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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】Ｗｅｔ－ＡＭＤの遺伝子療法のためのＡＡＶ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240822BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240822BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240822BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240822BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240822BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240822BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240822BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/864 100Z
C12N7/01
C12N15/13
A61P27/02
A61K35/76
A61K48/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024517071
(86)(22)【出願日】2022-09-16
(85)【翻訳文提出日】2024-05-15
(86)【国際出願番号】 CN2022119238
(87)【国際公開番号】W WO2023041015
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/119223
(32)【優先日】2021-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524102051
【氏名又は名称】スカイライン、セラピューティクス、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＫＹＬＩＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】チンチャオ、ホウ
(72)【発明者】
【氏名】イェンチュン、シュー
(72)【発明者】
【氏名】レン、チオンチオン
(72)【発明者】
【氏名】ホーピン、リー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90Y
4B065AA93X
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC03
4B065BC07
4B065BC11
4B065CA23
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA58
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA331
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087MA58
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA33
(57)【要約】
本発明は、ＶＥＧＦに対するナノボディをコードするポリヌクレオチドおよびベクター、特に、ＡＡＶベクターを提供する。本発明はまた、眼にナノボディの安定発現を提供するために、例えば硝子体内注射によりベクターを投与することを含んでなるＷｅｔ－ＡＭＤの治療方法も提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロモーターに作動可能に連結された、配列番号４、５および７から選択される第１のヌクレオチド配列、ならびにリンカーを介して第１のヌクレオチド配列に連結された、配列番号１５、１６および１８から選択される第２のヌクレオチド配列を含んでなるコード配列を含んでなる発現カセットを含んでなるポリヌクレオチド構築物。
【請求項2】
前記リンカーが配列番号３７および３８から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項3】
前記プロモーターが配列番号２６～２７のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項4】
前記発現カセットがエンハンサーを含んでなる、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項5】
第１のエンハンサーが第１のプロモーターの上流にある、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項6】
第１のエンハンサーが、配列番号２５のヌクレオチド配列を含んでなるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーである、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項7】
前記発現カセットがコード配列の下流にポリアデニル化シグナル配列を含んでなる、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項8】
第１のポリアデニル化シグナル配列が配列番号３１および３２から選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項9】
前記発現カセットが、好ましくは第１のヌクレオチド配列の上流に、イントロンを含んでなる、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項10】
第１のイントロンが少なくとも２００ヌクレオチド長である、請求項９に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項11】
第１のイントロンが配列番号２８を含んでなる、請求項９に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項12】
前記構築物が組換えＡＡＶのゲノムを含んでなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項13】
構築物がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含んでなる、請求項１２に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項14】
５’および３’ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲ１３０および／またはＡＡＶ ＩＴＲ１０５である、請求項１３に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項15】
５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方がＡＡＶ ＩＴＲ１３０である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を含んでなるゲノムを含んでなる、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項17】
請求項１６に記載のＡＡＶを含んでなる医薬組成物。
【請求項18】
ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療する方法であって、請求項１６に記載のｒＡＡＶまたは請求項１７に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、方法。
【請求項19】
前記疾患がＷｅｔ－ＡＭＤである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ｒＡＡＶまたは医薬組成物が硝子体内注射により投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の構築物、または請求項１５に記載のｒＡＡＶを含んでなる宿主細胞。
【請求項22】
必要とする対象においてＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療するための薬剤の調製における、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物、請求項１６に記載のｒＡＡＶ、請求項１７に記載の医薬組成物、または請求項２１に記載の宿主細胞の使用。
【請求項23】
前記疾患がＷｅｔ－ＡＭＤである、請求項２２に記載の使用。
【請求項24】
前記薬剤が硝子体内注射により投与される、請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、遺伝子療法に関する。特に、本発明は、Ｗｅｔ－ＡＭＤの遺伝子療法のためのＡＡＶベクターを含む。
本発明は、遺伝子療法に関する。特に、本発明は、Ｗｅｔ－ＡＭＤの遺伝子療法のためのＡＡＶベクターを含む。
【背景技術】
【0002】
背景
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、中心視力の進行性の低下を特徴とする様々な疾患を表す臨床用語である。ＡＭＤは、多くの先進国で高齢者の視力低下の主な原因となっている。視力低下は、高密度の錐体光受容体で構成される眼球後方の領域である黄斑の進行性の変性によって起こる。
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、中心視力の進行性の低下を特徴とする様々な疾患を表す臨床用語である。ＡＭＤは、多くの先進国で高齢者の視力低下の主な原因となっている。視力低下は、高密度の錐体光受容体で構成される眼球後方の領域である黄斑の進行性の変性によって起こる。
【0003】
ＡＭＤには、乾性（非新生血管性）ＡＭＤおよび湿性ＡＭＤとして現れ得る。乾性ＡＭＤは、より一般的（症例の８５～９０％）で軽症のＡＭＤであり、黄斑部やその下方の小さく丸い白黄色の病変（ドルーゼン）を特徴とする。眼の老化に従って、光受容器とその周辺組織からの残屑がブルッフ膜の内部および上部に蓄積し（ドライ型ＡＭＤ）、これが炎症を引き起こし、炎症細胞が網膜に動員される。これらの細胞と網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、血管の成長を促すＶＥＧＦを含むサイトカインを産生する。この段階で、乾性ＡＭＤは湿性ＡＭＤへと進行する。漏出した血管から出る血液および体液は光受容器および視力に必要な神経を損傷し、治療しなければ永久的な視力喪失に至る可能性がある（湿性ＡＭＤ）。
【0004】
湿性ＡＭＤの治療のためには、ベバシズマブ（アバスチン）、コンベルセプト、およびアフリバーセプトなどのいくつかの市販の薬剤がある。しかしながら、これらの薬剤は定期的に投与する必要があり、コストがかかる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するヒト化ナノボディ（Ｎｂ２４）は、湿性ＡＭＤを治療するのに有効であることが報告されている（ＣＮ１１０４５２２９７Ｂ）。しかし、薬剤を繰り返し投与することなく、好ましくは、限定された用量、より好ましくは、単回用量の投与で、湿性ＡＭＤの治療に所望の効果を達成することができる方法がなお必要である。
【課題を解決するための手段】
【0006】
概要
第１の側面において、本発明は、第１のプロモーターに作動可能に連結された配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される第１のヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセットを含んでなるポリヌクレオチド構築物を提供する。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号４、５および７から選択される。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号５である。
第１の側面において、本発明は、第１のプロモーターに作動可能に連結された配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される第１のヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセットを含んでなるポリヌクレオチド構築物を提供する。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号４、５および７から選択される。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号５である。
【0007】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、リンカーを介して第１のヌクレオチド配列に連結された第２のヌクレオチド配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２から選択される。いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号１５、１６および１８から選択される。
【0008】
いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーターまたはＣＭＶ由来プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、配列番号２６または２７のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0009】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、第１のエンハンサーを含んでなる。好ましくは、第１のエンハンサーは、第１のプロモーターの上流にある。いくつかの実施形態では、第１のエンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーである。いくつかの実施形態では、第１のエンハンサーは、配列番号２５を含んでなる。
【0010】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、コード配列の下流に第１のポリアデニル化シグナル配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３１および３２から選択される。
【0011】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、第１のイントロンを含んでなる。好ましくは、第１のイントロンは、第１のヌクレオチド配列の上流にある。いくつかの実施形態では、第１のイントロンは、少なくとも２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のイントロンは、配列番号２８を含んでなる。
【0012】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、第２のプロモーターに作動可能に連結された配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される第３のヌクレオチド配列を含んでなる第２の発現カセットをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、配列番号４、５および７から選択される。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、配列番号５である。
【0013】
いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーターまたはＣＭＶ由来プロモーターである。いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは、配列番号２６または２７のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0014】
いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、第２のエンハンサーを、好ましくは、第２のプロモーターの上流に含んでなる。いくつかの実施形態では、第２のエンハンサーは、ＣＭＶ初期エンハンサーである。いくつかの実施形態では、第２のエンハンサーは、配列番号２５を含んでなる。
【0015】
いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、コード配列の下流に第２のポリアデニル化シグナル配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２のポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３１および３２から選択される。
【0016】
いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、第２のイントロンを、好ましくは、第３のヌクレオチド配列の上流に含んでなる。いくつかの実施形態では、第２のイントロンは、少なくとも２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のイントロンは、配列番号２８を含んでなる。
【0017】
いくつかの実施形態では、構築物は、組換えＡＡＶのゲノムを含んでなる。いくつかの実施形態では、構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の５’および３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含んでなる。いくつかの実施形態では、５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲ１３０および／またはＡＡＶ ＩＴＲ１０５である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方がＡＡＶ ＩＴＲ１３０である。
【0018】
第２の側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド構築物を含んでなるゲノムを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。本発明は、本発明のポリヌクレオチド構築物またはＡＡＶを含んでなる宿主細胞をさらに提供する。
【0019】
第３の側面において、本発明は、ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本発明のｒＡＡＶを含んでなる。
【0020】
第４の側面において、本発明は、それを必要とする対象に本発明のｒＡＡＶまたは医薬組成物を投与することを含んでなる、ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療する方法を提供する。本発明はさらに、ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療するための薬剤の調製における本発明のポリヌクレオチド構築物、ｒＡＡＶまたは医薬の使用を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は湿性ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ、医薬組成物または薬剤は、硝子体内注射により投与される。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図2B】図２Ｂは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図2C】図２Ｃは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図2D】図２Ｄは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図2E】図２Ｅは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図2F】図２Ｆは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図2G】図２Ｇは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図7】図７は、ウエスタンブロッティングによる１価Ｎｂ２４の発現の検出を示す。図７Ａはメンブレンの画像を示し、番号（１～１１）で示されたレーンは、それぞれ、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－ｎ（ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１）でトランスフェクトした細胞からの上清に相当する。レーン「Ｐ」は陽性対照であり、レーン「ｓｕｐ」は、非トランスフェクト細胞からの上清に相当する。図７Ｂは、「１」と定義するＮｂ２４－１１（配列番号１１を含んでなるプラスミド）の発現レベルに対して正規化したウエスタンブロッティングの定量値を示す。
