特表 2024-531600 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用の応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用の応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/742 20150101AFI20240822BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/444 20060101ALI20240822BHJP

【ＦＩ】

A61K35/742

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K31/444

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024514748

(86)(22)【出願日】2022-10-09

(85)【翻訳文提出日】2024-03-06

(86)【国際出願番号】 CN2022124089

(87)【国際公開番号】W WO2023056972

(87)【国際公開日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】202111177878.9

(32)【優先日】2021-10-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522179507

【氏名又は名称】施慧達薬業集団（吉林）有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＩＨＵＩＤＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＧＲＯＵＰ （ＪＩＬＩＮ） ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ９９９， Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ， Ｂａｉｓｈａｎ， Ｊｉｌｉｎ， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110003823

【氏名又は名称】弁理士法人柳野国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】王勇

(72)【発明者】

【氏名】劉園園

(72)【発明者】

【氏名】張文華

(72)【発明者】

【氏名】▲シン▼艶秋

(72)【発明者】

【氏名】王少鵬

(72)【発明者】

【氏名】王丹

(72)【発明者】

【氏名】朱紅

(72)【発明者】

【氏名】徐興魯

(72)【発明者】

【氏名】姜聖彪

(72)【発明者】

【氏名】李暁楠

(72)【発明者】

【氏名】鄭嘉輝

(72)【発明者】

【氏名】張蓉

(72)【発明者】

【氏名】楊冬霞

(72)【発明者】

【氏名】▲ガオ▼玉霞

(72)【発明者】

【氏名】邵石麗

(72)【発明者】

【氏名】韓停

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA362

4C084ZB261

4C084ZC751

4C084ZC752

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC19

4C086GA08

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA36

4C086ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC68

4C087CA09

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用のガン治療における応用に関する。本発明は、初めてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量腫瘍血管新生阻害剤の併用により、腫瘍中のＭ２型マクロファージ、ＭＤＳＣなどの浸潤を低下させ、そして腫瘍中のＴＧＦβ数を減少させ、ＴＭＥ中の抗腫瘍免疫応答の抑制作用を低下させることを発見した。同時に低用量腫瘍血管新生阻害剤の併用により、ＣＤ８^＋、ＣＤ３^＋Ｔ、Ｆ４／８０^＋などの免疫細胞の腫瘍への浸潤を促進し、腫瘍中の免疫微小環境を改善し、抗腫瘍治療効果を増強することができる。本発明は、末期悪性実体腫瘍タイプに応用でき、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量のＡｉｔａｎの併用により、ＴＭＥ中の抗腫瘍免疫応答抑制作用を低下させることにより、ＴＭＥを免疫抑制から免疫活性化状態に変化させ、高効率的な抗腫瘍を実現する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍を治療するための医薬品の製造におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用の応用。

【請求項2】

前記薬物は、ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋Ｔ、ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ及びＦ４／８０^＋浸潤を促進し、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＧＭ－ＣＳＦ発現の増強を誘導し、ＴＧＦβの発現を低下させ、マクロファージＴＡＭ、及び骨髄由来免疫抑制細胞ＭＤＳＣの数を低下させ、免疫抑制を減少させる医薬製品を含むことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項3】

前記薬物は、腫瘍血管の正常化を誘導し、ＴＭＥを免疫抑制から免疫活性化状態に変化させる薬物を含むことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項4】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌ＭＷ－ＤＣＧ－ＬＣｖ－２６菌株（オーストラリア国家計量研究院に保管され、菌株番号はＶ１２／００１４８６であり）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株であることを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項5】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株は、ＭＷ－ＤＣＧ－ＨＮＣｖ－１８菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８５であり）、またはＭＷ－ＤＣＧ－ＣＣｖ－１７菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株の保存番号はＶ１２／００１４８７であり）を含むことを特徴とする請求項４に記載の応用。

【請求項6】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌は芽胞形態であることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の応用。

【請求項7】

前記腫瘍血管新生阻害剤は、Ａｉｔａｎ、スニチニブ、パゾパニブ、ベバシズマブ（ｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、コンベルセプト（Ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）、アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、ソラフェニブトシル酸塩（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂｔｏｓｙｌａｔｅ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）のうちの１種または２種以上の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の応用。

【請求項8】

前記腫瘍は、結腸がん、Ｌｅｗｉｓ肺がん、上咽頭がん、非小細胞肺がん、線維肉腫またはメラノーマであることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の応用。

【請求項9】

腫瘍を治療するための薬物であって、前記薬物中の有効成分はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤を含むことを特徴とする薬物。

【請求項10】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌ＭＷ－ＤＣＧ－ＬＣｖ－２６菌株（オーストラリア国家計量研究院に保管され、菌株番号はＶ１２／００１４８６であり）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株であることを特徴とする請求項９に記載の薬物。

【請求項11】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株は、ＭＷ－ＤＣＧ－ＨＮＣｖ－１８菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８５であり）、またはＭＷ－ＤＣＧ－ＣＣｖ－１７菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株の保存番号Ｖ１２／００１４８７であり）を含むことを特徴とする請求項１０に記載の薬物。

【請求項12】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌は芽胞形態であることを特徴とする請求項１０に記載の薬物。

