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特表2024-531887多形核骨髄由来免疫抑制細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）に特異的な新規診断用及び治療用マーカーとしての抗原ＣＤ１１１

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-03

(54)【発明の名称】多形核骨髄由来免疫抑制細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）に特異的な新規診断用及び治療用マーカーとしての抗原ＣＤ１１１

(51)【国際特許分類】

G01N 33/53 20060101AFI20240827BHJP

G01N 33/577 20060101ALI20240827BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240827BHJP

A61P 31/00 20060101ALI20240827BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240827BHJP

A61P 35/02 20060101ALI20240827BHJP

A61K 35/17 20150101ALI20240827BHJP

C07K 16/30 20060101ALI20240827BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 Y

G01N33/53 D

G01N33/577 B

A61P35/00

A61P31/00

A61K39/395 N

A61P35/02

A61K35/17

C07K16/30

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505060

(86)(22)【出願日】2022-08-01

(85)【翻訳文提出日】2024-03-25

(86)【国際出願番号】 IT2022050220

(87)【国際公開番号】W WO2023012844

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】102021000020702

(32)【優先日】2021-08-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520352377

【氏名又は名称】オスペダーレペディアトリコバンビーノジェス

【氏名又は名称原語表記】ＯＳＰＥＤＡＬＥＰＥＤＩＡＴＲＩＣＯＢＡＭＢＩＮＯＧＥＳＵ’

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田雅一

(72)【発明者】

【氏名】モレッタ，ロレンツォ

(72)【発明者】

【氏名】バッカ，パオラ

(72)【発明者】

【氏名】トゥミノ，ニコラ

【テーマコード（参考）】

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC23

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZB32

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA28

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

多形核骨髄由来免疫抑制細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）に特異的な新規の診断用及び治療用マーカーとしてのＣＤ１１１抗原。本発明は、多形核骨髄由来免疫抑制細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）のマーカーとしてＣＤ１１１抗原を用いることによって、生体試料中の前記細胞を検出するための方法、及び免疫療法の標的としての前記マーカーの使用に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料中の多形核骨髄由来免疫抑制細胞を検出するためのマーカーとしてのＣＤ１１１タンパク質の使用。

【請求項2】

前記生体試料が、例えば末梢血、腹水、滑液などの液体試料、又は例えば新鮮な、パラフィン包埋された、若しくは凍結保存された組織生検などの固形組織から選択される、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

生体試料中の多形核骨髄由来免疫抑制細胞を検出するための方法であって、前記細胞のためのマーカーとしてのＣＤ１１１タンパク質の同定によって前記細胞を検出する工程を含む、方法。

【請求項4】

前記生体試料が、例えば末梢血、腹水、滑液などの液体試料、又は例えば新鮮な、パラフィン包埋された、若しくは凍結保存された組織生検などの固形組織から選択される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

フローサイトメトリー又は免疫組織化学的分析によって行われる、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

腫瘍又は感染性疾患の治療における使用のための多形核骨髄由来免疫抑制細胞の阻害剤製品であって、ＣＤ１１１マーカーを自身の標的とする、阻害剤製品。

【請求項7】

抗ＣＤ１１１モノクローナル抗体、又はＣＤ１１１タンパク質を選択的に認識するように構築物で遺伝子改変された例えばＴ及びＮＫリンパ球などのエフェクター細胞から選択される、請求項６に記載の使用のための請求項６に記載の阻害剤製品。

【請求項8】

抗ＣＤ１１１モノクローナル抗体であり、前記抗体が、例えば薬物、毒素、又は放射性同位体などの、多形核型の骨髄由来免疫抑制細胞の死を誘導することができる物質に結合される、請求項７に記載の阻害剤製品。

【請求項9】

前記腫瘍が、固形腫瘍、例えば肺がん及び神経芽細胞腫、又は小児若しくは成人の血液がん、例えば白血病から選択される、請求項６に記載の使用のための請求項６～８のいずれか一項に記載の阻害剤製品。