【図8】図８は、ウエスタンブロッティングによる１価および２価Ｎｂ２４の発現の比較を示す。番号（１～８）で示されたレーンは、１価および２価Ｎｂ２４を発現するためのプラスミドでトランスフェクトした細胞からの上清に相当し、レーン「ｓｕｐ」は、非トランスフェクト細胞からの上清に相当する。・１で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ；・２または６で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｈＩｇＧ１Ｆｃ；・３で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｃｏ３．１Ｎｂ２４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ；・４で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｃｏ３．１Ｎｂ２４（ＩＬ２ シグナル）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ；・５で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ；・７で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－２；および・８で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４。
【図9】図９は、様々な戦略で構築したプラスミドでの発現の、ウエスタンブロッティングによる検出を示す。レーンは以下のようなプラスミドに相当する。・レーン１および７： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ；・レーン２： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ；・レーン３： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；・レーン４： ｐＣＢ１０８－５ＩＴＲ１３０－ＣＢＡ－ｐＣＩ－Ｎｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ；・レーン５： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ・レーン６： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ；・レーン８： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５；および・レーン９： 陰性対照。
【図10】図１０は、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ（レーン１）およびｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４（レーン２～５はそれぞれ構築物＃３６～３３）での発現の、ウエスタンブロッティングによる検出を示す。
【図11】図１１は、Ｎｂ２４の様々なバージョンの発現の検出を示す。「Ｆ１Ｆ３」で示されるレーンは、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖでトランスフェクトされた細胞に相当し；「Ｇ４Ｓ４」で示されるレーンは、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡでトランスフェクトされた細胞に相当し；「コドン３．１」で示されるレーンは、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇでトランスフェクトされた細胞に相当し；「ＣＢＡ－ＣＭＶ」で示されるレーンは、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡでトランスフェクトされた細胞に相当し；また「Ｎｂ２４－５」で示されるレーンは、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡでトランスフェクトされた細胞に相当する。
【図12】図１２は、ＶＥＧＦに対する抗体の結合を示す。図１２Ａで、「ＨｕＮｂ２４－５－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡにより発現された産物を表し、「Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖにより発現された産物を表し、ＯＤ５２５は、プレートのバックグラウンドを表す。図Ｂで、「ＣＭＶ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡにより発現された産物を表し；「Ｇ４Ｓ４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡにより発現された産物を表し；「Ｎｂ２４－５－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡにより発現された産物を表し；「Ｆ１Ｆ３－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖにより発現された産物を表す。図１２Ｃで、プロット１～４は、それぞれｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４）により発現された生成物を表し；プロット５は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡにより発現された産物を表し；またプロット６は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－４－ＨＡにより発現された産物を表す。図１２Ｄで、「Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖにより発現された産物を表し；「Ｎｂ２４－５」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡにより発現された産物を表し；「Ｎｂ２４－４－Ｇ４Ｓ４－Ｎｂ２４－７」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡにより発現された産物を表し；「Ｎｂ２４－７－Ｇ４Ｓ４－Ｎｂ２４－７」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡにより発現された産物を表し；また「コドン３．１Ｎｂ２４－Ｇ４Ｓ４－コドン３．１Ｎｂ２４」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉにより発現された産物を表す。
【図17】図１７は、湿性ＡＭＤモデル（ダッチベルテッドウサギ）に投与したＡＡＶの効果を示す。蛍光の漏出がある領域は、網膜新血管新生の重症度を示す。図１７Ｄの左のパネルの動物は、７日目から下痢が見られていたため９日目に検査し、１１日目に死亡した。剖検では、他の病態生理学的変化は見られなかった。
【発明を実施するための形態】
【0022】
発明の詳細な説明
１．定義
特に断りのない限り、本明細書で使用される総ての用語は、当業者に意味するものと同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内にある微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来技術を用いる。
１．定義
特に断りのない限り、本明細書で使用される総ての用語は、当業者に意味するものと同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内にある微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来技術を用いる。
【0023】
本明細書で使用する場合、「Ｎｂ２４」は、Ｎｏｖａｍａｂにより同定され、配列番号２３のアミノ酸配列、およびそのコード配列を有するＶＥＧＦに対するヒト化ナノボディを指す。「Ｎｂ２４－ｎ」は、当該コード配列のコドン最適化型、またはその発現産物を指す。
【0024】
本明細書で使用する場合、「ナノボディ」という用語は、「シングルドメイン抗体」とも呼ばれ、最初にアルパカの末梢血で発見された、天然に軽鎖を欠く抗体である。ナノボディは、１つのみの重鎖可変領域（ＶＨＨ）と従来の２つのＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。個々にクローニングされ、発現されたＶＨＨは構造的に安定であり、元の重鎖抗体に匹敵する抗原結合活性を有し、標的抗原と結合することが知られる最小単位である。本発明において、「ナノボディ」という用語は、そのＶＨＨを包含する。ＶＨＨ結晶は２．５ｎｍであり、長さは４ｎｍであり、分子量はわずか１５ＫＤａである。
【0025】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科(Parvoviridae)に属す。ＡＡＶは、単純な一本鎖ＤＮＡウイルスであり、複製にはヘルパーウイルス（アデノウイルスなど）を必要とする。野生型ＡＡＶのゲノムは、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列の間にｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を含んでなるおよそ４．７キロベース（ｋｂ）を含み、およそ１４５ヌクレオチドの長さであり、ＤＮＡ複製の開始時にプライマーとして機能するヘアピン構造へと折りたたまれるパリンドローム配列が挿入されている。ｃａｐ遺伝子は、ウイルスキャプシドタンパク質をコードし、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶの複製および組込みに関与する。ＡＡＶは、様々な細胞に感染し、ウイルスＤＮＡは、ｒｅｐ産物の存在下でヒト第１９染色体に組み込まれ得る。
【0026】
本明細書で使用する場合、「逆方向末端反復配列」または「ＩＴＲ」という用語は、本明細書で使用する場合、それらの対称性のためにそう命名されたＡＡＶウイルスシスエレメントを指す。これらのエレメントは、ＡＡＶゲノムの効率的な増幅に不可欠である。本発明において、「ＩＴＲ」という用語は、既知の天然ＡＡＶ血清型のＩＴＲ、異なる血清型に由来するＩＴＲエレメントの融合によって形成されたキメラＩＴＲ、およびその機能的変異体を指す。
【0027】
組換えＡＡＶ粒子の生産には、外因性ポリヌクレオチドを発現するためのポリヌクレオチド構築物を含んでなるプラスミド、ＲＥＰおよび／またはＣＡＰタンパク質をコードするパッケージングプラスミド、ならびにヘルパープラスミドの、３つのプラスミドを含み得る。
【0028】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド構築物」という用語は、ように改変された一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド構築物が本発明のコード配列を発現するのに必要とされる制御配列を含む場合、ポリヌクレオチド構築物は、発現カセット」を含んでなる。
【0029】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は通常、一般に、核酸分子（例えば、１００塩基、最大３０キロベース長）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡフラグメントまたは分子の配列と相補的（アンチセンス）または同一（センス）いずれかの配列を指す。この用語はまた、転写されるまたは転写されないＤＮＡまたはＲＮＡ分子も指し得る。
【0030】
「外因性ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する場合、それが置かれている宿主に起源しないヌクレオチド配列を指す。外因性ポリヌクレオチドは、宿主のＤＮＡと同一であっても異種であってもよい。例えば、ベクターに挿入された目的配列である。このような外因性ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む様々な供給源に由来し得る。外因性ポリヌクレオチドはまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を包含する。
【0031】
本明細書で使用する場合、「発現カセット」という用語は、ポリヌクレオチドの発現のために提供された付加的ヌクレオチド、例えば、制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドセグメントを指す。
【0032】
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含む、ポリペプチドの生産に関与するいずれのステップも含む。
【0033】
「制御配列」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要または有益な総てのエレメントを含む。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して天然であっても外来であってもよく、または互いに天然であっても外来であってもよい。このような制御配列としては、限定するものではないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサー、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれる。少なくとも制御配列は、プロモーターと転写および翻訳の終結のためのシグナルを含む。
【0034】
例えば、制御配列は、好適なプロモーター配列、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であってよく、例えば、大腸菌(E. coli)のｌａｃオペロンがある。プロモーターはまた、変異型プロモーター、末端切断型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含み、宿主細胞に対してホモまたはヘテロな細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【0035】
本明細書で使用する場合、本明細書において「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適当な位置に配置され、それにより制御配列はポリペプチドコード配列の発現を指令する配置を指す。
【0036】
Ｎｂ２４をコードするポリヌクレオチドには、ポリペプチドの発現を改善するために様々な操作を施すことができる。ベクターに挿入する前に、コドンの最適化など、発現ベクターまたは宿主に応じたポリヌクレオチドの操作が望ましい、または必要である。組換えＤＮＡ法によりポリヌクレオチド配列を改変するための技術は、当技術分野で周知である。
【0037】
「組換え」という用語は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ組換え（クローニング）法を用いて作出された、天然または野生型の核酸、ベクター、ポリペプチド、またはタンパク質とは異なる核酸、ベクター、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。
【0038】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸のポリマーを指し、全長タンパク質およびそれらのフラグメントを指す。
【0039】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、ｒＡＡＶベクターのレシピエントとして使用できる、または使用された、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を指す。この用語には、形質導入された元の細胞の後代が含まれる。よって、「宿主細胞」は、本明細書で使用する場合、一般に、外因性ＤＮＡ配列で形質導入された細胞を指す。単一の親細胞の後代は、自然の、偶発的な、または意図的な突然変異のために、元の親と、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補性において完全に同一である必要はない。
【0040】
「薬学上許容可能な」という用語は、本明細書で使用する場合、生理学上忍容性がある、かつ、ヒトに投与した際に、毒性またはアレルギーもしくは類似の不快な反応、例えば、胃の不快感、めまいなどを一般に生じない分子実体および組成物を指す。
【0041】
「対象」という用語は、本明細書で使用する場合、限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーおよびその他の無尾猿およびサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの農用動物；イヌおよびネコなどの家庭哺乳動物；マウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯類を含む実験室動物が含まれる。この用語は、特定の齢または性を表さない。よって、雄であれ雌であれ、成体および新生対象、ならびに胎児を包含することが意図される。
【0042】
２．ＶＥＧＦに対するヒト化ナノボディを発現するための構築物
遺伝子療法は、疾患の発症の基礎にある欠陥遺伝子を修正すること、および特定の疾患を治療するのに有用な外因性遺伝子の産物を発現させるために対象の目的の細胞に外因性遺伝子を導入することを目的とする。この目的のための一般的アプローチは、核への機能的遺伝子の送達を含む。この遺伝子は、その後、目的細胞のゲノムに挿入され得るか、またはエピソームにより維持され得る。対象の標的細胞への機能的遺伝子の送達は、ウイルスベクターの使用を含む多くの方法によって行うことができる。利用可能な多くのウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスなど）のうち、ＡＡＶは、遺伝子療法における万能ベクターとして普及している。
遺伝子療法は、疾患の発症の基礎にある欠陥遺伝子を修正すること、および特定の疾患を治療するのに有用な外因性遺伝子の産物を発現させるために対象の目的の細胞に外因性遺伝子を導入することを目的とする。この目的のための一般的アプローチは、核への機能的遺伝子の送達を含む。この遺伝子は、その後、目的細胞のゲノムに挿入され得るか、またはエピソームにより維持され得る。対象の標的細胞への機能的遺伝子の送達は、ウイルスベクターの使用を含む多くの方法によって行うことができる。利用可能な多くのウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスなど）のうち、ＡＡＶは、遺伝子療法における万能ベクターとして普及している。
【0043】
ＡＡＶに由来するベクターは、（ｉ）筋繊維およびニューロンを含む多様な非分裂および分裂細胞型に感染（形質導入）できる、（ｉｉ）ウイルス構造遺伝子を欠いているため、ウイルス感染に対する自然の宿主細胞応答、例えばインターフェロンを介した応答を排除する、（ｉｉｉ）野生型ウイルスはヒトの病理に関連したことがない、（ｉｖ）宿主細胞ゲノムに組み込むことができる野生型ＡＡＶとは対照的に、宿主細胞ゲノムに組み込むことができる、（ｉｉｉ）野生型ウイルスはヒトにおけるいかなる病理学的症状とも関連したことがない、（ｉｖ）宿主細胞ゲノムに組み込むことができる野生型ＡＡＶとは対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは一般にエピソームとして存続するため、挿入突然変異誘発または癌遺伝子の活性化のリスクが制限される、および（ｖ）他のベクター系とは対照的に、ＡＡＶベクターは重大な免疫反応を惹起しない（ｉｉ参照）ため、治療用導入遺伝子の長期発現が可能である（遺伝子産物が拒絶されない限り）ことから、遺伝物質の送達のために特に有利である。ＡＡＶベクターはまた、高力価で生産することもでき、動脈内、静脈内または腹腔内注射により、単回注射で齧歯類の重要な筋肉領域への遺伝子導入が可能であることが報告されている。
【0044】
Ｎｂ２４は、ＶＥＧＦＲに対するＶＥＧＦの結合を遮断し、それによりＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療するのに有効であることが報告されている。標的細胞において高レベルでＮｂ２４を長期発現させるためのポリヌクレオチド構築物を提供することが望まれる。
【0045】
よって、本発明は、対象の目的細胞においてＮｂ２４を発現させるためのポリヌクレオチド構築物、好ましくは、ＡＡＶベクターを提供することを意図する。
【0046】
本発明は、第１のプロモーターに作動可能に連結された、シグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびＮｂ２４を含んでなる第１の発現カセットを含んでなり、第１のヌクレオチド配列は宿主、好ましくは、ヒトでの発現のためにコドンが最適化されている、ポリヌクレオチド構築物を提供する。
【0047】
いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号４、５および７から選択される。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号５である。
【0048】
本発明者らは、意外にも、２価Ｎｂ２４をコードする構築物が１価のものよりも高い発現を達成したことを見出した。従って、本発明はさらに、２価Ｎｂ２４、すなわち、単一のポリペプチドとして２コピーのＮｂ２４を発現するためのポリヌクレオチド構築物を提供する。
【0049】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、リンカーを介して第１のヌクレオチド配列に、好ましくは、第１のヌクレオチド配列の３’末端に連結された第２のヌクレオチド配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２から選択される。いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号１５、１６および１８から選択される。
【0050】
いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号５であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１５である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号５であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１６である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号５であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１８である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号４であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１５である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号４であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１６である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号４であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１８である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号７であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１５である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号７であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１６である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号７であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１８である。
【0051】
本発明者らは、意外にも、同一のコード配列を有する２価のＮｂ２４をコードする構築物は、ウイルスの品質（ゲノムの完全性）が低いことを見出した。従って、いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド６６～４４１にわたる第１のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列と同一ではない。
【0052】
ペプチドリンカーは一般に、約４～２０またはそれを超えるアミノ酸の短いペプチド，例えば、Ｓｅｒ残基とＧｌｙ残基の組合せであり得る。本発明の構築物では、リンカーは、このようなペプチドリンカーをコードするヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、ペプチドリンカー（Ｇ４Ｓ）ｎ、ｎ＝１～４をコードする。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３６、３７、３８および３９、またはその縮重変異体から選択される。
【0053】
構築物は一般に、発現のために哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）にトランスフェクトされる。このような構築物は多くの場合、高レベル発現のためのプロモーター－エンハンサー、例えば、ＳＶ４０プロモーター－エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配列を含む。これらのプロモーター－エンハンサーは、多くの細胞種で活性がある。組織および細胞型プロモーターおよびエンハンサー領域も、発現に使用可能である。例示的プロモーター／エンハンサー領域としては、限定するものではないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α１アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、およびゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子コントロールなどの遺伝子からのものが含まれる。
【0054】
いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーターまたはＣＭＶ由来プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、配列番号２６もしくは２７のヌクレオチド配列、または配列番号２６もしくは２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0055】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、第１のエンハンサーを含んでなる。好ましくは、第１のエンハンサーは、第１のプロモーターの上流にある。いくつかの実施形態では、第１のエンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーである。いくつかの実施形態では、第１のエンハンサーは、配列番号２５、または配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0056】
また、真核細胞での発現を増加させるために構築物に真核生物由来のイントロンを含めることも望ましい。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、第１のイントロンを含んでなる。好ましくは、第１のイントロンは、第１のヌクレオチド配列の上流にある。
【0057】
本発明者は、意外にも、長いイントロンを組み込んだ方が、発現が増加することを見出した。いくつかの実施形態では、第１のイントロンは、少なくとも２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のイントロンは、配列番号２８、または配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0058】
構築物はさらに、転写産物のプロセシングのためのポリアデニル化シグナル配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、コード配列の下流に第１のポリアデニル化シグナル配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットのポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３１および３２、または配列番号３１もしくは３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列から選択される。
【0059】
本発明者はさらに、デュアルカセット構築物はモノカセット構築物よりも高い発現を達成したことに着目した。従って、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物はさらに、第２のプロモーターに作動可能に連結された、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される第３のヌクレオチド配列を含んでなる第２の発現カセットを含んでなる。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、配列番号４、５および７から選択される。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は配列番号５である。
【0060】
いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーターまたはＣＭＶ由来プロモーターである。いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは、配列番号２６もしくは２７のヌクレオチド配列、または配列番号２６もしくは２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0061】
いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、第２のエンハンサーを、好ましくは、第２のプロモーターの上流に含んでなる。いくつかの実施形態では、第２のエンハンサーは、ＣＭＶ初期エンハンサーである。いくつかの実施形態では、第２のエンハンサーは、配列番号２５、または配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0062】
いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、コード配列の下流に第２のポリアデニル化シグナル配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２のポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３１および３２、または配列番号３１もしくは３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列から選択される。
【0063】
いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、第２のイントロンを、好ましくは、第３のヌクレオチド配列の上流に含んでなる。いくつかの実施形態では、第２のイントロンは、少なくとも２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のイントロンは、配列番号２８、または配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0064】
いくつかの実施形態では、構築物は、５’から３’へ順に、エンハンサー、プロモーター、イントロン、Ｎｂ２４をコードするヌクレオチド配列およびポリアデニル化シグナル配列を含んでなる単一の発現カセットを含んでなる。
【0065】
特定の実施形態において、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号９、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３１を含んでなる。
【0066】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号９、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３１を含んでなる。
【0067】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号９、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３２を含んでなる。
【0068】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号９、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３２を含んでなる。
【0069】
いくつかの実施形態では、構築物は、５’から３’へ順に、エンハンサー、プロモーター、イントロン、第１のヌクレオチド配列とリンカーと第２のヌクレオチド配列を含んでなるコード配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含んでなる単一の発現カセットを含んでなる。
【0070】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。
【0071】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。
【0072】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。
【0073】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。
【0074】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。
【0075】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。
【0076】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。
【0077】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。
【0078】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。
【0079】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。
【0080】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。
【0081】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。
【0082】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。
【0083】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。
【0084】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。
【0085】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３１を含んでなる。
【0086】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３１を含んでなる。
【0087】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３１を含んでなる。
【0088】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。
【0089】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。
【0090】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。
【0091】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。
【0092】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。
【0093】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。
【0094】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。
【0095】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。
【0096】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。
【0097】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。
【0098】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。
【0099】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。
【0100】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。
【0101】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。
【0102】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。
【0103】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。
【0104】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。
【0105】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３６、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３９、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。
【0106】
いくつかの実施形態では、構築物は、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットを含んでなる。
【0107】
特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号９、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３１を含んでなる。
【0108】
特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号９、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３１を含んでなる。
【0109】
特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号９、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３２を含んでなる。
【0110】
特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号９、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３２を含んでなる。
【0111】
特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号９、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３１を含んでなる。
【0112】
特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号６、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号８、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号９、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３１を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３１を含んでなる。
【0113】
特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号９、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３２を含んでなる。
【0114】
特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号７、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号９、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１０、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、第２の発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１１、配列番号３２を含んでなる。
【0115】
いくつかの実施形態では、構築物は、組換えＡＡＶのゲノムを含んでなる。いくつかの実施形態では、構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の５’および３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含んでなる。いくつかの実施形態では、５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲ１３０および／またはＡＡＶ ＩＴＲ１０５である。いくつかの実施形態では、５’ ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方がＡＡＶ ＩＴＲ１３０である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲ１０５であり、３’ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲ１３０である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ１３０は配列番号３３である。いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲ１３０は配列番号３４である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ１０５は配列番号３５である。
【0116】
３．組換えＡＡＶｓおよび医薬組成物
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド構築物を含んでなるゲノムを含んでなる組換えＡＡＶを提供する。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド構築物を含んでなるゲノムを含んでなる組換えＡＡＶを提供する。
【0117】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、第１のプロモーターに作動可能に連結された、シグナルペプチドおよびＮｂ２４をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセットを含んでなり、第１のヌクレオチド配列は、宿主、好ましくは、ヒトでの発現のためにコドンが最適化されている。