【請求項13】

前記腫瘍血管新生阻害剤は、Ａｉｔａｎ、スニチニブ、パゾパニブ、ベバシズマブ（ｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、コンベルセプト（Ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）、アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、ソラフェニブトシル酸塩（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂｔｏｓｙｌａｔｅ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）のうちの１種または２種以上の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１０に記載の薬物。

【請求項14】

前記薬効成分であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の投与順序は、程度投与または同時投与であることを特徴とする請求項１０～１３のいずれか１項に記載の薬物。

【請求項15】

芽胞形態のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌１×１０^７ＣＦＵのあたり、併用するＡｉｔａｎの用量は６０ｍｇ／ｋｇ／ｄであることを特徴とする請求項１２に記載の薬物。

【請求項16】

前記腫瘍は結腸がん、Ｌｅｗｉｓ肺がん、上咽頭がん、非小細胞肺がん、線維肉腫またはメラノーマであることを特徴とする請求項１０～１３のいずれか１項に記載の薬物。

【請求項17】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末であることを特徴とする請求項１０に記載の薬物。

【請求項18】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞を活性成分とし、１％ショ糖を添加剤とし、－４０℃ ４ｈ、－３５℃ １０ｍｉｎ同時に真空引き、－３０℃ １０ｍｉｎ、－２５℃ １０ｍｉｎ、－２０℃ ２６ｈ、－１５℃ ２ｈ、－１０℃ １０ｍｉｎ、－５℃１０ｍｉｎ、０℃ １０ｍｉｎ、１０℃ ２ｈ、１５℃ １０ｍｉｎ、２０℃ ３ｈ、２７℃３ｈの凍結乾燥プロセスで調製されることを特徴とする請求項１７に記載の薬物。

【請求項19】

１本の前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末当たりのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞の個数が１×１０^８ＣＦＵであることを特徴とする請求項１８に記載の薬物。

【請求項20】

腫瘍治療方法であって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌とＡｉｔａｎを併用して投与し、
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌は芽胞形態であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の芽胞量は１×１０^７ｃｆｕ／腫瘍／回、腫瘍内投与、まずＡｉｔａｎを毎日１回で３日投与し、その後Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞を１日おきに１回で、合計２回投与し、
前記Ａｉｔａｎは６０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、１２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、または１８０ｍｇ／ｋｇ／ｄの投与量で胃内投与されることを特徴とする腫瘍治療方法。

【請求項21】

前記腫瘍は結腸がん、Ｌｅｗｉｓ肺がん、上咽頭がん、非小細胞肺がん、線維肉腫またはメラノーマであことを特徴とする請求項２０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本願は、２０２１年１０月０９日に中国特許庁へ提出された、出願番号ＣＮ２０２１１１１７７８７８．９であり、発明の名称「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用の応用」である中国特許出願に基づく優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は腫瘍学技術分野に属し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ（クロストリジウム ゴニイ）菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用に関し、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用により、腫瘍免疫抑制性微小環境を解除し、腫瘍微小環境を改善して、腫瘍治療効果を増強する応用に関する。

【背景技術】

【0003】

腫瘍微小環境（Ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ＴＭＥ）は、腫瘍成長において、腫瘍細胞、基質細胞と、細胞外基質及びそこに浸潤した生体分子などとともに構成する局所定常環境である。ＴＭＥは腫瘍の発生、発展、侵襲などに必要な物質基礎を提供し、腫瘍転移、再発などの多種の生物学的行為を制御する。同時にＴＭＥは腫瘍の薬剤耐性と耐放射性を増加させ、治療効果を低下させることができる。ＴＭＥ内の免疫調節は、腫瘍発生・成長において、重要な機能を持ち、多種のメカニズムにより、腫瘍局所免疫抑制を形成することができる。ＴＭＥ免疫治療戦略をどのように制御するか、積極的な免疫微小環境を再構築することは抗腫瘍治療の重点と難点である。

【0004】

悪性腫瘍は、様々なメカニズムにより、リンパ球浸潤損傷、酸素欠乏による免疫チェックポイントのタンパク質発現の向上、Ｔｒｅｇの募集、レジデント免疫効果細胞及び交通免疫効果細胞の機能を損なう機能を有する免疫抑制性腫瘍微小環境の構築などを含む宿主免疫監視を逃避する。腫瘍微小環境に浸潤した髄様細胞は、腫瘍微小環境において、腫瘍細胞の免疫脱出、腫瘍転移などの腫瘍発展を制御する重要な一環である。

【0005】

実体腫瘍は、通常、腫瘍関連のマクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの大量の免疫阻害剤を浸潤する。ＴＧＦβは、ＴＭＥの免疫反応において、重要な役割を果たし、抗腫瘍免疫抑制を促進する役割を有し、かつＴＧＦβにより抗血管新生治療に対する耐薬が生じると考えられている。

【0006】

無酸素または低酸素含有量は、実体腫瘍の典型的な特徴であり、実体腫瘍の酸素欠乏は、ＨＩＦ－１αの活性化により、ＭＤＳＣ、樹状細胞、腫瘍細胞の免疫チェックポイントの蛋白質ＰＤ－Ｌ１の発現を直接的に向上させ、免疫抑制と逃避を支援することができる。同時に、腫瘍の酸素欠乏は、移動促進タンパク質（例えば、ＳＤＦ１Ａ及びＨＧＦ）の誘導及び侵襲性細胞外基質分子の産生を促進することにより、腫瘍細胞の侵襲潜在能力を増加させることができる。酸素欠乏も腫瘍の放射線化学療法に対する抵抗力を増強する。

