特表 2024-531609 心臓線維芽細胞由来細胞外マトリクス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】心臓線維芽細胞由来細胞外マトリクス

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20240822BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 35/34 20150101ALI20240822BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

A61P9/00

A61P9/04

A61K35/12

A61K35/545

A61K35/28

A61K35/34

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515089

(86)(22)【出願日】2022-09-06

(85)【翻訳文提出日】2024-04-16

(86)【国際出願番号】 US2022075975

(87)【国際公開番号】W WO2023039371

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】63/241,240

(32)【優先日】2021-09-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591013274

【氏名又は名称】ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】シュムック エリック

(72)【発明者】

【氏名】ラヴァル アミッシュ

(72)【発明者】

【氏名】ロイ スシュミタ

(72)【発明者】

【氏名】チョウ ティアンファ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB10

4B065AC20

4B065BA30

4B065BC11

4B065BD50

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB44

4C087BB47

4C087BB63

4C087BB64

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA36

(57)【要約】

本開示は概して、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法、細胞、および組成物に関する。具体的には、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞およびＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を使用する心臓細胞外マトリクスを調製するための方法が、本明細書に提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

心臓細胞外マトリクスを調製するための方法であって、
（ａ）心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を選択することと、
（ｂ）前記ＳＵＳＤ２高線維芽細胞を、１ｃｍ²当たり１００，０００～５００，０００細胞の細胞密度を有する培養物にプレーティングすることであって、前記ＳＵＳＤ２高線維芽細胞が、前記ＳＵＳＤ２高線維芽細胞がその上にプレーティングされる表面へと取り付けられる心臓細胞外マトリクスを分泌する、プレーティングすることと、を含む、方法。

【請求項2】

前記心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を前記選択することが、フローサイトメトリーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＳＵＳＤ２高線維芽細胞が、平均蛍光強度（ＭＦＩ）＞５００を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記分泌された心臓細胞外マトリクスをエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と接触させ、それによって前記心臓細胞外マトリクスが、表面から取り外されるようになり、浮遊性のバイオスキャフォールドを形成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記心臓細胞外マトリクスを脱細胞化剤と接触させ、それによって前記心臓細胞外マトリクスが脱細胞化される工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記脱細胞化剤が、過酢酸、水酸化アンモニウムとオクチルフェノールエチレンオキシド（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）とを含む混合物、またはトリ－Ｎ－ブチル－ホスフェートとオクチルフェノールエチレンオキシド（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）とを含む混合物を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

請求項１に記載の方法に従って産生される心臓細胞外マトリクス。

【請求項8】

前記心臓細胞外マトリクスに、心臓の疾患または傷害に対して治療的である１つ以上の細胞を播種する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

心臓の疾患または傷害に対して治療的である前記１つ以上の細胞が、骨格筋芽細胞、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、多能性成体生殖系列幹細胞（ｍａＧＣＳ）、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）、極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬ細胞）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、心臓形成細胞（ＣＰＣ）、カーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）、多能性Ｉｓ／１＋心臓血管前駆細胞（ＭＩＣＰ）、心外膜由来前駆細胞（ＥＰＤＣ）、脂肪由来幹細胞、ヒトｍｅｓｏｃｈｙｍａｌ幹細胞、ヒト間葉系幹細胞（ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する）、骨格筋芽細胞、エクソソーム、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記心臓細胞外マトリクスに、心臓の疾患または傷害に対して治療的である１つ以上の生物活性タンパク質を播種する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記１つ以上の生物活性タンパク質がサイトカインまたは成長因子である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

心臓細胞外マトリクスを調製するための方法であって、
（ａ）心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を選択することと、
（ｂ）前記ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を、１ｃｍ²当たり１００，０００～５００，０００細胞の細胞密度を有する培養物にプレーティングすることであって、前記ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞が、前記ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞がその上にプレーティングされる表面へと取り付けられる心臓細胞外マトリクスを分泌する、プレーティングすることと、を含む、方法。

【請求項13】

前記心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を前記選択することが、フローサイトメトリーを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞が、平均蛍光強度（ＭＦＩ）＞５００を有する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記分泌された心臓細胞外マトリクスをエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と接触させ、それによって前記心臓細胞外マトリクスが、表面から取り外されるようになり、浮遊性のバイオスキャフォールドを形成する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記心臓細胞外マトリクスを脱細胞化剤と接触させ、それによって前記心臓細胞外マトリクスが脱細胞化される工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

前記脱細胞化剤が、過酢酸、水酸化アンモニウムとオクチルフェノールエチレンオキシド（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）とを含む混合物、またはトリ－Ｎ－ブチル－ホスフェートとオクチルフェノールエチレンオキシド（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）とを含む混合物を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

