特表 2024-531721 患者の腫瘍のネオアンチゲンをコードする二本鎖ＤＮＡプールを生成する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】患者の腫瘍のネオアンチゲンをコードする二本鎖ＤＮＡプールを生成する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20240822BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240822BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240822BHJP

【ＦＩ】

C12N15/31 ZNA

C12N15/12

C12N15/113 Z

C12P19/34 A

A61P35/00

A61P29/00

A61K39/00 H

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516455

(86)(22)【出願日】2022-09-13

(85)【翻訳文提出日】2024-04-30

(86)【国際出願番号】 EP2022075374

(87)【国際公開番号】W WO2023036999

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】21196366.5

(32)【優先日】2021-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21196390.5

(32)【優先日】2021-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21196406.9

(32)【優先日】2021-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524095579

【氏名又は名称】オンコディーエヌエー

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100183656

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 晃

(74)【代理人】

【識別番号】100224786

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 卓之

(74)【代理人】

【識別番号】100225015

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 彩夏

(74)【代理人】

【識別番号】100231647

【弁理士】

【氏名又は名称】千種 美也子

(72)【発明者】

【氏名】デティッフ，ジャン－ポール

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン フッフェル，クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】マルカイルー，チャールズ

【テーマコード（参考）】

4B064

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B064AF27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4C085AA03

4C085BB23

4C085DD51

4C085EE01

(57)【要約】

対応するＲＮＡ分子への転写のためのプロモーターの制御下にある腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする１つのセグメントおよび翻訳されるＲＮＡ分子をペプチドに翻訳するためのセグメントを含む合成ＤＮＡ分子。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対応するＲＮＡ分子への転写のためのプロモーターの制御下にある、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする１つのセグメント、および翻訳されるＲＮＡ分子のペプチドへの翻訳のためのセグメントを含む合成ＤＮＡ分子。

【請求項2】

小胞領域で腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを安定化および／または標的化および／または輸送するための配列および／またはコードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをＭＨＣ分子にアドレスさせるための配列をコードするセグメントをさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ分子。

【請求項3】

翻訳エンハンサーをコードするセグメントおよび／または３’－ＵＴＲおよび／または３’ポリＡテールセグメントおよび／または５’－ＵＴＲをさらに含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ分子。

【請求項4】

１つの鎖あたり１００ヌクレオチドから１つの鎖あたり約２５００ヌクレオチドまで、好ましくは、１つの鎖あたり３００ヌクレオチドから１つの鎖あたり約８００ヌクレオチドまで、より好ましくは、１つの鎖あたり約４００ヌクレオチドから１つの鎖あたり約７００ヌクレオチドまで、さらにより好ましくは、１つの鎖あたり約５００（または５５０）ヌクレオチドから１つの鎖あたり約６５０（または６００）ヌクレオチドまでを含むサイズを有しおよび二本鎖である、請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。

【請求項5】

抗原をＭＨＣ分子にアドレスさせるためのペプチドの（第２の）部分をコードするセグメント、（ｉｉ）転写されるＲＮＡの安定性を増大させるための、または転写されるＲＮＡのタンパク質への翻訳を増大させるためのセグメント、および（ｉｉｉ）ポリＡテールをコードするセグメントを含む、ＤＮＡ分子。

【請求項6】

アンチセンスである、請求項５に記載のＤＮＡ分子、好ましくは請求項１～４のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子をセンスＤＮＡ分子として塩基対形成するためのアンチセンスである、請求項５に記載のＤＮＡ分子。

【請求項7】

プロモーターの制御下で、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードするＤＮＡ分子の化学合成を行う工程を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子の製造方法。

【請求項8】

請求項７に記載の方法であって、
（ｉ） ＲＮＡへの転写のためのプロモーター、その翻訳のためのセグメントおよび腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープとインフレームで融合されるエンドソームにアドレスさせるための標的化配列、およびＴリンパ球への提示のための、コードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを負荷するための配列をコードする遺伝要素の第１の部分、を含む第１の一本鎖ＤＮＡ分子、および
（ｉｉ） Ｔリンパ球への提示のための、コードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープの負荷のための配列をコードする遺伝要素の第２の部分をコードする第２の一本鎖ＤＮＡ分子であって、該第２の一本鎖ＤＮＡ分子はアンチセンスであり、および前記第１の部分および第２の部分は、Ｔリンパ球への提示のための腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープの負荷のための完全な配列を形成するものであって、前記第１の部分および第２の部分は、（少なくとも１５の連続するヌクレオチドの）重複が存在し、特定の塩基対形成を可能にする、第２の一本鎖ＤＮＡ分子
の化学合成を行う工程を含み、
前記方法は、（ｉ）のＤＮＡ分子を（ｉｉ）のＤＮＡ分子とハイブリダイズさせる工程、およびプロモーター、翻訳エンハンサー、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをインフレームで融合されるエンドソームにアドレスさせるための標的化配列、およびＴリンパ球への提示のためのコードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープの負荷のための配列をコードする遺伝要素をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を生成するために２つの分子を伸長する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

（ｉｉ）のＤＮＡ分子が３’－ＵＴＲおよび／またはポリＡテールをさらに含む、請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

請求項１～５のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子のプール、または請求項７～９のいずれか１項に記載の方法で得ることができるＤＮＡ分子のプールであって、前記ＤＮＡ分子のプールは複数の異なる腫瘍ネオアンチゲンもしくは感染病原体由来の複数の異なるエピトープを含むものである、請求項１～５のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子のプール、または請求項７～９のいずれか１項に記載の方法で得ることができるＤＮＡ分子のプール。

【請求項11】

請求項１０に記載のＤＮＡ分子のプールであって、前記ＤＮＡ分子のプールの複数のＤＮＡ分子が腫瘍ネオアンチゲンもしくは感染病原体由来のエピトープのＲＮＡへの転写のための同一のプロモーターを有する、請求項１０に記載のＤＮＡ分子のプール。

【請求項12】

請求項１０または１１に記載のＤＮＡ分子のプールであって、前記ＤＮＡ分子のプールの複数のＤＮＡ分子が、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをエンドソームに標的化するための配列をコードする同一の遺伝要素、および／または同一の翻訳エンハンサーおよび／またはＴリンパ球への提示のためのコードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを負荷するための配列をコードする同一の遺伝要素および／または同一の３’－ＵＴＲを有する、請求項１０または１１に記載のＤＮＡ分子のプール。

