特表 2024-531713 試料中の標的ポリヌクレオチドを検出するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】試料中の標的ポリヌクレオチドを検出するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20240822BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240822BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240822BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/686 Z ZNA

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516382

(86)(22)【出願日】2022-09-11

(85)【翻訳文提出日】2024-03-28

(86)【国際出願番号】 US2022043169

(87)【国際公開番号】W WO2023039228

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】63/243,390

(32)【優先日】2021-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524094790

【氏名又は名称】ネクスジェン キャンサー ディテクション エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ネルソン， マシュー

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA17

4B063QQ03

4B063QQ12

4B063QQ28

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS36

(57)【要約】

標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの混合物を含む試料中の参照ポリヌクレオチドに対する遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドを検出するための方法が開示される。この方法は、標的ポリヌクレオチドが混合物の低い割合を表す、参照ポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの混合物中の標的ポリヌクレオチドを高選択性で検出するために利用され得る。この方法は、遺伝子改変に関連する疾患または障害を有する対象の診断、予後判定、及び治療に適応され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの混合物を含む試料中の、遺伝子改変を欠く前記参照ポリヌクレオチドに対する前記遺伝子改変を含む前記標的ポリヌクレオチドを検出するための方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施して、
（ｉ）前記試料、
（ｉｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠き、３’→５’ヌクレアーゼ活性を備える、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）前記遺伝子改変に隣接する一対のプライマー、及び
（ｉｖ）前記遺伝子改変を欠く前記参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションして、ブロッキング二本鎖を形成するブロッキングオリゴヌクレオチドを含む反応混合物中で、増幅産物を得ることと、
（ｂ）前記増幅産物を配列決定し、前記増幅産物中の前記遺伝子改変を検出し、それによって、前記試料中の前記遺伝子改変を含む前記標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、前記方法。

【請求項2】

前記標的ポリヌクレオチドが、前記混合物の約３％、２％、１％、０．５％、０．２５％、または０．１２５％以下を表す、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標的ポリヌクレオチドが、前記試料中に約３０、２０、または１０未満のコピー数で存在する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＰＣＲ増幅が、６０、５０、４０、または３０サイクル以下実施される、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、１０^－５、１０^－６、または１０^－７未満のエラー率を有する、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記増幅産物を配列決定して、複数のリードを得、前記遺伝子改変が、前記複数のリードの少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％に存在する、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記遺伝子改変が、前記増幅産物の少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％に存在する、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記増幅産物を配列決定する前に、前記増幅産物から前記ブロッキングオリゴヌクレオチドを除去することを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

０．１％、０．０５％、０．０２％、または０．０１％以下の割合で前記混合物中に存在する標的ポリヌクレオチドを検出するために必要なＰＣＲサイクルの最小数を決定することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記ブロッキングオリゴヌクレオチド及び前記参照ポリヌクレオチドによって形成される前記二本鎖の安定性を高める１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドと比較して、前記参照ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするための前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの選択性を高める１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、メチレン基を介して４’－Ｃにコンジュゲートされた２’－Ｏを有する糖部分を含む１つ以上のロック核酸（ＬＮＡ）を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドの全てが、ＬＮＡである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド以下の長さを有する、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

前記遺伝子改変が、置換を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記遺伝子改変が、欠失を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

前記遺伝子改変が、挿入を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

前記遺伝子改変が、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ、ＦＡＴ４、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＭＴ２Ｃ、及びＢＲＡＦから選択される遺伝子座に存在する、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

２つ以上の標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの混合物を含む試料中の、遺伝子改変を欠く前記参照ポリヌクレオチドに対して異なる遺伝子改変を各々含む、前記２つ以上の標的ポリヌクレオチドを検出するための方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施して、
（ｉ）前記試料、
（ｉｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠き、３’→５’ヌクレアーゼ活性を備えるＤＮＡポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）２つ以上のプライマー対であって、各プライマー対が前記異なる遺伝子改変の１つに隣接する、前記２つ以上のプライマー対、及び
（ｉｖ）前記異なる遺伝子改変を欠く前記参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションして、２つ以上のブロッキング二本鎖を形成する２つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む反応混合物中で、増幅産物を得ることと、
（ｂ）前記増幅産物を配列決定し、前記増幅産物中の前記異なる遺伝子改変を検出し、それによって、前記試料中の前記異なる遺伝子改変を含む前記２つ以上の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、前記方法。

【請求項20】

前記試料が、対象由来の生体試料である、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

前記試料が、対象由来の血液試料である、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

前記試料が、無細胞血液試料であり、及び／または前記血液試料が、ＰＣＲ増幅を実施する前に細胞を除去するように処理されている、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記方法が実施される前に、前記試料が試薬で処理されており、前記試薬は、非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

前記遺伝子改変が、対象におけるがんと関連している、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

ステップ（ａ）を実施する前に、前記対象由来のがん試料を配列決定することと、前記がん試料中の前記遺伝子改変を検出することと、を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記参照ポリヌクレオチドが、前記遺伝子改変に関して野生型配列を含み、前記遺伝子改変が、前記標的ポリヌクレオチドに存在する遺伝子変異である、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

前記試料が、がんを有するか、またはがんを発症するリスクがある対象から得られる、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

前記対象が、がんと診断されており、前記対象が、現在寛解している、請求項１～２７のいずれかに記載の方法。

【請求項29】

前述の方法のうちのいずれかを実施するための１つ以上の構成要素を含む、キット。

【請求項30】

（ｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠き、３’→５’ヌクレアーゼ活性を備えるＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）遺伝子改変に隣接する一対のプライマー、及び（ｉｉｉ）前記遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションしてブロッキング二本鎖を形成し、増幅された断片試料を得るブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項31】

（ｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠き、３’→５’ヌクレアーゼ活性を備えるＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ、ＦＡＴ４、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＭＴ２Ｃ、及びＢＲＡＦから選択される遺伝子座における遺伝子改変に隣接する一対のプライマー、及び（ｉｉｉ）前記遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションしてブロッキング二本鎖を形成し、増幅された断片試料を得るブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項32】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡからなり、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド以下である、請求項２９～３１のいずれかに記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月１３日に出願された米国仮出願第６３／２４３，３９０号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明の分野は、標的ポリヌクレオチドと非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含む試料中の標的ポリヌクレオチドを検出するための方法に関する。具体的には、本発明の分野は、標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの混合物を含む試料中の参照ポリヌクレオチドに対する遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドを検出するための方法に関し、標的ポリヌクレオチドは、混合物の比較的小さな割合を表す。この方法は、遺伝子改変に関連する疾患または障害を有する対象の診断、予後判定、及び治療に適応され得る。

【背景技術】

【0003】

遺伝子変異及びエピジェネティック修飾は、がん及び他の疾患に関連することが知られている。低侵襲試料を使用してセルフリーＤＮＡにおける遺伝子変異エピジェネティック修飾を検出する能力は、コンパニオン診断、最小残存疾患のモニタリング、がん再発のモニタリングなどの多くの異なる診断領域において、またはがんの診断における前向きな補助として使用され得る。

