特表 2024-531966 操作されたＡＤＡＲ動員ＲＮＡ及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-03

(54)【発明の名称】操作されたＡＤＡＲ動員ＲＮＡ及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240827BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240827BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/11 Z ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024509501

(86)(22)【出願日】2022-08-18

(85)【翻訳文提出日】2024-04-15

(86)【国際出願番号】 CN2022113304

(87)【国際公開番号】W WO2023020574

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/113290

(32)【優先日】2021-08-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2022/085144

(32)【優先日】2022-04-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】507232478

【氏名又は名称】北京大学

【氏名又は名称原語表記】ＰＥＫＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５， Ｙｉｈｅｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８７１， Ｃｈｉｎａ

(71)【出願人】

【識別番号】522264261

【氏名又は名称】北京▲輯▼因医▲療▼科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＥＤＩＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ （ＢＥＩＪＩＮＧ） ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】Ｆｌｏｏｒ ２，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ２， Ｎｏ．２２ Ｋｅｘｕｅｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｎｇｐｉｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２２０６， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所

(72)【発明者】

【氏名】魏 文▲勝▼

(72)【発明者】

【氏名】伊 宗裔

(72)【発明者】

【氏名】袁 ▲鵬▼▲飛▼

(57)【要約】

本願は、標的ＲＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化するために宿主細胞にデアミナーゼ動員ＲＮＡを導入することによってＲＮＡを編集する方法を提供する。本願はまた、ＲＮＡのオフターゲット編集を低減する方法を提供する。本願はさらに、前記ＲＮＡ編集方法に使用されるデアミナーゼ動員ＲＮＡ、ならびにそれを含む組成物及びキットを提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、前記二本鎖ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、かつ
（２）前記ｄＲＮＡが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、方法。

【請求項2】

前記二本鎖ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標的化ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、前記標的ＲＮＡに相補的である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記標的化ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の２つ以上の連続するヌクレオチドを欠いていることを除いて、前記標的ＲＮＡに相補的である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ｄＲＮＡ、または標的化ＲＮＡ配列を含むその構築物を使用する方法と比較して、前記方法は、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの編集レベルが減少し、前記標的化ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側のヌクレオチドを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ｄＲＮＡが線形ＲＮＡである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ｄＲＮＡが環状ＲＮＡを形成することができる、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ｄＲＮＡが環状ＲＮＡである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、前記リンカー核酸配列が、前記ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない、請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の末端を置換するリンカー核酸配列を含み、前記リンカー核酸配列が、前記ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない、請求項７または８に記載の方法。

【請求項11】

ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、前記リンカー核酸配列が、前記ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、
（２）前記ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員することができ、かつ
（３）前記ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである、方法。

【請求項12】

前記ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記リンカー核酸配列の長さが約５ヌクレオチド（ｎｔ）～約５００ｎｔである、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記リンカー核酸配列の長さが約５０ｎｔ～約５００ｎｔである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記リンカー核酸配列の長さが７０ｎｔ以下であり、場合により、前記リンカー核酸配列の長さが１０ｎｔ～５０ｎｔ、１０ｎｔ～４０ｎｔ、１０ｎｔ～３０ｎｔ、１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～５０ｎｔ、２０ｎｔ～４０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～５０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、または４０ｎｔ～５０ｎｔの間の任意の整数である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記リンカー核酸配列の長さが、約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり、場合により、前記リンカー核酸配列の長さが、約３０ｎｔ、または約５０ｎｔである、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記リンカー核酸配列の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれか１つがアデノシンまたはシチジンを含み、任意選択で、前記リンカー核酸配列の１００％がアデノシンまたはシチジンを含む、請求項９～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む、請求項９～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含む、請求項９～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含む、請求項９～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記リンカー核酸配列が配列番号２２を含む、請求項９～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む、請求項９～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む、請求項９～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む、請求項９～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む、請求項９～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記第１のリンカー核酸配列が、前記第２のリンカー核酸配列と同じである、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記第１のリンカー核酸配列が、前記第２のリンカー核酸配列とは異なる、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、前記リンカー核酸配列が、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端と前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端とを連結する、請求項９～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列と、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列とをさらに含む、請求項１２～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ｄＲＮＡが、３’連結配列と５’連結配列とをさらに含む、請求項１２～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記３’連結配列と前記５’連結配列が互いに少なくとも部分的に相補的である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記３’連結配列及び前記５’連結配列の長さが、約２０～約７５ヌクレオチドである、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ｄＲＮＡがＲＮＡリガーゼＲｔｃＢによって環状化される、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ｄＲＮＡが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（Ｒｎｌ１）またはＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）によって環状化される、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物が、用量依存的に前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記方法が、前記ｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記構築物が、前記ｄＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記プロモーターがポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記プロモーターがポリメラーゼＩＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター」）である、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

前記構築物がウイルスベクターまたはプラスミドである、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記構築物がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記構築物が自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記ＡＤＡＲが前記宿主細胞によって内因的に発現される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記宿主細胞がＴ細胞である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記標的化ＲＮＡ配列の長さが５０ｎｔを超える、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記標的化ＲＮＡ配列の長さが約１００～約２００ｎｔである、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記標的化ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいのシチジン、アデノシンまたはウリジンを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記標的化ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいのシチジンミスマッチを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記シチジンミスマッチが、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド、及び前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチドに位置する、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの５’に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的ＲＮＡにおける標的アデノシンの３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記標的アデノシンが、ＵＡＧの３塩基モチーフに位置し、前記標的化ＲＮＡが、前記３塩基モチーフのウリジンの真向かいのＡ、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記３塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡであり、任意選択で、前記標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

ＡＤＡＲ３阻害剤及び／またはインターフェロン刺激剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

それぞれが異なる標的ＲＮＡを標的とする複数のｄＲＮＡまたは構築物を前記宿主細胞に導入することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記標的ＲＮＡの編集効率が少なくとも４０％である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

ＡＤＡＲを前記宿主細胞に導入することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化が、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングもしくは選択的スプライシング、または前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングもしくは選択的スプライシングの復帰を引き起こす、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化が、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点突然変異、トランケート、伸長及び／またはミスフォールディング、あるいは前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングもしくは選択的スプライシングの復帰による機能的で、完全長の、正しくフォールディングされた、及び／または野生型タンパク質を引き起こす、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記宿主細胞が真核細胞であり、任意選択で、前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記請求項のいずれか一項に記載の方法によって生成された編集されたＲＮＡ、または編集されたＲＮＡを有する宿主細胞。

【請求項63】

請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法にしたがって、個体の細胞内に疾患または症状に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、前記個体の前記疾患または症状を治療または予防する方法。

【請求項64】

前記疾患または症状が、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の後天性遺伝子突然変異に関連する疾患または症状である、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記疾患または症状が、単一遺伝子あるいは多遺伝子疾患または症状である、請求項６３に記載の方法。

【請求項66】

前記標的ＲＮＡが、ＧからＡへの変異を有する、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

（ｉ）前記標的ＲＮＡがＴＰ５３、ＫＲＡＳであり、かつ前記疾患または症状ががんであり、
（ｉｉ）前記標的ＲＮＡがＩＤＵＡであり、かつ前記疾患または症状がムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）であり、
（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡがＣＯＬ３Ａ１であり、かつ前記疾患または症状がエーラス・ダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ－Ｄａｎｌｏｓ）症候群であり、
（ｉｖ）前記標的ＲＮＡがＢＭＰＲ２であり、かつ前記疾患または症状がジュベール（Ｊｏｕｂｅｒｔ）症候群であり、
（ｖ）前記標的ＲＮＡがＦＡＮＣＣであり、かつ前記疾患または症状がファンコニ貧血であり、
（ｖｉ）前記標的ＲＮＡがＭＹＢＰＣ３であり、かつ前記疾患または症状が原発性家族性肥大型心筋症であり、
（ｖｉｉ）前記標的ＲＮＡがＩＬ２ＲＧであり、かつ前記疾患または症状がＸ連鎖重度複合免疫不全症であり、
（ｖｉｉｉ）前記標的ＲＮＡがＭＡＬＡＴ１であり、かつ前記疾患または症状が高血糖症であり、または
（ｉｘ）前記標的ＲＮＡがＲＡＢ７Ａであり、かつ前記疾患または症状がシャルコー・マリー・トゥース（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ）症候群２Ｂ型（ＣＭＴ２Ｂ）である、
請求項６３～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡを編集するためのｄＲＮＡであって、前記二本鎖ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含む、ｄＲＮＡ。

【請求項69】

標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡを編集するためのｄＲＮＡであって、前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、前記リンカー核酸配列が、前記ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、前記ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである、ｄＲＮＡ。

【請求項70】

請求項６８または６９に記載のｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む、構築物。

【請求項71】

前記構築物が、前記ｄＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターがＰｏｌ ＩＩＩプロモーターである、請求項７０に記載の構築物。

【請求項72】

請求項６８～７２のいずれか一項に記載の構築物またはｄＲＮＡを含む、宿主細胞。

【請求項73】

請求項６８～７２のいずれか一項に記載の構築物またはｄＲＮＡ、及び宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための説明書を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、アデノシンデアミナーゼを動員して標的ＲＮＡ中の１つ以上のアデノシンを脱アミノ化することができる操作された線形または環状ＲＮＡを使用してＲＮＡを編集するための方法及び組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ゲノム編集は、生物医学研究及び疾患治療法の開発のための強力なツールである。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓタンパク質などの人工ヌクレアーゼを使用した編集技術は、無数の生物のゲノムを操作するために適用されている。最近、デアミナーゼタンパク質（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）など）を利用して、ＲＮＡ編集用の新しいツールが開発された。哺乳類細胞には、Ａｄａｒ１（２つのアイソフォーム、ｐ１１０とｐ１５０）、Ａｄａｒ２とＡｄａｒ３（触媒的に不活性）の３種類のＡＤＡＲタンパク質がある。ＡＤＡＲタンパク質の触媒基質は二本鎖ＲＮＡであり、ＡＤＡＲはアデノシン（Ａ）ヌクレオベースから－ＮＨ２基を除去し、Ａをイノシン（Ｉ）に変更することができる。（Ｉ）は、その後の細胞の転写及び翻訳プロセス中にグアノシン（Ｇ）として認識され、シチジン（Ｃ）とペアリングする。標的化ＲＮＡ編集を実現するには、ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインをλＮペプチド、ＳＮＡＰタグ、またはＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ１３ｂ）に融合し、ガイドＲＮＡがキメラＡＤＡＲタンパク質を標的部位に動員するように設計された。あるいは、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２タンパク質及びＲ／Ｇモチーフを持つガイドＲＮＡの過剰発現により、標的化ＲＮＡ編集が達成できることが報告されている。

【0003】

しかしながら、現在利用可能なＡＤＡＲを介したＲＮＡ編集技術には、一定の制限がある。例えば、遺伝子治療の最も効率的なインビボ送達はウイルスベクターを介するものであるが、非常に望ましいアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターはカーゴサイズ（約４．５ｋｂ）によって制限されるため、タンパク質とガイドＲＮＡの両方を収容することが困難になる。さらに、ＡＤＡＲ１の過剰発現は、ＲＮＡの異常な過剰編集により多発性骨髄腫に発がん性を与え、広範なグローバルなオフターゲット編集を引き起こすことが最近報告された。さらに、非ヒト起源のタンパク質またはそのドメインの異所性発現には、免疫原性を引き起こす潜在的なリスクが伴う。さらに、既存の適応免疫及びｐ５３媒介ＤＮＡ損傷応答は、Ｃａｓ９などの治療用タンパク質の有効性を妨げる可能性がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本願は、環状ＡＤＡＲ動員ＲＮＡ（「ｃｉｒｃ－ｄＲＮＡ」または「ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ」）を含む、ＡＤＡＲ動員ＲＮＡ（「ｄＲＮＡ」または「ａｒＲＮＡ」）を使用するＲＮＡ編集の方法を提供し、ＲＮＡタンパク質に作用する内因性アデノシンデアミナーゼ（「ＡＤＡＲ」）を使用してＲＮＡ編集をすることができる。また、本明細書では、操作されたｄＲＮＡ、またはこれらの方法で使用するための操作されたｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物、ならびにそれらを含む組成物及びキットも提供される。さらに本明細書では、個体の細胞の疾患または症状に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、個体の疾患または症状を治療または予防する方法が提供される。

【0005】

一態様では、本明細書は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法を提供し、ここで、（１）前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、前記二本鎖ＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、かつ（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の２つ以上の連続するヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、前記方法は、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの編集レベルを減少させることを含む。

【0006】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡである。

【0007】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない。

【0008】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端を置換するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない。

【0009】

別の態様では、本明細書は、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法を提供し、ここで、（１）ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、（２）ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員することができ、かつ（３）ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。

【0010】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡがリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列の長さが約５ヌクレオチド（ｎｔ）～約５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが約５０ｎｔ～約５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが約５ヌクレオチド（ｎｔ）～約５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが７０ｎｔ以下であり、場合により、リンカー核酸配列の長さが１０ｎｔ～５０ｎｔ、１０ｎｔ～４０ｎｔ、１０ｎｔ～３０ｎｔ、１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～５０ｎｔ、２０ｎｔ～４０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～５０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、または４０ｎｔ～５０ｎｔの間の任意の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり、場合により、リンカー核酸配列の長さが、約３０ｎｔ、または約５０ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれか１つがアデノシンまたはシチジンを含み、任意選択で、リンカー核酸配列の１００％がアデノシンまたはシチジンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列は、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。

【0011】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、リンカー核酸配列を含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列が、第２のリンカー核酸配列と同じである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列が、第２のリンカー核酸配列とは異なる。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、リンカー核酸配列が、標的化ＲＮＡ配列の５’末端と標的化ＲＮＡ配列の３’末端とを連結する。

【0012】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列とをさらに含む。

【0013】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、３’連結配列（ライゲーション配列）と５’連結配列とをさらに含む。いくつかの実施形態では、３’連結配列と５’連結配列が互いに少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、３’連結配列及び５’連結配列の長さが、約２０～約７５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、連結配列の長さが約５ヌクレオチド（ｎｔ）～約５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、連結配列の長さが７０ｎｔ以下であり、場合により、連結配列の長さが１０ｎｔ～５０ｎｔ、１０ｎｔ～４０ｎｔ、１０ｎｔ～３０ｎｔ、１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～５０ｎｔ、２０ｎｔ～４０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～５０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、または４０ｎｔ～５０ｎｔの間の任意の整数である。いくつかの実施形態では、連結配列の長さが、約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり、場合により、連結配列の長さが、約３０ｎｔ、または約５０ｎｔである。いくつかの実施形態では、連結配列の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれか１つがアデノシンまたはシチジンを含み、任意選択で、連結配列の１００％がアデノシンまたはシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡがＲＮＡリガーゼＲｔｃＢによって環状化される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢが宿主細胞内に内因的に発現される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（Ｒｎｌ１）またはＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）によって環状化される。

【0014】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物が、用量依存的に標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する。

【0015】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、前記方法が、ｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、構築物が、ｄＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターがポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）である。いくつかの実施形態では、プロモーターがポリメラーゼＩＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター」）である。いくつかの実施形態では、前記構築物がウイルスベクターまたはプラスミドである。いくつかの実施形態では、前記構築物がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、前記構築物が自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。

【0016】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、ＡＤＡＲが宿主細胞によって内因的に発現される。いくつかの実施形態では、宿主細胞がＴ細胞である。

【0017】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列の長さが約１００～約２００ｎｔ（例えば、約１５０ｎｔまたは約１７０ｎｔ）である。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいのシチジン、アデノシンまたはウリジンを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいのシチジンミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチが、標的化ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド、及び標的化ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの５’に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的ＲＮＡにおける標的アデノシンの３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。いくつかの実施形態では、標的アデノシンが、ＵＡＧの３塩基モチーフに位置し、標的化ＲＮＡが、３塩基モチーフのウリジンの真向かいのＡ、標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び３塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを含む。

【0018】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡである。

【0019】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、前記方法は、ＡＤＡＲ３阻害剤及び／またはインターフェロン刺激剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。

【0020】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、前記方法は、それぞれが異なる標的ＲＮＡを標的とする複数のｄＲＮＡまたは構築物を前記宿主細胞に導入することを含む。

【0021】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの編集効率が少なくとも４０％である。

【0022】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、前記方法は、ＡＤＡＲを前記宿主細胞に導入することをさらに含む。

【0023】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン脱アミノ化が、標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングもしくは選択的スプライシング、または標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングもしくは選択的スプライシングの復帰を引き起こす。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化が、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点突然変異、トランケート（切断）、伸長及び／またはミスフォールディング、あるいは標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングもしくは選択的スプライシングの復帰による機能的で、完全長の、正しくフォールディングされた、及び／または野生型タンパク質を引き起こす。

【0024】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、宿主細胞が真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞が哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である。

【0025】

別の態様では、本明細書は、上記のいずれか一項の方法によって生成された編集されたＲＮＡ、または編集されたＲＮＡを有する宿主細胞を提供する。

【0026】

別の態様では、本明細書は、上記のいずれか一項の方法にしたがって、個体の細胞内に疾患または症状に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、個体の前記疾患または症状を治療または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記疾患または症状が、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の後天性遺伝子変異に関連する疾患または症状である。いくつかの実施形態では、前記疾患または症状が、単一遺伝子または多遺伝子疾患または症状である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡが、ＧからＡへの変異を有する。

【0027】

上記のいずれか一項の方法によるいくつかの実施形態では、標的ＲＮＡがＴＰ５３であり、前記疾患または症状ががんである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡがＩＤＵＡであり、前記疾患または症状がムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡがＣＯＬ３Ａ１であり、前記疾患または症状がエーラス・ダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ－Ｄａｎｌｏｓ）症候群である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡがＢＭＰＲ２であり、前記疾患または症状がジュベール（Ｊｏｕｂｅｒｔ）症候群である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡがＦＡＮＣＣであり、前記疾患または症状がファンコニ貧血である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡがＭＹＢＰＣ３であり、前記疾患または症状が原発性家族性肥大型心筋症である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡがＩＬ２ＲＧであり、前記疾患または症状がＸ連鎖重度複合免疫不全症である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡがＭＡＬＡＴ１であり、前記疾患または症状が高血糖症である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡがＲＡＢ７Ａであり、前記疾患または症状がシャルコー・マリー・トゥース（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ）症候群２Ｂ型（ＣＭＴ２Ｂ）である。

【0028】

上記のいずれか一項の方法に使用するための組成物、キット、及び製品も提供される。

【0029】

別の態様では、本明細書は、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡを編集するためのｄＲＮＡを提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中に非標的アデノシンを含有するバルジを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の２つ以上の連続するヌクレオチドを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、前記方法は、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの編集レベルを減少させることを含む。

【0030】

上記のいずれか一項のｄＲＮＡによるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡである。

【0031】

上記のいずれか一項のｄＲＮＡによるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端を置換するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない。

【0032】

本明細書で提示される別の態様は、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡを編集するためのｄＲＮＡであり、ここで、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。

【0033】

本明細書で提示される別の態様は、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡを編集するためのｄＲＮＡであり、ここで、前記ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端を置換するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。

【0034】

上記のいずれか一項のｄＲＮＡによるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡがリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列の長さが約５ヌクレオチド（ｎｔ）～約５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが約５０ｎｔ～約５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが約５ヌクレオチド（ｎｔ）～約５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが７０ｎｔ以下であり、場合により、リンカー核酸配列の長さが１０ｎｔ～５０ｎｔ、１０ｎｔ～４０ｎｔ、１０ｎｔ～３０ｎｔ、１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～５０ｎｔ、２０ｎｔ～４０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～５０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、または４０ｎｔ～５０ｎｔの間の任意の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり、場合により、リンカー核酸配列の長さが、約３０ｎｔ、または約５０ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれか１つがアデノシンまたはシチジンを含み、任意選択で、リンカー核酸配列の１００％がアデノシンまたはシチジンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列は、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。

【0035】

上記のいずれか一項のｄＲＮＡによるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、リンカー核酸配列を含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列が、第２のリンカー核酸配列と同じである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列が、第２のリンカー核酸配列とは異なる。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、リンカー核酸配列が、標的化ＲＮＡ配列の５’末端と標的化ＲＮＡ配列の３’末端とを連結する。

【0036】

上記のいずれか一項のｄＲＮＡによるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列とをさらに含む。

【0037】

上記のいずれか一項のｄＲＮＡによるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、３’連結配列と５’連結配列とをさらに含む。いくつかの実施形態では、３’連結配列と５’連結配列が互いに少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、３’リンカー配列及び５’リンカー配列の長さが、約２０～約７５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡがＲＮＡリガーゼＲｔｃＢによって環状化される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢが宿主細胞内に内因的に発現される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（Ｒｎｌ１）またはＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）によって環状化される。

【0038】

上記のいずれか一項のｄＲＮＡによるいくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列の長さが約１００～約２００ｎｔ（例えば、約１５０ｎｔまたは約１７０ｎｔ）である。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいのシチジン、アデノシンまたはウリジンを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいのシチジンミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチが、標的化ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド、及び標的化ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの５’に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的ＲＮＡにおける標的アデノシンの３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。いくつかの実施形態では、標的アデノシンが、ＵＡＧの３塩基モチーフに位置し、標的化ＲＮＡが、３塩基モチーフのウリジンの真向かいのＡ、標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び３塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを含む。

【0039】

上記のいずれか一項のｄＲＮＡによるいくつかの実施形態では、標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡである。

【0040】

いくつかの実施形態では、上記のいずれか一項のｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む、構築物が提供される。いくつかの実施形態では、構築物が、ｄＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、ここで、該プロモーターがＰｏｌ ＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記構築物がウイルスベクターまたはプラスミドである。いくつかの実施形態では、前記構築物がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、前記構築物が自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。

【0041】

いくつかの実施形態では、上記のいずれか一項の構築物またはｄＲＮＡを含む、宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、上記のいずれか一項の構築物またはｄＲＮＡを含むキットが提供され、ここで、キットは、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための説明書をさらに含む。

