特表 2024-531728 心血管疾患の処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】心血管疾患の処置

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240822BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240822BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240822BHJP

   C07K 14/435 20060101ALN20240822BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K48/00

A61K31/713

A61K31/711

A61K31/7125

A61P3/06

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K47/54

A61K31/712

A61P9/00

C07K14/435

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516476

(86)(22)【出願日】2022-09-13

(85)【翻訳文提出日】2024-05-08

(86)【国際出願番号】 EP2022075355

(87)【国際公開番号】W WO2023041508

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】2113104.0

(32)【優先日】2021-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2207239.1

(32)【優先日】2022-05-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521548168

【氏名又は名称】アルゴノート アールエヌエー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100219265

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 崇大

(74)【代理人】

【識別番号】100203208

【弁理士】

【氏名又は名称】小笠原 洋平

(74)【代理人】

【識別番号】100216839

【弁理士】

【氏名又は名称】大石 敏幸

(74)【代理人】

【識別番号】100228980

【弁理士】

【氏名又は名称】副島 由加里

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】カーン，ステラ

(72)【発明者】

【氏名】ミッチェル，ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】カーン，マイケル

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076AA22

4C076AA36

4C076AA53

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB17

4C076BB31

4C076CC11

4C076CC21

4C076CC41

4C076DD66

4C076EE59

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA17

4C084MA23

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA52

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA36

4C084ZC33

4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA23

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA52

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA36

4C086ZC33

4C086ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045CA40

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、核酸であって、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ分子を含み、前記分子のセンスＲＮＡ部分又はアンチセンスＲＮＡ部分のいずれかの少なくとも５’末端に共有結合された一本鎖ＤＮＡ分子をさらに含み、前記二本鎖阻害的ＲＮＡは、高コレステロール血症及び心血管疾患などの、高コレステロール血症に関連する疾患の処置において心血管疾患に関連する遺伝子を標的とする、核酸に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸分子であって、
センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖阻害的リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１の部分と；
一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第２の部分であって、前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端は、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記センス鎖の５’末端に共有結合されているか、又は前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端は、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の５’に共有結合されており、前記二本鎖阻害的ＲＮＡは、心血管疾患に関連する心血管遺伝子標的の一部をコードするセンスヌクレオチド配列又はその多型配列変異体を含むことを特徴とし、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、相補的塩基対形成によって前記一本鎖ＤＮＡの一部にアニールしてステム及びループドメインを含む二本鎖ＤＮＡ構造を形成するように適合されたヌクレオチド配列を、その長さの少なくとも一部にわたって含み、前記核酸分子はＮ－アセチルガラクトサミンを含み及び前記二本鎖阻害的ＲＮＡは天然のヌクレオチドからなることを特徴とする、第２の部分と
を含む、核酸分子。

【請求項2】

前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端が、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記センス鎖の５’末端に共有結合されている、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端が、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の５’末端に共有結合されている、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項4】

前記ループドメインがヌクレオチド配列ＧＣＧＡＡＧＣを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項5】

前記一本鎖ＤＮＡ分子が、
５’ＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３８７及び２５１）；
５’ＣＧＡＡＧＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣＣＡＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３０）；及び
５’ＧＣＧＡＡＧＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＡＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４００）
の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の核酸分子。

【請求項6】

前記阻害的ＲＮＡ分子が、少なくとも１つのデオキシチミジンジヌクレオチド（ｄＴｄＴ）を含むか又は少なくとも１つのデオキシチミジンジヌクレオチド（ｄＴｄＴ）からなる２ヌクレオチドのオーバーハングを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項7】

前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖が、少なくとも１つのヌクレオチド間ホスホロチオアート結合を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項8】

前記核酸分子がビニルホスホナート修飾を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項9】

前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子が１７～２９ヌクレオチド又は１９～２１ヌクレオチド長である、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項10】

前記心血管遺伝子標的がヒトリポタンパク質（ａ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項11】

前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３及び３４からなる群から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の核酸分子。

【請求項12】

前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１を含むアンチセンスヌクレオチド配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記センス鎖の５’末端に共有結合されている、請求項１０に記載の核酸分子。

【請求項13】

前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含むアンチセンスヌクレオチド配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の５’末端に共有結合されている、請求項１０に記載の核酸分子。

【請求項14】

前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含むアンチセンスヌクレオチド配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の５’末端に共有結合されている、請求項１０に記載の核酸分子。

【請求項15】

前記心血管遺伝子標的がヒトアポリポタンパク質Ｃ ＩＩＩ（Ａｐｏ Ｃ ＩＩＩ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項16】

前記核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８及び７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項17】

前記核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９及び２５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項18】

前記核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８及び８９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項19】

前記心血管遺伝子標的がヒトジグリセリドアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項20】

前記核酸が、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８及び１１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１９に記載の核酸分子。

【請求項21】

前記核酸が、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９及び１７０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１９に記載の核酸分子。

【請求項22】

前記核酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８及び１２９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１９に記載の核酸分子。

【請求項23】

前記心血管遺伝子標的がヒトＰＣＳＫ９である、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項24】

前記核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９及び２１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項２３に記載の核酸分子。

【請求項25】

前記核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９及び２１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項２３に記載の核酸分子。

【請求項26】

前記心血管遺伝子標的がヒトアポリポタンパク質Ｂである、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項27】

前記核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９９、５００、４５３、５０２、５０３、４５７、５０５、５０６、４６２、５０８、５０９、４６７、５１１、５１２、４７２、５１４、５１５、４７７、５１７ ５１８、４８２、５２０、５２１、４８７、５２３、５２４及び４９２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項２６に記載の核酸分子。

【請求項28】

前記核酸分子が、４５０、５０１、４５５、５０４、４６０、５０７、４６５、５１０、４７０、５１３、４７５、５１６、４８０、５１９、４８５、５２２、４９０及び５２５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項２６に記載の核酸分子。

【請求項29】

前記核酸分子がＮ－アセチルガラクトサミンに共有結合されている、請求項１から２８のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項30】

請求項１～２９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸分子を含む薬学的組成物。

【請求項31】

前記組成物が少なくとも１つのさらなる治療薬を含む、請求項３０に記載の薬学的組成物。

【請求項32】

高コレステロール血症若しくは高コレステロール血症に関連する疾患を有するか、又は高コレステロール血症若しくは高コレステロール血症に関連する疾患にかかりやすい対象の処置又は予防において使用するための、請求項１～３１のいずれか一項に記載の核酸分子又は薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

開示の分野
本開示は、核酸であって、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ分子を含み、前記分子のセンスＲＮＡ部分又はアンチセンスＲＮＡ部分のいずれかの少なくとも５’末端に共有結合された一本鎖ＤＮＡ分子をさらに含み、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ）は、心血管疾患遺伝子を標的とする、核酸；前記核酸分子を含む薬学的組成物、及び心血管疾患遺伝子の発現の増加したレベルに関連する疾患、例えば高コレステロール血症の処置のための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

開示の背景
高コレステロール血症に関連する心血管疾患、例えば虚血性心血管疾患は一般的な症状であり、心疾患並びに高い死亡率及び罹患率をもたらし、質の悪い食事、肥満又は遺伝性機能不全遺伝子の結果であり得る。例えば、高レベルのリポタンパク質（ａ）及び他のリポタンパク質は、アテローム性動脈硬化症に関連する。コレステロールは、動物細胞における膜生合成のために不可欠である。水溶性の欠如は、コレステロールがリポタンパク質に付随して体内を輸送されることを意味する。アポリポタンパク質は、リン脂質、コレステロール及び血流を介した身体の様々な部分へのコレステロールなどの脂質の輸送を促進する脂質とともに形成される。リポタンパク質は、サイズによって分類され、ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）、ＩＤＬ（中間密度リポタンパク質）、ＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質）及びＵＬＤＬ（ウルトラ低密度リポタンパク質）リポタンパク質を形成することができる。

