質分泌レベル（ｎ＝４）。データは総細胞数（１００万）で正規化した。（Ｆ）２０日間のフォワードプログラミング後のＲＯＲｃと共に又はそれ無しで３ＴＦによって標的化したｈｉＰＳＣ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおける細胞数（１００万）で正規化したＣＹＰ３Ａ４活性レベル（ｎ＝６）。統計学的差異は、対応のないｔ検定で計算した。全てのプロットにおいて、バーは平均値とＳＤを表し、全てのバイオロジカルレプリケートについて、個々のデータ点が示される。
【図6】ＲＯＲｃが４ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓの機能性を促進することを示す。（Ａ）ダイレクト分化ＨＬＣ（ｎ＝６）及びＰＨＨ（ｎ＝４）に対するＦｏＰ－Ｈｅｐｓ（ｎ＝６）のＣＹＰ３Ａ４活性レベルの比較。ｈＥＳＣ（ｅＦｏＰ）及びｈｉＰＳＣ（ｉＦｏＰ）由来のＦｏＰ－Ｈｅｐｓを４ＴＦ（ＨＮＦ１Ａ、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ６及びＲＯＲｙ）で標的化し、２０日間フォワードプログラミングした。ＨＬＣとＦｏＰ－Ｈｅｐｓとの間の統計学的差異は、対応のないｔ検定で計算した。（Ｂ）４ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓ、ＨＬＣ及びＰＨＨにおけるフェーズＩ（ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｃ８）及びフェーズＩＩ（ＵＧＴ１Ａ６）生体内変換酵素のｍＲＮＡレベル（ｎ＝４）。（Ｃ）ＦｏＰ－Ｈｅｐｓ、ＨＬＣ及びＰＨＨにおける糖新生（Ｇ６ＰＣ及びＰＣＫ１）、脂質（ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲｙ）代謝、及び核内受容体ＲＯＲｙのｍＲＮＡレベル（ｎ＝４）。ＨＬＣと他の細胞型との間の統計学的差異は、対応のないｔ検定で計算した。（Ｄ）フォワードプログラミング２０日目のＦｏＰ－ＨｅｐｓにおけるＬＤＬ免疫蛍光染色。スケールバー、２００μｍ。ＤＡＰＩ（青色）で核を対比染色した。（Ｅ）最長２０又は３０日間のフォワードプログラミングにわたって２Ｄ及び３Ｄで培養したＦｏＰ－ＨｅｐｓにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１及びＵＧＴ１Ａ６のｍＲＮＡレベルの比較（ｎ＝４）。２Ｄと３Ｄとの間の統計学的差異は、対応のないｔ検定で計算した。発現データは全て、２つのハウスキーピング遺伝子（ＰＢＧＤ及びＲＰＬＰ０）の平均で正規化した。（Ｆ）フォワードプログラミングの２０日目から３Ｄで培養し、指示されるとおりの脂肪酸（オレイン酸［ＯＡ］、パルミチン酸［ＰＡ］又はＢＳＡ［Ｃｔｒ］）で７日間にわたって処理したＦｏＰ－ＨｅｐｓのＢＯＤＩＰＹ染色。スケールバー、２００μｍ。ＤＡＰＩ（青色）で核を対比染色した。（Ｇ）対照としてのＢＳＡで処理したＦｏＰ－Ｈｅｐｓで正規化した、指示されるとおりの脂肪酸で処理したＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおける細胞生存率（ｎ＝４）。（Ｈ）未処理のＦｏＰ－Ｈｅｐｓで正規化した、３Ｄ培養下に２５ｍＭのアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）で４８時間処理したＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおける細胞生存率（ｎ＝４）。有意差は、対応のあるｔ検定で決定した。ｐ値は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として指示される。全てのプロットにおいて、バーは平均値とＳＤを表し、全てのバイオロジカルレプリケートについて個々のデータ点が示される。
【図7】ＥＲαが５ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓの機能性を促進することを示す。（Ａ）ＡＡＶＳ１遺伝子座にクローニングした因子の組み合わせの概略表現。（Ｂ）５ＴＦ単独で又は加えてエストロゲン（Ｅ２）と共に２０日間フォワードプログラミングしたｈｉＰＳＣにおける位相差画像。（Ｃ）２０日間にわたって４ＴＦ、５ＴＦ、又は５ＴＦ＋Ｅ２と共に作成したｈｉＰＳＣ由来のＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおける肝細胞マーカー（ＡＬＢ、ＳＥＲＰＩＮＡ１及びＡＦＰ）のｍＲＮＡレベル（ｎ＝４）。統計学的差異は、対応のないｔ検定で計算したものであり、有意なｐ値を示す。発現データは全て、２つのハウスキーピング遺伝子（ＰＢＧＤ及びＲＰＬＰ０）の平均で正規化した。（Ｄ）４ＴＦ、５ＴＦ及び５ＴＦ＋Ｅ２ ＦｏＰ－ＨｅｐｓにおけるフェーズＩ（ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｃ８）及びフェーズＩＩ（ＵＧＴ１Ａ６）生体内変換酵素及び糖新生酵素（Ｇ６ＰＣ及びＰＣＫ１）のｍＲＮＡレベル（ｎ＝４）。（Ｅ）４ＴＦ、５ＴＦ、又は５ＴＦ＋Ｅ２で作成した、２０日間フォワードプログラミングしたＦｏＰ－ＨｅｐｓにおけるＣＹＰ３Ａ４活性レベルの比較。（Ｆ）フォワードプログラミングの２０日目から３Ｄで培養し、指示されるとおりの脂肪酸（オレイン酸［ＯＡ］、パルミチン酸［ＰＡ］又はＢＳＡ［Ｃｔｒ］）で７日間にわたって処理した５ＴＦで作成したＦｏＰ－ＨｅｐｓのＢＯＤＩＰＹ染色。スケールバー、２００μｍ。ＤＡＰＩ（青色）で核を対比染色した。（Ｇ）対照としてのＢＳＡで処理したＦｏＰ－Ｈｅｐｓで正規化した、５ＴＦで作成し、及び指示されるとおりの脂肪酸で処理したＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおける細胞生存率（ｎ＝４）。
【発明を実施するための形態】
【0030】
詳細な説明
本発明は、多能性細胞から肝細胞へのフォワードプログラミングに関する。ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及び任意選択でＥＲαからなる一組の転写因子が多能性細胞に導入される。次にその多能性細胞が培養される。細胞に導入された一組の転写因子は、多能性細胞に成熟肝細胞表現型を付与し、即ち、多能性細胞集団は、その一組の転写因子によって機能的に成熟した肝細胞へとフォワードプログラミングされる。こうした肝細胞は、例えば、疾患のモデル化、薬物スクリーニング及び治療方法において有用であり得る。
本発明は、多能性細胞から肝細胞へのフォワードプログラミングに関する。ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及び任意選択でＥＲαからなる一組の転写因子が多能性細胞に導入される。次にその多能性細胞が培養される。細胞に導入された一組の転写因子は、多能性細胞に成熟肝細胞表現型を付与し、即ち、多能性細胞集団は、その一組の転写因子によって機能的に成熟した肝細胞へとフォワードプログラミングされる。こうした肝細胞は、例えば、疾患のモデル化、薬物スクリーニング及び治療方法において有用であり得る。
【0031】
フォワードプログラミングは、多能性幹細胞又は他の前駆細胞に、より分化の進んだ表現型を直接付与するものであり、正常な分化経路を回避する；即ち細胞は中間的な分化段階を漸次通過するのではない。例えば、肝細胞へとフォワードプログラミングされる多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、内胚葉、前腸、肝芽細胞及び胎児肝細胞の段階を順次経て分化した後に成熟肝細胞表現型を呈するのではない。ＰＳＣにおいて転写因子を直接過剰発現させることによるフォワードプログラミングは、ニューロン、骨格筋細胞、及びオリゴデンドロサイトの作成への使用が成功している（Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0032】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、インビトロで自己複製能を有し、未分化の表現型を呈し、且ついかなる胎児又は成体細胞型の３胚葉（内胚葉、中胚葉及び内胚葉）のいずれにも分化する潜在的能力を有する。多能性幹細胞は全能性幹細胞とは区別され、胚体外細胞系列を生じさせることはできない。ＰＳＣの集団はクローナルであってよく、即ち、単一の共通する祖先細胞の子孫である遺伝学的に同一の細胞である。ＰＳＣは、以下の多能性関連マーカー：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＰＯＵ５ｆ１、ＳＳＥＡ－３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、ＫＬＦ－４及びｃ－ｍｙｃのうちの１つ以上、好ましくは、ＰＯＵ５ｆ１、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２のうちの１つ以上を発現し得る。ＰＳＣは、Ｂｒａ、Ｓｏｘ１７、ＦｏｘＡ２、αＦＰ、Ｓｏｘ１、ＮＣＡＭ、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ１及びＣＤＸ２など、特定の分化運命に関連するマーカーを欠いていてもよい。詳細には、ＰＳＣは、内胚葉運命に関連するマーカーを欠いていてもよい。
【0033】
好ましくは、ＰＳＣは、ヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）である。
【0034】
ＰＳＣには、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び非胚性幹細胞、例えば、胎児幹細胞、成体幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が含まれ得る。一部の実施形態において、ＰＳＣはヒト胚性幹細胞ではない。一部の実施形態において、ＰＳＣはヒト胚細胞ではない。ＰＳＣを作成する好適な技法は、当該技術分野において周知である。
【0035】
好ましくは、ＰＳＣは、ｉＰＳＣ、より好ましくはヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。
【0036】
ｉＰＳＣは、非多能性の完全に分化した祖先又は先祖細胞に由来する多能性細胞である。好適な祖先細胞としては、成体線維芽細胞及び末梢血細胞など、体細胞が挙げられる。祖先細胞は、典型的には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＳｏｘ１など、多能性遺伝子又はタンパク質を細胞に導入することによってリプログラミングされる。こうした遺伝子又はタンパク質は、プラスミド又はより好ましくは、ウイルストランスフェクション又はタンパク質への直接送達を含め、任意の好適な技術により、分化した細胞に導入し得る。誘導効率を高めるため、他の遺伝子、例えば、Ｋｌｆ－１、－２、－４及び－５など、Ｋｌｆ遺伝子；Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ及びＮ－ｍｙｃなど、Ｍｙｃ遺伝子；ｎａｎｏｇ；及びＬｉｎ２８もまた細胞に導入し得る。多能性遺伝子又はタンパク質の導入後、祖先細胞を培養し得る。多能性マーカーを発現する細胞を単離し、及び／又は精製することにより、ｉＰＳＣ集団を作製し得る。ｉＰＳＣの作製技法は当該技術分野において周知である（Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２００７；４４８：３１３－７；Ｙａｍａｎａｋａ ６ ２００７ Ｊｕｎ ７；１（１）：３９－４９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊｕｌ ３１；４５４（７２０４）：６４６－５０；Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｎｏｖ ３０；１３１（５）：８６１－７２．Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊａｎ １０；４５１（７１７５）：１４１－６；Ｋｉｍｅｔ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊｕｎ ５；４（６）：４７２－６；Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００９．９９９９（９９９Ａ）：ｐ．Ｎ／Ａ）。
【0037】
本方法における使用のためのｉＰＳＣは、正常な（即ち非疾患関連の）遺伝子型を有する線維芽細胞又は血液細胞などの体細胞、例えば正常な遺伝的背景の個体、例えば遺伝的障害のない個体から入手された細胞に由来し得る。こうしたｉＰＳＣを使用して、例えば、治療、モデル化、スクリーニング又は他の適用における使用のための、正常な（即ち非疾患関連の）遺伝子型の肝細胞を作製し得る。
【0038】
本方法の一部の実施形態における使用のためのｉＰＳＣは、遺伝的背景が特徴的に異なる個体から入手された体細胞又は他の先祖細胞に由来し得る。例えば、ｉＰＳＣは、疾患状態を有する個体、疾患状態の高いリスクを有する個体及び／又は疾患状態のリスクが低い個体からの細胞から作製されてもよい。疾患状態には、肝障害、例えばヘパトパシー又は他の肝臓に関連する障害が含まれ得る。遺伝的背景が特徴的に異なる個体から入手された細胞から作製されたｉＰＳＣを使用すると、その遺伝的背景を備える肝細胞を作製することができ、こうした肝細胞は、肝障害など、疾患状態の機構の研究に、及び治療標的の同定に有用であり得る。
【0039】
ＰＳＣの培養及び維持には、従来技法を利用し得る（Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７５，４０３－４２１（２００４）、Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０，１３５３－１３５６（２００４）、Ｊｏａｎｎｉｄｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４，２３０－２３５（２００６） Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３６５，１６３６－１６４１（２００５）、Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４，１８５－１８７（２００６））。本方法における使用のためのＰＳＣは、規定条件で、又はフィーダー細胞上で成長させてもよい。例えば、ＰＳＣは従来、培養皿内の適切な密度（例えば１０５～１０６細胞／６０ｍｍ培養皿）の照射マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）などのフィーダー細胞層上で、又はフィーダー馴化培地若しくは規定培地を含む適切な基質上で培養されてもよい。本方法における使用のための多能性細胞は、酵素的又は機械的手段によって継代されてもよい。
【0040】
好ましい実施形態において、本方法における使用のためのＰＳＣは、化学組成が規定されている培養培地で培養されてもよい。
【0041】
化学組成規定培地は、細胞を培養するための栄養溶液であって、指定された成分のみ、好ましくは既知の化学構造の成分のみを含有する溶液である。化学組成規定培地は、フィーダー細胞、間質細胞、血清、血清アルブミン及びｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）など、複合的な細胞外マトリックスなど、不定の成分又は不定の成分を含む構成要素を欠いている。一部の実施形態において、化学組成規定培地はヒト化される。ヒト化された化学組成規定培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びマウス又は他のフィーダー細胞など、非ヒト動物に由来する、又はそれから単離された成分又はサプリメントを欠いている。ヒト化ＣＤＭ中のタンパク質は、組換えヒトタンパク質であってもよい。馴化培地は、培養された細胞からの不定の成分を含み、化学組成が規定されていない。好適な化学組成規定培地は当該技術分野において周知であり、以下に更に詳細に記載する。培地及びその原材料は、商業的供給元（例えば、Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｅｕｒｏｐａｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から入手し得る。
【0042】
一部の実施形態において、化学組成規定培地は、無血清培地サプリメント及び／又は１つ以上の追加の成分、例えば、トランスフェリン、１－チオグリセロール、規定脂質、Ｌ－グルタミン又はＧｌｕｔａＭＡＸ－１（商標）などの代替品、ニコチンアミド、デキサメタゾン、セレン、ピルビン酸塩、ＨＥＰＥＳなどの緩衝液、重炭酸ナトリウム、グルコース並びにペニシリン及びストレプトマイシンなどの抗生物質及び任意選択でポリビニルアルコール；ポリビニルアルコール及びインスリン；血清アルブミン；又は血清アルブミン及びインスリンが補足された化学組成規定基本培地を含み得る。改良型ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ Ｆｏｃｕｓ（２００３）２５ ３－６）、イスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ウィリアムＥ培地及びＲＰＭＩ－１６４０（Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ Ｌ．Ｋ．，（１９７６）Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ．３，５０３－５０８；表３を参照）など、好適な化学組成規定基本培地が当該技術分野において公知であり、商業的供給元（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＭＩ ＵＳＡ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＵＳＡ）から入手可能である。他の好適な化学組成規定基本培地も当該技術分野において公知であり、商業的供給元（例えば Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＭＩ ＵＳＡ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＵＳＡ）から入手可能である。好適な無血清培地サプリメントとしては、Ｂ２７（Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ（１９８９）４９４ ６５－７４；Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３５ ５６７－５７６（１９９３）；Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ Ｆｏｃｕｓ １６ １ ６－９；Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４２：６７４－６８３；Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ（２０１０）２４ １３０－１３７）及びＮＳ２１（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｓ（２００８）１７１ ２３９－２４７）が挙げられる。Ｂ２７及びＮ２１など、無血清培地サプリメントについては、当該技術分野において周知であり、商業的に広く入手可能である（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ）。
【0043】
ＰＳＣの培養における使用に好適な化学組成規定培地としては、インスリン、セレン、トランスフェリン、Ｌ－アスコルビン酸、ＦＧＦ２、及びＴＧＦβ（又はＮＯＤＡＬ又はアクチビン）が補足された、ＮａＨＣＯ３でｐＨ調整済みのＤＭＥＭ／Ｆ１２を含むＥ８培地（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８（５）４２４－Ｕ７６）；及び、例えば０．５μｇ／ｍｌ～７０μｇ／ｍｌのインスリン、例えば１．５μｇ／ｍｌ～１５０μｇ／ｍｌの濃度のトランスフェリン、例えば３０μｇ／ｍｌ～１２０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸、ＦＧＦ２が補足された、ＮａＨＣＯ３でｐＨ調整済みのＤＭＥＭ／Ｆ１２を含むＥ６培地（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８（５）４２４－Ｕ７６）が挙げられる。
【0044】
他の好適な化学組成規定培地としては、ポリビニルアルコール、インスリン、トランスフェリン及び規定脂質が補足された基本培地を含むＣＤＭ－ＰＶＡ（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｅｓ（１９９５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５，１４１－１５１）が挙げられる。例えば、ＣＤＭ－ＰＶＡ培地は、１％の化学組成が規定された脂質濃縮物、４５０μＭ １－チオールグリセロール、１５μｇ／ｍｌトランスフェリン、１ｍｇ／ｍｌポリビニルアルコール、７μｇ／ｍｌインスリンが補足された５０％イスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）＋５０％ハムＦ１２とＧｌｕｔａＭＡＸ－１（商標）又は５０％Ｆ１２ ＮＵＴ－ＭＩＸ（Ｇｉｂｃｏからなり得る。他の好適な化学組成規定栄養培地としては、上記に記載したＣＤＭ－ＰＶＡと同一の、但しＰＶＡが５ｍｇ／ｍｌＢＳＡに置き換えられているｈＥＳＣ維持培地（ＣＤＭＡ）；及びＢ２７及びアクチビン（例えば少なくとも５０ｎｇ／ｍｌ）が補足されたＲＰＭＩ基本培地が挙げられる。ＣＤＭ－ＰＶＡ培地については、Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２００９ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４：ｅ６０８２．ｄｏｉ：１０．１３７１；Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７：２６５５－２６６６，Ｔｏｕｂｏｕｌ ２０１０ ５１：１７５４－１７６５．Ｔｅｏ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．（２０１１）２５：２３８－２５０及びＰｅｔｅｒｓｏｎ ＆ Ｌｏｒｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｕａｌ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ（２０１２）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【0045】
ＰＳＣ集団は、本明細書に記載される方法では、播種培地において１２～３６時間、好ましくは約２４時間培養し得る。好適な播種培地としては、Ｅ８培地が挙げられる。播種培地には、Ｒｈｏ結合コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害薬、例えば、１０μＭ Ｙ－２７６３２など、１～１００μＭ ＲＯＣＫ阻害薬が補足されてもよい。
【0046】
ＰＳＣは、本明細書に記載される方法では、ＰＳＣへの一組の転写因子の導入を通じて肝細胞になるようにフォワードプログラミングされる。この導入により、ＰＳＣにおけるその一組の転写因子の細胞内レベルが増加し、集団中のＰＳＣから肝細胞への変換が誘発される。
【0047】
転写因子は、細胞における遺伝子の発現を調節するＤＮＡ結合タンパク質である。好ましくは、ＰＳＣに導入される転写因子は、ヒト転写因子である。本明細書に記載される方法においてＰＳＣから肝細胞へのフォワードプログラミングに用いられる一組の転写因子は、ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及び任意選択でＥＲαからなる。例えば、一組の転写因子は、ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；及びＲＯＲｃからなってもよく；又は一組の転写因子は、ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及びＥＲαからなってもよい。
【0048】
肝細胞核因子１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ；遺伝子ＩＤ番号６９２７）は、肝臓に豊富に存在する転写因子（ＬＥＴＦ）である。ＨＮＦ１Ａは、ＮＰ＿００５３６．６又はＮＰ＿００１２９３１０８．２の参照アミノ酸配列を有し得るとともに、ＮＭ＿００５４５．８又はＮＭ＿００１３０６１７９．２の参照ヌクレオチドアミノ酸配列によってコードされ得る。
【0049】
肝細胞核因子（ＨＮＦ６；遺伝子ＩＤ ３１７５；別名ワンカットホメオボックス１；ＯＮＥＣＵＴ１））は、肝臓に豊富に存在する転写因子（ＬＥＴＦ）である。ＨＮＦ６は、ＮＰ＿００４４８９．１の参照アミノ酸配列を有し得るとともに、ＮＭ＿００４４９８．４の参照ヌクレオチドアミノ酸配列によってコードされ得る。
【0050】
フォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３；遺伝子ＩＤ：３１７１；別名、肝細胞核因子３－γ ＨＮＦ３Ｇ）は、肝臓に豊富に存在する転写因子（ＬＥＴＦ）である。ＦＯＸＡ３は、ＮＰ＿００４４８８．２の参照アミノ酸配列を有し得るとともに、ＮＭ＿００４４９７．３の参照ヌクレオチドアミノ酸配列によってコードされ得る。
【0051】
ＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（ＲＯＲｃ；遺伝子ＩＤ：６０９７）は、主に免疫細胞に発現する核内転写因子である。ＲＯＲｃは、ＮＰ＿００１００１５２３．１又はＮＰ＿００５０５１．２の参照アミノ酸配列を有し得るとともに、ＮＭ＿００１００１５２３．２又はＮＭ＿００５０６０．４の参照ヌクレオチドアミノ酸配列によってコードされ得る。
【0052】
エストロゲン受容体α（ＥＳＲ１、Ｅｒａ、ＥＲα又はＮＲ３Ａ１；遺伝子ＩＤ：２０９９）は、エストロゲンによって活性化される核内受容体である。ＥＲαは、ＮＰ＿０００１１６．２又はＮＰ＿００１１１６２１２．１の参照アミノ酸配列を有し得るとともに、ＮＭ＿０００１２５．４又はＮＭ＿００１１２２７４０．２の参照ヌクレオチドアミノ酸配列によってコードされ得る
【0053】
本明細書に記載されるとおりの使用に好適な転写因子は、参照データベースアミノ配列又はその変異体を含み得る。好適な変異体は、参照配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有し得る。アミノ酸配列同一性は、概してアルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（商標）、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に従い定義される。ＧＡＰは、ニードルマン・ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ）のアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））を使用して、２つの完全長配列をマッチ数が最大となり、且つギャップ数が最小となるようにアラインメントする。概して、ギャップ生成ペナルティ＝１２及びギャップ伸長ペナルティ＝４のデフォルトパラメータが使用される。ＧＡＰの使用が好ましいものであり得るが、他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ又はＴＢＬＡＳＴＮ（これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５－４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（これは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８の方法を使用する）、又はスミス－ウォーターマンアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）が、概してデフォルトパラメータを用いて使用されてもよい。詳細な配列変異体は、参照配列と比べて１アミノ酸、２、３、４、５～１０、１０～２０又は２０～３０アミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失が異なり得る。
【0054】
好適な転写因子核酸及びタンパク質は、ルーチンの組換え技術を用いて作製されてもよく、又は商業的供給業者（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ；Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ、独国；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）から入手されてもよい。
【0055】
一部の好ましい実施形態において、定義される一組の転写因子は、ＰＳＣに導入される唯一の転写因子である。ＨＮＦ４Ａなど、他の転写因子はＰＳＣに導入されない。
【0056】
他の実施形態において、ＮＲ１、ＣＵＸ２、ＡＲ、ＺＮＦ５５８、ＴＳＨＺ２、ＴＢＸ１５、ＮＦ１Ｘ、ＮＦ１Ｂ、ＡＴＯＨ８、ＺＭＡＴ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＺＮＦ３８５８、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＮＲ１１３、ＮＰＡＳ２、Ｌ３ＭＢＴＬ４、ＪＡＺＦ１、ＮＦ１Ａ、ＺＮＦ６８０、ＨＮＦ４Ｇ、ＣＲＥＢＬ２、ＤＭＲＴＡ１、ＩＲＦ６、ＡＲＩＤ５Ａ、ＳＯＸ５、ＺＢＴＢ２０、ＺＮＦ７０４、ＺＥＢ１、ＺＮＦ３６７、ＮＲ１Ｈ４、ＫＬＦ１５、ＨＬＦ及びＮＲ４Ａ２からなる群から選択される１つ以上の追加の転写因子もまた、一組の転写因子に加えてＰＳＣに導入されてもよい。
【0057】
一組の転写因子は、核酸（Ｗａｒｒｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１０ Ｎｏｖ ５；７（５）：６１８－３０）又はタンパク質（Ｚｈｏｕ Ｈ，ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｍａｙ ８；４（５）：３８１－４）の形態でＰＳＣに導入されてもよい。リプログラミング用の核酸又はタンパク質の導入後、処理された細胞の集団は培養されてもよい。
【0058】
一部の実施形態において、一組の転写因子は、一組の転写因子をコードする異種核酸をＰＳＣにおいて発現させることによりＰＳＣに導入されてもよい。この一組の中にある転写因子の量は、ひいてはＰＳＣにおいて増加する。この一組の中にある転写因子の量は、対照（例えば、一組の転写因子が導入されていないＰＳＣ）と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上増加し得る。
【0059】
核酸は、細胞内での発現に好適なベクター、例えばプラスミド又はレトロウイルス若しくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター内にある誘導性又は非誘導性の調節エレメントに作動可能に連結されていてもよい。核酸を含有するベクターは、次にＰＳＣにトランスフェクトされる。任意の好都合なトランスフェクション技法が用いられてもよい。一部の実施形態において、一組の転写因子は、（ａ）転写調節因子タンパク質をコードする核酸をＰＳＣの第１の遺伝子セーフハーバー部位に挿入すること；及び（ｂ）ＨＮＦ１Ａ；ＨＮＦ６；ＦＯＸＡ３；ＲＯＲｃ及び任意選択でＥＲαからなる一組の転写因子からなる一組の転写因子をコードする１つ以上の核酸をＰＳＣの第２の遺伝子セーフハーバー部位に挿入することであって、前記１つ以上の核酸が、転写調節因子タンパク質によって調節される誘導性プロモーターに作動可能に連結されていること；及び（ｃ）ＰＳＣを培養することを含む、それにより肝細胞を作製する方法によってＰＳＣに導入されてもよい。セーフハーバー遺伝子座は当該技術分野において周知であり、ｈＲＯＳＡ２６遺伝子座及びＡＡＶＳ１遺伝子座が挙げられる。
【0060】
トランスフェクション後、ＰＳＣにおいて一組の転写因子が発現し、それによってＰＳＣが肝細胞になるようにプログラミングされる。転写因子はＰＳＣにおいて過剰発現し得る。例えば、一組の転写因子は、細胞におけるその一組の転写因子の内因性発現レベルよりも高いレベル、例えば少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも２倍高い又は少なくとも５倍高いレベルで発現し得る。一部の実施形態において、トランスポゾン媒介によるか、又は他のランダム組込みのトランスジェネシス技法が用いられてもよい。１つ以上の転写因子をコードする核酸の発現を通じた細胞のリプログラミングについては、当該技術分野において周知である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ ２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ ２００７；Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ ２０１０；Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ ２０１０；Ｓｔａｅｒｋ ｅｔ ａｌ ２０１０）。
【0061】
ｉＰＳＣにおけるコード核酸からの転写因子の発現は、誘導性であってもよい。例えば、コード核酸は、好適なベクター内で１つ以上の誘導性調節エレメントに作動可能に連結されていてもよい。誘導性調節エレメントとしては、テトラサイクリン（Ｔｃ）又はドキシサイクリン（ｄｏｘ）誘導性調節エレメントを挙げることができる。ＰＳＣにおける転写因子の誘導性発現に好適な方法は、当該技術分野で確立されている（例えば、Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（２０１７）；国際公開第２０１８０９６３４３Ａ１号パンフレットを参照のこと）。
【0062】
一部の好ましい実施形態において、ＰＳＣは、細胞に対する遺伝子修飾を最小限に抑えて、又は全くなしに、肝細胞になるようにプログラミングされ得る。好適な技法は当該技術分野において公知であり、切出し可能なレンチウイルス及びトランスポゾンベクターの使用；一過性プラスミド、エピソーム及びアデノウイルス又はアデノ随伴ベクターの繰り返しの適用、又は；小分子、合成ｍＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡの使用が挙げられる（Ｓｉｄｈｕ ＫＳ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１１）Ｍａｙ；１１（５）：５６９－７９；Ｗｏｌｔｊｅｎ Ｋ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４５８（７２３９）：７６６－７０；Ｃｈｏｕ ＢＫ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１１ ２１（３）：５１８－２９）。
【0063】
他の実施形態において、一組の転写因子は、転写因子タンパク質又は転写因子をコードするｍＲＮＡなど、転写因子核酸をＰＳＣ集団と接触させることによりＰＳＣに導入されてもよい。転写因子核酸（Ｗａｒｒｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１０ Ｎｏｖ ５；７（５）：６１８－３０）又はタンパク質（Ｚｈｏｕ Ｈ，ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｍａｙ ８；４（５）：３８１－４）の直接送達を通じた細胞のプログラミングは、当該技術分野において周知であり、任意の好適な技術を用い得る。例えば、転写因子タンパク質又は核酸の組み合わせを、それらのタンパク質又は核酸が細胞に侵入することを可能にする条件下に、ＰＳＣの存在下で培養してもよい。一部の実施形態において、細胞への転写因子タンパク質の侵入は、転写因子タンパク質に連結されるか、又は取り付けられてもよい膜透過性ペプチドによって容易になり得る。転写因子タンパク質又は核酸の組み合わせは、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、パーティクルボンバードメント及び／又はマイクロインジェクションなど、従来方法によってＰＳＣに導入されてもよく、又はタンパク質デリバリー剤によって細胞に送達されてもよい。例えば、転写因子タンパク質又は核酸の組み合わせは、共有結合的又は非共有結合的に取り付けられた脂質、例えばミリストイル基によって細胞に導入することができる。
【0064】
ＰＳＣに直接送達される転写因子核酸は、細胞内で内因性翻訳因子によって翻訳可能であり得る。好適な合成ｍＲＮＡは、修飾されていてもよい。例えば、シチジンが５－メチルシチジンに、及びウリジンがプソイドウリジンに置換されてもよく、続くホスファターゼ処理により転写因子核酸が作製される（Ｚｈｏｕ Ｈ，ｅｔ ａｌ ２００９）。
【0065】
他の実施形態において、一組の転写因子は、ＰＳＣ集団におけるそれらの転写因子をコードする内因性核酸配列の発現を活性化させることによりＰＳＣに導入されてもよい。内因性遺伝子の活性化に好適な技法としては、ジンクフィンガー又は転写様活性化因子（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｉｋｅ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）（ＴＡＬ）技法が挙げられ、これらは当該技術分野で十分に確立されている（例えば、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｍａｙ １５；Ｚｈａｎｇ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｎｏｖ；２３（１１）：１１８６－９９を参照のこと）。
【0066】
ＰＳＣは、一組の転写因子が導入されると、プログラミング培地で培養し得る。
【0067】
好ましくは、プログラミング培地は、化学組成規定培地である。好適なプログラミング培地は、例えば０．５μｇ／ｍｌ～７０μｇ／ｍｌのインスリン、例えば１．５μｇ／ｍｌ～１５０μｇ／ｍｌの濃度のトランスフェリン、例えば３０μｇ／ｍｌ～１２０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸、例えば０．０５μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及び例えば０．０５μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌのＴＧＦβ（又はＮＯＤＡＬ）が補足された、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など、基本培養培地を含み得る。例えば、好適な化学組成規定プログラミング培地は、例えば０．５μｇ／ｍｌ～７０μｇ／ｍｌのインスリン、例えば１．５μｇ／ｍｌ～１５０μｇ／ｍｌの濃度のトランスフェリン、及びＬ－アスコルビン酸が補足された、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など、基本培養培地を含み得る。一部の好ましい実施形態において、プログラミング培地は、Ｅ６培地である。Ｅ６培地については、上記に詳細に記載している。
【0068】
一組の転写因子をコードする核酸が１つ以上の誘導性調節エレメントに作動可能に連結されている実施形態において、プログラミング培地には、一組の転写因子の発現を誘導する１つ以上の薬剤が補足されてもよい。例えば、コード核酸が１つ以上のドキシサイクリン誘導性調節エレメントに作動可能に連結されるとき、プログラミング培地にはドキシサイクリンが補足されてもよい。
【0069】
ＰＳＣへの一組の転写因子の導入後、細胞はプログラミング培地で１２時間以上、１日以上、２日以上又は３日以上、好ましくは約１日にわたって培養されてもよい。
【0070】
ＰＳＣなど、哺乳類細胞の培養方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃ．Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｕ．Ｓ．（１５ Ｏｃｔ ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９５４５１；Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．（９ Ｄｅｃ ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９２２２３；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ（２ Ａｕｇ ２００５）ＩＳＢＮ：０４７１４５３２９３、Ｈｏ ＷＹ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００６）３１０：４０－５２、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（ｅｄ．Ｒ．Ｌａｎｚａ）ＩＳＢＮ：０１２４３６６４３０を参照のこと）。培地及びその原材料は、商業的供給元（例えば、Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｅｕｒｏｐａ ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から入手し得る。標準的な哺乳類細胞培養条件、例えば３７℃、２１％酸素、５％二酸化炭素を用いることができる。培養培地は好ましくは２日毎に交換し、細胞は重力によって沈降させる。
【0071】
プログラミング培地での培養に続いて、次に細胞は、肝細胞培地で培養し得る。
【0072】
肝細胞培地とは、培養細胞における肝細胞表現型の維持を支える培養培地である。肝細胞培地は、好ましくは化学組成規定培地である。好適な培地としては、Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｊａｓｍｕｎｄ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎ ２４（１）５９－６９）、肝細胞培養培地（ＨＣＭ；Ｌｏｎｚａ）、Ｐｏｗｅｒ Ｐｒｉｍａｒｙ ＨＥＰ培地（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びウィリアムＥ培地（ＷＥＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ｔｏｄａ ｅｔ ａｌ（２０２０）ＰＬｏｓ Ｏｎｅ １５（２）ｅ０２２９６５４；Ｊａｓｍｕｎｄ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎ ２４（１）５９－６９；Ｄｅ Ｂａｒｔｏｌｏ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００６；２７：４７９４－４８０３；Ｈｅｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００６；２４：２８４０－２８５０．ｐｍｉｄ：１６９４５９９８；Ａｍｍｅｒｓｃｈｌａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ．２００４；７８：２２９－２４；Ｙｕ ｅｔ ａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１２；９：１９６－２０７；Ｍａｌｌａｎｎａ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１３；２６：１Ｇ．４．１－１Ｇ．４．１３；Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５；５：１２５０－１２６２；Ｇｉｅｓｅｃｋ ｅｔ ａｌ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１４；９：ｅ８６３７２；Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１６；１６：６４０－６５０）；ライボビッツＬ－１５培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｌｅｉｂｏｖｉｔｃｈ（１９６３）Ａｍｅｒ Ｊ．Ｈｙｇ ７８ １７３－１８０）；ウェイマウスＭＢ ７５２／１培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｔｃａ Ｍａｎｕａｌ ３，５２１－５２５（１９７７））；及びＳＦ３（Ｐｅｎｇ ｅｔ．ａｌ，ＩＯＶＳ ４４：８０８－１７，２００３；Ｊａｓｍｕｎｄ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎ ２４（１）５９－６９）及びチー培地（Ｃｈｅｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｚｉｒｖｉ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９１ Ａｕｇ；１２（２）：１３７－５１）が挙げられる。一部の好ましい実施形態において、細胞集団はＨｅｐａｔｏｚｙｍｅで培養し得る。
【0073】
一部の好ましい実施形態において、一組の転写因子がＥＲαを含むとき、肝細胞培地にはβ－エストラジオール（Ｅ２）が補足されてもよい。
【0074】
細胞集団は、好適な条件下にある肝細胞培地で、一組の転写因子の導入後に集団中の１つ以上の細胞が肝細胞表現型を呈することが可能になるのに十分な時間にわたって培養されてもよい。例えば、細胞は、１０～４０日間、好ましくは２０～３０日間、例えば約２０日間にわたって培養されてもよい。
【0075】
一部の実施形態において、肝細胞培地には、コード核酸からの一組の転写因子の発現を誘導する１つ以上の薬剤が補足されてもよい。例えば、一組の転写因子が１つ以上のドキシサイクリン誘導性調節エレメントに作動可能に連結されてもよく、及び肝細胞培地にはドキシサイクリンが補足されてもよい。細胞集団は、１つ以上の薬剤が補足された肝細胞培地で７～９日間、好ましくは８日間にわたって培養されてもよい。次に細胞集団は、１つ以上の薬剤のない肝細胞培地で更に８～１２日間、好ましくは１０日間にわたって培養されてもよい。
【0076】
一部の実施形態において、肝細胞培地中の細胞は、更に３Ｄで培養されてもよい。例えば、細胞は、マトリゲル成長因子基底膜マトリックスなどの足場に包埋され、肝細胞培地で、例えば５日以上、又は１０日以上にわたって培養されてもよい。これは、例えば、細胞傷害性薬剤に対する感受性など、肝細胞機能性を促進するのに有用であり得る。
【0077】
細胞集団に導入された一組の転写因子は成熟肝細胞表現型を付与し、即ち、集団中の細胞は、その一組の転写因子によって肝細胞へとフォワードプログラミングされる。
【0078】
細胞培養時、集団中の細胞において１つ以上の肝細胞マーカー及び／又は１つ以上の多能性細胞マーカーの発現をモニタ又は検出し得る。これにより、集団が培養されるに従い集団においてどの程度フォワードプログラミングされたかを決定することが可能になる。一部の実施形態において、方法は、培養物中の肝細胞のアイデンティティを同定すること、又は確認することを含み得る。肝細胞は、例えば、少なくとも１５日後に細胞培養物中に同定し得る。
【0079】
プログラミング後、肝細胞集団は、培養され、拡大され、及び任意選択で、例えば凍結保存により貯蔵されてもよい。
【0080】
上記に記載される方法によれば、他の細胞型を実質的に含まない肝細胞集団が作製されることになり得る。例えば、本明細書に記載される方法によって作製される集団は、培養後に８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の肝細胞を含有し得る。集団中の肝細胞の存在又は比率は、上記に記載したとおり、アルブミン及び／又はα１－アンチトリプシンの発現を通じて決定し得る。好ましくは、肝細胞集団は、精製が不要となるのに十分なほど他の細胞型を含まない。必要であれば、肝細胞集団は、ＦＡＣＳを含め、任意の好都合な技法により精製されてもよい。
【0081】
また、本明細書に記載される方法によってＰＳＣから作製される肝細胞集団も提供される。ＰＳＣ集団の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％が、本明細書に記載される方法によるフォワードプログラミング後に肝細胞になり得る。
【0082】
一部の実施形態において、肝細胞は、一組の転写因子をコードする異種核酸を含み得る。
【0083】
集団中の肝細胞は、機能的に成熟したものであってよい。機能的に成熟した肝細胞は、成熟肝細胞表現型を呈し得る。
【0084】
本明細書に記載される方法によって作製される肝細胞は、肝細胞マーカー；アルブミン（ＡＬＢ）、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ、Ａ１ＡＴ又はＳＥＲＰＩＮＡ１）、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＵＧＴ１Ａ１、ＡｐｏＡ１、ＦＡＳＮ、ＮＲ１Ｈ４、Ｇ６ＰＣ、ＵＧＴ１Ａ６、ＰＣＫ１、ＰＰＲａ／ｇ及びＲＯＲｇを発現し得る。
【0085】
他の肝細胞マーカーとしては、フマリルアセトアセターゼ（ＦＡＨ）、サイトケラチン８（ＣＫ８）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）、アルコールデヒドロゲナーゼ１、アルギナーゼＩ型、及び肝臓特異的有機アニオン輸送体（ＬＳＴ－１）を挙げることができる。
【0086】
本肝細胞は、初代成体ヒト肝細胞と同じレベル又は実質的に同じレベルで肝細胞マーカーを発現し得る。例えば、本肝細胞における発現レベルは、初代成体ヒト肝細胞における発現レベルと比べて同じか、又はそれより２０％以下、１０％以下又は５％以下だけ高い若しくは低いものであり得る。
【0087】
本肝細胞は、定方向分化によって作製された肝細胞様細胞（ＨＬＣ）、例えば、下記又はＰａｌａｋｋａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｚｋｏｌｎｉｃｋａ ＆ Ｈａｙ，２０１６；Ｓｉｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ ２００８；Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｇｒａｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９；若しくはＹｉａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８に開示される方法によって作製されたＨＬＣにおける発現レベルよりも高いレベルで肝細胞マーカーを発現し得る。例えば、本肝細胞における発現レベルは、ＨＬＣにおける発現レベルよりも１０％以上、２０％以上、３０％以上、又は５０％以上高いものであり得る。
【0088】