【0042】

なお、本明細書に記載される様々な実施形態の１つ、一部、またはすべての特徴を組み合わせて、本願の他の実施形態を形成できることを理解されたい。本願のこれら及び他の実施形態については、以下の発明を実施するための形態でさらに説明する。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1A】図１Ａ～１Ｃは、ｐｏｌ ＩＩプロモーター（ＣＭＶ）によって駆動されるａｒＲＮＡを発現するプラスミド及びＰｏｌ ＩＩＩプロモーター（Ｕ６）によって駆動されるａｒＲＮＡを発現するプラスミドのトランスフェクション後のＦＡＣＳ分析を示す図である。図１Ａは、Ｕ６またはＣＭＶプロモーターを介して遺伝的にコードされたａｒＲＮＡの概略図を示す。蛍光レポーター遺伝子１を標的とする１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡが、ヒトＵ６またはＣＭＶプロモーターの下で発現された。レポーター遺伝子１では、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子が、３ｘＧＧＧＧＳコード領域とインフレームＵＡＧ終止コドンを含む配列によって連結された。レポーター遺伝子によって発現される細胞はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のみを産生し、レポーター遺伝子転写物のＵＡＧ終止コドンを標的編集することでＵＡＧをＵＩＧに変換し、下流でのＥＧＦＰ発現が可能になる。

【図1B】図１Ｂは、ＧＡＰＤＨで正規化したａｒＲＮＡ発現レベルのＦＡＣＳ結果を示す。

【図1C】図１Ｃは、ＥＧＦＰ^＋パーセンテージのＦＡＣＳ結果を示し、レポーター遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるレポーター遺伝子転写物を標的とするさまざまなプロモーター駆動型ａｒＲＮＡの編集効率を示す。ＥＧＦＰ＋細胞の割合は、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋によって測定されたトランスフェクション効率によって正規化される。

【図2A】図２Ａ～２Ｎは、環状ＡＤＡＲ動員ＲＮＡ（ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ）の編集有効性を示し、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが内因性転写物に対して効率的かつ耐久性のあるプログラム可能なＲＮＡ編集が可能であることを示す図である。図２Ａは、蛍光レポーター遺伝子１を標的とする遺伝子コーディングｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの模式図を示す。

【図2B】図２Ｂは、線形ａｒＲＮＡ及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの発現レベルを示す定量的ＰＣＲの結果を示す。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）として表され、ｎは並行して実行された独立した実験の数を表す；対応のない両側スチューデントｔ検定、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図2C】図２Ｃは、レポーター遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるレポーター転写物を標的とするＵ６プロモーター及びＣＭＶプロモーターによって駆動されるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの編集効率を示すＥＧＦＰ^＋パーセンテージのＦＡＣＳ結果を示す。ＥＧＦＰ^＋パーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）として表され、ｎは並行して実行された独立した実験の数を表す；対応のない両側スチューデントｔ検定、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図2D】図２Ｄは、ＥＧＦＰ^＋パーセンテージのＦＡＣＳ結果を示し、レポーター遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるレポーター遺伝子転写物を標的とする異なるａｒＲＮＡバージョンの編集効率を示す。ＥＧＦＰ^＋パーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。

【図2E】図２Ｅは、Ｕ６駆動の線形ａｒＲＮＡ及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡをトランスフェクションした後の２、９、及び１８日目の、レポーター遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ発現を示す。スケールバーは２００μｍである。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）、ｎは並行して実行された独立した実験の数を表す。

【図2F】図２Ｆは、内因性ＡＤＡＲに対するａｒＲＮＡ及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの依存性を示すＥＧＦＰ^＋パーセンテージのＦＡＣＳ結果を示す。ＥＧＦＰ^＋パーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）、ｎは並行して実行された独立した実験の数を表す。

【図2G】図２Ｇは、複数の細胞株におけるレポーター遺伝子転写物を標的とするａｒＲＮＡの異なるバージョンの編集効率を示すＥＧＦＰ^＋パーセンテージのＦＡＣＳ結果を示す。ＥＧＦＰ^＋パーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。

【図2H】図２Ｈは、６つの遺伝子（ＰＰＩＡ、ＫＲＡＳ、ＲＡＢ７Ａ、ＦＡＮＣＣ、ＭＡＬＡＴ１、及びＴＰ５３）及びそれらの対応するａｒＲＮＡ／ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの内因性転写産物の概略図を示す。

【図2I】図２Ｉは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＵ６駆動線形ａｒＲＮＡ及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによる、ＰＰＩＡ、ＫＲＡＳ、ＲＡＢ７Ａ、ＦＡＮＣＣ、ＭＡＬＡＴ１、及びＴＰ５３転写物の標的アデノシンに対する編集比率を示すディープシーケンシングの結果を示す。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）、ｎは並行して実行された独立した実験の数を表す。

【図2J】図２Ｊは、線形ａｒＲＮＡに対して正規化された編集比率の対応する倍率変化を示す。有意性は対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して分析された；ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１については＊＊＊＊Ｐ＝１．３３１２４×１０^－１０、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１＿ＡＣ５０についてはＰ＝１．２０２８９×１０^－１０である；中心線、中央値；限界、７５％及び２５％；ひげ、最大値と最小値；部位あたりｎ＝３、２０部位。

【図2K】図２Ｋは、ＡＡＶ送達ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡに感染したＨＥＫ２９３Ｔ細胞における標的化編集率を示す次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の結果を示し、ｎ＝２、平均±ｓ．ｄ．。

【図2L】図２Ｌは、ＡＡＶ送達ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡに感染したヒト初代肝細胞における標的化編集率を示す次世代シークエンシングの結果を示し、ｎ＝２、平均±ｓ．ｄ．。

【図2M】図２Ｍは、ＡＡＶ送達ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡに感染した脳オルガノイドＰＰＩＡにおける標的化編集率を示す次世代シークエンシングの結果を示す。ｎ＝２、平均±ｓ．ｄ．。

【図2N】図２Ｎは、ＡＡＶ送達ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡに感染した脳オルガノイドＦＡＮＣＣにおける標的化編集率を示す次世代シーケンシングの結果を示し、ｎ＝４、平均±ｓ．ｄ．。

【図3A】図３Ａ～３Ｅは、インビトロ環状化された環状ＡＤＡＲ動員ＲＮＡ（ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ）による標的化ＲＮＡ編集のための内因性ＡＤＡＲタンパク質を示す。図３Ａは、インビトロ転写によって環状化されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡのＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す。上：Ｔ４ Ｒｎｌ処理なしの前駆体。中央：Ｔ４ Ｒｎｌ１によって連結されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ。下：Ｔ４ Ｒｎｌ２によって連結されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ。

【図3B】図３Ｂは、レポーター遺伝子転写物の標的部位のＡからＩへの変換率のディープシークエンシング解析を示す。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。

【図3C】図３Ｃは、Ｔ４ Ｒｎｌによって環状化されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入することによる、ＰＰＩＢ転写物の標的化されたアデノシンに対する編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す。

【図3D】図３Ｄは、グループＩリボザイム自己触媒的に結合したｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡをハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）症候群マウスから産生した初代ＭＥＦ細胞株に導入することによるＩｄｕａ転写物の標的化されたアデノシンの編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝２または３、ｎは並行して実行される独立した実験の数を表す。

【図3E】図３Ｅは、前駆体（上）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１で連結されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ（中央）、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２で連結されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ（下）でトランスフェクションした後の標的領域のサンガーシーケンシングの結果を示すエレクトロフェログラムを示す。

【図4A】図４Ａ～４Ｊは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによるＲＮＡ編集の全トランスクリプトームの特異性、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡのオフターゲット部位分析を示し、ＰＰＩＡの発現レベル及びスプライシングパターンがｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡの影響を受けないことを示す。図４Ａ～４Ｂは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１及びＡＤＡＲ２_ＤＤ過剰発現グループの全トランスクリプトームオフターゲット分析の結果を示す。ＰＰＩＡのオンターゲット部位を図４Ａに示す。ＰＰＩＡターゲティングＲＮＡグループ及びＡＤＡＲ２_ＤＤ過剰発現グループで同定された潜在的なオフターゲット部位は標識されていない。

【図4B】図４Ａ～４Ｂは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１及びＡＤＡＲ２_ＤＤ過剰発現グループの全トランスクリプトームオフターゲット分析の結果を示す。ＰＰＩＡターゲティングＲＮＡグループ及びＡＤＡＲ２_ＤＤ過剰発現グループで同定された潜在的なオフターゲット部位は標識されていない。

【図4C】図４Ｃは、天然編集部位に対するｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡの効果の全トランスクリプトーム分析を示す。３つの独立した実験が実行された。

【図4D】図４Ｄは、オフターゲット部位の分布を示す。

【図4E】図４Ｅは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１の最小自由エネルギーとＲＮＡハイブリッドのオフターゲット部位領域を示す。

【図4F】図４Ｆは、トランスクリプトームレベルのＲＮＡ配列データからの、対照ＲＮＡ_１５１（Ｃｔｒｌ－ＲＮＡ_１５１）及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１（ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１）の効果の差次的遺伝子発現解析を示す。ＦＰＫＭ値はＳＴＲＩＮＧＴＩＥツールを使用して計算され、グローバルな差次的遺伝子発現はピアソン相関係数分析を使用して評価された。

【図4G】図４Ｇは、対照ＲＮＡ_１５１及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡでトランスフェクトされた細胞におけるＰＰＩＡタンパク質発現レベルを示す免疫ブロットを示す。

【図4H】図４Ｈは、ＧＡＰＤＨに対して正規化した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における標的化ＰＰＩＡ転写物の発現レベルに対するｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ対対照ＲＮＡの効果を示す定量的ＰＣＲを示す。ｎ＝３、平均±ＳＤ。

【図4I】図４Ｉは、２つの主要なＰＰＩＡスプライシングアイソフォームのＦＰＫＭを示す。ｎｓ、有意ではない；ｎ＝２、平均±ＳＤ。対応のない両側スチューデントのｔ検定、ｎｓ、有意ではない。

【図4J】図４Ｊは、標的遺伝子のスプライス接合部を示す。上、ＲＮＡシーケンス解析におけるＰＰＩＡスプライシングアイソフォーム。中央、対照ＲＮＡ_１５１のＰＰＩＡスプライシング接合部。下、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１のＰＰＩＡスプライシング接合部。

【図5A】図５Ａ～５Ｍは、操作されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによる隣接塩基のオフターゲット編集、ならびにＡＤＡＲ及びインターフェロン刺激遺伝子の相対的な定量的発現レベルを示す。図５Ａは、蛍光レポーター遺伝子１を標的とするａｒＲＮＡの概略図を示し、標的となるアデノシンに対向するヌクレオチド欠失（線形ａｒＲＮＡ_ΔＣ）（上）、及びＥＧＦＰ^＋パーセンテージは、レポーターを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるａｒＲＮＡ及びａｒＲＮＡ_ΔＣを標的とするレポーター転写物の編集効率を示す（下）。

【図5B】図５Ｂは、蛍光レポーター１を標的とするｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの概略図を示し、標的となるアデノシン（ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_ΔＣ）に対向するヌクレオチド欠失（上）、及びＥＧＦＰ^＋パーセンテージは、レポーターを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるａｒＲＮＡ及びａｒＲＮＡ_ΔＣを標的とするレポーター転写物の編集効率を示す（下）。

【図5C】図５Ｃは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１（上）及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ８}（下）によって標的化されるＰＰＩＡ転写配列の概略図を示す。標的化されるアデノシンは７６番目にある。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ８}は、容易に編集可能なモチーフ（editing prone motif）における潜在的なオフターゲットを最小限に抑えるために、Ａ１８番目（Ａ^１８ｔｈ）、Ａ２５番目、Ａ３３番目、Ａ４１番目、Ａ４２番目、Ａ４７番目、Ａ５９番目、及びＡ８７番目にアデノシン欠失を持っている。

【図5D】図５Ｄは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ８}のＰＰＩＡ転写物のオンターゲット編集比率を示す。

【図5E】図５Ｅは、Ａ１８番目、Ａ２５番目、Ａ３３番目、Ａ４１番目、Ａ４２番目、Ａ４７番目、Ａ５９番目、及びＡ８７番目におけるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ８}のオフターゲット編集比率を示す。

【図5F】図５Ｆは、１５１ｎｔのａｒＲＮＡによってカバーされるＰＰＩＡ転写物配列の概略図を示す。黒い矢印は標的とされたアデノシンを示し、潜在的なオフターゲットのアデノシンは赤色でマークされている。容易に編集可能なモチーフにおける潜在的なオフターゲット編集を最大限に低減するように、ＰＰＩＡ転写物を標的とするｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}には、Ａ６番目、Ａ１３番目、Ａ１８番目、Ａ２５番目、Ａ３３番目、Ａ４１番目、Ａ４２番目、Ａ４７番目、Ａ５９番目、Ａ７２番目、Ａ８７番目、Ａ１０３番目、Ａ１１０番目、及びＡ１２９番目の反対側にＵ欠失がある。

【図5G】図５Ｇは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１＿ＡＣ５０及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}＿ＡＣ５０グループにおけるオフターゲットアデノシンの編集比率を示す；ｎ＝３、平均±ｓ．ｄ。

【図5H】図５Ｈは、ＰＰＩＡ転写物中のｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１＿ＡＣ５０及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}＿ＡＣ５０によってカバーされるアデノシンの編集比率ヒートマップを示す；ｎ＝３。灰色の三角形は、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}＿ＡＣ５０のＵ欠失の位置を表し、青い三角形は、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ５}に基づくｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ８}の追加のＵ欠失の位置を表す。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}＿ＡＣ５０におけるＵ欠失の位置は、灰色、青色及び黒色の三角形で示されている。

【図5I】図５Ｉは、ｃｉｒｃ－ＲＮＡ_１５１＿ＡＣ５０の編集された読み取り値を示すＩＧＶの結果を示す。

【図5J】図５Ｊは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}＿ＡＣ５０の編集された読み取り値を示すＩＧＶの結果を示す。

【図5K】図５Ｋは、インビトロ環状化ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}が用量依存的に標的部位で効率的なＲＮＡ編集を達成することを示す。ｎ＝２、平均±ＳＤ。

【図5L】図５Ｌは、ＧＡＰＤＨに対して正規化された、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、及びＡＤＡＲ２の相対発現レベルを示すヒートマップを示す。

【図5M】図５Ｍは、ＧＡＰＤＨに対して正規化されたインターフェロン刺激遺伝子の相対発現レベルを示すヒートマップを示す；ｎ＝２、平均±ＳＤ。

【図6A】図６Ａ～６Ｇは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによって回復された変異体ＴＰ５３^Ｗ５３Ｘの転写調節活性を示す。図６Ａは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１＿ＡＣ５０（上）及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}＿ＡＣ５０（下）によって標的化されるＴＰ５３転写配列の概略図を示す。

【図6B】図６Ｂは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡＧ１}、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡＧ４}、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１}、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１＿ＡＣ５０、及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}＿ＡＣ５０によるＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ転写物の標的化編集を示すディープシーケンシングの結果を示す。

【図6C】図６Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＰ５３^－／－細胞におけるＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ転写物からのｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによる全長ｐ５３タンパク質の産生の回復を示すウェスタンブロットを示す。

【図6D】図６Ｄは、同時トランスフェクトされたエクオレア－ルシフェラーゼベクターによって正規化された、復元されたｐ５３タンパク質の転写調節活性を検出するためのｐ５３－ホタルルシフェラーゼレポーターシステムの使用を示す。

【図6E】図６Ｅは、Ａ１８番目、Ａ２５番目、Ａ３３番目、Ａ４１番目、Ａ４２番目、Ａ４７番目、Ａ５９番目及びＡ８７番目におけるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ８}のオフターゲット編集比率のディープシーケンシングの結果を示す。すべてのデータは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）を表し、ｎは並行して実行された独立した実験の数を示す。

【図6F】図６Ｆは、臨床的に関連するｃ．１５８ＧからＡへのナンセンス変異（Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）を含む１５１－ｎｔのａｒＲＮＡによってカバーされるＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ転写物配列の概略図を示す。黒い矢印は、標的化されたアデノシンを示す。ＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ転写物を標的とするｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、容易に編集可能なモチーフにおける潜在的なオフターゲット編集を最小限に抑えるために、Ａ６６番目、Ａ３６番目、Ａ１１１番目、及びＡ１１４番目の反対側にＵ欠失をもつように設計された。

【図6G】図６Ｇは、ＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ転写物（青色で強調表示）中の示されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集比率のヒートマップを示す。Δはｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡのＵ欠失部位を示す；ｎ＝３。

【図7A】図７Ａ～７Ｃは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによるハーラー症候群マウスにおけるＩＤＵＡ活性の回復を示す図である。図７Ａは、マウス肝細胞におけるＩｄｕａ転写物の標的化アデノシンの編集比率を示すディープシーケンシングの結果を示す。

【図7B】図７Ｂは、４－メチルウンベリフェロンＩＤＵＡ基質に対するＩＤＵＡの触媒活性を示す。

【図7C】図７Ｃは、異なる処理におけるＩｄｕａ転写物の発現レベルを示す定量的ＰＣＲ結果を示す。シグナルはＧＡＰＤＨ転写物で正規化された。すべてのデータは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ≧３）として表され、ｎは並行して実行された独立した実験の数を表す；対応のない両側スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。

【図8A】図８Ａは、ａｒＲＮＡ配列の５’末端及び３’末端に隣接する隣接リンカー配列を有する環状ａｒＲＮＡ（ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ）の概略図を示す図である。

【図8B】図８Ｂは、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの様々な設計における隣接リンカー配列の位置を示す図である。

【図8C】図８Ｃは、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞及びＦＲＨＫ－４細胞におけるｍｆ－ＰＰＩＡ－ＵＴＲ２を標的とする様々なｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡのオンターゲット編集効率を示す図である。

【図8D】図８Ｄは、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞においてｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１－Ｌ、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１－Ｒ、及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１－ＬＲを使用したｍｆ－ＰＰＩＡ－ＵＴＲ２アンプリコンの各アデノシン（位置はｘ軸にマークされている）編集（つまり、ＡからＧへの変換）率を示す図である。

【図8E】図８Ｅは、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞及びＦＲＨＫ－４細胞におけるｍｆ－ＰＰＩＡ－３を標的とする様々なｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡのオンターゲット編集効率を示す図である。

【図8F】図８Ｆは、ＦＲＨＫ－４細胞におけるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１－Ｒ、及び無関係ａｒＲＮＡ（ＵＴ）を使用した、ｍｆ－ＰＰＩＡ－３アンプリコンにおける各アデノシンの編集比率を示す図である。

【図8G】図８Ｇは、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞及びＦＲＨＫ－４細胞におけるｍｆ－ＩＤＵＡ－１を標的とする様々なｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡのオンターゲット編集効率を示す。

【図8H】図８Ｈは、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞におけるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１＋ＬＲ、及び無関係ａｒＲＮＡ（ＵＴ）を使用した、ｍｆ－ＩＤＵＡ－１アンプリコンにおける各アデノシンの編集比率を示す図である。

【図9A】図９Ａは、ＦＲＨＫ及びＬＬＣ－ＭＫ２細胞におけるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１及びＵ欠失（－１、－２、－３、－４、－４３、－４３２、及び－４３２１）を含むｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ構築物の使用による、ｍｆ－ＰＰＩＡ－３アンプリコンの位置１２７（４オフターゲット）、１３２（３オフターゲット）、１５５（オンターゲット）、１６０（２オフターゲット）、及び１６８（１オフターゲット）の編集比率のヒートマップを示す図である。

【図9B】図９Ｂは、ＦＲＨＫ及びＬＬＣ－ＭＫ２細胞におけるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１及びＵ欠失（－１、－２、－３、－４、－４３、－４３２、及び－４３２１）を含むｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ構築物の使用による、ｍｆ－IDUA－１アンプリコンの位置６２（４オフターゲット）、９１（３オフターゲット）、１０２（２オフターゲット）、１１８（１オフターゲット）、及び１３４（オンターゲット）の編集比率のヒートマップを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0044】

本出願は、宿主細胞における標的ＲＮＡを編集するために、改善されたＲＮＡ編集法及び特別に設計されたＲＮＡ（本明細書ではデアミナーゼ動員ＲＮＡ（「ｄＲＮＡ」）またはＡＤＡＲ－動員ＲＮＡ（「ａｒＲＮＡ」）、またはこれらのａｒＲＮＡをコードする核酸を含む構築物と呼ばれる）を提供する。

【0045】

「ＬＥＡＰＥＲ」（内因性ＡＤＡＲを使用したＲＮＡのプログラム可能編集）は、本願の発明者らによって以前に開発されており、内因性ＡＤＡＲを利用して、ｄＲＮＡを用いて標的ＲＮＡを編集する。ＬＥＡＰＥＲ法は、ＷＯ２０２１／００８４４７及びＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７１２９２に記載されており、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、標的転写物に部分的に相補的な標的化ＲＮＡを使用してネイティブＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を動員し、オンターゲットＲＮＡ上の特定の部位でアデノシンをイノシンに変換する。したがって、宿主細胞内でＡＤＡＲタンパク質を異常発現または過剰発現させることなく、一部のシステムではＲＮＡ編集を実現できる。

【0046】

本願は、編集効率の向上、オフターゲット（本明細書では「バイスタンダー編集」とも呼ばれる）効果の低減、及び／またはより正確で耐久性のあるＲＮＡ編集を可能にする改良されたＬＥＡＰＥＲ方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは線形または環状であり、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンと塩基対を形成する１つ以上のウリジンの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡであり、環状ＲＮＡは、標的ＲＮＡに部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列に隣接する１つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、二次構造を形成しやすいＲＮＡ配列を標的とする環状ｄＲＮＡのオンターゲット編集効率を高めることができる。本明細書に記載される環状ｄＲＮＡは、線形ｄＲＮＡと比較して安定性及び有効性が向上する。ここで説明する方法は、病原性点突然変異を修正するために使用することに成功している。改良されたＬＥＡＰＥＲ方法は、治療や生物医学研究に幅広い応用可能性をもたらすことができる。

