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特表2024-531603肝細胞癌オルガノイド培養のための培養培地、肝細胞癌オルガノイドの培養方法、及び、それらの用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】肝細胞癌オルガノイド培養のための培養培地、肝細胞癌オルガノイドの培養方法、及び、それらの用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/09 20100101AFI20240822BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20240822BHJP
C07D 475/00 20060101ALI20240822BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20240822BHJP
C07K 14/475 20060101ALN20240822BHJP
C07K 14/485 20060101ALN20240822BHJP
C07K 14/62 20060101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
C12N5/09
C12N1/00 G
C07D475/00
A61K31/519
C07K14/475
C07K14/485
C07K14/62
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515028
(86)(22)【出願日】2021-09-16
(85)【翻訳文提出日】2024-05-01
(86)【国際出願番号】 CN2021118657
(87)【国際公開番号】W WO2023035299
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】202111048845.4
(32)【優先日】2021-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522178669
【氏名又は名称】合肥中科普瑞昇生物医▲薬▼科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110003845
【氏名又は名称】弁理士法人籾井特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 青松
(72)【発明者】
【氏名】汪 文亮
(72)【発明者】
【氏名】黄 涛
(72)【発明者】
【氏名】▲陳▼ 程
【テーマコード（参考）】
4B065
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065BB13
4B065BB19
4B065BB40
4B065BC46
4B065CA44
4B065CA46
4B065CA60
4C086AA01
4C086CB09
4C086NA20
4C086ZC20
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA20
4H045DA21
4H045DA37
4H045EA60
(57)【要約】
ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤と、Ｎ２及びＢ２７から選択される少なくとも１つの細胞培養添加剤と、肝細胞成長因子と、ＩＴＳ細胞培養添加剤と、Ｙ２７６３２と、デキサメタゾンと、ニューレグリン－１と、インスリンと、上皮細胞成長因子と、ＧｌｕｔａＭＡＸと、非必須アミノ酸とを含む、肝細胞癌オルガノイド培養のための培養培地。本件は、肝細胞癌オルガノイドの培養方法及びそれらの使用に更に関する。肝細胞癌オルガノイド培養培地を使用することで、肝細胞癌オルガノイドの効果的かつ迅速な増幅を達成することができ、かかる増幅により得られたオルガノイドは、患者の病理学的特徴を維持し、肝細胞癌オルガノイドの培養成功率及び増幅率を改善し、患者の個別化治療の研究基盤をもたらすことができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肝細胞癌オルガノイド用の培養培地であって、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤と、Ｎ２及びＢ２７から選択される少なくとも１つの細胞培養添加剤と、肝細胞成長因子と、ＩＴＳ細胞培養添加剤と、Ｙ２７６３２と、デキサメタゾンと、ニューレグリン－１と、インスリンと、上皮細胞成長因子と、ＧｌｕｔａＭＡＸと、非必須アミノ酸とを含むことを特徴とし、
該ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が、式（Ｉ）：
【化1】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリール、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたヘテロアリールから選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む、培養培地。
【請求項2】
Ｒ１が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたナフチル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルメチル、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたチエニルから選択され、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ３アルキルから選択され、
Ｒ４及びＲ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル、ピペリジルＣ１～Ｃ６アルキル、及びテトラヒドロピラニルＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ６が、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される、
請求項１に記載の培養培地。
【請求項3】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が、式（Ｉａ）：【化2】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたチエニル、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルメチルから選択され、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、
Ｒ６は、独立して、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む、請求項１に記載の培養培地。
【請求項4】
Ｒ１が１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルであり、Ｒ５が水素であり、
Ｒ６が、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである、請求項３に記載の培養培地。
【請求項5】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が、以下の化合物又はその薬学的に許容され得る塩から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の培養培地：【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【請求項6】
前記培養培地中の成分の量が、以下の条件のうちいずれか１つ以上又は全てを満たすことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の培養培地：前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の濃度が、２．５μＭ～１０μＭである；
前記培養培地中の前記Ｂ２７又はＮ２細胞培養添加剤の体積比が、１：２５～１：１００である；
前記肝細胞成長因子の濃度が、１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬである；
前記培養培地中の前記ＩＴＳ細胞培養添加剤の体積比が、１：３０～１：３００である；
Ｙ２７６３２の濃度が、３μＭ～３０μＭである；
デキサメタゾンの濃度が、０．１μＭ～１μＭである；
ニューレグリン－１の濃度が、１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬである；
インスリンの濃度が、１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬである；
前記上皮細胞成長因子の濃度が、２ｎｇ／ｍＬ～１８ｎｇ／ｍＬである；
前記培養培地中のＧｌｕｔａＭＡＸの体積比が、１：３０～１：３００である；
前記非必須アミノ酸が、グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン及びセリンからなる群から選択される１つ以上であり、濃度が５０μＭ～２００μＭである。
