特表 2024-531800 抗体の不均一性を制御する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】抗体の不均一性を制御する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/08 20060101AFI20240822BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240822BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20240822BHJP

【ＦＩ】

C12P21/08

C07K16/00

C12P21/00 C

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024517181

(86)(22)【出願日】2022-09-20

(85)【翻訳文提出日】2024-05-16

(86)【国際出願番号】 US2022044066

(87)【国際公開番号】W WO2023044139

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】63/246,047

(32)【優先日】2021-09-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 一志

(72)【発明者】

【氏名】メロース、 フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ホウリハン、 ジョン

(72)【発明者】

【氏名】クロウリー、 ジョン

【テーマコード（参考）】

4B064

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064BJ12

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC01

4B064CC09

4B064CC12

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4H045AA11

4H045AA20

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、培養ｐＣＯ_２を制御することによって、細胞培養、特に哺乳動物細胞培養において産生される抗体などのＦｃ含有タンパク質の不均一性を制御するための方法、並びにこれらの方法によって産生される産物を提供する。とりわけ、本発明は、抗体産物中の酸性電荷バリアントのパーセンテージを低下させることを提供する。Ｆｃ部分を含むタンパク質としては、抗体及び抗体誘導体、並びにそれら両方の断片などのＦｃ含有タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

培養中の哺乳動物細胞によって産生される抗体産物における酸性電荷バリアントのパーセンテージを低減するための方法であって、前記方法が、
抗体を産生する哺乳動物細胞を培地に播種することと、
前記哺乳動物細胞が、ｐＣＯ_２条件なしで得られるよりも少ない酸性酸バリアントを有する抗体産物を産生することを可能にする前記ｐＣＯ_２条件下で前記細胞を培養することであって、前記ｐＣＯ_２条件が、前記培地中の１２０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇのＣＯ_２である、培養することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記ｐＣＯ_２条件が、スパージングによって達成される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ｐＣＯ_２条件が、ＣＯ_２スパージングによって達成される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ｐＣＯ_２条件下で産生される前記抗体が、前記ｐＣＯ_２条件なしで得られるものよりも０．５％～４％少ない酸性バリアントを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記抗体が、ＰＤ－１因子に結合することができる、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記抗体が、ＩＬ－４受容体に結合することができる、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記抗体が、ヒトモノクローナル抗体である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記抗体が、ヒトモノクローナル抗体であり、ＩｇＧ抗体である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ４抗体である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記細胞が、１０～１５日間培養される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

培養中の哺乳動物細胞によって産生される抗体における不均一性を制御する方法であって、前記方法が、
抗体を産生する哺乳動物細胞を培地に播種することと、
前記哺乳動物細胞が抗体を産生することを可能にするｐＣＯ_２条件下で前記細胞を培養することであって、前記細胞によって産生される抗体の主ピーク形態が、全抗体の３８％～６５％を占め、前記抗体の前記酸性バリアントが、全抗体の２０％～４７％を占め、前記抗体の塩基性バリアントが、全抗体の最大３６％を占める、培養することと、を含む、方法。

【請求項14】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記モノクローナル抗体が、ＰＤ－１因子に結合することができる、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記抗体が、ＩＬ－４受容体に結合することができる、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

前記ヒトモノクローナル抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ４抗体である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

培養中の哺乳動物細胞によって産生される抗体、抗体誘導体又は抗体断片における不均一性を制御する方法であって、前記方法が、
抗体、抗体誘導体又は抗体断片を産生する哺乳動物細胞を培地に播種することと、
前記哺乳動物細胞が抗体、抗体誘導体又は抗体断片を産生することを可能にするｐＣＯ_２条件下で前記細胞を培養することであって、前記細胞によって産生される抗体、抗体誘導体又は抗体断片の主ピーク形態が、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の５０％～７０％を占め、前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の酸性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の２０％～４７％を占め、前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の塩基性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の最大１５％を占める、培養することと、を含む、方法。

【請求項21】

前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記塩基性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の最大１０％を占める、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記塩基性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の最大８％を占める、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記塩基性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の最大６％を占める、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記細胞によって産生される抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記主ピーク形態が、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の５０％～６５％を占め、前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記酸性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の２３％～４６％を占める、請求項２０に記載の方法。

【請求項25】

前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記酸性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の２３％～３９％を占める、請求項２０に記載の方法。

【請求項26】

前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記酸性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の３１％～４６％を占める、請求項２０に記載の方法。

【請求項27】

非グリコシル化重鎖を有する抗体のパーセンテージが、５～７％である、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記哺乳動物細胞が、ヒトモノクローナル抗体を産生する、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ヒトモノクローナル抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ４抗体である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ｐＣＯ_２条件が、前記培養中に３０ｍｍＨｇ～２１０ｍｍＨｇである、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記ｐＣＯ_２条件が、ＣＯ_２スパージングを使用して維持される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

ｐＣＯ_２が、ＣＯ_２電極を使用して測定される、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項２０～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

先行請求項のいずれか一項に記載の方法によって産生される、抗体産物。

【請求項36】

先行請求項のいずれか一項に記載の方法によって産生される、抗体誘導体産物。

【請求項37】

先行請求項のいずれか一項に記載の方法によって産生される、抗体断片産物。

【請求項38】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法によって産生される、抗体産物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年９月２０日に出願された米国特許出願第６３／２４６，０４７号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。

【0002】

本発明は、細胞培養、特に哺乳動物細胞培養において産生されるＦｃ含有タンパク質の不均一性を制御するための方法、並びにこれらの方法によって産生されるタンパク質産物及びタンパク質を提供する。Ｆｃ部分を含むタンパク質としては、抗体などのＦｃ含有タンパク質が挙げられる。

【背景技術】

【0003】

細胞培養における抗体などのＦｃ含有タンパク質の産生は、電荷バリアントをもたらすことができ、これらは、酸性バリアント及び塩基性バリアントと呼ばれる２つのタイプになる。加えて、主ピーク形態がある。Ｆｃは、自然界において見出される抗体重鎖において見出される定常領域であり、例えば、モノクローナル抗体にも含まれる「結晶化可能な断片」を指す。

【0004】

酸性バリアントは、典型的には、抗体中の塩基性バリアントよりも一般的であり、脱アミド化、シアリル化、糖化及び断片化をもたらす可能性があり、これは、Ｆｃ部分（抗体の断片結晶化可能領域からの部分）を含むタンパク質の安定性、活性及び効力を変化させる。Ｓｉｓｓｏｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４６：１１６７－７８（２０１９）。塩基性バリアントは、抗体のＦｃ受容体への結合の増加を引き起こし得る。Ｈｉｎｔｅｒｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡＢＳ ８：１４５８－６０（２０１６）。

【0005】

Ｆｃグリカンは、安全性、生体活性、薬力学及び薬物動態においても役割を果たす。Ｒｅｕｓｃｈ ａｎｄ Ｔｅｊａｄａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．２５：１３２５－３４（２０１５）。生じ得る現象は、非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）として知られる。ＮＧＨＣ変動は、オプソニン化などのエフェクター機能を変化させることができる。オプソニン化は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）、ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞食作用）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）に関与するＦｃ部分に関係する。ＮＧＨＣ変動は、いくつかの文脈（疾患状態、投与経路及びＦｃ含有タンパク質の種類に応じて）では懸念され得、他の文脈ではそれほど重要ではない。

【0006】

そのため、Ｆｃ部分を含むタンパク質における電荷変動及び／又はＮＧＨＣを制御する必要がある。しかしながら、これは、以下でより詳細に考察されるように、一方の最適化が、常にではないが、他方にとっておそらくより不利な状態につながり得る状況を生み出す可能性がある。抗体中の酸性電荷バリアントの影響により、通常、そのようなバリアントの発生を低減することが望まれる。最終的に、電荷変動は、いくつかの文脈（疾患状態、投与経路及びＦｃ含有タンパク質の種類に応じて）では懸念され得、他の文脈ではそれほど重要ではない。以下に記載される発明は、この必要性及び他の必要性に対処する。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、培養中の哺乳動物細胞によって産生される抗体などのＦｃ含有タンパク質における不均一性を制御する方法を提供する。本方法は、Ｆｃ含有タンパク質を産生する哺乳動物細胞を培地に播種することと、哺乳動物細胞がＦｃ含有タンパク質を産生することを可能にするｐＣＯ_２条件下で細胞を培養することと、を含み得る。好ましくは、ＣＯ_２スパージングを使用して、培養物中のｐＣＯ_２を増加させる。別のアプローチは、ｐＣＯ_２を蓄積させ、空気スパージングで制御されることを可能にすることである。バイオリアクター内の圧力低下を使用して、ｐＣＯ_２を制御することもできる。ＣＯ_２スパージング、空気／窒素スパージング及び圧力低下の組み合わせを用いることができる。電荷バリアントは、主にＦｃ領域における変化に起因する。