【請求項13】

請求項１～４のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子または請求項１０～１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子のプールを生成する工程、およびＤＮＡ分子のＲＮＡ分子へのインビトロ転写を行う工程を含む、患者に影響を与えるがんに対するＲＮＡワクチンの生成方法。

【請求項14】

ＲＮＡ分子をワクチンに配合する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

患者に影響を与えるがんまたは感染症の治療における使用のための、請求項１４の方法によって得られるワクチン。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、腫瘍ネオアンチゲンを生成するための、患者のゲノムから抽出された情報の使用に関する。特に、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体（infectious agent）由来のエピトープをコードする１つのセグメントを含む合成ＤＮＡ分子の発見に関する。このような合成ＤＮＡ分子は、ＲＮＡワクチン、例えば患者の腫瘍の腫瘍ネオアンチゲンを含む個別化ワクチン、または感染病原体由来のエピトープを含むワクチンの鋳型として使用され得る。

【0002】

より具体的には、限定されるものではないが、本開示は、ＲＮＡワクチンに転写できるＤＮＡ分子の製造方法に関する。

【0003】

本開示はまた、本発明によるＤＮＡ分子のプールにも関する。

【0004】

本開示はまた、本発明によるＤＮＡ分子または本発明によるＤＮＡ分子のプールを生成する工程を含む、患者に影響を及ぼすがんに対するＲＮＡワクチンの生成方法に関する。

【0005】

本開示はまた、本発明によるＲＮＡワクチンの生成方法によって得られるワクチンにも関する。

【背景技術】

【0006】

特許文献１は、de novo遺伝子合成の方法を提供する。特に、この文献は大きな遺伝子ライブラリーや比較的長いオリゴヌクレオチド断片をエラーが少なく効率的に迅速に合成できる方法、装置、およびシステムを提供する。de novo遺伝子合成に使用される基板はシリコンである。

【0007】

特許文献２は、所定の核酸配列を提供すること、各前駆体二本鎖核酸断片は２本の鎖を有するものである、複数の前駆体二本鎖核酸断片を提供すること、を含む核酸アセンブリのための方法を提供するものであって、それぞれの二本鎖は、５’－Ａ（Ｎｘ）Ｔ－３’または５’－Ｇ（Ｎｘ）Ｔ－３’の粘着末端配列を含み、Ｎはヌクレオチドであり、ｘはヌクレオチドＡとＴの間、またはＧとＣの間のヌクレオチドの数であり、ｘは１から１０であり、および同じ粘着末端配列を含む前駆体二本鎖核酸断片が２つ以下である、方法を提供する。

【0008】

特許文献３は、オリゴ核酸を合成するための装置であって、プレートと、 メインチャネルを備えるものであって、メインチャネルはプレートの上面の開口部からプレート内に垂直に延びるものであり、およびメインチャネルの幅は０．５～２ｍｍであり、およびメインチャネルに接続された複数のマイクロチャネルであって、複数のマイクロチャネルの各マイクロチャネルは、プレートの底面側の開口部からメインチャネル内に垂直に延びるものである、装置を提供する。

【0009】

特許文献４は、非常に正確で均一なポリヌクレオチドライブラリーを効率的にde novo合成するためのシステム、方法、および組成物を提供する。特に、特許文献４は、ａ）表面を含む構造を提供する工程、ｂ）少なくとも１つのヌクレオシドを表面に付着したポリヌクレオチドに結合させる工程、ｃ）表面に酸化溶液を堆積させる工程、ｄ）洗浄溶剤を表面に付着させる工程であって、該洗浄溶剤は、ケトン、エステル、エーテル、炭化水素、またはそれらの機能的等価物を含む、工程、およびｅ）工程ｂ～ｄを繰り返して複数のポリヌクレオチドを合成する工程、を含む、ポリヌクレオチド合成方法を提供する。

【0010】

特許文献５は、対象のほぼすべてのがんタンパク質またはその断片を生成するように体の細胞機構に安全に指示できるリボ核酸 (RNA)がんワクチンを提供する。この文献では、２０個のエピトープまたは５２個のエピトープを有するがんワクチンが例示されている。この文献には、エピトープのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡがんワクチンが記載されている。

【0011】

特許文献６は、ワクチン核酸が所与の長さに対して最大の抗がん効果を有する、ｍＲＮＡワクチンを用いて患者のがんを治療する方法を記載する。

【0012】

非特許文献１は、抗原をＭＨＣ分子に結合させることによる抗原提示の効率に言及するものであって、記載されているベクターはプロモーター、ポリＡテール、および３’ＵＴＲ配列を持っている。

【0013】

非特許文献２は、ＣＭＶ、ＥＢＶおよびインフルエンザの３２個のエピトープをコードするポリエピトープｍＲＮＡ構築物のインビトロ転写であって、該ｍＲＮＡ構築物はＤＣ－ＬＡＭＰシグナル配列、３’－ＵＴＲ配列およびポリＡ尾部を含む、インビトロ転写を記載する。

【0014】

特許文献７は、マラリアに対するワクチンのための方法および組成物であって、該ワクチンが、プラスミドまたはアデノウイルス発現ベクターを使用して産生されるいくつかの抗原のカクテルを含むことができる、方法および組成物を記載する。

【0015】

残念ながら、これらの文献はこれらの技術の利点を説明しているが、現在、患者の腫瘍から同定された腫瘍特異的抗原（ネオアンチゲン）または感染病原体由来のエピトープをコードするＤＮＡ分子、好ましくは２００ヌクレオチドを超える長さの長いＤＮＡ分子、のde novo合成が存在しない。特に、複数の異なる腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする複数のＤＮＡ分子をプール内で生成することを可能にする前記ＤＮＡ分子をプール内で生成する方法は存在しない。実際、病気、例えばがんは、多数の疾患特異的抗原によって特徴付けられる場合がある。効率的な個別化ＲＮＡワクチンの製造は、患者において適切な免疫学的反応を誘発できる十分に多数の疾患特異的抗原、例えば腫瘍ネオアンチゲンを含むワクチンの開発にかかっている。現在、個別化ワクチンの有効性は高くなく、その理由の一部は、ワクチンに組み込むことができる個別化エピトープまたはネオアンチゲンの数が限られているという事実である。実際、最先端の個別化ワクチンは、エピトープのコンカテマーを有するオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡまたはＲＮＡに基づく。ＤＮＡまたはＲＮＡのサイズは、対応するプラスミドの最大サイズによって制限される。サイズが限定されているため、異なるエピトープを標的とする特異的なＴ細胞の産生を特徴とする大きな免疫応答を誘発するために必要な、非常に多数の異なるエピトープを組み込むことができない。最先端技術では、ワクチンの鋳型として使用できるコンカテマーエピトープを含むＤＮＡ断片のde novo産生についても言及されているが、そのようなde novo産生は２００ヌクレオチド以下の長さを有する短いＤＮＡ断片の合成であって、これらの短いＤＮＡ断片は、複数のライゲーションによってさらに組み立てられるものによって制限される。したがって、最新技術による現在の方法におけるもう一つの重要な制限は、得られるＤＮＡ断片にエラーを導入する可能性がある複数のライゲーション工程の存在である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【特許文献1】US2015038373A1

