特表 2024-531942 線維芽細胞増殖因子受容体１阻害剤療法に対する応答性を同定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-03

(54)【発明の名称】線維芽細胞増殖因子受容体１阻害剤療法に対する応答性を同定する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20240827BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240827BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240827BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 31/498 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 31/47 20060101ALI20240827BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240827BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z ZNA

C07K16/18

A61P35/00

A61P43/00 111

A61K31/506

A61K31/496

A61K31/498

A61K31/5377

A61K31/47

G01N33/53 M

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508079

(86)(22)【出願日】2022-08-11

(85)【翻訳文提出日】2024-04-05

(86)【国際出願番号】 EP2022072607

(87)【国際公開番号】W WO2023017133

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】21190726.6

(32)【優先日】2021-08-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＪＡＶＡ

(71)【出願人】

【識別番号】308027710

【氏名又は名称】ウニヴェルジテート・ツー・ケルン

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マルチャーズ フロリアン

(72)【発明者】

【氏名】トーマス ロマン

【テーマコード（参考）】

4B063

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS36

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC28

4C086BC50

4C086BC52

4C086CB09

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZC42

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA40

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA50

(57)【要約】

本発明は、癌に罹患している被験体を線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）阻害剤療法に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして識別する方法に関する。該方法は、ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子改変の存在又は非存在の決定を伴い、遺伝子バリエーションは、ＦＧＦＲ１遺伝子のＯＲＦ内又は近傍内に断裂が位置する切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構によって引き起こされるコピー数変動である。これらの断裂はＦＧＦＲ阻害剤感受性と関連しており、ＦＧＦＲ１内の染色体内ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂は、ＦＧＦＲ阻害剤療法についての患者の層別化に使用することができる癌におけるＦＧＦＲ阻害剤治療の予測治療マーカーとして機能する可能性がある。さらに、癌治療に用いるＦＧＦＲ１の阻害剤、及び癌等の障害に関連する遺伝子バイオマーカーを識別する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）阻害剤療法に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして癌に罹患している被験体を識別する方法であって、前記方法が、
ａ）前記癌に関連する遺伝物質を含む生体試料を前記被験体から提供する工程と、
ｂ）前記遺伝物質中において、ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子改変の存在又は非存在を判定する工程と、
なお、前記遺伝子改変は、前記ＦＧＦＲ１遺伝子のＯＲＦ内又は近傍内に断裂が存在する、切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構等の染色体断裂によって引き起こされるコピー数変動である；
を含み、
前記被験体の前記生体試料中の前記ＦＧＦＲ１遺伝子における前記遺伝子改変の存在が、前記被験体がＦＧＦＲ１阻害剤療法に対するレスポンダーであることを示す、方法。

【請求項2】

前記癌が、固形癌、好ましくは乳癌、胃癌、膀胱癌、又は肺癌等のＦＧＦＲ１の発現を特徴とする癌、最も好ましくは扁平上皮肺癌（ＳＱＬＣ）等の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記被験体が、ヒト、好ましくはＳＱＬＣ等のＮＳＣＬＣと診断されたヒト患者である請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記生体試料が、前記被験体の腫瘍細胞を含む、好ましくは前記生体試料が、腫瘍生検である、又は切除された原発性腫瘍の試料である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＦＧＦＲ１阻害剤が、ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８、ＡＺＤ４５４７、ＴＫＩ２５８、ＪＮＪ４２７５６４９３、ペミガチニブ、ルシタニブ、ロガラチニブ、Ｄｅｂｉｏ １３４７、ＦＩＩＮ２、ＬＹ２８７４４５５、ＰＲＮ１３７１及びポナチニブからなる群より選択される阻害剤等の選択的又は非選択的ＦＧＦＲ１阻害剤である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記遺伝子改変が、
ａ）ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの少なくとも一部の短縮をもたらすＦＧＦＲ１遺伝子座の遺伝子修飾、及び／又は、
ｂ）ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子コピー数増加、又はその修飾バリアント、及び／又は、
ｃ）前記ＦＧＦＲ１遺伝子の連続回文配列、又は部分ＦＧＦＲ１遺伝子、及び／又は、
ｄ）非カノニカルＡＴＧ開始コドンの翻訳開始をもたらす前記ＦＧＦＲ１遺伝子座の遺伝子修飾、
である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記遺伝子改変が、ＦＧＦＲ１の外部ドメイン欠失バリアントの発現をもたらす前記ＦＧＦＲ１遺伝子の改変であり、好ましくはＦＧＦＲ１の前記バリアントが、ＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン９における非カノニカルＡＴＧから翻訳される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

患者における癌の治療に使用されるＦＧＦＲ１の阻害剤であって、前記癌が、ＦＧＦＲ１遺伝子の、又は前記ＦＧＦＲ１遺伝子のフラグメントの連続回文コピー数変動を含む前記ＦＧＦＲ１遺伝子における遺伝子改変を含むゲノムを特徴とし、任意に、前記癌が、固形癌、好ましくは乳癌、胃癌、膀胱癌又は肺癌等のＦＧＦＲ１の発現を特徴とする癌、最も好ましくは扁平上皮肺癌（ＳＱＬＣ）等の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、患者における癌の治療に使用されるＦＧＦＲ１の阻害剤。

【請求項9】

前記ＦＧＦＲ１の阻害剤が、好ましくはＦＧＦＲ、好ましくはＦＧＦＲ１に特異的に結合して阻害する、低分子阻害剤、抗体等の抗原結合タンパク質、又は任意の抗体誘導体であり、任意に、前記ＦＧＦＲ１の阻害剤が、ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８、ＡＺＤ４５４７、ＴＫＩ２５８、ＪＮＪ４２７５６４９３、ペミガチニブ、ルシタニブ、ロガラチニブ、Ｄｅｂｉｏ １３４７、ＦＩＩＮ２、ＬＹ２８７４４５５、ＰＲＮ１３７１及びポナチニブからなる群より選択される阻害剤等の選択的又は非選択的ＦＧＦＲ１阻害剤である、請求項８に記載の使用のためのＦＧＦＲ１の阻害剤。

【請求項10】

前記遺伝子改変が、前記ＦＧＦＲ１遺伝子の、又は前記ＦＧＦＲ１遺伝子のフラグメントの局所増幅であり、任意に、前記ＦＧＦＲ１遺伝子のフラグメントが、発現可能な配列であり、かつＦＧＦＲ１タンパク質バリアント、好ましくは外部ドメイン欠失ＦＧＦＲ１タンパク質バリアントをもたらす、請求項８又は９に記載の使用のためのＦＧＦＲ１の阻害剤。

【請求項11】

前記治療が、前記患者をＦＧＦＲ１阻害剤療法に対するレスポンダーとして識別する予備工程を含み、前記予備工程が、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の使用のためのＦＧＦＲ１阻害剤。

【請求項12】

被験体における癌の診断、予後、層別化及び／又は治療法のモニタリングの方法であって、
ａ）前記被験体からの生体試料を提供する工程と、
ｂ）前記生体試料中において、好ましくはＦＧＦＲ１の細胞外ドメインが欠失している、切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構、例えばｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ ＢＦＢ様機構等の染色体断裂であって、ＦＧＦＲ１遺伝子のＯＲＦ内又は近傍内に前記断裂が存在する染色体断裂、前記ＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の改変、ＦＧＦＲ１タンパク質の改変、前記ＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物のレベルの変化、及び／又は前記ＦＧＦＲ１タンパク質のレベルの変化の存在又は非存在を判定する工程と、
を含み、
健康な対照又は基準の値と比較して、工程（ｂ）で判定された前記染色体断裂、前記ＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の改変、前記ＦＧＦＲ１タンパク質の改変、前記ＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物のレベルの差、及び／又は前記ＦＧＦＲ１タンパク質のレベルの差の存在が、前記被験体における癌の存在を示す、方法。

【請求項13】

前記染色体断裂が、
（ｉ）ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの少なくとも一部の短縮をもたらす前記ＦＧＦＲ１遺伝子座の遺伝子修飾、及び／又は、
（ｉｉ）ＦＧＦＲ１の、若しくは前記ＦＧＦＲ１遺伝子のフラグメントの局所増幅、及び／又は、
（ｉｉｉ）前記ＦＧＦＲ１遺伝子の連続回文配列、若しくは部分ＦＧＦＲ１遺伝子、及び／又は、
（ｉｖ）非カノニカルＡＴＧ開始コドンの翻訳開始をもたらす、前記ＦＧＦＲ１遺伝子座の遺伝子修飾、
を誘導する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子修飾、及び／又はｍＲＮＡ転写産物の改変が、配列番号２、３、１０、１１、１５、１６、２０、２１、２５、２８、３１、３４若しくは３７のいずれか１つによる核酸配列を含み、及び／又は改変ＦＧＦＲ１タンパク質が、配列番号９、１４、１９、２４、２６、２９、３２若しくは３５のいずれか１つによるアミノ酸配列を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

前記癌が固形癌であり、好ましくは乳癌、胃癌、膀胱癌又は肺癌等のＦＧＦＲ１の発現を特徴とする癌であり、最も好ましくは扁平上皮肺癌（ＳＱＬＣ）等の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌に罹患している被験体を、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）阻害剤療法に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして識別する方法に関する。この方法は、ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子改変の存在又は非存在の判定を伴い、遺伝子改変は、染色体断裂によって引き起こされるコピー数変動である。切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構はこれらのコピー数変動の主要な原因であり、ＦＧＦＲ１遺伝子のＯＲＦ内又は近傍内の断裂を誘導する。断裂は、ＦＧＦＲ１の発現の調節解除、又はカノニカルＦＧＦＲ１ ＡＴＧ開始コドンの欠失をもたらし、ＦＧＦＲ阻害剤の感受性と関連し、ＦＧＦＲ１中又はそれに近い染色体内ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂は、ＦＧＦＲ阻害剤療法のための患者の層別化に使用することができる癌におけるＦＧＦＲ阻害剤療法の予測治療マーカーとして機能する可能性がある。さらに、癌の治療に用いるＦＧＦＲ１の阻害剤、癌等の障害に関連する遺伝子バイオマーカーを識別する方法が提供される。

【背景技術】

【0002】

受容体チロシンキナーゼの線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ）ファミリーは、５つの高度に保存されたメンバー、すなわち、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）、及び線維芽細胞増殖因子受容体様１（ＦＧＦＲＬ１）を含む。ＦＧＦＲファミリーの完全長の代表的なタンパク質メンバーは、２つ又は３つの免疫グロブリン様ドメイン、１つの疎水性膜貫通セグメント、及び細胞質チロシンキナーゼドメインで構成される細胞外領域のみからなる。タンパク質の細胞外部分は線維芽細胞増殖因子と相互作用し、下流シグナルのカスケードが動き始める。

【0003】

ＦＧＦＲ１はｆｍｓ関連チロシンキナーゼ－２及びＣＤ３３１としても知られており、ＦＧＦＲ１遺伝子はヒトの８番染色体上のｐ１１．２３の位置（すなわち８ｐ１１．２３）に位置する。この遺伝子は２４個のエクソンを含み、エクソン８Ａ又はエクソン８Ｂにおいて交互にスプライシングされる前駆体ｍＲＮＡをコードし、それによってＦＧＦＲ１の２つの異なるアイソフォーム、ＦＧＦＲ１－ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ１ｂとも呼ばれる）とＦＧＦＲ１－ＩＩＩｃ（ＦＧＦＲ１ｃとも呼ばれる）をそれぞれコードする２つのｍＲＮＡを生成する。ＦＧＦＲ１－ＩＩＩｃはＦＧＦＲ１遺伝子の機能の大部分を担っているように見えるが、ＦＧＦＲ１－ＩＩＩｂはマイナーでやや冗長な機能的役割しか持たないようである。さらに、少なくとも９つのＦＧＦＲ１スプライスバリアントの発現についても説明される（遺伝子：ＦＧＦＲ１（ＥＮＳＧ００００００７７７８２）－ホモ・サピエンス－Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ１０３）。特に、胚発生の間に、幾つかの細胞が、ＦＧＦＲの細胞外部分のみを発現する可能性が高い。興味深いことに、この部分の分泌はＦＧＦトラップとして機能し（ＦＧＦはＦＧＦＲ１の活性化リガンドである）、ＦＧＦＲシグナル伝達をＦＧＦ勾配によって調節する。

【0004】

以前の研究は、ＦＧＦＲ１の発現増強と、乳癌、膀胱癌及び肺癌等の様々な癌との関連を明らかにした。また、ＦＧＦＲ１遺伝子の発現における体細胞変異及びエピジェネティックな変化は、膠芽腫、黒色腫、乳癌、血液癌、及び肺癌を含む様々な癌と関連していることがわかっている。ＦＧＦＲ１遺伝子は、重複、他の遺伝子との融合、及び点突然変異の結果、ヒトの癌においてしばしば活性化される。したがってＦＧＦＲ１は原癌遺伝子に分類される。また、幾つかの癌性疾患は原則としてＦＧＦＲ１に依存していることが知られている。以上のことから、ＦＧＦＲ阻害剤は、遺伝子増幅又はＦＧＦＲ１のメンバーの発現増加を伴う癌患者の治療において、実行可能な治療選択肢となり得る。現在、複数のＦＧＦＲ阻害剤が臨床試験中である。

【0005】

特許文献１は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤による治療に反応する癌患者を識別する方法、及び癌患者の治療方法を開示する。この方法は、ＦＧＦＲ変異体遺伝子パネルからの１つ以上のＦＧＦＲ変異体の存在について患者からの生体試料を評価することを伴う。

【0006】

特許文献２は、ＦＧＦＲの状態及びｃ－ｍｙｃの状態の評価を含むＦＧＦＲ阻害剤に対する哺乳動物の腫瘍細胞又は癌細胞の応答性を予測する方法を開示し、ＦＧＦＲ及びｃ－ｍｙｃの状態は、該阻害剤に対する応答性の指標である。

【0007】

特許文献３は、癌を有することが疑われる被験体から試料を入手し、その試料中に線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の融合が存在するかどうかを判定することによって癌を特徴づける方法であって、ＦＧＦＲ融合がＦＧＦＲ遺伝子座を含み、ＦＧＦＲ融合の存在又は非存在に基づいて癌を特徴づける方法を開示する。

【0008】

肺癌は、２種類の多様な癌、すなわち非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）に分類される。ＮＳＣＬＣという用語はＳＣＬＣ以外のあらゆる種類の上皮性肺癌を含み、肺癌全体の約８５％を占める。残念ながら、ＮＳＣＬＣのほとんどの症例はＳＣＬＣと比較して化学療法に比較的非感受性である。ＮＳＣＬＣの最も一般的なタイプは、扁平上皮肺癌（ＳＱＬＣ）、大細胞癌、及び腺癌である。

