▶ ライセンテク カンパニー リミテッドの特許一覧 ▶ ハンクク ユニバーシティ オブ フォーリン スタディーズ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーションの特許一覧
特表2024-531962新規のポリペプチドおよびこれを含むグラム陰性菌に対する抗生剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-03
(54)【発明の名称】新規のポリペプチドおよびこれを含むグラム陰性菌に対する抗生剤
(51)【国際特許分類】
C12N 9/36 20060101AFI20240827BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20240827BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240827BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240827BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240827BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240827BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240827BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240827BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240827BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240827BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240827BHJP
C12N 15/56 20060101ALI20240827BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240827BHJP
A61K 38/47 20060101ALI20240827BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240827BHJP
A01N 37/46 20060101ALI20240827BHJP
A01N 63/60 20200101ALI20240827BHJP
A01N 63/20 20200101ALI20240827BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20240827BHJP
C11D 3/48 20060101ALI20240827BHJP
【ＦＩ】
C12N9/36
C07K14/435 ZNA
C07K19/00
C12N15/63 Z
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N7/01
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/56
A61K38/16
A61K38/47
A61P31/04
A01N37/46
A01N63/60
A01N63/20
A01P3/00
C11D3/48
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509135
(86)(22)【出願日】2022-08-18
(85)【翻訳文提出日】2024-04-10
(86)【国際出願番号】 KR2022012373
(87)【国際公開番号】W WO2023022546
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】10-2021-0109266
(32)【優先日】2021-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0012566
(32)【優先日】2022-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0070371
(32)【優先日】2022-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522448643
【氏名又は名称】ライセンテク カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＬｙｓｅＮＴｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｃ－１００２， ２５３， Ｐａｎｇｙｏ－ｒｏ， Ｂｕｎｄａｎｇ－ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(71)【出願人】
【識別番号】517050879
【氏名又は名称】ハンクク ユニバーシティ オブ フォーリン スタディーズ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ミュン ヒジュン
(72)【発明者】
【氏名】キム ミン ス
(72)【発明者】
【氏名】ホン ヘ－ウォン
(72)【発明者】
【氏名】キム ユン ドゥク
(72)【発明者】
【氏名】チャン チェヨン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4H003
4H011
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA90Y
4B065AA98X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA31
4B065CA43
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA01
4C084CA53
4C084DA42
4C084DC22
4C084NA14
4C084ZB351
4C084ZB352
4H003FA34
4H011AA01
4H011AA03
4H011BB06
4H011BB19
4H011BB21
4H011DA13
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA50
4H045DA89
4H045EA06
4H045EA07
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
エンドリシン活性を有する新規のポリペプチド、当該ポリペプチドおよび抗生物質活性蛋白質を含む融合ポリペプチド、および当該ポリペプチドおよび／または融合ポリペプチドのグラム陰性病原菌に対する抗生用途および／またはグラム陰性病原菌感染および／またはグラム陰性病原菌感染に係る病気または症状の予防および／または治療用途を提供する。
【選択図】図４ａ
【選択図】図４ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２のアミノ酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列における３９位、４３位、４５位、７３位、８１位、１０１位、および１１３位からなる群より選択された１以上の位置のアミノ酸が本来とは異なるアミノ酸に置換された変異を含む、
ポリペプチド。
【請求項2】
下記の１）ないし７）からなる群より選択された１種以上の変異を含む、請求項１に記載のポリペプチド。１）配列番号２のアミノ酸配列における３９位の残基に対応するアミノ酸が、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換、
２）配列番号２のアミノ酸配列における４３位の残基に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
３）配列番号２のアミノ酸配列における４５位の残基に対応するアミノ酸が、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
４）配列番号２のアミノ酸配列における７３位の残基に対応するアミノ酸が、バリン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
５）配列番号２のアミノ酸配列における８１位の残基に対応するアミノ酸が、セリン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
６）配列番号２のアミノ酸配列における１０１位の残基に対応するアミノ酸が、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；および
７）配列番号２のアミノ酸配列における１１３位の残基に対応するアミノ酸が、バリン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換。
【請求項3】
配列番号２のアミノ酸配列における３９位の残基に対応するアミノ酸がセリンに、配列番号２のアミノ酸配列における４３位の残基に対応するアミノ酸がヒスチジンに、
配列番号２のアミノ酸配列における４５位の残基に対応するアミノ酸がグルタミン酸に、
配列番号２のアミノ酸配列における７３位の残基に対応するアミノ酸がバリンに、
配列番号２のアミノ酸配列における８１位の残基に対応するアミノ酸がセリンに、および
配列番号２のアミノ酸配列における１０１位の残基に対応するアミノ酸がアラニンに置換された変異を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項4】
配列番号２のアミノ酸配列における１１３位の残基に対応するアミノ酸がバリンに置換された変異をさらに含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項5】
配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項6】
セクロピンＡ（セクロピンセクロピンＡ）をさらに含む、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項7】
前記セクロピンＡが、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項8】
前記セクロピンＡおよび前記ポリペプチドが、Ｎ－末端から順に連結されている、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項9】
前記セクロピンＡおよび前記ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項10】
配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項11】
グラム陰性菌に対して抗生物質活性を有する、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項12】
グラム陰性菌に対して抗生物質活性を有する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項13】
請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドおよびセクロピンＡを含む融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項14】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項15】
請求項１３に記載のポリヌクレオチド、またはこれを含む組換えベクターを含む、組換え細胞。
【請求項16】
請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドおよびセクロピンＡを含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、バクテリオファージ。
【請求項17】
配列番号１の核酸配列を含む、請求項１６に記載のバクテリオファージ。
【請求項18】
請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドおよびセクロピンＡを含む融合ポリペプチド、前記ポリペプチドまたは前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
前記ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、抗生剤。
【請求項19】
ポリミキシン系抗生剤をさらに含む、請求項１８に記載の抗生剤。
【請求項20】
前記ポリミキシン系抗生剤は、ポリミキシンＢ、コリスチン、またはこれらの組み合わせである、請求項１９に記載の抗生剤。
【請求項21】
グラム陰性菌に対して抗生物質活性を有する、請求項１８に記載の抗生剤。
【請求項22】
前記グラム陰性菌は、シュードモナス属細菌、アシネトバクター属細菌、エスケリキア属細菌、エンテロバクター属細菌、およびクレブシエラ属細菌からなる群より選択された１種以上である、請求項２１に記載の抗生剤。
【請求項23】
請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドおよびセクロピンＡを含む融合ポリペプチド、前記ポリペプチドまたは前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
前記ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を有効性分として含む、
グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項24】
前記グラム陰性菌は、シュードモナス属細菌、アシネトバクター属細菌、エスケリキア属細菌、エンテロバクター属細菌、およびクレブシエラ属細菌からなる群より選択された１種以上である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項25】
前記グラム陰性菌は、シュードモナス属細菌であり、シュードモナス属細菌によって誘発される病気は、皮膚感染、床擦れ、肺炎、菌血症、敗血症、心内膜炎、髄膜炎、外耳炎、中耳炎、角膜炎、骨髄炎、腸炎、腹膜炎、または嚢胞性線維症である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項26】
前記グラム陰性菌は、アシネトバクター属細菌であり、アシネトバクター属細菌によって誘発される病気は、皮膚感染、肺炎、菌血症、または敗血症である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項27】
前記グラム陰性菌は、エスケリキア属細菌であり、エスケリキア属細菌によって誘発される病気は、腸炎、クローン病、潰瘍性大膓炎、細菌性赤痢、尿道感染症、皮膚感染、菌血症、または敗血症である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項28】
請求項１８に記載の抗生剤を含む、飼料添加剤。
【請求項29】
請求項１８に記載の抗生剤を含む、消毒剤。
【請求項30】
請求項１８に記載の抗生剤を含む、洗浄剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示内容は、エンドリシン活性を有する新規のポリペプチド、エンドリシンペプチドと抗生物質活性蛋白質とを含む融合蛋白質、および前記ポリペプチドおよび／または融合蛋白質のグラム陰性病原菌に対する抗生剤および／またはグラム陰性病原菌感染および／またはグラム陰性病原菌感染に係る病気または症状の予防および／または治療用医薬組成物としての用途を提供する。
【背景技術】
【0002】
バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）は、特定の細菌に感染し、感染した細菌の成長を抑制して阻害する細菌特異的なウイルスを意味する。バクテリオファージは、自身の宿主バクテリアに感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）した後、細菌細胞内部で増殖し、増殖後に子孫バクテリオファージがバクテリアの外に出るとき、バクテリオファージの蛋白質であるエンドリシンを用いて宿主の細菌の細胞壁を破壊する方式で細菌を死滅させる能力を有する。したがって、バクテリオファージのエンドリシン活性を有する物質は、抗生剤候補物質として有用に適用することができる。
【0003】
近来、抗生剤耐性細菌が急速に増加していて、いかなる抗生剤でも治療できない多剤耐性細菌も増えている。特に、グラム陰性菌のうちの一つであるシュードモナスエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、全世界的に新たな治療手段の開発が至急なＥＳＫＡＰＥ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ａｎｄ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）ｂａｃｔｅｒｉａのうちの一つであり、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は、多様な感染症に関わるｂａｃｔｅｒｉａである。したがって、既存の抗生剤とは差別化される治療手段の開発が要求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
一態様は、配列番号２のアミノ酸配列における３９位、４３位、４５位、７３位、８１位、１０１位、および１１３位からなる群より選択された１以上の位置に対応するアミノ酸が、本来とは異なるアミノ酸に置換された変異を含む、変異型ポリペプチドを提供する。
【0005】
他の態様は、セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）および配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または前記変異型ポリペプチドを含む、融合ポリペプチドを提供する。
【0006】
また他の態様は、変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0007】
また他の態様は、ポリヌクレオチドを含む、組換えベクターを提供する。
【0008】
また他の態様は、ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターを含む、組換え細胞を提供する。
【0009】
また他の態様は、変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチド、
変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、抗生剤を提供する。
変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、抗生剤を提供する。
【0010】
また他の態様は、変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチド、
変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防または治療用医薬組成物を提供する。
変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【0011】
また他の態様は、抗生剤を含む、飼料添加剤を提供する。
【0012】
また他の態様は、抗生剤を含む、消毒剤を提供する。
【0013】
また他の態様は、抗生剤を含む、洗浄剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0014】
標準治療抗生剤と共に用いるとき、観察された上昇効果だけでなくグラム陰性病原体に対する向上した抗菌活性を有する、改変されたエンドリシンを提供する。
【0015】
一態様は、配列番号２または６のポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、グラム陰性菌に対するエンドリシン（エンドリシン）として作用することができ、抗生剤として有用である。ポリペプチドを組換えで合成する場合、配列番号２または６のアミノ酸配列のＮ－末端に第一のアミノ酸残基としてメチオニン（Ｍ）が付加されてもよい。
【0016】
他の態様は、配列番号２または６のポリペプチドと抗生剤蛋白質、例えば、セクロピンＡ（例えば、配列番号８、または配列番号９）を含む融合ポリペプチドを提供する。融合ポリペプチドでは、ポリペプチドと抗生剤蛋白質とは直接（リンカーなしに）またはペプチドリンカーを介して互いに融合することができる。例えば、融合ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでもよい。
【0017】
配列番号２（ＥＣ３４０）
ＶＳＲＮＩＳＮＮＧＩＫＦＴＡＡＦＥＧＦＲＧＴＡＹＲＡＴＰＮＥＫＹＬＴＩＧＹＧＨＹＧＰＤＶＴＰＧＫＴＩＴＰＧＱＧＬＬＬＬＮＲＤＭＡＫＡＶＡＡＶＤＡＡＡＨＨＳＬＴＱＡＱＦＤＡＶＣＤＬＶＹＮＡＧＡＧＶＩＡＡＴＴＧＴＧＫＡＬＲＳＧＤＩＡＴＬＲＡＫＬＡＬＦＩＮＱＮＧＫＰＬＬＧＬＲＲＲＴＡＧＲＬＡＬＦＤＧＫＰＷＱＥＡＥＡＩＧＲＡＶＫＧ
ＶＳＲＮＩＳＮＮＧＩＫＦＴＡＡＦＥＧＦＲＧＴＡＹＲＡＴＰＮＥＫＹＬＴＩＧＹＧＨＹＧＰＤＶＴＰＧＫＴＩＴＰＧＱＧＬＬＬＬＮＲＤＭＡＫＡＶＡＡＶＤＡＡＡＨＨＳＬＴＱＡＱＦＤＡＶＣＤＬＶＹＮＡＧＡＧＶＩＡＡＴＴＧＴＧＫＡＬＲＳＧＤＩＡＴＬＲＡＫＬＡＬＦＩＮＱＮＧＫＰＬＬＧＬＲＲＲＴＡＧＲＬＡＬＦＤＧＫＰＷＱＥＡＥＡＩＧＲＡＶＫＧ
【0018】
配列番号６（ｍｔＥＣ３４０）
ＶＳＲＮＩＳＮＮＧＩＫＦＴＡＡＦＥＧＦＲＧＴＡＹＲＡＴＰＮＥＫＹＬＴＩＧＹＧＳＹＧＰＨＶＥＰＧＫＴＩＴＰＧＱＧＬＬＬＬＮＲＤＭＡＫＡＶＡＡＶＤＡＶＡＨＨＳＬＴＱＳＱＦＤＡＶＣＤＬＶＹＮＡＧＡＧＶＩＡＡＡＴＧＴＧＫＡＬＲＳＧＤＶＡＴＬＲＡＫＬＡＬＦＩＮＱＮＧＫＰＬＬＧＬＲＲＲＴＡＧＲＬＡＬＦＤＧＫＰＷＱＥＡＥＡＩＧＲＡＶＫＧ
ＶＳＲＮＩＳＮＮＧＩＫＦＴＡＡＦＥＧＦＲＧＴＡＹＲＡＴＰＮＥＫＹＬＴＩＧＹＧＳＹＧＰＨＶＥＰＧＫＴＩＴＰＧＱＧＬＬＬＬＮＲＤＭＡＫＡＶＡＡＶＤＡＶＡＨＨＳＬＴＱＳＱＦＤＡＶＣＤＬＶＹＮＡＧＡＧＶＩＡＡＡＴＧＴＧＫＡＬＲＳＧＤＶＡＴＬＲＡＫＬＡＬＦＩＮＱＮＧＫＰＬＬＧＬＲＲＲＴＡＧＲＬＡＬＦＤＧＫＰＷＱＥＡＥＡＩＧＲＡＶＫＧ
【0019】
配列番号１０（ＬＮＴ１１３； Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ－ＧＧＧＧＳｘ３ ｌｉｎｋｅｒ－ｍｔＥＣ３４０）
ＭＫＷＫＬＦＫＫＩＥＫＶＧＱＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰＡＶＡＶＶＧＱＡＴＱＩＡＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＳＲＮＩＳＮＮＧＩＫＦＴＡＡＦＥＧＦＲＧＴＡＹＲＡＴＰＮＥＫＹＬＴＩＧＹＧＳＹＧＰＨＶＥＰＧＫＴＩＴＰＧＱＧＬＬＬＬＮＲＤＭＡＫＡＶＡＡＶＤＡＶＡＨＨＳＬＴＱＳＱＦＤＡＶＣＤＬＶＹＮＡＧＡＧＶＩＡＡＡＴＧＴＧＫＡＬＲＳＧＤＶＡＴＬＲＡＫＬＡＬＦＩＮＱＮＧＫＰＬＬＧＬＲＲＲＴＡＧＲＬＡＬＦＤＧＫＰＷＱＥＡＥＡＩＧＲＡＶＫＧ
ＭＫＷＫＬＦＫＫＩＥＫＶＧＱＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰＡＶＡＶＶＧＱＡＴＱＩＡＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＳＲＮＩＳＮＮＧＩＫＦＴＡＡＦＥＧＦＲＧＴＡＹＲＡＴＰＮＥＫＹＬＴＩＧＹＧＳＹＧＰＨＶＥＰＧＫＴＩＴＰＧＱＧＬＬＬＬＮＲＤＭＡＫＡＶＡＡＶＤＡＶＡＨＨＳＬＴＱＳＱＦＤＡＶＣＤＬＶＹＮＡＧＡＧＶＩＡＡＡＴＧＴＧＫＡＬＲＳＧＤＶＡＴＬＲＡＫＬＡＬＦＩＮＱＮＧＫＰＬＬＧＬＲＲＲＴＡＧＲＬＡＬＦＤＧＫＰＷＱＥＡＥＡＩＧＲＡＶＫＧ