【0007】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌は絶対嫌気性菌であり、腫瘍の酸素欠乏または壊死区のみにおいて特異的に発芽し、大量に増殖することができ、腫瘍組織を区別せずに有効であり、且つＴＭＥを破壊する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の腫瘍溶解後、ＴＭＥ免疫原性を変化させ、免疫抑制性ＴＭＥを調節し、腫瘍免疫反応を誘導する。現在、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用で腫瘍免疫抑制性微小環境を明らかに変化させ、抗腫瘍効果を増強できるという関連報道はない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、先行技術の不足に対して、より安全で、強い標的性を有する実体腫瘍を治療する嫌気性菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用の応用を提供する。

【0009】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用の腫瘍治療用医薬製品の製造における応用。
有効成分が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤を含む腫瘍治療用薬物である。
本発明の好ましい形態によれば、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌ＭＷ－ＤＣＧ－ＬＣｖ－２６菌株（オーストラリア国家計量研究院に保管され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８６であり）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株である。他の好ましい菌株は、ＭＷ－ＤＣＧ－ＨＮＣｖ－１８菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８５であり）、またはＭＷ－ＤＣＧ－ＣＣｖ－１７菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８７であり）を含む。
本発明の好ましい形態によれば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌は芽胞形態である。
本発明の好ましい形態によれば、前記腫瘍血管新生阻害剤は、Ａｉｔａｎ、スニチニブ、パゾパニブ、ベバシズマブ（ｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、コンベルセプト（Ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）、アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、ソラフェニブトシル酸塩（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂｔｏｓｙｌａｔｅ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）から選択されるものである。
本発明の好ましい形態によれば、前記薬効成分であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の投与順序は、前後投与または同時投与である。
本発明の好ましい形態によれば、薬物の組み合わせは１×１０^７ＣＦＵのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末とＡｉｔａｎの最適量６０ｍｇ／ｋｇ／ｄの併用である。
本発明の好ましい形態によれば、、前記腫瘍は、結腸がん、Ｌｅｗｉｓ肺がん、上咽頭がん、非小細胞肺がん、線維肉腫またはメラノーマなどを含むが、これらに限定されない。
本発明は、腫瘍血管新生阻害剤をランダムに併用することができる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞は純粋な微生物である必要があり、すなわち芽胞以外、他の細菌は一切含まないものであり、腫瘍血管新生阻害剤は、同様に無菌の要求に満たす必要がある。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞は当分野の既存の方法に従って、調製・精製を行い、関連品質基準に符合する薬物を獲得する。

【発明の効果】

【0010】

１、本発明は初めてより安全で、強い標的性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤の併用により、高効率的な抗腫瘍を得ることを発見した。
２、本発明は、初めてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と低用量腫瘍血管新生阻害剤の併用により、腫瘍中のＭ２型マクロファージ、ＭＤＳＣなどの浸潤を低下させ、そして腫瘍中のＴＧＦβ数を減少させ、ＴＭＥ中の抗腫瘍免疫応答の抑制作用を低下させることを発見した。同時に低用量腫瘍血管新生阻害剤の併用により、ＣＤ８^＋、ＣＤ３^＋Ｔ、Ｆ４／８０^＋などの免疫細胞の腫瘍への浸潤を促進し、腫瘍中の免疫微小環境を改善し、抗腫瘍治療効果を増強することができる。
３、本発明において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌に腫瘍血管新生阻害剤を併用する最適量を明らかにした。
４、本発明は、末期悪性実体腫瘍タイプに応用でき、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と低用量のＡｉｔａｎの併用により、ＴＭＥ中の抗腫瘍免疫応答抑制作用を低下させることにより、ＴＭＥを免疫抑制から免疫活性化状態に変化させ、高効率的な抗腫瘍を実現し、その独特な治療効果は、高用量のＡｉｔａｎを用いて腫瘍の酸素欠乏を加重させることによりＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌が繁殖する酸素欠乏環境を作ることによる高効率的な抗腫瘍ではなく、抗腫瘍免疫微小環境の変化に起因すべきである。
５、本発明における組成物は、腫瘍を治療する際に、より安全で、標的性がより高く、標的とする腫瘍の酸素欠乏環境のみで発芽し、非腫瘍の酸素欠乏環境では細菌に発芽することできない。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は実施例２におけるネットウエイトのヒストグラムである。

【図2】図２は実施例２における脳梗塞組織のＴＴＣ染色図である。

【図3】図３は実施例２における組織スライスのグラム染色図である。

【図4】図４は実施例２における心筋梗塞組織のＴＴＣ染色図である。

【図5】図５は実施例２における組織スライスのグラム染色図である。

【図6】図６は実施例３における実験マウスのネットウエイトのヒストグラムである。

【図7】図７は実施例３における実験マウスの腫瘍体積曲線図である。

【図8】図８は実施例３における実験マウスの腫瘍重量図である。

【図9】図９は実施例３における実験マウスの腫瘍解剖図である。

【図10】図１０は実施例４における腫瘍組織中のＴ細胞浸潤の割合である。

【図11】図１１は腫瘍組織におけるＴ細胞のサイトカイン発現状況である。

【図12】図１２は実施例４におけるマウス腫瘍内サイトカイン発現状況である。

【図13】図１３、１４は実施例４におけるマウス腫瘍内骨髄由来の抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の割合である。