【0004】

具体的には、がん、がん再発、または治療抵抗性変異の早期診断は、患者の転帰を改善することができる。変異ＤＮＡは、野生型ＤＮＡと比較して生体試料中で小さな割合のＤＮＡを表すため、低い感度は、早期診断にとって重要である。偽陽性診断に基づく化学療法など、患者が不必要ながん治療を受けるとき、患者の健康に悪影響を及ぼすため、高い特異性も重要である。

【0005】

変異ＤＮＡが、変異ＤＮＡと野生型ＤＮＡとの混合物を含む試料中の野生型ＤＮＡと比較して非常に低い濃度で存在し得るとき、遺伝的診断への１つの課題は、変異の存在または不在を正確に決定することに留まる。デジタル液滴ＰＣＲ、修飾オリゴヌクレオチドを用いたＲＴ－ＰＣＲ、ＢＥＡＭｉｎｇ、ディープシーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などの、低頻度変異を検出するために開発された多くの方法が存在する。これらの方法は非常に低い感度を有することが示されているが、これらの方法の１つの欠点は、それらが高感度と組み合わせた低い特異性を達成し得ないことである。具体的には、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）単独では、部分的には、単一塩基変異のエラー率が高すぎるため、ＮＧＳを有する低割合のバリアントの存在または不在を正確に決定することができない。豊富な野生型ＤＮＡ中の変異ＤＮＡの存在を正確に決定するための全ての試みにもかかわらず、より良い方法の必要性が依然として存在する。

【0006】

精度には、偽陽性を低減する特異性及び偽陰性を低減する感度の両方が含まれる。閾値は、変異が存在しない陰性試料と変異が存在する陽性試料との間の障壁を定義するために使用される。この閾値は、変異を検出するために使用される方法の特異性及び感度を計算するために使用される。同様に、信号対雑音比を使用して、方法の精度を評価することができ、信号は、変異が存在するときの結果を表し、雑音は、変異が存在しないときの結果を表す。信号及び雑音の分離が大きくなるにつれて、方法はより正確になる。

【0007】

信号対雑音比を増加させるための１つのアプローチは、変異体について試料を濃縮することである。濃縮は、ＰＣＲ中に、変異ＤＮＡに対する野生型ＤＮＡの複製を優先的に阻害または防止することを含み得る。そのような濃縮では、ＰＣＲの各サイクルは、変異体が、前のサイクルと比較して高い割合で存在することをもたらす。しかしながら、これまでのところ、濃縮方法は、適切な感度及び特異性を達成することができなかった。

【0008】

そのため、変異ＤＮＡセグメントが低い割合で存在する場合、変異ＤＮＡセグメントを正確に検出する必要性が残っている。これは、液体生検を使用してがんに関連する特定の変異の有無を決定することによって、特にがんの診断に関して、患者に利益をもたらすであろう。これは、コンパニオン診断、最小残存疾患、がん再発、またはがん診断の前向き支援などの、様々ながん診断領域に適用され得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者は、標的ポリヌクレオチドと非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含む試料中の標的ポリヌクレオチドを検出するための方法を発見し、標的ポリヌクレオチドは、混合物の比較的小さい割合を表す。本発明者の方法を利用して、非標的ポリヌクレオチドに対する増幅を介して標的ポリヌクレオチドを選択的に濃縮し、標的ポリヌクレオチドが１０未満のコピー数で存在し、標的ポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチド及び非標的ポリヌクレオチドを含む混合物の約０．１２５％未満を表す場合に、配列決定を介して標的ポリヌクレオチドを正確に検出することができる。いくつかの実施形態では、本発明者の方法は、試料が、本発明者の増幅方法に供され、配列決定された後、標的ポリヌクレオチドが、配列決定された増幅産物の約９９％超（すなわち、配列決定リードの約９９％超）を表し、７００倍を超える濃縮である濃縮を達成する。

【0010】

いくつかの実施形態では、開示される方法は、標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの混合物を含む試料中の参照ポリヌクレオチドに対する遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドを検出するために実施されてもよく、参照ポリヌクレオチドは、開示される方法において非標的ポリヌクレオチドである。本方法は、標的ポリヌクレオチドが試料中に比較的低濃度（例えば、１０コピー未満）で存在する標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの混合物中の標的ポリヌクレオチドを高感度及び高選択性で検出するために利用され得、標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドを含む混合物の低い割合（例えば、混合物の約０．１２５％未満）を表す。この方法は、検出された遺伝子改変に関連する疾患または障害を有する対象を診断、予後判定、及び治療するために適合され得る。

【0011】

開示される方法は、典型的には、標的ポリヌクレオチドを検出するために、その後配列決定されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物を実施することを含む。ＰＣＲ反応は、典型的には、（ｉ）試料または試料の画分、（ｉｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠き、３’→５’ヌクレアーゼ活性（すなわち、３’→５’校正活性）を備え、好ましくは、約１０^－６未満のエラー率（すなわち、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ）を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉｉ）本方法で検出される遺伝子改変に隣接する一対のプライマー、及び（ｉｖ）遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションしてブロッキング二本鎖を形成するブロッキングオリゴヌクレオチド（参照ポリヌクレオチドは非標的ポリヌクレオチドである）を含み、それによって、参照ポリヌクレオチドの選択的ブロックキング増幅及び標的ポリヌクレオチドの増幅を強化する。増幅が実施された後、そのように得られた増幅産物を、標的ポリヌクレオチドを検出するために配列決定に供してもよい。開示される方法は、顕著なレベルの濃縮を達成し、標的ポリヌクレオチドは、７００倍超の濃縮を表す、配列決定された増幅産物の９９％超（すなわち、配列決定リードの約９９％超）を表し得る。

【0012】

また、開示される方法を実施するためのキットも本明細書に開示される。開示されるキットは、開示される方法を実施するための、（ｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠き、３’→５’ヌクレアーゼ活性（すなわち、３’→５’校正活性）を備え、好ましくは約１０^－６未満のエラー率（すなわち、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ）を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉｉ）方法で検出される遺伝子改変に隣接する一対のプライマー、及び（ｉｖ）遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションしてブロッキング二本鎖を形成するブロッキングオリゴヌクレオチド（参照ポリヌクレオチドは非標的ポリヌクレオチドである）であって、それによって参照ポリヌクレオチドの増幅を選択的にブロックし、標的ポリヌクレオチドの増幅を増加させるブロッキングオリゴヌクレオチド、から選択される、１つ以上の構成要素を含んでもよい。

