(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】生体模倣角膜及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61L 27/24 20060101AFI20240822BHJP
A61L 27/18 20060101ALI20240822BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
A61L27/24
A61L27/18
C07K14/78 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024516493
(86)(22)【出願日】2022-06-20
(85)【翻訳文提出日】2024-05-10
(86)【国際出願番号】 CN2022099756
(87)【国際公開番号】W WO2023035721
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】202111059840.1
(32)【優先日】2021-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524095672
【氏名又は名称】熹微（▲蘇▼州）生物医▲薬▼科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110001896
【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】王 崇宇
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 加慧
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ ▲軍▼
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 沐▲栄▼
(72)【発明者】
【氏名】何 超先
【テーマコード（参考）】
4C081
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C081AB21
4C081BB08
4C081CA18
4C081CD12
4C081DA02
4H045AA30
4H045BA57
4H045EA20
4H045FA10
4H045GA10
(57)【要約】
本願は、生体模倣角膜及びその製造方法に関し、バイオ技術分野に属する。本願は、生体模倣角膜を提供する。前記生体模倣角膜は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を原料としており、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、コラーゲン様タンパク質と、コラーゲン様タンパク質に修飾されたＰＥＧ－４０ｋ及びＰＥＧ－２０ｋと、を含む。ＰＥＧ－４０ｋ及びＰＥＧ－２０ｋを修飾することにより、コラーゲン様タンパク質の架橋性を顕著に向上させ、本願の角膜の強度を、コラーゲン様タンパク質を用いて製造された角膜の強度よりも約２０倍、従来の他のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を用いて製造された角膜の強度よりも約１２倍向上させ、よって、本願の角膜の角膜移植分野における将来性が極めて期待できる。ＰＥＧ－４０ｋとＰＥＧ－２０ｋとのモル比が２～３：１である。このモル比のＰＥＧ修飾により、コラーゲン様タンパク質の架橋性を向上させる効果がより高く、本願の角膜の強度がさらに向上する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を原料としており、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、コラーゲン様タンパク質と、コラーゲン様タンパク質に修飾されたポリエチレングリコール誘導体と、を含み、前記ポリエチレングリコール誘導体は、ＰＥＧ－４０ｋ及びＰＥＧ－２０ｋを含む、ことを特徴とする生体模倣角膜。
【請求項2】
ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を架橋して硬化させることにより得られる、ことを特徴とする請求項１に記載の生体模倣角膜。
【請求項3】
前記コラーゲン様タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の生体模倣角膜。
【請求項4】
前記ＰＥＧ－４０ｋとＰＥＧ－２０ｋとのモル比は０．５～６：１である、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の生体模倣角膜。
【請求項5】
前記ＰＥＧ－４０ｋとＰＥＧ－２０ｋとのモル比は２～３：１である、ことを特徴とする請求項４に記載の生体模倣角膜。
【請求項6】
前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基数は、８－ａｒｍ、４－ａｒｍ、２－ａｒｍ、又は１－ａｒｍのうちの１つ又は複数であり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基数は、８－ａｒｍ、４－ａｒｍ、２－ａｒｍ、又は１－ａｒｍのうちの１つ又は複数である、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の生体模倣角膜。
【請求項7】
前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基数は４－ａｒｍ、又は８－ａｒｍであり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基数は４－ａｒｍ、又は８－ａｒｍである、ことを特徴とする請求項６に記載の生体模倣角膜。
【請求項8】
前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基は、－ＭＡＬ、－ＮＨＳ、－ＳＧ、－ＳＰＡ、－ＳＳ、又は－ＥＤＣのうちの１つ又は複数であり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基は、－ＭＡＬ、－ＮＨＳ、－ＳＧ、－ＳＰＡ、－ＳＳ、又は－ＥＤＣのうちの１つ又は複数である、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の生体模倣角膜。
【請求項9】
前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基は、－ＭＡＬであり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基は、－ＭＡＬである、ことを特徴とする請求項８に記載の生体模倣角膜。
【請求項10】
前記コラーゲン様タンパク質の一端にｌｉｎｋｅｒが連結されており、前記ポリエチレングリコール誘導体は、活性化基を通じてｌｉｎｋｅｒに修飾されている、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の生体模倣角膜。
【請求項11】
前記ｌｉｎｋｅｒは、コラーゲン様タンパク質のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項１０に記載の生体模倣角膜。
【請求項12】
前記ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示される、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の生体模倣角膜。
【請求項13】
前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位は、メルカプト、アミノ、カルボキシ、又はイミダゾリルのうちの１つ又は複数である、ことを特徴とする請求項１２に記載の生体模倣角膜。
【請求項14】
ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示される場合、前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位はメルカプトであり、ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示される場合、前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位はアミノである、ことを特徴とする請求項１３に記載の生体模倣角膜。
【請求項15】
コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ ４．０～１０．０、温度２～４０℃の条件で１～４８ｈ反応させて、反応生成物を得る反応ステップと、反応生成物を凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得る凍結乾燥ステップと、
凍結乾燥製剤を緩衝液に溶解し、溶解液を得て、溶解液とＭＰＣ母液を混合し、混合液１を得て、混合液１とＤＭＴＭＭ母液を混合し、混合液２を得る架橋ステップと、
混合液２を角膜の金型に注入して静置し、角膜の粗品を得る硬化ステップと、を含む、ことを特徴とする請求項１～１４のいずれか１項に記載の生体模倣角膜の製造方法。
【請求項16】
前記反応ステップは、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ６．０～８．０、温度２～８℃の条件で５～８ｈ反応させることである、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の供給モル数の比は１～１６：１である、ことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の供給モル数の比は８～１２：１である、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の反応溶媒は水又は希塩酸溶液である、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記希塩酸溶液の濃度は１～１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記希塩酸溶液のｐＨが希アルカリ溶液で６．０～８．０に調整される、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は１～１５ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は８～１０ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記凍結乾燥ステップは、反応生成物と凍結乾燥保護剤を混合して凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得ることである、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記凍結乾燥保護剤は、マンニトール、スクロース、又はアラニンのうちの１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