【0009】

扁平上皮肺癌（ＳＱＬＣ）は肺癌のサブタイプとしては２番目に多く、癌の中でも最も予後が悪い。残念ながら、扁平上皮肺癌では、肺腺癌で起こるような効果的な薬物治療の機会を提供する遺伝的に活性化されたキナーゼ標的（ＥＧＦＲ変異及びＡＬＫ再編成等）は今のところ同定されていない。ＦＧＦＲ１の再発増幅（８ｐ１１．２３に位置する）の発見は、そのような増幅を持つ患者がＦＧＦＲ阻害の恩恵を受けるかもしれないという期待を高めた。臨床試験では、ＦＧＦＲ１増幅腫瘍を有する患者のうち、単一薬剤のＦＧＦＲ阻害に対して永続性のある応答を示したのは少数派（およそ１０％）であった。ＮＳＣＬＣ、特にＳＱＬＣ等の新規癌治療方法の継続的な必要性から、線維芽細胞増殖因子受容体阻害療法のレスポンダーと非レスポンダーを区別する信頼性の高い方法が急務となっている。したがって、本発明の根本にある技術的課題は、線維芽細胞増殖因子受容体の阻害剤による抗癌治療に対する被験体及び／又は細胞の応答性を評価する手段及び方法を提供することである。

【0010】

上記技術的課題は、請求項に特徴づけられる実施形態の提供によって解決される。

【0011】

本発明は、驚くべきことに、本明細書において以下及び下記の（appended）実施例に示されているように、８ｐ腕内で切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構が起こり得ることが判明したため、上記特定された技術的課題を解決する。興味深いことに、ＢＦＢ様機構は、８ｐ腕内において幾つかのｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ及びｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌの断裂を誘導する。ＦＧＦＲ１転写開始部位に近いｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂は、局所ＦＧＦＲ１増幅を誘導し、ＦＧＦＲ１転写の調節を解除し、ＦＧＦＲ阻害剤の感受性と関連している。さらに、ＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン９内のｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂は、カノニカルＦＧＦＲ１ ＡＴＧ開始コドンの欠失を誘導し、癌細胞は下流のフレーム内ＡＴＧ開始コドンを使用する。これは、しばしばＦＧＦＲ１の細胞外部分に遅れた短縮型ＦＧＦＲ１バージョンの転写につながり、ＦＧＦＲ１シグナル伝達に対する阻害機能を有する。したがって、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ１に近いこれらのｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ染色体内断裂は、ＦＧＦＲ阻害剤療法のための患者の層別化に使用することができるＮＳＣＬＣ、特にＳＱＬＣ等の癌におけるＦＧＦＲ阻害剤療法の予測治療マーカーとして機能する可能性がある。ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子改変の存在又は非存在の分析は、遺伝子改変がＦＧＦＲ１遺伝子のＯＲＦ内又は近傍内に位置する断裂によって引き起こされるコピー数変動であり、ＦＧＦＲ１阻害剤療法による癌／腫瘍治療に対する腫瘍／癌細胞又は個体の応答性の信頼できる予測を提供する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１６００９０６３３号

【特許文献2】欧州特許出願公開第２６９５９５０号

【特許文献3】欧州特許出願公開第３１０２７０５号

【発明の概要】

【0013】

一般に、また、簡潔な説明によって、本発明の主要な態様を以下のように説明することができる。

【0014】

第１の態様においては、本発明は、癌に罹患している被験体を、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）阻害剤療法に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして識別する方法に関する。

【0015】

第２の態様においては、本発明は、患者における癌の治療に使用されるＦＧＦＲ１の阻害剤に関する。

【0016】

第３の態様においては、本発明は、癌に罹患している被験体を、受容体結合剤による治療法に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして識別する方法に関する。

【0017】

第４の態様においては、本発明は、障害に関連する遺伝子バイオマーカーを識別する方法に関する。

【0018】

第５の態様においては、本発明は、被験体における癌の診断、予後、層別化及び／又は治療法のモニタリングの方法に関する。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明の要素について説明する。これらの要素は、具体的な実施形態を伴って列挙されているが、どのような方法でも、またいくつでも組み合わされて、追加の実施形態を生み出し得ることを理解されたい。種々の記載例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載した実施形態のみに限定するものと解するべきではない。この記載は、２つ以上の明示的に記載された実施形態を組み合わせる、又は１つ以上の明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持し、包含するものと解すべきである。さらに、本出願における記載された全てのあらゆる要素の順列及び組み合わせは、文脈が別段の指示をしない限り、本出願の記載によって開示されたものと見なされるべきである。

【0020】

第１の態様においては、本発明は、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）阻害剤療法に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして癌に罹患している被験体を識別する方法であって、方法が、
ａ）癌に関連する遺伝物質を含む生体試料を被験体から提供する工程と、
ｂ）遺伝物質中において、ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子改変の存在又は非存在を判定する工程と、
なお、遺伝子改変は、ＦＧＦＲ１遺伝子のＯＲＦ内又は近傍内に断裂が存在する、切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構等の染色体断裂によって引き起こされるコピー数変動である；
を含み、
被験体の生体試料中のＦＧＦＲ１遺伝子における遺伝子改変の存在が、被験体がＦＧＦＲ１阻害剤療法に対するレスポンダーであることを示す、方法に関する。

【0021】

本明細書で使用される場合、「被験体」又は「患者」という用語は、特定の治療の受け手となる任意の動物（例えば哺乳動物）を指し、限定されるものではないが、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類等を含む。典型的には、本明細書において「被験体」及び「患者」という用語は、ヒトの被験体を指す際に同じ意味で使用される。特に好ましい実施形態においては、被験体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、又はヒト等の哺乳動物であり、好ましくはヒト（ヒト患者等）、より好ましくは癌に罹患するリスクのあるヒト患者であり、最も好ましくは肺移植、肺同種移植、造血幹細胞の移植、化学療法、及び／又は放射線療法を受けたことがあるヒト患者であり、任意に、該ヒト患者は、癌に罹患するリスクがある。

【0022】

本明細書で使用される場合、「癌に罹患するリスクがある被験体」又は「癌に罹患するリスクがあるヒト患者」という用語は、癌を示す１つ以上の症状を呈する被験体を指す。

【0023】

本発明による方法は、癌に罹患している被験体を、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）阻害剤療法に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして識別するのに有用であり、ここで、癌は、任意の種類の癌である。特に好ましい実施形態においては、癌は、固形癌、好ましくは乳癌、胃癌、膀胱癌、又は肺癌等のＦＧＦＲ１の発現を特徴とする癌、最も好ましくは扁平上皮肺癌（ＳＱＬＣ）等の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。

【0024】

好ましい実施形態においては、癌に罹患している被験体を線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）阻害剤療法に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして識別する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法である。本明細書に記載される方法は非侵襲的であるため、「生体試料の提供」という用語は、被験体に対して行われる外科的処置を含むと解釈されないことが好ましい。好ましい実施形態においては、被験体は、ヒト、好ましくはＳＱＬＣ等のＮＳＣＬＣと診断されたヒト患者である。

【0025】

本発明と関連して、「診断」又は「診断（の）」という用語は、病態の存在又は性質を特定することを意味する。診断方法は、感度及び特異度が異なる。診断アッセイの「感度」は、病気の人の陽性率（「真陽性」の割合）である。アッセイによって検出されなかった病気の人は「偽陰性」である。病気ではなく、アッセイで陰性と判定された被験体は、「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異度」は、１から偽陽性率を引いたもので、「偽陽性」率は病気のない人が陽性になる割合として定義される。特定の診断方法では、病状の確定診断ができない場合があるが、その方法が、診断に役立つ肯定的な兆候を提供すれば十分である。

【0026】

本明細書で使用される場合、「生体試料」という用語は、取得され、ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子改変の存在又は非存在についてアッセイされ得る試料を指し、遺伝子改変とは、断裂が本発明により開示されたＦＧＦＲ１遺伝子のＯＲＦ内又は近傍内に位置する、切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構等の染色体断裂によって引き起こされるコピー数変動である。生体試料は、生体液（例えば、血液、脳脊髄液、尿、血漿、血清）、組織生検等を含み得る。生体試料が、被験体の腫瘍細胞を含む、好ましくは生体試料が、腫瘍生検である、又は切除された原発性腫瘍の試料であることが好ましい。

【0027】

ＦＧＦＲ１依存性の根本的な機構を理解するため、本発明者らは、ＦＧＦＲ阻害時に応答が不明なＦＧＦＲ１増幅原発腫瘍の全ゲノムシーケンシング及びトランスクリプトームシーケンシングを行った。さらに、本発明者らは、ＦＧＦＲ阻害時の応答が一部の試料で知られていたＦＧＦＲ１増幅試料のディープシーケンシングを行った（実施例セクションを参照されたい）。両方のコホートにおいて、本発明者らは、ＦＧＦＲ１の転写開始部位に近い染色体内ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂がＦＧＦＲ１の局所増幅を担うことを特定した。本発明の過程で、これらの特異的な断裂は、驚いたことに、扁平上皮肺癌における切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構によって好んで引き起こされることがわかった。増幅機構は８ｐ腕内でｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ、続いてｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌの染色体内断裂を誘導する。

【0028】

この機構に基づいて、本発明者らは、観察された８ｐ１１－ｐ１２コピー数のプロファイルを再構築することができ、８ｐ腕内の全てのゲノム断裂のみを考慮に入れた。さらに、本発明者らは、ＦＧＦＲ１の転写開始側に近いｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂が多数の８ｐ１１－ｐ１２増幅試料で発生し、ＦＧＦＲ１の局所増幅につながることを示すことができた。これは主にＦＧＦＲ阻害剤療法に応答する細胞株、ＰＤＸモデル、及び患者試料で観察された。さらに、本発明者らはまた、ＦＧＦＲ１を増幅した一部の試料では、ＦＧＦＲ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内で断裂が起こり、外部ドメインを欠くＦＧＦＲ１（ΔＥＣ－ＦＧＦＲ１）の体細胞改変バリアントの発現を引き起こすことを示すことができた。具体的には、本発明者らは、ＩＨＣ染色、トランスクリプトームシーケンシング、及びゲノム機能解析によって示されるように、ＦＧＦＲ１の短いバリアント、特に非カノニカルインフレームＡＴＧ開始コドンを使用して発癌性ＦＧＦＲ１を欠損した改変ＦＧＦＲ１転写産物の発現を観察した。

【0029】

改変ＦＧＦＲ１転写産物の過剰発現はＢａｆ３細胞を形質転換させ、ＦＧＦＲ１依存的な表現型をもたらす。本発明者らの結果は、ＦＧＦＲ１の外部ドメインの短縮は、８ｐ１１．２３増幅扁平上皮肺癌においてｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂によって引き起こされる頻繁な事象であることを実証する。ＦＧＦＲ阻害剤感受性及びＦＧＦＲ１の染色体内ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂と関連するこれらの断裂は、ＦＧＦＲ阻害剤療法のための患者の層別化に使用することができる扁平上皮肺癌におけるＦＧＦＲ阻害剤療法の予測治療マーカーとして機能する可能性がある。

【0030】

したがって、本発明の方法及び手段を、患者をＦＧＦＲ阻害剤療法に対するレスポンダーと非レスポンダーに層別化するために使用することができる。本発明の目的における「層別化する」又は「層別化」という用語は、患者の入院、１つ以上の薬物の使用、効果及び／又は投与量、治療手段、又は疾患の経過及び治療若しくは病因の経過のモニタリング、又は例えば新規若しくは既存のサブタイプへの疾患の分類、又は疾患とその患者の鑑別といった、本発明による方法が患者の治療及び治療法に関する可能な決定を下せる利点を指す。

【0031】

本発明の方法及び手段は、癌の治療法、特に癌患者におけるＦＧＦＲ阻害剤療法をモニターするためにも使用できる。「治療法のモニタリング」という用語は、本発明の目的において、治療法を受ける被験体における疾患の進行を観察することを意味する。言い換えれば、治療中の被験体は、定期的に適用される治療法の効果についてモニターされ、医師は、処方された治療が有効かどうかを治療中の早い段階で推定することができ、したがって、それに応じて治療レジメンを調整することができる。

【0032】

本明細書で使用される場合、「阻害剤に対する応答性」又は「阻害剤に対して応答性の個体」という用語は、本発明と関連して、哺乳動物腫瘍細胞（又は哺乳動物腫瘍）又は哺乳動物癌細胞（又は哺乳動物癌）又は癌に罹患している個体、癌に罹患しているか若しくは罹患しやすいと疑われる個体が、ＦＧＦＲ１の阻害剤（又はＦＧＦＲ１の阻害剤による治療）に対する応答を示すことを意味する。当業者は、ＦＧＦＲ１の阻害剤に応答すると予測される細胞（複数の場合もある）又は個体（複数の場合もある）が、確かにＦＧＦＲ１の阻害剤（又はＦＧＦＲ１の阻害剤による治療）に対する応答を示すことを容易に確認する立場にある。例えば、阻害剤に対する応答は、腫瘍の増殖の減少及び／又は停止、及び／又は腫瘍の大きさの縮小、転移の形成の防止、又は転移の数若しくは大きさの縮小等、癌の苦しみの減少に反映される場合がある。

【0033】

本明細書で使用される場合、「応答」という用語は、本発明で特定された個体／患者又は腫瘍細胞の「完全応答」又は「部分応答」の形で反映される場合がある。かかる「完全応答」又は「部分応答」は、主に、ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの少なくとも一部の短縮をもたらすＦＧＦＲ１遺伝子座の遺伝子修飾、及び／又はＦＧＦＲ１遺伝子の標的遺伝子コピー数増加、又はその修飾バリアント、及び／又はＦＧＦＲ１遺伝子の連続回文配列、若しくは部分的なＦＧＦＲ１遺伝子を持つ腫瘍細胞又は個体で見ることができる。したがって、「完全応答」又は「部分応答」、特に「完全応答」が好ましい。

【0034】

この文脈において、「応答」という用語は「腫瘍の縮小」を指すことがある。「腫瘍の縮小」とは、ＦＧＦＲ１阻害剤による治療開始時（すなわち、ＦＧＦＲ１阻害剤による治療前）の初期の体積と比較して、ＦＧＦＲ１阻害剤による治療時の腫瘍の体積の減少を指し得る。例えば、腫瘍体積が初期体積の約６５％未満であれば、治療によって腫瘍が縮小したことになる。例えば、ＦＧＦＲ１阻害剤による治療開始時（すなわち治療前）の初期腫瘍体積（１００％）と比較して６５％未満（約１％～６４％のように）の腫瘍体積は、「部分応答」（又は部分寛解；例えば、ＦＧＦＲ１阻害剤による治療に応答した、腫瘍サイズの減少、又は体内の癌の程度の減少）を表すことができる。「部分応答」は、治療開始時（すなわち治療前）の初期腫瘍体積と比較した、一連の治療中の（一時的な）腫瘍の縮小／腫瘍体積の減少を包含し得る。

