特表 2024-531681 ＬｙｓＥ変異体及びそれを用いたＬ－アルギニン生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】ＬｙｓＥ変異体及びそれを用いたＬ－アルギニン生産方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/34 20060101AFI20240822BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240822BHJP

   C12P 13/10 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240822BHJP

【ＦＩ】

C07K14/34 ZNA

C12N1/21

C12P13/10 B

C12N15/31

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515816

(86)(22)【出願日】2022-10-26

(85)【翻訳文提出日】2024-03-11

(86)【国際出願番号】 KR2022016438

(87)【国際公開番号】W WO2023075397

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】10-2021-0143660

(32)【優先日】2021-10-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513178894

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100130373

【弁理士】

【氏名又は名称】椎名 佳代

(72)【発明者】

【氏名】キム、ヒョ ギョン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ジウォン

(72)【発明者】

【氏名】チェ、ソン ヒョン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AE24

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA10

4B065AA01X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA17

4B065CA41

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA11

4H045EA01

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本出願は、ＬｙｓＥ変異体を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１の５０番目、１５３番目及び２１５番目の位置に対応するアミノ酸中のいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、ＬｙｓＥ変異体。

【請求項2】

前記ＬｙｓＥ変異体は、コリネバクテリウム属由来である、請求項１に記載のＬｙｓＥ変異体。

【請求項3】

前記５０番目の位置に対応するアミノ酸は、非極性アミノ酸で置換された、請求項１に記載のＬｙｓＥ変異体。

【請求項4】

前記１５３番目または２１５番目の位置に対応するアミノ酸は、極性アミノ酸で置換された、請求項１に記載の変異体。

【請求項5】

前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で５０番目、１５３番目及び２１５番目のアミノ酸残基のいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、請求項１に記載のＬｙｓＥ変異体。

【請求項6】

前記ＬｙｓＥ変異体は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有するものである、請求項１に記載のＬｙｓＥ変異体。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項8】

配列番号１の５０番目、１５３番目及び２１５番目の位置に対応するアミノ酸中のいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＬｙｓＥ変異体または前記ＬｙｓＥ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、コリネバクテリウム属微生物。

【請求項9】

前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項８に記載の微生物。

【請求項10】

配列番号１の５０番目、１５３番目及び２１５番目の位置に対応するアミノ酸中のいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、ＬｙｓＥ変異体または前記ＬｙｓＥ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物を培養する段階を含む、Ｌ－アルギニンの生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、ＬｙｓＥ変異体、それを含むコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたＬ－アルギニン生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－アルギニン（Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ）は、肝機能促進剤、脳機能促進剤、総合アミノ酸製剤などの医薬用として用いられており、かまぼこ添加剤、健康飲料添加剤、高血圧患者の食塩代替用などの食品用としても最近脚光を浴びている物質である。

【0003】

産業的に利用可能な高濃度のＬ－アルギニンを生産するために、微生物を利用しようとする研究が持続的に行われており、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）の生産菌株であるブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物から誘導された変異株を利用する方法、細胞融合で生育改善されたアミノ酸生産菌株を利用する方法などが報告された。

【0004】

一方、リシンエクスポーターであるコリネバクテリウム属微生物のｌｙｓＥ（ｌｙｓｉｎｅ ｅｘｐｏｔｅｒ）がＬ－アルギニンも排出することが報告されているが（Ｂｅｌｌｍａｎｎ Ａ、ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４７：１７６５－１７７４，２００１）、Ｌ－アルギニン生産をさらに増加させるための研究が要求されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００２－００４５２２３号明細書

【特許文献2】米国特許第７６６２９４３号明細書

【特許文献3】米国特許第１０５８４３３８号明細書

【特許文献4】米国特許第１０２７３４９１号明細書

【特許文献5】大韓民国公開番号第１０－２０２０－０１３６８１３号明細書

【特許文献6】米国特許第８０３４６０２号明細書

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｂｅｌｌｍａｎｎ Ａ、ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４７：１７６５－１７７４，２００１

【非特許文献2】Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５］：２４４４

【非特許文献3】Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７

【非特許文献4】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３

【非特許文献5】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７ （１９８４）

【非特許文献6】Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３ （１９９０）

【非特許文献7】Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４

【非特許文献8】［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴ ＡＬ．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３

【非特許文献9】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２

【非特許文献10】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８ （１９７９）

【非特許文献11】Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９

【非特許文献12】Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８

【非特許文献13】Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２Ｄｅｃ；１８４（２３）：６６０２－１４．

【非特許文献14】Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３

【非特許文献15】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２

【非特許文献16】Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１） １９８６

【非特許文献17】Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０，Ｖｏｌ．２．１－１６

【非特許文献18】“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ” ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１）

【非特許文献19】ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本出願は、ＬｙｓＥ変異体を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本出願の目的は、配列番号１の５０番目、１５３番目及び２１５番目の位置に対応するアミノ酸中のいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、ＬｙｓＥ変異体を提供することにある。

【0009】

本出願の他の目的は、本出願のＬｙｓＥ変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。

【0010】

本出願のもう一つの目的は、本出願のＬｙｓＥ変異体またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を提供することにある。