【図14】

【図15】図１５、１６は実施例４におけるマウス腫瘍組織免疫組織化学染色図及びＣＤ１６３細胞割合図である。

【図16】

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明は具体的な実施例を参照してさらに詳細に説明され、記載された実施例は、公衆に理解しやすくなるために、列挙された実施例の一部であり、本発明の保護範囲を限定するのではなく、本発明を説明するのみに使用され、本発明の保護範囲は請求項によって規定される。
実施例１

【0013】

材料と方法

【0014】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末、菌株はＭＷ－ＤＣＧ－ＬＣｖ－２６菌株、この菌株はオーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号Ｖ１２／００１４８６、ロット番号：２０２００３００１－１、山東新創生物科学技術有限公司が開発した。注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞を活性成分とし、１％ショ糖を添加剤とし、－４０℃４時間；－３５℃ １０ ｍｉｎ同時に真空引き、－３０℃ １０ｍｉｎ、－２５℃ １０ ｍｉｎ、－２０℃ ２６ ｈ、－１５℃ ２ｈ、－１０℃１０ ｍｉｎ、－５℃ １０ ｍｉｎ、０℃ １０ｍｉｎ、１０℃ ２ｈ、１５℃ １０ ｍｉｎ、２０℃ ３ｈ、２７℃３ｈの凍結乾燥プロセスにより調製され、仕様は１×１０^８ＣＦＵ／本；対照品凍結乾燥粉末、ロット番号：２０１９１０００２Ｆ、山東新創生物科学技術有限公司が開発し、１％ショ糖溶液１ｍＬで上記凍結乾燥プロセスにより製造し；０．９％塩化ナトリウム注射液、ロット番号：２００５０６２１４６、辰欣薬業股▲ふん▼有限公司が販売しており；滅菌注射用水、ロット番号：１９０２２１２６２、辰欣薬業股▲ふん▼有限公司が販売している。

【0015】

細胞系及び細胞培養

【0016】

ＣＴ２６．ＷＴ結腸がん細胞、番号：３１３１Ｃ０００１０００８０００３７、中国科学院上海生命科学研究院細胞資源センター。ＲＰＭＩＭｅｄｉｕｍ １６４０ ｂａｓｉｃ基礎培地に体積百分率濃度１０％特級ウシ胎児血清（低温溶解後の血清中に浮遊物がある可能性があり、２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して浮遊物を除去し）と体積百分率濃度１．１％ペニシリン－ストレプトマイシンの混合液を添加し、十分に混合し、細胞を再懸濁した細胞懸濁液を７５ｃｍ^２細胞培養瓶に接種し、１瓶に細胞培地２５ｍＬを添加し、５％ＣＯ_２細胞培養箱に入れて３７℃で静置培養した。

【0017】

試薬

【0018】

ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉｕｍ１６４０ ｂａｓｉｃ基礎培地はＧｉｂｃｏから購入し、特級ウシ胎児血清とペニシリン－ストレプトマイシンはＢＩから購入し、Ａｉｔａｎ（アパチニブ）は江蘇恒瑞医薬菌股▲ふん▼有限公司から購入し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞は、従来の方法に従って、調製・精製し、関連品質基準に合う薬物を獲得した。

【0019】

モデル構築

【0020】

ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いてＣＴ２６腫瘍細胞を皮下接種し、結腸がん皮下移植腫瘍モデルを構築した。１ｍＬの使い捨て無菌注射器で抽出濃度７．５×１０^６個／ｍＬ（許容範囲：６．７５×１０^６個／ｍＬ～８．２５×１０^６個／ｍＬ）の細胞懸濁液０．２ｍＬをマウス右前肢腋窩皮下にゆっくり皮下注射で接種した（７５％アルコール事前消毒処理）。注射が終わったら、乾いた綿球で針目の部位を軽く押した。

【0021】

観察と検査

【0022】

臨床観察：投与期間は毎日の午前と午後、肉眼で、動物行動、死亡または瀕死の状況などを１回観察した。
腫瘍測定：腫瘍の最大長径（Ｌ）と最大横径（Ｗ）（マウスの皮膚の厚さを含み）をノギスで測定し、

【0023】

【数1】

【0024】

により腫瘍の体積を計算した。
体重：投与期間、治療日から腫瘍測定日に体重を秤量した。
腫瘍重量：腫瘍組織を解剖で分離し、腫瘍重量を秤量し記録した。
腫瘍抑制率（ＩＲ_ＴＷ％）＝（対照群平均腫瘍重量－実験群平均腫瘍重量）／対照群平均腫瘍重量×１００％。

【0025】

フローサイトメトリー解析

【0026】

結腸がんモデル中の腫瘍と脾臓を相応の時間に採取し、ＩＶ型コラーゲン（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）とＤＮａｓｅＩ（２０Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃で酵素消化を１時間行い、単一腫瘍細胞と脾臓細胞を収集した。分離された単一細胞をそれぞれ２％ＦＣＳを含むＰＢＳで洗浄し、その後、関連抗体を用いて表面染色を行った。細胞を大量に洗浄した後、ＢＤＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で得た。フローサイトメトリーデータは、Ｎｏｖｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＴＭ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）によって分析された。