請求項１２に記載の方法に従って産生される心臓細胞外マトリクス。

【請求項19】

前記心臓細胞外マトリクスに、心臓の疾患または傷害に対して治療的である１つ以上の細胞を播種する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項20】

心臓の疾患または傷害に対して治療的である前記それ以上の細胞が、骨格筋芽細胞、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、多能性成体生殖系列幹細胞（ｍａＧＣＳ）、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）、極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬ細胞）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、心臓形成細胞（ＣＰＣ）、カーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）、多能性Ｉｓ／１＋心臓血管前駆細胞（ＭＩＣＰ）、心外膜由来前駆細胞（ＥＰＤＣ）、脂肪由来幹細胞、ヒトｍｅｓｏｃｈｙｍａｌ幹細胞、ヒト間葉系幹細胞（ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する）、骨格筋芽細胞、エクソソーム、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記心臓細胞外マトリクスに、心臓の疾患または傷害に対して治療的である１つ以上の生物活性タンパク質を播種する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項22】

前記１つ以上の生物活性タンパク質がサイトカインまたは成長因子である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

ＳＵＳＤ２高線維芽細胞の集団を生成する方法であって、
ＳＵＳＤ２高線維芽細胞の集団を得るために心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を選択することを含む、方法。

【請求項24】

前記心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を前記選択することが、フローサイトメトリーを含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ＳＵＳＤ２高線維芽細胞が、平均蛍光強度（ＭＦＩ）＞５００を有する、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を生成する方法であって、
ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を得るために心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を選択することを含む、方法。

【請求項27】

前記心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を前記選択することが、フローサイトメトリーを含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞が、平均蛍光強度（ＭＦＩ）＞５００を有する、請求項２７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年９月７日に出願された米国仮特許出願第６３／２４１，２４０号に対する優先権を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

（連邦政府が支援する研究に関する声明）
この発明は、国立衛生研究所によって与えられたＣＡ０１４５２０に基づく政府支援によって行われた。政府は本発明にある特定の権利を有する。

【0003】

本開示は概して、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法、細胞、および組成物に関する。具体的には、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞およびＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を使用する心臓細胞外マトリクスを調製するための方法が、本明細書に提供される。

【背景技術】

【0004】

心臓線維芽細胞（ＣＦ）および心臓筋線維芽細胞（ＣＭＦ）は、プラスチックに接着し、マトリクス細胞タンパク質を分泌し、かつ器官の発生、創傷治癒、線維症、免疫調節、および細胞外マトリクス（ＥＣＭ）アセンブリに関与する間葉由来の細胞である。マトリクス産生の目的のためのＣＦおよびＣＭＦの単離および培養拡張は、組織工学および再生医療において潜在的な有用性を有する。例えば、培養したＣＦから組み立てられたフィブロネクチンが豊富なマトリクススキャフォールドを使用して、間葉系間質細胞を損傷した心筋へと送達することができる。加えて、培養したヒトＣＦ／ＣＭＦに由来するマトリクスは、単球を、興味深い抗炎症特性および血管新生促進特性を発現するマクロファージへと変換する。これらのバイオエンジニアリングされたマトリクスを含む拡張された調査は、製造をスケールアップする前に、品質管理の目的のために培養したＣＦおよびＣＭＦの慎重な特徴付けを必要とする。数多くの研究は、単純な形態計測学的幾何学的形状、プラスチック接着、およびＥＣＭを組み立てる能力によって、ヒトＣＦおよびＣＭＦを定義する。しかしながら、これらの特徴は非特異的である。間葉系間質細胞（ＭＳＣ）および周皮細胞などの他の細胞タイプは、形態計測学的に類似しており、またプラスチックに容易に接着する。その上、ある特定の実質細胞および免疫細胞は、ある特定の条件下でＥＣＭを産生する。いくつかのマーカーが、ヒトＣＦおよびＣＭＦ上で特定されている。Ｓｕｓｈｉ含有ドメイン２（ＳＵＳＤ２）は、ＣＦのための新しい細胞マーカーとして最近特定されている。

【発明の概要】

【0005】

本明細書では、（ａ）心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を選択することと、（ｂ）ＳＵＳＤ２高線維芽細胞を、１ｃｍ²当たり１００，０００～５００，０００細胞の細胞密度を有する培養物にプレーティングすることと、を含み、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞が、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞がプレーティングされる表面へと取り付けられる心臓細胞外マトリクスを分泌する、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法が提供される。

【0006】

また、本明細書では、（ａ）培養物中の心臓線維芽細胞を拡張して、心臓線維芽細胞の集団を得ることと、（ｂ）心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を選択することと、（ｃ）ＳＵＳＤ２高線維芽細胞を、１ｃｍ²当たり１００，０００～５００，０００細胞の細胞密度を有する培養物にプレーティングすることと、を含み、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞が、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞がプレーティングされる表面へと取り付けられる心臓細胞外マトリクスを分泌する、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法も提供される。