本肝細胞は、ＡＦＰ、ＣＫ１８及びＳｏｘ１７など、前駆細胞マーカーを発現しなくてもよく、又はそれらを低いレベルで発現し得る。例えば、本肝細胞における前駆細胞マーカーの発現レベルは、上記の肝細胞マーカーの発現レベルの２０％未満、１０％未満、５％未満又は１％未満であってもよい。
【0089】
好ましくは、本肝細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－４及びＴｒａ－１－６０など、ＰＳＣが発現する多能性関連マーカーを発現しないか、又はＰＳＣと比べると発現の低下を呈する。
【0090】
細胞マーカーの発現は、細胞集団中でモニタされ、及び／又は検出されてもよい。例えば、肝細胞集団によるアルブミン（ＡＬＢ）、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）又は他の肝細胞マーカーの発現又は産生が決定されてもよい。これにより、培養されている集団においてどの程度分化したかを決定し、及び／又はモニタすることが可能になる。細胞マーカーの発現は、免疫細胞化学、免疫蛍光法、ＲＴ－ＰＣＲ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、及び酵素的分析を含めた任意の好適な技術により決定し得る。
【0091】
本明細書に記載される方法によって作製される肝細胞は、初代成体ヒト肝細胞の機能を果たす能力を有し得る。例えば、肝細胞は、グリコーゲン及びＬＤＬを貯蔵し、ＡＡＴ及び／又はアルブミン（ＡＬＢ）を合成及び分泌し、ＬＤＬ及び脂肪酸を取り込み、及びＣｙｔＰ４５０経路を介して生体異物を解毒することが可能であり得る。肝細胞は、胆汁、トロンボポエチン、アンジオテンシノーゲン、尿素及びコレステロールを産生し；及びグリコーゲン分解、糖新生、グリコーゲン生成及び脂質生成を果たすことが可能であり得る。
【0092】
本明細書に記載される方法は、集団中の細胞が上記の肝細胞機能の１つ以上を果たすことが可能かをモニタし、及び／又は決定することを更に含み得る。
【0093】
肝細胞機能は、本明細書に記載される方法によって作製される肝細胞により、初代成体ヒト肝細胞と同じ活性又は実質的に同じ活性で果たされてもよい。例えば、肝細胞における活性の量は、初代成体ヒト肝細胞における活性の量と同じか、又はそれより２０％以下、１０％以下又は５％以下だけ高い若しくは低いものであり得る。
【0094】
本明細書に記載される方法によって作製される肝細胞は、定方向分化によって作製される肝細胞様細胞（ＨＬＣ）、例えば、Ｐａｌａｋｋａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｚｋｏｌｎｉｃｋａ ＆ Ｈａｙ，２０１６；Ｓｉｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ ２００８；Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｇｒａｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９；又はＹｉａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８に開示される方法によって作製されるＨＬＣの肝細胞機能の活性よりも高い活性で肝細胞機能を果たし得る。例えば、肝細胞における活性は、ＨＬＣにおける活性より１０％以上、２０％以上、３０％以上、又は５０％以上高くてもよい。
【0095】
本明細書に記載される方法によって作製される肝細胞は、モデルシステム、例えば、ヒト化ＦＲＧマウスなど、ネズミ科動物マウスモデルにおいて生体内生着及び肝コロニー形成の能力を有し得る（Ｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１０ ６４０ ４９１－５０９）。
【0096】
本明細書に記載される方法によって作製される肝細胞は、成熟初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の同じ又は実質的に同じ遺伝子発現プロファイルを呈し得る。
【0097】
本方法によって作製される肝細胞は、以下の肝細胞形態学的特徴：敷石状の形態、偶発的な二核性；グリコーゲン沈着；頂端側の微小突起；粗面及び滑面小胞体（ＥＲ）並びに顕著なゴルジ体のうちの１つ以上を呈し得る。
【0098】
一部の実施形態において、個体に投与される肝細胞は、治療用分子、例えば薬物又は成長因子を産生するように遺伝的に操作されてもよい（Ｂｅｈｒｓｔｏｃｋ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ Ｍａｒ；１３（５）：３７９－８８，Ｋｌｅｉｎ ＳＭ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００５ Ａｐｒ；１６（４）：５０９－２１）
【0099】
本明細書に記載される方法によって作製される肝細胞集団は、ヒト又は動物の身体の治療方法、例えば、肝障害、肝傷害及び／又は損害した若しくは機能不全の肝組織を有する個体の治療において使用し得る。集団はまた、個体の肝障害、肝傷害及び／又は損傷した若しくは機能不全の肝組織の治療における使用のための医薬品の製造においても使用し得る。好適な個体は、急性肝傷害、例えば、薬剤誘発性肝傷害；慢性肝疾患、例えば、肝炎（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｇ型又はＫ型肝炎）、肝硬変、肝細胞癌、非アルコール性脂肪肝障害、アルコール性肝障害、自己免疫性肝障害又は遺伝性代謝障害、例えば、α１アンチトリプシン欠損症、糖原病、例えば糖原病１ａ型、家族性高コレステロール血症、遺伝性チロシン血症、クリグラー・ナジャー症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、又は第ＩＸ因子欠損症若しくは他の血友病、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、デュビン・ジョンソン症候群、家族性アミロイドーシス、又はレフサム病を有し得る。
【0100】
治療的適用には、肝細胞は好ましくは、臨床グレードの肝細胞である。
【0101】
本発明の態様はまた、本明細書に記載されるとおり作製された肝細胞を含む医薬組成物、医薬品、薬物又は他の組成物、かかる肝細胞のそれを必要としている個体への、例えば、上記に記載されるとおりの肝障害又は損傷した若しくは機能不全の肝組織の治療（これには予防的治療が含まれ得る）のための投与を含む方法、及びかかる肝細胞を薬学的に許容可能な賦形剤、媒体又は担体、及び任意選択で１つ以上の他の成分と混合することを含む、医薬組成物を作成する方法にも関する。
【0102】
医薬組成物は、本明細書に記載されるとおり作製された肝細胞と、１つ以上の追加の成分とを含有し得る。医薬組成物は、肝細胞に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、保存剤、安定剤、抗酸化剤及び／又は当業者に周知の他の材料を含み得る。かかる材料は非毒性でなければならず、且つ肝細胞の活性を妨げてはならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存することになる。
【0103】
液体医薬組成物は、概して、水、石油、動物油若しくは植物油、鉱油又は合成油など、液体担体を含む。生理食塩水溶液、組織又は細胞培養培地、デキストロース又は他のサッカリド溶液又はグリコール類、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどが含まれてもよい。本組成物は、パイロジェンフリーであって、且つ好適なｐＨ、等張性及び安定性を示すものである、非経口的に許容可能な水溶液の形態であってもよい。当業者は、塩化ナトリウム、リンゲル液、又は乳酸加リンゲル液など、等張性媒体を例えば使用して、好適な溶液を調製することが十分に可能である。組成物は、人工脳脊髄液を使用して調製されてもよい。
【0104】
肝細胞は、当該技術分野において公知の任意の技法によって患者に移植されてもよい（例えば、Ｌｉｎｄｖａｌｌ，Ｏ．（１９９８）Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．１３，Ｓｕｐｐｌ．１：８３－７；Ｆｒｅｅｄ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，６，２０１－２０２；Ｋｏｒｄｏｗｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３３２，１１１８－１１２４；Ｆｒｅｅｄ，Ｃ．Ｒ．，（１９９２）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３２７，１５４９－１５５５、Ｌｅ Ｂｌａｎｃ ｅｔ ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ ２００４ Ｍａｙ １；３６３（９４１９）：１４３９－４１）。詳細には、細胞懸濁液が患者の門脈に注射されてもよい。一部の実施形態において、肝細胞は、アルギン酸に封入されて、マイクロビーズとして移植されもよい（Ｄｈａｗａｎ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０２０ ７２ ５ ８７７－８８４）。
【0105】
医薬組成物の投与は、好ましくは「治療有効量」であり（但し、場合によっては、予防が治療と見なされ得る）、これは、個体への利益が明らかになるのに十分なものである。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療されるものの性質及び重症度に依存することになる。治療の処方、例えば投薬量等に関する決定は、総合診療医及び他の医師の責任の範囲内にある。組成物は、治療しようとする病態に応じて単独で、又は他の治療と組み合わせて、同時投与又は逐次投与のいずれで投与されてもよい。
【0106】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり作製される集団中の肝細胞は、正常な表現型を呈し得る。例えば、肝障害又は肝損傷若しくは肝機能不全を有する個体から細胞を入手して、それを使用してｉＰＳ細胞を作製してもよい。一部の実施形態において、ｉＰＳ細胞には突然変異又は遺伝的欠陥が含まれてもよく、その突然変異又は欠陥を従来の組換え技術を用いて修正することにより、正常な表現型のｉＰＳ細胞を作製してもよい。正常な表現型の肝細胞は、これらのｉＰＳ細胞から本明細書に記載されるとおり作製されて、肝損傷又は肝機能不全を修復又は改善するため患者に移植されてもよい。
【0107】
他の実施形態において、本明細書に記載されるとおり作製される集団中の肝細胞は、疾患表現型を呈し得る。例えば、肝障害又は肝損傷若しくは肝機能不全を有する個体から細胞を入手して、それを使用して疾患特異的ｉＰＳ（ｄｓ－ＩＰＳ）細胞を作製してもよい。疾患表現型の肝細胞は、これらのｉＰＳ細胞から本明細書に記載されるとおり作製し得る。次にこれらの細胞を処理することにより、正常な表現型を回復させてもよい。例えば、疾患表現型が原因である遺伝子突然変異又は欠陥をインビトロで修正してもよい。単離された哺乳類細胞における遺伝子突然変異又は欠陥の修正には、様々な技法が利用可能である。欠陥又は突然変異が修正され、正常な表現型が回復すれば、肝障害又は肝損傷若しくは肝機能不全の修復又は改善するためその肝細胞が患者に移植されてもよい。
【0108】
上記に記載されるとおり作製される肝細胞集団は、試験化合物と肝細胞の相互作用のモデル化、例えば、毒性スクリーニング、肝障害のモデル化及び治療効果がある可能性のある化合物のスクリーニングにおいて有用であり得る。
【0109】
例えば、肝障害の治療において有用な化合物をスクリーニングする方法は、
本明細書に記載される方法によって作製された単離された肝細胞の細胞を試験化合物と接触させること、及び；
試験化合物が前記肝細胞の細胞に及ぼす効果を決定すること
を含み得る。
本明細書に記載される方法によって作製された単離された肝細胞の細胞を試験化合物と接触させること、及び；
試験化合物が前記肝細胞の細胞に及ぼす効果を決定すること
を含み得る。
【0110】
一部の実施形態において、肝細胞は、疾患関連表現型又は遺伝子型を有する細胞の試料に由来するｉＰＳＣから作製されてもよく、試験化合物が細胞に及ぼす効果が決定されてもよい。例えば、１つ以上の疾患関連病変に及ぼす効果が決定されてもよい。
【0111】
毒性スクリーニング方法は、
本明細書に記載される方法によって作製された単離された肝細胞の細胞を試験化合物と接触させること、及び；
試験化合物が前記肝細胞の細胞に及ぼす効果又は肝細胞が試験化合物に及ぼす効果を決定すること
を含み得る。
本明細書に記載される方法によって作製された単離された肝細胞の細胞を試験化合物と接触させること、及び；
試験化合物が前記肝細胞の細胞に及ぼす効果又は肝細胞が試験化合物に及ぼす効果を決定すること
を含み得る。
【0112】
決定されるにより、試験化合物が肝細胞の成長又は生存能力；遺伝子発現；又は機能に及ぼす効果。肝細胞の成長又は生存能力は、試験化合物の存在下で非存在下と比べて決定されてもよい。成長又は生存能力の低下は、その化合物が肝毒性効果を有することを指し示している。遺伝子発現は、試験化合物の存在下で非存在下と比べて決定されてもよい。例えば、アルブミン、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、シトクロムｐ４５０酵素、例えば、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ２Ｄ６など、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ａ２、ＣＥＢＰα及び／又はトランスサイレチンの発現が決定されてもよい。発現の低下は、その化合物が肝毒性効果を有することを指し示している。遺伝子発現は、核酸レベルで、例えばＲＴ－ＰＣＲによるか、又はタンパク質レベルで、例えば、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的技法によるか、又は活性アッセイにより決定されてもよい。シトクロムｐ４５０アッセイ、例えば、発光、蛍光又は発色アッセイは、当該技術分野において周知であり、商業的供給業者から入手可能である。肝細胞の１つ以上の機能は、試験化合物の存在下で非存在下と比べて決定及び／又は測定されてもよい。例えば、肝細胞が、有機化合物の解毒、グリコーゲン貯蔵、ＡＡＴ又はアルブミンの分泌、胆汁産生、トロンボポエチン産生、アンジオテンシノーゲン産生、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン生成及び脂質生成のうちの１つ以上を果たす能力が決定及び／又は測定されてもよい。肝細胞がこれらの機能のうちの１つ以上を果たす能力が、試験化合物の存在下で非存在下と比べて低下していることが、その化合物が肝毒性効果を有することを指し示している。
【0113】
一部の実施形態において、肝細胞による試験化合物の代謝、分解、又は崩壊が決定されてもよい。例えば、時間の経過に伴う試験化合物及び／又は前記試験化合物の代謝産物の量又は濃度の変化が、連続的に又は１時点以上のいずれかで決定又は測定されてもよい。試験化合物の量又は濃度の低下及び／又は前記試験化合物の代謝産物の量又は濃度の増加が決定又は測定されてもよい。一部の実施形態において、試験化合物及び／又は代謝産物の量又は濃度が変化する速度が決定されてもよい。試験化合物又は代謝産物の量の測定に好適な技法としては、質量分析法が挙げられる。これは、試験化合物の生体内半減期、毒性、有効性又は他のインビボ特性の決定において有用であり得る。
【0114】
肝障害又は肝損傷若しくは肝機能不全の治療において有用な化合物をスクリーニングする方法における使用に好適な肝細胞は、疾患表現型を呈し得る。試験化合物が肝細胞における１つ以上の疾患病変に及ぼす効果が決定されてもよい。例えば、試験化合物が、細胞成長、遺伝子発現、タンパク質凝集又は重合；ＥＲへのタンパク質捕捉；コレステロール取り込み；脂質及び／又はグリコーゲン蓄積；及び乳酸産生のうちの１つ以上に及ぼす効果が決定されてもよい。好適な技法は当該技術分野において周知であり、免疫染色、質量分析法、ウエスタンブロット、及び酵素アッセイが挙げられる。
【0115】
試験化合物の存在下での非存在下と比べた肝細胞における１つ以上の疾患病変の低下又は改善は、肝障害又は肝損傷若しくは肝機能不全の治療において有用であり得ることを指し示すものであり得る。
【0116】
本明細書に記載されるとおりの方法は、肝細胞における１つ以上の疾患病変を低減又は改善する試験化合物を同定する工程を含み得る。疾患病変を低減する化合物は、肝障害の治療用療法薬の開発において有用であり得る。
【0117】
肝障害又は肝損傷若しくは肝機能不全の治療において有用な化合物をスクリーニングする方法における使用に好適な他の肝細胞は、正常な表現型を呈してもよく、例えば、一般集団と比べて肝障害のリスクが高い又はそれに極めて罹り易い個体に由来してもよい。試験化合物が細胞成長、又は遺伝子発現、例えば、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ２Ｄ６など、シトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）の発現のうちの１つ以上に及ぼす効果が決定されてもよい。試験化合物が肝細胞の１つ以上の機能に及ぼす効果が決定されてもよい。例えば、肝細胞が、有機化合物の解毒、グリコーゲン貯蔵、ＡＡＴ又はアルブミンの分泌、胆汁産生、トロンボポエチン産生、アンジオテンシノーゲン産生、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン生成及び脂質生成のうちの１つ以上を果たす能力が、試験化合物の存在下で非存在下と比べて決定及び／又は測定されてもよい。
【0118】
試験化合物の存在下での非存在下と比べた遺伝子発現、成長及び／又は１つ以上の機能の増加は、その化合物が、肝障害又は肝損傷若しくは肝機能不全、例えば肝炎（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｇ型又はＫ型肝炎）、肝硬変、肝細胞癌、非アルコール性脂肪肝障害、薬剤誘発性肝傷害、アルコール性肝障害又は自己免疫性肝障害の治療において有用であり得ることを指し示すものであり得る。
【0119】
肝細胞における１つ以上の疾患病変を低減又は改善する化合物の同定後、その化合物は、その薬学的特性が最適となるように修飾されてもよい。これは、当該技術分野において周知であるモデル化技法を用いて行われ得る。
【0120】
１回以上の初期スクリーニングを用いて肝細胞における１つ以上の疾患病変を低減又は改善する能力を有すると同定された試験化合物は、１回以上の二次スクリーニングを用いて更に評価されてもよい。
【0121】
二次スクリーニングには、生物学的機能又は活性をインビトロ及び／又はインビボで、例えば動物モデルにおいて試験することが関わり得る。例えば、試験化合物がその疾患の動物モデルにおける肝障害に関連する１つ以上の症状又は病変を低減又は改善する能力が決定されてもよい。
【0122】
肝細胞における１つ以上の疾患病変を低減又は改善する試験化合物の同定後、その化合物は単離及び／又は精製されてもよく、又は代わりにそれは、組換え発現若しくは化学合成の従来技法を用いて合成されてもよい。更には、それは、医薬品、医薬組成物又は薬物などの組成物の調製、即ち製造又は製剤化において製造及び／又は使用されてもよい。それらは、本明細書に記載されるとおりの肝障害の治療のため、個体に投与されてもよい。
【0123】
上記に記載されるとおり作製される肝細胞は、疾患のモデル化及び肝障害の薬物標的の同定において有用であり得る。
【0124】
一部の実施形態において、上記に記載されるとおり作製される肝細胞の表現型に遺伝子突然変異が及ぼす効果が決定されてもよい。例えば、肝障害に関連する遺伝子突然変異を同定する方法は、
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、各々遺伝子突然変異を含むこと；及び
表現型について試験肝細胞集団を対照肝細胞集団と比較することであって、対照集団が遺伝子突然変異を含まないこと；及び
試験集団の中で、肝障害表現型など、疾患表現型を呈する肝細胞を同定すること
を含んでもよく、
ここでは疾患表現型を呈することが、同定された肝細胞における遺伝子突然変異が肝障害に関連することを指し示している。
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、各々遺伝子突然変異を含むこと；及び
表現型について試験肝細胞集団を対照肝細胞集団と比較することであって、対照集団が遺伝子突然変異を含まないこと；及び
試験集団の中で、肝障害表現型など、疾患表現型を呈する肝細胞を同定すること
を含んでもよく、
ここでは疾患表現型を呈することが、同定された肝細胞における遺伝子突然変異が肝障害に関連することを指し示している。
【0125】
疾患表現型は、肝障害など、疾患に関連する肝細胞表現型である。疾患表現型の肝細胞は、正常な表現型の肝細胞と比べて機能異常を呈し得る。例えば、疾患表現型の肝細胞では、上記に記載される肝細胞機能の１つ以上が低下しているか、又は存在しなくてもよい。
【0126】
他の実施形態において、疾患表現型の肝細胞を調べることにより、原因となる遺伝子突然変異が同定されてもよい。例えば、肝障害に関連する遺伝子突然変異を同定する方法は、
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、肝障害表現型など、疾患表現型を呈すること；及び
ゲノム配列について試験肝細胞集団を対照肝細胞集団と比較することであって、対照集団中の肝細胞が疾患表現型を呈しないこと；及び
対照集団と比べて試験集団のゲノム配列にある１つ以上の遺伝子突然変異を同定すること
を含んでもよく、
ここでは対照集団と比べた試験集団における遺伝子突然変異の存在が、その突然変異が疾患表現型に関連することを指し示している。
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、肝障害表現型など、疾患表現型を呈すること；及び
ゲノム配列について試験肝細胞集団を対照肝細胞集団と比較することであって、対照集団中の肝細胞が疾患表現型を呈しないこと；及び
対照集団と比べて試験集団のゲノム配列にある１つ以上の遺伝子突然変異を同定すること
を含んでもよく、
ここでは対照集団と比べた試験集団における遺伝子突然変異の存在が、その突然変異が疾患表現型に関連することを指し示している。
【0127】
他の実施形態において、疾患表現型の肝細胞を調べることにより、変異体遺伝子発現が同定されてもよい。例えば、肝障害に関連する遺伝子を同定する方法は、
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、肝障害表現型など、疾患表現型を呈すること；及び
肝細胞集団における１つ以上の遺伝子の発現を対照肝細胞集団における１つ以上の遺伝子の発現と比較すること
を含んでもよく、
ここでは対照集団と比べた集団における遺伝子の発現の差が、その遺伝子が肝障害に関連することを指し示している。
第５の態様の試験肝細胞集団を提供することであって、試験集団中の肝細胞が、肝障害表現型など、疾患表現型を呈すること；及び
肝細胞集団における１つ以上の遺伝子の発現を対照肝細胞集団における１つ以上の遺伝子の発現と比較すること
を含んでもよく、
ここでは対照集団と比べた集団における遺伝子の発現の差が、その遺伝子が肝障害に関連することを指し示している。
【0128】
これらの方法における使用に好適な試験肝細胞集団は、肝障害を有する個体に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から第１～第４の態様の方法によって作製されてもよい。
【0129】
また、ＰＳＣから肝細胞へのフォワードプログラミングに有用な転写因子の同定方法も提供される。例えば、肝細胞成熟を促進する転写因子を同定する方法は、
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）及びインビトロ定方向分化によって作製された肝細胞様細胞（ＨＬＣ）における一組の転写因子の発現を決定すること、及び
その一組の中でＣＬＣと比べてＰＨＨにおいて発現が増加している転写因子を同定すること
を含んでもよく、
同定された転写因子が、肝細胞成熟を促進する転写因子候補である。
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）及びインビトロ定方向分化によって作製された肝細胞様細胞（ＨＬＣ）における一組の転写因子の発現を決定すること、及び
その一組の中でＣＬＣと比べてＰＨＨにおいて発現が増加している転写因子を同定すること
を含んでもよく、
同定された転写因子が、肝細胞成熟を促進する転写因子候補である。
【0130】
好適な肝細胞様細胞（ＨＬＣ）は、確立された方法によって作製されてもよい（以下、又は例えば、Ｐａｌａｋｋａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｚｋｏｌｎｉｃｋａ ＆ Ｈａｙ，２０１６；Ｓｉｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ ２００８；Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｇｒａｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９；又はＹｉａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８を参照のこと）。
【0131】