【0013】

開示される方法及びキットは、疾患または障害を有するまたは有する疑いのある対象など、診断、予後判定、及び治療を必要とする対象のために利用することができる。具体的には、開示される方法及びキットは、がんを有する対象、またはがんを有することが疑われる対象を診断、予後判定、及び治療するために利用され得る。本開示の方法に好適な対象は、現在寛解しているがん患者を含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】０．２５％未満のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＤＮＡ及び９９．７５％超のＫＲＡＳ野生型ＤＮＡを含む混合試料を、ブロッキングオリゴヌクレオチドの不存在下で増幅し、配列決定した。１７４３９８のリードは、野生型ヌクレオチドを含有することが決定され（９９．６９％）、４９０のリードは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ヌクレオチドを含有し（０．２８％）、５２のリードは、野生型ヌクレオチドもＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃヌクレオチドも含有しない（０．０３％）。

【0015】

【図2】０．２５％未満のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＤＮＡ及び９９．７５％超のＫＲＡＳ野生型ＤＮＡを含む混合試料を、ブロッキングオリゴヌクレオチドの存在下で増幅し、配列決定した。４６４のリードは、野生型ヌクレオチドを含有すると決定され（０．６％）、７６８４２のリードは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃヌクレオチドを含有し（９９．３７％）、３１のリードは、野生型ヌクレオチドもＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃヌクレオチドも含有しない（０．０４％）。これらの結果は、ＬＮＡブロッカーの存在が、試料を約３５４倍濃縮し、生のリードを約１５７倍増加させたことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明は、以下に記載されるいくつかの定義を使用して、本出願を通して本明細書に記載される。

【0017】

文脈によって別段の指定または指示がない限り、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、「１つ以上」を意味する。例えば、「標的核酸（ａ ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、「１つ以上の標的核酸」を意味すると解釈されるべきである。

【0018】

本明細書で使用される場合、「約」、「およそ」、「実質的に」、及び「有意に」は、当業者によって理解され、それらが使用される文脈においてある程度変化する。これらの用語が、それらが使用される文脈において当業者に不明確に使用される場合、「約」及び「およそ」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％以下を意味し、「実質的に」及び「有意に」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％超を意味する。

【0019】

本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同じ意味を有する。例えば、「ステップを含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）方法」は、「ステップを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）方法」を意味すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲に列挙されるそれらの構成要素にさらに追加の構成要素を含めることを可能にする「オープンな」移行用語であると解釈されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、特許請求の範囲に列挙された構成要素以外の追加の構成要素を含めることを許可しない「クローズドな」移行用語であると解釈されるべきである。「から本質的になる」という用語は、部分的にクローズドであり、特許請求される主題の性質を根本的に変更しない追加の構成要素のみを含めることを可能にすると解釈されるべきである。

【0020】

また、反対であるとの明確な指示がない限り、２つ以上のステップまたは行為を含む本明細書に特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が列挙される順序に限定されないことも理解されたい。

【0021】

活動詞「ｍａｙ」は、いくつかの記載された実施形態またはその中に含まれる特徴のうちの１つ以上のオプションまたは選択の好ましい使用または選択を指す。特定の実施形態またはその中に含まれる特徴に関してオプションまたは選択肢が開示されていない場合、活動詞「ｍａｙ」は、記載された実施形態またはその中に含まれる特徴の態様をどのように作成または使用するかに関する肯定的行為、または記載された実施形態またはその中に含まれる特徴に関する特定のスキルを使用する決定的な決定を指す。この後者の文脈では、活動詞「ｍａｙ」は、補助動詞「ｃａｎ」と同じ意味及び含意を有する。

【0022】

本明細書で使用される場合、「患者」または「個体」という用語と互換的に使用され得る「対象」という用語は、医療ケア、処置または治療を受け、ヒト対象を包含し得るものを指す。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、疾患または障害に関連する遺伝子の変異など、疾患または障害に関連する１つ以上の遺伝子座における核酸の変化によって特徴付けられる疾患または障害を有する、及び／またはそれを発症するリスクがある人を包含することを意味する。「対象」という用語は、がんなどの細胞増殖性疾患または障害を有する、及び／またはそれを発症するリスクがある人を包含することを意味する。「対象」という用語は、がんと診断され、かつ現在寛解していると診断されている人を包含することを意味する。それは、疾患または障害に関連するか、または疾患または障害に関連する遺伝子変異を特徴とする１つ以上の遺伝子のメチル化状態をもたらす。遺伝子の「メチル化状態」は、例えば、対照遺伝子に対する遺伝子のプロモーターの「メチル化状態」を含み得る。

【0023】

本明細書で使用される場合、それを必要とする対象は、細胞増殖性疾患または障害（例えば、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、胆嚢癌、脳癌、子宮癌、卵巣癌、頭頚部癌、胃癌、肝臓癌、白血病、及びリンパ腫などのがん）、神経変性疾患または障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンチントン病）、精神疾患または障害（例えば、統合失調症及びうつ病）、代謝疾患または障害（例えば、１型または２型糖尿病）、心血管疾患または障害（例えば、心筋梗塞または脳卒中）、炎症性疾患または障害（例えば、関節炎）、ならびに免疫疾患または障害を含むがこれらに限定されない、疾患または障害を有するか、またはそれを発症するリスクがある対象を含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、がんと診断されており、現在、寛解していると診断されている。

【0024】

開示される方法は、対象から得られる試料中の疾患または障害に関連する１つ以上の遺伝子座の変化を検出することに基づいて、診断または予後判定を必要とする対象にそれを行うために利用され得る。本明細書で使用される場合、「診断する」、「診断」、または「診断すること」という用語は、疾患、症候群、もしくは状態を区別または識別すること、または特定の疾患、症候群、もしくは状態を有するか、もしくはそれを発症するリスクがある対象を区別または識別することを指す。本明細書で使用される場合、「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｅ）」または「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」または「予後判定」という用語は、対象における疾患、症候群、状態、または治療レジメンの転帰を予測することを指す。

【0025】

開示される方法は、それを必要とする対象を治療するために利用され得る。例えば、開示される方法は、疾患または障害に関連するか、または疾患または障害に関連する１つ以上の変異を特徴とする１つ以上の遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態に基づいて、診断または予後判定を必要とする対象にそれを行うために利用され得る。診断または予後に続いて、対象は、疾患または障害の診断または予後に基づいて適切な治療を施され得る。

【0026】

開示される方法は、対象の試料中の核酸を特徴付けるために利用され得る。「試料」または「対象の試料」という用語は、組織（例えば、生検から得られた組織）及び体液などの生体試料を含むことを意図している。「体液」には、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、胸膜液、涙液、乳管液、リンパ液、痰、及び精液が含まれ得るが、これらに限定されない。試料は、核酸、タンパク質、またはその両方を含み得る。

【0027】

本明細書に開示される方法は、ヌクレオチド試料のＤＮＡ増幅を実施するときに適用してもよい。具体的には、本明細書に開示される方法は、遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドと、遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチド（参照ポリヌクレオチドが非標的ポリヌクレオチドである場合）との混合物を含む試料のＤＮＡ増幅を実施するときに適用され得る。開示された増幅方法で分析される試料は、野生型ポリヌクレオチド（すなわち、変異体ポリヌクレオチド）と比較して、１つ以上の位置に１つ以上の遺伝子改変を有する標的ポリヌクレオチドと、野生型ポリヌクレオチド（野生型ポリヌクレオチドは非標的ポリヌクレオチドである）とを含む混合物を含み得る。