【0020】
配列番号８（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）
ＫＷＫＬＦＫＫＩＥＫＶＧＱＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰＡＶＡＶＶＧＱＡＴＱＩＡＫ
ＫＷＫＬＦＫＫＩＥＫＶＧＱＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰＡＶＡＶＶＧＱＡＴＱＩＡＫ
【0021】
配列番号９（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ、Ｍ ｉｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ 配列番号８）
ＭＫＷＫＬＦＫＫＩＥＫＶＧＱＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰＡＶＡＶＶＧＱＡＴＱＩＡＫ
ＭＫＷＫＬＦＫＫＩＥＫＶＧＱＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰＡＶＡＶＶＧＱＡＴＱＩＡＫ
【0022】
他の態様は、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0023】
他の態様は、ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。組換えベクターは発現ベクターであってもよい。
【0024】
他の態様は、ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。組換え細胞は、ポリヌクレオチドの発現のために用いられてもよい。
【0025】
他の態様は、下記からなる群より選択された１種以上を含む抗生剤を提供する。
ポリペプチド、例えば、配列番号２または６；
融合ポリペプチド、例えば、配列番号１０；
ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および
ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞。
ポリペプチド、例えば、配列番号２または６；
融合ポリペプチド、例えば、配列番号１０；
ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および
ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞。
【0026】
抗生剤は、一つまたは複数（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）のグラム陰性菌に対して抗生効果がある。
【0027】
他の態様は、グラム陰性細菌の感染および／またはグラム陰性細菌感染に係る（これによって誘発される）症状または病気を予防および／または治療するための薬学的組成物を提供し、薬学的組成物は、下記からなる群より選択される１種以上を含んでもよい。
先に説明したポリペプチド、例えば、配列番号２または６；
先に説明した融合ポリペプチド、例えば、配列番号１０；
ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および
ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞。
先に説明したポリペプチド、例えば、配列番号２または６；
先に説明した融合ポリペプチド、例えば、配列番号１０；
ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および
ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞。
【0028】
薬学的組成物は、一つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。
【0029】
他の態様は、下記からなる群より選択される１種以上を含む薬学的組成物を経口または非経口に（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内など）投与するステップを含む、グラム－陰性細菌の感染および／またはグラム－陰性細菌感染に係る（これによって誘発される）症状または病気を予防および／または治療方法を提供する。
先に説明したポリペプチド、例えば、配列番号２または６；
先に説明した融合ポリペプチド、例えば、配列番号１０；
ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および
ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞。
先に説明したポリペプチド、例えば、配列番号２または６；
先に説明した融合ポリペプチド、例えば、配列番号１０；
ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および
ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞。
【発明の効果】
【0030】
本明細書で提供される野生型または変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、多様なグラム－陰性菌に対して優れた抗菌効能を有するので、薬学的組成物だけでなく抗生剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図3】図３は、バクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２由来のエンドリシン（ＥＣ３４０）の試験管内の大腸菌、アシネトバクターバウマニおよびシュードモナスエルギノーザに対する抗生効果を示すグラフである。
【図4a】図４ａおよび図４ｂは、本出願で用いられたエンドリシンの構成と酵素活性を示す。図４ａは、ＥＣ３４０、ｍｔＥＣ３４０およびＬＮＴ１１３のドメイン構造を示す。それは、細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）がない予測されたリゾチームドメインを有している。Ｅ．ｃｏｌｉファージＰＢＥＣ１３１のＥＣ３４０は、アミノ酸のいくつかの置換を受けた（ｍｔＥＣ３４０）。置換されたアミノ酸の位置が表示された。ｍｔＥＣ３４０は、セクロピンセクロピンＡがＮ－末端に融合しており、ＬＮＴ１１３と命名した。
【図4b】図４ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび後続のザイモグラム分析で精製されたエンドリシン、ＥＣ３４０（１９．５ｋＤａ）、ｍｔＥＣ３４０（１８．２ｋＤａ）およびＬＮＴ１１３（２３．２ｋＤａ）の分析結果を示す。
【図5a】図５ａないし図５ｄは、エンドリシンの抗菌活性を示す。図５ａないし図５ｄに、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で２時間Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（図５ａ、図５ｃ；ＡＴＣＣ ８７３９、ＡＴＣＣ ２５９２２、ＣＣＡＲＭ １Ａ７４６、ＣＣＡＲＭ １Ｂ６８４およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株（図５ｂ、図５ｄ；ＡＴＣＣ ７００６０３、ＫＣＴＣ ２２０８、ＣＣＡＲＭ １０１４３、Ｆ８５）に対するエンドリシン（２μＭ）の抗菌活性を示した。Ｔｒｉｓバッファーは、陰性対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いられた。点線は、検出限界を示す。ｔ－検定以外にも二元配置ＡＮＯＶＡが行われており、垂直棒の上に水平棒として表示された（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。
【図5b】同上
【図5c】同上
【図5d】同上
【図6a】図６ａないし図６ｅは、ＬＮＴ１１３の細胞浸透および抗菌活性を示す。図６ａ：グラム陰性Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９の外膜透過性はＮＰＮ分析によって決定された。ＣｅｃＡ－ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰに融合されたセクロピンＡ；ｃｅｃＡ＋ｍｔＥＣ３４０、セクロピンセクロピンＡおよびｍｔＥＣ３４０をそれぞれ２μＭの混合物に別途に添加した；ＰＭＢ、ポリミキシンＢ。
【図6b】図６ｂは、ＬＮＴ１１３は、セクロピンセクロピンＡおよび／またはｍｔＥＣ３４０に比べてＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９に対して向上した抗菌活性を示した。いずれも０．５ｍＭの最終濃度で処理した。
【図6e】図６ｅは、ＭＣＲ－１陽性大腸菌ＦＯＲＣ８１に対するＬＮＴ１１３の抗菌活性を示す。細胞を２時間０．２または２μＭ濃度のＬＮＴ１１３またはコリスチンで処理した。点線は、検出限界を示す。星印は、対照群との統計的差を示す（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。
【図7a】図７ａないし図７ｂは、ＬＮＴ１１３の細胞毒性および溶血活性を示す。 図７ａは、Ｈｕｈ７細胞株でＬＮＴ１１３の細胞毒性分析を示す。細胞を異なる濃度のＬＮＴ１１３と共に２４時間または４８時間インキュベーションした。細胞毒性の陽性対照群としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いた。
【図7b】図７ｂは、ＬＮＴ１１３の溶血活性を示す。赤血球をＰＢＳまたは、ＬＮＴ１１３と共に３７°Ｃで１時間培養し、５７０ｎｍで上澄み液の吸光度を測定して溶血活性を確認した。溶血活性の陽性対照群としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ０．１％を用いた。
【図8】図８は、３つの異なるＥ．ｃｏｌｉ菌株に対するＬＮＴ１１３は、コリスチンと併用処理時に上昇効果を示す。Ｅ．ｃｏｌｉで、ＬＮＴ１１３とコリスチンのｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ．ＦＩＣ指数（ＦＩＣＩ）は、ＬＮＴ１１３およびコリスチンのＦＩＣ（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の合計を示す。
【図9】図９は、ＥＣ３４０の部位指定変異の誘発に用いられる推定エンドリシンのアミノ酸配列整列（ＣＬＵＳＴＡＬオメガ）（ＣＬＵＳＴＡＬオメガを用いるＥＣ３４０エンドリシンと類似の蛋白質の多重配列整列（バージョン１．２．４））を示す。
【図10a】図１０ａおよび図１０ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９（図１０ａ）およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＫＣＴＣ ２２０８（図１０ｂ）に対するエンドリシンの抗菌活性を示す。幾何級数的に成長したバクテリア細胞を、３７℃で２時間１５０ｍＭのＮａＣｌの存在または不在下で、２つの異なる緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５または２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）で２μＭのエンドリシンと共に培養した。点線は、検出限界を示す。ｔ－検定以外にも二元配置ＡＮＯＶＡが行われており、垂直棒の上に水平棒として表示された（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。
【図10b】同上
【発明を実施するための形態】
【0032】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0033】
細菌を宿主にして増殖して天然の抗生剤として用いられるバクテリオファージが、細菌に侵入して内部で増殖を終えると、完成されたファージ粒子が細菌外部に放出され、このとき、細菌の細胞壁を攻撃して分解し、外部に放出される通路を作る酵素がエンドリシンである。全てのバクテリオファージは、そのゲノム内にこのようなエンドリシン遺伝子を有し、増殖時に発現したエンドリシン蛋白質を用いる。細菌を宿主にして増殖するバクテリオファージと細胞壁を分解する特性を有するバクテリオファージに由来のエンドリシンは、天然の抗生剤として用いることができる。本明細書では、新規のバクテリオファージを分離し、バクテリオファージとこれに由来のエンドリシンの抗生効果を立証し、バクテリオファージとこれに由来のエンドリシンの抗生剤および／またはこれに関連する用途を提供する。
【0034】
グラム陽性細菌の場合には、最も外壁に細胞壁が位置するので、外部からエンドリシンを添加すると、細胞壁が直ちに攻撃されて分解される。これに対し、グラム陰性細菌の場合には、最も外部に外細胞膜が存在し、その内部に細胞壁が位置するので、外部からエンドリシンを添加しても、まず外細胞膜を通過してこそ細胞壁に接することになる。したがって、基本的に、エンドリシンは、グラム陰性細菌には効果がないと知らされてきた。
【0035】
本明細書で提供されるエンドリシン活性を有するポリペプチドは、グラム陰性菌を死滅させる効果を有することを特徴とする。
【0036】
エンドリシンまたはムレイン加水分解酵素ともいうバクテリオファージリシンは、溶菌周期の最後の段階でバクテリオファージによって生成される加水分解酵素であって、宿主の細胞壁を切断できるので、ファージが内部で増殖した後に宿主バクテリアで破裂することができる。外部からグラム陰性菌に組換え蛋白質として適用すると、外膜の存在によってリシンが細胞壁に容易に到達できない。本出願で、大腸菌を感染させるファージＰＢＥＣ１３１から得たエンドリシンＥＣ３４０は、外膜透過性を改善し、グラム陰性バクテリアに対する活性を増加させるように改変されている。改変されたエンドリシンであるＬＮＴ１１３は、標準治療抗生剤との潜在的な上昇効果についてテストされた。メロペネム、チゲサイクリン、クロラムフェニコール、アジスロマイシンおよびシプロフロキサシンでは付加効果が示されたのに対し、コリスチンでは上昇効果が立証された。セフタジジムおよびカナマイシンはいずれもＬＮＴ１１３エンドリシンと相乗効果や相加効果が示さなかった。さらに、相乗効果および付加効果は、抗生剤種類、外膜通過メカニズム、分子量またはテストした各抗生剤の殺菌特性によって一般化することができなかった。
【0037】
Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａの血リンパから分離されたセクロピンＡは３７個のアミノ酸ペプチドであって、両親媒性ａｌｐｈａ－ｈｅｌｉｘ構造を有しており、グラム陰性菌の外膜と相互作用して抗菌活性を示す。本出願で、セクロピンＡとｍｔＥＣ３４０との融合は、細胞膜透過性を１．８倍増加させ、抗菌性を２～４ｌｏｇ増加させた。セクロピンＡは、膜破壊を誘導するものと報告されているが、一般に同意された作用方式はまだ明らかになっていない。セクロピンＡは、自己促進吸収によって外膜を横切って膜の歪みを引き起こすものと提案されている。外膜の歪みは本出願で立証されているように、セクロピン融合エンドリシンおよびセクロピン自体の吸収を促進して融合蛋白質の抗菌効能をはるかに高めることができる。
【0038】
１９９０年代からコリスチンは、多剤耐性病原体の急激な増加に対する最後の手段として使用された。ＬＮＴ１１３は、チェッカーボード分析でコリスチンと相乗効果があるものと確認された。コリスチンは、脂質多糖類（ＬＰＳ）の脂質Ａと直接相互作用して、合成ＬＰＳ／リン脂質二重層でＬＰＳ－コリスチンクラスタを形成して抗菌活性に重要な役割を果たす。脂質Ａ生合成に関わる遺伝子の変異は、ＬＰＳ欠乏バクテリアを生成してコリスチン耐性を誘発する。また他の耐性機序は、ホスホエタノールアミントランスフェラーゼ酵素ファミリーのメンバーであるＭＣＲ－１に関連して、ホスホエタノールアミンを脂質Ａに添加してコリスチンの付着を妨げる。このようなコリスチンと脂質Ａとの相互作用は、エンドリシンのより効率的な吸収を可能にして融合蛋白質のより高い抗菌効能をもたらすことができる。ＬＮＴ１１３とコリスチン以外の抗生剤との間には相乗効果が観察されなかった。付加効果も対象菌株によって異なるように示され、以前の報告書と一致した。このような相異は抗生剤感受性とは無関係であった。ＭＤＲ菌株ＣＣＡＲＭ １Ａ７４６（表１）は、ＬＮＴ１１３の抗菌効果を色々な方式で抑制する多重耐性メカニズムの存在によってより高いＦＩＣＩ値を示した。他の種類の抗生剤による併用効果の一般化は不可能であった。例えば、テストした二つのベータ－ラクタム抗生剤のうちの一つのセフタジジムは、ＬＮＴ１１３とほとんど相加効果を示さないのに対し、他のベータ－ラクタム抗生剤のメロペネムは若干の相加効果を示した。外膜通過機序によってアジスロマイシンのようなマクロライドとカナマイシンのようなアミノグリコシドは、脂質媒介経路を用いるのに対し、ベータラクタムはポリン媒介拡散を用いる。言い換えると、本出願でグループ間で一貫したパターンが観察されなかった。また、テストした各抗生剤の分子量や静菌または殺菌作用メカニズムも一貫したパターンを示していない。
【0039】
要約すると、本出願で改変されたエンドリシンＬＮＴ１１３を生産し、試験管内で抗菌効能を確認した。このエンドリシンは、コリスチンとの相乗効果と標準治療抗生剤との一部追加効果を有しているので、現在の抗生剤耐性問題を克服するための新たな方式として用いることができる。
【0040】
用語の定義
本明細書で、ポリヌクレオチド（「遺伝子」と混用することがある）またはポリペプチド（「蛋白質」と混用することがある）が、「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなる」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須的に含むことを意味することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的する機能を維持する範囲で、特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、変形、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または、変異を排除しないもの）と解釈することができる。
本明細書で、ポリヌクレオチド（「遺伝子」と混用することがある）またはポリペプチド（「蛋白質」と混用することがある）が、「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなる」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須的に含むことを意味することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的する機能を維持する範囲で、特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、変形、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または、変異を排除しないもの）と解釈することができる。
【0041】
一例で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなるまたは表示される」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、（ｉ）特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須的に含むか、または（ｉｉ）特定の核酸配列またはアミノ酸配列と９６％以上、９６．３％以上、９７％以上、９７．７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列からなるか、これを必須的に含み、本来の機能および／または目的する機能を維持することを意味することができる。本明細書で、本来の機能は、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）、セクロピンＡ活性（例えば、細胞膜溶解活性）、および／または抗生作用であるか（アミノ酸配列の場合）、またはエンドリシン酵素機能、セクロピンＡ活性、および／または抗生作用を有する蛋白質コードする機能（核酸配列の場合）であることができ、目的する機能は、グラム陰性菌に対する抗生物質活性を意味することができる。
【0042】
本明細書で、用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は与えられた核酸配列またはアミノ酸配列と一致する程度を意味し、百分率（％）で表することができる。核酸配列に対する相同性の場合、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（参照：ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、５８７３、１９９３）やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３、６３、１９９０）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
【0043】
本明細書で提供される蛋白質またはポリペプチドは、天然から分離および／または精製されるか、組換えまたは化学的に合成されたものであってもよい。本明細書で提供される蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列が、Ｎ－末端から第一のアミノ酸残基としてメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）またはＭｅｔ－Ａｌａ－Ｓｅｒ（ＭＡＳ）配列を含む場合、蛋白質またはポリペプチドが組換えで生産されたものであってもよく、Ｎ－末端から第一のアミノ酸位置のメチオニンは開始コドンによってコードされたものであってもよい。したがって、本明細書で提供される蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列が、Ｎ－末端に組換え生産によるメチオニンを含む場合、蛋白質またはポリペプチドが他の方法（例えば、化学的合成または天然から分離）で得られる場合には、組換え生産によるＮ－末端の第一の位置のメチオニンを除いた第二のアミノ酸残基から開始されるアミノ酸配列またはＭＡＳ配列の次のアミノ酸残基（例えば、第四のアミノ酸残基）から開始されるアミノ酸配列を含むものと解釈することができる。
【0044】
エンドリシンは、バクテリオファージがコードするペプチドグリカン加水分解酵素を意味する。エンドリシンは、バクテリオファージ増殖の溶解回路で、後期遺伝子の発現の間に合成され、バクテリア性ペプチドグリカンの分解を通じて感染した細胞から子孫ビリオンの放出を媒介する。酵素的活性の面で、エンドリシンは、通常グルコサミニダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）、ムラミダーゼ（ｍｕｒａｍｉｄａｓｅ）（ｌｙｓｏｚｙｍｅの一種）、トランスグリコシラーゼ（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、アミダーゼ（ａｍｉｄａｓｅ）、エンドペプチダーゼ（ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）などからなる群より選択された一つ以上の活性を有するものであってもよい。