【0047】

したがって、本願の一態様は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法を提供し、ここで、（１）ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、かつ（２）ｄＲＮＡが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる。

【0048】

本願の別の態様は、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法を提供し、ここで、（１）ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、（２）ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員することができ、かつ（３）ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである。

【0049】

本願の別の態様は、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法を提供し、ここで、（１）ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端を置換するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、（２）ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員することができ、かつ（３）ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである。

【0050】

Ｉ．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての特許、出願、公開出願、及びその他の刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。このセクションに記載されている定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、またはその他の出版物に記載されている定義と相反または矛盾している限り、このセクションに記載されている定義は、参照により本明細書に組み込まれる定義より優先される。

【0051】

明確にするために別個の実施形態の文脈で説明される本開示の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせて提供されてもよいことを理解されたい。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明される本開示のさまざまな特徴は、個別に、または任意の適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。特定の方法ステップ、試薬、または条件に関する実施形態のすべての組み合わせが特に本開示に含まれ、あたかも各組み合わせが個別に明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。

【0052】

本明細書で使用される場合、「バルジ」という用語は、核酸二本鎖の一方の鎖における１つ以上の不対ヌクレオチド（例えば、非標的アデノシン）によって形成される核酸二本鎖における非対称のバブリング領域を指す。本明細書に記載のバルジは、一方の鎖に完全に不対の領域を有し、反対側の鎖には対応する相補的領域を一切有さない場合がある。あるいは、本明細書に記載されるバルジは、異なる数のヌクレオチドを有する２つの非相補的領域（各鎖に１つ）から形成され得、これは、ワトソン・クリック塩基対を形成しないミスマッチヌクレオチドをさらに含み得る。２つの非相補的領域のうち長い方は、反対側の鎖の非相補的領域内のどのヌクレオチドとも対にならない少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、非標的アデノシン）を有する。すなわち、反対側の鎖は、バルジに隣接する核酸配列に相補的な核酸配列を含むが、反対側の鎖はバルジ内のヌクレオチド(例えば、非標的アデノシン)に対向する少なくとも1つのヌクレオチドを含まない。本明細書で使用される場合、「バルジ」には、核酸二本鎖の一方の鎖内に位置するヌクレオチドの完全なミスマッチ領域は含まれない。すなわち、反対側の鎖は、バルジ内のすべてのヌクレオチドに相補的ではないヌクレオチドを含み、その結果、核酸二本鎖に対称的なバブリングが生じる。いくつかの実施形態では、バルジは、不対ヌクレオチドを有する鎖内に１、２、３、４、５、または５を超えるヌクレオチドを含む。例えば、図５Ａの模式図に示される二本鎖は、ｍＲＮＡ鎖（上部鎖）に１ヌクレオチドを含むバルジを有し、このヌクレオチドは線形ａｒＲＮＡｄＣ鎖（下部鎖）ヌクレオチドに対応するものを持たない非標的アデノシンである。

【0053】

第１の核酸鎖及び第２の核酸鎖が二本鎖核酸領域を形成する場合、第２の核酸鎖の第２のヌクレオシドと塩基対合した第１の核酸鎖の第１のヌクレオシドは、本明細書では互いに「対向する」または「対応する」と記載される。すなわち、第１のヌクレオシドは第２のヌクレオシドに対向し、第２のヌクレオシドは第１のヌクレオシドに対向する。

【0054】

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は置き換えて使用できる。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。当業者であれば、ウラシルを表すのに「ｕ」を使用し、チミンを表すのに「ｔ」を使用する代わりに、ウラシルとチミンの両方を「ｔ」で表すことができることを理解するであろう。また、リボ核酸（ＲＮＡ）に関しては、特に明記しない限り、「ｔ」はウラシルを表すために使用されることが理解されるであろう。

【0055】

「デアミナーゼ動員ＲＮＡ」、「ｄＲＮＡ」、「ＡＤＡＲ動員ＲＮＡ」及び「ａｒＲＮＡ」という用語は、本明細書では置き換えて使用でき、ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するためにＡＤＡＲを動員することができる操作されたＲＮＡを指す。

【0056】

「グループＩイントロン」及び「グループＩ触媒イントロン」という用語は互換的に使用され、ＲＮＡ前駆体からのそれ自体の切除を触媒する自己スプライシングリボザイムを指す。グループＩイントロンは、５’触媒グループＩイントロンフラグメントと３’触媒グループＩイントロンフラグメントの２つのフラグメントを含み、フォールディング機能と触媒機能（つまり、自己スプライシング活性）を保持している。天然環境では、５’触媒グループＩイントロンフラグメントの５’末端に、５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列を含む５’エクソンが隣接しており、３’触媒グループＩイントロンフラグメントの３’末端に、３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列を含む３’エクソンが隣接している。本明細書で使用される場合、「５’エクソン配列」及び「３’エクソン配列」という用語は、グループＩイントロンに対する自然環境におけるエクソンの順序にしたがって標識される。

【0057】

本明細書で使用される「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」及び「ヒポキサンチン」という用語は、核酸塩基それ自体を指す。「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」及び「イノシン」という用語は、リボースまたはデオキシリボース糖部分に結合された核酸塩基を指す。「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボースに結合した核酸塩基を指す。「ヌクレオチド」という用語は、それぞれの核酸塩基-リボシル-リン酸または核酸塩基-デオキシリボシル-リン酸を指す。アデノシンとアデニン（略して「Ａ」）、グアノシンとグアニン（略して「Ｇ」）、シトシンとシチジン（略して「Ｃ」）、ウラシルとウリジン（略して、「Ｕ」）、チミン及びチミジン（略して「Ｔ」）、イノシン及びヒポキサンチン（略して「Ｉ」）は、対応する核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを指し、交換可能に使用される。文脈が明らかに異なって要求しない限り、核酸塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチドという用語は交換可能に使用されることがある。

【0058】

「機能的タンパク質」という用語は、遺伝性疾患または遺伝的症状の治療において機能的である、天然に存在するタンパク質、その機能的変異体、またはその操作された誘導体を指す。疾患または症状は、機能的タンパク質に対応する野生型の天然タンパク質における突然変異などの変化によって、全体的または部分的に引き起こされる可能性がある。

【0059】

参照タンパク質の「機能的バリアント」という用語は、参照タンパク質またはその一部に由来し、参照タンパク質と実質的に同じ活性（例えば、標的結合活性または酵素活性）を有するバリアントポリペプチドを指す。「実質的に同じ活性」とは、参照タンパク質の活性の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の活性レベルを意味する。

【0060】

本開示は、バリアント及び誘導体を含む、いくつかのタイプのポリヌクレオチドまたはポリペプチドに基づく組成物を提供する。これらには、例えば、置換、挿入、欠失及び共有結合バリアント及び誘導体が含まれる。「誘導体」という用語は「バリアント」という用語と同義であり、一般に、参照分子または出発分子に対して何らかの方法で修飾及び／または変更された分子を指す。

【0061】

本明細書で使用される「導入すること」または「導入」という用語は、ｄＲＮＡなどの１つ以上のポリヌクレオチド、または本明細書に記載のベクターを含む１つ以上の構築物、その１つ以上の転写物の宿主細胞への送達を指す。本発明は、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）などのＲＮＡの標的編集を達成するための基本プラットフォームとして機能する。本願の方法は、ウイルス、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、及びコンジュゲーションを含むがこれらに限定されない多くの送達システムを使用して、本明細書に記載されるｄＲＮＡまたは構築物の前記宿主細胞への導入を達成することができる。従来のウイルス及び非ウイルス遺伝子導入法を使用して、哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入できる。このような方法は、本願のｄＲＮＡをコードする核酸を培養中の細胞または宿主生物に投与するために使用することができる。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載の構築物の転写物）、裸の核酸、及び送達ビヒクル（例えば、リポソーム）と複合体を形成した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、宿主細胞に送達するためのエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムを有するＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが含まれる。

【0062】

本出願の文脈において、「標的ＲＮＡ」は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ配列がそれと完全な相補性または実質的な相補性を有するように設計され、標的配列とｄＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションが、標的アデノシンを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を形成するＲＮＡ配列を指し、それはＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）が、標的アデノシンを脱アミノ化するように動員する。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、真核細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞）などの宿主細胞に自然に存在する。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、宿主細胞に導入される。

【0063】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、第２の核酸配列に作動可能に連結された第１の核酸配列である場合、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある状況を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。同様に、シグナルペプチドがポリペプチドの細胞外分泌に影響を及ぼす場合、シグナルペプチドのコード配列は、ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結される。通常、作動可能に連結された核酸配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結するために必要な場合にはオープンリーディングフレームが整列している。

【0064】

本明細書で使用される場合、「連結する」とは、例えば挿入された核酸配列を介して核酸配列を直接的または間接的に結合することを意味する。

【0065】

本明細書で使用される場合、「相補性」は、従来のワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成によって別の核酸と水素結合を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸と水素結合（すなわち、ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち約５、６、７、８、９、１０がそれぞれ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての連続する残基が、第２の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００のいずれか１つである相補性の程度、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。

【0066】

本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性を有する核酸が主に標的配列とハイブリダイズし、実質的に非標的配列にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は一般に配列に依存し、多くの要因によって異なる。一般に、配列が長いほど、その配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ，Ｙに詳細に記載されている。

【0067】

「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、またはその他の配列特異的な方法で発生できる。所定の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所定の配列の「相補体」と呼ばれる。

【0068】

「被験者」、「患者」、または「個体」は、ヒトまたは他の動物、典型的にはヒトなどの哺乳動物を含む。いくつかの実施形態では、治療薬及び組成物が投与される患者などの被験者は、哺乳動物、典型的にはヒトなどの霊長類である。いくつかの実施形態では、霊長類はサルまたは類人猿である。被験者は男性でも女性でもよく、幼児、青少年、青年、成人、高齢者を含む任意の適切な年齢であってもよい。いくつかの実施形態では、被験者は、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシまたはウマなどの家畜などの非霊長類哺乳動物である。

【0069】

本明細書で使用されるように、「治療」という用語は、臨床病理中に治療される個体または細胞の自然なプロセスに対して有益かつ望ましい効果をもたらすように設計された臨床介入を指す。本開示の目的のために、所望の治療結果には、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、及び予後の緩和または改善が含まれるが、これらに限定されない。例えば、がん細胞の増殖の減少（または破壊）、がん細胞の死滅の増加、疾患によって引き起こされる症状の緩和、疾患の蔓延の予防、疾患の再発の予防、疾患に罹患しているヒトの生活の質の改善、疾患の治療に必要な他の薬剤の剤量の低減、疾患の進行の遅延、及び／または個体の生存期間の延長が含まれるがこれらに限定されない、がんに関連する１つ以上の症状が軽減または除去された場合、その個体は成功裏に「治療」された。

【0070】

本明細書で使用されるように、物質の「有効量」または「治療有効量」という用語は、特定の状態の測定可能な改善または予防を達成するために必要な少なくとも最小濃度である。本明細書における有効量は、患者の病状、年齢、性別及び体重、ならびに個体において所望の反応を誘発する物質の能力などの要因に応じて変化し得る。有効量は、治療のあらゆる毒性または有害な効果が、治療上有益な効果によって相殺される量でもある。がんの場合、有効量には、腫瘍の縮小を引き起こす、及び／または腫瘍増殖速度を低下させる（例えば、腫瘍増殖を阻害する）、またはがんにおける他の望ましくない細胞増殖を防止もしくは遅延させるのに十分な量が含まれる。いくつかの実施形態では、有効量は、がんの進行を遅らせるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、再発を予防または遅らせるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、個体における再発率を低下させるのに十分な量である。有効量を１回または複数回投与することができる。有効量の薬剤または組成物は、（ｉ）がん細胞の数を減少させ、（ｉｉ）腫瘍のサイズを減少させ、（ｉｉｉ）末梢臓器へのがん細胞の浸潤をある程度阻害、遅延、遅くし、好ましくは防止することができ、（ｉｖ）腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度減速させ、好ましくはある程度まで停止させる）、（ｖ）腫瘍増殖を阻害し、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／または再発を予防または遅延させ、（ｖｉｉ）腫瘍の再発率を低下させ、及び／または（ｖｉｉｉ）がんに関連する１つ以上の症状をある程度軽減する。有効量を１回または複数回投与することができる。本開示の目的のため、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、直接的または間接的に予防的または治療的処置をもたらすのに十分な量である。臨床の文脈で理解されるように、有効量の薬剤、化合物または医薬組成物は、別の薬剤、化合物または医薬組成物と組み合わせて達成される場合もあれば、別の薬物、化合物または医薬組成物と組み合わせずに達成される場合もある。したがって、「有効量」は、１つまたは複数の治療薬が投与される場合に考慮され得、また、１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて、所望の結果が、達成される可能性があるまたは達成できる場合、有効量の単一薬剤の投与を考慮してもよい。

【0071】

本明細書で使用される「野生型」という用語は、変異体またはバリアントとは異なり、自然界に見られる生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を指すと当業者に理解される用語である。

【0072】

本明細書に記載の「宿主細胞」とは、本明細書に記載のように修飾されることができる限り、宿主細胞として使用することができる任意の細胞型を指す。例えば、宿主細胞は、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を内因的に発現する宿主細胞であり得るか、またはＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）が本分野で既知の方法によって導入される宿主細胞であり得る。例えば、宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、または植物細胞であってもよい。一部の実施形態において、宿主細胞は、ヒト細胞株または非ヒト細胞株を含む哺乳動物細胞株などの予め確立された細胞株に由来する。一部の実施形態において、宿主細胞は、ヒト個体などの個体に由来する。

【0073】

「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」とは、少なくとも１つ、実施形態では２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する１つ以上の異種配列（すなわち、非ＡＡＶ由来の核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターが、適切なヘルパーウイルス（または適切なヘルパー機能を発現するウイルス）に感染し、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現する宿主内に存在する場合、それらは複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。ｒＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター）に組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは「プレベクター」と呼ばれることができ、ＡＡＶパッケージング機能と適切な補助機能の存在下で複製してカプセル化することによって「救出」できる。ｒＡＡＶベクターは、プラスミド、線状人工染色体、脂質と複合体を形成したもの、リポソームにカプセル化されたもの、ウイルス粒子、特にＡＡＶ粒子にカプセル化されたものを含むがこれらに限定されない、様々な形態のいずれであってもよい。ｒＡＡＶベクターをＡＡＶウイルスキャプシドにパッケージングして、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成することができる。

【0074】

「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は、当技術分野で周知の用語であり、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両端に存在する約１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、２つの逆の配向のいずれかで存在する可能性があり、異なるＡＡＶゲノム間及び単一ＡＡＶゲノムの末端間で不均一性が生じる。最も外側の１２５ヌクレオチドには、ＩＴＲのこの部分内で鎖内塩基対形成が発生できるようにする、いくつかの短い自己相補的領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、及びＤ領域と呼ばれる）も含まれている。

【0075】

したがって、ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれ、前記ペプチドまたはポリペプチドは、参照配列、特に本明細書に開示されるポリペプチド配列の置換、挿入及び／または付加、欠失及び共有結合修飾を含む。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば１つ以上のリジンをペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製、または位置特定に使用できる。リジンを使用すると、ペプチドの溶解度を高めたり、ビオチン化を可能にしたりできる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシル及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意に削除して、トランケートされた配列を提供することができる。配列の使用に応じて、例えば、可溶性または固体支持体に連結されたより大きな配列の一部として配列を発現する場合、特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基またはＮ末端残基）が代替的に削除され得る。

【0076】

「非天然的に存在する」または「操作された」という用語は置き換えて使用され、人工の関与を示す。核酸分子またはポリペプチドに言及する場合、これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドが、自然界で自然に結合し、自然界に見出される少なくとも1つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。

【0077】

本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へ）転写されるプロセス、及び／または転写されたｍＲＮＡのその後のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質への翻訳を指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、総称して「遺伝子産物」と呼ばれることがある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。

【0078】

本明細書で使用される場合、「担体」には、曝露される細胞または哺乳動物に対して使用される用量及び濃度で非毒性である薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤が含まれる。典型的には、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の非限定的な例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン酸、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の糖類;ＥＤＴＡなどのキレート剤;マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの塩形成対イオン;及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

【0079】

「プロトコル」という用語は、治療用製品の市販パッケージに通常含まれている説明書を指し、そのような治療製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌、及び/または警告などの情報が含まれている。

【0080】

「製品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患または症状を治療するための薬剤を含む任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）またはキットである。いくつかの実施形態では、製品またはキットは、本明細書に記載の方法を実行するためのユニットとして宣伝、配布、または販売される。

【0081】

本明細書で使用される場合、「からなる」、「含有」、及び「含む」という用語は、オープンで非限定的な意味で使用される。また、本明細書に記載される本願の態様及び実施形態は、「から構成される」及び／または「本質的に…から構成される」態様及び実施形態を含み得ることも理解されよう。

【0082】

「約」という用語が明示的に使用されるかどうかにかかわらず、本明細書で与えられる各量は、実際の所定の値を意味し、また、当業者の通常の技術に基づいて合理的に推測できるそのような所定の値の近似値も意味することが理解されるであろう。この近似値は、そのような所定の値の実験条件及び／または測定条件から得られる等価物及び近似値を含む。本明細書における値またはパラメータの「約」への言及には、値またはパラメータ自体に関する変動が含まれる（及び説明される）。例えば、「約Ｘ」についての記述には、「Ｘ」に関する記述が含まれる。

【0083】

本明細書で使用される場合、「ではない」値またはパラメータへの言及は、一般に、その値またはパラメータとは「異なる」ことを意味し、説明する。例えば、Ｘ型疾患の治療に使用されない方法は、その方法がＸ型以外の疾患の治療に使用されることを意味する。

【0084】

本明細書において使用される用語「約Ｘ～Ｙ」は、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を有する。

【0085】

本明細書及び添付の請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。また、任意の要素を除外するように請求項を作成できることにも注意されたい。したがって、この記述は、請求項の要素を参照する場合、または「否定的な」制限を使用する場合に、「のみ」や「だけ」などの排他的な用語を使用するための先行根拠として機能することを目的としている。

【0086】

本明細書で使用される「及び／または」という用語、例えば、「Ａ及び／またはＢ」などの語句は、ＡとＢとの両方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、及びＢ（単独）を含むことを意図する。同様に、本明細書で使用される用語「及び／または」、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」などの語句は、以下の実施形態のそれぞれを包含することを意図している：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡとＣ；ＡとＢ；ＢとＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；Ｃ（単独）。

【0087】

ＩＩ．ＲＮＡ編集方法
本明細書では、標的化ＲＮＡ配列を含むデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）を使用して宿主細胞内の標的ＲＮＡを編集する方法が提供され、このデアミナーゼ動員ＲＮＡは、標的ＲＮＡ内の非標的アデノシンを含む領域の反対側の１つ以上のヌクレオシドの欠失を有し、及び／または標的化ＲＮＡ配列の５’及び／または３’末端に隣接する１つ以上のリンカー核配列酸を含み、ここで、ｄＲＮＡはＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員できる。ｄＲＮＡは、以下のセクションＩＩＩ（「ｄＲＮＡ、構築物及びライブラリー」）に記載されるｄＲＮＡのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは線形である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは環状である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記方法は、ｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を使用する。前記構築物は、以下のセクションＩＩＩに記載される構築物のいずれであってもよい。

【0088】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法が提供され、ここで、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、二本鎖ＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、（２）ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員することができる。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは線形である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは環状である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記方法は、任意のタンパク質またはタンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含まない。

【0089】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法が提供され、ここで、（１）ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、（２）ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員することができ、（３）ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約５ｎｔ～約５００ｎｔ、例えば、約５０ｎｔ～約２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、例えば、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、任意のタンパク質またはタンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含まない。

【0090】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法が提供され、ここで、（１）ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、（２）ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員することができ、（３）ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列及び／または第２のリンカー核酸配列の長さが、約５ｎｔ～約５００ｎｔ、例えば、約５０ｎｔ～約２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列が、第２のリンカー核酸配列と同じである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列が、第２のリンカー核酸配列とは異なる。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列及び／または第２のリンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列及び／または第２のリンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、例えば、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列及び／または第２のリンカー核酸配列が配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、リンカー核酸配列が、標的化ＲＮＡ配列の５’末端と標的化ＲＮＡ配列の３’末端とを連結する。いくつかの実施形態では、前記方法は、任意のタンパク質またはタンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含まない。

【0091】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法が提供され、ここで、（１）ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、（２）ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員することができ、（３）ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約５ｎｔ～約５００ｎｔ、例えば、約５０ｎｔ～約２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、例えば、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列が、第２のリンカー核酸配列と同じである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列が、第２のリンカー核酸配列とは異なる。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、リンカー核酸配列が、標的化ＲＮＡ配列の５’末端と標的化ＲＮＡ配列の３’末端とを連結する。いくつかの実施形態では、前記方法は、任意のタンパク質またはタンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含まない。

【0092】

いくつかの実施形態では、環状ｄＲＮＡ、または環状ｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法が提供され、ここで、（１）環状ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、二本鎖ＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、（２）環状ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員することができる。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、環状ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列をさらに含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない。いくつかの実施形態では、環状ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端を置換するリンカー核酸配列をさらに含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約５ｎｔ～約５００ｎｔ、例えば、約５０ｎｔ～約２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、標的化ＲＮＡ配列の５’末端と標的化ＲＮＡ配列の３’末端とを連結する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列とをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、３’連結配列と５’連結配列とをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、任意のタンパク質またはタンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含まない。

【0093】

いくつかの実施形態では、（ａ）ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物、及び（ｂ）ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法が提供され、ここで、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、二本鎖ＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、（２）ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員することができる。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞の内因的にコードされたＡＤＡＲであり、ＡＤＡＲの導入は、宿主細胞においてＡＤＡＲを過剰発現することを含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物は、プラスミド、またはウイルスベクター（例えば、ｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）などのベクターである。