【0035】

好ましくは、癌に罹患しており、本発明に従って線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）阻害剤療法に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして識別された患者群が「完全応答」を示す。本明細書で使用される場合、「完全応答」という用語は、ＦＧＦＲ１阻害剤（又はＦＧＦＲ１阻害剤による治療）に応答して、癌の兆候が全て消失することを指し得る。本明細書では、「完全応答」という用語と「完全寛解」という用語は同じ意味で使用することができる。例えば、「完全応答」は、腫瘍が消失するまで腫瘍が縮小し続けることに反映される場合がある。例えば、ＦＧＦＲ１阻害剤による治療開始時（すなわち、治療前）の腫瘍体積が初期腫瘍体積（１００％）と比較して０％であれば「完全応答」を表すことができる。したがって、本明細書で使用される場合、「阻害剤に対する応答性」又は「阻害剤に対して応答性の個体」とは、本発明に従って応答することが予測される腫瘍（細胞）、癌（細胞）又は個体の「完全応答」／「完全応答性」を示し得る。

【0036】

本発明の線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）阻害剤療法に対して、癌に罹患している被験体をレスポンダー又は非レスポンダーとして識別するためのあらゆる方法及び手段は、サンプリングされた標本の従来の組織学的分析によって補完することができ、これにより、癌のより早期かつ特異的な診断が可能となり、より良い結果をもたらす可能性のある早期治療が可能となる。

【0037】

本発明と関連して、「ＦＧＦＲ１阻害剤」又は「ＦＧＦＲ１の阻害剤」若しくは「ＦＧＦＲ１の拮抗剤」という用語又はこれらに類する表現は、ＦＧＦＲ１の発現、機能及び／又は安定性の調節因子としての活性を有する任意の化合物又はＦＧＦＲ１のバリアントを包含する。幾つかの実施形態においては、ＦＧＦＲ１阻害剤は、低分子、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、ペプチド模倣タンパク質、抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）（例えば、抗体、抗体様分子若しくはその他の抗原結合誘導体、又はその抗原結合フラグメント）、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸、例えばアンチセンス又は阻害性ＤＮＡ又はＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマー、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等から選択することができ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等のそのバリアント又は誘導体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクト及び／又はガイド核酸（ｇＲＮＡ又はｇＤＮＡ）及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ等の標的遺伝子編集のための遺伝子コンストラクトを含む。

【0038】

好ましい実施形態においては、ＦＧＦＲ１阻害剤は、ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８、ＡＺＤ４５４７、ＴＫＩ２５８、ＪＮＪ４２７５６４９３、ペミガチニブ、ルシタニブ、ロガラチニブ、Ｄｅｂｉｏ １３４７、ＦＩＩＮ２、ＬＹ２８７４４５５、ＰＲＮ１３７１及びポナチニブからなる群より選択される阻害剤等の選択的又は非選択的ＦＧＦＲ１阻害剤、例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及び／又はＦＧＦＲ４の阻害剤である。

【0039】

別の好ましい実施形態は、癌に罹患している被験体をＦＧＦＲ１阻害剤療法のレスポンダー又は非レスポンダーとして識別する方法に関連し、遺伝子改変は、
ａ）ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの少なくとも一部の短縮をもたらす、ＦＧＦＲ１遺伝子座の遺伝子修飾、及び／又は、
ｂ）ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子コピー数増加、又はその修飾バリアント、及び／又は、
ｃ）ＦＧＦＲ１遺伝子の連続回文配列、又は部分的なＦＧＦＲ１遺伝子、及び／又は、
ｄ）非カノニカルＡＴＧ開始コドンの翻訳開始をもたらす、ＦＧＦＲ１遺伝子座の遺伝子修飾である。

【0040】

ＦＧＦＲ１のバリアントは、幾つかの実施形態においては、配列番号１（ヒトＦＧＦＲ１アミノ酸配列）と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、最も好ましくは、配列番号１と少なくとも９５％（少なくとも９８％等）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明の好ましい一実施形態においては、ＦＧＦＲ１のバリアントは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0041】

本明細書で使用される場合、「同一性」又はパーセント「同一性」という用語は、２つ以上の核酸又はタンパク質／ポリペプチド配列と関連して本明細書の任意の箇所で使用される場合、同一の２つ以上の配列若しくは部分配列、又は配列比較アルゴリズムを使用して、若しくは手動アライメント及び目視検査（ＮＣＢＩウェブサイト等を参照）によって測定した、同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの指定された割合（すなわち、比較ウィンドウ又は指定された領域に対して最大限の対応が得られるように比較及び整列した場合、指定された領域に対して、好ましくは、その完全長配列に対して、約６０％又は少なくとも約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、若しくは９４％、又は少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、若しくは９４％の同一性、より好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性）を持つ（又は少なくとも持っている）２つ以上の配列若しくは部分配列を指す。

【0042】

特に好ましい実施形態においては、遺伝子改変は、ＦＧＦＲ１の外部ドメイン欠失バリアントの発現をもたらすＦＧＦＲ１遺伝子の改変であり、好ましくはＦＧＦＲ１のバリアントが、ＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン９における非カノニカルＡＴＧから翻訳される。

【0043】

本発明の更なる態様は、患者における癌の治療に使用されるＦＧＦＲ１の阻害剤であって、癌が、ＦＧＦＲ１遺伝子の、又はＦＧＦＲ１遺伝子のフラグメントの連続回文コピー数変動を含むＦＧＦＲ１遺伝子における遺伝子改変を含むゲノムを特徴とする、患者における癌の治療に使用されるＦＧＦＲ１の阻害剤に関する。ＦＧＦＲ１遺伝子又はＦＧＦＲ１遺伝子のフラグメントの連続回文コピー数変動を含むＦＧＦＲ１遺伝子中のかかる遺伝子改変は、調節されていない転写の原因となり得る。

【0044】

好ましい実施形態は、患者における癌の治療に使用するＦＧＦＲ１の阻害剤に関し、連続回文コピー数変動は外向性回文である。

【0045】

更なる実施形態は、ＦＧＦＲ１の阻害剤が、好ましくはＦＧＦＲ、好ましくはＦＧＦＲ１に特異的に結合して阻害する、低分子阻害剤、抗体等の抗原結合タンパク質、又は任意の抗体誘導体である、患者における癌の治療に用いるＦＧＦＲ１の阻害剤に関する。

【0046】

特に好ましい実施形態においては、ＦＧＦＲ１の阻害剤は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及び／又はＦＧＦＲ４、好ましくはＦＧＦＲ１の選択的又は非選択的阻害剤であり、例えば、ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８、ＡＺＤ４５４７、ＴＫＩ２５８、ＪＮＪ４２７５６４９３、ペミガチニブ、ルシタニブ、ロガラチニブ、デビオ１３４７、ＦＩＩＮ２、ＬＹ２８７４４５５、ＰＲＮ１３７１及びポナチニブからなる群より選択される阻害剤である。

【0047】

本発明による患者における癌の治療に用いるＦＧＦＲ１の阻害剤は、あらゆる種類の癌の治療に有用である。好ましい実施形態においては、ＦＧＦＲ１の阻害剤は、癌が固形癌、好ましくは乳癌、胃癌、膀胱癌、又は肺癌等のＦＧＦＲ１の発現を特徴とする癌であり、最も好ましくは扁平上皮肺癌（ＳＱＬＣ）等の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、患者における癌の治療に使用するためのものである。

【0048】

更に別の好ましい実施形態は、被験体における増殖性疾患の治療及び／又は予防に用いる化合物に関連し、増殖性疾患とは、少なくとも１つの先行療法による治療に難治性又は抵抗性の癌である。

【0049】

特に好ましい実施形態においては、遺伝子改変は、ＦＧＦＲ１遺伝子の、又はＦＧＦＲ１遺伝子のフラグメントの局所増幅である。

【0050】

更なる実施形態は、ＦＧＦＲ１遺伝子のフラグメントが、発現可能な配列であり、かつＦＧＦＲ１タンパク質バリアント、好ましくは外部ドメイン欠失ＦＧＦＲ１タンパク質バリアントをもたらす、患者における癌の治療に用いるＦＧＦＲ１の阻害剤に関する。

【0051】

更に別の実施形態は、治療が、患者をＦＧＦＲ１阻害剤療法に対するレスポンダーとして識別する予備工程を含み、予備工程が、本発明の第１の態様による方法を含む、患者における癌の治療に用いるＦＧＦＲ１阻害剤に関する。

【0052】

他の態様のいずれか及び特に好ましい実施形態のいずれかと組み合わせることができる別の態様において、本発明は、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と共に、前述の癌の治療及び／又は予防に用いる医薬組成物を提供する。

【0053】

本発明の医薬組成物は、その意図した投与経路に適合するように配合される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、髄腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経皮投与（局所投与）、脳室内投与、実質内投与、腫瘍内投与、及び経粘膜投与等が挙げられる。一般に、本発明の医薬組成物は、ＦＧＦＲ１を阻害するための１つ以上の化合物、及び／又は少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含む。本明細書に記載の医薬組成物は、特に、増殖性疾患に対する本明細書に記載の治療方法における使用に有用である。

【0054】

経口、皮内、又は皮下の適用に使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水等の滅菌希釈液、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン；プロピレングリコール又はその他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸又は硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸等の緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の浸透圧調整剤。

【0055】

さらに、本発明の更なる態様は、増殖性疾患の治療及び／又は予防のための医薬品の製造のためのＦＧＦＲ１阻害剤の使用に関する。

【0056】

本明細書に開示される化合物及び医薬組成物は、治療有効量のＦＧＦＲ１の阻害剤を被験体に投与することを含む、癌に罹患している被験体を予防又は治療する方法において特に有用である。本発明の他のいずれか１つの態様及び／又は実施形態と組み合わせることができる本発明の更に別の態様においては、被験体における癌疾患の治療及び／又は予防の方法であって、治療有効量のＦＧＦＲ１阻害剤を被験体に投与する１つ以上の工程を含む、方法を提供する。

【0057】

治療又は予防は、幾つかの実施形態においては、治療有効量のＦＧＦＲ１阻害剤の投与を含み、該阻害剤は、好ましくは、静脈内投与、膣内投与、経口投与、鼻腔内投与、髄腔内投与、動脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮投与（局所投与）、脳室内投与、実質内投与、腫瘍内投与、経粘膜投与、直腸投与、気管支投与、及び／又は非経口投与、又は臨床的／医学的に認められた任意の方法で、上記被験体に投与される。

【0058】

さらに、上記治療有効量のＦＧＦＲ１阻害剤は、錠剤、丸剤、カプセル、トローチ、ドラジェ、粉末、エアロゾルスプレー、鼻スプレー、坐剤、ゲル、軟膏、膏薬（salve）、クリーム、及び／又は溶液の形で提供されることが好ましい。

【0059】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、本明細書に開示されている発明に従って、例えば研究者又は臨床医が求めている組織、系、動物又はヒト被験体の生物学的又は医学的な応答を引き出す化合物又は医薬組成物の量を意味する。さらに、「治療有効量」という用語は、かかる量を受けていない対応する被験体と比較して、治療の改良、疾患、障害若しくは副作用の治療、治癒、予防若しくは改善、又は疾患若しくは障害の進行率の低下をもたらす任意の量を意味する。

【0060】

本発明による疾病の予防又は治療のため、ＦＧＦＲ１阻害剤（又はこれを含む医薬組成物）の適切な投与量は、治療される癌の種類、疾患の重症度及び経過、ＦＧＦＲ１阻害剤及び／又は医薬組成物が予防又は治療の目的で投与されるか否か、以前の治療法、患者の病歴、年齢、サイズ／体重、及びＦＧＦＲ１阻害剤に対する応答、及び主治医の判断に依存する。ＦＧＦＲ１の阻害剤及び／又は医薬組成物は、患者に１回又は一連の治療にわたって適切に投与される。かかるＦＧＦＲ１の阻害剤及び／又は医薬組成物を一連の治療にわたって投与する場合、所与の治療経過における投与回数の合計は、合計で約２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又は約１０回超の治療になることがある。例えば、１週間、１ヶ月、更には数ヶ月間にわたって、毎日１回（又は１日に２回、３回、若しくは４回）の治療が行われてもよい。或る特定の実施形態においては、治療の経過が無期限に継続することもある。

【0061】

本発明の別の態様は、癌に罹患した被験体を受容体結合剤による治療に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして識別する方法に関し、この方法は、
ａ）癌に関連する遺伝物質を含む被験体からの生体試料を提供する工程と、
ｂ）癌に関連する細胞において発現される受容体をコードする遺伝子の遺伝子改変の存在又は非存在を遺伝物質中で判定する工程と、
なお、遺伝子改変は、
ｉ．受容体をコードする遺伝子のコピー数増加、及び／又は、
ｉｉ．受容体の短縮型細胞外ドメインを含む、又は細胞外ドメインを含まないバリアント受容体タンパク質をコードするバリアント受容体遺伝子である；
を含み、
被験体の生体試料中の遺伝子改変の存在は、被験体が受容体結合剤による治療に対するレスポンダーであることを示す。

【0062】

好ましい実施形態は、癌に罹患している被験体を、受容体結合剤による治療に対するレスポンダー又は非レスポンダーとして識別する方法に関し、受容体結合剤は、該遺伝子改変の影響を受ける受容体に特異的に結合し、好ましくは、受容体結合剤は受容体の阻害剤である。

【0063】

別の好ましい実施形態においては、遺伝子改変は、バリアント受容体タンパク質をコードするバリアント受容体遺伝子のコピー数増加である。

【0064】

本発明の更なる態様は、障害に関連する遺伝子バイオマーカーを特定する方法に関し、この方法は、
ａ）障害に罹患していることがわかっている患者群の多数の遺伝子試料、及び障害に罹患していないことがわかっている対照群の多数の遺伝子試料を提供する工程と、
ｂ）１つ以上の候補遺伝子改変について、対照群の多数の遺伝子試料と比較して、患者群の多数の遺伝子試料における有意に高い発生確率を決定する工程と、
なお、候補遺伝子改変は、切断－融合－架橋（ＢＦＢ）機構によるｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂又は正常染色体断裂の結果であり、任意に、遺伝子の局所増幅が誘導され、好ましくは、ゲノム配列の連続回文コピー数変化である；
を含み、
候補遺伝子改変が、対照群の多数の遺伝子試料と比較して、患者群の多数の遺伝子試料内で有意に起こる場合、候補遺伝子改変は障害に関連するバイオマーカーである。

【0065】

本発明に関連して、「バイオマーカー」又は「マーカー」は、或る特定の状態を有する被験体から採取した試料中に差次的に存在する、該条件を有しない被験体から採取した比較可能な試料と比較した、遺伝子改変を指す。

【0066】

一実施形態においては、遺伝子試料は、ゲノムＤＮＡを含む生体試料、好ましくは液体試料、例えば血液、血漿、血清、唾液、尿に由来するもの、又は障害によって影響を受ける腫瘍組織の試料等の組織試料である。

