特表 2024-531607 ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/195 20060101AFI20240822BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240822BHJP

【ＦＩ】

C07K14/195

C12N5/10 ZNA

C12N15/31

C12N15/864 100Z

C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515064

(86)(22)【出願日】2022-09-08

(85)【翻訳文提出日】2024-04-04

(86)【国際出願番号】 US2022076112

(87)【国際公開番号】W WO2023039472

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】63/241,821

(32)【優先日】2021-09-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/296,741

(32)【優先日】2022-01-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518015608

【氏名又は名称】アーバー バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】チョン， シャオロン

(72)【発明者】

【氏名】ウェッセルズ， キントン ノーマン

(72)【発明者】

【氏名】ジブラット， ロイ

(72)【発明者】

【氏名】ジャキモ， ノア マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ギャリティ， アンソニー ジェイムズ

(72)【発明者】

【氏名】アルフォンス， ローレン イー．

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01Y

4B065AA93X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA50

4H045CA11

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、変異体ポリペプチド、変異体ポリペプチドを調製する方法、変異体ポリペプチド、変異体ポリペプチドを含む組成物及び細胞を特性化するためのプロセス、並びに変異体ポリペプチドを使用する方法に関する。本開示は、変異体ポリペプチドを含む複合体、複合体を製造するための方法、複合体、複合体を含む細胞を特性化するためのプロセス、並びに複合体を使用する方法に更に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３のアミノ酸配列に対して改変を含み、前記改変は、Ｄ５０９Ｒ、Ｓ５１１Ｒ、Ｉ５２１Ｒ、Ｄ５３５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、Ｌ５１６Ｇ、Ｅ１９８Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、Ｄ５０９Ｋ、Ｄ５０９Ｇ、Ｌ５８０Ｇ、Ｖ３５９Ｒ、Ｄ５３５Ｋ、Ｙ３８１Ｒ、Ｒ３５４Ｇ、Ｍ３８０Ｋ、Ｍ３８０Ｒ、Ｖ３８３Ｒ、Ｌ５８０Ｒ、Ｅ３６７Ｒ、Ｉ５２１Ｋ、Ｅ３６７Ｇ、Ｅ５０７Ｒ、Ｉ５２１Ｇ、Ｗ３５０Ｒ、Ｄ５３５Ｒ、Ｒ５２８Ｋ、Ｓ５２７Ｋ、Ｌ３８５Ｇ、Ｗ３５０Ｇ、Ｌ５１６Ｋ、Ｙ３８１Ｇ、Ｈ５３２Ｒ、Ｄ１２９Ｒ、Ｐ６１５Ｒ、Ｇ５７８Ｒ、Ｍ３８０Ｇ、Ｖ５９５Ｇ、Ｒ５３１Ｇ、Ｄ１２９Ｇ、Ｒ５３１Ｋ、Ｄ１５８Ｇ、Ｎ４７６Ｇ、Ｇ５７８Ｋ、Ａ５１２Ｒ、Ｐ６１８Ｒ、Ｖ５９５Ｒ、Ｖ５９５Ｋ、Ｖ３８３Ｇ、Ａ５９７Ｇ、Ｙ３８１Ｋ、Ｐ６１８Ｇ、Ｅ１９８Ｋ、Ｔ２８８Ｒ、Ｅ５０７Ｋ、Ｌ３８５Ｒ、Ｃ５３８Ｇ、Ｐ６１５Ｇ、Ｄ３８６Ｒ、Ｓ５１１Ｋ、Ｃ３７１Ｇ、Ｋ１３６Ｇ、Ｎ２２０Ｒ、Ｓ７８Ｋ、Ｋ１４１Ｇ、Ｋ２４０Ｒ、Ｄ２７７Ｒ、Ｔ１６５Ｒ又はＫ３７４Ｒであり、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を含む変異体ポリペプチド。

【請求項2】

配列番号３のアミノ酸配列に対して改変を含み、前記改変は、Ｄ５０９Ｒ、Ｓ５１１Ｒ、Ｉ５２１Ｒ、Ｄ５３５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、Ｌ５１６Ｇ、Ｅ１９８Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、Ｄ５０９Ｋ、Ｄ５０９Ｇ、Ｌ５８０Ｇ、Ｖ３５９Ｒ、Ｄ５３５Ｋ、Ｙ３８１Ｒ、Ｒ３５４Ｇ、Ｍ３８０Ｋ、Ｍ３８０Ｒ、Ｖ３８３Ｒ、Ｌ５８０Ｒ、Ｅ３６７Ｒ、Ｉ５２１Ｋ、Ｅ３６７Ｇ、Ｅ５０７Ｒ、Ｉ５２１Ｇ、Ｗ３５０Ｒ、Ｄ５３５Ｒ、Ｒ５２８Ｋ、Ｓ５２７Ｋ、Ｌ３８５Ｇ、Ｗ３５０Ｇ、Ｌ５１６Ｋ、Ｙ３８１Ｇ、Ｈ５３２Ｒ、Ｄ１２９Ｒ、Ｐ６１５Ｒ、Ｇ５７８Ｒ、Ｍ３８０Ｇ、Ｖ５９５Ｇ、Ｒ５３１Ｇ、Ｄ１２９Ｇ、Ｒ５３１Ｋ、Ｄ１５８Ｇ、Ｎ４７６Ｇ、Ｇ５７８Ｋ、Ａ５１２Ｒ、Ｐ６１８Ｒ、Ｖ５９５Ｒ、Ｖ５９５Ｋ、Ｖ３８３Ｇ、Ａ５９７Ｇ、Ｙ３８１Ｋ、Ｐ６１８Ｇ、Ｅ１９８Ｋ、Ｔ２８８Ｒ、Ｅ５０７Ｋ、Ｌ３８５Ｒ、Ｃ５３８Ｇ、Ｐ６１５Ｇ、Ｄ３８６Ｒ、Ｓ５１１Ｋ又はＣ３７１Ｇ、Ｋ１３６Ｇ、Ｎ２２０Ｒ、Ｓ７８Ｋ、Ｋ１４１Ｇ、Ｋ２４０Ｒ、Ｄ２７７Ｒ、Ｔ１６５Ｒ又はＫ３７４Ｒであり、配列番号３のアミノ酸配列と１～２０個のアミノ酸残基が異なっている変異体ポリペプチド。

【請求項3】

前記改変は、
ｉ）Ｄ５０９Ｒ、
ｉｉ）Ｓ５１１Ｒ、
ｉｉｉ）Ｉ５２１Ｒ、
ｉｖ）Ｄ５３５Ｇ、及び
ｖ）Ｑ５１４Ｇ
からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項4】

配列番号３のアミノ酸配列に対して第２の改変を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項5】

ｉ）前記改変はＬ５８０Ｇを含み、前記第２の改変はＬ３８５Ｇを含む
ｉｉ）前記改変はＤ５０９Ｒを含み、前記第２の改変はＭ３８０Ｒを含む；
ｉｉｉ）前記改変はＬ５８０Ｇを含み、前記第２の改変はＡ５１２Ｒを含む；
ｉｖ）前記改変はＳ５２７Ｒを含み、前記第２の改変はＣ５３８Ｇを含む；
ｖ）前記改変はＤ１２９Ｒを含み、前記第２の改変はＰ６１８Ｒを含む；又は
ｖｉ）前記改変はＱ５１４Ｇを含み、前記第２の改変はＡ５１２Ｒを含む
請求項４に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項6】

配列番号３のアミノ酸配列に対して第３の改変を更に含む、請求項４に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項7】

ｉ）前記改変はＤ５３５Ｇを含み、前記第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、前記第３の改変はＩ５２１Ｒを含む；
ｉｉ）前記改変はＬ５１６Ｒを含み、前記第２の改変はＱ５１４ＧＲを含み、前記第３の改変はＩ５２１Ｒを含む；
ｉｉｉ）前記改変はＤ５０９Ｒを含み、前記第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、前記第３の改変はＩ５２１Ｒを含む；
ｉｖ）前記改変はＤ５３５Ｇを含み、前記第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、前記第３の改変はＱ５１４Ｇを含む；
ｖ）前記改変はＤ５３５Ｇを含み、前記第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、前記第３の改変はＩ５２１Ｒを含む；
ｖｉ）前記改変はＫ１３６Ｇを含み、前記第２の改変はＮ２２０Ｒを含み、前記第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；
ｖｉｉ）前記改変はＳ７８Ｋを含み、前記第２の改変はＥ１９８Ｒを含み、前記第３の改変はＲ３５４Ｇを含む；
ｖｉｉｉ）前記改変はＫ１４１Ｇを含み、前記第２の改変はＮ２２０Ｒを含み、前記第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；
ｉｘ）前記改変はＫ１４１Ｇを含み、前記第２の改変はＫ２４０Ｒを含み、前記第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；及び
ｘ）前記改変はＫ１４１Ｇを含み、前記第２の改変はＤ２７７Ｒを含み、前記第３の改変はＭ３８０Ｒを含む、
請求項６に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項8】

第４の改変を更に含む、請求項６に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項9】

前記改変はＱ５１４Ｇを含み、前記第２の改変はＩ５２１Ｒを含み、前記第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、前記第４の改変はＥ１９８Ｒを含む、請求項８に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項10】

第５の改変を更に含む、請求項８に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項11】

前記改変はＤ５０９Ｒを含み、前記第２の改変はＤ５３５Ｇを含み、前記第３の改変はＬ５１６Ｒを含み、前記第４の改変はＱ５１４Ｇを含み、前記第５の改変はＩ５２１Ｒを含む、請求項１０に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項12】

第６の改変を更に含み、任意選択により第７、第８、第９及び第１０の改変を更に含む、請求項１０に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項13】

前記第２の改変は、置換、挿入又は欠失を含む、請求項４に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項14】

前記第３の改変は、置換、挿入又は欠失を含む、請求項６に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項15】

前記第４の改変は、置換、挿入又は欠失を含む、請求項８に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項16】

前記第５の改変は、置換、挿入又は欠失を含む、請求項１０に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項17】

ＲＮＡガイドに結合することができる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項18】

前記変異体ポリペプチド又は前記変異体ポリペプチドを含む複合体は、配列番号３のポリペプチドと比較して、酵素活性の増強、及び／又は安定性の増強を示す、請求項１～１７のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項19】

前記酵素活性の増強は、ヌクレアーゼ活性の増強である、請求項１８に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項20】

前記変異体ポリペプチド又は前記変異体ポリペプチドを含む複合体は、例えば実施例９及び１０に記載されるように、例えばインデル活性による測定で、配列番号３のポリペプチドと比較して少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍又は３倍の酵素活性の増強を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項21】

前記親ポリペプチドと比較して、前記ＲＮＡガイドに対する結合活性の増強を示す、請求項１～２０のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項22】

前記親ポリペプチドと比較して、前記ＲＮＡガイドに対する結合特異性の増強を示す、請求項１～２１のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項23】

ＲｕｖＣドメイン又はスプリットＲｕｖＣドメインを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項24】

１つ以上の触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項25】

前記１つ以上の触媒残基は、Ｄ３４５及びＥ５０６を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項26】

ヌクレアーゼ活性が低下しているか、又はヌクレアーゼ活性を伴わないポリペプチド（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｅａｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項27】

第２の改変は、ポリペプチドドメインの挿入を含み、任意選択で、前記挿入は、配列番号３の配列のＮ末端、Ｃ末端又は内部においてである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド又はシステム。

【請求項28】

ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項29】

ダイレクトリピート配列及びスペーサー配列を含み、前記ダイレクトリピート配列は、配列番号４～６のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含み、前記ダイレクトリピート配列の３’側にすぐのヌクレオチドは、Ｃ、Ｔ、又はＧから選択されるＲＮＡガイド又は前記ＲＮＡガイドをコードする核酸。

【請求項30】

請求項１～２８のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド又は前記変異体ポリペプチドをコードする核酸と、ＲＮＡガイド又は前記ＲＮＡガイドをコードする第２の核酸とを含み、前記ＲＮＡガイドはダイレクトリピート配列とスペーサー配列とを含み、任意選択で、前記ＲＮＡガイドは請求項２９に記載のＲＮＡガイドであるシステム。

【請求項31】

前記ダイレクトリピート配列は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載のシステム。

【請求項32】

前記ダイレクトリピート配列は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３０又は３１に記載のシステム。

【請求項33】

前記ダイレクトリピート配列は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６を含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項34】

前記スペーサー配列は、１５～３５ヌクレオチド長を含む、請求項３０～３３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項35】

前記第１の核酸は第１のベクター中に位置し、前記ＲＮＡガイドをコードする前記第２の核酸はベクター（例えば、前記第１のベクター又は第２のベクター）中に位置し、任意選択で、前記第１及び／又は前記第２のベクターはウイルスベクターである、請求項３０～３４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項36】

標的核酸は、前記スペーサー配列中のヌクレオチド配列に相補的な配列を含む、請求項３０～３５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項37】

前記標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接し、前記ＰＡＭ配列は５’－ＮＴＮ－３’、５’－ＨＴＮ－３’、又は５’－ＴＮＡ－３’として示されるヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＨはＡ又はＣ又はＴである、請求項３０～３６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項38】

前記ＰＡＭ配列は、５’－ＣＴＧ－３’又は５’－ＣＴＣ－３’として示されるヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載のシステム。

【請求項39】

標的核酸は、二本鎖ＤＮＡである、請求項３０～３８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項40】

請求項１～２８のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチドをコードする核酸。

【請求項41】

細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項４０に記載の核酸。

【請求項42】

ガイドＲＮＡをコードする配列を更に含む、請求項４０又は４１に記載の核酸。

【請求項43】

プロモーターに作動可能に連結されている、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項44】

ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項45】

ベクター内にある、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項46】

前記ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む、請求項４５に記載のベクター。

【請求項47】

前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４６に記載のウイルスベクター。

【請求項48】

請求項１～２９のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド、請求項３０～３９のいずれか一項に記載のシステム、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項４６若しくは４７に記載のベクターを含む組成物であって、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃中に存在する組成物。

【請求項49】

請求項１～２９のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド、請求項３０～３９のいずれか一項に記載のシステム、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項４６若しくは４７に記載のベクターを含む細胞。

【請求項50】

真核細胞である、請求項４９に記載の細胞。

【請求項51】

哺乳動物細胞又は植物細胞である、請求項５０に記載の細胞。

【請求項52】

ヒト細胞である、請求項５１に記載の細胞。

【請求項53】

請求項１～２９のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチドを生成する方法であって、（ｉ）前記変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を生成する工程と、（ｉｉ）前記核酸配列を発現することができる適切な宿主細胞に前記核酸配列を導入する工程と、（ｉｉｉ）前記宿主細胞が前記変異体ポリペプチドを発現するのを可能にする工程とを含む方法。

【請求項54】

請求項１～２９のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチドを生成する方法であって、（ｉ）配列番号１又は配列番号２を含む核酸に１つ以上のヌクレオチド置換を導入して、前記変異体ポリペプチドをコードする変異体核酸を生成する工程と、（ｉｉ）前記変異体核酸から前記変異体ポリペプチドを発現させる工程とを含む方法。

【請求項55】

請求項１～２８のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチドを細胞に送達する方法であって、請求項１～２９のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド又は前記変異体ポリペプチドをコードする核酸を前記細胞に導入する工程と、任意選択で、ＲＮＡガイド又は前記ＲＮＡガイドをコードする核酸を導入する工程とを含み、前記導入する工程は、任意選択で、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組み合わせを導入することを含む方法。

【請求項56】

細胞内の標的ＤＮＡ分子を改変する方法であって、請求項１～２９のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド又は前記変異体ポリペプチドをコードする核酸を前記細胞に導入する工程と、ＲＮＡガイド又は前記ＲＮＡガイドをコードする核酸を導入する工程とを含み、前記導入する工程は、任意選択で、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組み合わせを導入することを含む方法。

【請求項57】

前記細胞に導入する工程は、細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む、請求項５５又は５６に記載の方法。

【請求項58】

前記細胞に導入する工程は、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、又はこれらの任意の組み合わせの使用を含む、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記変異体ポリペプチドをコードする前記核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年９月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２４１，８２１号及び２０２２年１月５日に出願された米国仮特許出願第６３／２９６，７４１号の利益を主張する。前述の出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと総称され、特定の種を外来の遺伝因子から防御する古細菌及び細菌における適応免疫系である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本発明は、上記の背景技術に対して、先行技術を超えるある特定の利点及び進歩を提供する。

【0004】

本明細書に開示される本発明は、特定の利点又は機能に限定されないが、変異体ポリペプチド、及び／又は変異体ポリペプチドを含む組成物を提供し、変異体ポリペプチドは親ポリペプチドに対して改変を含み、親ポリペプチドは配列番号３を含み、変異体ポリペプチドはＲＮＡガイド及び標的核酸に結合することができ、変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドを含む複合体は親ポリペプチド又は親ポリペプチドを含む複合体と比較して、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す。

【0005】

いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であるが、１００％ではない同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0006】

一態様では、本開示は、変異体ポリペプチドを提供し、変異体ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列に対して改変を含み、改変はＤ５０９Ｒ、Ｓ５１１Ｒ、Ｉ５２１Ｒ、Ｄ５３５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、Ｌ５１６Ｇ、Ｅ１９８Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、Ｄ５０９Ｋ、Ｄ５０９Ｇ、Ｌ５８０Ｇ、Ｖ３５９Ｒ、Ｄ５３５Ｋ、Ｙ３８１Ｒ、Ｒ３５４Ｇ、Ｍ３８０Ｋ、Ｍ３８０Ｒ、Ｖ３８３Ｒ、Ｌ５８０Ｒ、Ｅ３６７Ｒ、Ｉ５２１Ｋ、Ｅ３６７Ｇ、Ｅ５０７Ｒ、Ｉ５２１Ｇ、Ｗ３５０Ｒ、Ｄ５３５Ｒ、Ｒ５２８Ｋ、Ｓ５２７Ｋ、Ｌ３８５Ｇ、Ｗ３５０Ｇ、Ｌ５１６Ｋ、Ｙ３８１Ｇ、Ｈ５３２Ｒ、Ｄ１２９Ｒ、Ｐ６１５Ｒ、Ｇ５７８Ｒ、Ｍ３８０Ｇ、Ｖ５９５Ｇ、Ｒ５３１Ｇ、Ｄ１２９Ｇ、Ｒ５３１Ｋ、Ｄ１５８Ｇ、Ｎ４７６Ｇ、Ｇ５７８Ｋ、Ａ５１２Ｒ、Ｐ６１８Ｒ、Ｖ５９５Ｒ、Ｖ５９５Ｋ、Ｖ３８３Ｇ、Ａ５９７Ｇ、Ｙ３８１Ｋ、Ｐ６１８Ｇ、Ｅ１９８Ｋ、Ｔ２８８Ｒ、Ｅ５０７Ｋ、Ｌ３８５Ｒ、Ｃ５３８Ｇ、Ｐ６１５Ｇ、Ｄ３８６Ｒ、Ｓ５１１Ｋ、Ｃ３７１Ｇ、Ｋ１３６Ｇ、Ｎ２２０Ｒ、Ｓ７８Ｋ、Ｋ１４１Ｇ、Ｋ２４０Ｒ、Ｄ２７７Ｒ、Ｔ１６５Ｒ又はＫ３７４Ｒであり、変異体ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を含む。

【0007】

一態様では、本開示は、変異体ポリペプチドを提供し、変異体ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列に対して改変を含み、改変はＤ５０９Ｒ、Ｓ５１１Ｒ、Ｉ５２１Ｒ、Ｄ５３５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、Ｌ５１６Ｇ、Ｅ１９８Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、Ｄ５０９Ｋ、Ｄ５０９Ｇ、Ｌ５８０Ｇ、Ｖ３５９Ｒ、Ｄ５３５Ｋ、Ｙ３８１Ｒ、Ｒ３５４Ｇ、Ｍ３８０Ｋ、Ｍ３８０Ｒ、Ｖ３８３Ｒ、Ｌ５８０Ｒ、Ｅ３６７Ｒ、Ｉ５２１Ｋ、Ｅ３６７Ｇ、Ｅ５０７Ｒ、Ｉ５２１Ｇ、Ｗ３５０Ｒ、Ｄ５３５Ｒ、Ｒ５２８Ｋ、Ｓ５２７Ｋ、Ｌ３８５Ｇ、Ｗ３５０Ｇ、Ｌ５１６Ｋ、Ｙ３８１Ｇ、Ｈ５３２Ｒ、Ｄ１２９Ｒ、Ｐ６１５Ｒ、Ｇ５７８Ｒ、Ｍ３８０Ｇ、Ｖ５９５Ｇ、Ｒ５３１Ｇ、Ｄ１２９Ｇ、Ｒ５３１Ｋ、Ｄ１５８Ｇ、Ｎ４７６Ｇ、Ｇ５７８Ｋ、Ａ５１２Ｒ、Ｐ６１８Ｒ、Ｖ５９５Ｒ、Ｖ５９５Ｋ、Ｖ３８３Ｇ、Ａ５９７Ｇ、Ｙ３８１Ｋ、Ｐ６１８Ｇ、Ｅ１９８Ｋ、Ｔ２８８Ｒ、Ｅ５０７Ｋ、Ｌ３８５Ｒ、Ｃ５３８Ｇ、Ｐ６１５Ｇ、Ｄ３８６Ｒ、Ｓ５１１Ｋ又はＣ３７１Ｇ、Ｋ１３６Ｇ、Ｎ２２０Ｒ、Ｓ７８Ｋ、Ｋ１４１Ｇ、Ｋ２４０Ｒ、Ｄ２７７Ｒ、Ｔ１６５Ｒ又はＫ３７４Ｒであり、変異体ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列と１～２０個のアミノ酸残基が異なっている。