【0094】

いくつかの実施形態では、（ａ）ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物、及び（ｂ）ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法が提供され、ここで、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、前記リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、（２）ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員することができ、（３）ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約５ｎｔ～約５００ｎｔ、例えば、約５０ｎｔ～約２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、例えば、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞の内因的にコードされたＡＤＡＲであり、ＡＤＡＲの導入は、宿主細胞においてＡＤＡＲを過剰発現することを含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物は、プラスミド、またはウイルスベクター（例えば、ｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）などのベクターである。

【0095】

いくつかの実施形態では、（ａ）ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物、及び（ｂ）ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法が提供され、ここで、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、二本鎖ＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、前記リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、（２）ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員することができ、（３）ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約５ｎｔ～約５００ｎｔ、例えば、約５０ｎｔ～約２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、例えば、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、リンカー核酸配列が、標的化ＲＮＡ配列の５’末端と標的化ＲＮＡ配列の３’末端とを連結する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞の内因的にコードされたＡＤＡＲであり、ＡＤＡＲの導入は、宿主細胞においてＡＤＡＲを過剰発現することを含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物は、プラスミド、またはウイルスベクター（例えば、ｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）などのベクターである。

【0096】

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法を提供し、ここで、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物は、用量依存的に標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する。

【0097】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の非標的アデノシン編集（本明細書では「バイスタンダー編集」とも呼ばれる）を減少させる方法が提供され、ここで、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、二本鎖ＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、（２）ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員することができ、ここで、標的ＲＮＡと相補的な標的化ＲＮＡ配列を含むｄＲＮＡを用いる方法と比較して、非標的アデノシンの編集比率が低減される。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の２つ以上の連続するヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端を置換するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約５ｎｔ～約５００ｎｔ、例えば、約５０ｎｔ～約２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、例えば、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、リンカー核酸配列が、標的化ＲＮＡ配列の５’末端と標的化ＲＮＡ配列の３’末端とを連結する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに相補的な標的化ＲＮＡ配列を含むｄＲＮＡを使用する方法と比較して、非標的アデノシンの編集率は、少なくとも約２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上減少する。

【0098】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの編集効率を高める方法が提供され、ここで、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、（２）ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員することができ、ここで、リンカー核酸配列を含まないｄＲＮＡを用いた方法と比較して、標的アデノシンの編集効率が向上する。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約５ｎｔ～約５００ｎｔ、例えば、約５０ｎｔ～約２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、例えば、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、リンカー核酸配列が、標的化ＲＮＡ配列の５’末端と標的化ＲＮＡ配列の３’末端とを連結する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列を含まないｄＲＮＡを使用する方法と比較して、標的アデノシンの編集効率は、少なくとも約５０％、２倍、３倍、４倍、２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上増加する。

【0099】

一態様では、本願は、複数のｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする１つ以上の構築物を宿主細胞に導入することによって、前記宿主細胞内で複数（例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００またはそれ以上）の標的ＲＮＡを編集する方法を提供する。

【0100】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はネズミ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、植物細胞または真菌細胞である。

【0101】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＴ２９、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＲＤ、ＳＦ２６８、ＳＷ１３及びＨｅＬａ細胞などの細胞株である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、または免疫細胞などの初代細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、有糸分裂後の細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、脳細胞、例えば、小脳細胞などの中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞である。

【0102】

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは宿主細胞に対して内因性である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）は、宿主細胞に自然にまたは内因的に存在し、例えば、真核細胞に自然にまたは内因的に存在する。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、宿主細胞によって内因的に発現される。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、前記宿主細胞に外因的に導入される。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１及び／またはＡＤＡＲ２である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２からなる群から選択される１つ以上のＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１のｐ１１０アイソフォーム（「ＡＤＡＲ１^ｐ１１０」）及び／またはＡＤＡＲ１のｐ１５０アイソフォーム（「ＡＤＡＲ１^ｐ１５０」）などのＡＤＡＲ１である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲはＡＤＡＲ２である。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、宿主細胞によって発現されるＡＤＡＲ２、例えば、小脳細胞によって発現されるＡＤＡＲ２である。

【0103】

いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因性のＡＤＡＲである。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、天然に存在するＡＤＡＲの多動性変異体である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、Ｅ１００８Ｑ変異を含むＡＤＡＲ１である。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、結合ドメインを含む融合タンパク質ではない。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、操作された二本鎖核酸結合ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、ｄＲＮＡの相補的ＲＮＡ配列に融合されたＭＳ２ヘアピンに結合するＭＣＰドメインを含まない。

【0104】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、高い発現レベルのＡＤＡＲ１（ＡＤＡＲ１^ｐ１１０及び／またはＡＤＡＲ１^ｐ１５０など）を有し、例えば、β-チューブリンのタンパク質発現レベルより、少なくとも約１０％、２０％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍またそれ以上のいずれか１つ高い。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、高い発現レベルのＡＤＡＲ２を有し、例えば、β-チューブリンのタンパク質発現レベルより、少なくとも約１０％、２０％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上のいずれか１つ高い。一部の実施形態において、宿主細胞は、低い発現レベルのＡＤＡＲ３を有し、例えば、β－チューブリンのタンパク質発現レベルより、少なくとも約５倍、３倍、２倍、１００％、５０％、２０％またはそれ以下のいずれか１つ低い。

【0105】

特定の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲ３の阻害剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、ＡＤＡＲ３の阻害剤は、ＡＤＡＲ３に対するＲＮＡｉであり、例えば、ＡＤＡＲ３に対するｓｈＲＮＡまたはＡＤＡＲ３に対するｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、この方法は、インターフェロンの刺激剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、インターフェロンによって誘導可能であり、例えば、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ^ｐ１５０である。一部の実施形態において、インターフェロンの刺激剤は、ＩＦＮαである。一部の実施形態において、ＡＤＡＲ３の阻害剤及び／またはインターフェロンの刺激剤は、ｄＲＮＡをコードする同じ構築体（例えば、ベクター）によってコードされる。

【0106】

特定の実施形態では、この方法は、自然免疫応答などの免疫応答を誘導しない。一部の実施形態において、この方法は、宿主細胞においてインターフェロン及び／またはインターロイキンの発現を誘導しない。一部の実施形態において、この方法は、宿主細胞においてＩＦＮ－β及び／またはＩＬ－６発現を誘導しない。

【0107】

ｄＲＮＡ、その構築物、及びＡＤＡＲをコードする核酸を含む核酸は、ウイルス送達または非ウイルス送達を含む、当技術分野で知られている任意の方法を使用して送達され得る。

【0108】

核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、エレクトロポレーション、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、または遺伝子銃、裸のＤＮＡ及び人工ビリオンが含まれる。

【0109】

核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、ウイルスを特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを細胞核に輸送するのに高い効率を有する。特定の実施形態では、この方法は、ｄＲＮＡをコードするウイルスベクター（ｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ、またはレンチウイルスベクターなど）を宿主細胞に導入することを含む。例えば、本明細書に記載される構築物は、以下のセクションＩＩＩ「ｄＲＮＡ、構築物及びライブラリー」に記載されるいずれかのウイルスベクターであってもよい。

【0110】

いくつかの実施形態では、この方法は、ｄＲＮＡをコードするプラスミドを宿主細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ｄＲＮＡ（例えば、合成ｄＲＮＡ）を宿主細胞にエレクトロポレーションすることを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、宿主細胞へのｄＲＮＡのトランスフェクションを含む。

【0111】

特定の実施形態では、標的ＲＮＡの編集効率は、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれ以上のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの編集効率は少なくとも約４０％である。いくつかの実施形態では、編集効率はサンガー配列決定によって決定される。いくつかの実施形態では、編集効率は、次世代配列決定によって決定される。いくつかの実施形態では、編集効率は、ＥＧＦＰなどの蛍光レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子の発現を評価することによって決定される。

【0112】

特定の実施形態では、この方法は、オフターゲット編集比率が低い。いくつかの実施形態では、この方法は、標的ＲＮＡ中の非標的Ａに対して約１％未満（例えば、約０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％未満、またはそれ以下のいずれか１つ）の編集効率を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、標的ＲＮＡ中の非標的Ａを編集しない。いくつかの実施形態では、この方法は、非標的ＲＮＡ中のＡに対して約０．１％未満（例えば、約０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００１％、またはそれ以下のいずれか１つ）の編集効率を有する。

【0113】

脱アミノ化後、標的ＲＮＡ及び/または標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の修飾は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの位置に応じて異なる方法を使用して確定することができる。例えば、標的ＲＮＡにおいて「Ａ」が「Ｉ」に編集されているかどうかを確認するために、本分野で知られているＲＮＡ配列決定法を使用して、ＲＮＡ配列の修飾を検出することができる。標的アデノシンがｍＲＮＡのコード領域にある場合、ＲＮＡ編集によりｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列が変化することができる。例えば、点突然変異をｍＲＮＡに導入し得、「Ａ」から「Ｉ」へ変換されたので、ｍＲＮＡ中の先天のまたは後天的な点突然変異を野生型遺伝子産物に復帰し得る。本分野で知られている方法によるアミノ酸配列決定を使用して、コードされたタンパク質中のアミノ酸残基の変化を見つけることができる。終止コドンの修飾は、機能的、伸長、トランケートされた、完全長及び/または野生型タンパク質の存在を評価することによって決定することができる。例えば、標的アデノシンがＵＧＡ、ＵＡＧ、またはＵＡＡ終止コドンに位置する場合、標的Ａ（ＵＧＡまたはＵＡＧ）または複数のＡ（ＵＡＡ）の修飾は、リードスルー変異及び/または伸長タンパク質を作成することができる。あるいは、標的ＲＮＡによってコードされるトランケートされたタンパク質を復帰して、機能的な完全長及び/または野生型タンパク質を作成することができる。標的ＲＮＡの編集はまた、標的ＲＮＡに異常なスプライシング部位及び/または選択的スプライシング部位を生成することができ、したがって、伸長、トランケート、またはミスフォールディングされたタンパク質、または標的ＲＮＡにコードされた異常なスプライシングまたは選択的スプライシング部位の復帰によって、機能的で正しくフォールディングされた完全長及び/または野生型タンパク質を作成する。一部の実施形態において、本出願は、先天性及び後天性の両方の遺伝的変化、例えば、ミスセンス突然変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは標的ＲＮＡによってコードされる選択的スプライシング部位の編集を考慮する。既知の方法を使用して、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の機能を評価することで、ＲＮＡ編集が所望の効果を達成したかどうかを確認できる。アデノシン（Ａ）のイノシン（Ｉ）への脱アミノ化は、タンパク質をコードする変異ＲＮＡの標的位置で変異したＡを修正することができるため、イノシンへの脱アミノ化の同定は、機能性タンパク質が存在するかどうか、または変異したアデノシンの存在によって引き起こされる疾患または薬剤耐性関連ＲＮＡは、復帰または部分的に復帰されたかという評価を提供することができる。同様に、アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化は、得られたタンパク質に点突然変異を導入する可能性があるため、イノシンへの脱アミノ化の特定は、疾患の原因または疾患の関連因子を特定するための機能的指標を見つけることができる。

【0114】

標的アデノシンの存在が異常なスプライシングを引き起こす場合、読み出しは異常なスプライシングの発生と頻度の評価であってもよい。一方、スプライシング部位を導入するために、標的アデノシンの脱アミノ化が必要な場合、類似した方法を使用して、必要なタイプのスプライシングが起こるかどうかをチェックすることができる。標的アデノシンの脱アミノ化後にイノシンの存在を同定するための例示的な適切な方法は、当業者に周知の方法を使用したＲＴ－ＰＣＲ及び配列決定である。

【0115】

標的アデノシンの脱アミノ化の効果には、例えば、点突然変異、早期終止コドン、異常なスプライシング部位、選択的なスプライシング部位、及び得られたタンパク質のミスフォールディングが含まれる。これらの効果は、遺伝的に受け継がれているか、後天的な遺伝子変異によって引き起こされているかにかかわらず、疾患に関連するＲＮＡ及び／またはタンパク質の構造的及び機能的変化を誘発するか、薬剤耐性の発生に関連するＲＮＡ及び／またはタンパク質の構造的及び機能的変化を誘発することができる。したがって、本願のｄＲＮＡ、ｄＲＮＡをコードする構築物、及びＲＮＡ編集方法は、疾患に関連するＲＮＡ及び／またはタンパク質の構造及び／または機能を変えることによって、遺伝性の疾患もしくは症状、または後天性遺伝子変異に関連する疾患もしくは症状の予防もしくは治療に使用することができる。

【0116】

一部の実施形態では、標的ＲＮＡはプレメッセンジャーＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは制御性ＲＮＡである。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡまたは低分子ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡまたはｓｃａＲＮＡ）である。標的アデノシンの脱アミノ化の効果には、例えば、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡまたは低分子ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）の、標的ＲＮＡの三次元構造の変化及び／または機能喪失もしくは機能の獲得を含む、構造及び機能の変化が含まれる。一部の実施形態において、標的ＲＮＡにおける標的Ａの脱アミノ化は、標的ＲＮＡの１つ以上の下流分子（例えば、タンパク質、ＲＮＡ及び／または代謝産物）の発現レベルを変化させる。下流分子の発現レベルの変化は、発現レベルの増加または減少であってもよい。

【0117】

本出願の一部の実施形態は、宿主細胞における標的ＲＮＡの多重編集に係り、これは、宿主細胞における標的遺伝子の異なるバリアントまたは異なる遺伝子をスクリーニングするために使用できる。前記方法が複数のｄＲＮＡを前記宿主細胞に導入することを含み、複数のｄＲＮＡの少なくとも２つのｄＲＮＡは、異なる配列を有し、及び／または異なる標的ＲＮＡを有する。一部の実施形態において、各ｄＲＮＡは、異なる配列及び／または異なる標的ＲＮＡを有する。一部の実施形態では、この方法は、宿主細胞内の単一の標的ＲＮＡに複数（例えば、少なくとも２、３、５、１０、５０、１００、１０００またはそれ以上）の修飾を生成する。一部の実施形態では、この方法は、宿主細胞内の複数（例えば、少なくとも２、３、５、１０、５０、１００、１０００またはそれ以上）の標的ＲＮＡに修飾を生成する。一部の実施形態では、この方法は、複数の宿主細胞群における複数の標的ＲＮＡを編集することを含む。一部の実施形態において、各宿主細胞群は、異なるｄＲＮＡ、または他の宿主細胞群とは異なる標的ＲＮＡを有するｄＲＮＡを受ける。

【0118】

また、本明細書に記載の方法のいずれか１つによって生成された、編集されたＲＮＡ、または編集されたＲＮＡを有する宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、編集されたＲＮＡはイノシンを含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ミスセンス突然変異、早期終止コドン、選択的スプライシング部位、または異常なスプライシング部位を有する標的ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、変異された、トランケートされた、またはミスフォールディングされたタンパク質を含む。一部の実施形態において、この方法は標的ＲＮＡの機能を回復する。

【0119】

ＩＩＩ．ｄＲＮＡ、構築物及びライブラリー
本出願はさらに、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法または治療方法のいずれかにおいて使用され得る、ｄＲＮＡ、ｄＲＮＡをコードする構築物、及び複数のｄＲＮＡまたはその構築物を含むライブラリーをさらに提供する。本明細書に記載されているｄＲＮＡまたは構築物の特徴及びパラメータのいずれかを、あたかもすべての組み合わせが個別に記載されているかのように、互いに組み合わせることができることが意図されている。

【0120】

一態様では、本願は、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡを編集するためのｄＲＮＡを提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡに相補的な配列中の１つ以上の非標的アデノシンの反対側にある１つ以上のウリジン残基を欠いている。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。

【0121】

一態様では、本願は、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡを編集するためのｄＲＮＡを提供し、ここで、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約５ｎｔ～約５００ｎｔ、例えば、約５０ｎｔ～約２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、例えば、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。

【0122】

一態様では、本願は、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡを編集するためのｄＲＮＡを提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列が、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の長さが、約５ｎｔ～約５００ｎｔ、例えば、約５０ｎｔ～約２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、例えば、（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含む。

【0123】

一態様では、本願は、本明細書に記載のいずれか１つのｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を提供する。特定の実施形態において、前記構築物は、ウイルスベクターまたはプラスミドである。一部の実施形態では、前記構築物はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、前記構築物は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、構築物は単一のｄＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、構築物は、複数の（例えば、約１、２、３、４、５、１０、２０またはそれ以上の）ｄＲＮＡをコードする。

【0124】

一態様では、本願は、本明細書に記載の複数のｄＲＮＡまたは複数の構築物を含むライブラリーを提供する。

【0125】

一態様では、本願は、デアミナーゼ動員ＲＮＡまたは本明細書に記載の構築物を含む組成物または宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はヒト細胞である。

【0126】

ｄＲＮＡ
本出願のｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含む。標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと完全に相補的または実質的に相補的であり、標的ＲＮＡへの標的化ＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションを可能にする。一部の実施形態において、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと１００％の配列相補性を有する。一部の実施形態において、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の少なくとも約２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、またはそれ以上のヌクレオチドの連続ストレッチと少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上のいずれか１つの相補性を有する。一部の実施形態において、標的化ＲＮＡ配列と標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されたｄｓＲＮＡは、１つ以上以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の非ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対（すなわち、ミスマッチ）を有する。

【0127】

いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列と標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡ（本明細書では「二本鎖ＲＮＡ」とも呼ばれる）は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の不対ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列と標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡ内に１つ以上の不対非標的アデノシンを有する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の１つ以上の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンの反対側のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含む領域に対向する２つ以上（例えば、２、３、４またはそれ以上）の連続するヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の１つ以上の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンの反対側のヌクレオチドが存在しないことを除いて、標的ＲＮＡに相補的である。

【0128】

ｄｓＲＮＡ内の不対ヌクレオチドはバルジを引き起こす。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ｄＲＮＡにハイブリダイズして、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含むバルジを含むｄｓＲＮＡを形成する。ｄＲＮＡと標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡのバルジには、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンが含まれている。バルジは、モノヌクレオチドバルジ、すなわち、不対の非標的アデノシンを含むもの、またはポリヌクレオチドバルジ、すなわち、不対の非標的アデノシンに隣接する追加の不対またはミスマッチのヌクレオチドを含むものであり得る。いくつかの実施形態では、バルジは、標的ＲＮＡ内の１つを超える（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）不対ヌクレオチドを含むことができ、すなわち、バルジは、非標的アデノシン残基の５’及び／または３’側に直接隣接する不対ヌクレオチドで構成される。いくつかの実施形態では、バルジは、非標的アデノシン残基の５’及び／または３’側に直接隣接する１つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）のミスマッチヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、バルジは、不対の非標的アデノシン、非標的アデノシン残基の５’側及び／または３’側に隣接する１つ以上の不対ヌクレオチド、ならびに非標的アデノシン残基の５’側及び／または３’側に隣接する１つ以上のミスマッチヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バルジの長さは、１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔまたはそれ以上である。

【0129】

いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡは、２つ以上のバルジ、例えば２、３、４、５、６、またはそれ以上のバルジのいずれかを含み、各バルジは標的ＲＮＡ内の非標的アデノシンを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡは、標的ＲＮＡ内の各非標的アデノシンにバルジを含む。

【0130】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されたｄｓＲＮＡは、ミスマッチを含まない。一部の実施形態において、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡは、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上のミスマッチ（例えば、同じタイプまたは異なるタイプのミスマッチ）を含む。一部の実施形態において、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡは、１つ以上の種類のミスマッチ、例えば、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、及びＵ－Ｕからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７種類のミスマッチを含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、ミスマッチは標的アデノシンの上流（５’）または下流（３’）に位置し、これにより標的ＲＮＡにおける標的アデノシンの編集効率が促進され得る。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡは、標的アデノシンの上流及び／または下流に追加のミスマッチを有する。

【0132】

いくつかの実施形態において、標的化ＲＮＡ配列は、例えば、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のＧなどの１つ以上のグアノシンをさらに含み、それぞれが標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの真向かいにある。いくつかの実施形態において、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチド（例えば、２、３、４、５またはそれ以上のミスマッチヌクレオシド）を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の１つ以上の非標的アデノシンの反対側のＧを含み、かつ標的ＲＮＡ中の１つ以上の非標的アデノシンの反対側のヌクレオチドを欠く、標的化ＲＮＡ配列を含む。二本鎖ＲＮＡは、１つ以上の非標的アデノシンを含む１つ以上のバルジを有し、ｄＲＮＡにおいて標的ＲＮＡ内の他の非標的アデノシンの反対側のＧを含むことができる。

【0134】

いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、例えば、約１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つ以下の非標的Ａなど、約２０以下の非標的Ａを含む。非標的Ａに対向するＵの欠失及び／またはＧは、ｄＲＮＡ中の隣接するミスマッチまたは不対ヌクレオチドとともに、ＡＤＡＲによるオフターゲット編集効果を低減する可能性がある。

【0135】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接する１つまたは複数のリンカー核酸配列（本明細書では「隣接リンカー配列」とも呼ばれる）を含み、リンカー核酸配列は、ｄＲＮＡのいずれの部分とも実質的に二次構造を形成しない。本願の発明者らは、隣接リンカー配列を含めることにより、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの編集効率を改善できることを発見した。いかなる理論にも束縛されるものではないが、リンカー核酸配列は環状ｄＲＮＡの柔軟性を高めることができ、これにより標的ＲＮＡ配列の標的化ＲＮＡへのハイブリダイゼーションを促進することができるという仮説が立てられる。

【0136】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは単一のリンカー核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端にリンカー核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端にリンカー核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化配列の５’末端に第１のリンカー核酸配列を含み、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に第２のリンカー核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端と３’末端を直接または間接的に連結するリンカー核酸配列を含む環状ＲＮＡである。第１のリンカー核酸配列と第２のリンカー核酸配列は、同じ配列であってもよいし、異なる配列であってもよい。

【0137】

いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列（第１のリンカー核酸配列及び第２のリンカー核酸配列を含む）の長さは、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ｎｔのいずれかである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列（第１のリンカー核酸配列及び第２のリンカー核酸配列を含む）の長さは、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５ｎｔ以下のいずれかである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列（第１のリンカー核酸配列及び第２のリンカー核酸配列を含む）の長さは、約５～１０、１０～２０、２０～５０、５～５０、１０～１００、５～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５～１００、５～２００、５～３００、５～４００、５～５００、５０～２００、５０～３００、５０～４００または５０～５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列（第１のリンカー核酸配列及び第２のリンカー核酸配列を含む）は、長さが約５０ｎｔである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列と第２のリンカー核酸配列は同じ長さである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列と第２のリンカー核酸配列は、異なる長さである。