【請求項10】

抗ＣＤ１１１モノクローナル抗体を用いることによって幹細胞を含むアフェレーシス試料中の多形核骨髄由来免疫抑制細胞を排除する工程を含む、幹細胞移植のための製品を調製する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多形核骨髄由来免疫抑制細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）に特異的な新規診断用及び治療用マーカーとしてのＣＤ１１１抗原に関する。

【0002】

特に、本発明は、多形核骨髄由来免疫抑制細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）のマーカーとしてＣＤ１１１抗原を用いることによって生体試料中の前記細胞を検出するための方法、及び免疫療法の標的としての前記マーカーの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）には、免疫調節活性を有する成熟及び未成熟骨髄細胞の不均一集団が含まれることが知られている。ＭＤＳＣは、造血系共通前駆細胞に由来し、一個体において先天免疫系と適応免疫系の両方を抑制することができる。

【0004】

健康な個体では、骨髄系統の前駆体（ＩＭＣ）は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のうちの約２．５％であり、骨髄中で生成され、顆粒球、マクロファージ、又は樹状細胞に分化する。反対に、がん、様々な感染性疾患、敗血症、外傷、骨髄移植、及び一部の自己免疫疾患などの病的状態では、ＩＭＣ分化の部分的な遮断、及びそれに続くＭＤＳＣの蓄積が誘導される。ＭＤＳＣが腫瘍進行、転移、及び腫瘍に対する免疫寛容の誘導に有利に働くことができるため、実質的な証拠によってヒト新生物におけるＭＤＳＣの重要性が示唆されている（１、２）。特に、これらの細胞の研究では、該細胞の増殖は、感染症、腫瘍、及び自己免疫疾患を含む炎症状態を特徴とする様々な病的状態と相関することが示されている。さらに、ある特定の因子がＭＤＳＣの増殖及び活性化の両方を促進する可能性があることが強調されている。文献において現在までのところ利用可能な証拠のほとんどは、主に動物の腫瘍モデル及びがん患者の研究に基づくものである。しかしながら、これらの細胞について、活性化過剰免疫系が調節されなければならない自己免疫性病理学においても研究することが非常に重要である。これらの自己免疫性病理学では、ＭＤＳＣが免疫応答の恒常性の維持に有利であることが実証されている（３）。

【0005】

ＭＤＳＣは表現型的及び機能的不均一性であるため、ＭＤＳＣが発生し、蓄積し、その活性を実行する正確な機序はまだ明白に定義されていない。ＰＭＮ－ＭＤＳＣの存在及び阻害効果は、ハイリスク白血病の治療のためのハプロタイプ一致移植の関連において、インビトロで既に実証されている。特に、造血幹細胞移植の関連では、ドナーの成熟ＮＫ細胞は、化学／放射線療法での調整の措置の後での、患者に残存する白血病細胞の排除に重要な役割を果たす。しかしながら、「αβＴ及びＢ枯渇」移植の関連では、ドナーのＮＫ細胞の抗白血病効果は大きく阻害される。既に実証されているように、Ｇ－ＣＳＦによって通常通りに「動員された」ドナーの移植片では、造血幹細胞の有意な増加に加えて、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの蓄積がみられる。ＰＭＮ－ＭＤＳＣは、様々な機序（ＩＤＯ、ＰＧＥ２、及びエクソソームの放出）でドナーの成熟ＮＫ細胞の活性を阻害し、よって、ドナーの成熟ＮＫ細胞の抗白血病効果を弱める（４）。