【0003】

リポタンパク質は、それらの循環全体を通して組成を変化させ、様々な比率のアポリポタンパク質Ａ（ＡｐｏＡ）、Ｂ（ＡｐｏＢ）、Ｃ（ＡｐｏＣ）、Ｄ（ＡｐｏＤ）又はＥ（ＡｐｏＥ）、トリグリセリド、コレステロール及びリン脂質を含む。例えば、ＡｐｏＢは、ＵＬＤＬ及びＬＤＬの主要なアポリポタンパク質であり、２つのアイソフォームａｐｏＢ－４８及びａｐｏＢ－１００を有する。両ＡｐｏＢアイソフォームは、単一の遺伝子によってコードされ、終止コドンの生成をもたらす残基２１８０でのＡｐｏＢ－１００転写物のＲＮＡ編集後に、より短いＡｐｏＢ－４８遺伝子が産生される。ＡｐｏＢ－１００は、ＬＤＬの主要な構造タンパク質であり、例えば細胞内へのコレステロールの輸送を可能にする細胞受容体に対するリガンドとしての役割を果たす。

【0004】

家族性高コレステロール血症は難病であり、血中ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの上昇に起因する。この疾患は、常染色体顕性障害であり、ヘテロ接合（３５０～５５０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ－Ｃ）状態及びホモ接合（６５０～１０００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ－Ｃ）状態のいずれもが上昇したＬＤＬ－Ｃをもたらす。家族性高コレステロール血症のヘテロ接合型は、集団の約１：５００である。ホモ接合状態ははるかに稀であり、約１：１００万である。ＬＤＬ－Ｃの正常レベルは１３０ｍｇ／ｄＬの領域にある。

【0005】

高コレステロール血症は小児患者において特に急性であり、早期に診断されなければ、冠動脈心疾患の加速及び早期の死亡をもたらし得る。早期に診断され治療されれば、子供は通常の平均余命を有することができる。成人では、変異又は他の要因のいずれかによる高ＬＤＬ－Ｃは、冠動脈疾患、脳卒中又は腎臓疾患をもたらし得るアテローム性動脈硬化症のリスク増加と直接関連している。ＬＤＬ－Ｃのレベルを低下させることは、アテローム性動脈硬化症及び関連する症状のリスクを低下させることが知られている。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼを阻害することによってコレステロールのデノボ合成を遮断するスタチンの投与によって、当初、ＬＤＬ－Ｃレベルを低下させることができる。一部の対象は、スタチンをエゼチミブ、コレスチポール又はニコチン酸などの他の治療薬と組み合わせる併用療法から恩恵を受けることができる。しかしながら、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの発現及び合成は、スタチン阻害に応答して適応し、時間が経過するにつれて増加するため、スタチン抵抗性が確立された後では、有益な効果は、一時的又は限定的であるに過ぎない。

【0006】

したがって、単独で、又は上昇したＬＤＬ－Ｃによる心血管疾患を制御するための既存の治療アプローチと組み合わせて使用することができる代替療法を特定することが望まれている。

【0007】

遺伝子機能を特異的に消失させるための技術は、低分子阻害又は干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれる、ｓｉＲＮＡ分子中に含まれる配列に相補的なｍＲＮＡの破壊をもたらす二本鎖阻害的ＲＮＡを細胞内に導入することによる。ｓｉＲＮＡ分子は、互いにアニールして二本鎖ＲＮＡ分子を形成するＲＮＡの２つの相補鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）を含む。ｓｉＲＮＡ分子は、典型的には、消失されるべき遺伝子のエクソンに由来するが、必ず由来するわけではない。多くの生物は、ｓｉＲＮＡの形成をもたらすカスケードを活性化することによって二本鎖ＲＮＡの存在に応答する。二本鎖ＲＮＡの存在は、二本鎖ＲＮＡをリボ核タンパク質複合体の一部になるより小さな断片（ｓｉＲＮＡ、約２１～２９ヌクレオチド長）にプロセシングするＲＮａｓｅ ＩＩＩを含むタンパク質複合体を活性化する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ複合体がｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡを切断し、それによってｍＲＮＡの破壊をもたらすためのガイドとして作用する。

【0008】

リポタンパク質（ａ）の発現の阻害は公知であり、リポタンパク質（ａ）の発現を停止させるための阻害的ＲＮＡの使用も公知である。例えば、国際公開第２０１９／０９２２８３号は、リポタンパク質（ａ）をコードするｍＲＮＡのノックダウンを標的とする特異的ｓｉＲＮＡ配列の同定、及び冠動脈心疾患、大動脈弁狭窄症又は脳卒中などの上昇したリポタンパク質（ａ）発現に関連する心血管疾患の処置におけるそれらの使用を開示している。同様に、米国特許第９，９３２，５８６号は、リポタンパク質（ａ）発現を標的とする特異的ｓｉＲＮＡ配列、並びにバージャー病、冠動脈心疾患、腎動脈狭窄症、高アポベータリポ蛋白血症、脳血管アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患及び静脈血栓症などの上昇したリポタンパク質（ａ）発現に関連する心血管疾患の処置におけるそれらの使用を開示している。

【0009】

ＡＰＯＣ ＩＩＩの過剰発現は、アテローム性動脈硬化症及び２型糖尿病に関連する。例えば、国際公開第２００３／０２０７６５号は、ＡｐｏＣＩＩＩポリペプチドに由来する免疫原を使用するアテローム性動脈硬化症の制御のためのワクチン接種アプローチ、並びに冠動脈及び脳血管疾患における動脈硬化性プラークを制御する上でのその使用を開示している。同様のワクチン接種アプローチは、国際公開第２００４／０８０３７５号及び国際公開第２００１／０６４００８号に開示されている５。国際公開第２０１４／２０５４４９号及び国際公開第２０１４／１７９６２６号には、ＡＰＯＣＩＩＩ発現を標的とすることによってインスリン感受性を改善し、ＩＩ型糖尿病を処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が開示されている。

【0010】

さらに、国際公開第２００７／１３６９８９号及び国際公開第２００５／０１９４１８号はそれぞれ、高コレステロール血症、心血管疾患、ＩＩ型糖尿病及びメタボリックシンドロームなどの血清トリグリセリドレベルの低下から利益を得る症状との関連で、ＤＧＡＴ２の発現を調節し、ＤＧＡＴ２発現の低下から利益を得る症状を処置するための、ＤＧＡＴに向けられたアンチセンス化合物の使用を開示している。国際公開第２０１８／０９３９６６号は、高コレステロール血症、心血管疾患、ＩＩ型糖尿病及びメタボリックシンドロームなどの肥満及び肥満関連疾患を処置するための、ＤＧＡＴ２及びジグリセリドアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）に向けられたＲＮＡサイレンシング１０の使用を開示している。同様に、国際公開第２００５／０４４９８１号は、多くの他の遺伝子標的の中でも特にＤＧＡＴ２を標的化するためのｓｉＲＮＡの使用、及びトリグリセリド調節から利益を得る疾患の処置におけるそれらの使用を開示している。

【0011】

本開示は、センス又はアンチセンス阻害的ＲＮＡのいずれかの少なくとも５’末端に連結された短いＤＮＡ部分の包含によって修飾されており、ヘアピン構造を形成する二本鎖阻害的ＲＮＡを含む核酸分子に関する。二本鎖阻害的ＲＮＡは、専ら又は主として天然のヌクレオチドを使用し、先行技術の二本鎖ＲＮＡ分子が薬力学及び薬物動態を改善するために典型的に利用する修飾されたヌクレオチド又は糖を必要としない。開示される二本鎖阻害的ＲＮＡは、潜在的により少ない副作用で心血管遺伝子標的を発現停止させる活性を有する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】国際公開第２０１９／０９２２８３号