【0138】

リンカー核酸配列（第１のリンカー核酸配列及び第２のリンカー核酸配列を含む）は、ｄＲＮＡのどの部分とも二次構造を実質的に形成しない。例えばＲＮＡフォールディングを含むＲＮＡの二次構造を予測するための計算ツールが当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列は、長さが約３、４、５、６、またはそれ以上の塩基対のうちのいずれか１つより長い標的化ＲＮＡ配列の一部と二本鎖領域を形成しない。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列は、長さが３、４、５、または６ヌクレオチドを超える相補的領域を含まない。いくつかの実施形態では、第１のリンカー核酸配列は、第２のリンカー核酸配列に対して３、４、５、または６ヌクレオチド長を超える相補的領域を有さない。

【0139】

リンカー核酸配列（第１のリンカー核酸配列及び第２のリンカー核酸配列を含む）は、モノヌクレオチドもしくはジヌクレオチドの反復配列、またはランダム配列であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、例えば、ＡＴまたはＴＡ反復配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が（ＡＴ）_ｎを含み、ここで、ｎは３以上の整数である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が配列番号２２を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列が環状ｄＲＮＡの標的化ＲＮＡ配列の５’末端と３’末端を連結するリンカー配列として使用される。

【0141】

ＡＤＡＲ、例えば、ヒトＡＤＡＲ酵素は、多くの要因に応じて、異なる特異性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構造を編集する。重要な要素の１つは、ｄｓＲＮＡ配列を構成する２本の鎖の相補性の程度である。ｄＲＮＡと標的ＲＮＡの間の完全な相補性により、通常、ＡＤＡＲの触媒ドメインが無差別にアデノシンを脱アミ化する。ＡＤＡＲの特異性と効率は、ｄｓＲＮＡ領域にミスマッチを導入することで修飾できる。例えば、編集されるアデノシンの脱アミノ化の特異性及び効率を高めるために、Ａ－Ｃミスマッチが好ましく推奨される。ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のｄｓＲＮＡのハイブリダイゼーション及びｄｓＲＮＡの生成に十分な相補性があれば、ｄＲＮＡとその標的ＲＮＡとの間のｄｓＲＮＡ形成には必ずしも完全な相補性は必要とされない。一部の実施形態において、最適なアラインメント時に、ｄＲＮＡ配列またはその一本鎖ＲＮＡ領域は、標的ＲＮＡとの配列相補性が、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）が含まれる。

【0142】

標的アデノシンに隣接するヌクレオチドもまた、脱アミノ化の特異性及び効率に影響を及ぼす。例えば、アデノシン脱アミノ化の特異性と効率の観点から、標的ＲＮＡ配列で編集される標的アデノシンの５'最近傍は、優先度Ｕ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇを有し、標的ＲＮＡ配列で編集される標的アデノシンの３'最近傍は、優先度Ｇ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕを有する。一部の実施形態において、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンが、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ及びＧＡＵからなる群から選択される３塩基モチーフであり得る場合、アデノシンの脱アミノ化の特異性と効率は、他の３塩基モチーフのアデノシンよりも高い。一部の実施形態では、編集される標的アデノシンが３塩基モチーフＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＣまたはＡＡＡにある場合、アデノシンの脱アミノ化の効率は、他のモチーフのアデノシンよりも高い。同じ３塩基モチーフに関して、ｄＲＮＡの異なるデザインも異なる脱アミノ化効率につながる可能性がある。３塩基モチーフＵＡＧを例として取り上げると、一部の実施形態において、ｄＲＮＡが、編集される標的アデノシンの真向かいのシチジン（Ｃ）、ウリジンの真向かいにあるアデノシン（Ａ）、グアノシンの真向かいにあるシチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、またはウリジン（Ｕ）を含む場合、標的アデノシンの脱アミノ化の効率は、他のｄＲＮＡ配列を使用した場合よりも高い。一部の実施形態では、ｄＲＮＡが標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＵを含む場合、標的ＲＮＡのＵＡＧにおけるＡの編集効率は、約２５％～９０％（例えば、約２５％～８０％、２５％～７０％、２５％～６０％、２５％～５０％、２５％～４０％、または２５％～３０％）に達することができる。

【0143】

標的アデノシンに加えて、標的ＲＮＡには１つ以上の編集するのが望ましくないアデノシン（本明細書において「非標的Ａ」と呼ばれる）が存在する可能性がある。これらのアデノシンに関しては、それらの編集効率を可能な限り低下させることが好ましい。本発明者らにより、非標的Ａの反対側のＵが欠失すると、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡの二本鎖内で不対の非標的Ａを有するバルジが形成され、非標的Ａのオフターゲット編集が大幅に減少することが見出された。ｄＲＮＡはさらに、非標的アデノシンの５’側または３’側に直接隣接する１つ以上の不対ヌクレオチド及び／または１つ以上のミスマッチヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用する「不対」という用語は、二本鎖核酸の第一鎖のヌクレオチドが二本鎖核酸の第二鎖のどのヌクレオチドとも塩基対形成しないことを意味する。いくつかの実施形態では、グアノシンが標的ＲＮＡのアデノシンの真向かいにある場合、脱アミノ化効率が有意に低下する。したがって、オフターゲット脱アミノ化を減少させるために、ｄＲＮＡは、第１の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチド（例えば、Ｕ）を欠失するように、及び／または標的ＲＮＡにおいて編集される第２の非標的アデノシンの直接反対側のヌクレオチドを有するように設計することができる。

【0144】

標的ＲＮＡ配列を編集する際の特異性と効率の望ましいレベルは、さまざまなアプリケーションによって異なる。本特許出願の説明に従って、当業者は、必要に応じて標的ＲＮＡ配列に相補的または実質的に相補的な配列を有するｄＲＮＡを設計することができ、また、試行錯誤を繰り返しながら、所望の結果を取得できる。本明細書で使用されるように、「ミスマッチ」という用語は、ワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）の塩基対形成規則に従って完全な塩基対を形成しない二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）中の反対のヌクレオチドを指す。ミスマッチの塩基対には、例えば、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、Ｕ－Ｕ塩基対が含まれる。Ａ－Ｃマッチを例にとると、一つの標的アデノシン残基が標的ＲＮＡで編集される場合、ｄＲＮＡは、編集されるＡに対向するＣを含むように設計され、標的ＲＮＡとｄＲＮＡの間のハイブリダイゼーションによって形成されたｄｓＲＮＡにおいてＡ－Ｃミスマッチを生成する。

【0145】

ｄＲＮＡの標的化ＲＮＡ配列は一本鎖である。ｄＲＮＡは、完全な一本鎖であるか、または１つ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）の二本鎖領域及び／または１つ以上のステムループ領域を有し得る。

【0146】

本明細書に記載のｄＲＮＡには、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列が含まれる。特定の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ヌクレオチド（ｎｔ）のいずれかを含む。特定の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ヌクレオチド以下のいずれかを含む。特定の実施形態において、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１６０、１１０～１７５、１１０～１５０、１４０～１６０、１０５～１４０、または１０５～１５５ヌクレオチドの長さのいずれかを有する。一部の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは約１００～２００ｎｔである。一部の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは約７０ｎｔ（例えば、７１ｎｔ）である。一部の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは約１２０ｎｔ（例えば、１２１ｎｔ）である。一部の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは約１５０ｎｔ（例えば、１５１ｎｔ）である。一部の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは約１７０ｎｔ（例えば、１７１ｎｔ）である。一部の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは約２００ｎｔ（例えば、２０１ｎｔ）である。一部の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは約２２０ｎｔ（例えば、２２１ｎｔ）である。

【0147】

いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡの標的アデノシン残基の真向かいにあるシチジン、アデノシン、またはウリジンを含む。一部の実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡの標的アデノシン残基の真向かいにあるシチジンミスマッチを含む。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド、例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチド離れた箇所に位置している。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド、例えば、少なくとも２５、３０、３５、またはそれ以上のヌクレオチド離れた箇所に位置している。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端から２０（例えば、１５、１０、５以下）ヌクレオチド内に位置していない。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド（例えば、少なくとも２５、３０、３５、またはそれ以上のヌクレオチド）及び５’末端から少なくとも５ヌクレオチド（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチド）離れて位置する。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、標的化ＲＮＡ配列の中心に位置する。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、ｄＲＮＡの標的化配列の中心から２０ヌクレオチド（例えば、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド）内に位置する。

【0148】

特定の実施形態において、標的アデノシン残基の５’に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的アデノシン残基の３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。一部の実施形態では、標的アデノシン残基の５'に最も近い隣接物がＣまたはＡである。一部の実施形態では、標的アデノシン残基の３’に最も近い隣接物がＧである。一部の実施形態では、標的アデノシン残基の３’に最も近い隣接物がＣである。

【0149】

いくつかの実施形態では、標的アデノシン残基は、標的ＲＮＡ中のＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフに位置する。いくつかの実施形態では、３塩基モチーフはＵＡＧであり、ｄＲＮＡは、３塩基モチーフのＵの真向かいにあるＡ、標的Ａの真向かいにあるＣ、及び３塩基モチーフのＧの真向かいにあるＣ、Ｇ、またはＵを含む。特定の実施形態では、３塩基モチーフは、標的ＲＮＡのＵＡＧであり、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧ、またはＡＣＵを含む。特定の実施形態では、３塩基モチーフは、標的ＲＮＡのＵＡＧであり、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣを含む。

【0150】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の他に、ｄＲＮＡを安定化するための領域、例えば、１つ以上の二本鎖領域及び／またはステムループ領域をさらに含むことができる。一部の実施形態において、ｄＲＮＡの二本鎖領域またはステムループ領域は、約２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０またはそれ以下の塩基対のうちの１つを含むことができる。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、ステムループまたは二本鎖領域を含まない。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲ動員ドメインを含む。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲ動員ドメインを含まない。

【0151】

ｄＲＮＡは、１つ以上の修飾を含み得る。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、核酸塩基修飾及び／または骨格修飾を含む１つ以上の修飾ヌクレオチドを有する。ＲＮＡの例示的な修飾には、ホスホロチオエート骨格修飾、リボースにおける２’－置換（例えば、２’－Ｏ－メチル及び２’－フルオロ置換）、ＬＮＡ、及びＬ－ＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

【0152】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは化学修飾を含まない。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドまたはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドなどの化学的に修飾されたヌクレオチドを含まない。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、最初の３つ及び最後の３つの残基にのみ２’－Ｏ－メチル化及びホスホロチオエート結合修飾を含む。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ではない。

【0153】

ｄＲＮＡは、ｄＲＮＡの発現及び／または環状化を促進する１つまたは複数の追加の発現エレメントをさらに含み得る。

【0154】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列とをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｔ４ファージＴｄ遺伝子のグループＩ触媒イントロンは、リボザイムのフォールディングに重要な構造要素を保存するように二分される。次いで、エクソンフラグメント２をエクソンフラグメント１の上流に連結し、標的化ＲＮＡ配列（５’及び／または３’末端に隣接するリンカー核酸配列を含んでいてもよい）をエクソン－エクソン接合部の間に挿入する。

【0155】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、環状化は、例えば、Ｌｉｔｋｅ，Ｊ．Ｌ．＆Ｊａｆｆｒｅｙ，Ｓ．Ｒ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ ａｐｔａｍｅｒｓ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７，６６７－６７５（２０１９）に記載されているＴｏｒｎａｄｏ発現系（「Ｔｗｉｓｔｅｒ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＲＮＡ ｆｏｒ ｄｕｒａｂｌｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）を使用して行われ、その全体が参照により組み込まれる。簡単に言うと、Ｔｏｒｎａｄｏによって発現される転写物には、ツイスターリボザイムが隣接する標的ＲＮＡが含まれている。ツイスターリボザイムは、自己切断可能な任意の触媒性ＲＮＡ配列である。リボザイムは急速に自己触媒的切断を受け、ＲＮＡリガーゼによって連結された末端が残る。

【0156】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、５’及び／または３’連結配列が（直接的または間接的に）隣接する標的化ＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは３’連結配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは５’連結配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、３’連結配列及び５’連結配列を含む。いくつかの実施形態では、３’連結配列及び５’連結配列は、互いに少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、３’連結配列及び５’連結配列は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％互いに相補的である。いくつかの実施形態では、３’連結配列と５’連結配列は互いに完全に相補的である。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ 連結配列は、５’－ツイストリボザイム及び／または３’－ツイストリボザイムによってさらに隣接される。

【0157】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡであり、ここで、ｄＲＮＡは、５’から３’まで、５’連結配列、第１のリンカー核酸配列、標的化ＲＮＡ配列、第２のリンカー核酸配列、及び３’連結配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡであり、ここで、ｄＲＮＡは、５’から３’まで、５’連結配列、リンカー核酸配列、標的化ＲＮＡ配列、及び３’連結配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡであり、ここで、ｄＲＮＡは、５’から３’まで、５’連結配列、標的化ＲＮＡ配列、リンカー核酸配列、及び３’連結配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡであり、ｄＲＮＡは、５’から３’まで、５’連結配列、標的化ＲＮＡ配列、及び３’連結配列を含む。いくつかの実施形態では、３’連結配列は配列番号１１を含む。いくつかの実施形態では、５’連結配列は配列番号１２を含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端と３’末端を直接的または間接的に連結する連結配列を含む環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、連結配列は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｒｎｌ１またはＲｎｌ２）などのリガーゼによって互いに連結された５’連結配列及び３’連結配列を含む。いくつかの実施形態では、連結配列は配列番号１０を含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、時計回り方向に、連結配列、第１のリンカー核酸配列、標的化ＲＮＡ配列、及び第２のリンカー核酸配列を含む環状ＲＮＡであり、連結配列は、第一のリンカー核酸配列の５’末端を、第二のリンカー核酸配列の３’末端に直接に連結する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、時計回りの方向に連結配列、リンカー核酸配列、及び標的化ＲＮＡ配列を含む環状ＲＮＡであり、ここで、連結配列は、リンカー核酸配列の５’末端を、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に直接に連結する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、時計回りの方向に連結配列、標的化ＲＮＡ配列、及びリンカー核酸配列を含む環状ＲＮＡであり、連結配列は標的化ＲＮＡ配列の５’末端をリンカー核酸配列の３’末端に直接に連結する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、連結配列及び標的化ＲＮＡ配列を含む環状ＲＮＡであり、連結配列は、標的化ＲＮＡ配列の５’末端を標的化ＲＮＡ配列の３’末端に直接に連結する。

【0160】

いくつかの実施形態では、３’ 連結配列及び５’ 連結配列は、独立して、長さが少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオシド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’ 連結配列及び５’ 連結配列は、独立して、長さが約２０～３０ヌクレオチド、約３０～４０ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約５０～６０ヌクレオチド、約６０～７０ヌクレオチド、約７０～８０ヌクレオチド、約８０～９０ヌクレオチド、約９０～１００ヌクレオチド、約１００～１２５ヌクレオチド、約１２５～１５０ヌクレオチド、約２０～５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、または約１００～１５０ヌクレオチドである。

【0161】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼによって環状化される。ＲＮＡリガーゼの非限定的な例としては、ＲｔｃＢ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（Ｒｎｌ１）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）、Ｒｎｌ３、及びＴｒ１１が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼは宿主細胞内で内因的に発現される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼはＲＮＡリガーゼＲｔｃＢである。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＲｔｃＢ）を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、前記宿主細胞への導入前に環状化される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは化学的に合成される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、インビトロ酵素ライゲーション（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡリガーゼを使用）または化学ライゲーション（例えば、臭化シアンまたは類似の縮合剤を使用）によって環化される。

【0163】

本明細書に記載のｄＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用されるｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡを含まない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲ動員ドメインを含まない。「ＡＤＡＲ動員ドメイン」は、ＡＤＡＲに高い親和性で結合するヌクレオチド配列または構造、あるいは操作されたＡＤＡＲ構築体においてＡＤＡＲに融合された結合パートナーに結合するヌクレオチド配列であり得る。例示的なＡＤＡＲ動員領域には、ＧｌｕＲ－２、ＧｌｕＲ－Ｂ（Ｒ／Ｇ）、ＧｌｕＲ－Ｂ（Ｑ／Ｒ）、ＧｌｕＲ－６（Ｒ／Ｇ）、５ＨＴ２Ｃ、及びＦｌｎＡ（Ｑ／Ｒ）ドメインが含まれるが、これらに限定されない;たとえば、Ｗａｈｌｓｔｅｄｔ、Ｈｅｌｅｎｅ、ａｎｄ Ｍａｒｉｅ，“Ｓｉｔｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｖｅｒｓｕｓ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ Ａ－ｔｏ－Ｉ ｅｄｉｔｉｎｇ”、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ：ＲＮＡ ２．６（２０１１）：７６１－７７１は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは二本鎖部分を含まない。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、ＭＳ２ステムループなどのヘアピンを含まない。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは一本鎖である。

【0164】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）及び標的化ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、または少なくとも約２００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、長さが約５０～７５ヌクレオチド、約７５～１００ヌクレオチド、約１００～１２５ヌクレオチド、約１２５～１５０ヌクレオチド、約１５０～１７５ヌクレオチド、約１７５～２００ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、約１００～１５０ヌクレオチド、約１５０～２００ヌクレオチド、約１２５～１７５ヌクレオチド、または約１００～２００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／Ｄ Ｂｏｘ ｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡ Ｂｏｘ ｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、複合Ｃ／Ｄ Ｂｏｘ及びＨ／ＡＣＡ Ｂｏｘ ｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列はオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である。

【0165】

核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡなどの他のＲＮＡの化学修飾をガイドすることが知られている小さな非コードＲＮＡ分子である。特定の二次構造の特徴に応じて、ｓｎｏＲＮＡにはＢｏｘ Ｃ／ＤとＢｏｘ Ｈ／ＡＣＡの２つの主要なカテゴリがある。ｓｎｏＲＮＡの両方の構造的特徴により、ｓｎｏＲＮＡは対応するＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）及びアクセサリータンパク質に結合して、機能的な小核小体リボ核タンパク質（ｓｎｏＲＮＰ）複合体を形成することができる。Ｂｏｘ Ｃ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡはメチル化に関連すると考えられ、Ｈ／ＡＣＡ ｂｏｘ ｓｎｏＲＮＡはシュードウリジル化に関連すると考えられている。他のｓｎｏＲＮＡファミリーには、例えば、複合Ｈ／ＡＣＡ及びＣ／Ｄ Ｂｏｘ ｓｎｏＲＮＡ、ならびにオーファンｓｎｏＲＮＡが含まれる。本明細書に記載されるｓｎｏＲＮＡ配列は、天然に存在するｓｎｏＲＮＡ、その一部、またはその変異体を含み得る。

【0166】

構築物
本願は、ｄＲＮＡ及び／またはＡＤＡＲをコードする構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む構築物（例えば、ウイルスベクターなどのベクター）が提供される。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む構築物（例えば、ウイルスベクターなどのベクター）が提供される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列とＡＤＡＲをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は、同じプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は、異なるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性である。いくつかの実施形態では、構築物はＡＤＡＲをコードしない。いくつかの実施形態では、前記ベクターは、ＡＤＡＲ３阻害剤（例えば、ＡＤＡＲ３ ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）及び／またはインターフェロン刺激剤（例えば、ＩＦＮ－α）をコードする核酸配列をさらに含む。

【0167】

本明細書で使用される「構築物」という用語は、ＲＮＡに転写される、またはタンパク質に発現されることができるコード核酸配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、構築物は、ＲＮＡまたはタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む。構築物が宿主細胞に導入されると、適切な条件下で、構築物中のコード核酸配列が転写または発現され得る。

【0168】

本明細書に記載の構築物は、コードヌクレオチド配列の転写または発現を制御するように、ｄＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーターを含むことができる。プロモーターは、その制御下にあるコードヌクレオチド配列の５'（上流）に配置することができる。プロモーターとコード配列との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターに由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであってもよい。本分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。一部の実施形態において、構築物は、コードヌクレオチド配列の転写または発現を調節する５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは２つ以上のｄＲＮＡの発現を駆動する。

【0169】

プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）またはポリメラーゼＩＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター」）であり得る。ｄＲＮＡが線形ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されたＰｏｌ ＩＩプロモーターを含む。Ｐｏｌ ＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１ａ、ＣＡＧ、及びＲＳＶが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、配列番号５の核酸配列を含む。

【0170】

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡであり、構築物はＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターはＵ６プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｕ６プロモーターは配列番号６の核酸配列を含む。

【0171】

一部の実施形態において、前記構築物は、本出願において開示されるｄＲＮＡのいずれか１つをコードするベクターである。「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子；１つ以上の自由端を含み、自由端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；及び本分野で知られている他の種類のポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などによって、追加のＤＮＡセグメントを挿入できる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入後に前記宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されているコードヌクレオチド配列の転写または発現を指導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。

【0172】

いくつかの実施形態では、前記構築物はウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、前記構築物はレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、前記ベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。任意のＡＡＶ血清型の使用は、本開示の範囲内であるとみなされる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型に由来するベクターであり、ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶカプシド血清型などであることが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、構築物は、１つ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接している。いくつかの実施形態では、構築物は２つのＡＡＶ ＩＴＲに隣接している。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0173】

いくつかの実施形態では、前記ベクターはスタッファー核酸（ｓｔｕｆｆｅｒ ｎｕｃｌｅｉｄ ａｃｉｄ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、スタッファー核酸は、ｄＲＮＡをコードする核酸の上流または下流に位置する。いくつかの実施形態では、前記ベクターは自己相補的ｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、前記ベクターは、ｄＲＮＡをコードする第１の核酸配列と、ｄＲＮＡに相補的な配列をコードする第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列は、その長さの大部分または全部に沿って第２の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列と第２の核酸配列は、変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端分解（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）配列の変異を含む。いくつかの実施形態では、前記ベクターはｒＡＡＶ粒子にカプセル化される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶまたはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型カプシドを含む。