【0011】

本出願のもう一つの目的は、本出願の微生物を培養する段階を含むＬ－アルギニンの生産方法を提供することにある。

【発明の効果】

【0012】

本出願の変異体を利用して微生物のＬ－アルギニン生産収率を増加させることができる。

【発明を実施するための形態】

【0013】

これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本出願で開示された様々な要素の全ての組合が本出願の範疇に属する。また、以下に記載される具体的な記述により本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。また、本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として組み込まれ、本出願が属する技術分野の水準及び本出願の内容がより明確に説明される。

【0014】

本出願の一態様は、配列番号１の５０番目、１５３番目及び２１５番目の位置に対応するアミノ酸中のいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、ＬｙｓＥ変異体を提供する。

【0015】

本出願において「ＬｙｓＥ」は、ｌｙｓＥ遺伝子によりコードされるリシンエクスポーター（Ｌｙｓｉｎｅ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）タンパク質を意味する。

【0016】

具体的には、前記ＬｙｓＥは、天然に発生するポリペプチドまたは野生型ポリペプチドであってもよく、その成熟ポリペプチドであってもよく、その変異体または機能的断片を含んでもよいが、本出願のＬｙｓＥ変異体の母体（ｐａｒｅｎｔ）となることができる限り、制限なく含まれる。

【0017】

本出願のＬｙｓＥは、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋからその配列を得ることができる。

【0018】

一つの具現例として、本出願のＬｙｓＥは、コリネバクテリウム属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来であってもよい。その例として、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・スラナレアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・パカエンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｃａｅｎｓｅ）由来であってもよいが、これに制限されない。

【0019】

一つの具現例として、本出願のＬｙｓＥは、配列番号１のポリペプチドであってもよい。一つの具現例として、本出願のＬｙｓＥは、配列番号１のポリペプチドと約６０％以上の配列同一性を有するポリペプチドであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一もしくは相当する活性を有する場合であれば、制限なくＬｙｓＥタンパク質に含まれる。

【0020】

例えば、前記ＬｙｓＥは、配列番号１と少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％．８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％または９９．５％以上の同一性を有するコリネバクテリウム属由来のタンパク質であってもよい。その例として、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿００３８５４７３４．１、Ｐ９４６３３．２、ＷＰ＿０４０９６７３３２．１、ＷＰ＿０７４４９４０３４．１、ＷＰ＿０３８５８３７４２．１、ＷＰ＿０７４５０６１０７．１、ＷＰ＿０１５４３９４６７．１、ＷＰ＿２２０３１３７５９．１、ＷＰ＿０７７３１１９１７．１、ＷＰ＿１７２７６８５１４．１、ＷＰ＿０９６４５５５５９．１、ＷＰ＿０１５６５１０４５．１、ＷＰ＿０５３５４４６９９．１、ＷＰ＿０６６５６５３１６．１、ＮＬＺ５７４８７．１、Ｑ８ＲＱＭ４．２、ＢＡＣ１８１６７．１、ＷＰ＿００６７６９３２１．１、ＷＰ＿１９１７３３７５７．１、ＷＰ＿０８０７９５２８６．１、ＷＰ＿１９７０８８４４９．１、ＷＰ＿０４７２５２９０３．１、ＷＰ＿２２１７０９７３８．１、ＷＰ＿１２３０４８２９０．１、ＷＰ＿０４２６２１２７０．１などのタンパク質が挙げられるが、これに制限されない。

【0021】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、本出願のＬｙｓＥは、配列番号１で記載のアミノ酸配列を有するか、含むか、前記アミノ酸配列から必須で構成される（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよいが、同一の活性を有するポリペプチド／タンパク質は、制限なく含まれ得る。また、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド／タンパク質も、このような相同性または同一性を有し、Ｌ－リシン排出活性を示すポリペプチド／タンパク質であれば、本出願の変異の対象となるポリペプチド／タンパク質の範囲内に含まれることは自明である。

【0022】

本出願において用語、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似の程度を意味し、百分率で表すことができる。用語の相同性及び同一性はしばしば互換的に使用することができる。

【0023】

保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準的な配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティを共に使用することができる。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列の全体または一部分と中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイゼーションすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドにおける一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。

【0024】

任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定することができる。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７ （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３ （１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴ ＡＬ．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベース センターのＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを利用して相同性、類似性または同一性を決定することができる。

【0025】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ （１９８１）２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含む）及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８ （１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ （ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。

【0026】

本出願において用語、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、一つ以上のアミノ酸が保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び／又は変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）され、前記変異体の変異前のアミノ酸配列と異なるが、機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）または特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持されるポリペプチドを指す。このような変異体は、一般に、前記ポリペプチドのアミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸を変形し、前記変形ポリペプチドの特性を評価して同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）されてもよい。即ち、変異体の能力は、変異前のポリペプチドに比べて増加したり、変化しないか、または減少することができる。また、一部の変異体は、Ｎ－末端リーダー配列または膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）などの一つ以上の部分が除去された変異体を含んでもよい。他の変異体は、成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ－及び／又はＣ－末端から一部分が除去された変異体を含んでもよい。前記用語「変異体」は、変異型、変形、変異型ポリペプチド、変異タンパク質、変異及び変異体などの用語（英文表現ではｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｍｕｔａｎｔ，ｍｕｔｅｉｎ，ｄｉｖｅｒｇｅｎｔなど）を混用することができ、変異された意味で使用される用語であれば、これに制限されない。