架橋ステップでは、前記緩衝液のｐＨは５．５～８．０である、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
架橋ステップでは、前記緩衝液のｐＨは、６．５～７．５である、ことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
架橋ステップでは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は、５～４０ｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
架橋ステップでは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は、１２～１８ｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
架橋ステップでは、前記溶解液とＭＰＣ母液との混合質量比は、２：１～４：１である、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
架橋ステップでは、前記混合液１とＤＭＴＭＭ母液との混合質量比は、５：１～７：１である、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記架橋ステップは、２５～６０℃で行われる、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記架橋ステップは、４５～５５℃で行われる、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
硬化ステップでは、前記静置温度は、４～３５℃である、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記ＭＰＣ母液の成分は、ＭＰＣ、ＰＥＧＤＡ、ＴＥＭＥＤ、及び溶媒を含む、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記ＭＰＣ母液において、ＭＰＣの濃度は１５～４０ｇ／ｍＬであり、前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は０．６～１５体積％であり、ＴＥＭＥＤの濃度は０．０５～２体積％である、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は８～１２％である、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記ＭＰＣ母液の溶媒は緩衝液であり、前記緩衝液のｐＨは６．０～８．０である、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記ＤＭＴＭＭ母液の成分は、ＤＭＴＭＭ、ＡＰＳ、及び溶媒を含む、ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記ＤＭＴＭＭ母液において、ＤＭＴＭＭの濃度は５～２０ｇ／ｍＬであり、ＡＰＳの濃度は０．５～５ｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記ＤＭＴＭＭ母液の溶媒は緩衝液であり、前記緩衝液のｐＨは６．０～８．０である、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
硬化ステップの後、角膜の粗品を金型とともに緩衝液に入れて第１浸漬を行い、第１浸漬終了後、金型を開いて、第２浸漬を行い、第２浸漬終了後、離型し、角膜の完成品を得る浸漬ステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
浸漬ステップでは、前記緩衝液のｐＨは５．５～８．０である、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記第１浸漬は、温度が４～３５℃、時間が５～２４ｈである、ことを特徴とする請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項44】
前記第２浸漬は、温度が４～３５℃、時間が３～１０ｈである、ことを特徴とする請求項４１～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
反応ステップの後かつ凍結乾燥ステップの前、反応生成物中の分子量が３０，０００Ｄａ以上の物質を濾過により遮断し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を得る精製ステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０２１年９月１３日に中国特許庁に提出された、出願番号が２０２１１１０５９８４０．１、発明の名称が「生体模倣角膜及びその製造方法」の中国特許出願の優先権を主張しており、当該出願のすべての内容は、引用により本明細書に組み込まれている。
本願は、２０２１年９月１３日に中国特許庁に提出された、出願番号が２０２１１１０５９８４０．１、発明の名称が「生体模倣角膜及びその製造方法」の中国特許出願の優先権を主張しており、当該出願のすべての内容は、引用により本明細書に組み込まれている。
【0002】
［技術分野］
本願は、生体模倣角膜及びその製造方法に関し、バイオ技術分野に属する。
本願は、生体模倣角膜及びその製造方法に関し、バイオ技術分野に属する。
【背景技術】
【0003】
角膜（Ｃｏｒｎｅａ）は、目の最も前にある凸状の透明度の高い物質で、横長の楕円形をしており、虹彩、瞳孔、前房を覆い、目の屈折力の大部分を担っている。水晶の屈折力と組み合わせることで、光は網膜上に正確に焦点を合わせて画像を形成することができる。角膜には非常に敏感な神経終末があり、異物が角膜に接触すると、目を守るためにまぶたが無意識に閉じる。透明性を維持するために、角膜には血管がなく、涙と房水を通じて栄養と酸素を得る。
【0004】
角膜は非常に壊れやすく、眼の外傷、炎症、アレルギー反応、物理的損傷、化学火傷、激しい運動、目の使い過ぎなどはすべて角膜の病変を引き起こす可能性がある。角膜が病気になると、目の痛み、羞明、流涙、視力低下などの明らかな目の症状が現れ、重度の場合は失明につながる。
【0005】
角膜移植は、患者の既存の病気の角膜を正常な角膜に置き換えて、病気に罹患した目の視力を回復したり、角膜の病変を制御したり、視力を改善したり、特定の角膜疾患を治療したりする治療法である。患者に重度の視覚障害や失明を引き起こす一部の角膜疾患の場合、角膜移植は完全な治療を達成させ、これらの不幸な患者の痛みを解消することができる。角膜自体には血管がなく、「免疫寛容」状態にあるため、角膜移植の成功率は他の同種臓器移植の中でも高い。
【0006】
しかしながら、角膜の資源は限られており、患者のニーズを満たすことができない。この問題を解決するために、一部の研究者は人工角膜移植術を提案した。人工角膜移植術は、透明な医療用ポリマー材料を用いて製造された特別な光学装置を角膜組織に外科的に埋め込めて、角膜瘢痕組織の一部を置換することで、視力を回復する外科的方法である。角膜組織による合成材料の拒絶反応などの問題がまだ解決されておらず、長期成績が悪く、移植部位での房水の漏出や移植片の剥離を引き起こすことが多いため、広く使用することができないのが現状である。現在、人工角膜が適しているのは、さまざまな重篤な角膜疾患を患った後の両眼失明者、特に重度の化学熱傷による角膜白板症を患った人、複数回の角膜移植に失敗し他の手術を受けることができない人だけである。
【0007】
研究者は人工角膜に基づいて、生体模倣角膜を提案している。例えば、文献「再生促進角膜インプラントにおけるコラーゲンの代替としての短いペプチド類似体（Short peptide analogs as alternatives to collagen in pro-regenerative corneal implants）」において、Ｊａｎｇａｍｒｅｄｄｙ、Ｊａｇａｎｍｏｈａｎ Ｒ．らはポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を提案しており、このポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を化学的に架橋すると、生体模倣角膜が得られる。この生体模倣角膜は、優れた生体適合性を備えており、人工合成材料に対する角膜組織の強い拒絶反応の問題を効果的に解決できる。
【0008】
しかし、この生体模倣角膜の強度は０．０２２ＭＰａと非常に低く、この生体模倣角膜を角膜移植に使用した場合、移植が困難であることや円錐角膜を引き起こす可能性があるなどの問題が残されている。
【発明の概要】
【0009】
従来の生体模倣角膜の強度が低いという問題を解決するために、本願は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を原料としており、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、コラーゲン様タンパク質と、コラーゲン様タンパク質に修飾されたポリエチレングリコール誘導体と、を含み、前記ポリエチレングリコール誘導体は、ＰＥＧ－４０ｋ及びＰＥＧ－２０ｋを含む、生体模倣角膜を提供する。
【0010】
本願の一実施形態では、前記生体模倣角膜は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を架橋して硬化させることにより得られる。
【0011】
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール誘導体は、ＰＥＧ－４０ｋ及びＰＥＧ－２０ｋからなる。
【0012】