【0008】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列と１～５０個のアミノ酸残基（例えば、１～４５個、１～３５個、１～２５個、１～２５個、１～１５及び１０個、並びに１～５個、５～５０個、５～４０個、５～３０個、５～２０個、５～１０個、１０～５０個、１０～４０個、１０～３０個、１０～２０個、１０～１５個、１５～５０個、１５～４０個、１５～３０個、１５～２０個、２０～５０個、２０～４０個、２０～３０個、２０～３５個、２５～５０個、２５～４０個、２５～３０個、３０～５０個、３０～４０個、３０～３５個又は４０～５０個のアミノ酸残基）が異なっている。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と５０個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸残基が異なっている。

【0009】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列に対して第２の改変を更に含む。特定の実施形態では、
ｉ）改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む
ｉｉ）改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む；
ｉｉｉ）改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む；
ｉｖ）改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む；
ｖ）改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む；又は
ｖｉ）改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列に対して第３の改変を更に含む。いくつかの実施形態では、
ｉ）改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含む；
ｉｉ）改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４ＧＲを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含む；
ｉｉｉ）改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含む；
ｉｖ）改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含む；
ｉ）改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含む；
ｖｉ）改変はＫ１３６Ｇを含み、第２の改変はＮ２２０Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；
ｖｉｉ）改変はＳ７８Ｋを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含み、第３の改変はＲ３５４Ｇを含む；
ｖｉｉｉ）改変はＫ１４１Ｇを含み、第２の改変はＮ２２０Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；
ｉｘ）改変はＫ１４１Ｇを含み、第２の改変はＫ２４０Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；及び
ｘ）改変はＫ１４１Ｇを含み、第２の改変はＤ２７７Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＱ５１４ＧＲを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＤ５３５Ｇを含み、第３の改変はＬ５１６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＤ５３５Ｇを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＤ５３５Ｇを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＫ１３６Ｇを含み、第２の改変はＮ２２０Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＳ７８Ｋを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含み、第３の改変はＲ３５４Ｇを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１４１Ｇを含み、第２の改変はＮ２２０Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１４１Ｇを含み、第２の改変はＫ２４０Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１４１Ｇを含み、第２の改変はＤ２７７Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１３６Ｇを含み、第２の改変はＤ２７７Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＳ７８Ｋを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含み、第３の改変はＬ３８５Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＳ７８Ｋを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１３６Ｇを含み、第２の改変はＫ２４０Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＴ１６５Ｒを含み、第２の改変はＮ２２０Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＳ７８Ｋを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含み、第３の改変はＫ３７４Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＴ１６５Ｒを含み、第２の改変はＤ２７７Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＴ１６５Ｒを含み、第２の改変はＫ２４０Ｒを含み、第３の改変はＭ３８０Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１４１Ｇを含み、第２の改変はＫ２４０Ｒを含み、第３の改変はＬ３８５Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１３６Ｇを含み、第２の改変はＮ２２０Ｒを含み、第３の改変はＬ３８５Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１４１Ｇを含み、第２の改変はＮ２２０Ｒを含み、第３の改変はＬ３８５Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１４１Ｇを含み、第２の改変はＤ２７７Ｒを含み、第３の改変はＬ３８５Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１３６Ｇを含み、第２の改変はＮ２２０Ｒを含み、第３の改変はＫ３７４Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１３６Ｇを含み、第２の改変はＤ２７７Ｒを含み、第３の改変はＬ３８５Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＫ１３６Ｇを含み、第２の改変はＫ２４０Ｒを含み、第３の改変はＬ３８５Ｒを含む；いくつかの実施形態では、改変はＴ１６５Ｒを含み、第２の改変はＫ２４０Ｒを含み、第３の改変はＬ３８５Ｒを含む；

【0012】

特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列に対して第４の改変を更に含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＩ５２１Ｒを含み、第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含み、第４の改変はＩ５２１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＩ５２１Ｒを含み、第３の改変はＳ５２７Ｒを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含み、第４の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＩ５２１Ｒを含み、第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含み、第３の改変はＥ１９８Ｒを含み、第４の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含み、第４の改変はＳ５１１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含み、第４の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含み、第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＳ５２７Ｒを含み、第４の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含み、第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含み、第４の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含み、第４の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＩ５２１Ｒを含み、第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含み、第３の改変はＥ１９８Ｒを含み、第４の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含み、第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含み、第４の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含み、第３の改変はＥ１９８Ｒを含み、第４の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＩ５２１Ｒを含み、第４の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＤ５３５Ｇを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＩ５２１Ｒを含み、第３の改変はＳ５２７Ｒを含み、第４の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＩ５２１Ｒを含み、第３の改変はＳ５２７Ｒを含み、第４の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＩ５２１Ｒを含み、第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含み、第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含み、第３の改変はＥ１９８Ｒを含み、第４の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＩ５２１Ｒを含み、第３の改変はＳ５２７Ｒを含み、第４の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＥ１９８Ｒを含み、第４の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含み、第３の改変はＥ１９８Ｒを含み、第４の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含み、第３の改変はＲ３５４Ｇを含み、第４の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含み、第３の改変はＥ１９８Ｒを含み、第４の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＳ５２７Ｒを含み、第４の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＳ５２７Ｒを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含み、第３の改変はＬ５８０Ｇを含み、第４の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含み、第３の改変はＳ５１１Ｒを含み、第４の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含み、第４の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含み、第３の改変はＳ５１１Ｒを含み、第４の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含み、第３の改変はＧ５７８Ｒを含み、第４の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含み、第３の改変はＲ３５４Ｇを含み、第４の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含み、第４の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含み、第３の改変はＳ５２７Ｒを含み、第４の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含み、第３の改変はＱ５１４Ｇを含み、第４の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含み、第３の改変はＳ５１２Ｒを含み、第４の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含み、第３の改変はＤ１５８Ｇを含み、第４の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含み、第３の改変はＳ５２７Ｒを含み、第４の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含み、第３の改変はＶ３５９Ｒを含み、第４の改変はＡ５１２Ｒを含む。

【0013】

特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列に対して第５の改変を更に含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＤ５３５Ｇを含み、第３の改変はＬ５１６Ｒを含み、第４の改変はＱ５１４Ｇを含み、第５の改変はＩ５２１Ｒを含む。

【0014】

特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは第６の改変を更に含み、任意選択により第７、第８、第９及び第１０の改変を更に含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、第２の改変は、置換、挿入又は欠失を含む。

【0016】

特定の実施形態では、第３の改変は、置換、挿入又は欠失を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、第４の改変は、置換、挿入又は欠失を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、第５の改変は、置換、挿入又は欠失を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、第６の、任意選択により第７の、任意選択により第８の、任意選択により第９の、又は任意選択により第１０の改変は、それぞれ独立して、置換、挿入又は欠失を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表６の改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表７の改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表８の改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表９の改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表７の任意の細胞の２つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表８の任意の細胞の２つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表９の任意の細胞の２つの改変を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドを含む複合体は、配列番号３のポリペプチドと比較して、酵素活性の増強及び／又は安定性の増強を示す。

【0022】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドを含む複合体は、例えば実施例９及び１０に記載されるように、例えばインデル活性による測定で、配列番号３のポリペプチドと比較して少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍又は３倍の酵素活性の増強を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強は、ヌクレアーゼ活性の増強である。

【0024】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、ＲＮＡガイドに対する結合活性の増強を示す。

【0025】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、ＲＮＡガイドに対する結合特異性の増強を示す。

【0026】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドは変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は以下の特徴のうちの１つ以上を示す：
（ｉ）親二成分複合体と比較して、標的核酸に対する結合活性（例えば、オンターゲット結合活性）が増強；
（ｉｉ）親二成分複合体と比較して、標的核酸に対する結合特異性（例えば、オンターゲット結合特異性）が増強；
（ｉｉｉ）親二成分複合体と比較して、安定性が増強；並びに／又は
（ｉｖ）親二成分複合体と比較して、標的核酸からの解離の減少、及び／若しくは非標的核酸へのオフターゲット結合の減少。

【0027】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドは変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比較して、標的核酸に対する結合活性（例えば、オンターゲット結合活性）の増強を示す。

【0028】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合特異性の増強（例えば、オンターゲット結合特異性）を示す。

【0029】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて安定性の増強を示す。

【0030】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体と標的核酸とは、変異体三成分複合体を形成し、変異体三成分複合体は、親三成分複合体と比べて安定性の増加を示す。

【0031】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べて、二成分複合体形成の増強、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強、及び／又はＲＮＡガイドからの解離の減少を更に示す。

【0032】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて、標的核酸からの解離の減少、及び／又は非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を更に示す。

【0033】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、例えば、２０℃～６５℃の温度範囲にわたって生じる。

【0034】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、インキュベーション時間の範囲にわたって生じる。

【0035】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で生じる。

【0036】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、変異体ポリペプチド、変異体二成分複合体、又は変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親ポリペプチド、親二成分複合体、又は親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合に生じる。

【0037】

他の実施形態では、改変は、配列番号３に記載の配列を有する親ポリペプチドと比べてアミノ酸配列の改変を含み、改変は、配列番号３に記載の配列を有する親ポリペプチドと比較すると、１つ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又はそれ以上）の置換、挿入、欠失、及び／又は付加を含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、改変は、配列番号３に記載の親ポリペプチド配列に比べてアミノ酸配列の改変を含み、改変は、表２に列挙されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、改変は、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、又はグリシンの置換を含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメイン又はスプリットＲｕｖＣドメインを含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、１つ以上の触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の触媒残基は、Ｄ３４５、Ｅ５０６及びＤ５９４を含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性が低下しているか、又はヌクレアーゼ活性を伴わないポリペプチド（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｅａｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）である。

【0043】

特定の実施形態では、第２の改変は、ポリペプチドドメインの挿入を含み、任意選択で、挿入は、配列番号３の配列のＮ末端、Ｃ末端又は内部においてである。

【0044】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。

【0045】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドをコードする第１の核酸と、ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする第２の核酸とを含み、ＲＮＡガイドはダイレクトリピート配列とスペーサー配列とを含む、システムを提供する。

【0046】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドを含む組成物又は複合体はＲＮＡガイドを更に含み、ＲＮＡガイドはダイレクトリピート配列及びスペーサー配列を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６のヌクレオチド配列を含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５～３５ヌクレオチド長を含む。

【0051】

特定の実施形態では、第１の核酸は第１のベクター中に位置し、ＲＮＡガイドをコードする第２の核酸はベクター（例えば、第１のベクター又は第２のベクター）中に位置し、任意選択で、第１及び／又は第２のベクターはウイルスベクターである。

【0052】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３のいずれか１つを含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、スペーサー配列中のヌクレオチド配列に相補的な配列を含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接し、ＰＡＭ配列は５’－ＮＴＮ－３’、５’－ＨＴＮ－３’、又は５’－ＴＮＡ－３’として示されるヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＨはＡ又はＣ又はＴである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’－ＣＴＧ－３’又は５’－ＣＴＣ－３’として示されるヌクレオチド配列を含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は二本鎖ＤＮＡである。

【0056】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の変異体ポリペプチドをコードする核酸を提供する。

【0057】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。

【0058】

特定の実施形態では、核のコード化は、ガイドＲＮＡをコードする配列を更に含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0060】

特定の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター内にある。

【0062】

いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む。

【0063】

特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

【0064】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の変異体ポリペプチド、システム、核酸、又はベクターを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、組成物は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する。

【0065】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の変異体ポリペプチド、システム、核酸、又はベクターを含む細胞を提供する。

【0066】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に開示される変異体ポリペプチド及び／又は組成物を含む。

【0067】

いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞又は原核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞又は植物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

【0068】

本開示は、本明細書に開示の変異体ポリペプチドを調製する方法を更に提供し、この方法は、（ｉ）配列番号１又は配列番号２を含む核酸に１つ以上のヌクレオチド置換を導入して、変異体ポリペプチドをコードする変異体核酸を生成する工程と、（ｉｉ）変異体核酸から変異体ポリペプチドを発現させる工程とを含む。

【0069】

本開示は、本明細書に開示の変異型二成分複合体を形成する方法を更に提供し、この方法は、本明細書に開示の変異型ポリペプチドを本明細書に開示のＲＮＡガイドと接触させる工程を含む。

【0070】

一態様では、本開示は、変異体ポリペプチドを生成する方法を提供し、この方法は（ｉ）変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を生成する工程と、（ｉｉ）核酸配列を発現することができる適切な宿主細胞に核酸配列を導入する工程と、（ｉｉｉ）宿主細胞が変異体ポリペプチドを発現するのを可能にする工程とを含む。

【0071】

一態様では、本開示は、変異体ポリペプチドを生成する方法を提供し、この方法は、（ｉ）配列番号１又は配列番号２を含む核酸に１つ以上のヌクレオチド置換を導入して、変異体ポリペプチドをコードする変異体核酸を生成する工程と、（ｉｉ）変異体核酸から変異体ポリペプチドを発現させる工程とを含む。

【0072】

本開示は、本明細書に開示の変異型三成分複合体を形成する方法を更に提供し、この方法は、本明細書に開示の変異型ポリペプチドを本明細書に開示のＲＮＡガイド及び本明細書に開示の標的核酸と接触させる工程を含む。

【0073】

一態様では、本開示は、変異体ポリペプチドを細胞に送達する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する工程と、任意選択で、ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を導入する工程とを含み、導入する工程は、任意選択で、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組み合わせを導入することを含む。

【0074】

一態様では、本開示は、細胞内の標的ＤＮＡ分子を改変する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する工程と、ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を導入する工程とを含み、導入する工程は、任意選択で、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組み合わせを導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入する工程は、細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む。特定の実施形態では、細胞に導入する工程は、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、又はこれらの任意の組み合わせの使用を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。

【0075】

一態様では、本開示は、標的ＤＮＡ分子を改変する方法を提供し、この方法は、標的ＤＮＡ分子を変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ分子は、インビトロ又は細胞内にある。特定の実施形態では、細胞は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボにある。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞から選択される。

【0076】

本開示は、本明細書に開示の変異体ポリペプチド又は組成物又は変異体二成分複合体を送達する方法を更に提供し、この方法は、変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する工程と、任意選択で、本明細書に記載のＲＮＡガイド若しくはＲＮＡガイドをコードする核酸を導入する工程、又は本明細書に記載の変異体二成分複合体を導入する工程とを含み、導入する工程は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組合せを導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入する工程は、細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、導入する工程は、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、又はこれらの任意の組み合わせの使用を含む。

【0077】

本開示は更に、変異体ポリペプチド、又は変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドを含む複合体を含む組成物を提供し、変異体ポリペプチドは親ポリペプチドに対して改変を含み、親ポリペプチドは配列番号３を含み、変異体ポリペプチドはＲＮＡガイド及び標的核酸に結合することができ、変異体ポリペプチド又は複合体は、親ポリペプチド又は親ポリペプチド及びＲＮＡガイドを含む複合体と比較して、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す。

【0078】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強は、ヌクレアーゼ活性の増強である。

【0079】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドに対する結合活性の増強を示す。

【0080】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドに対する結合特異性の増強を示す。

【0081】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合活性の増強（例えば、オンターゲット結合活性）を示す。

【0082】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合特異性の増強（例えば、オンターゲット結合特異性）を示す。

【0083】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて安定性の増強を示す。

【0084】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体と標的核酸とは、変異体三成分複合体を形成し、変異体三成分複合体は、親三成分複合体と比べて安定性の増加を示す。

【0085】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べて二成分複合体形成の増強、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強、及び／又はＲＮＡガイドからの解離の減少を更に示す。

【0086】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸からの解離の減少、及び／又は非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を更に示す。

【0087】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、所定の範囲の温度にわたって、例えば、２０℃～６５℃にわたって生じる。

【0088】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、所定のインキュベーション時間にわたって生じる。

【0089】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で生じる。

【0090】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、変異体ポリペプチド、変異体二成分複合体、又は変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親ポリペプチド、親二成分複合体、又は親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合に生じる。

【0091】

他の実施形態では、改変は、配列番号３に記載の配列を有する親ポリペプチドと比べてアミノ酸配列改変を含み、改変は、配列番号３に記載の配列を有する親ポリペプチドと比較すると、１つ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又はそれ以上）の置換、挿入、欠失、及び／又は付加を含む。

【0092】

いくつかの実施形態では、改変は、配列番号３に記載の親ポリペプチド配列と比べてアミノ酸配列改変を含み、改変は、表２に列挙されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、改変は、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、又はグリシンの置換を含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、改変は、Ｅ３８Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ８９Ｒ、Ｓ２２３Ｒ、Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｌ３６０Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、Ｅ５６６Ｒ、及び／又はＤ７３０Ｒ置換を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメイン又はスプリットＲｕｖＣドメインを含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、１つ以上の触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の触媒残基は、Ｄ３４５、Ｅ５０６及びＤ５９４を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列及びスペーサー配列を含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0100】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６のヌクレオチド配列を含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５～３５ヌクレオチドの長さを含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、スペーサー配列中のヌクレオチド配列に対する配列相補性を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、標的核酸はＰＡＭ配列に隣接しており、ＰＡＭ配列は５’－ＮＴＮ－３’、５’－ＨＴＮ－３’、又は５’－ＴＮＡ－３’として記載されるヌクレオチド配列を含み、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＨはＡ又はＣ又はＴである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’－ＣＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＣ－３’として記載されるヌクレオチド配列を含む。

【0104】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡである。

【0105】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。

【0107】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0108】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター内にある。

【0109】

いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む。

【0110】

いくつかの実施形態では、組成物又は複合体は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する。

【0111】

本開示は更に、配列番号４、５又は６のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を含むダイレクトリピート配列を含むＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を提供する。いくつかの態様では、ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸は、５’－ＣＴＧ－３’又は５’－ＣＴＣ－３’プロトスペーサー隣接モチーフに隣接して結合するスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号４～６のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＲＮＡガイドは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、配列番号３によるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する。

【0112】

本開示はＲＮＡガイドを含む組成物を更に提供し、この組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３と少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３と少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３を含む。

【0113】

本開示は、本明細書に開示の変異体ポリペプチド及び／又は複合体を含む細胞を更に提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞又は原核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞又は植物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

【0114】

本開示は、本明細書に開示の変異体ポリペプチドを調製する方法を更に提供し、この方法は、（ｉ）配列番号１又は配列番号２を含む核酸に１つ以上のヌクレオチド置換を導入して、変異体ポリペプチドをコードする変異体核酸を生成する工程と、（ｉｉ）変異体核酸から変異体ポリペプチドを発現させる工程とを含む。

【0115】

本開示は、変異型二成分複合体を形成する方法を更に提供し、この方法は、本明細書に開示の変異型ポリペプチドを本明細書に開示のＲＮＡガイドと接触させる工程を含む。

【0116】

本開示は、本明細書に開示の変異型三成分複合体を形成する方法を更に提供し、この方法は、本明細書に開示の変異型ポリペプチドを本明細書に開示のＲＮＡガイド及び本明細書に開示の標的核酸と接触させる工程を含む。

【0117】

本開示は、本明細書に開示の変異体ポリペプチド又は組成物又は変異体二成分複合体を細胞に送達する方法を更に提供し、この方法は、本明細書に開示の変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する工程と、任意選択で、本明細書に記載のＲＮＡガイド若しくはＲＮＡガイドをコードする核酸を導入する工程、又は本明細書に記載の変異体二成分複合体を導入する工程とを含み、導入する工程は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組合せを導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入する工程は、細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、導入する工程は、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、又はこれらの任意の組み合わせの使用を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボにある。

【0118】

本開示は更に、細胞中の標的ＤＮＡ分子を改変する方法を提供し、この方法は、本明細書に開示の変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する工程と、本明細書に記載のＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を導入する工程、又は本明細書に記載の変異体二成分複合体を導入する工程とを含み、導入する工程は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組合せを導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入する工程は、細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、導入する工程は、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、又はこれらの任意の組み合わせの使用を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボにある。

【0119】

本開示は、標的ＤＮＡ分子を改変する方法を更に提供し、この方法は、標的ＤＮＡ分子を、本明細書に開示の変異体ポリペプチド及び本明細書に開示されるＲＮＡガイドと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ分子は、インビトロ又は細胞内にある。いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボにある。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞から選択される。

【0120】

いくつかの態様では、本開示は、細胞内の標的核酸を改変する方法を提供し、この方法は、（ｉ）配列番号３によるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチド、又はこのポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する工程と、（ｉｉ）ＲＮＡガイド（例えば、本明細書に記載されるような）又はＲＮＡガイドをコードする核酸を細胞に導入する工程とを含み、標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接し、ＰＡＭ配列は５’－ＣＴＧ－３’又は５’－ＣＴＣ－３’として記載されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３～７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。導入工程は、任意選択で、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組み合わせを導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入する工程は、細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む。特定の実施形態では、細胞に導入する工程は、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、又はこれらの任意の組み合わせの使用を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの態様では、方法は、５’－ＣＴＧ－３’又は５’－ＣＴＣ－３’プロトスペーサー隣接モチーフに隣接する位置で標的ＤＮＡを改変する。いくつかの実施形態では、改変は、標的核酸をニッキング又は切断することを含む。

【0121】

いくつかの態様では、本開示は、ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を提供し、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列及びスペーサー配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４～６のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含み、ダイレクトリピート配列の３’側にすぐのヌクレオチドは、Ｃ、Ｔ、又はＧから選択される。いくつかの態様では、本開示は、ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を提供し、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列及びスペーサー配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４～６のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含み、ダイレクトリピート配列の３’側にすぐのヌクレオチドは、Ａ以外である。いくつかの態様では、本開示は、ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を提供し、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列及びスペーサー配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号５若しくは６のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を提供し、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列及びスペーサー配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４～６のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はその配列に対して１、２、３若しくは４個の置換がされた配列からなる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ダイレクトリピート配列に対して異種である。

