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特表2024-531706ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物
(51)【国際特許分類】
C12P 7/20 20060101AFI20240822BHJP
C12P 7/18 20060101ALI20240822BHJP
C12P 19/00 20060101ALI20240822BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240822BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240822BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
C12P7/20 ZNA
C12P7/18
C12P19/00
C12P21/02 Z
C12N15/31
C12N15/52 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515965
(86)(22)【出願日】2022-06-28
(85)【翻訳文提出日】2024-05-09
(86)【国際出願番号】 KR2022009268
(87)【国際公開番号】W WO2023038250
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】10-2021-0121930
(32)【優先日】2021-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513132586
【氏名又は名称】ジーエス カルテックス コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100121821
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 強
(72)【発明者】
【氏名】ソン チャン ウ
(72)【発明者】
【氏名】クォン ミン－ア
(72)【発明者】
【氏名】ソン ヒョ ハク
(72)【発明者】
【氏名】ジョン キ ウン
(72)【発明者】
【氏名】キム ソン ヒョン
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AC05
4B064AC06
4B064AF01
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA19
4B064CA21
4B064CC03
4B064CC06
4B064CC07
4B064CC15
4B064CC24
4B064CD09
4B064CD13
4B064CE02
4B064CE03
4B064CE06
4B064DA10
4B064DA11
4B064DA20
(57)【要約】
本発明は、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物に関する。また、本発明は、本発明の組換え微生物を用いたポリオールまたは粘液性高分子の選択的生産または同時生産方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を有する微生物において、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路からなる群から選択される１つ以上が抑制されたことを特徴とする、
ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物。
【請求項2】
前記組換え微生物は、組換えバチルスであることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項3】
前記ポリオールは、グリセロール、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項4】
前記粘液性高分子は、ポリグルタミン酸、レバン及び菌体外多糖からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項5】
前記菌体外多糖は、グルコース、ガラクトース、リン酸、グリセロール、及び酢酸からなる群から選択される１つ以上のモノマーを含むことを特徴とする、請求項４に記載の組換え微生物。
【請求項6】
野生型微生物に比べて、グリセロール、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール及び（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールからなる群から選択される１つ以上のポリオールの生産能が抑制されるか、上記１つ以上のポリオールの生産能がないことを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項7】
グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路が抑制され、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路からなる群から選択される１つ以上が抑制されたことを特徴とする、
請求項１に記載のポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物。
【請求項8】
前記組換え微生物は、ポリオール及び粘液性高分子の同時生産能を有することを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項9】
請求項１に記載の組換え微生物を準備する段階と、前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階と、
を含む、ポリオールの生産方法。
【請求項10】
請求項１に記載の組換え微生物を準備する段階と、前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階と、
を含む、粘液性高分子の生産方法。
【請求項11】
前記炭素源は、ショ糖、葡萄糖及びグルタミン酸からなる群から選択される１つ以上を含むことを特徴とする、請求項９または１０に記載の生産方法。
【請求項12】
上記培養は、２５～５５℃で行われることを特徴とする、請求項９または１０に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物に関する。また、本発明は、前記組換え微生物を用いたポリオールまたは粘液性高分子の生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｌｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）微生物は、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）微生物に分類され、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの産業用酵素と、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、レバン（ｌｅｖａｎ）、菌体外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）などの様々な粘液性高分子と、２，３－ブタンジオール（２，３－ＢＤＯ）、グリセロールなどの様々なポリオールと、を生産することができる微生物である。粘液性高分子に分類されるポリグルタミン酸、レバン、菌体外多糖は、化粧品、農業製品、食品などにおける保湿剤などの用途に広く利用可能な高付加な素材である。バチルス・リケニフォルミスが生成できるポリオールは、大きく２，３－ブタンジオールとグリセロールである。４つの炭素と２つのヒドロキシ基（－ＯＨ）とを有するアルコールの１つである２，３－ブタンジオール（ＣＨ３ＣＨＯＨＣＨＯＨＣＨ３）は、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオール、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオール、（２Ｓ，３Ｓ）－ブタンジオールからなる３種の異性質体が存在し、化粧品、農業製品、食品などにおける保湿剤、植物病抑制剤、免疫力強化剤などに広く利用可能な高付加な素材である。また、グリセロールは、３つの炭素と３つのヒドロキシ基（－ＯＨ）とを有するポリオールであり、化粧品などにおける保湿剤の原料として多く利用される。
【0003】
バチルス微生物を用いてポリグルタミン酸、レバン、菌体外多糖などに代表される、各々の粘液性高分子を生産しようとする研究は、古くから行われてきた（Ｂｉｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１６：２６５－２７５，１９９４；Ｇｏｊｇｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１２１：１４２－１５１，２０１９；Ａｓｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１５１：９８４－９９２，２０２０）。２，３－ブタンジオールの生産に関する研究は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｓなど、様々な微生物による生産研究が報告されてきた（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４６：１５８３－１６０１，２０１９）。２，３－ブタンジオールの生産収率及び選択度などを改善するために、様々な組換え微生物の開発研究が行われてきた。例えば、微生物をＵＶに露出させるか、主な副産物の生成経路を抑制させるなど、主に副産物の低減による微生物の開発研究が活発に行われてきた（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４６：１５８３－１６０１，２０１９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物を提供することである。
【0005】
また、本発明の目的は、前記組換え微生物を用いたポリオールの生産方法を提供することである。
【0006】
また、本発明の目的は、前記組換え微生物を用いた粘液性高分子の生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記目的を達成するために本発明は、
ポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を有する微生物において、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路からなる群から選択される１つ以上が抑制されたことを特徴とする、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物を提供する。
ポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を有する微生物において、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路からなる群から選択される１つ以上が抑制されたことを特徴とする、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物を提供する。
【0008】
また、本発明は、
本発明の組換え微生物を準備する段階と、
前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、
ポリオールの生産方法を提供する。
本発明の組換え微生物を準備する段階と、
前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、
ポリオールの生産方法を提供する。
【0009】
また、本発明は、
本発明の組換え微生物を準備する段階と、
前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、
粘液性高分子の生産方法を提供する。
本発明の組換え微生物を準備する段階と、
前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、
粘液性高分子の生産方法を提供する。
【発明の効果】
【0010】
本発明の組換え微生物は、ポリオール及び粘液性高分子を同時に生産することができ、選択的に特定の種類のポリオール及び／又は粘液性高分子の生産を抑制するか、生産をしないか、生産を増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】主に生産される粘液性高分子とポリオールの代謝回路に相応する酵素反応を示す図である。
【図2】発酵液から生成された粘液性高分子とポリオールの同時回収方法を示す図である。
【図3】粘液性高分子のうちレバンとポリグルタミン酸の１３Ｃ－ＮＭＲに基づく分析方法を示す図である。
【図4a】粘液性高分子のうち菌体外多糖の１３Ｃ－ＮＭＲ、１Ｈ－ＮＭＲ、３１Ｐ－ＮＭＲに基づいて単量体の同定方法を示す図である。
【図4b】リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）を示す図である。
【図4c】グルコースを示す図である。
【図4d】ガラクトースを示す図である。
【図4e】グリセロールを示す図である。
【図4f】酢酸を示す図である。
【図5】低温条件（３０℃）のフラスコ培養において、炭素源によって比較例１の野生型微生物と実施例１の組換え微生物のポリオールの生成量及び割合を示す図である。
【図6】低温条件（３０℃）のフラスコ培養において、炭素源によって比較例１の野生型微生物と実施例１の組換え微生物の粘液性高分子の生成量及び割合を示す図である。
