特表 2024-531944 ＣＬＤＮ１８．２標的化抗体、二重特異性抗体、及びそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-03

(54)【発明の名称】ＣＬＤＮ１８．２標的化抗体、二重特異性抗体、及びそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240827BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240827BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240827BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240827BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240827BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240827BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20240827BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240827BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240827BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240827BHJP

   G01N 33/531 20060101ALI20240827BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALN20240827BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

C12P21/08 ZNA

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/21

C12N5/10

C07K16/46

C07K19/00

C07K14/725

A61P35/00

A61P15/00

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K39/395 T

A61K39/395 E

A61K39/395 U

A61K39/395 G

A61K39/395 L

A61K39/395 C

A61K47/68

A61K35/17

G01N33/53 D

G01N33/531 A

C12Q1/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508097

(86)(22)【出願日】2022-08-04

(85)【翻訳文提出日】2024-03-28

(86)【国際出願番号】 CN2022110314

(87)【国際公開番号】W WO2023016348

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】202110909032.3

(32)【優先日】2021-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524050615

【氏名又は名称】ハーバー バイオメッド（シャンハイ）カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジェン，ミン－ジン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ヨンキアン

(72)【発明者】

【氏名】ザン，ユン

(72)【発明者】

【氏名】ザオ，チュチュ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ユンシン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，フェイ

(72)【発明者】

【氏名】キン，ベイベイ

(72)【発明者】

【氏名】ウー，ユエタオ

(72)【発明者】

【氏名】ディン，イ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA14

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ79

4B063QQ96

4B063QR48

4B063QS05

4B063QS33

4B063QS38

4B063QX01

4B064AG20

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC03

4B064CC06

4B064CC10

4B064CC12

4B064CC15

4B064CC24

4B064CD21

4B064CE03

4B064DA05

4B064DA14

4B065AA26X

4B065AA90X

4B065AA91X

4B065AA91Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA21

4B065BB25

4B065BC03

4B065BC07

4B065BC11

4B065BD15

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA10

4C084BA11

4C084BA14

4C084BA15

4C084BA41

4C084BA42

4C084BA44

4C084CA59

4C084DA32

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZA811

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA26

4C085AA27

4C085BB01

4C085BB12

4C085BB50

4C085CC03

4C085CC08

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG02

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087NA05

4C087NA13

4C087ZA81

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA51

4H045FA74

4H045GA15

(57)【要約】

本発明は、ＣＬＤＮ１８．２標的化抗体、二重特異性抗体、及びそれらの使用を開示する。ＣＬＤＮ１８．２標的化抗体は、ＣＬＤＮ１８．２を内生的に発現する腫瘍細胞に対する親和性が高く、且つ高いエンドサイトーシス活性を誘導することができるシングルドメイン重鎖抗体である。二重特異性抗体は、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３を標的とすることができ、且つＦｃＲｎへのＦｃの結合効果を保持する；一方、ＦｃｇＲへの結合を、故にＦｃｇＲの架橋結合によって引き起こされる非特異的Ｔ細胞の活性化を引き下げるようなミュータントＦｃが好まれる。ＣＲＳ、例えばＩＬ６及びＴＮＦαにおいて一般的なサイトカインの放出を引き下げることができるように、ＣＤ３末端活性が最適化される。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むＣＬＤＮ１８．２標的化抗体であって、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号１６～１８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号４２～４６及び配列番号４８～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号７７～８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、抗体。

【請求項2】

前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４２、及び配列番号７７にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４３、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４４、及び配列番号７９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１７、配列番号４５、及び配列番号８０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１８、配列番号４３、及び配列番号８０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１８、配列番号４３、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４３、及び配列番号８１にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４６、及び配列番号８２にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４８、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４９、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５０、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５１、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５２、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５３、及び配列番号７９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５４、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記重鎖可変領域はさらに、フレームワーク領域を含み、その中に、ＨＦＲ１は、配列番号６又は７に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＦＲ２は、配列番号２８～３４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、ＨＦＲ３は、配列番号６３～６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、ＨＦＲ４は、配列番号８４及び８６～８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項4】

前記重鎖可変領域は、配列番号１５０～１５７及び配列番号１５９～１６５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。

【請求項5】

前記抗体はさらに、重鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、及びｈＩｇＧ４、並びにそれらのバリアントから選択され、より好ましくは、前記重鎖定常領域はｈＩｇＧ１である、請求項１に記載の抗体。

【請求項6】

前記抗体は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体、若しくはシングルドメイン抗体、又は前記抗体から調製されるモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項7】

前記抗体は、配列番号１８２～１８９及び配列番号１９１～１９７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むシングルドメイン抗体である、請求項６に記載の抗体。

【請求項8】

ＣＤ３を標的とする第１のタンパク質機能領域及びＣＬＤＮ１８．２を標的とする第２のタンパク質機能領域を含む二重特異性抗体であって；
前記第１のタンパク質機能領域はＦａｂの形態であり、前記第２のタンパク質機能領域はＶＨの形態であり、好ましくは２又は３つのＶＨを含み；前記第２のタンパク質機能領域が、直列的に連結された３つのＶＨを含む場合、前記第１のタンパク質機能領域及び前記第２のタンパク質機能領域は各々、Ｆｃの二本鎖に連結されており；前記第２のタンパク質機能領域が、直列的に連結された２つのＶＨを含む場合、前記第１のタンパク質機能領域及び前記第２のタンパク質機能領域は各々、Ｆｃの二本鎖に連結されており；前記第２のタンパク質機能領域が３つのＶＨを含み、前記３つのＶＨのうちの１つが、前記第１のタンパク質機能領域に連結されている場合、残りの２つのＶＨは直列的に連結されており、前記第１のタンパク質機能領域、及び前記第２のタンパク質機能領域の直列的に連結された前記２つのＶＨは各々、Ｆｃの二本鎖に連結されており；
これ以外にも、前記第１のタンパク質機能領域はＦａｂの形態であり、前記第２のタンパク質機能領域はＨＣＡｂの形態であり；
これ以外にも、前記第１のタンパク質機能領域はＦａｂの形態であり、前記第２のタンパク質機能領域はＶＨ－ＨＣＡｂの形態であり、前記第２のタンパク質機能領域は好ましくは、合計４つのＶＨを含む、二重特異性抗体。

【請求項9】

前記第２のタンパク質機能領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号１６～１８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号４２～４６及び配列番号４８～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号７７～８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み；
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４２、及び配列番号７７にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４３、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４４、及び配列番号７９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４８、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４９、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５０、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５１、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５２、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５３、及び配列番号７９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５４、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含み；
より好ましくは、前記重鎖可変領域は、配列番号１５０～１５２及び配列番号１５９～１６５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の二重特異性抗体。

【請求項10】

前記第１のタンパク質機能領域は、配列番号１０１、配列番号１１６、及び配列番号１３１にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号１１、配列番号３８、及び配列番号７２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み；
好ましくは、前記重鎖可変領域は、配列番号１４９又は配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１６８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８又は９に記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

前記二重特異性抗体は、３つのポリペプチド鎖を以下の形態で含む：
前記Ｆｃの２つのＮ末端は、前記Ｆａｂ及び前記ＶＨにそれぞれ連結されており；好ましくは、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３又はＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；
これ以外にも、前記ＨＣＡｂの１つのＣ末端は、前記ＦａｂのＶＨ又はＶＬに連結されており；好ましくは、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；これ以外にも、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第３のポリペプチド鎖を有し；これ以外にも、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；これ以外にも、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第３のポリペプチド鎖を有し；
これ以外にも、前記Ｆａｂの重鎖のＮ末端は、１つのＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}に連結されており、前記重鎖のＣ末端は、前記Ｆｃの１つのＮ末端に連結されており、直列的に連結された前記ＶＨのＣ末端は、前記Ｆｃの他のＮ末端に連結されており；好ましくは、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；
より好ましくは、異なる機能ユニット、例えば、ＶＨ、ＣＨ２－ＣＨ３、及びＶＬは、好ましくは配列番号２４４～２４８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２４６に示される配列を含むリンカーペプチドによって作動可能に連結されており；
より好ましくは、前記Ｆｃの２つのＮ末端は、前記Ｆａｂ及び前記ＶＨにそれぞれ連結されており；好ましくは、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３又はＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；
これ以外にも、前記ＨＣＡｂの１つのＣ末端は、前記ＦａｂのＶＨ又はＶＬに連結されており；好ましくは、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカーペプチド－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；これ以外にも、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカーペプチド－ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第３のポリペプチド鎖を有し；
これ以外にも、前記ＶＨ－ＨＣＡｂの１つのＣ末端は、前記ＦａｂのＶＨ又はＶＬに連結されており；好ましくは、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカーペプチド－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；これ以外にも、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカーペプチド－ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第３のポリペプチド鎖を有し；
これ以外にも、前記Ｆａｂの重鎖のＮ末端は、１つのＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}に連結されており、重鎖のＣ末端は、前記Ｆｃの１つのＮ末端に連結されており、直列的に連結された前記ＶＨのＣ末端は、前記Ｆｃの他のＮ末端に連結されており；好ましくは、前記二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－リンカーペプチド－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有する、請求項８又は９に記載の二重特異性抗体。

【請求項12】

前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１４に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２２に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２６に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２２８に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３０に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３１に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３２に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２３４に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２３６に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２３６に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３７に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２３８に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２３９に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４０に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４１に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４２に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１１に記載の二重特異性抗体。

【請求項13】

請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸。

【請求項14】

請求項１３に記載の単離された核酸を含む組換え発現ベクターであって、好ましくは、プラスミド、コスミド、ファージ、又はウイルスベクターであり、前記ウイルスベクターは、好ましくは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターである、組換え発現ベクター。

【請求項15】

請求項１４に記載の組換え発現ベクターを宿主細胞内に含む形質転換体であって、好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１、ＢＬ２１細胞、又はＣＨＯ－Ｋ１細胞である、形質転換体。

【請求項16】

請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体を含むキメラ抗原受容体、又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項17】

請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む遺伝的に修飾された細胞であって、好ましくは、真核細胞、好ましくは単離されたヒト細胞、より好ましくは免疫細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である、遺伝的に修飾された細胞。

【請求項18】

二重特異性抗体を調製する方法であって、請求項１５に記載の形質転換体を培養することと、前記培養から前記抗体又は前記二重特異性抗体を得ることとを含む方法。

【請求項19】

細胞毒性剤、及び請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む抗体－薬物コンジュゲートであって、好ましくは、前記細胞毒性剤はＭＭＡＦ又はＭＭＡＥである、抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項20】

請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
好ましくはさらに、ホルモン剤、小分子標的剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断薬、化学療法剤、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、及びワクチンからなる群の１つ以上を含む、医薬組成物。

【請求項21】

ＣＤ３及び／又はＣＬＤＮ１８．２関連疾患の予防又は処置のための薬剤の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、又は請求項２０に記載の医薬組成物の使用であって、
前記疾患は、好ましくは癌であり、前記癌は、好ましくは、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、腎臓癌、黒色腫、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、頭頚部腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、膀胱癌、肉腫、又は結腸直腸癌であり；好ましくは、前記癌は、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、腎臓癌、又は胆管癌であり；より好ましくは、前記癌は乳癌である、使用。

【請求項22】

請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体、請求項１７に記載の遺伝的に修飾された細胞、請求項１９に記載の抗体－薬物コンジュゲート、又は請求項２０に記載の医薬組成物を含むキットであって、
好ましくはさらに、（ｉ）前記抗体若しくはその抗原結合断片、前記抗体－薬物コンジュゲート、又は前記医薬組成物を投与するためのデバイス；及び／或いは（ｉｉ）指示事項を含む、キット。

【請求項23】

キットＡ及びキットＢを含むキットオブパーツであって：
前記キットＡは、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体、請求項１７に記載の遺伝的に修飾された細胞、請求項１９に記載の抗体－薬物コンジュゲート、及び／又は請求項２０に記載の医薬組成物を含み；
前記キットＢは、他の抗腫瘍抗体、又は前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物、並びに／又はホルモン剤、小分子標的剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断薬、化学療法剤、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、及びワクチンからなる群の１つ以上を含む、
キットオブパーツ。

【請求項24】

ＣＬＤＮ１８．２媒介疾患又は障害を診断、処置、且つ／又は予防する方法であって、診断、処置、及び／若しくは予防を必要とする患者に、治療的に有効な量の、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９に記載の抗体－薬物コンジュゲート、若しくは請求項２０に記載の医薬組成物を投与するか、又は診断、処置、及び／若しくは予防を必要とする患者を、請求項２３に記載のキットオブパーツにより処置することを含む方法。

【請求項25】

前記疾患又は障害は、腫瘍、好ましくはＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍、より好ましくは、胃癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌、肝癌、膵癌、膀胱癌、頭頚部癌、気管支癌、神経膠腫、及び／又は白血病である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

ＣＬＤＮ１８．２の免疫検出又は判定の方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９に記載の抗体－薬物コンジュゲート、又は請求項２０に記載の医薬組成物を用いることを含み、好ましくは、前記検出は、非診断且つ／又は治療目的のものである、方法。

【請求項27】

併用療法であって、これを必要とする患者に、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９に記載の抗体－薬物コンジュゲート、又は請求項２０に記載の医薬組成物、及び第２の治療剤を投与することを含み、前記第２の治療剤は、好ましくは、他の抗腫瘍抗体、又は前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物、並びに／又はホルモン剤、小分子標的剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断薬、化学療法剤、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、及びワクチンからなる群の１つ以上を含む、併用療法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物医学の分野に、特にＣＬＤＮ１８．２標的化抗体、二重特異性抗体、及びそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は今日、人間の最も致命的な疾患の１つである。世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＨＯ）のＲｅｐｏｒｔ ２０１８に従えば、毎年、癌の約１８０７万件の新しい症例がある。毎年、およそ９５５万人が癌で死亡している。ＷＨＯの推計に従えば、世界で最も一般的に診断される癌の第５位に、胃癌がランクされている。胃癌は、癌関連の死因の第３位（男性について）に、そして第４位（女性について）にランクされている。毎年、世界中で、胃癌の１００万件の新しい症例がある。米国において胃癌と主に診断されている患者のおよそ３５％は、転移性胃癌を患う人々である。進行胃癌と診断された人々の５年生存率は５％であり、生存期間の中央値は約６ヵ月である。転移性／再発胃癌を患う患者を処置するためのファーストライン薬物投与は、２つのケースに分けられる：（１）ＨＥＲ２－ｎｅｕ陽性患者について、トラスツズマブが、化学療法薬物と組み合わせて使用される；（２）ＨＥＲ２－ｎｅｕ陰性患者について、処置は化学療法薬剤に限られる；しかしながら、処置成果はよくない（Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２０１８ Ｓｅｐ １３；９：４０４）。

【0003】

ＣＬＤＮ１８（Ｃｌａｕｄｉｎ１８）分子のスプライスバリアント１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５７４５３、ＮＭ０１６３６９に基づくＣＬＤ１８Ａ１、すなわちＣＬＤＮ１８．１）及びスプライスバリアント２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６に基づくＣＬＤ１８Ａ２、すなわちＣＬＤＮ１８．２）は、分子量がおよそ２７．９／２７．７２ｋＤである内在性膜貫通タンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。クラウディンは、上皮及び内皮の密着結合部内に位置する内在性膜タンパク質である。密着結合ファミリーの他の２つの主要なタンパク質は、オクルディン及び結合部接着分子（ＪＡＭ）である。クラウディンは、密着結合部の重要な構成要素であり、上皮細胞の極性を維持するのに、傍細胞拡散を制御するのに、そして細胞の成長及び分化を調節するのに重要な役割を果たす。クラウディンは、十分に構築された上皮内で抗体にほとんど近づくことができないが、腫瘍細胞において曝露されると推測される。クラウディン分子は、細胞質において、細胞膜を４回、Ｎ末端及びＣ末端の双方と交差させる。ヒトＣＬＤＮ１８．２（クラウディン１８．２）タンパク質は、全長で２６１アミノ酸を有する膜貫通タンパク質であり、そのうち１～２３は、シグナルペプチドを形成する；当該タンパク質は、シグナルペプチドの後に２つの膜外領域、約５５アミノ酸の細胞外ループ１（ＥＣＬ１）及び約２３アミノ酸のＥＣＬ２を有する。ＣＬＤＮ１８．１（クラウディン１８．１）及びＣＬＤＮ１８．２は、第１のＴＭ及びループ１（すなわちＥＣＬ１）を含むＮ末端の最初の２１アミノ酸が異なるが、Ｃ末端にて同一のプライマリタンパク質配列を有する。ヒトＣＬＤＮ１８．２及びヒトＣＬＤＮ１８．１のＥＣＬ１領域は非常に類似しており、ヒトＣＬＤＮ１８．２及びヒトＣＬＤＮ１８．１のＥＣＬ２領域は同一である。ゆえに、ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質標的に対する抗体の開発は、ＥＣＬ１領域にて標的とされる抗体の検索、又はヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質の空間的構造を必要とする。これにより、この側面での研究はより困難となる。ＣＬＤＮ１８．１は、正常な肺及び胃の上皮において選択的に発現される（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００１ Ｎｏｖ；２１（２１）：７３８０－９０）。正常組織におけるＣＬＤＮ１８．２の発現は、胃上皮の分化細胞に高度に限られており、胃幹細胞領域には存在しない。しかし、これは、胃腫瘍、食道腫瘍、膵臓腫瘍、及び肺腫瘍、並びにヒト癌細胞株が挙げられる数種類の癌において、高度に発現される。タンパク質の分子量は、一部の癌及び隣接する正常組織において変動する。健康な組織において観察される高分子量のタンパク質は、組織ライセートを脱グリコシル化化合物ＰＮＧａｓｅＦにより処理することによって、癌において観察されるのと同じ分子量のものに変換され得る。このことは、クラウディンが、癌において、その正常な組織対応物におけるよりもＮ－グリコシル化されないことを示唆している。この構造差異は、変更したエピトープを生じさせる可能性がある。古典的Ｎ－グリコシル化モチーフは、分子のループＤ３ドメイン内の位置１１６のアミノ酸内にある（ＣＮ１０３５０９１１０Ｂ号明細書）。

