2024-531805 ヒト脳オルガノイドを使用した、シヌクレイン病に対する薬物試験のプラットフォーム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】ヒト脳オルガノイドを使用した、シヌクレイン病に対する薬物試験のプラットフォーム

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/073 20100101AFI20240822BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240822BHJP

【ＦＩ】

C12N5/073

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024517491

(86)(22)【出願日】2022-09-21

(85)【翻訳文提出日】2024-05-16

(86)【国際出願番号】 JP2022035166

(87)【国際公開番号】W WO2023048182

(87)【国際公開日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】P 2021152986

(32)【優先日】2021-09-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512155478

【氏名又は名称】学校法人沖縄科学技術大学院大学学園

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(72)【発明者】

【氏名】ジュンヒョン ジョ

(72)【発明者】

【氏名】ホワン－ダイ トラン

(72)【発明者】

【氏名】ゴードン ウィリアム アーバスノット

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ61

4B063QR72

4B063QS28

4B063QX01

4B065AA93X

4B065BB04

4B065BD25

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、ヒト線条体に類似するヒト線条体様オルガノイド（ｈＳＬＯ）、ｈＳＬＯとｈＭＬＯとの間に機能的接続を有するｈＳＬＯおよびヒト中脳様オルガノイド（ｈＭＬＯ）の融合オルガノイド、ならびにオルガノイド培養プラットフォームを使用して薬物を試験する方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト胚様体などの胚様体（ＥＢ）を培養する方法であって、
第１の因子を含む第１の培地中でＥＢを培養することを含み、前記第１の因子は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤および／またはＧＳＫ阻害剤などのＷｎｔ阻害剤を含む、
方法。

【請求項2】

得られたＥＢを、第２の因子を含む第２の培地中で培養することをさらに含み、前記第２の因子は、ＬＧＥニューロスフェアを得るために、Ｗｎｔ阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路活性化のためのパターン形成因子、およびアクチビンを含み、第１の因子を有しない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記得られたＥＢを、第３の因子を含む第３の培地中で培養することを含み、前記第３の因子は、ヒト線条体様オルガノイドなどのオルガノイドを得るために、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および／またはアスコルビン酸を含み、前記第１および第２の因子を有しない、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

得られたオルガノイドが、成熟中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）の１以上のマーカーを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記得られたオルガノイドが、Ｄ１および／またはＤ２ ＭＳＮを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記得られたオルガノイドが、ＴＨなどの介在ニューロンマーカー、ＣＨＡＴおよび５－ＨＴなどのコリン作動性ニューロンマーカーおよびセロトニンニューロンマーカー、ＭＢＰおよびＧＦＡＰなどのグリア細胞マーカーの少なくとも１つまたは全てを発現する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記オルガノイドが、１ｍｍ以上の長軸直径または直径を、好ましくは１ｍｍ～２ｍｍの長軸直径または直径を有する、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

成熟ＭＳＮの１以上のマーカーを発現する成熟中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）を含む、単離されたオルガノイド。

【請求項9】

前記オルガノイドに含まれる細胞の５０％以上は、ＤＡＲＰＰ３２陽性およびＧＡＢＡ陽性である、請求項８に記載の単離されたオルガノイド。

【請求項10】

Ｄ１および／またはＤ２ ＭＳＮを含む、請求項８または９に記載の単離されたオルガノイド。

【請求項11】

介在ニューロンマーカー、コリン作動性ニューロンマーカー、およびセロトニンニューロンマーカーの少なくとも１つまたは全てを発現する、請求項８から１０のいずれか一項に記載の単離されたオルガノイド。

【請求項12】

１ｍｍ以上の長軸直径または直径を有する、請求項８から１１のいずれか一項に記載の単離されたオルガノイド。

【請求項13】

オルガノイドを産生する方法であって、
請求項８から１２のいずれか一項に記載のオルガノイド（第１のオルガノイド）、およびドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンを含む第２のオルガノイドを提供すること、ならびに
前記第１のオルガノイドおよび前記第２のオルガノイドを接触させて、前記第１のオルガノイドおよび前記第２のオルガノイドの融合オルガノイドを得ることを含み、前記第２のオルガノイドのドーパミン作動性ニューロンは、前記第１のオルガノイドに到達する投射を有し、前記第１のオルガノイドのＧＡＢＡ作動性ＭＳＮは、前記第２のオルガノイドに到達する投射を有する、方法。

【請求項14】

請求項８から１２のいずれか一項に記載の第１のオルガノイド、およびドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンを含む第２のオルガノイドの融合オルガノイドであって、
前記第２のオルガノイドのドーパミン作動性ニューロンは、前記第１のオルガノイドに到達する投射を有し、前記第１のオルガノイドのＧＡＢＡ作動性ＭＳＮは、前記第２のオルガノイドに到達する投射を有する、融合オルガノイド。

【請求項15】

前記融合オルガノイドに含まれている細胞は、α－ｓｙｎ凝集を有するＤＡニューロンを含む、請求項１４に記載の融合オルガノイド。

【請求項16】

候補薬物を試験する方法であって、
前記候補薬物および請求項１４または１５に記載の融合オルガノイドを接触させること、
ＤＡニューロンにおけるα－シヌクレイン凝集を観察すること、ならびに
α－ｓｙｎ凝集を、陰性対照と比較して減少させる前記候補薬物を選択すること
を含む方法。

【請求項17】

ＳＮＣＡは、第２のオルガノイド実体または前記オルガノイドの少なくともＤＡニューロンまたは全ての細胞にて過剰発現される、請求項１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、線条体様オルガノイド（ＳＬＯ）およびＳＬＯを産生する方法に関する。本開示は、機能的に融合された線条体様オルガノイド（ＳＬＯ）および中脳様オルガノイド（ＭＬＯ）にも関する。本開示は、ヒト線条体様オルガノイド（ｈＳＬＯ）およびｈＳＬＯを産生する方法にも関する。本開示は、機能的に融合されたヒト線条体様オルガノイド（ｈＳＬＯ）およびヒト中脳様オルガノイド（ｈＭＬＯ）にも関する。

【背景技術】

【0002】

線条体は、ヒトの脳の中央に位置し、随意運動を含む様々な機能を有する大脳基底核の構成要素である（Ｈｉｋｏｓａｋａら、２０００年）。線条体は、主に特定のニューロンの突起を介して様々な脳領域との間で情報を送受信する（Ｇｅｒｆｅｎ、２００６年；Ｉｎｇｈａｍら、１９９８年；Ｌｏｖｉｎｇｅｒ、２０１０年；Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎら、２０１４年）。したがって、線条体は、運動と関連付けられることが最も多く、パーキンソン病（ＰＤ）を罹患している患者では神経変性により大きな影響を受ける。

【0003】

線条体の線条体－黒質ＧＡＢＡ作動性ニューロンと中脳の黒質－線条体ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンと間の神経活性は、行動および運動を動機付ける（Ａｌｂｉｎら、１９８９年）。こうした神経回路の機能不全は、後にＰＤの病態形成に寄与する。しかしながら、こうした脳領域がどのように相互接続しているのか、および神経疾患において何が機能的欠陥を引き起こすのかについてはあまり理解されていない。現行の細胞培養および動物モデルは、脳における実際の神経回路を正確には模倣していないと批判されている。したがって、ヒト黒質－線条体経路を実証および視覚化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ脳モデルを作出することは、神経疾患、例えばアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）病理の今後の研究のためのプラットフォームを提供することになる。