【請求項7】
ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２又はＲＰＭＩ－１６４０からなる群から選択される初期培地と、ストレプトマイシン／ペニシリン、アムホテリシンＢ及びプリモシンからなる群から選択される１つ以上の抗生物質と、
を更に含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の培養培地。
【請求項8】
Ｗｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジンファミリータンパク質、ノギンタンパク質、ＢＭＰ阻害剤又は線維芽細胞成長因子１０を含まないことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の培養培地。
【請求項9】
以下の工程を含むことを特徴とする、肝細胞癌オルガノイドを培養する方法：（１）固形肝癌組織から試料を単離し、初代肝癌細胞を得る工程と、
（２）請求項１～８のいずれか一項に記載の肝細胞癌オルガノイド用の培養培地を調製し、工程（１）で得られた初代肝癌細胞上でオルガノイドを培養する工程。
【請求項10】
以下の工程を含むことを特徴とする、肝癌の治療薬を評価又はスクリーニングする方法：（１）請求項９に記載の肝細胞癌オルガノイドを培養する方法を用いて肝細胞癌オルガノイドを培養する工程、
（２）被検薬物を選択するとともに、必要とされる濃度勾配に希釈する工程、
（３）工程（１）で得られた前記オルガノイドに、希釈した前記薬物を添加する工程、
（４）前記オルガノイドのサイズ又は生存性を検出する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に肝細胞癌オルガノイド培養のための培養培地、該培養培地を用いた肝細胞癌オルガノイドの培養方法、並びに薬物の有効性評価及びスクリーニングにおけるその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、術後ＴＡＣＥ治療、経口薬治療等を含む、肝癌に対する術後補助化学療法が、新たなタイプの補助治療として、徐々に臨床医の注目を集め、認知されてきている。しかしながら、標準化された化学療法レジメンがないことから、経験に基づく従来の化学療法では、個体差が無視され、盲点となることがあるため、有効性は常に満足のいくものではなく、単剤療法又は併用療法における有効率は２０％未満である（非特許文献１）。新興の標的薬物によって毒性の副作用は或る程度軽減されたが、薬物の量が少なすぎ、治療費が高額であり、効果が個体によって異なるため、大部分の患者の治療ニーズに応えることは困難である。効果的な肝癌薬物感受性試験システムがないため、精密な化学療法を達成することができない。したがって、肝癌のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物感受性結果を臨床のｉｎ ｖｉｖｏ反応と一致させることが治療の鍵となる。
【0003】
従来の臨床薬物感受性試験では、二次元細胞培養が使用されることが多い。しかしながら、二次元培養細胞は、限られた範囲でしか組織の生理学的条件をシミュレートすることができず、ｉｎ ｖｉｖｏでの実際の組織構造を有しないため、分化レベルが低くなり、細胞の生理学的機能が失われる傾向があり、得られた実験結果から実際の臨床結果を予測することは困難である。オルガノイドは、三次元（３Ｄ）細胞培養に属し、主に分化能を有するヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞に由来する。内因性の組織幹細胞は、各器官の機能的形態を維持する上で重要な役割を果たし、様々な組織及び器官に存在する。これらの幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの或る特定の誘導条件下で自己組織化し、直径僅か数ミリメートルの小型構造を形成することができる。腫瘍オルガノイドは、患者の身体から採取した原発腫瘍から実験室内で培養された小型３Ｄ腫瘍細胞モデルである。腫瘍オルガノイドは、個体間の腫瘍の不均一性を維持しながら、原腫瘍組織の特徴を高度にシミュレートすることができ、高スループット薬物スクリーニング及び個別化精密療法等の機能的試験に使用することができる。
【0004】
現在、肝細胞癌オルガノイドの培養方法には、基本培養培地（ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２）、Ｒ－スポンジン－１、ノギン、及び幾つかの高価なタンパク質因子が使用されることが多く、オルガノイド培養のコストが高くなっている。また、この技術の複雑な操作及び困難さから、大規模な商業的応用は限られている。したがって、低コストで簡便であり、成功率の高いオルガノイドの培養方法及び培養培地の開発が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Jindal A, Thadi A, Shailubhai K. Hepatocellular Carcinoma: Etiology and Current and Future Drugs [J]. J Clin Exp Hepatol, 2019, 9(2): 221-232
【発明の概要】
【0006】
上述の技術的課題を解決するために、本発明は、肝細胞癌オルガノイドをｉｎ ｖｉｔｒｏで迅速に拡大増殖させるための培養培地及び培養方法を提供する。
【0007】
本発明の一態様は、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤と、Ｎ２及びＢ２７から選択される少なくとも１つの細胞培養添加剤と、肝細胞成長因子と、ＩＴＳ細胞培養添加剤と、Ｙ２７６３２と、デキサメタゾンと、ニューレグリン－１と、インスリンと、上皮細胞成長因子と、ＧｌｕｔａＭＡＸと、非必須アミノ酸とを含む、肝細胞癌オルガノイド用の培養培地を提供することである。ここで、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリール（例えば、フェニル及びナフチル等）、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、フェニルメチル等）、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたヘテロアリール（例えば、チエニル等）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル、より好ましくはメチルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（ヘテロシクリルは、例えば、ピペリジル、テトラヒドロピラニル等から選択される）から選択され、
Ｒ６は、ハロゲン（好ましくはフルオロ及びクロロ、より好ましくはフルオロ）、Ｃ１～Ｃ６アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ（好ましくはメトキシ）、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）から選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
【化1】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリール（例えば、フェニル及びナフチル等）、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、フェニルメチル等）、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたヘテロアリール（例えば、チエニル等）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル、より好ましくはメチルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（ヘテロシクリルは、例えば、ピペリジル、テトラヒドロピラニル等から選択される）から選択され、
Ｒ６は、ハロゲン（好ましくはフルオロ及びクロロ、より好ましくはフルオロ）、Ｃ１～Ｃ６アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ（好ましくはメトキシ）、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）から選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
【0008】
好ましい実施の形態において、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は式（Ｉａ）：
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたチエニル、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルメチルから選択され、より好ましくは、Ｒ１は１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、より好ましくは、Ｒ５は水素であり、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから独立して選択され、より好ましくは、Ｒ６は、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