【0004】

現時点では、ＣＬＤＮ１８．２に対するモノクローナル抗体の研究は、クラウジキシマブ（Ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ）（ＩＭＡＢ３６２）抗体の第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相臨床試験に限られている（国際公開第２０１４／１４６６７２号パンフレット参照）。ＩＭＡＢ３６２は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）効果を誘導し、且つ腫瘍致死を媒介することができる。ＩＭＡＢ３６２は、進行胃食道癌の処置について、第Ｉ及びＩＩ相臨床試験において有望な影響を示した（Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１８ Ｓｅｐ；１００：１７－２６）。しかしながら、ＩＭＡＢ３６２は、ヒト又はマウスキメラ抗体であるので、免疫原性リスクを包含し、親和性は高くない。多数の悪性腫瘍についての満たされていない医学的な必要性に起因して、より所望される薬学的特徴を有する他のＣＬＤＮ１８．２抗体が必要とされている。したがって、当該技術において、ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質を標的とする有効な抗体、特に完全ヒトモノクローナル抗体、及び細胞結合活性がより良好なモノクローナル抗体が欠けている。

【0005】

現時点では、臨床開発中のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体として、ＡｍｇｅｎのＡＭＧ９１０が挙げられる。ＡＭＧ９１０は、腫瘍致死を媒介するＴＤＣＣ（Ｔ細胞依存性細胞傷害活性）効果を誘導することができる。しかしながら、先行技術の抗体は、半減期が短い、薬物効果が不十分、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を引き起こす等の問題を有し得る。したがって、ヒトＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３の双方を標的とし、且つカニクイザルＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３に結合することができる、より安全且つより有効な二重特異性抗体を開発する切迫した必要性が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

ヒトＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３の双方を標的とし、且つカニクイザルＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３に結合することができるヒトＣＬＤＮ１８．２及び二重特異性抗体を標的とする安全且つ有効なモノクローナル抗体を欠いている先行技術における技術的課題を解決するために、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３標的化二重特異性抗体、並びにそれらの使用を提供する。

【0007】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第１の態様は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むＣＬＤＮ１８．２標的化抗体を提供し、ＨＣＤＲ１は、配列番号１６～１８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号４２～４６及び配列番号４８～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号７７～８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0008】

本発明の好ましい実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４２、及び配列番号７７にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４３、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４４、及び配列番号７９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１７、配列番号４５、及び配列番号８０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１８、配列番号４３、及び配列番号８０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１８、配列番号４３、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４３、及び配列番号８１にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４６、及び配列番号８２にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４８、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４９、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５０、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５１、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５２、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５３、及び配列番号７９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５４、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む。

【0009】

ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３についてのアミノ酸配列の先の組合せを、以下の表に詳述する。

【0010】

【表1-a】

【0011】

本発明の好ましい実施形態において、重鎖可変領域はさらに、フレームワーク領域を含み、その中に、ＨＦＲ１は、配列番号６又は７に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＦＲ２は、配列番号２８～３４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、ＨＦＲ３は、配列番号６３～６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、ＨＦＲ４は、配列番号８４及び８６～８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0012】

本発明の好ましい実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１５０～１５７及び配列番号１５９～１６５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。詳細について、以下の表ｂ参照。

【0013】

【表1-b】

【0014】

本発明の好ましい実施形態において、抗体はさらに、重鎖定常領域を含む。より好ましくは、重鎖定常領域は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、及びｈＩｇＧ４、並びにそれらのバリアントから選択される。さらに好ましくは、重鎖定常領域はｈＩｇＧ１である。

【0015】

本発明の好ましい実施形態において、抗体は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体、若しくはシングルドメイン抗体、又は上述の抗体から調製されるモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体である。

【0016】

本発明のより好ましい実施形態において、抗体は、配列番号１８２～１８９及び配列番号１９１～１９７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むシングルドメイン抗体である。詳細について、以下の表ｃ参照。

【0017】

【表1-c-1】

【0018】

【表1-c-2】

【0019】

本発明において、「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖、並びに１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合、及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によってまとめられる。「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖、並びにＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む１つの重鎖の一部、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメイン間の、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間で形成されてＦ（ａｂ’）_２分子を提供することができる領域を含有する。「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、２つの軽鎖、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部を含む２つの重鎖を、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖間で形成されるように含有する。ゆえに、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によってまとめられた２つのＦａｂ’断片からなる。用語「Ｆｖ」は、抗体のシングルアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる抗体断片を指すが、定常領域を欠いている。

【0020】

本発明において、ｓｃＦｖ（単鎖抗体断片）は、当該技術における従来の単鎖抗体であってよく、これは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、及び１５～２０アミノ酸の短いペプチドを含む。ｓｃＦｖにおいて、ＶＬドメイン及びＶＨドメインは、単ポリペプチド鎖を生成するのを可能にするリンカーを介して対形成されて一価の分子を形成する［例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３（１９８８）参照］。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有し得る。先行技術における適切なリンカーは、反復Ｇ_４Ｓアミノ酸配列又はそのバリアントからなる。例えば、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_４又は（Ｇ_４Ｓ）_３を有するリンカーが用いられ得るが、そのバリアントも用いられ得る。

【0021】

用語「多重特異性抗体」は、その最も広い意味で用いられており、マルチエピトープ特異性を有する抗体を包含する。当該多重特異性抗体として、以下に限定されないが：重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体であって、ＶＨ－ＶＬ単位はマルチエピトープ特異性を有する、抗体；２つ以上のＶＬ領域及びＶＨ領域を有する抗体であって、各ＶＨ－ＶＬ単位は、異なる標的、又は同じ標的の異なるエピトープに結合する、抗体；２つ以上の単可変領域を有する抗体であって、各単可変領域は、異なる標的、又は同じ標的の異なるエピトープに結合する、抗体；全長抗体、抗体断片、二重特異性抗体、トリアボディ、共有結合的に、又は非共有結合的に一緒に連結された抗体断片等が挙げられる。

【0022】

本発明の抗体は、モノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体又はｍＡｂ又はＡｂは、真核細胞株、原核細胞株、又はファージクローン細胞株に限定されない単一のクローン細胞株から得られる抗体を指す。

【0023】

本発明において、「重鎖抗体」（ＨＣＡｂとも称される）は、１つのみの重鎖可変領域（ＶＨＨ）、並びに２つの従来のＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む抗体を指す。

【0024】

本発明において、「シングルドメイン抗体」（「ナノボディ」とも称される）は、重鎖抗体からクローニングされたＶＨＨ構造を指す。これは、標的抗原に結合できることが知られている最も小さな単位である。

【0025】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第２の態様は、ＣＤ３を標的とする第１のタンパク質機能領域及びＣＬＤＮ１８．２を標的とする第２のタンパク質機能領域を含む二重特異性抗体を提供し；
第１のタンパク質機能領域はＦａｂの形態であり、第２のタンパク質機能領域はＶＨの形態であり、好ましくは２又は３つのＶＨを含み；第２のタンパク質機能領域が、直列的に連結された３つのＶＨを含む場合、第１のタンパク質機能領域及び第２のタンパク質機能領域は各々、Ｆｃの二本鎖に連結されており；第２のタンパク質機能領域が、直列的に連結された２つのＶＨを含む場合、第１のタンパク質機能領域及び第２のタンパク質機能領域は各々、Ｆｃの二本鎖に連結されており；第２のタンパク質機能領域が３つのＶＨを含み、３つのＶＨのうちの１つが、第１のタンパク質機能領域に連結されている場合、残りの２つのＶＨは直列的に連結されており、第１のタンパク質機能領域、及び第２のタンパク質機能領域の直列的に連結された２つのＶＨは各々、Ｆｃの二本鎖に連結されており；
これ以外にも、第１のタンパク質機能領域はＦａｂの形態であり、第２のタンパク質機能領域はＨＣＡｂの形態であり；
これ以外にも、第１のタンパク質機能領域はＦａｂの形態であり、第２のタンパク質機能領域はＶＨ－ＨＣＡｂの形態であり、第２のタンパク質機能領域は好ましくは、合計４つのＶＨを含む。

【0026】

本発明において、第１のタンパク質機能領域及び第２のタンパク質機能領域における「第１」及び「第２」は、実用的な意味を有しておらず、異なる標的について抗原結合ドメインを区別するのに用いられるだけである。あるタンパク質機能領域は、複数の抗原結合ドメインを同じ形態で含んでも異なる形態で含んでもよく；異なるタンパク質機能領域の抗原結合ドメインは、作動可能に一緒に連結され得、同じタンパク質機能領域の異なる抗原結合ドメインは、互いに連結され得ない。

【0027】

例えば、本発明において、第１のタンパク質機能領域は、ＣＤ３標的化抗原結合ドメインであり得、第２のタンパク質機能領域は、ＣＬＤＮ１８．２標的化抗原結合ドメインであり得る。

【0028】

本発明の好ましい実施形態において、第２のタンパク質機能領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１６～１８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号４２～４６及び配列番号４８～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号７７～８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0029】

より好ましくは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４２、及び配列番号７７にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４３、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４４、及び配列番号７９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４８、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号４９、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５０、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５１、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５２、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５３、及び配列番号７９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むか；又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号５４、及び配列番号７８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む。詳細について、以下の表ｄ参照。

【0030】

【表1-d】

【0031】

さらに好ましくは、重鎖可変領域は、配列番号１５０～１５２及び配列番号１５９～１６５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。それらは全て、表ｂに一覧にされている。

【0032】

本発明の特定の実施形態において、第１のタンパク質機能領域は、配列番号１０１、配列番号１１６、及び配列番号１３１にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号１１、配列番号３８、及び配列番号７２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。

【0033】

好ましくは、重鎖可変領域は、配列番号１４９又は配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１６８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0034】

上述の第１のタンパク質機能領域のアミノ酸配列は、以下の表ｅに示される。

【0035】

【表1-e】

【0036】

好ましくは、二重特異性抗体は、３つのポリペプチド鎖を以下の形態で含む：
Ｆｃの２つのＮ末端は、Ｆａｂ及びＶＨにそれぞれ連結されており；好ましくは、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３又はＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；
これ以外にも、ＨＣＡｂの１つのＣ末端は、ＦａｂのＶＨ又はＶＬに連結されており；好ましくは、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；これ以外にも、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第３のポリペプチド鎖を有し；これ以外にも、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；これ以外にも、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第３のポリペプチド鎖を有し；
これ以外にも、Ｆａｂの重鎖のＮ末端は、１つのＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}に連結されており、重鎖のＣ末端は、Ｆｃの１つのＮ末端に連結されており、直列的に連結されたＶＨのＣ末端は、Ｆｃの他のＮ末端に連結されており；好ましくは、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有する。

【0037】

より好ましくは、異なる機能ユニット、例えば、ＶＨ、ＣＨ２－ＣＨ３、及びＶＬは、好ましくは配列番号２４４～２４８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２４６に示される配列を含むリンカーペプチドによって作動可能に連結される。詳細について、表ｆ参照。

【0038】

【表1-f】

【0039】

本発明の一実施形態において、Ｆｃの２つのＮ末端は、Ｆａｂ及びＶＨにそれぞれ連結されており；好ましくは、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３又はＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し（特定の例について、図４の構造（１）及び（７）参照）；
これ以外にも、ＨＣＡｂの１つのＣ末端は、ＦａｂのＶＨ又はＶＬに連結されており；好ましくは、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカーペプチド－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；これ以外にも、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカーペプチド－ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第３のポリペプチド鎖を有し（特定の例について、図４の構造（２）及び（３）参照）；
これ以外にも、ＶＨ－ＨＣＡｂの１つのＣ末端は、ＦａｂのＶＨ又はＶＬに連結されており；好ましくは、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカーペプチド－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有し；これ以外にも、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカーペプチド－ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１に示される第３のポリペプチド鎖を有し（特定の例について、図４の構造（４）及び（５）参照）；
これ以外にも、Ｆａｂの重鎖のＮ末端は、１つのＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}に連結されており、重鎖のＣ末端は、Ｆｃの１つのＮ末端に連結されており、直列的に連結されたＶＨのＣ末端は、Ｆｃの他のＮ末端に連結されており；好ましくは、二重特異性抗体は、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２－}リンカーペプチド－ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第１のポリペプチド鎖、式：ＶＨ_{ＣＬＤＮ１８．２}－リンカーペプチド－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示される第２のポリペプチド鎖、及び式：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬに示される第３のポリペプチド鎖を有する（特定の例について、図４の構造（６）参照）。

【0040】

本発明の特定の実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１４に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２０に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２２に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２３に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２５に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２６に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２２８に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３０に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３１に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３２に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２３４に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２３６に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２３６に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３７に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２３８に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２３９に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４０に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４１に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４２に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含み；
これ以外にも、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４３に示されるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含む。

【0041】

上述の特定の実施形態における配列に関する情報が、以下の表ｇに示される。

【0042】

【表1-g-1】

【0043】

【表1-g-2】

【0044】

【表1-g-3】

【0045】

【表1-g-4】

【0046】

【表1-g-5】

【0047】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に従う抗体又は本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体をコードする単離された核酸を提供する。

【0048】

核酸の調製方法は、当該技術における従来の調製方法であり、好ましくは、以下の工程：遺伝子クローニング技術によって上述の抗体をコードする核酸分子を得る工程、又は人工完全配列合成によって上述の抗体をコードする核酸分子を得る工程を含む。

【0049】

ポリヌクレオチド相同体を提供するような置換、欠失、変更、挿入、又は付加が、上述の抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列中に適切に導入され得ることが当業者に知られている。本発明のポリヌクレオチド相同体は、抗体の活性が維持される範囲内で抗体配列をコードする遺伝子の１つ以上の塩基を置換するか、欠失させるか、又は付加することによって生成され得る。

【0050】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様に従う単離された核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。組換え発現ベクターは、当該技術における従来の方法を用いることによって、すなわち、本発明の核酸分子を種々の発現ベクターに連結することによって得ることができる。発現ベクターは、当該技術における従来のあらゆるベクターであるが、上述の核酸分子を有することができる場合に限る。

【0051】

好ましくは、組換え発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、又はウイルスベクターであり、ウイルスベクターは好ましくは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターである。

【0052】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第５の態様は、宿主細胞内に本発明の第４の態様に従う組換え発現ベクターを含む形質転換体を提供する；好ましくは、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１、ＢＬ２１細胞、又はＣＨＯ－Ｋ１細胞である。

【0053】

組換え発現形質転換体は、当該技術における従来の方法を用いることによって、例えば上述の組換え発現ベクターを宿主細胞中に形質転換することによって調製され得る。宿主細胞は、当該技術における従来のあらゆる宿主細胞であるが、上述の組換え発現ベクターの安定した複製を可能にし、且つ担持される核酸が効率的に発現され得る場合に限る。好ましくは、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１若しくはＢＬ２１細胞（単鎖抗体又はＦａｂ抗体を発現する）であるか、又はＣＨＯ－Ｋ１細胞（全長ＩｇＧ抗体を発現する）である。本発明の好ましい組換え発現形質転換体は、上述の組換え発現プラスミドを宿主細胞中に形質転換することによって得ることができる。形質転換方法は、当該技術における従来の形質転換方法、好ましくは、化学形質転換法、ヒートショック法、又は電気形質転換法である。

【0054】

本発明において、ＣＬＤＮ１８．２標的化抗体を用いて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等を修飾するように、Ｔ細胞又はＮＫ細胞等の細胞上に調製することができる。ゆえに、本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様に従う抗体又は本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0055】