【0027】

また、変異体は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含み得る。例えば、変異体のＮ－末端には、翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）タンパク質の移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に関与するシグナル（またはリーダー）配列がコンジュゲートされてもよい。また、前記変異体は、確認、精製、または合成可能に、他の配列またはリンカーとコンジュゲートされてもよい。

【0028】

本出願で提供するＬｙｓＥ変異体は、配列番号１の５０番目、１５３番目及び２１５番目の位置に対応するアミノ酸中のいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。

【0029】

一例として、本出願のＬｙｓＥ変異体は、リシン排出活性を有する任意のポリペプチドまたはタンパク質において、配列番号１のＮ－末端から５０番目、１５３番目及び２１５番目の位置に対応するアミノ酸中のいずれか一つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸での置換を含む変異体であってもよい。

【0030】

前記「他のアミノ酸」は、置換前のアミノ酸と異なるアミノ酸であれば限定されない。一方、本出願において「特定アミノ酸が置換された」と表現する場合、他のアミノ酸で置換されたと特に表記しなくても、置換前のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換されることは自明である。

【0031】

一つの具現例として、本出願の変異体は、比較（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）タンパク質である配列番号１のアミノ酸配列において５０番目の位置に対応するアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸であるか／であり、１５３番目の位置に対応するアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸であるか／であり、２１５番目の位置に対応するアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸であってもよい。

【0032】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、前記変異体において配列番号１の５０番目の位置に対応するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ヒスチジン及びアルギニンから選択されるものであってもよい。その例として、前記変異体の配列番号１の５０番目の位置に対応するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン及びプロリンから選択される非極性アミノ酸（ｎｏｎｐｏｌａｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）であってもよい。その例として、前記変異体の配列番号１の５０番目の位置に対応するアミノ酸は、バリン、ロイシン及びイソロイシンから選択される分岐鎖アミノ酸（ｂｒａｎｃｈｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）であってもよいが、これに制限されない。

【0033】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、前記変異体において配列番号１の１５３番目の位置に対応するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ヒスチジン及びアルギニンから選択されるものであってもよい。その例として、前記変異体の配列番号１の１５３番目の位置に対応するアミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、チロシン及びグルタミンから選択される極性アミノ酸（ｐｏｌａｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）であってもよい。その例として、前記変異体の配列番号１の１５３番目の位置に対応するアミノ酸は、セリン、スレオニンまたはグルタミンであってもよいが、これに制限されない。

【0034】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、前記変異体において配列番号１の２１５番目の位置に対応するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ヒスチジン及びアルギニンから選択されるものであってもよい。その例として、前記変異体の配列番号１の２１５番目の位置に対応するアミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、チロシン及びグルタミンから選択される極性アミノ酸（ｐｏｌａｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）であってもよい。その例として、前記変異体の配列番号１の１５３番目の位置に対応するアミノ酸は、セリン、スレオニンまたはグルタミンであってもよいが、これに制限されない。

【0035】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において５０番目、１５３番目及び２１５番目のアミノ酸残基のいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよい。前述した具現例のいずれか一つの具現例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において５０番目、１５３番目及び２１５番目のアミノ酸残基のいずれか一つのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよい。前記配列番号１のアミノ酸配列において５０番目、１５３番目または２１５番目のアミノ酸残基の置換後のアミノ酸は、上述の配列番号１のアミノ酸配列において５０番目、１５３番目または２１５番目の位置に対応するアミノ酸残基の置換後のアミノ酸と同様である。

【0036】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において５０番目、１５３番目及び２１５番目のアミノ酸残基のいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％．８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％以上、１００％未満の同一性を有することができる。

【0037】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、本出願の変異体は、配列番号２７～３５から選択されるアミノ酸配列からなるか、それと少なくとも６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％．８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．５％、９９．８％以上または１００％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を有するか、含むか、前記アミノ酸配列から必須で構成される（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよいが、これに制限されない。

【0038】

また、そのような相同性または同一性を有し、本出願の変異体に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願の範囲内に含まれることは自明である。

【0039】

例えば、前記アミノ酸配列のＮ－末端、Ｃ－末端及び／または内部に本出願の変異体の機能を変更しない配列の追加または欠失、自然に起こり得る突然変異、潜在性突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または保存的置換を有する場合である。

【0040】

前記「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、あるアミノ酸を類似の構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸で置換させることを意味する。そのようなアミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて起こり得る。通常、保存的置換はタンパク質またはポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないか、または影響を及ぼさなくてもよい。

【0041】

本出願において、用語「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」とは、ポリペプチドで列挙される位置のアミノ酸残基であるか、またはポリペプチドで列挙される残基と類似または同一または相同のアミノ酸残基を指す。対応する位置のアミノ酸を確認することは、特定の配列を参照する配列の特定のアミノ酸を決定することであってもよい。本出願で使用される「対応する領域」は、一般に、関連タンパク質または比較（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）タンパク質における類似または対応する位置を指す。

【0042】

例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１と整列（ａｌｉｇｎ）させ、これに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基と対応するアミノ酸残基の数字の位置を参照して番号付けすることができる。例えば、本出願に記載されているような配列整列アルゴリズムは、クエリシーケンス（「参照配列」ともいう）に比べてアミノ酸の位置、または置換、挿入または欠失などの変形が発生する位置を確認することができる。