【0007】

また、本明細書では、（ａ）心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を選択することと、（ｂ）ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を、１ｃｍ²当たり１００，０００～５００，０００細胞の細胞密度を有する培養物にプレーティングすることと、を含み、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞が、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞がプレーティングされる表面へと取り付けられる心臓細胞外マトリクスを分泌する、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法も提供する。

【0008】

また、本明細書では、（ａ）培養物中の心臓筋線維芽細胞を拡張して、心臓筋線維芽細胞の集団を得ることと、（ｂ）心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を選択することと、（ｃ）ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を、１ｃｍ²当たり１００，０００～５００，０００細胞の細胞密度を有する培養物にプレーティングすることと、を含み、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞が、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞がプレーティングされる表面へと取り付けられる心臓細胞外マトリクスを分泌する、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法も提供する。

【0009】

また、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞の集団を生成する方法も本明細書に提供され、方法は、心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を選択して、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞の集団を得ることを含む。

【0010】

また、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞の集団を生成する方法も本明細書に提供され、方法は、（ａ）培養物中の心臓線維芽細胞を拡張して、心臓線維芽細胞の集団を得ることと、（ｂ）心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を選択して、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞の集団を得ることと、を含む。

【0011】

また、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を生成する方法も本明細書に提供され、方法は、心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を選択して、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を得ることを含む。

【0012】

また、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を生成する方法も本明細書に提供され、方法は、（ａ）培養物中の心臓筋線維芽細胞を拡張して、心臓筋線維芽細胞の集団を得ることと、（ｂ）心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を選択して、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を得ることと、を含む。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、ＳＵＳＤ２を心臓線維芽細胞由来細胞外マトリクス産生のマーカーとして使用することができることを示す。ヒト心臓線維芽細胞株をＳＵＳＤ２について染色した。９８．８％の細胞はＳＵＳＤ２を発現し、細胞をＳＵＳＤ２高（平均蛍光強度（ＭＦＩ）＞５００）およびＳＵＳＤ２低（ＭＦＩ＜５００）へとソートし、そして高密度でプレーティングし、そして１０日間培養した。ＳＵＳＤ２高心臓線維芽細胞は、損傷がない心臓線維芽細胞由来細胞外マトリクスを産生し、一方でＳＵＳＤ２低細胞は、損傷がないマトリクスを産生しなかった。

【図2】図２は、ＳＵＳＤ２およびビメンチンを共発現する心臓線維芽細胞の免疫組織化学画像を示す。代表的な高ＳＵＳＤ２発現細胞および低ＳＵＳＤ２発現細胞を矢印で表示する。

【図3】図３は、ＳＵＳＤ２高心臓線維芽細胞およびＳＵＳＤ２低心臓線維芽細胞の安定性を示す。心臓線維芽細胞を、それらのＳＵＳＤ２の発現に基づいてフローサイトメトリーを用いてソートした。ＳＵＳＤ低集団およびＳＵＳＤ２高集団をプレーティングし、そして標準的な条件下で７日間培養した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーによってＳＵＳＤ２発現について分析した。ＳＵＳＤ２低集団およびＳＵＳＤ２高集団の両方は、高いレベルの純度を維持した。７日後、ＳＵＳＤ２低にソートされた細胞の８３．４％は、ＭＦＩに基づいて低いＳＵＳＤ２発現表現型を維持し、一方でＳＵＳＤ２高にソートされた細胞の９３．８％は、ＭＦＩに基づいて高いＳＵＳＤ２発現表現型を維持した。

【図4】図４Ａ～図４Ｈは、ＳＵＳＤ２高／低細胞集団についてのサイトカインセクレトーム分析間の差異を示す。試験したサイトカインは、（図４Ａ）ＩＬ－６；（図４Ｂ）Ａｎｇ－１；（図４Ｃ）Ａｎｇ－２；（図４Ｄ）ＰＧＩＦ；（図４Ｅ）ｂＦＧＦ；（図４Ｆ）ＩＬ－８；（図４Ｇ）ＰＥＣＡＭ、および（図４Ｈ）ＶＥＧＦであった。心臓線維芽細胞／筋線維芽細胞を、ＳＵＳＤ２ ＭＦＩ発現（低＜５００ＭＦＩ、高＞５００ＭＦＩ）に基づいてソートし、等しい数のＳＵＳＤ２高／低細胞をプレーティングし、そして標準的な培養条件下で３日間培養した。培地をサンプリングし、そして複数の検体（サイトカイン）について分析した。いくつかのサイトカインで有意な差異が検出された。