【特許文献2】WO2016126987A1

【特許文献3】WO2016172377A1

【特許文献4】US2020222875

【特許文献5】EP3576751

【特許文献6】W02020/097291

【特許文献7】WO2018/183922

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Kreiter Sebastianら、The Journal of Immunology, Vol180, 2008, pp 309-318

【非特許文献2】Nielsenら、Journal ofImmunological Methods, Vol 360, 2010, pp 149-156)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

したがって、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする１つのセグメントを含む合成ＤＮＡ分子であって、好ましくは該ＤＮＡ分子は２００ヌクレオチド以上の長さを有し、プール内に存在する異なるＤＮＡ分子の数に制限なくＤＮＡ分子のプール内で生成することができるものである合成ＤＮＡ分子、を処理する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本発明によれば、対応するＲＮＡ分子への転写のためのプロモーターの制御下にある腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする１つのセグメントと、翻訳されるＲＮＡ分子のペプチドへの翻訳のためのセグメントとを含む合成ＤＮＡ分子が提供される。

【0020】

本発明によれば、（ｉ）抗原をＭＨＣ分子に対応させる（addressing）ためのペプチドの（第２の）部分をコードするセグメント、（ｉｉ）転写されるＲＮＡの安定性を増加させるか、または転写されるＲＮＡのタンパク質への翻訳を増加させるためのセグメント、および（ｉｉｉ）ポリＡテールをコードするセグメント、を含む(相補的) ＤＮＡ分子も提供される。詳細な説明でさらに説明するように、本発明による前記（相補的）ＤＮＡ分子は、リバースプライマーとして使用され、１つのリバースプライマーのみを使用してプール内で複数の二本鎖ＤＮＡ分子の生成を可能にする。

【0021】

本発明は、プロモーターの制御下で腫瘍ネオアンチゲンをコードするＤＮＡ分子の化学合成を行う工程を含む、本発明によるＤＮＡ分子の製造方法にも関する。

【0022】

本発明の別の対象は、本発明によるＤＮＡ分子のプール、または本発明による方法によって得られるＤＮＡ分子のプールであって、前記プールは、複数の異なる腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体に由来するエピトープを含む。実際、複数の異なる腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来の異なるエピトープを含む本発明によるＤＮＡ分子のプールは、該プール中に存在する異なるネオアンチゲンまたはエピトープの数に制限はない。結果として、本発明によるＤＮＡ分子のプールは、患者の無制限の数のネオアンチゲンを組み込むことができる患者の個別化ワクチンの鋳型として機能することができ、したがって、最適な免疫学的応答を誘発し、個別化ワクチンの高い有効性を保証することができる。

【0023】

本発明は、本発明によるＤＮＡ分子または本発明によるＤＮＡ分子のプールを生成する工程、およびＤＮＡ分子をＲＮＡ分子にインビトロ転写する工程を含む、患者に影響を及ぼすがんに対するＲＮＡワクチンの生成方法にも関する。

【0024】

本発明は、本発明による工程によって得られるワクチンにも関する。

【0025】

従属請求項は、他の有利な実施形態について言及している。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１は対応する転写されるＲＮＡおよび翻訳されるポリヌクレオチドとともに異なる断片を含む、本発明によるＤＮＡ分子の模式図である。

【図2】図２は本発明によるＤＮＡ分子の様々なバリエーションを示す。

【図3】図３は２つの一本鎖ＤＮＡ分子の重複領域を伴う本発明によるＤＮＡ分子を示す。

【図4】図４は第１および第２の一本鎖ＤＮＡ分子間の部分的重複ハイブリダイゼーションを説明する模式図を示す。

【図5】図５は本発明によるＤＮＡ分子のプールを示す。

【図6】図６は本発明によるＤＮＡ分子の配列の一例を示す。

【図7】図７は本発明によるＤＮＡ分子の配列および対応するタンパク質配列の一例を示す。

【図8】図８はフォワード（forward）プライマーおよびリバース（reverse）プライマーとともに、本発明によるＤＮＡ分子の配列および対応するタンパク質配列の一例を示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

図面では、同じ参照番号が同じまたは類似の要素に割り当てられている。

【0028】

本発明の他の特徴および利点は、非限定的な以下の説明から、また図面および実施例を参照することによって導き出されるであろう。

【0029】

図１は、本発明による合成ＤＮＡ分子1.10は、対応するＲＮＡ分子1.20への転写のためのプロモーター1.11の制御下にある腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする１つのセグメント1.13と、転写された前記ＲＮＡ分子1.20のペプチド1.30への翻訳1.12のためのセグメントを備えることを示す模式図を示す。好ましくは、本発明による合成ＤＮＡ分子1.10は、腫瘍ネオアンチゲンを１つだけまたは感染病原体由来のエピトープを１つだけをコードするセグメント1.13を含んでなる。

【0030】

好ましくは、ＤＮＡ分子1.10 は一本鎖ＤＮＡ分子として合成される。

【0031】

好ましくは、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードするセグメント1.13は、21～504ヌクレオチド、好ましくは51～201ヌクレオチド、より好ましくは63～84ヌクレオチド、有利には81ヌクレオチドを含む配列であり、セグメント1.13は、患者の腫瘍の腫瘍ネオアンチゲンを都合よくコードする。

【0032】

図２は、本発明によるＤＮＡ分子1.10は、好ましくは、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを小胞領域または細胞表面にアドレス（addressing）および／または安定化および／または標的化および／または輸送するための配列をコードするセグメント2.11をさらに含むことを示す。好ましくは、ＤＮＡ分子1.10は、コードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをＭＨＣ分子に対応させるための配列をコードするセグメント2.21を含んでいる。有利には、ＤＮＡ分子1.10は、翻訳エンハンサーをコードするセグメント2.31をさらに含む。