本願の一実施形態では、前記コラーゲン様タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１において、Ｘは４Ｈｙｐ（４－ヒドロキシプロリン）であり、すなわち、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列は以下の通りである。
Ｈ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－ＯＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列は以下の通りである。
Ｈ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－ＯＨ
【0013】
本願の一実施形態では、前記ＰＥＧ－４０ｋとＰＥＧ－２０ｋとのモル比は０．５～６：１である。
【0014】
本願の一実施形態では、前記ＰＥＧ－４０ｋとＰＥＧ－２０ｋとのモル比は２～３：１である。本願の一実施形態では、前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基数は８－ａｒｍ、４－ａｒｍ、２－ａｒｍ、又は１－ａｒｍのうちの１つ又は複数であり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基数は８－ａｒｍ、４－ａｒｍ、２－ａｒｍ、又は１－ａｒｍのうちの１つ又は複数である。
【0015】
本願の一実施形態では、前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基数は４－ａｒｍ、又は８－ａｒｍであり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基数は、４－ａｒｍ、又は８－ａｒｍである。
【0016】
本願の一実施形態では、前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基は、－ＭＡＬ、－ＮＨＳ、－ＳＧ、－ＳＰＡ、－ＳＳ、又は－ＥＤＣのうちの１つ又は複数であり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基は、－ＭＡＬ、－ＮＨＳ、－ＳＧ、－ＳＰＡ、－ＳＳ、又は－ＥＤＣのうちの１つ又は複数である。
【0017】
本願の一実施形態では、前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基は、－ＭＡＬであり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基は、－ＭＡＬである。
【0018】
本願の一実施形態では、前記コラーゲン様タンパク質の一端にｌｉｎｋｅｒが連結されており、前記ポリエチレングリコール誘導体は、活性化基を通じてｌｉｎｋｅｒに修飾されている。
【0019】
本願の一実施形態では、前記ｌｉｎｋｅｒは、コラーゲン様タンパク質のＮ末端に連結されている。
【0020】
本願の一実施形態では、前記ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示される。
【0021】
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位は、メルカプト、アミノ、カルボキシ、又はイミダゾリルのうちの１つ又は複数である。
【0022】
本願の一実施形態では、ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示される場合、前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位はメルカプトであり、ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示される場合、前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位はアミノである。
【0023】
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質のコアコンホメーションは、ＨＧ又はＴＰのうちの１つ又は複数である。
【0024】
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質中のポリエチレングリコール誘導体のコアコンホメーションはＴＰである。
【0025】
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質中のコラーゲン様タンパク質のアミノ酸配置は、Ｄ型又はＬ型のうちの１つ又は複数である。
【0026】
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の分子量は、１５，０００～７５，０００Ｄａである。
【0027】
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の分子量は、３０，０００～７５，０００Ｄａである。
【0028】
本願はまた、
コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ ４．０～１０．０、温度２～４０℃の条件で１～４８ｈ反応させて、反応生成物を得る反応ステップと、
反応生成物を凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得る凍結乾燥ステップと、
凍結乾燥製剤を緩衝液に溶解し、溶解液を得て、溶解液とＭＰＣ母液を混合し、混合液１を得て、混合液１とＤＭＴＭＭ母液を混合し、混合液２を得る架橋ステップと、
混合液２を角膜の金型に注入して静置し、角膜の粗品を得る硬化ステップと、を含む、上記の生体模倣角膜の製造方法を提供する。
コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ ４．０～１０．０、温度２～４０℃の条件で１～４８ｈ反応させて、反応生成物を得る反応ステップと、
反応生成物を凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得る凍結乾燥ステップと、
凍結乾燥製剤を緩衝液に溶解し、溶解液を得て、溶解液とＭＰＣ母液を混合し、混合液１を得て、混合液１とＤＭＴＭＭ母液を混合し、混合液２を得る架橋ステップと、
混合液２を角膜の金型に注入して静置し、角膜の粗品を得る硬化ステップと、を含む、上記の生体模倣角膜の製造方法を提供する。
【0029】
本願の一実施形態では、前記反応ステップは、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ ６．０～８．０、温度２～８℃の条件で５～８ｈ反応させることである。
【0030】
本願の一実施形態では、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の供給モル数の比は１～１６：１である。
【0031】
本願の一実施形態では、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の供給モル数の比は８～１２：１である。
【0032】
本願の一実施形態では、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の反応溶媒は水又は希塩酸溶液である。
【0033】
本願の一実施形態では、前記希塩酸溶液の濃度は１～１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記希塩酸溶液のｐＨが希アルカリ溶液で６．０～８．０に調整される。
【0034】
本願の一実施形態では、前記希アルカリ溶液は、ｐＨ９．０～１１．０の水酸化ナトリウム溶液又はアンモニア水である。
【0035】
本願の一実施形態では、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は１～１５ｍｇ／ｍＬである。
【0036】
本願の一実施形態では、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は８～１０ｍｇ／ｍＬである。
【0037】
本願の一実施形態では、前記凍結乾燥ステップは、反応生成物と凍結乾燥保護剤を混合して凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得ることである。
【0038】
本願の一実施形態では、前記凍結乾燥保護剤は、マンニトール、スクロース、又はアラニンのうちの１種又は複数種である。
【0039】
本願の一実施形態では、前記凍結乾燥は、以下の段階を含む。
段階１：温度が－４５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が５００ｍ Ｔｏｒｒの条件で６ｈ凍結乾燥させる。
段階２：温度が－３０℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で１７ｈ凍結乾燥させる。
段階３：温度が２５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で７ｈ凍結乾燥させる。
段階１：温度が－４５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が５００ｍ Ｔｏｒｒの条件で６ｈ凍結乾燥させる。
段階２：温度が－３０℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で１７ｈ凍結乾燥させる。
段階３：温度が２５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で７ｈ凍結乾燥させる。
【0040】
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液のｐＨは５．５～８．０である。本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液のｐＨは６．５～７．５である。本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液の濃度は０．５～０．７ｍｏｌ／Ｌである。
【0041】
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液は、ＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、又はＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒである。
【0042】
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は５～４０ｇ／ｍＬである。
【0043】