例えば、ＮＲ１、ＣＵＸ２、ＡＲ、ＺＮＦ５５８、ＴＳＨＺ２、ＴＢＸ１５、ＮＦ１Ｘ、ＮＦ１Ｂ、ＡＴＯＨ８、ＺＭＡＴ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＺＮＦ３８５８、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＮＲ１１３、ＮＰＡＳ２、Ｌ３ＭＢＴＬ４、ＪＡＺＦ１、ＮＦ１Ａ、ＺＮＦ６８０、ＨＮＦ４Ｇ、ＣＲＥＢＬ２、ＤＭＲＴＡ１、ＩＲＦ６、ＡＲＩＤ５Ａ、ＳＯＸ５、ＺＢＴＢ２０、ＺＮＦ７０４、ＺＥＢ１、ＺＮＦ３６７、ＮＲ１Ｈ４、ＫＬＦ１５、ＨＬＦ及びＮＲ４Ａ２からなる群から選択される１つ以上の追加の転写因子の発現が決定されてもよい。
【0132】
本発明の他の態様及び実施形態は、用語「～を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用語「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に置き換えた上述の態様及び実施形態、及び用語「～を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用語「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に置き換えた上述の態様及び実施形態を提供する。
【0133】
本願は、文脈上特に要求されない限り、上記に記載される上記の態様及び実施形態のいずれかの互いのあらゆる組み合わせを開示することが理解されるべきである。同様に、本願は、文脈上特に要求されない限り、好ましい及び／又は任意選択の特徴のあらゆる組み合わせを、単独、又は他の態様のいずれかと一緒のいずれかで開示する。
【0134】
上記の実施形態の変形例、更なる実施形態及びその変形例は、この開示を読めば当業者には明らかであろうとともに、従って、それらは本発明の範囲内にある。
【0135】
本明細書で言及される全ての文書及び配列データベースエントリは、あらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される。
【0136】
本明細書で使用される場合に「及び／又は」は、２つの指定される特徴又は成分の各々の他方を伴う又は伴わない具体的な開示と解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の、まるで各々が本明細書に個々に示されたかのような具体的な開示と解釈されるべきである。
【実施例】
【0137】
実験例
フォワードプログラミングによって肝細胞を作製するため、本発明者らは初めにＬＥＴＦの異なる組み合わせを試験し、未熟な肝細胞（ＦｏＰ－Ｈｅｐｓ）への変換を駆動するのに十分な３つの因子のカクテルを同定した。次に本発明者らは、ＨＬＣとＰＨＨとの間のトランスクリプトーム及びエピジェネティクスの比較を実施して、肝細胞の機能的成熟を更に高めることができる可能性のある追加の転写因子を同定した。この比較により、成体肝細胞では多数の核内受容体が発現し、ひいてはインビボでの機能性及び成熟の誘導因子であるらしいことが明らかになった。これらの因子の選択をＬＥＴＦと組み合わせて、本発明者らは、４ＴＦ ＨＮＦ１Ａ－ＨＮＦ６－ＦＯＸＡ３－ＲＯＲｃが、ＣＹＰ３Ａ４活性、タンパク質分泌及び肝毒性反応を含めた成熟肝細胞の特徴を呈するＦｏＰ－Ｈｅｐｓを作成するのに最も効率的なカクテルであることを同定した。このように、フォワードプログラミングは、複雑な培養条件及び長いタイムラインの必要性を回避することで、ダイレクト分化に代わる方法を提供する。その上、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、再生医学、並びに疾患モデル化又は薬物スクリーニングに機能的に対応したレベルを呈する。
フォワードプログラミングによって肝細胞を作製するため、本発明者らは初めにＬＥＴＦの異なる組み合わせを試験し、未熟な肝細胞（ＦｏＰ－Ｈｅｐｓ）への変換を駆動するのに十分な３つの因子のカクテルを同定した。次に本発明者らは、ＨＬＣとＰＨＨとの間のトランスクリプトーム及びエピジェネティクスの比較を実施して、肝細胞の機能的成熟を更に高めることができる可能性のある追加の転写因子を同定した。この比較により、成体肝細胞では多数の核内受容体が発現し、ひいてはインビボでの機能性及び成熟の誘導因子であるらしいことが明らかになった。これらの因子の選択をＬＥＴＦと組み合わせて、本発明者らは、４ＴＦ ＨＮＦ１Ａ－ＨＮＦ６－ＦＯＸＡ３－ＲＯＲｃが、ＣＹＰ３Ａ４活性、タンパク質分泌及び肝毒性反応を含めた成熟肝細胞の特徴を呈するＦｏＰ－Ｈｅｐｓを作成するのに最も効率的なカクテルであることを同定した。このように、フォワードプログラミングは、複雑な培養条件及び長いタイムラインの必要性を回避することで、ダイレクト分化に代わる方法を提供する。その上、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、再生医学、並びに疾患モデル化又は薬物スクリーニングに機能的に対応したレベルを呈する。
【0138】
材料及び方法
ｈＰＳＣ培養
この計画には、ヒトＥＳＣ Ｈ９（ＷｉＣｅｌｌ）及びＩＰＳＣ Ａ１ＡＴＤＲ／Ｒ、ＦＳ１３Ｂ及びＮＩＨ Ｌｒｇ１（Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）株を使用した。地域の研究倫理委員会による承認を受けて（ＲＥＣ ０８／Ｈ０３１１／２０１）、ヒトｉＰＳＣ株を先述のとおり誘導した。両方のｈＰＳＣとも、ビトロネクチンＸＦＴＭ（１０μｇ／ｍＬ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコートしたプレート上、ＴＧＦＢ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）及びＦＧＦ２（１２ｎｇ／ｍｌ、Ｑｋｉｎｅ）を補足したてのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸（１％）、インスリン－トランスフェリン－セレン溶液（２％、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、重炭酸ナトリウム（０．７％）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（１％）からなるＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）化学組成規定培地で培養した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。常法どおりの解離のため、小さい塊状で播種した細胞を０．５μＭ ＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に３７℃で３分間インキュベートした。細胞は２０％Ｏ２、５％ＣＯ２に３７℃で維持し、培地は２４時間毎に交換した。
ｈＰＳＣ培養
この計画には、ヒトＥＳＣ Ｈ９（ＷｉＣｅｌｌ）及びＩＰＳＣ Ａ１ＡＴＤＲ／Ｒ、ＦＳ１３Ｂ及びＮＩＨ Ｌｒｇ１（Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）株を使用した。地域の研究倫理委員会による承認を受けて（ＲＥＣ ０８／Ｈ０３１１／２０１）、ヒトｉＰＳＣ株を先述のとおり誘導した。両方のｈＰＳＣとも、ビトロネクチンＸＦＴＭ（１０μｇ／ｍＬ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコートしたプレート上、ＴＧＦＢ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）及びＦＧＦ２（１２ｎｇ／ｍｌ、Ｑｋｉｎｅ）を補足したてのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸（１％）、インスリン－トランスフェリン－セレン溶液（２％、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、重炭酸ナトリウム（０．７％）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（１％）からなるＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）化学組成規定培地で培養した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。常法どおりの解離のため、小さい塊状で播種した細胞を０．５μＭ ＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に３７℃で３分間インキュベートした。細胞は２０％Ｏ２、５％ＣＯ２に３７℃で維持し、培地は２４時間毎に交換した。
【0139】
遺伝子ターゲティング
以前に記載されているとおりＯＰＴｉ－ＯＸシステムを使用して誘導性ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ株を作成した（Ｂｅｒｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。簡潔に言えば、２つの遺伝子セーフハーバーを標的化した（ＧＳＨ）。ｈＲＯＳＡ２６遺伝子座は、構成的に発現するトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）で標的化し、ＡＡＶＳ１遺伝子座はＴＥＴ応答性エレメント（ＴＲＥ）の下に目的のトランス遺伝子で標的化した。本稿全体を通じて記載されるとおりの異なる組み合わせの転写因子及び／又は核内受容体をクローニングした。鋳型ｃＤＮＡ配列は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから入手するか：ＨＮＦ６（ＭＨＳ６２７８－２１３２４４１７０）、ＨＮＦ１Ａ（ＭＨＳ６２７８－２０２８５７９０２）、ＲＯＲｙ（ＭＨＳ６２７８－２０２８００９９１）及びＥＳＲ１（ＭＨＳ６２７８－２１１６９１０５１）；又はヒト初代肝臓ｃＤＮＡ：ＨＮＦ４Ａ、ＦＯＸＡ３及びＡＲから増幅するかのいずれかであった。配列はＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して増幅した。増幅及び骨格ベクターへの配列のクローニングに使用したプライマーが上流及び下流のオーバーハングを含有したことにより、表１に挙げるとおりのＧＳＧ（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ）リンカー及び異なる２Ａペプチドが作成された。これらの異なるベクターは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により、１：３ｐｍｏｌのベクター対挿入物比を用いて構築した。標的化のため、ｈＰＳＣをＳＴＥＭｐｒｏ ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で５分間にわたって単一細胞に解離し、Ｐ３初代細胞４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して１００万個の細胞に２μｇのドナーベクター及び２μｇの各ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ発現プラスミドをトランスフェクトした。１０μＭ ＲＯＣＫ阻害薬Ｙ－２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補足したＥ８培地に細胞を播種した。５～７日後、１μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で少なくとも２日間にわたってコロニーを選択し、その後、それらを個別にピッキングし、以前に記載されているとおり遺伝子型を決定した（Ｂｅｒｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
以前に記載されているとおりＯＰＴｉ－ＯＸシステムを使用して誘導性ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ株を作成した（Ｂｅｒｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。簡潔に言えば、２つの遺伝子セーフハーバーを標的化した（ＧＳＨ）。ｈＲＯＳＡ２６遺伝子座は、構成的に発現するトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）で標的化し、ＡＡＶＳ１遺伝子座はＴＥＴ応答性エレメント（ＴＲＥ）の下に目的のトランス遺伝子で標的化した。本稿全体を通じて記載されるとおりの異なる組み合わせの転写因子及び／又は核内受容体をクローニングした。鋳型ｃＤＮＡ配列は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから入手するか：ＨＮＦ６（ＭＨＳ６２７８－２１３２４４１７０）、ＨＮＦ１Ａ（ＭＨＳ６２７８－２０２８５７９０２）、ＲＯＲｙ（ＭＨＳ６２７８－２０２８００９９１）及びＥＳＲ１（ＭＨＳ６２７８－２１１６９１０５１）；又はヒト初代肝臓ｃＤＮＡ：ＨＮＦ４Ａ、ＦＯＸＡ３及びＡＲから増幅するかのいずれかであった。配列はＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して増幅した。増幅及び骨格ベクターへの配列のクローニングに使用したプライマーが上流及び下流のオーバーハングを含有したことにより、表１に挙げるとおりのＧＳＧ（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ）リンカー及び異なる２Ａペプチドが作成された。これらの異なるベクターは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により、１：３ｐｍｏｌのベクター対挿入物比を用いて構築した。標的化のため、ｈＰＳＣをＳＴＥＭｐｒｏ ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で５分間にわたって単一細胞に解離し、Ｐ３初代細胞４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して１００万個の細胞に２μｇのドナーベクター及び２μｇの各ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ発現プラスミドをトランスフェクトした。１０μＭ ＲＯＣＫ阻害薬Ｙ－２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補足したＥ８培地に細胞を播種した。５～７日後、１μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で少なくとも２日間にわたってコロニーを選択し、その後、それらを個別にピッキングし、以前に記載されているとおり遺伝子型を決定した（Ｂｅｒｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0140】
肝細胞ダイレクト分化
ｈＰＳＣをＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と共に３７℃で５分間インキュベートした後に単一細胞に解離し、１０μＭ ＲＯＣＫ阻害薬Ｙ－２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補足したＥ８培地に５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。既報告のとおり（Ｈａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、但し少し修正を加えて、肝細胞を播種後４８時間分化させた。内胚葉分化後、５日間にわたる５０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ）を補足したＲＰＭＩ－Ｂ２７分化培地で前方前腸の特異化が実現した。この前腸段階の細胞は、最長２７日間にわたるＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地：２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、２％非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、２％の化学組成が規定された脂質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１４μｇ／ｍｌのインスリン（Ｒｏｃｈｅ）、３０μｇ／ｍｌのトランスフェリン（Ｒｏｃｈｅ）、５０ｎｇ／ｍｌ肝細胞増殖因子（Ｒ＆Ｄ）、及び２０ｎｇ／ｍｌオンコスタチンＭ（Ｒ＆Ｄ）を補足したＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で肝細胞へと更に分化させた。
ｈＰＳＣをＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と共に３７℃で５分間インキュベートした後に単一細胞に解離し、１０μＭ ＲＯＣＫ阻害薬Ｙ－２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補足したＥ８培地に５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。既報告のとおり（Ｈａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、但し少し修正を加えて、肝細胞を播種後４８時間分化させた。内胚葉分化後、５日間にわたる５０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ）を補足したＲＰＭＩ－Ｂ２７分化培地で前方前腸の特異化が実現した。この前腸段階の細胞は、最長２７日間にわたるＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地：２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、２％非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、２％の化学組成が規定された脂質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１４μｇ／ｍｌのインスリン（Ｒｏｃｈｅ）、３０μｇ／ｍｌのトランスフェリン（Ｒｏｃｈｅ）、５０ｎｇ／ｍｌ肝細胞増殖因子（Ｒ＆Ｄ）、及び２０ｎｇ／ｍｌオンコスタチンＭ（Ｒ＆Ｄ）を補足したＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で肝細胞へと更に分化させた。
【0141】
肝細胞へのフォワードプログラミング
ｈＰＳＣをＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と共に３７℃で５分間インキュベートした後に単一細胞に解離し、１０μＭ ＲＯＣＫ阻害薬Ｙ－２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補足したＥ８培地に４０～５０．０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。翌日、Ｅ８培地を補充した。４８時間後、１ｍｇ／ｍｌドキシサイクリン（ｄｏｘ）を補足したＥ６培地（成長因子のないＥ８）で２４時間インキュベートすることにより、トランス遺伝子の初期誘導を実現した。次に、プロトコルの残りの期間中にわたり、細胞を１ｍｇ／ｍｌ ｄｏｘを補足したＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地に維持した。培地は次の４日間は毎日、それ以降は隔日で補充した。特別な実験のため、フォワードプログラミングの２日目から、細胞株を１００ｎＭのデスモステロール、テストステロン又はβ－エストラジオール（Ｅ２）で処理した。リガンドは全て、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、エタノール中に再構成した。３Ｄ培養のため、１５日目又は２０日目に、フォワードプログラミングした細胞をマトリゲル低成長因子基底膜マトリックス、フェノールレッド不含（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に包埋し、それぞれ５日間又は１０日間培養した。細胞をハンクス液ベースの細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）によって３７℃で２０分間にわたって解離し、マトリゲルに再懸濁し、４０～５０μＬドーム内の１ｍｇ／ｍｌ ｄｏｘを補足したＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地に播種した。
ｈＰＳＣをＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と共に３７℃で５分間インキュベートした後に単一細胞に解離し、１０μＭ ＲＯＣＫ阻害薬Ｙ－２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補足したＥ８培地に４０～５０．０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。翌日、Ｅ８培地を補充した。４８時間後、１ｍｇ／ｍｌドキシサイクリン（ｄｏｘ）を補足したＥ６培地（成長因子のないＥ８）で２４時間インキュベートすることにより、トランス遺伝子の初期誘導を実現した。次に、プロトコルの残りの期間中にわたり、細胞を１ｍｇ／ｍｌ ｄｏｘを補足したＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地に維持した。培地は次の４日間は毎日、それ以降は隔日で補充した。特別な実験のため、フォワードプログラミングの２日目から、細胞株を１００ｎＭのデスモステロール、テストステロン又はβ－エストラジオール（Ｅ２）で処理した。リガンドは全て、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、エタノール中に再構成した。３Ｄ培養のため、１５日目又は２０日目に、フォワードプログラミングした細胞をマトリゲル低成長因子基底膜マトリックス、フェノールレッド不含（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に包埋し、それぞれ５日間又は１０日間培養した。細胞をハンクス液ベースの細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）によって３７℃で２０分間にわたって解離し、マトリゲルに再懸濁し、４０～５０μＬドーム内の１ｍｇ／ｍｌ ｄｏｘを補足したＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地に播種した。
【0142】
初代ヒト肝細胞
ＲＮＡ－ｓｅｑに使用する新鮮な初代肝細胞を既報告のとおり入手した（Ｓｅｇｅｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。製造者の品質管理要件を満たした４ドナー（男性３例及び女性１例）からの初代プレーティング済み肝細胞をＢｉｏｐｒｅｄｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｅｎｎｅｓ，フランス）から購入した。細胞は、短期単層培養で、１％グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、７００ｎＭインスリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）を補足したウィリアムＥ（Ｇｉｂｃｏ）に維持した。受領後８時間以内に、ＣＹＰ３Ａ４活性測定など、機能アッセイをＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地において実施した。
ＲＮＡ－ｓｅｑに使用する新鮮な初代肝細胞を既報告のとおり入手した（Ｓｅｇｅｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。製造者の品質管理要件を満たした４ドナー（男性３例及び女性１例）からの初代プレーティング済み肝細胞をＢｉｏｐｒｅｄｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｅｎｎｅｓ，フランス）から購入した。細胞は、短期単層培養で、１％グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、７００ｎＭインスリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）を補足したウィリアムＥ（Ｇｉｂｃｏ）に維持した。受領後８時間以内に、ＣＹＰ３Ａ４活性測定など、機能アッセイをＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地において実施した。
【0143】
ＣＹＰ３Ａ４アッセイ
Ｐ４５０ Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＣＹＰ３Ａ４酵素活性の測定を実施した。細胞をＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全中１：１０００のルシフェリン－ＩＰＡと共に３７℃で１時間インキュベートした。上清を検出試薬と１：１の比で混合し、Ｇｒｅｉｎｅｒ白色９６ウェルマイクロプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）において室温で２０分間インキュベートした。発光はＧｌｏＭａｘプレートリーダーでトリプリケートで測定した。Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地をバックグラウンド対照として使用した。相対発光単位は、バックグラウンド、容積及び分化後に入手された平均総細胞数で正規化した。