【0028】

本明細書に開示される方法は、ヌクレオチド試料のＤＮＡ配列解析を実施するときに適用してもよい。具体的には、本明細書に開示される方法は、遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドと、遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチド（参照ポリヌクレオチドが非標的ポリヌクレオチドである場合）との混合物を含む試料のＤＮＡ配列解析を実施するときに適用され得る。開示された増幅方法で分析される試料は、野生型ポリヌクレオチド（すなわち、変異体ポリヌクレオチド）と比較して、１つ以上の位置に１つ以上の遺伝子改変を有する標的ポリヌクレオチドと、野生型ポリヌクレオチド（野生型ポリヌクレオチドは非標的ポリヌクレオチドである）とを含む混合物を含み得る。

【0029】

本明細書に開示される方法は、メチル化分析を実施するときに適用してもよい。例えば、本明細書に開示される方法は、試料が、例えば亜硫酸水素塩薬剤などの、非メチル化シトシン残基を選択的に修飾するがメチル化シトシン残基を選択的に修飾しない薬剤で処理された後、ポリヌクレオチド試料を増幅及び配列決定するときに適用され得る。亜硫酸水素塩処理は、一般に、ポリヌクレオチド試料中の非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するために実施される。次いで、処理されたポリヌクレオチド試料を、ウラシル残基が最終的にチミジン残基に変換されるＤＮＡ合成のための鋳型として（例えば、ＰＣＲ増幅または配列決定反応において）利用することができる。処理されたポリヌクレオチド試料の配列決定を実施することによって、シトシン残基に対する所与の位置でのチミジン残基の検出は、それぞれ、元の試料中の非メチル化シトシンまたは元の試料中のメチル化シトシンを示すであろう。したがって、開示される増幅方法で分析される試料は、１つ以上の各位置にＴ／ＵまたはＣを有する非標的ポリヌクレオチドと比較して、それぞれ１つ以上の位置にＣまたはＴ／Ｕを有する標的ポリヌクレオチドを含む混合物を含み得る。

【0030】

本明細書に開示される方法は、多種多様な配列決定方法に適用することができる。配列決定方法は、高スループットまたは超高スループット配列決定方法を含み得る。開示される方法に適した、または適応可能なＤＮＡ配列決定プロセスは、限定されないが、合成による配列決定、単一分子リアルタイム配列決定、イオン半導体配列決定、ピロ配列決定、ライゲーションによる配列決定、鎖終結配列決定、大規模並列シグネチャ配列決定、ポロニー配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、ヘリスコープ単一分子配列決定、Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、質量分析による配列決定、マイクロ流体Ｓａｎｇｅｒ配列決定、及び顕微鏡ベースの配列決定技術を含み得る。したがって、開示される方法は、いわゆる「第一世代」ＤＮＡシーケンシング技術である、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング法またはＭａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔシーケンシング法、ならびにいわゆる「第二世代」及び「第三世代ＤＮＡシーケンシング技術」である高スループット分析により適合する方法、に基づく従来のＤＮＡシーケンシング方法に適用され得る。（例えば、Ｍａｒｄｉｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．９：３８７－４０２（２００８）、Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２００５）１５：１７６７－１７７６、Ｍｏｏｒｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｇｏ Ｊ．ｖ．５（１－４），Ｄｅｃ．（２０１１）、及びＳｃｈａｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．Ｒ２，ｐｐ．Ｒ２２７－２４９０，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２１，２０１０、及びＳｈｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６，１１３５－１１４５（２００８）を参照されたい。

【0031】

開示される技術は、核酸、ならびに疾患及び障害を診断、予後判定、及び／または治療するための核酸の使用に関する。「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」ならびに「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（リボースを含有する）、ならびにプリンまたはピリミジン塩基のＮグリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、「Ａ」、「Ｔ」、「Ｃ」、「Ｇ」、及び「Ｕ」という用語は、それぞれ、ヌクレオチド塩基としてのアデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシルを指す。「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」という用語の間には、長さにおいて意図された区別はなく、これらの用語は、互換的に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、これらの用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。本発明で使用するために、オリゴヌクレオチドはまた、塩基、糖またはリン酸骨格が修飾されているヌクレオチド類似体、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド類似体を含むことができる。

【0032】

開示される方法で利用されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド修飾には、限定されないが、ロック核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸、グリコール核酸、及びスレオース核酸が含まれ得る。

【0033】

本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの「断片」は、参照配列と配列が同一であるが、長さが短いポリヌクレオチド配列の一部である。断片は、最大、参照配列の全長マイナス少なくとも１つのヌクレオチドを含むことができる。例えば、断片は、参照ポリヌクレオチドの５～１０００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、断片は、参照ポリヌクレオチドの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、または５００個の連続したヌクレオチドを含み得、他の実施形態では、断片は、参照ポリヌクレオチドの５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、または５００個以下の連続したヌクレオチドを含み得、さらなる実施形態では、断片は、前述の値のいずれかによって囲まれた参照ポリヌクレオチドの連続したヌクレオチドの範囲を含み得る（例えば、参照ポリヌクレオチドの２０～５０個の連続したヌクレオチドを含む断片）。断片は、分子の特定の領域から優先的に選択され得る。「少なくとも１つの断片」という用語は、完全長ポリヌクレオチドを包含する。参照ポリヌクレオチド配列の「バリアント」、「変異体」、または「誘導体」は、参照ポリヌクレオチド配列の断片を含み得る。

【0034】

標的ポリヌクレオチド及び／または非標的ポリヌクレオチド（すなわち、参照ポリヌクレオチド）の断片は、ＰＣＲ増幅反応を介して生成され得る。増幅産物は、標的ポリヌクレオチド及び／または非標的ポリヌクレオチド（すなわち、参照ポリヌクレオチド）の増幅断片を含み得る。増幅産物は、標的ポリヌクレオチド及び／または非標的ポリヌクレオチド（すなわち、参照ポリヌクレオチド）の増幅断片の混合物を含み得る。

【0035】

ポリヌクレオチド配列に関して、「改変」、「バリアント」、「変異体」、または「誘導体」は、野生型配列を含み得る参照配列に対して異なる核酸配列を有する核酸配列として定義され得る。「改変」、「バリアント」、「変異体」、または「誘導体」は、１つ以上のヌクレオチドの置換（例えば、Ｇ→ｔ塩基転換）、１つ以上のヌクレオチドの欠失、及び／または１つ以上のヌクレオチドの挿入を含み得る。

【0036】

標的ポリヌクレオチドは、非標的ポリヌクレオチドである参照配列に対する変化を含み得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、野生型参照配列に対する変異を含んでもよい。開示される方法において、野生型参照ポリヌクレオチドであり得る非標的ポリヌクレオチドに対して、標的ポリヌクレオチドを選択的に増幅し、検出する。