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は１２～１８ｇ／ｍＬである。
【0044】
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は１５ｇ／ｍＬである。
【0045】
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記溶解液とＭＰＣ母液との混合質量比は２：１～４：１である。
【0046】
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記混合液１とＤＭＴＭＭ母液との混合質量比は５：１～７：１である。
【0047】
本願の一実施形態では、前記架橋ステップは、２５～６０℃で行われる。本願の一実施形態では、前記架橋ステップは、４５～５５℃で行われる。
【0048】
本願の一実施形態では、硬化ステップでは、前記静置温度は４～３５℃である。本願の一実施形態では、硬化ステップでは、前記静置温度は４～２５℃である。本願の一実施形態では、硬化ステップでは、前記静置時間は８～２０ｈである。本願の一実施形態では、前記ＭＰＣ母液の成分は、ＭＰＣ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリン）、ＰＥＧＤＡ（ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート）、ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン）及び溶媒を含む。
【0049】
本願の一実施形態では、前記ＭＰＣ母液において、ＭＰＣの濃度は１５～４０ｇ／ｍＬであり、前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は０．６～１５体積％であり、ＴＥＭＥＤの濃度は０．０５～２体積％である。
【0050】
本願の一実施形態では、前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は８～１２％である。本願の一実施形態では、前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は１０％である。本願の一実施形態では、前記ＭＰＣ母液の溶媒は緩衝液であり、前記緩衝液のｐＨは６．０～８．０である。
【0051】
本願の一実施形態では、ＭＰＣ母液において、前記緩衝液のｐＨは６．５～７．５である。本願の一実施形態では、ＭＰＣ母液において、前記緩衝液の濃度は０．５～０．７ｍｏｌ／Ｌである。
【0052】
本願の一実施形態では、ＭＰＣ母液において、前記緩衝液は、ＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、又はＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒである。
【0053】
本願の一実施形態では、前記ＤＭＴＭＭ母液の成分は、ＤＭＴＭＭ（４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩）、ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）及び溶媒を含む。
【0054】
本願の一実施形態では、前記ＤＭＴＭＭ母液において、ＤＭＴＭＭの濃度は５～２０ｇ／ｍＬであり、ＡＰＳの濃度は０．５～５ｇ／ｍＬである。
【0055】
本願の一実施形態では、前記ＤＭＴＭＭ母液の溶媒は緩衝液であり、前記緩衝液のｐＨは６．０～８．０である。
【0056】
本願の一実施形態では、ＤＭＴＭＭ母液において、前記緩衝液のｐＨは６．５～７．５である。
【0057】
本願の一実施形態では、ＤＭＴＭＭ母液において、前記緩衝液の濃度は０．５～０．７ｍｏｌ／Ｌである。
【0058】
本願の一実施形態では、ＤＭＴＭＭ母液において、前記緩衝液は、ＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、又はＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒである。
【0059】
本願の一実施形態では、硬化ステップの後、前記方法は、角膜の粗品を金型とともに緩衝液に入れて第１浸漬を行い、第１浸漬終了後、金型を開いて、第２浸漬を行い、第２浸漬終了後、離型し、角膜の完成品を得る浸漬ステップをさらに含む。
【0060】
本願の一実施形態では、浸漬ステップでは、前記緩衝液のｐＨは５．５～８．０である。本願の一実施形態では、浸漬ステップでは、前記緩衝液のｐＨは６．５～７．５である。
【0061】
本願の一実施形態では、浸漬ステップでは、前記緩衝液の濃度は０．０５～１ｍｏｌ／Ｌである。
【0062】
本願の一実施形態では、浸漬ステップでは、前記緩衝液は、ＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ、又はＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒである。
【0063】
本願の一実施形態では、前記第１浸漬は、温度が４～３５℃、時間が５～２４ｈである。
【0064】
本願の一実施形態では、前記第２浸漬は、温度が４～３５℃、時間が３～１０ｈである。
【0065】
本願の一実施形態では、反応ステップの後かつ凍結乾燥ステップの前、
前記方法は、反応生成物中の分子量が３０，０００Ｄａ以上の物質を濾過により遮断し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を得る精製ステップをさらに含む。
前記方法は、反応生成物中の分子量が３０，０００Ｄａ以上の物質を濾過により遮断し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を得る精製ステップをさらに含む。
【0066】
本願の一実施形態では、前記濾過は、透析又は限外濾過である。
【発明の効果】
【0067】
本願の技術的解決手段は、以下の利点を有する。
【0068】
１．本願は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を原料としており、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、コラーゲン様タンパク質と、コラーゲン様タンパク質に修飾されたＰＥＧ－４０ｋ及びＰＥＧ－２０ｋと、を含む、生体模倣角膜を提供する。ＰＥＧ－４０ｋ及びＰＥＧ－２０ｋを修飾することにより、コラーゲン様タンパク質の架橋性を顕著に向上させ、本願の角膜の強度を、コラーゲン様タンパク質を用いて製造された角膜の強度よりも約２０倍、従来の他のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を用いて製造された角膜の強度よりも約１２倍向上させることができ（文献「再生促進角膜インプラントにおけるコラーゲンの代替としての短いペプチド類似体（Short peptide analogs as alternatives to collagen in pro-regenerative corneal implants）におけるポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を用いて製造された角膜の強度は、わずか０．０２２ＭＰａである。）、よって、本願の角膜の角膜移植分野における将来性が極めて期待できる。
【0069】
さらに、前記ＰＥＧ－４０ｋとＰＥＧ－２０ｋとのモル比は、２～３：１である。このモル比のＰＥＧ修飾により、コラーゲン様タンパク質の架橋性を向上させる効果がより良好であり、本願の角膜の強度をさらに向上させることができる。
【0070】
さらに、前記ＰＥＧ－４０ｋは、８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬであり、前記ＰＥＧ－２０ｋは、４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬである。この構成のＰＥＧ修飾により、コラーゲン様タンパク質の架橋性を向上させる効果がより良好であり、本願の角膜の強度をさらに向上させることができる。
【0071】
２．本願は、上記の生体模倣角膜の製造方法を提供し、前記方法は、反応ステップと、凍結乾燥ステップと、架橋ステップと、硬化ステップとの４つのステップを含み、前記反応ステップは、コラーゲン様タンパク質とＰＥＧ誘導体を、ｐＨ ６．０～８．０、温度２～８℃の条件で反応させて、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を得ることである。この反応ステップで製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、より優れた架橋性を有し、製造された角膜の強度をさらに向上させることができる。さらに、他の従来のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法と比較して、この反応ステップの反応時間は短く、角膜を形成するためのヒドロゲルにすることができるポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質が得られるまでにわずか５～８時間しかかからない（文献「再生促進角膜インプラントにおけるコラーゲンの代替としての短いペプチド類似体（Short peptide analogs as alternatives to collagen in pro-regenerative corneal implants）」では、角膜を形成するためのヒドロゲルにすることができるポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の調製に４週間かかる。）、角膜の大規模工業生産に貢献する。
【0072】
さらに、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体との供給モル数の比は８～１２：１である。この供給モル比で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、より優れた架橋性を有し、製造された角膜の強度をさらに向上させることができる。
【0073】
さらに、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は８～１０ｍｇ／ｍＬである。この供給濃度で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、より優れた架橋性を有し、製造される角膜の強度をさらに向上させることができる。