【図面の簡単な説明】

【0122】

【図1】５’－ＣＴＧ－３’ＰＡＭ配列に隣接する８つの標的部位におけるインデル活性（％生インデル）を示す。標的部位及びｃｒＲＮＡの配列を表４に示す。

【発明を実施するための形態】

【0123】

定義
本発明は、特定の実施形態に関してまた、ある特定の図面を参照して説明するが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。以降に記載されるような用語は、別段の記載がない限り、一般に常識で理解されるべきである。

【0124】

別段の定めがない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。いずれかの潜在的曖昧性の場合には、本明細書で提供される定義が、あらゆる辞書又は外部の定義よりも先行する。文脈上他の意味に解する場合を除き、単数形用語には複数形が含まれるものとし、複数形用語には単数形が含まれるものとする。「又は」の使用は、特に明記されない限り、「及び／又は」を意味する。「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、並びに他の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は限定的ではない。

【0125】

一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は周知であり、当該技術分野において一般的に使用されている。本明細書に提供される方法及び技術は、特に明記されない限り、当該技術分野において周知の従来の方法に従って、また本明細書の全体を通して引用され、議論されている様々な一般的でより具体的な参考文献で記載されているように実施される。酵素反応及び精製技術は、当該技術分野において一般に達成されているか、又は本明細書に記載されているように、製造元の仕様に従って実施される。本明細書に記載の合成化学、合成有機化学、及び医薬品化学並びに創薬化学に関連して使用される命名法、及び実験室手順並びに技術は当該技術分において周知であり、一般的に使用されているものである。標準的な技術が化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化、及び送達、並びに患者の治療のために使用される。

【0126】

以下に定義される用語を選択すると、本開示はより容易に理解され得る。

【0127】

「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の項目の文法的対象物を指す。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。

【0128】

例えば、量、持続時間などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される「約」は、±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、及びなお更に好ましくは±０．１％の指定値からの変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示された方法を実施するために適切である。

【0129】

本明細書で使用される場合、「複合体」という用語は、２つ以上の分子のグループ化を指す。いくつかの実施形態では、複合体は、互いに相互作用する（例えば、結合する、接触する、付着する）ポリペプチドと核酸分子とを含む。

【0130】

本明細書で使用される場合、「二成分複合体」という用語は、２つの分子（例えば、ポリペプチドと核酸分子）のグループ化を指す。いくつかの実施形態では、二成分複合体は、ポリペプチドと標的化部分（例えば、ＲＮＡガイド）とのグループ化を指す。いくつかの実施形態では、二成分複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を指す。本明細書で使用される場合、「変異体二成分複合体」という用語は、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとのグループ化を指す。本明細書で使用される場合、「親二成分複合体」という用語は、親ポリペプチドとＲＮＡガイド又は参照ポリペプチドとＲＮＡガイドとのグループ化を指す。

【0131】

本明細書で使用される場合、「三成分複合体」という用語は、３つの分子（例えば、ポリペプチドと２つの核酸分子）のグループ化を指す。いくつかの実施形態では、「三成分複合体」は、ポリペプチド、ＲＮＡ分子、及びＤＮＡ分子のグループ化を指す。いくつかの実施形態では、三成分複合体は、ポリペプチド、標的化部分（例えば、ＲＮＡガイド）、及び標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ分子）のグループ化を指す。いくつかの実施形態では、「三成分複合体」は、二成分複合体（例えば、リボ核タンパク質）と第３の分子（例えば、標的核酸）とのグループ化を指す。

【0132】

本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、ポリペプチドの別個の機能及び／又は構造単位を指す。いくつかの実施形態では、ドメインは、保存されたアミノ酸配列を含み得る。

【0133】

本明細書で使用される場合、「親」、「親ポリペプチド」、及び「親配列」という用語は、本発明の変異体ポリペプチドを産生するために、改変が行われる元のポリペプチド（例えば、参照又は出発ポリペプチド）を指す。

【0134】

本明細書で使用される場合、「プロトスペーサー隣接モチーフ」又は「ＰＡＭ」という用語は、エフェクター（例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）及びＲＮＡガイドを含む複合体が結合する標的配列に隣接するＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは酵素活性に必要とされる。本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、複合体のＲＮＡガイドがＰＡＭに直接隣接している標的配列と特異的に結合し、相互作用し、又は会合する場合が含まれる。そのような場合、標的配列とＰＡＭとの間には、ヌクレオチドは存在しない。用語「隣接する」はまた、ＲＮＡガイドが結合する標的配列とＰＡＭとの間に少数（例えば、１、２、３、４、又は５）のヌクレオチドが存在する場合を含む。二本鎖ＤＮＡ分子において、ＰＡＭモチーフを含む鎖は「ＰＡＭ鎖」と呼ばれ、相補鎖は「非ＰＡＭ鎖」と呼ばれるＲＮＡガイドは、本明細書に開示の標的配列に相補的である非ＰＡＭ鎖中の部位に結合する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ鎖は、コード（例えば、センス）鎖である。他の実施形態では、ＰＡＭ鎖は非コード（例えば、アンチセンス鎖）である。ＲＮＡガイドは塩基対形成を介して非ＰＡＭ鎖に結合するので、非ＰＡＭ鎖は標的鎖（ＴＳ）としても知られ、一方、ＰＡＭ鎖は非標的鎖（ＮＴＳ）としても知られる。

【0135】

本明細書で使用される場合、「参照組成物」、「参照分子」、「参照配列」、及び「参照」は、陰性対照又は親（例えば、親配列、親タンパク質、又は野生型タンパク質）などの対照を指す。例えば、参照分子は、それに対して変異体ポリペプチドが比較されるポリペプチドを指す。同様に、参照ＲＮＡガイドは、それに対して修飾ＲＮＡガイドが比較される標的部分を指す。変異体又は改変分子は、配列に基づいて（例えば、変異体又は改変分子は、参照分子とＸ％の配列同一性又は相動性を有し得る）、熱安定性に基づいて、又は活性に基づいて（例えば、変異体又は改変分子は、参照分子のＸ％の活性であり得る）、参照分子に対して比較され得る。例えば、変異体又は改変分子は、参照ポリペプチドの１０％以下の活性を有すると特徴付けられてもよく、又は参照ポリペプチドの少なくとも１０％を超える活性を有すると特徴付けられてもよい。参照ポリペプチドの例としては、天然に存在する未修飾ポリペプチド、例えば、古細菌又は細菌種からの天然に存在するポリペプチドが含まれる。ある特定の実施形態では、参照ポリペプチドは、比較されている変異体ポリペプチドと最も近い配列同一性又は相動性を有する天然に存在するポリペプチドである。ある特定の実施形態では、参照ポリペプチドは、変異体ポリペプチドに行き着くために、突然変異が行われた天然に存在するか又は既知の配列を有する親分子である。

【0136】

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイド」又は「ＲＮＡガイド配列」という用語は、本明細書に記載のポリペプチドの標的核酸への標的化を促進する任意のＲＮＡ分子を指す。例えば、ＲＮＡガイドは標的核酸を認識する（例えば、結合する）分子であり得る。ＲＮＡガイドは、特定の核酸配列に相補的であるように設計され得る。ＲＮＡガイドは、ＤＮＡ標的化配列（本明細書では、スペーサー配列とも称される）、及びＲＮＡガイドの本発明のポリペプチドへの結合を促進するダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ、及び成熟ｃｒＲＮＡという用語もまた、ＲＮＡガイドを指すために本明細書で使用される。いくつかの例では、ＲＮＡガイドは、例えば、標的核酸の非ＰＡＭ鎖に結合するＲＮＡガイドに含まれるＤＮＡ結合配列中に、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む修飾ＲＮＡ分子であり得る。いくつかの例では、ＤＮＡ結合配列は、ＤＮＡ配列、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド配列を含み得る。

【0137】

本明細書で使用される場合、「実質的に同一」という用語は、参照配列に対してある程度の同一性を有する配列、ポリヌクレオチド、又はポリペプチドを指す。

【0138】

本明細書で使用される場合、「標的核酸」、「標的配列」、及び「標的基質」という用語は、ＲＮＡガイドが特異的に結合する核酸を指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドのＤＮＡ標的化配列（すなわち、スペーサー配列）は標的核酸に結合する。いくつかの実施形態では、標的配列は、（ＰＡＭ鎖上の）ＰＡＭモチーフに隣接するＤＮＡのセグメントである。標的配列の相補的領域は、非ＰＡＭ鎖上にある。標的配列は、ＰＡＭモチーフに直接隣接し得る。或いは、標的配列及びＰＡＭは、小さな配列セグメント（例えば、最大５ヌクレオチド、例えば、最大４、３、２、又は１ヌクレオチド）によって分離され得る。標的配列は、当該技術分野で知られるＰＡＭモチーフを認識するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに応じて、ＰＡＭモチーフの３’末端又はＰＡＭモチーフの５’末端に位置し得る。例えば、標的配列は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド（例えば、本明細書に開示されるものなどのＣａｓ１２ｉ２ポリペプチド）のＰＡＭモチーフの３’末端に位置する。ＤＮＡは多くの場合二本鎖であり、ＲＮＡガイドは、それが相補的である２つの鎖のうちの１つに結合することは当然理解されている。ＲＮＡガイドが結合するＤＮＡ中の位置は、ＲＮＡガイドが結合する鎖の配列（非ＰＡＭ鎖）又はＲＮＡガイドが結合しない鎖の配列（ＰＡＭ鎖）を提供することによって簡単に記載することができる。したがって、本出願全体の文脈から明らかなように、標的核酸配列は、本明細書に記載のＲＮＡガイドによって標的とされる二本鎖ＤＮＡのいずれかの鎖の核酸配列を提供することによって記載され得る。

【0139】

本明細書で使用される場合、「変異体ポリペプチド」、「変異体エフェクターポリペプチド」、及び「変異体ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド」という用語は、親ポリペプチドと比較して、１つ又は複数の残基位置での改変、例えば、以下に限定されないが、置換、挿入、欠失、付加及び／又は融合を含むポリペプチドを指す。本明細書で提供される特定された改変の位置は、別段の指定がない限り、配列番号３に対して番号付けされる。例えば、Ｄ５０９Ｒの改変は、変異体ポリペプチドがＮ末端、Ｃ末端、又は内部に融合又は切断を含む場合であっても、例えば、その改変が融合ポリペプチド又は切断型ポリペプチドにおけるＮ末端に対して５０９位にないように、配列番号３に対する５０９番目のアミノ酸の改変を示す。配列番号３のアミノ酸位置を表２に更に記載する。
本明細書で使用される場合、「変異体ポリペプチド」、「変異体エフェクターポリペプチド」、及び「変異体ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド」という用語は、配列番号３のポリペプチドに対して改変を含むポリペプチドを指す。

【0140】

組成物
いくつかの態様では、本発明は、配列番号３のエフェクター（例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）の新規変異体、変異体を含む組成物、並びにその調製及び使用の方法を提供する。他の態様では、本発明は、配列番号３のエフェクター（例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）の変異体を含む複合体、及び組成物、その調製及び使用方法を更に提供する。いくつかの態様では、１つ以上の特性を有する複合体を含む組成物が本明細書に記載される。いくつかの態様では、複合体を含む組成物を送達する方法が記載される。

【0141】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、親ペプチドと比べて酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す変異体ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、親複合体と比べて酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す変異体ポリペプチドを含む複合体を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドに対する改変を含み、親ポリペプチドは配列番号３を含み、変異体ポリペプチドはＲＮＡガイド及び標的核酸に結合することができる。

【0142】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとを含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとを含む変異体二成分複合体を含む。

【0143】

組成物のいくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドとの複合体形成の増加（例えば、二成分複合体形成の増加）を有する。組成物のいくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドは、親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較するとより大きな結合親和性を有する。組成物のいくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドは、親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較するとより強いタンパク質－ＲＮＡ相互作用（例えば、イオン相互作用）を有する。組成物のいくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体よりも安定である。

【0144】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、変異体ポリペプチドと、ＲＮＡガイドと標的核酸とを含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、変異体ポリペプチドを含む変異体三成分複合体と、ＲＮＡガイドと標的核酸とを含む。

【0145】

組成物のいくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイド及び標的核酸との複合体形成の増加（例えば、三成分複合体形成の増加）を有する。組成物のいくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイド（例えば、変異体二成分複合体）は、親ポリペプチド及びＲＮＡガイド（例えば、親二成分複合体）と比較すると、標的核酸に対するより大きな結合親和性を有する。組成物のいくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、親三成分複合体よりも安定である。

【0146】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、本明細書に記載の変異体ポリペプチドを含む。

【0147】

変異体ポリペプチド
一実施形態では、変異体ポリペプチド（例えば、変異体ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド）は、単離又は精製されたポリペプチドである。

【0148】

いくつかの実施形態では、本開示の変異体ポリペプチドは、親ポリペプチド（例えば、親ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）の変異体であり、親は、配列番号１若しくは配列番号２などのヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号３などのアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。表１を参照されたい。

【0149】

【表1-1】

【0150】

【表1-2】

【0151】

本明細書に記載の親ポリヌクレオチドをコードする核酸配列は、参照核酸配列、例えば、配列番号１、又は配列番号２に対して実質的に同一であり得る。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照核酸配列、例えば、親ポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１、又は配列番号２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する配列を含む核酸によってコードされる。２つのそのような核酸配列間のパーセント同一性は、２つの最適にアライメントされた核酸配列の精査によって手動で、又は標準的パラメータを使用したソフトウェア若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することによって決定することができる。２つの核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標は、核酸分子が他のストリンジェントな条件下で（例えば、中程度から高度のストリンジェンシーの範囲内で）相補的配列に対してハイブリダイズすることである。

【0152】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照核酸配列、例えば、親ポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１、又は配列番号２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性は有さない核酸配列によってコードされる。

【0153】

いくつかの実施形態では、本開示の変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するが、１００％の同一性を有さないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超の同一性を有するが、１００％の同一性を有さないポリペプチド配列を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の参照ポリペプチド、例えば、親ポリペプチドに対して指定された程度のアミノ酸配列同一性を有する、例えば、配列番号３のアミノ酸配列に対する少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性は有さない変異体ポリペプチドを記載する。相同性又は同一性は、本明細書に記載されるように、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用してアミノ酸配列アライメントによって決定することができる。

【0155】

また、酵素活性、例えば、ヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を有し、且つ親ポリペプチド及び配列番号３のいずれか１つのアミノ酸配列と５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含む（前述のアラインメント方法のいずれかを使用して整列させた場合）、本開示の変異体ポリペプチドも提供される。

【0156】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドの１つ以上（例えば、数個）のアミノ酸で改変を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６２、１６４、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００個、又はそれ以上が改変される。

【0157】

改変は、参照配列と比較した、ペプチド若しくはポリペプチド中のアミノ酸、又はヌクレオチド中のヌクレオチドの置換、挿入、欠失、付加、又は融合を含み得る。改変を含む配列を作製する方法に、特定のプロセスは含まれていない。例えば、改変を含む配列は、個々のヌクレオチドから直接合成することができる。他の実施形態では、改変は、参照配列を用意し、次いで改変することによって行われる。

【0158】

置換は、参照配列と異なるアミノ酸によるアミノ酸の置換、又は参照配列と異なるヌクレオチドによるヌクレオチドの置換を含み得る。置換を含む配列を作製する方法に、特定のプロセスは含まれていない。例えば、置換を含む配列は、個々のアミノ酸又はヌクレオチドから直接合成することができる。他の実施形態では、改変は、参照配列を用意し、次いで改変することによって行われる。核酸配列は、生物のゲノム中にあり得る。核酸配列は、細胞内にあり得る。核酸配列は、ＤＮＡ配列であり得る。本明細書に記載のヌクレオチドの置換は、数キロベースまでの置換を指す。

【0159】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表２に列挙されるアミノ酸置換の１つ以上を含む。

【0160】

【表2-1】

【0161】

【表2-2】

【0162】

【表2-3】

【0163】

【表2-4】

【0164】

【表2-5】

【0165】

【表2-6】

【0166】

【表2-7】

【0167】

【表2-8】

【0168】

【表2-9】

【0169】

【表2-10】

【0170】

本明細書に記載の有益な改変のいくつかは、ＴＳ－スペーサーヘリックス及びｓｓＤＮＡ ＮＴＳを分離するＲｕｖＣ「リッド」の近くにある、配列番号３のヌクレアーゼポリペプチドのおよそ５００～５８０の残基に位置するホットスポットに含まれる。理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の置換は、酵素機能に対する以下の利益の１つ以上を有する：活性部位の溝に入るｓｓＤＮＡ ＮＴＳの安定化；ＴＳ－スペーサーヘリックスとのＨ結合相互作用の除去；ＴＳ－スペーサーヘリックスとの好ましい電荷相互作用の付加；及びスペーサーヘリックスから進行するｓｓＤＮＡ ＴＳによる電荷反発の除去。

【0171】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ５１１Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｉ５２１Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｑ５１４Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５１６Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５１６Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｅ１９８Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ５２７Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５８０Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｖ３５９Ｒアミノ酸置換を含む。 いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｙ３８１Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｒ３５４Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｍ３８０Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｍ３８０Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｖ３８３Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５８０Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｅ３６７Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｉ５２１Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｅ３６７Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｅ５０７Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｉ５２１Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｗ３５０Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｒ５２８Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ５２７Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ３８５Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｗ３５０Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５１６Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｙ３８１Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｈ５３２Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ１２９Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｐ６１５Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｇ５７８Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｍ３８０Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｖ５９５Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｒ５３１Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ１２９Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｒ５３１Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ１５８Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｎ４７６Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｇ５７８Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ａ５１２Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｐ６１８Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｖ５９５Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｖ５９５Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｖ３８３Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ａ５９７Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｙ３８１Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｐ６１８Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｅ１９８Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｔ２８８Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｅ５０７Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ３８５Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｃ５３８Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｐ６１５Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ３８６Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ５１１Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｃ３７１Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１３６Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｎ２２０Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ７８Ｋアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１４１Ｇアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ２４０Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ２７７Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｔ１６５Ｒアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ３７４Ｒアミノ酸置換を含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列に対して第２の改変を含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１５８Ｇを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＡ５１２Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ３６７Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＩ５２１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１５８Ｇを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＶ３５９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１５８Ｇを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＡ５１２Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＡ５１２Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＡ５１２Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＹ３８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＮ４７６Ｇを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１５Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１５Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１５Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＹ３８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いく

つかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＤ５３５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ３６７Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＥ３６７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＹ３８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＮ４７６Ｇを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＹ３８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＡ５１２Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＹ３８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１５Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１５８Ｇを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ５９５Ｇを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＮ４７６Ｇを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１５Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１５８Ｇを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１５Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＨ５３２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ３６７Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ３６７Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＹ３８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１５８Ｇを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＥ３６７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ５３１Ｇを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＶ５９５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１５Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＶ５９５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変

はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＹ３８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＮ４７６Ｇを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５８０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＶ３５９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＤ５３５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＶ５９５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１５Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１５８Ｇを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＹ３８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＥ３６７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＡ５１２Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＶ５９５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＷ３５０Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ３６７Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ３８５Ｇを含み、第２の改変はＨ５３２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＶ３５９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ５９５Ｇを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＮ４７６Ｇを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ３６７Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＨ５３２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＩ５２１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＶ５９５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＡ５９７Ｇを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１５Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＥ３６７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＥ１９８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＤ１２９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＹ３８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ５３１Ｇを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＮ４７６Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＨ５３２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＶ５９５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＹ３８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１５８Ｇを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１８Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１８Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＮ４７６Ｇを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＱ５１４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＷ３５０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５２７Ｒを含み、第２の改変はＶ３５９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＴ２８８Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２の改変はＨ５３２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＷ３５０Ｒを含み、第２の改変はＡ５１２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ５９５Ｇを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＭ３８０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＲ５３１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５３５Ｇを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ５９５Ｇを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＲ３５４Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＶ５９５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＳ５２７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＹ３８１Ｒを含み、第２の改変はＨ５３２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ１２９Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５１６Ｒを含み、第２の改変はＲ５３１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ３８６Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＣ３７１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＷ３５０Ｒを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３８３Ｒを含み、第２の改変はＷ３５０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１５Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＨ５３２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ３５４Ｇを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＧ５７８Ｒを含み、第２の改変はＲ５３１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ３６７Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＩ５２１Ｒを含み、第２

