特表 2024-531761 ＣＯＶＩＤ－１９感染予防のためのデンタルバクテリアと放出ペプチドを介した経口ワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】ＣＯＶＩＤ－１９感染予防のためのデンタルバクテリアと放出ペプチドを介した経口ワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/215 20060101AFI20240822BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20240822BHJP

【ＦＩ】

A61K39/215

A61P37/04

A61P31/14

C12N1/21 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516767

(86)(22)【出願日】2022-09-19

(85)【翻訳文提出日】2024-05-09

(86)【国際出願番号】 US2022076681

(87)【国際公開番号】W WO2023044494

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】63/245,553

(32)【優先日】2021-09-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524097735

【氏名又は名称】デビッド・コトリアー

(74)【代理人】

【識別番号】100139778

【弁理士】

【氏名又は名称】栗原 潔

(72)【発明者】

【氏名】デビッド・コトリアー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B065AA53X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA45

4C085AA03

4C085BA71

4C085DD62

4C085EE03

4C085GG08

4C085GG10

(57)【要約】

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染を予防する医薬組成物を開示する。当該医薬組成物は遺伝子組換え細菌と、小ペプチドの配列と医薬賦形剤とを含む。ここで、遺伝子組み換え口腔細菌は、SARS-CoV-2をCOVID-19に対抗して中和する小ペプチドの配列を翻訳、生産、放出するように改変されている。遺伝子組換え口腔細菌を改変するためにトランスジェニック技術が使用され、遺伝子組換え口腔細菌に、付加された小ペプチドの配列から小ペプチドを産生するように転写される遺伝子が付加される。ここで、小ペプチドの配列は、SARS-CoV-2には極端に結合し中和するが、宿主のタンパク質やプロセスには結合しない。医薬賦形剤は、医薬組成物の経口および/または経鼻投与を補助する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の伝播を予防するための医薬組成物であって、
a) 遺伝子組換え細菌、
b) 小ペプチドの配列、
c) 医薬賦形剤、
を含み、
前記遺伝子組換え口腔細菌は、COVID-19に対抗してSARS-CoV-2を中和する小ペプチドの配列を翻訳し、産生し、放出するように改変されており、
前記遺伝子組換え口腔細菌を改変し、遺伝子組換え口腔細菌に、付加された小ペプチドの配列から小ペプチドを産生するように転写される遺伝子を付加するために、トランスジェニック技術が使用され、
前記小ペプチドの配列は、SARS-CoV-2に対する極端な結合および中和を示すが、宿主タンパク質またはプロセスに対する結合および中和を示さず、
前記医薬賦形剤は、前記医薬組成物の経口および／または経鼻投与を補助するものである、
医薬組成物。

【請求項2】

前記遺伝子組換え細菌は、経鼻および経口適用された遺伝子組換え細菌である、S. Lugdunensis、S. salivarius M18、または、それらの組み合わせである、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

SARS-COV-2の感染を予防する経口ワクチン、または、SARS-COV-2の感染を予防する点鼻薬である、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記小ペプチドの配列は、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、および、SEQ ID NO: 10から成る群より選択される、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項5】

小ペプチドの配列の１つ以上が、半減期を改善するために追加のn-グリコシル化部位で修飾されている、
請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記小ペプチドの配列が、SARS-COV-2に対する４つの自殺遺伝子を介して、遺伝子組換え細菌を切除および／または排除することができる、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記遺伝子組換え細菌には、SARS-CoV-2をCOVID-19に対抗して中和する小ペプチドの配列を翻訳、産生、放出するように改変できる、口や鼻に潜在するすべての常在細菌が含まれる、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項8】

COVID-19に対する被験体におけるSAR-CoV-2感染を治療または予防する方法であって、前記被験体に治療有効量の１つ以上の遺伝子組換え細菌を投与することを含む方法。

【請求項9】

前記治療上有効な量の１つ以上の遺伝子組換え細菌は、SARS-COV-2の感染を予防するための経口ワクチンとして、または、SARS-COV-2の感染を予防するための鼻腔スプレーワクチンとして投与される、
請求項８に記載の方法。

【請求項10】

対象が哺乳動物であり、好ましくは対象がヒトである、
請求項８に記載の方法。

【請求項11】

SAR-CoV-2ウイルスの侵入を阻止する方法であって、治療上有効な量の１つまたは複数の遺伝子組換え細菌を被験体に投与することを含む方法。

【請求項12】

治療有効量の１つ以上の遺伝子組換え細菌を、SARS-COV-2の感染を予防するための経口ワクチンまたはSARS-COV-2の感染を予防するための鼻腔スプレーワクチンとして投与する、
請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

対象が哺乳動物であり、好ましくは対象がヒトである、
請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

被験体に治療有効量の１つ以上の遺伝子組換え細菌を投与することを含む、COVID-19に対する被験体におけるSAR-CoV-2感染の治療または予防のための、請求項１に記載の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の伝播を予防するための医薬組成物の使用。

【請求項15】

治療有効量の１つ以上の遺伝子組換え細菌が、SARS-COV-2の感染を予防するための経口ワクチンまたはSARS-COV-2の感染を予防するための鼻腔スプレーワクチンとして投与される、
請求項１４に記載の医薬組成物の使用。