【0067】

更なる実施形態は、障害に関連する遺伝子バイオマーカーを特定する方法に関し、障害は、癌等の増殖性障害、好ましくは液性癌又は固形癌である。別の好ましい実施形態においては、癌は、乳癌、胃癌、膀胱癌又は肺癌であり、最も好ましくは、扁平上皮肺癌（ＳＱＬＣ）等の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。

【0068】

特に好ましい実施形態においては、遺伝子改変はコピー数増加である。

【0069】

別の実施形態においては、ゲノム配列はタンパク質コード遺伝子の完全又は部分的な配列を含む。

【0070】

更に別の実施形態は、障害に関連する遺伝子バイオマーカーを特定する方法に関し、タンパク質コード遺伝子の部分配列は、例えば、ＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン９中の非カノニカルＡＴＧを使用して、好ましくはカノニカルＡＴＧ開始コドンを使用せずに、短縮型オープンリーディングフレーム又は回文遺伝子座からのタンパク質の発現を依然として可能にする。

【0071】

更なる実施形態においては、切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構の断裂等の染色体断裂は、タンパク質コード遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に位置し、好ましくは転写開始部位に近接しており、近接は、転写開始部位から１ｍｂ以内、好ましくは８００ｋｂ以内、より好ましくは４００ｋｂ以内である。

【0072】

更に別の実施形態は、障害に関連する遺伝子バイオマーカーを特定する方法に関し、タンパク質コード遺伝子の部分配列が発現可能な配列であり、ＦＧＦＲ１タンパク質バリアント、好ましくは外部ドメイン欠失ＦＧＦＲ１タンパク質バリアントをもたらす。

【0073】

さらに、他の態様のいずれか又は特に好ましい実施形態のいずれかと組み合わせることができる本発明の更に別の態様は、ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子改変の存在又は非存在を判定する手段を含むキットに関する。好ましくは、本発明のキットは、本発明による方法を実施するためのキットであって、ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子改変の存在又は非存在を判定する手段を含み、遺伝子改変は、断裂がＦＧＦＲ１遺伝子のＯＲＦ内又は近傍内に位置する、切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構等の染色体断裂によって引き起こされるコピー数変動である。

【0074】

任意に、このキットは、ラベル若しくは別の添付文書、及び／又はその成分を保持する容器の形で、適切な操作パラメータの指示を更に含むことができる。例えば、このキットは、プローブに血漿の試料が接触した後のプローブの洗浄方法を消費者に知らせる標準的な説明書を有してもよい。

【0075】

他の態様のいずれか及び特に好ましい実施形態のいずれかと組み合わせることができる本発明の更なる態様においては、本発明は、以下を含むキットを提供する：
ｉ）本発明による使用のための治療有効量の化合物、又は本発明による使用のための医薬組成物、
ｉｉ）使用のための該治療有効量の該化合物、又は使用のための該医薬組成物を適用するための説明書、並びに、
ｉｉｉ）任意に、該化合物又は該医薬組成物を保持する容器、及び説明書。

【0076】

任意に、このキットは、ラベル又は別の添付文書の形で、適切な操作パラメータの説明書を更に含むことができる。例えば、このキットは、プローブに血漿の試料が接触した後のプローブの洗浄方法を消費者に知らせる標準的な説明書を有してもよい。いずれの実施形態においても、キットは、試験試料を対照情報スタンダードと比較できるように、任意に、スタンダード又は対照情報を更に含んでもよい。

【0077】

さらに、本発明の更なる態様は、被験体における癌の診断、予後、層別化及び／又は治療法のモニタリングの方法であって、
ａ）被験体からの生体試料を提供する工程と、
ｂ）生体試料中において、好ましくはＦＧＦＲ１の細胞外ドメインが欠失している、ＦＧＦＲ１遺伝子のＯＲＦ内又は近傍内に断裂が存在する切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構等の染色体断裂、ＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の改変、ＦＧＦＲ１タンパク質の改変、ＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物のレベルの変化、及び／又はＦＧＦＲ１タンパク質のレベルの変化の存在又は非存在を判定する工程と、
を含み、
健康な対照又は基準の値と比較して、工程（ｂ）で判定された染色体断裂、ＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の改変、ＦＧＦＲ１タンパク質の改変、ＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物のレベルの差、及び／又はＦＧＦＲ１タンパク質のレベルの差の存在が、被験体における癌の存在を示す、方法に関する。

【0078】

上記の診断法の好ましい実施形態においては、染色体断裂は、ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌの切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構であり、断裂は、ＦＧＦＲ１遺伝子のＯＲＦ内又は近傍内に位置する。

【0079】

別の好ましい実施形態においては、染色体断裂が、
ａ．ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの少なくとも一部の短縮をもたらすＦＧＦＲ１遺伝子座の遺伝子修飾、及び／又は、
ｂ．ＦＧＦＲ１の、若しくはＦＧＦＲ１遺伝子のフラグメントの局所増幅、及び／又は、
ｃ．ＦＧＦＲ１遺伝子の連続回文配列、若しくは部分ＦＧＦＲ１遺伝子、及び／又は、
ｄ．非カノニカルＡＴＧ開始コドンの翻訳開始をもたらす、ＦＧＦＲ１遺伝子座の遺伝子修飾、
を誘導する。

【0080】

ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子修飾の存在、及び／又はＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の改変により、Ｎ末端短縮ＦＧＦＲ１ポリペプチドが翻訳されることが更に好ましい。したがって、この方法は、好ましくは被験体からの生体試料中のＮ末端短縮ＦＧＦＲ１を検出することを含む。より好ましくは、この方法は、少なくとも１つのＩＧ様ドメインが欠落している短縮型ＦＧＦＲ１ポリペプチドの検出を含む。特に好ましい実施形態においては、被験体の癌の診断、予後、層別化及び／又は治療法のモニタリングの方法の工程ｂ）の判定は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって行われる。

【0081】

更に別の好ましい実施形態においては、短縮型ＦＧＦＲ１バリアントは、ＲＮＡ技術「Ａｒｃｈｅｒ」(Democratizing precision oncology (archerdx.com)）又は(Ａｒｃｈｅｒ ＦｕｓｉｏｎＰｌｅｘ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｈｙｒｏｉｄ ＆ Ｌｕｎｇ （ＣＴＬ）｜Diagnostica Longwood (dlongwood.com))により、被験体における癌の診断、予後、層別化及び／又は治療法のモニタリングの方法の工程ｂ）において検出される。

【0082】

更に別の好ましい実施形態においては、遺伝子改変、ＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の改変、又はＦＧＦＲ１タンパク質の改変は、配列番号２～配列番号３７のいずれか１つによる配列を含む。

【0083】

別の好ましい実施形態は、被験体における癌の診断、予後、層別化及び／又は治療法のモニタリングの上記の方法に関し、遺伝子改変及び／又はＦＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の改変は、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４若しくは配列番号３７のいずれか１つによる核酸配列を含み、及び／又は改変ＦＧＦＲ１タンパク質は、配列番号９、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２若しくは配列番号３５のいずれか１つによるアミノ酸配列を含む。

【0084】

被験体における癌の診断、予後、層別化及び／又は治療法のモニタリングの上記方法は、あらゆる種類の癌の診断、予後、層別化及び／又はモニタリングに有用である。好ましくは、癌は固形癌であり、より好ましくは乳癌、胃癌、膀胱癌又は肺癌等のＦＧＦＲ１の発現を特徴とする癌であり、最も好ましくは扁平上皮肺癌（ＳＱＬＣ）等の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。

【0085】

本明細書で使用される場合、「（本）発明の」、「本発明による」、「本発明によれば（よる）」等の用語は、本明細書に記載される及び／又は特許請求の範囲に記載される本発明の全ての態様及び実施形態を指すことを意図する。

【0086】

本明細書で使用される場合、「～を含む（comprising）」という用語は、「～を含む（including）」及び「～のみからなる（consisting of）」の双方を包含するものと解釈され、双方の意味が具体的に意図されており、したがって、本発明に従って個別に開示された実施形態を意味する。本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、他方の有無にかかわらず、指定された２つの特徴又は構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるものとする。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、本明細書で個々に定められているのと同様に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示であると受け取られる。本発明の状況において、「約」及び「およそ」という用語は、当該特徴の技術的効果を引き続き確保するために、当業者が理解する精度の間隔を示す。この用語は、典型的には、±２０％、±１５％、±１０％、及び例えば±５％の指定の数値からの偏差を示す。当業者によって理解されるように、所与の技術的効果に対する数値に関する具体的なかかる偏差は、技術的効果の性質に依存する。例えば、天然の又は生物学的な技術的効果は、一般的に、人為的又は工学的な技術的効果よりもかかる偏差が大きい場合がある。当業者によって理解されるように、所与の技術的効果に対する数値に関する具体的なかかる偏差は、技術的効果の性質に依存する。例えば、天然の又は生物学的な技術的効果は、一般的に、人為的又は工学的な技術的効果よりもかかる偏差が大きい場合がある。単数名詞を指すときに不定冠詞又は定冠詞、例えば「１つの（ａ）」、「１つの（an）」又は「その（the）」が使われる場合、別段の具体的な記述がない限り、これは、その名詞の複数形を含む。

【0087】

本発明の教示を具体的な課題又は環境に適用し、本発明のバリエーション又はそれに対する付加的な特徴（更なる態様及び実施形態等）を包めることは、本明細書に含まれる教示に照らして、当業者の技能の範囲内であると理解されるものとする。

【0088】

文脈により他に指示されない限り、上に提示される特徴の説明及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に同様に当てはまる。

【0089】

本明細書で引用される全ての参照文献、特許、及び出版物は、引用することでそれらの全体が本明細書の一部をなす。

【0090】

図面及び配列の簡単な説明
図面は以下を示す。

【図面の簡単な説明】

【0091】

【図1】ＦＧＦＲ阻害剤応答が不明な試料のコピー数分析を示す図である。ａ）染色体８ｐ１１－ｐ１２に８ｐ１１－ｐ１２増幅を有する２５の原発性扁平上皮肺癌腫瘍についてプロットした平均コピー数。腫瘍／正常全ゲノムシーケンシングデータからコピー数を算出し、ＲＯＢＯＣＯＰ（平均シーケンシング深度４０倍）でプロットした。線番号２はＦＧＦＲ阻害剤応答が不明な２５の試料の平均コピー数を示す。線番号１はＦＧＦＲ１（４００ｋｂの範囲）に近いｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂を持つ９つの原発腫瘍試料の平均コピー数を示す。線番号３はＦＧＦＲ１（＞１ｍｂ）に近いｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂のない１６の原発腫瘍試料の平均コピー数を示す。遺伝子の場所は、右向きの三角形（プラス鎖にコードされる）又は左向きの三角形（マイナス鎖にコードされる）で注釈される。ＦＧＦＲ１の場所が強調され、ＦＧＦＲ１に近いｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂の場所も強調される（左グラフ）。９試料の増幅ピークをズームする（右グラフ）。ＦＧＦＲ１及びＮＳＤ３の場所を、遺伝子内で検出されたｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ（中灰色の矢印）、正常（薄い灰色の矢印）、及びｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ（黒い矢印）の断裂と共に示す。ｂ）ＮＳＤ３短（上、１ＡＡ～６４５ＡＡ）とＮＳＤ３長（下、１ＡＡ～１４３７ＡＡ）のドメイン構造。中灰色の矢印はｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ、薄い灰色の矢印は正常の断裂を示す。Ｎ末端は右、Ｃ末端は左である。ｃ）ＦＧＦＲ１アルファのドメイン構造（３つのＩＧドメイン）。検出されたｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂を示す（黒い矢印）。ＴＭ＝膜貫通ドメイン、ＡＢ＝アシッドボックス（自己阻害機能）、Ｎ末端（右）からＣ末端（左、１ＡＡ～８２２ＡＡ）。ｄ）８ｐ１１－ｐ１２増幅を形成する２つのランダムに発生する切断－融合－架橋機構の模式図。この２つの例は、連続した断裂の順序（矢印、並びにＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶで示される）のみが異なる。ｅ）一度に同じゲル上で行われた、腫瘍ＤＮＡ、一致する正常ＤＮＡ（上）及び対応する対照（下、アクチンプライマー及びテンプレートなし）を使用する、検出されたｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ断裂（回文）に対する１プライマーネステッドＰＣＲ。ｆ）１つの腫瘍／正常全ゲノム配列決定試料のコピー数プロット（シーケンシング深さ６０倍）。リード数から算出した推定コピー数プロット（上）、純度推定で補正したリード数から算出した積分コピー数プロット（中）、及び切断－融合－架橋（ＢＦＢ）機構を考慮した検出された断裂とそれらのカバレッジのみから生成したコピー数プロット（下）。ｇ）図１ｆ（下）に示すＢＦＢの進化。８ｐ腕は中心体からＡで始まる文字で示される。合計７個の断裂が検出された。正常な断裂が１個（中灰色の矢印で示される）、切断－融合－架橋断裂が６個（１つ目の架橋及び黒い矢印で示される）である。