【0037】

本明細書に開示される核酸は、「実質的に単離または精製され」てもよい。「実質的に単離または精製された」という用語は、その天然環境から取り出され、天然に会合している他の成分を少なくとも６０％含まず、好ましくは少なくとも７５％含まず、より好ましくは少なくとも９０％含まず、さらにより好ましくは少なくとも９５％含まない核酸を指す。いくつかの実施形態では、開示される方法で利用される試料は、実質的に単離または精製された核酸試料を含んでもよい。

【0038】

本開示の方法は、動物由来の供給源及び／または環境由来の供給源を含む、任意の供給源由来の核酸を含む試料を利用し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド試料は、ゲノムＤＮＡを含む。さらなる実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列決定の前に試薬で処理されており、この試薬は、ＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基は修飾しない。なおもさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド試料のヌクレオチド位置にあるヌクレオチドは、メチル化シトシンまたは修飾残基であり、ポリヌクレオチド断片のセットは、ポリヌクレオチド試料のヌクレオチド位置に、シトシンまたはチミンを有する２つ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む。

【0039】

開示される方法は、標的ポリヌクレオチド及び／または非標的ポリヌクレオチド（すなわち、参照ポリヌクレオチド）に相補的であるプライマーを利用し得る。開示される方法はまた、非標的ポリヌクレオチドに相補的であり、１つ以上のヌクレオチド位置において標的ポリヌクレオチドに相補的ではないブロッキングオリゴヌクレオチドを利用してもよい。本明細書で使用される場合、第１のポリヌクレオチド配列及び第２のポリヌクレオチド配列に関して「相補的な」という用語は、第１のポリヌクレオチド配列が、ミスマッチすることなくヌクレオチドの伸長を通して第２のポリヌクレオチド配列と正確に塩基対になることを意味する。「同族」という用語は、第１のポリヌクレオチド配列及び第２のポリヌクレオチド配列に関連して、第１のポリヌクレオチド配列が、ヌクレオチドのストレッチを通して第２のポリヌクレオチド配列と塩基対になるが、ヌクレオチドのストレッチ内に１つ以上のミスマッチを含み得ることを意味する。本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドのヌクレオチド対（例えば、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｃ：Ｇ、Ｇ：Ｃ、Ｇ：Ｕ、Ｔ：Ａ、Ｕ：Ａ、及びＵ：Ｇ）の間の塩基対相互作用によって、第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションする能力を指し得る。

【0040】

本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的塩基対合による２つの一本鎖核酸による二本鎖構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖間、または少量のミスマッチの領域を含有する「実質的に相補的な」核酸鎖間で生じ得る。完全に相補的な核酸鎖のハイブリダイゼーションが強く好ましい条件は、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と称される。実質的に相補的な配列の安定した二本鎖は、よりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件下で達成することができ、許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の適切な調整によって制御することができる。核酸技術の当業者は、当該技術分野によって提供されるガイダンスに従って、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対組成、イオン強度、及びミスマッチ塩基対の発生率を含むいくつかの変数を考慮して、経験的に、二本鎖安定性を決定することができる（例えば、参照により本明細書に取り込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６（３／４）：２２７－２５９；ａｎｄ Ｏｗｃｚａｒｚｙ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：５３３６－５３５３を参照されたい）。核酸技術の当業者は、二本鎖の融解温度を決定することができる。

【0041】

混合試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法

【0042】

開示される主題は、例えば、参照ポリヌクレオチドが試料中の非標的ポリヌクレオチドである、標的ポリヌクレオチドと、参照ポリヌクレオチドとの混合物を含む試料中の、遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチドと比較して遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドを検出するための方法に関する。この方法は、標的ポリヌクレオチドが低コピー数（例えば、約１０コピー未満）で存在し、標的ポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの混合物の低い割合（例えば、約０．１２５％未満）を表す、参照ポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの混合物中の標的ポリヌクレオチドを、高感度及び高選択性で検出するために利用され得る。この方法は、検出された遺伝子改変に関連する疾患または障害を有する対象を診断、予後判定、及び治療するために適合され得る。

【0043】

開示される方法は、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの増幅産物を産生する増幅ステップを含む。ＰＣＲ増幅は、典型的には、遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチドに対して、標的ポリヌクレオチドに存在する遺伝子改変を選択的に増幅するように構成され、参照ポリヌクレオチドは、非標的ポリヌクレオチドである。開示される方法はまた、典型的には、増幅産物が配列決定され、標的ポリヌクレオチドの遺伝子改変が同定される、配列決定ステップを含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、開示される方法は、（ａ）反応混合物中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施し、増幅産物を得ることであって、反応混合物は、（ｉ）試料または試料の画分、（ｉｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠き、３’→５’ヌクレアーゼ活性などの校正活性を含む、好ましくは、高忠実度ポリメラーゼ（例えば、約１０^－６未満のエラー率を有するポリメラーゼ）であるＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）遺伝子改変に隣接するプライマー対、及び（ｉｉｉ）遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションしてブロッキング二本鎖を形成し、増幅断片試料を得るブロッキングオリゴヌクレオチド、を含む、増幅産物を得ること、ならびに（ｂ）増幅産物を配列決定して、増幅産物中の遺伝子改変を検出し、それによって試料中の遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドを検出すること、を含む。反応混合物は、ＰＣＲ増幅を実施するための追加の成分（例えば、緩衝液、ＮＴＰ、二価カチオンなど）をさらに含み得る。

【0045】

開示される方法は、試料中の標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの混合物の約３％、２％、１％、０．５％、０．２５％、０．１２５％以下を表す標的ポリヌクレオチドを検出するために実施されてもよい。開示される方法のいくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、試料中の標的ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの混合物の約０．１２５％以下を表す。

【0046】

本開示の方法は、比較的低いエラー率を有するポリメラーゼを利用し得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、約１０^－５、１０^－６、または１０^－７未満のエラー率を有する。

【0047】

開示される方法は、典型的には、いくつかの増幅サイクルを含む増幅ステップを含む。開示される方法のいくつかの実施形態では、方法は、ＰＣＲ増幅が６０、５０、４０、または３０サイクル以下実施されるＰＣＲ増幅ステップを含む。

【0048】

開示される方法では、標的ヌクレオチドの遺伝子改変が、選択的に増幅または濃縮される。開示される方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変は、配列決定された増幅産物の少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％において検出される。開示される方法のいくつかの実施形態では、増幅産物は、複数のリードから配列決定され、遺伝子改変は、複数のリードのうちの少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％において検出される。

【0049】

開示される方法において、標的ポリヌクレオチドの遺伝子改変は、選択的に濃縮され、検出される。開示される方法のいくつかの実施形態では、試料中の遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと、一般的な変化（ｇｅｎｅｒｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を欠く参照ポリヌクレオチドとの混合物の約０．１２５％以下を表す。開示される方法が実施された後、いくつかの実施形態では、増幅産物は、複数のリードから配列決定され、遺伝子改変は、複数のリードの少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％において検出され、少なくとも約７２０倍（すなわち、９０％／０．１２５％＝７２０）の濃縮を表す。