【請求項16】

対象が哺乳動物であり、好ましくは対象がヒトである、
請求項１４に記載の医薬組成物の使用。

【請求項17】

被験体に治療有効量の１つ以上の遺伝子組換え細菌を投与することを含む、SARS-CoV-2ウイルスの侵入を阻止するための、請求項１に記載の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染を予防するための医薬組成物の使用。

【請求項18】

治療有効量の１つ以上の遺伝子組換え細菌が、SARS-COV-2の感染を予防するための経口ワクチンまたはSARS-COV-2の感染を予防するための鼻腔スプレーワクチンとして投与される、
請求項１７に記載の医薬組成物の使用。

【請求項19】

対象が哺乳動物であり、好ましくは対象がヒトである、
請求項１７に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、広くは、経口および/または経鼻投与用ワクチンの医薬組成物に関する。特に、本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-COV-2）の感染を予防する前記ワクチンに関する。より具体的には、本発明は、SARS-COV-2を中和する防御分子を放出および/または翻訳する特定の遺伝子組み換え細菌を組み込んだ、前記経口および/または経鼻投与ワクチンを提供する。

【背景技術】

【0002】

2019年、新たな感染性呼吸器疾患が出現した。非定型肺炎の集団発生を引き起こした病原体として新型コロナウイルスが同定され、世界保健機関（WHO）により2019年新型コロナウイルス（2019-nCoV）という名称が与えられた。国際ウイルス分類委員会（ICTV）は、このウイルスを重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）、病名をコロナウイルス病2019（COVID-19）と改名した。SARS-CoV-2は、SARS-CoVおよび中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV、それぞれ82％および50％の相同性）と共に、ベータコロナウイルス属に属する。COVID-19の主な症状は、発熱、疲労、乾いた咳、上胸部不快感、呼吸困難などである。重症例では敗血症、二次感染、臓器不全が報告されている。WHOのウェブページによると、2022年9月16日現在、世界でCOVID-19の感染が確認された患者は608,328,548人、COVID-19パンデミックによる死亡が確認された患者は6,501,469人である (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019)。2020年1月30日、WHOはCOVID-19の発生を世界的な公衆衛生上の緊急事態と宣言し、2020年3月11日、WHOはCOVID-19をパンデミックと位置づけた。

【0003】

SARS-CoV-2感染は一般に鼻腔から始まり、下気道に広がる前に数日間そこでウイルスが複製される。SARS-CoV-2粒子の粒子構造の模式図を図１Ａに、SARS-CoV-2のライフサイクルの模式図を図１Ｂに示す。したがって、高濃度のウイルス阻害剤を鼻や呼吸器系に投与することで、予防的防御や早期感染の治療効果が得られる可能性があり、これは、特に医療従事者や感染者と頻繁に接触する人々にとって有用である。

【0004】

多くのモノクローナル抗体がCOVID-19の全身治療薬として開発中であるが、抗体は大きく、多くの場合極めて安定した分子ではなく、結合部位の密度が低い（150KDaの抗体１つにつき２つ）ため、これらのタンパク質は経鼻投与には理想的ではない。抗体依存性の疾患増強も潜在的な問題である。ヒト細胞受容体アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との相互作用を阻害する高親和性スパイクタンパク質結合体は、安定性を高め、サイズを小さくして阻害ドメインの密度を最大にすることで、鼻腔内投与、ネブライゼーション、乾燥粉末エアロゾルによる呼吸器系への直接投与において、抗体よりも有利になる可能性がある。このようなペプチド結合体またはペプチド抗ウイルス作用様式を図２Ａに模式的に示す。A.Chevalierらは、インフルエンザヘマグルチニンに強固に結合するように設計された小タンパク質の経鼻投与が、致死的インフルエンザ感染症のげっ歯類モデルにおいて、予防的および治療的防御を提供することを示している。追加研究において、Caoらは、AHB1（以下、SEQ ID NO:1）、AHB2（以下、SEQ ID NO:2）、LCB1～LCB5（以下、SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:7）の真性SARS-CoV-2による細胞感染を防ぐ能力を調べた。図２Ｂに、SARS-CoV-2の感染を中和し予防するための、本開示で用いるような技術と戦略の趣旨を示す。

【0005】

SARS-CoV-2感染の主な原因は、細胞侵入に先立ち、SARS-CoV-2と宿主表面の受容体タンパク質であるヒト・アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との間のクロストーク（相互干渉）である。したがって、ウイルス侵入の初期段階を阻止することは、SARS-CoV-2感染と闘うための有望な戦略／治療法となり得るのであり、そのような戦略のひとつにペプチドベースの抗ウイルス剤が含まれる。Maitiが想定しているように、ペプチドベースの抗ウイルス剤は、ウイルス侵入の段階で細胞表面レセプターおよび／またはウイルス細胞膜の破壊をブロックすることによって、宿主細胞へのウイルス侵入を減少させる可能性があり、COVID-19の予防のための有望な治療ルートを提示している。この参考文献（参照により本明細書に組み込まれる）では、ACE2のウイルス結合ドメインを模倣したペプチドが、SARS-CoV-2遮断薬として有望であることが提案された。ここでの基本戦略は、スパイクタンパク質と特異的に結合するACE2の全長を切断することである。