【0074】
さらに、前記架橋ステップでは、凍結乾燥製剤をｐＨ６．５～７．５、温度４５～５５℃の条件で架橋させて、生体模倣角膜を製造する。この架橋条件下で製造された生体模倣角膜は、より高い強度を有する。
【0075】
さらに、前記架橋ステップでは、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度を１２～１８ｇ／ｍＬに制御する。このポリエチレン化コラーゲン様タンパク質の濃度で製造された生体模倣角膜は、より高い強度を有する。
【0076】
さらに、前記架橋ステップでは、ＭＰＣ母液中のＰＥＧＤＡの濃度を８～１２％に制御する。このＰＥＧＤＡ濃度で製造された生体模倣角膜は、より高い強度を有する。
【0077】
さらに、前記凍結乾燥ステップは、凍結乾燥保護剤の保護下でポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を凍結乾燥させることである。凍結乾燥保護剤は、凍結乾燥プロセス中にポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の構造が破壊されないようにポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を保護することができ、それにより凍結乾燥製剤の架橋性を向上させ、製造される角膜の強度をさらに向上させる。
【発明を実施するための形態】
【0078】
以下の実施例は、本願をよりよく理解するために提供されたものであり、前述の最良の実施形態に限定されるものではなく、本願の内容及び保護範囲を制限するものではなく、本願の示唆又は本願と他の従来技術の特徴を組み合わせて得られた、本願と同一又は類似する如何なる製品も、本願の保護範囲内に入る。
【0079】
以下の実施例において特定の実験ステップまたは条件が明記されていない場合、当該分野の文献に記載されている従来の実験ステップの操作または条件に従って実行することができる。使用した試薬や機器の製造元が明記されていない場合、それらはすべて市販されている従来の試薬製品である。以下の実施例では、コラーゲン様タンパク質の合成、およびコラーゲン様タンパク質とｌｉｎｋｅｒとの連結は、上海昂博生物技術有限公司（ＡｍｂｉｏＰｈａｒｍ．ＩｎＣ．）によって行われる。下記の実施例におけるＰＥＧ誘導体は、すべて厦門賽諾邦格生物科技股▲ふん▼有限公司から購入する。
【実施例】
【0080】
実施例１：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を架橋して硬化させることより得られた生体模倣角膜を提供する。前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるコラーゲン様タンパク質と、コラーゲン様タンパク質 Ｎ末端に連結されたアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｌｉｎｋｅｒと、ｌｉｎｋｅｒのメルカプト上に修飾された８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬとからなる。ここで、８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬと４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬとのモル比は２：１であり、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質中のポリエチレングリコール誘導体のコアコンホメーションはＴＰであり、かつ、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の分子量は３０，０００～７５，０００Ｄａである。この生体模倣角膜は、生体模倣角膜１と命名される。
上記の生体模倣角膜１の製造方法は、以下のステップを含む。
反応ステップ：コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体を濃度５ｍｍｏｌ／Ｌの希塩酸溶液（希塩酸溶液のｐＨは、ｐＨ１１．０の水酸化ナトリウム溶液で６．５に調整）に溶解し、希塩酸溶液中のコラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ２．４ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．３ｍｍｏｌ／Ｌにし、反応系を得た。反応系をｐＨ６．５、温度５℃の条件で１２ｈ反応させ、反応生成物を得た。
精製ステップ：反応生成物を孔径３０，０００Ｄａの限外濾過膜により５℃で限外濾過し、反応生成物中の分子量が３０，０００Ｄａ以上の物質を遮断し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を得た。
凍結乾燥ステップ：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質とマンニトールを質量比１：５で混合し、凍結乾燥系を得た。凍結乾燥系を凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得た。
架橋ステップ：凍結乾燥製剤を濃度０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ中のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度を１２．５ｇ／ｍＬとし、溶解液を得た。溶解液とＭＰＣ母液を質量比５：１で混合し、混合液１を得た。混合液１とＤＭＴＭＭ母液を質量比７：１で混合し、混合液２を得た。架橋全体は、４５℃で行われた。
硬化ステップ：混合液２を角膜金型に注入して、２５℃で１２ｈ静置し、角膜の粗品を得た。
浸漬ステップ：角膜の粗品を（金型とともに）濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒに添加し、４℃で２４ｈ浸漬した後、金型を開いて、４℃でさらに４ｈ浸漬し、離型し、生体模倣角膜１を得た。
ここで、ＭＰＣ母液の処方：３０ｇ／ｍＬ ＭＰＣ、１０％ＰＥＧＤＡ（ｖ／ｖ）、１％ＴＥＭＥＤ（ｖ／ｖ）、溶媒 ０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ
ＤＭＴＭＭ母液の処方：１０ｇ／ｍＬＤＭＴＭＭ、１５ｇ／ｍＬ ＡＰＳ、溶媒０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ
凍結乾燥は、以下の段階を含む。
段階１：温度が－４５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が５００ｍ Ｔｏｒｒの条件で６ｈ凍結乾燥させる。
段階２：温度が－３０℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で１７ｈ凍結乾燥させる。
段階３：温度が２５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で７ｈ凍結乾燥させる。
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を架橋して硬化させることより得られた生体模倣角膜を提供する。前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるコラーゲン様タンパク質と、コラーゲン様タンパク質 Ｎ末端に連結されたアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｌｉｎｋｅｒと、ｌｉｎｋｅｒのメルカプト上に修飾された８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬとからなる。ここで、８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬと４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬとのモル比は２：１であり、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質中のポリエチレングリコール誘導体のコアコンホメーションはＴＰであり、かつ、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の分子量は３０，０００～７５，０００Ｄａである。この生体模倣角膜は、生体模倣角膜１と命名される。
上記の生体模倣角膜１の製造方法は、以下のステップを含む。
反応ステップ：コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体を濃度５ｍｍｏｌ／Ｌの希塩酸溶液（希塩酸溶液のｐＨは、ｐＨ１１．０の水酸化ナトリウム溶液で６．５に調整）に溶解し、希塩酸溶液中のコラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ２．４ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．３ｍｍｏｌ／Ｌにし、反応系を得た。反応系をｐＨ６．５、温度５℃の条件で１２ｈ反応させ、反応生成物を得た。
精製ステップ：反応生成物を孔径３０，０００Ｄａの限外濾過膜により５℃で限外濾過し、反応生成物中の分子量が３０，０００Ｄａ以上の物質を遮断し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を得た。
凍結乾燥ステップ：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質とマンニトールを質量比１：５で混合し、凍結乾燥系を得た。凍結乾燥系を凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得た。
架橋ステップ：凍結乾燥製剤を濃度０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ中のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度を１２．５ｇ／ｍＬとし、溶解液を得た。溶解液とＭＰＣ母液を質量比５：１で混合し、混合液１を得た。混合液１とＤＭＴＭＭ母液を質量比７：１で混合し、混合液２を得た。架橋全体は、４５℃で行われた。
硬化ステップ：混合液２を角膜金型に注入して、２５℃で１２ｈ静置し、角膜の粗品を得た。