【0050】

開示される方法は、典型的には、増幅産物の配列決定を含む。開示される方法のいくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、増幅産物を配列決定する前に、増幅産物から除去される。

【0051】

開示される方法は、典型的には、標的ヌクレオチド及び参照ポリヌクレオチドを含む混合試料中に存在する、標的ヌクレオチドを検出する。いくつかの実施形態では、開示される方法は、標的ポリヌクレオチドが相対的に低い割合で混合物中に存在するとき（例えば、標的ポリヌクレオチドが０．１％、０．０５％、０．０２％、または０．０１％以下の割合で混合物中に存在するとき）、標的ポリヌクレオチドを検出するために必要な最小数のＰＣＲサイクルを決定するステップを含む。

【0052】

開示される方法において、標的ポリヌクレオチドは、試料中に相対的に低い濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチドは、約１００００、１０００、１００、１０以下のコピー数で試料中に存在し得る。いくつかの実施形態では、開示される方法は、標的ポリヌクレオチドが約１００００、１０００、１００、１０またはそれ以下のコピー数で試料中に存在するときに、標的ポリヌクレオチドを検出するために必要なＰＣＲサイクルの最小数を決定するステップを含む。

【0053】

開示される方法では、標的ヌクレオチドの遺伝子改変が、選択的に増幅または濃縮される。遺伝子改変は、参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションしてブロッキング二本鎖を形成するブロッキングオリゴヌクレオチドを含むようにＰＣＲ増幅反応を構成することによって選択的に増幅または濃縮されてもよく、参照ポリヌクレオチドは一般的な変化（ｇｅｎｅｒｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を欠き、参照ポリヌクレオチドは非標的ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチド及び参照ポリヌクレオチドによって形成される二本鎖の安定性を高める、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと比較して、参照ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするためのブロッキングオリゴヌクレオチドの選択性を高める、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。

【0054】

ブロッキングオリゴヌクレオチドは、遺伝子改変を欠く（すなわち、参照ポリヌクレオチドが非標的ポリヌクレオチドである）参照ポリヌクレオチドと第１の二本鎖を形成し得、第１の二本鎖は、第１の融解温度Ｔ１を有する。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドと第２の二本鎖を形成し得、第２の二本鎖は第１の融解温度Ｔ２を有する。好ましくはＴ１＞Ｔ２である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、Ｔ１が、Ｔ２よりも少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５℃高い（すなわち、Ｔ１－Ｔ２が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５℃よりも高い）ように構成される。

【0055】

開示される方法では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。修飾ヌクレオチドには、限定されないが、ロック核酸（ＬＮＡ）またはブリッジ核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸、グリコール核酸、及びスレオース核酸が含まれ得る。ブロッキングオリゴヌクレオチド中の修飾ヌクレオチドの存在により、Ｔ１またはＴ２が変化し得る。好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチド中の修飾ヌクレオチドの存在は、Ｔ１を増加させる。好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチド中の修飾ヌクレオチドの存在は、Ｔ１とＴ２との間の差を増加させる。

【0056】

開示される方法では、ＰＣＲ反応混合物の温度を上げて一本鎖ＤＮＡを形成するために、標的ポリヌクレオチド及び参照ポリヌクレオチドを溶解してもよい。次に、温度は、ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションされたときにより低い融解温度を有するように構成されているため、ブロッキングオリゴヌクレオチドが選択的に参照ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポイントまで低下され得る。したがって、標的ポリヌクレオチドの割合と比較して、より高い割合の参照ポリヌクレオチドがブロッキングオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションされる。次に、ブロッキングオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションする位置に隣接するプライマーオリゴヌクレオチドを使用して、標的オリゴヌクレオチド及び参照オリゴヌクレオチドを増幅する。ＰＣＲ増幅中に、ブロッキングオリゴヌクレオチドの参照ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、ポリメラーゼの伸長を阻害する。その結果、標的ポリヌクレオチドが存在する場合、標的ポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドと比較してより高い程度まで増幅される。結果として、各ＰＣＲサイクル後、標的ポリヌクレオチドの増幅産物が濃縮される。標的ポリヌクレオチドの遺伝子改変を検出するために、標的ポリヌクレオチドの増幅産物のコピーの総数を配列決定を実施することができるポイントまで増加させるために、複数のＰＣＲサイクルを実施してもよい。

【0057】

好ましくは、開示される方法では、増幅中の伸長は、ブロッキングオリゴヌクレオチドが試料中の参照ポリヌクレオチド（非標的ポリヌクレオチドである）の比較的高い割合にハイブリダイゼーションされる温度、例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドが試料中の参照ポリヌクレオチド（非標的ポリヌクレオチドである）の約５０％超、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超えてハイブリダイゼーションされる温度で実施される。好ましくは、開示される方法では、増幅中の伸長は、ブロッキングオリゴヌクレオチドが試料中の比較的低い割合の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションされる温度、例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドが試料中の標的ポリヌクレオチドの約５０％未満、４０％、３０％、３０％、またはそれ未満にハイブリダイゼーションされる温度で実施される。

【0058】

ブロッキングオリゴヌクレオチドは、架橋核酸（ＢＮＡ）としても知られるロック核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ＬＮＡは、糖部分（例えば、リボース）が、２’酸素及び４’炭素を接続する架橋（すなわち、２’－Ｏ及び４’－Ｃが架橋部分を介してコンジュゲートされる）で修飾される修飾ヌクレオチドである。この橋は、Ａ型二本鎖によく見られる３’－ｅｎｄｏ（Ｎｏｒｔｈ）立体構造で糖部分を「ロック」する。この構造は、酵素分解に対する安定性の向上をもたらし、オリゴヌクレオチドの構成成分としての塩基対合における特異性及び親和性の向上ももたらす。ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合することができる。ＬＮＡの架橋部分は、アルキレン部分（例えば、メチレン架橋部分）及びアミノアルキレン部分（例えば、アミノメチレン架橋部分）を含み得る。ＬＮＡは、＋Ａ、＋Ｇ、＋Ｃ、または＋Ｔという名称で言及されてもよい。ブロッキングオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの全ては、ＬＮＡである。

【0059】

開示される方法は、比較的短い長さのブロッキングオリゴヌクレオチドを利用してもよい。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド以下の長さを有する。

【0060】

開示される方法は、参照ポリヌクレオチドに対して遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドを検出するために実施されてもよく、参照ポリヌクレオチドは非標的ポリヌクレオチドである。遺伝子改変は、例えば、標的ポリヌクレオチドが変異を含み、参照ポリヌクレオチドが野生型配列を含み、参照ポリヌクレオチドが非標的野生型ポリヌクレオチドである、野生型配列に対する変異を含み得る。開示される方法で検出される遺伝子改変は、置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせを含み得る。

【0061】

開示される方法で検出された遺伝子改変は、選択された遺伝子座に存在し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ、ＦＡＴ４、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＭＴ２Ｃ、及びＢＲＡＦのうちの１つ以上から選択される遺伝子座に存在する。