【図7】高温条件（４５℃）のフラスコ培養において、炭素源によって比較例１の野生型微生物と実施例１の組換え微生物のポリオールの生成量及び割合を示す図である。
【図8】高温条件（４５℃）のフラスコ培養において、炭素源によって比較例１の野生型微生物と実施例１の組換え微生物のポリグルタミン酸、菌体外多糖、ポリオールの生成量の変化を示す図である。
【図9】ショ糖（Ｓｕｃｒｏｓｅ）を炭素源とする低温条件（３０℃）のフラスコ培養において、組換え微生物のポリオールの生成量及び割合を示す図である。
【図10】ショ糖を炭素源とする低温条件（３０℃）のフラスコ培養において、組換え微生物のレバンの生成量及び割合を示す図である。
【図11】葡萄糖とグルタミン酸を炭素源とする高温条件（４５℃）のフラスコ培養において、組換え微生物のポリオールの生成量及び割合を示す図である。
【図12】葡萄糖とグルタミン酸を炭素源とする高温条件（４５℃）のフラスコ培養において、組換え微生物のポリグルタミン酸の生成量及び割合を示す図である。
【図13】葡萄糖を炭素源とする低温条件（３０℃）のフラスコ培養において、組換え微生物のポリオールの生成量及び割合を示す図である。
【図14】葡萄糖を炭素源とする低温条件（３０℃）のフラスコ培養において、組換え微生物のＥＰＳの生成量及び割合を示す図である。
【図15】ショ糖を炭素源として、３０℃の低温培養条件で、実施例８の組換え微生物の発酵による（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールとレバンの同時生産の結果である。
【図16】ショ糖を炭素源として、４５℃の高温培養条件で、実施例８の組換え微生物の発酵による（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールとレバンの同時生産の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、
ポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を有する微生物において、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路からなる群から選択される１つ以上が抑制されたことを特徴とする、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物に関する。
ポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を有する微生物において、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路からなる群から選択される１つ以上が抑制されたことを特徴とする、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物に関する。
【0013】
また、本発明は、
本発明の組換え微生物を準備する段階と、
前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、
ポリオールの生産方法に関する。
本発明の組換え微生物を準備する段階と、
前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、
ポリオールの生産方法に関する。
【0014】
また、本発明は、
本発明の組換え微生物を準備する段階と、
前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、
粘液性高分子の生産方法に関する。
本発明の組換え微生物を準備する段階と、
前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、
粘液性高分子の生産方法に関する。
【0015】
以下では、本発明を詳説する。
【0016】
ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物
本発明は、ポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を有する微生物において、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路からなる群から選択される１つ以上が抑制されたことを特徴とする、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物に関する。
本発明は、ポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を有する微生物において、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路からなる群から選択される１つ以上が抑制されたことを特徴とする、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物に関する。
【0017】
前記組換え微生物は、組換えバチルスであってもよく、好ましくは、組換えバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｌｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）であってもよい。
【0018】
本発明の組換え微生物は、ポリオール及び粘液性高分子の同時生産能を有していてもよい。
【0019】
前記ポリオールは、グリセロール、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールからなる群から選択される１つ以上であってもよい。
【0020】
前記粘液性高分子は、ポリグルタミン酸、レバン及び菌体外多糖からなる群から選択される１つ以上であってもよい。前記菌体外多糖は、グルコース、ガラクトース、リン酸、グリセロール、及び酢酸からなる群から選択される１つ以上のモノマーを含むものであってもよい。
【0021】
本発明の組換え微生物は、ポリオール及び粘液性高分子を同時に生産することができ、選択的に特定の種類のポリオール及び／又は粘液性高分子の生産を抑制するか、生産をしないか、生産を増加させることができる。よって、本発明の組換え微生物は、ポリオール及び粘液性高分子の同時生産及び選択的生産が可能である。
【0022】
本発明の組換え微生物は、野生型微生物に比べてグリセロール、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール及び（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールからなる群から選択される１つ以上のポリオールの生産能が抑制されるか、前記１つ以上のポリオールの生産能がない組換え微生物であってもよい。
【0023】
一具現例において、本発明の組換え微生物は、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路が抑制され、
グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路からなる群から選択される１つ以上が抑制されたことを特徴とする、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物であってもよい。
グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路からなる群から選択される１つ以上が抑制されたことを特徴とする、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物であってもよい。
【0024】
一具現例において、本発明の組換え微生物は、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路が抑制された組換え微生物であって、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路は抑制されない組換え微生物であってもよい。このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも総ポリオール、グリセロール、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオール、総粘液性高分子及び／又はレバンの生産能が高くてもよい。また、このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりもＥＰＳの生産能が低くてもよい。
【0025】
一具現例において、本発明の組換え微生物は、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、及びグリセロリン酸をグリセロールに転換する経路が抑制された組換え微生物であって、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路は抑制されない組換え微生物であってもよい。このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール及び／又は（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの生産能が高くてもよい。また、このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも総ポリオール、グリセロール、総粘液性高分子、レバン及び／又はＥＰＳの生産能が低くてもよい。
【0026】
一具現例において、本発明の組換え微生物は、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、及びアセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路が抑制された組換え微生物であって、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路は抑制されない組換え微生物であってもよい。このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール、総粘液性高分子及び／又はレバンの生産能が高くてもよい。また、このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも総ポリオール、グリセロール、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオール及び／又はＥＰＳの生産能が低くてもよい。
【0027】
一具現例において、本発明の組換え微生物は、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、及びアセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路が抑制された組換え微生物であって、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路は抑制されない組換え微生物であってもよい。このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの生産能が高くてもよい。また、このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも総ポリオール、グリセロール、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール、総粘液性高分子、レバン及び／又はＥＰＳの生産能が低くてもよい。
【0028】
一具現例において、本発明の組換え微生物は、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路が抑制された組換え微生物であって、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路、及びアセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路は抑制されない組換え微生物であってもよい。このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール、総粘液性高分子及び／又はレバンの生産能が高くてもよい。また、このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも総ポリオール、グリセロール、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオール及び／又はＥＰＳの生産能が低くてもよい。
【0029】
一具現例において、本発明の組換え微生物は、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路、及びグルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路が抑制された組換え微生物であって、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、及びアセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路は抑制されない組換え微生物であってもよい。このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオール、総粘液性高分子及び／又はレバンの生産能が高くてもよい。また、このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも総ポリオール、グリセロール、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール及び／又はＥＰＳの生産能が低くてもよい。
【0030】