浸漬ステップ：角膜の粗品を（金型とともに）濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒに添加し、４℃で２４ｈ浸漬した後、金型を開いて、４℃でさらに４ｈ浸漬し、離型し、生体模倣角膜１を得た。
ここで、ＭＰＣ母液の処方：３０ｇ／ｍＬ ＭＰＣ、１０％ＰＥＧＤＡ（ｖ／ｖ）、１％ＴＥＭＥＤ（ｖ／ｖ）、溶媒 ０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ
ＤＭＴＭＭ母液の処方：１０ｇ／ｍＬＤＭＴＭＭ、１５ｇ／ｍＬ ＡＰＳ、溶媒０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ
凍結乾燥は、以下の段階を含む。
段階１：温度が－４５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が５００ｍ Ｔｏｒｒの条件で６ｈ凍結乾燥させる。
段階２：温度が－３０℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で１７ｈ凍結乾燥させる。
段階３：温度が２５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で７ｈ凍結乾燥させる。
【0081】
実施例２：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、使用したＰＥＧ処方（モル比が２：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ）をそれぞれ以下のものに置換する。
モル比が１：０の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
モル比が０：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
モル比が６：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
モル比が４：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
モル比が２：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ
モル比が４：２：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ、及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ
モル比が２：２：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、４－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
モル比が２：２：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、４－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、及び８－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
上記の生体模倣角膜タンパク質は順次生体模倣角膜２～９と命名される。
上記の生体模倣角膜２～９の製造方法は、生体模倣角膜１と同様である。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、使用したＰＥＧ処方（モル比が２：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ）をそれぞれ以下のものに置換する。
モル比が１：０の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
モル比が０：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
モル比が６：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
モル比が４：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
モル比が２：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ
モル比が４：２：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ、及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ
モル比が２：２：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、４－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
モル比が２：２：１の８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、４－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ、及び８－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬ
上記の生体模倣角膜タンパク質は順次生体模倣角膜２～９と命名される。
上記の生体模倣角膜２～９の製造方法は、生体模倣角膜１と同様である。
【0082】
実施例３：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を架橋して硬化させることにより得られ、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるコラーゲン様タンパク質と、コラーゲン様タンパク質のＮ末端に連結されたアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示されるｌｉｎｋｅｒと、ｌｉｎｋｅｒアミノ上に修飾された８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬと、からなり、８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬと４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬとのモル比は２：１であり、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質中のポリエチレングリコール誘導体のコアコンホメーションはＴＰであり、かつポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の分子量は３０，０００～７５，０００Ｄａである。この生体模倣角膜は生体模倣角膜１０と命名される。
上記の生体模倣角膜１０の製造方法は生体模倣角膜１と同様である。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を架橋して硬化させることにより得られ、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるコラーゲン様タンパク質と、コラーゲン様タンパク質のＮ末端に連結されたアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示されるｌｉｎｋｅｒと、ｌｉｎｋｅｒアミノ上に修飾された８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ及び４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬと、からなり、８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬと４－ａｒｍ－ＰＥＧ－２０ｋ－ＭＡＬとのモル比は２：１であり、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質中のポリエチレングリコール誘導体のコアコンホメーションはＴＰであり、かつポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の分子量は３０，０００～７５，０００Ｄａである。この生体模倣角膜は生体模倣角膜１０と命名される。
上記の生体模倣角膜１０の製造方法は生体模倣角膜１と同様である。
【0083】
実施例４：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、反応ステップの反応温度（５℃）をそれぞれ２℃、８℃、２５℃、３７℃に変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜１１～１４と命名される。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、反応ステップの反応温度（５℃）をそれぞれ２℃、８℃、２５℃、３７℃に変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜１１～１４と命名される。
【0084】
実施例５：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、反応ステップの反応ｐＨ（６．５）をそれぞれｐＨ２．５、ｐＨ４．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ１０．５に変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜１５～２２と命名される。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、反応ステップの反応ｐＨ（６．５）をそれぞれｐＨ２．５、ｐＨ４．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ１０．５に変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜１５～２２と命名される。
【0085】