【0043】

このような整列には、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）などを用いることができるが、これに制限されず、当業界に知られている配列整列プログラム、ペアワイズ配列（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。

【0044】

本出願のもう一つの態様は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0045】

本出願において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）であり、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を意味する。

【0046】

本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）またはタンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、アミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われ得る。

【0047】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、本出願のポリヌクレオチドは、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのｌｙｓＥ配列から得ることができる。

【0048】

具体的には、本出願のＬｙｓＥタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２の配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である塩基配列を有するか、含むか、もしくは配列番号２の配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列からなるか、または必須に構成されてもよいが、これらに制限されない。このとき、前記相同性または同一性を有する配列において、配列番号１の５０番目の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、フェニルアラニン以外のアミノ酸をコードするコドンのうちの一つであってもよく／あるか、１５３番目の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンのうちの一つであってもよく／あるか、２１５番目の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドン（例えば、配列番号３６～３８）のうちの一つであってもよいが、これに制限されない。

【0049】

また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から製造することができるプローブ、例えば、本出願のポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列であれば、制限なく含まれる。前記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションし、それより相同性または同一性の低いポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的に２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。

【0050】

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、二つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いにハイブリダイゼーション可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願のポリヌクレオチドは、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含み得る。

【0051】

具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、上述の条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節することができる。

【0052】

前記ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性程度に依存し、変数は当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 同上）。

【0053】

本出願のもう一つの態様は、ＬｙｓＥ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。前記ＬｙｓＥ変異体及びそれをコードするポリヌクレオチドについては、前述の通りである。

【0054】

一つの具現例として、前記ベクターは、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるための発現ベクターであってもよいが、これに制限されない。

【0055】

本出願の「ベクター」は、適切な宿主内で目的ポリペプチドを発現させることができるように、適切な発現調節領域（または発現調節配列）に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物を含み得る。前記発現調節領域は、転写を開始し得るプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含み得る。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質変換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノム自体に統合することができる。

【0056】

本出願で使用されるベクターは、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

【0057】

一例として、細胞内における染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われ得るが、これらに限定されない。前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、ベクターで形質変換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーを使用することができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または他の表現形質を示すため、形質変換された細胞を選別することができる。

【0058】

本出願における用語「形質変換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞または微生物内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質変換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体外に位置するかに関係なく、それらの全部を含み得る。また、前記ポリヌクレオチドは、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態でも導入することができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位、及び翻訳終結信号を含み得る。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。

【0059】

また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。

【0060】

本出願のもう一つの態様は、ＬｙｓＥ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を提供する。前記ＬｙｓＥ変異体及びそれをコードするポリヌクレオチドについては、前述の通りである。

【0061】

本出願の微生物は、本出願のＬｙｓＥ変異体、それをコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含むことができる。

【0062】

本出願において、用語、「微生物（または、菌株）」とは、野生型微生物や天然または人為的に遺伝的変形が生じた微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり、または内在的遺伝子の活性が強化されたり、不活性化されるなどの原因により、特定の機構が弱化または強化された微生物であり、所望のポリペプチド、タンパク質または産物の生産のために遺伝的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む微生物であってもよい。

【0063】

本出願の微生物は、本出願の変異体、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチド及び本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含む微生物；本出願の変異体または本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを発現するように変形された微生物；本出願の変異体、または本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを発現する微生物（例えば、組換え菌株）；または本出願の変異体活性を有する微生物（例えば、組換え菌株）であってもよいが、これに制限されない。

【0064】

本出願の微生物は、Ｌ－アルギニン排出能及び／又は生産能を有し得る。

【0065】

本出願の微生物は、天然にＬｙｓＥタンパク質を発現するか、またはアルギニン排出能及び／又は生産能を有している微生物；またはＬｙｓＥタンパク質またはアルギニン排出能及び／又は生産能のない親株に、本出願の変異体またはそれをコードするポリヌクレオチド（または前記ポリヌクレオチドを含むベクター）が導入されるか、及び／又はアルギニン排出能及び／又は生産能が与えられた微生物であってもよいが、これに制限されない。一例として、本出願の微生物は、本出願のＬｙｓＥ変異体が導入され、Ｌ－アルギニン排出能及び／又は生産能が増加した微生物であってもよい。しかし、これに制限されない。

【0066】

一例として、本出願の菌株は、本出願のポリヌクレオチドまたは本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質変換され、本出願の変異体を発現する細胞または微生物であり、本出願の目的上、本出願の菌株は、本出願の変異体を含みＬ－アルギニンを排出または生産することができる全ての微生物を含み得る。例えば、本出願の菌株は、天然の野生型微生物、またはＬ－アルギニンを生産する微生物に本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドが導入されることによりＬｙｓＥ変異体が発現され、Ｌ－アルギニン排出能及び／又は生産能が増加した組換え菌株であってもよい。前記Ｌ－アルギニン排出能及び／又は生産能が増加した組換え菌株は、天然の野生型微生物またはＬｙｓＥ非変形微生物（即ち、野生型ＬｙｓＥ（配列番号１）を発現する微生物；または変異型ＬｙｓＥタンパク質を発現しない微生物）に比べてＬ－アルギニン排出能及び／又は生産能が増加した微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0067】