【発明の概要】

【0004】

３Ｄオルガノイドモデル系を、３Ｄオルガノイドモデル系が由来したｉｎ ｖｉｖｏ臓器または組織に近似するように設計する。こうした３Ｄ培養系は、分化上皮の複雑な形態学的特徴を再現して、細胞－細胞間および細胞－マトリックス間の生物学的相互作用を可能にすることができる。これは、元の組織と物理的、分子的、または生理学的類似性をほとんど共有しないことが多い古典的な２Ｄ培養モデルとは対照的である。ｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングには大きな期待が寄せられているが、現行の脳オルガノイド系は、ＰＤなどのヒト脳疾患のあらゆる側面を反映させることはできないため、ある特定の制限を有する。

【0005】

ヒト線条体オルガノイドの生成は、幾つかの問題：
－ 中脳黒質と大脳基底核の特定の領域である線条体との間に相互的な黒質－線条体投射および線条体－黒質投射を作出するための段階的なプロトコールは存在していないこと、
－ それぞれ中脳黒質および線条体におけるＤＡニューロンと中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）との間のシナプス形成を示すためのヒトｉｎ ｖｉｔｒｏニューロン系は存在していないこと、
－ α－ｓｙｎ病理をモデル化して様々な脳領域間の病理学的タンパク質伝播を研究するための系は存在しないこと、
－ 脳オルガノイド培養プラットフォームを使用した読み出しとしてのα－ｓｙｎ病理に基づく薬物スクリーニング／試験系は存在しないこと、
を解決する。神経変性疾患の薬物スクリーニングプラットフォームはほとんどが、２Ｄ神経細胞培養系および動物モデルで構築されているが、それらはｉｎ ｖｉｖｏヒト脳環境を再現しておらず、結果の解釈を誤るリスクが高い。

【0006】

本開示では、我々は、まず、ヒト線条体様オルガノイドを生成する方法を、遺伝子発現分析、免疫組織化学的分析、およびカルシウムイメージングを含む特徴付けデータと共に説明する。我々は、次に、ｈＳＬＯおよび我々の研究室により以前に確立されているｈＭＬＯを使用して融合オルガノイドを生成し、相互投射およびシナプス形成の特徴付けと共に、中脳と線条体とが物理的および機能的に接続されることを示す。

【0007】

本開示は、例えば、下記に記載の発明を提供する。
（１）ヒト胚様体などの胚様体（ＥＢ）を培養する方法であって、
第１の因子を含む第１の培地中でＥＢを、例えば、１～７日間、２～６日間、または３～５日間にわたって培養することを含み、第１の因子は、ＴＧＦ－β、およびＳＭＡＤ２／３シグナル伝達経路阻害剤および／またはＧＳＫ阻害剤（例えば、ＧＳＫ３阻害剤またはＧＳＫ３β阻害剤）などのＷｎｔ阻害剤、好ましくはＴＧＦ－βおよびＳＭＡＤ２／３シグナル伝達経路阻害剤ならびにＷｎｔ阻害剤を含む、方法。
（２）得られたＥＢを、第３の因子を含む第２の培地中で、例えば、７～１４日間、８～１３日間、９～１２日間、１０～１１日間にわたって、培養することを含み、培養はオービタル振とう条件下でもよく、
第３の因子は、ＬＧＥニューロスフェアを得るために、ＧＳＫ阻害剤（例えば、ＧＳＫ３阻害剤またはＧＳＫ３β阻害剤またはＸＡＶ９３９）などのＷｎｔ阻害剤、スムーズンドアゴニスト（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）およびプルモルファミンなどのソニックヘッジホッグ経路活性化のパターン形成因子、ならびアクチビンＡなどのアクチビンを含み、第１の因子を含まない、上記（１）に記載の方法。
（３）得られたＥＢを、第３の因子を含む第３の培地中で培養ことをさらに含み、第３の因子は、ヒト線条体様オルガノイドなどのオルガノイドを得るために、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および／またはアスコルビン酸を含み、第１の因子および第２の因子を有しない、上記（２）に記載の方法。
（４）得られたオルガノイドは、成熟中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）の１以上のマーカーを含む、上記（３）に記載の方法。
（５）得られたオルガノイドは、Ｄ１および／またはＤ２ ＭＳＮを含む、上記（４）に記載の方法。
（６）得られたオルガノイドは、ＴＨなどの介在ニューロンマーカー、ＣＨＡＴおよび５－ＨＴなどのコリン作動性ニューロンマーカーおよびセロトニンニューロンマーカー、ＭＢＰおよびＧＦＡＰなどのグリア細胞マーカーの少なくとも１つまたは全てを発現する、上記（５）に記載の方法。
（７）オルガノイドは、１ｍｍ以上の長軸直径または直径を、好ましくは１ｍｍ～２ｍｍの長軸直径または直径を有する、上記（４）～（６）のいずれか１つに記載の方法。
（８）成熟ＭＳＮの１以上のマーカーを発現する成熟中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）を含む、単離されたオルガノイド。
（９）オルガノイドに含まれる細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上は、ＤＡＲＰＰ３２陽性およびＧＡＢＡ陽性である、上記（８）に記載の単離されたオルガノイド。
（１０）Ｄ１および／またはＤ２ ＧＡＢＡ作動性ＭＳＮを含む、上記（８）または（９）に記載の単離されたオルガノイド。
（１１）ＴＨなどの介在ニューロンマーカー、ＣＨＡＴおよび５－ＨＴなどのコリン作動性ニューロンマーカーおよびセロトニンニューロンマーカー、ＭＢＰ、Ｓ１００β、およびＧＦＡＰなどのグリア細胞マーカーの少なくとも１つまたは全てを発現する、（８）～（１０）のいずれか１つに記載の単離されたオルガノイド。
（１２）１ｍｍ以上の長軸直径または直径を、好ましくは１ｍｍ～２ｍｍの長軸直径または直径を有する、（８）～（１１）のいずれか１つに記載の単離されたオルガノイド。
（１３）オルガノイドを産生する方法であって、
上記（８）～（１２）のいずれか１つに記載のオルガノイド（第１のオルガノイド）、およびドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン、例えば、Ａ９様サブタイプｍＤＡニューロンおよびＡ１０様サブタイプｍＤＡニューロンを含む第２のオルガノイドを準備すること、ここで、オルガノイドは、好ましくは、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２；ＴＨ、ＤＡＴ、およびＧＩＲＫ２などのＤＡニューロンマーカーの１以上を発現し、および
第１のオルガノイドおよび第２のオルガノイドを接触させて、第１のオルガノイドおよび第２のオルガノイドの融合オルガノイドを得ることを含み、第２のオルガノイドのドーパミン作動性ニューロンは、第１のオルガノイドに到達する投射を有し、第１のオルガノイドのＧＡＢＡ作動性ＭＳＮは、第２のオルガノイドに到達する投射を有する、方法。
（１４）上記（８）～（１２）のいずれか１つに記載の第１のオルガノイド、ならびにドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン、例えば、Ａ９様サブタイプｍＤＡニューロンおよびＡ１０様サブタイプｍＤＡニューロンを含む第２のオルガノイドの融合オルガノイドであって、オルガノイドは、好ましくは、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２；ＴＨ、ＤＡＴ、およびＧＩＲＫ２などのドーパミンニューロンマーカーの１以上を発現し、
第２のオルガノイドのドーパミン作動性ニューロンは、第１のオルガノイドに到達する投射を有し、第１のオルガノイドのＧＡＢＡ作動性ＭＳＮは、第２のオルガノイドに到達する投射を有する、融合オルガノイド。
（１５）融合オルガノイドに含まれている細胞は、α－ｓｙｎ凝集を有するＤＡニューロンを含む、上記（１４）に記載の融合オルガノイド。
（１６）候補薬物を試験する方法であって、
候補薬物および上記（１４）または（１５）に記載の融合オルガノイドを接触させること、
ＤＡニューロンにおけるα－シヌクレイン凝集を観察すること、ならびに
α－シヌクレイン凝集を、陰性対照と比較して減少させる候補薬物を選択すること、
を含む方法。
（１７）ＳＮＣＡは、第２のオルガノイド実体またはオルガノイドの少なくともＤＡニューロンまたは全ての細胞にて過剰発現される、上記（１６）に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】ヒト線条体様オルガノイド（ｈＳＬＯ）の生成に関する図である。（Ａ）特定のヒト中脳および線条体の発生を決定する経路を説明する概略図である。（Ｂ）ｈＳＬＯを生成するための戦略を示す概略図である。（Ｃ）ＤＩＣ画像は、分化の１０、２０、３０、および６０日目の細胞の典型的な形態学的特徴を示し、（Ｄ）にはＥＢの直径の定量化が示される。スケールバー＝５００μｍ。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝８）を表す。