【化2】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたチエニル、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルメチルから選択され、より好ましくは、Ｒ１は１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、より好ましくは、Ｒ５は水素であり、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから独立して選択され、より好ましくは、Ｒ６は、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
【0009】
好ましくは、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、以下の化合物又はその薬学的に許容され得る塩、若しくは溶媒和物から選択される少なくとも１つである：
【0010】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【0011】
最も好ましくは、本発明のＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は化合物１である。
【0012】
本発明の実施の形態において、本発明の培養培地中の成分の量は、以下の条件のうちいずれか１つ以上又は全てを満たす：
（１）ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の濃度が、２．５μＭ～１０μＭである；
（２）培養培地中のＢ２７又はＮ２細胞培養添加剤の体積比が、１：２５～１：１００である；
（３）肝細胞成長因子の濃度が、１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬである；
（４）培養培地中のＩＴＳ細胞培養添加剤の体積比が、１：３０～１：３００である；
（５）Ｙ２７６３２の濃度が、３μＭ～３０μＭである；
（６）デキサメタゾンの濃度が、０．１μＭ～１μＭである；
（７）ニューレグリン－１の濃度が、１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬである；
（８）インスリンの濃度が、１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬである；
（９）上皮細胞成長因子の濃度が、２ｎｇ／ｍＬ～１８ｎｇ／ｍＬである；
（１０）培養培地中のＧｌｕｔａＭＡＸの体積比が、１：３０～１：３００である；
（１１）非必須アミノ酸が、グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン及びセリンからなる群から選択される１つ以上であり、非必須アミノ酸の濃度が５０μＭ～２００μＭである。
（１）ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の濃度が、２．５μＭ～１０μＭである；
（２）培養培地中のＢ２７又はＮ２細胞培養添加剤の体積比が、１：２５～１：１００である；
（３）肝細胞成長因子の濃度が、１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬである；
（４）培養培地中のＩＴＳ細胞培養添加剤の体積比が、１：３０～１：３００である；
（５）Ｙ２７６３２の濃度が、３μＭ～３０μＭである；
（６）デキサメタゾンの濃度が、０．１μＭ～１μＭである；
（７）ニューレグリン－１の濃度が、１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬである；
（８）インスリンの濃度が、１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬである；
（９）上皮細胞成長因子の濃度が、２ｎｇ／ｍＬ～１８ｎｇ／ｍＬである；
（１０）培養培地中のＧｌｕｔａＭＡＸの体積比が、１：３０～１：３００である；
（１１）非必須アミノ酸が、グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン及びセリンからなる群から選択される１つ以上であり、非必須アミノ酸の濃度が５０μＭ～２００μＭである。
【0013】
本発明の実施の形態において、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２又はＲＰＭＩ－１６４０からなる群から選択される初期培地と、ストレプトマイシン／ペニシリン、アムホテリシンＢ及びプリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）からなる群から選択される１つ以上の抗生物質とを更に含む。
【0014】
好ましい実施の形態において、抗生物質としてストレプトマイシン／ペニシリンを使用する場合、ストレプトマイシンの濃度範囲は、２５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬであり、ペニシリンの濃度範囲は、２５Ｕ／ｍＬ～４００Ｕ／ｍＬであり、抗生物質としてアムホテリシンＢを使用する場合、濃度範囲は０．２５μｇ／ｍＬ～４μｇ／ｍＬであり、抗生物質としてプリモシンを使用する場合、濃度範囲は２５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬである。
【0015】
本発明はまた、肝細胞癌オルガノイドの培養方法を提供する。本発明の肝細胞癌オルガノイドの培養方法においては、本発明の肝細胞癌オルガノイド用の培養培地を用いて肝細胞癌オルガノイドを培養する。
【0016】
本発明の肝細胞癌オルガノイドの培養方法は、以下の工程を含む。
【0017】
１．固形肝癌組織から試料を単離し、初代肝癌細胞を得る。このプロセスは、以下の工程を含む：
（１）肝癌組織試料を分離し、基本培地及び組織消化液（組織消化液の添加量は、１ｇの腫瘍組織に対して約１０ｍＬの組織消化液である）を１：３の比率で添加し、恒温振とう機に入れ、４℃～３７℃の消化温度、２００ｒｐｍ～３５０ｒｐｍの回転速度で３時間～６時間の消化時間にわたって消化を行う。
（２）消化後、１２００ｒｐｍ～１６００ｒｐｍの遠心分離速度で２分～６分間の遠心分離時間にわたって遠心分離してから上清を捨てる。
（１）肝癌組織試料を分離し、基本培地及び組織消化液（組織消化液の添加量は、１ｇの腫瘍組織に対して約１０ｍＬの組織消化液である）を１：３の比率で添加し、恒温振とう機に入れ、４℃～３７℃の消化温度、２００ｒｐｍ～３５０ｒｐｍの回転速度で３時間～６時間の消化時間にわたって消化を行う。
（２）消化後、１２００ｒｐｍ～１６００ｒｐｍの遠心分離速度で２分～６分間の遠心分離時間にわたって遠心分離してから上清を捨てる。
【0018】
ここで、基本培地の配合は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２又はＲＰＭＩ－１６４０からなる群から選択される初期培地と、ストレプトマイシン／ペニシリン、アムホテリシンＢ及びプリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）からなる群から選択される１つ以上の抗生物質とを含む。組織消化液の配合は、１６４０培地、コラゲナーゼＩＩ（１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬ）、コラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮアーゼ（５０Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬ）、ヒアルロニダーゼ（０．５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ）、塩化カルシウム（１ｍＭ～５ｍＭ）、ウシ血清アルブミンＢＳＡ（５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ）を含む。
【0019】
２．本発明の肝細胞癌オルガノイド用の培養培地を調製し、上記の工程で得られた初代肝癌細胞を培養する。
上記の工程１で得られた初代肝癌細胞を本発明の肝細胞癌オルガノイド用の培養培地で再懸濁し、計数する。細胞密度が５×１０６細胞／ｍＬ～１０×１０６細胞／ｍＬとなるまで希釈し、希釈した細胞懸濁液に等量のマトリゲルマトリックスゲルを添加し、よく混合する。次いで、混合物をマルチウェルプレートに植え付け、マトリゲルが完全に凝固するまで３０分～６０分間、プレートを培養インキュベーターに入れる。次いで、拡大増殖及び培養のために肝細胞癌オルガノイド用の培養培地を添加する。
上記の工程１で得られた初代肝癌細胞を本発明の肝細胞癌オルガノイド用の培養培地で再懸濁し、計数する。細胞密度が５×１０６細胞／ｍＬ～１０×１０６細胞／ｍＬとなるまで希釈し、希釈した細胞懸濁液に等量のマトリゲルマトリックスゲルを添加し、よく混合する。次いで、混合物をマルチウェルプレートに植え付け、マトリゲルが完全に凝固するまで３０分～６０分間、プレートを培養インキュベーターに入れる。次いで、拡大増殖及び培養のために肝細胞癌オルガノイド用の培養培地を添加する。
【0020】
本発明はまた、以下の工程を含む、肝癌の治療薬を評価又はスクリーニングする方法を提供する：