【0062】

開示される方法のいくつかの実施形態では、方法は、内部対照としての対照配列を増幅する追加的なプライマー対を利用する。内部対照を利用して、開示される方法のステップが意図されたとおりに行われていること及び／またはブロッキングオリゴヌクレオチドが意図されたとおりに参照ポリヌクレオチドの指数関数的増幅をブロックしている場合を示すことができる。

【0063】

開示される方法は、参照ポリヌクレオチドに対して異なる遺伝子改変を含む複数の標的ポリヌクレオチドを検出するために構成され得る。いくつかの実施形態では、開示される方法は、多重解析を実施するように構成される。

【0064】

いくつかの実施形態では、開示される方法は、各々が、２つ以上の標的ポリヌクレオチドと、参照ポリヌクレオチドとの混合物を含む試料中の、遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチド（参照ポリヌクレオチドが試料中の非標的ポリヌクレオチドである）に対して異なる遺伝子改変を含む、２つ以上の標的ポリヌクレオチドを検出するように構成される。開示される方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施して、（ｉ）試料または試料の画分、（ｉｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性及び３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ（例えば、３’→５’ヌクレアーゼ活性を含む熱安定性ポリメラーゼ）、好ましくは、高忠実度ポリメラーゼ（例えば、約１０^－６未満のエラー率を有する熱安定性ポリメラーゼ）であるＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉｉ）各プライマー対が、異なる遺伝子改変のうちの１つに隣接する、２つ以上のプライマー対、及び（ｉｖ）各々が、異なる遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションして、２つ以上のブロッキング二本鎖を形成するように構成される、２つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと、を含む、反応混合物中の増幅産物を得ることと、（ｂ）増幅産物を配列決定し、増幅産物中の異なる遺伝子改変を検出し、それによって、試料中の異なる遺伝子改変を含む、２つ以上の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含み得る。反応混合物は、ＰＣＲ増幅を実施するための追加の成分（例えば、緩衝液、ＮＴＰ、二価カチオンなど）をさらに含み得る。

【0065】

開示される方法は、試料中の標的ポリヌクレオチドを検出するために実施され得る。好適な試料には、生体試料または環境試料が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0066】

いくつかの実施形態では、試料は、血液試料または血液製剤試料（例えば、血漿または血清）である。いくつかの実施形態では、試料は、無細胞血液試料などの無細胞試料であり、例えば、血液試料は、開示される方法を実施する前に細胞を除去するように処理されている。

【0067】

開示される方法は、参照ポリヌクレオチドに対する標的ポリヌクレオチドの遺伝子改変を検出するために実施され得る。いくつかの実施形態では、開示される方法は、参照ポリヌクレオチドに対する標的ポリヌクレオチドのメチル化を検出するために実施されてもよい。開示される方法のいくつかの実施形態では、方法が実施される前に、試料は、亜硫酸水素塩試薬などの試薬で処理されており、この試薬は、非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して検出可能な修飾残基（例えば、ウラシル残基）を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない。いくつかの方法では、標的ポリヌクレオチド及び参照ポリヌクレオチドは、検出可能な修飾残基（例えば、ウラシルまたはチミジン）と、メチル化シトシン残基との存在に基づいて異なり得る。

【0068】

開示される方法は、参照ポリヌクレオチドに対する標的ポリヌクレオチドの遺伝子改変を検出するために実施され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、対象におけるがん、例えば、対象におけるがんに関連する変異に関連する。いくつかの実施形態では、開示される方法の最初のステップを実施する前に、方法は、対象からのがん試料を配列決定することと、がん試料中の遺伝子改変を検出することと、がんが遺伝子改変に関連していることを決定することと、を含む。開示される方法は、次いで、対象における遺伝子改変の存在をモニタリングするために実施されてもよく、遺伝子改変の存在は、対象におけるがんの進行を示す。

【0069】

開示される方法のいくつかの実施形態では、試料は、がんを有するか、またはがんを発症するリスクがある対象から得られる。開示される方法のいくつかの実施形態では、対象は、がんと診断されており、現在、例えば、対象が診断されたがんの治療を受けた後に寛解している。開示される方法は、対象におけるがんの再発を監視するために実施され得、対象における遺伝子改変の検出は、がんが再発したことを示す。

【0070】

また、開示される方法を実施するためのキットも本明細書に開示される。開示されたキットは、開示される方法を実施するための１つ以上の構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠き、３’→５’ヌクレアーゼ活性を備え、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼが高忠実度ポリメラーゼ（例えば、約１０^－６未満のエラー率を有する熱安定性ポリメラーゼ）であるＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）遺伝子改変に隣接する１つ以上のプライマー対、及び／または（ｉｉｉ）遺伝子改変を欠く参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションしてブロッキング二本鎖を形成する１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド、のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠き、３’→５’ヌクレアーゼ活性備えるＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ、ＦＡＴ４、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＭＴ２Ｃ、及びＢＲＡＦから選択される遺伝子座における、遺伝子改変に隣接する１つ以上のプライマー対、及び／または（ｉｉｉ）遺伝子改変を欠いている参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションして、ブロッキング二本鎖を形成し、増幅された断片試料（すなわち、対応する遺伝子改変の位置で野生型ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ、ＦＡＴ４、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＭＴ２Ｃ、及びＢＲＡＦのうちの１つ以上にハイブリダイゼーションするブロッキングオリゴヌクレオチド）を得る１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド、のうちの１つ以上を含む。開示されるキットは、ＬＮＡからなるブロッキングオリゴヌクレオチドを含み得、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド以下であってよい。

【0071】

開示される方法及びキットは、疾患または障害を有するまたは有する疑いのある対象など、それを必要とする対象を診断、予後判定、及び治療するために利用することができる。開示される方法は、診断及び／または予後判定を必要とする対象を診断及び／または予後判定することを含んでもよく、さらに、その後、対象を診断及び／または予後判定した後に、それを必要とする対象に治療を施すことを含んでもよい。本明細書で企図される方法は、（ａ）遺伝子改変を含む標的ポリヌクレオチドを検出する分析を要求することと、（２）その後、分析の結果に基づいて治療を対象に投与することと、を含み得る。

【実施例】

【0072】

以下の実施例は例示的なものであり、特許請求の範囲される主題の範囲を限定すると解釈されるべきではない。

【0073】

実施例１

【0074】

この実施例は、どのように低頻度バリアントが濃縮され検出されたかを説明する。この例では、低頻度バリアントは、いくつかのがんに関連するか、または存在することが知られているＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異である。

【0075】

ＫＲＡＳ野生型（カタログＨＤ７１０）及びＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ（カタログＨＤ２６９）のＤＮＡは、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから購入した。プライマー及びブロッカーを含むオリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログＭ０４９２Ｓ）及びＭｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ及びＤＮＡクリーンアップキット（Ｔ１０３０Ｓ）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。