の改変はＷ３５０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＷ３５０Ｒを含み、第２の改変はＧ５７８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＥ３６７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＶ５９５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＣ５３８Ｇを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＡ５９７Ｇを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＰ６１５Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ３５９Ｒを含み、第２の改変はＶ５９５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＭ３８０Ｒを含み、第２の改変はＨ５３２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＷ３５０Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＨ５３２Ｒを含み、第２の改変はＰ６１８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＨ５３２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ５８０Ｇを含み、第２の改変はＨ５３２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＷ３５０Ｒを含み、第２の改変はＴ２８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＥ５０７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１８Ｒを含み、第２の改変はＤ３８６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ５０７Ｒを含み、第２の改変はＷ３５０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＡ５９７Ｇを含み、第２の改変はＣ５３８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＳ５１１Ｒを含み、第２の改変はＬ５１６Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＷ３５０Ｒを含み、第２の改変はＬ３８５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＷ３５０Ｒを含み、第２の改変はＤ１５８Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＰ６１８Ｒを含み、第２の改変はＡ５９７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＱ５１４Ｇを含み、第２の改変はＶ５９５Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＥ１９８Ｒを含み、第２の改変はＷ３５０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＶ３８３Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ５０９Ｒを含み、第２の改変はＲ３５４Ｇを含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、及びＩ５２１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｌ５１６Ｒ、及びＩ５２１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、及びＱ５１４Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、及びＩ５２１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｑ５１４Ｇ、Ｉ５２１Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、Ｉ５２１Ｒ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、及びＩ５２１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｑ５１４Ｇ、Ｉ５２１Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｄ５３５Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、及びＩ５２１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、Ｉ５２１Ｒ、及びＳ５２７Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｉ５２１Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｄ５３５Ｇ、及びＬ５１６Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｉ５２１Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、Ｅ１９８Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｌ５１６Ｒ、及びＱ５１４Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、及びＩ５２１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、及びＳ５１１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、及びＳ５２７Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｉ５２１Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｌ５１６Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｑ５１４Ｇ、Ｓ５２７Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５１６Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、Ｉ５２１Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｌ５１６Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、及びＳ５２７Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｉ５２１Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ５２７Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、Ｅ１９８Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５１６Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、Ｉ５２１Ｒ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、Ｉ５２１Ｒ、及びＳ５２７Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｑ５１４Ｇ、Ｌ５８０Ｇ、Ｅ１９８Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｌ５１６Ｒ、Ｉ５２１Ｒ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５１６Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、Ｉ５２１Ｒ、及びＬ５８０Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｄ５３５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５１６Ｒ、Ｉ５２１Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、及びＬ５８０Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｉ５２１Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５１６Ｒ、Ｉ５２１Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｄ５３５Ｇ、及びＩ５２１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｓ５２７Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｄ５３５Ｇ、及びＱ５１４Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ５２７Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、Ｅ１９８Ｒ、及びＲ３５４Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｑ５１４Ｇ、Ｉ５２１Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、及びＬ５８０Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、Ｅ１９８Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５１６Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、Ｌ５８０Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｉ５２１Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、Ｅ１９８Ｒ、及びＲ３５４Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｉ５２１Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、Ｒ３５４Ｇ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｉ５２１Ｒ、Ｌ５８０Ｇ、Ｅ１９８Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５１６Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、Ｓ５２７Ｒ、及びＬ５８０Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５３５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、Ｓ５２７Ｒ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ５０９Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、Ｌ５８０Ｇ、及びＥ１９８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１３６Ｇ、Ｎ２２０Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ７８Ｋ、Ｅ１９８Ｒ、及びＲ３５４Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１４１Ｇ、Ｎ２２０Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１４１Ｇ、Ｋ２４０Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１４１Ｇ、Ｄ２７７Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１３６Ｇ、Ｄ２７７Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ７８Ｋ、Ｅ１９８Ｒ、及びＬ３８５Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５８０Ｇ、Ｌ３８５Ｇ、Ｓ５１１Ｒ、及びＡ５１２Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ７８Ｋ、Ｅ１９８Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１３６Ｇ、Ｋ２４０Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｔ１６５Ｒ、Ｎ２２０Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５８０Ｇ、Ｌ３８５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、及びＡ５１２Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ１２９Ｒ、Ｐ６１８Ｒ、Ｓ５１１Ｒ、及びＡ５１２Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｓ７８Ｋ、Ｅ１９８Ｒ、及びＫ３７４Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｔ１６５Ｒ、Ｄ２７７Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５８０Ｇ、Ｌ３８５Ｇ、Ｇ５７８Ｒ、及びＤ１５８Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ１２９Ｒ、Ｐ６１８Ｒ、Ｒ３５４Ｇ、及びＡ５１２Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｔ１６５Ｒ、Ｋ２４０Ｒ、及びＭ３８０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１４１Ｇ、Ｋ２４０Ｒ、及びＬ３８５Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１３６Ｇ、Ｎ２２０Ｒ、及びＬ３８５Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ１２９Ｒ、Ｐ６１８Ｒ、Ｑ５１４Ｇ、及びＡ５１２Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ１２９Ｒ、Ｐ６１８Ｒ、Ｓ５２７Ｒ、及びＬ３８５Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１４１Ｇ、Ｎ２２０Ｒ、及びＬ３８５Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５８０Ｇ、Ｌ３８５Ｇ、Ｑ５１４Ｇ、及びＮ４７６Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５８０Ｇ、Ｌ３８５Ｇ、Ａ５１２Ｒ、及びＰ６１８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１４１Ｇ、Ｄ２７７Ｒ、及びＬ３８５Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ１２９Ｒ、Ｐ６１８Ｒ、Ｄ１５８Ｇ、及びＡ５１２Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１３６Ｇ、Ｎ２２０Ｒ、及びＫ３７４Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１３６Ｇ、Ｄ２７７Ｒ、及びＬ３８５Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｋ１３６Ｇ、Ｋ２４０Ｒ、及びＬ３８５Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｌ５８０Ｇ、Ｌ３８５Ｇ、Ｓ５２７Ｒ、及びＣ５３８Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｔ１６５Ｒ、Ｋ２４０Ｒ、及びＬ３８５Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｄ１２９Ｒ、Ｐ６１８Ｒ、Ｖ３５９Ｒ、及びＡ５１２Ｒ置換を含む。

【0174】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＲＮＡガイドに対する相互作用を増加させる改変を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドとの相互作用を増加させる改変は、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、又はヒスチジン置換である。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドの標的核酸に対する相互作用を増加させる改変を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸との相互作用を増加させる改変は、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、又はヒスチジン置換である。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、アラニン置換を含む。いくつかの実施形態では、アラニン置換は、変異体ポリペプチド骨格の幾何学的形状に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、グリシン置換を含む。いくつかの実施形態では、グリシン置換が変異体ポリペプチド骨格のラマチャンドラン結合角を変化させる。

【0175】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１つのＲｕｖＣモチーフ又はＲｕｖＣドメインを含む。本明細書で使用される場合、「生物学的活性部分」は、親ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する（例えば、完全に、部分的に、最小限に）部分である（例えば、「最小」又は「コア」ドメイン）。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、酵素活性を親ポリペプチドと少なくとも同程度の活性で保持する。したがって、いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドを超える酵素活性を有する。

【0176】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性が低下しているか、又はヌクレアーゼ活性を伴わないポリペプチド（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｅａｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）である。本明細書で使用される場合、本明細書に開示されるポリペプチドの触媒残基は、Ｄ３４５、Ｅ５０６、及びＤ５９４を含む。いくつかの実施形態では、Ｄ３４５及び／又はＥ５０６及び／又はＤ５９４における置換（例えば、Ｄ３４５Ａ及び／又はＥ５０６Ａ及び／又はＤ５９４Ａ）を含む変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、ヌクレアーゼ活性の低下を示すか、又はヌクレアーゼ活性を示さない。いくつかの実施形態では、残基Ｒ５９３は、ヌクレアーゼ活性に寄与する。いくつかの実施形態では、Ｒ５９３での置換は、ヌクレアーゼ活性を変化させ、例えば、ヌクレアーゼ活性の低下をもたらす。

【0177】

いくつかの実施形態では、本開示の変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと同等の、又はそれを超える酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の変異体ポリペプチドは、約２０℃～約９０℃の温度範囲で酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の変異体ポリペプチドは、約２０℃～約２５℃の温度で、又は約３７℃の温度で酵素活性を有する。

【0178】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡに対する親和性（例えば、ＲＮＡ親和性）を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとＲＮＡ親和性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡ親和性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡ親和性の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、ＲＮＡ親和性の増強を示す。

【0179】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドとの複合体形成（例えば、二成分複合体形成）を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較すると二成分複合体形成の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、二成分複合体形成の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、二成分複合体形成の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、二成分複合体形成の増強を示す。

【0180】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドに対する結合活性を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとＲＮＡガイド結合活性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイド結合活性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイド結合活性の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、ＲＮＡガイド結合活性の増強を示す。

【0181】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドに対する結合特異性を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、ＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す。

【0182】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、タンパク質－ＲＮＡ相互作用を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとタンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す。

【0183】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、タンパク質安定性を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとタンパク質安定性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、タンパク質安定性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、タンパク質安定性の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、タンパク質安定性の増強を示す。

【0184】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドからの解離（例えば、二成分複合体解離）を減少させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとＲＮＡガイドからの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃高い場合に、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が、親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合に、ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上の時間のいずれか１つのインキュベーション時間にわたって、親ポリペプチドと比較して、ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、ＲＮＡガイドを異なるＲＮＡで交換しない。

【0185】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドと標的核酸との三成分複合体の形成を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較すると、三成分複合体形成の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、三成分複合体形成の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、三成分複合体形成の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、三成分複合体形成の増強を示す。

【0186】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親二成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体（例えば、変異体二成分複合体）が標的核酸に対する結合親和性の増強を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親二成分複合体と比較すると、標的核酸に対する結合親和性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親二成分複合体と比較すると、標的核酸に対する結合親和性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親二成分複合体と比較すると、標的核酸に対する結合親和性の増強を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、親核酸に対する結合親和性の増強を示す。

【0187】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親二成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体（例えば、変異体二成分複合体）がオンターゲット結合活性の増強を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合活性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合活性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合活性の増強を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、オンターゲット結合活性の増強を示す。

【0188】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親二成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体（例えば、変異体二成分複合体）がオンターゲット結合特異性の増強を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合特異性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合特異性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合特異性の増強を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、オンターゲット結合特異性の増強を示す。

【0189】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親二成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体（例えば、変異体二成分複合体）が非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親二成分複合体と比較すると、非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親二成分複合体と比較すると、非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親二成分複合体と比較すると、非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す。

【0190】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親二成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体（例えば、変異体二成分複合体）が標的核酸からの解離の減少を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親二成分複合体と比較すると、標的核酸からの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で、親二成分複合体と比較すると、標的核酸からの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃高い場合に、親二成分複合体と比較すると、標的核酸からの解離の減少を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合に、標的核酸からの解離の減少を示す。

【0191】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親三成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む三成分複合体（例えば、変異体三成分複合体）が安定性の増強を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親三成分複合体と比較すると、安定性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親三成分複合体と比較すると、安定性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親三成分複合体と比較すると、安定性の増強を示す。一実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、安定性の増強を示す。

【0192】

本明細書に記載の変化は、１つ以上のアミノ酸の変化であり得るが、変異体ポリペプチドに対する変化はまた、アミノ末端伸長及び／又はカルボキシル末端伸長としてのポリペプチドの融合などの本質的な性質のものであってもよい。例えば、変異体ポリペプチドは、追加のペプチド、例えば１つ以上のペプチドを含有してもよい。追加のペプチドの例としては、標識付けのためのエピトープペプチド、例えばポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、Ｍｙｃ、及びＦＬＡＧが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異体ポリペプチドは、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ））などの検出可能な部分に融合され得る。

【0193】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）の核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）ののＮＬＳ、及び少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）のＮＥＳを含む。

【0194】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異体ポリペプチドは、自己不活性化することができる。Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（２０１６）：Ｓ５０を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0195】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞又は生物で使用するためにコドン最適化され得る。例えば、核酸は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト霊長類を含む任意の非ヒト真核生物に対してコドン最適化され得る。
コドン使用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／Ｃｏｄｏｎ／で入手可能な「コドン使用データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は多くの方法で適応することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の宿主細胞における発現のための特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズム、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）も利用可能である。

【0196】

ＲＮＡガイド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物又は複合体は標的核酸に結合し、変異体ポリペプチドと相互作用する標的化部分（例えば、ＲＮＡガイド、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート）を含む。標的化部分は、標的核酸に結合することができる（例えば、標的核酸に対する特異的結合親和性で）。

【0197】

いくつかの実施形態では、標的部分はＲＮＡガイドを含むか、又はＲＮＡガイドである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、本明細書に記載の変異体ポリペプチドを特定の核酸配列に向ける。当業者は、以下の特定の種類のＲＮＡガイドの例を読み取れば、いくつかの実施形態でＲＮＡガイドが部位特異的であることを理解するであろう。すなわち、いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、１つ以上の標的核酸配列（例えば、特異的ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列）と特異的に会合するが、非標的化核酸配列（例えば、非特異的ＤＮＡ又はランダム配列）とは会合しない。

【0198】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、本明細書に記載の変異体ポリペプチドと会合し、変異体ポリペプチドを標的核酸配列（例えば、ＤＮＡ）に向けるＲＮＡガイドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はその変異体）と会合することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、ポリペプチドを標的核酸配列（例えば、ＤＮＡ）に向ける。

【0199】

ＲＮＡガイドは、標的配列、例えば、部位特異的配列又は部位特異的標的の１つ以上のヌクレオチドを標的とすることができる（例えば、それと会合する、それに向けられる、それと接触し、又は結合することができる）。いくつかの実施形態では、変異体リボ核タンパク質（例えば、変異体ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドに加えてＲＮＡガイド）は、ＲＮＡガイド中のＤＮＡ標的化配列に相補的である標的核酸（例えば、配列特異的基質又は標的核酸）への結合の際に活性化される。

【0200】

いくつかの実施形態では、スペーサー又はスペーサー配列は、標的配列（ＤＮＡ配列）のＲＮＡ等価物であるＲＮＡガイドの一部である。典型的には、スペーサーは、（ＰＡＭ鎖中の）標的配列に相補的な部位での塩基対合によって非ＰＡＭ鎖に結合することができる配列を含有する。いくつかの例では、スペーサーは、この比較の目的のためにＴがＵと等価であると考えた場合、標的配列と少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）同一であり得る。いくつかの例では、スペーサーは、この比較の目的のためにＴがＵと等価であると考えた場合、標的配列と１００％同一であり得る。

【0201】

いくつかの例では、第１のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡガイドのスペーサー配列）が第２のポリヌクレオチド（例えば、標的配列の相補的配列）に対してある特定レベルの相補性を有する場合、ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドに相補的であり、第１及び第２のポリヌクレオチドが塩基対合によって二本鎖複合体を形成して、第１のポリヌクレオチドと複合体化したエフェクターポリペプチドが第２のポリヌクレオチドに作用（例えば、切断）することが可能になり得る。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに実質的に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相補性を有する。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに完全に相補的である、すなわち、第２のポリヌクレオチドに対して１００％の相補性を有する。

【0202】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、約１１ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有するスペーサーを含む。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１１ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、又は約１１ヌクレオチド～約１９ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、スペーサーは、約１９ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約３５ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約４５ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約３５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約４５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、又は約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。

【0203】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、一般に、１１～５０ヌクレオチド（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ヌクレオチド）の長さを有し、特異的標的核酸配列に相補的であるように設計され得る。いくつかの特定の実施形態では、ＲＮＡガイドは、例えば、ゲノム遺伝子座の特異的ＤＮＡ鎖に対して相補的であるように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化配列は、例えば、ゲノム遺伝子座の特異的ＤＮＡ鎖に対して相補的であるように設計される。

【0204】

ＲＮＡガイドは、参照核酸配列の相補鎖に対して実質的に同一であってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは参照核酸配列、例えば、標的核酸の相補鎖に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する配列を含む。そのような２つの核酸の間のパーセント同一性は、２つの最適にアライメントされた核酸配列の精査によって手動で、又は標準的パラメータを使用したソフトウェア若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することによって決定することができる。

【0205】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的核酸の相補鎖に対して、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する。

【0206】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、１１～５０ヌクレオチド（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ヌクレオチド）の長さであり、標的核酸に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的であるスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的ＤＮＡ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的ゲノム配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、例えば、最大５０の長さであり、標的核酸に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的であるＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的ＤＮＡ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的ゲノム配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。

【0207】

ある特定の実施形態では、ＲＮＡガイドは、ＤＮＡ標的化配列に結合したダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれを構成する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列及びＤＮＡ標的化配列、又はダイレクトリピート－ＤＮＡ標的配列－ダイレクトリピート配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは切断型ダイレクトリピート配列と、処理された又は成熟ｃｒＲＮＡに典型的なＤＮＡ標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、ＲＮＡガイドと複合体を形成し、ＲＮＡガイドは、複合体をＲＮＡガイドの少なくとも一部に相補的である部位特異的標的核酸と会合するように向ける。

【0208】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、表３に記載の配列又は表３に記載の配列の一部に対して少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、表３に記載の配列又は表３に記載の配列の一部に対して少なくとも９５％（例えば少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）同一である。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、表３に記載の配列又は表３に記載の配列の一部に対して同一である。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４～６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む。

【0209】

【表3】

【0210】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ＵＧＵＧＧＵＵＣＣＧＡＣ（配列番号７）に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号７に記載の配列を含む。

【0211】

いくつかの実施形態では、本開示の変異体ポリペプチドに対応するＰＡＭは、５’－ＮＴＮ－３’、５’－ＨＴＮ－３’、又は５’－ＴＮＡ－３’を含む。本明細書で使用される場合、Ｎはそれぞれ、任意のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣ）又はそのサブセット（例えば、Ｒ（Ａ又はＧ）、Ｙ（Ｃ又はＴ）、Ｋ（Ｇ又はＴ）、Ｂ（Ｇ、Ｔ、又はＣ）、Ｈ（Ａ、Ｃ、又はＴ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、５’－ＣＴＧ－３’を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、５’－ＣＴＧ－３’を含む。いくつかの実施形態では、本開示の変異体ポリペプチドを含む二成分複合体は、５’－ＮＴＮ－３’、５’－ＨＴＮ－３’、又は５’－ＴＮＡ－３’配列に隣接する標的核酸に結合する。いくつかの実施形態では、本開示の変異体ポリペプチドを含む二成分複合体は、５’－ＣＴＧ－３’又は５’－ＣＴＣ－３’配列に隣接する標的核酸に結合する。

【0212】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物又は複合体は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８個、又はそれ以上）のＲＮＡガイド、例えば、複数のＲＮＡガイドを含む。

【0213】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット及び同第２０１５／０７００８３号パンフレット（それらの各々の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる）のＲＮＡガイドに類似した構造を有する。

【0214】

特に明記しない限り、本明細書に提供される全ての組成物及び複合体、並びにポリペプチドは、その組成物又は複合体若しくはポリペプチドの活性レベルを参照して作製され、市販の供給源において存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は含まない。酵素成分の重量は、全活性タンパク質に基づく。全てのパーセンテージ及び比率は、特に明記されない限り、重量で計算される。全てのパーセンテージ及び比率は、特に明記されない限り、全組成に基づいて計算される。例示された組成では、酵素レベルは、全組成の重量で純粋な酵素によって表され、特に指定のない限り、成分は全組成の重量で表される。

【0215】

修飾
ＲＮＡガイド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸配列のいずれかは、参照配列、特に親ポリリボヌクレオチドに関して１つ以上の共有結合修飾を含んでもよく、これは本開示の範囲内に含まれる。

【0216】

例示的な修飾としては、例えば、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合への（例えば、リン酸結合への／ホスホジエステル結合への／ホスホジエステルバックボーンへの）、及びそれらの任意の組み合わせへのいずれかの修飾を含むことができる。本明細書に提供される例示的な修飾のいくつかは、以下に詳細に記載される。

【0217】

ＲＮＡガイド又は変異体ポリペプチドの成分をコードする核酸配列のいずれかは、例えば、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合への（例えば、リン酸結合への／ホスホジエステル結合への／ホスホジエステルバックボーンへの）、及びそれらの任意の組み合わせへのいずれかの有用な修飾を含むことができる。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択で置換されたアミノ、任意選択で置換されたチオール、任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル若しくはエチル）、又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）で置き換えられるか、又は置換されてもよい。ある特定の実施形態では、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合の各々に存在する。修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、又はそれらのハイブリッドに対する修飾であり得る。追加の修飾は、本明細書に記載されている。

【0218】

いくつかの実施形態では、修飾は、化学的修飾又は細胞誘発修飾を含み得る。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定的な例は、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－２１０から“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”においてＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｐａｎによって記載されている。

【0219】

異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、バックボーン構造）は、配列の様々な位置で存在してもよい。当業者であれば、ヌクレオチド類似体又は他の修飾が配列の任意の位置に配置されてもよく、それによって配列の機能は実質的に減少されないことを理解するであろう。配列は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（ヌクレオチド含量の全体に関して、又はヌクレオチドの１つ以上のタイプ、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、又はＣのいずれか１つ以上に関してのいずれかで）又は任意のそれらの間のパーセンテージ（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。

【0220】

いくつかの実施形態では、糖修飾（例えば、２’位若しくは４’位での）又は配列の１つ以上のリボヌクレオチドでの糖の置き換え、並びにバックボーン修飾は、ホスホジエステル結合の修飾又は置き換えを含んでもよい。配列の具体的な例としては、限定されないが、ホスホジエステル結合の修飾又は置き換えを含む、修飾バックボーン又はヌクレオシド間修飾などの非天然ヌクレオシド間結合を含む配列が挙げられる。修飾バックボーンを有する配列としては、とりわけバックボーンにリン原子を有さないものが挙げられる。本出願の目的のために、また当該技術分野において言及されることがあるように、それらのヌクレオシド間バックボーンにリン原子を有さない修飾ＲＮＡはまた、オリゴヌクレオシドであると見なされ得る。特定の実施形態では、配列は、そのヌクレオシド間バックボーンにリン原子を有するリボヌクレオチドを含むであろう。

【0221】

修飾配列のバックボーンとしては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、並びにヌクレオシド単位の隣接する対が３’－５’から５’－３’に又は２’－５’から５’－２’に結合している反転した極性を有するものを挙げることができる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。いくつかの実施形態では、配列は負に帯電していても正に帯電していてもよい。