一具現例において、本発明の組換え微生物は、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、グルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路、及びアセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路が抑制された組換え微生物であって、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路は、抑制されない組換え微生物であってもよい。このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール、総粘液性高分子及び／又はレバンの生産能が高くてもよい。また、このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも総ポリオール、グリセロール、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオール及び／又はＥＰＳの生産能が低くてもよい。
【0031】
一具現例において、本発明の組換え微生物は、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路、グルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路、及びアセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路が抑制された組換え微生物であって、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路は抑制されない組換え微生物であってもよい。このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオール、総粘液性高分子及び／又はレバンの生産能が高くてもよい。また、このとき、前記組換え微生物は、野生型微生物よりも総ポリオール、グリセロール、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール及び／又はＥＰＳの生産能が低くてもよい。
【0032】
ポリオールの生合成経路
本発明のポリオールの生合成経路は、微生物内の特定の代謝産物からポリオールが合成する経路を意味する。例えば、微生物内の特定の代謝産物からグリセロールが合成する経路、微生物内の特定の代謝産物から（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが合成する経路、微生物内の特定の代謝産物から（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが合成する経路などであってもよい。
本発明のポリオールの生合成経路は、微生物内の特定の代謝産物からポリオールが合成する経路を意味する。例えば、微生物内の特定の代謝産物からグリセロールが合成する経路、微生物内の特定の代謝産物から（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが合成する経路、微生物内の特定の代謝産物から（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが合成する経路などであってもよい。
【0033】
粘液性高分子の生合成経路
本発明の粘液性高分子の生合成経路は、微生物内の特定の代謝産物から粘液性高分子が合成する経路を意味する。例えば、微生物内の特定の代謝産物からポリグルタミン酸が合成する経路、微生物内の特定の代謝産物からレバンが合成する経路、微生物内の特定の代謝産物から菌体外多糖が合成する経路などであってもよい。
本発明の粘液性高分子の生合成経路は、微生物内の特定の代謝産物から粘液性高分子が合成する経路を意味する。例えば、微生物内の特定の代謝産物からポリグルタミン酸が合成する経路、微生物内の特定の代謝産物からレバンが合成する経路、微生物内の特定の代謝産物から菌体外多糖が合成する経路などであってもよい。
【0034】
ポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を有する微生物
本発明のポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を有する微生物は、前記生合成経路を有する微生物であり、好ましくは、ポリオール及び粘液性高分子の生合成経路を有する微生物である。前記微生物は、ポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を野生型として有している微生物または遺伝子の組換えによって有する組換え微生物であってもよい。例えば、本発明の微生物は、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属またはエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物であってもよく、好ましくは、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、パエニバシラス・ポリミキサ（Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）等であり、最も好ましくは、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。バチルス・リケニフォルミスを用いて本発明の組換え微生物を製造することが、粘液性高分子及び／又はポリオールの産業的規模の生産に有利である。
本発明のポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を有する微生物は、前記生合成経路を有する微生物であり、好ましくは、ポリオール及び粘液性高分子の生合成経路を有する微生物である。前記微生物は、ポリオールまたは粘液性高分子の生合成経路を野生型として有している微生物または遺伝子の組換えによって有する組換え微生物であってもよい。例えば、本発明の微生物は、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属またはエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物であってもよく、好ましくは、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、パエニバシラス・ポリミキサ（Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）等であり、最も好ましくは、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。バチルス・リケニフォルミスを用いて本発明の組換え微生物を製造することが、粘液性高分子及び／又はポリオールの産業的規模の生産に有利である。
【0035】
図１は、本発明の微生物、好ましくは、バチルス・リケニフォルミスにおいて、主に生産される粘液性高分子とポリオールの代謝回路、かつ、これに相応する酵素反応を示す。
【0036】
グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路の抑制
菌体外多糖の合成酵素（Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅｓ）は、グルコース－６－リン酸のＥＰＳへの転換を調節する。菌体外多糖の合成酵素をコードする遺伝子のうち、ｅｐｓＡＢ遺伝子を欠失させることによって、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路を抑えることができる。前記ｅｐｓＡＢの抑制は、菌体外多糖の合成酵素の発現の抑制、菌体外多糖の合成酵素の酵素活性の抑制などによって行うことができる。例えば、菌体外多糖の合成酵素をコードする遺伝子のうち、ｅｐｓＡＢを欠失させるか、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除するか、一部の塩基を導入して、正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こすか、転写過程または翻訳過程での遺伝子の発現の調節など、当業者は、適宜な方法を選択して、菌体外多糖の合成酵素を抑制することができる。
菌体外多糖の合成酵素（Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅｓ）は、グルコース－６－リン酸のＥＰＳへの転換を調節する。菌体外多糖の合成酵素をコードする遺伝子のうち、ｅｐｓＡＢ遺伝子を欠失させることによって、グルコース－６－リン酸を菌体外多糖に転換する経路を抑えることができる。前記ｅｐｓＡＢの抑制は、菌体外多糖の合成酵素の発現の抑制、菌体外多糖の合成酵素の酵素活性の抑制などによって行うことができる。例えば、菌体外多糖の合成酵素をコードする遺伝子のうち、ｅｐｓＡＢを欠失させるか、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除するか、一部の塩基を導入して、正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こすか、転写過程または翻訳過程での遺伝子の発現の調節など、当業者は、適宜な方法を選択して、菌体外多糖の合成酵素を抑制することができる。
【0037】
グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路の抑制
グリセロホスファターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）は、グリセロリン酸のグリセロールへの転換を調節する。前記グリセロホスファターゼを抑制することによって、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路を抑えることができる。前記グリセロホスファターゼの抑制は、グリセロホスファターゼの発現の抑制、グリセロホスファターゼの酵素活性の抑制などによって行うことができる。例えば、グリセロホスファターゼをコードする遺伝子であるｄｇｐを欠失させるか、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除するか、一部の塩基を導入して、正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こすか、転写過程または翻訳過程での遺伝子の発現の調節など、当業者は、適宜な方法を選択して、グリセロホスファターゼを抑制することができる。
グリセロホスファターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）は、グリセロリン酸のグリセロールへの転換を調節する。前記グリセロホスファターゼを抑制することによって、グリセロリン酸をグリセロールに転換する経路を抑えることができる。前記グリセロホスファターゼの抑制は、グリセロホスファターゼの発現の抑制、グリセロホスファターゼの酵素活性の抑制などによって行うことができる。例えば、グリセロホスファターゼをコードする遺伝子であるｄｇｐを欠失させるか、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除するか、一部の塩基を導入して、正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こすか、転写過程または翻訳過程での遺伝子の発現の調節など、当業者は、適宜な方法を選択して、グリセロホスファターゼを抑制することができる。
【0038】
アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路の抑制
（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（（２Ｒ，３Ｓ）－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、アセトインの（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールへの転換を調節する。前記（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼを抑制することによって、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路を抑えることができる。前記（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの抑制は、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの発現の抑制、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの酵素活性の抑制などによって行うことができる。例えば、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｂｕｄＣを欠失させるか、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除するか、一部の塩基を導入して、正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こすか、転写過程または翻訳過程での遺伝子の発現の調節など、当業者は、適宜な方法を選択して、グリセロホスファターゼを抑制することができる。