【図5】図５は、ＳＵＳＤ２低（ＳＵＳＤ２低）細胞株と比較した、高ＳＵＳＤ２発現細胞株（ＳＵＳＤ２高）から産生されたＣＭＦ－ＥＣＭの組成物を図示する。ＳＵＳＤ２低細胞株は、損傷がないスキャフォールドを形成せず、これは、ＳＵＳＤ２高（９２％）細胞株と比較して、ＳＵＳＤ２低（５６％）におけるフィブロネクチン発現の低減と相関する。

【図6】図６は、注入可能なＣＦ／ＣＭＦ－ＥＣＭは、製粉プロトコルを調整することによって定義された仕様へと製粉することができることを図示する。３つの異なる粉砕サイズが作製された（粗い：１３８＋／－４．０ｍｍ、中程度：９０＋／－１．５ｍｍ、および細かい、５３＋／－１．７ｍｍ）。

【図7】図７は、骨髄由来成長因子（ＭＹＤＧＦ）が本明細書に開示されるＥＣＭへと直接的に結合することを示す顕微鏡写真を図示する。矢印は、ＥＣＭのフィブロネクチン内に位置するＭＹＤＧＦを特定する。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本開示は概して、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法、細胞、および組成物に関する。具体的には、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞およびＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を使用する心臓細胞外マトリクスを調製するための方法が、本明細書に提供される。

【0015】

特許および特許出願を含むがしかしこれに限定されない、本明細書に引用されるすべての出版物は、本出願にその全体が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0016】

特定の実施形態では、（ａ）心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を選択することと、（ｂ）ＳＵＳＤ２高線維芽細胞を、１ｃｍ²当たり１００，０００～５００，０００細胞の細胞密度を有する培養物にプレーティングすることと、を含み、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞が、心臓細胞外を分泌する、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法が本明細書に提供される。

【0017】

特定の実施形態では、（ａ）培養物中の心臓線維芽細胞を拡張して、心臓線維芽細胞の集団を得ることと、（ｂ）心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を選択することと、（ｃ）ＳＵＳＤ２高線維芽細胞を、１ｃｍ²当たり１００，０００～５００，０００細胞の細胞密度を有する培養物にプレーティングすることと、を含み、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞が、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞がプレーティングされる表面へと取り付けられる心臓細胞外マトリクスを分泌する、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法が本明細書に提供される。

【0018】

特定の実施形態では、（ａ）心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を選択することと、（ｂ）ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を、１ｃｍ²当たり１００，０００～５００，０００細胞の細胞密度を有する培養物にプレーティングすることと、を含み、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞が、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞がプレーティングされる表面へと取り付けられる心臓細胞外マトリクスを分泌する、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法が本明細書に提供される。

【0019】

特定の実施形態では、（ａ）培養物中の心臓筋線維芽細胞を拡張して、心臓筋線維芽細胞の集団を得ることと、（ｂ）心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を選択することと、（ｃ）ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を、１ｃｍ²当たり１００，０００～５００，０００細胞の細胞密度を有する培養物にプレーティングすることと、を含み、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞が、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞がプレーティングされる表面へと取り付けられる心臓細胞外マトリクスを分泌する、心臓細胞外マトリクスを調製するための方法が本明細書に提供される。

【0020】

特定の実施形態では、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞の集団を生成する方法が本明細書に提供され、方法は、心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を選択して、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞の集団を得ることを含む。

【0021】

特定の実施形態では、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞の集団を生成する方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）培養物中の心臓線維芽細胞を拡張して、心臓線維芽細胞の集団を得ることと、（ｂ）心臓線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞を選択して、ＳＵＳＤ２高線維芽細胞の集団を得ることと、を含む。

【0022】

特定の実施形態では、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を生成する方法が本明細書に提供され、方法は、心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を選択して、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を得ることを含む。

【0023】

特定の実施形態では、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を生成する方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）培養物中の心臓筋線維芽細胞を拡張して、心臓筋線維芽細胞の集団を得ることと、（ｂ）心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞を選択して、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を得ることと、を含む。

【0024】

Ｓｕｓｈｉ含有ドメイン２（ＳＵＳＤ２）は、膜貫通ドメインおよび接着分子に固有の機能性ドメインを有する８２２アミノ酸Ｉ型膜タンパク質である。このマーカーは、子宮内膜間葉系幹細胞、乳がん細胞および肺がん細胞、ならびにヒト胚性幹細胞上で可変的に発現される。

【0025】

本明細書で使用される場合、「高」は、細胞がＳＵＳＤ２の高いレベルの発現によって特徴付けられることを意味する。特定の実施形態では、ＳＵＳＤ２陽性線維芽細胞または筋線維芽細胞は、細胞が５００より大きい平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有する場合、「高」として特徴付けられる。特定の実施形態では、ＳＵＳＤ２陽性線維芽細胞または筋線維芽細胞は、細胞が５００より小さい平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有する場合、「低」として特徴付けられる。