【0118】
いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号４、５および７から選択される。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号５である。
【0119】
本発明者らは、意外にも、２価Ｎｂ２４をコードする構築物が１価のものよりも高い発現を達成したことを見出した。従って、本発明はさらに、２価Ｎｂ２４、すなわち、単一のポリペプチドとして２コピーのＮｂ２４を発現するためのポリヌクレオチド構築物を提供する。
【0120】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、リンカーを介して第１のヌクレオチド配列に、好ましくは、第１のヌクレオチド配列の３’末端に連結された第２のヌクレオチド配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２から選択される。いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号１５、１６および１８から選択される。
【0121】
本発明者らは、意外にも、同一のコード配列を有する２価のＮｂ２４をコードする構築物は、ウイルスの品質（ゲノムの完全性）が低いことを見出した。従って、いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド６６～４４１にわたる第１のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列と同一ではない。
【0122】
いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号５であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１５である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号５であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１８である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号４であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１６である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号４であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１８である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号７であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１５である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は配列番号７であり、第２のヌクレオチド配列は配列番号１６である。
【0123】
ペプチドリンカーは一般に、約４～２０またはそれを超えるアミノ酸の短いペプチド，例えば、Ｓｅｒ残基とＧｌｙ残基の組合せであり得る。本発明の構築物では、リンカーは、このようなペプチドリンカーをコードするヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、ペプチドリンカー（Ｇ４Ｓ）ｎ、ｎ＝１～４をコードする。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３６、３７、３８および３９、またはその縮重変異体から選択される。
【0124】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、５’から３’へ順に、
配列番号５、配列番号３７、および配列番号１５、
配列番号５、配列番号３７、および配列番号１８、
配列番号４、配列番号３７、および配列番号１６、
配列番号４、配列番号３７、および配列番号１８、
配列番号７、配列番号３７、および配列番号１５、
配列番号７、配列番号３７、および配列番号１６、
配列番号５、配列番号３８、および配列番号１５、
配列番号５、配列番号３８、および配列番号１８、
配列番号４、配列番号３８、および配列番号１６、
配列番号４、配列番号３８、および配列番号１８、
配列番号７、配列番号３８、および配列番号１５、または
配列番号７、配列番号３８、および配列番号１６
を含んでなる２価Ｎｂ２４をコードする配列を含んでなる。
配列番号５、配列番号３７、および配列番号１５、
配列番号５、配列番号３７、および配列番号１８、
配列番号４、配列番号３７、および配列番号１６、
配列番号４、配列番号３７、および配列番号１８、
配列番号７、配列番号３７、および配列番号１５、
配列番号７、配列番号３７、および配列番号１６、
配列番号５、配列番号３８、および配列番号１５、
配列番号５、配列番号３８、および配列番号１８、
配列番号４、配列番号３８、および配列番号１６、
配列番号４、配列番号３８、および配列番号１８、
配列番号７、配列番号３８、および配列番号１５、または
配列番号７、配列番号３８、および配列番号１６
を含んでなる２価Ｎｂ２４をコードする配列を含んでなる。
【0125】
いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーターまたはＣＭＶ由来プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、配列番号２６もしくは２７のヌクレオチド配列、または配列番号２６もしくは２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0126】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、第１のエンハンサーを含んでなる。好ましくは、第１のエンハンサーは、第１のプロモーターの上流にある。いくつかの実施形態では、第１のエンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーである。いくつかの実施形態では、第１のエンハンサーは、配列番号２５、または配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0127】
また、真核細胞での発現を増加させるために構築物に真核生物由来のイントロンを含めることも望ましい。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、第１のイントロンを含んでなる。好ましくは、第１のイントロンは、第１のヌクレオチド配列の上流にある。
【0128】
本発明者は、意外にも、長いイントロンを組み込んだ方が、発現が増加することを見出した。いくつかの実施形態では、第１のイントロンは、少なくとも２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のイントロンは、配列番号２８、または配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなる。
【0129】
構築物はさらに、転写産物のプロセシングのためのポリアデニル化シグナル配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、コード配列の下流に第１のポリアデニル化シグナル配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットのポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３１および３２、または配列番号３１もしくは３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列から選択される。
【0130】
いくつかの実施形態では、構築物は、５’から３’へ順に、エンハンサー、プロモーター、イントロン、第１のヌクレオチド配列とリンカーと第２のヌクレオチド配列を含んでなるコード配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含んでなる単一の発現カセット含んでなる。
【0131】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。
【0132】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号５、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。
【0133】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。
【0134】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３７、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４、配列番号３８、配列番号１８、配列番号３２を含んでなる。
【0135】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１５、配列番号３２を含んでなる。
【0136】
特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３７、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。特定の実施形態では、発現カセットは、５’から３’へ順に、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号３８、配列番号１６、配列番号３２を含んでなる。
【0137】
いくつかの実施形態では、構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の５’および３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含んでなる。いくつかの実施形態では、５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲ１３０および／またはＡＡＶ ＩＴＲ１０５である。いくつかの実施形態では、５’ ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方がＡＡＶ ＩＴＲ１３０である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲ１０５であり、３’ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲ１３０である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ１３０は配列番号３３である。いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲ１３０は配列番号３４である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ１０５は配列番号３５である。
【0138】
本発明はまた、ｒＡＡＶを作製するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶのゲノムを含んでなる導入遺伝子プラスミド、ＲＥＰおよび／またはＣＡＰタンパク質をコードするパッケージングプラスミド、およびヘルパープラスミドを含む系、例えば、ｒＡＡＶのゲノムを含んでなる導入遺伝子プラスミド、ＲＥＰおよび／またはＣＡＰタンパク質をコードするパッケージングプラスミド、およびヘルパープラスミドを含んでなる哺乳動物細胞などの宿主細胞により作製される。従って、本発明はまた、本発明のｒＡＡＶのゲノムを含んでなるプラスミドなどのベクターも提供する。
【0139】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、Crosson SM et al. (Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018; 10:1-7)に記載されているように封入することができる。
【0140】
いくつかの実施形態では、本発明のｒＡＡＶは、ヒト血清型１ ＡＡＶ（ｈＡＡＶ１）、ｈＡＡＶ２、ｈＡＡＶ３、ｈＡＡＶ４、ｈＡＡＶ５、ｈＡＡＶ６、ｈＡＡＶ７、ｈＡＡＶ８、ｈＡＡＶ９、ｈＡＡＶ１０、およびｈＡＡＶ１１から選択することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｈＡＡＶ２である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｈＡＡＶ９である。
【0141】
本発明のＡＡＶを含有する医薬組成物は、任意の従来の方法で、選択された量のｒＡＡＶを１以上の薬学上許容可能な担体または賦形剤と混合することにより処方することができる。
【0142】
担体または賦形剤の選択は、投与する専門家の技量の範囲内であり、多くのパラメーターに依存し得る。これらには、例えば、投与様式（すなわち、全身投与、経口投与、局所投与、局部投与、またはその他の任意の様式）、および治療される疾患が含まれる。本明細書で提供されるｒＡＡＶの投与に適した医薬担体またはビヒクルには、特定の投与様式に適していることが当業者に知られているそのようないずれの担体も含まれる。いくつかの実施形態では、治療される疾患は湿性ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、硝子体内注射用に処方される。
【0143】
４．ＶＥＧＦ関連疾患の治療
本発明は、本発明のｒＡＡＶまたは医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は湿性ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ、または医薬組成物は、硝子体内注射により投与される。
本発明は、本発明のｒＡＡＶまたは医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は湿性ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ、または医薬組成物は、硝子体内注射により投与される。
【0144】
本発明はさらに、ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療するための薬剤の調製における本発明のポリヌクレオチド構築物、ｒＡＡＶまたは医薬組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は湿性ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、薬剤は、硝子体内注射により投与される。
【0145】
本発明はさらに、ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療する使用のための本発明のｒＡＡＶまたは医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は湿性ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、薬剤は、硝子体内注射により投与される。
【0146】
実施形態
第１項 第１のプロモーターに作動可能に連結された、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される、好しくは、配列番号４、５および７から選択される第１のヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセットを含んでなるポリヌクレオチド構築物。
第１項 第１のプロモーターに作動可能に連結された、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される、好しくは、配列番号４、５および７から選択される第１のヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセットを含んでなるポリヌクレオチド構築物。
【0147】
第２項 第１の発現カセットが好ましくはリンカーを介して第１のヌクレオチド配列に連結された第２のヌクレオチド配列を含んでなり、第１のヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド６６～４４１にわたって、第２のヌクレオチド配列と同一でない、第１項のポリヌクレオチド構築物。
【0148】
第３項 第２のヌクレオチド配列が配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２から選択される、好ましくは、配列番号１５、１６および１８から選択される、第１項または第２項のポリヌクレオチド構築物。
【0149】
第４項 リンカーが配列番号３６、３７、３８および３９から選択される、好ましくは、配列番号３７および３８から選択されるヌクレオチド配列である、第２項または第３項のポリヌクレオチド構築物。
【0150】
第５項 ポリヌクレオチド構築物が５’から３’へ順に
配列番号５、配列番号３７、および配列番号１５、
配列番号５、配列番号３７、および配列番号１８、
配列番号４、配列番号３７、および配列番号１６、
配列番号４、配列番号３７、および配列番号１８、
配列番号７、配列番号３７、および配列番号１５、
配列番号７、配列番号３７、および配列番号１６、
配列番号５、配列番号３８、および配列番号１５、
配列番号５、配列番号３８、および配列番号１８、
配列番号４、配列番号３８、および配列番号１６、
配列番号４、配列番号３８、および配列番号１８、
配列番号７、配列番号３８、および配列番号１５、または
配列番号７、配列番号３８、および配列番号１６
を含んでなる２価Ｎｂ２４、
をコードする配列を含んでなる、第２項～第４項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
配列番号５、配列番号３７、および配列番号１５、
配列番号５、配列番号３７、および配列番号１８、
配列番号４、配列番号３７、および配列番号１６、
配列番号４、配列番号３７、および配列番号１８、
配列番号７、配列番号３７、および配列番号１５、
配列番号７、配列番号３７、および配列番号１６、
配列番号５、配列番号３８、および配列番号１５、
配列番号５、配列番号３８、および配列番号１８、
配列番号４、配列番号３８、および配列番号１６、
配列番号４、配列番号３８、および配列番号１８、
配列番号７、配列番号３８、および配列番号１５、または
配列番号７、配列番号３８、および配列番号１６
を含んでなる２価Ｎｂ２４、
をコードする配列を含んでなる、第２項～第４項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
【0151】
第６項 第１のプロモーターがニワトリβ－アクチンプロモーターまたはＣＭＶ由来プロモーターである、第１項～第５項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
【0152】
第７項 第１のプロモーターが配列番号２６または２７のヌクレオチド配列を含んでなる、第６項のポリヌクレオチド構築物。
【0153】
第８項 第１の発現カセットが第１のエンハンサーを含んでなる、第１項～第７項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
【0154】
第９項 第１のエンハンサーが第１のプロモーターの上流にある、第８項のポリヌクレオチド構築物。
【0155】
第１０項 第１のエンハンサーがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーである、第８項のポリヌクレオチド構築物。
【0156】
第１１項 第１のエンハンサーが配列番号２５を含んでなる、第７項～第１０項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
【0157】
第１２項 第１の発現カセットがコード配列の下流に第１のポリアデニル化シグナル配列を含んでなる、第１項～第１１項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
【0158】
第１３項 第１のポリアデニル化シグナル配列が配列番号３１および３２から選択される、第１２項のポリヌクレオチド構築物。
【0159】
第１４項 第１の発現カセットが第１のイントロンを、好ましくは、第１のヌクレオチド配列の上流に含んでなる、第１項～第１３項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
【0160】
第１５項 第１のイントロンが少なくとも２００ヌクレオチド長である、第１４項のポリヌクレオチド構築物。
【0161】
第１６項 第１のイントロンが配列番号２８を含んでなる、第１４項のポリヌクレオチド構築物。
【0162】
第１７項 第２のプロモーターに作動可能に連結された配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される第３のヌクレオチド配列を含んでなる第２の発現カセットを含んでなる、第１項または第２項のポリヌクレオチド構築物。
【0163】
第１８項 第３のヌクレオチド配列が配列番号４、５および７から選択される、第１７項のポリヌクレオチド構築物。
【0164】
第１９項 第２のプロモーターがニワトリβ－アクチンプロモーターまたはＣＭＶ由来プロモーターである、第１７項または第１８項のポリヌクレオチド構築物。
【0165】
第２０項 第２のプロモーターが配列番号２６または２７を含んでなる、第１９項のポリヌクレオチド構築物。
【0166】