【0027】

Ｍｕｌｔｉ－ＥＬＩＳＡによるサイトカインの検出

【0028】

実験マウスの末梢血と腫瘍組織を収集し、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－ａ、ＧＭ－ＣＳＦとＴＧＦβ等のサイトカインを評価した。Ｍｕｌｔｉ－ＥＬＩＳＡキットはＱｉａｇｅｎ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入し、キット内に提供された説明書に従って実験を行った。ＥＬＩＳＡ結果は、ＥＬＩＳＡプロセスボードによって４５０ｎｍで読み出された（ＰｏｌａｒｓｔａｒＯｍｅｇａ ９６－ｗｅｌｌｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＧｍＢＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。

【0029】

ＴＣＣ染色

【0030】

腫瘍組織を取り出し、液体窒素により、急速凍結した後、スライスナイフで同じ厚さで５枚に切り出した。腫瘍組織スライスをガラス上に置き、２％のＴＴＣ溶液を滴下して組織スライスを覆い、３０ｍｉｎ遮光反応させ、デジタルカメラで撮影した。

【0031】

免疫組織化学

【0032】

腫瘍組織を採取した後、１０％中性ホルマリン溶液中に迅速に放置して固定し、パラフィン包埋し、スライスした。パラフィンスライスは通常、水に脱蝋された。３％Ｈ_２Ｏ_２脱イオン水を室温で光を避けて１０分間インキュベートし、内因性過酸化水素酵素活性を除去し、５ｍｉｎ×３回でＰＢＳ洗浄した。スライスをＥＤＴＡ修復液（１×）に浸漬し、電子レンジを沸騰まで加熱して、電源を切り、５～１０ｍｉｎ間隔で、さらに１～２回修復し、冷却した。５％ＢＳＡブロッキング液を滴下して３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、ゆれ乾燥させた。適切に希釈された抗ＣＤ１６３及びＨＩＦ－１αマウスモノクローナル抗体の一次抗体を滴下し、３７℃で１～２時間または４℃で一晩インキュベートした。５ｍｉｎ×３回でＰＢＳ洗浄した。ビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（二次抗体）を滴下し、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。５ｍｉｎ×３回で、ＰＢＳ洗浄した。ＳＡＢＣを滴下し、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。５ｍｉｎ×３回で、ＰＢＳ洗浄した。蒸留水１ｍＬに発色剤Ａ、Ｂ、Ｃを各１滴加え、混合し、標本に加え、１～１０ｍｉｎ発色し、蒸留水で十分に洗浄して反応を停止した。ヘマトキシリン染色を繰り返した。脱水し透明になった。中性ゴムで封止し、顕微鏡を観察した。

【0033】

腫瘍組織スライスＧｒａｍ ｓｔａｉｎ

【0034】

腫瘍組織を採取した後、１０％中性ホルマリン溶液中に迅速に放置して固定し、パラフィン包埋し、スライスした。スライスを３０ｍｉｎドライし、キシレンＩ５ｍｉｎ、キシレンＩＩ ５ｍｉｎ、１００％エタノのールＩ ２ｍｉｎ、９５％エタノールＩ ２ｍｉｎ、８０％エタノールＩ２ｍｉｎで、流水で洗浄し、少し乾燥させた。グラム試薬一１ｍｉｎで、流水で洗浄し、グラム試薬二１ｍｉｎで、流水で洗浄し、グラム試薬三２０ｓ程度で、流水で洗浄し、エオシン２０ｓ程度で、流水で洗浄し、９５％エタノールＩＩ３０ｓ、９５％エタノールＩＩＩ １ｍｉｎ、１００％エタノールＩＩ２ｍｉｎ、キシレンＩＩＩ ３ｍｉｎ、キシレンＩＶ３ｍｉｎ、中性ゴムで封止し、観察した。

【0035】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌の定量分析

【0036】

Ｔｒｉｚｏｌ法を用いて組織ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｐｅｒｆｅｃｔ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）キットを用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを鋳型として、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌のチオレドキシン特異性プライマーを用いてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌の細菌を検出し、プライマー配列は以下の通りである。
Ｔｒｘ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１）：５’－－ＡＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＴＴＴＴＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧ－３’
Ｔｒｘ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２）：５’－－ＧＣＴＡＡＣＡＴＣＴＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＡ－３’

【0037】

統計分析

【0038】

ダブルテールＴ検定またはＰｒｉｓｍ ６．０ Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ）を用いて統計分析を行った。ｐ＜０．０５で統計学的有意差がある。
実施例２

【0039】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌の実体腫瘍モデルへの応用の高安全性と強力標的性

【0040】

モデル構築

【0041】

結腸がん皮下移植腫瘍モデルを構築した。ＳＤラットにおける中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルを構築した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス急性心筋梗塞（ＭＩ）モデルを構築した。

【0042】

動物の群分け

【0043】

腫瘍体積０．３５～０．６０ｃｍ^３の実験動物を、腫瘍負荷動物のスクリーニングの当日に選択して試験に用いた。無作為原則でスクリーニングされた要求に合致する動物は、抽選法で、静脈投与対照群、腫瘍内投与対照群、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞静脈投与群、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞腫瘍内投与群という４つの群に分けられ、各群はいずれも８匹のマウスであった。

【0044】

ＳＤラット中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルは、ランダムに健康ラット対照群、脳梗塞モデル対照群、脳梗塞モデル静脈投与群、脳梗塞モデル頭蓋内投与群という４つの群に分けられて、各群はいずれも５匹であった。