【0026】

特定の実施形態では、心臓線維芽細胞または心臓筋線維芽細胞は、拡張のために適切な条件下で細胞を培養して、心臓線維芽細胞または心臓筋線維芽細胞の集団を産生することによって拡張される。一実施形態では、細胞は、高グルコースＭＣＤＢ１３１＋１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で、３７℃にて、５％ＣＯ₂、湿度１００％雰囲気中で、１０～１４日間培養される。特定の実施形態では、心臓線維芽細胞または心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞または筋線維芽細胞を選択して、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を得ることは、フローサイトメトリーを含む。特定の実施形態では、心臓線維芽細胞または心臓筋線維芽細胞の集団からＳＵＳＤ２高線維芽細胞または筋線維芽細胞を選択して、ＳＵＳＤ２高筋線維芽細胞の集団を得ることは、ＳＵＳＤ２遺伝子の過剰発現に基づく。

【0027】

特定の実施形態では、心臓線維芽細胞または心臓筋線維芽細胞は、心臓組織から単離される。心臓線維芽細胞および筋線維芽細胞は、当技術分野で知られている方法を使用して単離されてもよい。特定の実施形態では、心臓線維芽細胞または心臓筋線維芽細胞は、人工多能性幹細胞から分化される。「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」は、その中にある特定の力価決定因子の発現を誘導することによって、分化した体細胞などの非多能性細胞からインビトロで産生される多能性細胞または多能性細胞の集団を意味し、これは、力価決定因子の特定の組に関して変化する場合があるそれらの分化した本来の体細胞に関して変化する場合があり、また、それらを単離するために使用される培養条件に関して変化する場合があるが、しかしそれにもかかわらず、それらのそれぞれの分化した本来の体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、またＥＳＣなどの、より高い力価の細胞と類似した特性を表示する。

【0028】

特定の実施形態では、心臓細胞外マトリクスは、拡張心臓線維芽細胞がその上にプレーティングされる表面に取り付けられる２０～５００μｍの厚さを有する。他の実施形態では、心臓ＥＣＭは、３０～２００μｍまたは５０～１５０μｍの厚さを有してもよい。

【0029】

一部の実施形態では、心臓ＥＣＭは、構造タンパク質フィブロネクチン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩＩ型、およびエラスチンを含み、また他の構造タンパク質もまた含んでもよい。一部の実施形態では、心臓ＥＣＭは、構造タンパク質コラーゲンＶ型を含む。

【0030】

構造タンパク質に加えて、心臓ＥＣＭは、成長因子およびサイトカインなどのマトリクス細胞タンパク質だけでなく、他の物質も含んでもよい。心臓ＥＣＭ内に見出される場合がある他のタンパク質の非限定的な例としては、潜在型形質転換成長因子ベータ１（ＬＴＧＦＢ－１）、潜在型形質転換成長因子ベータ２（ＬＴＧＦＢ－２）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、酸性でシステインに富む分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）、バーシカンコアタンパク質（ＶＣＡＮ）、ガレクチン１、ガレクチン３、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、硫酸化糖タンパク質１、タンパク質－リジン６－オキシダーゼ、およびビグリカンが挙げられる。一部の実施形態では、ＥＣＭは、任意選択で、形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦＢ－１）、形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦＢ－３）、上皮成長因子様タンパク質８、成長／分化因子６、グラニュリン、ガレクチン３結合タンパク質、ナイドジェン１、ナイドジェン２、デコリン、プロラルギン、血管内皮成長因子Ｄ（ＶＥＧＦ－Ｄ）、フォン・ヴィレブランド因子Ａ１、フォン・ヴィレブランド因子Ａ５ Ａ、マトリクスメタルプロテアーゼ１４、マトリクスメタルプロテアーゼ２３、血小板因子４、プロトロンビン、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１１、およびグリア由来ネキシンのうちの１つ以上を含んでもよい。

【0031】

特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、分泌された心臓細胞外マトリクスをエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と接触させることをさらに含み、それによって心臓細胞外マトリクスは、表面から取り外され、浮遊性のバイオスキャフォールドを形成する。

【0032】

一部の実施形態では、ＥＣＭから作製されたバイオスキャフォールドは、２０～５００μｍの厚さを有する。一部の実施形態では、バイオスキャフォールドは、３０～２００μｍまたは５０～１５０μｍの厚さ範囲を有する。

【0033】

一部の実施形態では、ＥＣＭは、注入可能な製剤として製剤化される。例えば、ＥＣＭは、凍結乾燥され、そして薬学的なビーズミルを使用して、懸濁液として注射のために好適な特定の粒子サイズへと製粉される（図６）。他の実施例では、ＥＣＭは、フラッシュ凍結および製粉によって注射用に製剤化することができる。