【図2】ＦＧＦＲ阻害剤応答が既知の試料のコピー数分析を示す図である。ａ）ＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８及びＡＺＤ４５４７に対してスクリーニングされた８細胞株の平均ＧＩ５０値。バーは番号（１）（ＧＩ５０＞１μＭ）又は番号（２）（ＧＩ５０＞１μＭ）によって示される。ｂ）ＦＧＦＲ阻害に感受性のない６細胞株（番号（１）で示す）及びＦＧＦＲ阻害に感受性のある２細胞株（番号（２）で示す）の平均コピー数。ゲノムシーケンシング又は全エクソソームシーケンシングデータからコピー数を抽出し、ＲＯＢＯＣＯＰで８番染色体（ｈｇ１９）に対してプロットした。ＮＳＤ３及びＦＧＦＲ１の場所は背景が灰色である。ｃ）ＢＧＪ３９８対ビヒクルで治療された８例の患者由来異種移植片腫瘍モデルの平均腫瘍増殖縮小率。全てのモデルでＦＧＦＲ１ ＦＩＳＨによるＦＧＦＲ１増幅が確認された。各バーは、少なくとも６匹のマウス及び１２の腫瘍の実験を表す。バーを、番号（１）（腫瘍縮小率＜３０％）又は番号（２）（腫瘍縮小率＞３０％）で示す。ｄ）５例のＦＧＦＲ阻害の恩恵を受けない患者由来異種移植片腫瘍モデル（番号（１）で示す）及び３例のＦＧＦＲ阻害の恩恵を受ける患者由来異種移植片腫瘍（ＰＤＸ）モデル（番号（２）で示す）の平均コピー数。ゲノムシーケンシングデータからコピー数を抽出し、ＲＯＢＯＣＯＰで８番染色体（ｈｇ１９）に対してプロットした。ｅ）ＦＧＦＲ１増幅を持ち、ＢＧＪ３９８で治療された扁平上皮肺癌患者の腫瘍体積変化。腫瘍体積変化をＲＥＣＩＳＴ基準で測定した。５名の患者はＦＧＦＲ阻害時に進行性の疾患を有し（番号（１）で示す）、３名の患者はＦＧＦＲ阻害時に永続的な部分応答を示した（番号（２）で示す）。ＴＵＭ００３及びＴＵＭ００７は治療中に死亡し、応答の兆候はなかった。^＊で標識された試料は、ＲＥＣＩＳＴデータが入手できない標識ＦＧＦＲ阻害剤治療患者であった。ｆ）進行性疾患を有する患者５名（番号（２）で示す）とＦＧＦＲ阻害時に永続的な部分応答を有する患者４名の平均コピー数（番号（１）で示す、患者１名はオフラベルで使用したＦＧＦＲ阻害剤（ＧＷ７８６０３４ ＨＣｌ）で治療）。ハイブリッドキャプチャに基づくシーケンシングからコピー数を抽出し、ＲＯＢＯＣＯＰで８番染色体（ｈｇ１９）に対してプロットした。ｇ）ＦＧＦＲ１の場所にズームしたハイブリッドキャプチャに基づくゲノムシーケンシング（深度５５８倍）コピー数プロット（中央）。オフラベルで使用したＦＧＦＲ阻害剤（ＧＷ７８６０３４ ＨＣｌ）による治療に応答した患者に由来する腫瘍試料。ゲノム断裂を伴うＦＧＦＲ１の正常なエクソン構造を示す（下）。断裂カバレッジ（上）及び断裂の場所を示す（矢印）。対応するＨＥとｐＦＧＦＲ１のＩＨＣ染色を示す（右）。ｈ）結果として生じたｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂の再編成を示す（破線）。ｉ）ＦＧＦＲ１の場所にズームしたハイブリッドキャプチャに基づくゲノムシーケンシング（深度６１５倍）コピー数プロット（中央）。腫瘍試料はＦＧＦＲ阻害剤（ＢＧＪ３９８）による治療に応答した患者に由来する。ＦＧＦＲ１の正常なエクソン構造（下）、ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂の場所（矢印）、及び断裂カバレッジ（上）を示す。ｊ）結果として生じたｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂の再編成を示す（破線）。

【図3】新規な発癌遺伝子外部ドメイン欠失ＦＧＦＲ１バージョンの同定を示す図である。ａ）腫瘍／正常全ゲノム配列決定された（カバレッジ３０倍）原発性扁平上皮肺癌腫瘍のコピー数プロット、及びＲＯＢＯＣＯＰでプロットした（中央）。この領域に位置する遺伝子（中央、下；プラス鎖、マイナス鎖）、断裂カバレッジ（上）、ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂の場所（矢印及び黒い破線）を示す。上に示される染色体位置とは無関係に、ゲノム断裂を伴うＮＳＤ３及びＦＧＦＲ１の正常なエクソン構造をアスタリスクで示す（下）。ｂ）結果として生じたｔ－ｔｏ－ｔ断裂の再編成（破線、上）、及び全トランスクリプトームシーケンシングデータからのスパニングリード（下）を示す。ｃ）ｔ－ｔｏ－ｔ断裂及びＦＧＦＲ１にまたがる２つの異なるプライマー対を持つ対応するｃＤＮＡ（左）及び一致した正常なｃＤＮＡ（右）からのＰＣＲ。ｄ）ＦＧＦＲ１の場所にズームしたハイブリッドキャプチャに基づくゲノムシーケンシング（深度４６８倍）コピー数プロット（中央）。腫瘍試料はＦＧＦＲ阻害時の応答が不明な患者に由来する。ＦＧＦＲ１の正常なエクソン構造（下）、ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂の場所（矢印）、及び断裂カバレッジ（上）を示す。ｅ）結果として生じたｔ－ｔｏ－ｔ断裂の再編成を示す（破線）。ｆ）ＡＲＣＨＥＲシーケンシング技術によって検出された断裂スパニングリードを示す。ｇ）形質転換Ｂａｆ３細胞（Ｂａｆ３ ＦＧＦＲ１ ΔＥＣ及び対照としてＢａｆ３ ＥＭＬ４－ＡＬＫ）と、空のベクター（Ｂａｆ３ ｅ．Ｖ．）、ＦＧＦＲ１アルファ（Ｂａｆ３ ＦＧＦＲ１_アルファ）及びＦＧＦＲ１ベータ（Ｂａｆ３ ＦＧＦＲ１_ベータ）で形質導入した非形質転換Ｂａｆ３細胞の免疫ブロッティング。Ｂａｆ３ ｅ．Ｖ、ＦＧＦＲ１アルファ及びベータをＩＬ３で培養する。ｈ）漸増濃度のＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８又はｉ）ＦＧＦＲ阻害剤ＡＺＤ４５４７を用いたＢａｆ３ ｅ．Ｖ．、ＦＧＦＲ１ベータ、及び外部ドメイン欠損ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１ ΔＥＣ、エクソン９中のインフレームＡＴＧを使用、ＮＭ＿０１５８５０）のスクリーニング（９６時間後に細胞ＡＴＰ含有量を測定）。Ｂａｆ３ ｅ．Ｖ．とＢａｆ３ ＦＧＦＲ１ベータをＩＬ３でスクリーニングし、Ｂａｆ３ ＦＧＦＲ１ ΔＥＣをＩＬ３枯渇条件下でスクリーニングした。

【0092】

配列は、以下を示す。

【0093】

配列番号１：ヒト線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）のアミノ酸配列
Met Trp Ser Trp Lys Cys Leu Leu Phe Trp Ala Val Leu Val Thr Ala Thr Leu Cys Thr Ala Arg Pro Ser Pro Thr Leu Pro Glu Gln Ala Gln Pro Trp Gly Ala Pro Val Glu Val Glu Ser Phe Leu Val His Pro Gly Asp Leu Leu Gln Leu Arg Cys Arg Leu Arg Asp Asp Val Gln Ser Ile Asn Trp Leu Arg Asp Gly Val Gln Leu Ala Glu Ser Asn Arg Thr Arg Ile Thr Gly Glu Glu Val Glu Val Gln Asp Ser Val Pro Ala Asp Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Val Thr Ser Ser Pro Ser Gly Ser Asp Thr Thr Tyr Phe Ser Val Asn Val Ser Asp Ala Leu Pro Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Ser Ser Glu Glu Lys Glu Thr Asp Asn Thr Lys Pro Asn Arg Met Pro Val Ala Pro Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr Gln Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu Phe Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys Ile Gly Pro Asp Asn Leu Pro Tyr Val Gln Ile Leu Lys Thr Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Met Glu Val Leu His Leu Arg Asn Val Ser Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Leu Ser His His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Glu Ala Leu Glu Glu Arg Pro Ala Val Met Thr Ser Pro Leu Tyr Leu Glu Ile Ile Ile Tyr Cys Thr Gly Ala Phe Leu Ile Ser Cys Met Val Gly Ser Val Ile Val Tyr Lys Met Lys Ser Gly Thr Lys Lys Ser Asp Phe His Ser Gln Met Ala Val His Lys Leu Ala Lys Ser Ile Pro Leu Arg Arg Gln Val Thr Val Ser Ala Asp Ser Ser Ala Ser Met Asn Ser Gly Val Leu Leu Val Arg Pro Ser Arg Leu Ser Ser Ser Gly Thr Pro Met Leu Ala Gly Val Ser Glu Tyr Glu Leu Pro Glu Asp Pro Arg Trp Glu Leu Pro Arg Asp Arg Leu Val Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gln Val Val Leu Ala Glu Ala Ile Gly Leu Asp Lys Asp Lys Pro Asn Arg Val Thr Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Asp Ala Thr Glu Lys Asp Leu Ser Asp Leu Ile Ser Glu Met Glu Met Met Lys Met Ile Gly Lys His Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Gln Asp Gly Pro Leu Tyr Val Ile Val Glu Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Leu Arg Glu Tyr Leu Gln Ala Arg Arg Pro Pro Gly Leu Glu Tyr Cys Tyr Asn Pro Ser His Asn Pro Glu Glu Gln Leu Ser Ser Lys Asp Leu Val Ser Cys Ala Tyr Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Thr Glu Asp Asn Val Met Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile His His Ile Asp Tyr Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ala Leu Phe Asp Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Thr Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Val Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly His Arg Met Asp Lys Pro Ser Asn Cys Thr Asn Glu Leu Tyr Met Met Met Arg Asp Cys Trp His Ala Val Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys Gln Leu Val Glu Asp Leu Asp Arg Ile Val Ala Leu Thr Ser Asn Gln Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Met Pro Leu Asp Gln Tyr Ser Pro Ser Phe Pro Asp Thr Arg Ser Ser Thr Cys Ser Ser Gly Glu Asp Ser Val Phe Ser His Glu Pro Leu Pro Glu Glu Pro Cys Leu Pro Arg His Pro Ala Gln Leu Ala Asn Gly Gly Leu Lys Arg Arg

【0094】

本発明によれば、ＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子改変は、ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ切断－融合－架橋（ＢＦＢ）様機構等の染色体断裂の結果である。これらは、ｍＲＮＡレベル等幾つかのレベルで検出され得る。一般に、切断－融合－架橋様（ＢＦＢ様）機構等の染色体断裂後に、ＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン９にある任意のインフレームの非カノニカルＡＴＧ開始コドンが改変ＦＧＦＲ１の転写に使用され得る。例として、配列番号２は、ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ切断－融合－架橋（ＢＦＢ）機構によるＦＧＦＲ１遺伝子の遺伝子改変の結果を示す。

【0095】

配列番号２
GTGGGAGAGTGACACACAAAACACCCCGGGAAGCCGGAGGAGGCGTGGAAAGGTGGGGCCCGGGAGGTAAAACTGGGATCGGCGCGTTCAGTGAGGCTGATTAAAGAACAACGCGCAACCAGCGCCATACGGCGCTCCTCAGGGTGACTCGGCTCTCTAGCTCTTAAGGGTTAGAAGCGACCCTCGCACGGTCCCCGGTGCCACCTGGAGCATCATAATGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCATCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCATCCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGACTGCCACCCACACGCCCTCCCCAGACTCCACCGTCAGCTGTAACCCTCACCCACAGCCCCTGCTGGGCCCACCACCTGTCCGTCCCTGTCCCCTTTCCTGCTGGCAGGAGCCGGCTGCCTACCAGGGGCCTTCCTGTGTGGCCTGCCTTCACCCCACTCAGCTCACCTCTCCCTCCACCTCCTCTCCACCTGCTGGTGAGAGGTGCAAAGAGGCAGATCTTTGCTGCCAGCCACTTCATCCCCTCCCAGATGTTGGACCAACACCCCTCCCTGCCACCAGGCACTGCCTGGAGGGCAGGGAGTGGGAGCCAATGAACAGGCATGCAAGTGAGAGCTTCCTGAGCTTTCTCCTGTCGGTTTGGTCTGTTTTGCCTTCACCCATAAGCCCCTCGCACTCTGGTGGCAGGTGCCTTGTCCTCAGGGCTACAGCAGTAGGGAGGTCAGTGCTTCGTGCCTCGATTGAAGGTGACCTCTGCCCCAGATAGGTGGTGCCAGTGGCTTATTAATTCCGATACTAGTTTGCTTTGCTGACCAAATGCCTGGTACCAGAGGATGGTGAGGCGAAGGCCAGGTTGGGGGCAGTGTTGTGGCCCTGGGGCCCAGCCCCAAACTGGGGGCTCTGTATATAGCTATGAAGAAAACACAAAGTGTATAAATCTGAGTATATATTTACATGTCTTTTTAAAAGGGTCGTTACCAGAGATTTACCCATCGGGTAAGATGCTCCTGGTGGCTGGGAGGCATCAGTTGCTATATATTAAAAACAAAAAAGAAAAAAAAGGAAAATGTTTTTAAAAAGGTCATATATTTTTTGCTACTTTTGCTGTTTTATTTTTTTAAATTATGTTCTAAACCTATTTTCAGTTTAGGTCCCTCAATAAAAATTGCTGCTGCTTCA

【0096】

配列番号２中の下線部は転写されており、以下の配列番号３に示される。

【0097】

配列番号３
ATGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCATCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCATCCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA

【0098】

配列番号２及び配列番号３のクローニングに使用されるプライマーを、以下の配列番号４～配列番号８として示す。

【0099】

配列番号４：CACCTGGAGCATCATAATGGA (212_attB1_S00674)

【0100】

配列番号５：TGGAGCATCATAATGGACTCTG (213_attB1_S00674)

【0101】

配列番号６：AGTCAGCGGCGTTTGAGTC (220_attB2_FGFR1)

【0102】

配列番号７：GTGTGGGTGGCAGTCAGC (221_attB2_FGFR1)

【0103】

配列番号８：CAGTCAGCGGCGTTTGAGT (222_attB2_FGFR1)

【0104】

配列番号３の翻訳は、配列番号９のアミノ酸配列を含むタンパク質を生成する。

【0105】

配列番号９
MDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMVGSVIVYKMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR

【0106】

注目すべきことに、配列番号９のアミノ酸配列を含む改変ＦＧＦＲ１タンパク質は、６０４個のアミノ酸を持ち、Ｎ末端短縮により、改変ＦＧＦＲ１タンパク質は、１つのＩＧ様ドメインと、プロテインキナーゼドメインとを含む。

【0107】

ＦＧＦＲ１阻害剤療法に対するレスポンダーである被験体の例示的な原発性腫瘍試料のＦＧＦＲ１転写産物は、以下の例示的な配列番号に示される。原則として、以下の全てのバリアントは転写可能である（５’ＵＴＲなし）。例として、配列番号１０は、試料Ａ９２１の転写産物を示し、エクソン９以前のイントロン内にｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂が観察された。