【0033】

好ましくは、ＤＮＡ分子1.10は、３’－ＵＴＲおよび／または３’ポリＡテールセグメント2.41および／または５’－ＵＴＲを含む。有利には、本発明によるＤＮＡ分子は、図１および図２に示されるＤＮＡ分子に限定されない。実際に、本発明によるＤＮＡ分子は、少なくともプロモーター1.11、翻訳用セグメント1.12、および腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードするセグメント1.13を含む。好ましくは、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを安定化するための、および／または小胞領域および／または細胞表面にそれを標的化および／または輸送するための配列をコードするセグメント2.11、および／またはコードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをＭＨＣ分子にアドレスさせるための配列をコードするセグメント2.21、および／または翻訳エンハンサーおよび／または３’－ＵＴＲおよび／または３’ポリＡテールセグメント2.41および／または５’－ＵＴＲをコードするセグメント2.31、またはセグメント2.11および／または2.21および／または2.31および／または2.41の任意の組み合わせをさらに含んでよい。本発明によれば、ＤＮＡ分子の異なるセグメント1.11および／または1.12および／または2.11および／または1.13および／または2.21および／または2.31および／または2.41の５’から３’への連続順序は変化してもよく、図１～図３に示されるＤＮＡ分子で示される連続順序に限定されない。有利には、本発明者らは、ＤＮＡ分子1.10に付加された各ＤＮＡセグメント2.11および／または2.21および／または2.31および／または2.41が、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープ1.13のペプチド発現をそれぞれ約５倍増加させることを見出した。

【0034】

有利には、対応するＲＮＡ分子への転写のためのプロモーターの制御下にある腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする１つのセグメントおよび転写されるＲＮＡ分子をペプチドに翻訳するためのセグメントを含む合成ＤＮＡ分子は、小胞領域における腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを安定化および／または標的化および／または輸送するための配列をコードするセグメントをさらに含み、および好ましくはコードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをＭＨＣ分子にアドレスさせるための配列をコードするセグメント、翻訳エンハンサーをコードするセグメント、および３’－ＵＴＲおよび／または３’ポリＡテールセグメントおよび／または５’－ＵＴＲをさらに含む。

【0035】

あるいは、対応するＲＮＡ分子への転写のためのプロモーターの制御下にある腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする１つのセグメントおよび転写される前記ＲＮＡ分子をペプチドに翻訳するためのセグメントを含む合成ＤＮＡ分子は、コードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをＭＨＣ分子にアドレスさせるための配列をコードするセグメントをさらに含み、および好ましくは小胞領域における腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを安定化および／または標的化および／または輸送するための配列をコードするセグメント、翻訳エンハンサーをコードするセグメント、および３’－ＵＴＲおよび／または３’ポリＡテールセグメントおよび／または５’－ＵＴＲをさらに含む。

【0036】

あるいは、対応するＲＮＡ分子への転写のためのプロモーターの制御下にある腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする１つのセグメントおよび転写される前記ＲＮＡ分子をペプチドに翻訳するためのセグメントを含む合成ＤＮＡ分子は、翻訳エンハンサーをコードするセグメントをさらに含み、および好ましくは小胞領域における腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを安定化および／または標的化および／または輸送するための配列、コードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをＭＨＣ分子にアドレスさせるための配列をコードするセグメントおよび３’－ＵＴＲおよび／または３’ポリＡテールセグメントおよび／または５’－ＵＴＲをさらに含む。

【0037】

あるいは、対応するＲＮＡ分子への転写のためのプロモーターの制御下にある腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする１つのセグメントおよび転写される前記ＲＮＡ分子をペプチドに翻訳するためのセグメントを含む合成ＤＮＡ分子は、３’－ＵＴＲおよび／または３’ポリＡテールセグメントおよび／または５’－ＵＴＲをさらに含み、および好ましくは小胞領域における腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを安定化および／または標的化および／または輸送するための配列、コードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをＭＨＣ分子にアドレスさせるための配列、および翻訳エンハンサーをコードするセグメントをさらに含む。

【0038】

好ましくは、プロモーター1.11は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。より好ましくは、プロモーター1.11は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼ、ＫＰ３４ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含むプロモーターの群に属する。さらにより好ましくは、本発明によると、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列は、その配列全長にわたって配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼに対する結合配列であり、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列は、その配列全長にわたって配列番号７３に対して少なくとも９５％の同一性を有するＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼに対する結合配列であり、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列は、その配列全長にわたって配列番号７４に対して少なくとも９５％の同一性を有するＴ３ＲＮＡポリメラーゼに対する結合配列であり、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列は、その配列全長にわたって配列番号７５に対して少なくとも９５％の同一性を有するＳｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼに対する結合配列であり、ＫＰ３４ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列は、その配列全長にわたって配列番号７６（強プロモーター１）に対して、またはその配列全長にわたって配列番号７７（強プロモーター２）に対して、またはその配列全長にわたって配列番号７８（弱プロモーター）に対して、少なくとも９５％の同一性を有するＫＰ３４ＲＮＡポリメラーゼに対する結合配列である。好ましくは、本発明によるプロモーター1.11は、その配列全長にわたって配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列である。

【0039】

有利には、翻訳用セグメント1.12は、ＤＮＡ分子1.10の５’ＵＴＲ領域（コード領域の上流）に位置する翻訳エンハンサー配列である。ＤＮＡ分子1.10のコード領域、コード部分は、図１、図２および図３の灰色のボックスで表される。好ましくは、翻訳1.12のセグメントはヒトサイトメガロウイルス (CMV)エンハンサー、アルファまたはベータグロビンエンハンサー、EF-1アルファエンハンサー、サルウイルス40 (SV40)エンハンサー、PGK1プロモーター、HSD17B4プロモーター、ユビキチン Ｃプロモーター、およびベータアクチンプロモーターを含む翻訳エンハンサー／プロモーター配列の群から選択される翻訳エンハンサー／プロモーター配列である。より好ましくは、翻訳 1.12 のセグメントは、ベータグロビン翻訳エンハンサー配列である。好ましくは、該ベータグロビン翻訳エンハンサー配列は、その配列全長にわたって配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する。

【0040】

好ましくは、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを小胞領域にアドレスおよび／または安定化および／または標的化および／または輸送するための配列をコードするセグメント2.11は、エンドソームプロセシングのためのシグナル配列、例えば、リソソーム関連膜タンパク質のシグナル配列（ＬＡＭＰ１またはＬＡＭＰ２；例えば、配列番号３など）、あるいは樹状細胞（ＤＣ－ＬＡＭＰ）のシグナル配列、またはＭＨＣ－Ｉに結合させるための小胞コンパートメントにアドレスさせるための配列である。好ましくは、エンドソームプロセシングのためのシグナル配列であって、前記シグナル配列は、その配列全長にわたって配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を好ましくは有する。