【0006】

さらに、ChitsikeとDuerksen-Hughesによる概説では、多価抗体、組換えACE2、ミニタンパク質など、さまざまなウイルス侵入阻害剤を含む治療戦略が、曝露前予防だけでなく、SARS-CoV-2抗原ドリフトや将来の人獣共通感染症サルベコウイルスからの防御にも有効であることが、強調された研究（参照により本明細書に組み込まれる）によって明らかにされている。

【0007】

有望な治療戦略として、SARS-CoV-2スパイク（S）タンパク質とACE2レセプターの相互作用を標的とする前述のメカニズムは、Caoらの文献（参照により本明細書に組み込まれる）でさらに詳しく述べられており、スパイクレセプター結合ドメイン（RBD）と相互作用するACE2らせんの周りにコンピューターで生成された足場が構築されるか、新しい結合様式を同定するためにRBDに対してドッキングされ、標的の結合、フォールディング、安定性を最適化するためにアミノ酸配列が設計された。有望な治療戦略として、SARS-CoV-2スパイク（S）タンパク質とACE2レセプターの相互作用を標的とする前述のメカニズムについて、Cao et alらによりさらに詳述されている（参照により本明細書に組み込まれる）。スパイク受容体結合ドメイン（RBD）と相互作用するACE2らせんを中心に、あるいはRBDとドッキングして新たな結合様式を同定するために、コンピューターで生成した足場が作られ、そのアミノ酸配列は標的との結合、フォールディング、安定性を最適化するように設計された。10種類のデザインが100ピコモルから10ナノモルの親和性でRBDに結合し、24ピコモルから35ナノモルの阻害濃度（IC50）中央値でVero E6細胞のSARS-CoV-2感染を阻止した。新しい結合様式で最も強力だったのは、56残基と64残基のタンパク質であった（IC50～0.16ナノグラム/ml）。これらのミニバインダーとSARS-CoV-2スパイクエクトドメイン3量体との複合体の低温電子顕微鏡構造は、３つのRBDがすべて結合した状態で、計算モデルとほぼ同じであった。これらの超安定ミニバインダーはSARS-CoV-2治療薬の出発点となった。

【0008】

SARS-CoV-2-RBDのACE2への結合を阻害するペプチドは、宿主細胞への侵入を防ぐためにウイルスが付着する段階を標的としてウイルスを阻害することができ、COVID-19の治療介入の新しい手段となる。たとえば、ACE2ペプチダーゼドメイン（PD）のa1らせんのアミノ酸からなるSBP1（23merのペプチド断片）が合成された。バイオレイヤー干渉法の結果、SBP1は低ナノモル濃度でSARS-CoV-2-RBDと特異的に結合し、SARS-CoV-2 Sタンパク質とACE2の相互作用を阻害することで、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを防ぎ、COVID-19に対する新たな治療・診断戦略を提供することが明らかになった。Sタンパク質とACE2間のウイルス結合を阻害するために、Caoらによって２つのde novoデザインアプローチ（ミニバインダーとも呼ばれる）を用いてデザインされたペプチドは、ACE2ヘリックスを中心に構築されたか、RBD結合モチーフに基づいたものであった。AHB1（ここではSEQ ID NO:1と呼ぶ）とAHB2（ここではSEQ ID NO:2と呼ぶ）は最初のアプローチに従い、SARS-CoV-2をそれぞれ35と15.5nmol/LのIC50で強力に中和した。第二のアプローチにより、LCB1（ここではSEQ ID NO:3と呼ぶ）およびLCB3（ここではSEQ ID NO:5と呼ぶ）は、それぞれ23.54および48.1pmol/LのIC50でSARS-CoV-2を中和した。これらの超安定ミニバインダーは、SARS-CoV-2治療薬に新たなアプローチを提供する。

【0009】

さらに、ACE2と接触するSARS-Cov-2のSタンパク質のRBD上およびde novo結合体と接触するRBD上の界面残基は類似しており、RBD-ACE2相互作用および接触の近傍にあることが観察された（参照として本明細書に組み込まれるCao et al.の表S1を参照）。本明細書で使用され、前述のde novo結合体について本開示の図３に表形式で示されている小ペプチドの配列は以下の通りである。SEQ ID NO: 1 はAHB1 (すなわち、DEDLEELERLYRKAEEVAKEAKDASRRGDDERAKEQMERAMRL DQVFELAQELQEKQTDGNRQKATHLDKAVKE AADELYQRVR)、SEQ ID NO: 2はAHB2 (すなわち、ELEEQVMHVLDQVSELAHELLHKLTGEELERAAYFNWWATEMMLELIKSDDEREIREIEEEARRILEHLEELARK)、SEQ ID NO: 3 はLCB1 (すなわち、DKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEVER)、SEQ ID NO: 4 はLCB2 (すなわち、SDDEDSVRYLLYMAELRYEQGNPEKAKKILEMAEFIAKRNNNEELERLVREVKKRL)、SEQ ID NO: 5 はLCB3 (すなわち、NDDELHMLMTDLVYEALHFAKDEEIKKRVFQLFELADKAYKNNDRQKLEKVVEELKELLERLLS)、SEQ ID NO: 6はLCB4 (すなわち、QREKRLKQLEMLLEYAIERNDPYLMFDVAVEMLRLAEENNDERIIERAKRILEEYE)、SEQ ID NO: 7 は LCB5 (すなわち、SLEELKEQVKELKKELSPEMRRLIEEALRFLEEGNPAMAMMVLSDLVYQLGDPRVIDLYMLVTKT)、SEQ ID NO: 8 はLCB6 (すなわち、DREQRLVRFLVRLASKFNLSPEQILQLFEVLEELLERGVSEEEIRKQLEEVAKELG)、SEQ ID NO: 9 はLCB7 (すなわち、DDDIRYLIYMAKLRLEQGNPEEAEKVLEMARFLAERLGMEELLKEVRELLRKIEELR)、SEQ ID NO: 10 はLCB8 (すなわち、PIIELLREAKEKNDEFAISDALYLVNELLQRTGDPRLEEVLYLIWRALKEKDPRLLDRAIELFER)。本明細書で前述のde novo結合体に使用した小ペプチドの配列は、AHB2とLCB1-LCB8を大腸菌から発現・精製し、Caoらの文献に見られるようにBLIでRBDへの結合を評価したものである。デザインのうち７つについては、解離定数（Kd）の値は1～20 nMの範囲であり、２つ（LCB1とLCB3）については、Kdの値は1nM以下であった。これは、Caoらに示されているように、この手法で確実に測定するには強すぎる。したがって、参照文献として本明細書に組み込まれたCaoらの図５に見られるように、質量当たりで見ると、そのサイズが非常に小さいため、設計は最良のモノクローナル抗体よりも６倍強力であり、それゆえ、潜在的な治療薬として抗体を上回る潜在的な利点を有する。しかし、SARS-Cov-2の中和に有効で、投与が容易なこれらの潜在的な小ペプチドの適切な投与には、まだ疑問と必要性が残っている。