【0045】
本明細書で、ポリヌクレオチド（「遺伝子」と混用することがある）またはポリペプチド（「蛋白質」と混用することがある）が、「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなる」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなるか、これを必須的に含むことを意味することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的する機能を維持する範囲で、特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、変形、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または、変異を排除しないもの）と解釈することができる。
【0046】
本明細書で、本来の機能は、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）（アミノ酸配列の場合）、またはエンドリシン酵素機能を有する蛋白質をコードする機能（核酸配列の場合）であることができ、目的する機能は、シュードモナス属細菌、例えば、シュードモナスエルギノーザに対する抗生物質活性を意味することができる。
【0047】
本明細書で提供されるポリペプチドは、天然由来のものでなくてもよく、組換えまたは化学的に合成されたものであってもよい。ポリペプチドが組換えで生産される場合、精製のために通常のシグナルペプチド、切断部位、ｔａｇなどが結合された形態であってもよい。したがって、非制限的な一例で、本明細書で提供されるポリペプチドは、蛋白質の組換え生産過程に通常使用可能なシグナルペプチド、切断部位、タグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タグ、ＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグなど）などからなる群より選択された一つ以上をさらに含む形態であるか、これらが除去された精製された形態であってもよい。
【0048】
バクテリオファージ
一例は、新規のバクテリオファージを提供する。
一例は、新規のバクテリオファージを提供する。
【0049】
バクテリオファージは、配列番号１の核酸配列を含むか、配列からなるポリヌクレオチド、または、
配列番号１の核酸配列と９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性または同一性を有する核酸配列を含むか、配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。
配列番号１の核酸配列と９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性または同一性を有する核酸配列を含むか、配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。
【0050】
バクテリオファージは、下記で説明する野生型ポリペプチド、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、変異型ポリペプチド、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される１種以上を含むものであってもよい。
【0051】
以下、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドについて詳細に説明する。
【0052】
野生型ポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド
一例は、新規のポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
一例は、新規のポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【0053】
ポリペプチドは、バクテリオファージに由来のものであってもよい。ポリペプチドは、バクテリオファージに由来のエンドリシン活性を有するものであってもよい。ポリペプチドは、分子量が約１９ｋＤａ（１９ｋＤａ±２）であるものであってもよい。一例で、ポリペプチドは、配列番号１の核酸配列を含むバクテリオファージに由来のものであってもよい。ポリペプチドは、グラム陰性菌に対して抗生物質活性を有するものであってもよい。
【0054】
他の例は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列を含むものであってもよい。
【0055】
本明細書で、特に記載されない限り、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてエンドリシン活性を有するポリペプチドは、
（１）配列番号２のアミノ酸配列からなるか、またはこれを必須的に含むポリペプチド、および／または、
（２）配列番号２のアミノ酸配列と９８．８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．６％以上、または９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるか、これを必須的に含み、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）および／またはシュードモナス属細菌、例えば、シュードモナスエルギノーザに対する抗生物質活性を有する（維持する）ポリペプチド、
を意味するものであってもよい。
（１）配列番号２のアミノ酸配列からなるか、またはこれを必須的に含むポリペプチド、および／または、
（２）配列番号２のアミノ酸配列と９８．８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．６％以上、または９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるか、これを必須的に含み、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）および／またはシュードモナス属細菌、例えば、シュードモナスエルギノーザに対する抗生物質活性を有する（維持する）ポリペプチド、
を意味するものであってもよい。
【0056】
また、本明細書で、特に記載されない限り、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたは配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるか、またはこれを必須的に含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と９８．８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．６％以上、または９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるか、これを必須的に含み、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）および／またはシュードモナス属細菌、例えば、シュードモナスエルギノーザに対する抗生物質活性を有する（維持する）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、
（ｃ）配列番号３の核酸配列を含むポリヌクレオチドを意味することができ、
配列番号３の核酸配列を含むポリヌクレオチドは、
（ｄ）配列番号３の核酸配列からなるか、またはこれを必須的に含むポリヌクレオチドを意味するものであってもよい。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるか、またはこれを必須的に含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と９８．８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．６％以上、または９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるか、これを必須的に含み、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）および／またはシュードモナス属細菌、例えば、シュードモナスエルギノーザに対する抗生物質活性を有する（維持する）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、
（ｃ）配列番号３の核酸配列を含むポリヌクレオチドを意味することができ、
配列番号３の核酸配列を含むポリヌクレオチドは、
（ｄ）配列番号３の核酸配列からなるか、またはこれを必須的に含むポリヌクレオチドを意味するものであってもよい。
【0057】
変異型ポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド
一例は、新規の変異型ポリペプチドを提供する。変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドに変異を含む変異型ポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、バクテリオファージに由来のものであってもよい。ポリペプチドは、バクテリオファージに由来のエンドリシン活性を有するものであってもよい。ポリペプチドは、グラム陰性菌に対して抗生物質活性を有するものであってもよい。
一例は、新規の変異型ポリペプチドを提供する。変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドに変異を含む変異型ポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、バクテリオファージに由来のものであってもよい。ポリペプチドは、バクテリオファージに由来のエンドリシン活性を有するものであってもよい。ポリペプチドは、グラム陰性菌に対して抗生物質活性を有するものであってもよい。
【0058】
変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに一つ以上のアミノ酸残基が置換、欠失、または挿入された変異を含む変異型ポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、組換えまたは合成的（例えば、化学的合成）に製造されたものであってもよい。
【0059】
本出願の変異導入の対象となるポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるか、配列番号２のアミノ酸配列を含み、エンドリシン活性を有するものであってもよいが、これに制限されない。つまり、配列番号２のアミノ酸配列の前後への無意味な配列追加または自然に発生し得る変異、あるいは、そのサイレント変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除くのではなく、配列番号２のアミノ酸配列を含む蛋白質と互いに同一または対応する活性を有する場合であれば、本出願の変異導入の対象となる蛋白質に該当できる。例えば、本出願の変異導入の対象となる蛋白質は、配列番号２のアミノ酸配列またはこれと９８．８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．６％以上、または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列で構成される蛋白質であってもよい。また、このような相同性または同一性を有し、蛋白質に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質も、本出願の変異対象となる蛋白質の範囲内に含まれもよい。
【0060】
他の例で、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位、４３位、４５位、７３位、８１位、１０１位、および１１３位からなる群より選択された１種以上（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、または７種全て）の位置に対応するアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換された変異を含む変異型ポリペプチドであってもよい。
【0061】
具体的に、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、下記１）ないし７）の中から選択された１種以上（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、または７種全て）の変異を含む変異型ポリペプチドであってもよい。
１）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
２）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４３位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、ヒスチジン、アルギニン、リシン、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
３）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４５位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
４）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から７３位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、バリン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
５）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から８１位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、セリン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
６）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から１０１位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；および
７）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から１１３位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、バリン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換。
１）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
２）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４３位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、ヒスチジン、アルギニン、リシン、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
３）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４５位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
４）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から７３位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、バリン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
５）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から８１位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、セリン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；
６）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から１０１位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換；および
７）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から１１３位の残基に対応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、バリン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換。
【0062】
一例で、変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基、４３位の残基、４５位の残基、７３位の残基、１０１位の残基、および１１３位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換されたものであってもよい。
【0063】
一例で、変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基、７２位の残基、１０１位の残基、および１１３位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換されたものであってもよい。
【0064】
一例で、変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４３位の残基、および４５位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換された変異を含むものであってもよい。
【0065】
一例で、変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、
（１）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基、７２位の残基、１０１位の残基、および１１３位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換され、
（２）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４３位の残基、４５位の残基、および８１位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、さらに本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換された変異を含むものであってもよい。
（１）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基、７２位の残基、１０１位の残基、および１１３位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換され、
（２）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４３位の残基、４５位の残基、および８１位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、さらに本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換された変異を含むものであってもよい。
【0066】
一例で、変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、
（１）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４３位の残基、および４５位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換され、
（２）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基、７３位の残基、８１位の残基、および１０１位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、さらに本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換された変異を含むものであってもよい。
（１）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４３位の残基、および４５位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換され、
（２）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基、７３位の残基、８１位の残基、および１０１位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、さらに本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換された変異を含むものであってもよい。
【0067】
一例で、変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、
（１）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基、４３位の残基、３５位の残基、７２位の残基、１０１位の残基、および１１３位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換され、
（２）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から８１位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、さらに本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換されたものであってもよい。
（１）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基、４３位の残基、３５位の残基、７２位の残基、１０１位の残基、および１１３位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換され、
（２）配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から８１位の残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸が、さらに本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換されたものであってもよい。
【0068】