【0041】

好ましくは、セグメント2.21は、コードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをＭＨＣ分子にアドレスさせるための配列をコードしており、Ｔリンパ球に提示するための免疫プロセシングである。より好ましくは、セグメント2.21は、好ましくは配列全長にわたって配列番号５に対して少なくとも９５％の同一性を有する、樹状細胞リソソーム関連膜糖タンパク質シグナル配列である。

【0042】

有利には、翻訳エンハンサーをコードするセグメント2.31は、ＤＮＡ分子1.10の３’ＵＴＲ領域（コード領域の下流）に優先的に位置する翻訳エンハンサーおよび／または翻訳安定化配列である。好ましくは、セグメント2.31は、βグロビン翻訳エンハンサー配列であり、βグロビン翻訳エンハンサーは、好ましくは、その配列全長にわたって配列番号６に対して少なくとも９５％の同一性を有する。

【0043】

好ましくは、セグメント2.41は、少なくとも６８ヌクレオチドの、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドの３’ポリＡテール配列である。

【0044】

好ましくは、ＤＮＡ分子は、保存された配列要素に対応する３’および／または５’セグメント（３’および／または５’ＣＳＥセグメント）をさらに含み得る。これらの３’および／または５’ＣＳＥセグメントは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）によって有利に認識され、転写されるＤＮＡ分子のＲＮＡ増幅を可能にする。

【0045】

有利には、本発明によるＤＮＡ分子は、１つの鎖あたり１００ヌクレオチドから１つの鎖あたり約２５００ヌクレオチドまで、好ましくは、１つの鎖あたり３００ヌクレオチドから１つの鎖あたり約８００ヌクレオチドまで、より好ましくは、１つの鎖あたり約４００ヌクレオチドから１つの鎖あたり約７００ヌクレオチドまで、さらにより好ましくは、１つの鎖あたり約５００（または５５０）ヌクレオチドから１つの鎖あたり約６５０（または６００）ヌクレオチドまでのサイズを有する。

【0046】

図３は、本発明に従って、（相補的）ＤＮＡ分子3.20が、（ｉ）抗原（エピトープ1.13）をＭＨＣ分子にアドレスさせるためのペプチドのセグメント2.21の（第２の）部分をコードするセグメント、（ｉｉ）転写されるＲＮＡの安定性を増大させるため、または転写されるＲＮＡのタンパク質への翻訳を増大させるためのセグメント2.31、および（ｉｉｉ）ポリＡテールをコードするセグメント2.41を含むことを示す。

【0047】

有利には、本発明によるアンチセンスであるＤＮＡ分子3.20は、好ましくはセンスＤＮＡ分子3.10と塩基対形成するためのものであって、前記ＤＮＡ分子3.10は、対応するＲＮＡ分子への転写のためのプロモーターの制御下で、抗原またはエピトープをコードするセグメント1.13、その翻訳用のセグメント1.12、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを小胞領域にアドレスおよび／または安定化および／または標的化および／または輸送するための配列をコードするセグメント2.11およびＴリンパ球に提示するための抗原を負荷（loading）するためのペプチドのセグメント2.21の（第１の）部分をコードするセグメントを含むものであって、ここで前記第１の部分と第２の部分は、Ｔリンパ球に提示するための抗原を負荷するための完全な配列2.21を形成するものであって、および、前記第１の部分および第２の部分は、センスおよびアンチセンスであり、ＤＮＡ分子3.10とＤＮＡ分子3.20との塩基対形成を可能にする重複配列3.30が存在する。

【0048】

有利には、重複配列3.30は、少なくとも５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、有利には少なくとも２０ヌクレオチドおよび／または好ましくは最大１００ヌクレオチド、より好ましくは最大７５ヌクレオチド、有利には最大４０ヌクレオチドの連続した配列である。好ましくは、重複配列3.30は、定常配列領域（constant sequence region）に位置する。本発明によれば、定常配列領域とは、本発明によるあらゆるＤＮＡ分子1.10に存在する配列領域を指す。

【0049】

好ましくは、重複配列は、その配列全長にわたって、配列番号５のうちのヌクレオチド３０～５２に対応する配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列である。

【0050】

好ましくは、本発明によるＤＮＡ分子の製造方法は、プロモーターの制御下で腫瘍ネオアンチゲンをコードするＤＮＡ分子の化学合成を行う工程を含む。

【0051】

好ましくは、化学合成は、シリコンベースのＤＮＡ書き込み技術（すなわち、US2018104664A1）を使用した一本鎖オリゴヌクレオチド合成である。

【0052】

好ましくは、本発明による方法は：
（ｉ） ＲＮＡへの転写のためのプロモーター1.11、その翻訳のためのセグメント1.12および、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープ1.13とインフレームで融合されるエンドソームにアドレスさせるための標的化配列2.11およびＴリンパ球への提示のための、コードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを負荷するための配列をコードする遺伝要素2.21の第１の部分、を含む第１の一本鎖ＤＮＡ分子、および
(ii) Ｔリンパ球への提示のための、コードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープの負荷のための配列をコードする遺伝要素2.21の第２の部分をコードする第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20であって、該第２の一本鎖ＤＮＡ分子はアンチセンスであり、および前記第１の部分および第２の部分は、Ｔリンパ球への提示のための腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープの負荷のための完全な配列2.21を形成するものであって、前記第１の部分および第２の部分は、（少なくとも１５の連続するヌクレオチドの）重複3.30が存在し、特定の塩基対形成を可能にする、第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20、
の合成を行う工程を含む方法であって、
前記方法は、（ｉ）のＤＮＡ分子を（ｉｉ）のＤＮＡ分子とハイブリダイズさせる工程、および、プロモーター1.11、翻訳イニシエーター（translational initiator）1.12、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープ1.13をインフレームで融合されるエンドソームにアドレスさせるための標的化配列2.11およびＴリンパ球への提示のためにコードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープの負荷のための配列2.21をコードする遺伝要素をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を生成するために２つの分子を伸長する工程をさらに含む、方法。