【特許文献2】米国特許第９，９３２，５８６号

【特許文献3】国際公開第２００３／０２０７６５号

【特許文献4】国際公開第２００４／０８０３７５号

【特許文献5】国際公開第２００１／０６４００８号

【特許文献6】国際公開第２０１４／２０５４４９号

【特許文献7】国際公開第２０１４／１７９６２６号

【特許文献8】国際公開第２００７／１３６９８９号

【特許文献9】国際公開第２００５／０１９４１８号

【特許文献10】国際公開第２０１８／０９３９６６号

【特許文献11】国際公開第２００５／０４４９８１号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

発明の記述
本発明の一局面によれば、核酸分子であって、
センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖阻害的リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１の部分と；
一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第２の部分であって、前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端は、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記センス鎖の５’末端に共有結合されているか、又は前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端は、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の５’に共有結合されており、前記二本鎖阻害的ＲＮＡは、心血管疾患に関連する心血管遺伝子標的の一部をコードするセンスヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、相補的塩基対形成によって前記一本鎖ＤＮＡの一部にアニールして二本鎖ＤＮＡ構造を形成するように適合されたヌクレオチド配列を、その長さの少なくとも一部にわたって含み、前記二本鎖阻害的ＲＮＡは天然のヌクレオチドからなる、第２の部分と
を含む、核酸分子が提供される。

【0014】

本発明の一局面によれば、核酸分子であって、
センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖阻害的リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１の部分と；
一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第２の部分であって、前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端は、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記センス鎖の５’末端に共有結合されているか、又は前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端は、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の５’に共有結合されており、前記二本鎖阻害的ＲＮＡは、心血管疾患に関連する心血管遺伝子標的の一部をコードするセンスヌクレオチド配列又はその多型配列変異体を含むことを特徴とし、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、相補的塩基対形成によって前記一本鎖ＤＮＡの一部にアニールしてステム及びループドメインを含む二本鎖ＤＮＡ構造を形成するように適合されたヌクレオチド配列を、その長さの少なくとも一部にわたって含み、前記核酸分子はＮ－アセチルガラクトサミンを含み及び前記二本鎖阻害的ＲＮＡは天然のヌクレオチドからなることを特徴とする、第２の部分と
を含む、核酸分子が提供される。

【0015】

「多型配列変異体」は、１、２、３又はそれより多くのヌクレオチドが変化する遺伝子配列である。

【0016】

本発明の好ましい態様において、前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端は、二本鎖阻害的ＲＮＡ分子のセンス鎖の５’末端に共有結合されている。

【0017】

本発明の好ましい態様において、前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端は、二本鎖阻害的ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端に共有結合されている。

【0018】

本発明の好ましい態様において、一本鎖ＤＮＡ分子は、前記センス鎖の５’末端及び前記アンチセンス鎖の５’末端に共有結合されている。

【0019】

本発明の代替の態様において、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、前記センス鎖の５’末端、前記センス鎖の３’末端に共有結合されている。

【0020】

本発明の好ましい態様において、前記ループ部分は、ヌクレオチド配列ＧＮＡ又はＧＮＮＡを含む領域を含み、各Ｎは、独立して、グアニン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、アデニン（Ａ）又はシトシン（Ｃ）を表す。

【0021】

本発明の好ましい態様において、前記ループドメインは、Ｇ及びＣヌクレオチド塩基を含む。

【0022】

本発明の代替の態様において、前記ループドメインは、ヌクレオチド配列ＧＣＧＡＡＧＣを含む。

【0023】

本発明の好ましい態様において、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、ヌクレオチド配列５’ＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３８７及び２５１）を含む。
本発明の好ましい態様において、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、ヌクレオチド配列５’ ＣＧＡＡＧＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣＣＡＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３０）を含む。

【0024】

本発明の好ましい態様において、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、ヌクレオチド配列５’ ＧＣＧＡＡＧＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＡＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４００）を含む。

【0025】

阻害的ＲＮＡ分子は、化学的修飾を必要としない天然のヌクレオチド塩基を含むか又は化学的修飾を必要としない天然のヌクレオチド塩基からなる。さらに、本発明のいくつかの態様においては、湾曲（ｃｒｏｏｋ）ＤＮＡ分子が前記二本鎖阻害的ＲＮＡのセンス鎖の３’末端に連結されており、アンチセンス鎖には、少なくとも２ヌクレオチド塩基オーバーハング配列が提供されていてもよい。２ヌクレオチドオーバーハング配列は、標的によってコードされるヌクレオチドに対応することができ、又は非コードである。２ヌクレオチドオーバーハングは、任意の配列及び任意の順序の２つのヌクレオチド、例えば、ＵＵ、ＡＡ、ＵＡ、ＡＵ、ＧＧ、ＣＣ、ＧＣ、ＣＧ、ＵＧ、ＧＵ、ＵＣ、ＣＵ及びＴＴであり得る。

【0026】

本発明の好ましい態様において、前記阻害的ＲＮＡ分子は、デオキシチミジンジヌクレオチド（ｄＴｄＴ）を含むか又はデオキシチミジンジヌクレオチド（ｄＴｄＴ）からなる２ヌクレオチドオーバーハングを含む。

【0027】

本発明の好ましい態様において、前記ｄＴｄＴオーバーハングは、前記アンチセンス鎖の５’末端に位置する。

【0028】

本発明の代替の好ましい態様において、前記ｄＴｄＴオーバーハングは、前記アンチセンス鎖の３’末端に位置する。

【0029】

本発明の好ましい態様において、前記ｄＴｄＴオーバーハングは、前記センス鎖の５’末端に位置する。

【0030】

本発明の代替の好ましい態様において、前記ｄＴｄＴオーバーハングは、前記センス鎖の３’末端に位置する。

【0031】

本発明の好ましい態様において、前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド間ホスホロチオアート結合を含む。

【0032】

本発明の好ましい態様において、前記センス鎖は、ヌクレオチド間ホスホロチオアート結合を含む。

【0033】

好ましくは、前記センス鎖の５’及び／又は３’末端の２つのヌクレオチドは、２つのヌクレオチド間ホスホロチオアート結合を含む。

【0034】

本発明の好ましい態様において、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド間ホスホロチオアート結合を含む。

【0035】

好ましくは、前記アンチセンス鎖の５’及び／又は３’末端の２つのヌクレオチドは、２つのヌクレオチド間ホスホロチオアート結合を含む。

【0036】

本発明の代替の好ましい態様において、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、１つ又は複数のヌクレオチド間ホスホロチオアート結合を含む。

【0037】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子はビニルホスホナート修飾を含む。

【0038】

本発明の好ましい態様において、前記ビニルホスホナート修飾は、前記センスＲＮＡ鎖の５’末端ホスファートへの修飾である。

【0039】

本発明の好ましい態様において、前記ビニルホスホナート修飾は、前記アンチセンスＲＮＡ鎖の５’末端ホスファートへの修飾である。

【0040】

本発明の好ましい態様において、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子は、１０～４０ヌクレオチド長である。

【0041】

本発明の好ましい態様において、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子は、１７～２９ヌクレオチド長である。

【0042】

本発明の好ましい態様において、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子は、１９～２１ヌクレオチド長である。好ましくは、１９ヌクレオチド長である。

【0043】

本発明の好ましい態様において、前記心血管遺伝子標的は、ヒトリポタンパク質（ａ）である。

【0044】

本発明の代替の態様において、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３又は３４からなる群から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。

【0045】

本発明の好ましい態様において、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１を含むアンチセンスヌクレオチド配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、二本鎖阻害的ＲＮＡ分子のセンス鎖の５’末端に共有結合されている。

【0046】

本発明の好ましい態様において、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含むアンチセンスヌクレオチド配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、二本鎖阻害的ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端に共有結合されている。

【0047】

本発明の好ましい態様において、前記二本鎖阻害的ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含むアンチセンスヌクレオチド配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、二本鎖阻害的ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端に共有結合されている。

【0048】

本発明の代替の好ましい態様において、前記心血管遺伝子標的はヒトアポリポタンパク質Ｃ ＩＩＩ（Ａｐｏ Ｃ ＩＩＩ）である。

【0049】

好ましくは、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８及び７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0050】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９及び２５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0051】

好ましくは、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８及び８９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0052】

本発明の代替の好ましい態様において、前記心血管遺伝子標的はヒトジグリセリドアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）である。

【0053】

好ましくは、前記核酸は、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８及び１１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0054】

好ましくは、前記核酸は、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９及び１７０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0055】

好ましくは、前記核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８及び１２９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0056】