（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（（２Ｒ，３Ｓ）－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、アセトインの（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールへの転換を調節する。前記（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼを抑制することによって、アセトインを（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールに転換する経路を抑えることができる。前記（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの抑制は、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの発現の抑制、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの酵素活性の抑制などによって行うことができる。例えば、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｂｕｄＣを欠失させるか、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除するか、一部の塩基を導入して、正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こすか、転写過程または翻訳過程での遺伝子の発現の調節など、当業者は、適宜な方法を選択して、グリセロホスファターゼを抑制することができる。
【0039】
アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路の抑制
（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（（２Ｒ，３Ｒ）－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、アセトインの（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールへの転換を調節する。前記（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼを抑制することによって、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路を抑えることができる。前記（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの抑制は、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの発現の抑制、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの酵素活性の抑制などによって行うことができる。例えば、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｇｄｈを欠失させるか、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除するか、一部の塩基を導入して、正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こすか、転写過程または翻訳過程での遺伝子の発現の調節など、当業者は、適宜な方法を選択して、グリセロホスファターゼを抑制することができる。
（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（（２Ｒ，３Ｒ）－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、アセトインの（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールへの転換を調節する。前記（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼを抑制することによって、アセトインを（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールに転換する経路を抑えることができる。前記（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの抑制は、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの発現の抑制、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの酵素活性の抑制などによって行うことができる。例えば、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｇｄｈを欠失させるか、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除するか、一部の塩基を導入して、正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こすか、転写過程または翻訳過程での遺伝子の発現の調節など、当業者は、適宜な方法を選択して、グリセロホスファターゼを抑制することができる。
【0040】
グルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路の抑制
ポリグルタメート・シンターゼ（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）は、グルタミン酸のポリグルタミン酸への転換を調節する。前記ポリグルタメート・シンターゼを抑制することによって、グルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路を抑えることができる。前記ポリグルタメート・シンターゼの抑制は、ポリグルタメート・シンターゼの発現の抑制、ポリグルタメート・シンターゼの酵素活性の抑制などによって行うことができる。例えば、ポリグルタメート・シンターゼをコードする遺伝子であるｐｇｓＢＣＡＥを欠失させるか、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除するか、一部の塩基を導入して、正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こすか、転写過程または翻訳過程での遺伝子の発現の調節など、当業者は、適宜な方法を選択して、ポリグルタメート・シンターゼを抑制することができる。
ポリグルタメート・シンターゼ（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）は、グルタミン酸のポリグルタミン酸への転換を調節する。前記ポリグルタメート・シンターゼを抑制することによって、グルタミン酸をポリグルタミン酸に転換する経路を抑えることができる。前記ポリグルタメート・シンターゼの抑制は、ポリグルタメート・シンターゼの発現の抑制、ポリグルタメート・シンターゼの酵素活性の抑制などによって行うことができる。例えば、ポリグルタメート・シンターゼをコードする遺伝子であるｐｇｓＢＣＡＥを欠失させるか、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除するか、一部の塩基を導入して、正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こすか、転写過程または翻訳過程での遺伝子の発現の調節など、当業者は、適宜な方法を選択して、ポリグルタメート・シンターゼを抑制することができる。
【0041】
ポリオールの生産方法及び粘液性高分子の生産方法
本発明は、組換え微生物を準備する段階と、前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、ポリオールの生産方法に関する。
本発明は、組換え微生物を準備する段階と、前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、ポリオールの生産方法に関する。
【0042】
また、本発明は、組換え微生物を準備する段階と、前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、粘液性高分子の生産方法に関する。
【0043】
また、本発明は、組換え微生物を準備する段階と、前記組換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する段階とを含む、ポリオール及び粘液性高分子の同時生産方法に関する。
【0044】
上記培養は、嫌気的条件で行われて、好ましくは、微嫌気的条件（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で行われる。例えば、上記培養は、培養の際、酸素、つまり空気を供給しながら行われ、具体例では、これは撹拌によって行うことができるものの、これに制限されるものではない。本発明の組換え微生物は、複合培地で培養されてもよい。複合培地の種類は、特に制限されず、通常の技術者は、一般に市販、使用される複合培地を適宜選択して使用することができることは自明である。
【0045】
前記炭素源は、ショ糖、葡萄糖及びグルタミン酸からなる群から選択される１つ以上を含んでいてもよい。一例では、前記炭素源は、ショ糖、葡萄糖及びグルタミン酸からなる群から選択される２つ以上を含んでいてもよい。
【0046】
一例では、菌体外多糖を生産するために、炭素源として葡萄糖を用いることができる。一例では、ポリグルタミン酸を生産するために、葡萄糖とグルタミン酸とを同時に炭素源として用いることができる。一例では、レバンを生産するために、ショ糖を炭素源として用いることができる。
【0047】
上記培養は、２５～５５℃で行うことができる。通常の技術者は、所望のポリオールまたは粘液性高分子の種類によって培養温度を適宜選択することができる。例えば、菌体外多糖を高い選択度で生産するために、２５℃以上且つ３７℃以下の温度で培養することができる。例えば、ポリグルタミン酸を高い選択度で生産するために、３７℃以上且つ５５℃以下の温度で培養することができる。レバンは、２５～５５℃の全体温度範囲における高い選択度で生産することができる。
【0048】
前記ポリオールの生産方法は、組換え微生物を培養して得た培養液からポリオールを回収する段階を更に含んでいてもよい。また、前記粘液性高分子の生産方法は、組換え微生物を培養して得た培養液からポリオールを回収する段階を更に含んでいてもよい。
【0049】
また、本発明は、図２のように、培養液からポリオール及び粘液性高分子を同時に回収することができる。
【0050】
粘液性高分子を回収するために、培養液の遠心分離によって細胞を除去し、上澄液に２～３倍数のエタノールを添加して沈殿させることによって、固形物のＣｒｕｄｅ粘液性高分子を得て、さらに洗浄、膜透析（Ｍｅｍｅｂｒａｎｅ ｄｉａｌｙｓｉｓ）、凍結乾燥（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）などの後段工程によって高純度の粘液性高分子を得ることができる。また、２，３－ブタンジオール、グリセロールのようなポリオールは、高い沸点（１８０℃以上）の特性を用いて、蒸留工程によって最終に高純度のポリオール製品を得ることができる。よって、細胞が除去された発酵液から沈殿によって粘液性高分子は回収し、他の上澄液から蒸留工程によってポリオールを回収する方式により、２つの異なる物質を同時に回収することができる。
【0051】
一具現例において、培養液から遠心分離（３，５００ｒｐｍ、１０分）によって細胞を除去し、細胞が除去された上澄液に２倍～３倍体積のエタノールを添加して、粘液性高分子を沈殿させる。沈殿した粘液性高分子は、膜透析（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉａｌｙｓｉｓ）、凍結乾燥（ｌｙｐｈｙｌｉｚａｔｉｏｎ）などによって粉末状に回収し、ポリオールは、高い沸点の特性を用いて、粘液性高分子が除去された残余液から蒸留によって回収することができる。
【実施例】
【0052】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述する実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下で開示の実施例に限定されるものではなく、互いに異なる様々な形態に具現されるものである。但し、本実施例は、本発明の開示を完全にして、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
【0053】
＜材料及び方法＞
大田近くの土壌サンプルから分離した野生型菌株であるバチルス・リケニフォルミスＧＳＣ４０７１（ＫＣＴＣ１４４８５ＢＰ）を用意した。下記の実験例における粘液性高分子（Ｖｉｓｃｏｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒ）は、培養後、細胞を除去して、エタノールの沈殿によって得られる固形物を総称し、具体的には、ポリグルタミン酸及びレバンを含み、このほか、他の粘液性高分子も含む種々の粘液性高分子の総称である。
大田近くの土壌サンプルから分離した野生型菌株であるバチルス・リケニフォルミスＧＳＣ４０７１（ＫＣＴＣ１４４８５ＢＰ）を用意した。下記の実験例における粘液性高分子（Ｖｉｓｃｏｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒ）は、培養後、細胞を除去して、エタノールの沈殿によって得られる固形物を総称し、具体的には、ポリグルタミン酸及びレバンを含み、このほか、他の粘液性高分子も含む種々の粘液性高分子の総称である。
【0054】
粘液性高分子またはポリオールの濃度（ｇ／Ｌ）、収率（ｇ／ｇ）及び選択度（％）は、下記のように計算した。
【0055】
－粘液性高分子またはポリオールの濃度（ｇ／Ｌ）：単位体積当たりに生産される粘液性高分子またはポリオールの量
－粘液性高分子またはポリオールの収率（ｇ／ｇ）：（粘液性高分子またはポリオールの生産量（ｇ）／炭素源（ｇ））×１００