【0053】

好ましくは、本発明による方法において、ＤＮＡ分子（ｉｉ）は、３’－ＵＴＲ2.31および／またはポリＡテール2.41をさらに含む。

【0054】

図４はさらに、4.10において、第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10は、第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20の遺伝要素2.21の第２の部分に位置する配列4.12と重複する、遺伝要素2.21の第１の部分に位置する配列4.11を含むことを示す。第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10は、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープのセグメント1.13を含む。第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10は、重複3.30を介して第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20とハイブリダイズした（図４の4.20を参照）。次に、重複領域3.30から始まる伸長により、二本鎖ＤＮＡ分子4.30の生成が可能になる。好ましくは、伸長は、一本鎖ＤＮＡ分子3.10と3.20の両方を鋳型として使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって実行される酵素を利用した工程である。

【0055】

有利には、本発明はまた、本発明によるＤＮＡ分子のプール、または本発明による方法によって得られるプールにも関するものであり、該プールは、複数の異なる腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを含む。好ましくは、複数の腫瘍ネオアンチゲンの各腫瘍ネオアンチゲンは、患者の腫瘍において同定された特異的腫瘍抗原である。

【0056】

有利には、分子3.20は、分子3.10のプールと同一であり、相補的である。

【0057】

図５は、本発明によるＤＮＡ分子のプール5.10、または本発明による方法によって得られるプールを示す。有利には、プールは、第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20の遺伝要素2.21の第２の部分に位置する配列4.12と重複する、遺伝要素2.21の第１の部分に位置する配列4.11を含む、第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10を含む。第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10は、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをコードする配列1.13を有する。好ましくは、プールはまた、複数の異なる第１の一本鎖ＤＮＡ分子、例えば3.10aおよび3.10bを含み、それぞれ第１の一本鎖ＤＮＡ分子は第２および第３の特異的腫瘍ネオアンチゲン（または第２のおよび第３の感染病原体由来のエピトープ）1.13aおよび1.13bをコードするそれぞれの特異的配列を有する。好ましくは、配列1.13、1.13aおよび1.13bによってコードされる腫瘍ネオアンチゲンのアミノ酸配列は、対応する「参照」配列とそれぞれ少なくとも１アミノ酸異なるか、または前記アミノ酸配列は、患者の腫瘍にのみ存在し、患者の正常細胞、すなわち患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）には存在しないオープンリーディングフレームからコードされるde novoアミノ酸配列である。複数の異なる第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10aおよび3.10bはまた、第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20の遺伝要素2.21の第２の部分に位置する配列4.12と重複する、遺伝要素2.21の第１の部分に位置する配列4.11を含む。プールはまた、第１の一本鎖ＤＮＡ分子（例えば3.10、3.10aおよび／または3.10b）と第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20との間でハイブリダイズした分子（例えば第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10と第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20との間のハイブリダイズした分子4.20）、および第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10bと第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20との間でハイブリダイズした分子5.30の複数のハイブリダイズした分子を含んでもよい。有利には、プールは複数の二本鎖ＤＮＡ分子も含むものであって、各二本鎖ＤＮＡ分子は、第１の一本鎖ＤＮＡ分子（例えば3.10、3.10aまたは3.10b）とその相補配列に対応する配列の部分と、第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20とその相補配列に対応する第２の部分とを含む。図５において、第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10および第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20を含む二本鎖ＤＮＡ分子4.30と、第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10bおよび第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20を含む二本鎖ＤＮＡ分子5.40が示される。好ましくは、本発明によるＤＮＡ分子のプールでは、プールの複数のＤＮＡ分子が、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープのＲＮＡへの転写のための同一のプロモーターを有する。

【0058】

本発明によれば、対応する「参照」配列は、患者の正常細胞、すなわちＰＢＭＣに由来するＤＮＡ配列データの予測ペプチド配列に相当する。

【0059】

より好ましくは、本発明によるＤＮＡ分子のプールにおいて、前記プールの複数のＤＮＡ分子は、腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープをエンドソームに標的化するための配列をコードする同一の遺伝要素および／または同一の翻訳エンハンサーおよび／またはＴリンパ球への提示のためのコードされた腫瘍ネオアンチゲンまたはコードされた感染病原体由来のエピトープを負荷するための配列をコードする同一の遺伝要素および／または同一の３’－ＵＴＲを有する。

【0060】

有利には、本発明によるＤＮＡ分子のプールは、複数の第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20を含むものであり、複数の第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20の各第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20は、同一のＤＮＡ配列を有する。

【0061】

好ましくは、複数の第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20のうちの各第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20は、その配列全長にわたって配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列によって定義される。

【0062】

好ましくは、本発明によるＤＮＡ分子のプールは、複数の異なる腫瘍ネオアンチゲンまたは複数の異なる感染病原体由来のエピトープを含む複数の第１の一本鎖ＤＮＡ分子を含む。

【0063】

有利には、第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10と第２の一本鎖ＤＮＡ分子3.20との間の重複配列3.30は、定常配列領域内の連続配列であることから、２つの部分的に重複し対になった鎖3.10と3.20の伸長によって二本鎖ＤＮＡ分子のプールの生成を可能にする。

【0064】

有利には、第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10、3.10a、および 3.10bは、複数の異なる腫瘍ネオアンチゲンまたは複数の異なる感染病原体由来のエピトープ、すなわち、第１の特異的腫瘍ネオアンチゲン1.13、第２の特異的腫瘍ネオアンチゲン1.13a、および／または第３の特異的腫瘍ネオアンチゲン1.13bをコードすることができる腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープのセグメント1.13についてのみが互いに異なる配列をそれぞれ有するＤＮＡ分子である。腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープのセグメント1.13を除いて、複数の第１の一本鎖ＤＮＡ分子のうちの各第１の一本鎖ＤＮＡ分子3.10の他のセグメント、例えば、ＲＮＡでの転写のためのプロモーター1.11、その翻訳のためのセグメント1.12、およびエンドソームにアドレスさせるための標的化配列2.11 およびＴリンパ球に提示するためのコードされた腫瘍ネオアンチゲンまたは感染病原体由来のエピトープを負荷するための配列をコードする遺伝要素2.21の第１の部分は、実質的に同一である。

【0065】

有利には、腫瘍ネオアンチゲンをコードするセグメント、すなわち1.13、1.13aまたは1.13bは、対応するペプチドおよび／または腫瘍内にのみ存在し患者の正常細胞には存在しないオープンリーディングフレームでコードされる新規アミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列に質的差異を有する腫瘍ネオアンチゲンを生成するものである。好ましくは、複数の異なる腫瘍ネオアンチゲンの各腫瘍ネオアンチゲンは、互いに少なくとも１つのアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列によって定義される。