【図2】分化の初期時間における多能性および初期外側基底核隆起（ＬＧＥ）マーカーの発現を示すｑＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図である。ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＡＳＣＬ１、ＤＬＸ５、ＧＳＸ２、およびＥＢＦ１に関する、ｈＳＬＯから解離させた細胞の定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。

【図3】６０日目のＧＡＢＡ作動性ニューロンの分化効率を示す免疫組織化学的分析を示す図である。（Ａ）ＣＴＩＰ２およびＧＡＢＡを免疫染色した６０日目のｈＳＬＯの凍結切片。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）Ａの定量化。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。

【図4】機能的ＧＡＢＡ作動性マーカーＤＡＲＰＰ３２およびＧＡＢＡの発現および定量化を示す免疫組織化学的分析を示す図である。白色スケールバー＝５０μｍ。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。

【図5】ｈＳＬＯにサブタイプＧＡＢＡ作動性ニューロンが存在することを示す免疫組織化学的分析を示す図である。（Ａ）ＧＡＢＡおよびサブスタンス－Ｐを免疫染色したｈＳＬＯの凍結切片。（Ｂ）ＧＡＢＡおよびＤＲＤ２を免疫染色したｈＳＬＯの凍結切片。スケールバー＝５μｍ。

【図6】ヒト線条体と同様に、ｈＳＬＯでの異なる細胞型の発現を示す免疫組織化学的分析の結果を示す図である。（Ａ）ＭＡＰ２、ＴＨ、およびＤＡＰＩ、（Ｂ）ＣＨＡＴ、５’ＨＴ、およびＤＡＰＩ、（Ｃ）ＭＢＰおよびＤＡＰＩ、（Ｄ）ＧＦＡＰおよびＤＡＰＩを免疫染色した６０日目および９０日目のｈＳＬＯの凍結切片。スケールバー＝５０μｍ。

【図7】ｈＳＬＯにおける解離ニューロンの特徴付けの結果を示す図である。（Ａ）ＡＡＶ－ｍＤｌｘ：：ＥＧＦＰレポーターで標識された解離ｈＳＬＯ細胞を示す代表的な画像。ニューロンはＥＧＦＰおよびＣＴＩＰ２が免疫染色されている。（Ｂ）ＡＡＶ－ｍＤｌｘ：：ＥＧＦＰレポーターで標識された解離ｈＳＬＯ細胞を示す代表的な画像。パネルの拡大図は（Ｂ’）成長円錐および（Ｂ’’）樹状投射スパインを示し、矢印は成長円錐および樹状投射スパインの位置を示す。白色スケールバー＝２０μｍ、黄色スケールバー＝５μｍ。

【図8】ｈＳＬＯのカルシウムイメージングの結果およびカルシウム活性を示す追跡ピークを示す図である。１５０日目のｈＳＬＯにおける９個の単一ニューロンのスパイクを右パネルに抽出した。スケールバー＝２００μｍ。

【図9】ｈＳＬＯとｈＭＬＯとの間のニューロンの相互投射を示すための免疫組織化学的分析の結果を示す図である。（Ａ）大脳基底核における線条体と黒質との間のニューロンの投射形成を示す簡略的な概略図。（Ｂ）ＡＡＶ－ｈＳｙｎ１：：ＥＧＦＰを発現するｈＳＬＯオルガノイドおよび未標識ｈＭＬＯを有するｈＭＬＯ－ｈＳＬＯ融合オルガノイドのクリアリングの３Ｄ免疫染色。（Ｃ）ＴＨ－ＥＧＦＰ ＤＡニューロンレポーターを有するｈＭＬＯオルガノイドおよび未標識ｈＳＬＯを有するｈＭＬＯ－ｈＳＬＯ融合オルガノイドのクリアリングの３Ｄ免疫染色。スケールバー＝２００μｍ。

【図10】ｈＭＬＯ－ｈＳＬＯ融合オルガノイドにおけるニューロンのシナプス形成を示すための免疫組織化学的分析の結果を示す図である。（Ａ）ＥＧＦＰ、ＰＳＤ９５、およびＳＹＮ１を免疫染色した、Ｈ９ ＴＨ－ＥＧＦＰ ｈＭＬＯおよびＨ９ ｈＳＬＯから生成された融合オルガノイドは、ｈＭＬＯからの投射ニューロンと共に、プレおよびポストシナプスマーカーの発現を示す。（Ｂ）ＥＧＦＰ、ＶＭＡＴ２、およびＧＡＢＡを免疫染色した、Ｈ９ ＴＨ－ＥＧＦＰ ｈＭＬＯおよびＨ９ ｈＳＬＯから生成された融合オルガノイドは、ｈＭＬＯからの投射ニューロンと共に、ＶＭＡＴ２およびＧＡＢＡの発現を示す。（Ｃ）ＥＧＦＰ、ＰＳＤ９５、およびＳＹＮ１を免疫染色した、Ｈ９ ｈＭＬＯおよびＨ９－ＡＡＶ－ｈＳｙｎ１：：ＥＧＦＰ ｈＳＬＯから生成された融合オルガノイドは、ｈＳＬＯからの投射ニューロンと共に、プレおよびポストシナプスマーカーの発現を示す。（Ｂ）ＥＧＦＰ、ＶＧＡＴ、およびＧＡＢＡを免疫染色した、Ｈ９ ｈＭＬＯおよびＨ９－ＡＡＶ－ｈＳｙｎ１：：ＥＧＦＰ ｈＳＬＯから生成された融合オルガノイドは、ｈＳＬＯからの投射ニューロンと共に、ＶＧＡＴおよびＧＡＢＡの発現を示す。赤色スケールバー＝１μｍ。白色スケールバー＝１０μｍ。