【0006】

腫瘍を有する患者では、さらに、末梢血中のＰＭＮ－ＭＤＳＣの存在と治療に対する応答との間に相関が認められている（１）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、ＰＭＮ－ＭＤＳＣは、免疫細胞の抗腫瘍応答を阻害する並外れた能力を示す。異なる病理学におけるＰＭＮ－ＭＤＳＣの免疫抑制的役割をかんがみると、よって、幹細胞移植の関連ではアフェレーシス産物、及び新生物を有する患者の末梢血の両方から、ＰＭＮ－ＭＤＳＣを標的選択して排除することを可能にするためには、ＰＭＮ－ＭＤＳＣを直接的に認識できるマーカーを使ってＰＭＮ－ＭＤＳＣを容易に同定できることが重要と考えられる。特に移植の関連では、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの直接的な同定及び選択／排除によって、ＮＫ細胞の抗白血病活性（ＧｖＬ）の機能的回復が可能となると考えられ、一方、新生物を有する患者では、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの直接的な同定及び選択／排除によって、末梢血中のＰＭＮ－ＭＤＳＣの存在が容易に確認でき、治療の有効性及び疾患の再発の両方を評価することが可能となると考えられる。

【0008】

しかしながら、ＰＭＮ－ＭＤＳＣを同定するための専用マーカーは、現在のところまだ特定されていない。

【0009】

現在のところ、ＭＤＳＣを同定するためには、ＭＤＳＣを単球性（ＭＯ）と多形核（ＰＭＮ）との２グループに類別する様々なマーカーを組み合わせることが必要である。ＭＤＳＣの両グループとも、成熟骨髄細胞及び好中球と形態的に似ていることから、それらを同定するためには、先の研究で実証されているように、特定の表面マーカーを互いに組み合わせて発現を評価すること、及びそれらの免疫抑制活性を評価することの両方が必要である（５）。ＭＤＳＣは系列（ＣＤ３／５６／１９／１２３）^－ＨＬＡ－ＤＲ^{ｌｏｗ／ｎｅｇ}ＣＤ３３^＋ＣＤ１１ｂ^＋として同定され；ＭＯ－ＭＤＳＣはＣＤ１４^＋であるのに対し、ＰＭＮ－ＭＤＳＣはＣＤ１５^＋ＣＤ６６ｂ^＋である。

【0010】

これらの細胞の同定には、密度勾配媒体上に層状に重ね、次いで、様々なマーカーの発現又は非存在を判定する複合的表現型分析を行い、最後に、機能性試験による免疫抑制能を評価する、という手順を実行することが必要である。

【0011】

上記をかんがみると、既知マーカーの不利な点を克服する、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの選択的同定のための新規マーカーを提供することが必要であることが明らかとなる。

【0012】

本発明による解決策は、ＰＭＮ－ＭＤＳＣを同定するための特異的マーカーを提供することを目的としており、この状況に適合する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】（Ａ）フローサイトメトリー分析、末梢血形態（ＦＳＣ）の評価、及び粒度（ＳＳＣ）による、異なった白血球亜集団の同定；（Ｂ）ＣＤ６６ｂ及びＣＤ１１１の発現；（Ｃ）単離されたＰＢＭＣにおけるＰＭＮ－ＭＤＳＣの同定；（Ｄ）同定されたＰＭＮ－ＭＤＳＣにおけるＣＤ１１１の発現、を示す図である。

【図2A-1】プロテインアトラスデータセットを使用した、様々なヒト組織におけるＣＤ１１１コードｍＲＮＡの発現を示す図である。

【図2A-2】プロテインアトラスデータセットを使用した、様々なヒト組織におけるＣＤ１１１コードｍＲＮＡの発現を示す図である。

【図2B】プロテインアトラスデータセットを使用した、免疫系の様々なヒト細胞サブセットにおける、ＣＤ１１１をコードするｍＲＮＡの発現を示す図である。

【図3】健康なドナー及び肺がんを有する患者（患者）の末梢血由来ＰＢＭＣにおけるＰＭＮ－ＭＤＳＣの頻度を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