一具体例で、変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位の残基に対応するアミノ酸がセリンに、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４３位の残基に対応するアミノ酸がヒスチジンに、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から４５位の残基に対応するアミノ酸がグルタミン酸に、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から７３位の残基に対応するアミノ酸がバリンに、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から８１位の残基に対応するアミノ酸がセリンに、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から１０１位の残基に対応するアミノ酸がアラニンに、および配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から１１３位の残基に対応するアミノ酸がバリンに置換された変異を含むものであってもよい。
【0069】
一具体例で、変異型ポリペプチドは、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むか、配列番号６のアミノ酸配列からなるか、または、
（２）配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．３％以上、９７％以上、９７．７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むか、アミノ酸配列からなるものであってもよい。
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むか、配列番号６のアミノ酸配列からなるか、または、
（２）配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．３％以上、９７％以上、９７．７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むか、アミノ酸配列からなるものであってもよい。
【0070】
変異型ポリペプチドのうち、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位、４３位、４５位、７３位、８１位、１０１位、および１１３位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸を除いた一部のアミノ酸配列が欠失、変形、置換または付加されても、エンドリシン活性を示す限り、本出願の変異型ポリペプチドに含まれ得ることは自明である。
【0071】
例えば、アミノ酸配列Ｎ－末端、Ｃ－末端および／または内部に本出願の変異型ポリペプチドの機能を変更しない配列追加または欠失、自然に発生し得る変異、サイレント変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または保存的置換を有する場合である。
【0072】
「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、あるアミノ酸を類似の構造的および／または化学的性質を有するまた他のアミノ酸に置換させることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）での類似性に基づいて生じ得る。通常、保存的置換は、蛋白質またはポリペプチドの活性にほとんど影響を与えない場合もあれば、影響を与えない場合もある。
【0073】
つまり、本出願の変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位、４３位、４５位、７３位、８１位、１０１位、および１１３位からなる群より選択された１種以上（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、または７種全て）の位置に対応するアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換され、配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．３％以上、９７％以上、９７．７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を有するか、含むか、または配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．３％以上、９７％以上、９７．７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上のアミノ酸配列からなるか、必須的に構成されてもよいがが、これに制限されるものではない。
【0074】
また一例で、本出願の変異型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と９８．８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．６％以上、または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列で、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位、４３位、４５位、７３位、８１位、１０１位、および１１３位からなる群より選択された１種以上（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、または７種全て）の位置に対応するアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換された配列を有するか、含むか、または、
配列番号２のアミノ酸配列と９８．８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．６％以上、または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列で、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位、４３位、４５位、７３位、８１位、１０１位、および１１３位からなる群より選択された１種以上（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、または７種全て）の位置に対応するアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換された配列からなるか、必須的に構成されてもよいがが、これに制限されるものではない。
配列番号２のアミノ酸配列と９８．８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．６％以上、または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列で、配列番号２のアミノ酸配列のＮ－末端から３９位、４３位、４５位、７３位、８１位、１０１位、および１１３位からなる群より選択された１種以上（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、または７種全て）の位置に対応するアミノ酸が、本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換された配列からなるか、必須的に構成されてもよいがが、これに制限されるものではない。
【0075】
一例で、変異型ポリペプチドは、
（１）配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはアミノ酸配列からなるか、または、
（２）配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．３％以上、９７％以上、９７．７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはアミノ酸配列からなるものであってもよい。
（１）配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはアミノ酸配列からなるか、または、
（２）配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．３％以上、９７％以上、９７．７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【0076】
他の例は、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0077】
ポリヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列を含むものであってもよい。
【0078】
本明細書で、特に記載されない限り、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むまたは配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列からなるか、またはこれを必須的に含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、
（ｂ）配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列と９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるか、これを必須的に含み、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）および／またはシュードモナス属細菌、例えば、シュードモナスエルギノーザに対する抗生物質活性を有する（維持する）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、
（ｃ）配列番号１２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを意味することができ、
配列番号１２の核酸配列を含むポリヌクレオチドは、
（ｄ）配列番号１２の核酸配列からなるか、またはこれを必須的に含むポリヌクレオチドを意味するものであってもよい。
（ａ）配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列からなるか、またはこれを必須的に含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、
（ｂ）配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列と９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるか、これを必須的に含み、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）および／またはシュードモナス属細菌、例えば、シュードモナスエルギノーザに対する抗生物質活性を有する（維持する）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、
（ｃ）配列番号１２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを意味することができ、
配列番号１２の核酸配列を含むポリヌクレオチドは、
（ｄ）配列番号１２の核酸配列からなるか、またはこれを必須的に含むポリヌクレオチドを意味するものであってもよい。
【0079】
融合ポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド
他の例は、新規の融合ポリペプチドを提供する。融合ポリペプチドは、野生型ポリペプチドまたは変異型ポリペプチド（以下、「野生型または変異型ポリペプチド」と記載する）、およびセクロピンＡ（セクロピンセクロピンＡ）を含むものであってもよい。セクロピンＡは、蛾（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａ）に由来のものであってもよく、例えば、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含むか、アミノ酸配列からなるものであってもよい。ポリペプチドは、グラム陰性菌に対して抗生物質活性を有するものであってもよい。
他の例は、新規の融合ポリペプチドを提供する。融合ポリペプチドは、野生型ポリペプチドまたは変異型ポリペプチド（以下、「野生型または変異型ポリペプチド」と記載する）、およびセクロピンＡ（セクロピンセクロピンＡ）を含むものであってもよい。セクロピンＡは、蛾（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａ）に由来のものであってもよく、例えば、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含むか、アミノ酸配列からなるものであってもよい。ポリペプチドは、グラム陰性菌に対して抗生物質活性を有するものであってもよい。
【0080】
一例で、融合ポリペプチドは、
野生型ポリペプチドまたは変異型ポリペプチド、および
セクロピンＡをさらに含むものであってもよい。
野生型ポリペプチドまたは変異型ポリペプチド、および
セクロピンＡをさらに含むものであってもよい。
【0081】
融合ポリペプチドにおけるセクロピンＡ（例えば、配列番号８または配列番号９）および野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド）は、順序に関係なく連結されたものであってもよい。つまり、融合ポリペプチドにおいて、セクロピンＡと野生型または変異型ポリペプチドは、Ｎ－末端から、セクロピンＡおよびポリペプチドの順序またはポリペプチドおよびセクロピンＡの順序に連結されたものであってもよく、例えば、セクロピンＡおよびポリペプチドの順序に連結されたものであってもよい。
【0082】
また、セクロピンＡ（セクロピンＡ）（例えば、配列番号８または配列番号９）およびポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７）は、ペプチドリンカーを通じて連結されるか、リンカーなしに直接連結されたものであってもよい。
【0083】
一例で、融合ポリペプチドは、
（１）配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたはアミノ酸配列からなるか、または、
（２）配列番号１０のアミノ酸配列と９６％以上、９６．３％以上、９７％以上、９７．７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはアミノ酸配列からなるものであってもよい。
（１）配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたはアミノ酸配列からなるか、または、
（２）配列番号１０のアミノ酸配列と９６％以上、９６．３％以上、９７％以上、９７．７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【0084】
融合ポリペプチドは、ポリペプチドまたはセクロピンＡと比較して、グラム陰性菌に対して優れた抗生物質活性および／または優れた細胞外膜透過（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）活性を有するものであってもよい。融合ポリペプチド、ポリペプチドまたはセクロピンＡは、組換えまたは合成的（例えば、化学的合成）に製造されたものであってもよい。
【0085】
本明細書で提供される融合ポリペプチドにおいて、セクロピンＡとポリペプチドとは、ペプチドリンカーを通じて連結されるか、ペプチドリンカーなしに直接連結されたものであってもよい。ペプチドリンカーは、１ないし１００個、２ないし５０個、１ないし３０個、２ないし２０個、または２ないし１０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであってもよく、その含まれるアミノ酸種類には制限がない。ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群より選択された１種以上のアミノ酸残基をそれぞれ一つ以上含んでもよい。ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は当業界に公知されている。一方、リンカーは、融合蛋白質の構造および／または機能に影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定することができる。例えば、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群より選択された１種以上を合計１ないし１００個、２ないし５０個、１ないし３０個、２ないし２０個、または２ないし１０個を含んで構成されたものであってもよい。一例で、ペプチドリンカーは、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号１２）、（Ｇ）４～１０（例、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧＧ、など）、（ＧＧＧＧＳ）１～５（例、（ＧＧＧＧＳ）１、など）、（ＥＡＡＡＫ）１～５（例、（ＥＡＡＡＫ）３、（ＥＡＡＡＫ）５、など）、（ＥＡＡＡＫ）４（ＧＧＧＧＳ）１等で表されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0086】
他の例は、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0087】
ポリヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列を含むものであってもよい。
【0088】
他の例は、野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号３、配列番号１２、または配列番号１３）を提供する。
【0089】
組換えベクターおよび組換え細胞
他の例は、先に説明した野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド）または、先に説明した融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。組換えベクターは、発現ベクターとして用いることができる。
他の例は、先に説明した野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド）または、先に説明した融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。組換えベクターは、発現ベクターとして用いることができる。
【0090】
他の例は、野生型または変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを適した宿主細胞で発現させるステップを含む、野生型または変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの製造方法を提供する。野生型または変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを適した宿主細胞で発現させるステップは、ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターを含む組換え細胞を培養することによって行うことができる。
【0091】
エンドリシンの製造方法は、発現させるステップ以降に、発現したエンドリシンを分離および／または精製するステップをさらに含んでもよい。
【0092】
ポリヌクレオチドまたはベクターの宿主細胞への導入は、公知された形質転換方法を当業者が適切に選んで行うことができる。本明細書で、用語「形質転換」は、ポリペプチド（野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチド、以下、同一である。）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内でポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現しさえすれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するかまたは染色体外に位置するかにかかわず、これらをいずれも含んでもよい。ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、その導入される形態には制限がない。例えば、ポリヌクレオチドは自体的に発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。発現カセットは、通常ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位および／または翻訳終結信号などの発現調節要素を含んでもよい。発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクター形態であってもよい。また、ポリヌクレオチドは、その自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。で用語「作動可能に連結」されたものとは、ポリヌクレオチドの転写調節（例、転写開始）を行うことができるように、発現調節要素（例、プロモーター）とポリヌクレオチドとが機能的に連結されていることを意味することができる。作動可能な連結は、当業界の公知された遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。
【0093】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に形質転換する方法は、核酸を細胞（微生物）内に導入するいかなる方法でも行うことができ、宿主細胞によって当分野において公知された形質転換技術を適切に選んで行うことができる。公知された形質転換方法として、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱法、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これに制限されるものではない。
【0094】
本明細書で、用語「ベクター」は、適した宿主内で目的蛋白質を発現できるように適した調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ構造体を意味する。調節配列は、転写を開始できるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および／または解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは適した宿主細胞内に形質転換された後、宿主細胞のゲノム（遺伝体）と無関係に発現するか、宿主細胞のゲノム内に統合することができる。
【0095】
本明細書で使用可能なベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、通常使用される全てのベクターの中から選択されてもよい。通常使用されるベクターの例としては、天然状態であるか組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージなどが挙げられる。例えば、ベクターとして、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどが挙げられるが、これに制限されない。
【0096】