【0008】

当業者の目的に応じて、本明細書に含まれる教示を考慮して、ＣＯ_２スパージング、空気／窒素スパージング及び圧力低下の組み合わせを用いることができる。

【0009】

本発明はまた、培養中の哺乳動物細胞によって産生される抗体などのＦｃ含有タンパク質産物における酸性電荷バリアントのパーセンテージを制御する、好ましくは低減するための方法を提供し、本方法は、Ｆｃ含有タンパク質を産生する哺乳動物細胞を培地に播種することと、哺乳動物細胞が、ｐＣＯ_２条件なしで得られるよりも少ない酸性酸バリアントを有するＦｃ含有タンパク質産物を産生することを可能にするｐＣＯ_２条件下で細胞を培養することと、を含み、ｐＣＯ_２条件は、例えば、培地中で１２０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇのＣＯ_２であるか、又はそうでなければ本明細書に開示されるとおりである。ｐＣＯ_２条件は、ＣＯ_２スパージングなどのスパージングによって達成することができる。電荷バリアントは、Ｆｃ領域における変化によって引き起こされ得る。ｐＣＯ_２条件下で産生されるＦｃ含有タンパク質は、例えば、ｐＣＯ_２条件なしで得られるよりも０．５％～４％少ない酸性バリアントを有することができる。Ｆｃ含有タンパク質は、ＰＤ－１因子又はＩＬ－４受容体に結合することができる抗体などの抗体であり得る。好ましくは、抗体は、ヒトモノクローナル抗体、好ましくは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４などのサブクラスを含むＩｇＧ抗体である。哺乳動物細胞は、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ヒト羊水、Ｐｅｒ．Ｃ６及びＳｐ２／０細胞であり得る。細胞は、本明細書に開示される様々なｐＣＯ_２条件下で１０～１５日間、好ましくは約１４日間培養することができる。

【0010】

本発明は更に、抗体などのＦｃ含有タンパク質を産生する哺乳動物細胞を培地に播種することと、哺乳動物細胞がＦｃ含有タンパク質を産生することを可能にするｐＣＯ_２条件下で細胞を培養することと、を含む方法を提供し、細胞によって産生されるＦｃ含有タンパク質の主ピーク形態は、全Ｆｃ含有タンパク質の約３８％～約６５％を含み、Ｆｃ含有タンパク質の酸性バリアントは、全Ｆｃ含有タンパク質の約２０％～約４７％を含み、Ｆｃ含有タンパク質の塩基性バリアントは、抗体、誘導体、及びそれら両方の断片であり得る全Ｆｃ含有タンパク質の最大約３６％を含む。細胞は、約１０～１５日間、好ましくは約１４日間培養することができる。ｐＣＯ_２条件は、培養中に約３０ｍｍＨｇ～約２１０ｍｍＨｇ、５０ｍｍＨｇ～２００ｍｍＨｇ、６０ｍｍＨｇ～１９０ｍｍＨｇ、７０ｍｍＨｇ～１８０ｍｍＨｇ、８０ｍｍＨｇ～１７０ｍｍＨｇ、９０ｍｍＨｇ～１６０ｍｍＨｇ、１００ｍｍＨｇ～１５０ｍｍＨｇ、１１０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇ、１２０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇ、１２０ｍｍＨｇ～１３０ｍｍＨｇ、又はこれらの範囲内の任意の値とすることができ、好ましくはＣＯ_２スパージングによって維持され、ＣＯ_２電極を使用して測定することができる。細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ヒト羊水、Ｐｅｒ．Ｃ６及びＳｐ２／０細胞を含む、任意の好適な哺乳動物細胞であり得る。

【0011】

Ｆｃ含有タンパク質は、ＰＤ－１因子又はＩＬ－４受容体に結合することができる抗体などの抗体であり得る。好ましくは、抗体は、ヒトモノクローナル抗体、好ましくは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４などのサブクラスを含む全てのＩｇＧ抗体である。

【0012】

本発明はまた、培養中の哺乳動物細胞によって産生される抗体、抗体誘導体又は抗体断片の不均一性を、抗体、抗体誘導体又は抗体断片を産生する哺乳動物細胞を培地に播種することによって制御する方法、並びに哺乳動物細胞が抗体、抗体誘導体又は抗体断片を産生することを可能にするｐＣＯ_２条件下で細胞を培養する方法を提供し、細胞によって産生される抗体、抗体誘導体又は抗体断片の主ピーク形態は、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の約５０％～約７０％を占め、抗体、抗体誘導体又は抗体断片の酸性バリアントは、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の約２０％～約４７％を占め、抗体、抗体誘導体又は抗体断片の塩基性バリアントは、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の最大約１５％を占める。抗体、抗体誘導体又は抗体断片の塩基性バリアントは、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の最大約６％、約８％又は約１０％、好ましくは約１５％以下を占めることができる。細胞によって産生される抗体、抗体誘導体又は抗体断片の主ピーク形態は、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の約５０％～約６５％を占めることができ、抗体、抗体誘導体又は抗体断片の酸性バリアントは、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の約２３％～約４６％、約２３％～約３９％又は約３１％～約４６％を占める。例えば、非グリコシル化重鎖を有する抗体などのＦｃ含有タンパク質のパーセンテージは、約５～約７％を含み、他の範囲が本明細書に提供される。細胞は、約１０～１５日間、好ましくは約１４日間培養することができる。ｐＣＯ_２条件は、培養中に約３０ｍｍＨｇ～約２１０ｍｍＨｇ、５０ｍｍＨｇ～２００ｍｍＨｇ、６０ｍｍＨｇ～１９０ｍｍＨｇ、７０ｍｍＨｇ～１８０ｍｍＨｇ、８０ｍｍＨｇ～１７０ｍｍＨｇ、９０ｍｍＨｇ～１６０ｍｍＨｇ、１００ｍｍＨｇ～１５０ｍｍＨｇ、１１０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇ、１２０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇ、１２０ｍｍＨｇ～１３０ｍｍＨｇ、又はこれらの範囲内の任意の値とすることができ、好ましくはＣＯ_２スパージングによって維持され、ＣＯ_２電極を使用して測定することができる。本明細書に含まれる教示を考慮して当業者によって決定されるように、ｐＣＯ_２は、ＣＯ_２スパージング、空気若しくは他のスパージング、及び／又はバイオリアクター圧力を変動させることによって、培養プロセス中に変化させることができる。

【0013】

細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ヒト羊水、Ｐｅｒ．Ｃ６及びＳｐ２／０細胞を含む、任意の好適な哺乳動物細胞であり得る。それによって産生される抗体、抗体誘導体及び抗体断片などのＦｃ含有タンパク質は、本明細書に提供される発明である。

【0014】

Ｆｃ含有タンパク質は、ＰＤ－１因子又はＩＬ－４受容体に結合することができる抗体などの抗体であり得る。好ましくは、抗体は、ヒトモノクローナル抗体、好ましくは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４などのサブクラスを含む全てのＩｇＧ抗体である。

【0015】

典型的には、本明細書に含まれる本発明の教示に従って産生される抗体などのＦｃ含有タンパク質は、全Ｆｃ含有タンパク質の２０％～５０％、より具体的には、２０％～４７％、２３％～４５％、２５％～４０％、２８％～３７％、２８％～３５％、２９％～３４％、３０％～３３％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値を構成する酸性電荷バリアントを有する。Ｆｃ含有タンパク質は、全Ｆｃ含有タンパク質の３８％～７０％、より具体的には４５％～７０％、５０％～６５％、５５％～６０％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値を構成する主ピーク形態を有する。Ｆｃ含有タンパク質は、全Ｆｃ含有タンパク質の１％～４０％、より具体的には２％～３５％、３％～３０％、４％～２５％、５％～２０％、６％～１５％、７％～１２％、７．５％～１０％、８％～９％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値を構成する塩基性電荷バリアントを有する。

【0016】

産物全体の酸性電荷バリアント画分は、本発明に従って、０．１％～１０％の範囲、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値だけ制御する、好ましくは低減することができる。例えば、表１を参照されたい。より具体的には、酸性バリアント画分は、０．２％～９％、０．３％～８％、０．４％～７％、０．５％～６％、０．６％～５％、０．７％～４．７５％、０．７５％～４．５％、０．８％～４．２５％。０．９％～４％、１％～３．７５％。１％～３．５％、１％～３．２５％、１％～３％、１％～２．７５％、１．２５％～２．５％、１．２５％～２．２５％、１．２５％～２％、１．５％～２％、１．５％～１．７５％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値だけ低下させることができる。更に、他の範囲には、０．１％～４％、０．２５％～４％、０．２５％～３．７５％、０．２５％～３．５％、０．２５％～３％、０．２５％～２．７５％、０．２５％～２．５％、０．２５％～２．２５％、０．２５％～２％、０．２５％～１．７５％、０．２５％～１．５％、０．２５％～１．２５％、０．２５％～１％、０．２５％～０．７５％。０．２５％～０．５％、０．５％～４％、０．５％～３．７５％、０．５％～３．５％、０．５％～３％、０．５％～２．７５％、０．５％～２．５％、０．５％～２．２５％、０．５％～２％、０．５％～１．７５％、０．５％～１．５％、０．５％～１．２５％、０．５％～１％、０．５％～０．７５％、０．７５％～４％、０．７５％～３．７５％、０．７５％～３．５％、０．７５％～３％、０．７５％～２．７５％、０．７５％～２．５％、０．７５％～２．２５％、０．７５％～２％、０．７５％～１．７５％、０．７５％～１．５％、０．７５％～１．２５％、０．７５％～１％、１％～４％、１％～３．７５％、１％～３．５％、１％～３％、１％～２．７５％、１％～２．５％、１％～２．２５％、１％～２％、１％～１．７５％、１％～１．５％、１％～１．２５％、１．２５％～４％、１．２５％～３．７５％、１．２５％～３．５％、１．２５％～３％、１．２５％～２．７５％、１．２５％～２．５％、１．２５％～２．２５％、１．２５％～２％、１．２５％～１．７５％、１．２５％～１．５％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値が含まれる。例えば、酸性電荷バリアント画分は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％。１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％以上、例えば、最大５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％以上変化させる、好ましくは、低下させることができる。