【0222】

配列に組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸バックボーン）上で修飾され得る。したがって、ポリヌクレオチドバックボーンに関して、「リン酸」及び「ホスホジエステル」という語句は、互換的に使用される。バックボーンリン酸基は、酸素原子のうちの１つ以上を異なる置換基で置き換えることによって修飾され得る。更に、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、未修飾リン酸部分の本明細書に記載されるような別のヌクレオシド間結合による大規模な置き換えを含み得る。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄によって置き換えられている両方の非連結酸素を有する。リン酸リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレン－ホスホネート）による連結酸素の置き換えによっても修飾され得る。

【0223】

α－チオ置換リン酸部分は、非天然ホスホロチオエートバックボーン結合を通して、ＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに安定性を付与するために提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡはヌクレアーゼ提供性の増加を有し、その後細胞内環境においてより長い半減期を有するようになる。

【0224】

具体的な実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、アルファ－チオ－ヌクレオシド（例えば、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シチジン（ａ－チオ－シチジン）、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジン、又は５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シュードウリジン）が挙げられる。

【0225】

リン原子を含有しないヌクレオシド間結合が含まれる、本開示に従って利用され得る他のヌクレオシド間結合が、本明細書に記載されている。

【0226】

いくつかの実施形態では、配列は、１つ以上の細胞傷害性ヌクレオシドを含んでもよい。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、二機能性修飾として配列に組み込まれてもよい。細胞傷害性ヌクレオシドとしては、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフールとウラシルの組み合わせ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－１－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシジチン（ＤＭＤＣ）、及び６－メルカプトプリンを挙げることができるが、これらに限定されない。追加の例としては、リン酸フルダラビン、Ｎ４－ベヘノイル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、及びＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。

【0227】

いくつかの実施形態では、配列は、１つ以上の翻訳後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリ－Ａ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化、並びにチオール基及びチオシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ以上の翻訳後修飾は、ＲＮＡ中で特定された１００個を超える異なるヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）。いくつかの実施形態では、最初に単離された核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンからなる群から選択される１つ以上のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデノシン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、イノシン、１－メチル－イノシン、ウィオシン、ウィブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。

【0228】

配列は、分子の全長に沿って均一に修飾されても又は修飾されなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ以上又は全てのタイプ（例えば、天然に存在するヌクレオチド、プリン、若しくはピリミジン、又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵのうちのいずれか１つ以上若しくは全て）は、配列において、若しくはその所定の配列領域において、均一に修飾されても又は修飾されなくてもよい。いくつかの実施形態では、配列は、シュードウリジンを含む。いくつかの実施形態では、配列はイノシンを含み、これは免疫系において配列をウイルスＲＮＡに対して内因性ＲＮＡとして特徴付けることで役立つ。イノシンの組込みはまた、改善されたＲＮＡ安定性／低減した分解を媒介し得る。例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｙｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたい。

【0229】

標的核酸
本明細書に開示される方法は、様々な標的核酸に適用可能である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡ遺伝子座などのＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡ遺伝子座又はｍＲＮＡなどのＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、二本鎖（例えば、二本鎖ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、一本鎖及び二本鎖領域の両方を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、直線状である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、環状である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、メチル化ヌクレオチド、損傷したヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、修飾されていない。

【0230】

標的核酸は任意の長さのものであってもよく、例えば、約１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、５０００ｂｐ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、２００ｋｂ、５００ｋｂ、１Ｍｂ、又はそれ以上の長さのうちの少なくともいずれか１つである。標的核酸はまた、任意の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＧＣリッチであり、例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、又はそれより高いＧＣ含量のうちの少なくともいずれか１つを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも約７０％、８０％、又はそれ以上のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、非ＧＣリッチ標的核酸中のＧＣリッチ断片である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＧＣリッチではない。いくつかの実施形態では、標的核酸は、１つ以上の二次構造又はより高次の構造を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的核酸を変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体によってアクセス不能にするために、クロマチンなどの凝縮状態にはない。

【0231】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞中に存在する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞の核中に存在する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞に対して内因性である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、染色体ＤＮＡである。一実施形態では、標的核酸は、染色体外核酸である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、タンパク質コード遺伝子若しくはその機能的領域、例えば、コード領域、又は調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、５’若しくは３’非翻訳領域などである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、非コード遺伝子、例えば、トランスポゾン、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、又はｌｉｎｃＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、プラスミドである。

【0232】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ウイルス核酸、例えば、ウイルスＤＮＡ又はウイルスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、水平伝播プラスミドである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞のゲノム中には組み込まれない。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞中のプラスミドである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、染色体外配列（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｒｒａｙ）中に存在する。

【0233】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、単離された核酸、例えば、単離されたＤＮＡ又は単離されたＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、無細胞環境中に存在する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、単離されたベクター、例えば、プラスミドである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、超高純度プラスミドである。

【0234】

標的核酸は、ＲＮＡガイドにハイブリダイズする標的核酸のセグメントである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的核酸の１つのコピーのみを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的核酸の２つ以上のコピー、例えば、約２、３、４、５、１０、１００、又はそれ以上のコピーの少なくともいずれか１つを有する。例えば、ウイルス核酸又は細菌のゲノム中の反復配列を含む標的核酸は、変異体リボ核タンパク質によって標的化され得る。

【0235】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的核酸の容易にアクセス可能な領域中に存在する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的遺伝子のエクソン中に存在する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的遺伝子のエクソン－イントロン接合部にわたってある。いくつかの実施形態では、標的核酸は、非コード領域、例えば、遺伝子の調節領域中に存在する。標的核酸が細胞に対して外因性であるいくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞のゲノム中では見出されない配列を含む。

【0236】

好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞において通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野において既知であり、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。ＲＮＡガイドに相補的であり、ＲＮＡガイドにハイブリダイズする標的核酸の鎖は「相補鎖」と称され、「相補鎖」に相補的である（したがって、ＲＮＡガイドに相補的ではない）標的核酸の鎖は、「非相補鎖（ｎｏｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）」又は「非相補鎖（ｎｏｎ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）」と称される。

【0237】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

【0238】

二成分複合体
本明細書に記載の二成分複合体は、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡガイドと会合する変異体ポリペプチドを含み、各ＲＮＡガイドは、ＤＮＡなどの標的核酸を標的とする。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（例えば、変異体二成分複合体）は、標的核酸にニックを入れるか又は切断することができる、ヌクレアーゼ活性などの酵素活性を含む。変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドは、単独でも一緒でも天然には存在しない。変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとの間の複合体形成は、親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較して、２つの間の安定性及び／又はタンパク質－ＲＮＡ相互作用を増強することができる。

【0239】

一般に、変異体ポリペプチド及びターゲティング部分（例えば、ＲＮＡガイド）は、約１：１のモル比で互いに結合して、変異体二成分複合体を形成する。
変異体二成分複合体を形成するための変異体ポリペプチド及びターゲティング部分（例えば、ＲＮＡガイド）の結合は、ＲＮＡガイドをポリペプチドにロードすることと称される。

【0240】

いくつかの実施形態では、二成分複合体は、ワンガイドルールに従い、すなわち、変異体ポリペプチドは複合体中の結合したＲＮＡガイドから解離しないか、又は遊離の非結合ＲＮＡを有するＲＮＡガイドを切り替える。いくつかの実施形態では、三成分複合体は、１－二成分複合体規則に従う、すなわち、変異体二成分複合体は、結合した標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ基質）から解離しないか、又は標的核酸を遊離した非結合核酸に切り替えることはない。

【0241】

二成分複合体の機能性
いくつかの態様では、変異体二成分複合体は、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性の少なくとも１つを増強する少なくとも１つの改変又は変異を有する変異体ポリペプチドを含む。

【0242】

いくつかの態様では、変異体二成分複合体は、少なくとも１つの改変又は変異を有する変異体ポリペプチドを含み、変異体二成分複合体は、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、二成分複合体解離、標的核酸からの解離のうちの少なくとも１つが減少している。

【0243】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチド及びターゲティング部分（例えば、ＲＮＡガイド）は変異体二成分複合体を形成し、この変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比較して、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増加を示す。

【0244】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体の酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つを、親二成分複合体の酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％増加させる、少なくとも１つの改変又は変異を有する変異体ポリペプチドを含む。

【0245】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃～約６５℃の範囲の温度、例えば約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つの温度で、親二成分複合体と比較して、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増強を示す。

【0246】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨ（例えば、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、又はこれらの値を任意に組み合わせた範囲の任意の値）を有する緩衝液中で、親二成分複合体と比較して、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増強を示す。

【0247】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃高い場合、親二成分複合体と比較して、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増強を示す一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増強を示す。

【0248】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比較して、少なくとも約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上のインキュベーション時間にわたって、約３７℃での酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増加を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比較して、様々なインキュベーション時間で、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増加を示す。

【0249】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチド及びターゲティング部分（例えば、ＲＮＡガイド）は変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比較して、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、二成分複合体の解離、及び／又は標的核酸からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体の非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、二成分複合体の解離、及び／又は標的核酸からの解離より、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％低い、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、二成分複合体の解離、及び／又は標的核酸からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0250】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体の非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、二成分複合体の解離、及び／又は標的核酸からの解離より、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％低い、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、二成分複合体の解離、及び／又は標的核酸からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0251】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃～約６５℃の範囲の温度、例えば約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つの温度で、親二成分複合体と比較して、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、二成分複合体の解離、及び／又は標的核酸からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0252】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨ（例えば、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、又はこれらの値を任意に組み合わせた範囲の任意の値）を有する緩衝液中で、親二成分複合体と比較して、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、二成分複合体の解離、及び／又は標的核酸からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0253】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃高い場合、親二成分複合体と比較して、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、二成分複合体の解離、及び／又は標的核酸からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、二成分複合体の解離、及び／又は標的核酸からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0254】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親ポリペプチド及びＲＮＡガイドによって形成される複合体と比較して、少なくとも約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上のインキュベーション時間にわたって、約３７℃での複合体（変異二成分複合体又は変異三成分複合体）の解離及び／又は標的遺伝子座からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親ポリペプチド及びＲＮＡガイドによって形成される複合体と比較して、様々なインキュベーション時間で、複合体（変異二成分複合体又は変異三成分複合体）の解離及び／又は標的遺伝子座からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0255】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親二元性複合体と比較して、少なくとも約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上のインキュベーション時間にわたって、約３７℃での複合体（変異二成分複合体又は変異三成分複合体）の解離及び／又は標的遺伝子座からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比較して、様々なインキュベーション時間で、複合体（変異二成分複合体又は変異三成分複合体）の解離及び／又は標的遺伝子座からの解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0256】

三成分複合体
本明細書に記載の三成分複合体は、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡガイドと会合する（すなわち、変異体二成分複合体を形成する）変異体ポリペプチドを含み、各ＲＮＡガイドは、ＤＮＡなどの標的核酸を標的として会合する（すなわち、変異体三成分複合体を形成する）。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（例えば、変異体二成分複合体）は、変異体三成分複合体の標的核酸にニックを入れるか又は切断することができる、ヌクレアーゼ活性などの酵素活性を含む。いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、ヌクレアーゼ活性などの酵素活性を含む。変異体ポリペプチド、ＲＮＡガイド、及び標的核酸は、単独でも一緒でも天然には存在しない。

【0257】

一般に、変異体二成分複合体、例えば変異体ポリペプチド及びターゲティング部分は、約１：１のモル比で標的核酸に結合して、変異体三成分複合体を形成する。変異体三成分複合体を形成するための、変異体二成分複合体の標的核酸、例えば標的ＤＮＡ基質への結合は、変異体二成分複合体を標的核酸にロードすることと称される。

【0258】

一般に、変異体ポリペプチド、ターゲティング部分（例えば、ＲＮＡガイド）、及び標的核酸は、約１：１：１のモル比で互いに会合して、変異体三成分複合体を形成する。

【0259】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、変異体二成分複合体又は複数の変異体二成分複合体の１つ以上の標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、変異体二成分複合体又は複数の変異体二成分複合体の１つ以上の非標的遺伝子座を含む。

【0260】

三成分複合体の機能性
いくつかの態様では、変異体三成分複合体は、少なくとも１つの改変又は変異を有する変異体ポリペプチドを含み、変異体三成分複合体は、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性の少なくとも１つが増強されている。

【0261】

いくつかの態様では、変異体三成分複合体は、少なくとも１つの改変又は変異を有する変異体ポリペプチドを含み、変異体三成分複合体は、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体の解離のうちの少なくとも１つが減少している。

【0262】

いくつかの態様では、変異体二成分複合体及び標的核酸（例えば、ＤＮＡ）は変異体三成分複合体を形成し、この変異体三成分複合体は、親二成分複合体と比較して、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増加を示す。

【0263】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、親二成分複合体の酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％大きい、変異体三成分複合体の酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つを示す。

【0264】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、約２０℃～約６５℃の範囲の温度、例えば約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つの温度で、親三成分複合体と比較して、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増強を示す。

【0265】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨ（例えば、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、又はこれらの値を任意に組み合わせた範囲の任意の値）を有する緩衝液中で、親三成分複合体と比較して、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増強を示す。

【0266】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親三成分複合体のＴ_ｍ値より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合、親三成分複合体と比較して、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増強を示す一実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合、酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増強を示す。

【0267】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、親三成分複合体と比較して、少なくとも約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上のインキュベーション時間にわたって、約３７℃での酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、親三成分複合体と比較して、様々なインキュベーション時間で酵素活性、標的核酸複合体形成、標的核酸結合活性、標的核酸親和性、標的核酸結合特異性、タンパク質－核酸相互作用、三成分複合体形成、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合特異性、及び／又は安定性のうちの少なくとも１つの増加を示す。

【0268】

いくつかの態様では、変異体二成分複合体及び標的核酸（例えば、ＤＮＡ）は変異体三成分複合体を形成し、変異体三成分複合体は、親二成分複合体と比較して、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体の解離、のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0269】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、親二成分複合体の標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体の解離より、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％低い、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体の解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0270】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つの温度で、親三成分複合体と比較して、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体の解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0271】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、親三成分複合体と比較して、約２０℃～約６５℃の温度範囲にわたって、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、約３７℃で、親三成分複合体と比較して、少なくとも約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上のいずれか１つのインキュベーション時間にわたって、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体の解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、親三成分複合体と比較して、様々なインキュベーション時間で、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0272】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で、親三成分複合体と比較して、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。一実施形態では、変異体三成分複合体は、約７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、又は８．６のｐＨで、親三成分複合体と比較して、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0273】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が参照分子のＴ_ｍ値、又は参照値のＴ_ｍ、例えば親三成分複合体のＴ_ｍより少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃高い場合、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。一実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が参照分子のＴ_ｍ値、又は参照値のＴ_ｍ、例えば親三成分複合体のＴ_ｍより少なくとも８℃高い場合、標的遺伝子座からの解離、非標的核酸へのオフターゲット結合、標的核酸の非標的遺伝子座での活性、及び／又は三成分複合体解離のうちの少なくとも１つの減少を示す。

【0274】

いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、約３７℃で、少なくとも約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上のいずれか１つのインキュベーション時間にわたって、親三成分複合体と比較して、安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、変異三成分複合体は、親三成分複合体と比較して、様々なインキュベーション時間で、安定性の増加を示す。

【0275】

いくつかの態様では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比較して、標的核酸の非標的遺伝子座での活性の減少を示す。いくつかの実施形態では、非標的活性は、オンターゲット遺伝子座配列から特定のレーベンシュタイン距離（例えば、１、２、３、又は４の編集距離）のＰＡＭ隣接配列で評価される。いくつかの実施形態では、変異二成分複合体による非標的遺伝子座での活性は、親二成分複合体による非標的遺伝子座での活性よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％低い可能性がある。

【0276】

調製
いくつかの実施形態では、本開示の変異体ポリペプチドは、（ａ）本開示の変異体ポリペプチドを産生する細菌を培養し、変異体ポリペプチドを単離し、任意選択で変異体ポリペプチドを精製し、及び変異体ポリペプチドをＲＮＡガイドと複合体化することによって調製することができる。変異体ポリペプチドはまた、（ｂ）既知の遺伝子工学技術によって、具体的には本開示の変異体ポリペプチドをコードする遺伝子を細菌から単離し、組換え発現ベクターを構築し、次いで、ベクターを宿主細胞中でＲＮＡガイドと複合体化する組換えタンパク質の発現のためのＲＮＡガイドを発現する適切な宿主細胞中にベクターを移動させることによって調製することもできる。或いは、変異体ポリペプチドは、（ｃ）インビトロ結合転写－翻訳システムによって、次いで、ＲＮＡガイドと複合体化することによって調製することができる。本開示の変異体ポリペプチドの調製に使用され得る細菌は、それらが本開示の変異体ポリペプチドを産生することができる限り、特に限定されない。細菌のいくつかの非限定的な例としては、本明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。

【0277】

ベクター
本開示は、本明細書に記載の変異体ポリペプチドを発現するためのベクターを提供するか、又は本明細書に記載の変異体ポリペプチドをコードする核酸はベクター中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0278】

本開示はまた、本明細書に記載されるような変異体ポリペプチド、又は変異体ポリペプチドを含む組成物の調製に使用され得るベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組成物又はベクターを細胞中に含む。いくつかの実施形態では、本開示は、変異体ポリペプチドを含む組成物、又は変異体ポリペプチドをコードするベクター若しくは核酸を細胞中で発現する方法を含む。方法は、組成物、例えば、ベクター又は核酸を提供する工程と、組成物を細胞に送達する工程とを含み得る。

【0279】

天然又は合成ポリヌクレオチドの発現は、典型的には、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチド、例えば、変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクター中に組み込むことによって達成される。発現ベクターは、それが本開示の変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、真核生物細胞中での複製及び組込みに好適であり得る限り、特に限定されない。

【0280】

典型的な発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドの発現に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びにプロモーターを含み得る。例えば、ＲＮＡポリメラーゼのための認識配列を担持するプラスミドベクター（ｐＳＰ６４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）が使用されてもよい。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するものを含むベクターは、それらが導入遺伝子の長期的且つ安定した組込み及び娘細胞へのその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を達成するために好適なツールである。ベクターの例としては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、シーケンシングベクターが挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。

【0281】

ウイルスベクター技術は当該技術分野において周知であり、様々なウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとしては、ファージウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカーを含有する。

【0282】

ベクターの種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現され得るベクターを適宜選択することができる。更に具体的に言うと、宿主細胞の種類に応じて、変異体ポリペプチドのポリヌクレオチドからの発現を確実にするためにプロモーター配列が適宜選択され、このプロモーター配列及びポリヌクレオチドが発現ベクターの調製のために様々なプラスミドなどのいずれかに挿入される。

【0283】

更なるプロモーター要素、例えば、増強化配列は転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、プロモーターの数は細菌、開始部位の下流の機能的要素も同様に含有することが示されている。プロモーターに応じて、個々の要素が協調的又は独立して機能して、転写を活性化することができると思われる。

【0284】

更に、本開示は、構成的プロモーターの仕様に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本開示の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は分子スイッチを提供し、分子スイッチはポリヌクレオチド配列の発現が望ましい場合に作動可能に連結しているポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、又はその発現が望ましくない場合に発現をオフにすることができる。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0285】

導入される発現ベクターはまた、選択性マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれか、又は両方を含有することができ、ウイルスベクターを通してトランスフェクト又は感染されようとする細胞の集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にする。他の態様では、選択性マーカーは、ＤＮＡの別個の部分で運ばれ、コトランスフェクション手法で使用され得る。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の両方は、適切な転写制御配列によって隣接され、宿主細胞中の発現を可能にすることができる。そのようなマーカーの例としては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子、並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の細菌の培養については、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。そのような選択マーカーを使用することによって、本開示の変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞中に移動され、次いで、間違いなく発現されたかどうかを確認することができる。

【0286】

組換え発現ベクターのための調製方法は特に限定されず、その例としては、プラスミド、ファージ、又はコスミドを使用する方法が挙げられる。

【0287】

発現の方法
本開示は、本明細書に記載の変異体ポリペプチドを翻訳することを含む、タンパク質発現のための方法を含む。

【0288】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞は、変異体ポリペプチドを発現するために使用される。宿主細胞は特に限定されず、様々な既知の細胞が好ましく使用され得る。宿主細胞の具体的な例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母（出芽酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及び分裂酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））、線虫（カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ））、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞、及び動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＨＥＫ２９３細胞）が挙げられる。上記の発現ベクターを宿主細胞中に転移させるための方法、すなわち形質転換法は特に限定されず、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、リポソーム法、及びＤＥＡＥデキストラン法などの既知の方法を使用することができる。

【0289】

宿主が発現ベクターで形質転換された後に、変異体ポリペプチドの産生のために宿主細胞を培養し、栽培し、又は育種することができる。変異体ポリペプチドの発現後に、宿主細胞を回収し、従来の方法（例えば、濾過、遠心分離、細胞破壊、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、変異体ポリペプチドを培養物などから生成することができる。

【0290】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド発現のための方法は、変異体ポリペプチドの少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２５０個のアミノ酸、少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、少なくとも５００個のアミノ酸、少なくとも６００個のアミノ酸、少なくとも７００個のアミノ酸、少なくとも８００個のアミノ酸、少なくとも９００個のアミノ酸、又は少なくとも１０００個のアミノ酸の翻訳を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質発現のための方法は、変異体ポリペプチドの約５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸、約７００個のアミノ酸、約８００個のアミノ酸、約９００個のアミノ酸、約１０００個のアミノ酸、又はそれ以上の翻訳を含む。

【0291】

様々な方法を宿主細胞中の成熟変異体ポリペプチドの産生のレベルを決定するために使用することができる。そのような方法としては、例えば、本明細書の他の箇所で記載されるような変異体ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体のいずれか、又は標識付けタグを利用する方法が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な方法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。これら及び他のアッセイは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｍａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１［１９８３］を参照されたい）。