【0066】

本発明によれば、二本鎖ＤＮＡ分子のプールは、それぞれ異なる腫瘍ネオアンチゲン（または感染病原体由来の異なるエピトープ）をコードする、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも４０個、さらにより好ましくは少なくとも６０個、有利には少なくとも１００個の異なる二本鎖ＤＮＡ分子を数えるものであり、二本鎖ＤＮＡ分子が、別の二本鎖ＤＮＡ分子によってコードされる別のネオアンチゲンのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸配列が異なるアミノ酸配列を有する腫瘍ネオアンチゲンをコードする配列によって規定される場合、二本鎖ＤＮＡ分子は二本鎖ＤＮＡ分子のプールの別の二本鎖ＤＮＡ分子とは異なるものである。当然、プールには同じ二本鎖ＤＮＡ分子の複数のコピーが含まれる場合がある。

【0067】

有利には、複数の異なる腫瘍ネオアンチゲン中の各腫瘍ネオアンチゲンは、対応する参照配列のアミノ酸配列と比較して同一の変異を有するアミノ酸配列によって定義されるか、または患者の腫瘍のＤＮＡにのみ存在し、患者の正常細胞（すなわちＰＢＭＣ）由来のＤＮＡには存在しない、de novoオープンリーディングフレームからコードされるde novoアミノ酸配列によって定義されるものであり、ここで同一の変異は、複数の異なる腫瘍ネオアンチゲン中の各ネオアンチゲンについて、アミノ酸配列内の異なる位置に位置する。例えば、第１の腫瘍ネオアンチゲンに関して、第１の変異が第１の腫瘍ネオアンチゲンのアミノ酸配列の実質的に中央に位置する場合、第２の腫瘍ネオアンチゲンに関して、同一の第１の変異が第２の腫瘍ネオアンチゲンのアミノ酸配列の実質的に前半部もしくは第１の四分の一、または後半部もしくは最後の四分の一に位置するものであり、腫瘍ネオアンチゲンの最初のアミノ酸は、腫瘍ネオアンチゲンのセグメント1.13の最初の５’コドンに対応する。

【0068】

好ましくは、二本鎖ＤＮＡ分子のプールは、フォワードプライマー5.50およびリバースプライマー5.60を使用した ＰＣＲ増幅によって増幅される。好ましくは、リバースプライマーは、本発明による配列番号７９または配列番号８０などの、ＤＮＡ分子の３’末端まで伸長することができるオリゴヌクレオチドポリＴである。

【0069】

好ましくは、二本鎖ＤＮＡ分子のプールの生成と二本鎖ＤＮＡ分子のプールの増幅は同じチューブを使用して実行されるため、同じ反応物（プライマーペア、ポリメラーゼ、dNTP、反応媒体）が使用され、最初に２つの鎖が伸長され、それぞれの鎖が他方の鎖を伸長させるための鋳型として機能し、次に、伸長した２本の鎖を分離し、低温で特異的プライマー(5.50, 5.60)の塩基対を形成させ、その後高温で伸長させながら、同時またはその後の方法で増幅させる。あるいは、最初の伸長、すなわち最初の伸長工程が完了した後に、プライマーを反応媒体に添加する。

【0070】

好ましくは、二本鎖ＤＮＡ分子のプールには、アルファウイルス nsP1-4の非構造タンパク質など、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼによって認識されるセグメントも含まれる。実際に、二本鎖ＤＮＡ分子のプールがＲＮＡワクチンを生成するためにＤＮＡ分子からＲＮＡ分子へのインビトロ転写の鋳型として使用する場合、生成されたｍＲＮＡがトランス増幅（transamplification）、例えばコードされたＲｄＲｐに基づくトランス増幅、が可能であることが有用である。このようなＲＮＡトランス増幅により、患者に投与されるｍＲＮＡワクチンの用量を減らすことができる。

【0071】

好ましくは、本発明はまた、本発明によるＤＮＡ分子または本発明によるＤＮＡ分子のプールを生成する工程、およびＤＮＡ分子のＲＮＡ分子へのインビトロ転写を行う工程を含む、患者に影響を与えるがんに対するＲＮＡワクチンの生成方法にも関する。

【0072】

好ましくは、本発明によるＲＮＡワクチンの生成方法は、ＲＮＡ分子をワクチンに配合する（formulating）工程をさらに含む。

【0073】

有利には、本発明は、本発明によるＲＮＡワクチンの生成方法によって得られるワクチンにも関連する。
好ましくは、本発明はまた、患者が罹患しているがんの治療に使用するための、本発明に従って得ることができるワクチンにも関する。

【実施例】

【0074】

実施例１：患者の腫瘍の腫瘍ネオアンチゲンの同定。

【0075】

本発明者らは、患者の腫瘍サンプルからのＤＮＡおよび患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からのＤＮＡの全ゲノム配列決定を行った。腫瘍サンプルのＲＮＡＳｅｑも実行された。腫瘍ネオアンチゲンの同定は、腫瘍のＲＮＡＳｅｑからｍＲＮＡが特定されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に基づいて実現され、ｍＲＮＡは、参照ペプチド配列と比較して、少なくとも１つの確認された差異を有する予測ペプチド配列を有する。参照ペプチド配列は、患者のＰＢＭＣのＤＮＡからの全ゲノム配列決定データから同定されたオープンリーディングフレームに由来する予測ペプチド配列である。同定された差異は、参照ペプチド配列と比較して異なるアミノ酸による点突然変異、あるいは転座、欠失および／またはインデル、あるいは融合の結果である可能性がある。患者の腫瘍の腫瘍ネオアンチゲンを同定するための詳細なプロトコルは、特許出願EP21 196366.5に記載されている。

【0076】

実施例２：ネオアンチゲンのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列の同定。

【0077】

本発明者らは、２７アミノ酸のネオアンチゲンペプチド配列を同定した。ここで、参照ペプチド配列と比較して同定された差異は、ネオアンチゲンペプチド配列の２７アミノ酸配列長の実質的に中央に位置するものである。

【0078】

ネオアンチゲンのペプチド配列は、オンラインツールを使用して核酸配列に変換される。このようなツールは、ヒトにおける最適な発現のためにコドンの使用を最適化し、ＲＮＡの二次構造の形成や核酸配列がＲＮＡワクチンの鋳型として使用される場合に望ましくない免疫応答を減少させたり、望ましい免疫応答を増加させたりする。