【図11】ｈＭＬＯ－ｈＳＬＯ融合オルガノイドにおけるα－ｓｙｎ病態形成モデリングの結果を示す図である。（Ａ）２１ｄ．ｐ．ｆ．でのｈＭＬＯからｈＳＬＯへのＴＨ－ＥＧＦＰ⁺ニューロンの投射を示す、ＥＧＦＰを染色したＷ／ＴおよびＳＮＣＡ Ｏ／Ｅ融合オルガノイドのホールマウント染色画像および定量化（平均±ＳＥＭ；^*ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。白色スケールバー＝２００μｍ、黄色スケールバー＝５０μｍ。（Ｂ）ＳＮＣＡ－リンカー－ｍＫＯ２過剰発現細胞株を生成するためのレンチウイルス構築物。（Ｃ）ｈＳＬＯからｈＭＬＯへ、およびその逆のＳＮＣＡ－リンカー－ｍＫＯ２伝播を標識するためにｍＫＯ２抗体で染色した融合オルガノイドのホールマウント画像。白色スケールバー＝１００μｍ、黄色スケールバー＝５０μｍ。（Ｄ）Ｃの定量化（平均±ＳＥＭ；^****ｐ＜０．０００１、ｎ＝４）。

【図12】融合オルガノイドを使用した抗ＰＤ薬物試験のモデルを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書で使用される「胚様体」（ＥＢ）という用語は、多能性細胞または好ましくは多能性幹細胞（ＰＳＣ）の三次元凝集塊を指す。ＥＢは、多能性細胞上に発現するＣａ²⁺依存性接着分子Ｅ－カドヘリンの分子内結合を介して、胚性幹細胞（ＥＳＣ）などの多能性細胞により形成される。抗分化因子の非存在下で単一細胞として培養すると、ＰＳＣは自発的に凝集してＥＢを形成する。そのような自発的形成は、多くの場合、培養基質とではなく単一細胞間での優先的接着を促進するために、寒天または親水性ポリマーなどの非接着性物質で培養皿がコーティングされているバルク懸濁培養で達成される。

【0010】

本明細書で使用される「胚性幹細胞」という用語は、動物、例えば、マウスおよびラットを含むげっ歯動物、ヒトおよびサルを含む霊長類などの哺乳動物の胚盤胞の内部細胞塊から導出することができる多能性幹細胞を指す。

【0011】

本明細書で使用される「多能性幹細胞」という用語は、多能性を有する幹細胞を指す。多能性は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む３つの胚葉のいずれにも分化するが、胎盤のような胚体外組織には分化しない細胞の潜在能力である。多能性幹細胞は、ある特定のリプログラミング因子の組合せの強制発現を誘導することにより、成体体細胞などの非多能性細胞から人工的に誘導することができる。例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃの強制発現は、線維芽細胞などから人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生成することができる。

【0012】

「オルガノイド」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができ、通常は１以上のタイプの細胞を含み三次元構造を形成する細胞凝集塊を指す。オルガノイドのいくつかは、体内の元の臓器と同様の組織構造を有する。臓器と同様の機能を有するオルガノイドは、臓器の機能低減により引き起こされる疾患に対して治療効果を示すことができる。臓器と同様の構造を有するオルガノイドが生成され、臓器の発生が研究された。

【0013】

本開示は、胚様体（ＥＢ）を培養する方法を提供する。ＥＢは、好ましくは動物ＥＢ、より好ましくは哺乳動物ＥＢ、さらにより好ましくはヒトＥＢである。ＥＢは、上記で説明したように、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を培養することにより得ることができる。

【0014】

一実施形態では、この方法は、第１の因子を含む第１の培地中でＥＢを、例えば１～７日間、２～６日間、または３～５日間にわたって培養することを含む。第１の因子は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤および／またはＷｎｔ阻害剤、好ましくはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、およびＧＳＫ阻害剤（例えば、ＧＳＫ３阻害剤またはＧＳＫ３β阻害剤）などのＷｎｔ阻害剤を含んでいてもよい。

【0015】

ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の例としては、これらに限定されないが、例えば、（ｉ）ＡＬＫ４阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ７阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化阻害剤を含むＳＭＡＤ２／３阻害剤などのＳＭＡＤ阻害剤、ならびにＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ＳＭＡＤ２／３およびＳＭＡＤ２／３リン酸化などのＳＭＡＤからなる群から選択される２つ以上に対する多重阻害剤（例えば、二重阻害剤）、好ましくはＴＧＦ－βおよびＳＭＡＤ２／３に対する二重阻害剤からなる群から選択される１以上；（ｉｉ）その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００２７２４号Ａパンフレットに開示されている、ＬＹ－３６４９４７、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、およびＳＢ－５０５１２４；６１６４５２および６１６４５３；ＧＷ７８８３８８およびＧＷ６６０４；ＬＹ５８０２７６からなる群から選択される１つもしくは複数；または（ｉｉｉ）ＳＢ－４３１５４２が挙げられる。一実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の例としては、ＬＤＮ－１９３１８９およびＫ０２２８８などの汎ＴＧＦ－ベータ／Ｓｍａｄ阻害剤；ならびにＳＢ４３１５４２およびガルニセルチブなど選択的ＴＧＦ－ベータ／Ｓｍａｄ阻害剤が挙げられる。ドルソモルフィンは、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤としても使用することができる。

【0016】

Ｗｎｔ阻害剤の例としては、これらに限定されないが、例えば、アダビビント（ＳＭ０４６９０）、ＩＭ－１２、ラナトシドＣ、Ｍ４３５－１２７９、Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｃ５９）、アトラノリン、Ｂｏｘ５、イソクエルシトリン、ＡＺＤ２８５８、ＣＣＴ２５１５４５、ＰＮＵ－７４６５４、ＩＷＰ－２、ＣＰ２１Ｒ７（ＣＰ２１）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ギンセノシドＲｈ４、ＦＩＤＡＳ－３、ギガントール、ＡＺ６１０２、ＩＷＲ－１－ｅｘｏ、ステノパリブ（Ｓｔｅｎｏｐａｒｉｂ）（Ｅ７４４９）、インジルビン－３’－オキシム、カプマチニブ（ＩＮＣＢ２８０６０）、ＷＡＹ－３１６６０６、ｉＣＲＴ３、ＦＨ５３５、ＩＷＰ－Ｏ１、ＬＦ３、プロジギオシン、ＫＹ１９３８２（Ａ３０５１）、ＷＩＫＩ４、ヘパラン硫酸、ホスセンビビント（ＩＣＧ－００１）、トリプトニド、ＸＡＶ－９３９、ＩＷＰ－４、ＬＧＫ－９７４、Ｆｏｘｙ－５、ＭＳＡＢ、ラドゥビグルシブ（ＣＨＩＲ－９９０２１）ＨＣｌ、ＫＹ－０５００９、ＫＹ１２２０、ＩＱ－１、ＫＹＡ１７９７Ｋ、ハルミン、Ｇ２４４－ＬＭ、ＫＹ０２１１１、ＪＷ５５、ＰＨ－０６４、およびラドゥビグルシブ（ＣＨＩＲ－９９０２１）が挙げられる。