本出願において用語、「非変形微生物」とは、微生物に自然に生じ得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株または天然型菌株自体であるか、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質変化する前の菌株を意味する。例えば、前記非変形微生物は、本明細書に記載のＬｙｓＥ変異体が導入されないか、または導入される前の菌株を意味する。前記「非変形微生物」は「変形前の菌株」、「変形前の微生物」、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」または「基準微生物」と混用され得る。

【0068】

一つの具現例として、本出願の微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよい。例えば、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・スタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよい。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよいが、これに制限されない。

【0069】

本出願のＬ－アルギニンを排出及び／又は生産する微生物は、本明細書で開示したＬｙｓＥ変異体を含み、目的とするＬ－アルギニンの生産能及び／又は排出能が増加したことを特徴とすることができる。

【0070】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、本出願においてＬ－アルギニンを生産及び／又は排出する微生物またはＬ－アルギニンを生産及び／又は排出能を有する微生物は、Ｌ－アルギニン生合成経路内の遺伝子の一部が強化または弱化されたり、またはＬ－アルギニン分解経路内の遺伝子の一部が強化または弱化された微生物であってもよい。

【0071】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、前記微生物は、Ｌ－アルギニン生合成経路内遺伝子の遺伝子の一部が強化または弱化された微生物であってもよい。Ｌ－アルギニン生合成酵素の例には、Ｎ－アセチルグルタミルホスフェートレダクターゼ（ａｒｇＣ）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＪ）、Ｎ－アセチルグルタメートキナーゼ（ａｒｇＢ）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（ａｒｇＤ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ａｒｇＦ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ａｒｇＧ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇＨ）、及びカルバモイルホスフェートシンテターゼ（ｃａｒＡＢ）を含む。Ａｒｇオペロン（ａｒｇＣＪＢＤＦＲＧＨ）上に存在するアルギニン生合成酵素は、ａｒｇＲによりコードされたアルギニンリプレッサーにより調節することができる（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２Ｄｅｃ；１８４（２３）：６６０２－１４．）。したがって、アルギニンリプレッサー（ａｒｇＲ）の欠損または弱化（ＵＳ２００２－００４５２２３）及び／又は前記生合成関連の遺伝子の一つ以上の遺伝子を過剰発現させることにより、Ｌ－アルギニン生産能力を付与または増進させることができる。例えば、前記アルギニンリプレッサーは、配列番号３９のアミノ酸配列で表示されるポリペプチドであってもよいが、これに制限されない。

【0072】

本出願における用語、ポリペプチド活性の「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少したりまたは活性がないことを全て含む概念である。前記弱化は、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、下方制御（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、低下（ｒｅｄｕｃｅ）、減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）などの用語と混用され得る。

【0073】

前記弱化は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などにより、ポリペプチド自体の活性が本来微生物が有しているポリペプチドの活性に比べて減少または除去された場合、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害またはポリペプチドへの翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）阻害などにより細胞内で全体的なポリペプチド活性程度及び／又は濃度（発現量）が天然型菌株に比べて低い場合、前記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び／又はポリヌクレオチドの発現にもかかわらず、ポリペプチドの活性がない場合も含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化した場合、形質変化前の親株、野生型または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方制御、低下、減衰」するということは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性に比べて低下したことを意味する。

【0074】

そのようなポリペプチドの活性の弱化は、当業界に知られた任意の方法により行うことができるが、これらに制限されるものではなく、当該分野においてよく知られている様々な方法の適用により達成することができる（例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。

【0075】

具体的には、本出願のポリペプチドの弱化は、
１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように変形されたポリペプチドをコードするように、前記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／付加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に制限されるものではない。

【0076】

例えば、
前記１）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部または全体の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。

【0077】

また、前記２）発現調節領域（または発現調節配列）の変形は、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節領域（または発現調節配列）上の変異が発生、またはさらに弱い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。

【0078】

また、前記３）及び４）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を弱化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、またはそれらの組み合わせで、配列上の変異の発生、またはより弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列もしくは活性がないように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成させることにより、遺伝子の発現を阻害または弱化させることができるが、これに制限されない。

【0079】

また、前記５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより低い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換するものであってもよいが、これらに制限されない。

【0080】

前記６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入は、例えば、文献［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１） １９８６］を参照することができる。

【0081】

前記７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるために、ポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加はｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、または速度を低下させるものであってもよい。

【0082】

前記８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’の末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化するものであってもよい。

【0083】

本出願において用語、ポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上方制御（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方制御、過剰発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを全て含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する場合、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が、内在的活性に比べて「強化」、「上方制御」、「過剰発現」または「増加」するとは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。

【0084】

前記強化は、外来のポリペプチドを導入するか、または内在的なポリペプチドの活性強化及び／又は濃度（発現量）を通じて達成することができる。前記ポリペプチドの活性の強化有無は、当該ポリペプチドの活性度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。

【0085】

前記ポリペプチドの活性の強化は、当該分野においてよく知られた様々な方法の適用が可能であり、目的のポリペプチドの活性を変形前の微生物より強化させることができる限り、制限されない。具体的には、分子生物学の日常的な方法である当業界の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したものであってもよいが、これで制限されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０，Ｖｏｌ．２．１－１６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。