第２１項 第２の発現カセットが第２のエンハンサーを含んでなる、第１７項～第２０項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
【0167】
第２２項 第２のエンハンサーが第２のプロモーターの上流にある、第２１項のポリヌクレオチド構築物。
【0168】
第２３項 第２のエンハンサーがＣＭＶ初期エンハンサーである、第２１項のポリヌクレオチド構築物。
【0169】
第２４項 第２のエンハンサーが配列番号２５を含んでなる、第２３項のポリヌクレオチド構築物。
【0170】
第２５項 第２の発現カセットがコード配列の下流に第２のポリアデニル化シグナル配列を含んでなる、第１７項～第２４項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
【0171】
第２６項 第２のポリアデニル化シグナル配列が配列番号３１および３２から選択される、第２５項のポリヌクレオチド構築物。
【0172】
第２７項 第２の発現カセットが第２のイントロンを、好ましくは、第３のヌクレオチド配列の上流に含んでなる、第１７項～第２６項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
【0173】
第２８項 第２のイントロンが少なくとも２００ヌクレオチド長である、第２７項のポリヌクレオチド構築物。
【0174】
第２９項 第２のイントロンが配列番号２８を含んでなる、第２７項のポリヌクレオチド構築物。
【0175】
第３０項 構築物が組換えＡＡＶのゲノムを含んでなる、第１項～第２９項のいずれかのポリヌクレオチド構築物。
【0176】
第３１項 構築物がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含んでなる、第３０項のポリヌクレオチド構築物。
【0177】
第３２項 ５’および３’ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲ１３０および／またはＡＡＶ ＩＴＲ１０５である、第３１項のポリヌクレオチド構築物。
【0178】
第３３項 ５’ ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方がＡＡＶ ＩＴＲ１３０である、第３２項のポリヌクレオチド構築物。
【0179】
第３４項 第１項～第３３項のいずれかのポリヌクレオチド構築物を含んでなるゲノムを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【0180】
第３５項 第３４項のＡＡＶを含んでなる医薬組成物。
【0181】
第３６項 第３４項のｒＡＡＶまたは第３５項の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療する方法。
【0182】
第３７項 疾患が湿性ＡＭＤである、第３６項の方法。
【0183】
第３８項 ｒＡＡＶまたは医薬組成物が硝子体内注射により投与される、第３７項の方法。
【0184】
第３９項 第１項～第３３項のいずれかの構築物、または第３４項のｒＡＡＶを含んでなる宿主細胞。
【0185】
第４０項 必要とする対象においてＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療するための薬剤の調製における第１項～第３３項のいずれかのポリヌクレオチド構築物、第３４項のｒＡＡＶ、第３５項の医薬組成物、または第３９項の宿主細胞の使用。
【0186】
第４１項 疾患が湿性ＡＭＤである、第４０項の使用。
【0187】
第４２項 薬剤が硝子体内注射により投与される、第４１項の使用。
【0188】
第４３項 ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療する使用のための、第３４項のｒＡＡＶまたは第３５項の医薬組成物。
【0189】
第４４項 疾患が湿性ＡＭＤである、第４３項の使用のためのｒＡＡＶまたは医薬組成物。
【0190】
第４５項 ｒＡＡＶまたは医薬組成物が硝子体内注射により投与される、第４４項の使用のためのｒＡＡＶまたは医薬組成物。
【0191】
本発明の利益
本発明は、Ｎｂ２４発現を増強する、Ｎｂ２４の活性（ＶＥＧＦへの結合および／またはＶＥＧＦＲ２などのＶＥＧＦＲに対する阻害）を増大させるおよび／またはウイルス品質を向上させるポリヌクレオチド、構築物、ベクターおよびｒＡＡＶを提供する。
本発明は、Ｎｂ２４発現を増強する、Ｎｂ２４の活性（ＶＥＧＦへの結合および／またはＶＥＧＦＲ２などのＶＥＧＦＲに対する阻害）を増大させるおよび／またはウイルス品質を向上させるポリヌクレオチド、構築物、ベクターおよびｒＡＡＶを提供する。
【実施例】
【0192】
以下の実施例は、本願を限定するものではなく、単に例示のために示す。
【0193】
実施例１ ＶＥＧＦナノボディまたはＶＥＧＦ抗体をコードするコドン最適化配列を含んでなるベクターの構築
１．１． Ｎｂ２４ナノボディ（ヒト化）コドン最適化プラスミドの構築
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ、カタログＥ２６２１）を用い、ｐＧＣＢ１０８プラスミドに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）およびニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）とともに、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンおよび第１のイントロン（Ｆ１と呼称、配列番号２８）およびＮｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択され、シグナル配列を含む）、およびｒＧＢポリＡシグナル配列（配列番号３１）とのギブソンアセンブリを行い、１１のプラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－ｎ（ｎ＝１～１１、図１、および図２Ａ参照）を得た。適正にプラスミドが構築されたことを確認するために、制限マッピング（ＡｇｅＩ（Ｒ３５５２Ｌ）およびＫｐｎＩ（Ｒ３１４２Ｌ）、ともにＮＥＢ製、製造者の説明書に従う）およびＤＮＡシークエンシング（ＧＥＮＥＷＩＺ、蘇州、中国）を行った。
１．１． Ｎｂ２４ナノボディ（ヒト化）コドン最適化プラスミドの構築
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ、カタログＥ２６２１）を用い、ｐＧＣＢ１０８プラスミドに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）およびニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）とともに、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンおよび第１のイントロン（Ｆ１と呼称、配列番号２８）およびＮｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択され、シグナル配列を含む）、およびｒＧＢポリＡシグナル配列（配列番号３１）とのギブソンアセンブリを行い、１１のプラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－ｎ（ｎ＝１～１１、図１、および図２Ａ参照）を得た。適正にプラスミドが構築されたことを確認するために、制限マッピング（ＡｇｅＩ（Ｒ３５５２Ｌ）およびＫｐｎＩ（Ｒ３１４２Ｌ）、ともにＮＥＢ製、製造者の説明書に従う）およびＤＮＡシークエンシング（ＧＥＮＥＷＩＺ、蘇州、中国）を行った。
【0194】
１．２． ２価Ｎｂ２４ナノボディプラスミドの構築
２価Ｎｂ２４ナノボディプラスミドは、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５のｒＧＢポリＡシグナル配列（配列番号３１）をｈＧＨポリＡ配列（配列番号３２）に置換することにより構築し、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡを得；ギブソンアセンブリにより２つのＮｂ２４－５配列（配列番号５と配列番号１６）をリンカー（Ｇ４Ｓ）ｎで連結して、配列番号５、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号３６、３７、３８、または３９）、および配列番号１６を含んでなるプラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４、図２Ｂ）、ならびに配列番号５、配列番号３８、および配列番号１８を含んでなるプラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－７－ＨＡと、配列番号７、配列番号３８および配列番号１６を含んでなるｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－５－ＨＡを得た。
２価Ｎｂ２４ナノボディプラスミドは、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５のｒＧＢポリＡシグナル配列（配列番号３１）をｈＧＨポリＡ配列（配列番号３２）に置換することにより構築し、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡを得；ギブソンアセンブリにより２つのＮｂ２４－５配列（配列番号５と配列番号１６）をリンカー（Ｇ４Ｓ）ｎで連結して、配列番号５、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号３６、３７、３８、または３９）、および配列番号１６を含んでなるプラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４、図２Ｂ）、ならびに配列番号５、配列番号３８、および配列番号１８を含んでなるプラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－７－ＨＡと、配列番号７、配列番号３８および配列番号１６を含んでなるｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－５－ＨＡを得た。
【0195】
プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５＿スタッファーは、 配列番号４９のスタッファー配列を、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡの配列番号３２の顆粒に付加することにより構築した。プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ＿スタッファーは、配列番号４９のヌクレオチド１～１８００をｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡのｈＧＨポリＡ配列の下流に挿入することにより構築した。
【0196】
以下の２価プラスミドを、同様の方法で、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４およびｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７に基づき、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－４－ｈＧＨｐＡおよびｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－７－ｈＧＨｐＡを中間体として構築した。
・配列番号４、配列番号３６、および配列番号１５を含んでなるｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－４－ＨＡ（図２Ｃ）、
・配列番号４、配列番号３６、および配列番号１８を含んでなるｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ（図２Ｄ）、ならびに
・配列番号７、配列番号３６、および配列番号１５を含んでなるｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ（図２Ｅ）。
・配列番号４、配列番号３６、および配列番号１５を含んでなるｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－４－ＨＡ（図２Ｃ）、
・配列番号４、配列番号３６、および配列番号１８を含んでなるｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ（図２Ｄ）、ならびに
・配列番号７、配列番号３６、および配列番号１５を含んでなるｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ（図２Ｅ）。
【0197】
さらなる２価プラスミドは、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５のシグナル配列（配列番号５のヌクレオチド１～６６）をＩＬ２シグナル配列（配列番号４１）に置換すること；Ｎｂ２４－５配列（配列番号１６）をリンカー（Ｇ４Ｓ）４で連結された２つのＮｂ２４配列（Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４、配列番号４０）に置換すること；および場合により、ＨＡタグ（配列番号３０）をｈＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号４２）に置換することにより構築し、以下のプラスミドを得た。
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ（図２Ｆ）；および
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｈＩｇＧ１Ｆｃ （図２Ｇ）。
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ（図２Ｆ）；および
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｈＩｇＧ１Ｆｃ （図２Ｇ）。
【0198】
実施例１．１に記載したように、適正にプラスミドが構築されたことを確認するために、制限マッピングおよびＤＮＡシークエンシングを行った。
【0199】
１．３． ベンチマーク抗ＶＥＧＦプラスミドの構築
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖプラスミド（図３）を次のように構築した。ｐＧＣＢ１０８プラスミドに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ） 初期エンハンサーエレメントおよびニワトリβ－アクチンプロモーターとともに、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンおよび第１のイントロン（Ｆ１）、およびＢｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ配列（配列番号４３）のＰＣＲ産物とのギブソンアセンブリを行った。実施例１．１に記載したように、適正にプラスミドが構築されたことを確認するために、制限マッピングおよびＤＮＡシークエンシングを行った。
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖプラスミド（図３）を次のように構築した。ｐＧＣＢ１０８プラスミドに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ） 初期エンハンサーエレメントおよびニワトリβ－アクチンプロモーターとともに、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンおよび第１のイントロン（Ｆ１）、およびＢｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ配列（配列番号４３）のＰＣＲ産物とのギブソンアセンブリを行った。実施例１．１に記載したように、適正にプラスミドが構築されたことを確認するために、制限マッピングおよびＤＮＡシークエンシングを行った。
【0200】
１．４． ＩＬ２シグナルペプチドＮｂ２４ナノボディプラスミドの構築
１）プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ（図４Ａ）は、ギブソンアセンブリによって、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４のＮｂ２４－４－ＨＡのシグナルペプチドをコードする配列（配列番号４の位置１～６６）を、ＩＬ２シグナルペプチドをコードする配列（配列番号４１）に置換することにより構築した。
１）プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ（図４Ａ）は、ギブソンアセンブリによって、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４のＮｂ２４－４－ＨＡのシグナルペプチドをコードする配列（配列番号４の位置１～６６）を、ＩＬ２シグナルペプチドをコードする配列（配列番号４１）に置換することにより構築した。
【0201】
２）プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｃｏ３．１Ｎｂ２４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ（図４Ｂ）は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡのＮｂ２４－４配列をＣｏ３．１Ｎｂ２４（配列番号４０）ＤＮＡ配列に置換することにより構築し、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｃｏ３．１Ｎｂ２４（ＩＬ２シグナル）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ（図４Ｃ）は、ＨＡタグをコードする配列を、ｈＩｇＧ１Ｆｃをコードする配列（配列番号４２）に置換することにより構築した。実施例１．１に記載したように、適正にプラスミドが構築されたことを確認するために、制限マッピングおよびＤＮＡシークエンシングを行った。
【0202】
１．５． デュアルプロモータープラスミドの構築
プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（図５）は次のように構築した：Ｔ４ ＤＮＡライゲーションを用い、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５のプロモーターをＣＭＶプロモーター（配列番号４４）に置換し；付加的制限酵素（ＮｏｔＩ）を用い、ＰＣＲにより、ＣＭＶ－Ｆ１Ｎｂ２４－５－ｒＧＢｐＡのＧＯＩを増幅し；制限酵素消化およびＴ４ ＤＮＡライゲーションを用い、ＣＭＶ－Ｆ１Ｎｂ２４－５－ｒＧＢｐＡのＧＯＩをｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡのｈＧＨポリＡ配列の下流に連結することにより、デュアルプロモータープラスミドをトランスで構築した。実施例１．１に記載したように、適正にプラスミドが構築されたことを確認するために、制限マッピングおよびＤＮＡシークエンシングを行った。
プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（図５）は次のように構築した：Ｔ４ ＤＮＡライゲーションを用い、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５のプロモーターをＣＭＶプロモーター（配列番号４４）に置換し；付加的制限酵素（ＮｏｔＩ）を用い、ＰＣＲにより、ＣＭＶ－Ｆ１Ｎｂ２４－５－ｒＧＢｐＡのＧＯＩを増幅し；制限酵素消化およびＴ４ ＤＮＡライゲーションを用い、ＣＭＶ－Ｆ１Ｎｂ２４－５－ｒＧＢｐＡのＧＯＩをｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡのｈＧＨポリＡ配列の下流に連結することにより、デュアルプロモータープラスミドをトランスで構築した。実施例１．１に記載したように、適正にプラスミドが構築されたことを確認するために、制限マッピングおよびＤＮＡシークエンシングを行った。
【0203】
１．６． イントロンおよびＩＴＲが異なるプラスミドの構築
プラスミドｐＣＢ１０８－５ＩＴＲ１３０－ＣＢＡ－ｐＣＩ－Ｎｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ（図６）は、Ｔ４ ＤＮＡライゲーション（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｌ）を製造者の説明書に従って用いて、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５のＦ１をｐＣＩ（配列番号２９）に変更し、５ＩＴＲ１３０（配列番号３３）を５ＩＴＲ１０５（配列番号３５）に置換することにより構築した。実施例１．１に記載したように、適正にプラスミドが構築されたことを確認するために、制限マッピングおよびＤＮＡシークエンシングを行った。
プラスミドｐＣＢ１０８－５ＩＴＲ１３０－ＣＢＡ－ｐＣＩ－Ｎｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ（図６）は、Ｔ４ ＤＮＡライゲーション（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｌ）を製造者の説明書に従って用いて、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５のＦ１をｐＣＩ（配列番号２９）に変更し、５ＩＴＲ１３０（配列番号３３）を５ＩＴＲ１０５（配列番号３５）に置換することにより構築した。実施例１．１に記載したように、適正にプラスミドが構築されたことを確認するために、制限マッピングおよびＤＮＡシークエンシングを行った。
【0204】