本発明の好ましい態様において、前記心血管遺伝子標的はヒトＰＣＳＫ９である。

【0057】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８９及び１９０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0058】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９及び２１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0059】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３及び２６４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0060】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３及び２７４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0061】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９２、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９及び３３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0062】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、２８５及び３８６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0063】

本発明の好ましい態様において、前記心血管遺伝子標的はヒトアポリポタンパク質Ｂである。

【0064】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９９、５００、４５３、５０２、５０３、４５７、５０５、５０６、４６２、５０８、５０９、４６７、５１１、５１２、４７２、５１４、５１５、４７７、５１７ ５１８、４８２、５２０、５２１、４８７、５２３、５２４及び４９２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。

【0065】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、４５０、５０１、４５５、５０４、４６０、５０７、４６５、５１０、４７０、５１３、４７５、５１６、４８０、５１９、４８５、５２２、４９０及び５２５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。
本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、表１に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体を含むか又は表１に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体からなるＲＮＡ鎖を含む。
本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、表２に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体を含むか又は表２に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体からなるＲＮＡ鎖を含む。

【0066】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、表３に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体を含むか又は表３に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体からなるＲＮＡ鎖を含む。

【0067】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、表４に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体を含むか又は表４に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体からなるＲＮＡ鎖を含む。

【0068】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、表５に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体を含むか又は表５に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体からなるＲＮＡ鎖を含む。

【0069】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、表８に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体を含むか又は表８に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体からなるＲＮＡ鎖を含む。

【0070】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、表１０に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体を含むか又は表１０に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体からなるＲＮＡ鎖を含む。

【0071】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、表１４に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体を含むか又は表１４に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体からなるＲＮＡ鎖を含む。

【0072】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、表１５に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体を含むか又は表１５に記載されているヌクレオチド配列若しくは多型配列変異体からなるＲＮＡ鎖を含む。

【0073】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８８に記載されているヌクレオチド配列の１９～２１個の連続するヌクレオチドを含むか又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８８に記載されているヌクレオチド配列の１９～２１個の連続するヌクレオチドからなる。

【0074】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、Ｎ－アセチルガラクトサミンに共有結合されている。

【0075】

本発明のさらなる態様において、Ｎ－アセチルガラクトサミンは、前記阻害的ＲＮＡのアンチセンス部分又は前記阻害的ＲＮＡのセンス部分のいずれかに結合されている。

【0076】

好ましくは、Ｎ－アセチルガラクトサミンは、前記センスＲＮＡの５’末端に結合されている。

【0077】

本発明の代替の態様において、Ｎ－アセチルガラクトサミンは、前記センスＲＮＡの３’末端に結合されている。

【0078】

本発明の代替の好ましい態様において、前記Ｎ－アセチルガラクトサミンは、前記アンチセンスＲＮＡの３’末端に結合されている。

【0079】

本発明の好ましい態様において、Ｎ－アセチルガラクトサミンは一価である。

【0080】

本発明の好ましい態様において、Ｎ－アセチルガラクトサミンは二価である。

【0081】

本発明の代替の態様において、Ｎ－アセチルガラクトサミンは三価である。

【0082】

本発明の好ましい態様において、前記核酸分子は、以下の構造を含む分子に共有結合されている。

【化1】

【0083】

本発明の代替の態様において、前記核酸分子は、以下の構造を含む分子に共有結合されている。

【化2】

【0084】

本発明の代替の態様において、前記核酸分子は、以下の構造を含む分子に共有結合されている。

【化3】

【0085】

本発明の代替の態様において、前記核酸分子は、以下の構造を含む分子に共有結合されている。

【化4】

【0086】

本発明の代替の好ましい態様において、前記核酸分子は、Ｎ－アセチルガラクトサミン４－サルファートを含む分子に共有結合されている。

【0087】

本発明のさらなる局面によれば、本発明による少なくとも１つの核酸分子を含む薬学的組成物が提供される。

【0088】

本発明の好ましい態様において、前記組成物は、薬学的担体及び／又は賦形剤をさらに含む。

【0089】

投与される場合、本発明の組成物は、薬学的に許容され得る調製物で投与される。このような調製物は、薬学的に許容され得る濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合的な担体を通常含有し得、任意でコレステロール低下剤などの他の治療剤を含有してもよく、他の治療剤は本発明による核酸分子とは別個に、又は組み合わせが適合的である場合には組み合わされた調製物で投与され得る。

【0090】

本発明による核酸と他の異なる治療剤との組み合わせは、同時、逐次又は時間的に別個の投与量として投与される。

【0091】

本発明の治療薬は、注射又は時間とともに徐々に注入することを含む任意の慣用の経路によって投与され得る。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経皮又は経上皮であり得る。

【0092】

本発明の組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独で、又はさらなる用量とともに、所望の応答を生じる組成物の量である。心血管疾患などの疾患を処置する場合、所望の応答は、疾患の進行を阻害すること又は反転させることである。これは、疾患の進行を一時的に遅らせるに過ぎないことを含み得るが、より好ましくは、疾患の進行を恒常的に停止させることを含む。これは、日常的な方法によって監視され得る。

【0093】

そのような量は、当然のことながら、処置されている具体的な症状、症状の重症度、年齢、身体状態、サイズ及び体重を含む個々の患者パラメータ、処置の期間、併用療法の性質（もし存在すれば）、具体的な投与経路、並びに医療従事者の知識及び専門知識に属する同様の要因に依存する。これらの要因は当業者に周知であり、日常的な実験のみで対処することができる。個々の成分又はそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、健全な医学的判断による最も高い安全用量が使用されることが一般に好ましい。しかしながら、医学的理由、心理学的理由、又は実質的に任意の他の理由のために、患者は、より低い用量又は耐容され得る用量を求め得ることが当業者によって理解されよう。

【0094】

前述の方法で使用される薬学的組成物は、好ましくは無菌であり、患者／患畜への投与に適した重量又は体積の単位で、所望の応答を生成するための有効量の本発明による核酸分子を含有する。応答は、例えば、心血管疾患の退縮及び疾患症候の減少などを決定することによって測定することができる。

【0095】

対象に投与される本発明による核酸分子の用量は、種々のパラメータに従って、特に使用される投与様式及び対象の状態に従って選択され得る。他の要因には、所望の処置期間が含まれる。適用された初期用量において対象における応答が不十分であれば、より高い用量（又は異なる、より局所的な送達経路による効果的により高い用量）が、患者の耐容性が許容する程度まで使用され得る。本発明による核酸の検出方法は、処置を必要とする対象に対する適切な投与量の決定を容易にすることは明らかであろう。

【0096】

一般に、１ｎＭ～１μＭの本明細書に開示される核酸分子の用量が、一般に、標準的な手順に従って製剤化され、投与される。好ましくは、用量は、１ｎＭ～５００ｎＭ、５ｎＭ～２００ｎＭ、１０ｎＭ～１００ｎＭの範囲であり得る。組成物の投与のための他のプロトコルは当業者に公知であり、用量量、注射スケジュール、注射部位、投与様式などが前述のものとは異なる。（例えば、試験目的又は獣医学的治療目的のための）ヒト以外の哺乳動物への組成物の投与は、上記と実質的に同じ条件下で行われる。対象は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、好ましくはヒトであり、ヒトリポタンパク質（ａ）の発現に関して適合した非ヒト霊長類又はトランスジェニック哺乳動物を含む。

【0097】

投与される場合、本発明の薬学的調製物は、薬学的に許容され得る量及び薬学的に許容され得る組成物で適用される。「薬学的に許容され得る」という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を意味する。そのような調製物は、塩、緩衝剤、防腐剤、適合的な担体を通常含有し得、任意に他の治療剤、例えばスタチンを含有してもよい。医薬に使用される場合、塩は薬学的に許容され得るべきであるが、薬学的に許容され得ない塩は、その薬学的に許容され得る塩を調製するために都合よく使用され得、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的及び薬学的に許容され得る塩には、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製されるものが含まれるが、これらに限定されない。また、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩などのアルカリ金属塩又はアルカリ土類塩として調製され得る。