ベクターは、染色体内の挿入有無を確認するための選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターに形質転換された細胞を選別、つまり、ポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのものであって、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面蛋白質の発現のような選択可能表現型を与える遺伝子の中から選択されて用いられてもよい。選択試薬（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選択マーカーを発現する細胞だけ生存するか他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。
【0097】
抗生剤
他の例は、
野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７）または融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）、
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、抗生剤を提供する。
他の例は、
野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７）または融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）、
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、抗生剤を提供する。
【0098】
他の例は、野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチド、
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上をグラム陰性菌に対する抗生（例えば、グラム陰性菌の成長（または、生長）の阻害（または、抑制）、グラム陰性菌の殺菌、防除など）に用いるための用途を提供する。
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上をグラム陰性菌に対する抗生（例えば、グラム陰性菌の成長（または、生長）の阻害（または、抑制）、グラム陰性菌の殺菌、防除など）に用いるための用途を提供する。
【0099】
他の例は、野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチド、
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上の有効量をグラム陰性菌に対する抗生（または、グラム陰性菌の殺菌、防除など）を必要とする対象に適用（または、投与）するステップを含む、グラム陰性菌の殺菌方法（または、防除方法、成長阻害方法）を提供する。
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上の有効量をグラム陰性菌に対する抗生（または、グラム陰性菌の殺菌、防除など）を必要とする対象に適用（または、投与）するステップを含む、グラム陰性菌の殺菌方法（または、防除方法、成長阻害方法）を提供する。
【0100】
他の例は、野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を抗生剤製造に用いるための用途を提供する。
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を抗生剤製造に用いるための用途を提供する。
【0101】
抗生剤は、グラム陰性菌に対して抗生効果を有するものであってもよい。
【0102】
グラム陰性菌は、シュードモナス属細菌、アシネトバクター属細菌、エスケリキア属細菌、エンテロバクター属細菌、クレブシエラ属細菌などからなる群より選択された１種以上（例えば、１種、２種、３種、４種、または５種）であってもよい。
【0103】
例えば、シュードモナス属細菌は、シュードモナスエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であってもよく、アシネトバクター属細菌は、アシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）であってもよく、エスケリキア属細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であってもよく、エンテロバクター属細菌は、エンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ；または、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓとも知られている）またはエンテロバクタークロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）であってもよく、クレブシエラ属細菌は、クレブシエラニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0104】
一例で、大腸菌は、接着浸潤性大腸菌（または大腸菌ＡＩＥＣ（Ａｄｈｅｒｅｎｔ－ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株）、大腸菌ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）菌株、大腸菌ＵＰＥＣ（Ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株、大腸菌ＣＣＡＲＭ（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｉｃｒｏｂｅｓ）菌株、大腸菌ＦＯＲＣ８１菌株（コリスチン耐性大腸菌）、または大腸菌Ｃｌｉｎｉｃａｌ菌株であってもよいが、これに制限されるものではない。一例で、大腸菌は、ＡＴＣＣ ８７３９、ＡＴＣＣ ２５９２２、ＡＴＣＣ ５１７３９、ＣＣＡＲＭ １Ａ７４６、ＣＣＡＲＭ １Ｇ４９０、Ｆ４８５、Ｆ５２４、Ｆ５７６、Ｆ７１６、Ｆ８５２、ＦＯＲＣ８１、ＵＰＥＣ９０、ＵＰＥＣ３０３８、ＵＰＥＣ３０４２、ＵＰＥＣ３０５１、ＵＰＥＣ ３１５０、ＵＰＥＣ３１５１、ＵＰＥＣ３１６３、ＵＰＥＣ３１６４、ＵＰＥＣ３１６８、ＵＰＥＣ３１８１、ＥＣＯＲ１、ＥＣＯＲ２、ＥＣＯＲ９、ＥＣＯＲ１５、ＥＣＯＲ３５、ＥＣＯＲ３６、ＥＣＯＲ４３、ＥＣＯＲ４５、ＥＣＯＲ５２、およびＥＣＯＲ６９等からなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0105】
一例で、アシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）は、ＡＴＣＣ １９６０６、ＡＴＣＣ １７９７８、ＣＣＡＲＭ １２００１、Ｆ４、Ｆ６５、Ｆ６６、およびＦ６７等からなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0106】
一例で、シュードモナスエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、ＰＡ０１、ＡＴＣＣ １５５２２、Ｆ１０２、Ｆ１２５、Ｆ１４１、Ｆ１７１、およびＦ３８８等からなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0107】
一例で、エンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ；または、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓとも知られている）は、ＣＣＡＲＭ １６００６、ＣＣＡＲＭ １６００８、ＣＣＡＲＭ １６０１０、およびＦ２７６等からなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0108】
一例で、エンテロバクタークロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）は、ＡＴＣＣ １３０４７、ＣＣＡＲＭ ０２５２、およびＣＣＡＲＭ １６００３等からなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0109】
本明細書で提供される抗生剤は、先に説明した野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７）または融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）、野生型または変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上（以下、第１抗生剤）に加え、他の抗生剤（第２抗生剤）をさらに含むものであってもよい。
【0110】
第２抗生剤は、通常使用される抗生剤、例えば、グラム陰性菌に対して抗生物質活性を有する抗生剤の中から選択された１種以上であってもよい。一例で、第２抗生剤は、ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ）系抗生剤、セフタジジム（セフタジジム）、メロペネム（ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）、カナマイシン（カナマイシン）、チゲサイクリン（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、アジスロマイシン（ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、シプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、またはこれらから選択された１種以上の組み合わせであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0111】
一例で、第２抗生剤は、ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ）系抗生剤であってもよく、例えば、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）、コリスチン（コリスチン）、またはその組み合わせであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0112】
このように、抗生剤（第１抗生剤）を他の抗生剤（第２抗生剤）と共に併用することによって、第１抗生剤自体の抗生効果による上昇効果および低い濃度の第２抗生剤としても優れた抗生効果を発揮できるようにする利点を有する。これによって、高濃度の抗生剤使用による毒性（例えば、腎臓毒性、肝臓毒性など）等の副作用を減少させることができる。また、他の機序の抗生剤併用による抗生剤耐性菌の出現を抑制することができる。
【0113】
よって、一例は、
野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７）または融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）、野生型または変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上（以下、第１抗生剤）；および
（ｂ）第２抗生剤
を含む併用抗生剤を提供する。
野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７）または融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）、野生型または変異型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上（以下、第１抗生剤）；および
（ｂ）第２抗生剤
を含む併用抗生剤を提供する。
【0114】
本明細書で、用語「抗生剤」は、グラム陰性菌に対して成長阻害能および／または死滅能を有する全ての形態の製剤を包括するものであって、特別な言及がない限り、抗菌剤、防腐剤、殺菌剤などと互換的に使用することができる。
【0115】
一例で、第１抗生剤および第２抗生剤が組合わせて用いられる場合の組合比は、第２抗生剤の濃度（μｇ／ｍｌ）を１にするとき、第１抗生剤を０．０１ないし１０２４μｇ／ｍｌ、０．０１ないし５１２μｇ／ｍｌ、０．０１ないし１２８μｇ／ｍｌ、０．０１ないし１６μｇ／ｍｌ、０．０１ないし１μｇ／ｍｌ、０．０３１２５ないし１０２４μｇ／ｍｌ、０．０３１２５ないし５１２μｇ／ｍｌ、０．０３１２５ないし１２８μｇ／ｍｌ、０．０３１２５ないし１６μｇ／ｍｌ、０．０３１２５ないし１μｇ／ｍｌ、０．５ないし１０２４μｇ／ｍｌ、０．５ないし５１２μｇ／ｍｌ、０．５ないし１２８μｇ／ｍｌ、０．５ないし１６μｇ／ｍｌ、０．５ないし１μｇ／ｍｌ、１ないし１０２４μｇ／ｍｌ、１ないし５１２μｇ／ｍｌ、１ないし２５６μｇ／ｍｌ、１ないし１２８μｇ／、１ないし６４μｇ／ｍｌ、１ないし３２μｇ／ｍｌ、１ないし１６μｇ／ｍｌ、１ないし８μｇ／ｍｌ、１ないし４μｇ／ｍｌ、１ないし２μｇ／ｍｌ、２ないし１０２４μｇ／ｍｌ、２ないし５１２μｇ／ｍｌ、２ないし２５６μｇ／ｍｌ、２ないし１２８μｇ／ｍｌ、２ないし６４μｇ／ｍｌ、２ないし３２μｇ／ｍｌ、２ないし１６μｇ／ｍｌ、２ないし８μｇ／ｍｌ、２ないし４μｇ／ｍｌ、４ないし１０２４μｇ／ｍｌ、４ないし５１２μｇ／ｍｌ、４ないし２５６μｇ／ｍｌ、４ないし１２８μｇ／ｍｌ、４ないし６４μｇ／ｍｌ、４ないし３２μｇ／ｍｌ、４ないし１６μｇ／ｍｌ、４ないし８μｇ／ｍｌ、８ないし１０２４μｇ／ｍｌ、８ないし５１２μｇ／ｍｌ、８ないし２５６μｇ／ｍｌ、８ないし１２８μｇ／ｍｌ、ないし６４μｇ／ｍｌ、８ないし３２μｇ／ｍｌ、８ないし１６μｇ／ｍｌ、１６ないし１０２４μｇ／ｍｌ、１６ないし５１２μｇ／ｍｌ、１６ないし２５６μｇ／ｍｌ、１６ないし１２８μｇ／ｍｌ、１６ないし６４μｇ／ｍｌ、１６ないし３２μｇ／ｍｌ、３２ないし１０２４μｇ／ｍｌ、３２ないし５１２μｇ／ｍｌ、３２ないし２５６μｇ／ｍｌ、３２ないし１２８μｇ／ｍｌ、３２ないし６４μｇ／ｍｌ、６４ないし１０２４μｇ／ｍｌ、６４ないし５１２μｇ／ｍｌ、６４ないし２５６μｇ／ｍｌ、６４ないし１２８μｇ／ｍｌ、１２８ないし１０２４μｇ／ｍｌ、１２８ないし５１２μｇ／ｍｌ、１２８ないし２５６μｇ／ｍｌ、２５６ないし１０２４μｇ／ｍｌ、２５６ないし５１２μｇ／ｍｌ、または５１２ないし１０２４μｇ／ｍｌの比率で組み合わせて用いてもよいが、これに制限されるものではない。
【0116】
医薬組成物
他の例は、野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７）または融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）、
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、
グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防および／または治療用医薬組成物を提供する。
他の例は、野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７）または融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）、
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、
グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防および／または治療用医薬組成物を提供する。
【0117】
他の例は、野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上をグラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防および／または治療に用いるための用途を提供する。
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上をグラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防および／または治療に用いるための用途を提供する。
【0118】
他の例は、野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上をグラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防および／または治療用組成物の製造に用いるための用途を提供する。
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上をグラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防および／または治療用組成物の製造に用いるための用途を提供する。
【0119】
他の例は、抗生剤または併用抗生剤を有効性分として含む、グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防および／または治療用医薬組成物を提供する。
【0120】
他の例は、抗生剤または併用抗生剤の薬学的有効量をグラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防および／または治療を必要とする対象に投与するステップを含む、グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防または治療方法を提供する。予防または治療方法は、投与するステップ以前に、グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって誘発される病気の予防または治療を必要とする対象を確認するステップをさらに含んでもよい。グラム陰性菌は前述の通りである。
【0121】
グラム陰性菌によって誘発される病気は、グラム陰性菌の感染が原因になる全ての病気の中から選択されてもよく、例えば、皮膚感染、床擦れ、肺炎、菌血症、敗血症、心内膜炎、髄膜炎、外耳炎、中耳炎、角膜炎、骨髄炎、腸炎、腹膜炎、嚢胞性線維症などのようなシュードモナス属細菌によって誘発される病気；皮膚感染、肺炎、菌血症、敗血症などのようなアシネトバクター属細菌によって誘発される病気；腸炎、クローン病、潰瘍性大膓炎、細菌性赤痢、尿道感染症、皮膚感染、菌血症、敗血症などのようなエスケリキア属細菌によって誘発される病気などからなる群より選択されてもよいが、これに制限されるものではない。
【0122】
本明細書で用いられているように、薬学的有効量は、所望する効果が得られる有効成分の含有量または投与量を意味する。医薬組成物内の有効成分の含有量または投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年令、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方することができる。例えば、有効成分がポリペプチドの場合、１回投与量は、０．００１ないし１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０１ないし１００ｍｇ／ｋｇ、０．０１ないし５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ないし２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ないし１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ないし５ｍｇ／ｋｇ、０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ないし５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇ、０．１ないし１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ないし５ｍｇ／ｋｇ、１ないし１００ｍｇ／ｋｇ、１ないし５０ｍｇ／ｋｇ、１ないし２０ｍｇ／ｋｇ、１ないし１０ｍｇ／ｋｇ、または１ないし５ｍｇ／ｋｇ範囲であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0123】
他の例で、薬学組成内の耐有効成分の含有量は、全体医薬組成物重量を基準に、０．０１重量％ないし９９．９重量％、０．０１重量％ないし９０重量％、０．０１重量％ないし８０重量％、０．０１重量％ないし７０重量％、０．０１重量％ないし６０重量％、０．０１重量％ないし５０重量％、０．０１重量％ないし４０重量％、０．０１重量％ないし３０重量％、１重量％ないし９９．９重量％、１重量％ないし９０重量％、１重量％ないし８０重量％、１重量％ないし７０重量％、１重量％ないし６０重量％、１重量％ないし５０重量％、１重量％ないし４０重量％、１重量％ないし３０重量％、５重量％ないし９９．９重量％、５重量％ないし９０重量％、５重量％ないし８０重量％、５重量％ないし７０重量％、５重量％ないし６０重量％、５重量％ないし５０重量％、５重量％４０重量％、５重量％ないし３０重量％、１０重量％ないし９９．９重量％、１０重量％ないし９０重量％、１０重量％ないし８０重量％、１０重量％ないし７０重量％、１０重量％ないし６０重量％、１０重量％ないし５０重量％、１０重量％ないし４０重量％、または１０重量％ないし３０重量％であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0124】
また、医薬組成物は、有効成分以外に、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。薬学的に許容可能な担体は、蛋白質、核酸、または細胞を含む薬物の製剤化に通常用いられるものであって、生物体を刺激せず有効成分の生物学的活性および／または特性を阻害しない担体を意味することができる。一例で、担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるのではない。医薬組成物はまた、医薬組成物の製造に通常用いられる希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択された１種以上をさらに含んでもよい。
【0125】
医薬組成物の投与対象は、ヒト、猿などの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類、犬、猫、豚、牛、馬、羊、ヤギ、などの家畜類、鶏、鴨、ガチョウ、キジ、ウズラ、七面鳥などの家禽類などを含む哺乳類から選択された１種以上、またはこれらに由来の細胞、組織、またはこれらの培養物であってもよい。
【0126】
医薬組成物は、経口投与または非経口的投与によって投与されるか、細胞、組織、または体液に接触させることによって投与されるものであってもよい。具体的に、非経口投与である場合には、皮下注入、筋肉注入、静脈内注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時に、蛋白質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化しれなければならない。鼻内投与時に、医薬組成物を希釈して噴霧器や噴霧システムを通じて鼻腔から吸収されるようにする鼻腔噴霧を通じて投与することができ、鼻腔噴霧のための鼻腔噴霧剤または呼吸器用剤形にはエアゾール剤などが挙げられる。
【0127】
また、医薬組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、注射剤、懸濁液、シロップ剤、乳化液形態、塗布剤、パッチ、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、エアゾール剤などの形態に剤形化してもよく、剤形化のために分散剤または安定化剤をさらに含んでもよい。
【0128】
他の例は、野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７）または融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）、