ＣＤ１１１マーカーは、ポリオウイルス受容体関連１（ＰＶＲＬ１）又はネクチン－１とも呼ばれ、免疫グロブリンのスーパーファミリーに属すヒトタンパク質であり、またネクチンのメンバーとされることが公知である。ＣＤ１１１マーカーは、３つの細胞外免疫グロブリンドメインと膜貫通型シングルヘリックスと細胞質側末端とを有する膜タンパク質である。ＣＤ１１１は、Ｃａ２^＋非依存的に機能する接着分子である。後に下記にて、特に図２Ａにて示す、実験データによっても確認されるように、ＣＤ１１１マーカーは、様々な組織の接合部、特に、上皮組織の接合部間、又はニューロンの化学シナプスに限局化する（図２Ａ）。化学シナプスでは、ＰＶＲＬ１はＰＶＲＬ３（ネクチン－３）と相互作用しており、両タンパク質とも、既に脳発生の初期においてニューロン性組織において見出すことができる。ＣＤ１１１タンパク質はまた、ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）と相互作用することによって、単純ヘルペスウイルスの細胞への侵入において役割を果たしている（６）。

【0015】

本発明によると、ＣＤ１１１マーカーによって、ＰＭＮ－ＭＤＳＣを選択的に同定することができることが、今や見出されている。詳細には、後に下記にて報告する実験データによって示すように、本発明によると、既知の方法によって同定されたすべてのＰＭＮ－ＭＤＳＣがＣＤ１１１マーカーを発現することが観察された。ＰＭＮ－ＭＤＳＣは、健康な個体と比較して、腫瘍を有する個体の末梢血に極めて豊富に存在することが知られている。

【0016】

既知の方法とは異なり、本発明によるＣＤ１１１マーカーは、有利には、単核細胞を分離することを全く必要とせずに、ＰＭＮ－ＭＤＳＣをその好中球類似物と区別することができる。実際、ＰＢＭＣの精製で、末梢血を層状に重ねる工程が非存在の場合、顕微鏡法及びフローサイトメトリーの両方によって分析すると、ＰＭＮ－ＭＤＳＣと好中球とは同じ形態を有することを示す。したがって、既知の方法による末梢血中でのこれらの細胞の直接的な同定は、現在のところ不可能である。驚くべきことに、本発明によるＣＤ１１１マーカーの同定によれば、好中球はこのマーカーを発現しないため、末梢血で直接、ＰＭＮ－ＭＤＳＣを選択的に同定することが可能である。

【0017】

したがって、本発明によるＣＤ１１１発現の評価によって、有利には、末梢血試料で直接、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの迅速で直接的な同定が可能となり、疾患経過及び使用される様々な治療アプローチに対する応答に及ぼすＰＭＮ－ＭＤＳＣの影響を研究することが可能となる。上述のように、実際に、ＰＭＮ－ＭＤＳＣが、ＮＫ細胞及びＴリンパ球などの免疫系のリンパ系エフェクター細胞の機能性を激的に阻害することが知られている。

【0018】

さらに、本発明によるＣＤ１１１マーカーは、この細胞サブセット、すなわちＰＭＮ－ＭＤＳＣを排除するために、免疫療法の標的／マーカーとして有利に用いることができ、これによって、免疫系のエフェクター細胞の抗腫瘍性機能を回復させることができる。

【0019】

したがって、本発明の具体的な目的は、生体試料中の多形核骨髄由来免疫抑制細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）を検出するためのマーカーとしてのＣＤ１１１タンパク質（遺伝子ＩＤ：５８１８）の使用である。

【0020】

本発明によると、生体試料は、例えば末梢血、腹水、滑液などの液体試料、又は例えば新鮮な、パラフィン包埋された、若しくは凍結保存された組織生検などの固形組織から選択されてもよい。

【0021】

本発明は、生体試料中の多形核骨髄由来免疫抑制細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）を検出するための方法であって、前記細胞のためのマーカーとしてのＣＤ１１１タンパク質の同定によって前記細胞を検出する工程を含む、方法にさらに関する。本発明によると、生体試料は、例えば末梢血、腹水、滑液などの液体試料、又は例えば新鮮な、パラフィン包埋された、若しくは凍結保存された組織生検などの固形組織から選択されてもよい。本発明による方法は、フローサイトメトリー又は免疫組織化学的分析によって実施されてもよい。