Ｐ４５０ Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＣＹＰ３Ａ４酵素活性の測定を実施した。細胞をＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全中１：１０００のルシフェリン－ＩＰＡと共に３７℃で１時間インキュベートした。上清を検出試薬と１：１の比で混合し、Ｇｒｅｉｎｅｒ白色９６ウェルマイクロプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）において室温で２０分間インキュベートした。発光はＧｌｏＭａｘプレートリーダーでトリプリケートで測定した。Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地をバックグラウンド対照として使用した。相対発光単位は、バックグラウンド、容積及び分化後に入手された平均総細胞数で正規化した。
【0144】
ＬＤＬ取り込みアッセイ
ＬＤＬ取り込み能力をＬＤＬ取り込みアッセイキット（Ａｂｃａｍ）で測定した。細胞を１：１００のＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５５０にコンジュゲートしたヒトＬＤＬと共にＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地中、３７℃で３時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、４％ＰＦＡによって４℃で２０分間固定した。
ＬＤＬ取り込み能力をＬＤＬ取り込みアッセイキット（Ａｂｃａｍ）で測定した。細胞を１：１００のＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５５０にコンジュゲートしたヒトＬＤＬと共にＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地中、３７℃で３時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、４％ＰＦＡによって４℃で２０分間固定した。
【0145】
脂肪酸処理
フォワードプログラミングした細胞を２０日目から３Ｄで包埋し、ＢＳＡ（対照）、又はＢＳＡとコンジュゲートしたオレイン酸（０．２５ｍＭ）若しくはパルミチン酸（０．２５ｍＭ）のいずれかを補足したＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地において７日間培養した。細胞を１μｌ／ｍｌ Ｂｏｄｉｐｙ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に３０分間、続いてＰＢＳ中に１：１０，０００希釈したＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）と共に３０分間インキュベートすることにより細胞内脂質蓄積を検出し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡で画像化した。
フォワードプログラミングした細胞を２０日目から３Ｄで包埋し、ＢＳＡ（対照）、又はＢＳＡとコンジュゲートしたオレイン酸（０．２５ｍＭ）若しくはパルミチン酸（０．２５ｍＭ）のいずれかを補足したＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地において７日間培養した。細胞を１μｌ／ｍｌ Ｂｏｄｉｐｙ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に３０分間、続いてＰＢＳ中に１：１０，０００希釈したＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）と共に３０分間インキュベートすることにより細胞内脂質蓄積を検出し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡で画像化した。
【0146】
ＡＰＡＰ毒性
１５日目から３Ｄで培養したフォワードプログラミングした細胞を、２５ｍＭアセトアミノフェン（Ｒ＆Ｄ）を補足したＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地中で４８時間インキュベートし（１８日目～２０日目）、その後、細胞生存率を決定することにより、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）の肝毒性を試験した。
１５日目から３Ｄで培養したフォワードプログラミングした細胞を、２５ｍＭアセトアミノフェン（Ｒ＆Ｄ）を補足したＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地中で４８時間インキュベートし（１８日目～２０日目）、その後、細胞生存率を決定することにより、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）の肝毒性を試験した。
【0147】
細胞生存率
細胞を１：１０のＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地中３７℃で４時間インキュベートすることにより、細胞生存率を決定した。蛍光は、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して５６０ｎｍ／５９０ｎｍの励起／発光で測定した。
細胞を１：１０のＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地中３７℃で４時間インキュベートすることにより、細胞生存率を決定した。蛍光は、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して５６０ｎｍ／５９０ｎｍの励起／発光で測定した。
【0148】
ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＧｅｎＥｌｕｔｅ哺乳類全ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造者の指示に従い使用して、細胞又は組織のいずれかからＲＮＡを抽出した。ランダムプライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従い使用して５００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲキット低ＲＯＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２００ｎＭのフォワード及びリバースプライマー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；プライマーは表２に掲載する）と共に使用してｑＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲはテクニカルデュプリケートで実施し、２－ΔＣｔ法を用いて２つのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬＰ０及びＰＢＧＤ）の平均で正規化した。
ＧｅｎＥｌｕｔｅ哺乳類全ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造者の指示に従い使用して、細胞又は組織のいずれかからＲＮＡを抽出した。ランダムプライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従い使用して５００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲキット低ＲＯＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２００ｎＭのフォワード及びリバースプライマー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；プライマーは表２に掲載する）と共に使用してｑＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲはテクニカルデュプリケートで実施し、２－ΔＣｔ法を用いて２つのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬＰ０及びＰＢＧＤ）の平均で正規化した。
【0149】
免疫蛍光染色
単層状の細胞を４％ＰＦＡ中４℃で２０分間固定し、１０％ロバ血清（ＢｉｏＲａｄ）及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間ブロックした。固定した細胞を、表３に掲載する一次抗体と共に１％ロバ血清及び０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８、５６８又は６４７をコンジュゲートした二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に１％ロバ血清及び０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に希釈して室温で１時間インキュベートした。核を可視化するため、ＰＢＳ中に１：１０，０００希釈したＤＡＰＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（ビスベンズイミドＨ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて細胞を室温で１０分間インキュベートした。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、又はＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡のいずれかで細胞を画像化した。
単層状の細胞を４％ＰＦＡ中４℃で２０分間固定し、１０％ロバ血清（ＢｉｏＲａｄ）及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間ブロックした。固定した細胞を、表３に掲載する一次抗体と共に１％ロバ血清及び０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８、５６８又は６４７をコンジュゲートした二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に１％ロバ血清及び０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に希釈して室温で１時間インキュベートした。核を可視化するため、ＰＢＳ中に１：１０，０００希釈したＤＡＰＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（ビスベンズイミドＨ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて細胞を室温で１０分間インキュベートした。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、又はＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡のいずれかで細胞を画像化した。
【0150】
分泌タンパク質定量化
収集の２４時間前に新鮮なＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地を補充した単層培養の細胞培養上清中のアルブミン、αフェトプロテイン及びα１－アンチトリプシンを測定した。濃度はＥＬＩＳＡにより検出し（生物医学分析中央検査室（ｃｏｒｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ケンブリッジ大学病院（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ）によって実施された）、細胞数で正規化した。
収集の２４時間前に新鮮なＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地を補充した単層培養の細胞培養上清中のアルブミン、αフェトプロテイン及びα１－アンチトリプシンを測定した。濃度はＥＬＩＳＡにより検出し（生物医学分析中央検査室（ｃｏｒｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ケンブリッジ大学病院（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ）によって実施された）、細胞数で正規化した。
【0151】
ＲＮＡ－ｓｅｑ分析
未分化ｈｉＰＳＣ（ｎ＝３）、ｈＥＳＣ由来のＨＬＣ（ｎ＝２）、ｈｉＰＳＣ由来のＨＬＣ（ｎ＝６）、回収直後のＰＨＨ（ｆＰＨＨ、ｎ＝３）及び市販品を購入したＰＨＨ（ｐＰＨＨ、ｎ＝２）について、ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを作成した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ哺乳類全ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造者の指示に従い使用して、細胞又は組織のいずれかからＲＮＡを抽出した。ポリＡライブラリ調製及びシーケンシングは、ケンブリッジ・ゲノミック・サービシーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）（ｈＥＳＣ＿ＨＬＣ；ｐＰＨＨ）及びウェルカム・トラスト・サンガー研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ｈｉＰＳＣ、ｈｉＰＳＣ＿ＨＬＣ、ｆＰＨＨ）により実施された。リードのクオリティはＦａｓｔＱＣで判定した。一貫性を求めて、ｆａｓｔｑリードをシングルエンドリードに分割し、ｃｕｔａｄａｐｔバージョン２．１０を使用して同じ長さ（４０ｂｐ）にトリミングした。ｓａｌｍｏｎバージョン１．２．１を以下のパラメータ：－ｌ Ａ、－ＧＣｂｉａｓ、－ｐｏｓｂｉａｓ、－ｖａｌｉｄａｔｅｍａｐｐｉｎｇｓで使用してシングルエンドｆａｓｔｑファイルをマッピングし、定量化した（Ｐａｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。使用したインデックスは、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｒｅｆｇｅｎｏｍｅｓ．ｄａｔａｂｉｏ．ｏｒｇ）からのヒトＧＲＣｈ３８ ｃＤＮＡ参照配列から予め作成した。遺伝子発現差を、ＤＥＳｅｑ２を使用して（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、各図に図示されるとおり以下のパラメータ、ｐａｄｊ＞０．０５、ｂａｓｅｍｅａｎ＞１００及びグループ間ｌｏｇ２変化倍数＞２又は＜－２で計算した。遺伝子オントロジーエンリッチメントは、ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒパッケージで計算した（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。有意に誤調節された転写因子のパスウェイ解析をＲｅａｃｔｏｍｅＰＡを使用して判定した（Ｙｕ ＆ Ｈｅ，２０１６）。マウス肝臓ポリＡ＋ＲＮＡ－ｓｅｑをＥＮＣＯＤＥからダウンロードした（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，２０１２）。各データセットからの両方のレプリケートでシングルエンドｆａｓｔｑリードをｃｕｔａｄａｐｔバージョン２．１０を使用して７０ｂｐにトリミングした。ｓａｌｍｏｎバージョン１．２．１を以下のパラメータ：－ｌ Ａ、－Ｇｂｉａｓ、－ｓｅｑｂｉａｓ、－ｖａｌｉｄａｔｅｍａｐｐｉｎｇｓで使用して、予め作成したｍｍ１０ ｃＤＮＡ参照ゲノムを使用してｆａｓｔｑをマッピングし、定量化した。可視化のための全てのプロットの作成には、ＤｅＳｅｑ２を使用した。
未分化ｈｉＰＳＣ（ｎ＝３）、ｈＥＳＣ由来のＨＬＣ（ｎ＝２）、ｈｉＰＳＣ由来のＨＬＣ（ｎ＝６）、回収直後のＰＨＨ（ｆＰＨＨ、ｎ＝３）及び市販品を購入したＰＨＨ（ｐＰＨＨ、ｎ＝２）について、ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを作成した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ哺乳類全ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造者の指示に従い使用して、細胞又は組織のいずれかからＲＮＡを抽出した。ポリＡライブラリ調製及びシーケンシングは、ケンブリッジ・ゲノミック・サービシーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）（ｈＥＳＣ＿ＨＬＣ；ｐＰＨＨ）及びウェルカム・トラスト・サンガー研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ｈｉＰＳＣ、ｈｉＰＳＣ＿ＨＬＣ、ｆＰＨＨ）により実施された。リードのクオリティはＦａｓｔＱＣで判定した。一貫性を求めて、ｆａｓｔｑリードをシングルエンドリードに分割し、ｃｕｔａｄａｐｔバージョン２．１０を使用して同じ長さ（４０ｂｐ）にトリミングした。ｓａｌｍｏｎバージョン１．２．１を以下のパラメータ：－ｌ Ａ、－ＧＣｂｉａｓ、－ｐｏｓｂｉａｓ、－ｖａｌｉｄａｔｅｍａｐｐｉｎｇｓで使用してシングルエンドｆａｓｔｑファイルをマッピングし、定量化した（Ｐａｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。使用したインデックスは、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｒｅｆｇｅｎｏｍｅｓ．ｄａｔａｂｉｏ．ｏｒｇ）からのヒトＧＲＣｈ３８ ｃＤＮＡ参照配列から予め作成した。遺伝子発現差を、ＤＥＳｅｑ２を使用して（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、各図に図示されるとおり以下のパラメータ、ｐａｄｊ＞０．０５、ｂａｓｅｍｅａｎ＞１００及びグループ間ｌｏｇ２変化倍数＞２又は＜－２で計算した。遺伝子オントロジーエンリッチメントは、ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒパッケージで計算した（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。有意に誤調節された転写因子のパスウェイ解析をＲｅａｃｔｏｍｅＰＡを使用して判定した（Ｙｕ ＆ Ｈｅ，２０１６）。マウス肝臓ポリＡ＋ＲＮＡ－ｓｅｑをＥＮＣＯＤＥからダウンロードした（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，２０１２）。各データセットからの両方のレプリケートでシングルエンドｆａｓｔｑリードをｃｕｔａｄａｐｔバージョン２．１０を使用して７０ｂｐにトリミングした。ｓａｌｍｏｎバージョン１．２．１を以下のパラメータ：－ｌ Ａ、－Ｇｂｉａｓ、－ｓｅｑｂｉａｓ、－ｖａｌｉｄａｔｅｍａｐｐｉｎｇｓで使用して、予め作成したｍｍ１０ ｃＤＮＡ参照ゲノムを使用してｆａｓｔｑをマッピングし、定量化した。可視化のための全てのプロットの作成には、ＤｅＳｅｑ２を使用した。
【0152】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
ＣｈＩＰを既報告のとおり実施した（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。簡潔に言えば、クロマチンを１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって室温で１０分間架橋し、０．１２５Ｍグリシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でクエンチした。続いて細胞及び核を溶解させて、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｉｃｏ超音波処理装置（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）でクロマチンを超音波処理することにより、ＤＮＡを約２００～５００ｂｐに断片化した。超音波処理したクロマチンを同じ宿主ＩｇＧ及びプロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で予め清澄化し、１００μｇの清澄化されたクロマチン（タンパク質）を２μｇの以下の抗体：Ｈ３Ｋ２７ａｃ（Ａｂｃａｍ、ａｂ４７２９）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ８８９５）、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（活性モチーフ、３９１５５）及びＨ３Ｋ４ｍｅ３（Ｍｅｒｋ、０５－７４５Ｒ）と共に４℃で一晩インキュベートし、その後、３０μｌのプロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で複合体を捕捉した。複合体を洗浄し、ＲＮアーゼＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及びプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、ＤＮＡをフェノール－クロロホルム抽出によって精製し、ＧｌｙｃｏＢｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、酢酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及びエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で沈殿させた。超音波処理したクロマチン試料（１％）はまた、正規化のための入力として収集し、ＣｈＩＰシーケンシングライブラリ調製に１０ｎｇのＤＮＡを使用した。
ＣｈＩＰを既報告のとおり実施した（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。簡潔に言えば、クロマチンを１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって室温で１０分間架橋し、０．１２５Ｍグリシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でクエンチした。続いて細胞及び核を溶解させて、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｉｃｏ超音波処理装置（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）でクロマチンを超音波処理することにより、ＤＮＡを約２００～５００ｂｐに断片化した。超音波処理したクロマチンを同じ宿主ＩｇＧ及びプロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で予め清澄化し、１００μｇの清澄化されたクロマチン（タンパク質）を２μｇの以下の抗体：Ｈ３Ｋ２７ａｃ（Ａｂｃａｍ、ａｂ４７２９）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ８８９５）、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（活性モチーフ、３９１５５）及びＨ３Ｋ４ｍｅ３（Ｍｅｒｋ、０５－７４５Ｒ）と共に４℃で一晩インキュベートし、その後、３０μｌのプロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で複合体を捕捉した。複合体を洗浄し、ＲＮアーゼＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及びプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、ＤＮＡをフェノール－クロロホルム抽出によって精製し、ＧｌｙｃｏＢｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、酢酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及びエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で沈殿させた。超音波処理したクロマチン試料（１％）はまた、正規化のための入力として収集し、ＣｈＩＰシーケンシングライブラリ調製に１０ｎｇのＤＮＡを使用した。
【0153】
ＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析