例えば、キメラ抗原受容体は、以下の構造：（ａ）ＣＬＤＮ１８．２を特異的に認識する細胞外結合ドメインｓｃＦｖ；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）共刺激細胞内ドメイン；及び（ｅ）シグナル伝達ドメインを含み得；細胞外結合ドメインは、本発明の第１の態様に従うＣＬＤＮ１８．２標的化抗体を含む。

【0056】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第７の態様は、本発明の第１の態様に従う抗体又は本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体を含む遺伝的に修飾された細胞を提供する。好ましくは、遺伝的に修飾された細胞は、真核細胞、好ましくは単離されたヒト細胞、より好ましくは免疫細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。

【0057】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第８の態様は、二重特異性抗体を調製する方法であって、本発明の第５の態様に従う形質転換体を培養することと、培養から抗体又は二重特異性抗体を得ることとを含む方法を提供する。

【0058】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第９の態様は、細胞毒性剤、及び本発明の第１の態様に従う抗体又は本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供し；好ましくは、細胞毒性剤は、ＭＭＡＦ又はＭＭＡＥである。

【0059】

抗体－薬物コンジュゲートの調製方法は、当該技術における従来の方法、好ましくはＤｏｒｏｎｉｎａ，２００６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １７：１１４－１２４に記載される調製方法であってよい。好ましくは、調製方法は、最小低コンジュゲート画分（ｍｉｎｉｍａｌ ｌｏｗ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＬＣＦ）が１０％未満の抗体－薬物コンジュゲートを生成する。

【0060】

抗体－薬物コンジュゲートは、好ましくは澄明な溶液として、当該技術において知られているあらゆる物理的形態で存在し得る。

【0061】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第１０の態様は、本発明の第１の態様に従う抗体又は本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0062】

好ましくは、医薬組成物はさらに、ホルモン剤、小分子標的剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断薬、化学療法剤、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、及びワクチンからなる群の１つ以上を含む。

【0063】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第１１の態様は、ＣＤ３及び／又はＣＬＤＮ１８．２関連疾患の予防又は処置のための薬剤の製造における、本発明の第１の態様に従う抗体、本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体、又は本発明の第１０の態様に従う医薬組成物の使用を提供し；
疾患は、好ましくは癌であり、癌は、好ましくは、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、腎臓癌、黒色腫、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、頭頚部腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、膀胱癌、肉腫、又は結腸直腸癌であり；好ましくは、癌は、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、腎臓癌、又は胆管癌であり；より好ましくは、癌は乳癌である。

【0064】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第１２の態様は、本発明の第１の態様に従う抗体、本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体、本発明の第６の態様に従うキメラ抗原受容体、本発明の第７の態様に従う遺伝的に修飾された細胞、本発明の第９の態様に従う抗体－薬物コンジュゲート、又は本発明の第１０の態様に従う医薬組成物を含むキットを提供し；
好ましくは、キットはさらに、（ｉ）抗体若しくはその抗原結合断片、抗体－薬物コンジュゲート、又は医薬組成物を投与するためのデバイス；及び／或いは（ｉｉ）指示事項を含む。

【0065】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第１３の態様は、キットＡ及びキットＢを含むキットオブパーツを提供し：
キットＡは、本発明の第１の態様に従う抗体、本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体、本発明の第６の態様に従うキメラ抗原受容体、本発明の第７の態様に従う遺伝的に修飾された細胞、本発明の第９の態様に従う抗体－薬物コンジュゲート、及び／又は本発明の第１０の態様に従う医薬組成物を含み；
キットＢは、他の抗腫瘍抗体、又は他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物、並びに／又はホルモン剤、小分子標的剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断薬、化学療法剤、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、及びワクチンからなる群の１つ以上を含む。

【0066】

キットＡ及びキットＢは、同時に用いられてもよいし、キットＡは、キットＢの使用前に用いられてもよいし、キットＢは、キットＡの使用前に用いられてもよい。使用順は、特定の用途における実際の要求に従って決定することができる。

【0067】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第１４の態様は、ＣＬＤＮ１８．２媒介疾患又は障害を診断、処置、且つ／又は予防する方法であって、これを必要とする患者に、治療的に有効な量の、本発明の第１の態様に従う抗体、本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体、本発明の第６の態様に従うキメラ抗原受容体、本発明の第９の態様に従う抗体－薬物コンジュゲート、若しくは本発明の第１０の態様に従う医薬組成物を投与するか、又はこれを必要とする患者を、本発明の第１３の態様に従うキットオブパーツを用いて処置することを含む方法を提供する。

【0068】

好ましくは、疾患又は障害は、腫瘍、好ましくはＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍、より好ましくは、胃癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌、肝癌、膵癌、膀胱癌、頭頚部癌、気管支癌、神経膠腫、及び／又は白血病である。

【0069】

本発明で用いられる「ＣＬＤＮ１８．２陽性」は、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質の過剰発現に、例えばＣＬＤＮ１８．２陽性細胞ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞株に言及する；それ以外の場合には、「ＣＬＤＮ１８．２陰性」と称される。

【0070】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第１５の態様は、ＣＬＤＮ１８．２の免疫検出又は判定の方法であって、本発明の第１の態様に従う抗体、本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体、本発明の第６の態様に従うキメラ抗原受容体、本発明の第９の態様に従う抗体－薬物コンジュゲート、又は本発明の第１０の態様に従う医薬組成物を用いることを含む方法を提供する。好ましくは、検出は、非診断且つ／又は治療目的のものである。

【0071】

上述の技術的課題を解決するために、本発明の第１６の態様は、併用療法であって、これを必要とする患者に、本発明の第１の態様に従う抗体、本発明の第２の態様に従う二重特異性抗体、本発明の第６の態様に従うキメラ抗原受容体、本発明の第９の態様に従う抗体－薬物コンジュゲート、又は本発明の第１０の態様に従う医薬組成物、及び第２の治療剤を投与することを含み；第２の治療剤は、好ましくは、他の抗腫瘍抗体、又は他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物、並びに／又はホルモン剤、小分子標的剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断薬、化学療法剤、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、及びワクチンからなる群の１つ以上を含む、併用療法を提供する。

【0072】

本出願において、一覧にされるＣＤＲのアミノ酸配列は全て、Ｃｈｏｔｈｉａスキームに従って示される（本発明の特許請求の範囲における配列もまた、Ｃｈｏｔｈｉａスキームに従って示される）。しかしながら、抗体のＣＤＲを、種々の方法、例えば、配列変異性に基づくＫａｂａｔスキーム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（Ｕ．Ｓ．），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９９１）参照）、及び構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａスキーム（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－４８，１９９７参照）を用いて、当該技術において定義することができることは、当業者に周知である。本出願において、Ｋａｂａｔスキーム及びＣｈｏｔｈｉａスキームを含む組み合わせたスキームを用いて、アミノ酸残基を可変ドメイン順に決定することもできる。組み合わせたスキームは、ＫａｂａｔスキームをＣｈｏｔｈｉａスキームと組み合わせて、より大きな範囲を得る。詳細について、表１参照。特に明記しない限り、所与の抗体又はその領域（例えば可変領域）の用語「ＣＤＲ」及び「相補性決定領域」は、本明細書中に記載される上述の知られているスキームのいずれか１つによって定義される相補性決定領域を包含するものと解釈されることが、当業者によって理解されよう。本発明の特許請求の範囲において請求される範囲は、Ｃｈｏｔｈｉａスキームに基づいて示される配列であるが、他のＣＤＲ定義のスキームに対応するアミノ酸配列もまた、本発明の範囲内に入るものとする。

【0073】

【表1-1】

【0074】

Ｃｈｏｔｈｉａスキームにおいて、Ｌａａ～Ｌｂｂは、抗体の軽鎖のＮ末端から始まる位置ａａから位置ｂｂまでのアミノ酸配列を指し得；Ｈａａ～Ｈｂｂは、抗体の重鎖のＮ末端から始まる位置ａａから位置ｂｂまでのアミノ酸配列を指し得る。例えば、Ｌ２４～Ｌ３４は、抗体の軽鎖のＮ末端から始まる、Ｃｈｏｔｈｉａスキームに従う位置２４から位置３４までのアミノ酸配列を指し得；Ｈ２６～Ｈ３２は、抗体の重鎖のＮ末端から始まる、Ｃｈｏｔｈｉａスキームに従う位置２６から位置３２までのアミノ酸配列を指し得る。ＣｈｏｔｈｉａスキームによるナンバリングＣＤＲ内に挿入部位が存在する位置があることが、当業者に周知である。

【0075】

本発明において、定義される場合を除き、本明細書中で用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。加えて、本明細書中で用いられる細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学のラボ操作は、対応する分野において広く用いられているルーチン手順である。一方、本発明をより十分に理解するために、関連する用語の定義及び説明が、以下で提供される。

【0076】

本発明に用いられるアミノ酸の３文字コード及び１文字コードは、当業者に知られているか、又はＪ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ，２４３，ｐ３５５８（１９６８）に記載されている。

【0077】

本明細書中で用いられる用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ／ｉｎｃｌｕｄｅｓ／ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ／ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物及び方法が、記載される要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味することが意図される；しかし、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ／ｃｏｎｓｉｓｔｓ／ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の場合も、文脈に応じて含まれる。

【0078】

用語「ＣＬＤＮ１８．２」は、アイソタイプ、哺乳動物（例えばヒト）ＣＬＤＮ１８．２、ヒトＣＬＤＮ１８．２の種相同体、及びＣＬＤＮ１８．２と少なくとも１つの共通のエピトープを含む類似体を含む。ＣＬＤＮ１８．２（例えばヒトＣＬＤＮ１８．２）のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに示されるように、当該技術において知られている。

【0079】

用語「ＣＬＤＮ１８．１」は、アイソタイプ、哺乳動物（例えばヒト）ＣＬＤＮ１８．１、ヒトＣＬＤＮ１８．１の種相同体、及びＣＬＤＮ１８．１と少なくとも１つの共通のエピトープを含む類似体を含む。ＣＬＤＮ１８．１（例えばヒトＣＬＤＮ１８．１）のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに示されるように、当該技術において知られている。

【0080】

用語「エピトープ」は、抗体分子と特異的に相互作用する抗原（例えばヒトＣＬＤＮ１８．２）の部分を指す。本発明における用語「競合する」は、標的（例えばヒトＣＬＤＮ１８．２）への抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子の結合に干渉する抗体分子の能力に言及する。結合に対する干渉は、直接的であっても間接的（例えば、抗体分子又は標的のアロステリック調節を介する）であってもよい。競合結合アッセイ（例えば、ＦＡＣＳアッセイ、ＥＬＩＳＡ、又はＢＩＡＣＯＲＥアッセイ）を用いて、ある抗体分子が、別の抗体分子の、その標的への結合に干渉することができる程度を決定することができる。

【0081】

本発明において用いられる用語「抗体」は、鎖間ジスルフィド結合による、２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖間の結合によって形成されるテトラペプチド鎖構造の免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンは、その重鎖定常領域のアミノ酸組成及び配置が、従ってその抗原性が異なる。したがって、免疫グロブリンは、免疫グロブリンの５つのクラス又はアイソタイプ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥに分類され得、それらの対応する重鎖はそれぞれ、μ、δ、γ、α、及びε鎖である。同じクラスのＩｇは、ヒンジ領域のアミノ酸組成、並びに重鎖におけるジスルフィド結合の数及び位置の差異に従って、異なるサブクラスに分割され得；例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分割され得る。軽鎖は、定常領域の差異によって、κ鎖又はλ鎖に分類される。５つのクラスのＩｇは各々、κ鎖又はλ鎖を有し得る。

【0082】

本発明において、本発明の抗体の軽鎖可変領域はさらに、ヒトκ若しくはλ鎖、又はそのバリアントを含む軽鎖定常領域を含んでよい。本発明において、本発明の抗体の重鎖可変領域はさらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はそのバリアントを含む重鎖定常領域を含んでよい。

【0083】

抗体の重鎖及び軽鎖のＮ末端近くの約１１０個のアミノ酸の配列は、かなり変異するので、可変領域（Ｖ領域）と称され；Ｃ末端の近くの残りのアミノ酸配列は、比較的安定しているので、定常領域（Ｃ領域）と称される。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）、及び配列が比較的保存されている４つのフレームワーク領域（ＦＷＲ）を含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定するので、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られている。軽鎖可変領域（ＶＬ）又は重鎖可変領域（ＶＨ）は各々、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置される３つのＣＤＲ領域及び４つのＦＷＲ領域：ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＷＲ４からなる。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を指し；重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を指す。

【0084】

軽鎖及び重鎖において、可変領域及び定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖はさらに、約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクタ細胞）の、古典的補体系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）への結合が挙げられる、免疫グロブリンの、宿主の組織又は因子への結合を媒介することができる。ＶＨ領域及びＶＬ領域はさらに、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に再分割され得、これらの間にフレームワーク領域（ＦＷＲ）と呼ばれる保存領域が分配されている。ＶＨ及びＶＬは各々、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＷＲ：ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＷＲ４からなる。各重鎖／軽鎖の対応する可変領域（ＶＨ及びＶＬ）はそれぞれ、抗体結合部位を形成する。特に、重鎖は、３つ以上のＣＤＲ、例えば、６、９、又は１２個のＣＤＲを含み得る。例えば、本発明の二重特異性抗体において、重鎖は、別の抗体に連結されたＩｇＧ抗体の重鎖のＮ末端を有するＳｃＦｖであってもよく、この場合、重鎖は９つのＣＤＲを含む。

【0085】

用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列中にグラフトされている抗体（すなわち「ヒト化抗体」）を含まない。

【0086】

本明細書中で用いられる用語、抗体に関する「特異的な」は、抗体が特定の抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないか、又はこれに結合しないことを意味する。例えば、ある種由来の抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の種由来の抗原に結合する場合もある。しかしながら、そのような種間交差反応性はそれ自体で、特異性による抗体の分類を変えない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体は、当該抗原に異なる対立遺伝子形態でも結合し得る。しかしながら、そのような交差反応性はそれ自体で、特異性による抗体の分類を変えない。場合によっては、用語「特異性」又は「特異的結合」は、抗体、タンパク質、又はペプチドの、第２の化学物質との相互作用に言及するのに用いられ得、これは、相互作用が、化学物質内の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する；例えば、抗体は一般に、タンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識してこれに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的であれば、標識「Ａ」及び抗体を含有する反応において、エピトープＡ（又は遊離、非標識Ａ）を含有する分子の存在は、抗体によって結合された標識Ａの量を引き下げることとなる。

【0087】

本明細書中で用いられる用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、細胞外ドメイン（細胞外結合ドメイン）、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン（膜貫通領域）（抗原及びポリペプチドに結合してドメイン（すなわち細胞内シグナルドメイン）への細胞質シグナルのパスを生じさせることができる）を含む。ヒンジドメインは、細胞外抗原結合領域にフレキシビリティを付与する部分とみなされ得る。細胞内シグナルドメインは、細胞の活性を調節するための第２のメッセンジャを生成することによって、確定したシグナル伝達経路を介して情報を細胞中に送信するタンパク質、又はそのようなメッセンジャに対応することによってエフェクタとして機能するタンパク質を指す。これは、ＣＡＲの細胞（例えばＣＡＲＴ細胞）の免疫エフェクタ機能を促進することができるシグナルを生成する。細胞内シグナルドメインは、シグナル伝達ドメインを含み、そしてまた、共刺激分子に由来する共刺激細胞内ドメインを含み得る。

【0088】

「相同性」、「バリアント配列」、又は「変異」は、２つのポリヌクレオチド配列間の、又は２つのポリペプチド配列間の配列類似性に言及する。２つの比較される配列内の位置が全て、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンによって占有されているならば、分子は、当該位置にて相同である。２つの配列間の同一性パーセンテージは、２つの配列によって共有されるマッチ位置又は相同位置の数÷比較される位置の数×１００％の関数である。例えば、配列が最適にアラインされている場合、２つの配列内の１０個の位置のうち６つがマッチするか、又は相同であるならば、２つの配列は６０％相同である。一般に、２つのアラインされた配列が、最も大きな同一性パーセンテージを与えるときに、比較がなされる。「最適化」は、抗原への抗体の結合を維持するか、又は向上させる変異を指す。本発明では、ＣＬＤＮ１８．２への結合を維持するか、保存するか、又は向上させる変異を指す。

【0089】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」（一本鎖であれば）は、本発明において互換的に用いられる。用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、又は「ポリヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に用いられる。

【0090】

用語「変異」は、アミノ酸又はヌクレオチドの置換、付加、及び／又は欠失を含む。「アミノ酸置換」及び「保存的アミノ酸置換」はそれぞれ、アミノ酸残基の、別のアミノ酸残基による置換、及び側鎖が類似するアミノ酸残基による置換である。