（１）本発明の肝細胞癌オルガノイドの培養方法を用いて肝細胞癌オルガノイドを培養する工程；
（２）被検薬物を選択し、必要とされる濃度勾配に希釈する工程；
（３）工程（１）で得られたオルガノイドに、希釈した薬物を添加する工程；
（４）オルガノイドのサイズ又は生存性を検出する工程。
（１）本発明の肝細胞癌オルガノイドの培養方法を用いて肝細胞癌オルガノイドを培養する工程；
（２）被検薬物を選択し、必要とされる濃度勾配に希釈する工程；
（３）工程（１）で得られたオルガノイドに、希釈した薬物を添加する工程；
（４）オルガノイドのサイズ又は生存性を検出する工程。
【0021】
本発明の有益な効果としては、以下のことが挙げられる：
（１）肝細胞癌オルガノイドの培養の成功率は、９０％以上の成功率で改善される；
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代培養した肝細胞癌オルガノイドは、患者の病理学的特徴を維持することを確実にする；
（３）肝細胞癌オルガノイドは、高い拡大増殖効率で迅速に培養することができ、拡大増殖した肝細胞癌オルガノイドは、継続的な継代能力を有する；
（４）培養培地は、高価なＷｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジンファミリータンパク質、ノギンタンパク質、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）等の因子を必要としないため、培養するコストを抑制可能である；
（５）本技術は、肝細胞癌オルガノイドを大量に培養して提供することができることから、候補化合物の高スループットスクリーニング及び患者に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの高スループット薬物感受性機能的試験に適している。
（１）肝細胞癌オルガノイドの培養の成功率は、９０％以上の成功率で改善される；
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代培養した肝細胞癌オルガノイドは、患者の病理学的特徴を維持することを確実にする；
（３）肝細胞癌オルガノイドは、高い拡大増殖効率で迅速に培養することができ、拡大増殖した肝細胞癌オルガノイドは、継続的な継代能力を有する；
（４）培養培地は、高価なＷｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジンファミリータンパク質、ノギンタンパク質、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）等の因子を必要としないため、培養するコストを抑制可能である；
（５）本技術は、肝細胞癌オルガノイドを大量に培養して提供することができることから、候補化合物の高スループットスクリーニング及び患者に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの高スループット薬物感受性機能的試験に適している。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図2】図２Ａ～図２Ｄは、本発明の肝細胞癌オルガノイド用の培養培地を用いて培養した肝細胞癌オルガノイドの顕微鏡下での写真である。図２Ａは、試料ＧＬ－００３から１０日間培養したオルガノイドの写真を示す。図２Ｂは、試料ＧＬ－００６から１０日間培養したオルガノイドの写真を示す。図２Ｃは、試料ＧＬ－００８から１２日間培養したオルガノイドの写真を示す。図２Ｄは、試料ＧＬ－０１３から１５日間培養したオルガノイドの写真を示す。
【図3】図３Ａは、本発明の肝細胞癌オルガノイド用の培養培地を用いて試料ＧＬ－００６から培養した肝細胞癌オルガノイドの病理学的及び免疫組織化学的特定の結果を示す図である。図３Ｂは、組織試料ＧＬ－００６の病理学的及び免疫組織化学的特定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明をより良く理解するために、実施形態及び図面と組み合わせて以下に更に説明する。以下の実施例は、本発明を限定するものではなく、例示のみを目的として提示される。
【0024】
（ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の調製例）
本明細書では、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とは、直接的又は間接的にＭＳＴ１／２シグナル伝達を負に制御する任意の阻害剤を指す。一般に、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１／２キナーゼに結合することにより、ＭＳＴ１／２キナーゼの活性を低下させる。ＭＳＴ１とＭＳＴ２は構造が似ているため、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１又はＭＳＴ２に結合してその活性を低下させる化合物であってもよい。
本明細書では、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とは、直接的又は間接的にＭＳＴ１／２シグナル伝達を負に制御する任意の阻害剤を指す。一般に、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１／２キナーゼに結合することにより、ＭＳＴ１／２キナーゼの活性を低下させる。ＭＳＴ１とＭＳＴ２は構造が似ているため、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１又はＭＳＴ２に結合してその活性を低下させる化合物であってもよい。
【0025】
１．ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤化合物１の調製
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド１
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド１
【化3】
【0026】
メチル２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（Ａ２）：２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）酢酸（２．０ｇ）、次いでメタノール（３０ｍｌ）を丸底フラスコに加え、続いて塩化チオニル（１．２ｍｌ）を氷浴下で滴下して加えた。反応系を８５℃で一晩反応させた。反応終了後、この系を減圧下で蒸発させて溶剤を乾燥させ、得られた白色固体をそのまま次の工程に使用した。
【0027】
メチル２－（（２－クロロ－５－ニトロピリミジン－４－イル）アミノ）－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（Ａ３）：丸底フラスコにメチル２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（２ｇ）、次いでアセトン（３０ｍｌ）及び炭酸カリウム（２．２ｇ）を加え、次いで氷塩浴で系を－１０℃に冷却した後、アセトン中の２，４－ジクロロ－５－ニトロピリミジン（３．１ｇ）の溶液をゆっくりと加えた。反応系を室温で一晩撹拌した。反応終了後、反応混合物を濾過し、濾液から減圧下で溶剤を除去し、残渣を加圧シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物Ａ３を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ３５９．０。
【0028】
２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（Ａ４）：丸底フラスコにメチル２－（（２－クロロ－５－ニトロピリミジン－４－イル）アミノ）－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（２．５ｇ）、次いで酢酸（５０ｍｌ）及び鉄粉（３．９ｇ）を加えた。反応系を６０℃で２時間撹拌した。反応終了後、反応系を減圧下で蒸発させて溶剤を乾燥させ、得られたものを飽和炭酸水素ナトリウム溶液でアルカリ性に中和し、酢酸エチルで抽出した。有機相を水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機相を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて、粗生成物を得た。粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、化合物Ａ４を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ２９７．０。
【0029】
２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（Ａ５）：丸底フラスコに２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（２ｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１０ｍｌ）を加え、－３５℃に冷却し、続いてヨードメタン（０．９ｍｌ）、次いで水素化ナトリウム（６１５ｍｇ）を加え、反応系を２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を水で冷却（ｑｕｅｎｃｈ）し、酢酸エチルで抽出した。有機相をそれぞれ水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて、粗生成物を得た。粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、化合物Ａ５を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ３２５．０。