【0292】

本開示は、変異体ポリペプチドの細胞中のインビボ発現の方法であって、変異体ポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドを宿主細胞に提供することであって、ポリリボヌクレオチドが変異体ポリペプチドをコードする、提供することと、変異体ポリペプチドを細胞中で発現することと、変異体ポリペプチドを細胞から得ることと、を含む方法を提供する。

【0293】

改変又は突然変異の導入
変異体ポリペプチドをコードする核酸配列又は変異体ポリペプチドは、当該技術分野において既知の合成方法によって生成することができる。親ポリペプチドそれ自体をコードする核酸配列をフレームワークとして使用して、改変又は突然変異を１回以上挿入し、親ポリペプチドをコードする核酸配列を改変することができる。同じように考えて、変化をポリペプチド配列にそれが実効的に合成されるときに導入することによって親ポリペプチドを改変するか、又は突然変異させてもよい。これは、当該技術分野において周知の方法によって達成することができる。

【0294】

親ポリペプチド配列への改変又は突然変異の産生及び導入は、当業者に既知の任意の方法を使用して達成され得る。特に、いくつかの実施形態では、ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプライマーを、変異体ポリペプチドをコードする核酸配列中に１つ以上の改変又は突然変異を含むＤＮＡテンプレートの迅速な合成のために使用することができる。部位特異的突然変異導入もまた、基礎となるＤＮＡの特定の突然変異誘発を通して、個々のペプチド又は生物学的に機能的に同等のタンパク質若しくはペプチドの調製に有用な技術として使用することもできる。１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することによって、前述した考慮事項のうちの１つ以上を組み込む技術は、変異体を調製し、試験するための容易な能力を更に提供する。部位特異的突然変異導入は、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、並びに十分な数の隣接するヌクレオチドの使用を通して変異体の産生を可能にし、十分なサイズ及び配列複雑性のプライマー配列を提供して、通過される欠失接合部の両側に安定した二本鎖を形成する。典型的には、約１７～２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、改変される配列の接合部の両側に約５～１０個の残基を有する。

【0295】

アミノ末端伸長部及び／又はカルボキシル末端伸長部のようなポリペプチドの融合部などの構造変化の導入は、改変又は突然変異の親ポリペプチドの導入と同様な様式で達成することができる。追加のペプチドは、追加のペプチドをコードする適切な核酸配列を親ポリペプチド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸配列に含めることによって、親ポリペプチド又は変異体ポリペプチドに添加され得る。任意選択で、追加のペプチドは、合成ポリペプチド産生を通して変異体ポリペプチドに直接付加されてもよい。

【0296】

態様では、本開示はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して親ポリペプチド配列と比較すると、標的核酸の２つ以上の遺伝子座（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個、又はそれ以上）とのオンターゲット結合の増加を有する変異体ポリペプチドを産生するための方法も提供する。

【0297】

態様では、本開示はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して、複数の別個のＲＮＡガイドと個々に複合体化されると、複数の親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較すると、標的配列の２つ以上の遺伝子座とのオンターゲット結合の増加を有する複数の変異体ポリペプチド（例えば、同じアミノ酸配列を有する別個の変異体ポリペプチド）を産生するための方法も提供する。

【0298】

態様では、本開示はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して親ポリペプチドと比較すると、標的核酸の２つ以上の標的遺伝子座とのオンターゲット三成分複合体形成の増加を有する変異体ポリペプチドを産生するための方法も提供する。

【0299】

態様では、本開示はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して、複数の別個のＲＮＡガイドと個々に複合体化されると、複数の親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較すると、標的核酸の２つ以上の遺伝子座との三成分複合体形成の増加を有する複数の変異体ポリペプチド（例えば、同じアミノ酸配列を有する別個の変異体ポリペプチド）を産生するための方法も提供する。

【0300】

態様では、本開示はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して親ポリペプチドと比較すると、標的核酸又は標的遺伝子座の標的化の数の増加を示す変異体ポリペプチドを産生するための方法も提供する。

【0301】

態様では、本開示はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して、複数の別個のＲＮＡガイドと個々に複合体化されると、複数の親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較すると、標的核酸又は標的遺伝子座の標的化の数の増加を示す複数の変異体ポリペプチド（例えば、同じアミノ酸配列を有する別個の変異体ポリペプチド）を産生するための方法も提供する。

【0302】

態様では、本開示はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して、変異体ポリペプチドの安定性を増強させるための方法も提供する。変異体ポリペプチドの安定性は、限定されないが、熱変性アッセイ、サーマルシフトアッセイ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）、パルスチェイス法、ブリーチチェイス法、シクロヘキシミドチェイス法、円二色性（ＣＤ）分光法、結晶化、及び蛍光ベース活性アッセイによって決定され得るか、又はこれらの技術を含み得る。

【0303】

機能性のための変異体選択
一態様では、本開示は、二成分複合体形成、ＲＮＡガイド結合活性、及び／又はＲＮＡガイド結合特異性を増強するための改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入する方法を提供する。

【0304】

一態様では、本開示はまた、三成分複合体形成、オンターゲット結合親和性、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合、及び／又はオンターゲット結合特異性を増強するための改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入する方法を提供する。一態様では、本開示はまた、二成分複合体（例えば、リボ核タンパク質）の、オンターゲット結合親和性（例えば、標的と相互作用する親和性又は時間）、オンターゲット結合活性（例えば、標的と相互作用するときのヌクレアーゼ活性）、オンターゲット結合（例えば、標的との相互作用の強度）、及び／又はオンターゲット結合特異性（例えば、特異的標的に対する優先性）を増強するための改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入する方法を提供する。

【0305】

いくつかの実施形態では、改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入して、オンターゲット結合及び／又は活性が増加した変異体ポリペプチドを生成する。また、そのような実施形態では、変異体ポリペプチドにおいて、オフターゲット結合及び／又は活性を、親ポリペプチドと比較して減少させることができる。更に、オンターゲット結合対オフターゲット結合に関して、特異性が増加又は減少させ得る。

【0306】

いくつかの実施形態では、改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入して、ＲＮＡガイドと複合体化された場合にオンターゲット結合が増加した、変異体ポリペプチドを生成する。また、そのような実施形態では、変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドを含む複合体において、オフターゲット結合を減少させることができる。更に、オンターゲット結合／活性対オフターゲット結合／活性に関して、特異性を増加又は減少させ得る。

【0307】

特定の実施形態では、改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入して、安定性及び／又はタンパク質－ＲＮＡ相互作用を増強する変異体ポリペプチドを生成する。特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、変異体ポリペプチドの安定性及び／又はＲＮＡ相互作用並びに酵素活性を促進する少なくとも１つの改変を含む。

【0308】

特定の実施形態では、改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入して、（ａ）酵素活性を欠くが、（ｂ）安定性及び／又はタンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を保持する変異体ポリペプチドを生成する。特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、変異体ポリペプチドの安定性及び／又はＲＮＡ相互作用を促進するが、酵素活性は促進しない少なくとも１つの改変を含む。

【0309】

特定の実施形態では、改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入して、（ａ）酵素活性を増強し、（ｂ）二成分複合体形成、ＲＮＡガイド結合活性、及び／又はＲＮＡガイド結合特異性を増強する変異体ポリペプチドを生成する。特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、変異体ポリペプチドのＲＮＡガイド複合体形成、ＲＮＡガイド結合活性、及び／又はＲＮＡガイド結合特異性、並びに酵素活性を促進する少なくとも１つの改変を含む。

【0310】

特定の実施形態では、改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入して、（ａ）酵素活性を欠くが、（ｂ）二成分複合体形成、ＲＮＡガイド結合活性、及び／又はＲＮＡガイド結合特異性の増強を保持する変異体ポリペプチドを生成する。特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、変異体ポリペプチドの二成分複合体形成、ＲＮＡガイド結合活性、及び／又はＲＮＡガイド結合特異性を促進するが、酵素活性は促進しない少なくとも１つの改変を含む。

【0311】

特定の実施形態では、改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入して、（ａ）酵素活性を増強し、且つ（ｂ）オンターゲット三成分複合体形成、オンターゲット結合親和性、オンターゲット結合活性、及び／又はオンターゲット結合特異性を増強する変異体ポリペプチドを生成する。特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、変異体ポリペプチドのオンターゲット三成分複合体形成、オンターゲット結合親和性、オンターゲット結合活性、及び／又はオンターゲット結合特異性、並びに酵素活性を促進する少なくとも１つの改変を含む。

【0312】

特定の実施形態では、改変又は変異を親ポリペプチド配列に導入して、（ａ）酵素活性を欠くが、（ｂ）オンターゲット三成分複合体形成、オンターゲット結合親和性、オンターゲット結合活性、及び／又はオンターゲット結合特異性の増強を保持する変異体ポリペプチドを生成する。特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、変異体ポリペプチドのオンターゲット三成分複合体形成、オンターゲット結合親和性、オンターゲット結合活性、及び／又はオンターゲット結合特異性を促進するが、酵素活性は促進しない少なくとも１つの改変を含む。

【0313】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡ親和性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡ親和性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡ親和性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。

【0314】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡ親和性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡ親和性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較して二成分複合体形成の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。

【0315】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイド結合活性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイド結合活性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイド結合活性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。

【0316】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。

【0317】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してタンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してタンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してタンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。

【0318】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してタンパク質安定性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してタンパク質安定性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してタンパク質安定性の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。

【0319】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイドからの解離の減少を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイドからの解離の減少を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイドからの解離の減少を示す変異体ポリペプチドを生成する。

【0320】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較して三成分複合体形成の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較して三成分複合体形成の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変を配列番号３の親ポリペプチドに導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３の親ポリペプチドと比較して三成分複合体形成の増強を示す変異体ポリペプチドを生成する。

【0321】

いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較して標的核酸に対する結合親和性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較して標的核酸に対する結合親和性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較して標的核酸に対する結合親和性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。

【0322】

いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較してオンターゲット結合活性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較してオンターゲット結合活性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較してオンターゲット結合活性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプ結合チドを生成する。

【0323】

いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較してオンターゲット結合特異性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較してオンターゲット結合特異性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較してオンターゲット結合特異性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプ結合チドを生成する。

【0324】

いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較して非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較して非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較して非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。

【0325】

いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の低下、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較して標的核酸からの解離の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較して標的核酸からの解離の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号３の親ポリペプチドに少なくとも１つの改変を導入して、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比較して標的核酸からの解離の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを生成する。

【0326】

変異体二成分複合体形成
一般に、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、約１：１のモル比で互いに結合して変異体二成分複合体を形成する。変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、単独で又は一緒のいずれかで天然には存在しない。

【0327】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは宿主細胞中で過剰発現され、本明細書に記載されるように精製され、次いで、ＲＮＡガイドと複合して（例えば、試験管中で）変異体リボ核タンパク質（ＲＮＰ）（例えば、変異体二成分複合体）を形成する。

【0328】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、標的核酸に対する結合親和性の増加、オンターゲット結合活性の増加、オンターゲット結合特異性の増加、標的核酸との三成分複合体形成の増加、及び／又はインキュベーション時間の範囲にわたる安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少、及び／又はインキュベーション時間の範囲にわたる標的核酸からの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、標的核酸複合体形成の増加、標的核酸活性、及び／又はインキュベーション時間の範囲にわたる標的核酸特異性を示す。

【0329】

いくつかの実施形態では、二成分複合体の複合体化は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、又は５５℃のいずれか１つよりも低い温度で起こる。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約３７℃で約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上の時間のうちの少なくともいずれか１つのインキュベーション時間にわたってＲＮＡガイドから解離しないか、又は遊離ＲＮＡに結合しない。いくつかの実施形態では、二成分複合体形成後に、変異体リボ核タンパク質複合体は、ＲＮＡガイドを異なるＲＮＡと交換しない。

【0330】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、二成分複合体化緩衝液中で複合体化される。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、二成分複合体化緩衝液で置き換えられる緩衝液中で保存され、ＲＮＡガイドとの複合体を形成する。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、二成分複合体化緩衝液中で保存される。

【0331】

いくつかの実施形態では、二成分複合体化緩衝液は、約７．３～８．６の範囲のｐＨを有する。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．３である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．４である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．５である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．６である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．７である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．８である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．９である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．０である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．１である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．２である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．３である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．４である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．５である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．６である。

【0332】

変異体ポリペプチドの熱安定性は、ＲＮＡガイドの添加、例えば、ＲＮＡガイドへの結合などの好ましい条件下で増加することができる。

【0333】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、本明細書に記載されるような精製の前に宿主細胞中で過剰発現され、ＲＮＡガイドと複合体化することができる。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡは細胞に導入され、それによって変異体ポリペプチドが細胞中で発現される。変異体ポリペプチドを所望の標的核酸に誘導するＲＮＡガイドもまた、単一のｍＲＮＡ若しくはＤＮＡ構築物と同時に、別々に、又は逐次的のいずれかで細胞に導入され、それによって必要なリボ核タンパク質複合体が細胞中で結合される。

【0334】

変異体二成分複合体の安定性及び機能性の評価
ある特定の実施形態では、最適な変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（本明細書では、変異体二成分複合体と称される）を特定するための方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）試料中で変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとを組み合わせて変異体二成分複合体を形成することと、（ｂ）変異体二成分複合体の値を測定することと、（ｃ）変異体二成分複合体の値が、参照分子の値よりも大きい場合に変異体二成分複合体が参照分子よりも最適であると決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、値としては、安定性測定値（例えば、Ｔ_ｍ値、熱安定性）、二成分複合体形成の割合、ＲＮＡガイド結合特異性、及び／又は複合体活性を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0335】

いくつかの実施形態では、最適な変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（すなわち、変異体二成分複合体）は、（ａ）試料中で変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとを組み合わせて変異体二成分複合体を形成する工程と、（ｂ）変異体二成分複合体のＴ_ｍ値を検出する工程と、（ｃ）変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が参照分子のＴ_ｍ値より大きいか、又はＴ_ｍ参照値より少なくとも８℃大きい場合に、変異体二成分複合体が安定であると決定する工程とによって特定される。

【0336】

変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（すなわち、変異体二成分複合体）の熱安定性を測定するための工程を伴う方法としては、変異体二成分複合体の安定性を決定するための方法、安定な変異体二成分複合体を促進する条件を決定する方法、安定な変異体二成分複合体をスクリーニングする方法、及び最適なＲＮＡガイドを特定して安定な変異体二成分複合体を形成するための方法を挙げることができるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、変異体二成分複合体の熱安定性値が測定されてもよい。

【0337】

更に、ある特定の実施形態では、参照分子の熱安定性値も測定されてもよい。ある特定の実施形態では、変異体二成分複合体の測定された熱安定性値が、参照分子の測定された熱安定性値又は本明細書に記載されるような同じ実験条件下で測定された熱安定性参照値よりも大きい場合に、変異体二成分複合体は安定であると決定され得る。ある特定の実施形態では、参照分子は、ＲＮＡガイドが存在しない変異体ポリペプチドであり得る。

【0338】

ある特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、変性温度値であってもよい。これらの実施形態では、熱安定性参照値は、変性温度参照値である。ある特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、Ｔ_ｍ値であり得る。これらの実施形態では、熱安定性参照値は、Ｔ_ｍ参照値であり得る。ある特定の実施形態では、熱安定性値は、サーマルシフトアッセイを使用して測定され得る。ある特定の実施形態では、熱安定性を測定するために使用されるアッセイは、限定されないが、熱変性アッセイ、サーマルシフトアッセイ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）、パルスチェイス法、ブリーチチェイス法、シクロヘキシミドチェイス法、円二色性（ＣＤ）分光法、結晶化、及び蛍光ベース活性アッセイが挙げられる、本明細書に記載の技術を伴い得る。

【0339】

ある特定の実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体形成の割合、ＲＮＡガイド結合特異性、及び／又は変異体二成分複合体の複合体活性が参照分子の値又は参照値（例えば、本明細書で親二成分複合体と称される親ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体の値）よりも大きい場合に特定され得る。例えば、ある特定の実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体形成の割合、ＲＮＡガイド結合特異性、及び／又は変異体二成分複合体の複合体活性の値が、参照分子の値又は参照値（例えば、親二成分複合体の値）よりも少なくともＸ％大きい場合に特定され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載されるような変異体二成分複合体の活性を測定することを含む工程を更に含んでもよい。

【0340】

変異体三成分複合体形成
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とは、変異体三成分複合体を形成する（例えば、試験管又は細胞中で）。一般に、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とは、約１：１：１のモル比で互いに会合して変異体三成分複合体を形成する。変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とは、単独で又は一緒のいずれかで天然には存在しない。

【0341】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような変異体二成分複合体（例えば、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとの複合体）は、標的核酸と更に複合体化され（例えば、試験管又は細胞中で）、変異体三成分複合体を形成する。

【0342】

いくつかの実施形態では、三成分複合体化は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、又は５５℃のいずれか１つよりも低い温度で起こる。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約３７℃で約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上の時間のうちの少なくともいずれか１つのインキュベーション時間にわたって標的核酸から解離しないか、又は遊離核酸（例えば、遊離ＤＮＡ）に結合しない。いくつかの実施形態では、三成分複合体の形成後に、変異体二成分複合体は、標的核酸を異なる核酸と交換しない。

【0343】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とは、三成分複合体化緩衝液中で複合体化される。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、三成分複合体化緩衝液と置き換えられる緩衝液中で保存され、ＲＮＡガイドと標的核酸との複合体を形成する。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、三成分複合体化緩衝液中で保存される。

【0344】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体と標的核酸とが、三成分複合体化緩衝液中で複合体化される。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、三成分複合体化緩衝液で置き換えられる緩衝液中で保存され、標的核酸との複合体を形成する。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、三成分複合体化緩衝液中で保存される。

【0345】

いくつかの実施形態では、三成分複合体化緩衝液は、約７．３～８．６の範囲のｐＨを有する。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．３である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．４である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．５である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．６である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．７である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．８である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．９である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．０である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．１である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．２である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．３である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．４である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．５である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．６である。

【0346】

変異体ポリペプチドの熱安定性は、ＲＮＡガイド及び標的核酸の添加などの好ましい条件下で増加することができる。

【0347】

変異体三成分複合体の安定性及び機能性の評価
ある特定の実施形態では、最適な変異体三成分複合体を特定するための方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）試料中で変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とを組み合わせて変異体三成分複合体を形成することと、（ｂ）変異体三成分複合体の値を測定することと、（ｃ）変異体三成分複合体の値が、参照分子の値よりも大きい場合に変異体三成分複合体が参照分子よりも最適であると決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、値としては、安定性測定値（例えば、Ｔ_ｍ値、熱安定性）、三成分複合体形成の割合、ＤＮＡ結合親和性測定値、ＤＮＡ結合特異性測定値、及び／又は複合体活性測定値（例えば、ヌクレアーゼ活性測定値）を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0348】

いくつかの実施形態では、最適な変異体三成分複合体は、（ａ）試料中で変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とを組み合わせて変異体三成分複合体を形成する工程と、（ｂ）変異体三成分複合体のＴ_ｍ値を検出する工程と、（ｃ）変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が参照分子のＴ_ｍ値より大きいか、又はＴ_ｍ参照値より少なくとも８℃大きい場合に、変異体三成分複合体が安定であると決定する工程とによって特定される。

【0349】

変異体三成分複合体の熱安定性を測定する工程を伴う方法としては、変異体三成分複合体の安定性を決定する方法、安定な変異体三成分複合体を促進する条件を決定する方法、安定な変異体三成分複合体をスクリーニングする方法、及び最適な二成分複合体を特定して安定な変異体三成分複合体を形成するための方法を挙げることができるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、変異体三成分複合体の熱安定性値が測定されてもよい。

【0350】

更に、ある特定の実施形態では、参照分子の熱安定性値も測定されてもよい。ある特定の実施形態では、変異体三成分複合体の測定された熱安定性値が、参照分子の測定された熱安定性値又は本明細書に記載されるような同じ実験条件下で測定された熱安定性参照値よりも大きい場合に、変異体三成分複合体は安定であると決定され得る。ある特定の実施形態では、参照分子は、ＲＮＡガイド及び／又は標的核酸が存在しない変異体ポリペプチドであり得る。

【0351】

ある特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、変性温度値であってもよい。これらの実施形態では、熱安定性参照値は、変性温度参照値である。ある特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、Ｔ_ｍ値であり得る。これらの実施形態では、熱安定性参照値は、Ｔ_ｍ参照値であり得る。ある特定の実施形態では、熱安定性値は、サーマルシフトアッセイを使用して測定され得る。ある特定の実施形態では、熱安定性を測定するために使用されるアッセイは、限定されないが、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、又は等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）が挙げられる、本明細書に記載の技術を伴い得る。

【0352】

ある特定の実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体の三成分複合体形成の割合、ＤＮＡ結合親和性、ＤＮＡ結合特異性、及び／又は複合体活性（例えば、ヌクレアーゼ活性）が参照分子の値又は参照値（例えば、親三成分複合体の値）よりも大きい場合に特定され得る。例えば、ある特定の実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体の三成分複合体形成の割合、ＤＮＡ結合親和性、ＤＮＡ結合特異性、及び／又は複合体活性の値が、参照分子の値又は参照値（例えば、親三成分複合体の値）よりも少なくともＸ％大きい場合に特定され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載されるような変異体三成分複合体の活性を測定することを含む工程を更に含んでもよい。

【0353】

一態様では、標的ＤＮＡ分子を改変する方法を提供し、この方法は、標的ＤＮＡ分子を、本明細書に開示の変異体ポリペプチド及び本明細書に開示のＲＮＡガイドと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ分子はインビトロにある。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ分子は細胞内にある。特定の実施形態では、細胞は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボにある。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞から選択される。