【0091】

本明細書中で用いられる「レンチウイルス」は、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）科の属を指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中で独特であり、非分裂細胞に感染することができ；宿主細胞のＤＮＡ中にかなりの量の遺伝的情報を送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは、レンチウイルスの全ての例である。レンチウイルスに由来するベクターは、かなりの水平遺伝子導入をインビボで達成する手段を提供する。

【0092】

本明細書中で用いられる用語「ベクター」は、単離された核酸を含み、且つ単離された核酸を細胞の内部に送達するのに有用な組成物である。多くのベクターが、当該技術において知られている。以下に限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性化合物又は両親媒性化合物と関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられる。ゆえに、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。また、当該用語は、ポリリシン化合物及びリポソーム等の、細胞中への核酸の移入を促進する非プラスミド化合物及び非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターその他が挙げられるが、これらに限定されない。

【0093】

本発明中で用いられる表現「細胞」及び「細胞株」は、互換的に用いられており、そのような全ての表示は、後代を含む。用語「宿主細胞」は、ベクターを導入することができる細胞を指し、以下に限定されないが、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、真菌細胞、例えば酵母細胞、又は動物細胞、例えば、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、若しくはヒト細胞が挙げられる。

【0094】

用語「形質移入」は、真核細胞中への外来核酸の導入を指す。形質移入は、当該技術において知られている種々の手段によって達成され得、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介形質移入、ポリブレン媒介形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、及びバイオリスティックが挙げられる。

【0095】

用語「免疫細胞」は、免疫応答を誘発することができる細胞を指す。「免疫細胞」及びその他の文法上の変形は、あらゆる起源の免疫細胞を指し得る。「免疫細胞」の例として、骨髄内で生成される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球及びリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、並びに骨髄由来の細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が挙げられる。また、用語「免疫細胞」は、ヒト免疫細胞又は非ヒト免疫細胞を指し得る。

【0096】

本明細書中で用いられる用語「Ｔ細胞」は、胸腺において成熟するクラスのリンパ球を指す。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において重要な役割を果たし、他のリンパ球（例えばＢ細胞）とはＴ細胞受容体が細胞表面上に存在する点で異なる。「Ｔ細胞」は、ＣＤ３を発現する全てのタイプの免疫細胞を含み、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及びγ－δＴ細胞が挙げられる。「細胞傷害性細胞」として、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び好中球が挙げられ、これらは細胞傷害性応答を媒介することができる。本明細書中で用いられる用語「ＮＫ細胞」は、骨髄から始まって、自然免疫系において重要な役割を果たすクラスのリンパ球を指す。ＮＫ細胞は、細胞表面上での抗体及び主要組織適合性複合体の不在下ですら、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、又は他のストレスを受けた細胞に対する迅速な免疫応答を実現する。

【0097】

例えば、免疫細胞は、血液に由来してもよく、例えば、自家Ｔ細胞、同種異系Ｔ細胞、自家ＮＫ細胞、及び同種異系ＮＫ細胞があり、又はＥＢＶウイルスによる感染によって調製されるＮＫ細胞株、胚性幹細胞及びｉＰＳＣの誘導された分化によって得られるＮＫ細胞、並びにＮＫ９２細胞株等の細胞株に由来してもよい。

【0098】

用語「場合による」、「場合によっては」、「いずれか」、又は「のいずれか１つ」は、後に記載される事象又は状況が、必ずしもではないが起こり得ること、そして当該記載が、事象若しくは状況が起こるか、又は起こらない例を含むことを意味する。例えば、「場合によっては、１つの抗体重鎖可変領域を含む」は、特定の配列の抗体重鎖可変領域が、必ずしもではないが存在し得ることを意味する。本明細書中で用いられる「ａ」及び「ａｎ」は、本発明中で、１つ以上の文法上の目的語に言及するのに用いられる。内容において具体的に述べられる場合を除き、用語「又は」は、本発明において、用語「及び／又は」を意味するのに用いられ得、そしてこれと交換可能である。「約」及び「およそ」は通常、測定値の性質又は精度を考慮して、測定される量における許容可能な誤差の程度を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、典型的にはその１０％以内、より典型的には５％以内である。本発明に開示される方法及び組成物は、指定される配列、バリアント配列、又はこれと実質的に同一であるか、若しくは類似する配列、例えば、指定される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはこれを超えて同一の配列を有するポリペプチド及び核酸を包含する。アミノ酸配列の文脈において、用語「実質的に同一である」は、本発明において、第１のアミノ酸配列に言及するのに用いられる。

【0099】

本明細書中で用いられる用語ＥＣ_５０は、最大効果の５０％の濃度、すなわち、最大効果の５０％を引き起こすことができる濃度を指す。

【0100】

本明細書中で用いられる用語「抗体－薬物コンジュゲート」及び「ＡＤＣ」は、互換的に用いられる。

【0101】

オーリスタチンは、化学構造式がその物性及びドラッガビリティを最適化するように修飾するのが比較的容易である完全合成薬物である。抗体とのコンジュゲーションに用いられるオーリスタチン誘導体として、主に、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）が挙げられ、前者は、２－アミノ－１－フェニルプロピル－１－オールを、天然のチューブリンポリメラーゼ阻害剤ドラスタチン－１０に由来する合成ペンタペプチドのＣ末端に加えることによって合成される。種々のヒト腫瘍細胞株に対するＭＭＡＥの阻害活性は、１ナノモル未満である。ＭＭＡＥの細胞傷害活性を引き下げるために、ＭＭＡＦ内のドラスタチン－１０のＣ末端にフェニルアラニンが加えられる。ＭＭＡＦの細胞膜移動能力は、構造内の導入カルボキシルについて、不十分である。したがって、細胞の生物活性は、著しく引き下げられるが、細胞に対する阻害活性は、抗体とのコンジュゲーション後に大いに向上する（米国特許第７７５０１１６号明細書）。

【0102】

一部の実施形態において、抗体細胞傷害性の薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、１つ以上のマイタンシノイド分子とコンジュゲートした本発明の抗体を含む。マイタンシノイドは、チューブリンの重合を阻害することによってチューブリンを無効にする有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは元々、西アフリカ低木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａ）から単離された（米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。その後、特定の微生物も、メイタンシノイド、例えば、メイタンシノール及びＣ－３メイタンシノールビネガーを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。マイタンシノイド薬物モジュールは、抗体－薬物コンジュゲートにおける魅力的な薬物モジュールである。というのも：（ｉ）発酵製品の発酵又は化学修飾又は誘導体化によって調製するのが比較的容易であり；（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介した抗体へのコンジュゲーションに適した官能基により容易に誘導体化され；（ｉｉｉ）血漿中で安定しており；且つ（ｉｖ）種々の腫瘍細胞株について有効であるからである。マイタンシノイド薬物モジュールとして用いるのに適したマイタンシン化合物は、当該技術において周知であり、知られている方法に従って天然の源から単離され得るか、又は遺伝子工学技術を用いて生成され得る（Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （２００２）ＰＮＡＳ ９９：７９６８－７９７３参照）。また、メイタンシノール及びメイタンシノール類似体は、知られている方法に従って合成的に調製することができる。マイタンシノイド薬物モジュールの例示的な実施形態は：本明細書中で開示されるＤＭ１、ＤＭ３、及びＤＭ４を含む。

【0103】

本発明の方法、組成物、及び併用療法は、他の活性剤又は治療様式と組み合わされてよく、当該方法は、対象に、場合によっては、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、Ｔｉｍ－３抗体（免疫治療）、又は他の腫瘍治療抗体、Ｈｅｒ－２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ抗体その他、並びにＡＤＣ（例えばＴ－ＤＭ１）、二重特異性抗体、化学療法剤その他の１つ以上の阻害剤と組み合わせて、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子を、疾患（例えば癌）を処置又は予防するのに有効な量で投与することを含み、そしてさらに、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子、追加の活性剤、又は全てを、単独で（例えば単独療法として）用いた場合の活性剤毎の量又は用量よりも高いか、低いか、又はこれと等しい量又は用量で投与することを含む。投与される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、追加の活性剤、又は全てについての量又は用量は、例えば、単独で（例えば単独療法として）用いた場合の活性剤毎の量又は用量よりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％低い。

【0104】

さらに、本発明の実施例に記載されるように、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、及びＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物コンジュゲートは、ＣＬＤＮ１８．２に結合して、標的細胞（腫瘍細胞）のアポトーシスを誘導し、腫瘍細胞の増殖を阻害し、且つ腫瘍細胞に及ぼすエフェクタ細胞のインビボＡＤＣＣ及びＣＤＣ致死効果を増大させることによって、癌患者を処置する目的を達成することができる。ゆえに、特定の実施形態において、本発明に記載される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、及びＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物コンジュゲートは、本発明の抗体の抗腫瘍効果、並びに腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、対象に、治療的に有効な量の、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、及びＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物コンジュゲートを、これらの機構を介して投与することを含む方法を示す。当該方法は、癌のインビボ処置に適している。標的特異的治療効果を達成するために、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子は、他の抗体と共に投与されてもよい。ＣＬＤＮ１８．２抗体、及び１つ以上の活性剤と組み合わせたＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物コンジュゲートを投与する際に、組合せは、あらゆる順序で、又は同時に、一種の癌を有する患者、特にＣＬＤＮ１８．２の発現が高い腫瘍患者に投与され得る。特定の態様において、対象における高増殖性の徴候又は疾患（例えば癌）の処置（例えば、引下げ又は寛解）が実現される。当該方法は、対象に、本発明の１つ以上の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物コンジュゲートを、単独で、又は他の活性剤若しくは治療様式と組み合わせて投与することを含む。

【0105】

抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子は、単独で、又は別の免疫調節剤（例えば、抗ＬＡＧ－３、抗Ｔｉｍ－３、抗ＰＤ－Ｌ、又は抗ＰＤ－Ｌ１、及び抗ＣＴＬＡ－４抗体分子）と組み合わせて使用されて、胃癌、膵癌、肺癌、食道癌、卵巣癌その他を処置する。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子は、以下の１つ以上と組み合わせて投与され得る：免疫ベースの戦略、標的薬剤（例えば、ＶＥＧＦ阻害剤、例えばＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体）；ＶＥＧＦチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、及びアパチニブ；ＶＥＧＦシグナル伝達の下流側メディエータのＲＮＡｉ阻害剤又は阻害剤、例えばラパマイシン哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）の阻害剤。

【0106】

本明細書中で用いられる用語「癌」、「癌患者」は、組織病理学的タイプにも侵入期にも関係なく、全てのタイプの癌性増殖若しくは発癌プロセス、転移性組織、又は悪性形質転換した細胞、組織、若しくは器官を含むことが意図される。例として、固形腫瘍、血液癌、軟部組織腫瘍、及び転移性病変が挙げられるが、これらに限定されない。

【0107】

本発明において開示されるＣＬＤＮ１８．２標的化抗体を用いて適切に処置され得る癌の非限定的な例として、胃癌、食道癌、肺癌、黒色腫、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌、肝癌、膵癌、膀胱癌、神経膠腫、及び／若しくは白血病等、又はそれらの転移性病変が挙げられる。

【0108】

上記の好ましい条件は、当該技術における一般知識に基づいて、本発明の好ましい実施形態を得るように任意に組み合わされてよい。

【0109】

本発明で用いられる試薬及び出発物質は、商業的に入手可能である。

【0110】

本発明の有益な効果は、以下の通りである：
１． 本発明は、親和性、特異性、及びエンドサイトーシス活性が優れる抗ＣＬＤＮ１８．２ ＨＣＡｂ抗体を記載する。抗体は、分子量が従来のＩｇＧ抗体の約半分しかない「重鎖」を含有する真新しい完全ヒト抗体である。軽鎖の不在に起因して、抗体は、二重特異性抗体の開発に用いることができ、そして軽鎖ミスマッチ、及び二重特異性抗体の開発におけるヘテロ二量体化の共通の問題は回避される。また、ＡＤＣに発展する潜在性を有する。特定の好ましい実施形態において、ＨＣＡｂ抗体は、ＩＭＡＢ３６２類似体と比較して、ＣＬＤＮ１８．２を内生的に発現する腫瘍細胞に対する親和性が大きくて、大きなエンドサイトーシス活性を誘導することができる。
２． また、本発明は、インビトロＴＤＣＣ活性及びインビボ薬物効果が優れるＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体を記載する。本発明の二重特異性抗体は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する活性を有し、且つＡｍｇｅｎの特許の二重特異性抗体類似体よりも良好な殺腫瘍細胞効果を有する。特定の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、Ｆｃ断片を有するので、ＦｃＲｎへのＦｃの結合効果を保持する；一方、ＦｃｇＲへの結合を、故にＦｃｇＲの架橋結合によって引き起こされる非特異的Ｔ細胞の活性化を引き下げるようなミュータントＦｃが好まれる。ＣＲＳ、例えばＩＬ６及びＴＮＦαにおいて一般的なサイトカインの放出を引き下げることができるように、ＣＤ３末端活性が最適化される。ＣＬＤＮ１８．２末端は、軽鎖及び重鎖のミスマッチの共通の問題を回避し、優れた親水性を保持し、且つＣＬＤＮ１８．２の発現が高い腫瘍細胞についての選択性を向上させる、直列的に連結されたＶＨＨの形態である。抗体は、インビボ安定性が良好であり、且つインビボ半減期が長く、大きなインビボ抗腫瘍活性を示す。

【図面の簡単な説明】

【0111】

【図1a-c】図１ａ～ｆは、（ａ～ｂ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｃ）ＳＮＵ６０１、（ｄ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２、及び（ｅ～ｆ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対するＨＣＡＢ抗体の結合親和性を示す。

【図1d-f】図１ａ～ｆは、（ａ～ｂ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｃ）ＳＮＵ６０１、（ｄ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２、及び（ｅ～ｆ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対するＨＣＡＢ抗体の結合親和性を示す。

【図2】図２ａ～ｂは、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対する、（ａ）ＰＲ０００４００及び（ｂ）ＰＲ００４５４９に対するＨＣＡＢ抗体の競合結合活性を示す。

【図3】図３ａ～ｂは、試験抗体及びＭＭＡＦ結合抗ヒトＩｇＧ抗体と共培養した場合の標的細胞の生存度を示す。

【図4a-b】図４ａ～ｈは、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の構造を示す。

【図4c-d】図４ａ～ｈは、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の構造を示す。

【図4e-f】図４ａ～ｈは、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の構造を示す。

【図4g-h】図４ａ～ｈは、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の構造を示す。

【図5a-c】図５ａ～ｓは、（ａ～ｃ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２、（ｄ～ｉ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｊ～ｏ）Ｊｕｒｋａｔ、及び（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性を示す。

【図5d-f】図５ａ～ｓは、（ａ～ｃ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２、（ｄ～ｉ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｊ～ｏ）Ｊｕｒｋａｔ、及び（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性を示す。

【図5g-i】図５ａ～ｓは、（ａ～ｃ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２、（ｄ～ｉ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｊ～ｏ）Ｊｕｒｋａｔ、及び（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性を示す。

【図5j-l】図５ａ～ｓは、（ａ～ｃ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２、（ｄ～ｉ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｊ～ｏ）Ｊｕｒｋａｔ、及び（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性を示す。

【図5m-o】図５ａ～ｓは、（ａ～ｃ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２、（ｄ～ｉ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｊ～ｏ）Ｊｕｒｋａｔ、及び（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性を示す。

【図5p-r】図５ａ～ｓは、（ａ～ｃ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２、（ｄ～ｉ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｊ～ｏ）Ｊｕｒｋａｔ、及び（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性を示す。

【図5s】図５ａ～ｓは、（ａ～ｃ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２、（ｄ～ｉ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｊ～ｏ）Ｊｕｒｋａｔ、及び（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性を示す。

【図6a-b】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6c-d】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6e-f】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6g-h】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6i-j】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6k-l】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6m-n】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6o-p】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6q-r】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6s-t】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6u-v】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図6w】図６ａ～ｗは、（ａ）ＩＭ９５細胞によるＣＬＤＮ１８．２の発現収量、並びに（ｂ～ｋ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、（ｌ～ｏ）ＩＭ９５、（ｐ～ｓ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、及び（ｔ～ｗ）ＳＮＵ６２０細胞に対する二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図7】図７は、ヒトＣＬＤＮ１８．２パラロガスファミリータンパク質ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６、及びＣＬＤＮ９を過剰発現する細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性を示す。

【図8】図８ａ～ｃは、（ａ）ＨＥＫ２９３／ｃｙｎｏＣＬＤＮ１８．１、（ｂ）ＨＥＫ２９３／ｃｙｎｏＣＬＤＮ１８．２、及び（ｃ）カニクイザルＣＤ３＋Ｔ細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性を示す。

【図9】図９は、ｃｙｎｏ Ｔ細胞によるＨＥＫ２９３／ｃｙｎｏＣＬＤＮ１８．２細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性を示す。