実施例６：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、反応ステップ中のコラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の希塩酸溶液中のモル濃度をそれぞれ以下の濃度に変更した。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ３．０ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．３７５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ１．８ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．２２５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ１．２ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．１５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜２３～２５と命名される。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、反応ステップ中のコラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の希塩酸溶液中のモル濃度をそれぞれ以下の濃度に変更した。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ３．０ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．３７５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ１．８ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．２２５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ１．２ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．１５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜２３～２５と命名される。
【0086】
実施例７：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、反応ステップ中の反応時間（１２ｈ）をそれぞれ４ｈ、８ｈ、１６ｈ、２４ｈに変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜２６～２９と命名される。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、反応ステップ中の反応時間（１２ｈ）をそれぞれ４ｈ、８ｈ、１６ｈ、２４ｈに変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜２６～２９と命名される。
【0087】
実施例８：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、凍結乾燥ステップの凍結乾燥保護剤（マンニトール）をそれぞれスクロース、アラニンに変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜３０～３１と命名される。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、凍結乾燥ステップの凍結乾燥保護剤（マンニトール）をそれぞれスクロース、アラニンに変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜３０～３１と命名される。
【0088】
実施例９：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、架橋ステップの架橋温度（４５℃）をそれぞれ２０℃、２５℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃に変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜３２～３８と命名される。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、架橋ステップの架橋温度（４５℃）をそれぞれ２０℃、２５℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃に変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜３２～３８と命名される。
【0089】
実施例１０：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、架橋ステップのＢｕｆｆｅｒのｐＨ（５．５）をそれぞれ５．０、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０に変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜３９～４６と命名される。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、架橋ステップのＢｕｆｆｅｒのｐＨ（５．５）をそれぞれ５．０、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０に変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜３９～４６と命名される。
【0090】
実施例１１：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、架橋ステップのポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ中の濃度（１５ｇ／ｍＬ）をそれぞれ１ｇ／ｍＬ、５ｇ／ｍＬ、１０ｇ／ｍＬ、２０ｇ／ｍＬ、２５ｇ／ｍＬ、３０ｇ／ｍＬ、３５ｇ／ｍＬ、４０ｇ／ｍＬ、４５ｇ／ｍＬに変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜４７～５５と命名される。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、架橋ステップのポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ中の濃度（１５ｇ／ｍＬ）をそれぞれ１ｇ／ｍＬ、５ｇ／ｍＬ、１０ｇ／ｍＬ、２０ｇ／ｍＬ、２５ｇ／ｍＬ、３０ｇ／ｍＬ、３５ｇ／ｍＬ、４０ｇ／ｍＬ、４５ｇ／ｍＬに変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜４７～５５と命名される。
【0091】
実施例１２：生体模倣角膜及びその製造
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、架橋ステップのＰＥＧＤＡのＭＰＣ母液中の濃度（１０％、ｖ／ｖ）をそれぞれ０．５％、０．６％、１％、５％、８％、１２％、１５％（ｖ／ｖ）に変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜５６～６２と命名される。
本実施例は、生体模倣角膜を提供し、前記生体模倣角膜は、実施例１の生体模倣角膜１を基にして、架橋ステップのＰＥＧＤＡのＭＰＣ母液中の濃度（１０％、ｖ／ｖ）をそれぞれ０．５％、０．６％、１％、５％、８％、１２％、１５％（ｖ／ｖ）に変更した。
上記の生体模倣角膜は順次生体模倣角膜５６～６２と命名される。
【0092】
実験例１：ＰＥＧ処方及び製造プロセスが生体模倣角膜の強度に与える影響についての実験
本実験例は、ＰＥＧ処方及び製造プロセスが生体模倣角膜の強度に与える影響についての実験を提供し、実験の過程は以下の通りである。
生体模倣角膜１の製造方法を参照して、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるコラーゲン様タンパク質をそのまま用いて生体模倣角膜を製造し、この生体模倣角膜をブランクとし、ユニバーサル引張機によって角膜１～６２の強度を検出し、検出結果を表１に示す。
本実験例は、ＰＥＧ処方及び製造プロセスが生体模倣角膜の強度に与える影響についての実験を提供し、実験の過程は以下の通りである。
生体模倣角膜１の製造方法を参照して、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるコラーゲン様タンパク質をそのまま用いて生体模倣角膜を製造し、この生体模倣角膜をブランクとし、ユニバーサル引張機によって角膜１～６２の強度を検出し、検出結果を表１に示す。
【0093】
表１から、ＰＥＧ修飾処方の組み合わせ及び調製プロセスのいずれも生体模倣角膜の強度に影響を与えることがわかった。中でも、ＰＥＧ修飾処方の組み合わせは角膜の強度と弾性に大きな影響を与える。反応温度とｐＨは、コラーゲン様タンパク質とＰＥＧ誘導体の結合率に直接関係しており、ポリマーネットワーク構造の形成に影響を与えることによって、修飾生成物をヒドロゲルにして角膜を形成できるかどうかの重要な要素の１つとなる。凍結乾燥賦形剤の組成は、ポリエチレングリコール化コラーゲンのために骨格サポートと保護を提供し、それによってポリマーの空間構造と生物学的活性に影響を与え、その結果、成膜後の硬度に違いがある。ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度が低すぎると角膜の強度が低下し、濃度が高すぎると角膜の硬化時間が非常に短くなり、その後の注入ステップを完了できなくなる。ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の等電点は中性であるため、架橋ｐＨが等電点から遠く離れていると、反応に関与する基が互いに近づくことができず、角膜強度が低下したり、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質のゲル化は起こらなかったりする。ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質で製造されたヒドロゲルは、温度に敏感なヒドロゲルであり、温度が低いと溶解性が悪く、角膜の固形分濃度が低くなり、強度が低下し、温度が高いと架橋速度が非常に速くなり、金型に流し込めなくなり、早期にゲル化してしまう。ＭＰＣ母液中のＰＥＧＤＡの濃度が低すぎると、角膜の強度が低下し、濃度が高すぎると、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質が過剰に架橋され、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質で製造されたヒドロゲルの脆性と靭性は増加し、靭性は低下し、それによって角膜の強度が低下する。表１では、角膜１～１３、１６～２１、２３～３１、３３～３７、３９～４４、４９～５３、および５６～６２は、強度と生体適合性に優れており、角膜移植の分野での応用が期待されている。