【0086】

具体的には、本出願のポリペプチドの強化は、
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化するように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化するように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、または化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に制限されるものではない。

【0087】

より具体的には、
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されるものであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに制限されない。前記ベクターは、前述の通りである。

【0088】

前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）を活性の強力な配列での交換は、例えば、前記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、またはこれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び解読の終結を調節する配列などを含み得る。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターと交換させることであってもよいが、これらに制限されない。

【0089】

公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（米国登録特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２）、Ｏ２プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これらに制限されない。

【0090】

前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これらに制限されない。

【0091】

前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、またはこれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列もしくは活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行うことができるが、これらに制限されない。このときに使用されるベクターは、染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、前述の通りである。

【0092】

前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内の導入であってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限はない。前記導入に用いられる方法は、公知の形質変換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりポリペプチドが生成し、その活性が増加され得る。

【0093】

前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。

【0094】

前記８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形または化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより、配列の類似性の程度にしたがって、鋳型タンパク質候補を決定し、それに基づいて構造を確認し、変形または化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。

【0095】

このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたポリペプチドの活性または濃度を基準にして増加するか、または当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加することであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0096】

本出願の微生物においてポリヌクレオチドの一部または全体の変形は、（ａ）微生物内の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ｅ．ｇ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を用いたゲノム編集及び／又は（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／又は化学物質処理により誘導されてもよいが、これらに制限されない。前記遺伝子の一部または全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法を含むことができる。例えば、目的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を起こさせるようにして、遺伝子の一部または全体の欠損がなされ得る。前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含んでもよいが、これらに制限されるものではない。

【0097】

本出願のもう一つの態様は、ＬｙｓＥ変異体またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培養する段階を含むＬ－アルギニン生産方法を提供する。

【0098】

前記ＬｙｓＥ変異体、それをコードするポリヌクレオチド及びそれを含む微生物、Ｌ－アルギニンについては、前述の通りである。

【0099】

本出願のＬ－アルギニン生産方法は、本明細書に記載のＬｙｓＥ変異体またはそれをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む微生物を培地で培養する段階を含んでもよい。

【0100】

本出願において、用語「培養」とは、本出願の微生物を適切に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び／又は流加式であってもよいが、これらに制限されるものではない。

【0101】

本出願において、用語「培地」とは、本出願の微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば、特別に制限なくいずれも使用できるが、本出願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。

【0102】

例えば、コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、文献［“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ” ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１）］で見ることができる。

【0103】

本出願において、前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物；マンニトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのようなアミノ酸などを含むことができる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（即ち、還元糖に転換された糖蜜）などのような炭水化物を使用することができ、その他の適正量の炭素源を制限なく多様に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。

【0104】

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などのような有機窒素源が使用され得る。これらの窒素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。

【0105】

前記リン源としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、またはそれに対応するナトリウム含有塩などが含まれ得る。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを使用することができ、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び／又は適切な前駆体などが含まれ得る。これらの構成成分または前駆体は、培地に回分式または連続式で添加され得る。しかし、これに限定されるものではない。

【0106】

また、本出願の微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方式で添加し、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中は脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができ、これに限定されるものではない。

【0107】

本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに限定されるものではない。

【0108】

本出願の培養により生成されたＬ－アルギニンは、培地中に分泌されるか、または細胞内に残存する。

【0109】

本出願のＬ－アルギニン生産方法は、例えば、前記培養する段階以前に、本出願の微生物を準備する段階、前記微生物を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組み合わせを、さらに含むことができる（順は無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）。

【0110】

本出願のＬ－アルギニン生産方法は、前記培養による培地（培養が行われた培地）または前記微生物からＬ－アルギニンを回収する段階をさらに含むことができる。前記回収する段階は、前記培養する段階の後にさらに含むことができる。

【0111】

前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を利用して所望のＬ－アルギニンを収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはそれらの方法を組み合わせて使用することができ、当該分野において公知となった適切な方法を用いて培地または微生物から所望のＬ－アルギニンを回収することができる。

【0112】

また、本出願のＬ－アルギニン生産方法は、さらに精製段階を含んでもよい。前記精製は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。一例として、本出願のＬ－アルギニン生産方法が回収段階と精製段階の両方を含む場合、前記回収段階と精製段階は、順序に関係なく連続的または非連続的に行われるか、または同時にまたは一つの段階に統合されて行うことができるが、これに制限されるものではない。

【0113】

本出願の方法において、ＬｙｓＥ変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物／菌株などは、前記他の様態で記載した通りである。

【0114】

本出願のもう一つの態様は、本出願のＬｙｓＥ変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または本出願のポリヌクレオチドを含む微生物；これを培養した培地；またはそれらの組み合わせを含むＬ－アルギニン生産用組成物を提供することである。

【0115】

本出願の組成物は、Ｌ－アルギニン生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含むことができ、そのような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0116】

本出願の組成物において、ＬｙｓＥ変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物／菌株、培地などは、前記他の様態で記載した通りである。