【0017】

産物全体の塩基性電荷バリアント画分は、本発明に従って、０．１％～１５％の範囲、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値だけ制御することができる。より具体的には、塩基性電荷バリアント画分は、０．１％～１４％、０．１％～１３％、０．１％～１２％、０．１％～１１％、０．２％～１０％、０．２％～９％、０．３％～８％、０．４％～７％、０．５％～６％、０．６％～５％、０．７％～４．７５％、０．７５％～４．５％、０．８％～４．２５％。０．９％～４％、１％～３．７５％。１％～３．５％、１％～３．２５％、１％～３％、１％～２．７５％、１％～２．７５％、１．２５％～２．５％、１．２５％～２．２５％、１．２５％～２％、１．５％～２％、１．５％～１．７５％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値だけ変化させることができる。更に、他の範囲には、０．１％～４％、０．２５％～４％、０．２５％～３．７５％、０．２５％～３．５％、０．２５％～３％、０．２５％～２．７５％、０．２５％～２．５％、０．２５％～２．２５％、０．２５％～２％、０．２５％～１．７５％、０．２５％～１．５％、０．２５％～１．２５％、０．２５％～１％、０．２５％～０．７５％。０．２５％～０．５％、０．５％～４％、０．５％～３．７５％、０．５％～３．５％、０．５％～３％、０．５％～２．７５％、０．５％～２．５％、０．５％～２．２５％、０．５％～２％、０．５％～１．７５％、０．５％～１．５％、０．５％～１．２５％、０．５％～１％、０．５％～０．７５％、０．７５％～４％、０．７５％～３．７５％、０．７５％～３．５％、０．７５％～３％、０．７５％～２．７５％、０．７５％～２．５％、０．７５％～２．２５％、０．７５％～２％、０．７５％～１．７５％、０．７５％～１．５％、０．７５％～１．２５％、０．７５％～１％、１％～４％、１％～３．７５％、１％～３．５％、１％～３％、１％～２．７５％、１％～２．５％、１％～２．２５％、１％～２％、１％～１．７５％、１％～１．５％、１％～１．２５％、１．２５％～４％、１．２５％～３．７５％、１．２５％～３．５％、１．２５％～３％、１．２５％～２．７５％、１．２５％～２．５％、１．２５％～２．２５％、１．２５％～２％、１．２５％～１．７５％、１．２５％～１．５％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値が含まれる。塩基性電荷バリアント画分は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％。１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％以上、例えば、最大５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％以上変化させることができる。

【0018】

本明細書に含まれる本発明の教示に従って産生される抗体などのＦｃ含有タンパク質は、典型的には、全Ｆｃ含有タンパク質の３％～８％、より具体的には、４％～７％、５％～７％、及び５％～６．５％、５％～６％、５％～５．７５％、５％～５．５％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値で存在する非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）のパーセンテージを有する。

【0019】

本発明の方法によって産生される抗体などのＦｃ含有タンパク質、並びにＦｃ含有タンパク質の誘導体及び断片もまた、本明細書に提供される本発明の一部である。抗体としては、ＰＤ－１因子に結合することができる抗体及びインターロイキン４受容体に結合することができる抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】実施例１及び３のｐＣＯ_２レベルを示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図2】実施例２及び４のｐＣＯ_２レベルを示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図3】表６に示される空気スペアリング及びｐＨ条件での２リットルバイオリアクターの産生日中の予測ｐＨレベルを示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図4】実際の領域１（％）（ｙ軸）及び予測される領域１（％）（ｘ軸）を示す。領域１は、酸性電荷バリアントについてのものである。

【図5】図４のデータの適合性の要約、分散分析及びパラメータ推定について設定する。

【図6】実際の領域２（％）（ｙ軸）及び予測される領域２（％）（ｘ軸）を示す。領域２は、主ピーク形態についてのものである。

【図7】図６のデータの適合性の要約、分散分析及びパラメータ推定について設定する。

【図8】実際の領域３（％）（ｙ軸）及び予測される領域３（％）（ｘ軸）を示す。領域３は、塩基性電荷バリアントについてのものである。

【図9】図８のデータの適合性の要約、分散分析及びパラメータ推定について設定する。

【図10】実際のＮＧＨＣ（ｙ軸）及び予測されるＮＧＨＣ（ｘ軸）を示す。

【図11】図１０のデータの適合性の要約、分散分析及びパラメータ推定について設定する。

【図12】プロセス時間（日）にわたる生細胞密度値を示す。ｙ軸は、最大３５０×１０^５細胞／ｍｌの値を有する。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図13】プロセス時間（日）にわたる細胞生存率パーセンテージを示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図14】プロセス時間（日）にわたるｐＨ値を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図15】プロセス時間（日）にわたるｐＣＯ_２値を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図16】プロセス時間（日）にわたるグルコース値を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図17】プロセス時間（日）にわたるカリウム値を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図18】プロセス時間（日）にわたるナトリウム値を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図19】プロセス時間（日）にわたる浸透圧値を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図20】プロセス時間（日）にわたるグルタメート値を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図21】プロセス時間（日）にわたるラクテート値を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図22】プロセス時間（日）にわたるアンモニア値を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図23】プロセス時間（日）にわたるグルタミン値を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。

【図24】実施例６からのプロセス時間（日）にわたるｍｍＨｇでのｐＣＯ_２（ｙ軸）を示す。中程度のｐＣＯ_２を中間点対照として選択した。ＴＥＭＰは、本明細書に記載される細胞の生理学的温度を指す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、これらの発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。

【0022】

定義
数値及び範囲の文脈における「約」という用語は、本明細書に含まれる教示から明らかであるように、本発明が、例えば、求められた速度、量、密度、程度、増加、減少、パーセンテージ、形態の値若しくは存在、バリアント、温度又は時間の量を有して実施することができるように、列挙された値若しくは範囲に近似するか、又はそれらに近い値若しくは範囲を指す。したがって、この用語は、単に系統誤差から生じる値を超えた値を包含する。例えば、「約」は、実施する能力に応じて、およそ＋／－１０％以上又はそれ以下の範囲の記載された値を上回るか下回るかのいずれかの値を示すことができる。

【0023】

「抗体」（「免疫グロブリン」とも称される）は、複数のポリペプチド鎖及び広範な翻訳後修飾を有するタンパク質の例である。正準免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＧ）は、４つのポリペプチド鎖－２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む。各軽鎖は、システインジスルフィド結合を介して１つの重鎖に連結し、２つの重鎖は、２つのシステインジスルフィド結合を介して互いに結合している。哺乳動物系において産生される免疫グロブリンはまた、様々な多糖によって様々な残基（例えば、アスパラギン残基）においてグリコシル化され、種によって異なり得、これは治療用抗体の抗原性に影響を及ぼし得る。Ｂｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｓｐｅａｒｍａｎ，“Ｔｈｅ ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３０：１０７－１１２（２０１４）。

【0024】

抗体は、しばしば、治療用生体分子として使用される。抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖で構成される免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される（重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と略され得、軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲｌ、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と略され得る）。「高親和性」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）又は溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定されるとき、少なくとも１０^－９Ｍ、少なくとも１０^－１０Ｍ、少なくとも１０^－１１Ｍ、又は少なくとも１０^－１２Ｍのそれらの標的に対する結合親和性を有する抗体を指す。

【0025】

「酸性電荷バリアント」は、Ｆｃ含有タンパク質（例えば、抗体）バリアントであって、Ｆｃ含有タンパク質の主ピーク形態よりも低いｐＩを有するバリアントである。酸性電荷バリアントは、より多くの負電荷を有する傾向がある。

【0026】

「塩基性電荷バリアント」は、Ｆｃ含有タンパク質（例えば、抗体）バリアントであって、Ｆｃ含有タンパク質の主ピーク形態よりも高いｐＩを有するバリアントである。塩基性電荷バリアントは、より多くの正の電荷又はより少ない負の電荷を有する傾向がある。

【0027】

Ｆｃ含有タンパク質（例えば、抗体）の「主ピーク形態」は、Ｆｃ含有タンパク質の優勢形態であり、酸性電荷バリアントと塩基性電荷バリアントとの間にｐＩを有する。

【0028】

「二重特異性抗体」という語句は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は一般に、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば、抗原）上、又は同じ分子上（例えば、同じ抗原上）のいずれかで異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープと第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は一般に、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性よりも少なくとも１～２桁、３桁又は４桁低くなり、また、その逆も同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じ標的上に存在することも、異なる標的上に存在することもできる（例えば、同じタンパク質上又は異なるタンパク質上）。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合することができ、そのような配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞内で発現させることができる。典型的な二重特異性抗体は、各々３つの重鎖ＣＤＲ、次いで（Ｎ末端からＣ末端まで）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有する２つの重鎖と、抗原結合特異性を与えないが各重鎖と会合することができる、又は各重鎖と会合することができ、重鎖抗原結合領域によって結合されるエピトープのうちの１つ以上に結合することができる、又は各重鎖と会合することができ、一方若しくは両方の重鎖を一方若しくは両方のエピトープに結合させることができる、免疫グロブリン軽鎖とを有する。

【0029】

「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」という語句は、任意の生物からの免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含み、別途指定されない限り、重鎖可変ドメインを含む。重鎖可変ドメインは、別途指定されない限り、３つの重鎖ＣＤＲ及び４つのＦＲ領域を含む。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲ及びＦＲ、並びにそれらの組み合わせが含まれる。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端まで）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片は、抗原を特異的に認識することができ（例えば、マイクロモル、ナノモル、又はピコモル範囲のＫＤで抗原を認識する）、細胞から発現及び分泌することができ、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片を含む。