【0017】

好ましい実施形態では、第１の因子は、ＳＢ４３１５４２、ＸＡＶ－９３９、およびドルソモルフィンを含む。

【0018】

一実施形態では、この方法は、得られたＥＢを、第２の因子を含む第２の培地中で、例えば、好適な期間、例えば、７～１４日間、８～１３日間、９～１２日間、または１０～１１日間にわたって培養するステップをさらに含む。第２の因子は、スムーズンド受容体アゴニスト（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ）、例えばスムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）およびプルモルファミンなどの、ソニックヘッジホッグ経路活性化に関するパターン形成因子を含んでいてもよい。培養は、アクチビンＡの存在下で行うことができる。好ましい実施形態では、第２の因子は、ＸＡＶ－９３９、アクチビンＡ、ＳＡＧ、およびプルモルファミンを含む。この培養は、好ましくは、第１の因子を用いずに実施される。この培養プロセスは、ＥＢが、外側基底核隆起（ＬＧＥ）への分化をモジュレートすることを可能にすることができ、それにより発生中に線条体を生じさせる。

【0019】

一実施形態では、この方法は、得られたＥＢを、第３の因子を含む第４の培地中で培養して、線条体様オルガノイド（例えば、ｈＳＬＯ）などのオルガノイドを得ることをさらに含む。第３の因子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および／またはアスコルビン酸を含んでいてもよい。この培養は、好ましくは、第１および第２の因子を用いずに実施される。

【0020】

一実施形態では、線条体様オルガノイド（例えば、ｈＳＬＯ）は、直径が、好ましくは、５００μｍ以上か、６００μｍ以上か、７００μｍ以上か、８００μｍ以上か、９００μｍ以上か、１０００μｍ以上か、１１００μｍ以上か、１２００μｍ以上か、または１３００μｍ以上である。線条体様オルガノイド（例えば、ｈＳＬＯ）は、ドーパミン受容体Ｄ１（ＤＲＤ１）およびサブスタンス－Ｐを発現するＤ１ ＧＡＢＡ作動性ＭＳＮならびにＤＲＤ２およびエンケファリンを発現するＤ２ ＧＡＢＡ作動性ＭＳＮなどの、Ｄ１サブタイプおよびＤ２サブタイプの両方のＧＡＢＡ作動性中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）を含む。一実施形態では、線条体様オルガノイド（例えば、ｈＳＬＯ）は、ＡＳＣＬ１、ＤＬＸ２、ＧＳＸ２、およびＥＢＦ１などの、外側基底核隆起（ＬＧＥ）に対する１以上のマーカー（ＬＧＥマーカー）を発現することができる。一実施形態では、線条体様オルガノイド（例えば、ｈＳＬＯ）は、ＳＯＸ１およびＳＯＸ２などの１以上の初期神経外胚葉マーカーをさらに発現することができる。一実施形態では、線条体様オルガノイド（例えば、ｈＳＬＯ）は、好ましくは、ＤＡＲＰＰ３２などの、成熟中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）の１以上のマーカーを発現する。一実施形態では、線条体様オルガノイド（例えば、ｈＳＬＯ）は、好ましくは、ＴＨなどの介在ニューロンマーカー、ＣＨＡＴおよび５－ＨＴなどのコリン作動性ニューロンマーカーおよびセロトニンニューロンマーカー、ＭＢＰおよびＧＦＡＰなどのグリア細胞マーカーからなる群から選択される１以上のマーカーを発現する。好ましい実施形態では、線条体様オルガノイド（例えば、ｈＳＬＯ）の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンであってもよい。一実施形態では、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＧＡＢＡおよびＣＯＵＰ－ＴＦ相互作用タンパク質２（ＣＴＩＰ２）を発現する。好ましい実施形態では、線条体様オルガノイド（例えば、ｈＳＬＯ）は、軸索末端の１以上の軸索側枝および成長円錐、ならびに樹状投射スパインの形成を有することができる。本開示は、こうした線条体様オルガノイド（例えば、ｈＳＬＯ）のいずれかを提供する。

【0021】

本開示は、オルガノイドを産生する方法を提供する。この方法は、第１のオルガノイドおよび第２のオルガノイドを提供することを含んでいてもよい。第１のオルガノイドは線条体様オルガノイド（例えばｈＳＬＯ）であり、第２のオルガノイドはドーパミン作動性ニューロン（ＤＡ）、例えば中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロンを含む。好ましい実施形態では、ｍＤＡニューロンは、Ａ９様サブタイプｍＤＡニューロンおよびＡ１０様サブタイプｍＤＡニューロンからなる群から選択される。好ましい実施形態では、第２のオルガノイドは、好ましくは、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２；ＴＨ、ＤＡＴ、およびＧＩＲＫ２などのドーパミンニューロンマーカーの１以上を発現する。好ましい実施形態では、第２のオルガノイドは中脳様オルガノイド（ＭＬＯ）であり、より好ましくはヒトＭＬＯ（ｈＭＬＯ）である。好ましい実施形態では、オルガノイドは、線条体様オルガノイド（ＳＬＯ）を中脳様オルガノイド（ＭＬＯ）と接触させ、融合させることにより得ることができる。

【0022】

実施形態の全てにおいて、ＳＬＯは好ましくはｈＳＬＯであり、ＭＬＯは好ましくはｈＭＬＯである。

【0023】

一実施形態では、オルガノイドまたは融合ＳＬＯおよびＭＬＯは、ＳＬＯからＭＬＯへの投射を含む。一実施形態では、オルガノイドまたは融合ＳＬＯおよびＭＬＯは、ＭＬＯからＳＬＯへの投射を含む。好ましい実施形態では、オルガノイドまたは融合ＳＬＯおよびＭＬＯは、ＳＬＯとＭＬＯとの間の相互投射を含む。好ましい実施形態では、投射は、神経回路、より好ましくは電気生理学的に機能性の神経回路を形成することができる。

【0024】

一実施形態では、ＭＬＯのニューロン、好ましくはｍＤＮＡニューロンは、α－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）を発現し、好ましくはα－ｓｙｎ凝集を示す。この実施形態では、ニューロン、好ましくはｍＤＮＡニューロンは、プロモーター（例えば、ＰｏｌＩＩプロモーター）などの制御配列に作動可能に連結した、α－ｓｙｎをコードする遺伝子（ＳＮＣＡ）を含んでいてもよい。本開示は、オルガノイドまたは融合ＳＬＯおよびＭＬＯを提供し、ＭＬＯのニューロンはα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）を発現し、好ましくは、オルガノイドまたは融合ＳＬＯおよびＭＬＯは検出可能なα－ｓｙｎ凝集を示す。