【0117】

本出願のもう一つの態様は、本出願のＬｙｓＥ変異体を発現するように微生物を変形する段階を含む、微生物のＬ－アルギニン排出能及び／又は生産能の増加方法または前記微生物にＬ－アルギニン排出能及び／又は生産能の付与方法を提供する。

【0118】

本出願の微生物のＬ－アルギニン生産能を増加させる方法において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物／菌株などは、前記他の様態で記載した通りである。

【0119】

前記微生物の変形方法は、ＬｙｓＥ変異体、それをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを微生物に導入する段階を含むことができる。しかし、これに制限されず、変形方法は、本明細書に開示の方法を含めて当業界において公知となった方法を制限なく使用することができる。

【0120】

本出願のもう一つの態様は、本出願のＬｙｓＥ変異体のＬ－アルギニン排出用途を提供する。

【0121】

本出願のもう一つの態様は、本出願のＬｙｓＥ変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含むベクター中の１つ以上を含む微生物のＬ－アルギニン生産用途を提供する。

【0122】

前記ＬｙｓＥ変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物については、前記他の様態で記載した通りである。

【0123】

以下、本出願を実施例及び実験例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例及び実験例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。

【0124】

実施例１．ＬｙｓＥの５０番目、１５３番目、２１５番目のアミノ酸残基が置換された多様な変異体の確保
本発明者らは、配列番号１の５０番目、１５３番目、２１５番目のアミノ酸残基がＬｙｓＥの活性に重要な位置であると判断し、当該アミノ酸残基が他のアミノ酸で置換された変異体を製作した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型として表１のプライマー対（配列番号３及び５、配列番号４及び６、配列番号３及び７、配列番号４及び８、配列番号３及び９、配列番号４及び１０、配列番号３及び１１、配列番号４及び１２、配列番号３及び１３、配列番号４及び１４、配列番号３及び１５、配列番号４及び１６、配列番号３及び１７、配列番号４及び１８、配列番号３及び１９、配列番号４及び２０、配列番号３及び２１、配列番号４及び２２）を利用したＰＣＲ及び配列番号３及び４のプライマー対を用いたオーバーラッピング（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ） ＰＣＲを行い、それぞれのＬｙｓＥ－Ｆ５０Ｌ、Ｆ５０Ｉ、Ｆ５０Ｖ、Ｎ１５３Ｓ、Ｎ１５３Ｔ、Ｎ１５３Ｑ、Ｎ２１５Ｔ、Ｎ２１５Ｓ、Ｎ２１５Ｑ変異配列を有する相同組換え断片を得た。その時、ＰＣＲ反応は、９５℃、３０秒変性；５５℃、３０秒アニーリング；及び７２℃、 １分伸張過程を３０回繰り返して行った。その後、コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なｐＤＣＭ２ （大韓民国公開番号第１０－２０２０－０１３６８１３号）ベクターとＰＣＲで増幅された前記断片を染色体導入用制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理した後、ＤＮＡ接合酵素を利用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質変換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。

【0125】

【表1】

【0126】

ＰＣＲを通じて前記所望の遺伝子が挿入されたプラスミドに形質変換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を利用してプラスミドを獲得し、そのプラスミドをそれぞれｐＤＣＭ２－ｌｙｓＥ（Ｆ５０Ｌ）、ｐＤＣＭ２－ｌｙｓＥ（Ｆ５０Ｉ）、ｐＤＣＭ２－ｌｙｓＥ（Ｆ５０Ｖ）、ｐＤＣＭ２－ｌｙｓＥ（Ｎ１５３Ｓ）、ｐＤＣＭ２－ｌｙｓＥ（Ｎ１５３Ｔ）、ｐＤＣＭ２－ｌｙｓＥ（Ｎ１５３Ｑ）、ｐＤＣＭ２－ｌｙｓＥ（Ｎ２１５Ｔ）、ｐＤＣＭ２－ｌｙｓＥ（Ｎ２１５Ｓ）、ｐＤＣＭ２－ｌｙｓＥ（Ｎ２１５Ｑ）と命名した。

【0127】

実施例２．コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ由来のＬｙｓＥ変異体導入菌株の製作及びＬ－アルギニン生産能の評価
Ｌ－アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（ＵＳ ８０３４６０２ Ｂ２）にＬｙｓＥ変異を導入するために、前記製作された組換えプラスミドを用いて形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。次いで、４％のスクロースを含む固体平板培地で２次組換えを行い、２次組換えが完了した形質転換株を対象にプライマー対（配列番号３及び４）を利用してＰＣＲを行って染色体上ＬｙｓＥ遺伝子にそれぞれの変異が導入されたことを確認した。その時、ＰＣＲ反応は９５℃、３０秒変性；５５℃、３０秒アニーリング；及び７２℃、１分伸張過程を３０回繰り返して行った。これから選別されたＬｙｓＥ変異体導入菌株をそれぞれＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－ｌｙｓＥ（Ｆ５０Ｌ）、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－ｌｙｓＥ（Ｆ５０Ｉ）、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－ｌｙｓＥ（Ｆ５０Ｖ）、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－ｌｙｓＥ（Ｎ１５３Ｓ）、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－ｌｙｓＥ（Ｎ１５３Ｔ）、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－ｌｙｓＥ（Ｎ１５３Ｑ）、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－ｌｙｓＥ（Ｎ２１５Ｔ）、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－ｌｙｓＥ（Ｎ２１５Ｓ）、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－ｌｙｓＥ（Ｎ２１５Ｑ）と命名した。