【0030】
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド（１）：丸底フラスコに２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（１００ｍｇ）、スルファニルアミド（５３ｍｇ）、ｐ－トルエンスルホン酸（５３ｍｇ）及びｓｅｃ－ブタノール（５ｍｌ）を加えた。反応系を１２０℃で一晩撹拌した。反応終了後、反応混合物を濾過し、メタノール及びジエチルエーテルで洗浄し、化合物１を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ４６１．１。
【0031】
２．本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物の調製
本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物を化合物１と同様の方法で合成し、それらの構造及び質量スペクトルデータを以下の表に示す。
本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物を化合物１と同様の方法で合成し、それらの構造及び質量スペクトルデータを以下の表に示す。
【0032】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【0033】
実施例１．肝細胞癌オルガノイドの増殖に対する肝細胞癌オルガノイド用の培養培地に添加した様々な因子の影響
（１）肝細胞癌オルガノイド用の培養培地の調製
初めに、初期培地を含有する基本培地を調製した。初期培地は、一般に使用されているＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、又はＲＰＭＩ－１６４０から選択することができる。本実施形態において、基本培地の配合は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｃｏｒｎｉｎｇから購入）＋１００μｇ／ｍＬ プリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入、０．２％（容量／容量）、市販品の濃度は５０ｍｇ／ｍｌである）である。
（１）肝細胞癌オルガノイド用の培養培地の調製
初めに、初期培地を含有する基本培地を調製した。初期培地は、一般に使用されているＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、又はＲＰＭＩ－１６４０から選択することができる。本実施形態において、基本培地の配合は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｃｏｒｎｉｎｇから購入）＋１００μｇ／ｍＬ プリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入、０．２％（容量／容量）、市販品の濃度は５０ｍｇ／ｍｌである）である。
【0034】
異なるタイプの添加剤（表１を参照されたい）を基本培地に添加し、異なる成分を含む肝細胞癌オルガノイド用の培養培地を調製した。
【0035】
（２）初代肝癌細胞の単離及び処理
１．試料の選択
肝癌固形腫瘍の組織試料（術中）は、専門医療機関の専門医療従事者によって患者から採取され、全ての患者がインフォームドコンセントに署名した。サイズが０．２５ｃｍ３の術中試料を、市販の組織保存液（製造業者：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて保管及び輸送した。
１．試料の選択
肝癌固形腫瘍の組織試料（術中）は、専門医療機関の専門医療従事者によって患者から採取され、全ての患者がインフォームドコンセントに署名した。サイズが０．２５ｃｍ３の術中試料を、市販の組織保存液（製造業者：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて保管及び輸送した。
【0036】
２．材料の準備
表面消毒（ｓｕｒｆａｃｅ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）に供した後、１５ｍＬ滅菌遠心分離管、ピペッター、１０ｍＬピペット、滅菌ピペットチップ等をウルトラクリーンワークベンチ（ｕｌｔｒａ－ｃｌｅａｎ ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ）に置き、３０分間紫外線照射した。基本培地は、４℃の冷蔵庫から３０分前に取り出し、組織消化液は、－２０℃の冷蔵庫から３０分前に取り出した。
表面消毒（ｓｕｒｆａｃｅ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）に供した後、１５ｍＬ滅菌遠心分離管、ピペッター、１０ｍＬピペット、滅菌ピペットチップ等をウルトラクリーンワークベンチ（ｕｌｔｒａ－ｃｌｅａｎ ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ）に置き、３０分間紫外線照射した。基本培地は、４℃の冷蔵庫から３０分前に取り出し、組織消化液は、－２０℃の冷蔵庫から３０分前に取り出した。
【0037】
組織消化液：１６４０培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０４０－ＣＶＲ）、コラゲナーゼＩＩ（２ｍｇ／ｍＬ）、コラゲナーゼＩＶ（２ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮアーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）、ヒアルロニダーゼ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）、塩化カルシウム（３．３ｍＭ）、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）。
【0038】
上述のコラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼは、全てＳｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入し、塩化カルシウムはＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海（Ｓｈａｎｇｈａｉ）） Ｃｏ．, Ｌｔｄ．から購入し、ＢＳＡはＢｉｏｆｒｏｘｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。
【0039】
３．試料の単離
３．１．組織試料をウルトラクリーンワークベンチから培養皿に移し、血液が付いた組織を除去した。組織試料を基本培地で２回洗浄した後、別の培養皿に移し、滅菌メスで１×１×１ｍｍ３のサイズの組織ブロックに機械的に切断した。
３．１．組織試料をウルトラクリーンワークベンチから培養皿に移し、血液が付いた組織を除去した。組織試料を基本培地で２回洗浄した後、別の培養皿に移し、滅菌メスで１×１×１ｍｍ３のサイズの組織ブロックに機械的に切断した。
【0040】
３．２．切断した術中組織を１５ｍＬ遠心分離管に吸引し、これに５ｍＬの基本培地を添加し、完全に混合した後、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
【0041】
３．３．上清を捨て、得られたものに基本培地及び組織消化液（組織消化液の添加量は、１ｇの腫瘍組織に対して約１０ｍＬの組織消化液とした）の１：３混合物を添加した。試料に名前及び番号を付け、シーリングフィルムで密閉した後、振とう機（Ｚｈｉｃｈｕ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔのＺＱＬＹ－１８０Ｎ）内にて３７℃、３００ｒｐｍで消化した。消化の完了は、３０分毎の観察により、目に見える粒子が存在するか否かに基づいて決定した。
【0042】
３．４．消化が完了した後、未消化の組織塊を１００μＭフィルターメッシュに通して濾過した。フィルターメッシュ上の組織塊を、細胞の喪失を減らすために基本培地で遠心分離管に洗い入れた。得られたものを２５℃、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
【0043】
３．５．上清を捨て、得られたものを観察して、血球が存在するかを決定した。血球が存在する場合、得られたものに８ｍＬの血球溶解液（Ｓｉｇｍａから購入）を添加し、完全に混合し、４℃で２０分間溶解させた。この過程で転倒混和を１回行った。得られたものを２５℃、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
【0044】
３．６．上清を捨て、２ｍＬの基本培地を添加し、細胞を再懸濁して保存した。
【0045】
４．細胞の計数及び処理