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、
飼料添加剤を提供する。
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、
飼料添加剤を提供する。
【0129】
他の例は、抗生剤または併用抗生剤を有効性分として含む、飼料添加剤を提供する。
【0130】
他の例は、飼料添加用組成物を含む飼料を提供する。
【0131】
飼料は、抗生剤または併用抗生剤を飼料添加剤形態に別途に製造して飼料に混合するか、飼料製造時に直接添加して製造することができる。
【0132】
飼料内の抗生剤または併用抗生剤は、液状または乾燥状態であってもよく、例えば、乾燥された粉末形態であってもよい。抗生剤は、全体飼料重量の０．００５ないし１０重量％、０．０５ないし１０重量％、０．１ないし１０重量％、０．００５ないし５重量％、０．０５ないし５重量％、０．１ないし５重量％、０．００５ないし２重量％、０．０５ないし２重量％、または０．１ないし２重量％の量で含まれてもよいが、これに制限されるものではない。また、飼料は、抗生剤または併用抗生剤以外に飼料の保存性を高めることができる通常の添加剤をさらに含んでもよい。
【0133】
本明細書で、抗生剤または併用抗生剤が添加できる飼料は、市販の飼料、または穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、デンプン類、ヒョウタン類、穀物副産物類、蛋白質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、単細胞蛋白質、動物性プランクトン類、残った飲食物などからなる群より選択されてもよいが、これに制限されるものではない。
【0134】
他の例は、抗生剤または併用抗生剤を有効性分として含む食品添加剤または飲用水添加剤を提供する。抗生剤または併用抗生剤を飲用水に混合して供給することによって、飲用水内のグラム陰性菌の数字を減少させることができる。グラム陰性菌は、前述の通りである。
【0135】
他の例は、野生型または変異型ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号６、または配列番号７）または融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１１）、
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、
消毒剤を提供する。
野生型または変異型ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
およびポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞、
からなる群より選択された１種以上を含む、
消毒剤を提供する。
【0136】
他の例は、抗生剤または併用抗生剤を有効性分として含む、消毒剤を提供する。
【0137】
他の例は、抗生剤または併用抗生剤を消毒が必要な対象に適用するステップを含む、消毒方法を提供する。消毒剤は、病原菌感染を防止するために製剤を総称するものであって、一般生活消毒剤、食品および調理場所および設備の消毒剤、養鶏場、畜舎などの建物、畜体、飲水、敷き藁、卵座、運搬車量、食器などの各種生育用品の消毒などに用いられてもよい。
【0138】
他の例は、抗生剤または併用抗生剤を有効性分として含む洗浄剤を提供する。他の例は、抗生剤または併用抗生剤を洗浄が必要な対象に適用するステップを含む、洗浄方法を提供する。抗生剤が、グラム陰性菌に対して抗生効果を有するので、グラム陰性菌に露出されるか露出される可能性がある個体の皮膚表面または身体の各部位などを洗浄する用途に適用することができる。グラム陰性菌は、前述の通りである。
【実施例】
【0139】
以下、実施例を通じて本発明を詳細に説明する。
【0140】
下記の実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明を制限するものと解釈されない。
【0141】
材料および方法
製造例１．バクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２の分離およびＥＣ３４０エンドリシンの精製
１．１．菌株の培養条件
大腸菌（ＡＴＣＣ ８７３９）を宿主として用いており、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で３７℃条件で振盪培養した。
製造例１．バクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２の分離およびＥＣ３４０エンドリシンの精製
１．１．菌株の培養条件
大腸菌（ＡＴＣＣ ８７３９）を宿主として用いており、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で３７℃条件で振盪培養した。
【0142】
１．２．バクテリオファージの分離
大腸菌に感染するバクテリオファージを選別するために、大韓民国京畿道果川市の果川下水処理場でサンプルを採取した。採取したサンプルと大腸菌を３７℃で３時間振盪培養した後、５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄み液を回収した。次いで、上澄み液を０．４５μｍフィルターでろ過した後、二重寒天層プラーク分析法（ｄｏｕｂｌｅ ａｇａｒ ｌａｙｅｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を行った。
大腸菌に感染するバクテリオファージを選別するために、大韓民国京畿道果川市の果川下水処理場でサンプルを採取した。採取したサンプルと大腸菌を３７℃で３時間振盪培養した後、５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄み液を回収した。次いで、上澄み液を０．４５μｍフィルターでろ過した後、二重寒天層プラーク分析法（ｄｏｕｂｌｅ ａｇａｒ ｌａｙｅｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を行った。
【0143】
分析法を簡略に説明すると、上層（ｔｏｐ）アガー５ｍｌに宿主バクテリア大腸菌とバクテリオファージの培養液を０．１Ｍ．Ｏ．Ｉ．で混合して寒天プレートに注ぎ、３７℃で２４時間培養し、プラークを得た。過程を繰り返し行うことによって精製された純粋なバクテリオファージを確保することができ、このバクテリオファージを、バクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２と命名した。
【0144】
１．３．バクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２のゲノム分離および分析
製造例１．２．で確保されたバクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２のゲノムに対する配列分析を実施した。２００ｍｌのＬＢ培地に大腸菌をＯＤ６００＝０．５まで培養した後、ここにろ過したバクテリオファージ１０９ｐｆｕ／ｍｌまたは０．１ Ｍ．Ｏ．Ｉ．に感染させて溶菌した。以降、ここに塩化ナトリウムを最終濃度１Ｍになるように追加した後、４℃で１時間放置した。次いで、１１，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、沈殿物にＰＥＧ（ポリエチレングリコール８０００）を１０％（ｗ／ｖ）に入れ、４℃で１時間放置した。次いで、１１，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、沈殿物をＳＭ緩衝液[１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４（七水和物）、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５]で懸濁した。ここにクロロホルムを１：１の比率で入れてボルテックスした後、３，０００×ｇで１５分間遠心分離して上澄み液を得た。
製造例１．２．で確保されたバクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２のゲノムに対する配列分析を実施した。２００ｍｌのＬＢ培地に大腸菌をＯＤ６００＝０．５まで培養した後、ここにろ過したバクテリオファージ１０９ｐｆｕ／ｍｌまたは０．１ Ｍ．Ｏ．Ｉ．に感染させて溶菌した。以降、ここに塩化ナトリウムを最終濃度１Ｍになるように追加した後、４℃で１時間放置した。次いで、１１，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、沈殿物にＰＥＧ（ポリエチレングリコール８０００）を１０％（ｗ／ｖ）に入れ、４℃で１時間放置した。次いで、１１，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、沈殿物をＳＭ緩衝液[１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４（七水和物）、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５]で懸濁した。ここにクロロホルムを１：１の比率で入れてボルテックスした後、３，０００×ｇで１５分間遠心分離して上澄み液を得た。
【0145】
ポリカーボネート試験管に４０％（ｗ／ｖ）グリセロール３ｍｌを入れ、次いで５％（ｗ／ｖ）グリセロール４ｍｌを混ざらないように入れた。ここに用意した上澄み液を入れ、４℃で１１，０００×ｇで１時間遠心分離した。次いで、上澄み液を除去した後、沈殿物をＳＭ緩衝液で再懸濁してバクテリオファージゲノムＤＮＡを得た。バクテリオファージゲノムＤＮＡは、ｐｈａｇｅ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ ｂｉｏｔｅｋ ｃｏｒｐ．）を製造会社マニュアルに従って用いて分離した。のように分離されたゲノム試料を用いてゲノムに対する塩基配列を分析した（Ｌ．Ａ．Ｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍ）。
【0146】
最終的に分析されたバクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２ゲノムは、全体核酸配列長さが４２、７５１ｂｐである。バクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２ゲノムの全長核酸配列を配列番号１に示した。ゲノム核酸配列情報に基づいてＷｅｂ上のＢＬＡＳＴを用いて既に知られたバクテリオファージゲノム配列との類似性（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を調査した。ＢＬＡＳＴ調査結果、バクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２のゲノム配列は、エスケリキアバクテリオファージｖＢ_ＥｃｏＳ－Ｇｏｌｅｓｔａｎ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＣ_０４２０８４．１）とｑｕｅｒｙ ｃｏｖｅｒａｇｅ：８０％、ｉｄｅｎｔｉｔｙ：９３．４５％の配列相同性を有するものと確認された。このような事実に基づいてバクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２は、既に知らされない新たなバクテリオファージであることを確認した。
【0147】
１．４．ＥＣ３４０Ｍエンドリシンのクローニングおよび精製
分析されたバクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２のゲノム配列（配列番号１）に対するＯＲＦ ｓｅａｒｃｈを通じて、４８９ｂｐ（配列番号３）のＯＲＦがエンドリシン遺伝子であるものと推定して、バクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２由来のエンドリシンおよびこれをコードする遺伝子をそれぞれＥＣ３４０エンドリシンおよびＥＣ３４０遺伝子と命名した。
分析されたバクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２のゲノム配列（配列番号１）に対するＯＲＦ ｓｅａｒｃｈを通じて、４８９ｂｐ（配列番号３）のＯＲＦがエンドリシン遺伝子であるものと推定して、バクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２由来のエンドリシンおよびこれをコードする遺伝子をそれぞれＥＣ３４０エンドリシンおよびＥＣ３４０遺伝子と命名した。
【0148】
プライマー（Ｆ：５'－ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣＧＡＡＡＣＡＴタグＣＡＡＣＡＡＴＧＧＣ－３’（配列番号４）、Ｒ：５’－ＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＧＣＧＣＣ－３'（配列番号５））を用いて、バクテリオファージＥＣ３４０－Ｍ－１１－１２のゲノムに対してＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行って、ＥＣ３４０遺伝子（配列番号１内の４８９ｂｐの長さの核酸配列）を得た。ＥＣ３４０遺伝子によって暗号化されるＥＣ３４０エンドリシンのアミノ酸配列を配列番号２（１６２ａａ）に示した。ＰＣＲは、次の条件で行った：ステップ１：９４℃、５分； ステップ２：９４℃、３０秒； ステップ３：５２℃、４５秒； ステップ４：７２℃、１分； ステップ５：ステップ２～４を３０回繰り返し； ステップ６：７２℃、１０分。得られたＰＣＲ産物をＮ末端 ６ＸＨｉｓ－タグを有するｐＥＴ－２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングして、ＥＣ３４０エンドリシン発現のための発現ベクター（ｐＥＴ－ＥＣ３４０プラスミド）を用意した。用意された発現ベクターｐＥＴ－ＥＣ３４０を、図１に模式的に示した。
【0149】
用意されたｐＥＴ－ＥＣ３４０ ｐｌａｓｍｉｄを大腸菌ＢＬ２１－ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した後、液体ＬＢ培地（１％のトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）で、ＯＤ６００＝０．５まで培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加した後、３７℃で４時間振盪培養した。細胞を回収後、溶解バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）で再懸濁し、１ｍのＭＰＭＳＦおよび１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを入れ、氷で３０分間静置した。超音波で細胞を溶解し、１３，０００ｒｐｍで４０分遠心分離して上澄み液を得た。これをＮｉ－ＮＴＡアガロースレジン（Ｑｉａｇｅｎ）がパックされたカラムに通過させた。その後、洗浄バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのイミダゾール）で洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール）で溶出して、ＥＣ３４０蛋白質（６ｘＨｉｓタグを含む）を精製した。
【0150】
１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥでＥＣ３４０蛋白質の純度を確認し、ＢｒａｄｆｏｒｄアッセイでＥＣ３４０蛋白質の濃度を測定した。精製過程中に得られたそれぞれの反応物をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて確認した結果を図２に示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて確認した精製したＥＣ３４０蛋白質の分子量は、約１９ｋＤａであった。
【0151】
製造例２．バクテリア菌株および培養条件
本研究に用いられた菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ、Ｋｏｒｅａ）およびＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ（ＣＣＲＭ、Ｋｏｒｅａ）から入手した。Ｆ菌株と尿路病原性（ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）大腸菌（ＵＰＥＣ）菌株は臨床的に分離しており、ゴ・グァンス（成均館大学校医科大学）教授から提供された。付着性侵襲性大腸菌（Ａｄｈｅｒｅｎｔ ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＩＥＣ））収集（ＥＣＯＲ）菌株は、Ｃｈｒｉｓｔｅｌ Ｎｅｕｔ教授から提供された（Ｒａｈｍｏｕｎｉ ｅｔ ａｌ．、２０１８）。ＭＣＲ－１陽性Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＯＲＣ８１菌株は、リュ・サンリョル教授（ソウル大学校）から提供された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、２０１９）。この作業に用いられた全ての菌株は、ＬＢ（ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ）またはＣＡＡ培地（５ｇ／ｌのカザミノ酸、５．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４および１ｍＭのＭｇＳＯ４）で３７℃で成長させた。
本研究に用いられた菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ、Ｋｏｒｅａ）およびＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ（ＣＣＲＭ、Ｋｏｒｅａ）から入手した。Ｆ菌株と尿路病原性（ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）大腸菌（ＵＰＥＣ）菌株は臨床的に分離しており、ゴ・グァンス（成均館大学校医科大学）教授から提供された。付着性侵襲性大腸菌（Ａｄｈｅｒｅｎｔ ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＩＥＣ））収集（ＥＣＯＲ）菌株は、Ｃｈｒｉｓｔｅｌ Ｎｅｕｔ教授から提供された（Ｒａｈｍｏｕｎｉ ｅｔ ａｌ．、２０１８）。ＭＣＲ－１陽性Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＯＲＣ８１菌株は、リュ・サンリョル教授（ソウル大学校）から提供された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、２０１９）。この作業に用いられた全ての菌株は、ＬＢ（ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ）またはＣＡＡ培地（５ｇ／ｌのカザミノ酸、５．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４および１ｍＭのＭｇＳＯ４）で３７℃で成長させた。
【0152】
製造例３．バクテリオファージおよびエンドリシン
下記の実施例で用いたバクテリオファージＰＢＥＣ１３１は、製造例１で得たものと同一である。
下記の実施例で用いたバクテリオファージＰＢＥＣ１３１は、製造例１で得たものと同一である。
【0153】
推定エンドリシンを発現する遺伝子（配列番号３）は、バクテリオファージＰＢＥＣ１３１から得ており、推定リゾチーム様スーパーファミリードメイン（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｌｙｓｏｚｙｍｅ－ｌｉｋｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ）は、ＢＬＡＳＴｐを通じて発見された。
【0154】
製造例４．分子クローニング
ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いてバクテリオファージＰＢＥＣ１３１の推定エンドリシンをコードする遺伝子（配列番号３）をｐＥＴ２１ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）にクローニングし、ＥＣ３４０遺伝子と命名した。ＥＣ３４０ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列で表される。
ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いてバクテリオファージＰＢＥＣ１３１の推定エンドリシンをコードする遺伝子（配列番号３）をｐＥＴ２１ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）にクローニングし、ＥＣ３４０遺伝子と命名した。ＥＣ３４０ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列で表される。
【0155】
変異ＥＣ３４０（ｍｔＥＣ３４０；配列番号６）は、配列番号２のアミノ酸配列で７個のアミノ酸を代替して生成された（図４ａ；Ｈ３９Ｓ、Ｄ４３Ｈ、Ｔ４５Ｅ、Ａ７３Ｖ、Ａ８１Ｓ、Ｔ１０１Ａ、およびＩ１１３Ｖ）。
【0156】
ＬＮＴ１１３（配列番号１０）は、抗菌性ペプチドセクロピンＡ（ＮＣＢＩ ＰＲＦ ０７０８２１４Ａ；配列番号８）を変異ＥＣ３４０（ｍｔＥＣ３４０；配列番号６）のＮ－末端に（ＧＧＧＧＳ）３リンカーと融合して構築した。（つまり、下記の実施例で、セクロピンＡおよび変異型ポリペプチド（ｍｔＥＣ３４０）を含む融合ポリペプチドをＬＮＴ１１３と命名した。）
【0157】
本出願の実施例で用いた全ての構成物には、親和性精製のためのＣ－末端ヘキサ－ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）を有する。また、強化緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ；ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＢ０２５７６．１）をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２１ａ＋ベクターに５'末端にセクロピンセクロピンＡ（ＣｅｃＡ）をコードする遺伝子と共にクローニングした。
【0158】
用いられた配列：
Ｈｉｓ（６Ｈ）タグがある組換えｍｔＥＣ３４０[メチオニン（Ｍｅｔ）＋ｍｔＥＣ３４０（配列番号６）＋Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）]（配列番号７）
ＭＶＳＲＮＩＳＮＮＧＩＫＦＴＡＡＦＥＧＦＲＧＴＡＹＲＡＴＰＮＥＫＹＬＴＩＧＹＧＳＹＧＰＨＶＥＰＧＫＴＩＴＰＧＱＧＬＬＬＬＮＲＤＭＡＫＡＶＡＡＶＤＡＶＡＨＨＳＬＴＱＳＱＦＤＡＶＣＤＬＶＹＮＡＧＡＧＶＩＡＡＡＴＧＴＧＫＡＬＲＳＧＤＶＡＴＬＲＡＫＬＡＬＦＩＮＱＮＧＫＰＬＬＧＬＲＲＲタグＲＬＡＬＦＤＧＫＰＷＱＥＡＥＡＩＧＲＡＶＫＧＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号７）
組換え融合蛋白質ＬＮＴ１１３[メチオニン（Ｍｅｔ）＋セクロピンＡ＋ＧＧＧＧＳｘ３ ｌｉｎｋｅｒ＋ｍｔＥＣ３４０＋Ｈｉｓ タグ（ＨＨＨＨＨＨ）]（配列番号１１）