【0045】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス急性心筋梗塞（ＭＩ）モデルは、無作為に心筋梗塞モデルＴＴＣ染色群、心筋梗塞モデル対照群、心筋梗塞モデル尾静脈投与群という３つの群に分けられ、各群はいずれも５匹であった。

【0046】

投与

【0047】

結腸がんモデル：芽胞使用量１×１０^７ｃｆｕ／腫瘍／回、腫瘍内投与、対照群に同じ体積の質量体積パーセント濃度０．９％塩化ナトリウム注射液を投与し；芽胞使用量１×１０^８ｃｆｕ／腫瘍／回、尾静脈投与、対照群に同じ体積の質量体積パーセント濃度０．９％塩化ナトリウム注射液を投与し；
ＳＤラット中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデル：尾静脈投与量５×１０^７ＣＦＵ、頭蓋内投与量１×１０^６ＣＦＵ。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス急性心筋梗塞（ＭＩ）モデル：尾静脈投与量２×１０^７ＣＦＵ。

【0048】

観察と検出

【0049】

結腸がんモデルは、実験期間中にマウスの死亡または瀕死の情況、行為、マウスの体重情況を観察した。
ＭＣＡＯモデルとＭＩモデルは、それぞれ脳組織と心臓組織を採取し、ＴＴＣ染色、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌細菌ｑＰＣＲと芽胞細菌培養法による検出、および組織をスライスにして、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌のＧｒａｍ ｓｔａｉｎによる検出を行った。

【0050】

結果

【0051】

結腸がんモデルは、実験期間中、腫瘍内投与または静脈投与にかかわらず、動物の死亡が認められなかった。また、マウスのネットウエイトは対照群と比較して、いずれも有意差がなかった（図１）。
ＭＣＡＯモデル試験において、健康ラット対照群、脳梗塞モデル対照群、脳梗塞モデル静脈投与群、脳梗塞モデル頭蓋内投与群の脳組織に対してＴＴＣ染色を行い、正常ラットの脳組織スライスＴＴＣ染色は赤色であり、ＭＣＡＯモデルラットの脳組織スライスのＴＴＣ染色により、脳梗塞が発生したラットの脳組織の一部の領域は蒼白色であった（図２）。

【0052】

ＭＣＡＯモデル試験における脳組織に対して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌の細菌と芽胞の検出を行い、注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞の尾静脈単回投与と注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞の頭蓋内単回投与の後、脳梗塞が発生した脳組織においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞を検出したが、いずれもＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌の細菌は検出されなかった。

【0053】

脳組織に対して、スライス作製とＧｒａｍ ｓｔａｉｎを行い、そしてデジタル病理スキャンシステムを用いて、各組のラットの脳組織スライスをスキャンしてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の細菌分布情況を検出し、陽性対照組の腫瘍組織スライスをグラム染色したスライスには、短桿状、青紫色のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌が見られた（図３ａ）。陰性対照群の腫瘍組織スライをスグラム染色したスライスには、細菌が見られなかった（図３ｂ）。ラット中大脳動脈閉塞になった後、注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ芽胞の尾静脈単回投与と注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ芽胞の頭蓋内単回投与を行い、脳梗塞が発生した脳組織スライスにはいずれもＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌の細菌は検出されなかった（図３ｃ、３ｄ）。

【0054】

ＭＩモデルＴＴＣ染色群のマウスの心臓組織のＴＴＣ染色により、マウスの心筋組織が白色を呈し、ＭＩモデルのマウスの心臓組織が明らかな梗塞を呈した（図４）ことが示される。ＭＩモデルマウスに注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞の尾静脈単回投与し、心筋梗塞が発生した心筋組織からＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞が検出されたが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌の細菌は検出されなかった。

【0055】

心臓組織はスライス作製とＧｒａｍ ｓｔａｉｎを行い、デジタル病理スキャンシステムを用いて、各群のマウス心臓組織スライスをスキャンして、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の細菌分布を検出した。陽性対照群の腫瘍組織スライスグラムを染色したスライスには、短桿状、青紫色のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌が見られた（図３ａ）、陰性対照群の腫瘍組織スライスグラムを染色したスライスには、細菌は見られなかった（図３ｂ）。ＭＩモデルマウスに注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞を尾静脈単回投与した後、心臓梗塞が発生した心筋組織スライスにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の細菌は検出されなかった（図５）。
実施例３

【0056】

ＣＴ２６マウスモデルにおけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞と異なる用量のＡｉｔａｎの併用による抗腫瘍作用

【0057】

要求に合致するマウス（腫瘍体積０．３１～０．４１ｃｍ^３）は、ランダム原則を用いて、抽選法で、対照群、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞群、Ａｉｔａｎ高用量群、Ａｉｔａｎ中用量群、Ａｉｔａｎ低用量群、芽胞と低用量Ａｉｔａｎの併用群、芽胞と中用量Ａｉｔａｎの併用群、芽胞とＡｉｔａｎ高用量の併用群という８つの群に分けられた。