ライブラリ調製並びにシーケンシング及びアラインメントは、ウェルカム・トラスト・サンガー研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ＤＮＡシーケンシング施設（Ｈｉｎｘｔｏｎ、英国）によって実施された。シーケンシングはＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ｖ４で実施され、７５ｂｐ長のペアエンドリードが入手された。ｂｗａでＣｈＩＰ－ｓｅｑリードをヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８にマッピングした。ＢＡＭ形式のアラインメントデータをｓａｍｔｏｏｌｓでソートし、インデックスを付けた。ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ ｂａｍＣｏｖｅｒａｇｅを使用してビンサイズ１０ｂｐでカバレッジファイルを作成し、ＩＧＶにおける可視化及びｄｅｅｐｔｏｏｌｓでのヒートマップ表現のためＲＰＫＭとして正規化した。主成分分析（ＰＣＡ）をプロットするため、１０００ｂｐビンの平均スコアを計算した。ピークコーリングのため、ＢＡＭファイルをＳＡＭに変換し、ｈｏｍｅｒを使用してピークをコールした（Ｈｅｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。入力に対するピークコーリングには両方のレプリケートを使用し、ここでＨ３Ｋ２７ａｃについて以下のフラグ：－ｒｅｇｉｏｎ－Ｌ ０を呼び出してローカルフィルタリングを無効にした。ＰＨＨ又はＨＬＣで特異的活性を示す調節領域を同定するため、バックグラウンドとしての全てのＨＬＣデータセットに対する標的としてＰＨＨデータセットを使用し、及び逆もまた同様に、バックグラウンドに対する濃縮倍数を４として、結合差のあるピークを決定した。モチーフエンリッチメントのため、ヌクレオソームのない領域に対してフラグ－Ｌ １ －ｎｆｒを呼び出すことによりピークコーリングを実施し、それによってＨ３Ｋ２７ａｃリッチ領域内にある「ディップ」を決定した。これらの一組の領域を上記のとおりの結合差のあるピークと重ね合わせることにより、ＰＨＨ又はＨＬＣ特異的モチーフエンリッチメントを実施した。ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ Ｒパッケージでピークアノテーション及び遺伝子オントロジーエンリッチメントを決定した（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。同じゲノムアセンブリとアラインメントした未分化ｈｉＰＳＣ ＣｈＩＰ－ｓｅｑリードはＥＮＣＯＤＥからダウンロードし（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，２０１２）、上記のとおり処理した。
ライブラリ調製並びにシーケンシング及びアラインメントは、ウェルカム・トラスト・サンガー研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ＤＮＡシーケンシング施設（Ｈｉｎｘｔｏｎ、英国）によって実施された。シーケンシングはＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ｖ４で実施され、７５ｂｐ長のペアエンドリードが入手された。ｂｗａでＣｈＩＰ－ｓｅｑリードをヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８にマッピングした。ＢＡＭ形式のアラインメントデータをｓａｍｔｏｏｌｓでソートし、インデックスを付けた。ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ ｂａｍＣｏｖｅｒａｇｅを使用してビンサイズ１０ｂｐでカバレッジファイルを作成し、ＩＧＶにおける可視化及びｄｅｅｐｔｏｏｌｓでのヒートマップ表現のためＲＰＫＭとして正規化した。主成分分析（ＰＣＡ）をプロットするため、１０００ｂｐビンの平均スコアを計算した。ピークコーリングのため、ＢＡＭファイルをＳＡＭに変換し、ｈｏｍｅｒを使用してピークをコールした（Ｈｅｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。入力に対するピークコーリングには両方のレプリケートを使用し、ここでＨ３Ｋ２７ａｃについて以下のフラグ：－ｒｅｇｉｏｎ－Ｌ ０を呼び出してローカルフィルタリングを無効にした。ＰＨＨ又はＨＬＣで特異的活性を示す調節領域を同定するため、バックグラウンドとしての全てのＨＬＣデータセットに対する標的としてＰＨＨデータセットを使用し、及び逆もまた同様に、バックグラウンドに対する濃縮倍数を４として、結合差のあるピークを決定した。モチーフエンリッチメントのため、ヌクレオソームのない領域に対してフラグ－Ｌ １ －ｎｆｒを呼び出すことによりピークコーリングを実施し、それによってＨ３Ｋ２７ａｃリッチ領域内にある「ディップ」を決定した。これらの一組の領域を上記のとおりの結合差のあるピークと重ね合わせることにより、ＰＨＨ又はＨＬＣ特異的モチーフエンリッチメントを実施した。ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ Ｒパッケージでピークアノテーション及び遺伝子オントロジーエンリッチメントを決定した（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。同じゲノムアセンブリとアラインメントした未分化ｈｉＰＳＣ ＣｈＩＰ－ｓｅｑリードはＥＮＣＯＤＥからダウンロードし（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，２０１２）、上記のとおり処理した。
【0154】
データの利用可能性
本研究に使用したＲＮＡ－ｓｅｑデータセットは、Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓにてアクセッション番号Ｅ－ＭＴＡＢ－１０６３４でアクセス可能である。加えて、ｈｉＰＳＣ＿ＨＬＣデータセットのうちの３つは、以前にアクセッション番号Ｅ－ＭＴＡＢ－６７８１で寄託されている（Ｓｅｇｅｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｃ５７ＢＬ／６肝臓胚ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットは、ＥＮＣＯＤＥデータベース（Ｎａｋａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｎｃｏｄｅｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）から、以下のアクセッション番号：ＥＮＣＳＲ２１６ＫＬＺ（Ｅ１２．５肝）、ＥＮＣＳＲ８２６ＨＩＱ（Ｅ１６．５肝）、ＥＮＣＳＲ０９６ＳＴＫ（Ｐ０肝）、ＥＮＣＳＲ０００ＢＹＳ（８週齢雌雄混合成体肝）及びＥＮＣＳＲ２１６ＫＬＺ（１０週齢成体肝）で入手した。本研究において作成したＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットは、Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓにアクセッション番号Ｅ－ＭＴＡＢ－１０６３７で寄託されており、ｈｉＰＳＣの公的に利用可能なデータセットは、ＥＮＣＯＤＥデータベースから、以下のアクセッション番号：ＥＮＣＳＲ７２９ＥＮＯ（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）、ＥＮＣＳＲ２４９ＹＧＧ（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）、ＥＮＣＳＲ３８６ＲＩＪ（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）、ＥＮＣＳＲ６５７ＤＹＬ（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）及びＥＮＣＳＲ７７３ＩＹＺ（入力）で使用した。
本研究に使用したＲＮＡ－ｓｅｑデータセットは、Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓにてアクセッション番号Ｅ－ＭＴＡＢ－１０６３４でアクセス可能である。加えて、ｈｉＰＳＣ＿ＨＬＣデータセットのうちの３つは、以前にアクセッション番号Ｅ－ＭＴＡＢ－６７８１で寄託されている（Ｓｅｇｅｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｃ５７ＢＬ／６肝臓胚ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットは、ＥＮＣＯＤＥデータベース（Ｎａｋａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｎｃｏｄｅｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）から、以下のアクセッション番号：ＥＮＣＳＲ２１６ＫＬＺ（Ｅ１２．５肝）、ＥＮＣＳＲ８２６ＨＩＱ（Ｅ１６．５肝）、ＥＮＣＳＲ０９６ＳＴＫ（Ｐ０肝）、ＥＮＣＳＲ０００ＢＹＳ（８週齢雌雄混合成体肝）及びＥＮＣＳＲ２１６ＫＬＺ（１０週齢成体肝）で入手した。本研究において作成したＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットは、Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓにアクセッション番号Ｅ－ＭＴＡＢ－１０６３７で寄託されており、ｈｉＰＳＣの公的に利用可能なデータセットは、ＥＮＣＯＤＥデータベースから、以下のアクセッション番号：ＥＮＣＳＲ７２９ＥＮＯ（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）、ＥＮＣＳＲ２４９ＹＧＧ（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）、ＥＮＣＳＲ３８６ＲＩＪ（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）、ＥＮＣＳＲ６５７ＤＹＬ（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）及びＥＮＣＳＲ７７３ＩＹＺ（入力）で使用した。
【0155】
統計的分析
統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ ９．０．０を使用して行っており、具体的な検定は図の凡例に指示している。各図について、標本サイズｎは、独立した実験又はバイオロジカルレプリケートの回数を指示し、グラフ毎に個々の値を表す。群間の検定は、少なくともｎ≧３回の独立した実験で実施しており、有意な場合には、図中に正確なｐ値を指示する。
統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ ９．０．０を使用して行っており、具体的な検定は図の凡例に指示している。各図について、標本サイズｎは、独立した実験又はバイオロジカルレプリケートの回数を指示し、グラフ毎に個々の値を表す。群間の検定は、少なくともｎ≧３回の独立した実験で実施しており、有意な場合には、図中に正確なｐ値を指示する。
【0156】
結果
肝臓に豊富に存在する転写因子により、細胞に肝細胞アイデンティティをフォワードプログラミングすることが可能になる
フォワードプログラミング方法の開発の最初の工程は、標的細胞型を特徴付ける転写ネットワークを再現することのできる転写因子のカクテルを同定することにある。しかしながら、肝細胞についてはこの工程は難題であり、これは、肝発生が単一の特異的なマスターレギュレーターによって惹起されるわけではなく、肝細胞の機能的成熟を駆動する因子が完全には解明されていないことに伴うものである。こうした制限を回避するため、本発明者らは、胎児発生の間に肝臓プログラムの誘導を制御することが公知の、体細胞変換において試験されているＬＥＴＦに焦点を置くことに決めた（Ｒｏｍｂａｕｔ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。４つのＬＥＴＦ（ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６及びＦＯＸＡ３）のコード配列をＯＰＴｉ－ＯＸシステムにクローニングし（図１Ａ）、得られた誘導性カセットをＡＶＳＳ１遺伝子セーフハーバーに標的化した（Ｂｅｒｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。選択後、個々のサブ系統をピッキングし、拡大培養し、及び遺伝子型を決定した後、更に特徴付けた。ドキシサイクリン（ｄｏｘ）を２４時間加えることで十分に、選択のｈＥＳＣにおいて各ＬＥＴＦの均一でロバストな発現が誘導され（図１Ｂ、図１Ｃ）、トランス遺伝子発現の誘導におけるこのＯＰＴｉ－ＯＸシステムの有効性が確認された。重要なことに、この誘導は、肝臓細胞への分化との関連性がなかったことから、肝細胞アイデンティティを付与するには、ＬＥＴＦ単独は十分でないことが示唆される。このように、本発明者らは、肝細胞の生存及び分化の両方を持続させることのできる培養条件をスクリーニングすることに決め（データは示さず）、最初の２４時間はＥ６培地にあった後、Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地で１４日間培養したとき、細胞は肝細胞様の形態を獲得したことを見出した（図１Ｄ）。興味深いことに、得られた細胞は、アルブミン（ＡＬＢ）、α１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ又はＳＥＲＰＩＮＡ１）及びαフェトプロテイン（ＡＦＰ）などの肝細胞マーカーを発現しており（図１Ｅ）、ダイレクト分化によって作成したＨＬＣと同等のＣＹＰ３Ａ４活性レベルを呈する（図１Ｆ）。次に、本発明者らは、この肝細胞様表現型を実現するのに、これらの４つのＬＥＴＦ全てが必須であったかどうかという問いを立てた。そのため、本発明者らは各因子を取り除くことにより、３つの因子の組み合わせを発現するｈＥＳＣサブ系統を作成した（図１）。この場合もやはり、２４時間のｄｏｘ誘導の後にタンパク質レベルでロバストで均一な発現が確認された（図１）。上記に同定した培養条件で３つのＬＥＴＦの組み合わせ各々を誘導したところ、ＡＬＢなどの肝細胞マーカーを発現する細胞を作成するには、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６又はＦＯＸＡ３が必須であることが示された（図１Ｇ）。ＨＮＦ４Ａの過剰発現は不要であるように見え、それというのも、残り３つのＬＥＴＦ（ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ３）の過剰発現によって作成した細胞は、敷石状様形態を獲得し、高いレベルのＡＬＢ、ＳＥＲＰＩＮＡ１及びＡＦＰを発現したためである（図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ）。特筆すべきことに、これらの３つのＴＦを使用して作成した肝細胞（３ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓ）は、最も高いレベルのＣＹＰ３Ａ４活性を実現しており、ＨＮＦ４Ａの過剰発現によって機能的特性の獲得が阻まれた可能性があることが示唆される（図１Ｊ）。まとめると、これらの結果は、肝細胞様細胞へのｈＰＳＣのフォワードプログラミングにＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６及びＦＯＸＡ３の過剰発現が十分であることを示すものであった。
肝臓に豊富に存在する転写因子により、細胞に肝細胞アイデンティティをフォワードプログラミングすることが可能になる
フォワードプログラミング方法の開発の最初の工程は、標的細胞型を特徴付ける転写ネットワークを再現することのできる転写因子のカクテルを同定することにある。しかしながら、肝細胞についてはこの工程は難題であり、これは、肝発生が単一の特異的なマスターレギュレーターによって惹起されるわけではなく、肝細胞の機能的成熟を駆動する因子が完全には解明されていないことに伴うものである。こうした制限を回避するため、本発明者らは、胎児発生の間に肝臓プログラムの誘導を制御することが公知の、体細胞変換において試験されているＬＥＴＦに焦点を置くことに決めた（Ｒｏｍｂａｕｔ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。４つのＬＥＴＦ（ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６及びＦＯＸＡ３）のコード配列をＯＰＴｉ－ＯＸシステムにクローニングし（図１Ａ）、得られた誘導性カセットをＡＶＳＳ１遺伝子セーフハーバーに標的化した（Ｂｅｒｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。選択後、個々のサブ系統をピッキングし、拡大培養し、及び遺伝子型を決定した後、更に特徴付けた。ドキシサイクリン（ｄｏｘ）を２４時間加えることで十分に、選択のｈＥＳＣにおいて各ＬＥＴＦの均一でロバストな発現が誘導され（図１Ｂ、図１Ｃ）、トランス遺伝子発現の誘導におけるこのＯＰＴｉ－ＯＸシステムの有効性が確認された。重要なことに、この誘導は、肝臓細胞への分化との関連性がなかったことから、肝細胞アイデンティティを付与するには、ＬＥＴＦ単独は十分でないことが示唆される。このように、本発明者らは、肝細胞の生存及び分化の両方を持続させることのできる培養条件をスクリーニングすることに決め（データは示さず）、最初の２４時間はＥ６培地にあった後、Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ完全培地で１４日間培養したとき、細胞は肝細胞様の形態を獲得したことを見出した（図１Ｄ）。興味深いことに、得られた細胞は、アルブミン（ＡＬＢ）、α１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ又はＳＥＲＰＩＮＡ１）及びαフェトプロテイン（ＡＦＰ）などの肝細胞マーカーを発現しており（図１Ｅ）、ダイレクト分化によって作成したＨＬＣと同等のＣＹＰ３Ａ４活性レベルを呈する（図１Ｆ）。次に、本発明者らは、この肝細胞様表現型を実現するのに、これらの４つのＬＥＴＦ全てが必須であったかどうかという問いを立てた。そのため、本発明者らは各因子を取り除くことにより、３つの因子の組み合わせを発現するｈＥＳＣサブ系統を作成した（図１）。この場合もやはり、２４時間のｄｏｘ誘導の後にタンパク質レベルでロバストで均一な発現が確認された（図１）。上記に同定した培養条件で３つのＬＥＴＦの組み合わせ各々を誘導したところ、ＡＬＢなどの肝細胞マーカーを発現する細胞を作成するには、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６又はＦＯＸＡ３が必須であることが示された（図１Ｇ）。ＨＮＦ４Ａの過剰発現は不要であるように見え、それというのも、残り３つのＬＥＴＦ（ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ３）の過剰発現によって作成した細胞は、敷石状様形態を獲得し、高いレベルのＡＬＢ、ＳＥＲＰＩＮＡ１及びＡＦＰを発現したためである（図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ）。特筆すべきことに、これらの３つのＴＦを使用して作成した肝細胞（３ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓ）は、最も高いレベルのＣＹＰ３Ａ４活性を実現しており、ＨＮＦ４Ａの過剰発現によって機能的特性の獲得が阻まれた可能性があることが示唆される（図１Ｊ）。まとめると、これらの結果は、肝細胞様細胞へのｈＰＳＣのフォワードプログラミングにＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６及びＦＯＸＡ３の過剰発現が十分であることを示すものであった。
【0157】
ダイレクト分化によって作成されたＨＬＣは特異的核内受容体の発現を欠いている
これらの期待の持てる結果を受けて、本発明者らは、肝成熟及び肝機能の促進において役割を果たすことのできるＴＦを加えることにより、３ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓの機能を高めることを目指した。しかしながら、肝細胞の機能的成熟を駆動する機構に関して、特に成体肝機能が確立される新生児期の辺りの情報がほとんどないため、それらの因子を同定するのは難題であることが分かった。この制限を回避するため、本発明者らは、成体ＰＨＨのトランスクリプトームプロファイルを、ｈＰＳＣからダイレクト分化によって作成したＨＬＣのトランスクリプトームと比較することに決めた。実際、ＨＬＣは、広範に特徴付けられている胎児状態に相当し（Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、一方、３ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、自然の発生には関連性が低いように思われる。この比較のため、本発明者らは、肝障害をモデル化するため（Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓｅｇｅｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、及び細胞ベース療法の適用に向けた概念実証として（Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）用いられている最先端のプロトコルを使用した（Ｈａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｏｕｂｏｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。このプロトコルは、ＳＯＸ１７を発現する内胚葉細胞の作製から始まり、それにＨＨＥＸを発現する前腸の特異化が続き、その後細胞は、ＴＢＸ３を特徴とする肝芽細胞様状態を通じて移行する（図２）。興味深いことに、ＬＥＴＦはこの分化の間にＰＨＨと同等のレベルで発現し（図２）、これらの最初の工程が自然の発生経路に従うことが確認された。得られた前駆細胞は、最終的な分化段階を経て、ＡＬＢ及びＳＥＲＰＩＮＡ１などの機能マーカーを発現するＨＬＣになる（図２Ａ、図１Ａ、図１Ｄ）。主要な肝機能を呈するにもかかわらず（Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｇｒａｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｙｉａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、ＡＦＰの発現によって示されるとおり（図２）、又はＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ａ６又はＣＹＰ２Ｃ９の活性／発現が限られていることにより示されるとおり（図１Ｂ）、ＨＬＣは「胎児」状態に相当する。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）又はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）のいずれかから作成したＨＬＣ、及び回収直後のＰＨＨ）（ｆＰＨＨ）又は単層としてインビトロ培養したＰＨＨ（ｐＰＨＨ）に対して実施したＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）は、これらの観察を強化している。最もばらつきの大きい５００個の遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）では、これらの３つの細胞型間の明確な違いが示され、未分化ｈｉＰＳＣとＰＨＨとの間でのＨＬＣクラスタリングにより、その中間的な分化状態が確認された（ＰＣ１：５２％、図２Ｃ）。ＨＬＣとＰＨＨとの差異を更に調べるため、本発明者らは、遺伝子発現差（ＤＧＥ）解析と遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析とを組み合わせて、各細胞型に特異的な遺伝子及び生物学的機能を同定した（図２Ｄ）。ＰＨＨにユニークに発現する遺伝子（クラスター１）は、生体異物に対する応答及び生体異物代謝、炎症反応及び補体活性化など、成体肝機能と関連付けられた（図２Ｅ）。ＨＬＣ及びＰＨＨの両方に発現する遺伝子（Ｈｅｐｓ；クラスター３）は、肝発生、脂肪酸代謝又は広範な細胞機能に関与した（図１Ｆ）。注目すべきことに、ＨＬＣで特異的に上方制御された遺伝子は、細胞外マトリックスの組織化及びそのインビトロ環境から生じている可能性のある様々な発生機能と関連付けられた（図２－補図１Ｆ）。本発明者らは次に、以前キュレートされたリストを使用して（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、特に転写因子（ＴＦ）に焦点を置くことに決め（図２Ｇ、図２Ｈ）、ＨＬＣに対してＰＨＨで高発現（ｐ＜０．０５、ｌｏｇ２変化倍数＞２）の３６個のＴＦを同定した。興味深いことに、リアクトームパスウェイ解析では、これらのＴＦは２つの主要な経路：ＮＦＩファミリー及び８個の核内受容体のコホートにグループ化され（図２Ｈ）、これらは肝代謝活性において役割を果たすことが公知である。まとめると、これらの観察は、ＨＬＣの「胎児」状態が、幾つかの核内受容体の欠如と関連付けられることを示しており、従って、肝細胞の機能的成熟を駆動するのにそれらの因子が必須である可能性があることが示唆される。