【0108】

配列番号１０
CCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGACTGCCACCCACACGCCCTCCCCAGACTCCACCGTCAGCTGTAACCCTCACCCACAGCCCCTGCTGGGCCCACCACCTGTCCGTCCCTGTCCCCTTTCCTGCTGGCAGGAGCCGGCTGCCTACCAGGGGCCTTCCTGTGTGGCCTGCCTTCACCCCACTCAGCTCACCTCTCCCTCCACCTCCTCTCCACCTGCTGGTGAGAGGTGCAAAGAGGCAGATCTTTGCTGCCAGCCACTTCATCCCCTCCCAGATGTTGGACCAACACCCCTCCCTGCCACCAGGCACTGCCTGGAGGGCAGGGAGTGGGAGCCAATGAACAGGCATGCAAGTGAGAGCTTCCTGAGCTTTCTCCTGTCGGTTTGGTCTGTTTTGCCTTCACCCATAAGCCCCTCGCACTCTGGTGGCAGGTGCCTTGTCCTCAGGGCTACAGCAGTAGGGAGGTCAGTGCTTCGTGCCTCGATTGAAGGTGACCTCTGCCCCAGATAGGTGGTGCCAGTGGCTTATTAATTCCGATACTAGTTTGCTTTGCTGACCAAATGCCTGGTACCAGAGGATGGTGAGGCGAAGGCCAGGTTGGGGGCAGTGTTGTGGCCCTGGGGCCCAGCCCCAAACTGGGGGCTCTGTATATAGCTATGAAGAAAACACAAAGTGTATAAATCTGAGTATATATTTACATGTCTTTTTAAAAGGGTCGTTACCAGAGATTTACCCATCGGGTAAGATGCTCCTGGTGGCTGGGAGGCATCAGTTGCTATATATTAAAAACAAAAAAGAAAAAAAAGGAAAATGTTTTTAAAAAGGTCATATATTTTTTGCTACTTTTGCTGTTTTATTTTTTTAAATTATGTTCTAAACCTATTTTCAGTTTAGGTCCCTCAATAAAAATTGCTGCTGCTTCA

【0109】

配列番号１０中の下線部は転写されており、以下の配列番号１１に示される。

【0110】

配列番号１１
ATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA

【0111】

配列番号１０及び配列番号１１のクローニングに使用されるプライマーを、以下の配列番号１２及び配列番号１３として示す。

【0112】

配列番号１２－CCGGCAGTGATGACCTCG (214_attB1_A921)

【0113】

配列番号１３－CAGTGATGACCTCGCCCC (215_attB1_A921)

【0114】

配列番号１１の翻訳は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質を生成する。

【0115】

配列番号１４
MTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMVGSVIVYKMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR

【0116】

注目すべきことに、配列番号１４のアミノ酸配列を含む改変ＦＧＦＲ１タンパク質は、４５２個のアミノ酸を持ち、Ｎ末端短縮によりＩＧ様ドメインを含まないが、プロテインキナーゼドメインを含む。本発明の状況では、配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、ΔＥＣ－ＦＧＦＲ１とも称される。配列番号１４中の二重下線付き残基は膜貫通ドメインを形成し、一重下線付き残基はキナーゼドメインを形成する。

【0117】

配列番号１５は、試料ｐ６８の転写産物を示す。

【0118】

配列番号１５
CCGTAGCTCCATATTGGACATCCCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGCATGCAGTGCCGGCTGCCAAGACAGTGAAGTTCAAATGCCCTTCCAGTGGGACCCCAAACCCCACACTGCGCTGGTTGAAAAATGGCAAAGAATTCAAACCTGACCACAGAATTGGAGGCTACAAGGTCCGTTATGCCACCTGGAGCATCATAATGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCATCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCATCCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGACTGCCACCCACACGCCCTCCCCAGACTCCACCGTCAGCTGTAACCCTCACCCACAGCCCCTGCTGGGCCCACCACCTGTCCGTCCCTGTCCCCTTTCCTGCTGGCAGGAGCCGGCTGCCTACCAGGGGCCTTCCTGTGTGGCCTGCCTTCACCCCACTCAGCTCACCTCTCCCTCCACCTCCTCTCCACCTGCTGGTGAGAGGTGCAAAGAGGCAGATCTTTGCTGCCAGCCACTTCATCCCCTCCCAGATGTTGGACCAACACCCCTCCCTGCCACCAGGCACTGCCTGGAGGGCAGGGAGTGGGAGCCAATGAACAGGCATGCAAGTGAGAGCTTCCTGAGCTTTCTCCTGTCGGTTTGGTCTGTTTTGCCTTCACCCATAAGCCCCTCGCACTCTGGTGGCAGGTGCCTTGTCCTCAGGGCTACAGCAGTAGGGAGGTCAGTGCTTCGTGCCTCGATTGAAGGTGACCTCTGCCCCAGATAGGTGGTGCCAGTGGCTTATTAATTCCGATACTAGTTTGCTTTGCTGACCAAATGCCTGGTACCAGAGGATGGTGAGGCGAAGGCCAGGTTGGGGGCAGTGTTGTGGCCCTGGGGCCCAGCCCCAAACTGGGGGCTCTGTATATAGCTATGAAGAAAACACAAAGTGTATAAATCTGAGTATATATTTACATGTCTTTTTAAAAGGGTCGTTACCAGAGATTTACCCATCGGGTAAGATGCTCCTGGTGGCTGGGAGGCATCAGTTGCTATATATTAAAAACAAAAAAGAAAAAAAAGGAAAATGTTTTTAAAAAGGTCATATATTTTTTGCTACTTTTGCTGTTTTATTTTTTTAAATTATGTTCTAAACCTATTTTCAGTTTAGGTCCCTCAATAAAAATTGCTGCTGCTTCA

【0119】

配列番号１５中の下線部は転写されており、以下の配列番号１６に示される。

【0120】

配列番号１６
ATGGAAAAGAAATTGCATGCAGTGCCGGCTGCCAAGACAGTGAAGTTCAAATGCCCTTCCAGTGGGACCCCAAACCCCACACTGCGCTGGTTGAAAAATGGCAAAGAATTCAAACCTGACCACAGAATTGGAGGCTACAAGGTCCGTTATGCCACCTGGAGCATCATAATGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCATCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCATCCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA

【0121】

配列番号１５及び配列番号１６のクローニングに使用されるプライマーを、以下の配列番号１７及び配列番号１８として示す。

【0122】

配列番号１７－TTGGACATCCCCAGAAAAGA (216_attB1_p68)

【0123】

配列番号１８－CCATATTGGACATCCCCAGA (217_attB1_p68)

【0124】

配列番号１６の翻訳は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むタンパク質を生成する。

【0125】

配列番号１９
MEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMVGSVIVYKMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR

【0126】

配列番号１９のアミノ酸配列を有する改変ＦＧＦＲ１タンパク質は、２つのＩＧ様ドメインと、プロテインキナーゼドメインとを含む６６０個のアミノ酸を持つ。

【0127】

配列番号２０は、試料Ａ１１１６の転写産物を示す。注目すべきことに、５’ＵＴＲ（ＦＧＦＲ１のイントロン１）内の断裂は、ＤＮＡレベルで多数の調節エレメントの欠失をもたらす。ｍＲＮＡレベルでは、（ＦＧＦＲ１のエクソン１からコードされる）５’ＵＴＲの欠失が観察され得る。配列番号２０は、エクソン２にコードされるｗｔ－ＦＧＦＲ１のＡＴＧ開始コドンを含む。配列番号２０の転写産物の翻訳は、ｗｔ－ＦＧＦＲ１に対応する（配列番号１；ＦＧＦＲ１ ＮＭ＿０１５８５０）。

【0128】

配列番号２０
ACTGCTGGAGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGACTGCCACCCACACGCCCTCCCCAGACTCCACCGTCAGCTGTAACCCTCACCCACAGCCCCTGCTGGGCCCACCACCTGTCCGTCCCTGTCCCCTTTCCTGCTGGCAGGAGCCGGCTGCCTACCAGGGGCCTTCCTGTGTGGCCTGCCTTCACCCCACTCAGCTCACCTCTCCCTCCACCTCCTCTCCACCTGCTGGTGAGAGGTGCAAAGAGGCAGATCTTTGCTGCCAGCCACTTCATCCCCTCCCAGATGTTGGACCAACACCCCTCCCTGCCACCAGGCACTGCCTGGAGGGCAGGGAGTGGGAGCCAATGAACAGGCATGCAAGTGAGAGCTTCCTGAGCTTTCTCCTGTCGGTTTGGTCTGTTTTGCCTTCACCCATAAGCCCCTCGCACTCTGGTGGCAGGTGCCTTGTCCTCAGGGCTACAGCAGTAGGGAGGTCAGTGCTTCGTGCCTCGATTGAAGGTGACCTCTGCCCCAGATAGGTGGTGCCAGTGGCTTATTAATTCCGATACTAGTTTGCTTTGCTGACCAAATGCCTGGTACCAGAGGATGGTGAGGCGAAGGCCAGGTTGGGGGCAGTGTTGTGGCCCTGGGGCCCAGCCCCAAACTGGGGGCTCTGTATATAGCTATGAAGAAAACACAAAGTGTATAAATCTGAGTATATATTTACATGTCTTTTTAAAAGGGTCGTTACCAGAGATTTACCCATCGGGTAAGATGCTCCTGGTGGCTGGGAGGCATCAGTTGCTATATATTAAAAACAAAAAAGAAAAAAAAGGAAAATGTTTTTAAAAAGGTCATATATTTTTTGCTACTTTTGCTGTTTTATTTTTTTAAATTATGTTCTAAACCTATTTTCAGTTTAGGTCCCTCAATAAAAATTGCTGCTGCTTCA

【0129】

配列番号２０中の下線部は転写されており、以下の配列番号２１に示される。

【0130】

配列番号２１
ATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA

【0131】

配列番号２０及び配列番号２１のクローニングに使用されるプライマーを、以下の配列番号２２及び配列番号２３として示す。

【0132】

配列番号２２－CCGACAAAGAGATGGAGGTG (218_attB1_FGFR1_Virtuell)

【0133】

配列番号２３－CAAAGAGATGGAGGTGCTTCAC (219_attB1_FGFR1_Virtuell)

【0134】

配列番号２５は、ＦＧＦＲ１阻害剤療法に対するレスポンダーの更なる例示的な試料のＦＧＦＲ１転写産物である。

【0135】

配列番号２５
ATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA

【0136】

配列番号２５の翻訳は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むタンパク質を生成する。

【0137】

配列番号２６
MVGSVIVYKMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR

【0138】

配列番号２６のアミノ酸配列を含む改変ＦＧＦＲ１タンパク質は、ΔＥＣ－ＦＧＦＲ１（配列番号１４）と比較して、Ｎ末端短縮のため追加の２１アミノ酸を欠く。配列番号２６はΔＥＣ－２１－ＦＧＦＲ１とも呼ばれる。配列番号２６中の二重下線付き残基は、より短い膜貫通ドメインの一部であり、一重下線付き残基はキナーゼドメインを形成する。

【0139】

配列番号２５のクローニングに使用されるフォワードプライマーを、以下の配列番号２７に示す。配列番号２７－ＡＴＧＧＴＧＧＧＧＴＣＧＧＴＣＡＴ（２３０＿Ｆ＿ΔＥＣ－２１－ＦＧＦＲ１）。配列番号２５のクローニング用リバースプライマーとして、ＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン１２の任意のリバースプライマーを使用することができる。

【0140】

配列番号２８は、ＦＧＦＲ１阻害剤療法に対するレスポンダーの更なる例示的な試料のＦＧＦＲ１転写産物である。

【0141】

配列番号２８
ATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA

【0142】

配列番号２８の翻訳は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むタンパク質を生成する。

【0143】

配列番号２９
MKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR

【0144】

配列番号２９のアミノ酸配列を含む改変ＦＧＦＲ１タンパク質は、ΔＥＣ－ＦＧＦＲ１（配列番号１４）と比較した場合、３０個のアミノ酸を欠く。配列番号２９はΔＥＣ－３０－ＦＧＦＲ１とも称される。Ｎ末端短縮により、配列番号２９のアミノ酸配列を含むタンパク質は、ＩＧ様ドメインを持たないが、キナーゼドメインを持つ。配列番号２９中の下線付き残基はキナーゼドメインを形成する。

【0145】

配列番号２８のクローニングに使用されるフォワードプライマーを、以下の配列番号３０に示す。配列番号３０－ＡＴＧＡＡＧＡＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＴＧ（２３１＿Ｆ＿ΔＥＣ－３０－ＦＧＦＲ１）。配列番号２８のクローニング用リバースプライマーとして、ＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン１２の任意のリバースプライマーを使用することができる。

【0146】

配列番号３１は、ＦＧＦＲ１阻害剤療法に対するレスポンダー更なる例示的な試料のＦＧＦＲ１転写産物である。

【0147】

配列番号３１
ATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA

【0148】

配列番号３１の翻訳は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質を生成する。

【0149】

配列番号３２
MLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR

【0150】

配列番号３２のアミノ酸配列を含む改変ＦＧＦＲ１タンパク質は、ΔＥＣ－ＦＧＦＲ１（配列番号１４）と比較した場合、８５個のアミノ酸を欠く。配列番号３２はΔＥＣ－８５－ＦＧＦＲ１とも称される。配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質は、Ｎ末端短縮により、ＩＧ様ドメインを持たないが、キナーゼドメインを持つ。配列番号３２中の下線付き残基はキナーゼドメインを形成する。

【0151】

配列番号３１のクローニングに使用されるフォワードプライマーを、以下の配列番号３３に示す。配列番号３３－ＣＡＴＧＣＴＡＧＣＡＧＧＧＧＴＣＴＣＴ（２３２＿Ｆ＿ΔＥＣ－８５－ＦＧＦＲ１）。配列番号２５のクローニング用リバースプライマーとして、ＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン１２の任意のリバースプライマーを使用することができる。

【0152】

配列番号３４は、ＦＧＦＲ１阻害剤療法に対するレスポンダーの更なる例示的な試料のＦＧＦＲ１転写産物である。

【0153】

配列番号３４
ATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA

【0154】

配列番号３４の翻訳は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むタンパク質を生成する。

【0155】

配列番号３５
MLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR

【0156】

配列番号３５のアミノ酸配列を含む改変ＦＧＦＲ１タンパク質は、ΔＥＣ－ＦＧＦＲ１（配列番号１４）と比較した場合、１４４個のアミノ酸を欠く。したがって、配列番号３５はΔＥＣ－１４４－ＦＧＦＲ１とも称される。Ｎ末端短縮により、配列番号３５のアミノ酸配列を含むタンパク質はＩＧ様ドメインを持たず、おそらく機能性キナーゼドメインも持たない。しかしながら、配列番号３５のアミノ酸配列のキナーゼドメインの一部を形成する残基には下線を付してある。

【0157】

配列番号３４のクローニングに使用されるフォワードプライマーを、以下の配列番号３６に示す。配列番号３６－ATGCTAGCAGGGGTCTCTGA（２３３＿Ｆ＿ΔＥＣ－１４４－ＦＧＦＲ１）。配列番号２５のクローニング用リバースプライマーとして、ＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン１２の任意のリバースプライマーを使用することができる。