ＭＫＷＫＬＦＫＫＩＥＫＶＧＱＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰＡＶＡＶＶＧＱＡＴＱＩＡＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＳＲＮＩＳＮＮＧＩＫＦＴＡＡＦＥＧＦＲＧＴＡＹＲＡＴＰＮＥＫＹＬＴＩＧＹＧＳＹＧＰＨＶＥＰＧＫＴＩＴＰＧＱＧＬＬＬＬＮＲＤＭＡＫＡＶＡＡＶＤＡＶＡＨＨＳＬＴＱＳＱＦＤＡＶＣＤＬＶＹＮＡＧＡＧＶＩＡＡＡＴＧＴＧＫＡＬＲＳＧＤＶＡＴＬＲＡＫＬＡＬＦＩＮＱＮＧＫＰＬＬＧＬＲＲＲタグＲＬＡＬＦＤＧＫＰＷＱＥＡＥＡＩＧＲＡＶＫＧＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１）
Ｈｉｓ（６Ｈ）タグがある組換えｍｔＥＣ３４０[メチオニン（Ｍｅｔ）＋ｍｔＥＣ３４０（配列番号６）＋Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）]（配列番号７）
ＭＶＳＲＮＩＳＮＮＧＩＫＦＴＡＡＦＥＧＦＲＧＴＡＹＲＡＴＰＮＥＫＹＬＴＩＧＹＧＳＹＧＰＨＶＥＰＧＫＴＩＴＰＧＱＧＬＬＬＬＮＲＤＭＡＫＡＶＡＡＶＤＡＶＡＨＨＳＬＴＱＳＱＦＤＡＶＣＤＬＶＹＮＡＧＡＧＶＩＡＡＡＴＧＴＧＫＡＬＲＳＧＤＶＡＴＬＲＡＫＬＡＬＦＩＮＱＮＧＫＰＬＬＧＬＲＲＲタグＲＬＡＬＦＤＧＫＰＷＱＥＡＥＡＩＧＲＡＶＫＧＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号７）
組換え融合蛋白質ＬＮＴ１１３[メチオニン（Ｍｅｔ）＋セクロピンＡ＋ＧＧＧＧＳｘ３ ｌｉｎｋｅｒ＋ｍｔＥＣ３４０＋Ｈｉｓ タグ（ＨＨＨＨＨＨ）]（配列番号１１）
ＭＫＷＫＬＦＫＫＩＥＫＶＧＱＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰＡＶＡＶＶＧＱＡＴＱＩＡＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＳＲＮＩＳＮＮＧＩＫＦＴＡＡＦＥＧＦＲＧＴＡＹＲＡＴＰＮＥＫＹＬＴＩＧＹＧＳＹＧＰＨＶＥＰＧＫＴＩＴＰＧＱＧＬＬＬＬＮＲＤＭＡＫＡＶＡＡＶＤＡＶＡＨＨＳＬＴＱＳＱＦＤＡＶＣＤＬＶＹＮＡＧＡＧＶＩＡＡＡＴＧＴＧＫＡＬＲＳＧＤＶＡＴＬＲＡＫＬＡＬＦＩＮＱＮＧＫＰＬＬＧＬＲＲＲタグＲＬＡＬＦＤＧＫＰＷＱＥＡＥＡＩＧＲＡＶＫＧＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１）
【0159】
製造例５．組換え蛋白質の精製
蛋白質発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にエンドリシン発現ベクターを導入した。セクロピンＡ（ＣｅｃＡ）融合ＥＧＦＰをインコードする遺伝子を保有するプラスミドを発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。細胞をＬＢブロスで指数期（ＯＤ６００＝０．４～０．５）まで成長させた後、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で２５℃で５時間０．５ｍＭ濃度で誘導した。バクテリア細胞を遠心分離によって採取し、ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのイミダゾール）で再懸濁し、５分間超音波処理（Ｓｏｎｉｃｓ、ＵＳＡ）で破壊した。細胞溶解物から３０分間１５，０００×ｇで遠心分離して上澄み液を得た。抽出物をＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ ｇｏ、Ｃｙｔｉｖａ、ＵＫ）を用いてＮｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーコラムにローディングした。２０ないし５００ｍＭのイミダゾールの線状勾配を用いて蛋白質を溶離した。その後、蛋白質を陽イオン交換クロマトグラフィーのために、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰコラム（Ｃｙｔｉｖａ）にローディングし、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５で、０ないし１ＭのＮａＣｌの線状勾配で溶離した。その後、蛋白質を保存緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））で透析した。
蛋白質発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にエンドリシン発現ベクターを導入した。セクロピンＡ（ＣｅｃＡ）融合ＥＧＦＰをインコードする遺伝子を保有するプラスミドを発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。細胞をＬＢブロスで指数期（ＯＤ６００＝０．４～０．５）まで成長させた後、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で２５℃で５時間０．５ｍＭ濃度で誘導した。バクテリア細胞を遠心分離によって採取し、ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのイミダゾール）で再懸濁し、５分間超音波処理（Ｓｏｎｉｃｓ、ＵＳＡ）で破壊した。細胞溶解物から３０分間１５，０００×ｇで遠心分離して上澄み液を得た。抽出物をＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ ｇｏ、Ｃｙｔｉｖａ、ＵＫ）を用いてＮｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーコラムにローディングした。２０ないし５００ｍＭのイミダゾールの線状勾配を用いて蛋白質を溶離した。その後、蛋白質を陽イオン交換クロマトグラフィーのために、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰコラム（Ｃｙｔｉｖａ）にローディングし、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５で、０ないし１ＭのＮａＣｌの線状勾配で溶離した。その後、蛋白質を保存緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））で透析した。
【0160】
製造例６．ザイモグラム分析（Ｚｙｍｏｇｒａｍ Ａｓｓａｙ）
ザイモグラム分析は、以前に説明された方法を一部修正して行った（Ｋｈａｋｈｕｍ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。つまり、一晩Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９の培養物を採取し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で一度洗浄した後、４，０００×ｇで１５分間遠心分離して採取した。その後、ペレットを３ｍｌの脱イオン水で再懸濁させた。細胞をオートクレーブし、重合前に１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに添加した。その後、３μｇの精製されたエンドリシン（ＥＣ３４０、ｍｔＥＣ３４０または、ＬＮＴ１１３）を２ｘサンプルバッファー（０．５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２０％のグリセロール、０．２％のブロモフェノールブルー）と混合してＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードした。電気泳動後、ゲルを１時間脱イオン水で洗浄し、反応緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で室温でインキュベーションした。エンドリシンの酵素活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物を含有するゲルの透明な領域で観察された。
ザイモグラム分析は、以前に説明された方法を一部修正して行った（Ｋｈａｋｈｕｍ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。つまり、一晩Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９の培養物を採取し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で一度洗浄した後、４，０００×ｇで１５分間遠心分離して採取した。その後、ペレットを３ｍｌの脱イオン水で再懸濁させた。細胞をオートクレーブし、重合前に１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに添加した。その後、３μｇの精製されたエンドリシン（ＥＣ３４０、ｍｔＥＣ３４０または、ＬＮＴ１１３）を２ｘサンプルバッファー（０．５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２０％のグリセロール、０．２％のブロモフェノールブルー）と混合してＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードした。電気泳動後、ゲルを１時間脱イオン水で洗浄し、反応緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で室温でインキュベーションした。エンドリシンの酵素活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物を含有するゲルの透明な領域で観察された。
【0161】
製造例７．抗菌活性分析
精製された蛋白質の抗菌活性は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび色々なＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株についてテストされた。細菌を指数期（ＯＤ６００＝０．５）まで成長させ、１２，０００×ｇで３分間遠心分離して採取した。その後、ペレットを反応緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、緩衝液で約１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈した。次いで、１００μｌの細菌懸濁液を反応緩衝液に１００μｌの精製されたエンドリシンと混合し、３７℃で２時間インキュベーションした。最後に、混合物をＰＢＳで希釈し、ＬＢプレートにローディングした。３７℃で一晩培養した後、細菌コロニーを計数した。全ての分析は、三重に行われた。
精製された蛋白質の抗菌活性は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび色々なＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株についてテストされた。細菌を指数期（ＯＤ６００＝０．５）まで成長させ、１２，０００×ｇで３分間遠心分離して採取した。その後、ペレットを反応緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、緩衝液で約１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈した。次いで、１００μｌの細菌懸濁液を反応緩衝液に１００μｌの精製されたエンドリシンと混合し、３７℃で２時間インキュベーションした。最後に、混合物をＰＢＳで希釈し、ＬＢプレートにローディングした。３７℃で一晩培養した後、細菌コロニーを計数した。全ての分析は、三重に行われた。
【0162】
同一の反応を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、１５０ｍＭのＮａＣｌ[ｐＨ７．４]から選択された対象細菌に対して行い、Ｔｒｉｓの可能な固有抗菌活性とｔｕｒｇｏｒ圧力に対するエンドリシンの依存性を排除した（図１０ａおよび図１０ｂ）。図１０は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９（Ａ）（図１０ａ）およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＫＣＴＣ ２２０８（Ｂ）（図１０ｂ）に対するエンドリシンの抗菌活性に対するＮａＣｌの効果を示す。幾何級数的に成長した細菌細胞を３７℃で２時間、低等張性バッファー（ｌｏｗ ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｂｕｆｆｅｒｓ）（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５または２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）または高等張性バッファー（ｈｉｇｈ ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｂｕｆｆｅｒｓ）（１５０ｍＭのＮａＣｌが含まれた緩衝液）で２μＭのエンドリシンと共に培養した。保存緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））で処理された細胞は、陰性対照群として用いられた。点線は、検出限界（１Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）を示す。
【0163】
製造例８．１－Ｎ－フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）吸収分析
ＮＰＮ吸収分析は、以前に説明した方法で行われた（Ｈｅｌａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｍａｔｔｉｌａ－Ｓａｎｄｈｏｌｍ、２０００）。つまり、指数期（ＯＤ６００＝０．４）まで成長したＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９を洗浄し、緩衝液（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）に約１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌで再懸濁させた。４０μＭのＮＰＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５０μｌを９６ウェルブラックプレートで最終濃度２μＭになるように精製されたエンドリシンまたはセクロピンＡ（ＡｂＣｌｏｎ、韓国）５０μｌと混合した。外膜透過剤、１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｄｕｃｈｅｆａ）および２μＭのＰｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を陽性対照群として用いた。その後、各ウェルに細胞懸濁液１００μｌを添加して３７℃で５分間培養した。緩衝液単独、緩衝液＋ＮＰＮ、細菌懸濁液＋緩衝液および細菌懸濁液＋緩衝液＋ＮＰＮを陰性対照群として用いた。蛍光は、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて励起（３５０ｎｍ）および放出（４２０ｎｍ）で測定された。ＮＰＮ吸収因子は、バックグラウンドの除去後に蛍光値（サンプルがある細胞混合物の蛍光値からＮＰＮがない値を減算した値）を、ＮＰＮがないバッファーの蛍光値から減算したバッファーがある細胞懸濁液の蛍光値で除算して計算した。
ＮＰＮ吸収分析は、以前に説明した方法で行われた（Ｈｅｌａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｍａｔｔｉｌａ－Ｓａｎｄｈｏｌｍ、２０００）。つまり、指数期（ＯＤ６００＝０．４）まで成長したＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９を洗浄し、緩衝液（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）に約１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌで再懸濁させた。４０μＭのＮＰＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５０μｌを９６ウェルブラックプレートで最終濃度２μＭになるように精製されたエンドリシンまたはセクロピンＡ（ＡｂＣｌｏｎ、韓国）５０μｌと混合した。外膜透過剤、１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｄｕｃｈｅｆａ）および２μＭのＰｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を陽性対照群として用いた。その後、各ウェルに細胞懸濁液１００μｌを添加して３７℃で５分間培養した。緩衝液単独、緩衝液＋ＮＰＮ、細菌懸濁液＋緩衝液および細菌懸濁液＋緩衝液＋ＮＰＮを陰性対照群として用いた。蛍光は、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて励起（３５０ｎｍ）および放出（４２０ｎｍ）で測定された。ＮＰＮ吸収因子は、バックグラウンドの除去後に蛍光値（サンプルがある細胞混合物の蛍光値からＮＰＮがない値を減算した値）を、ＮＰＮがないバッファーの蛍光値から減算したバッファーがある細胞懸濁液の蛍光値で除算して計算した。
【0164】
製造例９．溶血分析
試験管内の溶血活性試験に羊の赤血球（Ｓｈｅｅｐ ＲＢＣ）を用いた。１ｍｌの赤血球（ＭＢ Ｃｅｌｌ、Ｋｏｒｅａ）を９ｍｌのＰＢＳで希釈した。その後、１８０μｌのＲＢＣ溶液を２０μｌのＬＮＴ１１３（最終濃度、２～１２８μｇ／ｍｌ）、ＰＢＳ（陰性対照群）または０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（陽性対照群）に添加して３７℃で３０分間培養した。混合物を５００×ｇで５分間遠心分離し、上澄み液を９６－ウェルマイクロプレートに移した。吸光度は５７０ｎｍで測定された。溶血率は、下記の数式１を用いて計算された。
試験管内の溶血活性試験に羊の赤血球（Ｓｈｅｅｐ ＲＢＣ）を用いた。１ｍｌの赤血球（ＭＢ Ｃｅｌｌ、Ｋｏｒｅａ）を９ｍｌのＰＢＳで希釈した。その後、１８０μｌのＲＢＣ溶液を２０μｌのＬＮＴ１１３（最終濃度、２～１２８μｇ／ｍｌ）、ＰＢＳ（陰性対照群）または０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（陽性対照群）に添加して３７℃で３０分間培養した。混合物を５００×ｇで５分間遠心分離し、上澄み液を９６－ウェルマイクロプレートに移した。吸光度は５７０ｎｍで測定された。溶血率は、下記の数式１を用いて計算された。
【0165】
【数1】
【0166】
製造例１０．試験管内細胞毒性分析
ヒト肝細胞癌腫細胞株Ｈｕｈ７（韓国細胞株バンクから入手した）をＬＮＴ１１３の細胞毒性分析に用いた。まず、１ｘ１０４ Ｈｕｈ７細胞を９６－ウェルプレートに接種した。２４時間後、ＬＮＴ１１３（最終濃度、１２５または２５０μｇ／ｍｌ）、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（陽性対照群）またはＰＢＳ（陰性対照群）を細胞に添加して、２４時間または４８時間培養した。その後、ＷＳＴ－８ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｄｙｎｅ Ｂｉｏ、Ｋｏｒｅａ）のテトラゾリウム塩溶液１０μｌを各ウェルに添加した。５％のＣＯ２培養器で３７℃、１時間培養後、４５０ｎｍでホルマザンの生成を測定した。
ヒト肝細胞癌腫細胞株Ｈｕｈ７（韓国細胞株バンクから入手した）をＬＮＴ１１３の細胞毒性分析に用いた。まず、１ｘ１０４ Ｈｕｈ７細胞を９６－ウェルプレートに接種した。２４時間後、ＬＮＴ１１３（最終濃度、１２５または２５０μｇ／ｍｌ）、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（陽性対照群）またはＰＢＳ（陰性対照群）を細胞に添加して、２４時間または４８時間培養した。その後、ＷＳＴ－８ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｄｙｎｅ Ｂｉｏ、Ｋｏｒｅａ）のテトラゾリウム塩溶液１０μｌを各ウェルに添加した。５％のＣＯ２培養器で３７℃、１時間培養後、４５０ｎｍでホルマザンの生成を測定した。
【0167】
製造例１１．最小抑制濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の測定
ＬＮＴ１１３または抗生剤のＭＩＣは、以前に説明された方法（Ｈｅｓｅｌｐｏｔｈ ｅｔ ａｌ．、２０１９）に従って、９６ウェル・丸底・マイクロプレートでブロス微量稀釈方法の修正を用いて決定された。幾何級数的に成長した細胞を、ＣＡＡ培地に１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度に希釈した後、組換えＬＮＴ１１３（１－６４μｇ／ｍｌ）または抗生剤と共に３５℃で２０時間培養した。ＭＩＣ値は、バクテリア成長を完全に抑制する最も低い抗菌濃度として決定された。ＭＢＣは、ＬＢ寒天にＭＩＣテストプレートの各ウェルで混合物１０μｌをスポッティングして決定した。ＭＢＣは、プレートで成長がない最も低い抗菌剤の濃度と定義された。全ての分析は、二重に行われた。
ＬＮＴ１１３または抗生剤のＭＩＣは、以前に説明された方法（Ｈｅｓｅｌｐｏｔｈ ｅｔ ａｌ．、２０１９）に従って、９６ウェル・丸底・マイクロプレートでブロス微量稀釈方法の修正を用いて決定された。幾何級数的に成長した細胞を、ＣＡＡ培地に１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度に希釈した後、組換えＬＮＴ１１３（１－６４μｇ／ｍｌ）または抗生剤と共に３５℃で２０時間培養した。ＭＩＣ値は、バクテリア成長を完全に抑制する最も低い抗菌濃度として決定された。ＭＢＣは、ＬＢ寒天にＭＩＣテストプレートの各ウェルで混合物１０μｌをスポッティングして決定した。ＭＢＣは、プレートで成長がない最も低い抗菌剤の濃度と定義された。全ての分析は、二重に行われた。
【0168】
製造例１２．チェッカーボードアッセイ（Ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ Ａｓｓａｙ）
以前に説明した通り、連続稀釈方法を用いてチェッカーボードアッセイ（Ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ Ａｓｓａｙ）を行った（Ｔｈｕｍｍｅｅｐａｋ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。ＬＮＴ１１３は、垂直に２倍希釈されており、抗生剤は、９６ウェルマイクロプレートで水平に連続希釈された。各ウェルにＣＡＡ培地で１０６ＣＦＵ／ｍｌ濃度のバクテリアを添加した。３５℃で２０時間インキュベーションした後、成長しない細胞に対してＭＩＣを目視で確認した。ＬＮＴ１１３または抗生剤に対する部分抑制濃度（ＦＩＣ）は、二つの薬物のＭＩＣを各薬物単独のＭＩＣと組み合わせて除算して計算した。二つの薬物の相互作用を確認するために、各薬物のＦＩＣを加算したＦＩＣ指数（ＦＩＣＩ）を用いた。ＦＩＣＩは、相乗効果（ｓｙｎｅｒｇｉｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）≦０．５、相加効果（ａｄｄｉｔｉｖｅ）＞０．５～≦１、インディペンデント効果（ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）＞１．０～≦２、拮抗効果（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）＞２と見なした。