４．１ 顕微鏡観察：少量の再懸濁細胞を培養皿にプレーティングし、癌細胞の密度及び形態を顕微鏡（ＣＮＯＰＴＥＣ、ＢＤＳ４００）下で観察した。
４．１ 顕微鏡観察：少量の再懸濁細胞を培養皿にプレーティングし、癌細胞の密度及び形態を顕微鏡（ＣＮＯＰＴＥＣ、ＢＤＳ４００）下で観察した。
【0046】
４．２ 生存細胞の計数：１２μＬの再懸濁した細胞懸濁液を１２μＬのトリパンブルー染色液（製造元：Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （上海（Ｓｈａｎｇｈａｉ）） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）と完全に混合した後、２０μＬの混合物を細胞計数プレート（製造元：Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ、仕様：５０個／箱）に添加した。セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ、ＩＣ１０００）を用いて、生存大細胞（１０μｍ超の細胞サイズ）のパーセンテージ＝生存細胞数／総細胞数×１００％を算出した。
【0047】
（３）肝細胞癌オルガノイドの培養
上記の工程で得られた初代肝癌細胞を、予め冷却したＤＭＥＭ／Ｆ１２で再懸濁し、計数した。細胞密度が５×１０６細胞／ｍＬ～１０×１０６細胞／ｍＬとなるまで希釈し、希釈した細胞懸濁液４００μＬに等量のマトリゲルマトリックスゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加し、静かによく混合した。次いで、混合物を９６ウェルプレートに５μＬ／ウェルで植え付けた。植え付けたプレートを、マトリゲルが完全に凝固するまで３０分間インキュベーターに入れた。次いで、予め室温に戻しておいた、表１に示す培養培地をそれぞれ添加し、拡大増殖及び培養のために培養培地を３日ごとに交換した。７日後、培養したオルガノイドを写真撮影し、オルガノイドの直径を測定して集計し、肝細胞癌オルガノイドの増殖に対する様々な因子の促進効果を比較した。実験コントロールとして、添加剤を全く含まない基本培地を使用した。実験結果を表１に示す。
上記の工程で得られた初代肝癌細胞を、予め冷却したＤＭＥＭ／Ｆ１２で再懸濁し、計数した。細胞密度が５×１０６細胞／ｍＬ～１０×１０６細胞／ｍＬとなるまで希釈し、希釈した細胞懸濁液４００μＬに等量のマトリゲルマトリックスゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加し、静かによく混合した。次いで、混合物を９６ウェルプレートに５μＬ／ウェルで植え付けた。植え付けたプレートを、マトリゲルが完全に凝固するまで３０分間インキュベーターに入れた。次いで、予め室温に戻しておいた、表１に示す培養培地をそれぞれ添加し、拡大増殖及び培養のために培養培地を３日ごとに交換した。７日後、培養したオルガノイドを写真撮影し、オルガノイドの直径を測定して集計し、肝細胞癌オルガノイドの増殖に対する様々な因子の促進効果を比較した。実験コントロールとして、添加剤を全く含まない基本培地を使用した。実験結果を表１に示す。
【0048】
【表3】
【0049】
ここで、「＋」は、基本培地と比較して、添加剤（複数の場合もある）を添加した培地が、少なくとも２例において肝癌組織から単離した肝細胞癌オルガノイドの増殖を促進する効果を有することを示し、「－」は、添加剤（複数の場合もある）を添加した培地が、少なくとも１例において肝癌組織から単離した肝細胞癌オルガノイドの増殖を阻害する効果を有することを示し、「○」は、添加剤（複数の場合もある）を添加した培地が、少なくとも２例において肝癌組織から単離した肝細胞癌オルガノイドの増殖に対して顕著な影響を及ぼさないことを示す。
【0050】
上記の結果に従い、Ｂ２７、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ＩＴＳ細胞培養添加剤、Ｙ２７６３２、デキサメタゾン、ニューレグリン－１（ＮＲＧ１）、インスリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ、化合物１、及び非必須アミノ酸を含む因子を更なる培養実験に選択した。
【0051】
実施例２．肝細胞癌オルガノイドの増殖に対する培養培地に添加した異なる濃度の因子の影響
実施例１のセクション（２）に記載の方法に従い、初代肝癌細胞を術中組織試料（番号ＧＬ－００３、ＧＬ－００４）から得て、以下の表２に示す培養培地の配合を用いてオルガノイドを培養した。
実施例１のセクション（２）に記載の方法に従い、初代肝癌細胞を術中組織試料（番号ＧＬ－００３、ＧＬ－００４）から得て、以下の表２に示す培養培地の配合を用いてオルガノイドを培養した。
【0052】
【表4】
【0053】
配合１の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合１の培地に加えて、調製したＢ２７を、Ｂ２７の最終濃度がそれぞれ１：２５、１：５０及び１：１００となるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合１の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。この一連の培養培地に添加した他の因子の最終濃度は、ＨＣ－３培養培地と同じであった。以下の配合１～配合１１の実験も同様に行ったため、詳細は説明しない。
【0054】
配合２の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合２の培地に加えて、調製したＨＧＦを、ＨＧＦの最終濃度がそれぞれ１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ及び２５ｎｇ／ｍＬとなるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合２の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0055】
配合３の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合３の培地に加えて、調製したＩＴＳ細胞培養添加剤を、ＩＴＳ細胞培養添加剤の最終濃度がそれぞれ１：３００、１：１００及び１：３０となるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合３の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0056】
配合４の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合４の培地に加えて、調製したＹ２７６３２を、Ｙ２７６３２の最終濃度がそれぞれ３μＭ、１０μＭ及び３０μＭとなるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合４の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0057】
配合５の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合５の培地に加えて、調製したデキサメタゾンを、デキサメタゾンの最終濃度がそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ及び１μＭとなるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合５の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0058】
配合６の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合６の培地に加えて、調製したＮＲＧ１を、ＮＲＧ１の最終濃度がそれぞれ１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ及び２５ｎｇ／ｍＬとなるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合６の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0059】
配合７の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合７の培地に加えて、調製したインスリンを、インスリンの最終濃度がそれぞれ１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬとなるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合７の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0060】
配合８の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合８の培地に加えて、調製したＥＧＦを、ＥＧＦの最終濃度がそれぞれ２ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ及び１８ｎｇ／ｍＬとなるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合８の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0061】