【0174】

いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイストリボザイム配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸配列の５’末端に連結された５’ツイストリボザイム配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸配列の３’末端に連結された３’ツイストリボザイム配列、及びｄＲＮＡをコードする核酸配列の５’末端に連結された５’ツイストリボザイム配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ツイストリボザイム配列はツイスターＰ３ Ｕ２Ａであり、５’ツイストリボザイム配列はツイスターＰ１である。いくつかの実施形態では、５’ツイストリボザイム配列はツイスターＰ３ Ｕ２Ａであり、３’ツイストリボザイム配列はツイスターＰ１である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは自己触媒的切断を受ける。いくつかの実施形態では、触媒されたｄＲＮＡ産物は、３’末端に５’－ヒドロキシル基及び２’，３’－環状リン酸エステルを含む。

【0175】

調製方法
本明細書に記載のｄＲＮＡは、化学合成及びインビトロ転写を含む、当技術分野で知られている任意の方法を使用して調製することができる。環状ｄＲＮＡは、線形ＲＮＡの化学的ライゲーション、酵素的ライゲーション、またはリボザイム自己触媒作用によって調製できる。いくつかの実施形態では、環状ｄＲＮＡは、インビトロで線形ＲＮＡを環状化することによって調製される。

【0176】

いくつかの実施形態において、本出願は、上記実施形態のいずれかの環状ｄＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡは、臭化シアンまたは類似の縮合剤を使用する化学環化法によって環化することができる。いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡは、５’触媒性グループＩイントロンフラグメント及び３’触媒性グループＩイントロンフラグメントを含むグループＩイントロンの自己触媒作用によって環化され得る。いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡはリガーゼによって環状化され得る。いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによって環状化され得る。いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡは、ＤＮＡリガーゼによって環状化され得る。適切なリガーゼには、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ Ｄｎｌ）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４ Ｒｎｌ１）、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４ Ｒｎｌ２）が含まれるが、これらに限定されない。環状ｄＲＮＡは、ゲル精製または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの当技術分野で知られている方法を使用して精製することができる。

【0177】

いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡを化学的に環状化して、環状ｄＲＮＡを提供することができる。一部の化学的方法では、核酸（線形または環状ポリリボヌクレオチドなど）の５’及び３’末端に化学反応性基が含まれており、これらの反応性基が近づけると、分子の５’末端と３’末端との間に新しい共有結合を形成することができる。５’末端にはＮＨＳエステル反応性基を含めることができ、３’末端には３’アミノ末端ヌクレオチドを含めることができるため、有機溶媒中では、線形ＲＮＡ分子の３’末端にある３’アミノ末端ヌクレオチドは、５’－ＮＨＳエステル部分に対して求核攻撃をし、新しい５’－／３’－アミド結合を形成する。

【0178】

いくつかの実施形態では、環状ｄＲＮＡは、線形ＲＮＡのリボザイム自己触媒的環状化によって得ることができる。いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡはインビトロで環状化される。いくつかの実施形態では、リボザイムによる自己触媒的環化は、（ａ）線形ＲＮＡを、グループＩイントロン（またはその５’及び３’触媒性グループＩイントロンフラグメント）の自己触媒作用を活性化する条件に供して、環状化ＲＮＡ産物を提供すること；（ｂ）環状化ＲＮＡ産物を単離して環状ｄＲＮＡを提供することを含む。

【0179】

いくつかの実施形態では、この方法は、まず線形ＲＮＡをコードする配列をプラスミドベクターにクローニングし、次に組換えプラスミドを線状化することによって線形ＲＮＡを取得するステップを含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、制限酵素消化によって線状化される。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドはＰＣＲ増幅によって線状化される。いくつかの実施形態では、この方法は、線形プラスミドテンプレートを使用するインビトロ転写をさらに含む。いくつかの実施形態では、インビトロ転写は、Ｔ７プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、この方法は、線形ＲＮＡ転写物を精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡはゲル精製法によって精製される。

【0180】

いくつかの実施形態では、本出願は、グループＩイントロンのリボザイム自己触媒作用によって線形ＲＮＡ（例えば、精製された線形ＲＮＡ）を環状化する方法を提供する。スプライシングプロセス中、グアノシンヌクレオチドの３’ヒドロキシル基は５’スプライシング部位でエステル交換反応を起こす。５’イントロンの半分が切除され、中間体の末端にある遊離ヒドロキシル基が３’スプライス部位で２回目のエステル交換を受け、その結果、中間領域が環化して３’イントロンが切除される。いくつかの実施形態では、グループＩイントロンまたは５’及び３’触媒グループＩイントロンフラグメントの自己触媒作用を活性化するための条件は、ＧＴＰ及びＭｇ^２＋の添加である。いくつかの実施形態では、ＧＴＰ及びＭｇ^２＋を５５℃で添加することによって線形ＲＮＡを１５分間環状化するステップが提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、線形ＲＮＡ転写物を消化するためにＲＮａｓｅ Ｒで処理することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、環状ｄＲＮＡを単離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、環状ｄＲＮＡを単離するステップは、環状ｄＲＮＡをゲルで精製することを含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、環状ｄＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用して線形ＲＮＡを環状化することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡはインビトロで環状化される。いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによって環状化され得る。いくつかの実施形態では、線形ＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に位置する５’連結配列と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に位置する３’連結配列とを含み、５’連結配列及び３’連結配列はＲＮＡリガーゼを通過して互いに結合する。非限定的な例において、線形ＲＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ Ｄｎｌ）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４ Ｒｎｌ１）、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４ Ｒｎｌ２）などのリガーゼによって環状化され得る。線形ＲＮＡは、一本鎖核酸リンカー（スプリントＤＮＡなど）の存在下または非存在下で環状化できる。

【0182】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを使用して、５’－リン酸化核酸分子（例えば、線形ＲＮＡ）を核酸（例えば、線形核酸）の３’－ヒドロキシル基に酵素的に連結して、新しいホスホジエステル結合を形成することができる。反応例では、製造業者のプロトコールに従って、線形環状ＲＮＡを１～１０ユニットのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を促進するために、並置された５’及び３’領域と塩基対形成できる線形核酸の存在下で発生する。いくつかの実施形態では、ライゲーションはスプリントライゲーションである。例えば、ＳＰＬＩＮＴＲ（登録商標）リガーゼなどのスプリントリガーゼをスプリントライゲーションに使用することができる。スプリントライゲーションの場合、一本鎖ＲＮＡなどの一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）は、線形ポリリボヌクレオチドの両端にハイブリダイズするように設計することができ、これにより、一本鎖スプリントにハイブリダイズするときに２つの末端が並置され得る。したがって、スプリントリガーゼは、並置された線形ポリリボヌクレオチドの２つの末端のライゲーションを触媒して、環状ポリリボヌクレオチドを生成することができる。いくつかの実施形態では、環状ｄＲＮＡを合成するためにＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを使用することができる。非限定的な例として、リガーゼは、環状（ｃｉｒｃ）リガーゼまたは環状（ｃｉｒｃｕｌａｒ）リガーゼであり得る。

【0183】

ＩＶ．治療方法
本明細書に記載のＲＮＡ編集方法及び組成物は、遺伝性遺伝子疾患及び薬剤耐性を含むがこれらに限定されない、個体の疾患または病症を治療または予防するために使用することができる。

【0184】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法のいずれか１つを使用して標的ＲＮＡを編集することを含む、エクスビボで個体（例えば、ヒト個体）の細胞内の標的ＲＮＡを編集する方法が提供される。

【0185】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して、個体の細胞内に疾患または症状に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、個体（例えば、ヒト個体）の疾患または症状を治療または予防する方法が提供される。ここで、ｄＲＮＡは、疾患または症状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物をエクスビボで個体の単離された細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体に投与することを含む。

【0186】

一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、個体の疾患または病症に関連する。一部の実施形態では、前記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の後天性遺伝子突然変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患または病症である。一部の実施形態では、この方法は、個体から細胞を得ることをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、この方法は、編集されたＲＮＡを有する細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、編集されたＲＮＡを有する細胞を個体に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、前記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の後天性遺伝子突然変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患または病症である。

【0187】

本願の方法を使用した治療に適した疾患及び病症は、ＲＮＡ転写物におけるミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシング、または選択的なスプライシングを引き起こすＧからＡへの突然変異のような変異に関連する疾患を含む。本出願の方法によって回復され得る疾患関連突然変異の例には、癌に関連するＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）に関連するＩＤＵＡ^{Ｗ４０２Ｘ}（例えば、エキソン９におけるＴＧＧ＞ＴＡＧ突然変異）、エーラース・ダンロス症候群に関連するＣＯＬ３Ａ１^{Ｗ１２７８Ｘ}（例、３８３３Ｇ＞Ａ突然変異）、原発性肺高血圧症に関連するＢＭＰＲ２^{Ｗ２９８Ｘ}（例、８９３Ｇ＞Ａ）、ジュベール症候群に関連するＡＨＩ１^{Ｗ７２５Ｘ}（例、２１７４Ｇ＞Ａ）症候群、ファンコニ貧血に関連するＦＡＮＣＣ^{Ｗ５０６Ｘ}（例、１５１７Ｇ＞Ａ）、原発性家族性肥大性心筋症に関連するＭＹＢＰＣ３^{Ｗ１０９８Ｘ}（例、３２９３Ｇ＞Ａ）、及びＸ連鎖重症複合免疫不全症に関連するＩＬ２ＲＧ^{Ｗ２３７Ｘ}（例、７１０Ｇ＞Ａ）が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記疾患または病症は癌である。一部の実施形態では、前記疾患または病症は単一遺伝子疾患である。一部の実施形態では、前記疾患または病症は多遺伝子性疾患である。

【0188】

一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して個体の細胞において標的ＲＮＡを編集することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するがんを治療する方法が提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）である。

【0189】

一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して個体の細胞において標的ＲＮＡを編集することを含む、個体に変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＭＰＳ Ｉ（例えば、ハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）症候群またはシャイエ（Ｓｃｈｅｉｅ）症候群）を治療する方法が提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡ^{Ｗ４０２Ｘ}（例えば、エクソン９におけるＴＧＧ＞ＴＡＧ突然変異）である。

【0190】

一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して個体の細胞において標的ＲＮＡを編集することを含む、個体に変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するエーラス－ダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ－Ｄａｎｌｏｓ）症候群を治療または予防する方法が提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＣＯＬ３Ａ１^{Ｗ１２７８Ｘ}（例えば、３８３３Ｇ＞Ａ突然変異）である。

【0191】

一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して個体の細胞において標的ＲＮＡを編集することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連する原発性肺高血圧症を治療する方法が提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＢＭＰＲ２^{Ｗ２９８Ｘ}（例えば、８９３Ｇ＞Ａ）である。

【0192】

一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して個体の細胞において標的ＲＮＡを編集することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するジュベール（Ｊｏｕｂｅｒｔ）症候群を治療する方法が提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＡＨ１１^{Ｗ７２５Ｘ}（例えば、２１７４Ｇ＞Ａ）である。

【0193】

一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して個体の細胞において標的ＲＮＡを編集することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するファンコニ貧血を治療する方法が提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＦＡＮＣＣ^{Ｗ５０６Ｘ}（例えば、１５１７Ｇ＞Ａ）である。

【0194】

一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して個体の細胞において標的ＲＮＡを編集することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連する原発性家族性肥大型心筋症を治療する方法が提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＭＹＢＰＣ３^{Ｗ１０９８Ｘ}（例えば、３２９３Ｇ＞Ａ）である。

【0195】

一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して個体の細胞において標的ＲＮＡを編集することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＸ連鎖重症複合免疫不全を治療する方法が提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＩＬ２ＲＧ^{Ｗ２３７Ｘ}（例えば、７１０Ｇ＞Ａ）である。

【0196】

一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して個体の細胞において標的ＲＮＡを編集することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連する高血糖症を治療する方法が提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＭＡＬＡＴ１である。

【0197】

一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法を使用して個体の細胞において標的ＲＮＡを編集することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するシャルコー・マリー・トゥース病２Ｂ型（ＣＭＴ２Ｂ）を治療する方法が提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＲＡＢ７Ａである。

【0198】

一般に、組成物（例えば、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築物）の投与量、スケジュール、及び投与経路は、個体のサイズ及び状態に従って、そして標準的な製薬実践に従って決定されることができる。例示的な投与経路には、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、または経皮が含まれる。

【0199】

本出願のＲＮＡ編集方法は、動物細胞、例えば哺乳動物細胞で使用できるだけでなく、植物または真菌のＲＮＡ、例えば、内因的に発現されたＡＤＡＲを有する植物または真菌のＲＮＡの修飾にも使用することができる。本明細書に記載の方法は、改善された特性を有する遺伝子操作された植物及び真菌を生成するために使用することができる。

【0200】

さらに、本明細書に記載のいずれかの治療方法に使用する本明細書に記載のいずれかのｄＲＮＡ、構築物、編集されたＲＮＡを有する細胞及び組成物、ならびに、疾患または症状を治療する薬剤の製造における本明細書に記載のいずれかのｄＲＮＡ、構築物、編集された細胞及び組成物が提供される。

【0201】

Ｖ．組成物、キット及び製品
本明細書はさらに、本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築物、ライブラリー、または編集されたＲＮＡを有する宿主細胞のいずれか１つを含む組成物（医薬組成物など）を提供する。

【0202】

一部の実施形態では、本明細書に記載のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築物のいずれか１つ、及び薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含む医薬組成物が提供される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して毒性がなく、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピルなどのｐ－ヒドロキシ安息香酸アルキル;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;３－ペンタノール;及びｍ－クレゾールなど）;低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の糖類;ＥＤＴＡなどのキレート剤;ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体（例：Ｚｎ－タンパク質錯体）;及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。一部の実施形態では、凍結乾燥製剤が提供される。インビボ投与に使用される医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成され得る。

【0203】

本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築物、組成物、ライブラリー、または編集された宿主細胞のいずれか１つを含む、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法または治療方法のいずれか１つに使用できるキットまたは製品がさらに提供される。

【0204】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を含む、宿主細胞内に標的ＲＮＡを編集するためのキットが提供され、ここで、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成する標的化ＲＮＡ配列を含み、標的ＲＮＡは、疾患または症状に関連し、二本鎖ＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは環状である。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含む。

【0205】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を含む、宿主細胞内に標的ＲＮＡを編集するためのキットが提供され、ここで、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、標的ＲＮＡは、疾患または症状に関連し、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、リンカー核酸配列は、ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、かつｄＲＮＡは、環状ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである。

【0206】

一部の実施形態において、前記キットは、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物をさらに含む。一部の実施形態において、前記キットは、ＡＤＡＲ３の阻害剤またはその構築物をさらに含む。一部の実施形態において、前記キットは、インターフェロンの刺激物またはその構築物をさらに含む。一部の実施形態では、前記キットは、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法または治療方法のいずれか１つを実行するための説明書をさらに含む。

【0207】

本出願のキットは、適切な包装に入っている。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟な包装（例えば、密封されたポリエステルフィルムまたはビニール袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、トランスフェクションまたは形質導入試薬、細胞培養培地、緩衝液、及び解釈情報などの追加コンポーネントを選択可能に提供する場合がある。

【0208】

したがって、本出願はまた、製品を提供する。前記製品は、容器と、容器上または容器に関連付けられたラベルまたはプロトコルを含むことができる。適切な容器には、バイアル（密封されたバイアルなど）、ボトル、ジャー、柔軟な包装などが含まれる。一部の実施形態では、容器は医薬組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。医薬組成物を収容する容器は、再構成された製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする多用途バイアルであってもよい。プロトコルとは、治療用製品の市販パッケージに通常含まれている説明書を指し、そのような製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、禁忌、及び/または警告などの情報が含まれている。また、前記製品は、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及び注射器を含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。

【0209】

キットまたは製品は、薬局（例えば、病院薬局及び調剤薬局）での保管及び使用に十分な量で包装された、複数の単位用量の医薬組成物の及び使用説明書を含んでもよい。

【0210】

実施例
以下の実施例は、本出願の例示的なもののみであるため、いかなる方法でも本発明を限定すると見なされるべきではない。以下の例示的な実施形態及び実施例、ならびに詳細な説明は、限定としてではなく、例示として提供されている。

【0211】

材料及び方法
（プラスミドの構築）
線形ａｒＲＮＡを発現する構築物の場合、ａｒＲＮＡの配列を合成し、ｐＬｅｎｔｉ－ｓｇＲＮＡ－ｌｉｂ ２．０（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８９６３８）バックボーンにＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによってクローニングし、ａｒＲＮＡの転写をｈＵ６またはＣＭＶプロモーターによってそれぞれ駆動した。遺伝子コードされたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ発現構築物については、まず、Ｔｗｉｓｔｅｒ Ｐ３ Ｕ２Ａ、５’連結配列、３’連結配列、及びＴｗｉｓｔｅｒ Ｐ１^４８を含むｐＬｅｎｔｉ－ｓｇＲＮＡ－ｌｉｂ ２．０ベクターに基づいてクローニングベクターを構築した。次に、ａｒＲＮＡ配列を合成し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによって自己触媒性環状ＲＮＡ発現ベクターにクローニングした。

【0212】

編集効率をさらに向上させるために、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１に２０ｎｔのスペーサーと３０ｎｔのポリＡＣ配列を隣接させ、次に遺伝的にコードされたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ発現ベクターにＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによってクローニングした。

【0213】

オフターゲット編集を減らすために、潜在的なオフターゲットアデノシンの反対側のヌクレオチドを削除し、遺伝的にコードされたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ発現ベクターにクローニングした。

【0214】

二重蛍光レポーターについては、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰ（ＥＧＦＰの開始コドンＡＴＧが削除された）コード配列をＰＣＲによって増幅し、ＢｓｍＢＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＲ０４５２）を使用して消化し、続いて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｌ）を介した３×ＧＧＧＧＳリンカーとのライゲーションが行われた。そして、ライゲーション産物をｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＰＵＲＯバックボーンに挿入した。

【0215】

病原性変異を有する遺伝子を発現する構築物については、ＴＰ５３（Ｖｉｇｅｎｅｂｉｏから注文、中国医学科学院病原体生物学研究所のＪ．Ｗａｎｇの研究室からの贈り物）の全長コード配列は、対応する遺伝子をコードする構築物から増幅され、誘発ＰＣＲによりＧ＞Ａ突然変異を導入した。増幅産物は、Ｇｉｂｓｏｎクローニング法によりｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ｍＣｈｅｒｒｙバックボーンにクローニングされた。

【0216】

（インビトロでの環状ＲＮＡの生成及び精製）
環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の生成は、Ａｂｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，”Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡｓ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０１８．１８１－１９２、及びＣｈｅｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｒｉｎｇｓ ｂｙ Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ ２ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｙ ｓｐｌｉｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｓｔｒａｎｄ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８，ｅ５４－ｅ５４（２０２０）に記載の方法にしたがう。簡単に説明すると、ＨＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｅ２０４０Ｓ）を使用して、線状化環状ＲＮＡプラスミドテンプレートからインビトロ転写（ＩＶＴ）によって環状ＲＮＡ前駆体を合成した。ＩＶＴ後、ＩＶＴ生成物をＤＮａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｍ０３０３Ｓ）で３０分間処理してＤＮＡテンプレートを消化した。Ｔ４ Ｒｎｌ環化の場合、Ｔ４ Ｒｎｌ １（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｍ０２３９Ｌ）またはＴ４ Ｒｎｌ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｍ０２０４Ｌ）を線形環状ＲＮＡ前駆体に添加し、ＤＮａｓｅ Ｉ消化後３７℃で一晩インキュベートした。自己触媒環化のグループ１では、ＤＮａｓｅ Ｉ消化後、ＧＴＰを最終濃度２ｍＭで反応に添加し、反応を５５℃で１５分間インキュベートして、環状ＲＮＡの環化を触媒した。次いで、環状化したｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｔ２０４０Ｌ）を使用してカラム精製した。そして、カラム精製したＲＮＡを６５℃で３分間加熱し、氷上で冷却した。反応物をＲＮａｓｅ Ｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、＃ＲＮＲ０７２５０）で３７℃で１５分間処理して、ｃｉｒｃＲＮＡを濃縮した。ＲＮａｓｅ Ｒで処理したＲＮＡをカラム精製した。

【0217】

ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡをさらに濃縮するために、精製したＲＮａｓｅ Ｒで処理したｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを、粒径５μｍ、孔径２０００Åの４．６×３００ｍｍサイズ排除カラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃２１５９８０Ｐ－４６３０）を備えた高速液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ１２６０）を使用してＲＮａｓｅフリーＴＥ緩衝液中で分析した。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが豊富な画分を収集し、カラム精製に供した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｔ２０４０Ｌ）。精製したｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの免疫原性をさらに低下させるために、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを６５℃で３分間加熱し、氷上で冷却し、次いでクイックＣＩＰホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｍ０５２５Ｓ）で処理した。最後に、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ、＃Ｒ１０１８）を使用して、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡをカラム精製し、濃縮した。

【0218】

（細胞培養とトランスフェクション）
ＨｅＬａ細胞株はＺ．Ｊｉａｎｇの研究室（北京大学）から入手し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株はＣ．Ｚｈａｎｇの研究室（北京大学）から入手した。Ａ５４９細胞株はＥｄｉＧｅｎｅからのものであった。Ｃ２Ｃ１２細胞株はＰｒｏｃｅｌｌから購入した。ＭＥＦ細胞はＩｄｕａ－Ｗ３９２Ｘマウスから生成された。Ｈｅｐ Ｇ２／ＲＰＥ１／ＳＦ２６８／Ｃｏｓ７／ＮＩＨ３Ｔ３細胞株は、北京大学の我らの研究室で維持されていた。これらの哺乳類細胞株を、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充した１０％ウシ胎児血清（ＢＩ）を含むダルベッコ改良イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０１３－ＣＶ）中で３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0219】