【0030】

「軽鎖」という語句は、任意の生物からの免疫グロブリン軽鎖定常領域配列を含み、別途指定されない限り、ヒトカッパ及びラムダ軽鎖を含む。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、典型的に、別途指定されない限り、３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。一般に、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＶＬドメイン、及び軽鎖定常ドメインを含む。これらの発明で使用することができる軽鎖としては、例えば、抗原結合タンパク質によって選択的に結合される第１又は第２の抗原のいずれにも選択的に結合しない軽鎖が挙げられる。好適な軽鎖としては、既存の抗体ライブラリ（ウェットライブラリ又はインシリコ）において最も一般的に用いられる軽鎖についてスクリーニングすることによって特定することができるものが挙げられ、軽鎖は、抗原結合タンパク質の抗原結合ドメインの親和性及び／又は選択性に実質的に干渉しない。好適な軽鎖としては、抗原結合タンパク質の抗原結合領域によって結合される一方又は両方のエピトープに結合することができるものが挙げられる。

【0031】

「可変ドメイン」という語句は、Ｎ末端からＣ末端までの配列に（別途示されない限り）、以下のアミノ酸領域を含む、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列（所望のとおり修飾される）を含む：ＦＲｌ、ＣＤＲｌ、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「可変ドメイン」は、ベータシートが第１のベータシートの残基と第２のベータシートの残基との間のジスルフィド結合によって接続される、二重ベータシート構造を有する正準ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）に折り畳むことができるアミノ酸配列を含む。

【0032】

「相補性決定領域」という語句又は「ＣＤＲ」という用語は、通常（すなわち、野生型生物において）、免疫グロブリン分子（例えば、抗体又はＴ細胞受容体）の軽鎖又は重鎖の可変領域における２つのフレームワーク領域の間に現れる、生物の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系列配列、あるいは、例えば、ナイーブ又は成熟Ｂ細胞若しくはＴ細胞によって、再配列されたか又は再配列されていない配列によってコードすることができる。いくつかの状況において（例えば、ＣＤＲ３の場合）、ＣＤＲは、隣接していない（例えば、再配列されていない核酸配列において）が、Ｂ細胞核酸配列において、例えば、配列のスプライシング又は接続の結果（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するＶ－Ｄ－Ｊ組換え）として隣接している、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）によってコードすることができる。

【0033】

「抗体誘導体及び断片」としては、抗体断片（例えば、ＳｃＦｖ－Ｆｃ、ｄＡＢ－Ｆｃ、半抗体）、多重特異性（例えば、ＩｇＧ－ＳｃＦｖ、ＩｇＧ－ｄａｂ、ＳｃＦＶ－Ｆｃ－ＳｃＦＶ、三重特異性）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0034】

「Ｆｃ含有タンパク質」という語句は、抗体、二重特異性抗体、Ｆｃを含有する抗体誘導体、Ｆｃを含有する抗体断片、Ｆｃ融合タンパク質、イムノアドヘシン、並びに免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも機能的部分を含む他の結合タンパク質を含む。「機能的部分」は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃｙＲ、又はＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に結合することができ、かつ／又は補体の活性化に関与することができる、ＣＨ２及びＣＨ３領域を指す。ＣＨ２領域及びＣＨ３領域が、それを任意のＦｃ受容体に結合できないようにし、また補体を活性化できないようにする、欠失、置換、及び／若しくは挿入又は他の修飾を含む場合、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域は機能的ではない。Ｆｃ融合タンパク質としては、例えば、Ｆｃ融合（Ｎ末端）、Ｆｃ融合（Ｃ末端）、単一Ｆｃ融合及び二重特異性Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。

【0035】

「Ｆｃ」は、結晶化可能な断片を表し、しばしば、断片定数と称される。抗体は、２つの同一のタンパク質配列で形成されるＦｃ領域を含む。ＩｇＧは、γ鎖として知られる重鎖を有する。ＩｇＡは、α鎖として知られる重鎖を有し、ＩｇＭは、μ鎖として知られる重鎖を有する。ＩｇＤは、σ鎖として知られる重鎖を有する。ＩｇＥは、ε鎖として知られる重鎖を有する。自然界では、Ｆｃ領域は、同じ種における所与のクラス及びサブクラスの全ての抗体で同じである。ヒトＩｇＧは、４つのサブクラスを有し、サブクラス間で約９５％の相同性を共有する。各サブクラスでは、Ｆｃ配列は同じである。例えば、ヒトＩｇＧ１抗体は、同じＦｃ配列を有する。同様に、ＩｇＧ２抗体は、同じＦｃ配列を有し、ＩｇＧ３抗体は、同じＦｃ配列を有し、ＩｇＧ４抗体は、同じＦｃ配列を有する。Ｆｃ領域における変化は、電荷変動を生じる。

【0036】

Ｆｃ含有タンパク質、例えば抗体は、免疫グロブリンドメインに修飾を含むことができ、修飾が結合タンパク質の１つ以上のエフェクター機能に影響を与える場合（例えば、ＦｃｙＲ結合、ＦｃＲｎ結合、したがって半減期、及び／又はＣＤＣ活性に影響を与える修飾）を含む。そのような修飾としては、免疫グロブリン定常領域のＥＵ付番を参照して、以下の修飾及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない：２３８、２３９、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１５、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８、及び４３９。

【0037】

例えば、限定によるものではなく、結合タンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質（例えば、抗体）であり、増強された血清半減期を呈し（列挙された修飾（複数可）を有しない同じＦｃ含有タンパク質と比較して）、２５０位（例えば、Ｅ又はＱ）、２５０位及び４２８位（例えば、Ｌ又はＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ又はＴ）、２５４位（例えば、Ｓ又はＴ）、及び２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ又はＴ）における修飾、あるいは４２８位及び／又は４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／ＳＩ／Ｐ／Ｑ若しくはＫ）及び／又は４３４位（例えば、Ｈ／Ｆ若しくはＹ）における修飾、あるいは２５０位及び／又は４２８位における修飾、あるいは３０７位又は３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）及び４３４位における修飾を有する。別の例では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）修飾及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾、４２８Ｌ修飾、２５９１（例えば、Ｖ２５９Ｉ）修飾、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）修飾及び４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾、２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）修飾、２５０Ｑ修飾及び４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）、３０７修飾及び／又は３０８修飾（例えば、３０８Ｆ又は３０８Ｐ）を含むことができる。

【0038】

「培養培地（培地）」は水性であり、培養中の細胞、例えば、バイオリアクターにおいて培養中の細胞の増殖及びタンパク質の産生をサポートするために必要なミネラル、緩衝塩、栄養素及び他の添加剤を含む。

【0039】

「ピーク生細胞密度」又は「ピークＶＣＤ」は、培養中の細胞のピーク密度を指す。図１２を参照されたい。

【0040】

「スパージング」とは、培養培地にガスを圧送することを指す。ガスは、ＣＯ_２、空気又は他のガスであり得る。ＣＯ_２スパージングは、ｐＣＯ_２を増加させる。空気スパージング及び窒素スパージングは、ｐＣＯ_２を減少させる。スパージング速度は、バイオリアクターのサイズに基づいて決定され、速度は、典型的には、小型バイオリアクターにおいて立方センチメートル／分（ｃｃｍ）で測定される。商業的生産に利用される大型バイオリアクター（典型的には１，０００～１０，０００リットル）では、スパージング速度は、標準リットル／分（ｓｌｐｍ）で測定される。

【0041】

「タンパク質産物」は、Ｆｃ含有タンパク質（例えば、抗体）などの目的のタンパク質を指す。タンパク質産物は、培養中の細胞、通常は操作された哺乳動物細胞によって産生され得る。典型的には、培養中の細胞、例えば、バイオリアクターにおいて培養中の細胞は、目的のタンパク質を産生し、それらのタンパク質は、タンパク質産物になる。タンパク質産物は、後に精製、特性評価、滅菌、製剤化、及び濃縮又は凍結乾燥などの他の仕上げステップ、及び最終的に完成したタンパク質産物を形成するためのパッケージングに供することができる。タンパク質産物には、製剤原薬（ＦＤＳ）が含まれる。

【0042】

本明細書に示される全ての数値的限界及び範囲は、当該範囲又は限界の数値の周辺又はその間の全ての数値又は値を含む。本明細書に記載される範囲及び限界は、範囲又は限界によって定義され、包含される全ての整数、小数、及び分数値を明示的に表し、記載する。

【0043】

詳細な説明
抗体電荷バリアントには、酸性バリアント及び塩基性バリアントが含まれる。電荷バリアントは、抗体上の正味の負電荷を増加させる脱アミド化及びシアリル化を含む酵素修飾によって引き起こされ得、これがｐＩ値を減少させ、酸性バリアントを形成する。更に、Ｃ末端からのリジン切断は、正味の正電荷の喪失を引き起こし、酸性バリアントの形成につながる。
酸性バリアントはまた、グルコース又はラクトースがリジン残基の一級アミンと反応する糖化のような共有結合部分の作製によっても生じ得る。塩基性バリアントの形成は、Ｃ末端リジン若しくはグリシンアミド化、スクシンイミド形成、アミノ酸酸化、又はシアル酸の除去の存在によって引き起こされる。これらは、正電荷の追加又は負電荷の排除を提供し、それによってｐＩ値を増加させる。Ｋｈａｗｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２：６，６１３－６２４（２０１０）を参照されたい。