－粘液性高分子またはポリオールの選択度（％）：（特定の粘液性高分子またはポリオールの生産量（ｇ）／全体の粘液性高分子またはポリオールの生産量（ｇ））×１００
－粘液性高分子またはポリオールの収率（ｇ／ｇ）：（粘液性高分子またはポリオールの生産量（ｇ）／炭素源（ｇ））×１００
－粘液性高分子またはポリオールの選択度（％）：（特定の粘液性高分子またはポリオールの生産量（ｇ）／全体の粘液性高分子またはポリオールの生産量（ｇ））×１００
【0056】
＜実験例１＞
バチルス・リケニフォルミスＧＳＣ４０７１を用いて組換え菌株を作製した。
バチルス・リケニフォルミスＧＳＣ４０７１を用いて組換え菌株を作製した。
【0057】
＜１－１＞ｅｐｓＡＢ、ｄｇｐ、ｂｕｄＣ、ｇｄｈ、ｐｇｓＢＣＡＥが欠失した組換えバチルス・リケニフォルミスの作製
標的遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片の作製
バチルス・リケニフォルミスの標的遺伝子を不活性化するために、バクテリアの組換え機構を用いており、除去しようとする遺伝子の相同部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ）をＰＣＲで増幅した。その後、相同部位を含む当該ＤＮＡ断片をバクテリアに伝達した後、ＤＮＡ断片にある遺伝子の相同部位と、バチルス・リケニフォルミスの染色体にある遺伝子との間に組換え酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）による組換え機構により標的遺伝子を除去することになる。
標的遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片の作製
バチルス・リケニフォルミスの標的遺伝子を不活性化するために、バクテリアの組換え機構を用いており、除去しようとする遺伝子の相同部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ）をＰＣＲで増幅した。その後、相同部位を含む当該ＤＮＡ断片をバクテリアに伝達した後、ＤＮＡ断片にある遺伝子の相同部位と、バチルス・リケニフォルミスの染色体にある遺伝子との間に組換え酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）による組換え機構により標的遺伝子を除去することになる。
【0058】
先ず、バチルス・リケニフォルミスのＥＰＳ合成酵素の相同部位をクローニングするために、標的遺伝子であるｅｐｓＡＢ（配列番号１）の相同部位１（配列番号２）を、配列番号３及び４のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。また、ｅｐｓＡＢの相同部位２（配列番号５）を、配列番号６及び７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。その後、相同部位１及び２を同時に鋳型としてＰＣＲで増幅し、相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片（配列番号８）が完成した。
【0059】
一方、バチルス・リケニフォルミスのポリグルタメート・シンターゼの相同部位をクローニングするために、標的遺伝子であるｐｇｓＢＣＡＥ（配列番号９）の相同部位１（配列番号１０）を、配列番号１１及び１２のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。また、相同部位２（配列番号１３）を、配列番号１４及び１５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。その後、相同部位１及び２を同時に鋳型としてＰＣＲで増幅し、相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片（配列番号１６）が完成した。
【0060】
一方、バチルス・リケニフォルミスのグリセロホスファターゼの相同部位をクローニングするために、標的遺伝子であるｄｇｐ（配列番号１７）の相同部位１（配列番号１８）を、配列番号１９及び２０のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。また、相同部位２（配列番号２１）を、配列番号２２及び２３のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。その後、相同部位１及び２を同時に鋳型としてＰＣＲで増幅し、相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片（配列番号２４）が完成した。
【0061】
一方、バチルス・リケニフォルミスの（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの相同部位をクローニングするために、標的遺伝子であるｂｕｄＣ（配列番号２５）の相同部位１（配列番号２６）を、配列番号２７及び２８のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。また、相同部位２（配列番号２９）を、配列番号３０及び３１のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。その後、相同部位１及び２を同時に鋳型としてＰＣＲで増幅し、相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片（配列番号３２）が完成した。
【0062】
一方、バチルス・リケニフォルミスの（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールデヒドロゲナーゼの相同部位をクローニングするために、標的遺伝子であるｇｄｈ（配列番号３３）の相同部位１（配列番号３４）を、配列番号３５及び３６のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。また、相同部位２（配列番号３７）を、配列番号３８及び３９のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。その後、相同部位１及び２を同時に鋳型としてＰＣＲで増幅し、相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片（配列番号４０）が完成した（表１）。
【0063】
［表１］
【0064】
【0065】
【0066】
【0067】
【0068】
【0069】
【0070】
【0071】
【0072】
＜１－２＞ｅｐｓＡＢ、ｐｇｓＢＣＡＥ、ｄｇｐ、ｂｕｄＣ、ｇｄｈが欠失した組換えバチルス・リケニフォルミスの作製
上記＜１－１＞で作製したＤＮＡ断片を電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、２５ｕＦ、２００Ω、２．５ｋＶ／ｃｍ）によりバチルス・リケニフォルミスＧＳＣ４０７１に伝達し、微生物の組換え機構を用いて標的遺伝子を除去することができた。
上記＜１－１＞で作製したＤＮＡ断片を電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、２５ｕＦ、２００Ω、２．５ｋＶ／ｃｍ）によりバチルス・リケニフォルミスＧＳＣ４０７１に伝達し、微生物の組換え機構を用いて標的遺伝子を除去することができた。
【0073】
野生型バチルス・リケニフォルミスＧＳＣ４０７１にｅｐｓＡＢ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｅｐｓＡＢ遺伝子を除去した組換えバチルス・リケニフォルミスを作製した。このように作製されたｅｐｓＡＢが欠失した組換え微生物を実施例１の組換え菌株（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４０７１ ΔｅｐｓＡＢ）として使用した。
【0074】
一方、バチルス・リケニフォルミスの野生型からｅｐｓＡＢ遺伝子を除去した後、ｄｇｐ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｅｐｓＡＢ遺伝子にさらにｄｇｐ遺伝子が除去されたバチルス・リケニフォルミスを作製した。このように作製されたｅｐｓＡＢ、ｄｇｐが欠失した組換え微生物を実施例２の菌株（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４０７１ ΔｅｐｓＡＢ Δｄｇｐ）として使用した。
【0075】
そして、バチルス・リケニフォルミスの野生型からｅｐｓＡＢ遺伝子を除去した後、ｂｕｄＣ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｅｐｓＡＢ遺伝子にさらにｂｕｄＣ遺伝子が除去されたバチルス・リケニフォルミスを作製した。このように作製されたｅｐｓＡＢ、ｂｕｄＣが欠失した組換え微生物を実施例３の菌株（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４０７１ ΔｅｐｓＡＢ ΔｂｕｄＣ）として使用した。
【0076】
そして、バチルス・リケニフォルミスの野生型からｅｐｓＡＢ遺伝子を除去した後、ｇｄｈ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｅｐｓＡＢ遺伝子にさらにｇｄｈ遺伝子が除去されたバチルス・リケニフォルミスを作製した。このように作製されたｅｐｓＡＢ、ｇｄｈが欠失した組換え微生物を実施例４の菌株（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４０７１ ΔｅｐｓＡＢ Δｇｄｈ）として使用した。
【0077】
そして、バチルス・リケニフォルミスの野生型からｅｐｓＡＢ、ｄｇｐ遺伝子を除去した後、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｅｐｓＡＢ、ｄｇｐ遺伝子にさらにｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子が除去されたバチルス・リケニフォルミスを作製した。このように作製されたｅｐｓＡＢ、ｄｇｐ、ｐｇｓＢＣＡＥが欠失した組換え微生物を実施例５の菌株（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４０７１ ΔｅｐｓＡＢ Δｄｇｐ ΔｐｇｓＢＣＡＥ）として使用した。
【0078】
そして、バチルス・リケニフォルミスの野生型からｅｐｓＡＢ、ｇｄｈ遺伝子を除去した後、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｅｐｓＡＢ、ｇｄｈ遺伝子にさらにｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子が除去されたバチルス・リケニフォルミスを作製した。このように作製されたｅｐｓＡＢ、ｇｄｈ、ｐｇｓＢＣＡＥが欠失した組換え微生物を実施例６の菌株（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４０７１ ΔｅｐｓＡＢ Δｇｄｈ ΔｐｇｓＢＣＡＥ）として使用した。
【0079】
そして、バチルス・リケニフォルミスの野生型からｅｐｓＡＢ、ｄｇｐ、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子を除去した後、ｂｕｄＣ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｅｐｓＡＢ、ｄｇｐ、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子にさらにｂｕｄＣ遺伝子が除去されたバチルス・リケニフォルミスを作製した。このように作製されたｅｐｓＡＢ、ｄｇｐ、ｐｇｓＢＣＡＥ、ｂｕｄＣが欠失した組換え微生物を実施例７の菌株（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４０７１ ΔｅｐｓＡＢ Δｄｇｐ ΔｐｇｓＢＣＡＥ ΔｂｕｄＣ）として使用した。
【0080】
そして、バチルス・リケニフォルミスの野生型からｅｐｓＡＢ、ｄｇｐ、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子を除去した後、ｇｄｈ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｅｐｓＡＢ、ｄｇｐ、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子にさらにｇｄｈ遺伝子が除去されたバチルス・リケニフォルミスを作製した。このように作製されたｅｐｓＡＢ、ｄｇｐ、ｐｇｓＢＣＡＥ、ｇｄｈが欠失した組換え微生物を実施例８の菌株（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４０７１ ΔｅｐｓＡＢ Δｄｇｐ ΔｐｇｓＢＣＡＥ Δｇｄｈ）として使用した。
【0081】
そして、バチルス・リケニフォルミスの野生型からｄｇｐ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｄｇｐ遺伝子を除去した後、ｂｕｄＣ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｄｇｐ遺伝子及びｂｕｄＣ遺伝子が除去されたバチルス・リケニフォルミスを作製した。このように作製されたｄｇｐ、ｂｕｄＣが欠失した組換え微生物を実施例９の菌株（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４０７１ Δｄｇｐ ΔｂｕｄＣ）として使用した。
【0082】
そして、バチルス・リケニフォルミスの野生型からｄｇｐ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｄｇｐ遺伝子を除去した後、ｇｄｈ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達して、ｄｇｐ遺伝子及びｇｄｈ遺伝子が除去されたバチルス・リケニフォルミスを作製した。このように作製されたｄｇｐ、ｇｄｈが欠失した組換え微生物を実施例１０の菌株（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４０７１ Δｄｇｐ Δｇｄｈ）として使用した。