【図10】図１０ａ～ｂは、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体によってインビトロで誘導されるサイトカインの放出を示す。（ａ）ＴＮＦα及び（ｂ）ＩＬ－６。

【図11】図１１ａ～ｂは、（ａ）Ｊｕｒｋａｔ及び（ｂ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を示す。

【図12】図１２ａ～ｂは、（ａ）ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２及び（ｂ）Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤＣ活性を示す。

【図13】図１３ａ～ｂは、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対する、（ａ）ＰＲ０００４００及び（ｂ）ＰＲ００４５４９に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の競合結合活性を示す。

【図14】図１４は、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の薬物動態を示す。

【図15a-b】図１５ａ～ｅは、（ａ～ｂ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８ ＰＢＭＣ、（ｃ）ＳＮＵ６２０ ＰＢＭＣ、及び（ｄ）ＨｕＰ－Ｔ４ ＰＢＭＣ腫瘍モデルにおけるインビボ薬力学研究、並びに（ｅ）ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体に関するインビボサイトカインストーム研究を示す。

【図15c-d】図１５ａ～ｅは、（ａ～ｂ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８ ＰＢＭＣ、（ｃ）ＳＮＵ６２０ ＰＢＭＣ、及び（ｄ）ＨｕＰ－Ｔ４ ＰＢＭＣ腫瘍モデルにおけるインビボ薬力学研究、並びに（ｅ）ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体に関するインビボサイトカインストーム研究を示す。

【図15e】図１５ａ～ｅは、（ａ～ｂ）ＮＵＧＣ４＿Ｄ８ ＰＢＭＣ、（ｃ）ＳＮＵ６２０ ＰＢＭＣ、及び（ｄ）ＨｕＰ－Ｔ４ ＰＢＭＣ腫瘍モデルにおけるインビボ薬力学研究、並びに（ｅ）ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体に関するインビボサイトカインストーム研究を示す。

【発明を実施するための形態】

【0112】

本発明を、以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明を制限することは意図していない。以下の実施例において条件が指定されていない実験手順は、従来の手順及び条件に従って、又は指示事項に従って実行される。

【実施例】

【0113】

実施例１：発現ベクター及び安定形質移入細胞株の調製、並びにマウスの免疫化
１．１． マウスを免疫化するための発現ベクターの調製
完全ヒト化トランスジェニックマウスを免疫化するためのヒトＣＬＤＮ１８．２発現ベクターを、以下のように調製した：ヒトＣＬＤＮ１８．２（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ５６８５６－ｉｓｏ２）をコードするｃＤＮＡ配列を合成して、ヒトＣＬＤＮ１８．２遺伝子のコード配列を酵素的消化によってｐＣＡＧＧＳプラスミド（ＹＯＵＢＩＯ，ＶＴ１０７６）中にクローニングした。

【0114】

１．２． 安定形質移入細胞株の調製
ヒトＣＬＤＮ１８．１又はＣＬＤＮ１８．２を安定して発現するＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃：ＣＲＬ－１５７３）細胞株を、具体的には以下のように構築した：ヒトＣＬＤＮ１８．１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＯＨｕ２９１７４Ｄ）又はＣＬＤＮ１８．２（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＯＨｕ０３３７４Ｄ）をコードするプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞中に形質移入して、ヒトＣＬＤＮ１８．１又はＣＬＤＮ１８．２を過剰発現させる安定した細胞株を生成した。ＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２の発現を、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって検出した。具体的には、２０，０００個の形質移入細胞を、９６ウェルプレートの各ウェル内にプレーティングしてから、市販のウサギ抗ヒトＣＬＤＮ１８抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏ、ＬＳ－Ｃ１６８８１２－４００）を加えた。４℃にて１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄してから、ＡＦ－６８０コンジュゲート二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１１０９）を加えた。４℃にて１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄してから、細胞の蛍光強度をＦＡＣＳ機器（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔｉＱｕｅ Ｐｌｕｓ ＢＲ）を用いてモニターした。

【0115】

１．３． マウスの免疫化
完全ヒト化トランスジェニックマウス（市販のＨａｒｂｏｕｒ ＨＣＡＢ １．０マウス、Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄから購入）を、先で調製したヒトＣＬＤＮ１８．２発現ベクター及びＣＬＤＮ１８．２発現ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞）により免疫化した。遺伝子銃用の銃弾を、ヒトＣＬＤＮ１８．２発現ベクター及び金粉末により調製した。マウスを、腹部の多部位にて遺伝子銃を用いて免疫化した。マウスを、発現ベクターＤＮＡ（各時５０μｇ）により２週間隔で免疫化した。３回の免疫化後に、マウスをＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞により２週間隔で免疫化した（免疫化毎にマウスあたり４×１０^６細胞）。２回の免疫化後に、血液を力価測定のために収集した。マウス血清を、結合親和性について、ヒトＣＬＤＮ１８．２発現ＣＨＯＫ１細胞（ｋｙｉｎｎｏ、ｋｃ－１１８０）を用いるＦＡＣＳによってアッセイした。マウスを、ＨＣＡＢモノクローナル抗体をスクリーニングするために、力価測定の結果に従って選択した。マウスを、免疫原としてのＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞（マウスあたり４×１０^６細胞）により、スクリーニングの３日前にブースト免疫にかけた。

【0116】

実施例２：抗ＣＬＤＮ１８．２ ＨＣＡＢシングルドメイン抗体の生成及びスクリーニング
実施例１において得た、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体血清力価が高いマウスを選択した。これらのマウスの脾臓を収集して、Ｂ細胞を単離した。ＣＤ１３８（ＢＤ、５５８６２６）陽性形質細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩセルソーターを用いてソートして、ＣＬＤＮ１８．２（ＣＨＯＫ１／ｈＣＬＤＮ１８．２、ｋｙｉｎｎｏ、ＫＣ－１１８０）陽性Ｂ細胞集団を、磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１１２０６Ｄ）を用いて富化した。Ｂ細胞のＲＮＡを抽出して、ｃＤＮＡに逆転写して（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ合成システム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０９１２００）、ヒトＶＨ遺伝子を、特定のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲプライマー：
５’－ＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＳＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧ－３’（配列番号２４９）
５’－ＡＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ－３’（配列番号２５０）

【0117】

増幅されたＶＨ遺伝子断片を、ヒトＩｇＧ１抗体の重鎖Ｆｃドメインの配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドｐＣＡＧベクター中に構築した。

【0118】

構築したプラスミドを、ＨＥＫ２９３哺乳動物宿主細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５７３）中に形質移入して、ＨＣＡｂ抗体の発現上清を得た。一次スクリーニングを、ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＨＯＫ１／ｈＣＬＤＮ１８．２を用いるＭｉｒｒｏｒｂａｌｌによって実行した。陽性クローンを、二次スクリーニング用に選択した。二次スクリーニングを、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を用いるＦＡＣＳによって実行した。

【0119】

ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する２９５個のモノクローナル抗体を得た一方、抗体分子の可変ドメイン及び対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、従来の配列決定手段を用いて得た。反復配列の除去後に、固有の配列を有し、且つヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する２１１個の完全ヒトＣＬＤＮ１８．２ ＨＣＡｂモノクローナル抗体を得た。総合ランキングトップの５４個の抗体を、一次スクリーニング結果及び二次スクリーニング結果に従って、組換え発現用に選択した。精製モノクローナル抗体をさらに、ヒトＣＬＤＮ１８．２を内生的に発現する腫瘍細胞への結合能力の有無に関してフローサイトメトリによってスクリーニングして、表３に示すように、総合ランキングのトップ８の抗体配列を候補分子として選択した。

【0120】

抗体のＣＤＲを、種々の方法、例えば、配列変異性に基づくＫａｂａｔスキーム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（Ｕ．Ｓ．），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９９１）参照）、及び構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａスキーム（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－４８，１９９７参照）を用いて、当該技術において定義することができることは、当業者に周知である。本出願において、Ｋａｂａｔスキーム及びＣｈｏｔｈｉａスキームを含む組み合わせたスキームを用いて、アミノ酸残基を可変ドメイン順に決定することもできる。組み合わせたスキームは、ＫａｂａｔスキームをＣｈｏｔｈｉａスキームと組み合わせて、より大きな範囲を得る。これを本発明の概要の表１に詳述する。この実施例から配列決定後に得た生殖細胞系遺伝子分析及びＰＴＭ部位分析を、以下の表２に示す。抗原結合タンパク質の配列番号を、以下の表３に示す。

【0121】

【表2】

【0122】

【表3】

【0123】

実施例３：抗ＣＬＤＮ１８．２ ＨＣＡＢ抗体の翻訳後修飾部位の除去
ＰＲ００４５３３及びＰＲ００４５３６は双方とも、重鎖のＣＤＲ２領域内に異性化部位及び脱アミド化部位を有する。ＣＤＲ２領域内の翻訳後修飾部位について、ＮＳ及びＤＧの４つのアミノ酸が、ＰＣＲによってランダムに変異した。ＰＣＲ生成物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に電気的に形質移入して、４つのアミノ酸部位のランダム変異ライブラリを確立した。ミュータントライブラリを、ＣＨＯＫ１／ｈＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯＫ１／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を用いるＭｉｒｒｏｒｂａｌｌによってスクリーニングして、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する陽性分子を配列決定用に選択した。分子の配列番号を、以下の表４に示す。

【0124】

【表4】

【0125】

実施例４：全長抗ＣＬＤＮ１８．２ ＨＣＡｂシングルドメイン抗体の調製及び特性評価
４．１． 組換えＨＣＡｂシングルドメイン抗体の調製
ＨＣＡｂシングルドメイン抗体分子をコードする重鎖可変ドメインの配列を得た後に、重鎖可変ドメインの配列を、ヒト抗体の重鎖定常ドメインの対応する配列と融合させて、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて発現させて、組換えＨＣＡｂシングルドメイン抗体分子を得ることができる。この実施例において、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の配列を遺伝的に合成して、ＨＣＡｂシングルドメイン抗体を生成する全長配列をコードするように、ヒトＩｇＧ１抗体の重鎖定常ドメインの配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクター中にクローニングした。この実施例において、免疫化されたＨａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂマウスから得られるモノクローナル抗体分子の可変ドメインの配列は、ヒト抗体配列であったので、完全ヒト抗ＣＬＤＮ１８．２組換えＨＣＡｂ抗体もまた、この実施例から得られた。

【0126】

組換えＨＣＡｂシングルドメイン抗体をコードするプラスミドを、哺乳動物宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）中に形質移入して、対応する精製組換え抗体を、従来の組換えタンパク質発現精製技術を用いて得ることができる。具体的には、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１２７）を、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１０００１）中で増殖させた。一過性形質移入の前に、細胞を、３×１０^６～４×１０^６細胞／ｍＬの濃度に調整して、８％ＣＯ_２シェーカー内で３７℃にて２４時間培養して、７×１０^６～１０×１０^６細胞／ｍＬの細胞濃度に至った。続いて、細胞を６×１０^６細胞／ｍＬに希釈して、１０ｍＬの培養細胞を調製した。ＨＣＡｂシングルドメイン抗体をコードする８μｇの上述のプラスミド（プラスミドの、細胞に対する比率は、０．８μｇ：１ｍＬである）を、０．４ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１２３０９０１９）中に溶解させた。結果として生じた混合液を、０．２２μｍ滅菌フィルタを通して濾過した。続いて、３２μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１２９）を、０．３７ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１２３０９０１９）に加えた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬溶液を直ぐに、プラスミド溶液にゆっくり加えた。混合液を逆さにして、十分に混合した。プラスミド及び形質移入試薬の混合溶液をゆっくり滴加しながら、フラスコを振盪した。細胞を、８％ＣＯ_２シェーカー内で３７℃にて８～９日間培養した。細胞生存度を８日後に観察した。

【0127】

培養物を収集して、３，３００ｇにて１０分間遠心分離してから、上清を収集して、高速で遠心分離して不純物を除去した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７１－５０２０－９１ ＡＥ）を含有するグラビティカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃７３１１５５０）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化して、２～５カラム容量のＰＢＳでリンスした。上清試料をカラム上にロードした。カラムを、５～１０カラム容量のＰＢＳでリンスした。標的タンパク質を、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．５）で溶出した。溶出液を、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中立に調整して、濃縮して、限外濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０１０２４）によりＰＢＳバッファ中にバッファ交換して、精製された抗体溶液を得た。続いて、精製された抗体溶液を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ）を用いて濃度決定に供して、後の使用のためにサブパッケージングして保存した。

【0128】

４．２． ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、ＨＩＣ－ＨＰＬＣ、及びＤＳＦによる抗体特性評価
適切な量の上述の精製試料を、純度の測定のために、分析ＳＥＣカラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（ＨＰＬＣシステムモデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）上にロードした。この方法では、以下のパラメータ及び条件を用いた：移動相：１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｓａｎｇｏｎ、Ｅ６０７０１６）；室温；流量：１．０ｍＬ／分；試料濃度：１ｍｇ／ｍＬ；注入容量：２０μＬ；検出波長：２８０ｎｍ。記録した後に、クロマトグラムを、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて積分して、関連データを算出した。分析を生成し、試料中の異なる構成要素について保持時間を報告した。

【0129】

適切な量の上述の精製試料を、純度及び疎水性の測定のために、分析ＨＩＣカラムＴＳＫｇｅ１ Ｂｕｔｙ１－ＮＰＲ ４．６＊３５（ＨＰＬＣシステムモデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）上にロードした。方法は、１６分以内の１００％移動相Ａ（２０ｍＭ ＰＢ、１．８Ｍ（ＮＨ４）_２ＳＯ_４、ｐＨ６．０）から１００％移動相Ｂ（２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ６．０）の線形勾配からなった。流量を０．７ｍＬ／分にセットした。試料濃度は１ｍｇ／ｍＬであった。注入容量は２０μＬであった。検出波長は２８０ｎｍであった。記録した後に、クロマトグラムを、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて積分して、関連データを算出した。分析を生成し、試料中の異なる構成要素について保持時間を報告した。

【0130】

この実施例では、タンパク質分子の熱変性温度（Ｔｍ）を、差分スキャニング蛍光測定（ＤＳＦ）によって測定した。１０μｇのタンパク質を９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ、ＡＢ－０７００／Ｗ）に加えた後に、２μＬの１００×希釈色素ＳＹＰＲＯＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００８１３８）を加えてから、バッファを加えて、ウェルあたり４０μＬの最終容量を得た。ＰＣＲプレートをシールして、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）内に置いて、２５℃にて５分間インキュベートしてから、０．２℃／０．２分の勾配にて２５℃から９５℃に徐々に温めて、試験の終了時に２５℃に冷却した。ＦＲＥＴスキャニングモードを用いて、データ分析を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアを用いて実行して、試料のＴｍを算出した。上述の特性評価の結果を、以下の表５に示す。

【0131】

【表5】

【0132】

実施例５：細胞に対する抗ＣＬＤＮ１８．２ ＨＣＡＢ抗体の結合親和性
抗体の結合親和性を、ヒトＣＬＤＮ１８．１発現ＨＥＫ２９３細胞、ヒトＣＬＤＮ１８．２発現ＨＥＫ２９３細胞、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞、及びヒトＣＬＤＮ１８．２を内生的に発現するＳＮＵ６０１細胞を用いるＦＡＣＳによって検出した（Ｃｏｂｉｏｅｒ、ＣＢＰ６０５０７）。サブクローニングしたＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞を、ＮＵＧＣ４細胞（ＪＣＲＢ、ＪＣＲＢ０８３４）を用いる限界希釈によってスクリーニングした。結合親和性を、以下のように決定した：細胞を、３００ｇにて５分間遠心分離してから、ＦＡＣＳバッファ（２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中に再懸濁させた。細胞密度を１０^６細胞／ｍＬに調整して、５０μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。抗体をＦＡＣＳバッファで様々な濃度に希釈して、５０μＬの抗体希釈液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。４℃にて２時間のインキュベーション後に、プレートをＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。続いて、ＡＰＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－６０５－０９８）を含有するＦＡＣＳバッファを加えた。４℃にて１時間のインキュベーション後に、プレートをＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。細胞を固定液中に再懸濁させてから、細胞の蛍光を、ＦＡＣＳ機器（ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を用いてモニターした。ＰＲ０００４００、ＩＭＡＢ３６２類似体（社内で生成、国際公開第２０１４／１４６６７２号パンフレット参照、ＩＭＡＢ３６２と同じ可変領域を有し、ＩＭＡＢ３６２と、定常領域内の少数のアミノ酸だけ異なる）を、ＣＬＤＮ１８．２結合についての陽性対照として用いた。ＰＲ００４５４９、ＣＬ－１ｘＩ２Ｃ ｓｃＦｃ類似体（社内で生成、国際公開第２０２００２５７９２Ａ１号パンフレット参照、ＣＬ－１ｘＩ２Ｃ ｓｃＦｃと同じ可変領域を有し、ＣＬ－１ｘＩ２Ｃ ｓｃＦｃと、定常領域内の少数のアミノ酸だけ異なる）を、ＣＬＤＮ１８．２結合についての陽性対照として用いた。ＰＲ００２７２５抗体を、ＣＬＤＮ１８．１結合についての陽性対照として用いた。ＣＮ２０２０／１１８６５０号明細書（表６、表７、及び表８）参照。Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃ０００１－４）抗体を陰性対照として用いた。