【0010】

本発明は、SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10に記載の小ペプチドの前記配列の治療上有効な量の有効な伝達を提供するように、鼻腔および経口適用可能である遺伝子改変細菌を含み、また、それに基づく医薬組成物を提供する。小ペプチドは、SARS-CoV-2がCOVID-19に感染するのを防ぐために、SARS-Cov-2との極端な結合と中和により、SARS-Cov-2との極端な結合と中和により、本明細書に記載されているように、デノボ・バインダーとして転写、翻訳、生産、放出する遺伝子組み換え細菌に添加される。開示された医薬組成物は、経口ワクチンとして、または鼻腔スプレーワクチンとして投与され、SARS-Cov-2の中和と、鼻腔そのものへの侵入段階での感染予防を可能にするという利点がある。有利な点として、本発明は、防御分子を放出および／または翻訳する特定の遺伝子組換え細菌を組み込むことにより、経口および／または経鼻投与が可能なワクチンを提供し、SARS-CoV-2の効果的な投与、中和および感染予防に関する現状のニーズおよび技術的ギャップに対処する。現在開示されているSEQ ID NO:1からSEQ ID NO:10に記載の小ペプチドの配列は、SARS-CoV-2を従来の適応免疫学的手段で達成できるよりも生物物理学的に高いオーダーで中和する。治療上有効な中和ペプチド配列を持つ遺伝子組み換え細菌を経口・経鼻投与することで、変異体が変異してこのようなワクチンに対する耐性を獲得することは統計的に不可能にななる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】A. Chevalier et al., Nature, 2017, 550, 74-79.

【非特許文献2】Cao et al., Science, 2020, 370, 426-431.

【非特許文献3】Maiti B.K., ACS Pharmacol. Transl. Sci., 2020, 3, 783-785.

【非特許文献4】Chitsike and Duerksen-Hughes, Virol J, 2021, 18:154.

【発明の概要】

【0012】

本開示は、SARS-CoV-2の感染を予防するための経口または鼻腔スプレーワクチンである医薬組成物を提供する。本発明は、SARS-CoV-2を中和する保護分子を、従来の適応免疫学的手段で達成できるよりも生物物理学的に高いオーダーで放出および／または翻訳する、特定の遺伝子組み換え口腔内細菌を組み込んだ前記経口または鼻腔スプレーワクチンを提供する。前記遺伝子組み換え経口細菌と小ペプチド抗ウイルス剤である防御分子の組み合わせを使用することで、変異体が変異してワクチンに対する耐性を獲得することは統計的に不可能となる。本開示では、遺伝子組換え口腔内細菌と、宿主のタンパク質やプロセスには結合せず、SARS-CoV-2に対して極端な結合と中和（従来の適応免疫では不可能）を示すペプチドの配列である防御分子によって得られる組み合わせを開示する。本開示での好ましい細菌は、鼻腔および経口投与されるトランスジェニックStaphylococcus lugdunensis、および/またはStreptococcus salivarius M18である。

【0013】

本発明の一実施形態では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染を予防するための医薬組成物が開示される。当該医薬組成物は以下を含む：a)遺伝子組み換え細菌、b)小ペプチドの配列、c)医薬賦形剤。ここで、遺伝子組み換え口腔細菌は、SARS-CoV-2をCOVID-19に対抗して中和する小ペプチドの配列を翻訳、産生、放出するように改変されている。ここで、トランスジェニック技術が、遺伝子改変された口腔細菌を改変するために使用され、遺伝子改変された口腔細菌に、そのように付加された小ペプチドの配列から小ペプチドを産生するように転写される遺伝子を付加する。ここで、小ペプチドの配列は、SARS-CoV-2に対する極端な結合および中和を示すが、宿主タンパク質またはプロセスに対する結合および中和は示さない。ここで、医薬賦形剤は、医薬組成物の経口および/または経鼻投与を補助する。