以前に説明した通り、連続稀釈方法を用いてチェッカーボードアッセイ（Ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ Ａｓｓａｙ）を行った（Ｔｈｕｍｍｅｅｐａｋ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。ＬＮＴ１１３は、垂直に２倍希釈されており、抗生剤は、９６ウェルマイクロプレートで水平に連続希釈された。各ウェルにＣＡＡ培地で１０６ＣＦＵ／ｍｌ濃度のバクテリアを添加した。３５℃で２０時間インキュベーションした後、成長しない細胞に対してＭＩＣを目視で確認した。ＬＮＴ１１３または抗生剤に対する部分抑制濃度（ＦＩＣ）は、二つの薬物のＭＩＣを各薬物単独のＭＩＣと組み合わせて除算して計算した。二つの薬物の相互作用を確認するために、各薬物のＦＩＣを加算したＦＩＣ指数（ＦＩＣＩ）を用いた。ＦＩＣＩは、相乗効果（ｓｙｎｅｒｇｉｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）≦０．５、相加効果（ａｄｄｉｔｉｖｅ）＞０．５～≦１、インディペンデント効果（ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）＞１．０～≦２、拮抗効果（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）＞２と見なした。
【0169】
製造例１３．統計分析
全ての統計分析には、Ｐｒｉｓｍバージョン９（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）が用いられた。試験管内の研究の場合、全ての実験は３重に行われており、結果は平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で提供された。Ｔｕｋｅｙの多重比較テストがある二元配置Ａｎｏｖａを用いて各データセット間の差異点を比較した。
全ての統計分析には、Ｐｒｉｓｍバージョン９（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）が用いられた。試験管内の研究の場合、全ての実験は３重に行われており、結果は平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で提供された。Ｔｕｋｅｙの多重比較テストがある二元配置Ａｎｏｖａを用いて各データセット間の差異点を比較した。
【0170】
実験結果
実施例１．エンドリシンＥＣ３４０のグラム陰性菌に対する死滅能の調査
本実施例では、エンドリシンＥＣ３４０のアシネトバクターバウマニ（ＡＴＣＣ １９６０６）、シュードモナスエルギノーザ（ＡＴＣＣ １３３８８）および大腸菌（ＡＴＣＣ ８７３９）を対象に抗菌活性を確認するためにバクテリア死滅能を試験した。
実施例１．エンドリシンＥＣ３４０のグラム陰性菌に対する死滅能の調査
本実施例では、エンドリシンＥＣ３４０のアシネトバクターバウマニ（ＡＴＣＣ １９６０６）、シュードモナスエルギノーザ（ＡＴＣＣ １３３８８）および大腸菌（ＡＴＣＣ ８７３９）を対象に抗菌活性を確認するためにバクテリア死滅能を試験した。
【0171】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
このために、２μＭ濃度のエンドリシンＥＣ３４０とそれぞれの試験菌を反応バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５）に最終体積が２００μｌになるように入れ、３７℃で２時間静置した。２時間後、アシネトバクターバウマニ、シュードモナスエルギノーザおよび大腸菌のコロニー数を確認し、その結果を図３に示した。図３に示されているように、エンドリシンＥＣ３４０は、アシネトバクターバウマニ、シュードモナスエルギノーザおよび大腸菌これに対する死滅能を有することを確認した。
このために、２μＭ濃度のエンドリシンＥＣ３４０とそれぞれの試験菌を反応バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５）に最終体積が２００μｌになるように入れ、３７℃で２時間静置した。２時間後、アシネトバクターバウマニ、シュードモナスエルギノーザおよび大腸菌のコロニー数を確認し、その結果を図３に示した。図３に示されているように、エンドリシンＥＣ３４０は、アシネトバクターバウマニ、シュードモナスエルギノーザおよび大腸菌これに対する死滅能を有することを確認した。
【0172】
実施例２．バクテリオファージＰＢＥＣ１３１由来のエンドリシンおよびその変形
バクテリオファージＰＢＥＣ１３１の１６２個のアミノ酸で構成されたＯＲＦは推定エンドリシンであって注釈が付けられている。ＥＣ３４０（配列番号２） と命名されたこのエンドリシンには、ファージ関連リゾチーム（ムラミダーゼ）ドメイン（ｐｆａｍ００９５９）を有する（図４ａ）。この遺伝子を発現ベクターにクローニングして発現させ、精製されたエンドリシンでザイモグラム分析（ｚｙｍｏｇｒａｍ ａｓｓａｙ）を行って（製造例６参照）酵素活性を観察した（図４ｂのＥＣ３４０）。
バクテリオファージＰＢＥＣ１３１の１６２個のアミノ酸で構成されたＯＲＦは推定エンドリシンであって注釈が付けられている。ＥＣ３４０（配列番号２） と命名されたこのエンドリシンには、ファージ関連リゾチーム（ムラミダーゼ）ドメイン（ｐｆａｍ００９５９）を有する（図４ａ）。この遺伝子を発現ベクターにクローニングして発現させ、精製されたエンドリシンでザイモグラム分析（ｚｙｍｏｇｒａｍ ａｓｓａｙ）を行って（製造例６参照）酵素活性を観察した（図４ｂのＥＣ３４０）。
【0173】
エンドリシンの活性を向上させるために、ＥＣ３４０と配列が非常に類似の８個の蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＱＱＮＯ１１７０５．１、ＱＮＯ１１６２９．１、ＱＮＯ１１７７７．１、ＱＢＪ０２９５１．１、ＨＡＭ５２０７７８６．１、ＹＰ_００９１６８８８０．１、ＱＩＧ５９３３５．１、およびＹＰ_００９１１３２００．１）でＢＬＡＳＴｐを行った（図９）。また、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／で蛋白質のコンピュータ支援モデリングを実行した。特に、外部に露出したアミノ酸Ｈ３９Ｓ、Ａ７３Ｖ、Ｔ１０１ＡおよびＩ１１３Ｖの変化が蛋白質の疎水性を増加させ、膜通過性の改善をもたらすことができると考えられた。Ｄ４３ＨおよびＴ４５Ｅの変更は、外部に露出したヒンジ領域にあるものであり、ここで荷電されたアミノ酸のスイッチは、当該領域に対して立体的にさらに安定した特性をもたらすことがある。蛋白質の第三の螺旋領域に位置したＡ８１Ｓの変化は、蛋白質の特性に目立った変化をもたらさない可能性もある。ＥＣ３４０の酵素活性ドメイン内の７個のアミノ酸位置に変異が導入され（図４ａ；Ｈ３９Ｓ、Ｄ４３Ｈ、Ｔ４５Ｅ、Ａ７３Ｖ、Ａ８１Ｓ、Ｔ１０１Ａ、およびＩ１１３Ｖ）ＧＲＡＶＹ（Ｇｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ ｉｎｄｅｘ；ペプチドの疎水性値を示すのに用いられる指標）に若干の変化が生じた。つまり、配列番号１０のアミノ酸配列で表される変異型ポリペプチドｍｔＥＣ３４０は、配列番号２のアミノ酸配列で表されるＥＣ３４０で、Ｈ３９Ｓ、Ｄ４３Ｈ、Ｔ４５Ｅ、Ａ７３Ｖ、Ａ８１Ｓ、Ｔ１０１Ａ、およびＩ１１３Ｖ変異を含むポリペプチドである。
【0174】
ｍｔＥＣ３４０変異は、基準菌株、薬物耐性菌株および臨床的に分離された菌株を含め、Ｅ．ｃｏｌｉまたは、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多様な菌株についてテストする時に、最大１ｌｏｇ（図５ａないし図５ｄ）まで増加された抗菌活性を示した（抵抗プロファイルは、下記の表１に表される）。エンドリシンに対するより高い抗菌効能は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅよりＥ．ｃｏｌｉで観察された。これは、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのカプセル厚さが、Ｅ．ｃｏｌｉで観察されるるものの１６倍以上という以前の報告書と一致する。
【0175】
【表1】
【0176】
表１は、薬物耐性菌株に対する多様な抗生剤のＭＩＣに関するものである。
Ｓｏｕｒｃｅ：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｒｒｂ．ｃｃａｒｍ－ｂｉｏ．ｏｒ．ｋｒ
－：ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
Ｓｏｕｒｃｅ：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｒｒｂ．ｃｃａｒｍ－ｂｉｏ．ｏｒ．ｋｒ
－：ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
【0177】
つまり、図５ａないし図５ｄで確認できるように、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＣＡＲＭ １Ａ７４６、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＣＡＲＭ １Ｂ６８４、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ ７００６０３、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＫＣＴＣ ２２０８、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＣＡＲＭ １０１４３、およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｆ８５菌株に何も処理しない場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＥＣ３４０を処理した場合、ｍｔＥＣ３４０を処理した場合、およびＬＮＴ１１３を処理した場合で、細菌数を測定した結果、ＥＣ３４０、ｍｔＥＣ３４０、およびＬＮＴ１１３はいずれも優れた抗菌活性が示された。そのうち、ｍｔＥＣ３４０およびＬＮＴ１１３はさらに優れた抗菌活性が示されることを確認した。
【0178】
また、本実験に用いられたＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株のうちの一つのＡＴＣＣ ７００６０３は、カプセル構造を有するものと知られている。厚いカプセルは、ペプチドグリカン細胞壁に対するエンドリシンの接近を妨げる可能性がある。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカプセル多糖類は、ポリミキシンおよびラクトフェリンのような抗菌ペプチドに対する耐性を媒介するものと報告された。活性をさらに増加させるために、ｍｔＥＣ３４０のＮ－末端に抗菌性ペプチドのセクロピンセクロピンＡの３７個のアミノ酸配列（配列番号８）を融合してエンドリシンＬＮＴ１１３（配列番号１０）を構築した。これは、ｍｔＥＣ３４０と比較すると、活動において最大４－ｌｏｇ増加を示した。テストした全ての菌株に対して２時間培養後、生存可能な細菌細胞が検出されなかった。エンドリシンの抗菌活性は、潜在的に膨圧に依存し、Ｔｒｉｓ自体が外膜透過剤として作用できるので、多様な生理的条件（１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＴｒｉｓバッファーまたは１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＨｅｐｅｓバッファー（図１０ａおよび図１０ｂ））で追加抗菌分析を行った。予想外に、抗バクテリア活性は、ＮａＣｌがないＴｒｉｓバッファーよりＨｅｐｅｓバッファーでさらに高かった。しかし、ＮａＣｌを追加すると、ＥＣ３４０およびｍｔＥＣ３４０がほとんど不活性化した。しかし、以前に報告されているように、セクロピンセクロピンＡ融合エンドリシン（ＬＮＴ１１３）を用いた場合、塩存在の否定的な影響が大きく減少した。
【0179】
実施例３．ＬＮＴ１１３の向上した細胞透過性によって向上した抗菌効能
一般に、外用エンドリシンは、グラム陰性菌に外膜が存在するため、ペプチドグリカン層に到達しにくい。外膜と相互作用するセクロピンＡとの融合は膜浸透性を増加させなければならない。
一般に、外用エンドリシンは、グラム陰性菌に外膜が存在するため、ペプチドグリカン層に到達しにくい。外膜と相互作用するセクロピンＡとの融合は膜浸透性を増加させなければならない。
【0180】
ＮＰＮ（１－Ｎ－フェニルナフチルアミン）分析を通じて（製造例８参照）セクロピンＡおよび／またはエンドリシンを含むの色々な構成物の膜貫通能力を比較した（図６ａ）。
【0181】
図６ａ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９の外膜透過性）で確認できるように、ｍｔＥＣ３４０に比べてセクロピンＡが融合されたＬＮＴ１１３（図６ａのＬＮＴ１１３）を処理した細胞で膜浸透性が１．８倍増加するものと観察された。これはまた、セクロピンセクロピンＡ単独（図６ａのＣｅｃＡ）より１．３倍さらに高かった。また、ｍｔＥＣ３４０とセクロピンセクロピンＡとを併用投与した時（図６ａのＣｅｃＡ＋ｍｔＥＣ３４０）、膜透過度が増加した。反対に、ＥＧＦＰに融合されたセクロピンＡ（図６ａのＣｅｃＡ＋ＥＧＦＰ）は、ＬＮＴ１１３と比較すると、メンブレインを透過する能力が制限されていることを示しており、これは、ＡＭＰとメンブレインを透過する強力な能力を示すエンドリシンとの連携が追加効果を達成するのに必要であることを示唆する。
【0182】
図６ｂに示す各構造物の殺菌効能は、図６ａに示しているように、膜を透過する能力に比例した。試験管内で、ＬＮＴ１１３は容量および時間によって抗菌活性を示した（大腸菌ＡＴＣＣ ８７３９（図６ｃ）および図６ｄ）。コリスチン耐性菌株のＥ．ｃｏｌｉ ＦＯＲＣ８１は、ＬＮＴ１１３に対する感受性についてテストされた（Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＯＲＣ８１（図６ｅ））。２μＭの濃度で、コリスチン処理された細胞で１．２－ｌｏｇ減少が観察されたのに対し、同一の濃度でＬＮＴ１１３は、検出限界以下にバクテリア細胞の量を減少させることに成功した。
【0183】
実施例４．最小抑制濃度（ＭＩＣ）の決定
Ｅ．ｃｏｌｉは、ヒトと動物の多様な病気に関連がある。病原性大腸菌は、尿路、腎臓、血流など人体の多様な部位に群集を形成して病気を誘発する。ＭＩＣ測定を通じて（製造例１１参照）多様なＥ．ｃｏｌｉ菌株でＬＮＴ１１３の抗菌活性を確認した（表２）。
Ｅ．ｃｏｌｉは、ヒトと動物の多様な病気に関連がある。病原性大腸菌は、尿路、腎臓、血流など人体の多様な部位に群集を形成して病気を誘発する。ＭＩＣ測定を通じて（製造例１１参照）多様なＥ．ｃｏｌｉ菌株でＬＮＴ１１３の抗菌活性を確認した（表２）。
【0184】
【表2】
【0185】
表２は、多様な大腸菌菌株に対するＬＮＴ１１３のＭＩＣおよびＭＢＣに関するものである。
【0186】
標的菌株には、基準菌株、薬物耐性菌株（ＣＣＲＭおよびＦＯＲＣ８１）、臨床的に分離された菌株（Ｆ）、尿路病原性菌株（ＵＰＥＣ）および付着性侵襲性菌株（ＥＣＯＲ）が含まれた。ＭＩＣは、大部分の菌株で４－６４μｇ／ｍｌであるものと示された（１ｍＭのＬＮＴ１１３は、２３．２ｍｇ／ｍｌであり、１ｍｇ／ｍｌのＬＮＴ１１３は、０．０４３１ｍＭである）。エンドリシンＥＣ３４０またはｍｔＥＣ３４０に対するＭＩＣは＞１２８ｍｇ／ｍｌであった（表３）。
【0187】
また、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、ＭＩＣと同一であり、作用方式が殺菌であることを示唆する。ＬＮＴ１１３のＭＩＣは、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのような多様なグラム陰性菌に対して確認された（表４）。
【0188】
【表3】
【0189】
表３は、大腸菌菌株でコリスチンと組み合わせられたエンドリシンのＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）に関するものである。
【0190】
【表4】
【0191】
表４は、多様なグラム陰性菌に対するＬＮＴ１１３のＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）に関するものである。
【0192】
菌株には、基準菌株、臨床的に分離された菌株および薬物耐性菌株が含まれる。用いられた薬物耐性菌株に対する抗生剤のＭＩＣは、表１に記載されている。ＭＩＣは、４－３２μｇ／ｍｌ範囲であった。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの場合、ＭＩＣは＞６４μｇ／ｍｌであった。
【0193】
実施例５．ＬＮＴ１１３の細胞毒性および溶血活性
ＬＮＴ１１３の細胞毒性を確認するために、ヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７に対してＷＳＴ－１分析を行った（製造例１０参照）。ＬＮＴ１１３を４８時間２５０または１２５μｇ／ｍｌで処理した場合、細胞生存率の減少が観察されなかった（図７ａ）。
ＬＮＴ１１３の細胞毒性を確認するために、ヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７に対してＷＳＴ－１分析を行った（製造例１０参照）。ＬＮＴ１１３を４８時間２５０または１２５μｇ／ｍｌで処理した場合、細胞生存率の減少が観察されなかった（図７ａ）。
【0194】
溶血活性を測定するために、ＬＮＴ１１３を２～１２８μｇ／ｍｌの濃度で赤血球に添加した。ＬＮＴ１１３の溶血活性は観察されなかった（図７ｂ）。
【0195】
実施例６．ＬＮＴ１１３と多様な抗生剤との相乗効果
ＬＮＴ１１３と多様な抗生剤との結合効果を確認するために、チェッカーボードアッセイ（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ａｓｓａｙ）を行った（製造例１２参照）。まず、ＦＩＣＩ（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）を測定して、大腸菌菌株でＬＮＴ１１３とコリスチンとの組み合わせ効果を観察した。ＬＮＴ１１３およびコリスチンのＦＩＣフローティングを含め、ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍで表されるｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ分析結果は、図８に示した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９で、コリスチンとＬＮＴ１１３とをいずれも処理したとき、二つの値の和（ＦＩＣＩ）は０．２５であった。これは、二つの製剤の相乗効果を示す。ＵＰＥＣ ３１５０菌株の場合、ＦＩＣＩは０．３７５と上昇效果を示した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＯＲＣ８１の場合、ＦＩＣＩは０．５とまた他の上昇效果を示した。コリスチン耐性大腸菌ＦＯＲＣ８１で、コリスチンのＭＩＣを４ｍｇ／ｍｌのＬＮＴ１１３と組み合わせて処理されるとき、１６ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌに減少したという点は注目するに値する（表３）。
ＬＮＴ１１３と多様な抗生剤との結合効果を確認するために、チェッカーボードアッセイ（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ａｓｓａｙ）を行った（製造例１２参照）。まず、ＦＩＣＩ（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）を測定して、大腸菌菌株でＬＮＴ１１３とコリスチンとの組み合わせ効果を観察した。ＬＮＴ１１３およびコリスチンのＦＩＣフローティングを含め、ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍで表されるｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ分析結果は、図８に示した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９で、コリスチンとＬＮＴ１１３とをいずれも処理したとき、二つの値の和（ＦＩＣＩ）は０．２５であった。これは、二つの製剤の相乗効果を示す。ＵＰＥＣ ３１５０菌株の場合、ＦＩＣＩは０．３７５と上昇效果を示した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＯＲＣ８１の場合、ＦＩＣＩは０．５とまた他の上昇效果を示した。コリスチン耐性大腸菌ＦＯＲＣ８１で、コリスチンのＭＩＣを４ｍｇ／ｍｌのＬＮＴ１１３と組み合わせて処理されるとき、１６ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌに減少したという点は注目するに値する（表３）。
【0196】
ＬＮＴ１１３と８個の他の抗生剤の間の相乗効果は、ＦＩＣＩを決定することによって、５個の他のＥ．ｃｏｌｉ菌株に対して確認された（表５）。
【0197】
【表5】
【0198】
表５は、多様な抗生剤を用いたＬＮＴ１１３の部分抑制濃度指数（ＦＩＣＩ）に関するものである。
（*：ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ＦＩＣＩ：≦０．５、ｓｙｎｅｒｇｙ；＞０．５－≦１．０、ａｄｄｉｔｉｖｅ；＞１．０ｔｏ≦２、ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ；＞２．０、ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）
（*：ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ＦＩＣＩ：≦０．５、ｓｙｎｅｒｇｙ；＞０．５－≦１．０、ａｄｄｉｔｉｖｅ；＞１．０ｔｏ≦２、ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ；＞２．０、ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）
【0199】
５個の菌株のうち４個の菌株で、コリスチンとの相乗効果が観察されたのに対し、他の全ての組み合わせでは、付加（ａｄｄｉｔｉｖｅ）または無関係な（ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）効果が観察された。
【0200】
またＭＩＣが＞１２８ｍｇ／ｍｌのエンドリシンＥＣ３４０またはｍｔＥＣ３４０があるとき、コリスチンのＭＩＣが顕著に減少するということを観察した（表３）。
【0201】
以上の説明から、本出願の属する技術分野における当業者は、本出願がその技術的な思想や必須的特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するはずである。これに関連して、以上で記述した実施例は、あらゆる面で例示的なものであって限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲およびその等価概念から導出される全ての変更または変形された形態が、本出願の範囲に含まれるものと解釈されなければならない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図6e】
【図7a】
【図7b】
【図8】
【図9】
【図10a】
【図10b】
【配列表】
【国際調査報告】