【0083】
下記の実験例では、このように作製された組換え微生物を用いて、下記の培養及び分析実験を行った。このとき、野生型菌株であるバチルス・リケニフォルミスＧＳＣ４０７１は、比較例１として使用した。
【0084】
［表２］
【0085】
＜実験例２＞比較例１及び実施例１の微生物の３０℃の低温培養による粘液性高分子及びポリオール生産能の評価
比較例１の野生型バチルス及び実施例１の組換えバチルス菌株を用いて、粘液性高分子及びポリオールの同時生産能を評価した。
比較例１の野生型バチルス及び実施例１の組換えバチルス菌株を用いて、粘液性高分子及びポリオールの同時生産能を評価した。
【0086】
これら微生物に対してフラスコ培養を行った。前記微生物の培養は、下記のように行った。
【0087】
先ず、炭素源による粘液性高分子生産への影響を確認するために、葡萄糖、葡萄糖＋グルタミン酸、ショ糖、ショ糖＋グルタミン酸をそれぞれ添加した培地での培養を行った。
【0088】
前記微生物を１００ｇ／Ｌの葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）または同じ濃度のショ糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）を含む５０ｍｌの複合培地を含む２５０ｍｌのフラスコに接種して、３０℃で、４８時間、１８０ｒｐｍの条件で培養した。また、ポリグルタミン酸を生産するためには、２０ｇ／Ｌのグルタミン酸を培地にさらに添加した。培養条件は、微嫌気的条件が維持されるようにして、初期ｐＨ７．０で行った。前記野生型及び組換え微生物に対して培養を終了した後、サンプルを採取し、採取した試料は、１３，０００ｒｐｍで、１０分間、遠心分離した後、細胞を除去して、上層液は、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、２，３－ブタンジオール及びグリセロールを分析しており、上層液の粘液性高分子の濃度は、先ず、上層液をエタノール１：２の割合で混合した後、２４時間、エタノール沈殿（ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させて、遠心分離し、高分子を回収した。透析（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉａｌｙｓｉｓ，１０ｋＤａ）によって回収した高分子から低分子を除去し、最後に、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）によって乾燥重量を測定した。乾燥した粘液性高分子のうちポリグルタミン酸、レバン、ＥＰＳを特定するために、ＮＭＲ分析によって同定した。
【0089】
その結果、比較例１の野生型微生物を葡萄糖で培養するとき、総ポリオールは、３８．５７ｇ／Ｌであり、グリセロールが８．０９ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１６．４８ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが１４ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は、９．７１ｇ／Ｌであり、いずれもＥＰＳと確認された。よって、比較例１の野生型微生物を葡萄糖で３０℃の低温培養時、三種類のポリオールがいずれも生産されており、粘液性高分子は、ＥＰＳのみ選択的に生産されることが確認された。
【0090】
比較例１の野生型微生物を葡萄糖＋グルタミン酸培地で培養したとき、総ポリオールは３８．１２ｇ／Ｌであり、グリセロールが８．２４ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１３．８０ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが１６．０８ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は１０．７１ｇ／Ｌであり、このうちＰＧＡが７．２２ｇ／Ｌ（６７．４％）、ＥＰＳが３．４９ｇ／Ｌ（３２．６％）生成された。よって、比較例１の野生型微生物を３０℃で低温培養の際、グルタミン酸を培地に添加することによって、ＰＧＡを高選択度で生産可能であることを確認することができた。
【0091】
比較例１の野生型微生物をショ糖で培養したとき、総ポリオールは３５．６１ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが７．９７ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１３．７８ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが１３．８５ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は、１３．６５ｇ／Ｌであり、このうちレバンが１１．１８ｇ／Ｌ（８１．９％）、ＥＰＳが２．４７ｇ／Ｌ（１８．１％）であった。よって、比較例１の野生型微生物をショ糖で培養したとき、レバンが優勢に生成されることを確認することができた。
【0092】
最後に、比較例１の野生型微生物をショ糖＋グルタミン酸培地で培養したとき、総ポリオールは３７．５１ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが９．７６ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１１．２３ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが１６．５２ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は１６．１８ｇ／Ｌであり、このうちＰＧＡが１．６５ｇ／Ｌ（１０．２％）、レバンが１０．４０ｇ／Ｌ（６４．３％）、ＥＰＳが４．１３ｇ／Ｌ（２５．５％）であった。本培養条件では、三種類のポリオールと三種類の粘液性高分子がいずれも生成されることを確認することができた。
【0093】
次いで、実施例１の組換え微生物を用いた培養試験を行った。
【0094】
実施例１の組換え微生物を葡萄糖培地で培養したとき、総ポリオールは３９．７２ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが６．７７ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１７．８７ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが１５．０９ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は０．８８ｇ／Ｌの水準であり、いずれもＥＰＳと確認された。これは、ｅｐｓＡＢ遺伝子の欠失によってＥＰＳ生成がほぼ抑制され得ることを示す。
【0095】
実施例１の組換え微生物を葡萄糖＋グルタミン酸培地で培養した結果、総ポリオールは４１．６７ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが８．３１ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１６．２２ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが１７．１４ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は１．８２ｇ／Ｌであり、このうちＰＧＡが１．３０ｇ／Ｌ（７１．４％）、ＥＰＳが０．５２ｇ／Ｌ（２８．６％）であった。ｅｐｓＡＢ遺伝子を除去することによって、ＰＧＡ生成の割合は、小さい幅で上昇しているが、全体的な粘液性高分子の生成量が減っていることを確認することができる。これは、３０℃の低温培養の影響と判断して、実験例２で追加試験を行った。
【0096】
最後に、実施例１の組換え微生物をショ糖培地で培養した結果、総ポリオールは、４１．２３ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが８．７３ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１６．６６ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが１５．８３ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は、１９．２９ｇ／Ｌであり、このうちレバンが１８．７２ｇ／Ｌ（９７％）、ＥＰＳが０．５８ｇ／Ｌ（３％）であった。よって、ｅｐｓＡＢ遺伝子の欠失によってレバンの選択度及び生成量が大きく増加したことを確認することができた。これによって、３０℃の低温培養条件で、培地成分及びｅｐｓＡＢ遺伝子の欠失によるポリオールの生成量の変化は大きくないものの、粘液性高分子は大きく影響を受けることを確認した。
【0097】
結果として、比較例１の野生型微生物は、葡萄糖培地でポリオールとＥＰＳを選択的に生成することができた。３０℃の低温培養条件で、ＰＧＡの場合、ｅｐｓＡＢ遺伝子の欠失による選択度の改善が観察されており、その生成量は高くないことが分かった。しかし、ｅｐｓＡＢ遺伝子が欠失した実施例１の組換え微生物に対して、ショ糖を含む培地で３０℃の低温培養を行った結果、高選択度のレバンの生成が可能であることを確認した（表３及び表４、図５及び図６）。
【0098】
［表３］
比較例１の野生型微生物の炭素源による培養物分析
【0099】
［表４］
実施例１の組換え微生物の炭素源による培養物の分析
【0100】
＜実験例３＞比較例１及び実施例１の微生物の４５℃の高温培養による粘液性高分子及びポリオール生産能の評価
比較例１の野生型バチルス及び実施例１の組換えバチルス菌株を４５℃の高温条件で培養して、ポリオールと粘液性高分子の生成量の変化を評価した。すべての基本条件は、実施例１と同様に行っており、培養温度のみ４５℃に変更して行った。
比較例１の野生型バチルス及び実施例１の組換えバチルス菌株を４５℃の高温条件で培養して、ポリオールと粘液性高分子の生成量の変化を評価した。すべての基本条件は、実施例１と同様に行っており、培養温度のみ４５℃に変更して行った。
【0101】
その結果、比較例１の野生型微生物は、葡萄糖培地で高温培養したとき、総ポリオールは４５．１５ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが８．８５ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１３．６ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが２２．７ｇ／Ｌであった。これにより、高温培養によるポリオールの総生成量は、低温培養に比べて増加することを確認した。総粘液性高分子は５．０６ｇ／Ｌであり、このうちＰＧＡが３．６９ｇ／Ｌ、ＥＰＳが１．３７ｇ／Ｌであった。
【0102】
比較例１の野生型微生物を葡萄糖＋グルタミン酸培地で高温培養したとき、総ポリオールは４４．８１ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが９．０１ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１０．６ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが２５．２ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は５．４７ｇ／Ｌであり、このうちＰＧＡが３．９８ｇ／Ｌ、ＥＰＳが１．４９ｇ／Ｌであった。比較例１の野生型微生物に対する低温培養では、グルタミン酸の未添加培地を用いるとき、ＰＧＡは全く生成されていないものの、高温培養では、グルタミン酸を添加することなく、ＰＧＡの生成が可能であることを確認した。
【0103】
次いで、実施例１の組換え微生物を用いて培養試験を行った。
【0104】
実施例１の組換え微生物を葡萄糖培地で生産した結果、総ポリオールの生産量は５０．１ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが１１．５ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１２．８ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが２５．８ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は２．６５ｇ／Ｌであり、このうちＰＧＡが１．５９ｇ／Ｌ、ＥＰＳが１．０５ｇ／Ｌであった。高温培養によってｅｐｓＡＢが欠失して、グルタミン酸が添加されていない培地でもＰＧＡが生成されることを確認した。
【0105】
実施例１の組換え微生物を葡萄糖＋グルタミン酸培地で培養した結果、総ポリオールは４８．１２ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが１０．０２ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１１．５ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが２６．６ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は５．４５ｇ／Ｌであり、このうちＰＧＡが５．１０ｇ／Ｌ、ＥＰＳが０．３５ｇ／Ｌであった。葡萄糖＋グルタミン酸培地で実施例１の組換え微生物を培養したとき、ＰＧＡの選択度は９３％であり、比較例１の野生型微生物の７３％よりも増加したことが確認できた。また、実施例１の組換え微生物を高温培養したとき、ＰＧＡの選択度だけでなく、生産量も大きく増加することを確認することができた。