【0022】

本発明によると、ＣＤ１１１タンパク質は、免疫療法の標的として有利に用いることができる。例えば、ＣＤ１１１マーカーは、多形核骨髄由来免疫抑制細胞を阻害且つ／又は選択的に排除することができる製品を調製するために用いることができ、前記製品は、ＣＤ１１１マーカーを自身の標的とする。多形核骨髄由来免疫抑制細胞の選択的排除によって、免疫系のエフェクター細胞の抗腫瘍性機能を回復させることが可能となる。

【0023】

本発明は、腫瘍又は感染性疾患の治療における使用のための多形核骨髄由来免疫抑制細胞の阻害剤製品であって、ＣＤ１１１マーカーを自身の標的とする、阻害剤製品にさらに関する。

【0024】

本発明による阻害剤製品は、したがって、ＣＤ１１１分子を自身の特異的標的とする分子であり、ＣＤ１１１分子に結合することによって、ＰＭＮ－ＭＤＳＣを認識且つ排除／阻害することができるものである。特に、前記阻害剤製品のＣＤ１１１との結合によって、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの抑制性機能の遮断又は細胞自身（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）の死の誘導を媒介することができる。

【0025】

本発明によると、前記阻害剤製品は、抗ＣＤ１１１モノクローナル抗体、又はＣＤ１１１タンパク質を選択的に認識することができる構築物で、特に受容体で、遺伝子改変されたエフェクター細胞（例えばＴ及びＮＫリンパ球）から選択されてもよい。

【0026】

特に、本発明による腫瘍又は感染性疾患の治療において用いられる阻害剤製品が、ＣＤ１１１を選択的に認識することができるモノクローナル抗体である場合、前記抗体は、２通りのアプローチによって用いることが可能であるという利点を有する。第１のアプローチによると、本発明による前記抗体は、内在性の免疫系を活性化する目的でそれ自体が投与されることが可能である：該抗体の免疫グロブリンの定常部（Ｆｃ）は、Ｆｃ部に対する受容体を発現する内在性の免疫系細胞（ナチュラルキラー細胞及び単球）によって認識されうる。この特異的認識によって、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）として同定されるプロセスの活性化が確実となる。さらに、該抗体のＦｃは、補体系によって認識され、ＣＤ１１１陽性細胞のオプソニン化及び排除を誘導することができる。

【0027】

本発明による別の治療アプローチによると、前記抗体のＦｃフラグメントを、例えば毒素、放射性同位体、又は薬物などの、ＣＤ１１１陽性多形核型の骨髄由来免疫抑制細胞の死を特異的に誘導することができる物質に結合させることができる。この方法では、抗ＣＤ１１１抗体の結合特異性と前記物質の薬理活性とが有利に組み合わせされることになる。したがって、本発明によると、前記阻害剤製品は抗ＣＤ１１１モノクローナル抗体であってもよく、前記抗体、又は、より特には前記抗体のＦｃフラグメントは、例えば薬物、毒素、又は放射性同位体などの、多形核型の骨髄由来免疫抑制細胞の死を誘導することができる物質に結合される。

【0028】

本発明によると、治療されるべき腫瘍は、固形腫瘍、例えば肺がん及び神経芽細胞腫、又は小児若しくは成人の血液がん、例えば白血病から選択され得る。

【0029】

さらに、本発明は、抗ＣＤ１１１モノクローナル抗体を用いることによって幹細胞を含むアフェレーシス試料中の多形核骨髄由来免疫抑制細胞を排除する工程を含む、幹細胞の移植のための製品を調製する方法に関する。