【0098】

組成物は、所望であれば、薬学的に許容され得る担体と組み合わされ得る。本明細書で使用される「薬学的に許容され得る担体」という用語は、ヒトへの投与に適した１つ又は複数の適合的な固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入物質を意味する。この文脈における「薬学的に許容され得る担体」という用語は、例えば溶解性及び／又は安定性を促進するために活性成分と組み合わされる、天然又は合成の有機又は無機成分を示す。薬学的組成物の成分はまた、所望の薬学的有効性を実質的に損なう相互作用が存在しないように、本発明の分子と、及び互いと混合することができる。

【0099】

薬学的組成物は、塩中の酢酸；塩中のクエン酸；塩中のホウ酸；及び塩中のリン酸を含む適切な緩衝剤を含有し得る。薬学的組成物はまた、適切な防腐剤を含有してもよい。

【0100】

薬学的組成物は、単位剤形で都合よく提供され得、薬学の分野で周知の方法のいずれによっても調製され得る。全ての方法は、活性剤を、１つ又は複数の補助成分を構成する担体と混ぜる工程を含む。一般に、組成物は、活性化合物を液体担体又は細かく分割された固体担体又はその両方と均一かつ緊密に混ぜ、次いで、必要であれば生成物を成形することによって調製される。経口投与に適した組成物は、それぞれが所定量の活性化合物を含有するカプセル、錠剤、ロゼンジなどの分離した単位として提供され得る。

【0101】

非経口投与に適した組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張である核酸の無菌水性又は非水性調製物を都合よく含む。この調製物は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して公知の方法に従って製剤化され得る。無菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液であり得る。使用され得る許容され得る溶媒としては、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌固定油は、溶媒又は懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノ又はジグリセリドを含む任意の無刺激性固定油が使用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製において使用され得る。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適した担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。

【0102】

本発明のさらに好ましい態様において、前記薬学的組成物は、少なくとも１つのさらなる異なる治療剤を含む。

【0103】

本発明の好ましい態様において、前記さらなる治療薬はスタチンである。

【0104】

スタチンは、一般に、上昇したＬＤＬ－Ｃを有する対象においてコレステロールレベルを制御するために使用される。スタチンは、罹患しやすい対象及び心血管疾患を有する対象を予防及び治療する上で有効である。スタチンの典型的な投与量は５～８０ｍｇの領域内にあるが、これはスタチン及び高ＬＤＬ－Ｃに苦しむ対象のために必要とされるＬＤＬ－Ｃの所望の低下レベルに依存する。しかしながら、スタチンの標的であるＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素の発現及び合成は、スタチン投与に応答して適応するため、スタチン治療の有益な効果は、スタチン抵抗性が確立された後では、一時的又は限定的であるに過ぎない。

【0105】

好ましくは、前記スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピトバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチンからなる群より選択される。

【0106】

本発明の好ましい態様において、前記さらなる治療薬はエゼチミブである。エゼチミブは、少なくとも１つのスタチン、例えばシンバスタチンと組み合わされてもよい。

【0107】

本発明の代替の好ましい態様において、前記さらなる治療薬は、フィブラート、ニコチン酸、コレスチラミンからなる群より選択される。

【0108】

本発明のさらなる代替の好ましい態様において、前記さらなる治療剤は、治療抗体、例えば、エボロクマブ、ボコシズマブ又はアリロクマブである。

【0109】

本発明のさらなる局面によれば、高コレステロール血症若しくは高コレステロール血症に関連する疾患を有するか、又は高コレステロール血症若しくは高コレステロール血症に関連する疾患にかかりやすい対象の処置又は予防において使用するための、本発明の核酸分子又は薬学的組成物が提供される。

【0110】

本発明の好ましい態様において、前記対象は小児対象である。

【0111】

小児対象には、新生児（０～２８日齢）、乳児（１～２４月齢）、幼児（２～６歳）及び思春期前［７～１４歳］の小児が含まれる。

【0112】

本発明の代替の好ましい態様において、前記対象は成人／成体対象である。

【0113】

本発明の好ましい態様において、高コレステロール血症は家族性高コレステロール血症である。

【0114】

本発明の好ましい態様において、家族性高コレステロール血症は、上昇したレベルのリポタンパク質（ａ）発現に関連する。

【0115】

本発明の好ましい態様において、前記対象はスタチン治療に抵抗性である。

【0116】

本発明の好ましい態様において、高コレステロール血症に関連する前記疾患は、脳卒中予防、高脂血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、大動脈弁狭窄症、脳血管疾患、末梢動脈疾患、高血圧症、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪酸肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、バージャー病、腎動脈狭窄症、高アポベータリポ蛋白血症、脳血管アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患及び静脈血栓症からなる群より選択される。

【0117】

本発明のさらなる局面によれば、有効量の本発明による核酸又は薬学的組成物を投与し、それにより高コレステロール血症を処置又は予防する工程を含む、高コレステロール血症を有する又は高コレステロール血症にかかりやすい対象を処置するための方法が提供される。

【0118】

本発明の好ましい方法において、前記対象は小児対象である。

【0119】

本発明の別の好ましい方法において、前記対象は成人／成体対象である。

【0120】

本発明の好ましい方法において、高コレステロール血症は家族性高コレステロール血症である。

【0121】

本発明の好ましい方法において、家族性高コレステロール血症は、上昇したレベルのリポタンパク質（ａ）発現に関連する。

【0122】

本発明の好ましい方法において、前記対象はスタチン治療に抵抗性である。

【0123】

本発明の好ましい方法において、高コレステロール血症に関連する前記疾患は、脳卒中予防、高脂血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、大動脈弁狭窄症、脳血管疾患、末梢動脈疾患、高血圧症、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪酸肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、バージャー病、腎動脈狭窄症、高アポベータリポ蛋白血症、脳血管アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患及び静脈血栓症からなる群より選択される。

【0124】

本明細書の説明及び特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語並びにこれらの用語の変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味し、他の部分、添加剤、成分、整数又は工程を排除することは意図されない（排除しない）。

【0125】

本明細書の説明及び特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の必要がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈上別段の必要がない限り、本明細書は単数だけでなく複数も想定していると理解されるべきである。

【0126】

本発明の局面、態様又は実施例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物、化学部分又は基は、これらと整合しない場合を除き、本明細書に記載される任意の他の局面、態様又は実施例に適用可能であると理解されるべきである。

【0127】

ここで、本発明の一態様を、単に例として、以下の図を参照しながら説明する。

【図面の簡単な説明】

【0128】

【図1】ｓｉＲＮＡ化合物の形質移入後のＨｅｐＧ２細胞における標的ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを示す血清安定性アッセイ。水、１０％ＦＢＳ又は１０％ヒト血清中において３７℃で３０分間又は２時間のインキュベーション後に、ＨｅｐＧ２細胞を以下のｓｉＲＮＡで形質移入した：修飾されたインクリシラン［白いバー］、湾曲のない非修飾「インクリシラン」［灰色のバー］、３’ＳＳ湾曲ありの非修飾インクリシラン［格子模様のバー］、５’ＳＳ「反転されたヘアピン」湾曲ありの非修飾インクリシラン［斑点のあるバー］、又は５’ＳＳ湾曲ありの非修飾インクリシラン［格子模様のバー］。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって定量した。対照は、「ｓｉＲＮＡなし」処置を含む［黒いバー］；

【図2】ｓｉＲＮＡ化合物の形質移入後のＨｅｐＧ２細胞における標的ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを示す血清安定性アッセイ。水、１０％、２０％又は５０％ＦＢＳ中において３７℃で２時間のインキュベーション後に、ＨｅｐＧ２細胞を以下のｓｉＲＮＡで形質移入した：修飾されたインクリシラン［白いバー］、湾曲のない非修飾「インクリシラン」［灰色のバー］、５’ＳＳ「反転されたヘアピン」湾曲ありの非修飾インクリシラン［斑点のあるバー］、又は５’ＳＳ湾曲ありの非修飾インクリシラン［縞模様のバー］。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって定量した。対照は、「ｓｉＲＮＡなし」前処置を含む［黒いバー］；