【0079】

実施例３：複数の腫瘍ネオアンチゲンを含む本発明によるＤＮＡ分子のプールの合成。

【0080】

本発明者らは、シリコンベースのＤＮＡ書き込み技術（ＴＷＩＳＴ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＴｗｉｓｔ Ｏｌｉｇｏ Ｐｏｏｌｓ技術を参照）を使用して、実施例２で得られた複数の腫瘍ネオアンチゲンのＤＮＡ配列を含むプール内の一本鎖ＤＮＡ分子を合成した。本発明によるＤＮＡ分子のプールでは、それぞれが２９７ヌクレオチド長の実質的に同じ配列である配列番号８を有する複数の第２の一本鎖ＤＮＡ分子が合成されている。複数の６０の異なる第１の一本鎖ＤＮＡ分子もプール内で合成され、６０の異なる第１の一本鎖ＤＮＡ分子は実質的に配列番号１３～配列番号７２の配列を有するものであり、配列番号１３～配列番号７２の各配列は、２９１ヌクレオチド長の配列である。アンチセンスである第２の一本鎖ＤＮＡ分子は、配列番号５のヌクレオチド３０～５２（センス／アンチセンス対形成のための配列）に対応する配列を有する重複を有する各第１の一本鎖ＤＮＡ分子とハイブリダイズすることができる。

【0081】

実施例４：本発明によるＤＮＡ分子

【0082】

本発明に従って得られるＤＮＡ分子の配列の一例を、６００ヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す図６に示す。最初のヌクレオチド１から始まって、ＤＮＡ分子は最適化されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターセグメント（図６のＤＮＡ分子の配列中の太字の小文字）と、それに続くβグロビン翻訳エンハンサーセグメントの配列（小文字）を含む。次のセグメントは、ヒトＬＡＭＰ－１シグナルペプチドをコードするセグメント（太字の小文字）に続き、２７アミノ酸の腫瘍ネオアンチゲンをコードするセグメント（大文字）が続く。次のセグメントは、ＤＣ－Ｌａｍｐをコードするセグメント（小文字）である。ＤＣ－Ｌａｍｐ配列内には、第１の一本鎖ＤＮＡ分子および第２の一本鎖ＤＮＡ分子間の重複配列を表す重複配列（強調表示された大文字）が存在する。ＤＣ－Ｌａｍｐ配列の後に、翻訳と安定化の最適化のために３’ＵＴＲβグロビンセグメント（βグロビンＵＴＲ）（太字の小文字）が存在し、その後に７０ヌクレオチドから最大１０５ヌクレオチドのポリＡテールが続く。

【0083】

図７は、ＤＮＡ分子の同じ配列を示しており、ＤＮＡ配列のコードされた部分のアミノ酸配列がＤＮＡ配列に並置されている。

【0084】

図８は図７と類似しており、第１の一本鎖ＤＮＡ分子の５’から３’までの配列が表され（Forward Pr.）、一方、第１の一本鎖ＤＮＡ分子とアンチセンスである第２の一本鎖ＤＮＡ分子の５’から３’までの配列も表されている（Rev.Pr.） 。後続のＰＣＲ増幅で使用されるフォワードプライマー(PCR prim.)およびリバースプライマー(gc-T150)も示されている。

【0085】

実施例５：二本鎖ＤＮＡ分子のプールの作成

【0086】

第１の一本鎖ＤＮＡ分子と第２の一本鎖ＤＮＡ分子との間でハイブリダイズしたＤＮＡ分子は、実施例３で得られる。これらのハイブリダイズしたＤＮＡ分子から、ＤＮＡポリメラーゼを使用して各鎖を伸長することにより、フェムトモル濃度レベルで二本鎖ＤＮＡ分子を生成することができる。

【0087】

実施例６：二本鎖ＤＮＡ分子のプールの増幅

【0088】

本発明によるＲＮＡワクチンに組み込まれるＲＮＡ分子の生成を可能にし、その後のインビトロ転写に必要な十分に大量の二本鎖ＤＮＡ分子の生成を可能にするため、実施例５で得られた二本鎖ＤＮＡ分子のプールを増幅した。そうするために、本発明者らは、配列番号７に対応する配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号７９に対応する配列５’（Ｔ１００）－ＧＣ－３’を有するリバースプライマーを使用して、二本鎖ＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅を１３サイクル行った。

【0089】

ＰＣＲ反応の成分は：
- 5x KAPA HiFi Fidelity バッファー(1x)、
- 各10ｍＭ dNTP ミックス、
- 10μＭ フォワードプライマー、
- 10μＭリバースプライマー、
- 実施例４で得られたＤＮＡ分子のプール(20ng/ul)、
- KAPA HiFi HotStart ＤＮＡポリメラーゼ (1 U/ul) および、
- ＰＣＲグレードの水。

【0090】

ＰＣＲ反応の条件は：
- 初期化変性（95℃で3分間）
- 変性（98℃で20秒）
- アニーリング（15 秒）
- 伸長（72℃で15秒）
- 最終伸長（72℃で1分間）。

【0091】

実施例７：二本鎖ＤＮＡ分子のプールのインビトロ転写（In vitro transcription）

【0092】

実施例６で得られた二本鎖ＤＮＡ分子の増幅されたプールをインビトロ転写して、対応するＲＮＡ分子のプールを生成する。

【0093】

本発明者らは、ＩＶＴ後に増幅された二本鎖ＤＮＡ分子のプールおよび対応するｍＲＮＡ分子のプールが、ＤＮＡプールのＤＮＡ断片のサイズおよびＲＮＡプールのＲＮＡ断片のサイズが、ＤＮＡプールおよびＲＮＡプールの断片の予想される理論的サイズに一致する状態で、正しく生成されることを示している。さらに、本発明者らは、ＩＶＴ前の各ＤＮＡ分子の読み取りカウント比（read count ratio）が、ＩＶＴ後に得られる対応する各ＲＮＡ分子の読み取りカウント比と正の相関があることを示した。最後に、本発明者らは、ＤＮＡ分子のプールのすべてのＤＮＡ分子がｍＲＮＡ分子に正しく転写されたことを示した。

【0094】

本発明は、記載された実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲を逸脱することなく変形が可能であることを理解されたい。

【0095】

図面の用語
promoter プロモーター
translation 翻訳
epitope エピトープ
addressing アドレス
stability and/or enhancer 安定性および／またはエンハンサー
poly A tail ポリＡテール
Optimized T7RNApol prom. 最適化Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター
β-globin transl. enhancer β－グロビン翻訳エンハンサー
Human LAMP-1 Sig. peptide ヒトＬＡＭＰ－１シグナルペプチド
NEOANTIGEN ネオアンチゲン
OVERLAP 重複
3’ β-globin UTR ３’β－グロビンＵＴＲ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】