これらの期待の持てる結果を受けて、本発明者らは、肝成熟及び肝機能の促進において役割を果たすことのできるＴＦを加えることにより、３ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓの機能を高めることを目指した。しかしながら、肝細胞の機能的成熟を駆動する機構に関して、特に成体肝機能が確立される新生児期の辺りの情報がほとんどないため、それらの因子を同定するのは難題であることが分かった。この制限を回避するため、本発明者らは、成体ＰＨＨのトランスクリプトームプロファイルを、ｈＰＳＣからダイレクト分化によって作成したＨＬＣのトランスクリプトームと比較することに決めた。実際、ＨＬＣは、広範に特徴付けられている胎児状態に相当し（Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、一方、３ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、自然の発生には関連性が低いように思われる。この比較のため、本発明者らは、肝障害をモデル化するため（Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓｅｇｅｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、及び細胞ベース療法の適用に向けた概念実証として（Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）用いられている最先端のプロトコルを使用した（Ｈａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｏｕｂｏｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。このプロトコルは、ＳＯＸ１７を発現する内胚葉細胞の作製から始まり、それにＨＨＥＸを発現する前腸の特異化が続き、その後細胞は、ＴＢＸ３を特徴とする肝芽細胞様状態を通じて移行する（図２）。興味深いことに、ＬＥＴＦはこの分化の間にＰＨＨと同等のレベルで発現し（図２）、これらの最初の工程が自然の発生経路に従うことが確認された。得られた前駆細胞は、最終的な分化段階を経て、ＡＬＢ及びＳＥＲＰＩＮＡ１などの機能マーカーを発現するＨＬＣになる（図２Ａ、図１Ａ、図１Ｄ）。主要な肝機能を呈するにもかかわらず（Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｇｒａｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｙｉａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、ＡＦＰの発現によって示されるとおり（図２）、又はＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ａ６又はＣＹＰ２Ｃ９の活性／発現が限られていることにより示されるとおり（図１Ｂ）、ＨＬＣは「胎児」状態に相当する。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）又はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）のいずれかから作成したＨＬＣ、及び回収直後のＰＨＨ）（ｆＰＨＨ）又は単層としてインビトロ培養したＰＨＨ（ｐＰＨＨ）に対して実施したＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）は、これらの観察を強化している。最もばらつきの大きい５００個の遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）では、これらの３つの細胞型間の明確な違いが示され、未分化ｈｉＰＳＣとＰＨＨとの間でのＨＬＣクラスタリングにより、その中間的な分化状態が確認された（ＰＣ１：５２％、図２Ｃ）。ＨＬＣとＰＨＨとの差異を更に調べるため、本発明者らは、遺伝子発現差（ＤＧＥ）解析と遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析とを組み合わせて、各細胞型に特異的な遺伝子及び生物学的機能を同定した（図２Ｄ）。ＰＨＨにユニークに発現する遺伝子（クラスター１）は、生体異物に対する応答及び生体異物代謝、炎症反応及び補体活性化など、成体肝機能と関連付けられた（図２Ｅ）。ＨＬＣ及びＰＨＨの両方に発現する遺伝子（Ｈｅｐｓ；クラスター３）は、肝発生、脂肪酸代謝又は広範な細胞機能に関与した（図１Ｆ）。注目すべきことに、ＨＬＣで特異的に上方制御された遺伝子は、細胞外マトリックスの組織化及びそのインビトロ環境から生じている可能性のある様々な発生機能と関連付けられた（図２－補図１Ｆ）。本発明者らは次に、以前キュレートされたリストを使用して（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、特に転写因子（ＴＦ）に焦点を置くことに決め（図２Ｇ、図２Ｈ）、ＨＬＣに対してＰＨＨで高発現（ｐ＜０．０５、ｌｏｇ２変化倍数＞２）の３６個のＴＦを同定した。興味深いことに、リアクトームパスウェイ解析では、これらのＴＦは２つの主要な経路：ＮＦＩファミリー及び８個の核内受容体のコホートにグループ化され（図２Ｈ）、これらは肝代謝活性において役割を果たすことが公知である。まとめると、これらの観察は、ＨＬＣの「胎児」状態が、幾つかの核内受容体の欠如と関連付けられることを示しており、従って、肝細胞の機能的成熟を駆動するのにそれらの因子が必須である可能性があることが示唆される。
【0158】
ＨＬＣのエピジェネティクスの特徴付けから、核内受容体ＲＯＲｃ、ＡＲ及びＥＲαの役割が示唆される
本発明者らのトランスクリプトーム解析によって同定されたＴＦのリストを更に改良するため、本発明者らは、エピジェネティクス的構図をＨＬＣとＰＨＨとで比較することに決めた。実際、本発明者らは、ＰＨＨにおいてＴＦが結合する調節領域が、成熟に主要な機能を担っている可能性があると仮定した。Ｈ３Ｋ２７ａｃ（活性な調節領域）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（活性な又はプライミングされた調節領域）、及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３（サイレンシングされた遺伝子）を含めたヒストンマークに関してＣｈＩＰシーケンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）を実施した（Ｃｒｅｙｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。これらのマークを、ｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣの両方に由来するＨＬＣ、並びにＰＨＨにおいてプロファイリングした一方、未分化ｈｉＰＳＣを対照として使用した。予想どおり、ＰＣＡ分析によれば、分析したマークとは無関係に、ＨＬＣとｈｉＰＳＣとの間のエピジェネティクプロファイルに著しい違いがあることが示された（図３Ａ）。興味深いことに、ＨＬＣとＰＨＨとが近接したクラスターに分類されたことは、それらの細胞型がそのトランスクリプトームに差異があるにもかかわらず、そのエピジェネティクプロファイルの重要な一部を共有していることを示唆している。Ｈ３Ｋ２７ａｃを分析すると、ＨＬＣとその天然の対応物との間に最も強力な特徴的差異がもたらされ、このマークが細胞アイデンティティの確立に重要であることが確認されたとともに（図３Ａ）、ＨＬＣとＰＨＨとの間の相違を理解する上でＨ３Ｋ２７ａｃが最も情報価値のあるマークである可能性があることが示唆された。本発明者らは次に、差を見るピークコーリングを実施して、ＨＬＣと比べてＰＨＨでユニークに濃縮された活性な調節領域を（「ＰＨＨ特異的」）、及び逆もまた同様に（「ＨＬＣ特異的」）同定した（図３）。本発明者らは、ＰＨＨ又はＨＬＣのいずれかの特異的領域においてＨ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３をプロファイリングした。この分析によれば、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１がＨＬＣの「ＰＨＨ特異的」領域に存在せず、代わりにＨ３Ｋ２７ｍｅ３沈着の広がりによって広範囲に置き換えられたように見えることが明らかになった（図３Ｂ）。興味深いことに、ＨＬＣで下方制御された遺伝子では、調節領域の個別的な各部分がＨ３Ｋ２７ａｃを欠いていた（例えばＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ１Ａ、図３Ｃを参照のこと）。各一組の領域と関連付けられる遺伝子のオントロジーによれば、トランスクリプトーム解析と一致して、ステロイド、脂質及び生体異物代謝など、「ＰＨＨ特異的」な一組における幾つかの成体肝代謝過程、及び「ＨＬＣにユニークな」領域についてのある範囲の発生機能が浮かび上がった（図３）。全体的に見て、これらの結果から、成体肝機能に関与する遺伝子のサブセットに、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１プライミング並びにＨＬＣにおける全Ｈ３Ｋ２７ａｃの沈着が欠如していることが示唆された。
本発明者らのトランスクリプトーム解析によって同定されたＴＦのリストを更に改良するため、本発明者らは、エピジェネティクス的構図をＨＬＣとＰＨＨとで比較することに決めた。実際、本発明者らは、ＰＨＨにおいてＴＦが結合する調節領域が、成熟に主要な機能を担っている可能性があると仮定した。Ｈ３Ｋ２７ａｃ（活性な調節領域）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（活性な又はプライミングされた調節領域）、及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３（サイレンシングされた遺伝子）を含めたヒストンマークに関してＣｈＩＰシーケンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）を実施した（Ｃｒｅｙｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。これらのマークを、ｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣの両方に由来するＨＬＣ、並びにＰＨＨにおいてプロファイリングした一方、未分化ｈｉＰＳＣを対照として使用した。予想どおり、ＰＣＡ分析によれば、分析したマークとは無関係に、ＨＬＣとｈｉＰＳＣとの間のエピジェネティクプロファイルに著しい違いがあることが示された（図３Ａ）。興味深いことに、ＨＬＣとＰＨＨとが近接したクラスターに分類されたことは、それらの細胞型がそのトランスクリプトームに差異があるにもかかわらず、そのエピジェネティクプロファイルの重要な一部を共有していることを示唆している。Ｈ３Ｋ２７ａｃを分析すると、ＨＬＣとその天然の対応物との間に最も強力な特徴的差異がもたらされ、このマークが細胞アイデンティティの確立に重要であることが確認されたとともに（図３Ａ）、ＨＬＣとＰＨＨとの間の相違を理解する上でＨ３Ｋ２７ａｃが最も情報価値のあるマークである可能性があることが示唆された。本発明者らは次に、差を見るピークコーリングを実施して、ＨＬＣと比べてＰＨＨでユニークに濃縮された活性な調節領域を（「ＰＨＨ特異的」）、及び逆もまた同様に（「ＨＬＣ特異的」）同定した（図３）。本発明者らは、ＰＨＨ又はＨＬＣのいずれかの特異的領域においてＨ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３をプロファイリングした。この分析によれば、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１がＨＬＣの「ＰＨＨ特異的」領域に存在せず、代わりにＨ３Ｋ２７ｍｅ３沈着の広がりによって広範囲に置き換えられたように見えることが明らかになった（図３Ｂ）。興味深いことに、ＨＬＣで下方制御された遺伝子では、調節領域の個別的な各部分がＨ３Ｋ２７ａｃを欠いていた（例えばＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ１Ａ、図３Ｃを参照のこと）。各一組の領域と関連付けられる遺伝子のオントロジーによれば、トランスクリプトーム解析と一致して、ステロイド、脂質及び生体異物代謝など、「ＰＨＨ特異的」な一組における幾つかの成体肝代謝過程、及び「ＨＬＣにユニークな」領域についてのある範囲の発生機能が浮かび上がった（図３）。全体的に見て、これらの結果から、成体肝機能に関与する遺伝子のサブセットに、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１プライミング並びにＨＬＣにおける全Ｈ３Ｋ２７ａｃの沈着が欠如していることが示唆された。
【0159】
これらの遺伝子はまた、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３など、抑制的なマークも呈し得る。加えて、ＨＬＣは、肝分化と関連性のない遺伝子を含む領域において活性なヒストンマークを呈し、ｈＰＳＣから作成した細胞が、そのインビトロ状態に特異的なエピジェネティックシグネチャもまた提示することが確認される（図３）。まとめると、これらの観察から、ＨＬＣ及びＰＨＨが同じエピジェネティックアイデンティティを幅広く共有していることが示唆された。しかしながら、限られた特定の一組の調節領域の活性化はＨＬＣには見当たらず、これは、その機能的成熟の欠如を説明する。これらの領域の調節に関与している可能性のある核内受容体を同定するため、本発明者らは、Ｈ３Ｋ２７ａｃを特徴とする「ＰＨＨ特異的」領域においてモチーフエンリッチメント解析を実施した。興味深いことに、この解析によれば、アンドロゲン（ＡＲ）及びエストロゲン（ＥＲα）応答エレメント、並びにＲＯＲｃモチーフの有意な濃縮が同定されたが（図３Ｄ）、これらは、本発明者らのトランスクリプトーム解析における発現に差のある核内受容体の中でも上位に含まれるものであった。本発明者らは次に、肝器官形成の種々の段階で入手されるマウスＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを使用して（Ｅ１２．５、Ｅ１６．５、Ｐ０、８週及び１０週の成体）、発生全体を通じたこれらの核内受容体の重要性を更に調べることに決めた（図３）。興味深いことに、これらの３つの核内受容体の発現は、成体肝において特異的に上方制御されることが見出された（図３）。総じて、これらの観察によれば、成熟肝細胞を特徴付ける転写ネットワークの確立又は維持において核内受容体ＡＲ、ＥＲα及びＲＯＲｃが役割を果たしている可能性があることが示唆された。
【0160】
ＲＯＲｃの過剰発現により、フォワードプログラミングによって作成される肝細胞の機能性が増す
本発明者らは次に、ＲＯＲｃ（ＲＯＲｙ）、ＡＲ、及びＥＲα（ＥＳＲ１）が、３つのＬＥＴＦを使用して作成されるＦｏＰ－Ｈｅｐｓの機能性を更に向上させる能力について試験した。このため、本発明者らは、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６及びＦＯＸＡ３（３ＴＦ）の発現に関して誘導性のｈＥＳＣ系列を、上記で同定された核内受容体の各々と組み合わせて作成した。４ＴＦの誘導の均一性を免疫染色を用いて検証した。興味深いことに、これらの分析によれば、過剰発現した核内受容体は核に局在することが示され、それらの過剰発現により、その活性を促進するためのリガンドの必要性を回避し得る可能性があることが示唆された。本発明者らは次に、上記で同定された培養条件を用いてフォワードプログラミングを誘導し、敷石状の形態を有する倍数体細胞の産生を観察した（図４Ａ）。これらの細胞の肝細胞アイデンティティが、全ての系列でアルブミン、ＳＥＲＰＩＮＡ１／Ａ１ＡＴ及びＡＦＰの発現によって確認された（図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ）。注目すべきことに、ＲＯＲｃの過剰発現により、細胞は最も高いアルブミンタンパク質レベルを有することになり（図４Ｂ、図４Ｄ、図４Ｅ）、及びＡＦＰの発現レベルが、特に３０日間にわたる分化後に低くなった（図４Ｄ、図４Ｅ）。ＣＹＰ３Ａ４活性レベルもまた、３ＴＦのみでリプログラミングした細胞と比較したとき、ＲＯＲｃの存在下で作成した細胞で有意に高くなった（図４Ｆ）。本発明者らは次に、各核内受容体に特異的な外因性リガンドによる刺激が、ＣＹＰ３Ａ４活性（ＲＯＲｃについてデスモステロール、ＥＲαについてβ－エストラジオール及びＡＲについてテストステロン）によって測定したときの機能的成熟を更に誘導し得るかどうかを試験した。興味深いことに、β－エストラジオール処理のみが、ＣＹＰ３Ａ４活性の３倍の増加をもたらし、一方、テストステロン処理ではＣＹＰ３Ａ４活性が有意に低下し、デスモステロールは何ら効果がなかった（図４Ｇ）。この増加は、３ＴＦ Ｆｏｐ－Ｈｅｐｓでは観察されなかったため、従ってこれらのリガンドの効果がそれらの受容体の過剰発現に関係していたことが示唆される。
本発明者らは次に、ＲＯＲｃ（ＲＯＲｙ）、ＡＲ、及びＥＲα（ＥＳＲ１）が、３つのＬＥＴＦを使用して作成されるＦｏＰ－Ｈｅｐｓの機能性を更に向上させる能力について試験した。このため、本発明者らは、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６及びＦＯＸＡ３（３ＴＦ）の発現に関して誘導性のｈＥＳＣ系列を、上記で同定された核内受容体の各々と組み合わせて作成した。４ＴＦの誘導の均一性を免疫染色を用いて検証した。興味深いことに、これらの分析によれば、過剰発現した核内受容体は核に局在することが示され、それらの過剰発現により、その活性を促進するためのリガンドの必要性を回避し得る可能性があることが示唆された。本発明者らは次に、上記で同定された培養条件を用いてフォワードプログラミングを誘導し、敷石状の形態を有する倍数体細胞の産生を観察した（図４Ａ）。これらの細胞の肝細胞アイデンティティが、全ての系列でアルブミン、ＳＥＲＰＩＮＡ１／Ａ１ＡＴ及びＡＦＰの発現によって確認された（図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ）。注目すべきことに、ＲＯＲｃの過剰発現により、細胞は最も高いアルブミンタンパク質レベルを有することになり（図４Ｂ、図４Ｄ、図４Ｅ）、及びＡＦＰの発現レベルが、特に３０日間にわたる分化後に低くなった（図４Ｄ、図４Ｅ）。ＣＹＰ３Ａ４活性レベルもまた、３ＴＦのみでリプログラミングした細胞と比較したとき、ＲＯＲｃの存在下で作成した細胞で有意に高くなった（図４Ｆ）。本発明者らは次に、各核内受容体に特異的な外因性リガンドによる刺激が、ＣＹＰ３Ａ４活性（ＲＯＲｃについてデスモステロール、ＥＲαについてβ－エストラジオール及びＡＲについてテストステロン）によって測定したときの機能的成熟を更に誘導し得るかどうかを試験した。興味深いことに、β－エストラジオール処理のみが、ＣＹＰ３Ａ４活性の３倍の増加をもたらし、一方、テストステロン処理ではＣＹＰ３Ａ４活性が有意に低下し、デスモステロールは何ら効果がなかった（図４Ｇ）。この増加は、３ＴＦ Ｆｏｐ－Ｈｅｐｓでは観察されなかったため、従ってこれらのリガンドの効果がそれらの受容体の過剰発現に関係していたことが示唆される。
【0161】
ＲＯＲｃで作成したＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、最も高いレベルの機能性を有するように見えたため、従って本発明者らは、代替的な多能性幹細胞株におけるこの因子の組み合わせの潜在的能力を検証することに決めた。本発明者らは、３ＴＦ又は３ＴＦ＋ＲＯＲｃ ＦｏＰシステムでＯｐｔｉ－ＯＸ ｈｉＰＳＣを作成し、２４時間のｄｏｘ処理後にこれらの因子の上方制御、次に誘導された分化を、上記で確立されたプロトコルに従い検証した。ＲＯＲｃが過剰発現したとき、ｈｉＰＳＣに由来するＦｏＰ－Ｈｅｐｓはまた敷石状の形態も呈し（図５Ａ）、アルブミン、ＡＦＰ及びＳＥＲＰＩＮＡ１／Ａ１ＡＴをより高いレベルで発現した（図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ）。加えて、ＲＯＲｃが存在することにより、基礎的なＣＹＰ３Ａ４活性が有意に増加し、それによってこの因子がＦｏＰ－Ｈｅｐｓの機能的成熟度に及ぼす正の効果が確認された（図５Ｆ）。全体的に見て、これらの結果から、特定の核内受容体の過剰発現がＦｏＰ肝細胞の作成と同等であったことが示された。詳細には、ＲＯＲｃの過剰発現により、３つのＬＥＴＦの過剰発現によって作成した肝細胞の機能性を向上させることができたことから、肝細胞成熟におけるこの核内受容体の役割が確認された。
【0162】
４ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓはインビトロで機能的特徴を呈する
次に、本発明者らは、ダイレクト分化によって作成したＨＬＣ及びＰＨＨとの比較において、ｈＥＳＣ（ｅＦｏＰ－Ｈｅｐｓ）又はｈｉＰＳＣ（ｉＦｏＰ－Ｈｅｐｓ）のいずれかに由来する４ＴＦ（ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ３及びＲＯＲｃ）ＦｏＰ－Ｈｅｐｓの機能性を更に特徴付けようとした。ＣＹＰ３Ａ４活性は、３０日間の定方向分化後にＨＬＣによって実現したものと比べて、２０日後のフォワードプログラミングした４ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおいて有意に高かった（図６Ａ）。加えて、本発明者らは、フェーズＩ（シトクロムＰ４５０酵素）及びフェーズＩＩ（ＵＧＴ）生体内変換、糖新生（Ｇ６ＰＣ及びＰＣＫ１）及び脂質（ＰＰＡＲ、ＰＰＡＲｙ、ＦＡＳＮ及びＡＰＯＡ１）及び胆汁酸（ＮＲ１Ｈ４）代謝など、肝代謝機能に関連するマーカーの発現を分析した。ＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、ある種の範囲のこれらの機能マーカーを発現したことから、肝機能性の獲得が確認された（図６Ｂ、図６Ｃ）。全体的に見て、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓで増加した糖新生遺伝子を除いては、フォワードプログラミングによって実現した発現レベルは、ダイレクト分化によって実現したレベルと等価であった（図６Ｃ）。興味深いことに、糖新生及び脂質代謝遺伝子の発現は、ＦｏＰ－ＨｅｐｓとＰＨＨとの間で同等であった。しかしながら、シトクロムＰ４５０遺伝子の誘導は依然として難題であり、この特定の肝機能の獲得には、本発明者らのプロトコルの更なる改良が必要となり得るであろうことが指摘される（図６Ｂ）。注目すべきことに、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓでは、ＲＯＲｃは、本発明者らのプロトコルの終了時においても生理的レベルで発現したままであった（図６Ｂ）。成熟肝細胞マーカーの発現に加えて、ｅＦｏＰ－Ｈｅｐｓ及びｉＦｏＰ－Ｈｅｐｓはまた、培養培地からのＬＤＬの取り込みも可能であったことから、脂質を輸送するそれらの能力が確認された（図６Ｄ）。脂質を代謝するその能力を更に調べるため、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓを更に５日間（Ｄ２０）又は１０日間（Ｄ３０）にわたって３Ｄで成長させた。これは、本発明者らが最近になって、かかる培養条件がＨＬＣにおける脂質蓄積を促進することを観察したことに伴うものである（Ｃａｒｏｌａ Ｍｏｒｅｌｌ、私信）。本発明者らは初めに、３Ｄで成長させたＦｏＰ－Ｈｅｐｓが肝細胞マーカーの発現を保持していることを確認した（図６Ｅ）。興味深いことに、これらの条件でＳＥＲＰＩＮＡ１又はＵＧＴ１Ａ６の発現が増加したことから、機能的成熟の増加が３Ｄで促進されたことが示唆される（図６Ｅ）。本発明者らは次に、ｅＦｏＰ及びｉＦｏＰ－Ｈｅｐｓの両方が脂肪酸に応答する能力について、これらの細胞を、それぞれ脂肪症及び脂肪毒性を誘導することが公知のオレイン酸（ＯＡ）及びパルミチン酸（ＰＡ）の両方で処理することにより試験した（Ｒｉｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。肝細胞に対するその公知の効果と一致して、ＯＡ処理は、ＢＯＤＩＰＹ染色によって示されるとおりの脂質の強力な蓄積を誘導し（図６Ｆ）、一方で、ＰＡ処理は、脂肪毒性と一致する細胞生存率の低下を誘導した（図６Ｇ）。このように、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、その一次的な対応物と同様に脂肪酸に応答するように見える。最後に、本発明者らは、パラセタモール／アセトアミノフェンの肝毒性効果をモデル化する際のＦｏＰ－Ｈｅｐｓの利益を調べた。このため、肝不全を誘導することが公知のアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）用量の存在下でＦｏｐ－Ｈｅｐｓを成長させた。この処理により、細胞生存率が５０％低下したことから（図６Ｈ）、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓを細胞毒性研究に使用できる可能性があることが示唆される。要約すれば、これらの結果から、ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣのいずれに由来する４ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓも、薬物、脂質、グルコース及び胆汁酸代謝に関与する遺伝子の発現、培養培地からＬＤＬ及び脂肪酸を取り込む能力、並びに肝毒性因子に対する応答など、機能性の肝細胞の特徴を呈することが示され、それらがインビトロでの肝障害のモデル化及び毒性スクリーニングに利益がある可能性があることが実証された。