【図3】ｓｉＲＮＡ化合物の形質移入後のＨｅｐＧ２細胞における標的ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを示す血清安定性アッセイ。水、１０％ＦＢＳ又は１０％ヒト血清中において３７℃で４時間のインキュベーション後に、ＨｅｐＧ２細胞を以下のｓｉＲＮＡで形質移入した：修飾されたインクリシラン［白いバー］、湾曲のない非修飾「インクリシラン」［灰色のバー］、５’ＳＳ「反転されたヘアピン」湾曲ありの非修飾インクリシラン［斑点のあるバー］、又は５’ＳＳ湾曲ありの非修飾インクリシラン［縞模様のバー］。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって定量した。対照は、「ｓｉＲＮＡなし」前処置を含む［黒いバー］；

【図4】ｓｉＲＮＡ（ＰＣ８－ＰＣ１８と名付けられた）化合物の形質移入後のＨｅｐＧ２細胞における標的ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを示す血清安定性アッセイ。水、１０％ＦＢＳ又は１０％ヒト血清中において３７℃で２時間のインキュベーション後に、ＨｅｐＧ２細胞を以下の非修飾ＰＣ８－１８ ｓｉＲＮＡで形質移入した：湾曲なしのｓｉＲＮＡ３５［白いバー］、湾曲なしであるが、３’ＳＳ及び３’ＡＳ上にｄＴｄＴオーバーハングを含むｓｉＲＮＡ３６［灰色のバー］、３’ＳＳ上に湾曲を有するｓｉＲＮＡ３７［斑点のあるバー］、３’ＡＳ上に湾曲を有するｓｉＲＮＡ３８［縦の縞模様のバー］、３’ＳＳ上に湾曲及び３’ＡＳ上にｄＴｄＴオーバーハングを有するｓｉＲＮＡ３９［格子模様のバー］、５’ＳＳ「反転されたヘアピン」湾曲を有するｓｉＲＮＡ４１［横の縞模様のバー］、又は５’ＳＳ上に湾曲及び３’ＡＳ上にｄＴｄＴオーバーハングを有するｓｉＲＮＡ４２［黒地に斑点のあるバー］。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって定量した。対照は、「ｓｉＲＮＡなし」前処置を含む［黒いバー］；

【図5】図５Ａ 非修飾ｓｉＲＮＡ化合物（ＰＣ２－ＰＣ１２と名付けられた）の投与後の肝臓ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのインビボサイレンシング。各処置群について５匹のマウスの群に、ビヒクル［黒いバー］、化合物Ａ（湾曲なし；白いバー）、化合物Ｇ（センス鎖（ＳＳ）の５’末端に湾曲；斑点のあるバー）又は化合物Ｈ（ＳＳの３’末端の湾曲；灰色のバー）のいずれかを皮下（ＳＣ）に注射した。２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのいずれかで各化合物を与え、屠殺後、ＲＴ－ｑＰＣＲによる肝臓ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを２つの時点（２日目及び７日目）で測定した。 図５Ｂ インビボ研究（図５Ａ）においてマウスで使用されたｓｉＲＮＡ化合物Ａ、Ｇ及びＨの形質移入後のＨｅｐＧ２細胞における標的ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを示す血清安定性アッセイ。水、１０％ＦＢＳ又は１０％ヒト血清中において、３７℃で３０分間又は２時間のインキュベーション後に、ｓｉＲＮＡ化合物Ａ、Ｇ又はＨでＨｅｐＧ２細胞を形質移入した：化合物Ａ（湾曲なし；白いバー）、化合物Ｇ（センス鎖（ＳＳ）の５’末端に湾曲；斑点のあるバー）又は化合物Ｈ（ＳＳの３’末端に湾曲；灰色のバー）。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって定量した。対照は、「ｓｉＲＮＡなし」［黒いバー］及び「血清なし」前処置を含む。 図５Ｃ インビボ研究（図５Ａ）においてマウスで使用されたｓｉＲＮＡ化合物Ａ、Ｇ及びＨの形質移入後のＨｅｐＧ２細胞における標的ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを示す血清安定性アッセイ。水、２０％又は５０％ヒト血清中において、３７℃で２時間のインキュベーション後に、ｓｉＲＮＡ化合物Ａ、Ｇ又はＨでＨｅｐＧ２細胞を形質移入した：化合物Ａ（湾曲なし；白いバー）、化合物Ｇ（センス鎖（ＳＳ）の５’末端に湾曲；斑点のあるバー）又は化合物Ｈ（ＳＳの３’末端に湾曲；灰色のバー）。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって定量した。対照は、「ｓｉＲＮＡなし」［黒いバー］及び「血清なし」前処置を含む。

【発明を実施するための形態】

【0129】

材料及び方法
ＨｅｐＧ２逆形質移入
Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）によって合成された二重鎖ｓｉＲＮＡ（表１）を、ヌクレアーゼを含まない水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＡＭ９９３２）に再懸濁して、１０μＭのストック溶液を生成した。血清安定性アッセイのために、ビヒクル（ヌクレアーゼを含まない水）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又は種々の濃度（１０％～８０％）のヒト血清（ＨＳ）中で、２時間、３７℃でストックｓｉＲＮＡをインキュベートした。血清又はビヒクル中でのプレインキュベーション後、０．１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）１３７７８０７５）／ウェルを使用して、３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）１６４６８８）中のＨｅｐＧ２細胞中に、２５ｎＭの濃度でｓｉＲＮＡを形質移入した。形質移入された細胞を３７℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。ｓｉＲＮＡ処理を受けていない細胞を対照として使用した。
初代マウス肝細胞における自由取り込み及び形質移入

【0130】

マウス肝細胞（ＭＳＣＰ１０、Ｌｏｎｚａ）を解凍し、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｔｈａｗｉｎｇ ａｎｄ Ｐｌａｔｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（Ｇｉｂｃｏ（商標）ＣＭ３０００）を補充したＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）Ａ１２１７６０１）中、３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）１６４６８８）に播種した。自由取り込みのために、ウェルあたり０．１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して２５ｎＭのｓｉＲＮＡで、又は１００ｎＭのＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡで細胞を処理した。
二本鎖ＲＴ－ｑＰＣＲ

【0131】

Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ １－ｓｔｅｐ ＴａｑＭａｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ａ２５６０３）を使用して、ＲＴ－ｑＰＣＲ読み取りのために細胞を処理した。簡単に説明すると、細胞を５０μＬの氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＤＮａｓｅ Ｉを含有する２０μＬの溶解溶液に溶解した。２μＬのＳＴＯＰ溶液を２分間添加することにより、５分後に溶解を停止した。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析のために、ウェルあたり１μＬの溶解物を２０μＬのＲＴ－ｑＰＣＲ反応体積で９６ウェルＰＣＲプレートに分注した。ＧＡＰＤＨ（ＶＩＣ＿ＰＬ、アッセイＩｄ Ｈｓ００２６６７０５＿ｇ１）及びＰＣＳＫ９（ＦＡＭ、アッセイＩｄ Ｈｓ００５４５３９９－ｍ１）又はＡｐｏＢ（ＦＡＭ、アッセイＩｄ Ｍｍ０１５４５１５０＿ｍ１）に対するＴａｑＭａｎプローブとともに、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ １－ｓｔｅｐ ＴａｑＭａｎ ＫｉｔからのＴａｑＭａｎ（登録商標）１－Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｍｉｘを使用して、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５サーモサイクリング機器（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨを内部対照として使用し、発現変化を参照試料（ｓｉＲＮＡ処理なし）に対して正規化した、ΔΔＣＴ法を用いて相対定量を決定した。
インビボマウス研究動物

【0132】

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＲｅａｄｉｎｇのＳａｒｅｔｉｕｓ動物ユニット中で雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２０～２５ｇ）を群で飼育し、１２時間の明／暗サイクル下、２３℃で、Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅの規制に従って湿度を制御して維持した。研究の期間中、マウスに標準的なげっ歯類飼料ＳＤＳラット拡張食餌（ＲＭ３－Ｅ－ＦＧ）を与えた。
ｓｉＲＮＡ化合物の製剤化