【0133】

図１（ａ～ｂ）、表９、及び表１０は、ＣＬＤＮ１８．２を内生的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対する抗体の結合親和性を示す。試験抗体は、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に用量依存的に結合することができた。結果は、以下のことを示す：ＰＲ００４５３３、ＰＲ００４９４９、ＰＲ００４９５０、ＰＲ００４９５２、ＰＲ００４９５３、ＰＲ００７２４２、ＰＲ００７２４３、ＰＲ００７２４４、ＰＲ００７２４５、ＰＲ００７２４６、及びＰＲ００７２４８抗体は、ＰＲ０００４００よりも高い、ＣＬＤＮ１８．２を内生的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対する親和性を示す。図１ｃ及び表１１は、ＣＬＤＮ１８．２を内生的に発現するＳＮＵ６０１細胞に対する抗体の結合親和性を示す。試験抗体は、ＳＮＵ６０１細胞に用量依存的に結合することができた。結果は、以下のことを示す：ＰＲ００４２２７、ＰＲ００４５３３、ＰＲ００４５３６、ＰＲ００４５４０、ＰＲ００４９４９、ＰＲ００４９５０、及びＰＲ００４９５２抗体は、ＰＲ０００４００よりも高い、ＣＬＤＮ１８．２を内生的に発現するＳＮＵ６０１細胞に対する親和性を示す。図１ｄ及び表１２は、ヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２）に対する抗体の結合親和性を示す。図１（ｅ～ｆ）は、ヒトＣＬＤＮ１８．１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１）に対する抗体の結合親和性を示す。試験抗体は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対する結合親和性が低い。上述の結果から、試験抗体は、ＥＣＬ２ではなくＥＣＬ１（細胞外ループ１）にてヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合すると推測することができる。

【0134】

【表6】

【0135】

【表7】

【0136】

【表8】

【0137】

【表9】

【0138】

【表10】

【0139】

【表11】

【0140】

【表12】

【0141】

実施例６：抗ＣＬＤＮ１８．２ ＨＣＡｂ抗体の競合結合活性
この実施例は、抗ヒトＣＬＤＮ１８．２ ＨＣＡｂモノクローナル抗体の、ヒトＣＬＤＮ１８．２抗原のエピトープ領域への結合を研究するものである。競合結合実験を、ヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を用いて、細胞レベルにて実行した。簡潔に、抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体ＰＲ０００４００及びＰＲ００４５４９を、ビオチン化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ３５３５８）を用いて、指示事項に従ってビオチン化した。ビオチン化された５０μＬの抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体ＰＲ０００４００又はＰＲ００４５４９を各々、９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３８９４）内で、対応する段階希釈した５０μＬの非ビオチン化抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体と十分に混合した。続いて、ヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の懸濁液を、３×１０^６細胞／ｍＬに調整して、５０μＬ／ウェルで播種した。細胞を、４℃にて２時間共インキュベートした。各ウェル内の細胞を、予め冷却した２００μＬのＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で２回洗浄して、５００ｇで４℃にて５分間遠心分離してから、上清を破棄した。２回洗浄した後に、蛍光二次抗体（ＢＤ、５５４０６０、１μｇ／ｍＬの最終濃度）を加えて、暗所で４℃にて１時間インキュベートした。各ウェル内の細胞を、予め冷却した２００μＬのＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で２回洗浄して、５００ｇで４℃にて５分間遠心分離してから、上清を破棄した。最後に、各ウェル内の細胞を、予め冷却した２００μＬのＦＡＣＳバッファ中に再懸濁させて、蛍光シグナル値を、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを用いて読み出した。阻害率は、式、阻害率（％）＝（Ａ－Ｂ）／Ａ×１００を用いて算出した（注：Ａ：ビオチン化された抗体の、ＩＳＯ ｈＩｇＧ１（Ｃｒｏｗｎｂｉｏ、Ｃ０００１－４）との相互作用後の蛍光シグナル；Ｂ：ビオチン化された抗体の、非ビオチン化抗体との相互作用後の蛍光シグナル）。

【0142】

図２（ａ～ｂ）及び表１３に示すように、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２ ＨＣＡｂ抗体は全て、ＰＲ０００４００又はＰＲ００４５４９の、ヒトＣＬＤＮ１８．２への結合をブロックすることができ、そして抗体の検出されるブロッキング能力は、抗体濃度と正に相関して増大する；阻害率は、＞８０％に達し得る。このことは、試験ＨＣＡｂが、ＰＲ０００４００及びＰＲ００４５４９のエピトープと非常に類似するエピトープを有することを示している。試験抗体は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対する結合親和性が低い。上述の結果から、試験抗体は、ＥＣＬ２ではなくＥＣＬ１（細胞外ループ１）にてヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合すると推測することができる。

【0143】

【表13】

【0144】

実施例７：抗ＣＬＤＮ１８．２ ＨＣＡＢ抗体のエンドサイトーシス活性
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存度アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７３）を用いてＭＭＡＦコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｍｏｒａｄｅｃ、Ｃａｔ＃：ＡＨ－１０２－ＡＦ）と共培養した場合にＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対して細胞傷害性の致死を誘導する能力について、抗体をアッセイした。ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞を、３００ｇで５分間遠心分離してから、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）中に再懸濁させて、細胞の密度を２×１０^４細胞／ｍＬに調整した。５０μＬの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。細胞を３７℃にて一晩インキュベートした。抗体を、培地で様々な濃度に希釈して、２５μＬの抗体希釈液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。ＭＭＡＦコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を培地で希釈して、２５μＬの抗体希釈液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えて、６．６ｎＭの最終濃度にした。細胞を、３７℃にて３日間、抗体とインキュベートした。９６ウェルプレートを、室温にて３０分間静置したままにして、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発色溶液を室温にて各ウェルに加えた。続いて、試料を、暗所で室温にて１０分間インキュベートした。プレートを、ＰＥ Ｅｎｓｐｉｒｅにより読み出した。細胞生存度（％）＝［（発光試料）／（発光モック対照）］×１００。ＰＲ０００４００（ＩＭＡＢ３６２類似体）を陽性対照として、そしてＩｓｏ ｈＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃ０００１－４）抗体を陰性対照として用いた。図３（ａ～ｂ）は、標的細胞の生存度を示す。ＭＭＡＦコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共培養した場合、試験抗体は、ＰＲ０００４００と比較して、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対してより良好な細胞傷害効果を用量依存的に示す。

【0145】

実施例８：ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の構造及び設計
選択した抗ＣＬＤＮ８．２及び抗ＣＤ３抗体を用いて、二重特異性抗体を調製した。調製されたＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体は、２つの標的に同時に結合することができ、一方の末端は、腫瘍細胞表面上で特異的に発現されるＣＬＤＮ１８．２を認識することができ、他方の末端は、Ｔ細胞上のＣＤ３分子に結合することができる。腫瘍細胞の表面に結合した後に、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体分子は、腫瘍細胞の周りでＴ細胞を動員して活性化することによって、腫瘍細胞を死滅させることができる。

【0146】

図４に示すように、構造（１）は、「２＋１」Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｄｕａｌ ＶＨ非対称構造を有する分子である；「２＋１」非対称構造を有する分子について、構造は、対応する抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖、並びに抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＤｕａｌ ＶＨポリペプチド鎖をそれぞれ含む３つのタンパク質鎖を包含する；構造（２）及び（３）は、「２＋１」ＨＣＡｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ非対称構造を有する分子であった。これは、対応する抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖、並びに抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＨＣＡｂポリペプチド鎖をそれぞれ含む３つのタンパク質鎖を包含する。

【0147】

構造（４）は、「４＋１」ＶＨ－ＶＨ＿ＨＣ－Ｆａｂ非対称構造を有する分子であり、これは、対応する抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖、並びに抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の四価ＶＨポリペプチド鎖をそれぞれ含む３つのタンパク質鎖を包含する。

【0148】

構造（５）は、「４＋１」ＶＨ－ＶＨ＿ＬＣ－Ｆａｂ非対称の構造を有する分子であり、これは、対応する抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖、並びに抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の四価ＶＨポリペプチド鎖をそれぞれ含む３つのタンパク質鎖を包含する。

【0149】

構造（６）は、「３＋１」ＶＨ＿ＨＣ－Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｄｕａｌ ＶＨ非対称構造を有する分子であり、これは、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の一価ＶＨに連結された対応するＮ末端を有する抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖、並びに抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の二価ＶＨポリペプチド鎖をそれぞれ含む３つのタンパク質鎖を包含する。

【0150】

構造（７）は、「３＋１」Ｆａｂ－Ｆｃ－ＶＨ－ＶＨ－ＶＨ非対称構造を有する分子であり、これは、対応する抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖、並びに抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の三価ＶＨポリペプチド鎖を含む３つのタンパク質鎖をそれぞれ包含する。

【0151】

構造（８）は、「１＋１」Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ非対称構造を有する分子であり、これは、対応する抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖を含む２つのタンパク質鎖、並びに抗リゾチーム又は抗ＣＬＤＮ１８．１抗体のｓｃＦｖポリペプチド鎖をそれぞれ包含する。

【0152】

ミスマッチ重鎖との副産物の形成（例えば、抗ＣＤ３抗体の２つの重鎖のミスマッチ）を最小にするように、ミュータントヘテロ二量体Ｆｃ領域を用いた。これは、国際公開第２００９０８０２５１号パンフレット及び国際公開第２００９０８０２５２号パンフレットに記載されるような「ノブ－ホール」変異及び修飾ジスルフィド結合を有する。ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体は、ＩｇＧ１のＦｃを有しており、そしてＦｃのＣＨ３上に、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ（ＥＵインデックスに従って番号付けした）変異を有する。各二重特異性抗体を、以下をコードする３つ又は４つの異なる哺乳動物発現ベクターを同時に形質移入することによって生成した：１）ヘテロ二量体抗体を生成するようにＦｃ領域内に「ホール」変異を有する、対応する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の重鎖（ＦｃのＣＨ３は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ変異を有する）；２）ヘテロ二量体抗体を生成するようにＦｃ領域内に「ノブ」変異を有する、対応する抗ＣＤ３抗体の重鎖（ＦｃのＣＨ３は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ変異を有する）；及び３）対応する抗ＣＤ３抗体の軽鎖。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域内の「ノブ」変異は：Ｔ３６６Ｗからなり、「ホール」変異は：Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖからなる。加えて、「ノブ」Ｆｃ領域内のＳ３５４Ｃ、及び「ホール」Ｙ３４９Ｃを含めてもよい；これらは、ジスルフィド結合の対を形成して、ヘテロ二量体抗体の安定性及び収量を増大させる。

【0153】

本発明において構築したＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体に関する具体的な情報を、表１４、表１５、及び表１６に示す。

【0154】

【表14】

【0155】

【表15】

【0156】

【表16】

【0157】

実施例９：ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の調製及び特性評価
９．１ 組換えＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の調製
組換えＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体をコードする複数のプラスミドを、特定の割合に従って哺乳動物宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）中に形質移入して、対応する精製組換え抗体を、従来の組換えタンパク質発現精製技術を用いて得ることができる。具体的には、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１２７）を、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１０００１）中で増殖させた。一過性形質移入の前に、細胞を、３×１０^６～４×１０^６細胞／ｍＬの濃度に調整して、８％ＣＯ_２シェーカー内で３７℃にて２４時間培養して、７×１０^６～１０×１０^６細胞／ｍＬの細胞濃度に至った。続いて、細胞を６×１０^６細胞／ｍＬに希釈して、１０ｍＬの培養細胞を調製した。ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体をコードする合計８μｇの上述のプラスミド（プラスミドの、細胞に対する比率は、０．８μｇ：１ｍＬである）を、０．４ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１２３０９０１９）中に溶解させた。結果として生じた混合液を、０．２２μｍ滅菌フィルタを通して濾過した。続いて、３２μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１２９）を、０．３７ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１２３０９０１９）に加えた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬溶液を直ぐに、プラスミド溶液にゆっくり加えた。混合液を逆さにして、十分に混合した。プラスミド及び形質移入試薬の混合溶液をゆっくり滴加しながら、フラスコを振盪した。細胞を、８％ＣＯ_２シェーカー内で３７℃にて８～９日間培養した。細胞生存度を８日後に観察した。

【0158】

培養物を収集して、３３００ｇにて１０分間遠心分離してから、上清を収集して、高速で遠心分離して不純物を除去した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７１－５０２０－９１ ＡＥ）を含有するグラビティカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、７３１１５５０）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化して、２～５カラム容量のＰＢＳでリンスした。上清試料をカラム上にロードした。カラムを、５～１０カラム容量のＰＢＳでリンスした。標的タンパク質を、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．５）で溶出した。溶出液を、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中立に調整して、濃縮して、限外濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０１０２４）によりＰＢＳバッファ中にバッファ交換して、精製された抗体溶液を得た。続いて、精製された抗体溶液を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ）を用いて濃度決定に供して、後の使用のためにサブパッケージングして保存した。

【0159】

９．２． ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、ＨＩＣ－ＨＰＬＣ、及びＤＳＦによる抗体特性評価
適切な量の上述の精製試料を、純度の測定のために、分析ＳＥＣカラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（ＨＰＬＣシステムモデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）上にロードした。この方法では、以下のパラメータ及び条件を用いた：移動相：１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｓａｎｇｏｎ、Ｅ６０７０１６）；室温；流量：１．０ｍＬ／分；試料濃度：１ｍｇ／ｍＬ；注入容量：２０μＬ；検出波長：２８０ｎｍ。記録した後に、クロマトグラムを、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて積分して、関連データを算出した。分析を生成し、試料中の異なる構成要素について保持時間を報告した。

【0160】

適切な量の上述の精製試料を、純度及び疎水性の測定のために、分析ＨＩＣカラムＴＳＫｇｅ１ Ｂｕｔｙ１－ＮＰＲ ４．６＊３５（ＨＰＬＣシステムモデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）上にロードした。方法は、１６分以内の１００％移動相Ａ（２０ｍＭ ＰＢ、１．８Ｍ（ＮＨ４）_２ＳＯ_４、ｐＨ６．０）から１００％移動相Ｂ（２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ６．０）の線形勾配からなった。流量を０．７ｍＬ／分にセットした。試料濃度は１ｍｇ／ｍＬであった。注入容量は２０μＬであった。検出波長は２８０ｎｍであった。記録した後に、クロマトグラムを、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて積分して、関連データを算出した。分析を生成し、試料中の異なる構成要素について保持時間を報告した。

【0161】

この実施例では、タンパク質分子の熱変性温度（Ｔｍ）を、差分スキャニング蛍光測定（ＤＳＦ）によって測定した。１０μｇのタンパク質を９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ、ＡＢ－０７００／Ｗ）に加えた後に、２μＬの１００×希釈色素ＳＹＰＲＯＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００８１３８）を加えてから、バッファを加えて、ウェルあたり４０μＬの最終容量を得た。ＰＣＲプレートをシールして、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）内に置いて、２５℃にて５分間インキュベートしてから、０．２℃／０．２分の勾配にて２５℃から９５℃に徐々に温めて、試験の終了時に２５℃に冷却した。ＦＲＥＴスキャニングモードを用いて、データ分析を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアを用いて実行して、試料のＴｍを算出した。上述の特性評価の結果を、以下の表１７に示す。

【0162】

【表17】

【0163】

実施例１０：細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性
抗体を、結合親和性について、ＦＡＣＳによってアッセイした。試験細胞は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、及びＪｕｒｋａｔ細胞を含んだ。結合親和性を、以下のように求めた：細胞を、３００ｇにて５分間遠心分離してから、ＦＡＣＳバッファ（２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中に再懸濁させた。細胞密度を１０^６細胞／ｍＬに調整して、５０μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。抗体をＦＡＣＳバッファで様々な濃度に希釈して、５０μＬの抗体希釈液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。４℃にて２時間のインキュベーション後に、プレートをＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。続いて、ＡＰＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（１．５μｇ／ｍＬの最終濃度、Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－６０５－０９８）を含有するＦＡＣＳバッファを加えた。４℃にて１時間のインキュベーション後に、プレートをＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。細胞を固定液中に再懸濁させてから、細胞の蛍光を、ＦＡＣＳ機器（ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を用いてモニターした。図５及び表１８は、細胞に対する抗体の結合親和性を示す。全ての試験抗体は、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３発現細胞に結合することができ、ＣＬＤＮ１８．１発現細胞に結合しない。