次に、本発明者らは、ダイレクト分化によって作成したＨＬＣ及びＰＨＨとの比較において、ｈＥＳＣ（ｅＦｏＰ－Ｈｅｐｓ）又はｈｉＰＳＣ（ｉＦｏＰ－Ｈｅｐｓ）のいずれかに由来する４ＴＦ（ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ３及びＲＯＲｃ）ＦｏＰ－Ｈｅｐｓの機能性を更に特徴付けようとした。ＣＹＰ３Ａ４活性は、３０日間の定方向分化後にＨＬＣによって実現したものと比べて、２０日後のフォワードプログラミングした４ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓにおいて有意に高かった（図６Ａ）。加えて、本発明者らは、フェーズＩ（シトクロムＰ４５０酵素）及びフェーズＩＩ（ＵＧＴ）生体内変換、糖新生（Ｇ６ＰＣ及びＰＣＫ１）及び脂質（ＰＰＡＲ、ＰＰＡＲｙ、ＦＡＳＮ及びＡＰＯＡ１）及び胆汁酸（ＮＲ１Ｈ４）代謝など、肝代謝機能に関連するマーカーの発現を分析した。ＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、ある種の範囲のこれらの機能マーカーを発現したことから、肝機能性の獲得が確認された（図６Ｂ、図６Ｃ）。全体的に見て、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓで増加した糖新生遺伝子を除いては、フォワードプログラミングによって実現した発現レベルは、ダイレクト分化によって実現したレベルと等価であった（図６Ｃ）。興味深いことに、糖新生及び脂質代謝遺伝子の発現は、ＦｏＰ－ＨｅｐｓとＰＨＨとの間で同等であった。しかしながら、シトクロムＰ４５０遺伝子の誘導は依然として難題であり、この特定の肝機能の獲得には、本発明者らのプロトコルの更なる改良が必要となり得るであろうことが指摘される（図６Ｂ）。注目すべきことに、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓでは、ＲＯＲｃは、本発明者らのプロトコルの終了時においても生理的レベルで発現したままであった（図６Ｂ）。成熟肝細胞マーカーの発現に加えて、ｅＦｏＰ－Ｈｅｐｓ及びｉＦｏＰ－Ｈｅｐｓはまた、培養培地からのＬＤＬの取り込みも可能であったことから、脂質を輸送するそれらの能力が確認された（図６Ｄ）。脂質を代謝するその能力を更に調べるため、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓを更に５日間（Ｄ２０）又は１０日間（Ｄ３０）にわたって３Ｄで成長させた。これは、本発明者らが最近になって、かかる培養条件がＨＬＣにおける脂質蓄積を促進することを観察したことに伴うものである（Ｃａｒｏｌａ Ｍｏｒｅｌｌ、私信）。本発明者らは初めに、３Ｄで成長させたＦｏＰ－Ｈｅｐｓが肝細胞マーカーの発現を保持していることを確認した（図６Ｅ）。興味深いことに、これらの条件でＳＥＲＰＩＮＡ１又はＵＧＴ１Ａ６の発現が増加したことから、機能的成熟の増加が３Ｄで促進されたことが示唆される（図６Ｅ）。本発明者らは次に、ｅＦｏＰ及びｉＦｏＰ－Ｈｅｐｓの両方が脂肪酸に応答する能力について、これらの細胞を、それぞれ脂肪症及び脂肪毒性を誘導することが公知のオレイン酸（ＯＡ）及びパルミチン酸（ＰＡ）の両方で処理することにより試験した（Ｒｉｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。肝細胞に対するその公知の効果と一致して、ＯＡ処理は、ＢＯＤＩＰＹ染色によって示されるとおりの脂質の強力な蓄積を誘導し（図６Ｆ）、一方で、ＰＡ処理は、脂肪毒性と一致する細胞生存率の低下を誘導した（図６Ｇ）。このように、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、その一次的な対応物と同様に脂肪酸に応答するように見える。最後に、本発明者らは、パラセタモール／アセトアミノフェンの肝毒性効果をモデル化する際のＦｏＰ－Ｈｅｐｓの利益を調べた。このため、肝不全を誘導することが公知のアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）用量の存在下でＦｏｐ－Ｈｅｐｓを成長させた。この処理により、細胞生存率が５０％低下したことから（図６Ｈ）、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓを細胞毒性研究に使用できる可能性があることが示唆される。要約すれば、これらの結果から、ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣのいずれに由来する４ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓも、薬物、脂質、グルコース及び胆汁酸代謝に関与する遺伝子の発現、培養培地からＬＤＬ及び脂肪酸を取り込む能力、並びに肝毒性因子に対する応答など、機能性の肝細胞の特徴を呈することが示され、それらがインビトロでの肝障害のモデル化及び毒性スクリーニングに利益がある可能性があることが実証された。
【0163】
５ＴＦ ＦｏＰ－Ｈｅｐｓはインビトロで機能的特徴を呈する
次に、本発明者らは、４ＴＦ ｉＦｏＰ－Ｈｅｐｓとの比較において、ｈｉＰＳＣに由来する５ＴＦ（ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ３、ＲＯＲｃ、ＥＲα）ＦｏＰ－Ｈｅｐｓ（ｉＦｏＰ－Ｈｅｐｓ）の機能性を更に特徴付けようとした。エストロゲン（ｅｏｓｔｒｏｇｅｎ）の存在下又は非存在下で５ＴＦが過剰発現すると、肝細胞に似た細胞の産生が可能になる（図７Ｂ）。これらの細胞は、主要な肝細胞マーカーを発現することが示された（図７Ｃ及び図７Ｄ）。５ＦＴで作成したｉＦｏｐ－Ｈｅｐｓはまた、高いレベルのＣＹＰ３Ａ４活性（図７Ｅ）、脂質輸送／蓄積（図７Ｆ）及び脂肪毒性（図７Ｇ）を呈することも見出された。
次に、本発明者らは、４ＴＦ ｉＦｏＰ－Ｈｅｐｓとの比較において、ｈｉＰＳＣに由来する５ＴＦ（ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ３、ＲＯＲｃ、ＥＲα）ＦｏＰ－Ｈｅｐｓ（ｉＦｏＰ－Ｈｅｐｓ）の機能性を更に特徴付けようとした。エストロゲン（ｅｏｓｔｒｏｇｅｎ）の存在下又は非存在下で５ＴＦが過剰発現すると、肝細胞に似た細胞の産生が可能になる（図７Ｂ）。これらの細胞は、主要な肝細胞マーカーを発現することが示された（図７Ｃ及び図７Ｄ）。５ＦＴで作成したｉＦｏｐ－Ｈｅｐｓはまた、高いレベルのＣＹＰ３Ａ４活性（図７Ｅ）、脂質輸送／蓄積（図７Ｆ）及び脂肪毒性（図７Ｇ）を呈することも見出された。
【0164】
本研究では、本発明者らは、ｈＰＳＣを肝細胞にフォワードプログラミングする方法を確立した。この手法の成功は、初期肝発生を制御する因子と成体肝機能の調節因子とを組み合わせるＴＦの選択に依存している。それにもかかわらず、ほとんどのフォワードプログラミング方法は、ｈＰＳＣを特異的細胞型に変換するのにマスターレギュレーターに頼る。例として、ニューロン及び筋細胞は、それぞれＮＧＮ２及びＭＹＯＤの単純な過剰発現によって作成することができる（Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。本発明者らの結果は、肝細胞の作製に、３つの転写因子が関わる一層複雑な過程が必要であるが、初代肝細胞を支持する培養培地もまた必要であることを示している。更には、本発明者らの最良のＬＥＴＦの組み合わせには、成体肝における肝細胞機能の主要な調節因子であることが公知のＨＮＦ４Ａは含まれなかった。むしろ逆に、ＨＮＦ４Ａを取り除くと、作成された肝細胞のアイデンティティが有意に向上した。同様の観察が、ヒト臍帯静脈内皮細胞から二分化能の肝細胞前駆細胞への直接のリプログラミングについても最近報告されており、ここではＨＮＦ４Ａが有害であることが見出された（Ｉｎａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ＨＮＦ４Ａは、成体肝のみならず、発生の間にもまた、特に肝芽の確立において必須である（Ｇｏｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。このように、ＨＮＦ４Ａは、肝芽細胞など、胎児肝臓細胞の維持においても役割を有する可能性があり、フォワードプログラミング中のその過剰発現により、成体肝細胞アイデンティティの獲得が阻まれる可能性がある。この例は、成体肝でユニークに発現する因子を同定するという難題を例示している。重要なことには、ＬＥＴＦ過剰発現によって作成したＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、成体機能が低下した肝細胞アイデンティティを獲得したことから、この転写カクテルはｈｉＰＳＣを胎児様細胞にしか変換しない可能性があることが示唆される。このように、本発明者らは、肝臓の機能的成熟を導くことのできる因子を追加することに決めた。この最後のカテゴリーの因子は、ＰＨＨ及びダイレクト分化によって作成したＨＬＣのトランスクリプトーム及びエピジェネティクスの比較を実施することにより同定された。ＨＬＣに焦点を置くのは、その十分に特徴付けられた胎児状態、及びまたこれらの細胞での広範な経験にも基づいた。これらの分析から、ＰＨＨ及び成体肝においてのみ発現する核内受容体のサブセットが同定され、それによって本発明者らの手法の妥当性が確認された。特に興味深いことに、ＲＯＲｃ、ＥＲα及びＡＲが、肝細胞における機能的成熟を制御する主要な候補として同定された。重要なことには、核内受容体は、脂質及びグルコース恒常性、胆汁酸クリアランス、生体異物検知及び再生を含め、多様な肝機能を制御することが周知である（Ｒｕｄｒａｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ステロイドホルモン受容体ＥＲ及びＡＲの両方とも、肝臓のエネルギー恒常性の調節において役割を担うことが示されている（Ｓｈｅｎ ＆ Ｓｈｉ，２０１５）。その上、ＥＲはコレステロールクリアランスに関与し（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、肝再生（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）及びＣＹＰ２Ａ６を通じたビリルビン代謝（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）ともまた関連付けられている。ＲＯＲｃは、肝臓、筋肉及び脂肪組織を含めた末梢組織に発現する核内受容体であり、概日時計とグルコース／脂質代謝との間の仲介役として機能することが提唱されている（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。その上、ＲＯＲｙ欠損マウスは、インスリン感受性並びに糖新生、脂質代謝マーカー、及び胆汁酸合成に関与するフェーズＩ酵素及びフェーズＩＩ酵素のサブセットの発現低下を呈する（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｔａｋｅｄａ，Ｋａｎｇ，Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｔａｋｅｄａ，Ｋａｎｇ，Ｌｉｈ，ｅｔ ａｌ．，２０１４）。これらの先行の報告に基づき、本発明者らは、ＲＯＲｃ及び他の核内受容体が過剰発現すると、ＬＥＴＦの過剰発現によって誘導される肝臓のコンテクストで標的遺伝子のサブセットが活性化することにより、ＦｏＰ－Ｈｅｐｓの特定の機能が向上する可能性があることを提唱する。重要なことに、肝細胞の機能性は肝小葉全体で空間的に異なり、酸素勾配、栄養素及びシグナル伝達の影響を受けている（Ｔｒｅｆｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。このように各肝区域に分かれていることにより、異なるトランスクリプトームプログラムの制御下にあるグルコース、脂質、鉄、又は更には生体異物までもに関して異なる代謝過程が駆動される（Ｈａｌｐｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。従って、本発明者らは、ＬＥＴＦの過剰発現によって誘導されるバックグラウンドとなる核内因子の種々の組み合わせにより、特徴的な個別の機能レパートリーを持つ肝細胞の産生が実現する可能性があると予想する。
【0165】
４ＴＦ（ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ３及びＲＯＲｃ）の過剰発現で作成したＦｏＰ－Ｈｅｐｓは、アルブミン及びＡ１ＡＴ分泌、基礎ＣＹＰ３Ａ４活性、フェーズＩ／フェーズＩＩ酵素の発現、糖新生及び脂質代謝マーカー、ＬＤＬ及び脂肪酸を取り込む能力並びに毒性化合物に対する応答を含め、成体肝細胞の機能的特徴を呈した。それにもかかわらず、ＣＹＰ３Ａ４発現は依然として限られており、この遺伝子は、インビトロでの誘導が依然として困難である。このように、ＰＨＨが呈する機能活性を全範囲にわたって呈するＦｏＰ－Ｈｅｐｓを作成するには、追加のＴＦが必須である可能性がある。同様に、培養条件により、主要な肝機能の支持が更に向上する可能性がある。実際、本発明者らのプロトコルで使用される基本培地はＰＨＨの脱分化を妨げないため、フォワードプログラミングによる完全に機能性の細胞の作製とは適合しない可能性がある。それにもかかわらず、ここで確立したフォワードプログラミング方法は、従来の定方向分化プロトコルに優る幾つかの利点を提示する。これは、ロバストな二段階方法であり、バッチ間変動に結び付くことの多い多段階分化の必要性を回避する。更には、フォワードプログラミングはより速く、ダイレクト分化の３０～３５日と対照的に、２０日で機能的細胞を作成する。最後に、細胞の収率は良好で、大規模生産に適しているように見える。実際、本発明者らは、フォワードプログラミングが分化時に６～８倍の細胞数増加を伴った一方、ダイレクト分化の収率はそれより低いことを観察した。まとめると、本発明者らの結果は、フォワードプログラミングを用いて肝細胞を作成する初めての方法を表している。この手法は、疾患のモデル化及び薬物スクリーニングにおける種々の適用に関連性のある様々な機能を呈する特殊化した肝細胞のハイスループットな大規模生産に向けた第一歩に相当する。
【0166】
配列
【0167】
【表1】
【0168】
【表2】
【0169】
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Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１５，Ａｐｒ）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１６（４），３８６－３９９．
Ｙｉａｎｇｏｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ（２０１８，Ａｐｒ ５）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２２（４），４８５－４９９．
Ｙｕ，Ｇ．，＆Ｈｅ，Ｑ．Ｙ．（２０１６，Ｆｅｂ）．Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ，１２（２），４７７－４７９．
Ｙｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ（２０１２，Ｍａｙ） ＯＭＩＣＳ， １６（５）， ２８４－２８７．
Ｙｕｓａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ（２０１１，Ｏｃｔ ２０）．Ｎａｔｕｒｅ，４７８（７３６９），３９１－３９４．
Ｚｈａｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ（２０１３，Ｊａｎ）．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２３（１），１５７－１６１．
Ｚｈｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ（２０１８，Ｆｅｂ）．Ｍｏｌ Ｍｅｔａｂ，８，１０６－１１６．
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Ｂｅｒｔｅｒｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１６，Ｄｅｃ １）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４３（２３），４４０５－４４１８．
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Ｄｈａｗａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ（２０２０，Ｍａｙ）Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ，７２（５），８７７－８８４
Ｄｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ（２０１４ Ｍａｒ ６）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １４（３）３９４－４０３．
Ｇｏｒｄｉｌｌｏ，Ｍ ｅｔ ａｌ（２０１５，Ｊｕｎ １５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４２（１２），２０９４－２１０８．
Ｇｒａｎｄｙ，Ｒ．ｅｔ ａｌ（２０１９，Ｊａｎ ２４）．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ １４，４４９－４６８．
Ｈａｌｐｅｒｎ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ ａｌ（２０１７，Ｆｅｂ １６）．Ｎａｔｕｒｅ，５４２（７６４１），３５２－３５６
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Ｈｅｉｎｚ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０，Ｍａｙ ２８）．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３８（４）５７６－５８９
Ｈｕａｎｇ，Ｐ．ｅｔ ａｌ（２０１４，Ｍａｒ ６）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １４（３）３７０－３８４．
Ｉｎａｄａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（２０２０，Ｏｃｔ ２１）．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，１１（１）５２９２．
Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ ａｌ（２００７，Ｏｃｔ ２２）．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３１（２）２８１－２９４．
Ｋａｏ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ（２０１７，Ｎｏｖ）．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２６（１１）１８２２－１８２９．
Ｋａｏ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ（２０１８）．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，８（１０），２６７２－２６８２．
Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１８，Ｏｃｔ ４）．Ｃｅｌｌ，１７５（２），５９８－５９９．
Ｌａｕ，Ｈ．Ｈ ｅｔ ａｌ（２０１８，Ｍａｙ）．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ，６８（５），１０３３－１０４８．
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Ｐａｔｒｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ（２０１７，Ａｐｒ）．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４（４），４１７－４１９
Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（２０１７，Ａｐｒ １１）．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８（４）８０３－８１２．
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Ｒｏｍｂａｕｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（２０２１，Ｍａｙ １１）．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．７５ ６９０－７０５
Ｒｕｄｒａｉａｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（２０１６）．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ，５６，６０５－６２６．
Ｓｃｈｒｅｍ，Ｈ．ｅｔ ａｌ（２００２，Ｍａｒ）．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ，５４（１），１２９－１５８．
Ｓｅｇｅｒｉｔｚ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ ａｌ（２０１８，Ｏｃｔ）．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ，６９（４），８５１－８６０．
Ｓｈｅｎ，Ｍ．，＆ Ｓｈｉ，Ｈ．（２０１５）．Ｉｎｔ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１５，２９４２７８．
Ｓｉｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１５ ４ ５ ９３９－９５２
Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ，Ｋ．ｅｔ ａｌ（２０１０，Ｆｅｂ １６）Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，１８（２）１７５－１８９．
Ｓｚｋｏｌｎｉｃｋａ，Ｄ．，＆Ｈａｙ，Ｄ．Ｃ．（２０１６，Ｊｕｎ）．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，８１３ ３４（６），１４２１－１４２６．
Ｔａｋｅｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２０１４）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，
Ｔａｋｅｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ（２０１４）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４２（１６），１０４４８－
Ｔｏｕｂｏｕｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ（２０１０，Ｍａｙ）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，
Ｔｒｅｆｔｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ（２０１７，Ｎｏｖ ６）．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ，２７（２１），
Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１５，Ａｐｒ）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１６（４），３８６－３９９．
Ｙｉａｎｇｏｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ（２０１８，Ａｐｒ ５）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２２（４），４８５－４９９．
Ｙｕ，Ｇ．，＆Ｈｅ，Ｑ．Ｙ．（２０１６，Ｆｅｂ）．Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ，１２（２），４７７－４７９．
Ｙｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ（２０１２，Ｍａｙ） ＯＭＩＣＳ， １６（５）， ２８４－２８７．
Ｙｕｓａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ（２０１１，Ｏｃｔ ２０）．Ｎａｔｕｒｅ，４７８（７３６９），３９１－３９４．
Ｚｈａｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ（２０１３，Ｊａｎ）．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２３（１），１５７－１６１．
Ｚｈｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ（２０１８，Ｆｅｂ）．Ｍｏｌ Ｍｅｔａｂ，８，１０６－１１６．
【図1A-C】
【図1D-E】
【図1F-G】
【図1H-I】
【図1J】
【図2A】
【図2B-C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図3A】
【図3B】
【図3C-D】
【図4A-C】
【図4D】
【図4E】
【図4F-G】
【図5A】
【図5B-C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E-F】
【図6G-H】
【図7A-C】
【図7D-E】
【図7F-G】
【配列表】
【国際調査報告】