実施例２ コドン最適化プラスミドによるＮｂ２４ナノボディの発現
Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造者のプロトコールに従い、３７℃、８％ＣＯ２、８０％湿度で培養した。Ｅｘｐｉ２９３細胞を１２ウェルプレートに２．５×１０６細胞／ウェルの密度で播種し、製造者のプロトコールに従い（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－ｎ（ｎ＝１～１１）でトランスフェクトした。トランスフェクション効率を示す参照としてプラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖを各ＣｏＮｂ２４導入遺伝子に１：９比で加えた。トランスフェクション７２時間後に培養上清を回収した。
Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造者のプロトコールに従い、３７℃、８％ＣＯ２、８０％湿度で培養した。Ｅｘｐｉ２９３細胞を１２ウェルプレートに２．５×１０６細胞／ウェルの密度で播種し、製造者のプロトコールに従い（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－ｎ（ｎ＝１～１１）でトランスフェクトした。トランスフェクション効率を示す参照としてプラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖを各ＣｏＮｂ２４導入遺伝子に１：９比で加えた。トランスフェクション７２時間後に培養上清を回収した。
【0205】
等容量のＮｂ２４上清をＰＡＧＥ用ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードした（１μｌ還元＋９μｌ ４Ｘｌｉ－ｃｏｒタンパク質ローディング＋３０μｌ ｓｕｐ、２００Ｖ、２２分）。ｉＢｌｏｔ（登録商標）２ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびｉＢｌｏｔ（登録商標）２ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｔａｃｋ（ニトロセルロース、レギュラーサイズ）を用い、ニトロセルロースメンブレン上でタンパク質をトランスフェクトした。ブロッキングバッファー（Ｏｄｙｓｓｅｙ、Ｌｉ－Ｃｏｒ）とともに１時間インキュベートし、３回すすいだ（１分／回）後、同じバッファー中、一次抗体（抗ＨＡウサギ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＰＡ１－９８５）、１：５０００，４℃，一晩）でメンブレンをプローブし、その後３回すすぎ（１分／回）、次いで、ロバ抗ウサギ８００ＣＷ（１：５０００）（カタログ＃ ＲＥＦ９２６－３２２１３、Ｌｉ－Ｃｏｒ）ともに室温で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴ（希釈Ｐｉｅｒｃｅ（商標）２０倍ＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０バッファー、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのカタログ番号：２８３６０）で２時間洗浄した（１５分／回）後、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を用いて免疫反応を可視化した。
【0206】
図７Ａに示されるように、１１のコドン最適化プラスミド（ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－ｎ、ｎ＝１～１１）は総て効率的にＮｂ２４を発現することができる。プラスミドの発現はシグナル強度に基づいて計算し、「１」として示したｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－１１による発現に対して正規化した。３つのプラスミド（ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４、－５および－７）でより高い発現が見られ、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５による発現が最高であり、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－１１の２倍を超えた（図７Ｂ）。
【0207】
実施例３ ２価Ｎｂ２４ナノボディの発現
３．１． Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ）を培養し、製造者のプロトコールに従い、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｈＩｇＧ１Ｆｃ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｃｏ３．１Ｎｂ２４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｃｏ３．１Ｎｂ２４（ＩＬ２シグナル）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－２；および
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４。
３．１． Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ）を培養し、製造者のプロトコールに従い、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｈＩｇＧ１Ｆｃ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｃｏ３．１Ｎｂ２４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｃｏ３．１Ｎｂ２４（ＩＬ２シグナル）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－２；および
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４。
【0208】
細胞上清をトランスフェクション７２時間後に回収し、ウエスタンブロッティングにより調べた。細胞培養およびトランスフェクション、ならびにウエスタンブロッティングは、一次抗体の希釈を（１：２０００）としたこと、およびｈＩｇＧ１Ｆｃをコードするプラスミドを、抗Ｆｃ ＨＲＰ（１：３０００、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１８８２３）とともに室温で２時間インキュベートし、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を用いて可視化することにより検出したこと以外は実施例２に記載したように行った。
【0209】
図８に示されるように、２価プラスミド（１、２、４および６で示されるレーン）は、１価プラスミド（３、５、７および８で示されるレーン）に比べて高い発現レベルを達成した。
【0210】
３．２． Ｅｘｐｉ２９３細胞を培養し、製造者のプロトコールに従い、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；
・ｐＣＢ１０８－５ＩＴＲ１３０－ＣＢＡ－ｐＣＩ－Ｎｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ；および
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５。
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；
・ｐＣＢ１０８－５ＩＴＲ１３０－ＣＢＡ－ｐＣＩ－Ｎｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ；および
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５。
【0211】
細胞上清をトランスフェクション７２時間後に回収し、ウエスタンブロッティングにより調べた。細胞培養およびトランスフェクション、ならびにウエスタンブロッティングは、二次抗体の希釈を（１：２５００）としたこと以外は実施例２に記載したように行った。
【0212】
図９に示されるように、デュアルプロモータープラスミド（ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ、レーン３）は、モノプロモータープラスミド（ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ、レーン２）に比べてＮｂ２４発現の増大を示した。
【0213】
より短いイントロンを含んでなるプラスミド（ｐＣＢ１０８－５ＩＴＲ１３０－ＣＢＡ－ｐＣＩ－Ｎｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ、レーン４）は、Ｎｂ２４発現の低下を示したことも示された。
【0214】
３．３． Ｅｘｐｉ２９３細胞を培養し、製造者のプロトコールに従い、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡおよびｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡでトランスフェクトした。細胞上清をトランスフェクション７２時間後に回収し、ウエスタンブロッティングにより調べた。細胞培養およびトランスフェクション、ならびにウエスタンブロッティングは、二次抗体の希釈を（１：２５００）としたこと以外は実施例２に記載したように行った。ウエスタンブロッティングの結果を図１０に示す：１価Ｎｂ２４の発現レベルは２価Ｎｂ２４より低く、２価Ｎｂ２４は、リンカーの長さによってサイズは互いに異なっていたが、それらの発現レベルは同等であった。
【0215】
実施例４ 種々のバージョンのＮｂ２４の発現
Ｅｘｐｉ２９３細胞を培養し、製造者のプロトコールに従い、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；および
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ。
Ｅｘｐｉ２９３細胞を培養し、製造者のプロトコールに従い、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；および
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ。
【0216】
細胞上清をトランスフェクション７２時間後に回収し、ウエスタンブロッティングにより調べた。細胞培養およびトランスフェクション、ならびにウエスタンブロッティングは、二次抗体の希釈を（１：２５００）としたこと以外は実施例２に記載したように行った。
【0217】
図１１に示されるように、プラスミド中の導入遺伝子はよく発現し、１価Ｎｂ２４の発現レベルは、デュアルプロモーター構築物でやや高く、Ｎｂ２４－５によりコードされる２価Ｎｂ２４（配列番号５および１６）は、Ｃｏ３．１ ＨｕＮｂ２４によりコードされる（配列番号４０）より高かった。
【0218】
実施例５ ＶＥＧＦに対するＨｕＮｂ２４の結合
ＨｕＮｂ２４の結合は、ＶＥＧＦＡ－１６５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ２９３－ＶＥ／ＣＦ）を用いてＥＬＩＳＡにより調べた。特に、ｅｘｐｉ２９３細胞をプラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡおよびｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖでトランスフェクトすることによりＨｕＮｂ２４を発現させ、トランスフェクト細胞（以下、それぞれＮｂ２４およびＢｅｏｖｕと呼称）の培養上清をトランスフェクション７２時間後に回収した。上清の濃度は、実施例２に記載したようにウエスタンブロッティングにより決定した。ＥＬＩＳＡは次のように行い、非トランスフェクト細胞からの上清を陰性対照として使用した。
ＨｕＮｂ２４の結合は、ＶＥＧＦＡ－１６５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ２９３－ＶＥ／ＣＦ）を用いてＥＬＩＳＡにより調べた。特に、ｅｘｐｉ２９３細胞をプラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡおよびｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖでトランスフェクトすることによりＨｕＮｂ２４を発現させ、トランスフェクト細胞（以下、それぞれＮｂ２４およびＢｅｏｖｕと呼称）の培養上清をトランスフェクション７２時間後に回収した。上清の濃度は、実施例２に記載したようにウエスタンブロッティングにより決定した。ＥＬＩＳＡは次のように行い、非トランスフェクト細胞からの上清を陰性対照として使用した。
【0219】
ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＲＥＦ３６９０）を１μｇ／ｍｌ濃度のＶＥＧＦＡ－１６５ ５０μｌ／ウェルで、プレートのウェルの半分の高さまで一晩コーティングした。室温でスターターブロッカー（ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）Ｔ２０（ＴＢＳ）ブロッキングバッファー、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのカタログ番号：３７５４３）とともに、穏やかに振盪しながら２時間インキュベートした後、予め希釈したＮｂ２４上清およびＢｅｏｖｕ上清をそのＥＬＩＳＡプレートに加え、次いで、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。ブロッカーを除去した後、一次抗体（ウサギ抗ＨＡ、Ｔｈｅｒｍｏ、ＰＡ１－９８５）をブロッキングバッファー（ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）Ｔ２０（ＴＢＳ）ブロッキングバッファー、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのカタログ番号：３７５４３）で希釈し（１：５０００）、ＥＬＩＳＡプレートに加え（５０μｌ／ウェル）、次いで、２５０ｒｐｍで穏やかに振盪しながら室温でインキュベートした。１倍ＴＢＳＴバッファーで３回洗浄した後、二次抗体（ヤギ抗ウサギ－ＨＲＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１４６）をブロッキングバッファーで希釈し（１：５０００）、ＥＬＩＳＡプレートに加え（５０μｌ／ウェル）、その後、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを１倍ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＲＥＦ３４０２８）をプレートに加え（５０μｌ／ウェル）、室温で５～１０分間インキュベートした後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えてＴＭＢ反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートのＯＤ４５０およびＯＤ５２５を検出した。ヒトＶＥＧＦＡに対するＮｂ２４およびＢｅｏｖｕの用量依存的結合を、Ｇｒａｐｈ ｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて計算した。
【0220】
以下のプラスミドも、上記のように、発現した１価および２価Ｎｂ２４の結合に関して調べた。
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４）；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－４－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ；および
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ。
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４）；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－４－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ；
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ；および
・ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ。
【0221】
【0222】
実施例６ Ｎｂ２４によるＶＥＧＦＲ２の阻害
ＶＥＧＦＲ２／ＮＦＡＴリポーター－ＨＥＫ２９３細胞（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ＃：９３８７）におけるＮｂ２４によるＶＥＧＦのキナーゼ活性の阻害を以下のように調べた。
ＶＥＧＦＲ２／ＮＦＡＴリポーター－ＨＥＫ２９３細胞（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ＃：９３８７）におけるＮｂ２４によるＶＥＧＦのキナーゼ活性の阻害を以下のように調べた。
【0223】
ＶＥＧＦＲ２／ＮＦＡＴリポーター－ＨＥＫ２９３細胞を製造者の説明書に従って完全増殖培地で培養し、培養系から採取し、白色透明底の９６ウェルマイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、６００５）に、１００μｌの完全増殖培地中、約４０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞をＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で約１６時間インキュベートした。完全増殖培地を除去し、８０μｌのアッセイ培地（製造者の説明書に従う）を加えた。細胞をＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で約１時間インキュベートした。ＶＥＧＦと１価Ｎｂ２４および２価Ｎｂ２４の混合物は、ａ）アッセイ培地でＶＥＧＦ溶液を作製し（２５０ｎｇ／ｍｌ）；ｂ）アッセイ培地で連続希釈Ｎｂ２４溶液を作製し（初期濃度１０μｇ／ｍｌ、２倍連続希釈、１２サンプル、および終点はアッセイ培地のみ）；ｃ）３０μｌのＶＥＧＦ溶液と３０μｌの連続希釈２価Ｎｂ２４溶液を混合し、１５０ｒｐｍで振盪しながら室温で１時間インキュベートすることにより調製した。２０μｌの混合物を、細胞を含むウェルに２反復で加え、バックグラウンド発光を求めるために１００μｌのアッセイ培地を無細胞対照ウェルに加えた。プレートをＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で４時間インキュベートした。ルシフェラーゼアッセイは、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイキット（ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａのセレクトカタログ番号：Ｅ６１２０）を用い、推奨される説明書に従い、ウェル当たり１００μｌの最終ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼ試薬を加え、室温で約１５～３０分環揺動し、照度計を用いて発光を測定することで行った。
【0224】
阻害は、発光により表され、発光は、各ウェルの発光測定値から平均バックグラウンド発光（無細胞対照ウェル）を差し引くことにより計算した。
【0225】
図１３Ａに示されるように、２価Ｎｂ２４は、ＶＥＧＦのキナーゼ活性の阻害において同等であり、ＩＣ５０は１．４４９～２．４７８ｎＭであった（下表１を参照）。
【0226】
【表1】
【0227】
図１３Ｂに示されるように、２価Ｎｂ２４は、１価Ｎｂ２４よりも強い阻害を示した。
【0228】
実施例７ ＶＥＧＦに対するＶＥＧＦＲ２の結合
ヒトＶＥＧＦに対するヒトＶＥＧＦＲ２の結合をＥＬＩＳＡにより検出した。
ヒトＶＥＧＦに対するヒトＶＥＧＦＲ２の結合をＥＬＩＳＡにより検出した。
【0229】
ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌ濃度のＶＥＧＦＡ－１６５ ５０μｌ／ウェルで、プレートのウェルの半分の高さまで一晩コーティングした。室温でスターターブロッカーとともに、穏やかに振盪しながら２時間インキュベートした後、予め希釈したヒトＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ Ｆｃキメラタンパク質（ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓおよびＮｏｖａｍａｂ）をＥＬＩＳＡプレートに加え、次いで、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。ブロッカーを除去した後、検出抗体（ウサギ抗ヒトＦＣ ＨＲＰ、Ｔｈｅｒｍｏ）をブロッキングバッファーで１：５０００希釈し、５０μｌ／ウェルを加え、２５０ｒｐｍで穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを１倍ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ基質をプレートに加え（５０μｌ／ウェル），室温で５～１０分間インキュベートした後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えてＴＭＢ反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートのＯＤ４５０およびＯＤ５２５を検出した。ヒトＶＥＧＦＡに対するＶＥＧＦＲ２の用量依存的結合を、Ｇｒａｐｈ ｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて計算した。