メーカーのプロトコルにしたがって、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、０６３６６５４６００１）またはＰＥＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｂ６０００７０）を使用してプラスミドを細胞にトランスフェクトし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＲＮＡ００３）を使用してインビトロで環状化されたＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。

【0220】

（細胞株の構築）
安定したレポーター細胞株の場合、レポーター構築物（ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＰＵＲＯバックボーン）を、２つのウイルスパッケージングプラスミドｐＲ８．７４及びｐＶＳＶＧとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。７２時間後、上清ウイルスを回収し、－８０℃で保存した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をレンチウイルスに感染させた後、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で選別して培養し、検出可能なＥＧＦＰバックグラウンドのない二重蛍光レポーターを安定して発現する単一クローン細胞株を選択した。ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１^－／－及びＴＰ５３^－／－細胞株は、Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．＆ＷｅｉＷ， “Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，”ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １１（２０１６）に記載の方法に従って生成された。ＡＤＡＲ１を標的とするシングルガイドＲＮＡと、ＣＭＶ駆動ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＰＣＲで増幅されたドナーＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。次に、トランスフェクションの７日後に細胞をピューロマイシンで処理した。ピューロマイシン耐性細胞から単一クローンを単離した後、シーケンシングとウエスタンブロットによる検証を行った。

【0221】

（内因性または外因性で発現した転写産物のＲＮＡ編集）
二重蛍光レポーターでのＲＮＡ編集を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞を１２ウェルプレート（１～３×１０^５細胞／ウェル）に播種した。２４時間後、細胞を２μｇの線形ａｒＲＮＡまたはｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、編集効率をＥＧＦＰ^＋比率によって測定した。二重蛍光レポーター細胞と同様に、ＡＤＡＲ１^－／－ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をレポーター遺伝子と線形ａｒＲＮＡまたはｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡプラスミドによってトランスフェクトした。

【0222】

複数の細胞株でのＲＮＡ編集効率を評価するために、１×１０^５（ＨｅＬａ、Ｈｅｐ Ｇ２、Ａ５４９、ＲＰＥ１、ＳＦ２６８、Ｃ２Ｃ１２、ＮＩＨ３Ｔ３）または４×１０^５（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を１２ウェルプレートに播種した。２４時間後、レポーター遺伝子とａｒＲＮＡプラスミドをこれらの細胞に同時トランスフェクトした。編集効率は、ＥＧＦＰ^＋比率によって測定された。

【0223】

ＥＧＦＰ^＋比率を評価するために、トランスフェクションの４８時間後に、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ分析）によって細胞を選別して収集した。ｍＣｈｅｒｒｙシグナルは、レポーター遺伝子／ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ発現細胞の蛍光選択マーカーとして機能し、ＥＧＦＰ^＋／ｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞のパーセンテージは編集効率の読み取り値として計算された。

【0224】

内因性ｍＲＮＡ転写産物のＲＮＡ編集を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種した（８×１０^５細胞／ウェル）。２４時間後、細胞を３μｇの線形または環状ａｒＲＮＡプラスミドによってトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＦＡＣＳ分析によって選別して収集した。ディープシーケンシングによって編集効率を測定した。

【0225】

ＡからＩへの編集比率の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）定量化について、トランスフェクションの４８時間後に、細胞をＦＡＣＳアッセイによって選別及び収集してＲＮＡ単離（Ｚｙｍｏ、Ｒ１０５５）をした。次に、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＫＲ１１８）を介して全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、対応するプライマーｍＣｈｅｒｒｙ－ＳｐｅＩ－Ｆ（配列番号１）、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＢｓｍＢＩ－Ｒ１（配列番号２）及びＥＧＦＰ－ＢｓｍＢＩ－Ｆ１（配列番号３）を使用して、標的部位をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、サンガーシーケンシングまたは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ）用に精製された。

【0226】

（標的部位のＲＮＡ編集分析）
ディープシーケンシング分析では、ａｒＲＮＡカバー配列の標的部位配列（上流及び下流２０－ｎｔ）を使用してインデックスが生成された。読み取り値は、ＢＷＡ（ｖ．０．７.１０－ｒ７８９）を使用してアライメント及び定量化された。次に、ＢＡＭをＳａｍｔｏｏｌｓアライメントで選別し、ＲＥＤｉｔｏｏｌｓ（ｖ．１．０.４）を使用してＲＮＡ編集部位を分析した。パラメータは、－Ｕ［ＡＧまたはＴＣ］－ｔ８－ｎ０．０－Ｔ６－６－ｅ－ｄ－ｕであった。フィッシャーの正確確率検定（ｐ値＜０．０５）によって計算されたａｒＲＮＡ標的化領域内のすべての有意なＡからＧへの変換は、ａｒＲＮＡによる編集と見なされた。標的アデノシンを除く変換は、オフターゲット編集であった。対照群と実験群に同時に現れた変異は単一ヌクレオチド多型によるものと見なされた。

【0227】

（全トランスクリプトームＲＮＡシーケンシング分析）
青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）発現カセットを有する対照ＲＮＡ_１５１またはｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡ発現プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＢＦＰ^＋細胞はトランスフェクションの４８時間後にＦＡＣＳによって濃縮され、ＲＮＡはＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ Ｍｉｃｒｏキット（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ４２０）で精製された。次に、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁性分離モジュール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｅ７４９０）を使用してｍＲＮＡを精製し、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＲＮＡＬｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｅ７７７０）で処理した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎプラットフォーム（２×１５０塩基対ペアエンド;各サンプル３０Ｇ）を使用してディープシーケンス分析を行った。トランスフェクションによる非特異的影響を排除するために、トランスフェクション試薬でのみ細胞を処理したモック群を含めた。各群には４つの複製が含まれていた。

【0228】

バイオインフォマティクス分析パイプラインは、Ｖｏｇｅｌらの研究に従った。分析の品質管理はＦａｓｔＱＣを使用して行われ、品質トリムはＣｕｔａｄａｐｔに基づいた（各リードの最初の６ｂｐがトリムされ、最大２０ｂｐが品質トリムされた）。ＡＷＫスクリプトを使用して、導入されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡをフィルタリングした。トリミング後、９０ｎｔ未満の長さのリードはフィルタリングされた。続いて、フィルタリングされたリードは、ＳＴＡＲソフトウェアによってリファレンスゲノム（ＧＲＣｈ３８－ｈｇ３８）にマッピングされた。ＧＡＴＫ Ｈａｐｌｏｔｙｐｃａｌｌｅｒを使用してバリアントを呼び出した。ＧＡＴＫによって生成された原始ＶＣＦ（Ｖａｒｉａｎｔ Ｃａｌｌ Ｆｏｒｍａｔ）ファイルは、ＧＡＴＫ ＶａｒｉａｎｔＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ｂｃｆｔｏｏｌｓ、及びＡＮＮＯＶＡＲによってフィルタリングされ、注釈が付けられた。ｄｂＳＮＰ、１０００ Ｇｅｎｏｍｅ及びＥＶＳのバリアントはろ過された。次に、各群の６つの複製の共有バリアントがＲＮＡ編集部位として選択された。モック（ｍｏｃｋ）群のＲＮＡ編集レベルをバックグラウンドとして表示し、モック群のバリアントを差し引くことにより、対照ＲＮＡ_１５１及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡのグローバルターゲットを取得した。

【0229】

ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが自然な編集ホメオスタシスを混乱させるかどうかを評価するために、対照ＲＮＡ_１５１及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡが共有するグローバル編集部位を分析した。ネイティブのＡからＩへの編集部位でのＲＮＡ編集比率の差は、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）の相関係数分析で評価された。

【0230】

（ｐ５３の転写調節活性アッセイ）
ＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ ｃＤＮＡ発現プラスミドとｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ発現プラスミドを、ｐ５３の転写調節活性を検出するために、ｐ５３-ホタルルシフェラーゼシス報告プラスミド（ＹＲＧｅｎｅ、ＶＸＳ０４４６）及びウミシイタケシフェラーゼプラスミド（北京大学Ｚ．Ｊｉａｎｇ研究室から）とともに使用した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し、製造元のプロトコルに従ってＰｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２９４０）でアッセイした。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００リーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて発光を測定した。ｐ５３誘導性ルシフェラーゼの倍率変化を、ホタルの発光とウミシイタケの発光の比として計算した。

【0231】

ウエスタンブロット
ｐ５３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１２６）及びβ－チューブリン（ＣＷＢｉｏｔｅｃｈ、ＣＷ００９８）に対するマウスモノクローナル一次抗体を使用した。ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ、１１５－０３５－００３）二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入した。そして、２×１０^６個の細胞を選別して溶解し、等量の各溶解物のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用にロードした。次に、サンプルタンパク質をポリ二フッ化ビニリデンメンブレン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移し、一次抗体（ｐ５３、１：３００、抗チューブリン、１：２０００）でイムノブロットした。続いて、二次抗体のインキュベーション（１：３，０００）及び曝露を行った。実験は３回繰り返された。半定量分析は、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用して行われた。

【0232】

（動物実験）
Ｉｄｕａ－Ｗ３９２Ｘマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。すべてのマウスを、北京大学実験動物センターでＳＰＦ（特定病原体を含まない）条件下で繁殖及び飼育した。動物実験は北京大学実験動物センターによって承認され、国家衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施された。

【0233】

ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ ＡＡＶ８はＰａｃｋＧｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈによってパッケージングされた。６～８週齢で、ＡＡＶをマウスあたり１×１０^１３ベクターゲノムの用量で尾静脈を介してＩＤＵＡ－Ｗ３９２Ｘマウス（Ｂ６．１２９Ｓ－Ｉｄｕａｔｍｌ．１Ｋｍｋｅ／Ｊ）に注射した。実験期間中（４～５週間）、マウスを週に４回モニタリングした。

【0234】

採取したマウス組織を１ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ中でホモジナイズし、クロロホルム抽出法によりＲＮＡを抽出した。次に、組織の逆転写されたＲＮＡがＰＣＲにかけられ、サンガーシーケンシングまたは次世代シーケンシングによって分析された。

【0235】

（ＩＤＵＡ触媒活性アッセイ）
採取した細胞ペレットを１×ＰＢＳ緩衝液中の２８μＬの０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で再懸濁及び溶解し、氷上で３０分間保持した。次に、２５μＬの細胞溶解液を２５μＬの１９０μＭ ４－メチルウンベリフェリル－α－Ｌ－イデュロニダーゼ基質（Ｃａｙｍａｎ、２Ａ－１９５４３－５００）に添加し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ３．５］に溶解し、暗所で３７℃で９０分間インキュベートした。触媒反応は、２００μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ／グリシン緩衝液［ｐＨ１０．３］を添加してクエンチし、４℃で２分間遠心分離した。上澄みを９６ウェルプレートに移し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００リーダー（ＴＥＣＡＮ）を使用して３６５ｎｍ及び４５０ｎｍの発光波長で蛍光を測定した。

【0236】

（統計）
群比較のために、対応のない両側スチューデントｔ検定を実行した。全トランスクリプトームＲＮＡ－ｓｅｑデータについては、ＤＥＳｅｑ２（ｖ．１．１８．１）を使用して統計的有意性を分析した。統計分析は、Ｒ及びＰｒｉｓｍ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して実行された。

【0237】

実施例１．Ｐｏｌ ＩＩプロモーターから生成されるａｒＲＮＡにより、高いＲＮＡ編集効率が実現できる
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）が編集効率を改善できるかどうかをテストするために、Ｐｏｌ ＩＩプロモーター（ＣＭＶ）によって駆動されるａｒＲＮＡを発現するプラスミドを構築した。ｍＣｈｅｒｒｙとＥＧＦＰの間にインフレーム終止コドンを含むレポーターシステム（レポーター１、図１Ａ）を使用して、ＣＭＶ及びＵ６（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターによって駆動されるａｒＲＮＡ間のＲＮＡ編集効率（ａｒＲＮＡ_１５１）を比較した。未処理の細胞をモック（未処理）として使用した。

【0238】

使用した配列は次のとおりである：ａｒＲＮＡ_１５１は配列番号４の配列を有する。ＣＭＶプロモーターは、配列番号５の核酸配列を有する。Ｕ６プロモーターは、配列番号６の核酸配列を有する。二重蛍光レポーター遺伝子１は、ｍＣｈｅｒｒｙの配列（配列番号７）、３×ＧＳリンカー及び標的とされるＡを含む配列（配列番号８）、ならびにｅＧＦＰの配列（配列番号９）を含む。

【0239】

ＣＭＶ－ａｒＲＮＡは、ＲＮＡ編集においてＵ６－ａｒＲＮＡよりも優れていることが分かった（図１Ｂ～１Ｃ）。これらの結果は、ａｒＲＮＡの存在量がＬＥＡＰＥＲ効率にとって重要であり、５’－Ｃａｐ及び３’－ｐｏｌｙ（Ａ）が標的化編集中のａｒＲＮＡを妨げないことを示している。

【0240】

実施例２．ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡにより、効率的かつ耐久性のあるプログラム可能なＲＮＡ編集が可能になる
ａｒＲＮＡの環状化がＲＮＡの安定性と半減期を改善できるかどうかを試験するために、実施例１に記載のように、ｍＣｈｅｒｒｙとＥＧＦＰの間にインフレーム終止コドンを含むレポーター遺伝子１を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図２Ａ）を、レポーター１を標的とするｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１を発現するプラスミドによってトランスフェクトした。ＥＧＦＰ蛍光は、ＲＮＡに対する標的編集の効率を示す。

【0241】

ａｒＲＮＡ（ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ）の環状化効率は、対応するプライマー対を使用した標的遺伝子座のＰＣＲ増幅によって決定され、ＰＣＲ産物はサンガー配列決定のために精製された。サンガー配列決定により、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが正常に生成されたことが示された。レポーター１を使用して、ＣＭＶ（Ｐｏｌ ＩＩ）またはＵ６（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターによって駆動される１５１ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ_１５１；配列番号４）とｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ（ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１）の間でＲＮＡ編集効率を比較した。Ｕ６－ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１は、ＲＮＡ編集においてＣＭＶ－ａｒＲＮＡ_１５１よりも優れていることが判明した（図２Ｂ）。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１は、配列番号４の５’と３’を連結する配列番号１０の連結リンカー配列を有する。３’連結リンカー配列は配列番号１１であり、５’連結リンカー配列は配列番号１２である。ＲＮＡ生成量をさらに増加させるために、Ｐｏｌ ＩＩプロモーター（ＣＭＶ）によって駆動されるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１を発現するプラスミドを構築した。サロゲートレポーターアッセイにおけるＥＧＦＰ発現によって示されるように、Ｕ６－ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１はＲＮＡ編集においてＣＭＶ－ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１よりも優れていることが判明した（図２Ｃ）。上記の結果に基づいて、ＲＮＡ編集においては、ＣＭＶプロモーターよりもＵ６プロモーターによって駆動されるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの編集効率が優れていることが証明されたため、以下のすべての実験にはＵ６プロモーターを使用した。

【0242】

レポーター１を使用して、Ｕ６プロモーターによって駆動されるａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ_１５１）とｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ（ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１）の間でＲＮＡ編集効率を比較した。非標的化ＲＮＡをトランスフェクトした細胞を対照として使用した（対照ＲＮＡ_１５１）。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ^＋百分率の有意な増加によって示されるように、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡはａｒＲＮＡよりも優れていることが判明した（図２Ｄ）。さらに、このＲＮＡ編集は持続的であり、少なくとも約１８日間持続した（図２Ｅ）。

【0243】

ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによるＲＮＡ編集が内因性ＡＤＡＲ１タンパク質にも依存するかどうかをテストするために、レポーター１と、レポーター１を標的とするｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１を発現するプラスミドを、ＡＤＡＲ１ノックアウト有り及びなしのＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした（ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ^－／－）。ＥＧＦＰ^＋百分率は、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ^－／－細胞における編集によって生成されたＥＧＦＰシグナルの完全な消失によって示されるように、ａｒＲＮＡとｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの両方のＲＮＡ編集は内因性ＡＤＡＲに依存していることが分かった（図２Ｆ）。

【0244】

ａｒＲＮＡとｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡのＲＮＡ編集効率を、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、ＲＰＥ１、ＳＦ２６８、Ｃ２Ｃ１２、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｃｏｓ７を含む複数細胞型でさらに比較した（図２Ｇ）。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、あらゆる細胞型においてａｒＲＮＡよりも優れた性能を発揮することが判明した。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが内因性転写物に対して効率的なＲＮＡ編集を実行できるかどうかをテストするために、６つの内因性転写物、ＰＰＩＡ（配列番号１３）、ＫＲＡＳ（配列番号４４）、ＲＡＢ７Ａ（配列番号４５）、ＦＡＮＣＣ（配列番号４６）、ＭＡＬＡＴ１（配列番号４７）及びＴＰ５３（配列番号１６）を標的とするｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１を設計した（図２Ｈ）。次世代配列決定（ＮＧＳ；Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ）によって、逆転写されたＲＮＡをＰＣＲ増幅及び精製した。次世代シークエンシングの結果は、６つの転写物すべての中で、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡ編集において線形対応物よりも優れた性能を発揮することを示した（図２Ｉ）。さらに、定量的ＰＣＲによって決定された同様の相対ＲＮＡ発現によって示されるように、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、ＰＰＩＡ及びＦＡＮＣＣ遺伝子転写物の発現に対していかなるＲＮＡｉ効果も示さなかった（データは示さず）。

【0245】

次に、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが内因性転写物の複数の標的部位で効率的なＲＮＡ編集も達成できるかどうかをテストするために、９つの内因性遺伝子ＰＰＩＢ、ＧＵＳＢ、ＫＲＡＳ、ＭＡＬＡＴ１、ＴＵＢＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＰＰＩＡ、ＳＭＹＤ５及びＣＴＮＮＢ１の２０の異なるＲＮＡ部位を標的とするために１５１－ｎｔのｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを設計した（表２）。次世代シーケンシングでは、２０部位のうち１７部位において、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが線形対応物よりも標的ＲＮＡ編集において優れた性能を発揮することが示された。しかし、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、ＭＡＬＡＴ１（部位１）では同等の編集率を示し、ＫＲＡＳ（部位１及び２）ではさらに編集比率が低下した。これら３つの部位を標的とするｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、標的の認識や標的編集活性を媒介する機能を妨げる構造を持っている可能性がある。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡに隣接する柔軟なＲＮＡリンカーの付加により編集活性を媒介する能力をさらに最適化できるかどうかをテストするために、５０ヌクレオチドの柔軟なポリＡＣ ＲＮＡリンカー（ＡＣ５０と呼ばれる）を隣接するｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１に付加し、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１と比較して、これらのｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ＿ＡＣ５０リンカーは、１４部位で編集比率が向上した。実際、ＫＲＡＳ（部位１及び２）を標的とするｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ＿ＡＣ５０は、最初のｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの編集効率を、対応する線形ａｒＲＮＡの編集効率に匹敵するレベルまで改善した。平均して、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ＿ＡＣ５０の編集効率は、線形対応物よりもそれぞれ２．３倍及び３．１倍高かった（図２Ｊ）。

【0246】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ヒト初代肝細胞、及びヒト脳オルガノイドに送達した。次世代シークエンシングの結果は、ＡＡＶ送達ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが、線形対応物と比較して、これらすべての細胞及びオルガノイドにおいて、より高いレベルの標的編集を、長期間持続する方法で生成することを示した（図２Ｋ～Ｎ）。

【0247】

【表1】

【0248】

【表2】

【0249】

【表3】

【0250】

【表4】

【0251】

【表5】

【0252】

【表6】

【0253】

【表7】

【0254】

【表8】

【0255】

【表9】

【0256】

【表10】

【0257】

【表11】

【0258】

【表12】

【0259】

実施例３．インビトロ環化戦略を使用したＬＥＡＰＥＲ用のｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの生成
ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを生成するためのインビトロ戦略をテストするために（図２Ａ）、インビトロ転写によって作成された線形ａｒＲＮＡをＴ４ Ｒｎｌｌ及びＲｎｌ２との２種類のＴ４ ＲＮＡリガーゼ^５０によって環状化し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した（図３Ａ）。ＥＧＦＰレポーター^４２を含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした後、１、３、７日目にＥＧＦＰ発現が観察された。これらの精製されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、線状バージョンよりも高く、より長く持続するＥＧＦＰシグナルレベルを生成できることが観察された。さらに、サンガーシーケンシング（図３Ｅ）及び次世代シーケンシング（図３Ｂ）では、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡレポーターの転写物における標的部位のアデノシンからイノシン（ＡからＩ）への変換率は、線形ａｒＲＮＡの５倍以上高かった。さらに、内因性ＰＰＩＢ転写物上でインビトロで送達されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの編集比率も５０％以上に達することができた（図３Ｃ）。

【0260】

グループＩリボザイム媒介自己触媒活性^{５１，５２}を研究するために、グループＩリボザイム自己触媒結合したｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを、ハーラー症候群マウスから産生した初代ＭＥＦ細胞株に導入した。病原性点突然変異（ＩＤＵＡ^{Ｗ３９２Ｘ}）を持つＩｄｕａ転写物の標的とされるアデノシンに対する編集比率を測定した。未処理の細胞をモック対照（未処理）として使用した。非標的化ＲＮＡをトランスフェクトした細胞も対照（対照ＲＮＡ）として使用した。次世代シーケンシングの結果は、グループＩリボザイム自己触媒作用によって生成されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが、ＭＥＦ細胞におけるＩＤＵＡ^{Ｗ３９２Ｘ}転写物の病原性点突然変異を約２５％の編集比率で修正できることを示した（図３Ｄ）。これらの結果は、インビボまたはインビトロで生成されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが、内因性転写物において効率的かつ持続的な標的ＲＮＡ編集を達成できることを実証している。