【0164】

【表18】

【0165】

実施例１１：ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性
ＮＵＧＣ４＿Ｄ４、ＳＮＵ６２０、ＩＭ９５、及びＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対するＴＤＣＣ有効性について、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体を、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を用いてアッセイした。Ｔ細胞を、ヒトＰＢＭＣから、ヒト総Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９６－５３５）を用いて単離した。ヒトＴ細胞及び標的細胞を、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）中に再懸濁させた。標的細胞密度を３×１０^５細胞／ｍＬに調整し、Ｔ細胞密度を１．２×１０^６／ｍＬに調整した。５０μＬの各タイプの細胞を、９６ウェルプレートのウェルに加えた（４：１のエフェクタ対標的比）。試験抗体を、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）で様々な濃度に希釈して、５０μＬを９６ウェルプレートのウェルに加えた。試料を、３７℃にて４８時間インキュベートしてから、１０×トリトン－Ｘ １００ライセート（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ＋１０％トリトン－Ｘ １００）を、標的細胞最大ＬＤＨ放出対照ウェル及び容量補正対照ウェルに加えた。混合液を、３７℃にて０．５時間十分に混合してインキュベートした。９６ウェルプレートを、４００ｇで４分間遠心分離した。５０μＬの上清をとってから、ＬＤＨ発色溶液を５０μＬ／ウェルの濃度にて加えた。混合液を光の不在下で室温にて２０分間静置したままにした後に、プレートをＭＤ ＳｔａｋＭａｘ（ＯＤ_４９０）で読み出した。ＰＲ００４５４９をＣＬＤＮ１８．２標的細胞用の陽性対照として、ＰＲ００４３１３をＣＬＤＮ１８．１標的細胞用の陽性対照として、そしてＰＲ００４３１２抗体を陰性対照として用いた。結果の算出のために、補正読出しを最初に算出した。培地バックグラウンド対照ウェルの読出しを、実験ウェル、標的細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェル、及びエフェクタ細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの読出しから減算してから、容量補正対照ウェルの読出しを、標的細胞最大ＬＤＨ放出対照ウェルの読出しから減算した。ＴＤＣＣ活性（％）＝（実験ウェルの補正読出し－エフェクタ細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの補正読出し－標的細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの補正読出し）／（標的細胞最大ＬＤＨ放出対照ウェルの補正読出し－標的細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの補正読出し）×１００。図６は、試験抗体のＴＤＣＣ活性を示しており、値を表１９に詳述する。ＣＬＤＮ１８．２を高度に内生的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞では、試験抗体は、ＰＲ００４５４９と比較して、より高いか、又は匹敵するＴＤＣＣ活性を誘導することができる。一方、ＣＬＤＮ１８．２を低く発現するＩＭ９５細胞では、試験抗体は、ＰＲ００４５４９と比較して、より低いＴＤＣＣ活性を誘導する。ＳＮＵ６２０細胞は、ＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸１４９にて、メチオニンからロイシンへの変異を有する。これは、ＣＬＤＮ１８．２変異を有する胃癌患者のサブセットを表す。試験抗体は、ＰＲ００４５４９と比較して、より高いか、又は匹敵するＴＤＣＣ活性を誘導することができる。試験抗体は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ １８．１細胞に対して、ＴＤＣＣ効果を誘発できなかった。

【0166】

【表19】

【0167】

実施例１２：ＢＬＩ法によるヒトＦｃ受容体タンパク質に対する抗体の結合親和性
タンパク質と抗体間の結合動力学を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６ｅ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）システムを用いるバイオレイヤーインターフェロメトリ（ＢＬＩ）技術によって分析した。回転速度を、システムについて１０００ｒｐｍにセットした。１０×動力学バッファ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｃａｔ＃１８－１１０５）を、試料の親和性アッセイ及び希釈のために、１×動力学バッファに希釈した。インラインに配置したＦＡＢ２Ｇセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、１８－５１２５）を、試験バッファで１０分間平衡化してから用いて、抗体（ＰＲ００２７２５、ＰＲ００５３９７、ＰＲ００６３８４、ＰＲ００５４１１、ＰＲ００６２９２、ＰＲ００６０２３、及びＰＲ００６２９３）を、１ｎｍの捕捉高さにて捕捉した。バッファ中で１２０秒間平衡化した後に、ＦＡＢ２Ｇセンサーを、２倍で段階希釈したヒトＦｃ受容体タンパク質に結合させた。タンパク質濃度及び結合解離時間を表２０に示す。最後に、ＦＡＢ２Ｇセンサーを、再生のために、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシン－塩酸溶液中に浸漬して、センサーに結合したタンパク質を溶出した。ＦｃＲｎに対する抗体の親和性アッセイを、ｐＨ６．０バッファ及びｐＨ７．４バッファの双方の条件の下で実行した。ＰＲ００４５４９について、捕捉センサーはＰｒｏＬ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、１８－５０８５）である。データ分析を、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、バージョン１１．０）を用いて実行した場合、０ｎＭを基準ホールとして用いて、基準減算を実行した；「１：１グローバルフィッティング」法を選択してデータをフィットさせて、抗体へのタンパク質の結合の動力学パラメータを算出し、ｋｏｎ（１／Ｍｓ）値、ｋｄｉｓ（１／ｓ）値、及びＫＤ（Ｍ）値を得た。急速結合及び急速解離の相互作用について、「定常状態」法を選択して、データをフィットさせて、ＫＤ（Ｍ）値を得た。ヒトＦｃ受容体タンパク質に対する抗体の結合親和性を表２１に示す。

【0168】

【表20】

【0169】

【表21-1】

【0170】

【表21-2】

【0171】

実施例１３：ＢＬＩ法による様々な種のＣＤ３タンパク質に対する抗体の結合親和性
タンパク質と抗体間の結合動力学を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６ｅ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）システムを用いるバイオレイヤーインターフェロメトリ（ＢＬＩ）技術によって分析した。ヒトＣＤ３Ｅ（Ａｃｒｏ、ＣＤＥ－Ｈ５２２３）、カニクイザルＣＤ３Ｅ（Ａｃｒｏ、ＣＤＥ－Ｃ５２２６）、及びマウスＣＤ３Ｅ（Ａｃｒｏ、ＣＤＥ－Ｍ５２５６）を、ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ３９２５７）と１：３のモル比で混合した。混合液を４℃にて一晩インキュベートしてから、過剰なビオチンを除去してビオチン化ＣＤ３Ｅを得た。回転速度を、システムについて１０００ｒｐｍにセットした。１０×動力学バッファ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｃａｔ＃１８－１１０５）を、試料の親和性アッセイ及び希釈のために、１×動力学バッファに希釈した。インラインに配置したＳＡセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、１８－５０１９）を、試験バッファで１０分間平衡化してから用いて、ビオチン標識を有するＣＤ３又はビオチン化ＣＤ３を、０．２ｎｍの捕捉高さにて捕捉した。バッファ中で１２０秒間平衡化した後に、ＣＤ３を捕捉したＳＡセンサーを、２倍で段階希釈した抗体に結合させた。抗体濃度を表２２に示し、結合及び解離時間を１８０秒及び３００秒にセットした。最後に、ＳＡセンサーを、再生のために、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシン－塩酸溶液中に浸漬して、センサーに結合した抗体を溶出した。抗体抗ＣＤ３ｅ ４８－２Ｂ（ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓ ＳＣ－１１７４）は、マウスの陽性抗体である。データ分析を、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、バージョン１１．０）を用いて実行した場合、０ｎＭを基準ホールとして用いて、基準減算を実行した；「１：１グローバルフィッティング」法を選択してデータをフィットさせて、抗体へのタンパク質の結合の動力学パラメータを算出し、ｋｏｎ（１／Ｍｓ）値、ｋｄｉｓ（１／ｓ）値、及びＫＤ（Ｍ）値を得た。急速結合及び急速解離の相互作用について、「定常状態」法を選択して、データをフィットさせて、ＫＤ（Ｍ）値を得た。様々な種のＣＤ３タンパク質に対する抗体の結合親和性を表２３に示す。ＰＲ００２１９９は、Ｔｅｎｅｏｂｉｏの国際公開第２０１８０５２５０３号パンフレットの抗ＢＣＭＡ（ＴＮＢ３０８９０２）×ＣＤ３（ＴＮＢ＿Ｆ２Ｂ）二重特異性抗体に由来した。ＰＲ００４９３１は、Ｒｏｃｈｅの国際公開第２０１７０５５３８９Ａ１号パンフレットの抗ＣＥＡ×ＣＤ３二重特異性抗体に由来した。

【0172】

【表22】

【0173】

【表23】

【0174】

実施例１４：ヒトＣＬＤＮ１８．２パラロガスタンパク質に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性
抗体を、ＦＡＣＳ（ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）によってヒトＣＬＤＮ１８．２パラロガスタンパク質に対する結合親和性についてアッセイした。ヒトＣＬＤＮ１８．２パラロガスファミリーのＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６、及びＣＬＤＮ９遺伝子を、ＨＥＫ２９３細胞中に一過的に形質移入した。プラスミドに関する情報を表２４に示す。結合親和性を、以下のように判定した：細胞を３００ｇで５分間遠心分離してから、ＦＡＣＳバッファ（２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中に再懸濁させた。細胞密度を１０^６細胞／ｍＬに調整して、５０μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。抗体をＦＡＣＳバッファで６０ｎＭに希釈して、５０μＬの抗体希釈液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。４℃にて２時間のインキュベーション後に、プレートをＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。続いて、二次抗体を含有するＦＡＣＳバッファを加えた。４℃にて１時間のインキュベーション後に、プレートをＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。細胞を固定液中に再懸濁させてから、ＦＡＣＳをランした。陽性対照抗体、陰性対照抗体、及び二次抗体に関する情報を表２５に示す。ＰＲ００５０８０は、ＣＬＤＮ２結合についての陽性対照として用いたクローン１Ａ２抗体（社内で生成、欧州特許出願公開第３５６７０５３Ａ１号明細書参照）であった。ＦＡＣＳの結果を図７に示す。これは、ヒトＣＬＤＮ１８．２パラロガスファミリータンパク質のＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６、及びＣＬＤＮ９へのＰＲ００６３８４及びＰＲ００６２９２の非特異的結合がなかったことを示す。

【0175】

【表24】

【0176】

【表25】

【0177】

実施例１５：カニクイザル標的タンパク質に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性
抗体を、結合親和性について、ＦＡＣＳによってアッセイした。試験細胞は、カニクイザルＣＬＤＮ１８．２発現ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ｃｙｎｏＣＬＤＮ１８．２）、カニクイザルＣＬＤＮ１８．１過剰発現ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ｃｙｎｏＣＬＤＮ１８．１）、及びカニクイザルＣＤ３陽性Ｔ細胞を含んだ。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、非ヒト霊長類ＣＤ３細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９２－０１２）を用いて、カニクイザルＰＢＭＣから単離した。結合親和性を、以下のように求めた：細胞を３００ｇにて５分間遠心分離してから、ＦＡＣＳバッファ（２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中に再懸濁させた。細胞密度を１０^６細胞／ｍＬに調整して、５０μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。抗体をＦＡＣＳバッファで様々な濃度に希釈して、５０μＬの抗体希釈液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。４℃にて２時間のインキュベーション後に、プレートをＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。続いて、ＡＰＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（１．５μｇ／ｍＬの最終濃度、Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－６０５－０９８）を含有するＦＡＣＳバッファを加えた。４℃にて１時間のインキュベーション後に、プレートをＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。細胞を固定液中に再懸濁させてから、ＦＡＣＳ（ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）をランさせた。図８及び表２６は、カニクイザルＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞、並びにカニクイザルＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞に対する抗体の結合親和性を示す。全ての試験抗体は、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３発現細胞に結合することができ、ＣＬＤＮ１８．１発現細胞に結合しない。

【0178】

【表26】

【0179】

実施例１６：カニクイザルＣＬＤＮ１８．２発現細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体のＴＤＣＣ活性
ＨＥＫ２９３／ｃｙｎｏＣＬＤＮ１８．２に対するＴＤＣＣ有効性を誘発する活性について、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体を、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を用いてアッセイした。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、カニクイザルＰＢＭＣから、非ヒト霊長類ＣＤ３細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９２－０１２）を用いて単離した。カニクイザルＴ細胞及び標的細胞を、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）中に再懸濁させた。標的細胞密度を３×１０^５細胞／ｍＬに調整し、Ｔ細胞密度を１．２×１０^６／ｍＬに調整した。５０μＬの各タイプの細胞を、９６ウェルプレートのウェルに加えた（４：１のエフェクタ対標的比）。試験抗体を、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）で様々な濃度に希釈して、５０μＬを９６ウェルプレートのウェルに加えた。試料を３７℃にて２４時間インキュベートしてから、１０×トリトン－Ｘ １００ライセート（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ＋１０％トリトン－Ｘ １００）を、標的細胞最大ＬＤＨ放出対照ウェル及び容量補正対照ウェルに加えた。混合液を、３７℃にて０．５時間十分に混合してインキュベートした。９６ウェルプレートを、４００ｇで４分間遠心分離した。５０μＬの上清をとってから、ＬＤＨ発色溶液を５０μＬ／ウェルの濃度にて加えた。混合液を光の不在下で室温にて２０分間静置したままにした後に、プレートをＭＤ ＳｔａｋＭａｘ（ＯＤ_４９０）で読み出した。結果の算出のために、補正読出しを最初に算出した。培地バックグラウンド対照ウェルの読出しを、実験ウェル、標的細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェル、及びエフェクタ細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの読出しから減算してから、容量補正対照ウェルの読出しを、標的細胞最大ＬＤＨ放出対照ウェルの読出しから減算した。ＴＤＣＣ活性（％）＝（実験ウェルの補正読出し－エフェクタ細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの補正読出し－標的細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの補正読出し）／（標的細胞最大ＬＤＨ放出対照ウェルの補正読出し－標的細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの補正読出し）×１００。図９は、ＨＥＫ２９３／ｃｙｎｏＣＬＤＮ１８．２に対する抗体によって誘導されるＴＤＣＣ活性を示す。具体的な値を表２７に示す。

【0180】

【表27】

【0181】

実施例１７．インビトロサイトカイン放出アッセイ
ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒトＰＢＭＣを用いてインビトロ誘導サイトカイン放出についてアッセイして、抗体の安全性を予測した。ＰＢＭＣを、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞の存在又は不在下で、抗体とインキュベートした。ＰＢＭＣ及びＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１を、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）中に再懸濁させた。ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞の密度を１．５×１０^６細胞／ｍＬに調整して、ＰＢＭＣの細胞密度を２×１０^６／ｍＬに調整した。１００μＬのＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及び２００μＬのＰＢＭＣを、４８ウェルプレートのウェルに加えた。試験抗体を、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ）で様々な濃度に希釈して、１００μＬを４８ウェルプレートのウェルに加えて、４００μＬの最終容量にした。ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｌ６５２９）を陽性対照として用いた。Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃ０００１－４）抗体を陰性対照として用いた。試料を３７℃にて２４時間インキュベートした。上清を３００ｇにて１０分間遠心分離して、３００μＬの上清を収集した。上清中のＩＬ－６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、８８－７０６６）及びＴＮＦ－α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、８８－７３４６）の濃度を、ＥＬＩＳＡによって定量化した。図１０は、抗体によってインビトロで誘導されたサイトカイン放出を示す。ＰＲ００４５４９によって誘導されるＩＬ－６及びＴＮＦ－αの放出は、ＣＬＤＮ１８．２標的細胞の不在下でＰＲ００６２９２によって誘導されるものよりも高かった。これは、ＰＲ００６２９２のより良好な安全性プロファイルを示す。