【0025】

本開示は、パーキンソン病（ＰＤ）治療のための候補薬物を試験する、または候補薬物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、オルガノイドまたは融合ＳＬＯおよびＭＬＯを提供することを含む。この方法は、候補薬物をオルガノイドまたは融合ＳＬＯおよびＭＬＯと接触させること、ならびに次いでオルガノイドまたは融合ＳＬＯおよびＭＬＯ（好ましくはｍＤＡニューロン）におけるα－シヌクレイン（特に、α－シヌクレインの凝集の存在もしくは非存在またはα－シヌクレインの凝集の度合い）を観察することを含む。この方法は、α－シヌクレイン凝集を、ビヒクル処置群などの陰性対照と比較して減少させる候補薬物を選択することをさらに含む。

【0026】

実施形態の全てにおいて、培養は、好適な培地中で好適な条件下にて実施される。一実施形態では、培地は無血清培地であってもよい。一実施形態では、培地は、使用されている化学物質が全て既知である化学的に定義された組成培地であってもよい。本明細書で使用することができる培養培地の例としては、これらに限定されないが、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、アルファ最小必須培地（ａＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩまたはＲＰＭＩ１６４０）、グラスゴー最小必須培地（ＧＭＥＭ）、Ｂｉｇｇｅｒｓ、Ｇｗａｔｋｉｎ、およびＪｕｄａｈ培地（ＢＧＪ）、Ｂｉｇｇｅｒｓ、Ｇｗａｔｋｉｎ、およびＪｕｄａｈ培地Ｆｉｔｔｏｎ－Ｊａｃｋｓｏｎ変法（ＢＧＪｂ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、ブリンスター卵子培養培地（ＢＭＯＣ－３）、コンノート医学研究所培地（ＣＭＲＬ）、神経基礎培地、ＣＯ₂非依存性培地、ハムＦ－１０栄養混合物、ハムＦ－１２栄養混合物、改良型ＭＥＭ、イスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ－１５、ＭｃＣｏｙの５Ａ、ＭＣＤＢ１３１、培地１９９、ｍＴｅＳＲ培地、最小必須培地（ＭＥＭ）、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ＷａｙｍｏｕｔｈのＭＢ７５２／１、Ｗｉｌｌｉａｍｓの培地Ｅ、またはそれらの組合せ、既知の代替物、もしくは改変が挙げられる。典型的には、最小培地は、グルコースなどの炭素源；塩；マグネシウム、窒素、リン、および硫黄などの必須元素；および水を含む。実施しようとする実験、問題となる細胞タイプ、ならびに必要とされる細胞の状態に基づき必要に応じて、任意の細胞培養培地をさらなる成分で補完してもよい。細胞培養サプリメントは、これらに限定されないが、血清、アミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、化学的化合物、塩、緩衝塩または緩衝剤、抗生物質、抗真菌剤、サイトカイン、成長因子、ホルモン、脂質、およびそれらの誘導体である。培養は、典型的には、５％ＣＯ₂条件下で３７℃にて実施することができる。

【0027】

実施形態の全てにおいて、培地の各々には、第１、第２、および第３の因子の各々が好適な量で含まれている。

【実施例】

【0028】

１．プロトコールの確立およびｈＳＬＯの特徴付け
我々が以前にｈＭＬＯを生成するために使用した手法（Ｊｏら、２０１６年）と同様に、我々は、背側線条体への神経外胚葉分化を促進するために幾つかの小分子を適用した（図１Ａ）。まず、ｈＥＳＣを解離して単一細胞を生成し、１０，０００個の細胞をＶ底９６ウェルプレートに播種して胚体（ＥＢ）を形成した。１日目に、こうしたＥＢを、ＷＮＴ阻害剤（ＸＡＶ９３９、０．８μＭ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に、二重ＳＭＡＤ阻害剤（ＳＢ４３１５４２、１０μＭ、Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ、およびドルソモルフィン、２μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が追加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｎａｃａｌａｉ）：Ｎｅｕｒａｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）（１：１）、１：１００ Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ビタミンＡを含まない１：５０ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％最小必須培地非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１％β－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む神経誘導培地中で培養した。７日目に、ＳＡＧ（０．５μＭ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびプルモルファミン（０．５μＭ、Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含むパターン形成因子が培地に追加され、外側基底核隆起（ＬＧＥ）への分化をモジュレートし、それにより発生中に線条体を生じさせた（図１Ｂ）。重要なことには、我々は、以前に報告されているように（Ａｒｂｅｒら、２０１５年）、ＬＧＥパターン形成により線条体ニューロンの分化を促進するために、アクチビンＡ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）を含める。ＥＢを７日目からオービタル振とう器に移した。１４日目にパターン形成因子を除去し、オルガノイドを、ＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０ｎｇ／ｍｌ）およびアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１００μＭ）を追加した神経培地中で維持した（図１Ｂ）。複数のバッチにわたる発生を追跡したところ、こうしたオルガノイドは、分化の６０日目までに直径１．３ｍｍまで成長した（図１Ｃ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析によるオルガノイド発生の検討は、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４などの多能性マーカーの発現減少、およびＡＳＣＬ１、ＤＬＸ５、ＧＳＸ２、およびＥＢＦ１などの初期ＬＧＥマーカーのロバストな発現を示した（図２）。

【0029】

ヒト線条体は９０％よりも多くがＧＡＢＡ作動性ＭＳＮで構成されていることが知られている。ＭＳＮは、軸索投射形成能力および神経化学的内容物に基づき、ドーパミン受容体Ｄ１（ＤＲＤ１）およびサブスタンスＰ発現ＭＳＮとＤＲＤ２およびエンケファリン発現ＭＳＮの２つの半部分集団に分割することができる（ＧｒａｖｅｌａｎｄおよびＤｉＦｉｇｌｉａ、１９８５年）。以前の研究により、Ｄ１ ＭＳＮは内部淡蒼球（ＧＰｉ）および黒質網状部（ＳＮｒ）に対して出力を送り、大脳基底核に線条体－黒質経路を直接形成することが示されている。その一方で、線条体は、黒質－線条体経路の黒質緻密部（ＳＮｐｃ）からドーパミン作動性入力を受け取り、ＳＮｐｃ投射からのドーパミン作動性ニューロンは線条体へと投射を形成し、その軸索末端からドーパミンを放出して、線条体に位置するＧＡＢＡ作動性ＭＳＮに影響を及ぼす（Ｙａｇｅｒら、２０１５年）。この神経回路は、運動にも重要な役割を果たす。黒質－線条体経路および線条体－黒質経路の機能不全は、ＰＤなどの複数の神経疾患の原因であることが発表されている（Ｇｏｔｏら、１９８９年）。