【0034】

一部の実施形態では、心臓ＥＣＭは、ＥＣＭからあらゆる残りの心臓線維芽細胞を除去するために脱細胞化される。任意の脱細胞化剤を使用して、心臓ＥＣＭを脱細胞化してもよい。当技術分野で知られている脱細胞化剤の非限定的な例としては、トリプシン、エンドヌクレアーゼ、またはエクソヌクレアーゼなどの酵素剤；アルカリ溶液または酸溶液、高張性または高張性溶液、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、水酸化アンモニウム、および過酢酸などの化学物質：オクチルフェノールエチレンオキシド（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）－Ｘ １００）などの非イオン性界面活性剤：ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびポリエーテルスルホン酸ナトリウム（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）－Ｘ ２００）などのイオン性界面活性剤：および３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、スルホベタイン－１０および－１６、ならびにトリ（ｎ－ブチル）リン酸塩などの両性イオン性界面活性剤、が挙げられる。

【0035】

一実施形態では、脱細胞化は、心臓ＥＣＭを過酢酸（ＰＡＡ）と接触させ、そしてその後、心臓細胞外マトリクスを水でゆすぐことによって実施される。一実施形態では、脱細胞化は、分泌した心臓細胞外マトリクスをトリ－Ｎ－ブチル－ホスフェート（ＴＮＢＰ）およびオクチルフェノールエチレンオキシド（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）と接触させ、そしてその後、心臓細胞外マトリクスを水でゆすぐことによって実施される。別の方法として、脱細胞化は、分泌した心臓細胞外マトリクスを水酸化アンモニウム（ＡＨ）およびオクチルフェノールエチレンオキシド（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）と接触させ、そしてその後、心臓細胞外マトリクスを水でゆすぐことによって実施される。

【0036】

一部の実施形態では、ＥＣＭまたはバイオスキャフォールドは、心臓疾患または傷害に対して治療的である１つ以上の細胞を用いる当技術分野で知られている方法を使用して播種されてもよい。播種のために使用することが可能である治療的な細胞タイプの例としては、骨格筋芽細胞、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、多能性成体生殖系列幹細胞（ｍａＧＣＳ）、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）、極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬ細胞）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、心臓形成細胞（ＣＰＣ）、カーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）、多能性Ｉｓ／１＋心臓血管前駆細胞（ＭＩＣＰ）、心外膜由来前駆細胞（ＥＰＤＣ）、脂肪由来幹細胞、ヒト間葉系幹細胞（ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する）、ヒト間葉系間質細胞（ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する）骨格筋芽細胞、エクソソーム、またはその組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。

【0037】

一部の実施形態では、ＥＣＭまたはバイオスキャフォールドは、サイトカインおよび成長因子を含む生物活性タンパク質を結合する。一部の実施形態では、ＥＣＭまたはバイオスキャフォールドは、サイトカインまたは成長因子などの生物活性タンパク質を用いて播種されてもよい。一部の実施形態では、ＥＣＭまたはバイオスキャフォールドは、骨髄由来成長因子（ＭＹＤＧＦ）を用いて播種されてもよい。播種されたＥＣＭまたはバイオスキャフォールドは、生物活性タンパク質を心臓またはその他の組織へと送達し、かつ局所的な組織濃度を増加するために使用されてもよい。

【0038】

一部の実施形態では、ＥＣＭまたはバイオスキャフォールドは、遺伝子送達のために使用されてもよい。例えば、ＥＣＭまたはバイオスキャフォールドは、治療法として組織に送達するためにＲＮＡプラスミドまたはＤＮＡプラスミドを用いて播種されてもよい。

【0039】

一部の実施形態では、ＥＣＭまたはバイオスキャフォールドは、それ自体が治療薬として使用される。例えば、ＥＣＭまたはバイオスキャフォールドは、心臓機能を改善し、かつ／または有害な再形成を低減するために心臓組織へと送達される。

【0040】

本開示に従って利用される場合、別段の指示がない限り、すべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有すると理解されるべきである。文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0041】

本開示を限定することなく、本開示のいくつかの実施形態を、例示の目的で以下に記述する。

【実施例】

【0042】

以下の実施例は、本開示の具体的な実施形態、およびその様々な使用の例示である。これらは説明的な目的でのみ記載され、またいかなるやり方でも本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0043】