【0014】

本発明の一実施形態では、COVID-19に対する被験者のSAR-CoV-2感染を治療または予防する方法が開示される。当該方法は、治療上有効な量の１つまたは複数の遺伝子組み換え細菌を被験者に投与することを含む。

【0015】

本発明の一実施形態では、被験体におけるSAR-CoV-2ウイルスの侵入を阻止する方法が開示される。治療上有効な量の１つまたは複数の遺伝子組換え細菌を被験体に投与することを含む。

【0016】

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示すものであるが、例示のためのみであり、本発明の精神および範囲内での様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者には明らかであることを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0017】

添付図面は、本発明のさらなる理解を提供するために含まれるものであり、本発明に組み込まれ、本発明の一部を構成し、本明細書とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。

【図1A】SARS-CoV-2ウイルスのウイルス粒子構造を漫画で表現したものであり、このウイルスは、ヌクレオカプシドタンパク質（N）と共に、30kbのポジティブセンス一本鎖RNA（+）ssRNAゲノムを持つエンベロープウイルスであり、ウイルス粒子表面の構造タンパク質には、スパイクタンパク質（S）、エンベロープタンパク質（E）、膜タンパク質（M）を含む。

【図1B】呼吸器上皮細胞表面におけるSARS-CoV-2のライフサイクルの概略図であり、SARS-CoV-2はまず細胞表面のACE2に結合し、エンドサイトーシスとカテプシン活性化によりエンドソームから、あるいは、プロテアーゼによるS活性化により細胞表面膜から直接RNAを細胞質に放出する。宿主細胞の細胞質では、(+)ゲノムRNAはORF1a/bから複合レプリカーゼ・マシナリー（例えばRdRp）の非構造タンパク質を含むポリタンパク質に直接翻訳される。(-)センスRNAが合成され、(+)センスゲノムRNAやサブゲノムRNAの鋳型となり、そこから構造タンパク質やアクセサリータンパク質が作られる。これらのタンパク質とゲノムRNAは、エキソサイトーシスによって細胞外に出る新しいビリオンを組み立てるために利用される。ビリオンと感染細胞の死は宿主の免疫反応を引き起こす。これらのタンパク質とゲノムRNAは、エキソサイトーシスによって細胞外に出る新しいビリオンを組み立てるために利用される。ビリオンと感染細胞の死は宿主の免疫反応を引き起こす。

【図2A】SARS-CoV-2に対するペプチドベースの抗ウイルス薬の概略図であり、アンジオテンシン変換酵素-2（ACE2）のウイルス結合ドメインの界面を模倣したペプチドは、ウイルス侵入の段階で細胞表面レセプターをブロックしたり、ウイルス細胞膜を破壊したりすることにより、宿主細胞へのウイルス侵入を減少させる可能性がある。

【図2B】ヒトアンジオテンシン変換酵素-2（ACE2）およびSARS-Cov-2のスパイクタンパク質（S）をブロックおよび中和するために、SEQ ID NO: 1～SEQ ID NO: 10に記載されるような小ペプチドの配列の使用による、本開示において使用される１つのそのような機構を示す。

【図3】AHB1、AHB2、LCB1～LCB8にそれぞれ対応する本開示の小ペプチドのSEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10の配列である。

【図4】本開示の遺伝子改変細菌が、SARS-CoV-2ウイルスの結合および阻害活性に対して有効であると考えられる濃度で、SEQ ID NO: 1からSEQ ID NO: 10に記載の配列の小ペプチドを実際に放出することを実証するために計画された実験および本発明の実施形態の概略フローチャートである。

【図5】SEQ ID NO:1からSEQ ID NO:10に記載の配列の小ペプチドを発現および放出する本開示の遺伝子改変細菌が、このアッセイ法によってSARS-CoV-2中和を示す培養ヒトVero細胞の感染のダウンレギュレーションを実際に引き起こすことをin vitroで実証するために計画された実験および本発明の実施形態の概略フローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、本開示の一部を構成する添付図面図と関連する以下の発明の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本発明は、本明細書に記載および／または示された特定の装置、医薬品、システム、条件またはパラメーターに限定されるものではなく、本明細書で使用される用語は例示のためのものであり、特許請求される発明を限定することを意図するものではないことを理解されたい。また、添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、単数形の"a"、"an"、および"the"は複数形を含み、特定の数値への言及は、内容が明確に指示しない限り、少なくともその特定の値を含む。本明細書では、範囲を別の特定の値に対して「約」または「およそ」と表現する場合がある。このような範囲が表現される場合、それはもう一つの実施形態である。また、別段の指示がない限り、本明細書に記載された寸法および材料特性は、限定ではなく例示によるものであり、好適な実用性の実施形態例をよりよく理解するためのものであり、特定の用途によっては、記載された値以外の変形も本発明の範囲内となり得ることを理解されたい。