【0133】

５ｍＬ／ｋｇの投与体積で皮下（ＳＣ）に与えられた場合に２及び１０ｍｇ／ｋｇの用量を提供するために、化合物Ａ、化合物Ｇ及び化合物Ｈをそれぞれ、ＲＮＡａｓｅを含まないＰＢＳ中で０．４及び２ｍｇ／ｍＬの濃度に製剤化した。対照群（ｎ＝５）には、５ｍＬ／ｋｇの投与体積で、ビヒクル（ＲＮａｓｅを含まないＰＢＳ）を皮下に与えた。
ＲＴ－ｑＰＣＲのための肝臓処理

【0134】

ｓｉＲＮＡ化合物又はビヒクル注射（ｎ＝５）後２日目（４８時間）及び７日目（１６８時間）に、イソフルラン下での心臓穿刺によって、各処置群から試料を最終的に採取した。肝臓組織を切除し、液体Ｎ_２中で急速凍結した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＲＮＢ１００－１００ＲＸＮ）を使用して、急速凍結された全肝臓のホモジネートから全ＲＮＡを抽出した。

【0135】

ＧＡＰＤＨ（ＶＩＣ＿ＰＬ）、ＰＣＳＫ９（ＦＡＭ）及びｍＴＴＲ（ＦＡＭ）に対するＴａｑＭａｎプローブとともにＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、Ｄｕｐｌｅｘ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨを内部対照として使用し、標的遺伝子の発現変化をビヒクル対照に対して正規化したΔΔＣＴ法を使用して、ＰＣＳＫ９の相対定量（ＲＱ）を決定した。
［実施例１］
血清安定性アッセイにおける非修飾「インクリシラン」配列のセンス鎖（ＳＳ）上の湾曲の５’対３’配置を試験する

【0136】

１０％ＦＢＳ又は１０％ヒト血清中での２時間のインキュベーション後、ＳＳの５’又は３’末端のいずれかに位置する湾曲を有する非修飾「インクリシラン」は、「湾曲なし」ｓｉＲＮＡと比較して増加した標的ｍＲＮＡ（ＰＣＳＫ９）ノックダウン（ＫＤ）を示す。しかしながら、ヒト血清中での前処理後には、湾曲が５’末端に存在する場合、ＳＳの３’末端と比較してより優れたＫＤが観察される。

【0137】

これは図１で実証されており、ヘアピン配列ＧＣＧＡＡＧＣを含有する５’ＳＳ湾曲ｓｉＲＮＡ［縞模様のバー］は、１０％ヒト血清での２時間の処理後のＨｅｐＧ２細胞において、修飾されたインクリシランで観察された標的ＫＤ（８０％）［白いバー］に匹敵する高いレベルの標的ＫＤ（８５％）を維持する。同様の結果は、「反転された」湾曲ヘアピン（ＣＧＡＡＧＣＧ）がＳＳの５’末端に配置された場合に示され得る［斑点のあるバー］。対照的に、３’ＳＳに配置された湾曲［格子模様のバー］は、ヒト血清中での前処理後のＨｅｐＧ２細胞において－１８．７５％（標的ＫＤの低下）；６５％ＫＤ（血清インキュベーションなしでの８０％ＫＤと比較）を示す。予想されたように、湾曲が付着されていない非修飾「インクリシラン」［灰色のバー］は、ＦＢＳ又はヒト血清のいずれかの中での前処理後に標的ＫＤの低下したレベルを示す；それぞれ５０％及び６０％ＫＤで、ＫＤの－２６．８％及び－３９％の低下に等しい。
［実施例２］
漸増濃度のＦＢＳを用いた血清安定性アッセイにおける非修飾「インクリシラン」配列のセンス鎖（ＳＳ）上の湾曲の５’配置を試験する

【0138】

漸増濃度のＦＢＳ中での、３７℃で２時間のインキュベーション後、ＳＳの５’末端に湾曲が配置された非修飾「インクリシラン」配列［縞模様のバー］は、試験されたＦＢＳの全ての濃度（１０％、２０％及び５０％）で持続的な標的ｍＲＮＡ（ＰＣＳＫ９）ノックダウン（７０～８０％ＫＤ）を示し、修飾されたインクリシランで観察されたレベル（７０～８０％ＫＤ）［白いバー］と同等である。同様に、ＳＳの５’末端上の「反転された」湾曲ヘアピン（ＣＧＡＡＧＣＧ）は、ＫＤの低下なしに、６５～７５％のＫＤを提供する［斑点のあるバー］。これに対して、「湾曲なし」化合物［灰色のバー］は、わずか２０～５０％の標的ＫＤが血清処理後に明らかであるように、ＫＤの最大－８５％の低下を示す。
［実施例３］
４時間のインキュベーション期間にわたる血清安定性アッセイにおける非修飾「インクリシラン」配列のセンス鎖（ＳＳ）上の湾曲の５’配置を試験する

【0139】

１０％ＦＢＳ又は１０％ヒト血清のいずれかの中での４時間のインキュベーション後に、ＳＳの５’末端に位置する湾曲を有する非修飾「インクリシラン」は、それぞれ約７５％の標的ｍＲＮＡ（ＰＣＳＫ９）ノックダウン（ＫＤ）及び６５％ＫＤの持続したレベルを示す［縞模様のバー］。同様に、ＳＳの５’末端における「反転した」湾曲ヘアピン（ＣＧＡＡＧＣＧ）については明らかなＫＤの低下は存在せず［斑点のあるバー］、修飾された「インクリシラン」と同等であり、約７０％のＫＤが観察される［白いバー］。対照的に、湾曲の非存在［灰色のバー］は、１０％ＦＢＳ（４５％ＫＤ）又は１０％ヒト血清（３５％ＫＤ）中での４時間の前処理後に、それぞれＫＤの－３６％及び－５０％の低下に等しい、大幅により低いレベルのＫＤをもたらす。
［実施例４］
血清安定性アッセイにおける、ＰＣＳＫ９を標的とする非修飾ｓｉＲＮＡ配列（ＰＣ８－１８と名付けられた配列）上の湾曲の５’対３’配置を試験する

【0140】

１０％ＦＢＳ又は１０％ヒト血清中での２時間のインキュベーション後、センス鎖（ＳＳ）の５’末端に位置する湾曲を有するＰＣ８－１８は、ＳＳ又はＡＳのいずれかの３’に位置する湾曲と比較して、標的ｍＲＮＡ（ＰＣＳＫ９）の優れたレベルのノックダウン（ＫＤ）を示す。これは図４に示されており、３’ＳＳに位置する湾曲で見られる６０～７０％ＫＤ（血清処理なしと比較して３０％ＫＤの低下に等しい）［白地に斑点のあるバー及び格子模様のバー］と比較して、５’ＳＳ湾曲を有するＰＣ８－１８ ｓｉＲＮＡについては持続的な標的ＫＤ（約８５％）が存在する：［横の縞模様のバー及び黒地に斑点のあるバー］。同様に、湾曲が３’ＡＳ上に配置されている場合、ＫＤの低下は６～１６％であり、６５～７５％の標的ＫＤをもたらす［縦の縞模様のバー］。ＰＣ８－１８ ｓｉＲＮＡ上に湾曲が存在しない場合、標的ＫＤは、ＦＢＳ中での２時間のインキュベーション後にわずか３５％に低下し、ＫＤの大幅な低下（血清処置なしと比較して－６３％）に相当し、ヒト血清中ではわずか２５％のＫＤ（－７７％）に低下する。同様に、３’ｄＴｄＴオーバーハングを含有する湾曲なしの分子は、それぞれ、ＦＢＳ及びヒト血清中での前処理後に（血清処理なしと比較して）－４４％及び－７２％のＫＤレベルの低下を示す。
［実施例５］
ＰＣＳＫ９を標的とする非修飾ｓｉＲＮＡ化合物（ＰＣ２配列）上の湾曲の５’配置対３’配置のインビボサイレンシング効果を試験する