【0030】

ここで、本発明を、その好ましい一実施形態によって、添付の図面の例及び図への個々の言及とともに、例示ではあるが非限定として説明する。

【実施例】

【0031】

実施例１：ＰＭＮ－ＭＤＳＣのマーカーとしてのＣＤ１１１タンパク質の研究
材料及び方法
精製、単離、及び細胞培養物：
産業財産権法（ＣＰＩ）の第１７０条ｂｉｓに従った公表：実験で使用したヒト由来のすべての生物学的材料は、現行の立法に基づき、そのような採取及び使用に対する、材料を採取される個人のエクスプレスフリー（ｅｘｐｒｅｓｓｆｒｅｅ）及びインフォームドコンセントを得て採取され、使用された。（倫理委員会：１．ＢａｍｂｉｎｏＧｅｓｕＰａｅｄｉａｔｒｉｃＨｏｓｐｉｔａｌ照合番号１３２２８／０１／２０１９；２．地方保健当局３（ＬｏｃａｌＨｅａｌｔｈＡｕｔｈｏｒｉｔｙ３）（ＡＳＬ３、Ｇｅｎｏａ）コード：Ｎ９－１３、２０１３；ＩＤ：４９７５、２０２０）。

【0032】

アフェレーシス産物又は末梢血は、等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈（１：１比）した後、密度勾配媒体（フィコール）上に層状に重ねた。このように希釈した血液を、フィコール－パク（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）上にゆっくりと層状に重ね、２：１の血液：フィコール容量比を維持した。層状に重ねた試料を、次いで、傾斜ローターを備えた遠心機で、２０℃にて４００×ｇで２０分間、遠心分離した；減速勾配は最小又は無効に設定した。遠心分離終了時に、相の混合を防ぐよう、試料を静かに遠心機から取り出した。リンパ球及びＭＤＳＣの精製のためには、上層（血漿及び血小板を含む）の２／３を界面相（単核細胞を含む）近くまで慎重に吸引し；次いで、リンパ球及びＭＤＳＣの層を全部吸引し、新しい試験管に移した。次いで、採取した細胞の層に３容量のリン酸緩衝生理食塩水を加え、２０℃にて１００×ｇで１０分間、遠心分離し、上清を除去した。この洗浄を２回繰り返した。最後に、細胞ペレットを、もう一度、適用に好適な媒体に懸濁した。続いて、細胞計数を行い、１：１比にて細胞をトリパンブルーで希釈し、次いで自動セルカウンターを使用して細胞計数することによって生存率を評価した。

【0033】

フローサイトメトリー分析
ＭＤＳＣの同定では、それぞれに異なる表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体の混合物を使用して、マルチパラメトリックパネルを設計した。使用した抗体は：ＣＤ１１ｂ－ＦＩＴＣ、ＨＬＡＤＲ－ＰＥ、ＣＤ１４－ＥＣＤ、ＣＤ３３－ＰＣ７、ＣＤ６６－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ａ７００、ＣＤ１９－ＡＰＣ－Ａ７００、ＣＤ４５－ＫｒＯ、ＣＤ５６－ＢＶ６５０、及びＣＤ１２３－ＡＰＣ－Ａ７００であった。マーキングには、５００万個／ｍｌの濃度の細胞懸濁液１００μｌが必須である。この抗体の混合物を細胞に加えた。４℃にて２０分間のインキュベーションの後、ＰＢＳで洗浄し、マーカーの発現をフローサイトメトリー（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒのＣｙｔｏｆｌｅｘＬＸ）によって評価した。得られたデータは、続いてＦｌｏｗＪＯソフトウエアを使用して解析した。

【0034】

プロテインアトラスによる、ＣＤ１１１をコードするｍＲＮＡの発現の解析
ＣＤ１１１発現の評価は、アドレスｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／にてオンラインで入手可能なデータセットを使用して行った。異なるヒト組織及び免疫系の様々な細胞サブセットにおける発現を評価することによって解析した。ヒューマンプロテインアトラス（ＨｕｍａｎＰｒｏｔｅｉｎＡｔｌａｓ）の使用は、著作権によって保護されているデータベースの全部分に対し、ＣｒｅａｔｉｖｅＣｏｍｍｏｎｓＡｔｔｒｉｂｕｔｉｏｎ－ＳｈａｒｅＡｌｉｋｅ３．０によって国際的に許諾されている。