【0019】

用語 "comprising"、"having"、"including "および "containing "は、特に断りのない限り、オープンエンドな用語（すなわち、「～を含むが、～に限定されない」という意味であり、１つ以上の特徴または成分の存在を許可する）として解釈される。本明細書における様々な実施形態は、「から成る（comprising）」言語を用いて提示されているが、様々な状況下では、関連する実施形態は、「から成る（consisting of）」または「本質的に～から成る（consisting essentially of）」言語を用いて説明されることもあることを理解されたい。そのため、本明細書では、"a"（または"an"）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」という用語を互換的に使用されることがある。さらに、本明細書で使用される「および／または」は２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれについて、他方を伴うか伴わないかを問わず、具体的に開示されているものとみなされる。

【0020】

また、値の範囲を記述する場合、記述される特性は、その範囲内で見出される個々の値であり得ることも理解されるべきである。例えば、「約pH4から約pH6までのpH」とは、pH4、4.2、4.6、5.1、5.5など、およびその間の任意の値であり得るが、これらに限定されない。さらに、「約pH4から約pH6のpH」は、当該製剤のpHが保存中にpH4からpH6の範囲で2pH単位変化することを意味すると解釈されるべきではなく、むしろ溶液のpHについてその範囲で値を選ぶことができ、pHはそのpH程度でバッファーされたままであることを意味する。いくつかの実施形態では、「約」または「およそ」（"about"）という用語が使用される場合、それは、記載された数のプラスまたはマイナス10％を意味する。

【0021】

本明細書に記載された範囲のいずれにおいても、範囲の端点は範囲に含まれる。しかし、本明細書では、下限および/または上限が除外された同じ範囲も想定している。本発明の追加の特徴および変形は、図面および詳細な説明を含む本出願の全体から当業者には明らかであり、そのような特徴はすべて本発明の態様として意図されている。同様に、本明細書に記載された本発明の特徴は、特徴の組み合わせが本発明の態様または実施形態として上記で具体的に言及されているか否かにかかわらず、本発明の態様として意図される追加の実施形態に再組み合わせされてよい。また、本明細書では、本発明にとって重要であるとして説明されている限定のみをそのようにみなすべきである。本明細書では重要であるとして説明されていない限定を欠く本発明の変形は、本発明の態様として意図されている。

【0022】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0023】

単位、接頭辞、記号は、国際単位系（SI）で認められている形式で表記する。数値範囲は、その範囲を定義する数値を含む。特に断りのない限り、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向で左から右に書かれている。本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって有することができる本開示の様々な態様または側面を限定するものではない。本書全体は、統一された開示として捉えられることを意図しており、本明細書に記載された特徴のあらゆる組み合わせが想定されることを理解されたい。

【0024】

本明細書で引用したすべての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0025】

以下に、添付図面を参照して実施形態を詳細に説明する。本開示において不必要な曖昧さを避けるため、例えば、周知の特徴を記載しなかったり、実質的に同じ要素を重複して記載しなかったりすることがある。これは理解を容易にするためである。図面および以下の説明は、当業者が本開示を十分に理解できるようにするために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲に規定される本開示の範囲を限定することを意図するものでは決してない。

【0026】

本発明の根底にある一般的な概念は、以下の種からなるトランスジェニック細菌の作製と使用である：SARS-CoV-2に対する極端な結合と中和を示し、宿主のタンパク質やプロセスには結合せず、SARS-CoV-2の感染を防ぐために、従来の適応免疫学的手段によって達成されるよりも生物物理学的に高いオーダーでSARS-CoV-2を中和する、保護小ペプチド抗ウイルス剤の送達と投与のための、経口または鼻腔スプレーワクチンとしての医薬組成物における、Staphylococcus lugdunensis, and/or Streptococcus salivarius M18の経鼻および経口適用。さらに、本開示は、前記遺伝子組換え経口細菌と小ペプチド抗ウイルス剤である保護分子との組み合わせの使用による相乗効果を示す点で有利であり、これにより、変異体が変異してワクチンに対する耐性を発達させることが統計的に不可能になる。本開示において、本開示の好ましい細菌は、鼻腔および経口適用されるトランスジェニックStaphylococcus lugdunensis、および／またはStreptococcus salivarius M18であるが、これらのペプチドを送達し得る口および鼻のすべての潜在的常在細菌を含むこともできる。

【0027】

本発明の一実施形態に従って、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染を予防するための医薬組成物を開示する。当該医薬組成物は以下を含む：
a) 遺伝子組み換え細菌
b) 小ペプチドの配列
c) 医薬賦形剤
ここで、遺伝子改変された口腔内細菌は、COVID-19に対抗してSARS-CoV-2を中和する小ペプチドの配列を翻訳、産生、放出するように改変されている。ここで、トランスジェニック技術を使用して、遺伝子組換え口腔内細菌を改変し、遺伝子組換え口腔内細菌に、そのように付加された小ペプチドの配列から小ペプチドを産生するように転写される遺伝子が付加される。ここで、小ペプチドの配列は、SARS-CoV-2に対する極端な結合と中和を示しますが、宿主のタンパク質やプロセスには結合しない。ここで、医薬賦形剤は、医薬組成物の経口および／または経鼻投与を補助する。

【0028】

本発明の別の実施形態では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染を予防するための医薬組成物を開示し、ここで、遺伝子組換え細菌は、鼻腔および経口適用されるトランスジェニック細菌、S. lugdunensis、またはS. salivarius M18、またはそれらの組み合わせである。

【0029】

本発明の別の実施態様では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染を予防するための医薬組成物を開示し、ここで、医薬組成物は、SARS-COV-2の感染を予防するための経口ワクチンまたはSARS-COV-2の感染を予防するための点鼻スプレーワクチンである。