実施例１：ＳＵＳＤ２^高およびＳＵＳＤ２^低心臓線維芽細胞由来細胞外マトリクス
材料および方法
ヒト心臓線維芽細胞の単離および培養。健康であると考えられたが、移植のためには合致しなかったドナーヒト心臓（ｎ＝６、３人の男性、３人の助成）を得た。採取時に、心臓を無菌的に切除し、灌流し、そして冷たい心停止液に保存し、そして氷上で輸送した。心臓は、移植の４～６時間後に処理された。心外膜脂肪を除去し、そしておよそ２０～３０ｇの左心室の自由壁を刻み、そして４つのｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ、ベルギッシュ・グラードバッハ）の中へと移した。ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州、コーニング）および１．２５ｍｇのＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、スイス、バーゼル）を含有する１０ｍｌの消化培地を各チューブに添加した。試料をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ、ベルギッシュ・グラードバッハ）で均質化し、３７℃にて３０分間、一定の撹拌でインキュベートし、そしてプロセスを合計１時間の組織解離で繰り返した。心臓試料を２００μｍフィルタを通して篩分けし、次いで１０００×ｇで２０分間遠心分離した。細胞ペレットを、２０ｍｌの完全培地（１０％のＦＢＳ、１ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、５μｇ／ｍｌインスリン、１０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン、および２．５ｍｇ／ｍｌアンホテリシンＢを含むＭＣＤＢ １３１）中に懸濁し、そして２つのＴ７５フラスコの中にプレーティングした。細胞を２時間付着させた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄することによって、非接着細胞を除去した。最終的に、完全培地を添加し、そして細胞を３７℃、５％のＣＯ２、および１００％の湿度で培養し、そしてそれらが約９０％コンフルエントになったら継代した。すべての手順を無菌条件下で行った。比較として、Ｌｏｎｚａカタログ番号ＣＣ－２５１１から３つの皮膚線維芽細胞系統（２つの雄、１つの雌）を購入し、製造業者のプロトコルに従って培養した。

【0044】

ヒト心臓線維芽細胞由来マトリクス産生。継代３～６におけるヒトＣＭＦを、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ピーク血清、コロラド州ウェリントン）および１０μｇ／ｍｌのシプロフロキサシン、２．５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを有する高グルコースＤＭＥＭ中に懸濁し、そして１．１×１０⁵～２．２×１０⁵細胞／ｃｍ²でプレーティングし、そして培地を２～３日ごとに交換して標準的な培養条件下で７～１０日間維持した。ＣＦを、３７℃にて２ｍＭのＥＤＴＡと接触させ、そして穏やかに撹拌することによって、連続的なシートとしてプレートから持ち上げて外した。結果として得られたシートを、低／高張性ＰＢＳ（それぞれ１５分）の４回の交互洗浄によって細胞をむき出しにし、続いて、低張性ＰＢＳ中の０．１％トリ－Ｎ－ブチル－ホスフェート、１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００中で、４℃にて７２時間、一定の穏やかな撹拌を用いてインキュベーションした。スキャフォールドをＰＢＳ、次いで１００％エタノール（×２）でゆすいだ。残留ＤＮＡを、１００Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ溶液を用いて３７℃にて２０時間インキュベーションし、続いて１００％エタノールリンス（×２）、ＰＢＳ（３×１５分）、および分子グレードの水（２時間）で除去した。スキャフォールドを、ＰＢＳ中で４℃にて保存した。

【0045】

フローサイトメトリーの特徴解析。ＣＦおよびＣＭＦ継代０～４を８０％コンフルエンシーまで培養し、そして１×ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ－ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２５６３～０２９）を用いて持ち上げることによって収集した。フローサイトメトリー分析のためにＰＥ－ａｎｔｉ－ＳＵＳＤ２（クローンＷ３Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または精製された抗ＳＵＳＤ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン＃Ｗ５Ｃ５）について単一細胞懸濁液を染色した。心臓線維芽細胞を、ＳＵＳＤ２（ＳＵＳＤ２高（ＭＦＩ＞５００）およびＳＵＳＤ２低（ＭＦＩ＜５００））の発現に基づいてフローサイトメトリーを用いてソートした。すべてのゲーティングを、それらの未染色対照に基づいて行った。試料をＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ上で実行した。

【0046】

ＳＵＳＤ２－ＰＥソーティングは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ上で標準化された。未染色および染色対照に基づいて、ＳＵＳＤ２－ＰＥの感度を最適化した。次いで、レインボービーズを収集した（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＲＦＰ－３０－５Ａ）およびレインボービーズのＭＦＩを、今後の感受性の標的として使用した。連続実験では、レインボービーズを実行し、そして標的ＭＦＩに合うように電圧を調整した。これは、ゲート定置を標準化し、そしてＭＦＩを使用してＳＵＳＤ２－ＰＥの発現レベルを試料ごとに、および実行ごとに比較し、実行することを可能にする。