【0106】
最後に、実施例１の組換え微生物をショ糖で培養した結果、総ポリオールは４６ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが１０．２ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１１．５ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが２４．３ｇ／Ｌであった。総粘液性高分子は１５．４７ｇ／Ｌであり、このうちレバンが１５．３１ｇ／Ｌ、ＥＰＳが０．１５４ｇ／Ｌであった。レバンの場合、低温及び高温条件でいずれも高選択度及び高い生成量を示すことを確認することができた（表５、図７及び８）。
【0107】
［表５］
【0108】
＜実験例４＞レバン及びポリオールの選択度が改善した組換え微生物の培養の評価
実験例２及び３では、粘液性高分子の生産量及び選択度の改善に対する評価を行っており、粘液性高分子のうちレバンの生産量及び選択度が最も高いことを確認した。この点、比較例１の野生型微生物にさらなる遺伝子組換えを行い、レバンと特定のポリオールの選択的同時生産が可能であるか否かを確認しようとした。培養時の炭素源は、ショ糖を用いており、その他実験条件は、実験例１と同様の条件で行った。
実験例２及び３では、粘液性高分子の生産量及び選択度の改善に対する評価を行っており、粘液性高分子のうちレバンの生産量及び選択度が最も高いことを確認した。この点、比較例１の野生型微生物にさらなる遺伝子組換えを行い、レバンと特定のポリオールの選択的同時生産が可能であるか否かを確認しようとした。培養時の炭素源は、ショ糖を用いており、その他実験条件は、実験例１と同様の条件で行った。
【0109】
その結果、実施例２の組換え微生物は、グリセロールの生成を抑制するために作製されたが、培養の結果、ポリオールのうちグリセロールを全く生産していないことが確認された。実施例３の組換え微生物は、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの生成を抑制するために作製されたが、培養の結果、ポリオールのうち（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールをほとんど生産しないことが確認された。実施例４の組換え微生物は、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールの生成を抑制するために作製されたが、培養の結果、ポリオールのうち（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールをほとんど生産しないことが確認された。
【0110】
実施例３の組換え微生物は、２３．８５ｇ／Ｌのレバンの生成が確認されたが、実施例２及び実施例４の組換え微生物は、特定のポリオールの生成遺伝子を欠失することによって、レバンの生成量が大きく抑制されることが確認された。これにより、バイオフィルム（Ｂｉｏｆｉｌｍ）を構成する要素間の調節機構によって、特定のポリオールの生成に関与する遺伝子の除去は、粘液性高分子の生成の抑制と連結されていることが確認された。
【0111】
かかる問題は、実施例２の組換え微生物におけるｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子をさらに欠失させた実施例５の組換え微生物を作製することで解決した。ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子はＰＧＡ合成酵素であり、ＰＧＡは、バイオフィルムを形成する構成成分の１つである。実験的に、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子をさらに欠失させることが粘液性高分子の生産能を回復させることができることが確認できた。
【0112】
実施例５の組換え微生物を培養した結果、総ポリオールは２９．８７ｇ／Ｌであり、このうち（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１６．１５ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが１３．７１ｇ／Ｌに生成されたことが確認され、グリセロールは、全く生成されていない。総粘液性高分子は２２．１８ｇ／Ｌであり、このうちレバンが２１．９１ｇ／Ｌ、ＥＰＳが０．２７ｇ／Ｌに生成されることが確認された。実施例５の組換え微生物を介してグリセロールが除去されたポリオールとレバンの選択的同時生産が可能であることを確認した。
【0113】
実施例６の組換え微生物は、実施例４の組換え微生物にｐｇｓＢＣＡＥをさらに欠失させて作製した。その結果、総ポリオールは３５．４ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが７．２９ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが２８．１ｇ／Ｌに生成された。総粘液性高分子は２５．５９ｇ／Ｌであり、このうちレバンが２４．８２ｇ／Ｌ、ＥＰＳが０．７７ｇ／Ｌに生成された。（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールを除くポリオールとレバンを選択的に同時生産できることを確認した。
【0114】
実施例７の組換え微生物は、グリセロールの生産能が抑制されて、粘液性高分子の生産能が回復した、実施例５の組換え微生物におけるｂｕｄＣ遺伝子をさらに欠失させて作製した。実施例７の組換え微生物を培養した結果、総ポリオールは２５．４７ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが０、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが２５．３４ｇ／Ｌ（９９．５％）、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが０．１４ｇ／Ｌ（０．５％）であった。実施例７の組換え微生物を培養した結果、総粘液性高分子は２３．９４ｇ／Ｌであり、このうちレバンが２３．１５ｇ／Ｌ（９６．７％）、ＥＰＳが０．７９ｇ／Ｌ（３．３％）であった。最終に、実施例７の組換え微生物を培養して、高選択度の（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールと高選択度のレバンとを同時に生産できることを確認した。
【0115】
実施例８の組換え微生物は、グリセロールの生産能が抑制されて、粘液性高分子の生産能が回復した、実施例５の組換え微生物におけるｇｄｈ遺伝子をさらに欠失して作製した。実施例８の組換え微生物を培養した結果、総ポリオールは２５．４ｇ／Ｌであり、このうちグリセロールが０、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが０、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが２５．４ｇ／Ｌ（１００％）であった。実施例８の組換え微生物を培養した結果、総粘液性高分子は２３．５９ｇ／Ｌであり、このうちレバンが２２．４１ｇ／Ｌ（９５％）、ＥＰＳが１．１８ｇ／Ｌ（５％）であった。最終に、実施例８の組換え微生物を培養して、高選択度の（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールと高選択度のレバンとを同時に生産できることが確認された（表６、図９及び１０）。
【0116】
［表６］
【0117】
＜実験例５＞ＰＧＡ及びポリオールの選択度が改善した組換え微生物の培養の評価
実験例３では、微生物の４５℃の高温培養による粘液性高分子及びポリオールの生産能を評価した。葡萄糖培地で培養したとき、実施例１の場合、グルタミン酸を添加することなく、ＰＧＡの生成が可能であり、グルタミン酸を添加するとき、粘液性高分子のうちＰＧＡを高い選択度及び生産量に得ることができることを確認した。実施例１の微生物に基づいて、ＰＧＡとポリオールとの選択的同時生産の可能性を確認するため実験を行った。本実験は、グルタミン酸を添加した葡萄糖培地で４５℃の高温培養によって行った。実施例２、実施例３及び実施例４について比較評価を行った。
実験例３では、微生物の４５℃の高温培養による粘液性高分子及びポリオールの生産能を評価した。葡萄糖培地で培養したとき、実施例１の場合、グルタミン酸を添加することなく、ＰＧＡの生成が可能であり、グルタミン酸を添加するとき、粘液性高分子のうちＰＧＡを高い選択度及び生産量に得ることができることを確認した。実施例１の微生物に基づいて、ＰＧＡとポリオールとの選択的同時生産の可能性を確認するため実験を行った。本実験は、グルタミン酸を添加した葡萄糖培地で４５℃の高温培養によって行った。実施例２、実施例３及び実施例４について比較評価を行った。
【0118】
実施例２の組換え微生物を培養した結果、総ポリオールは３１．８ｇ／Ｌであり、このうち（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが１０．６ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが２１．２ｇ／Ｌに生成されたことが確認され、グリセロールは、全く生成されていない。総粘液性高分子は０．３５ｇ／Ｌであり、いずれもＥＰＳが生成されることが確認された。グリセロールの生成遺伝子であるｄｇｐを欠失したとき、ＰＧＡを含む粘液性高分子の生成量が大きく抑制されることを確認することができた。
【0119】
実施例３の組換え微生物を培養した結果、総ポリオールは４８．３ｇ／Ｌであり、このうち（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが３５．４ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが１．１ｇ／Ｌ、グリセロールが１１．８ｇ／Ｌに生成された。（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールを高い選択度で生産できることを確認した。総粘液性高分子は６．３５ｇ／Ｌであり、このうちＰＧＡが６．１５ｇ／Ｌ、ＥＰＳが０．２０ｇ／Ｌに生成されることが確認された。全体として、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの生成遺伝子であるｂｕｄＣを欠失したとき、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール及びグリセロールとＰＧＡを選択的に同時生産できる可能性を確認することができた。
【0120】
実施例４の組換え微生物を培養した結果、総ポリオールは３７．２ｇ／Ｌであり、このうち（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが３５．０ｇ／Ｌ、グリセロールが２．２ｇ／Ｌに生成された。（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールは、全く生成されていない。総粘液性高分子は０．４５ｇ／Ｌであり、いずれもＥＰＳが生成されることが確認された。実施例４の場合、（２Ｒ，２Ｒ）－ブタンジオールの生成遺伝子であるｇｄｈを欠失したとき、ＰＧＡを含む粘液性高分子の生成が大きく抑制されることを確認することができた（表７、図１１及び図１２）。
【0121】
［表７］
【0122】
＜実験例６＞ＥＰＳ及びポリオールの選択度が改善した組換え微生物の培養の評価
実験例２では、比較例１の微生物を葡萄糖培地で３０℃に低温培養したとき、粘液性高分子のうちＥＰＳのみ生成可能であることを確認した。ＥＰＳと（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールまたは（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの選択的な同時生産可能性を確認するために、実施例９及び実施例１０の微生物を用いて培養試験を行った。本実験は、葡萄糖培地で、３０℃の低温培養によって行った。
実験例２では、比較例１の微生物を葡萄糖培地で３０℃に低温培養したとき、粘液性高分子のうちＥＰＳのみ生成可能であることを確認した。ＥＰＳと（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールまたは（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの選択的な同時生産可能性を確認するために、実施例９及び実施例１０の微生物を用いて培養試験を行った。本実験は、葡萄糖培地で、３０℃の低温培養によって行った。
【0123】
実施例９の組換え微生物を培養した結果、総ポリオールは２８．１ｇ／Ｌであり、このうち（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールが２７．８ｇ／Ｌ、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールが０．３ｇ／Ｌに生成された。グリセロールは、全く生成されておらず、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールを高い選択度で生成できることを確認した。総粘液性高分子は７．２２ｇ／Ｌであり、いずれもＥＰＳと確認された。これによって、（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオールとＥＰＳを選択的に同時生産できることを確認した。