【0141】

各処置群について５匹のマウスの群に、ビヒクル（ＰＢＳ）、化合物Ａ（湾曲なし）、化合物Ｇ（センス鎖（ＳＳ）の５’末端上の湾曲）又は化合物Ｈ（ＳＳの３’末端上の湾曲）のいずれかを皮下に（ＳＣ）注射した。各化合物を２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのいずれかで与え、屠殺後、２つの時点（２日目及び７日目）で肝臓ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのレベルを測定した。

【0142】

化合物Ｇ（５’ＳＳ湾曲）は、ビヒクル対照と比較して、２及び１０ｍｇ／ｋｇで４８時間後に肝臓においてＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの４０％ＫＤ及び７日後に１０ｍｇ／ｋｇで３０％ＫＤをもたらす（図５Ａ）。化合物Ｈ（３’ＳＳ湾曲）については、４８時間後に、同等の肝臓標的ＫＤ、２ｍｇ／ｋｇで約５０％ＫＤ（１０ｍｇ／ｋｇでは３０％ＫＤ）が見られ、７日目には有意なＫＤは観察されなかった（図５Ａ）。湾曲を含有しない化合物Ａは、顕著により低い標的ＫＤを示し、２日又は７日のいずれかでの２ｍｇ／ｋｇ用量のＳＣ注射後にサイレンシングは存在しない。１０ｍｇ／ｋｇの用量では、化合物Ａは、４８時間後には２０％未満のＫＤを示し、７日後には４０％を示す（図５Ａ）。
［実施例６］
血清安定性アッセイ（ＨｅｐＧ２細胞）において化合物Ａ、Ｇ及びＨを試験する

【0143】

ＳＳ上の５’及び３’に位置する湾曲の両方について、同様の結果が示されている。化合物Ｇ（５’ＳＳ湾曲）及び化合物Ｈ（３’ＳＳ湾曲）は、１０％ＦＢＳ又はヒト血清中のいずれかでの２時間のインキュベーション後に、（血清処理なしと比較して）５０％超のＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ ＫＤを維持する。対照的に、２時間の血清処置後に５０％からわずか２０％ＫＤへ、化合物Ａ（湾曲なし）について見られる標的ＫＤの低下が存在する；図５Ｂ。

【0144】

２時間にわたって、増加する血清濃度（２０％及び５０％）でこれらのｓｉＲＮＡ化合物をさらに検証すると、化合物Ｇ（５’ＳＳ湾曲）は、ヒト血清中において、３’ＳＳに位置する湾曲（Ｈ）よりも優れた性能を示した。これは図５Ｃに示されており、標的ｍＲＮＡ ＫＤの持続的なレベル（約５０％）は、５０％ヒト血清中での２時間のインキュベーション後の化合物Ｇ［斑点のあるバー］においてのみ明瞭である。これは、その「血清なし」処理ＫＤレベルと比較すると、Ｇについては、ＫＤの低下が存在しないことに相当する。対照的に、化合物Ｈ［灰色のバー］は、ＫＤの完全な喪失（０％）を示し、５０％ヒト血清中で２時間後に、「湾曲なし」化合物Ａ［白いバー］と全く同じように機能する。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

［実施例７］
（インクリシラン、ＰＣＳＫ９配列）

【0145】

湾曲がセンス鎖の５’末端に付着された場合（ｓｉＲＮＡ１５－５’Ｃ）、ｓｉＲＮＡ配列は、１０％ＦＢＳ又はヒト血清中での２時間のインキュベーション後に、化学的に修飾されたバージョン（ｓｉＲＮＡ１４ｍ）に匹敵して、標的ＰＣＳＫ９に対する完全なＫＤ活性を維持した。センス鎖の３’末端の湾曲（ｓｉＲＮＡ １５ｂ）は、ＨＳ中で部分的な保護を示した。３’末端に短い湾曲（ヘアピン部分のみ）を有するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１５ｓ７）及び５’末端に短い湾曲（ヘアピン部分のみ）を有するｓｉＲＮＡ（Ｉｎｃ＿０３）並びに５’末端にのみステム１２ヌクレオチド部分を有するｓｉＲＮＡ（ＩＮＣ＿０２）は全て、２５ｎＭでＨｅｐＧ２中に形質移入された場合、完全な１９ヌクレオチドの湾曲と比較して、ＫＤの著しい低下を示した（表６及び７）。

【表6】

【表7】

【表8】

［実施例８］
（ＰＣ８－１８ ＰＣＳＫ９配列）

【0146】

湾曲がセンス鎖の５’末端に付着された場合（ＰＣ８＿０５）、ｓｉＲＮＡ配列は、８０％ＨＳ中での２時間のインキュベーション後に標的ＰＣＳＫ９に対する完全なＫＤ活性を維持し、これは血清プレインキュベーションなしで観察されたＫＤレベルに匹敵した。センス鎖の３’末端の湾曲（ＰＣ８＿０１）は、ＨＳ中で大幅に低下した保護を与え、血清プレインキュベーションなしと比較してＫＤの７２％の低下を示した。３’末端に短い湾曲（ヘアピン部分のみ）を有するｓｉＲＮＡ（ＰＣ８＿０３）及び５’末端に短い湾曲（ヘアピン部分のみ）を有するｓｉＲＮＡ（ＰＣ８＿１１）並びに５’末端にのみステム１２ヌクレオチド部分を有するｓｉＲＮＡ（ＰＣ８＿１０）は全て、２５ｎＭでＨｅｐＧ２中に形質移入された場合、完全な１９ヌクレオチドの湾曲と比較して、ＫＤの著しい低下を示した（表９）。

【表9】

【表10】

［実施例９］
（化合物Ｇ－ＰＣＳＫ９配列）

【0147】

湾曲がセンス鎖の５’末端に付着された場合（ｓｉＲＮＡ＿Ｇ）、ｓｉＲＮＡ配列は、８０％ＨＳ中での８時間のインキュベーション後に、血清プレインキュベーションなしで観察されたＫＤのレベルに匹敵して、ＰＣＳＫ９に対する完全なＫＤ活性を維持した（表１１）。対照的に、ｓｉＲＮＡ＿Ａ（湾曲なし）又はｓｉＲＮＡ＿Ｈ（センス鎖の３’末端の湾曲）は、２５ｎＭでＨｅｐＧ２中に形質移入された場合、８０％ＨＳ中で保護を示さず、それぞれ７０．８％及び１００％の％ＫＤの低下を示した。自由取り込みアッセイでは、ｓｉＲＮＡ＿Ｇは、１０％ＦＢＳ中で培養され、１００ｎＭのｓｉＲＮＡで２４、４８及び７２時間処理された初代マウス肝細胞において、ｓｉＲＮＡ＿Ｈと比較してより良好なＫＤレベルを示した（表１２）。

【表11】

【表12】

［実施例１０］
（ＡｐｏＢ配列）

【0148】

マウスＡｐｏＢに対する配列を保有する合計１１個のｓｉＲＮＡを２０％及び５０％ヒト血清に曝露し、その後、初代マウス肝細胞中に２５ｎＭで形質移入すると、センス鎖上に５’湾曲を保有するｓｉＲＮＡ変異体は、総じて、３’末端に湾曲を保有するｓｉＲＮＡ変異体と比較して、血清への曝露後にＡｐｏＢのＫＤを誘導するより優れた能力を示した（表１３）。

【表13】

【表14】

【表15】

参考文献

【0149】

Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．，Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ａ．，Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．，Ａｌａｍ，Ｍ．Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｈｏｅｋｓｔｒａ，Ｍ．，Ｋａｎｄａｓａｍｙ，Ｐ．，Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａ．Ｖ．，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．，２０１４．Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｓ ｒｏｂｕｓｔ ＲＮＡｉ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３６（４９），ｐｐ．１６９５８－１６９６１．
Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，Ａｋｉｎｃ，Ａ．，Ｂｒａｍｌａｇｅ，Ｂ．，Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．，Ｃｏｎｓｔｉｅｎ，Ｒ．，Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，Ｍ．，Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．，Ｇｅｉｃｋ，Ａ．，Ｈａｄｗｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ，Ｍ．，２００４．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４３２（７０１４），ｐ．１７３

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【配列表】

2024531728000001.xml

【国際調査報告】