【0230】
図１４Ａに示されるように、ＶＥＧＦＲ２は、Ｎｂ２４の不在下でヒトＶＥＧＦに結合することができる。
【0231】
競合的ＥＬＩＳＡも同様の手順に従って行い、連続希釈したＮｂ２４またはＢｅｏｖｕ溶液を予め希釈したヒトＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ Ｆｃキメラタンパク質（１μｇ／ｍｌ）を１：１（ｖ／ｖの比率）で混合した。
【0232】
図１４Ｂに示されるように、ＶＥＧＦに対するＶＥＧＦＲ２の結合は、Ｎｂ２４およびＢｅｏｖｕにより阻害された。
【0233】
実施例８ ＶＥＧＦＲ２に対するＶＥＧＦの結合
ＶＥＧＦＲ２に対するＶＥＧＦの結合は、次のような細胞に基づくアッセイにより検出された。
１）ＶＥＧＦＲ２／ＮＦＡＴリポーターＨＥＫ２９３組換え細胞を製造者のプロトコールに従って培養した。
２）ＨＥＫ２９３組換え細胞に対するＶＥＧＦ用量応答は、ＶＥＧＦＡ－１６５を用い、製造者（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のプロトコールに従って行った。
３）ルシフェラーゼアッセイは、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイキットを用いて行った。
４）データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。
ＶＥＧＦＲ２に対するＶＥＧＦの結合は、次のような細胞に基づくアッセイにより検出された。
１）ＶＥＧＦＲ２／ＮＦＡＴリポーターＨＥＫ２９３組換え細胞を製造者のプロトコールに従って培養した。
２）ＨＥＫ２９３組換え細胞に対するＶＥＧＦ用量応答は、ＶＥＧＦＡ－１６５を用い、製造者（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のプロトコールに従って行った。
３）ルシフェラーゼアッセイは、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイキットを用いて行った。
４）データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。
【0234】
図１５Ａに示されるように、ｈＶＥＧＦは、Ｎｂ２４の不在下でＶＥＧＦＲ２を発現する細胞に対し、ＥＣ５０ １７．４３ｎｇ／ｍｌで、用量依存的結合を示した。
【0235】
ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）と連続希釈したＮｂ２４－５（Ｇ４Ｓ）４Ｎｂ２４－５の混合物を用いることにより若干改変した実施例６に記載のアッセイを行い、ＶＥＧＦＲ２に対するＶＥＧＦの結合に及ぼすＮｂ２４の効果を検出した。ＶＥＧＦＲ２に対するＶＥＧＦの結合はＥＣ５０ ３０．４０ｎｇ／ｍｌでＮｂ２４により阻害されたことが示された（図１５Ｂ）。
【0236】
実施例９ Ｎｂ２４をコードするベクターによる遺伝子療法
表２に列挙された組換えＡＡＶ（群３～８）は、種々のパッケージングプラスミドおよび導入遺伝子プラスミドを用い、Crosson SM et al. 2018に記載されているものと同様の方法を用いて作製した。簡単に述べれば、無血清ウイルス生産培地ＯＰＭ－２９３ ＣＤ０５（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＯＰＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ．カタログ：８１０７５－００１）中、３Ｅ６細胞／ｍｌの２９３ＶＰＣ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログＡ３５３４７）を、ポリエチレンイミンを用い、以下のヘルパープラスミド、ｒｅｐ／ｃａｐをコードするパッケージングプラスミド、および導入遺伝子プラスミドで三重にトランスフェクトした。
・ヘルパープラスミド（Crosson Sm et al.に記載されているようなＡｄ Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡヘルパー遺伝子を含む「ｐＨｅｌｐｅｒ」、そのマップは図１６Ａに示される）；
・パッケージングプラスミド、例示的マップが図１６Ｂに示され、「ＡＡＶ２ Ｃａｐ」はＡＡＶ２－ｍ２（群３の場合、配列番号４４）、ＡＡＶ９（群４および６の場合、配列番号４５）、ＡＡＶ２．ＧＬ（群５の場合、配列番号４６）、ＡＡＶ２－７ｍ８－ｆｌａｎｋ（群７の場合、配列番号４７）、またはＡＡＶ２－ＮＮ（群８の場合、配列番号４８）のＣａｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換することができ、「ＡＡＶ２ Ｒｅｐ」は、野生型ＡＡＶ２ Ｒｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である；
・導入遺伝子プラスミド、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ（群３および５～８の場合）、またはｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（群４の場合）。
表２に列挙された組換えＡＡＶ（群３～８）は、種々のパッケージングプラスミドおよび導入遺伝子プラスミドを用い、Crosson SM et al. 2018に記載されているものと同様の方法を用いて作製した。簡単に述べれば、無血清ウイルス生産培地ＯＰＭ－２９３ ＣＤ０５（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＯＰＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ．カタログ：８１０７５－００１）中、３Ｅ６細胞／ｍｌの２９３ＶＰＣ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログＡ３５３４７）を、ポリエチレンイミンを用い、以下のヘルパープラスミド、ｒｅｐ／ｃａｐをコードするパッケージングプラスミド、および導入遺伝子プラスミドで三重にトランスフェクトした。
・ヘルパープラスミド（Crosson Sm et al.に記載されているようなＡｄ Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡヘルパー遺伝子を含む「ｐＨｅｌｐｅｒ」、そのマップは図１６Ａに示される）；
・パッケージングプラスミド、例示的マップが図１６Ｂに示され、「ＡＡＶ２ Ｃａｐ」はＡＡＶ２－ｍ２（群３の場合、配列番号４４）、ＡＡＶ９（群４および６の場合、配列番号４５）、ＡＡＶ２．ＧＬ（群５の場合、配列番号４６）、ＡＡＶ２－７ｍ８－ｆｌａｎｋ（群７の場合、配列番号４７）、またはＡＡＶ２－ＮＮ（群８の場合、配列番号４８）のＣａｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換することができ、「ＡＡＶ２ Ｒｅｐ」は、野生型ＡＡＶ２ Ｒｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である；
・導入遺伝子プラスミド、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ（群３および５～８の場合）、またはｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（群４の場合）。
【0237】
３７℃で７２時間のインキュベーションの後、細胞を採取し、ウイルス粒子をイオジキサノール勾配により精製した（Crosson SM et al.参照)。
【0238】
ｒＡＡＶの力価をｄｄＰＣＲにより調べたところ、総て、１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬを超えるレベルであった（表２参照）。特に、ｄｄＰＣＲを、製造者の説明書に従い、Ｂｉｏ－ＲａｄのＱＸＤｘ ＡｕｔｏＤＧ ｄｄＰＣＲシステムおよびＡｕｔｏＤＧ ｄｄＰＣＲシステムのＱＸＤｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌキットと以下のプライマーおよびプローブを用いて行った。
ｑＰＣＲ－ＡＭＤ－２４－５－Ｆ ＧＡＧＴＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧ（配列番号５０）
ｑＰＣＲ－ＡＭＤ－２４－５－Ｒ ＧＣＧＴＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧ（配列番号５１）
ｑＰＣＲ－ＡＭＤ－２４－５－Ｐ ＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＣ （配列番号５２）
ｑＰＣＲ－ＡＭＤ－２４－５－Ｆ ＧＡＧＴＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧ（配列番号５０）
ｑＰＣＲ－ＡＭＤ－２４－５－Ｒ ＧＣＧＴＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧ（配列番号５１）
ｑＰＣＲ－ＡＭＤ－２４－５－Ｐ ＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＣ （配列番号５２）
【0239】
遺伝子療法は、ダッチベルテッド（ＤＢ）ウサギ（ＪＯＩＮＮ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｌｔｄ．）で行った。
【0240】
特に、網膜新血管新生（ＲＮＶ）を、２０２０年４月および２０２０年７月のそれぞれにＤＬ－α－ＡＡＡの硝子体内注射（ＩＶＩ）により、ダッチベルテッド（ＤＢ）ウサギの２つのコホートの右眼（ＯＤ）に片側的に誘導した。試験眼のＲＮＶは、それぞれ２０２１年４月２４日および５月１６日に眼底画像および網膜蛍光血管造影（ＦＡ）によって評価し、可視的ＲＮＶおよび蛍光漏出を有するものを遺伝子療法のために選択した。
【0241】
ＲＮＶの重症度は、電子眼底画像の蛍光漏出面積（ピクセル）を測定することにより数値化した。選択した動物は無作為に、群間で漏出面積に有意差がないように群に分けた（ｎ＝３／群）（データは示していない）。
【0242】
対照およびｒＡＡＶを含め、表２に挙げた試験品を、動物の右眼に１００μｌ／眼の用量で硝子体内（ＩＶＴ）注射により投与した。陽性対照として市販のＡＭＤ薬Ｅｙｌｅａ（登録商標）を、陰性対照としてビヒクルを用いた。試験品の効果は、眼底画像と網膜蛍光血管造影（ＦＡ）によって評価した。
【0243】
【表2】
【0244】
ビヒクルはＲＮＶにより誘導されたフルオレセイン漏出を変化させず（図１６Ａ）、ＩＶＴ後の眼の炎症応答はごくわずかであり、一方、Ｅｙｌｅａ（登録商標）（４ｍｇ／１００μｌ）はＲＮＶによる漏出を完全に阻止し（図１６Ｂ）、眼の炎症応答は眼房水、硝子体液の細胞浸潤、および硝子体混濁を含む軽度のものであった。
【0245】
群３では、ＲＮＶによる漏出は投与１４日後に改善されず（図１６Ｃ）、眼内の炎症応答の重症度は軽度で、Ｅｙｌｅａ群で見られたものと同様であった。
【0246】
群４では、ＲＮＶ漏出に対する有意な治療効力が誘導され（図１６Ｄ）、眼内の炎症応答は、硝子体液の細胞浸潤および硝子体混濁を含む軽度から中等度のものであった。
【0247】
群５では、ＲＮＶ漏出に対する有意な治療効力が誘導され（図１６Ｅ）、眼内の炎症応答は、眼房水、硝子体液の細胞浸潤および明白な硝子体混濁を含む中等度のものであった。
【0248】
群６では、ＲＮＶによる漏出は投与１４日後に改善されず（図１６Ｆ）、軽度から中等度の硝子体細胞浸潤および混濁が主要な所見であった。
【0249】
群７では、ＲＮＶによる漏出は投与１４日後に部分的に改善され（図１６Ｇ）、軽度の、眼房水、硝子体液の細胞浸潤、および硝子体混濁が主要な所見であった。
【0250】
群８では、ＲＮＶによる漏出は投与１４日後に部分的に改善され（図１６Ｈ）、中等度の硝子体液の細胞浸潤および混濁が主要な所見であった。
【0251】
実施例１０ Ｎｂ２４をコードする構築物の最適化
本実施例は、Ｎｂ２４をコードする最適な構築物を得るために実施した。
本実施例は、Ｎｂ２４をコードする最適な構築物を得るために実施した。
【0252】
１０．１ ２価Ｎｂ２４は、ＶＥＧＦＲ２に対して１価Ｎｂ２４よりも高い阻害を達成した。
Ｅｘｐｉ２９３細胞は、実施例２に従い、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ、および
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－７－ＨＡ。
Ｅｘｐｉ２９３細胞は、実施例２に従い、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ、および
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－７－ＨＡ。
【0253】
上清中の１価および２価Ｎｂ２４を、実施例２に記載したようにウエスタンブロットにより定量し、一連の濃度に希釈した。ＶＥＧＦＲ２に対するそれらの阻害を、実施例７に記載したようにＥＬＩＳＡにより調べ、市販の製品ルセンティス（ＮＯＶＡＲＴＩＳ、ＳＡＷＥ７）を参照として使用した。
【0254】
図１８に示されるように、２価Ｎｂ２４は、１価Ｎｂ２４の５倍のＩＣ５０を示し（２５．６ｎＭ対１３２．５ｎｍ）、一方、ルセンティスは６２．１ｎＭのＩＣ５０を示した。
【0255】
１０．２． リンカー（Ｇ４Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）２を有する２価Ｎｂ２４は、（Ｇ４Ｓ）１または（Ｇ４Ｓ）４を有するものよりも高い親和性を示した。
Ｅｘｐｉ２９３細胞を、実施例２に従って、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４）；
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－４－ＨＡ、および
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ。
Ｅｘｐｉ２９３細胞を、実施例２に従って、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４）；
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－４－ＨＡ、および
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ。
【0256】
ＶＥＧＦに対する２価Ｎｂ２４の結合を、実施例５に記載したように調べた。図１９に示されるように、曲線は形状が類似していた。リンカー（Ｇ４Ｓ）３および（Ｇ４Ｓ）２を有する２価Ｎｂ２４（それぞれ３４５．５ｎＭおよび３７６．１ｎＭ）は、リンカー（Ｇ４Ｓ）１および（Ｇ４Ｓ）４（それぞれ４００．２ｎＭおよび４６３．８ｎＭ）を有するものよりも低いＥＣ５０値を示した。
【0257】
１０．３． 同一のコード配列を有する２価Ｎｂ２４をコードするｒＡＡＶは低いウイルス品質を示した。
ｒＡＡＶは、実施例９に記載したような方法によって作製し、導入遺伝子プラスミドは以下から選択される。
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４）、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５＿スタッファー、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ＿スタッファー、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１～Ｎｂ２４－５－ＨＡ、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－４－ＨＡ、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ、および
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ。
ｒＡＡＶは、実施例９に記載したような方法によって作製し、導入遺伝子プラスミドは以下から選択される。
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４）、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５＿スタッファー、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ＿スタッファー、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１～Ｎｂ２４－５－ＨＡ、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－４－ＨＡ、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ、および
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡ。
【0258】
得られたｒＡＡＶを表３および４に示した。
【0259】
ｒＡＡＶを９５℃で５分間加熱し、変性ゲルにロードし、電気泳動（２０Ｖ、一晩、４℃）を行った。
【0260】
【表3】
【0261】
【表4】
【0262】
図２０および２１に示されるように、同一のコード配列を有する２価Ｎｂ２４をコードするｒＡＡＶは、そのゲノムの電気泳動の２本のバンドを示し（図２０のレーン４、６および１２、図２１のレーン７～９および１２～１８）、これは対応するｒＡＡＶ集団(polulations)はヘテロゲノムを含んでなることを示唆し、すなわち、低いウイルス品質（低いゲノムの完全性）を示唆したが、異なるコード配列を有する２価Ｎｂ２４をコードするｒＡＡＶは単一のバンド（図２０のレーン８）を示し、ホモゲノム、すなわち、有利なウイルス品質（所望のゲノム完全性）を示唆した。
【0263】
ｒＡＡＶはまた、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－７－ＨＡおよびｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－７－ＨＡから選択される導入遺伝子プラスミドと、それぞれＡＡＶ２－７ｍ８およびＡＡＶ９から選択されるＣａｐポリペプチドをコードするパッケージングプラスミドを用いて作製した。得られたｒＡＡＶから単離したゲノムの変性電気泳動でも単一のバンドが示され、ホモゲノム、すなわち、有利なウイルス品質（所望のゲノム完全性）が示唆された。
【0264】
異なるコード配列を有する２価Ｎｂ２４をコードするｒＡＡＶは、ウイルス品質において、同一のコード配列を有する２価Ｎｂ２４をコードするｒＡＡＶに優る利点を達成したと結論付けられる。
【0265】
１０．４． ２価構築物におけるＮｂ２４のコード配列の配置は発現に有意な影響を及ぼさない
Ｅｘｐｉ２９３細胞を、実施例２に従い、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－５－ＨＡ、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－７－ＨＡ、および
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－５－ＨＡ。
Ｅｘｐｉ２９３細胞を、実施例２に従い、以下のプラスミドでトランスフェクトした。
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－５－ＨＡ、
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－７－ＨＡ、および
ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－５－ＨＡ。
【0266】
上清中の２価Ｎｂ２４を、実施例２に記載したようにウエスタンブロットにより定量し、一連の濃度に希釈した。ＶＥＧＦＲ２に対するその阻害を実施例６に記載したように調べた。結果を図２２に示した。３種類のプラスミドによって発現された２価Ｎｂ２４は、発現レベルおよびＶＥＧＦＲ２に対する阻害において互いに有意な差を示さなかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A-B】
【図12C-D】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図17-4】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0010】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、コード配列の下流に第１のポリアデニル化シグナル配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第１のポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３１および３２から選択される。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0021】