【0094】
【表1】
【0095】
明らかに、上記の実施例は、単に明確に説明するための例であり、実施形態を限定するものではない。当業者にとっては、上記の説明に基づいて、他の異なる形の変化または変更が行われてもよい。ここでは、すべての実施形態を網羅的に挙げる必要もなく、また、不可能なことである。そして、そこから引き出された自明な変化又は変動も本願の保護範囲に含まれるものとする。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を原料としており、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、コラーゲン様タンパク質と、コラーゲン様タンパク質に修飾されたポリエチレングリコール誘導体と、を含み、前記ポリエチレングリコール誘導体は、ＰＥＧ－４０ｋ及びＰＥＧ－２０ｋを含む、ことを特徴とする生体模倣角膜。
【請求項2】
ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を架橋して硬化させることにより得られ、及び／又は
前記コラーゲン様タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される、ことを特徴とする請求項１に記載の生体模倣角膜。
【請求項3】
前記ＰＥＧ－４０ｋとＰＥＧ－２０ｋとのモル比は０．５～６：１であり、好ましくは２～３：１であり、及び／又は
前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基数は、８－ａｒｍ、４－ａｒｍ、２－ａｒｍ、又は１－ａｒｍのうちの１つ又は複数であり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基数は、８－ａｒｍ、４－ａｒｍ、２－ａｒｍ、又は１－ａｒｍのうちの１つ又は複数であり、好ましくは、前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基数は４－ａｒｍ、又は８－ａｒｍであり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基数は４－ａｒｍ、又は８－ａｒｍであり、及び／又は
前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基は、－ＭＡＬ、－ＮＨＳ、－ＳＧ、－ＳＰＡ、－ＳＳ、又は－ＥＤＣのうちの１つ又は複数であり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基は、－ＭＡＬ、－ＮＨＳ、－ＳＧ、－ＳＰＡ、－ＳＳ、又は－ＥＤＣのうちの１つ又は複数であり、好ましくは、前記ＰＥＧ－４０ｋの活性化基は、－ＭＡＬであり、前記ＰＥＧ－２０ｋの活性化基は、－ＭＡＬである、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載の生体模倣角膜。
【請求項4】
前記コラーゲン様タンパク質の一端にｌｉｎｋｅｒが連結されており、前記ポリエチレングリコール誘導体は、活性化基を通じてｌｉｎｋｅｒに修飾されており、好ましくは、前記ｌｉｎｋｅｒは、コラーゲン様タンパク質のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載の生体模倣角膜。
【請求項5】
前記ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示され、好ましくは、前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位は、メルカプト、アミノ、カルボキシ、又はイミダゾリルのうちの１つ又は複数であり、より好ましくは、前記ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示される場合、前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位はメルカプトであり、ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示される場合、前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位はアミノである、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載の生体模倣角膜。
【請求項6】
コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ ４．０～１０．０、温度２～４０℃の条件で１～４８ｈ反応させて、反応生成物を得る反応ステップと、反応生成物を凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得る凍結乾燥ステップと、
凍結乾燥製剤を緩衝液に溶解し、溶解液を得て、溶解液とＭＰＣ母液を混合し、混合液１を得て、混合液１とＤＭＴＭＭ母液を混合し、混合液２を得る架橋ステップと、
混合液２を角膜の金型に注入して静置し、角膜の粗品を得る硬化ステップと、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の生体模倣角膜の製造方法。
【請求項7】
前記反応ステップは、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ６．０～８．０、温度２～８℃の条件で５～８ｈ反応させることであり、及び／又は
前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の供給モル数の比は１～１６：１であり、好ましくは、８～１２：１であり、及び／又は
前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の反応溶媒は水又は希塩酸溶液であり、好ましくは、前記希塩酸溶液の濃度は１～１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記希塩酸溶液のｐＨが希アルカリ溶液で６．０～８．０に調整され、及び／又は
前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は１～１５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は８～１０ｍｇ／ｍＬであり、及び／又は
前記凍結乾燥ステップは、反応生成物と凍結乾燥保護剤を混合して凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得ることであり、好ましくは、前記凍結乾燥保護剤は、マンニトール、スクロース、又はアラニンのうちの１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項8】
架橋ステップでは、前記緩衝液のｐＨは５．５～８．０であり、好ましくは、前記緩衝液のｐＨは、６．５～７．５であり、及び／又は
架橋ステップでは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は、５～４０ｇ／ｍＬであり、好ましくは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は、１２～１８ｇ／ｍＬであり、及び／又は
架橋ステップでは、前記溶解液とＭＰＣ母液との混合質量比は、２：１～４：１であり、及び／又は
架橋ステップでは、前記混合液１とＤＭＴＭＭ母液との混合質量比は、５：１～７：１であり、及び／又は
前記架橋ステップは、２５～６０℃で行われ、好ましくは、４５～５５℃で行われる、ことを特徴とする請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
硬化ステップでは、前記静置温度は、４～３５℃である、ことを特徴とする請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＭＰＣ母液の成分は、ＭＰＣ、ＰＥＧＤＡ、ＴＥＭＥＤ、及び溶媒を含み、好ましくは、前記ＭＰＣ母液において、ＭＰＣの濃度は１５～４０ｇ／ｍＬであり、前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は０．６～１５体積％であり、ＴＥＭＥＤの濃度は０．０５～２体積％であり、より好ましくは、前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は８～１２％である、ことを特徴とする請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＭＰＣ母液の溶媒は緩衝液であり、前記緩衝液のｐＨは６．０～８．０であり、好ましくは、前記ＤＭＴＭＭ母液の成分は、ＤＭＴＭＭ、ＡＰＳ、及び溶媒を含み、より好ましくは、前記ＤＭＴＭＭ母液において、ＤＭＴＭＭの濃度は５～２０ｇ／ｍＬであり、ＡＰＳの濃度は０．５～５ｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＤＭＴＭＭ母液の溶媒は緩衝液であり、前記緩衝液のｐＨは６．０～８．０である、ことを特徴とする請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
硬化ステップの後、角膜の粗品を金型とともに緩衝液に入れて第１浸漬を行い、第１浸漬終了後、金型を開いて、第２浸漬を行い、第２浸漬終了後、離型し、角膜の完成品を得る浸漬ステップをさらに含み、好ましくは、浸漬ステップでは、前記緩衝液のｐＨは５．５～８．０である、ことを特徴とする請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記第１浸漬は、温度が４～３５℃、時間が５～２４ｈであり、及び／又は、
前記第２浸漬は、温度が４～３５℃、時間が３～１０ｈである、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
反応ステップの後かつ凍結乾燥ステップの前、反応生成物中の分子量が３０，０００Ｄａ以上の物質を濾過により遮断し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を得る精製ステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】