【0044】

本発明は、哺乳動物細胞培養において産生されるタンパク質及びグリコシル化バリアントの電荷バリアント（酸性及び塩基性）の集団を制御するためのアプローチを提供する。実施形態は、抗体並びにその断片及び誘導体を含む、Ｆｃ含有タンパク質の産生を含む。本発明は、産生中に培地の二酸化炭素濃度（ｐＣＯ_２）を選択することによって、この制御を可能にする。ＮＧＨＣはまた、ｐＨを介して制御することもできる。

【0045】

本明細書で教示されるｐＣＯ_２レベルとは別に、標準的な条件及び培地を用いてもよい。典型的には、細胞は、約３６℃～３８℃、好ましくは３６℃～３７℃の温度などの生理学的条件下で培養される。

【0046】

典型的には、本明細書に含まれる本発明の教示に従って産生されるＦｃ含有タンパク質（例えば、抗体）は、全Ｆｃ含有タンパク質の２０％～５０％、より具体的には、２０％～４７％、２３％～４５％、２５％～４０％、２８％～３７％、２８％～３５％、２９％～３４％、３０％～３３％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値を構成する酸性電荷バリアントを有する。Ｆｃ含有タンパク質は、全Ｆｃ含有タンパク質の３８％～７０％、より具体的には４５％～７０％、５０％～６５％、５５％～６０％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値を構成する主ピーク形態を有する。Ｆｃ含有タンパク質は、全Ｆｃ含有タンパク質の１％～４０％、より具体的には２％～３５％、３％～３０％、４％～２５％、５％～２０％、６％～１５％、７％～１２％、７．５％～１０％、８％～１０％、８％～９％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値を構成する塩基性電荷バリアントを有する。

【0047】

本明細書に含まれる本発明の教示に従って産生されるＦｃ含有タンパク質（例えば、抗体）は、典型的には、全Ｆｃ含有タンパク質の３％～８％、より具体的には、４％～７％、５％～７％、及び５％～６．５％、５％～６％、５％～５．７５％、５％～５．５％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値で存在する非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）のパーセンテージを有する。

【0048】

産物全体の酸性電荷バリアント画分は、本発明に従って、０．１％～１０％の範囲、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値だけ制御する、好ましくは低減することができる。例えば、表１を参照されたい。より具体的には、酸性バリアント画分は、０．２％～９％、０．３％～８％、０．４％～７％、０．５％～６％、０．６％～５％、０．７％～４．７５％、０．７５％～４．５％、０．８％～４．２５％。０．９％～４％、１％～３．７５％。１％～３．５％、１％～３．２５％、１％～３％、１％～２．７５％、１％～２．７５％、１．２５％～２．５％、１．２５％～２．２５％、１．２５％～２％、１．５％～２％、１．５％～１．７５％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値変化させることができる。更に、他の範囲には、０．１％～４％、０．２５％～４％、０．２５％～３．７５％、０．２５％～３．５％、０．２５％～３％、０．２５％～２．７５％、０．２５％～２．５％、０．２５％～２．２５％、０．２５％～２％、０．２５％～１．７５％、０．２５％～１．５％、０．２５％～１．２５％、０．２５％～１％、０．２５％～０．７５％。０．２５％～０．５％、０．５％～４％、０．５％～３．７５％、０．５％～３．５％、０．５％～３％、０．５％～２．７５％、０．５％～２．５％、０．５％～２．２５％、０．５％～２％、０．５％～１．７５％、０．５％～１．５％、０．５％～１．２５％、０．５％～１％、０．５％～０．７５％、０．７５％～４％、０．７５％～３．７５％、０．７５％～３．５％、０．７５％～３％、０．７５％～２．７５％、０．７５％～２．５％、０．７５％～２．２５％、０．７５％～２％、０．７５％～１．７５％、０．７５％～１．５％、０．７５％～１．２５％、０．７５％～１％、１％～４％、１％～３．７５％、１％～３．５％、１％～３％、１％～２．７５％、１％～２．５％、１％～２．２５％、１％～２％、１％～１．７５％、１％～１．５％、１％～１．２５％、１．２５％～４％、１．２５％～３．７５％、１．２５％～３．５％、１．２５％～３％、１．２５％～２．７５％、１．２５％～２．５％、１．２５％～２．２５％、１．２５％～２％、１．２５％～１．７５％、１．２５％～１．５％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値が含まれる。例えば、酸性電荷バリアント画分は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％。１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％以上、例えば、最大５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％以上変化させることができる。

【0049】

産物全体の塩基性電荷バリアント画分は、本発明に従って、０．１％～１０％の範囲、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値だけ制御することができる。より具体的には、塩基性バリアント画分は、０．２％～９％、０．３％～８％、０．４％～７％、０．５％～６％、０．６％～５％、０．７％～４．７５％、０．７５％～４．５％、０．８％～４．２５％。０．９％～４％、１％～３．７５％。１％～３．５％、１％～３．２５％、１％～３％、１％～２．７５％、１％～２．７５％、１．２５％～２．５％、１．２５％～２．２５％、１．２５％～２％、１．５％～２％、１．５％～１．７５％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値だけ変化させることができる。更に、他の範囲には、０．１％～４％、０．２５％～４％、０．２５％～３．７５％、０．２５％～３．５％、０．２５％～３％、０．２５％～２．７５％、０．２５％～２．５％、０．２５％～２．２５％、０．２５％～２％、０．２５％～１．７５％、０．２５％～１．５％、０．２５％～１．２５％、０．２５％～１％、０．２５％～０．７５％。０．２５％～０．５％、０．５％～４％、０．５％～３．７５％、０．５％～３．５％、０．５％～３％、０．５％～２．７５％、０．５％～２．５％、０．５％～２．２５％、０．５％～２％、０．５％～１．７５％、０．５％～１．５％、０．５％～１．２５％、０．５％～１％、０．５％～０．７５％、０．７５％～４％、０．７５％～３．７５％、０．７５％～３．５％、０．７５％～３％、０．７５％～２．７５％、０．７５％～２．５％、０．７５％～２．２５％、０．７５％～２％、０．７５％～１．７５％、０．７５％～１．５％、０．７５％～１．２５％、０．７５％～１％、１％～４％、１％～３．７５％、１％～３．５％、１％～３％、１％～２．７５％、１％～２．５％、１％～２．２５％、１％～２％、１％～１．７５％、１％～１．５％、１％～１．２５％、１．２５％～４％、１．２５％～３．７５％、１．２５％～３．５％、１．２５％～３％、１．２５％～２．７５％、１．２５％～２．５％、１．２５％～２．２５％、１．２５％～２％、１．２５％～１．７５％、１．２５％～１．５％、又はこれらの範囲内の任意の整数値若しくは分数値が含まれる。塩基性電荷バリアント画分は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％以上、例えば、最大５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％以上変化させることができる。

【0050】

典型的には、発酵中のＣＯ_２濃度は、２つの供給源、すなわち、大気中のＣＯ_２及び呼吸を介して細胞によって産生されるＣＯ_２に由来する。本発明は、有利には、電荷バリアントを制御するために追加のＣＯ_２を用いることができる。いかなる理論にも縛られないが、培地中のＣＯ_２レベルの増加は、電荷変動に単独で又は共同で関与する細胞内ＣＯ_２の増加につながると考えられている。この効果は、炭酸又は他の酸性化学物質の形成に起因する可能性のあるｐＨのいかなる減少とも別のものである。

【0051】

二酸化炭素濃度は、ＣＯ_２スパージングを使用するか、又は空気スパージングを低下させることによって増加させることができる。ＣＯ_２スパージングは、ｐＣＯ_２を増加させる。二酸化炭素濃度の減少が所望される場合、スパージングは、空気を含む他のガスで行うことができる。空気スパージング及び窒素スパージングは、ｐＣＯ_２を減少させる。産生バイオリアクター内の圧力を低減すると、酸素の溶解度が低減し、次にこれは、溶解酸素（ＤＯ）設定値を維持するための酸素のより大きなスパージング、及び培養培地からｐＣＯ_２を除去するガス流量の増加を必要とする。

【0052】

二酸化炭素濃度は、ＣＯ_２電極（セベリングハウス電極とも称される）を使用して測定することができる。ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ及びＦＬＥＸ２分析装置など、より高度なシステムが市販されている。電荷バリアントは、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）及び塩勾配による溶出を伴うイオン交換クロマトグラフィーを使用して測定することができる。ＮＧＨＣは、還元キャピラリー電気泳動（ＣＥ）－ＳＤＳによって測定することができる。

【0053】

本発明は、哺乳動物細胞培養での使用に適している。例示的な細胞株は、ＣＨＯ、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＨＥＫ２９３細胞である。ＣＨＯ細胞としては、ＣＨＯ－ｏｒｉ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ｓ、ＣＨＯ－ＤＨＢ１１、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ、並びにそれらの変異体及びバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。ＨＥＫ２９３細胞としては、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３ＦＴＭ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３ＭＳＲ、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３ＳＧ、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ２９３Ｔ、並びにそれらの変異体及びバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な細胞としては、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＨｅＬａ細胞及びヒト羊水上皮細胞などのヒト羊水細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0054】