【0035】

結果及び考察
ＣＤ１１１マーカーは排他的な方法でＰＭＮ－ＭＤＳＣを同定する
ＭＤＳＣは、成熟骨髄細胞及び好中球と形態的に似ている。したがって、ＭＤＳＣを同定するためには、様々な表面マーカーの発現を互いに組み合わせて評価することが必要である。上述のように、先の研究において、ＭＤＳＣは系列ＨＬＡ－ＤＲ^{ｌｏｗ／ｎｅｇ}ＣＤ３３^＋ＣＤ１１ｂ^＋として同定され；ＭＯ－ＭＤＳＣはＣＤ１４^＋であるのに対し、ＰＭＮ－ＭＤＳＣはＣＤ１５^＋ＣＤ６６ｂ^＋であることが実証されている（７）。

【0036】

健康なドナーの末梢血（ＰＢ）を、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの存在を評価するために分析した。実証されているように、現在のところ、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの同定は、密度勾配による末梢血細胞（ＰＢＭＣ）の分別を必要とする。実際に、健康なドナーの末梢血では、異なった細胞集団は、細胞粒度（ＳＳＣ）及び寸法（ＦＳＣ）に基づいて識別することができる。図１Ａに示すように、顆粒球は高いＳＳＣ値及びＦＳＣ値を特徴とし、単球は中間的なＳＳＣ値及びＦＳＣ値を有するのに対し、Ｔ、Ｂ、及びＮＫリンパ球を含むリンパ球はＳＳＣ及びＦＳＣが最も低い集団である。しかしながら、ＰＭＮ－ＭＤＳＣはまた、好中球の形態と類似した形態を有する。図１Ｂは、ＣＤ６６ｂ^＋細胞（好中球）の一部に、ＣＤ１１１を共発現する小集団が含まれることを示している。２つの亜集団（ＣＤ６６ｂ^＋／ＣＤ１１１^－及びＣＤ６６ｂ^＋／ＣＤ１１１^＋）のＦＳＣ及びＳＳＣの評価を進めると（図１Ｂ）、両者は同じ形態を示すと推論することができる。

【0037】

続いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を好中球及び赤血球から分離するために、血液を密度勾配媒体（フィコール）上に層状に重ねた。層状に重ねた後に形成した単核細胞を、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの存在について分析した。マルチパラメトリックフローサイトメトリーを、単核細胞の試料中のこれらの細胞を同定する目的で使用した。図１Ｃに示すように、細胞がＰＭＮ－ＭＤＳＣ亜集団に属すという確認を可能とするには、連続的なゲーティング戦略が不可欠である。特に、ＰＭＮ－ＭＤＳＣは、リンパ球系統（ｌｉｎ－）のためのマーカー（ＣＤ３／５６／１９／１２３）^－を発現せず、ＨＬＡ－ＤＲの発現は低いレベルか又は陰性レベルであるが、ＣＤ３３^＋及びＣＤ１１ｂ^＋であることを示している。この亜集団の中で、ＰＭＮ－ＭＤＳＣはＣＤ６６ｂ及びＣＤ１５を発現している。最後に、同定されたＰＭＮ－ＭＤＳＣのうちでＣＤ１１１発現を評価したところ、これらの細胞はすべて、同じ様式で該マーカーを発現することが観察された（図１Ｄ）。したがって、密度勾配上に層状に重ねる工程が非存在の場合、ＰＭＮ－ＭＤＳＣ及び好中球を顕微鏡法及びフローサイトメトリーによって分析すると両者は同じ形態を有するように見えることから、末梢血でのこれらの細胞の直接的な同定は今まで不可能とされてきた。観察されたことに基づくと（図１）、末梢血でのＣＤ１１１発現によって、単核細胞を分離することを必要とせずに、ＰＭＮ－ＭＤＳＣをその好中球類似物と区別することが可能となると推論することができる。