【0158】

配列番号３７は、野生型ＦＧＦＲ１（ＮＭ＿０１５８５０）を示す。

【0159】

配列番号３７
ATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCCTCTTCTGGGCTGTGCTGGTCACAGCCACACTCTGCACCGCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTGAACAAGCCCAGCCCTGGGGAGCCCCTGTGGAAGTGGAGTCCTTCCTGGTCCACCCCGGTGACCTGCTGCAGCTTCGCTGTCGGCTGCGGGACGATGTGCAGAGCATCAACTGGCTGCGGGACGGGGTGCAGCTGGCGGAAAGCAACCGCACCCGCATCACAGGGGAGGAGGTGGAGGTGCAGGACTCCGTGCCCGCAGACTCCGGCCTCTATGCTTGCGTAACCAGCAGCCCCTCGGGCAGTGACACCACCTACTTCTCCGTCAATGTTTCAGATGCTCTCCCCTCCTCGGAGGATGATGATGATGATGATGACTCCTCTTCAGAGGAGAAAGAAACAGATAACACCAAACCAAACCCCGTAGCTCCATATTGGACATCCCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGCATGCAGTGCCGGCTGCCAAGACAGTGAAGTTCAAATGCCCTTCCAGTGGGACCCCAAACCCCACACTGCGCTGGTTGAAAAATGGCAAAGAATTCAAACCTGACCACAGAATTGGAGGCTACAAGGTCCGTTATGCCACCTGGAGCATCATAATGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCATCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCATCCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA

【実施例】

【0160】

本発明の或る特定の態様及び実施形態が、ここで例として、本明細書に示す説明、図面及び表を参照しながら説明される。本発明の方法、使用及びその他の態様のかかる例は、あくまでも代表例であり、本発明の範囲をかかる代表例のみに限定するものと解釈すべきではない。

【0161】

実施例は以下を示す：

【0162】

実施例１：扁平上皮肺癌における切断－融合－架橋様機構による８ｐ腕内のｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄに続くｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌの染色体内断裂の同定
本発明者らは、８ｐ１１－８ｐ１２の異種増幅パターン等の明確な８ｐ１１増幅ゲノム構造が、遺伝子型及び表現型のＦＧＦＲ１依存性、すなわちＦＧＦＲ１増幅腫瘍のＦＧＦＲ阻害剤（ＦＧＦＲｉ）療法に対する応答性につながるかどうかを分析した。具体的には、本発明者らは、ＦＧＦＲ阻害に対する応答性が不明な８ｐ１１－１２増幅扁平上皮肺癌を最初に分析した。

【0163】

ヒト肺腫瘍標本（初期研究コホート）：本発明者らは、複数の共同研究機関から新鮮凍結組織標本、凍結切片又は新鮮凍結材料から抽出したゲノムＤＮＡとして提供された合計計２７の新鮮凍結扁平上皮肺癌腫瘍（ＳＱＬＣ）試料を収集した。全ての腫瘍試料は、少なくとも６０％の純度を有し、壊死の広範な兆候がないことが病理学的に評定された。さらに、これらの腫瘍試料は少なくとも２人の独立した専門家病理医によって審査され、ＳＱＬＣの診断はＨ＆Ｅ染色及び免疫組織化学によって組織学的に確認された。免疫組織化学では、４％ＰＢＳ緩衝ホルマリンで組織を固定し、パラフィン（ＦＦＰＥ）に包埋した。免疫組織化学を、ｐＦＧＦＲ１に対する特異的抗体（Ａｂｎｏｖａ、Ｙ１５４）を用いて３μｍスライドで以前に記載されるように行った。

【0164】

ＥＤＴＡ－抗凝固血液又は隣接する非腫瘍性肺組織の形で、適合する正常材料が提供された。適合する正常組織は病理学的評定により腫瘍汚染がないことが確認された。さらに、ＳＮＰ ６．０アレイ及びシークエンス分析により、同一患者から腫瘍及び適合する正常材料が取得されたことが確認された。ヒト腫瘍試料は書面によるインフォームドコンセントに従ってＩＲＢ承認プロトコルの下で患者から取得され、患者材料を－８０℃で保存した。

【0165】

ゲノム及びトランスクリプトームシーケンシング：ｂｗａ－ｍｅｍ（０．７．１３－ｒ１１２６；https://github.com/lh3/bwa）を使用してシーケンシングリードを参照ゲノム（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３７／ｈｇ１９）にアラインメントし、ＰＣＲ重複の可能性及び重複するリード対の領域をマスキングし、突然変異及び全ゲノムの場合はゲノム再編成を呼び出すために使用される様々なカウント統計を収集することによってデータが処理される。最後に、Ｓｃｌｕｓｔを試料純度推定及びコピー数分析に使用する。ＴＲＵＰを用いてＲＮＡ－ｓｅｑデータを分析した。

【0166】

ＡＲＣＨＥＲシーケンシング：製造業者の指示に従って、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ＲＮＡ ＦＦＰＥキットと組み合わせたＭａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ（Promega）を使用して、ＦＦＰＥ材料からＲＮＡを抽出した。ＴＵＲＢＯ ＤＮＡフリーキット（Thermo Fisher Scientific）でゲノムＤＮＡの除去を行い、Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳアッセイキット（Thermo Fisher）を用いてｔＲＮＡとＲＮＡの両方を定量した。ＲＮＡの完全性の分析を、４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）で行った。

【0167】

融合検出には、ライブラリー調製用に２００ｎｇ ｔＲＮＡインプットを用いて、製造業者の指示に従ってＡｒｃｈｅｒ ＦｕｓｉｏｎＰｌｅｘ Ｌｕｎｇ Ｐａｎｅｌ（ArcherDX）を使用した。ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ定量キット（Roche、米国カリフォルニア州プレザントン）を用いて精製したライブラリーを定量した。Ｎｅｘｔｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ（Illumina、米国カリフォルニア州サンディエゴ）でシーケンシングを行い、Ａｒｃｈｅｒ Ｓｕｉｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖ ６．２．７（ArcherDX）で結果を分析した。Ａｒｃｈｅｒ Ｓｕｉｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアは逆位を標識することができないため、ｂａｍファイルを抽出してＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）に直接ロードし、ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂を可視化した。

【0168】

コンピューター分析：コピー数をＧＩＳＴＩＣ（GISTIC2.0 facilitates sensitive and confident localization of the targets of focal somatic copy-number alteration in human cancersを参照）及びＲＯＢＯＣＯＰで可視化した。ＦＧＦＲ１領域におけるコピー数の情報を試料間で要約するため、ＦＧＦＲ１遺伝子座の周囲２ＭＢのビューウィンドウを１０’０００ビンに分割した。次いで、利用可能な染色体セグメントベースのコピー数データを各試料についてこれらのビンにマッピングした。次に、或る特定の条件内の全ての試料のコピー数のビン当たりの平均を計算し、ウィンドウサイズを１０（全ゲノムシーケンシングデータの場合）とし、これらの数字のうち５００をＣＡＧＥデータにおいてノイズを低減するローリング平均を求めた。コピー数のローリングビン平均を決定するプロセスは、ここではＲＯＢＯＣＯＰアルゴリズムとして定義される。染色体のセグメンテーションと（増幅された）ＦＧＦＲ１遺伝子座におけるセグメントコピー数の値の配列ｎが与えられた場合、このアプローチは最初の野生型セグメンテーションに回文ＢＦＢ変換を適用することで、おおよそのコピー数配列「ｎ’」を推定する。シーケンス間の類似性／距離は、近似ｎ’が与えられたときに配列ｎを観察するポアソン尤度として測定される。提供されたＪａｖａアプリケーションを使用して、ＢＦＢ推論は２つの工程、すなわち（１）ｎ’の推定（java bfb.BFB_Algo counts:n mode:substring model:Poisson maxError:0）、及び（２）ｎ’をＢＦＢ変換の配列に変換すること（java bfb.BFB_Algo counts:n' mode:search）で行われた。興味深いことに、ＢＦＢが少なくとも８セグメントの近似を持つアンプリコンのみが高信頼（ｎ＝１１）であると考えられ、一方、８セグメント未満のアンプリコン及び／又は折り返し型逆位による支持がないアンプリコンは、ＢＦＢを基礎メカニズムとして確実に推論するには曖昧すぎた（ｎ＝１４）。

【0169】

本発明者らは、腫瘍及びそれらの適合する正常組織の全ゲノムシーケンシング及びトランスクリプトーム（２５のうち２２）シーケンシングを行った。予想通り、２５個の試料全ての平均コピー数をプロットしたところ、ＦＧＦＲ１と隣接するＮＳＤ３遺伝子（ＦＤＲ ｑ＝１．３×１０^－３８）を中心に増幅されていることが明らかになった（図１ａ）。８ｐ１１－１２アンプリコンの正確なゲノム構造を解読するために、本発明者らは、発生する全ての再編成を調べ、参照ゲノム（正常、ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ、又はｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ）と比較して、それらの向きに従って命名した。本発明者らは、ＦＧＦＲ１の転写開始側に近いｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂を持つアンプリコンのみが、ＦＧＦＲ１／ＮＳＤ３周辺を中心とした増幅パターンを駆動することを見出した。本発明者らは、ＦＧＦＲ１の上流４００キロベース（ｋｂ）の領域内でｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂が起こった９つの試料を特定した（３６％）。これらの試料は、ＦＧＦＲ１という１つの遺伝子のみに焦点を当てた５５０ｋｂの局所アンプリコンを示したが、明瞭なｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂がない腫瘍では、増幅領域は３倍（１．７ｍｂ）大きかった（図１ａ）。アンプリコンがＦＧＦＲ１を中心とする、９標本中５標本（５６％）において、局所増幅につながる第２の断裂が、ＮＳＤ３（又はＷＨＳＣ１Ｌ１）遺伝子内にあった。これらの断裂は、主にｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ断裂（５個中４個）であり、ＮＳＤ３のエクソン１３～エクソン２３の欠失につながる（図１ｂ）。ＮＳＤ３内にｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ断裂を有する腫瘍は、触媒ＳＥＴドメインを欠損するＮＳＤ３の短いアイソフォームの発現増加を示し、非発癌性であることが報告されている。反対に、ＦＧＦＲ１の細胞内部分を特に増幅する別の腫瘍では、ＦＧＦＲ１内のｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂が起こる（図１ｃ）。この断裂の影響を以下に述べる（図３）。したがって、２５個の８ｐ増幅扁平上皮肺癌標本のうち９個において、ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ再編成は、ＦＧＦＲ１のみを中心とする局所増幅を引き起こした。これらの腫瘍のうち４つにおいて、本発明者らは、破壊的なゲノム事象に起因するＳＥＴドメインをコードするエクソンを欠くＮＳＤ３の非発癌性バージョンが優勢に発現していることを見出した（図１ｂ）。

【0170】

更に詳細な解析により、８ｐ上のゲノム再編成のパターンはテロメア喪失、切り取られた読み取り方向、コピー数変動、及び少なくとも８つのコピー数セグメントという特徴的な性質を持つ切断－融合－架橋（ＢＦＢ）サイクルに由来することを示した（図１ｄ）。ＦＧＦＲ１を増幅した２５例全てにおいて、テロメア喪失が観察され、これは染色体内のｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ融合及びｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ融合を頻繁に伴っていた（切り取られた読み取り方向によってｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ断裂又はｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂として検出）（図１ｄ、図１ｅ）。こうして本発明者らは、腫瘍の４４％（２５個中１１個）でＢＦＢが８ｐ増幅の根本的な原因であることを確実に特定することができた。試料の５６％では、セグメント化が低いか、観察された再編成からの支持がないため、ＢＦＢ機構が不確実であった（４８％）か、又は除外（８％）された。最後に、本発明者らは、再びＢＦＢ機構を確認し、観察されたゲノム断裂のみを考慮して、根本的な機構としてのＢＦＢの組み立て理論に従って、１つの腫瘍において正確な８ｐアンプリコンを正しく再構築することができた（図１ｆ、図１ｇ）。要約すると、扁平上皮肺癌における８ｐ増幅は、大多数の症例で切断融合架橋によって引き起こされる。ＦＧＦＲ１転写開始側に近い染色体内ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂とそれに続くＮＳＤ３内又はそれに近いｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ断裂は、局所増幅及びＦＧＦＲ１を中心とする増幅を引き起こす。

【0171】

まとめると、本発明者らは、８ｐ１１－８ｐ１２の増幅は、ＢＦＢ様機構によって駆動されることを示した。ＦＧＦＲ１転写開始側に近い染色体内のｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂は局所増幅を引き起こし、ＦＧＦＲ阻害剤の感受性と関連している。

【0172】

実施例２：８ｐ１１－ｐ１２増幅肺癌腫瘍を形成する切断－融合－架橋機構とＦＧＦＲ１阻害剤依存性の根本的な機構の確認
８ｐ１１－８ｐ１２増幅肺癌腫瘍の理解を深め、８ｐ１２－８ｐ１１アンプリコン構造の特定のパターンとＦＧＦＲ１の依存性を結びつけるために、本発明者らはＦＧＦＲ阻害に対する既知の感度を持つ２６個の８ｐ増幅腫瘍標本の独立したコホートを分析した。詳細には、本発明者らは、ＦＧＦＲ１を増幅した８つの肺癌細胞株を分析し（図２ａ、図２ｂ）、そのうち６個は低分子阻害剤であるＢＧＪ３９８及びＡＺＤ４５４７によるＦＧＦＲ阻害に耐性であり（半増殖阻害濃度、すなわちＧＩ_５０、＞１μＭ）、２個の細胞株は感受性であった（ＧＩ_５０＜１μＭ、Ｈ１５８１及びＤＭＳ１１４）（図２ａ）。８ｐアンプリコンの特定の構造がＦＧＦＲ依存性を決定するという本発明者らの仮説を確認し、感受性細胞株ではアンプリコンはＦＧＦＲ１とＮＳＤ３を中心とするが、耐性細胞株では増幅はＦＧＦＲ１に対して局所でもなく、ＦＧＦＲ１を中心としなかった（図２ｂ）。注目すべきことに、本発明者らは、最も高感度な細胞株Ｈ１５８１に１つの破壊的なＮＳＤ３断裂ポイントを見つけ、ＮＳＤ３のエクソン１５をＡＮＫ１のエクソン１０とのフレーム外融合に再編成した。