【0058】

対照群：腫瘍内に同じ体積の０．９％塩化ナトリウム注射液を投与し；
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞群：使用量１×１０^７ｃｆｕ／腫瘍／回、腫瘍内投与、２回投与、
Ａｉｔａｎ高用量群：使用量１８０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、胃内投与、１日に１回で、合計７回投与し、
Ａｉｔａｎ中用量群：使用料１２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、胃内投与し、１日に１回で、計７回投与した、
Ａｉｔａｎ低用量群：用量は６０ ｍｇ／ｋｇ／ｄ、胃に灌漑投与し、毎日１回、合計７回投与し；
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌とＡｉｔａｎの併用群：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞量１×１０^７ｃｆｕ／腫瘍／回、腫瘍内投与し、まずＡｉｔａｎを１日に１回で３日間投与し、その後芽胞投与を行い、１日おきに１回で、合計２回投与した。高、中、低用量Ａｉｔａｎとの併用群及び単独のＡｉｔａｎの高、中、低用量群。

【0059】

結果
治療期間中、各組はいずれも死亡または瀕死の状況はなかった。治療前、各群のマウス体重に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。対照群と比較して、各群のマウスのネットウエイトに有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。腫瘍マウスのネットウエイトは表１と図６に示される。

【0060】

【表1】

【0061】

治療前、各群の腫瘍体積に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。投与末期には、対照群と比較して、単独芽胞群、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎ群併用群及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と中用量Ａｉｔａｎの併用群の腫瘍体積はいずれも対照群（ｐ＝０．０４５、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０２６）より有意に小さかった。腫瘍負荷マウスの腫瘍体積を表２と図７に示す。

【0062】

【表2】

【0063】

単独芽胞群、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と中用量Ａｉｔａｎの併用群及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用群の腫瘍重量は、対照群と比較して、対照群（ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００）より顕著に小さかった。各群の腫瘍重量を表３、図８に示す。

【0064】

【表3】

【0065】

腫瘍重量に基づいて腫瘍抑制率を計算し、腫瘍抑制率は表４に示すように、以下を現れた：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群＞芽胞と中用量Ａｉｔａｎの併用群＞Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用群＞単独芽胞群＞高用量Ａｉｔａｎ群＞低用量Ａｉｔａｎ群＞中用量Ａｉｔａｎ群。腫瘍抑制率腫瘍解剖形態を図９に示す。

【0066】

【表4】

【0067】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群では、２８．６％のマウス腫瘍が完全に除去され、実験終点まで腫瘍の成長が見られず、治癒率がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用群（１４．３％）とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と中用量Ａｉｔａｎの併用群（１４．３％）より明らかに高かった。しかし、高、中和低用量の単独Ａｉｔａｎ群と単独芽胞群では、腫瘍の消失は見られず、治癒率が０％であった。表５に示されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用は、顕著な抗腫瘍効果を示し、他の組より明らかに優れていることが分かった。

【0068】

【表5】

【0069】

上記の結果から分かるように、各用量治療群は、いずれも腫瘍成長に対する抑制作用を示し、芽胞と低用量Ａｉｔａｎ群の併用による抗腫瘍作用が最も顕著であった。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とＡｉｔａｎなどの抗血管新生阻害剤の併用による治療はプラス超の作用を示し、その中でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞と低用量Ａｉｔａｎの併用による治療の抗腫瘍効果は最も優れている。
実施例４

【0070】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎ及び低用量Ａｉｔａｎの併用による抗腫瘍作用メカニズムの研究

【0071】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用による抗腫瘍作用は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用により明らかに優れており、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用による抗腫瘍作用メカニズムについて、研究を行った。

【0072】

対照群、単独芽胞群、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用群で処理したマウス腫瘍組織をそれぞれ採取し、フローサイトメトリーを用いて上述の腫瘍組織サンプルに対し、フローサイトメトリー分析を行った。対照群と比較して、単独芽胞群、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用群の腫瘍組織中のＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋Ｔ、ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＴとＦ４／８０^＋細胞浸潤腫瘍の割合はいずれも顕著に上昇し、単独芽胞群と比較して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群のマウス腫瘍組織中のＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋Ｔ、ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＴとＦ４／８０^＋細胞浸潤腫瘍の割合はいずれも顕著に上昇した。しかし、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用群には、顕著な差は見られなかった（図１０）。

【0073】

細胞内染色法を用いて、腫瘍内Ｔ細胞のサイトカイン発現を研究し、単独芽胞群と比較して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌及び低用量Ａｉｔａｎの併用群の腫瘍内、ＣＤ３^＋ＩＬ－１０^＋Ｔ、ＣＤ３^＋ＩＦＮ－γ^＋Ｔ細胞は有意に上昇した（ｐ＜０．０５）。しかし、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用群には、ＣＤ３^＋ＩＬ－１０^＋Ｔ、ＣＤ３^＋ＩＦＮ－γ^＋Ｔ細胞は明らかな変化が見られなかった（図１１）。

【0074】

Ｍｕｌｔｉ－ＥＬＩＳＡによる腫瘍内ＩＬ－１０、ＴＮＦ－ａ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦβ等のサイトカインの検出について、対照群と比較して、単独芽胞群、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用群及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群はいずれもＩＬ－１０、ＴＮＦ－ａ、ＧＭ－ＣＳＦが増加した。他の群と比較して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群は、腫瘍内のＴＧＦβ発現が著しく低下した（図１２）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の腫瘍溶解は、ＴＭＥ中のサイトカイン、ケモカイン発現を誘導することができる。同時にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用でＴＧＦβの発現を著しく低下させ、免疫抑制性腫瘍の微小環境を改善した一方、高用量Ａｉｔａｎとの併用はＴＧＦβ発現に顕著な抑制作用がなかった。