【0038】

様々な組織領域におけるＣＤ１１１発現の評価
ＣＤ１１１抗原の発現が、生理学的及び病的状態下の末梢血に存在するＰＭＮ－ＭＤＳＣの集団に限定されていたことを確認する目的で、ｍＲＮＡ発現レベルに関する情報を提供する、オンラインの無料で入手できるデータベースを使用して、ＣＤ１１１発現の分析を実施した。分析したデータでは、形質細胞様樹状細胞が、ＣＤ１１１をコードするｍＲＮＡを発現する唯一の細胞であることが実証されている（図２Ｂ）。しかしながら、形質細胞様樹状細胞は、末梢血の循環細胞のうち１％未満である。さらに、形質細胞様樹状細胞におけるこのＣＤ１１１をコードするｍＲＮＡの発現は非常に低く、ｍＲＮＡの存在はタンパク質発現の直接的な証拠ではない。末梢血細胞亜集団の大部分に関するデータを含むこのデータベース内で、ＰＭＮ－ＭＤＳＣは分析されていなかったことは考慮するに値する。特に、骨髄系カテゴリーに関しては、樹状細胞、単球、及び好中球しか分析されていない。

【0039】

ＰＭＮ－ＭＤＳＣに特異的な新規の診断用及び治療用マーカーとしてのＣＤ１１１
健康なドナー及び腫瘍を有する患者から得た異なる末梢血試料において、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの存在を分析した。実証されているように、健康なドナーでは、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの頻度は非常に低く、末梢血の０％～５％の範囲である。この頻度は、Ｇ－ＣＳＦでの処理後にかなり上昇する。Ｇ－ＣＳＦは、造血幹細胞を動員するために使用されており、該造血幹細胞は、血液学的新生物（ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｎｅｏｐｌａｓｉａ）に冒された患者に追って注入されるものである（４）。さらに、肺疾患新生物に冒された患者では、健康なドナーの血液で観察された平均頻度と比較して、ＰＭＮ－ＭＤＳＣの増加が観察される（図３）。

【0040】

ＣＤ１１１発現の評価によって、末梢血試料で直接なされる、迅速且つ直接的なＰＭＮ－ＭＤＳＣの同定が可能となり、疾患経過及び使用される異なる治療アプローチに対する応答に及ぼすＰＭＮ－ＭＤＳＣの影響を研究することが可能となる。実際に、ＰＭＮ－ＭＤＳＣがＮＫ細胞及びＴリンパ球などの免疫系のリンパ系エフェクター細胞の機能性を激的に抑制することは知られている。さらに、この細胞サブセットを排除するために、ＣＤ１１１を免疫療法の標的として用い、これによって、免疫系のエフェクター細胞の抗腫瘍性機能を回復させることが可能である。

【0041】

（参考文献）
(1) Kumar V, Patel S, Tcyganov E,Gabrilovich DI. The Nature of Myeloid-Derived Suppressor Cells in the TumorMicroenvironment. Trends in immunology 2016;37(3):208-20 doi10.1016/j.it.2016.01.004.
(2) Nagaraj S, Youn JI, Gabrilovich DI.Reciprocal relationship between myeloid-derived suppressor cells and T cells.Journal of immunology 2013;191(1):17-23 doi 10.4049/jimmunol.1300654.
(3) Pawelec G, Verschoor CP,Ostrand-Rosenberg S. Myeloid-Derived Suppressor Cells: Not Only in TumorImmunity. Frontiers in immunology 2019;10:1099 doi10.3389/fimmu.2019.01099.
(4) Tumino N, Besi F, Di Pace AL, Mariotti FR,Merli P, Li Pira G, et al. PMN-MDSC are a new target torescue graft-versus-leukemia activity of NK cells in haplo-HSC transplantation.Leukemia 2020;34(3):932-7 doi 10.1038/s41375-019-0585-7.
(5) Bronte V, Brandau S, Chen SH, ColomboMP, Frey AB, Greten TF, et al. Recommendations for myeloid-derived suppressorcell nomenclature and characterization standards. Naturecommunications 2016;7:12150 doi 10.1038/ncomms12150.
(6) Di Giovine P, Settembre EC, Bhargava AK,Luftig MA, Lou H, Cohen GH, et al. Structure of herpessimplex virus glycoprotein D bound to the human receptor nectin-1. PLoSpathogens 2011;7(9):e1002277 doi 10.1371/journal.ppat.1002277.

【図1】