【0182】

実施例１８：ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性
Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ １８．２に対するＡＤＣＣ効果を誘発する活性について、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体を、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を用いてアッセイした。ヒトＰＢＭＣを、３００ｇで１０分間遠心分離して、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）中で一晩培養した。ＮＫ細胞をヒトＰＢＭＣから、ヒトＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９２－６５７）を用いて単離した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を３００ｇで５分間、そしてヒトＮＫ細胞を３００ｇで１０分間遠心分離した。続いて、細胞を培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）中に再懸濁させた。標的細胞密度を３×１０^５細胞／ｍＬに調整し、ＮＫ細胞密度を１．８×１０^６／ｍＬに調整した。５０μＬの各タイプの細胞を、９６ウェルプレートのウェルに加えた（６：１のエフェクタ対標的比）。試験抗体を、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）で様々な濃度に希釈して、５０μＬを９６ウェルプレートのウェルに加えた。試料を、３７℃にて５時間インキュベートしてから、１０×トリトン－Ｘ １００ライセート（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ＋１０％トリトン－Ｘ １００）を、標的細胞最大ＬＤＨ放出対照ウェル及び容量補正対照ウェルに加えた。混合液を、３７℃にて０．５時間十分に混合してインキュベートした。９６ウェルプレートを、３００ｇで５分間遠心分離した。５０μＬの上清をとってから、ＬＤＨ発色溶液を５０μＬ／ウェルの濃度にて加えた。混合液を光の不在下で室温にて２０分間静置したままにした後に、プレートをＭＤ ＳｔａｋＭａｘ（ＯＤ_４９０）で読み出した。ＰＲ００３７６７を陽性対照として、そしてＩｓｏ ｈＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃ０００１－４）抗体を陰性対照として用いた。結果の算出のために、補正読出しを最初に算出した。培地バックグラウンド対照ウェルの読出しを、実験ウェル、標的細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェル、及びエフェクタ細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの読出しから減算してから、容量補正対照ウェルの読出しを、標的細胞最大ＬＤＨ放出対照ウェルの読出しから減算した。ＡＤＣＣ活性（％）＝（実験ウェルの補正読出し－エフェクタ細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの補正読出し－標的細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの補正読出し）／（標的細胞最大ＬＤＨ放出対照ウェルの補正読出し－標的細胞自然発生放出ＬＤＨ対照ウェルの補正読出し）×１００。図１１（ａ）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する抗体のＡＤＣＣ活性を示す。ＰＲ００６２９２及びＰＲ００４５４９は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対してＡＤＣＣ効果を誘発することができなかった。

【0183】

ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体を、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８に対してＡＤＣＣ効果を誘発する活性について、ＮＫ９２／ＣＤ１６ａ細胞を用いてアッセイした。ＮＵＧＣ４＿Ｄ８及びＮＫ９２／ＣＤ１６ａを、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）中に再懸濁させた。標的細胞密度を３×１０^５細胞／ｍＬに調整して、ＮＫ９２／ＣＤ１６ａ細胞密度を１．８×１０^６／ｍＬに調整した。５０μＬの各タイプの細胞を、９６ウェルプレートのウェルに加えた（６：１のエフェクタ対標的比）。試験抗体を、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）で様々な濃度に希釈して、５０μＬを９６ウェルプレートのウェルに加えた。試料を３７℃にて５時間インキュベートした。ＰＲ００３１９７を陽性対照として用いた。図１１（ｂ）は、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８に対する抗体のＡＤＣＣ活性を示す。ＰＲ００６２９２及びＰＲ００４５４９は、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対してＡＤＣＣ効果を誘発することができなかった。

【0184】

実施例１９：ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤＣ活性
ＣＬＤＮ１８．２抗体を、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２及びＪｕｒｋａｔ細胞に対するＣＤＣ効果について、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存度アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７３）を用いてアッセイした。標的細胞を、３００ｇで５分間遠心分離してから、ＲＰＭＩ１６４０無血清培地中に再懸濁させた。標的細胞密度を２×１０^５細胞／ｍＬに調整して、２５μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。抗体を無血清培地で様々な濃度に希釈して、２５μＬの抗体希釈液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。５０μＬの正常ヒト血清（Ａｃｃｅｓｓ細胞培養、５１５）を加えて５０％の最終濃度にして、結果として生じた混合液を３７℃にて２４時間インキュベートした。９６ウェルプレートを室温にて３０分間静置したままにして、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発色溶液を室温にて各ウェルに加えた。続いて、試料を、光の不在下で室温にて１０分間インキュベートした。プレートをＰＥ Ｅｎｓｐｉｒｅにより読み出した。ＣＤＣ活性（％）＝［１－（発光試料）／（発光モック対照）］×１００。ＩＭＡＢ３６２類似体を陽性対照として、そしてＩｓｏ ｈＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃ０００１－４）抗体を陰性対照として用いた。図１２は、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びヒトＣＬＤＮ１８．２過剰発現ＨＥＫ２９３細胞に対するＰＲ００６２９２抗体のＣＤＣ活性を示す。ＰＲ００６２９２は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２において、ＰＲ００４５４９によって誘導されるものよりも大きなＣＤＣ効果を誘導したが、ＣＤＣ活性は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において観察されなかった。ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤＣ活性を、表２８に具体的に示す。

【0185】

【表28】

【0186】

実施例２０：ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の競合結合活性
この実施例は、ヒトＣＬＤＮ１８．２抗原のエピトープ領域への抗ヒトＣＬＤＮ１８．２二重特異性抗体の結合を研究するものである。競合結合実験を、細胞レベルにて、ヒトＣＬＤＮ１８．２過剰発現ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を用いて実行した。簡潔に、抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体ＰＲ０００４００及びＰＲ００４５４９を、ビオチン化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ３５３５８）を用いて、指示事項に従ってビオチン化した。９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３８９４）に、細胞を２×１０^６細胞／ｍＬにて、そしてヒトＣＬＤＮ１８．２過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ／ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の懸濁液を５０μＬ／ウェルにて加えてから、２５μＬのビオチン化抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体ＰＲ０００４００又はＰＲ００４５４９を加えた。混合液を、４℃にて３０分間十分に混合してインキュベートして、対応する段階希釈した２５μＬの非ビオチン化抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体を加えた。混合液を、４℃にて１時間十分に混合してインキュベートした。各ウェル内の細胞を、２００μＬの予め冷却したＦＡＣＳバッファ（ＤＰＢＳ中２％ＢＳＡ）で２回洗浄して、５００ｇで４℃にて５分間遠心分離してから、上清を破棄した。蛍光二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、０１６－５４０－０８４、１：５００）を加えた。混合液を、光の不在下で４℃にて１時間インキュベートした。各ウェル内の細胞を、２００μＬの予め冷却したＦＡＣＳバッファ（ＤＰＢＳ中２％ＢＳＡ）で２回洗浄して、５００ｇで４℃にて５分間遠心分離してから、上清を破棄した。最後に、各ウェル内の細胞を、２００μＬの予め冷却したＦＡＣＳバッファ中に再懸濁させて、蛍光シグナル値を、ＡＣＥＡ＿ＮｏｖｏＣｙｔｅを用いて読み出した。阻害率を、式、阻害率（％）＝（Ａ－Ｂ）／Ａ×１００）（注：Ａ：ＩＳＯ（ｈＩｇＧ１）（Ｃｒｏｗｎｂｉｏ、ｃ０００１－４）とのビオチン化抗体の相互作用後の蛍光シグナル；Ｂ：非ビオチン化抗体とのビオチン化抗体の相互作用後の蛍光シグナル）を用いて算出した。

【0187】

図１３及び表２９に示すように、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２二重特異性抗体は全て、ヒトＣＬＤＮ１８．２へのＰＲ０００４００又はＰＲ００４５４９の結合をブロックすることができ、そして抗体の検出されるブロッキング能力は、抗体濃度と正に相関して増大する。このことは、これらの抗体が、ＰＲ０００４００及びＰＲ００４５４９のエピトープに非常に類似したエピトープを有することを示している。試験抗体は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対する結合親和性が低い。上述の結果から、試験抗体は、ＥＣＬ２ではなくＥＣＬ１（細胞外ループ１）にてヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合すると推測することができる。

【0188】

【表29】

【0189】

実施例２１：ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体の薬物動態研究
薬物動態研究を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを用いて、以下のように実行した。１８～２２ｇの体重の６頭の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを選択して、抗体投与を静脈注射によって５ｍｇ／ｋｇの用量にて受けさせた。一方の群内の３頭のマウスの全血を、投与前、そして投与の１５分、２４時間（１日）、４日、及び１０日後に収集し、他方の群内の３頭のマウスの全血を、投与前、そして投与の５時間、２日、７日、及び１４日後に収集した。全血を、３０分間静置したままにして凝固させてから遠心分離した。単離した血清試料を、分析にかけるまで－８０℃にて低温保存した。マウス血清中の薬物濃度をＥＬＩＳＡによって定量化した。総ＥＬＩＳＡ（トータル法）を、ヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体を用いてマウス血清中のヒトＦｃ含有抗体を捕捉することによって実行して、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体によって検出した。ＣＬＤＮ１８．２結合ドメインＥＬＩＳＡ（Ｆｒｅｅ Ｘ法）を、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質を用いてマウス血清中のＣＬＤＮ１８．２結合ドメイン含有抗体を捕捉することによって実行して、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体によって検出した。血漿濃度データを、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（バージョン８．２）を用いて非コンパートメント分析（ＮＣＡ）によって分析して、薬物動態学的パラメータを評価した。

【0190】

ＰＲ００６２９２、ＰＲ００６３８４、及びＰＲ００４５４９の薬物動態を図１４に示し、薬物動態学的パラメータを表３０に示す。ＰＲ００６２９２及びＰＲ００６３８４は、マウスにおける安定性がＰＲ００４５４９よりも優れており、マウスにおいて半減期が長く、且つ薬物曝露量が高い。

【0191】

【表30】

【0192】

実施例２２：ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３二重特異性抗体に関するインビボ薬力学研究
ＮＵＧＣ４＿Ｄ８腫瘍モデル
インビボ薬力学研究を、ＮＣＧマウスを用いてヒトＰＢＭＣ免疫系のＮＵＧＣ４＿Ｄ８腫瘍モデルを再確立することによって実行した。当該方法は、具体的には以下の通りである。細胞接種の日に、各ＮＣＧマウスにＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞及びＰＢＭＣを皮下接種した。マウスの各群の平均腫瘍容量が９０ｍｍ^３に達したときに、マウスを群に分けて、合計１回の投与を尾静脈を介して実行した。投与の開始後に、体重及び腫瘍容量を週に２回測定した。腫瘍容量を以下のように算出した：腫瘍容量（ｍｍ^３）＝０．５×腫瘍の長径×腫瘍の短径^２。データを、ｔ検定を用いて分析した。

【0193】

ＰＲ００５３９７、ＰＲ００５４１１、及びＰＲ００４５４９のインビボ抗腫瘍効果を図１５（ａ）に示す。具体的には、接種後２５日目のマウスのＩｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量は、１８９７ｍｍ^３であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００４５４９（０．２ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、１０４ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＜０．０００１）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は９４．４８％であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００４５４９（０．０４ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、５３８ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＜０．０００１）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は７１．６１％であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００５４１１（０．２ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、３０ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＜０．０００１）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は９８．３９％であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００５４１１（０．０４ ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、２６３ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＜０．０００１）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は８６．１％であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００５３９７（０．０４ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、３２７ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＜０．０００１）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は８２．７５％であった。処置の全体を通して、動物は、薬物に対する良好な寛容性を示し、大きな体重損失及び動物死は起こらなかった。ＰＲ００５３９７及びＰＲ００５４１１のインビボ抗腫瘍効果は、ＰＲ００４５４９のものよりも優れている。

【0194】

ＰＲ００６２９２、ＰＲ００６２９３、ＰＲ００６３８４、及びＰＲ００４５４９のインビボ抗腫瘍効果を、図１５（ｂ）に示す。具体的には、接種後２５日目のマウスのＩｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量は、１３５５ｍｍ^３であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００４５４９（０．２ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、４０８ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＝０．０００１）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は６９．８３％であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００４５４９（０．０４ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、７４３ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＝０．００３７）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は４５．１５％であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００６２９３（０．２ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、３９ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＜０．０００１）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は９７．０６％であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００６２９３（０．０４ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、１９０ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＜０．０００１）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は８５．９６％であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００６３８４（０．２ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、８１ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＜０．０００１）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は９４％であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００６３８４（０．０４ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、７５２ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＝０．００７１）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は４４．４７％であった。接種後２５日目の試験薬物ＰＲ００６２９２（０．０４ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、５８０ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＝０．０００６）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は５７．１５％であった。処置の全体を通して、動物は、薬物に対する良好な寛容性を示し、大きな体重損失及び動物死は起こらなかった。ＰＲ００６２９２、ＰＲ００６２９３、及びＰＲ００６３８４のインビボ抗腫瘍効果は、ＰＲ００４５４９のものよりも優れている。

【0195】

ＳＮＵ６２０ ＰＢＭＣ腫瘍モデル
インビボ薬力学研究を、ＮＣＧマウスを用いてヒトＰＢＭＣ免疫系のＳＮＵ６２０腫瘍モデルを再確立することによって実行した。当該方法は、具体的には以下の通りである。細胞接種の日に、各ＮＣＧマウスにＳＮＵ６２０腫瘍細胞を皮下接種した。マウスの各群の平均腫瘍容量が７０ｍｍ^３に達したときに、マウスを群に分けて、合計４回の投与を尾静脈を介して実行した。投与の開始後に、体重及び腫瘍容量を週に２回測定した。腫瘍容量を以下のように算出した：腫瘍容量（ｍｍ^３）＝０．５×腫瘍の長径×腫瘍の短径^２。データを、ｔ検定を用いて分析した。

【0196】

ＰＲ００６２９２及びＰＲ００４５４９のインビボ抗腫瘍効果を図１５（ｃ）に示す。具体的には、接種後３６日目のマウスのＩｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量は、８４７ｍｍ^３であった。接種後３６日目の試験薬物ＰＲ００６２９２（０．２ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、１３１ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＝０．００７６）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は８４．５３％であった。接種後３６日目の試験薬物ＰＲ００６２９２（０．０４ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、５０５ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＝０．３８５６）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は４０．３６％であった。接種後３６日目の試験薬物ＰＲ００４５４９（０．２ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、８５８ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＞０．９９９９）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は－１．２８％であった。接種後３６日目の試験薬物ＰＲ００４５４９（０．０４ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、８４４ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＞０．９９９９）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は０．３９％であった。処置の全体を通して、動物は、薬物に対する良好な寛容性を示し、大きな体重損失及び動物死は起こらなかった。

【0197】

ＨｕＰ－Ｔ４ ＰＢＭＣ腫瘍モデル
インビボ薬力学研究を、ＮＣＧマウスを用いてヒトＰＢＭＣ免疫系のＨｕＰ－Ｔ４腫瘍モデルを再確立することによって実行した。当該方法は、具体的には以下の通りである。細胞接種の日に、各ＮＣＧマウスにＨｕＰ－Ｔ４腫瘍細胞を皮下接種した。マウスの各群の平均腫瘍容量が１３０ｍｍ^３に達したときに、マウスを群に分けて、合計４回の投与を尾静脈を介して実行した。投与の開始後に、体重及び腫瘍容量を週に２回測定した。腫瘍容量を以下のように算出した：腫瘍容量（ｍｍ^３）＝０．５×腫瘍の長径×腫瘍の短径^２。データを、ｔ検定を用いて分析した。

【0198】

ＰＲ００６２９２のインビボ抗腫瘍効果を図１５（ｄ）に示す。具体的には、接種後３６日目のマウスのＩｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量は、１０５９ｍｍ^３であった。接種後３６日目の試験薬物ＰＲ００６２９２（０．５ｍｇ／ｋｇ）処置群の平均腫瘍容量は、１２９ｍｍ^３であった。これは、Ｉｓｏ ｈＩｇＧ１対照群の平均腫瘍容量との有意差を示し（ｐ値＝０．００２２）、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）は８７．７５％であった。処置の全体を通して、動物は、薬物に対する良好な寛容性を示し、大きな体重損失及び動物死は起こらなかった。

【0199】

マウスにおけるインビボサイトカイン放出試験
インビボサイトカインストーム研究を、ＮＣＧマウスを用いてヒトＰＢＭＣ免疫系を再確立することによって実行した。当該方法は、具体的には以下の通りである。各ＮＣＧマウスに２×１０^７ヒトＰＢＭＣを静脈内に注射して、次の日に、ＰＲ００６２９２、ＰＲ００４５４９、及び対照ＩｇＧ１抗体を静脈内に投与した。０時間（投与前）、投与後４及び２４時間に採血して、血清を収集した。ＭＳＤ法を利用して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＴＮＦ－αが挙げられる血清中の複数のサイトカインのレベルを検出した。データを、ｔ検定を用いて分析した。

【0200】

図１５（ｅ）は、抗体の注射の４時間後にマウス血清中で検出可能であった一部のサイトカインの発現を示す。結果は、ＰＲ００６２９２が、対照抗体ＰＲ００４５４９と比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－α等のサイトカインのより低い放出を誘導することを示した。このことは、より良好な安全性を示している。

【図1a-c】

【図1d-f】

【図2】

【図3】

【図4a-b】

【図4c-d】

【図4e-f】

【図4g-h】

【図5a-c】

【図5d-f】

【図5g-i】

【図5j-l】

【図5m-o】

【図5p-r】

【図5s】

【図6a-b】

【図6c-d】

【図6e-f】

【図6g-h】

【図6i-j】

【図6k-l】

【図6m-n】

【図6o-p】

【図6q-r】

【図6s-t】

【図6u-v】

【図6w】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15a-b】

【図15c-d】

【図15e】

【配列表】

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【国際調査報告】