配合９の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合９の培地に加えて、調製したＧｌｕｔａＭＡＸを、ＧｌｕｔａＭＡＸの最終濃度がそれぞれ１：３００、１：１００及び１：３０となるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合９の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0062】
配合１０の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合１０の培地に加えて、調製した化合物１を、化合物１の最終濃度がそれぞれ２．５μＭ、５μＭ及び１０μＭとなるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合１０の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0063】
配合１１の培養培地を使用する場合、オルガノイドを植え付けた９６ウェルプレートに、配合１１の培地に加えて、調製した非必須アミノ酸を、非必須アミノ酸の最終濃度がそれぞれ５０μＭ、１００μＭ及び２００μＭとなるように１ウェル当たり２００μＬ添加した。配合１１の培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0064】
１０日後、培養したオルガノイドを写真撮影し、オルガノイドの直径を測定して集計し、肝細胞癌オルガノイドの増殖に対する様々な因子濃度の促進効果を比較した。２つの試料から収集したデータをまとめ、図１Ａ～図１Ｋに示した。図１Ａ～図１Ｋにおいては、比率は、各培養培地を用いて１０日間培養したオルガノイドの直径と、対応する培養培地を用いてＢＣウェルにおいて１０日間培養したオルガノイドの直径との比率を表す。１より大きい比率は、異なる濃度の因子又は低分子化合物を含有する培養培地が、ブランクコントロールのウェル中の培養培地よりも良好な増殖促進効果を有することを示す。１より小さい比率は、異なる濃度の因子又は低分子化合物を含有する培養培地が、ブランクコントロールのウェル中の培養培地よりも増殖促進効果が低いことを示す。
【0065】
図１Ａ～図１Ｋの結果によると、Ｂ２７の体積濃度は、好ましくは１：２５～１：１００であり、肝細胞成長因子の量は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬであり、ＩＴＳ細胞培養添加剤の体積濃度は、好ましくは１：３０～１：３００であり、Ｙ２７６３２の量は、好ましくは３μＭ～３０μＭであり、デキサメタゾンの量は、好ましくは０．１μＭ～１μＭであり、ＮＲＧ１の量は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬであり、インスリンの量は、１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、上皮成長因子の量は、好ましくは２ｎｇ／ｍＬ～１８ｎｇ／ｍＬであり、ＧｌｕｔａＭＡＸの体積濃度は、好ましくは１：３０～１：３００であり、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤化合物１の量は、好ましくは２．５μＭ～１０μＭであり、非必須アミノ酸の量は、好ましくは５０μＭ～２００μＭである。
【0066】
実施例３．肝細胞癌オルガノイドの培養及び特定
実施例１のセクション（２）に記載の方法によって得られた初代肝癌細胞（ＧＬ－００３、ＧＬ－００６、ＧＬ－００８、ＧＬ－０１３）を、本発明の肝細胞癌オルガノイド用のＨＣ－３培養培地を用いて再懸濁し、計数した。細胞密度が５×１０６細胞／ｍＬ～１０×１０６細胞／ｍＬとなるまで希釈し、希釈した細胞懸濁液４００μＬに等量のマトリゲルマトリックスゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加し、静かによく混合した。次いで、混合物を２４ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで植え付けた。植え付けたプレートを、マトリゲルが完全に凝固するまで３０分間インキュベーターに入れた。次いで、予め室温に戻しておいた肝細胞癌オルガノイド用のＨＣ－３培養培地を１ウェル当たり５００μＬで添加し、拡大増殖及び培養のために培養培地を３日ごとに更新した。
実施例１のセクション（２）に記載の方法によって得られた初代肝癌細胞（ＧＬ－００３、ＧＬ－００６、ＧＬ－００８、ＧＬ－０１３）を、本発明の肝細胞癌オルガノイド用のＨＣ－３培養培地を用いて再懸濁し、計数した。細胞密度が５×１０６細胞／ｍＬ～１０×１０６細胞／ｍＬとなるまで希釈し、希釈した細胞懸濁液４００μＬに等量のマトリゲルマトリックスゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加し、静かによく混合した。次いで、混合物を２４ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで植え付けた。植え付けたプレートを、マトリゲルが完全に凝固するまで３０分間インキュベーターに入れた。次いで、予め室温に戻しておいた肝細胞癌オルガノイド用のＨＣ－３培養培地を１ウェル当たり５００μＬで添加し、拡大増殖及び培養のために培養培地を３日ごとに更新した。
【0067】
１０日目～１５日目に、培養した肝細胞癌オルガノイドを顕微鏡（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＥＶＯＳ Ｍ５００）を用いて観察した。図２Ａ～図２Ｄは、４倍の対物レンズ下で撮影した試料ＧＬ－００３（１０日目）、ＧＬ－００６（１０日目）、ＧＬ－００８（１２日目）及びＧＬ－０１３（１５日目）から培養した肝細胞癌オルガノイドの写真を示す。肝細胞癌オルガノイドは、顕微鏡下で比較的滑らかな表面を有する規則的な球形に見える。
【0068】
培養した肝細胞癌オルガノイドに対して病理学的及び免疫組織化学的特定を行い、対応する組織試料も病理学的及び免疫組織化学的特定に送り、オルガノイドと組織との間の結果の一貫性を比較した。
【0069】
図３Ａは、試料ＧＬ－００６からｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した肝細胞癌オルガノイドの病理学的及び免疫組織化学的特定の結果を示し、それぞれ２０倍の対物レンズ下で撮影した写真である。図３Ａに示すように、ＨＥの結果は、オルガノイドの構造形態が癌組織の形態であることを示す。ＣＫ１９、Ｈｅｐｐａｒ－１及びＫｉ６７が発現され、試料が肝癌であることが示される。図３Ｂは、培養前のＧＬ－００６の対応する組織の病理学的及び免疫組織化学的結果を示し、本発明のＨＣ－３培養培地を用いて培養した肝細胞癌オルガノイドの診断結果が培養前の肝癌組織の診断結果と一致することが示される。
【0070】
実施例４．既存の培養培地との培養効果の比較
（１）コントロール培養培地の調製
文献（Ｌａｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２０１７， ２３（１２）： １４２４－１４３５）で使用されている培養培地を調製した。これは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｃｏｒｎｉｎｇから購入）＋１：１００ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇから購入）＋１：１００ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｃｏｒｎｉｎｇから購入）＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）＋１：５０ Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏから購入）＋１：１００ Ｎ２（Ｇｉｂｃｏから購入）＋１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ－アセチルシステイン（ＭＣＥから購入）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ ニコチンアミド（ＭＣＥから購入）＋１０ｎＭ ガストリン（ＭＣＥから購入）＋５０ｎｇ／ｍｌ 上皮成長因子（Ｒ＆Ｄから購入）＋１００ｎｇ／ｍｌ 線維芽細胞成長因子１０（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）＋２５ｎｇ／ｍｌ 肝細胞成長因子（Ｒ＆Ｄから購入）＋１０μｍｏｌ／Ｌ フォルスコリン（ＭＣＥから購入）＋５μｍｏｌ／Ｌ Ａ８３０１（ＭＣＥから購入）＋１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ２７６３２（ＭＣＥから購入）＋３ｎｍｏｌ／Ｌ デキサメタゾン（ＭＣＥから購入）の配合を有する。以下、これをＬａｕｒａ培養培地と称する。
（１）コントロール培養培地の調製