【0030】

本発明の別の実施形態では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染を予防するための医薬組成物を開示し、ここで、小ペプチドの配列は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、およびSEQ ID NO：10からなる群から選択される。

【0031】

本発明の別の実施態様では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染を予防するための医薬組成物を開示する。ここで、小ペプチドの１つ以上の配列は、半減期を改善するために余分なn-グリコシル化部位で修飾されている。

【0032】

本発明の別の実施態様では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染を予防するための医薬組成物を開示する。ここでは、小ペプチドの配列が、SARS-COV-2用の４つの自殺遺伝子を介して、遺伝子組換え細菌を死滅させ、あるいは除去することができる。

【0033】

本発明の別の実施態様では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染を予防するための医薬組成物を開示する。遺伝子組換え細菌には、SARS-CoV-2をCOVID-19に対抗して中和する小ペプチドの配列を翻訳し、産生し、放出するように改変できる、口や鼻に潜在するすべての常在細菌を含めることができる。

【0034】

本発明の一実施態様では、COVID-19に対する被験者のSAR-CoV-2感染を治療または予防する方法を開示する。この方法は、治療上有効な量の1つまたは複数の遺伝子組み換え細菌を被験者に投与することを含む。

【0035】

本発明の別の実施態様では、COVID-19に対する被験者のSAR-CoV-2感染を治療または予防する方法を開示する。ここで、治療上有効な量の１つ以上の遺伝子組み換え細菌を、SARS-COV-2の感染を予防する経口ワクチンまたはSARS-COV-2の感染を予防する鼻腔スプレーワクチンとして投与する。

【0036】

本発明の別の実施態様では、COVID-19に対する被験者のSAR-CoV-2感染を治療または予防する方法を開示する。ここで、ここで、対象は哺乳動物であり、好ましくは対象はヒトである。

【0037】

本発明の一実施態様では、被験体に治療有効量の1つ以上の遺伝子組換え細菌を投与することから成る、被験体におけるSAR-CoV-2ウイルスの侵入を阻止する方法を開示する。

【0038】

本発明の別の実施態様では、被験体におけるSAR-CoV-2ウイルスの侵入を阻止する方法を開示する。ここで、治療上有効な量の１つ以上の遺伝子組換え細菌は、SARS-COV-2の感染を予防するための経口ワクチンまたはSARS-COV-2の感染を予防するための鼻腔スプレーワクチンとして投与される。

【0039】

本発明の別の実施態様では、被験体におけるSAR-CoV-2ウイルスの侵入を阻止する方法を開示しており、ここで被験体は哺乳動物であり、好ましくは被験体はヒトである。

【0040】

本発明の1つの実施態様において、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の伝播を予防するための医薬組成物の使用を開示する。開示は、COVID-19に対する被験体におけるSAR-CoV-2感染の治療または予防のために、本明細書に開示されるように、被験体に治療有効量の１つ以上の遺伝子組換え細菌を投与することから成る。

【0041】

本発明の別の実施態様では、COVID-19に対する被験体におけるSAR-CoV-2感染を治療または予防するための、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の伝播を予防するための医薬組成物の使用を開示する。ここで、治療上有効な量の1つ以上の遺伝子組換え細菌は、SARS-COV-2の感染を予防するための経口ワクチンまたはSARS-COV-2の感染を予防するための鼻腔スプレーワクチンとして投与される。

【0042】

本発明の別の実施態様では、COVID-19に対する対象におけるSAR-CoV-2感染を治療または予防するための、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の伝播を予防するための医薬組成物の使用を開示し、ここで対象は哺乳動物であり、好ましくは対象はヒトである。

【0043】

本発明の一実施形態では、被験体に治療有効量の１つ以上の遺伝子組換え細菌を投与することから成る、被験体におけるSAR-CoV-2ウイルスの侵入を阻止するための、本明細書に開示される重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の伝播を予防するための医薬組成物の使用を開示する。

【0044】

本発明の別の実施態様では、対象におけるSAR-CoV-2ウイルスの侵入を阻止するために、本明細書に開示されるような重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の伝播を予防するための医薬組成物の使用を開示する。ここで、治療上有効な量の1つ以上の遺伝子組換え細菌は、SARS-COV-2の感染を予防するための経口ワクチンまたはSARS-COV-2の感染を予防するための鼻腔スプレーワクチンとして投与される。

【0045】

本発明の別の実施態様において、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の伝播を予防するための医薬組成物の使用を開示する。被験体におけるSAR-CoV-2ウイルスの侵入を阻止するために、本明細書で開示したように、被験体は哺乳動物であり、好ましくは被験体はヒトである。

【0046】

本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらの実施例は本発明の純粋な例示を意図したものであり、本発明を何ら限定するものとみなされるべきではない。