【0354】

送達
本明細書に記載の組成物又は複合体は、例えば、担体及び／又はポリマー担体、例えば、リポソームなどの担体を含んで配合され、細胞（例えば、原核生物、真核生物、植物、哺乳動物など）に既知の方法によって送達することができる。そのような方法としては、トランスフェクション（例えば、脂質媒介、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）、エレクトロポレーション若しくは膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、マイクロインジェクション、微粒子銃（「遺伝子銃」）、フュージーン（ｆｕｇｅｎｅ）、直接音響負荷、細胞圧縮、光学的トランスフェクション、原形質体融合、インペイルフェクション、マグネトフェクション、エクソソーム媒介転移、脂質ナノ粒子媒介転移、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0355】

いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の核酸（例えば、変異体ポリペプチドをコードする核酸、ＲＮＡガイド、ドナーＤＮＡなど）、それらの１つ以上の転写物、及び／又は予め形成された変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（すなわち、変異体二成分複合体）を細胞に送達することを含む。例示的な細胞内送達方法としては、ウイルス若しくはウイルス様物質；化学ベースのトランスフェクション法、例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン又はポリエチレンイミン）を使用するもの；非科学的方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞圧縮、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、インペイルフェクション、原形質体融合、細菌接合、プラスミド若しくはトランスポゾンの送達；粒子ベースの方法、例えば、遺伝子銃、マグネトフェクション若しくはマグネット支援トランスフェクション、粒子銃；並びにハイブリッド法、例えば、ヌクレオフェクションが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本出願は、そのような方法によって産生される細胞、及びそのような細胞を含むか、又はそれらから産生される生物（動物、植物、又は真菌など）を更に提供する。

【0356】

細胞
本明細書に記載のポリペプチド、組成物、又は複合体は、様々な細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、単離された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞培養物中にある。いくつかの実施形態では、細胞は、エクスビボにある。いくつかの実施形態では、細胞は、生きている生物から得られ、細胞培養物中で維持される。いくつかの実施形態では、細胞は、単細胞生物である。

【0357】

いくつかの実施形態では、細胞は、原核生物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は細菌細胞であるか、又は細菌細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、親ポリペプチドが由来する細菌種には関係しない。いくつかの実施形態では、細胞は、古細菌細胞であるか、又は古細菌細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細菌は、真核生物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は植物細胞であるか、又は植物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は真菌細胞であるか、又は真菌細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は動物細胞であるか、又は動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は無脊椎動物細胞であるか、又は無脊椎動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は脊椎動物細胞であるか、又は脊椎動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞であるか、又は哺乳動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ゼブラフィッシュ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、齧歯類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は合成的に作製され、人工細胞と呼ばれることもある。

【0358】

いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株に由来する。組織培養のための多種多様な細胞株が、当該技術分野において知られている。細胞株の例としては、２９３Ｔ、ＭＦ７、Ｋ５６２、ＨｅＬａ、及びそれらのトランスジェニック品種が挙げられるが、これらに限定されない。細胞株は、当業者に既知の様々な供給源から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の核酸（Ａｇｏコードベクター及びｇＤＮＡなど）又はＡｇｏ－ｇＤＮＡ複合体でトランスフェクトされた細胞を用いて標的核酸に対して改変を含む新しい細胞株を確立するために、１つ以上のベクター由来細胞を含む新しい細胞株を確立する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の核酸（変異体ポリペプチドをコードするベクター及びＲＮＡガイドなど）又は変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（すなわち、変異体二成分複合体）で一過性に又は非一過性にトランスフェクトされた細胞、又はそのような細胞から誘導された細胞株が１つ以上の試験化合物の評価で使用される。

【0359】

いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡガイド）及び／又は変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を宿主細胞に導入することを含む。一実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボにある。他の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡガイド）及び／又は変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、例えば、アデノ随伴ウイルス構築物、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物、組換えレトロウイルス構築物などが挙げられるが、これらに限定されない組換え発現ベクターに含まれる。

【0360】

いくつかの実施形態では、細胞は初代細胞である。例えば、初代細胞の培養は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、１５回、又はそれ以上継代され得る。いくつかの実施形態では、初代細胞は、任意の既知の方法によって固体から採取される。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球吸着除去療法、密度勾配分離法によって採取されてもよい。組織、例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などからの細胞は、生検によって採取され得る。適切な溶液を採取された細胞の分散又は懸濁のために使用してもよい。そのような溶液は、一般には、平衡塩類溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液など）であってもよく、これらは低濃度での許容可能な緩衝液と共にウシ胎児血清又は他の天然に存在する因子で好都合に補充されている。緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などを挙げることができる。細胞はすぐに使用されてもよく、又はそれらは保存されてもよい（例えば、凍結することによって）。凍結細胞は融解され、再使用可能であり得る。細胞は、ＤＭＳＯ、血清、培地緩衝液（例えば、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝化培地）中で凍結することができ、及び／又はいくつかの他のそのような一般的な溶液を凍結温度で用いて細胞を保存することができる。

【0361】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）において二本鎖切断又は一本鎖切断を誘発させるヌクレアーゼ活性を有する。二本鎖切断は、相同組換え（ＨＤＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、又は非相同末端再結合（Ａ－ＮＨＥＪ）を含む細胞内因性ＤＮＡ修復経路を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とすることなく切断された標的核酸を修復することができる。これは、１つ以上のヌクレオチドの標的核酸への欠失又は挿入をもたらし得る。ＨＤＲは、ドナーＤＮＡなどの相同テンプレートと共に起こり得る。相同テンプレートは、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同である配列を含み得る。いくつかの場合では、ＨＤＲは、外因性ポリヌクレオチド配列を切断された標的核酸に挿入することができる。ＮＨＥＪ及び／又はＨＤＲに起因する標的ＤＮＡの改質は、例えば、突然変異、欠失、変更、組換え、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タギング、導入遺伝子ノックイン、遺伝子破壊、及び／又は遺伝子ノックアウトに繋がり得る。

【0362】

いくつかの実施形態では、細胞培養は、本方法の効率を高めるために同調される。いくつかの実施形態では、Ｓ期及びＧ２期にある細胞は、ＨＤＲ媒介遺伝子編集に使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、任意の細胞周期で本方法にかけられてもよい。いくつかの実施形態では、オーバープレーティングにある細胞は、本方法の効率を著しく低下させる。いくつかの実施形態では、本方法は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、又は７０％のいずれか１つ以下の集密度で細胞培養に適用される。

【0363】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（すなわち、変異体二成分複合体）の細胞中での標的核酸への結合は、１つ以上の内因性細胞分子又はＤＮＡ修復経路以外の経路を動員して標的核酸を修飾する。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体の結合は、１つ以上の内因性細胞分子又は経路の標的核酸へのアクセスをブロックし、それにより標的核酸を修飾する。例えば、変異体二成分複合体の結合は、内因性転写又は翻訳機械をブロックして、標的核酸の発現を減少させることができる。

【0364】

いくつかの実施形態では、細胞中で標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法が提供される。方法は、細胞内部で標的ＤＮＡ分子を本明細書に記載の変異体ポリペプチドと、５’から３’への順序で、標的ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする第１のヌクレオチドセグメント、ヌクレオチドリンカー、及び第１のヌクレオチドセグメントとハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡデュプレックスを形成する第２のヌクレオチドセグメントを含む単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡとに接触させることを含む。変異体ポリペプチドは、細胞内部で単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡと複合体を形成し、標的ＤＮＡ分子が修飾される。

【0365】

一態様では、細胞内の標的ＤＮＡ分子を改変する方法が提供される。本明細書に開示の変異体ポリペプチド若しくは変異体ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する工程、及び本明細書に記載のＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を導入する工程、又は本明細書に記載の変異体二成分複合体を導入する工程を含む方法であって、導入工程は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組合せを導入することを含む、方法。いくつかの実施形態では、細胞に導入する工程は、細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、導入する工程は、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、又はこれらの任意の組み合わせの使用を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボにある。

【0366】

キット
本開示はまた、例えば、本明細書に記載の方法を実施するために使用することができるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本開示の変異体ポリペプチド、例えば、表２の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、そのような変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、任意選択で、ポリヌクレオチドは、例えば本明細書に記載されるようなベクター内に含まれる。キットはまた、任意選択で、例えば本明細書に記載されるようなＲＮＡガイドを含むことができる。本開示のキットのＲＮＡガイドは、当該技術分野で知られているように、目的の配列を標的とするように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ変異体及びＲＮＡガイドは、キット内の同じバイアル又は他の容器内にパッケージングすることもできるし、別々のバイアル又は他の容器内にパッケージングすることができ、その内容物は、使用前に混合することができる。キットは更に、任意選択で、緩衝液、及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ変異体及び／又はＲＮＡガイドを使用するための説明書を含むことができる。

【0367】

本明細書に引用される全ての参考文献及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0368】

以下の実施例は、本開示のいくつかの実施例を更に例証するために提供されているが、本開示の範囲の限定することを意図するものではなく、当業者に既知の他の手法、方法論、又は技術が代替え的に使用されてもよいことがそれらの例示的な性質によって理解されるであろう。

【0369】

実施例１－変異体構築物の操作
この実施例では、変異体構築物を生成した。

【0370】

単一の突然変異を含むＤＮＡテンプレートを、ＩＤＴから注文した変異原性フォワードプライマー及び変異原性リバースプライマーを使用する２つのＰＣＲステップを介して構築した。第１のステップでは、ＰＣＲ反応の２つのセットを３８４のプレートで行い、２つの断片を生成した。２つのＰＣＲ断片の重複領域は所望の単一突然変異を含有し、第２のＰＣＲを介してのＤＮＡテンプレート全体のアセンブリを可能にした。第２のステップでは、第１のステップからの精製断片をオーバーラッピングＰＣＲ（ＯＬ ＰＣＲ）のためのテンプレートとして使用し、Ｆｗ及びＲｖオリゴをＯＬ ＰＣＲプライマーとしてベクターバックボーンにアニーリングした。得られた直線状ＤＮＡテンプレートは、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ用のオープンリーディングフレームを含有した。

【0371】

これらの直線状ＤＮＡテンプレートを、無細胞転写及び翻訳システムで直接使用して、単一突然変異を含有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ変異体を発現させた。変異体構築物を更に個々に一過性トランスフェクションベクター中に転移させた。更に、組み合わせ突然変異を含むＤＮＡテンプレートをＰＣＲによって調製し、その後一過性トランスフェクションベクターに転移させた。

【0372】

実施例２－変異体二成分複合体の検出のための蛍光偏光アッセイ
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド及びＲＮＡガイドの二成分複合体を形成する能力を、蛍光偏光アッセイを通して評価する。

【0373】

ダイレクトリピート配列の上流のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の逆相補配列を含む直線状ｓｓＤＮＡ断片、及び所望の２０ｂｐ ＲＮＡガイド標的をＩＤＴによって合成する。次いで、ユニバーサルＴ７フォワードオリゴを逆相補配列ｓｓＤＮＡにアニーリングし（５℃／分で９５～４℃）、Ｋｌｅｎｏｗ断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））を用いて２５℃で１５分間埋めることによって、直線状ｄｓＤＮＡインビトロ転写（ＩＶＴ）テンプレートを生成する。次いで、得られたＩＶＴテンプレートを、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））を用いて、３７℃で４時間ＲＮＡガイドに転写する。転写後に、各ＲＮＡガイドをＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を用いて精製し、使用するまで－２０℃で保存した。

【0374】

次いで、ＲＮＡガイドを６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）（ＩＤＴ）で標識する。１×アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ）中の２５ｎＭのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）を、増加する濃度の標識されたＲＮＡガイド（７．５～２５０ｎＭ）で滴定する。複合体を３７℃で３０分間インキュベートし、その後マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）を使用して蛍光偏光測定値を取る。

【0375】

異なる温度での二成分複合体形成も調べる。更に、上述したような結合実験を、２５、５０、６０、及び７０℃で等温的に実施する。

【0376】

増加する濃度のＲＮＡガイドによるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）の滴定の際の二成分複合体の形成（又は、増加する濃度のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドによるＲＮＡガイドの滴定の際の二成分複合体の形成）は、ミリ偏光（ｍＰ）単位での蛍光偏光シグナルにおける変化をもたらす。蛍光偏光シグナルにおける変化を、ＲＮＡガイド濃度の範囲にわたってプロットすることによって結合曲線を生成する。

【0377】

この実施例は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）のＲＮＡガイドに対する結合親和性がどのように決定され、比較され得るかを示している。

【0378】

実施例３－変異体二成分複合体の検出のためのＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ
この実施例は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体）のＲＮＡガイドに対する結合の能力を決定するためのＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の使用を記載する。

【0379】

ＩＤＴ（商標）からの合成ＲＮＡガイドを、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８に以前に詳述されたように、５’ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷで、５’ＥｎｄＴａｇ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｌａｂｓ）及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して標識付けする。標識付けの後、ＲＮＡガイドを、フェノールクロロホルム抽出を介して浄化及び濃縮する。濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）によって定量化する。

【0380】

ＲＮＡ結合アッセイについては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）を１×結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）中２．５μＭに希釈する。次いで、ポリペプチドを１×結合緩衝液中で２．５μＭから３７．５μＭまで段階希釈する。ポリペプチドを、１×結合緩衝液に５０ｎＭのＩＲ８００標識ＲＮＡガイドを加えたもので、１：１０に再度希釈し、十分に混合する。これらの反応物は、０．５～５μｇのｔＲＮＡを更に含めることができ、これはポリペプチドのＲＮＡへの非特異的結合を減少させるための競合的阻害剤として機能し、したがって正確な特異的結合の決定を容易にする。反応物を３７℃で１時間インキュベートする。染色全面可視化のために、１μＬの１００×ブロモフェノールブルーを反応物に添加し、全反応物を６％のＤＮＡ遅滞（Ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））上に充填し、８０Ｖで９０分間移動させた。ゲルを、Ｌｉｃｏｒ（登録商標）Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘで画像化する。

【0381】

このアッセイは、ＲＮＡがゲルを通って移動する速度がそのサイズによって決定されるという原理に基づいている。ＲＮＡのみの試料は、特定の距離を移動することができる。しかしながら、ＲＮＡがポリペプチドに結合する場合、より大きくあまり移動しないＲＮＡ複合体を表すバンドが出現し、これはゲル上で「アップシフトされる」。

【0382】

したがって、２つのバンド：１）ＲＮＡのみのバンド、及び２）ポリペプチドに結合した「アップシフトされた」ＲＮＡバンドが測定される。全てのＲＮＡがポリペプチドに結合している場合、アップシフトされたバンドのみが観察される。ポリペプチドの濃度が減少するにつれて、アップシフトされたバンドの強度が減少し、一方、ＲＮＡのみのバンドの強度が増加する。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）に対するＲＮＡ結合親和性の比較において、より高いポリペプチド／ＲＮＡ親和性は、より低い濃度のポリペプチドでのより特異的な結合によって特徴付けられる。

【0383】

この実施例は、野生型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドのＲＮＡガイドに対する結合親和性及び変異体ポリペプチドのＲＮＡガイドに対する結合親和性がどのように決定され、比較され得るかを示している。

【0384】

実施例４－変異体二成分複合体についてのインビトロ切断アッセイ
この実施例は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＲＮＰを調製するための方法及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（野生型又は変異体）ＲＮＰのインビトロ生化学的活性を決定するための方法を記載する。

【0385】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））に形質転換し、Ｔ７プロモーター下で発現させる。形質転換細胞を、最初に５ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ （ＴＥＫＮＯＶＡ）＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシン中で一晩増殖させ、続いて、１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＥＫＮＯＶＡ）＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシンに接種した。細胞を、０．６～０．８のＯＤ_６００になるまで３７℃で増殖させ、次いで、０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導する。次いで、培養物を１８℃で更に１４～１８時間培養する。培養物を採取し、遠心分離によりペレット化し、次いで、５ｇの細胞ペレット当たり１ｍＬの抽出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中に再懸濁させる。細胞破砕器（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を介して細胞を溶解し、次いで、溶解物を清澄化させるために、４℃にて２０，０００×ｇで２０分間遠心分離する。０．２％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を清澄化溶解物に添加し、一定の転倒型回転を用いて４℃で２０分間インキュベートする。次いで、溶解物を２０，０００×ｇで１０分間再度遠心分離する。溶解物を、イオン交換クロマトグラフィーを介して精製する。精製後、画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上を移動させ、適切なサイズのタンパク質を含有する画分をプールし、３０ｋＤのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを使用して濃縮する。タンパク質を、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、及び５０％のグリセロールに緩衝液交換する。次いで、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））を用いて濃度を測定し、タンパク質を－２０℃で保存する。

【0386】

合成ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）対タンパク質の２：１の比を使用して、ＲＮＰを調製する。ＲＮＰを１×ＮＥＢ２ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）中で３７℃にて３０分間複合体化する。複合体化後に、ＲＮＰを１×ＮＥＢ２を希釈緩衝液として使用して希釈する。アポ反応物（ＲＮＡガイドを含まないタンパク質）を同じ方法で調製し、Ｈ_２ＯでｃｒＲＮＡの体積に作り上げた。

【0387】

標的ｄｓＤＮＡ基質（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２０ｎＭでＲＮＰ及びアポ試料に添加する。反応物を十分に混合した後、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、１μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））でクエンチする。反応物を５０℃で更に１５分間インキュベートし、次いで、反応物全体を２％アガロースＥ－ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））上を移動させた。Ｇｅｌ ＤｏｃＥＺ Ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））で臭化エチジウムによってゲルを可視化した。

【0388】

２つのタイプのバンド：１）完全長（非切断）ＤＮＡバンド、及び２）１つ以上のダウンシフトされた切断ＤＮＡバンドの強度を測定する。不活性ＲＮＰは、完全長ＤＮＡバンドによって特徴付けられる。活性ＲＮＰは、１つ以上のダウンシフトされた切断ＤＮＡバンドをもたらす。活性ＲＮＰの濃度が減少するにつれて、完全長バンドの強度は増加し、切断バンドの強度は減少する。複数のＲＮＰの活性の比較において、別のものよりも高い活性を有するＲＮＰは、より低いＲＮＰ濃度でのより強い切断バンドによって特徴付けられる。

【0389】

この実施例の方法は、標的ＤＮＡに対する野生型又は変異体ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＲＮＰ（二成分複合体）のインビトロ切断活性の比較を可能にする。

【0390】

実施例５－変異体ポリペプチド及び変異体二成分複合体のインビトロ安定性アッセイ
この実施例では、変異体ＲＮＰの安定性を評価する。

【0391】

加速安定性試験については、ＲＮＰ（５μＭ）を実施例４に記載されたものと同じ方法で生成し、試料をその後２５℃で４８時間保存する。

【0392】

インビトロ切断アッセイ（実施例４に記載されるような）をＲＮＰ試料に対して実施する。これらの結果を実施例４のものと比較して、２５℃で４８時間保存されたＲＮＰが生化学的活性を保持する範囲を決定する。

【0393】

アポポリペプチド（ＲＮＡガイドを含まない）も２５℃で４８時間インキュベートする。ＲＮＡ ＥＭＳＡアッセイを、実施例３に記載された方法を使用してアポ試料で実施する。これらの結果を実施例３のものと比較して、変異体ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＲＮＡガイドと二成分複合体を形成することができる範囲を決定する。

【0394】

２５℃で４８時間インキュベートしたアポ試料も、実施例４に記載された方法を使用して、ＲＮＡガイドと複合体化してＲＮＰを形成させる。次いで、実施例４の方法に従って、インビトロ切断アッセイを実施する。アッセイの結果を実施例４のものと比較して、２５℃でインキュベートしたタンパク質で形成された変異体ＲＮＰの活性レベルを評価する。

【0395】

この実施例の方法は、野生型及び変異体ポリペプチド、並びに野生型及び変異体ＲＮＰ（二成分複合体）の安定性の比較を可能にする。別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドのＲＮＡガイドに対する特異的結合よりも大きなＲＮＡガイドに対する特異的結合を実証するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドは、より安定なポリペプチドの指標である。別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドによる切断よりもロバストな標的ＤＮＡのインビトロ切断を実証するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＲＮＰは、より安定な二成分複合体の指標である。

【0396】

実施例６－変異体三成分複合体の検出のためのＤＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ
この実施例は、三成分複合体を形成するためのＲＮＡガイド、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）、及び標的ＤＮＡ基質の能力を決定するためのＤＮＡ ＥＭＳＡの使用について記載する。

【0397】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））に形質転換し、Ｔ７プロモーター下で発現させる。形質転換された細胞を、最初に５ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＴＥＫＮＯＶＡ）＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシン中で一晩増殖させ、続いて１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＥＫＮＯＶＡ）＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシンに接種する。細胞を０．６～０．８のＯＤ_６００になるまで３７℃で増殖させ、次いで０．５ｍＭＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘発させる。次いで、培養物を１８℃で更に１４～１８時間増殖させる。培養物を採取し、遠心分離によってペレット化し、次いで５ｇの細胞ペレット当たり１ｍＬの抽出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中に再懸濁させる。細胞破砕器（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を介して細胞を溶解し、次いで、溶解物を清澄化させるために、４℃にて２０，０００×ｇで２０分間遠心分離する。０．２％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を清澄化溶解物に添加し、一定の転倒型回転を用いて４℃で２０分間インキュベートする。次いで、溶解物を２０，０００×ｇで１０分間再度遠心分離する。溶解物を、イオン交換クロマトグラフィーを介して精製する。精製後、画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上を移動させ、適切なサイズのタンパク質を含有する画分をプールし、３０ｋＤのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを使用して濃縮する。タンパク質を、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、及び５０％のグリセロールに緩衝液交換した。次いで、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））を用いて濃度を測定し、タンパク質を－２０℃で保存した。