文献（Ｌａｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２０１７， ２３（１２）： １４２４－１４３５）で使用されている培養培地を調製した。これは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｃｏｒｎｉｎｇから購入）＋１：１００ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇから購入）＋１：１００ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｃｏｒｎｉｎｇから購入）＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）＋１：５０ Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏから購入）＋１：１００ Ｎ２（Ｇｉｂｃｏから購入）＋１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ－アセチルシステイン（ＭＣＥから購入）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ ニコチンアミド（ＭＣＥから購入）＋１０ｎＭ ガストリン（ＭＣＥから購入）＋５０ｎｇ／ｍｌ 上皮成長因子（Ｒ＆Ｄから購入）＋１００ｎｇ／ｍｌ 線維芽細胞成長因子１０（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）＋２５ｎｇ／ｍｌ 肝細胞成長因子（Ｒ＆Ｄから購入）＋１０μｍｏｌ／Ｌ フォルスコリン（ＭＣＥから購入）＋５μｍｏｌ／Ｌ Ａ８３０１（ＭＣＥから購入）＋１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ２７６３２（ＭＣＥから購入）＋３ｎｍｏｌ／Ｌ デキサメタゾン（ＭＣＥから購入）の配合を有する。以下、これをＬａｕｒａ培養培地と称する。
【0071】
（２）肝細胞癌オルガノイドの培養
実施例１のセクション（２）に記載の方法に従い、初代肝癌細胞を術中組織試料ＧＬ－０１８から得て、ＨＣ－３培養培地及びＬａｕｒａ培養培地をそれぞれ用い、実施例３に記載の方法に従って培養して、オルガノイドを得た。
実施例１のセクション（２）に記載の方法に従い、初代肝癌細胞を術中組織試料ＧＬ－０１８から得て、ＨＣ－３培養培地及びＬａｕｒａ培養培地をそれぞれ用い、実施例３に記載の方法に従って培養して、オルガノイドを得た。
【0072】
培養２５日目に、培養した肝細胞癌オルガノイドを顕微鏡（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＥＶＯＳ Ｍ５００）を用いて観察した。図４Ａ及び図４Ｂは、それぞれＨＣ－３培養培地及びＬａｕｒａ培養培地中で培養したオルガノイドの４倍の対物レンズ下で撮影した写真である。図４Ｃは、２つの培養培地を用いて培養したオルガノイドの相対サイズを比較した棒グラフである。
【0073】
【0074】
実施例５．本発明の培養培地を用いて拡大増殖させることによって得られた肝細胞癌オルガノイドを用いた薬物スクリーニング
（１）肝細胞癌オルガノイドの培養
実施例１のセクション（２）に記載の方法に従い、初代肝癌細胞を肝癌術中試料（ＧＬ－００６）から単離し、肝細胞癌オルガノイドの直径が５０μｍを超えるまでＨＣ－３培養培地を用いて培養し、オルガノイドを得て、これを続いて薬物スクリーニングに使用した。
（１）肝細胞癌オルガノイドの培養
実施例１のセクション（２）に記載の方法に従い、初代肝癌細胞を肝癌術中試料（ＧＬ－００６）から単離し、肝細胞癌オルガノイドの直径が５０μｍを超えるまでＨＣ－３培養培地を用いて培養し、オルガノイドを得て、これを続いて薬物スクリーニングに使用した。
【0075】
（２）スクリーニング用の薬物の調製
２つの濃度勾配の３つの薬物（ボルテゾミブ、アクラルビシン及びドキソルビシン；全てＭＣＥから購入）を以下の表に従って調製し、使用のために保管した。
２つの濃度勾配の３つの薬物（ボルテゾミブ、アクラルビシン及びドキソルビシン；全てＭＣＥから購入）を以下の表に従って調製し、使用のために保管した。
【0076】
【表5】
【0077】
（３）薬物負荷
調製した薬物を取り出し、室温に置いた。薬物をＨＣ－３培養培地で１０００倍に希釈した後、使用した。工程（１）に従って培養して得られたオルガノイドをインキュベーターから取り出し、培養培地をウェルから除去し、薬物を含有する培養培地をウェルの壁に沿ってゆっくりとウェルに添加した。薬物を添加した後、９６ウェルプレートの表面を滅菌し、続いてインキュベーターに移して更に培養した。５日後、オルガノイドの生存性を測定した。
調製した薬物を取り出し、室温に置いた。薬物をＨＣ－３培養培地で１０００倍に希釈した後、使用した。工程（１）に従って培養して得られたオルガノイドをインキュベーターから取り出し、培養培地をウェルから除去し、薬物を含有する培養培地をウェルの壁に沿ってゆっくりとウェルに添加した。薬物を添加した後、９６ウェルプレートの表面を滅菌し、続いてインキュベーターに移して更に培養した。５日後、オルガノイドの生存性を測定した。
【0078】
（４）オルガノイドの生存性の検出
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）を４℃の冷蔵庫から取り出し、１０ｍＬの試薬を充填スロット（ｌｏａｉｎｇ ｓｌｏｔ）に添加し、試験用の９６ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬を各ウェルに添加した。１０分間静置し、続いてよく混合した後、多機能マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて試験を行った。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）を４℃の冷蔵庫から取り出し、１０ｍＬの試薬を充填スロット（ｌｏａｉｎｇ ｓｌｏｔ）に添加し、試験用の９６ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬を各ウェルに添加した。１０分間静置し、続いてよく混合した後、多機能マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて試験を行った。
【0079】
（５）データ処理
薬物阻害率（％）＝１００％－（５日目の薬物処理ウェルの化学発光値／０日目の薬物処理ウェルの化学発光値）／（５日目のＤＭＳＯウェルの化学発光値／０日目のＤＭＳＯウェルの化学発光値）×１００％の式に従い、異なる薬物の阻害率を算出した。結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。図５Ａは、４倍対物顕微鏡（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＥＶＯＳ Ｍ５００）下で撮影した、薬物処理なしのオルガノイドの成長の写真及び薬物処理の５日後のオルガノイドの成長の写真を示す。図５Ｂは、異なる濃度の試験薬物による肝細胞癌オルガノイドの成長に対する阻害率の棒グラフを示す。
薬物阻害率（％）＝１００％－（５日目の薬物処理ウェルの化学発光値／０日目の薬物処理ウェルの化学発光値）／（５日目のＤＭＳＯウェルの化学発光値／０日目のＤＭＳＯウェルの化学発光値）×１００％の式に従い、異なる薬物の阻害率を算出した。結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。図５Ａは、４倍対物顕微鏡（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＥＶＯＳ Ｍ５００）下で撮影した、薬物処理なしのオルガノイドの成長の写真及び薬物処理の５日後のオルガノイドの成長の写真を示す。図５Ｂは、異なる濃度の試験薬物による肝細胞癌オルガノイドの成長に対する阻害率の棒グラフを示す。
【0080】
図５Ａから、本発明の肝細胞癌オルガノイド用の培養培地を用いて培養したオルガノイドの成長が良好であり、ボルテゾミブ及びアクラルビシンでの処理後にオルガノイドの成長が顕著に阻害されたことを確認することができる。図５Ｂは、異なる濃度の３つの試験薬物による肝細胞癌オルガノイドの成長に対する阻害率の棒グラフを示す。図５Ｂから、薬物処理群のデータ誤差が極めて小さいことが分かり、このシステムを薬物スクリーニングに使用する場合、同じ薬物の複製ウェル間のデータが実質的に一貫していることが示される。３つの抗腫瘍薬のうち、ボルテゾミブは、２つの濃度でオルガノイドの成長に対して強い阻害効果を有していたが、アクラルビシンの阻害効果は、濃度によって大きく異なり、ドキソルビシンは、この肝細胞癌オルガノイド株の成長に対して阻害効果を有しなかった。これにより、同じ患者に由来するオルガノイドの有効性及び感受性が薬物によって異なることが示された。この結果に基づき、肝癌患者に対して臨床で使用される薬物の有効性及び有効用量を決定することができる。
【産業上の利用可能性】
【0081】
本発明は、肝細胞癌オルガノイド培養のための培養培地及び培養方法を提供し、培養したオルガノイドは、薬物の有効性評価及びスクリーニングに使用することができる。このため、本発明は産業上の利用に適している。
【0082】
本発明を本明細書において詳細に説明したが、本発明はこれに限定されず、当業者であれば本発明の原理に従って変更を加えることができる。したがって、本発明の原理に従って加えられたいかなる変更も、本発明の保護範囲に含まれると理解されるものとする。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】