【0075】

腫瘍内の骨髄由来の免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）などの細胞数をフローサイトメトリーにより分析した。対照群と比較して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用による治療後、腫瘍内のＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉｇｈＭｏｎｏｃｙｔｉｃ－ＭＤＳＣｓとＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｌｏｗＰＭＮ－ＭＤＳＣｓの数に明らかな差は見られなかった。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用に比べて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用による治療後のＭｏ－ＭＤＳＣｓとＰＭＮ－ＭＤＳＣＳの割合はいずれも低下した（図１３）。さらに、他の治療群と比較して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群のＣＤ１１ｂ^＋Ｆ４／８０^＋－ＴＡＭｓの全生存細胞中の割合は顕著に低下した（図１４）。ＩＨＣ染色により腫瘍中のＣＤ１６３^＋（Ｍ２型マクロファージマーカー）を検出し、研究結果により、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群の腫瘍中のＣＤ１６３^＋細胞数が低下し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用による治療が、腫瘍中のＴＡＭ数を効果的に減少できることを表明した（図１５）。

【0076】

腫瘍組織ＨＩＦ－１α免疫組織化学染色により、対照群と比較して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌連合低用量Ａｉｔａｎ腫瘍組織の酸素欠乏は明らかに軽減され、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と高用量Ａｉｔａｎの併用群の腫瘍組織の酸素欠乏度は上昇した（図１６）。高用量のＡｉｔａｎは、腫瘍組織の酸素欠乏を加重し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の繁殖に有利な酸素欠乏環境を創造したが、その抗腫瘍効果はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群より低かった。一方、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用群の腫瘍の酸素欠乏は明らかに低下しているが、理論的には腫瘍の成長を加速させる可能性があるが、腫瘍の体積から、腫瘍の成長が明らかに抑制されていることを示した。

【0077】

以上より、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用はＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋Ｔ、ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ、Ｆ４／８０^＋などの免疫細胞の浸潤を促進し、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカインとケモカインの発現の増強を誘導し、同時に腫瘍組織中のＴＧＦβの発現を効果的に低下させ、免疫阻害剤腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）などの数を低下させ、免疫抑制を減少させる。以上から分かるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と低用量Ａｉｔａｎの併用による高効率的な抗腫瘍は、腫瘍血管の正常化を誘導することにより、ＴＭＥを免疫抑制から免疫活性化状態に変化させ、高効率的な抗腫瘍を実現し、その独特な治療効果は、高用量のＡｉｔａｎを用いて腫瘍の酸素欠乏を加重させることによりＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌が繁殖する酸素欠乏環境を作ることによる高効率的な抗腫瘍ではなく、抗腫瘍免疫微小環境の変化に起因すべきである。

【0078】

上記の実施例は、本発明を詳細に説明したが、本発明の一部の実施例にすぎず、すべての実施例ではなく、本実施形態に従って他の実施形態を創造的ではなく得ることができ、これらの実施例はすべて本発明の保護範囲に属する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-03-13

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤を含むことを特徴とする腫瘍治療用医薬製品。

【請求項2】

前記医薬製品は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ及びＦ４／８０＋浸潤を促進し、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＧＭ－ＣＳＦ発現の増強を誘導し、ＴＧＦβの発現を低下させ、マクロファージＴＡＭ、及び骨髄由来免疫抑制細胞ＭＤＳＣの数を低下させ、免疫抑制を減少させる医薬製品を含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬製品。

【請求項3】

前記医薬製品は、腫瘍血管の正常化を誘導し、ＴＭＥを免疫抑制から免疫活性化状態に変化させる薬物を含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬製品。

【請求項4】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌ＭＷ－ＤＣＧ－ＬＣｖ－２６菌株（オーストラリア国家計量研究院に保管され、菌株番号はＶ１２／００１４８６であり）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株であることを特徴とする請求項１に記載の医薬製品。

【請求項5】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株は、ＭＷ－ＤＣＧ－ＨＮＣｖ－１８菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８５であり）、またはＭＷ－ＤＣＧ－ＣＣｖ－１７菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８７であり）を含むことを特徴とする請求項４に記載の医薬製品。

【請求項6】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌は芽胞形態であることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬製品。

【請求項7】

前記腫瘍血管新生阻害剤は、Ａｉｔａｎ、スニチニブ、パゾパニブ、ベバシズマブ（ｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、コンベルセプト（Ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）、アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、ソラフェニブトシル酸塩（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂｔｏｓｙｌａｔｅ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）のうちの１種または２種以上の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬製品。

【請求項8】

前記腫瘍は、結腸がん、Ｌｅｗｉｓ肺がん、上咽頭がん、非小細胞肺がん、線維肉腫またはメラノーマであることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬製品。

【請求項9】

腫瘍を治療するための薬物であって、前記薬物中の有効成分はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と腫瘍血管新生阻害剤を含むことを特徴とする薬物。

【請求項10】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌ＭＷ－ＤＣＧ－ＬＣｖ－２６菌株（オーストラリア国家計量研究院に保管され、菌株番号はＶ１２／００１４８６であり）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株であることを特徴とする請求項９に記載の薬物。

【国際調査報告】