【0076】

ＫＲＡＳ野生型配列は、配列番号１：

【0077】

（配列番号１）

【0078】

【化1】

によって提供される。

【0079】

ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ配列は、配列番号２によって提供され、Ｇ→ｔ塩基転換：

【0080】

（配列番号２）

【0081】

【化2】

を含む。

【0082】

プライマーは以下のように設計した。

【0083】

フォワードプライマー（配列番号３）：ＣＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＣＡＴＧＴＴＣ

【0084】

リバースプライマー（配列番号４）ＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣ

【0085】

オリゴヌクレオチドブロッカーは、以下のようにＬＮＡ（＋Ａ、＋Ｇ、＋Ｃ、または＋Ｔと表記）からなる：

【0086】

オリゴヌクレオチドブロッカー（配列番号５）

【化3】

【0087】

以下のように１００μｌの総反応体積を調製した。
・フォワードプライマー：０．１μＭの作動濃度（１μｌの１０ｕＭストック）
・リバースプライマー：０．１μＭの作動濃度（１μｌの１０μＭストック）
・野生型：５０ｎｇ（１４５００コピー）（１μｌの５０ｎｇ／ｕｌ）
・ヘテロ接合性ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ：０．２５ｎｇ（３６コピー、１８コピーの変異体及び１８の野生型）（０．５ｎｇ／ｕｌの０．５μｌ）
・ブロッカー：０．２μＭ（作動濃度（１μｌの２０ｕＭストック）
・２ｘ Ｑ５ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：１×の作動濃度（５０ｕμｌの２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）
・水（４５．５μｌ）

【0088】

フォワードプライマー（配列番号３）及びリバースプライマー（配列番号４）は、０．１μＭの最終濃度であった。ブロッカー（配列番号５）は、０．２μＭの濃度であった。Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘは１×濃度であった。５０ｎｇのＫＲＡＳ野生型ＤＮＡを添加し、０．２５ｎｇのＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＤＮＡを添加して混合物を作製した。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＤＮＡは、ヘテロ接合性であったため、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異を有するＤＮＡが混合物の０．２５％未満（すなわち、０．２５ｎｇ／２＝０．１２５ｎｇ ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＤＮＡ／（５０ｎｇ＋０．２５ｎｇ）＜０．２５％）を表した。ＫＲＡＳ野生型ＮＡの量は１４５００コピーを含み、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＤＮＡの量は３６コピーを含み、そのうち１８は変異ＤＮＡであり、そのうち１８はＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＤＮＡのヘテロ接合性による野生型ＤＮＡであった。作動溶液を短時間ボルテックスし、２５μｌを薄肉ＰＣＲチューブにアリコートした。したがって、各チューブは、９コピーのＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異ＤＮＡを含有した。

【0089】

ＰＣＲプロトコルを以下のように実施した。９５℃で６０秒、５５サイクル（９５℃で１０秒、７０℃で５秒、５５℃で２５秒）、７０℃で６０秒。ＰＣＲ生成物を、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲクリーンアッププロトコルを使用して精製した。精製生成物を２０ｎｇ／ｕｌに希釈し、Ａｚｅｎｔａ Ｇｅｎｅｗｉｚ Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＥＺサービスを使用して配列決定した。

【0090】

生のシークエンスリードを、変異体及び野生型配列にアラインさせた。リードを、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異の外側のリードに追加の突然変異が存在するか、または存在しない３つのカテゴリー（野生型ヌクレオチド（Ｇ）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃヌクレオチド（ｔ）、または他のヌクレオチド）に分離した。出発混合物は、＜０．２５％の変異ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＤＮＡを有した。濃縮後、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異を含有するリードは、クオリティリードの９５％超を表した。

【0091】

図１は、対照反応の結果を示す。０．２５％未満のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＤＮＡ及び９９．７５％超のＫＲＡＳ野生型ＤＮＡを含む混合試料を、ブロッキングオリゴヌクレオチドの不存在下で増幅し、配列決定した。１７４３９８リードは、野生型ヌクレオチドを含有すると決定され（９９．６９％）、４９０リードは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃヌクレオチドを含有し（０．２８％）、５２リードは、野生型ヌクレオチドもＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃヌクレオチドも含有しない（０．０３％）。

【0092】

図２は、ブロッキングオリゴヌクレオチドとの試験反応の結果を示す。０．２５％未満のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ ＤＮＡ及び９９．７５％超のＫＲＡＳ野生型ＤＮＡを含む混合試料を、ブロッキングオリゴヌクレオチド（配列番号５）の存在下で増幅し、配列決定した。４６４リードは、野生型ヌクレオチドを含有すると決定され（０．６％）、７６８４２リードは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃヌクレオチドを含有し（９９．３７％）、３１リードは、野生型ヌクレオチドもＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃヌクレオチドも含有しない（０．０４％）。

【0093】

上記の説明では、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に様々な置換及び修正が行われ得ることが当業者には容易に明らかであろう。本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または複数の要素、限定または複数の限定の不在下で実施され得る。使用されている用語及び表現は、限定ではなく、説明の用語として使用され、そのような用語及び表現の使用において、示され、説明される、特徴、またはその一部の任意の等価物を除外することは意図されず、本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。したがって、本発明は特定の実施形態及び任意の特徴によって示されているが、本明細書に開示される概念の修正及び／または変形は、当業者によってなされ得、そのような修正及び変形は、本発明の範囲内であるとみなされることを理解されたい。

【0094】

いくつかの特許及び非特許参考文献への引用が本明細書で行われる。引用される参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。引用文献における用語の定義と比較して、本明細書における用語の定義との間に矛盾がある場合、用語は、本明細書における定義に基づいて解釈されるべきである。
配列表
＜１１０＞ＮｅｘＧｅｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＬＬＣ
＜１２０＞ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ Ａ ＴＡＲＧＥＴ ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＩＮ Ａ ＭＩＸＥＤ ＳＡＭＰＬＥ
＜１３０＞ＮＧ．２０２１－０９－１３．ＰＣＴ
＜１５０＞ＵＳ６３／２４３，３９０
＜１５１＞２０２１－０９－１３
＜１６０＞５
＜１７０＞ＰａｔｅｎｔＩｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．５
＜２１０＞１
＜２１１＞１４３
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ホモ・サピエンス
＜４００＞１

【化4】

＜２１０＞２
＜２１１＞１４３
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ホモ・サピエンス
＜４００＞２

【化5】

＜２１０＞３
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞人工
＜２２０＞
＜２２３＞ヒトＫＲＡＳのフォワードプライマー
＜４００＞３

【化6】

＜２１０＞４
＜２１１＞２０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞人工
＜２２０＞
＜２２３＞ＫＲＡＳのリバースプライマー
＜４００＞４

【化7】

＜２１０＞５
＜２１１＞１０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞人工
＜２２０＞
＜２２３＞ＫＲＡＳのブロッキングオリゴヌクレオチド
＜４００＞５

【化8】

【図1】

【図2】

【配列表】

2024531713000001.xml

【国際調査報告】