本発明は、細胞培養において産生される既存のバイオ製品及び医薬品の次世代版を含む、バイオ製品及び医薬品の製造に用いられ得る。モノクローナル抗体ベースの治療薬などの広範囲のタンパク質ベースの治療薬を、本発明に従って産生することができる。例えば、以下に特定される抗体を含むがこれらに限定されない、抗体をコードする必要なＤＮＡ配列を含む細胞を、本発明による培養において増殖させることができる。

【0055】

以下は、本発明に従って産生することができる、細胞培養において作製されたタンパク質を特定し、説明する。これらのタンパク質をコードする必要なＤＮＡを含む細胞を、本発明による産生のために培養することができる。

【0056】

例えば、抗体産生において、本発明は、全ての主要な抗体クラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥに基づいた診断及び治療のための研究及び産生使用のために修正可能である。ＩｇＧは、好ましいクラスであり、サブクラスＩｇＧ１（ＩｇＧ１λ及びＩｇＧ１κを含む）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。更なる抗体実施形態としては、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディ、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ′）２断片、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体が挙げられる。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。上記の誘導体、成分、ドメイン、鎖及び断片もまた含まれる。

【0057】

更なる抗体実施形態としては、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ若しくはテトラボディ、Ｆａｂ断片若しくはＦ（ａｂ′）２断片、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体が挙げられる。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。別の実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。別の実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。別の実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。

【0058】

追加の実施形態では、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５７９Ａ１号に記載されるような抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド１（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５８０Ａ１号に記載されるような抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン－２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載されるような抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載されるような抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載されるような抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載されるような抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３１３１９４Ａ１号に記載されるような２５抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載されるような抗ＥＧＦＲ抗体、又は米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２３Ａ１号に記載されるような抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗前駆体タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン－９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号又は米国特許出願公開第２０１４／００４４７３０Ａ１号に記載されるような抗ＰＣＳＫ９）、抗増殖及び分化因子－８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号又は同第９，２６０，５１５号に記載されるような抗ミオスタチン抗体としても知られる抗ＧＤＦ８抗体）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０４５Ａ１号又は同第２０１６／００７５７７８Ａ１号に記載されるような抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６８１Ａ１号又は米国特許第８，７３５，０９５号又は同第８，９４５，５５９号に記載されるような抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、同第８，０４３，６１７号又は同第９，１７３，８８０号に記載されるような抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５８Ａ１号又は同第２０１４／０２７１６４２Ａ１号に記載されるような抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５３Ａ１号に記載されるような抗ＲＳＶ抗体）、抗分化抗原群３（例えば、米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５Ａ１号及び同第２０１５／０２６６９６６Ａ１号、並びに米国出願第６２／２２２，６０５号に記載されるような抗ＣＤ３抗体）、抗分化抗原群２０（例えば、米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５Ａ１号及び同第２０１５／０２６６９６６Ａ１号、並びに米国特許第７，８７９，９８４号に記載されるような抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化抗原群４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載されるような抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載されるような）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０２９Ａ１号に記載されるような抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２１５０４０号に記載されるような）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体、又は抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１７０２９号、並びに米国特許第８，３０９，０８８号及び同第９，３５３，１７６号に記載されるような抗ＮＧＦ抗体）、並びに抗アクチビンＡ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５Ａ１号及び同第２０１５／０２６６９６６Ａ１号に記載されるような）、抗ＣＤ３×抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、並びに抗ＣＤ３×抗前立腺特異性膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。米国特許公開第２０１９／０２８５５８０Ａ１号も参照されたい。Ｍｅｔ×Ｍｅｔ抗体、ＮＰＲ１に対するアゴニスト抗体、ＬＥＰＲアゴニスト抗体、ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体、ＭＵＣ１６×ＣＤ２８抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＩＬ－２Ｒｇ抗体、ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体、第ＸＩ因子抗体、ＳＡＲＳ－ＣｏＣ－２バリアントに対する抗体、Ｆｅｌｄ１多抗体療法、Ｂｅｔ ｖ１多抗体療法も含まれる。上記の誘導体、成分、ドメイン、鎖及び断片もまた含まれる。

【0059】

例示的な抗体を産生する細胞は、本発明に従って培養することができる。例示的な抗体としては、アリロクマブ、アトルチビマブ、マフチビマブ、オデシビマブ、オデシビブマブ－ｅｂｇｎ、カシリビマブ、イムデビマブ、セミプリマブ及びセミプリマブ－ｒｗｌｃ（ＰＤ－１に結合するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体）、デュピルマブ（ＩＬ－４Ｒアルファ（α）サブユニットに結合し、それによってインターロイキン４（ＩＬ－４）及びインターロイキン１３（ＩＬ－１３）シグナル伝達を阻害するＩｇＧ４サブクラスのヒトモノクロー抗体）、エビナクマブ、エビナクマブ－ｄｇｎｂ、ファシヌマブ、フィアンリマブ、ガレトスマブ、イテペキマブ、ネスバクマブ、オドロネクスタマブ、ポゼリマブ、サリルマブ、トレボグルマブ、並びにレイヌクマブが挙げられる。

【0060】

追加の例示的な抗体としては、ラブリズマブ－ｃｗｖｚ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アダリムマブ－ａｔｔｏ、アド－トラスツズマブ、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ベズロトキスマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カプロマブペンデチド、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エミシズマブ－ｋｘｗｈ、エンタンシンアリロクマブ、エボロクマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダルシズマブ、インフリキシマブ、インフリキシマブ－ａｂｄａ、インフリキシマブ－ｄｙｙｂ、イピリムマブ、イキセキズマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リヌクマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、及びベドリズマブが挙げられる。

【0061】

次世代製品に加えて、本発明はまた、バイオシミラーの製造にも適用可能である。バイオシミラーは、管轄区域に応じて様々な方法で定義されるが、その管轄区域で以前に承認されたバイオ製品（通常は「参照製品」と称される）との比較の共通の特徴を共有する。世界保健機関によると、バイオシミラーは、品質、安全性及び有効性の点で、すでにライセンスされている参照バイオセラピー製品に類似したバイオセラピー製品であり、フィリピンなどの多くの国で使用されている。

【0062】

米国におけるバイオシミラーは、現在、（Ａ）バイオ製品は、臨床的に不活性な成分のわずかな差異にもかかわらず、参照製品と非常に類似している；及び（Ｂ）製品の安全性、純度、及び効力に関して、バイオ製品と参照製品との間に臨床的に意味のある差異はないと説明されている。米国では、以前の製品を処方した医療従事者の介入なしに、以前の製品と置き換えることができる交換可能なバイオシミラー又は製品が示されている。欧州連合では、バイオシミラーは、ＥＵですでに承認されている別のバイオ医薬品（「参照医薬品」と呼ばれる）と非常に類似したバイオ医薬品であり、とりわけ、構造、生物学的活性、有効性、及び安全性の考慮を含み、ロシアがこれらのガイドラインに従っている。中国では、バイオシミラー製品は、現在、元のバイオ医薬品と同様の活性物質を含有し、品質、安全性、及び有効性の点で元の薬物と同様であり、臨床的に有意な差異がない生物製剤を指す。日本では、バイオシミラーは、現在、日本ですでに承認されている参照製品と比較して、生物学的に同等／品質的に同等の品質、安全性、及び有効性を有する製品である。インドでは、バイオシミラーは、現在、「類似した生物製剤」と称されており、類似した生物製剤とは、比較可能性に基づいて承認された参照バイオ製品と品質、安全性、及び有効性の点で類似しているものを指す。オーストラリアでは、バイオシミラー医薬品は、現在、参照バイオ医薬品の非常に類似したバージョンである。メキシコ、コロンビア、及びブラジルでは、バイオシミラーは、現在、品質、安全性、及び有効性の点で、すでにライセンスされた参照製品と類似したバイオセラピー製品である。アルゼンチンでは、バイオシミラーは、現在、共通の特徴を有するオリジナル製品（コンパレーター）に由来している。シンガポールでは、バイオシミラーは、現在、物理化学的特性、生物学的活性、安全性、及び有効性の点でシンガポールで登録されている既存のバイオ製品と類似したバイオ治療薬である。マレーシアでは、バイオシミラーは、現在、すでに登録されている十分に確立された医薬品と、品質、安全性、及び有効性の点で類似するように開発された新しいバイオ医薬品である。カナダでは、バイオシミラーは、現在、すでに販売が承認されているバイオ医薬品と非常に類似したバイオ医薬品である。南アフリカでは、バイオシミラーは、現在、すでにヒトへの使用が承認されているバイオ医薬品に類似するように開発されたバイオ医薬品である。これら及び任意の改訂された定義の下でのバイオシミラー及びその同義語の産生は、本発明に従って行うことができる。

【0063】

典型的には、培養は、約１０～１５日間、好ましくは約１２～１４日間行うことができる。ｐＣＯ_２条件は、培養中に３０ｍｍＨｇ～２１０ｍｍＨｇのＣＯ_２、５０ｍｍＨｇ～２００ｍｍＨｇ、６０ｍｍＨｇ～１９０ｍｍＨｇ、７０ｍｍＨｇ～１８０ｍｍＨｇ、８０ｍｍＨｇ～１７０ｍｍＨｇ、９０ｍｍＨｇ～１６０ｍｍＨｇ、１００ｍｍＨｇ～１５０ｍｍＨｇ、１１０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇ、１２０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇ、１２０ｍｍＨｇ～１３０ｍｍＨｇ、又はこれらの範囲内の任意の値である。本発明は、抗体などのＦｃ含有タンパク質産物を提供することができ、主ピーク（ほぼ中性とみなされる）形態は、全Ｆｃ含有タンパク質の３８％～６５％を占め、Ｆｃ含有タンパク質の酸性バリアントは、全Ｆｃ含有タンパク質の２０％～４７％を占め、Ｆｃ含有タンパク質の塩基性バリアントは、全Ｆｃ含有タンパク質の最大３６％を占める。抗体の場合、本発明は、細胞によって産生される抗体の主ピーク形態が全抗体の５０％～７０％を占め、抗体の酸性バリアントが全抗体の２０％～４７％を占め、抗体の塩基性バリアントが全抗体の最大１５％を占める製品を提供することができる。