【0047】

（例１）
遺伝子組換え口腔細菌細胞からの治療有効濃度での小ペプチド発現のアッセイ法: 図４に示すように、図３に示したSEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10に記載の本開示の小ペプチドの設計されたタンパク質配列をコードする遺伝子を用いて実験を行い、前記小ペプチドを合成した。まず、Cao らの参照文献に示されるように、改変pET-29b（＋）大腸菌プラスミド発現ベクター（GenScript、N末端8×His-タグの後にTEV切断部位が続く）に、前述の小ペプチド用アミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列をクローニングする。このようにして得られた前記プラスミドをStaphylococcus lugdunensisおよび／またはStreptococcus salivarius M18に形質転換した後、それぞれペプチドAHB1、AHB2およびLCB1～LCB8をコードするSEQ ID NO: 1～SEQ ID NO: 10に記載の配列からなる群の小ペプチドのタンパク質発現を適宜誘導する。その後、遺伝子組換えStaphylococcus lugdunensisおよび/またはStreptococcus salivarius M18細胞を、4,000xgで10分間スピンすることにより採取し、DNAseおよびプロテアーゼ阻害剤タブレットを含む溶解バッファー（300mM NaCl、30mM Tris-HCL、pH8.0、細胞アッセイサンプルには0.25% CHAPSを含む）に再懸濁する。その後、QSONICA SONICATORSソニケーターで合計4分間（オン2分、オン10秒-オフ10秒）、振幅80％で細胞を溶解する。その後、可溶性画分を20,000g、30分間の遠心分離で清澄化する。その後、可溶性画分をImmobilized Metal Affinity Chromatography（Qiagen）で精製し、続いてFPLCサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 75 10/300 GL、GE Healthcare）で精製する。すべてのタンパク質サンプルは、純度95％以上のSDS-PAGEで特性評価される。タンパク質濃度は、NanoDrop分光光度計（Thermo Scientific）を用いて、予測される消光係数を用いて280nmの吸光度を測定し、決定する。

【0048】

（例２）
遺伝子組換えStaphylococcus lugdunensisおよび/またはStreptococcus salivarius M18の転写、翻訳、および放出された小ペプチドの配列が、SARS-CoV-2中和試験で測定される培養ヒトVero細胞の感染のダウンレギュレーションを引き起こすのに有効であることを示すin vitro実験：図５のフローチャートに示すように、適切なSARS-CoV-2株を入手し、Vero CCL81細胞（ATCC）でウイルスストックを作製し、Vero E6細胞でフォーカス形成アッセイにより滴定する。本開示の図３に示すSEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10に示すような小ペプチドの配列を発現、転写、翻訳、放出する遺伝子組み換えStaphylococcus lugdunensisおよび/またはStreptococcus salivarius M18の連続希釈液を、10^2フォーカス形成単位(FFU)のSARS-CoV-2と37℃で1時間インキュベートする。RBD結合剤-ウイルス複合体を96ウェルプレートのVero E6細胞単層に添加し、37℃で1時間インキュベートする。次に、2％FBS添加MEM中で、細胞を1％(w/v)メチルセルロースでオーバーレイする。その後30時間後にオーバーレイを取り除き、PBS中4％PFAで20分間室温で固定し、プレートを採取する。その後プレートを洗浄し、0.1%サポニンと0.1%BSAを添加したPBS中で、1μg/mLのCR3022(5)抗S抗体とHRP標識ヤギ抗ヒトIgGを順次インキュベートする。SARS-CoV-2に感染した細胞病巣は、TrueBlueペルオキシダーゼ基質（KPL）を用いて可視化され、ImmunoSpotマイクロアナライザー（Cellular Technologies）で定量される。データはPrismソフトウェア（GraphPad Prism 8.0）を用いて処理される。

【0049】

（例３）
以下を含む本開示のワクチンの医薬組成物の使用を実証するための実験: 本開示の図３に示すSEQ ID NO:1からSEQ ID NO:10に記載の小ペプチドの配列を発現し、転写し、翻訳し、放出する、遺伝子改変されたStaphylococcus lugdunensisおよび/またはStreptococcus salivarius M18細菌、本開示のワクチンによるSARS-CoV-2感染の減弱を実証するために、ハムスターおよびトランスジェニックマウスにおいて、鼻腔スプレーとして使用するための医薬賦形剤とともに実施される。同様に、本開示の経口および経鼻投与ワクチンによるSARS-CoV-2感染のそもそもの予防さえ実証するために、さらなる実験が行われる。本開示に基づく効果的な経口および/または経鼻ワクチンとして使用するために、経口および/または経鼻ワクチン、すなわち、遺伝子組換え細菌、およびそこから発現および放出される小ペプチドの配列において、組み合わせにおける２つの要素の濃度の最も適切かつ効果的な範囲を決定するために、追加の実験が実施される。

【0050】

本発明の実施において、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、様々な修正および変形が可能であることは、当業者には明らかであろう。本発明の他の実施形態は、明細書および本発明の実施を考慮すれば、当業者には明らかであろう。本明細書および実施例は例示的なものとしてのみ考慮されることを意図しており、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示される。

【0051】

本発明をその好ましい実施形態に関連して説明したが、以下に請求する本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の多くの可能な修正および変形を行うことができることを理解されたい。

【0052】

（関連出願への相互参照）
本出願は、2021年9月17日に出願された米国仮特許出願63/245,553の利益を主張するものである。本出願は2022年9月19日に出願されたが、2022年9月17日は週末であった。

【0053】

（配列表）
本出願には、ASCII形式で電子的に提出されたシーケンスリストが含まれており、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。2022年9月19日に作成された当該ASCIIコピーは、TPC70987 SEQ LIST_ST25.txtと命名され、サイズは6,689バイトである。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

2024531761000001.xml

【国際調査報告】