【0030】

ここで、我々は、我々のｈＳＬＯのニューロンをＣＴＩＰ２およびＧＡＢＡで標識することにより、６０日目にはＧＡＢＡ作動性ニューロンの６４％がＣＴＩＰ２に対しても陽性であると結論付ける（図３）。以前の研究では、ホメオボックス遺伝子ＧＳＸ２がＬＧＥ運命の決定および線条体の発生に重要であることが示されている（Ｈｓｉｅｈ－Ｌｉら、１９９５年；Ｔｏｒｅｓｓｏｎら、２０００年；Ｙｕｎら、２００１年）。３０日目のｈＳＬＯ凍結切片をＧＳＸ２および腹側前脳マーカーＤＬＸ２で標識することにより、我々は、ＧＳＸ２⁺細胞の大部分（８３％）がＤＬＸ２も発現することを観察した。６０日目に成熟ｈＳＬＯをさらに特徴付けたところ、線条体マーカーであるＣＯＵＰ－ＴＦ相互作用タンパク質２（ＣＴＩＰ２）がＧＡＢＡ⁺ニューロンにおいて発現されたことが示された。最後に、９０日目にｈＳＬＯ凍結切片を免疫染色したところ、成熟ＭＳＮのマーカーであるＤＡＲＰＰ３２の発現が確認され、９０％細胞がＤＡＲＰＰ３２⁺／ＧＡＢＡ⁺共発現性だった（図４）。より興味深いことには、サブスタンス－ＰおよびＤＲＤ２抗体によるｈＳＬＯニューロンの免疫染色により、ＧＡＢＡ⁺ニューロンのある特定の集団が、こうした２つのマーカーを個々に発現することが同定された（図５）。現時点では、Ｄ１およびＤ２ ＧＡＢＡ作動性ニューロンのパーセンテージが高いヒト線条体の生成を示す２Ｄまたは３Ｄヒト線条体培養物は存在しないため、この特徴は実際に非常に重要である。

【0031】

様々な研究により、ヒト線条体は、ＭＳＮの他に、ニューロン生存を促進し、ならびにシナプス形成を維持するために支持細胞の少数の集団を含むと結論付けられていた（Ｈｕｏｔら、２００７年）。我々は、我々のｈＳＬＯの細胞がＴＨ（ドーパミン作動性ニューロンマーカー）、ＣＨＡＴおよび５－ＨＴ（コリン作動性ニューロンマーカーおよびセロトニンニューロンマーカー）、ＭＢＰ（乏投射膠細胞マーカー）、ならびにＧＦＡＰ（星状膠細胞マーカー）を発現することを見出した（図６）。

【0032】

投射ニューロンとしての樹状投射スパインおよび成長円錐を含むＭＳＮの形態学的特徴をさらに特徴付けるために、我々は、ＤＬＸ５およびＤＬＸ６エンハンサー（ＡＡＶ－ｍＤｌｘ：：ＥＧＦＰ）下でＥＧＦＰレポーターを発現するＡＡＶウイルスでオルガノイドを標識し、それらを再播種してＭＳＮの軸索伸長を促進させた。その結果、我々は、８０日目に、ＣＴＩＰ２マーカーで標識されているＥＧＦＰ⁺細胞の集団を観察した（図７Ａ）。我々は、ニューロンを１３０～１５０日目までさらに培養することにより、ほとんどのＥＧＦＰ⁺ニューロンが、多数の軸索側枝を有するより複雑な形態学的特徴へと成長したことを見出した。さらに興味深いことには、我々は、軸索末端の成長円錐ならびに樹状投射スパインの形成を捕捉した（図７Ｂ）。これは、ニューロンが成熟し、他のニューロンとのシナプス形成が活性であることを示す。

【0033】

カルシウムイメージングは、我々が、脳オルガノイドの個々のニューロンの電気生理学的活動をモニターすることを可能にする。この目的のため、我々は、Ｆｌｕｏ－４アセトキシメチルエステル（ＡＭ）ベースのカルシウムイメージングを実施した。ｈＳＬＯをＦｌｕｏ－４ ＡＭとインキュベートしたところ、顕著な自発的Ｃａ²⁺トランジエントを示す標識細胞がもたらされた。記録された活動をＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析したところ、１５０日目のｈＳＬＯの単一ニューロンのスパイクが示された（図８）。ｈＳＬＯのカルシウム活性は共焦点顕微鏡を使用して測定することができるため、融合オルガノイドのカルシウムイメージングの測定は、ＰＤモデルにおける融合オルガノイドの機能の直接的評価を可能にする有望なアッセイであり得る。

【0034】

全てのこうした結果は、我々により生成されたｈＳＬＯが、ヒト線条体に似た複数の特徴を有するＭＳＮ ＧＡＢＡ作動性ニューロンを産生することできることを示唆している。さらに重要なことには、我々は、ｈＳＬＯのトランスクリプトーム特徴付けおよび細胞タイプの組成をさらに理解するため、ならびにｈＳＬＯのニューロンを以前に公開されたプロトコールから導出されたニューロンと比較するために、ｈＳＬＯからのバルク細胞および単一細胞ＲＮＡシークエンスを分析中である。

【0035】

２．ｈＳＬＯおよびｈＭＬＯの融合は相互投射を再現する
我々は、ｈＭＬＯ－ｈＳＬＯ融合オルガノイドの投射形成ニューロン（projected neuron）が、より良好な機能的シナプス接続を形成することができると予想した。したがって、我々は、融合オルガノイドにおいてより活性なＣａ²⁺活性を記録することを目指す。中脳黒質と大脳基底核の特定領域である線条体との間の相互投射は、神経発生中に生じる（図９Ａ）。神経投射形成を効率的に視覚化するために、我々は、ｈＭＬＯおよびｈＳＬＯにレポーター系を構築した。我々は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、ｈＭＬＯのＤＡニューロンで特異的に発現するＥＧＦＰ蛍光タンパク質を３’－ＴＨ遺伝子座にノックインした。その一方で、我々は、ｈＳｙｎ１：：ＥＧＦＰを搭載するＡＡＶ感染系（ＡＡＶ－ｈＳｙｎ１：：ＥＧＦＰ）を使用して、ｈＳＬＯのＧＡＢＡ作動性ＭＳＮを標識した。こうした投射をｉｎ ｖｉｔｒｏで確立するために、我々は、ｈＳＬＯおよびｈＭＬＯを、２４ウェルプレート内で互いに隣り合うように配置し、それらの直接的な物理的接触を促進し、それらを一緒に融合させた。融合の２日後、オルガノイドをオービタル振とう器に戻し、さらに２週間にわたって培養した。

【0036】

線条体－黒質投射形成を示すために、我々は、ｈＳｙｎ１：：ＥＧＦＰ感染ｈＳＬＯを未標識ｈＭＬＯと融合させた。興味深いことには、我々は、融合３日後から投射形成を観察し始めた。融合２週間後、我々は、ｈＳＬＯからｈＭＬＯの反対側に到達し、軸索束を形成するＥＧＦＰ⁺プロセスのロバストな伸長を見出した（図９Ｂ）。これは、ヒト脳の同様な解剖学的特徴である（Ｍｏｒｅｌｌｏら、２０１５年）。同様に、ｈＭＬＯからｈＳＬＯへの投射形成能力を調査するために、我々は、ＴＨ－ＥＧＦＰレポーターｈＭＬＯを未標識ｈＳＬＯと融合させた。予想通り、我々は、融合後２週間でｈＳＬＯ側へのＥＧＦＰ⁺プロセスを検出した（図９Ｃ）。培養がより長くなると、我々は、両融合オルガノイドからのＥＧＦＰ標識投射シグナルの強度増加を見た。まとめると、こうした結果は、ｈＳＬＯとｈＭＬＯとの間に相互投射が存在することを示し、融合オルガノイドがヒト神経回路の解剖学的レプリカであることを示唆した。