【実施例】

【0064】

本発明は、本発明の多くの態様を例示する以下の実施例によって更に説明されるが、いかなる方法でも本発明を限定するものではない。

【0065】

実施例１－プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）因子に結合するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体の調製において、酸性バリアントを減少させ、主ピーク形態を増加させるために、培養ｐＣＯ_２を増加させることができる
培養培地に、１８×１０^６細胞／ｍｌの濃度でＣＨＯ細胞を接種し、流加培養プロセスで増殖させた。細胞が７日目にピーク濃度（３０×１０^６細胞／ｍｌ）に達すると、追加のＣＯ_２でスパージして１２０ｍｍＨｇを超えるｐＣＯ_２レベルを増加させる、高ｐＣＯ_２バイオリアクター。制御プロセスは、ｐＣＯ_２レベルを１０５ｍｍＨｇ未満に維持するための標準的な製造プロセスを実装した。図１を参照されたい。観察された酸性不均一性は、以下の表１に表されており、酸性電荷バリアントでは３１％～３２％、主ピークフォームでは５７％～６０％の高ｐＣＯ_２範囲をサポートしている。

【表1】

【0066】

実施例２－ＰＤ－１因子に結合するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体の調製において、培養ｐＣＯ_２を減少させ、それによって酸性バリアントを増加させることができる
培地に、１８×１０^６細胞／ｍｌの濃度でＣＨＯ細胞を接種し、プロセスを供給バッチモードで進めた。培養ｐＣＯ_２を除去して低減するために、６．５日目に、複製バイオリアクター内の空気スパージを２２ｃｃｍから３３ｃｃｍに２４時間増加させ、その後、７．５日目から収穫まで４４ｃｃｍに増加させた。対照複製バイオリアクターは、プロセスの期間中、２２ｃｃｍの空気スパージを維持した。図２を参照されたい。観察された酸性バリアントの不均一性を、以下の表２に表す。

【表2】

【0067】

この実施例は、低ｐＣＯ_２が、より高いパーセンテージの酸性電荷バリアントをもたらすことを確立した。

【0068】

実施例３－培養ｐＣＯ_２の増加は、ＰＤ－１因子に結合するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体の調製におけるＮＧＨＣの有病率の増加と関連する
培養培地に、１８×１０^６細胞／ｍｌの濃度でＣＨＯ細胞を接種し、流加培養プロセスで増殖させた。細胞が７日目にピーク濃度（３０×１０^６細胞／ｍｌ）に達すると、追加のＣＯ_２でスパージして１２０ｍｍＨｇを超えるｐＣＯ_２レベルを増加させる、高ｐＣＯ_２バイオリアクター。制御プロセスは、ｐＣＯ_２レベルを１０５ｍｍＨｇ未満に維持するための標準的な製造プロセスを実装した。図１を参照されたい。観察されたＮＧＨＣ不均一性を、以下の表３に表す。

【表3】

ＮＧＨＣの増加は、ｐＣＯ_２自体の影響ではなく、培養ｐＨの減少に関連することが決定された。実施例５、並びに図１０及び１１を参照されたい。

【0069】

実施例４－培養ｐＣＯ_２の減少は、ＰＤ－１因子に結合することができるヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体の調製におけるＮＧＨＣの有病率の減少と関連する
培地に、１８×１０^６細胞／ｍｌの濃度でＣＨＯ細胞を接種し、プロセスを供給バッチモードで進めた。培養ｐＣＯ_２を除去して低減するために、６．５日目に、複製バイオリアクター内の空気スパージを２２ｃｃｍから３３ｃｃｍに２４時間増加させ、その後、７．５日目から収穫まで４４ｃｃｍに増加させた。対照複製バイオリアクターは、プロセスの期間中、２２ｃｃｍの空気スパージを維持した。図２を参照されたい。観察されたＮＧＨＣ不均一性を、以下の表４に表す。

【表4】

ＮＧＨＣの減少は、ｐＣＯ_２自体の影響ではなく、培養ｐＨの増加に関連することが決定された。実施例５、並びに図１０及び１１を参照されたい。

【0070】

実施例５－ＰＤ－１因子に結合することができるヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体の産生に関する小規模研究における培養ｐＣＯ_２及びｐＨの分析
ＣＨＯ細胞を使用したＦｃ含有タンパク質（例えば、抗体）の典型的な大規模産生実行からのデータを、以下の表５に示す。

【表5】

【0071】

製剤原薬（ＦＤＳ）の大規模生産を再現するために、２Ｌ発酵槽を使用した小規模研究を行った。本明細書に記載される研究の結果を使用して_、１０，０００Ｌ産生バイオリアクターで観察されたものと類似した培養ｐＣＯ_２及びｐＨの変化が、電荷バリアントプロファイル及びＰＤ－１に結合するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体における非グリコシル化重鎖の発生に影響を及ぼすことを実証する。

【0072】

小規模研究は、産生バイオリアクターにおけるｐＣＯ_２レベルの上昇が、ｉＣＩＥＦ領域１（酸性電荷バリアント）及び領域３（塩基性電荷バリアント）において観察された減少を引き起こし、ｉＣＩＥＦ領域２（主ピーク形態、別名主ピークバリアント）において付随する増加に寄与したことを決定した。この研究はまた、ｐＣＯ_２自体ではなく、培養ｐＨが、観察されたＮＧＨＣプロファイルの変化を引き起こしたと結論付けた。これらの結果を以下でより具体的に考察する。空気スパージング及びｐＣＯ_２スパージングを使用した研究パラメータを、以下の表６に概説する。

【表6】

【0073】

各実行の電荷バリアント（ｉＣＩＥＦ）及びＮＧＨＣ結果を表７に記載する。＊注記－中程度のｐＣＯ_２＃３（中間点対照とみなされる）は、データの解釈を混乱させる可能性のある外れ値を表すため、更なる分析から除外した。

【表7】

【0074】

電荷バリアント及びピーク形態、すなわち、ｉＣＩＥＦ領域１（酸性電荷バリアント）、領域２（主ピーク形態）及び領域３（塩基性電荷バリアント）の原因は、以下でより詳細に考察される。ＮＧＨＣについても以下で考察する。

【0075】

図３は、表６に従ったパラメータを使用して予測されたｐＨ値を示す。

【0076】

図４は、培養ｐＣＯ_２がｉＣＩＥＦ領域１（Ｒ１、酸性電荷バリアント％）のモデルにおける唯一の有意項目（ｐ＜０．０００１）であり、この電荷バリアントの可変性の８７％を占めるため（Ｒ^２：０．８７）、より高いｐＣＯ_２がより低い領域１（％）に関連する唯一の統計的に項目（酸性電荷バリアント）であることを示すデータを示す。培養ｐＨは、酸性電荷バリアント（領域１）の統計的に有意な項目ではなかった。図５を参照されたい。

【0077】

図６は、培養ｐＣＯ_２及びｐＨの両方がｉＣＩＥＦ領域２（Ｒ２、主ピーク形態％）のモデルにおいて有意な項目（ｐ＜０．０００１）であり、観察された可変性の９７％（Ｒ^２：０．９７）を占めることを示すデータを示す。したがって、より高い培養ｐＣＯ_２及びより低い培養ｐＨは、主ピーク形態を増加させる。図７を参照されたい。

【0078】

図８は、培養ｐＣＯ_２がモデルにおいて有意な項目であったことを示すデータを示し（ｐ＝０．０３５２）、領域３の可変性の３８％を説明した（Ｒ３、塩基性電荷バリアント％）。しかしながら、このモデルは、おそらくデータポイントの過剰なレバレッジングに起因して、有意ではなかった（ｐ＝０．０５９２）。図９を参照されたい。

【0079】

上記のデータは、一般に、電荷バリアントが、ｐＣＯ_２レベルを増加させることによって、全体的又は部分的に引き起こされることを示す。より重要なことに、ｐＣＯ_２の増加は、ｐＨの減少ではなく、酸性電荷バリアントのパーセンテージを低下させるための唯一の統計的に有意な項目であった（領域１）。したがって、ここでヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体によって表されるＩｇＧクラスについて、ｐＣＯ_２の増加は、酸性電荷バリアントのパーセンテージを低下させ、酸性電荷バリアントのパーセンテージの低下は、ｐＨ値の減少によって引き起こされない。図４及び５を参照されたい。

【0080】

最後に、図１０及び１１は、ｐＣＯ_２自体の増加ではなく、減少した培養ｐＨが、モデルにおいて有意な項目であり（ｐ＝０．０４０１）、ＮＧＨＣの可変性の３８％を占める（Ｒ^２：０．３８）ことを示すデータを示す。したがって、より低い培養ｐＨは、ＮＧＨＣプロファイルに影響を与える可能性がある。ｐＣＯ_２はｐＨに影響を及ぼす可能性があるが、他の培地成分もまたｐＨに影響を及ぼし、したがって、原因にかかわらず、ｐＨがＮＧＨＣを変化させる。したがって、より少ない酸性電荷バリアント（％）は、任意のタイプの酸性分子によるｐＨの低下によって引き起こされるＮＧＨＣの増加とは異なる現象であるｐＣＯ_２自体に起因する。