【0124】
実施例１０の組換え微生物を培養した結果、総ポリオールは２６．１ｇ／Ｌであり、いずれも（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールと確認された。（２Ｒ，３Ｒ）－ブタンジオール及びグリセロールは、全く生成されておらず、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールを高い選択度で生成できることを確認した。総粘液性高分子は６．５６ｇ／Ｌであり、いずれもＥＰＳと確認された。これによって、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールとＥＰＳを選択的に同時生産できることを確認した（表８、図１３及び図１４）。
【0125】
［表８］
【0126】
＜実験例７＞レバン及び（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの選択的同時生産のための流加式発酵培養
レバン及び（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの高選択度の同時生産能を検証するために、実施例８の組換え微生物をショ糖培地の条件で流加式発酵して、発酵性能を評価した。
レバン及び（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの高選択度の同時生産能を検証するために、実施例８の組換え微生物をショ糖培地の条件で流加式発酵して、発酵性能を評価した。
【0127】
微生物の発酵実験は、下記のように行った。
【0128】
先ず、実施例８の組換え微生物を３００ｍｌの複合培地を含む１Ｌのフラスコに接種して、３０℃または４５℃で、１６時間、１８０ｒｐｍの条件で培養した。培養した微生物は、最終培養液の体積が３Ｌになるように、７．５Ｌ容量の発酵器に接種した。初期条件として、ｐＨ７．０、温度３０℃または４５℃、５５０ｒｐｍ、酸素１ｖｖｍの条件で行った。初期ショ糖の濃度は、１００ｇ／Ｌとして行った。培養中でアセトイン（ａｃｅｔｏｉｎ）の量が、１０ｇ／Ｌ以上になると、撹拌速度を３５０ｒｐｍに下げる２段階の発酵を行っており、培養液内の糖濃度が２０ｇ／Ｌ以下に下げるとき、１５０ｇのショ糖粉をさらにフィード（ｆｅｅｄｉｎｇ）して行った。発酵中で、４時間の間隔でサンプルを採取しており、細胞の生長は、ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒによってＯＤ６００値で測定し、採取した試料を、１３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した後、上層液の（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオール濃度を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。レバンは、エタノールの沈殿による回収及びＮＭＲ分析によって定量した。その結果、３０℃の低温培養流加式発酵を行ったとき、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの生産量は４１．８ｇ／Ｌであり、レバンの生産量は２７ｇ／Ｌであった。一方、４５℃の高温培養流加式発酵を行ったときは、（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの生産量は８８．６ｇ／Ｌであり、レバンは７１ｇ／Ｌであった。低温かつ高温の培養条件でいずれも、粘液性高分子及びポリオールのうちレバンと（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールは、９９％以上の選択度に生産された。低温培養に比べて、高温培養におけるレバン及び（２Ｒ，３Ｓ）－ブタンジオールの生産量が２倍ほど高かった。これは、実施例８の組換え微生物が高温で早く生長して、代謝速度が非常に早いからであると把握された。また、粘液性高分子とポリオールを選択的に同時生産することにあたって、産業的水準の高濃度の生産が可能であることが確認された（表９、図１５及び１６）。
【0129】
［表９］
【産業上の利用可能性】
【0130】
本発明は、ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物に関する。また、本発明は、本発明の組換え微生物を用いたポリオールまたは粘液性高分子の生産方法に関する。
【0131】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：ｅｐｓＡＢの塩基配列である。
配列番号２：ｅｐｓＡＢの相同部位１の塩基配列である。
配列番号３：ｅｐｓＡＢの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号４：ｅｐｓＡＢの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号５：ｅｐｓＡＢの相同部位２の塩基配列である。
配列番号６：ｅｐｓＡＢの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号７：ｅｐｓＡＢの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号８：ｅｐｓＡＢの相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片の塩基配列である。
配列番号９：ｐｇｓＢＣＡＥの塩基配列である。
配列番号１０：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位１の塩基配列である。
配列番号１１：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号１２：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号１３：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位２の塩基配列である。
配列番号１４：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号１５：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号１６：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片の塩基配列である。
配列番号１７：ｄｇｐの塩基配列である。
配列番号１８：ｄｇｐの相同部位１の塩基配列である。
配列番号１９：ｄｇｐの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号２０：ｄｇｐの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号２１：ｄｇｐの相同部位２の塩基配列である。
配列番号２２：ｄｇｐの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号２３：ｄｇｐの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号２４：ｄｇｐの相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片の塩基配列である。
配列番号２５：ｂｕｄＣの塩基配列である。
配列番号２６：ｂｕｄＣの相同部位１の塩基配列である。
配列番号２７：ｂｕｄＣの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号２８：ｂｕｄＣの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号２９：ｂｕｄＣの相同部位２の塩基配列である。
配列番号３０：ｂｕｄＣの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号３１：ｂｕｄＣの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号３２：ｂｕｄＣの相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片の塩基配列である。
配列番号３３：ｇｄｈの塩基配列である。
配列番号３４：ｇｄｈの相同部位１の塩基配列である。
配列番号３５：ｇｄｈの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号３６：ｇｄｈの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号３７：ｇｄｈの相同部位２の塩基配列である。
配列番号３８：ｇｄｈの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号３９：ｇｄｈの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号４０：ｇｄｈの相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片の塩基配列である。
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１４４８５ＢＰ
受託日：２０２１年３月５日
配列番号１：ｅｐｓＡＢの塩基配列である。
配列番号２：ｅｐｓＡＢの相同部位１の塩基配列である。
配列番号３：ｅｐｓＡＢの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号４：ｅｐｓＡＢの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号５：ｅｐｓＡＢの相同部位２の塩基配列である。
配列番号６：ｅｐｓＡＢの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号７：ｅｐｓＡＢの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号８：ｅｐｓＡＢの相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片の塩基配列である。
配列番号９：ｐｇｓＢＣＡＥの塩基配列である。
配列番号１０：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位１の塩基配列である。
配列番号１１：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号１２：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号１３：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位２の塩基配列である。
配列番号１４：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号１５：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号１６：ｐｇｓＢＣＡＥの相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片の塩基配列である。
配列番号１７：ｄｇｐの塩基配列である。
配列番号１８：ｄｇｐの相同部位１の塩基配列である。
配列番号１９：ｄｇｐの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号２０：ｄｇｐの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号２１：ｄｇｐの相同部位２の塩基配列である。
配列番号２２：ｄｇｐの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号２３：ｄｇｐの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
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配列番号２９：ｂｕｄＣの相同部位２の塩基配列である。
配列番号３０：ｂｕｄＣの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号３１：ｂｕｄＣの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号３２：ｂｕｄＣの相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片の塩基配列である。
配列番号３３：ｇｄｈの塩基配列である。
配列番号３４：ｇｄｈの相同部位１の塩基配列である。
配列番号３５：ｇｄｈの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号３６：ｇｄｈの相同部位１をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号３７：ｇｄｈの相同部位２の塩基配列である。
配列番号３８：ｇｄｈの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号３９：ｇｄｈの相同部位２をＰＣＲで増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号４０：ｇｄｈの相同部位１と２とが含まれたＤＮＡ断片の塩基配列である。
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１４４８５ＢＰ
受託日：２０２１年３月５日
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図4e】
【図4f】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】