【0047】

マトリクス産生のＳＵＳＤ２免疫蛍光撮像。ＣＦ、ＣＭＦ、およびＤＦ（ウェル当たり細胞１００，０００個）をフィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲート化ＳＵＳＤ２一次抗体（クローンＷ３Ｃ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて染色した。細胞を洗浄し、そしてさらに１％ ＰＦＡ（ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒド溶液、ＣｈｅｍＣｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ－２８１，６９２）を用いて室温にて３０分間さらに固定した。細胞を、ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて室温にて１０分間透過処理し、次いで３％ＢＳＡ溶液を用いて２０分間ブロックした。細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートビメンチン（カタログ番号ＩＣ２１０５Ｇ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて一晩、４℃にてさらに再染色した。細胞を１× ＰＢＳでゆすいだ。洗浄した細胞を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（１０μｇ／ｍｌ）を用いて短時間処理し、そして１×のＰＢＳで洗浄した。染色した細胞をＥＶＯＳ顕微鏡を用いて撮像し、また２０×対物レンズおよび４０×対物レンズを使用して画像を取得した。

【0048】

サイトカインセクレトーム解析。ＳＵＳＤ２高／低細胞集団間の差異を試験するために、ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘアッセイを使用してサイトカインセクレトーム分析を行った。アッセイは、蛍光色素でタグ付けされた抗体ビーズを使用して、分泌したサイトカインを検出した。心臓線維芽細胞／筋線維芽細胞を、次いでＳＵＳＤ２ ＭＦＩ発現（低＜５００ＭＦＩ、高＞５００ＭＦＩ）に基づいてソートし、等しい数のＳＵＳＤ２高／低細胞をプレーティングし、そして標準的な培養条件下で３日間培養した。培地をサンプリングし、そして複数のサイトカインについて分析した。

【0049】

結果
図１で実証されるように、ＳＵＳＤ２は、心臓線維芽細胞由来細胞外マトリクス産生のマーカーとして使用することができる。ヒト心臓線維芽細胞株をＳＵＳＤ２について染色した。９８．８％の細胞はＳＵＳＤ２を発現し、細胞をＳＵＳＤ２高（ＭＦＩ＞５００）およびＳＵＳＤ２低（ＭＦＩ＜５００）へとソートし、そして高密度（すなわち１００，０００～５００，０００細胞／ｃｍ²）でプレーティングし、そして１０日間培養した。ＳＵＳＤ２高心臓線維芽細胞は、損傷がない心臓線維芽細胞由来細胞外マトリクスを産生し、一方でＳＵＳＤ２低細胞は、損傷がないマトリクスを産生しなかった。結果は、ＳＵＳＤ２が心臓線維芽細胞マトリクス能力のマーカーであることを表示した。

【0050】

図３で実証されるように、ＳＵＳＤ２低集団およびＳＵＳＤ２高集団の両方は、培養後に高いレベルの純度を維持した。心臓線維芽細胞を、それらのＳＵＳＤ２の発現に基づいてフローサイトメトリーを用いてソートした。ＳＵＳＤ低集団およびＳＵＳＤ２高集団をプレーティングし、そして標準的な条件下（３７℃、５％のＣＯ₂、および１００％の湿度）で７日間培養した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーによってＳＵＳＤ２発現について分析した。７日後、ＳＵＳＤ２低にソートされた細胞の８３．４％は、ＭＦＩに基づいて低いＳＵＳＤ２発現表現型を維持し、一方でＳＵＳＤ２高にソートされた細胞の９３．８％は、ＭＦＩに基づいて高いＳＵＳＤ２発現表現型を維持した。

【0051】

図４は、ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘアッセイを使用して行ったサイトカインセクレトーム分析に対する、ＳＵＳＤ２高／低細胞集団間の差異を実証する。このアッセイは、蛍光色素でタグ付けされた抗体ビーズを使用して、分泌したサイトカインを検出した。心臓線維芽細胞／筋線維芽細胞を、ＳＵＳＤ２ ＭＦＩ発現（低＜５００ＭＦＩ、高＞５００ＭＦＩ）に基づいてソートし、等しい数のＳＵＳＤ２高／低細胞をプレーティングし、そして標準的な培養条件下で３日間培養した。培地をサンプリングし、そして複数の検体（サイトカイン）について分析した。いくつかのサイトカインで有意な差異が検出された。上記のグラフは、ＳＵＳＤ２高／低細胞集団が、非常に異なるセクレトームプロファイルを有することを実証し、これらの細胞集団が明らかに異なることをさらに表示する。

【0052】

当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記述される特定の実施形態に対する数多くの均等物を認識する、または確認することができるであろう。本明細書に記述される本実施形態の範囲は、上記の記述に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。当業者であれば、以下の特許請求の範囲に定義されるように、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、本明細書に対する様々な変更および修正を行うことができることを理解するであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】