【0081】

図１２～２３は、以下のデータを示す。
（ａ）生細胞密度（ＶＣＤ）（図１２）、
（ｂ）生存率値（図１３）、
（ｃ）ｐＨ値－ｐＨは、表６に示されるゾーンアプローチに従って、６．５日目から変化した（図１４）、
（ｄ）ｐＣＯ_２値－ｐＣＯ_２は、表６に示されるゾーンアプローチに従って、６．５日目から変化した（図１５）
（ｅ）グルコース値（図１６）、
（ｆ）カリウム値（図１７）、
（ｇ）ナトリウム値－７日目以降のナトリウム値の変化は、センサーの変化に起因する可能性があり、研究結果に影響を与えることは予想されなかった（図１８）、
（ｈ）浸透圧値－１０日目の非定型値は、サンプルエラーに起因する可能性がある（図１９）、
（ｉ）グルタメート値－６．５日目の非定型値は、サンプルエラーに起因する可能性がある（図２０）、
（ｊ）ラクテート値（図２１）、
（ｋ）アンモニア値－アンモニア値は、ｐＨの影響を受けた可能性がある（図２２）、及び
（ｌ）グルタミン値（図２３）。

【0082】

これらのデータは、異なる空気スパージング条件下で増殖した細胞間の類似性を示す。表６を参照されたい。

【0083】

実施例６－インターロイキン４（ＩＬ－４）受容体に結合するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体のＣＯ_２スパージングを使用した培養における産生
以下の研究は、ＩＬ－４Ｒアルファ（α）サブユニットに結合し、それによってインターロイキン４（ＩＬ－４）及びインターロイキン１３（ＩＬ－１３）シグナル伝達を阻害するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体の電荷バリアントプロファイルに対する培養ｐＣＯ_２の効果を評価するために実施された。

【0084】

産生バイオリアクター内の培養培地に、ＣＨＯ細胞を約１２×１０^５細胞／ｍｌの濃度で接種し、流加培養プロセスで増殖させた。５．５日目に２００×１０^５細胞／ｍＬのピーク生細胞密度（ＶＣＤ）に達すると、ＣＯ_２スパージングを表８に定義されるように修正して、細胞培養内のｐＣＯ_２レベルを変化させた。３つの実験条件の得られたｐＣＯ_２プロファイルを、図２４に提供する。

【表8】

【0085】

１０．５日間の培養後、バイオリアクターを採取し、モノクローナル抗体を精製した。グリコシル化及び電荷バリアントプロファイルを決定した。産生バイオリアクター内のｐＣＯ_２レベルが増加するにつれて、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）によって測定されるように、塩基性バリアントのレベルが同時に減少したことが注目された（表９）。更に、ｐＣＯ_２の増加は、凹状の酸性バリアントプロファイルにつながり、中程度のｐＣＯ_２条件でピークに達したが、高ｐＣＯ_２条件では最も低いパーセンテージに低下した（表１０）。全体的な傾向は、酸性電荷バリアントのより低いパーセンテージであり、中程度のｐＣＯ_２測定は、誤差の結果である可能性が高い。

【表9】

【表10】

【0086】

上記実施例５における詳細な統計分析は、ｐＨを減少させずにｐＣＯ_２を増加させたことが、ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体による酸性電荷バリアント（領域１）のパーセンテージを低下させるための唯一の統計的に有意な項目であることを確認した。したがって、ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体によって表されるＩｇＧクラスについて、ｐＣＯ_２自体の増加は、酸性電荷バリアントのパーセンテージを低下させ、ＩｇＧ４抗体における酸性電荷バリアントのパーセンテージの低下は、ｐＨ値の減少によって引き起こされない。

【0087】

説明、具体的な例及びデータは、例示的な実施形態を示すが、例証として与えられており、本発明を限定することを意図していないことを理解されたい。本明細書に含まれる考察、開示及びデータから、全体的及び部分的に実施形態を組み合わせることを含む、本発明内の様々な変更及び修正が当業者に明らかになり、したがって、本発明の一部とみなされる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【手続補正書】

【提出日】2024-05-20

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

培養中の哺乳動物細胞によって産生される抗体産物における酸性電荷バリアントのパーセンテージを低減するための方法であって、前記方法が、
抗体を産生する哺乳動物細胞を培地に播種することと、
前記哺乳動物細胞が、ｐＣＯ_２条件なしで得られるよりも少ない酸性酸バリアントを有する抗体産物を産生することを可能にする前記ｐＣＯ_２条件下で前記細胞を培養することであって、前記ｐＣＯ_２条件が、前記培地中の１２０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇのＣＯ_２である、培養することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記ｐＣＯ_２条件が、スパージングによって達成される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ｐＣＯ_２条件が、ＣＯ_２スパージングによって達成される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ｐＣＯ_２条件下で産生される前記抗体が、前記ｐＣＯ_２条件なしで得られるものよりも０．５％～４％少ない酸性バリアントを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記抗体が、ＰＤ－１因子に結合することができる、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記抗体が、ＩＬ－４受容体に結合することができる、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記抗体が、ヒトモノクローナル抗体である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記抗体が、ヒトモノクローナル抗体であり、ＩｇＧ抗体である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ４抗体である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記細胞が、１０～１５日間培養される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

培養中の哺乳動物細胞によって産生される抗体における不均一性を制御する方法であって、前記方法が、
抗体を産生する哺乳動物細胞を培地に播種することと、
前記哺乳動物細胞が抗体を産生することを可能にするｐＣＯ_２条件下で前記細胞を培養することであって、前記細胞によって産生される抗体の主ピーク形態が、全抗体の３８％～６５％を占め、前記抗体の前記酸性バリアントが、全抗体の２０％～４７％を占め、前記抗体の塩基性バリアントが、全抗体の最大３６％を占める、培養することと、を含む、方法。

【請求項14】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記モノクローナル抗体が、ＰＤ－１因子に結合することができる、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記抗体が、ＩＬ－４受容体に結合することができる、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

前記ヒトモノクローナル抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ４抗体である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

培養中の哺乳動物細胞によって産生される抗体、抗体誘導体又は抗体断片における不均一性を制御する方法であって、前記方法が、
抗体、抗体誘導体又は抗体断片を産生する哺乳動物細胞を培地に播種することと、
前記哺乳動物細胞が抗体、抗体誘導体又は抗体断片を産生することを可能にするｐＣＯ_２条件下で前記細胞を培養することであって、前記細胞によって産生される抗体、抗体誘導体又は抗体断片の主ピーク形態が、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の５０％～７０％を占め、前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の酸性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の２０％～４７％を占め、前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の塩基性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の最大１５％を占める、培養することと、を含む、方法。

【請求項21】

前記抗体、
抗体誘導体又は抗体断片の前記塩基性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の最大１０％を占める、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記塩基性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の最大８％を占める、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記塩基性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の最大６％を占める、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記細胞によって産生される抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記主ピーク形態が、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の５０％～６５％を占め、前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記酸性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の２３％～４６％を占める、請求項２０に記載の方法。

【請求項25】

前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記酸性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の２３％～３９％を占める、請求項２０に記載の方法。

【請求項26】

前記抗体、抗体誘導体又は抗体断片の前記酸性バリアントが、全抗体、抗体誘導体又は抗体断片の３１％～４６％を占める、請求項２０に記載の方法。

【請求項27】

非グリコシル化重鎖を有する抗体のパーセンテージが、５～７％である、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記哺乳動物細胞が、ヒトモノクローナル抗体を産生する、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ヒトモノクローナル抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ４抗体である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ｐＣＯ_２条件が、前記培養中に３０ｍｍＨｇ～２１０ｍｍＨｇである、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記ｐＣＯ_２条件が、ＣＯ_２スパージングを使用して維持される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

ｐＣＯ_２が、ＣＯ_２電極を使用して測定される、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項２０～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

先行請求項のいずれか一項に記載の方法によって産生される、抗体産物。

【請求項36】

先行請求項のいずれか一項に記載の方法によって産生される、抗体誘導体産物。

【請求項37】

先行請求項のいずれか一項に記載の方法によって産生される、抗体断片産物。

【請求項38】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法によって産生される、抗体産物。

【請求項39】

ｐＣＯ _２ が、ピーク細胞濃度に達すると増加する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

ピーク細胞濃度に達すると、前記培地中のｐＣＯ２を増加させることによって、酸性バリアントの存在が低減し、前記増加させることが、培養中に５０ｍｍＨｇ～２００ｍｍＨｇ、培養中に６０ｍｍＨｇ～１９０ｍｍＨｇ、培養中に７０ｍｍＨｇ～１８０ｍｍＨｇ、培養中に８０ｍｍＨｇ～１７０ｍｍＨｇ、培養中に９０ｍｍＨｇ～１６０ｍｍＨｇ、培養中に１００ｍｍＨｇ～１５０ｍｍＨｇ、培養中に１１０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇ、培養中に１２０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇ、及び培養中に１２０ｍｍＨｇ～１３０ｍｍＨｇからなる群から選択される範囲までである、請求項１３～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記範囲が、培養中に１００ｍｍＨｇ～１５０ｍｍＨｇである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記範囲が、培養中に１１０ｍｍＨｇ～１４０ｍｍＨｇである、請求項４１に記載の方法。

【国際調査報告】