【0173】

さらに、本発明者らは、患者由来の８ｐ１２－８ｐ１１増幅扁平上皮肺癌異種移植モデルを分析した。全体として、本発明者らは、EpoBerlinの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデル３５例、Crown Bioscience Inc.からのＰＤＸモデル３９例、以前に記載されたMoro Massimoの試料３例に対してＦＧＦＲ１蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。さらに、本発明者らは、ＮＳＧマウスにマトリゲル（Corning）５μｌ～１０μｌと共に生検（ＤＭＥＭ培地中で輸送）に由来する腫瘍片２ｍｍ^３～３ｍｍ^３を皮下に移植して、８つのＰＤＸモデルを確立した。本発明者らは、８つのＦＧＦＲ１増幅モデルを特定し、ＣＡＧＥシーケンシングを行った。ＦＧＦＲ１増幅を確認するＣＡＧＥシーケンシング試料は、ＢＧＪ３９８（Tocris Bioscience、２０ｍｇ／ｋｇ、３３％のＰＥＧ３００、５％のグルコースに溶解、毎週ストックを新しく調製し、４℃で保存）又はビヒクル（３３％ＰＥＧ３００、５％グルコース）で１群あたり少なくとも３匹ずつ毎日経口治療した。患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデル８例のうち３例はＦＧＦＲ阻害に感受性であった（図２ｃ）。ゲノムシーケンシングデータから抽出した染色体遺伝子のコピー数を分析すると、高感度ＰＤＸモデルではＮＳＤ３とＦＧＦＲ１を中心とした増幅パターンが再び明らかになった（図２ｄ）。注目すべきことに、本発明者らは、或る感受性モデルでは、エクソン９～エクソン２３を欠失する有害なｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ ＮＳＤ３再編成を観察したが、これは非感受性モデルのいずれにも見られなかった。対照的に、非感受性ＰＤＸモデルでは、８ｐ増幅はＦＧＦＲ１中心ではなく、８ｐ１１－８ｐ１２遺伝子座内でも局所ではなく、本発明者らは、ＦＧＦＲ１遺伝子に影響を与える破壊的なｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ再編成を見出し、１つの非感受性ＰＤＸではエクソン６～エクソン１８を欠失したが、これはどの感受性モデルでも検出されなかった。

【0174】

最後に、本発明者らは、ＦＧＦＲ１増幅扁平上皮肺癌を有する患者１０名から得られた生検標本を分析した。試料はホルマリン固定生検であり、治療前に採取した。これらの患者のうち８名は、第Ｉ相臨床試験の一環としてＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８で治療されており（図２ｅ）、１名は、ＦＧＦＲも阻害するマルチキナーゼ阻害剤であるパゾパニブの適用外使用に応答した。この１０名の患者のうち、４名は９ヶ月～１７ヶ月持続する部分応答（最大腫瘍径の少なくとも３０％の腫瘍縮小と定義）を経験し、６名はＦＧＦＲ阻害剤による治療下で進行性の疾患を有した。患者試料から入手可能なＤＮＡの量が少ないことを考慮して、本発明者らは、ゲノム８ｐ１１－８ｐ１２遺伝子座の大部分と並んで、追加の２２６遺伝子をカバーするように調整されたハイブリッドキャプチャに基づくシーケンシングアッセイを開発した。本発明者らは、このアプローチを用いて、平均シークエンス深度４７０倍で１０個の臨床標本を配列決定した。本発明者らは、ＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８に対する応答を経験していない患者から得られた５つの腫瘍標本のうち３つに８ｐの非局所増加に加えて、３つの異なるＰＩＫ３ＣＡ変異（Ｇ１１８Ｓ、Ｅ５４５Ｋ、及びＨ１０４７Ｒ）を見出した。一般にＦＧＦＲ阻害に応答しなかった患者は、ＡＤＡＭファミリー遺伝子を中心とした増幅を示す（図２ｅ、図２ｆ）。対照的に、染色体遺伝子のコピー数を詳細に解析したところ、ＦＧＦＲ阻害に対して測定可能な応答を有する患者では、ＦＧＦＲ１／ＮＳＤ３を中心とした局所増幅が明らかになった（図２ｅ、図２ｆ）。さらに、本発明者らは、応答患者群でＮＳＤ３内に１つの有害なｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ断裂（９個の試料のうち１個、エクソン６～エクソン２３を欠失）を認めた。

【0175】

本発明者らは、ＦＧＦＲ阻害剤で治療を受けた患者、ＰＤＸモデル、及び細胞株のプール分析では、ＦＧＦＲ１転写開始側に近いｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂によって、局所ＦＧＦＲ１増幅及びＦＧＦＲ１中心増幅が誘導されることを見出した。これらの断裂は、９名中７名（７８％）の「レスポンダー」（すなわち、ＦＧＦＲ阻害に感受性のある腫瘍／細胞株）と、１２名中３名（２５％）の非レスポンダー（すなわち、非感受性の腫瘍／細胞株、５つの細胞株試料では、全エクソソームシーケンシングデータのみが利用可能）で起こった。したがって、ＦＧＦＲ１の転写開始部位に近いｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂は局所増幅を誘導し、ＦＧＦＲ阻害に対する感受性と関連していた（ｐ＝０．０３、フィッシャーの正確確率検定）。さらに、本発明者らは、感受性の試料において、エクソン６～エクソン２３を欠失する３つの破壊的なＮＳＤ３断裂（３３％）を見出したが、これは非感受性モデルのいずれでも見られなかった。

【0176】

４名の感受性患者のうち２名から得られた腫瘍では、本発明者らは、ＦＧＦＲ１の最初のエクソン（カノニカルＡＴＧ開始コドンを含む）を欠失するｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌの再編成を特定し（図２ｇ～図２ｊ）、したがって、有害なゲノム事象の可能性を示唆した。１人目の患者では、エクソン２とエクソン３の間に再編成が起こった（図２ｈ）。２人目の患者における断裂はエクソン１とエクソン２の間に起こった（図２ｊ）。そこで、本発明者らは、ＦＧＦＲ１のＯＲＦの残りの部分は下流の代替開始コドンによって保存されているのではないかと推測した。この考えを裏付けるように、本発明者らは、これら２つの標本のうちの１つの組織を得ることができ、この標本はｐＦＧＦＲ１陽性に染色され、したがって、無傷で活性化されたＦＧＦＲ１シグナル伝達を示した（図２ｇ、右パネル）。

【0177】

実施例３：ＦＧＦＲ１／ＮＳＤ３とＦＧＦＲ１の間の非コード領域からの染色体内ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂の特定
本発明者らの仮説を更に裏付けるものとして、本発明者らは、前述の腫瘍において、ＮＳＤ３に有害な断裂がない、ＮＳＤ３／ＦＧＦＲ１中心増幅による同様の断裂を特定した（図３ａ）。この腫瘍は、ＦＧＦＲ１の転写開始側に近い高度に覆われたｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂を呈し、断裂増幅による早期事象、及びＦＧＦＲ１内の非コード領域の染色体内ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂を示した。この断裂により、カノニカルＡＴＧ開始コドンを含むＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン７を欠失した（図３ａ、図３ｂ）。しかしながら、この試料は、ＮＳＤ３_長（１キロベースミリオン当たり１２フラグメント）と比較してＦＧＦＲ１（１キロベースミリオン当たり１８フラグメント）の転写が５０％高く、断裂ポイント全体での転写が明らかとなった。さらに、本発明者らは、断裂ポイントをカバーするプライマーを用いた逆転写酵素ＰＣＲにより、再編成された遺伝子の転写を確認し、続いてシーケンシングを行った（図３ｃ）。最後に、本発明者らは、ＦＧＦＲ１内にｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂を有する追加のＦＧＦＲ１増幅腺扁平上皮癌を特定した（図３ｄ）。この断裂は、ＦＧＦＲ１のエクソン１～エクソン８の欠失をもたらした（図３ｅ）。ここでも、Ｎ末端の欠失の状況でＦＧＦＲ１遺伝子を無傷で発現させるという本発明者らの仮説を支持して、本発明者らは、断裂ポイントを横切って活性な転写を見出した（図３ｆ）。この腫瘍においても、本発明者らは、免疫化学におけるｐＦＧＦＲ１の陽性染色を観察した。したがって、ＦＧＦＲ１内の４つのｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂は全て、遺伝子の５’部分（エクソン８まで）のエクソンのゲノム欠失をもたらし、外部ドメインを欠くＦＧＦＲ１のＮ末端短縮バージョンの発現、並びに膜貫通ドメイン及びキナーゼドメインをコードする領域（エクソン９～エクソン１８）の増幅を伴った。

【0178】

ＦＧＦＲ１のＮ末端部分（外部ドメインを含む）は受容体の自己阻害と同様にリガンド特異性を担う。さらに、エクソン９は、フレーム内非カノニカルＡＴＧ開始コドンを持ち、ＦＧＦＲ１エクトドメイン全体の欠失は、リガンド非依存的な二量体化をもたらす。そこで本発明者らは、遺伝子内ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ再編成によるＦＧＦＲ１の外部ドメインのＮ末端欠失が、ＦＧＦＲ１依存性、ひいてはＦＧＦＲ阻害に対する感受性を引き起こすキナーゼの発癌性バージョンを生成する可能性があるという仮説を立てた。

【0179】

本発明者らは、免疫ブロッティングを用いて、遺伝子内ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ再編成によるＦＧＦＲ１のエクトドメインのＮ末端欠失がＦＧＦＲ１依存性を引き起こすキナーゼの発癌性バージョンを生成するかどうかを解析した。簡潔には、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ（Roche）とホスファターゼ阻害剤（Calbiochem）のカクテルで補ったＲＩＰＡ溶解バッファーに溶解した。氷上で２０分間インキュベーションした後、溶解液を１８０００ｇで２５分間遠心分離した。上清中のタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（ThermoScientific）を用いて測定した。等量のタンパク質（３０μｇ～６０μｇ）を変性させて４％～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離した後、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ－Ｃ Ｅｘｔｒａ）上にブロッティングした。免疫ブロッティングには、β－アクチン（MP Bioscience）、ホスホ－ＦＧＦＲ（Ｔｙｒ６５３、Ｔｙｒ６５４）、ホスホ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＡＫＴ、ホスホ－ＥＲＫ、及び全ＥＲＫ、全ＦＧＦＲ１（Ａｂｃａｍ）、並びにウサギ及びマウスに対するコンジュゲート抗体（Millipore）を用いた。

【0180】

本発明者らは、さらに、マウスＢａ／Ｆ３細胞におけるΔＥＣ－ＦＧＦＲ１の異所性発現がＩＬ３非依存的な細胞増殖をもたらすことを観察した。対照的に、野生型（ｗｔ）ＦＧＦＲ１の過剰発現は、ＩＬ－３の独立性を誘導するのに十分ではなかった。さらに、ΔＥＣ－ＦＧＦＲ１を発現するＢａ／Ｆ３細胞は、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８及びＡＺＤ４５４７によるＦＧＦＲ阻害に対して非常に感受性であった（図３ｇ、図３ｈ、図３ｉ）。

【0181】

まとめると、本発明者らは、扁平上皮肺癌における８ｐ１１－８ｐ１２増幅が、典型的には、切断融合架橋によって引き起こされることを発見した。増幅機構は、８ｐ腕内でｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ、続いてｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌの染色体内断裂を誘導する。この機構に基づいて、本発明者らは、観察された８ｐ１１－ｐ１２コピー数のプロファイルを、８ｐ腕内の全てのゲノム断裂を考慮して再構築することができた。さらに、ＦＧＦＲ１の転写開始側に近いｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂は、ＦＧＦＲ１／ＮＳＤ３の局所増幅及びＦＧＦＲ１／ＮＳＤ３を中心とする高振幅の増幅をもたらし、ＦＧＦＲ阻害に対する感受性と関連していた。対応するｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ断裂はＮＳＤ３（ＷＨＳＣ１Ｌ１）内に頻繁に位置し、これは、エクソン６～エクソン２３の欠失につながり、その結果、ＮＳＤ３の触媒ＳＥＴドメイン（エクソン１９～エクソン２０）が欠失した。５２の試料を全て合わせると、非発癌性ＮＳＤ３_短（エクソン１～エクソン１０）の局所ＦＧＦＲ１増幅駆動発現を持つ１８の試料で、９個中８個（８９％）のＮＳＤ３断裂が検出された。対照的に、４個のＦＧＦＲ１増幅試料（本研究で使用したＦＧＦＲ１増幅試料の８％）では、ＦＧＦＲ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内でｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂が発生し、エクソン１～エクソン８の範囲の遺伝子の様々な部分が欠失された。これらの断裂は、エクソン９における非カノニカルインフレームＡＴＧ開始コドンを用いて、外部ドメインを欠くＦＧＦＲ１の短い発癌性バージョンの発現を誘導した。機構的には、外部ドメインを欠くＦＧＦＲ１バリアントによるリガンド非依存的な二量体化が以前に報告されている。しかしながら、かかるバリアントを引き起こす体細胞ゲノム改変は現在まで記載されていない。

【0182】

断裂ポイントにわたる発現を証明するため、ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ再編成並びにΔＥＣ－ＦＧＦＲ１バリアントを検証するため、本発明者らは、試料Ｓ００６７４とそれに対応する正常（グルノーブルのElisabeth Brambillaにより提供された）の１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。製造業者の指示に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐＩＩＩキット（Invirtrogen）を使用してｃＤＮＡを生成し、続いて１９１＿Ｆ１＿Ｓ００６７４／２０１＿Ｒ９＿Ｓ００６７４及び１９３＿Ｆ２＿Ｓ００６７４／２０２＿Ｒ１０＿Ｓ００６７４の断裂スパニングプライマーを使用してＰＣＲを行った。この試料では、（この断裂の回文性に基づいて）ＰＣＲランごとに１つのプライマーのみを使用するネステッドＰＣＲによって、ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ再編成を検証した。１回目のランでは、本発明者らは、プライマー２６１＿６＿Ｒ１を使用した。２回目のラン（最初のＰＣＲからの４μｌのテンプレート）では、本発明者らは、プライマー２６２＿６＿Ｒ２を使用した。予想されるバンドサイズは７９４塩基対（全ゲノムシーケンシングデータに基づく）であった。Ｈ１５８１細胞のｃＤＮＡ（１００ｎｇ）を用いてａｔｔＢオーバーハングプライマーによりＦＧＦＲ１を増幅し、ＢＰクローナーゼ（Invitrogen）を用いてｐＤＯＮＲ．２２１に反転させた。コンピテント大腸菌（E. coli）株ＤＨ５α（Invitrogen）の細菌形質転換を、製造業者の指示に従って行った。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎミニキット（Machery Nagel）を用いて、プラスミドＤＮＡのミニ調製物からシングルクローンを配列決定した。プラスミドＤＮＡのミディ調製には、本発明者らは、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦキット（Machery Nagel）を使用した。異なるＦＧＦＲ１バリアントを、ギブソンアッセンブリ（Gibson Assembly）、並びに２３４＿Ｆ＿ΔＥＣ－２１－ＦＧＦＲ１、２３５＿Ｆ＿ΔＥＣ－３０－ＦＧＦＲ１、２３６＿Ｆ＿ΔＥＣ－８５－ＦＧＦＲ１、２３７＿Ｆ＿ΔＥＣ－１４４－ＦＧＦＲ１、及び２１１＿Ｒ＿ＦＧＦＲ１＿ＧＡのプライマーを用いて、並べて生成した。

【0183】

結論として、本発明者らの知見は、ＦＧＦＲ１の染色体内ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ断裂（場合によってはキナーゼの外部ドメイン欠損バージョンを引き起こす）が、治療上関連するＦＧＦＲ依存性を持つ扁平上皮肺癌を定義する可能性があることを示唆している。かかる再編成を有する患者は、ＦＧＦＲ阻害剤による治療の恩恵を受ける可能性がある。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【配列表】

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【国際調査報告】