【図2B】図２Ｂは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図2C】図２Ｃは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図2D】図２Ｄは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図2E】図２Ｅは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図2F】図２Ｆは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図2G】図２Ｇは、２価Ｎｂ２４を発現する構築物の構造を示す。エレメント「ＣＭＶｅｎ」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（配列番号２５）を表し；エレメント「ＣＢプロモーター」は、ニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を表し；エレメント「ｈＧｂｉｎイントロン」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエキソンと第１のイントロン（配列番号２８）を表し、エレメント「ＣｏＨｕＮｂ２４－ｎ」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される）を表し、エレメント「ＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列（配列番号３０）を表し；エレメント「ｒＧＢポリ（Ａ）シグナル」は、ウサギグロビン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３１）を表し；エレメント「ＣＢＡプロモーター」は、「ＣＭＶｅｎ」および「ＣＢプロモーター」を表し；エレメント「（Ｇ４Ｓ）ｎ」は、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２およびＧ４Ｓから選択されるリンカーのコード配列（それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９）を表し；エレメント「ｈＧＨポリ（Ａ）」は、ヒト増殖因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列（配列番号３２）を表し；エレメント「Ｃｏ３．１ＨｕＮｂ２４」は、Ｎｂ２４ナノボディをコードするコドン最適化配列（配列番号４０）を表し；およびエレメント「ｈＩｇＧ１Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする配列（配列番号４２）を表す。以下の図で同じ名称のエレメントは、同じ配列を表す。
【図7】図７は、ウエスタンブロッティングによる１価Ｎｂ２４の発現の検出を示す。図７Ａはメンブレンの画像を示し、番号（１～１１）で示されたレーンは、それぞれ、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－ｎ（ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１）でトランスフェクトした細胞からの上清に相当する。レーン「Ｐ」は陽性対照であり、レーン「ｓｕｐ」は、非トランスフェクト細胞からの上清に相当する。図７Ｂは、「１」と定義するＮｂ２４－１１（配列番号１１を含んでなるプラスミド）の発現レベルに対して正規化したウエスタンブロッティングの定量値を示す。
【図8】図８は、ウエスタンブロッティングによる１価および２価Ｎｂ２４の発現の比較を示す。番号（１～８）で示されたレーンは、１価および２価Ｎｂ２４を発現するためのプラスミドでトランスフェクトした細胞からの上清に相当し、レーン「ｓｕｐ」は、非トランスフェクト細胞からの上清に相当する。・１で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ；・２または６で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｈＩｇＧ１Ｆｃ；・３で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｃｏ３．１Ｎｂ２４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ；・４で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｃｏ３．１Ｎｂ２４（ＩＬ２ シグナル）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ；・５で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４（ＩＬ２シグナル）－ＨＡ；・７で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－２；および・８で示されるレーン： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４。
【図9】図９は、様々な戦略で構築したプラスミドでの発現の、ウエスタンブロッティングによる検出を示す。レーンは以下のようなプラスミドに相当する。・レーン１および７： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ；・レーン２： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇ；・レーン３： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡ；・レーン４： ｐＣＢ１０８－５ＩＴＲ１３０－ＣＢＡ－ｐＣＩ－Ｎｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ；・レーン５： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ・レーン６： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ；・レーン８： ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５；および・レーン９： 陰性対照。
【図10】図１０は、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡ（レーン１）およびｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４、レーン２～５はそれぞれ構築物＃３６～３３）での発現の、ウエスタンブロッティングによる検出を示す。
【図11】図１１は、Ｎｂ２４の様々なバージョンの発現の検出を示す。「Ｆ１Ｆ３」で示されるレーンは、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖでトランスフェクトされた細胞に相当し；「Ｇ４Ｓ４」で示されるレーンは、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡでトランスフェクトされた細胞に相当し；「コドン３．１」で示されるレーンは、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉｇでトランスフェクトされた細胞に相当し；「ＣＢＡ－ＣＭＶ」で示されるレーンは、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡでトランスフェクトされた細胞に相当し；また「Ｎｂ２４－５」で示されるレーンは、プラスミドｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡでトランスフェクトされた細胞に相当する。
【図12】図１２は、ＶＥＧＦに対する抗体の結合を示す。図１２Ａで、「ＨｕＮｂ２４－５－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡにより発現された産物を表し、「Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖにより発現された産物を表し、ＯＤ５２５は、プレートのバックグラウンドを表す。図１２Ｂで、「ＣＭＶ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－ＨＡ－ＣＭＶ－ＡＭＤＦ１－Ｎｂ２４－５－ＨＡにより発現された産物を表し；「Ｇ４Ｓ４－Ｎｂ２４－５－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－５－ＨＡにより発現された産物を表し；「Ｎｂ２４－５－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡにより発現された産物を表し；「Ｆ１Ｆ３－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖにより発現された産物を表す。図１２Ｃで、プロット１～４は、それぞれｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）ｎ－Ｎｂ２４－５－ＨＡ（ｎ＝１～４）により発現された生成物を表し；プロット５は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡにより発現された産物を表し；またプロット６は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－４－ＨＡにより発現された産物を表す。図１２Ｄで、「Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖ－ＨＡ」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１－Ｂｅｏｖｕ－ｓｃＦｖにより発現された産物を表し；「Ｎｂ２４－５」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ｈｕＮｂ２４－５－ｈＧＨｐＡにより発現された産物を表し；「Ｎｂ２４－４－Ｇ４Ｓ４－Ｎｂ２４－７」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－４－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡにより発現された産物を表し；「Ｎｂ２４－７－Ｇ４Ｓ４－Ｎｂ２４－７」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）４－Ｎｂ２４－７－ＨＡにより発現された産物を表し；また「コドン３．１Ｎｂ２４－Ｇ４Ｓ４－コドン３．１Ｎｂ２４」は、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１ Ｂｉ－ｈｕＮｂ２４－ｐＣＤＮＡ３．１＋－ＨＡ＿ＩＬ２ｓｉにより発現された産物を表す。
【図17】図１７は、湿性ＡＭＤモデル（ダッチベルテッドウサギ）に投与したＡＡＶの効果を示す。蛍光の漏出がある領域は、網膜新血管新生の重症度を示す。図１７Ｄの左のパネルの動物は、７日目から下痢が見られていたため９日目に検査し、１１日目に死亡した。剖検では、他の病態生理学的変化は見られなかった。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0263】
ｒＡＡＶはまた、ｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－５－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－７－ＨＡおよびｐＧＣＢ１０８－ＩＴＲ１３０－ＡＭＤＦ１Ｎｂ２４－７－（Ｇ４Ｓ）２－Ｎｂ２４－５－ＨＡから選択される導入遺伝子プラスミドと、それぞれＡＡＶ２－７ｍ８およびＡＡＶ９から選択されるＣａｐポリペプチドをコードするパッケージングプラスミドを用いて作製した。得られたｒＡＡＶから単離したゲノムの変性電気泳動でも単一のバンドが示され、ホモゲノム、すなわち、有利なウイルス品質（所望のゲノム完全性）が示唆された。
【手続補正4】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロモーターに作動可能に連結された、配列番号４、５および７から選択される第１のヌクレオチド配列、ならびにリンカーを介して第１のヌクレオチド配列に連結された、配列番号１５、１６および１８から選択される第２のヌクレオチド配列を含んでなるコード配列を含んでなる発現カセットを含んでなるポリヌクレオチド構築物。
【請求項2】
前記リンカーが配列番号３７および３８から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項3】
前記プロモーターが配列番号２６～２７のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項4】
前記発現カセットがエンハンサーを含んでなる、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項5】
エンハンサーが第１のプロモーターの上流にある、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項6】
エンハンサーが、配列番号２５のヌクレオチド配列を含んでなるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーである、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項7】
前記発現カセットがコード配列の下流にポリアデニル化シグナル配列を含んでなる、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項8】
ポリアデニル化シグナル配列が配列番号３１および３２から選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項9】
前記発現カセットが、好ましくは第１のヌクレオチド配列の上流に、イントロンを含んでなる、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項10】
イントロンが少なくとも２００ヌクレオチド長である、請求項９に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項11】
イントロンが配列番号２８を含んでなる、請求項９に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項12】
前記構築物が組換えＡＡＶのゲノムを含んでなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項13】
構築物がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含んでなる、請求項１２に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項14】
５’および３’ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲ１３０および／またはＡＡＶ ＩＴＲ１０５である、請求項１３に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項15】
５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方がＡＡＶ ＩＴＲ１３０である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を含んでなるゲノムを含んでなる、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項17】
請求項１６に記載のｒＡＡＶを含んでなる医薬組成物。
【請求項18】
ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療する方法であって、請求項１６に記載のｒＡＡＶまたは請求項１７に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、方法。
【請求項19】
前記疾患がＷｅｔ－ＡＭＤである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ｒＡＡＶまたは医薬組成物が硝子体内注射により投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の構築物、または請求項１６に記載のｒＡＡＶを含んでなる宿主細胞。
【請求項22】
必要とする対象においてＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療するための薬剤の調製における、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物、請求項１６に記載のｒＡＡＶ、請求項１７に記載の医薬組成物、または請求項２１に記載の宿主細胞の使用。
【請求項23】
前記疾患がＷｅｔ－ＡＭＤである、請求項２２に記載の使用。
【請求項24】
前記薬剤が硝子体内注射により投与される、請求項２３に記載の使用。
【手続補正書】
【提出日】2024-08-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロモーターに作動可能に連結された、配列番号４、５および７から選択される第１のヌクレオチド配列、ならびにリンカーを介して第１のヌクレオチド配列に連結された、配列番号１５、１６および１８から選択される第２のヌクレオチド配列を含んでなるコード配列を含んでなる発現カセットを含んでなるポリヌクレオチド構築物。
【請求項2】
前記リンカーが配列番号３７および３８から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項3】
前記プロモーターが配列番号２６または２７のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項4】
前記発現カセットがエンハンサーを含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項5】
エンハンサーが第１のプロモーターの上流にある、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項6】
エンハンサーが、配列番号２５のヌクレオチド配列を含んでなるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーである、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項7】
前記発現カセットがコード配列の下流にポリアデニル化シグナル配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項8】
ポリアデニル化シグナル配列が配列番号３１および３２から選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項9】
前記発現カセットが、好ましくは第１のヌクレオチド配列の上流に、イントロンを含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項10】
イントロンが少なくとも２００ヌクレオチド長である、請求項９に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項11】
イントロンが配列番号２８を含んでなる、請求項９に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項12】
前記構築物が組換えＡＡＶのゲノムを含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項13】
構築物がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含んでなる、請求項１２に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項14】
５’および３’ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲ１３０および／またはＡＡＶ ＩＴＲ１０５である、請求項１３に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項15】
５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方がＡＡＶ ＩＴＲ１３０である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項16】
請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物を含んでなるゲノムを含んでなる、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項17】
請求項１６に記載のｒＡＡＶを含んでなる医薬組成物。
【請求項18】
ＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療する方法であって、請求項１６に記載のｒＡＡＶまたは請求項１７に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、方法。
【請求項19】
前記疾患がＷｅｔ－ＡＭＤである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ｒＡＡＶまたは医薬組成物が硝子体内注射により投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
請求項１に記載の構築物、または請求項１６に記載のｒＡＡＶを含んでなる宿主細胞。
【請求項22】
必要とする対象においてＶＥＧＦに関連する疾患を予防または治療するための薬剤の調製における、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物、請求項１６に記載のｒＡＡＶ、請求項１７に記載の医薬組成物、または請求項２１に記載の宿主細胞の使用。
【請求項23】
前記疾患がＷｅｔ－ＡＭＤである、請求項２２に記載の使用。
【請求項24】
前記薬剤が硝子体内注射により投与される、請求項２３に記載の使用。
【国際調査報告】