【0037】

我々は、融合オルガノイドのシナプス特性を調査するために一連のアッセイをさらに実施した。まず、投射形成ニューロンが融合オルガノイドの軸索標的化およびシナプス形成を指図することができるか否かを決定するために、我々は、ＴＨ－ＥＧＦＰレポーターｈＭＬＯを未標識ｈＳＬＯと融合させ、次いで我々は、投射形成軸索末端のプレシナプスマーカーと共に投射形成ニューロンを標識して、投射形成ニューロンにおけるシナプス接続の確立を確かめた。予想通り、我々は、ｈＳＬＯ側のＴＨ－ＥＧＦＰ⁺投射形成ニューロンと共に、ＳＹＮ１プレシナプスマーカーおよびＰＳＤ９５ポストシナプスマーカーの発現を観察する。さらに、我々は、ＴＨ－ＥＧＦＰ⁺投射形成ニューロンおよび局所ＧＡＢＡ作動性ニューロンと共に、小胞モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２）の発現を観察した（図１０）。加えて、我々は、ｈＭＬＯ側のＡＡＶ－ｈＳｙｎ１：：ＥＧＦＰ⁺投射形成ニューロンと共に、ＳＹＮ１プレシナプスマーカーおよびＰＳＤ９５ポストシナプスマーカーの発現を観察する。さらに、我々は、ＡＡＶ－ｈＳｙｎ１：：ＥＧＦＰ⁺投射形成ニューロンおよび局所ＧＡＢＡ作動性ニューロンと共に小胞ＧＡＢＡトランスポーター（ＶＧＡＴ）の発現を観察し、投射形成ＤＡニューロンおよびＧＡＢＡ作動性ニューロンと局所ＧＡＢＡ作動性ニューロンとのシナプス形成を示した。

【0038】

次に、カルシウムイメージング、ＭＥＡ、およびホールセルパッチクランプを含む電気生理学的記録を使用して、融合オルガノイドの神経回路の機能的成熟および形成を調査することができる。投射形成ニューロンは、融合させると、対応するニューロンとより良好なシナプスを形成することができると我々は予想した。これは各オルガノイド単独では起こらないことである。

【0039】

我々の融合オルガノイド系を使用してα－ｓｙｎ病理をモデル化することが可能であることを示すために、我々は、ＷＴとＳＮＣＡ過剰発現との間でｈＭＬＯ－ｈＳＬＯ融合オルガノイドを比較する（図１１Ａ）。ｈＭＬＯのＴＨ⁺ＤＡニューロンを標識することにより、我々は、α－Ｓｙｎ発現の上昇が、ｈＭＬＯからｈＳＬＯへのＤＡニューロンの投射形成を制限することを示した。興味深いことには、ＷＴ ＤＡニューロンは束として投射形成したのに対し、ＳＮＣＡ過剰発現オルガノイドのＤＡニューロンは、より少数の無作為な投射形成を示した。次に、我々は、レンチウイルス系を使用して、α－ｓｙｎと融合したｍＫＯ２レポーター（赤色蛍光タンパク質）を過剰発現させる（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。このレポーター系は、我々が、α－ｓｙｎの凝集を視覚化し、ならびにｈＭＬＯ－ｈＳＬＯ融合オルガノイドでのα－ｓｙｎ伝播の作用をモニターすることを可能にした。ｍＫＯ２抗体を使用してホールマウント染色を行うことにより、我々は、ｈＳＬＯからｈＭＬＯへのα－Ｓｙｎ－ｍＫＯ２の伝播レベルが著しくより高いが、その逆は高くなく、ほぼ４倍の差があることを観察する（図１１Ｃ～１１Ｄ）。こうしたデータは、ＳＮＣＡ－ｍＫＯ２レポーターが、我々のｈＭＬＯ－ｈＳＬＯ融合オルガノイドモデルを使用して、線条体と中脳黒質との間のα－ｓｙｎ伝播およびα－ｓｙｎ凝集の形成を調査するための実行可能な系であることを強く示唆している。

【0040】

３．融合オルガノイドを使用したシヌクレイン病の薬物スクリーニングおよび検査への応用
ｈＭＬＯ－ｈＳＬＯ融合オルガノイドモデルを使用する主な目的は、特にシヌクレイン病理に焦点を当てるが、中脳黒質と線条体との間の相互投射におけるＰＤの病態形成を研究するために革命的な変化を起こす系を開発することである。我々は、融合オルガノイドｉｎ ｖｉｔｒｏ系を使用して、臨床試験において抗ＰＤ薬物化合物の効果および影響を試験することを目指す。我々の研究室で確立されたＴＨ－ＥＧＦＰレポーター系を有するアイソジェニックＰＤ ｈＥＳＣ株（Ｊｏら、２０２１年）を使用して、我々は、ＰＤ表現型を示す融合オルガノイドを生成する（図１２）。まず、我々は、薬物（例えば、化合物、核酸、もしくは抗体）または第Ｉ相臨床治験（ＮＰＴ２００－１１およびＮＰＴ０８８：α－ｓｙｎミスフォールディングの阻害剤）および第ＩＩ相臨床治験（ＳＡＲ４０２６７１：グルコシルセラミドシンターゼの阻害剤、およびアンブロキソール：ＧＣａｓｅ活性化剤）における候補薬物をα－ｓｙｎ病理のレスキュー効果について試験する。その後、我々は、様々な程度のＰＤ表現型を呈する様々な時点でα－ｓｙｎ凝集の度合いを測定し、最適化された濃度で薬物を適用して、融合オルガノイドに対する長期的で直接的な薬物応答をプロファイリングする。ＴＨ⁺ＤＡニューロンにおける病理学的α－ｓｙｎの改善レベルの評価は、マルチオミクス分析、イメージング、生化学、電気特性調査、代謝アッセイ、ならびに物理的様式および機能的様式の両方のシナプス形成能力を含む種々の手法により検証されることになる。我々は、薬物処置後の神経変性の低減に関連付けられるα－ｓｙｎの蓄積減少という転帰を予想する。

【0041】

パーキンソン病（ＰＤ）は、２番目に最も一般的な神経変性障害であり、ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの変性により明らかになる。ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンは、通常、黒質－線条体経路において中脳から線条体へと投射を形成する。神経疾患をモデル化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ系を構築することはチャレンジングであるが、多数の研究グループが試みている達成可能な目標である。本明細書では、我々は、Ｄ１およびＤ２サブタイプＧＡＢＡ作動性中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）の存在など、ヒト線条体に類似する特徴を有する特定のヒト線条体様オルガノイド（ｈＳＬＯ）を産生するための詳細なプロトコールを開発した。ｈＳＬＯを我々が以前に生成した中脳様オルガノイド（ｈＭＬＯ）と融合させることにより、我々は、中脳と大脳基底核の線条体との間の接続および通信のｉｎ ｖｉｔｒｏ証拠を提供する。最後に、我々は、我々の融合オルガノイド系が、α－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）伝播に基づく、パーキンソン病に対する好適な薬物スクリーニングプラットフォームであるという証拠を提供する。この知見は、ｈＳＬＯとｈＭＬＯとの間の構造的相互作用および機能的相互作用の両方を観察することに基づき、ｉｎ ｖｉｔｒｏ神経変性疾患モデリング、特にシヌクレイン病を革命的に変化させることができる最初の試みである。

【0042】

本明細書で引用されている参考文献および特許および特許出願の各々は、その全体が参照により組み込まれる。
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】