【0398】

合成ＲＮＡガイド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）対ポリペプチドの２：１の比を使用して、ＲＮＰを調製する。本明細書に開示されるＰＡＭ配列に隣接する標的を選択し、ＲＮＡガイドを本明細書に記載されるようなダイレクトリピート配列を使用して設計する。ＲＮＰを１×ＮＥＢ２ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）中で３７℃にて３０分間複合体化する。複合体化後に、１×ＮＥＢ２を希釈緩衝液として使用して、５μＭから３７．５μＭまでの５ポイント１：２段階希釈を実施する。アポ反応物（ＲＮＡガイドを含まないタンパク質）を同じ方法で調製し、Ｈ_２ＯでＲＮＡガイドの体積に作り上げる。

【0399】

ｄｓＤＮＡ標的基質を、オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのＰＣＲによって生成する。ＰＣＲの前に、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８に記載されるように、フォワードプライマーの５’末端をＩＲ８００染料で標識付けする。Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））を使用して、次いで、ｄｓＤＮＡをＩＲ８００標識フォワードプライマー及び非標識リバースプライマーを用いて増幅する。得られたｄｓＤＮＡをＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（登録商標）－５ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））によって定量化する。

【0400】

ＲＮＰ試料及びアポ（対照）試料を、１×結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、１０％のグリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に２０ｎＭのＩＲ８００標識標的ＤＮＡ基質を加えたものに１：１０で希釈し、十分に混合する。反応物を３７℃で１時間インキュベートする。染色全面可視化のために、ブロモフェノールブルーを反応物に添加し、反応物全体を６％のＤＮＡ遅滞ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））上に充填し、８０Ｖで９０分間移動させる。ゲルを、Ｌｉｃｏｒ（登録商標）Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘで画像化する。

【0401】

このアッセイでは、ＤＮＡがゲルを通って移動する速度がそのサイズによって決定される。ＤＮＡのみの試料は、特定の距離を移動することができる。しかしながら、ＲＮＰがＤＮＡに結合する場合、より大きくあまり移動しないＤＮＡ複合体を表すバンドが出現し、これはゲル上で「アップシフトされる」。

【0402】

この実施例は、変異体ＲＮＰ（変異体二成分複合体）のＤＮＡ標的に対する親和性（三成分複合体を生成するための）が、野生型ＲＮＰ（野生型二成分複合体）のＤＮＡ標的に対する親和性とどのように比較され得るかを示している。

【0403】

実施例７－５’－ＣＴＧ－３’ＰＡＭ配列を用いた哺乳動物標的の編集
この実施例は、５’－ＣＴＧ－３’ＰＡＭ配列に隣接する複数の標的配列についてのインデル評価を記載する。

【0404】

配列番号３のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、ｐｃｄａ３．１バックボーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））にクローニングした。それぞれが配列番号６のダイレクトリピート配列を含むＲＮＡガイドを、Ｕ６プロモーター下でｐＵＣ１９バックボーン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））にクローニングした。次いで、プラスミドをマキシ－プレップし、希釈した。ＲＮＡガイド（すなわち、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３のｃｒＲＮＡ配列）及び標的配列（すなわち、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２）を表４に示す。

【0405】

【表4】

【0406】

トランスフェクションのおよそ１６時間前に、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中の２５，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。トランスフェクションの当日に、細胞は７０～９０％の集密度であった。トランスフェクトされる各ウェルについては、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）とＯｐｔｉＭＥＭ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））との混合物を調製し、その後、室温で５分間インキュベートした（溶液１）。インキュベーション後、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）：ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）混合物を、ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）で希釈したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼプラスミド及びガイドプラスミドを含む別々の溶液に加えた（溶液２）。陰性対照の場合、ｃｒＲＮＡは溶液２には含まれなかった。溶液１と溶液２の混合物を上下にピペッティングすることによって混合し、次いで、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、溶液１と溶液２を、細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに滴加した。トランスフェクションの７２時間後、ＴｒｙｐＬＥ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））を各ウェルの中心に添加することによって細胞をトリプシン処理し、およそ５分間インキュベートした。次いで、Ｄ１０培地を各ウェルに添加し、混合して細胞を再懸濁した。細胞を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、１０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、ペレットを２０μＬのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）抽出試薬（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。再懸濁した細胞液を、サーマルサイクラーで、６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、及び９８℃で１０分間インキュベートした。

【0407】

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）用の試料を、２ラウンドのＰＣＲによって調製した。第１ラウンド（ＰＣＲ１）は、標的に依存する特異的ゲノム領域を増幅するために使用した。ＰＣＲ１生成物をカラム精製により精製した。ラウンド２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター及びインデックスを添加するために実施した。次いで、反応物をプールし、カラム精製により精製した。１５０ ｃｙｃｌｅ ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）ｖ２．５ ｍｉｄ又はｈｉｇｈ ｏｕｔｐｕｔキットを用いて、シーケンシングランを実施した。編集された標的は、バックグラウンドを超えるインデルレベル（このアッセイでは＞０．５％）を示した標的として定義された。

【0408】

図１は、インデルを含むＮＧＳリードのパーセンテージ（％生インデル）を示す。８つの異なる標的のインデルパーセントの平均は１０．６％であった。この実施例は、配列番号３のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び配列番号６のダイレクトリピート配列を含むＲＮＡガイドが５’－ＣＴＧ－３’ＰＡＭ配列に隣接する標的配列においてインデルを生成していることを実証している。

【0409】

実施例８－ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ変異体による哺乳動物遺伝子の標的化
この実施例は、一過性トランスフェクションによって哺乳動物細胞に導入された野生型及び変異体エフェクター（例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ変異体）を使用する、複数の標的に対するインデル評価を記載する。

【0410】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをｐｃｄａ３．１バックボーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））にクローニングする。次いで、プラスミドをマキシ－プレップし、１μｇ／μＬに希釈する。本明細書に開示のＰＡＭ配列に隣接する標的を選択し、ＲＮＡガイドを本明細書に記載されるようなダイレクトリピート配列を使用して設計する。ＲＮＡガイドの調製のために、ｃｒＲＮＡをコードするｄｓＤＮＡフラグメントを、標的配列足場及びＵ６プロモーターを含有するウルトラマーによって誘導する。ウルトラマーを、ｐＨ７．５の１０ｍＭトリス・ＨＣｌに、１００μＭの最終ストック濃度まで再懸濁する。続いて、ＰＣＲ反応の鋳型として機能させるために、ワーキングストックを１０ｍＭトリス・ＨＣｌを再び用いて１０μＭに希釈する。ｃｒＲＮＡの増幅を、以下の成分を含む５０μＬの反応液において行う：０．０２μｌの前述の鋳型、２．５μｌのフォワードプライマー、２．５μｌのリバースプライマー、２５μｌのＨｉＦｉポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））、及び２０μｌの水。サイクリング条件は、１×（９８℃で３０秒）、３０×（９８℃で１０秒、６７℃で１５秒）、１×（７２℃で２分）である。ＰＣＲ産物を１．８×ＳＰＲＩ処理で洗浄し、２５ｎｇ／μＬに標準化する。

【0411】

トランスフェクションのおよそ１６時間前に、１００μｌの、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中に２５，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種する。トランスフェクションの当日に、細胞は７０～９０％の集密度である。トランスフェクトされる各ウェルについては、０．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００と９．５μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（商標）との混合物を調製し、次いで、室温で５～２０分間インキュベートする（溶液１）。インキュベーション後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）：ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）混合物を、１８２ｎｇのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼプラスミド及び１４ｎｇのｃｒＲＮＡと１０μＬまでの水とを含有する別々の混合物に添加する（溶液２）。溶液１と溶液２の混合物を上下にピペッティングすることによって混合し、次いで、室温で２５分間インキュベートする。インキュベーション後、２０μＬの溶液１と溶液２の混合物を、細胞を含有する９６ウェルプレートの各ウェルに滴加する。トランスフェクションの７２時間後、ＴｒｙｐＬＥ（商標）１０μＬを各ウェルの中心に添加することによって細胞をトリプシン処理し、およそ５分間インキュベートする。次いで、Ｄ１０培地１００μＬを各ウェルに添加し、混合して細胞を再懸濁する。次いで、細胞を５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄する。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）緩衝液を、元の細胞懸濁液容量の１／５の量に添加する。細胞を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、及び９８℃で１０分間インキュベートする。

【0412】

次世代シーケンシング用の試料を、２ラウンドのＰＣＲによって調製した。第１ラウンド（ＰＣＲ１）は、標的に依存する特異的ゲノム領域を増幅するために使用する。ＰＣＲ１生成物をカラム精製により精製する。ラウンド２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター及びインデックスを添加するために実施する。次いで、反応物をプールし、カラム精製により精製する。１５０ ｃｙｃｌｅ ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）ｖ２．５ ｍｉｄ又はｈｉｇｈ ｏｕｔｐｕｔキットを用いて、シーケンシングランを実施する。

【0413】

編集された標的は、バックグラウンドを超えるインデルレベル（このアッセイでは＞０．５％）を示した標的として定義される。同じ標的セットにわたって、野生型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び変異体ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって誘導されたインデルを比較して、野生型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼよりも高いヌクレアーゼ活性を有する変異体ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特定する。

【0414】

実施例９－変異体ポリペプチドによる哺乳動物遺伝子の標的化
この実施例は、一過性トランスフェクションによって哺乳動物細胞に導入された変異体を使用する、複数の標的に対するインデル評価を記載する。

【0415】

配列番号３の変異体（表６～８）を、ｐｃＤＮＡ３．１バックボーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））にクローニングした。ＲＮＡガイドをｐＵＣ１９バックボーン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））にクローニングした。次いで、プラスミドをマキシ－プレップし、希釈した。ｃｒＲＮＡ、標的、及びＰＡＭ配列を表５に列挙する。

【0416】

【表5】

【0417】

トランスフェクションのおよそ１６時間前に、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｄ１０培地）中の２５，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。トランスフェクションの当日に、細胞は７０～９０％の集密度であった。トランスフェクションされる各ウェルについては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））とＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））との混合物を調製し、室温で５分間インキュベートした（溶液１）。インキュベーション後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）：Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）混合物を、ヌクレアーゼプラスミド、ＲＮＡガイドプラスミド、及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）を含有する別々の混合物に添加した（溶液２）。陰性対照の場合、ＲＮＡガイドプラスミドは、溶液２には含まれなかった。溶液１及び溶液２を上下にピペッティングすることによって混合し、次いで、室温で２５分間インキュベートした。インキュベーション後、溶液１と溶液２の混合物を、細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに滴加した。トランスフェクションのおよそ７２時間後に、各ウェルの中心にＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））を添加することによって細胞をトリプシン処理し、３７℃でおよそ５分間インキュベートした。次いで、Ｄ１０培地を各ウェルに添加し、混合して細胞を再懸濁させた。再懸濁した細胞を５００ｇで１０分間遠心分離してペレットを得て、上清を廃棄した。次いで、細胞ペレットをＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標））中に再懸濁させ、細胞を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、及び９８℃で１０分間インキュベートした。

【0418】

次世代シーケンシング用の試料を、２ラウンドのＰＣＲによって調製した。第１のラウンド（ＰＣＲ１）は、標的に依存する特異的ゲノム領域を増幅するために使用した。ラウンド２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）は、イルミナアダプター及びインデックスを添加するために実施した。次いで、反応物をプールし、カラム精製によって精製した。１５０ Ｃｙｃｌｅ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ Ｍｉｄ又はＨｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ ｖ２．５キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））を用いて、シーケンシングランを実施した。

【0419】

【表6】

【0420】

【表7-1】

【0421】

【表7-2】

【0422】

【表7-3】

【0423】

【表7-4】

【0424】

【表7-5】

【0425】

【表8-1】

【0426】

【表8-2】

【0427】

表６～８に示すように、Ｄ５０９Ｒなどの単一アミノ酸置換、又はＬ５８０Ｇ及びＬ３８５Ｇなどの２～５個のアミノ酸置換を含む複数の変異体は、少なくとも２倍のｉｎｄｅｌ活性の増加をもたらした。

【0428】

実施例１０－変異体ポリペプチドによる哺乳動物遺伝子の標的化
この実施例は、一過性トランスフェクションによって哺乳動物細胞に導入された変異体ポリペプチドを使用する、複数の標的に対するインデル評価を記載する。

【0429】

実施例９に記載のアッセイ及び３つの標的を用いて、配列番号３のさらなる組み合わせ変異体を分析した。Ｋ１３６Ｇ、Ｎ２２０Ｒ、及びＭ３８０Ｒなどのインデル活性の少なくとも２倍の増加をもたらす組合せ変異を、表９に示す。

【0430】

【表9】

【0431】

実施形態の列挙
以下に列挙する実施形態が提供されるが、その番号付けは、重要度のレベルを指定するものとして解釈されるべきではない。

【0432】

実施形態１は、変異体ポリペプチド、又は変異体ポリペプチドを含む組成物を提供し、変異体ポリペプチドは親ポリペプチドに対して改変を含み、親ポリペプチドは配列番号３を含み、変異体ポリペプチドはＲＮＡガイド及び標的核酸に結合することができ、変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドを含む複合体は、親ポリペプチド又は親ポリペプチドを含む複合体と比較して、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す。

【0433】

実施形態２は、酵素活性の増強が、ヌクレアーゼ活性の増強である、実施形態１の変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0434】

実施形態３は、変異体ポリペプチドが、親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイドに対する結合活性の増強を示す、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0435】

実施形態４は、変異体ポリペプチドが、親ポリペプチドと比較してＲＮＡガイドに対する結合特異性の増強を示す、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0436】

実施形態５は、変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドが変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体が以下の特徴の１つ以上を示す、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する：
（ｉ）親二成分複合体と比較して、標的核酸に対する結合活性（例えば、オンターゲット結合活性）が増強；
（ｉｉ）親二成分複合体と比較して、標的核酸に対する結合特異性（例えば、オンターゲット結合特異性）が増強；
（ｉｉｉ）親二成分複合体と比較して、安定性が増強；並びに／又は
（ｉｖ）親二成分複合体と比較して、標的核酸からの解離の減少、及び／若しくは非標的核酸へのオフターゲット結合の減少。

【0437】

実施形態６は、変異体二成分複合体及び標的核酸が変異体三成分複合体を形成し、変異体三成分複合体が親三成分複合体と比較して安定性の増加を示す、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0438】

実施形態７は、変異体ポリペプチドが、親ポリペプチドと比較して、二成分複合体形成の増強、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強、及び／又はＲＮＡガイドからの解離の減少を更に示す、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0439】

実施形態８は、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強が、例えば２０℃～６５℃の温度範囲にわたって起こる、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0440】

実施形態９は、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強が、様々なインキュベーション時間で起こる、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0441】

実施形態１０は、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強が、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で起こる、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0442】

実施形態１１は、変異体ポリペプチド、改変体二成分複合体、又は改変体三成分複合体のＴ_ｍ値が、親ポリペプチド、親二成分複合体、又は親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合に、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強が起こる、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0443】

実施形態１２は、改変が、表２に列挙される少なくとも１つのアミノ酸置換である、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0444】

実施形態１３は、改変が、アルギニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、又はグリシン置換である、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0445】

実施形態１４は、変異体ポリペプチドが、ＲｕｖＣドメイン又はスプリットＲｕｖＣドメインを含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0446】

実施形態１５は、変異体ポリペプチドが、１つ以上の触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0447】

実施形態１６は、１つ以上の触媒残基が、Ｄ３４５及びＥ５０６を含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0448】

実施形態１７は、ＲＮＡガイドが、ダイレクトリピート配列及びスペーサー配列を含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0449】

実施形態１８は、ダイレクトリピート配列が、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0450】

実施形態１９は、ダイレクトリピート配列が、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0451】

実施形態２０は、ダイレクトリピート配列が、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６を含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0452】

実施形態２１は、スペーサー配列が１５～３５ヌクレオチド長を含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0453】

実施形態２２は、ＲＮＡガイドが、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３のいずれか１つを含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0454】

実施形態２３は、標的核酸が、スペーサー配列中のヌクレオチド配列に相補的な配列を含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0455】

実施形態２４は、標的核酸がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接し、ＰＡＭ配列が５’－ＮＴＮ－３’、５’－ＨＴＮ－３’、又は５’－ＴＮＡ－３’として示されるヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＨはＡ又はＣ又はＴである、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0456】

実施形態２５は、ＰＡＭ配列が、５’－ＣＴＧ－３’として示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態２４の変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0457】

実施形態２６は、標的核酸が一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡである、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0458】

実施形態２７は、変異体ポリペプチドが、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0459】

実施形態２８は、変異体ポリペプチドをコードする核酸が、細胞における発現のためにコドン最適化されている、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0460】

実施形態２９は、変異体ポリペプチドをコードする核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態２８の変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0461】

実施形態３０は、変異体ポリペプチドをコードする核酸がベクター中にある、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0462】

実施形態３１は、ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む、実施形態３１の変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0463】

実施形態３２は、組成物が、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を提供する。

【0464】

実施形態３３は、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド又は組成物を含む細胞を提供する。

【0465】

実施形態３４は、細胞が真核細胞又は原核細胞である、実施形態３３の細胞を提供する。

【0466】

実施形態３５は、細胞が哺乳動物細胞又は植物細胞である、前述の実施形態のいずれかの細胞を提供する。

【0467】

実施形態３６は、細胞がヒト細胞である、前述の実施形態のいずれかの細胞を提供する。

【0468】

実施形態３７は、ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を提供し、ＲＮＡガイドはダイレクトリピート配列及びスペーサー配列を含み、ダイレクトリピート配列は配列番号４～６のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0469】

実施形態３８は、ダイレクトリピート配列が配列番号４～６からなる群から選択される、実施形態４２に記載のＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を提供する。

【0470】

実施形態３９は、スペーサー配列が５’－ＣＴＧ－３’プロトスペーサー隣接モチーフに隣接して結合する、実施形態４０又は４１のいずれか１つのＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を提供する。

【0471】

実施形態４０は、ＲＮＡガイドが、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態４０～４２のいずれか１つのＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を提供する。

【0472】

実施形態４１は、実施形態３７～４０のいずれか１つのＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を含む組成物を提供する。

【0473】

実施形態４２は、組成物がＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸を更に含む、実施形態４１の組成物を提供する。

【0474】

実施形態４３は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４２の組成物を提供する。

【0475】

実施形態４４は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４３の組成物を提供する。

【0476】

実施形態４５は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが実施形態１～３２のいずれか１つの変異体ポリペプチドである、実施形態４１～４４のいずれか１つの組成物を提供する。

【0477】

実施形態４６は、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチドを調製する方法を提供し、この方法は、（ｉ）配列番号１又は配列番号２を含む核酸に１つ以上のヌクレオチド置換を導入して、変異体ポリペプチドをコードする変異体核酸を生成する工程と、（ｉｉ）変異体核酸から変異体ポリペプチドを発現させる工程とを含む。

【0478】

実施形態４７は、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドを含む変異体二成分複合体を提供する。

【0479】

実施形態４８は、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド、ＲＮＡガイド、及び標的核酸を含む変異体三成分複合体を提供する。

【0480】

実施形態４９は、変異体二成分複合体を形成する方法を提供し、この方法は、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチドを、前述の実施形態のいずれかのＲＮＡガイドと接触させることを含む。

【0481】

実施形態５０は、変異体三成分複合体を形成する方法を提供し、この方法は、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチドを、前述の実施形態のいずれかのＲＮＡガイド及び前述の実施形態のいずれかの標的核酸と接触させることを含む。

【0482】

実施形態５１は、前述の実施形態のいずれかの変異体ポリペプチド若しくは組成物又は変異体二成分複合体を細胞に送達する方法を提供し、この方法は、実施形態１～３２のいずれか１つの変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する工程と、任意選択で、前述の実施形態のいずれかのＲＮＡガイド若しくはＲＮＡガイドをコードする核酸を導入する工程、又は実施形態５の変異体二成分複合体を導入する工程とを含み、導入する工程は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組み合わせを導入することを含む。

【0483】

実施形態５２は、細胞中の標的ＤＮＡ分子を改変する方法を提供し、この方法は、実施形態１～３２のいずれか１つの変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する工程と、前述の実施形態のいずれかのＲＮＡガイド若しくはＲＮＡガイドをコードする核酸を導入する工程、又は実施形態４７の変異体二成分複合体を導入する工程とを含み、導入する工程は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクター、又はこれらの任意の組み合わせを導入することを含む。

【0484】

実施形態５３は、細胞に導入する工程が細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む、実施形態５１又は５２の方法を提供する。

【0485】

実施形態５４は、細胞に導入する工程が、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、又はこれらの任意の組み合わせの使用を含む、実施形態５１～５３のいずれか１つの方法を提供する。

【0486】

実施形態５５は、標的ＤＮＡ分子を改変する方法を提供し、この方法は、標的ＤＮＡ分子を、実施形態１～３２のいずれか１つの変異体ポリペプチド、及び前述の実施形態のいずれかのＲＮＡガイドと接触させることを含む。

【0487】

実施形態５６は、標的ＤＮＡ分子がインビトロ又は細胞内にある、実施形態５５の方法を提供する。

【0488】

実施形態５７は、細胞が、インビトロ、エクスビボ、又はインビボにある、実施形態５１～５４、及び５６のいずれか１つの方法を提供する。

【0489】

実施形態５８は、細胞が、原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞から選択される、実施形態５７の方法を提供する。

【0490】

他の実施形態
本明細書に引用されるあらゆる特許、特許出願、及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態を参照して本開示を説明してきたが、当業者であれば、本開示の他の実施形態及び変形を、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく考案し得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような全ての実施形態及び等価な変形形態を含むと解釈されることが意図される。

【図1】

【国際調査報告】