【0128】

前記ＬｙｓＥ変異体導入菌株のＬ－アルギニン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ菌株と共に以下の方法で培養した。

【0129】

下記種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐと前記製作されたＬｙｓＥ変異体菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。前記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。

【0130】

＜種培地（ｐＨ７．２）＞
ブドウ糖２０ｇ、硫酸アンモニウム４５ｇ、硫酸マグネシウム７水塩２ｇ、第一リン酸カリウム２ｇ、塩化アンモニウム１０ｇ、ビオチン０．０１ｍｇ、チアミン－ＨＣｌ ０．１ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、硫酸第１鉄１０ｍｇ、硫酸マンガン１０ｍｇ、硫酸亜鉛０．０２ｍｇ、硫酸銅０．５ｍｇ（蒸溜水１リットル基準）

【0131】

＜生産培地（ｐＨ７．２）＞
ブドウ糖６０ｇ、硫酸アンモニウム４５ｇ、硫酸マグネシウム７水塩２ｇ、第一リン酸カリウム２ｇ、塩化アンモニウム１０ｇ、ビオチン０．０１ｍｇ、チアミン－ＨＣｌ ０．１ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、硫酸第１鉄１０ｍｇ、硫酸マンガン１０ｍｇ、硫酸亜鉛０．０２ｍｇ、硫酸銅０．５ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）

【0132】

培養終了後、ＨＰＬＣ （Ｗａｔｅｒｓ ２４７８）によりＬ－アルギニンの生産能を測定した（表２）。

【0133】

【表2】

【0134】

その結果、前記ＬｙｓＥ変異体導入菌株の全てで親株に比べてＬ－アルギニン生産能が平均２０％増加することを確認した。

【0135】

実施例３．Ｌ－アルギニン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１Ｒ由来のＬｙｓＥ変異体導入菌株の製作及びＬ－アルギニン生産能の評価
Ｌ－アルギニンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株でも実施例２と同様な効果があるかを下記のように確認した。

【0136】

野生株（ＡＴＣＣ１３８６９）に１種の変異（ΔａｒｇＲ）を導入してＬ－アルギニン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を製作した。具体的には、前記遺伝子ａｒｇＲ（配列番号４０）の欠損のための組換えベクターを前記実施例１と同様の方法で製作し、ベクターの製作に用いられたプライマーは、表３の通りである。

【0137】

【表3】

【0138】

ＰＣＲを通じて前記目的の断片が挿入されたプラスミドに選別した後、そのプラスミドをｐＤＣＭ２－ΔａｒｇＲと命名した。ｐＤＣＭ２－ΔａｒｇＲを用いてコリネバクテリウム・グルタミカム野生株を前記実施例２と同様な方法で形質転換させ、形質転換株を対象にプライマー対（配列番号２３及び２６）を利用したＰＣＲを通じて染色体上でａｒｇＲが欠損した菌株を確認し、ＣＪ１Ｒと命名した。

【0139】

ＣＪ１Ｒに前記実施例２と同様な方法で９種のＬｙｓＥ変異体がそれぞれ導入された変異株を製作し、それぞれＣＪ１Ｒ－ｌｙｓＥ（Ｆ５０Ｌ）、ＣＪ１Ｒ－ｌｙｓＥ（Ｆ５０Ｉ）、ＣＪ１Ｒ－ｌｙｓＥ（Ｆ５０Ｖ）、ＣＪ１Ｒ－ｌｙｓＥ（Ｎ１５３Ｓ）、ＣＪ１Ｒ－ｌｙｓＥ（Ｎ１５３Ｔ）、ＣＪ１Ｒ－ｌｙｓＥ（Ｎ１５３Ｑ）、ＣＪ１Ｒ－ｌｙｓＥ（Ｎ２１５Ｔ）、ＣＪ１Ｒ－ｌｙｓＥ（Ｎ２１５Ｓ）、ＣＪ１Ｒ－ｌｙｓＥ（Ｎ２１５Ｑ）と命名した。

【0140】

ＣＪ１Ｒ由来のＬｙｓＥ変異体導入菌株のＬ－アルギニン生産能を分析するために、前記実施例２と同様の方法で培養し、培養終了後、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４７８）によりＬ－アルギニンの生産能を測定した（表４）。

【0141】

【表4】

【0142】

その結果、変異体ＬｙｓＥ導入菌株の全てで親株に比べてＬ－アルギニン生産能が平均１９％増加していることを確認した。

【0143】

以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

【0144】

【表5】

【配列表】

2024531681000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-03-11

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0034】

前述した具現例のいずれか一つの具現例として、前記変異体において配列番号１の２１５番目の位置に対応するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ヒスチジン及びアルギニンから選択されるものであってもよい。その例として、前記変異体の配列番号１の２１５番目の位置に対応するアミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、チロシン及びグルタミンから選択される極性アミノ酸（ｐｏｌａｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）であってもよい。その例として、前記変異体の配列番号１の２１５番目の位置に対応するアミノ酸は、セリン、スレオニンまたはグルタミンであってもよいが、これに制限されない。

【国際調査報告】