【0261】

実施例４．ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡのＲＮＡ編集特異性
ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡのＲＮＡ編集特異性を評価するために、全トランスクリプトームＲＮＡシーケンシング分析を実行した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡ発現プラスミドでトランスフェクトした。非標的化ＲＮＡをトランスフェクトした細胞を対照（対照ＲＮＡ）として使用した。全トランスクリプトームＲＮＡシーケンシングの結果、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡトランスフェクション群には１７の潜在的なオフターゲット編集（図４Ａ）と１つのＰＰＩＡオンターゲット部位があることが示された。対照的に、多くの報告されているＲＮＡ編集ツールで使用されているＡＤＡＲ２デアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲ２_ＤＤ）過剰発現群では、対照と比較してＲＮＡトランスクリプトームに１６，５８８近くのオフターゲット編集が発生した（図４Ｂ）。したがって、ＡＤＡＲ２_ＤＤ過剰発現群（１６５８８のオフターゲット）におけるオフターゲット編集は、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ群（１７のオフターゲット）よりもはるかに高かった。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡトランスフェクショング群で同定された１７のオフターゲット部位のほとんどは、イントロン及び偽遺伝子領域に位置していた（図４Ｄ）。最小自由エネルギー分析により、これらのオフターゲットヒットのすべてが、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡと安定した二重鎖を形成できず（図４Ｅ）、したがって実際の配列依存性のオフターゲットである可能性が低いことが示された。

【0262】

ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡが標的とされるＰＰＩＡ転写物の発現レベルに影響を与えるかどうかをテストするために、上記の全トランスクリプトームのＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用してさらなる分析を実行した。ＰＰＩＡ転写物におけるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡ媒介編集は、ＰＰＩＡ転写物の発現にもスプライシングパターン（図４Ｆ及び４Ｈ～Ｊ）にも影響を与えず、ＰＰＩＡのタンパク質レベル（図４Ｇ）にも影響を及ぼさなかった。さらに、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡ群と対照ＲＮＡ_１５１群が共有するＡ－ｔｏ－ＩのＲＮＡ編集部位を比較すると、互いに非常に類似しており、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡが内因性ＡＤＡＲデアミナーゼのネイティブなＡ－ｔｏ－Ｉ編集機能にほとんど影響を及ぼさないことが示された（図４Ｃ）。

【0263】

実施例５．操作されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによる隣接塩基のオフターゲットの低減
標的とされる転写物のａｒＲＮＡで覆われた領域における隣接塩基のオフターゲットをテストするために、ｍＣｈｅｒｒｙとＥＧＦＰの間にインフレーム終止コドンを含むレポーター１を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、レポーター１を標的とする線形ａｒＲＮＡまたは環状ａｒＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした（図５Ａ～５Ｂ、上図）。ＡＤＡＲ１／２デアミナーゼの触媒特性に基づいて^{５４－５６}、線形ａｒＲＮＡ（図５Ａ、下図）またはｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ（図５Ｂ、下図）における標的とされるアデノシンの反対側のヌクレオチドを削除すると（それぞれ、ａｒＲＮＡ_ΔＣ及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_ΔＣ）、標的とされるＲＮＡの編集が完全に除去されることが判明した。

【0264】

バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）オフターゲットを減らすために、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡで覆われた領域内の不要なアデノシンの反対側のヌクレオチドを削除した（図５Ｃ）。内因性ＰＰＩＡ転写物（配列番号１３の標的配列）を標的とするｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの異なるバージョンが設計され、これには、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＡ（配列番号１４の標的化ＲＮＡ配列を有する）、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ５}－ＰＰＩＡ（配列番号１３９の標的化ＲＮＡ配列）、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ８}－ＰＰＩＡ（配列番号１５の標的化ＲＮＡ配列を有する）、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＡＣ５０－ＰＰＩＡ（配列番号１１５の標的化ＲＮＡ配列を有する）、及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}＿ＡＣ５０－ＰＰＩＡ（配列番号１４１の標的化ＲＮＡ配列を有する）が含まれ、潜在的なオフターゲット部位の反対側にあるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ上のウリジンが保持または削除されていた（図５Ｃ及び５Ｆ、及び表２）。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ８}では、配列番号１４の位置１８、２５、３３、４１、４２、４７、５９及び８７のウリジンが欠失されており、これは標的ＲＮＡ内の８つの潜在的なオフターゲット部位に対応する。標的化ＲＮＡ配列の５’末端と３’末端は、配列番号１０の連結リンカー配列を介して互いに連結されていた。次世代シークエンシングの結果は、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１（図５Ｄ）と比較して、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ８}を使用するとより高いオンターゲット編集比率が達成されるため、オンターゲット編集比率はｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ上のＵ欠失の影響を受けないことを示した。注目すべきことに、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ８}は、試験した８つの部位すべてでオフターゲット編集を有意に減少させた（図５Ｅ）。これらの結果は、哺乳動物細胞において、ミスマッチまたはバルジのある不完全二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）内のアデノシンがＡＤＡＲによって高い特異性と効率で効果的に編集できることを裏付けている^{５７，５８}。さらに、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}＿ＡＣ５０は、標的部位で６０％の編集効率を依然として維持しながら、すべてのバイスタンダーオフターゲットをほぼ除去することが判明した（図５Ｇ及び５Ｈ）。標的部位周囲のＮＧＳ読み取り値は、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}＿ＡＣ５０が、編集された転写物の＞９０％においてバイスタンダーオフターゲットを伴わない標的とされる編集を生成できることを示した（図５Ｉ及び５Ｊ）。

【0265】

次に、インビトロで合成されたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１４}をテストしたところ、用量依存的な方法で効率的な編集も可能であることが判明した（図５Ｋ）。欠失の有無にかかわらず、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡはＡＤＡＲの発現レベルに影響を与えず、先天性免疫応答を誘発しなかった（図５Ｌ及び５Ｍ）。

【0266】

実施例６．高い効率と特異性を備えたｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによるｐ５３転写活性の回復
ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの潜在的な治療用途を探るために、５０％を超えるヒトのがんで頻繁に変異が起こるＴＰ５３腫瘍抑制遺伝子が標的とされた^５９。ＴＰ５３のｃ．１５８ＧからＡへのバリアントは、臨床的に関連するナンセンス突然変異（Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）であり、機能しないトランケートされたタンパク質を生成する（図６Ｆ）。柔軟なＲＮＡリンカーが隣接する、及び／またはＵ欠失を有する、ＴＰ５３^Ｗ５３Ｘを標的とするｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの異なるバージョンを設計した（図６Ａ）。ＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ転写物の標的配列は配列番号１６である。標的化ＲＮＡ配列は次のとおりである：ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１（配列番号１７）、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡＧ１}（配列番号１８）、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡＧ４}（配列番号１９）、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１}（配列番号２０）、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}（配列番号２１）、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１＿ＡＣ５０}（配列番号１７）、及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}＿ＡＣ５０（配列番号２１）。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ１５１－ＡＧ１、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡＧ４}及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１}、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}は、配列番号１０の連結リンカー配列を有する。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡＧ１}の標的化ＲＮＡ配列において、配列番号１７の６６番目のウリジンがＧに置換されている。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡＧ４}の標的化ＲＮＡ配列において、配列番号１７の３６、６６、１１１及び１１４番目のウリジンがＧに置換された。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１}の標的化ＲＮＡ配列においては、配列番号１７の６６番目のウリジンが欠失されている。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}の標的化ＲＮＡ配列では、配列番号１７の３６、６６、１１１及び１１４番目のウリジンが欠失されている。

【0267】

次世代シーケンシング解析では、標的とされるアデノシンの編集比率が変動しており、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１では約３０％であり、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡＧ１}、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡＧ４}、及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ１}では約４０％であり、１つの望ましくないオフターゲット部位にＡ－ＧミスマッチまたはＵ欠失を有し（図６Ｂ及び表２）、すべて対応する線形ａｒＲＮＡバージョンよりも高いことが示された^４２。さらに、４つの潜在的なオフターゲット部位にＵ欠失を有するｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}は、約５０％というより高い編集比率をもたらした（図６Ｂ）。

【0268】

ａｒＲＮＡ配列に隣接する柔軟なＲＮＡリンカーをｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡに付加すると、標的化ＲＮＡへの結合能力が向上し、編集効率が向上するかどうかをテストするために、ＡＣ５０（配列番号２２）と呼ばれる５０ｎｔポリＡＣ ＲＮＡリンカーを、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}の両方の隣接ａｒＲＮＡ配列に付加し、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１＿ＡＣ５０及びｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}＿ＡＣ５０が得られた。次世代シーケンス解析では、柔軟なリンカーを使用したこのような最適化により、特にｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}＿ＡＣ５０について、標的化ＲＮＡ編集効率が向上し、約７０％の編集が行われたことが示された（図６Ｂ）。

【0269】

転写物編集に加えて、すべてのｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡバージョンは、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＰ５３^－／－細胞における全長ｐ５３タンパク質の産生を効果的にレスキューすることができた（図６Ｃ）。以前に報告されたｐ５３－ルシフェラーゼシス報告システム^{６０，６１}を使用して、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡのすべてのバージョンがｐ５３の転写調節機能を回復できることが分かった（図６Ｄ）。さらに、線形ａｒＲＮＡバージョン^４２と比較して、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}＿ＡＣ５０は最も高い編集比率を示し、最も高い転写調節活性を回復した（図６Ｄ）。

【0270】

ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡで覆われる領域内の潜在的なオフターゲットも調べた。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ上の潜在的なオフターゲットＡヌクレオチドの反対側にあるＵヌクレオチドが削除されると、４つの予測部位上のバイスタンダーオフターゲットがほぼ消失し（図６Ｅ及び６Ｇ）、オンターゲット編集比率がさらに上昇することが分かった（図６Ｂ）。標的とされる部位におけるｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１＿ＡＣ５０の編集効率はｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}よりも高かったが（図６Ｂ）、そのバイスタンダーオフターゲット効果の割合が低いため、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{１５１－ＡΔ４}の機能回復レベルはｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１＿ＡＣ５０よりもはるかに高かった（図６Ｄ及び６Ｇ）。まとめると、これらの結果は、ＬＥＡＰＥＲ２．０と呼ばれるアップグレードされたＬＥＡＰＥＲバージョンが、オフターゲット効果を排除しながらオンターゲット編集比率を大幅に向上できることを示した。

【0271】

実施例７．ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡによるハーラー症候群マウスにおけるα－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）活性の回復
ハーラー症候群は、ムコ多糖類の代謝を担うリソソーム代謝酵素であるα－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）の欠損に起因するムコ多糖症Ｉ型の最も重篤なサブタイプである。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡの治療可能性を探るために、ハーラー症候群のマウスモデルを使用した。このマウスモデルは、Ｉｄｕａのエクソン９にホモ接合Ｗ３９２Ｘ（ＴＧＧからＴＡＧ）点変異を持っており、これは臨床的ハーラー症候群の患者で見られるＷ４０２Ｘ変異と類似している。

【0272】

それぞれＩｄｕａの成熟ｍＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とする２つのバージョンのｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを設計した。ＩＤＵＡ^{Ｗ３９２Ｘ}ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物は、配列番号２３の標的配列を有する。ＩＤＵＡ^{Ｗ３９２Ｘ}ｍＲＮＡ転写物は、配列番号２５の標的配列を有する。ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{ｍＲＮＡ－１５１}（配列番号２６の標的化ＲＮＡ配列を有する）またはｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_{ｐｒｅ－ｍＲＮＡ－１５１}（配列番号２４の標的化ＲＮＡ配列を有する）は、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ウイルスの形質導入によってＩｄｕａ－Ｗ３９２Ｘマウスに送達された。４週間後にマウスを殺処分し、肝臓組織を採取して、標的化ＲＮＡ編集及びα－Ｌ－イズロニダーゼの触媒活性を測定した。次世代シーケンシング解析により、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１／ｍＲＮＡターゲティングとｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１／ｐｒｅ－ＲＮＡターゲティングの両方が、標的化編集比率１０％に達していることが示された（図７Ａ）。さらに、両方のｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、Ｉｄｕａ転写物の量に影響を与えることなく（図７Ｃ）、Ｉｄｕａ－Ｗ３９２Ｘマウスの肝臓組織におけるＩＤＵＡ触媒活性を有意に回復した（図７Ｂ）。これらの結果は、特定の臨床的単一遺伝子疾患における正確、効率的、持続的な標的とされるＲＮＡの編集を有するＬＥＡＰＥＲ２．０の治療可能性を実証している。

【0273】

実施例８．隣接リンカー配列及び／またはＵ欠失を持つｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ
この実施例は、ｃｉｒｃ－ＲＮＡ内の柔軟なリンカー配列（すなわち、隣接リンカー）の付加と、非標的アデノシンの反対側の１つ以上のＵの削除が、オンターゲット及びオフターゲット編集比率に対する影響を説明する。

【0274】

（隣接するリンカー）
ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡにａｒＲＮＡ配列に隣接する柔軟なＲＮＡリンカーを付加すると、標的化ＲＮＡへの結合能力が向上し、その結果、オンターゲット編集効率が向上し、及び／またはバイスタンダーオフターゲット編集効果が低減できるかどうかをテストするには、５０ｎｔ ＰｏｌｙＡＣ ＲＮＡリンカー（ＡＣ５０（配列番号２２）と呼ばれる）を、環状１７１ｎｔ ａｒＲＮＡ（ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１）配列の５’または３’末端の異なるヌクレオチド位置に隣接するように付加した。図８Ａ～８Ｂを参照されたい。ａｒＲＮＡ配列のストレッチに５つを超えるＧがある状況では、ストレッチ内の中央のＧがＡに置き換えられた。

【0275】

３つの標的配列を試験した：（１）内因性ＰＰＩＡ転写物の３’ＵＴＲの１２９番目のＡ（「ｍｆ－ＰＰＩＡ－ＵＴＲ２」；配列番号２７）；（２）内因性ＰＰＩＡ転写物の３’ＵＴＲの１５５番目のＡ（「ｍｆ－ＰＰＩＡ－３」；配列番号２８）；（３）内因性ＩＤＵＡ－１転写物の３’ＵＴＲの１３４番目のＡ（「ｍｆ－ＩＤＵＡ－１」；配列番号２９）。カニクイザルの参照配列は、ＮＣＢＩ識別子ＮＣ＿０２２２７４で見つけることができる。アカゲザルＵｓｈ２ａエクソンの参照配列はＸＭ＿００５５４０８４７である。各ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１の標的化ＲＮＡ配列は、各標的配列の配列と相補的である。

【0276】

簡単に説明すると、胎児アカゲザル腎臓細胞（ＦＲＨＫ－４）及びアカゲザル腎臓細胞（ＬＬＣ－ＭＫ２）を、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ及びｅＧＦＰを発現する組換えＡＡＶプラスミドでトランスフェクトした。ｒＡＡＶプラスミドは、発現カセットに隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲを有し、５’から３’へ、ａｒＲＮＡに作動可能に連結されたＵ６プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＧＦＰ、及びＷＰＲＥが含まれる。トランスフェクションの４８時間後、細胞からＲＮＡサンプルを取得した。ＦＲＨＫ－４実験では、ＧＦＰの発現に基づいて細胞をＦＡＣＳソーティングに供した。標的ＲＮＡのアンプリコンが得られ、ＮＧＳ分析に供された。

【0277】

図８Ｃに示すように、ｍｆ－ＰＰＩＡ－ＵＴＲ２を標的とする様々なｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、オンターゲットの編集効率が向上したａｒＲＮＡ領域の５’配列（－Ｌ）を部分的に置換するリンカーを有するｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを除き、ソーティングの有無にかかわらず、同等のオンターゲット編集効率をもたらした。さらに、図８Ｄに示すように、ａｒＲＮＡ配列を５’末端（－Ｌ）及び／または３’末端（－Ｒ）でＡＣ５０リンカーで部分的に置換すると、標的ＲＮＡ転写物の置換領域におけるバイスタンダーオフターゲット編集が減少した。さらに、オンターゲット編集効率ならびにオフターゲット編集パターン及び効率は、１７１ｎｔ線形及び環状ａｒＲＮＡで同様であることが判明した（データは示さず）。

【0278】

標的に応じて、隣接リンカーの異なる位置は、オンターゲット編集効率に異なる影響を与える。しかし、例えば、ｍｆ－ＰＰＩＡ３標的に関しては、ａｒＲＮＡ領域の３’配列（－Ｒ）を部分的に置き換えるリンカーを有するｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、一貫して元のｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１と同等のオンターゲット編集効率をもたらした（図８Ｅ）。ｍｆ－ＰＰＩＡ－ＵＴＲ２と同様に、ａｒＲＮＡ配列の５’末端（－Ｌ）及び／または３’末端（－Ｒ）でＡＣ５０リンカーで部分的に置換すると、標的ＲＮＡ転写物の置換領域におけるバイスタンダーオフターゲット編集が減少した（図８Ｆ；－Ｌデータは示されていない）。１２７、１３２、１６０、及び１６８位で高いＡからＧへの変換率が観察された。

【0279】

ｍｆ－ＩＤＵＡ－１標的に関しては、ａｒＲＮＡ配列の５’配列（－Ｌ）または３’配列（－Ｒ）を部分的に置換するリンカーを有するｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、両方ともオンターゲット編集効率を低下させた。ａｒＲＮＡ配列（ＲＬ）の５’末端と３’末端の両方に隣接するリンカー配列を有するｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡは、元のｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１７１と同等のオンターゲット編集効率を有していた（図８Ｇ）。バイスタンダーのオフターゲット編集効果を図８Ｈに示す。６２、９１、１０２、及び１１８位で高いＡからＧへの変換率が観察された。

【0280】

理論に束縛されるものではないが、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡに隣接配列を含めることでオンターゲット編集効率が向上するかどうかは、ａｒＲＮＡが複雑な二次構造を形成できるかどうかに依存する可能性がある。－Ｌ、－Ｒ、及び－ＬＲ ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを使用した、ａｒＲＮＡのＡＣ５０リンカー置換領域に対応するｍＲＮＡ領域におけるオフターゲット編集の減少は、ＡＤＡＲ編集には二本鎖ＲＮＡの形成が必要であるという以前の観察と一致している。

【0281】

Ｕの欠失
バイスタンダーのオフターゲット編集を減らすために、ｍｆ－ＰＰＩＡ－３及びｍｆ－ＩＤＵＡ－１を標的とする、特定の非標的Ａの反対側にＵを有するｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを構築した。以下の表１は、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡにおける欠失したＵ残基に対応する非標的Ａ残基の位置、及び対応するｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ配列を列挙する。

【0282】

【表13】

【0283】

ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡを使用したｍｆ－ＰＰＩＡ－３及びｍｆ－ＩＤＵＡ－１の非標的及び標的Ａ位置におけるＡからＧへの編集比率をそれぞれ図９Ａ及び図９Ｂのヒートマップに示す。「Ｘ」のマークが付いている構築物には利用可能なデータがない。ｍｆ－ＰＰＩＡ－３（図９Ａ）に関しては、４つのオフターゲットＡは高い分子内オフターゲット編集比率を有していた。ａｒＲＮＡ内の各オフターゲットＡ残基の反対側にあるＵ残基を欠失させると、オフターゲット編集率が大幅に低下し、場合によってはほぼ０になる。ａｒＲＮＡ内の複数のオフターゲットＡ残基の反対側にあるＵ残基を欠失させると、複数のオフターゲットＡ残基のオフターゲット編集比率を同時に低下させることができる。特定のＵ残基またはその組み合わせを欠失させると、オンターゲット編集比率が向上する可能性がある。

【0284】

ｍｆ－ＩＤＵＡ－１（図９Ｂ）に関しては、分子内オフターゲット率は一般に高くなかった。ただし、標的ＡはＩＤＵＡ３’ＵＴＲの末端に近いため、リバースプライマーがａｒＲＮＡを増幅する可能性があり、その結果、オンターゲット比率が異常に高くなる。両方の細胞型における同様のオフターゲット編集パターンは、非標的Ａの反対側にあるＵを欠失させると、ｍｆ－ＩＤＵＡ－１のオンターゲット編集比率が増加する可能性があることを示唆している。

【0285】

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【0286】

配列表
配列番号1 mCherry-SpeI-F
TATAACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG

【0287】

配列番号2 mCherry-BsmBI-R1
TATACGTCTCATCTACAGATTCTTCCGGCGTGTATACCTTC

【0288】

配列番号3 EGFP-BsmBI-F1
TATACGTCTCATAGAGATCCCCGGTCGCCACCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG

【0289】

配列番号4 arRNA₁₅₁
ACUACAGUUGCUCCGAUAUUUAGGCUACGUCAAUAGGCACUAACUUAUUGGCGCUGGUGAACGGACUUCCUCUCGAGUACCAGAAGAUGACUACAAAACUCCUUUCCAUUGCGAGUAUCGGAGUCUGGCUCAGUUUGGCCAGGGAGGCACU

【0290】

配列番号5 CMVプロモーター
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT

【0291】

配列番号6 U6プロモーター
GAGGGCCTATTTCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTATTTGCAGTTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGAC

【0292】

配列番号7 mCherry
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG

【0293】

配列番号8 3 × GSリンカー及び標的とされるアデノシン
CTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGCAGAAGGTATACACGCCGGAAGAATCTGTAGAGATCCCCGGTCGCCACC

【0294】

配列番号9 eGFP
GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA

【0295】

配列番号10 連結リンカー配列
CTGCCATCAGTCGGCGTGGACTGTAGAACCATGCCGACTGATGGCAG

【0296】

配列番号11 3’ 連結リンカー配列
CTGCCATCAGTCGGCGTGGACTGTAG

【0297】

配列番号12 5’ 連結リンカー配列
AACCATGCCGACTGATGGCAG

【0298】

配列番号13 PPIA 標的配列
GAUGUAGGCUUUAUUUUAAGCAGUAAUGGGUUACUUCUGAAACAUCACUUGUUUGCUUAAUUCUACACAGUACUUAGAUUUUUUUUACUUUCCAGUCCCAGGAAGUGUCAAUGUUUGUUGAGUGGAAUAUUGAAAAUGUAGGCAGCAACUG

【0299】

配列番号14 PPIA circ-arRNA₁₅₁の標的化RNA配列
CAGUUGCUGCCUACAUUUUCAAUAUUCCACUCAACAAACAUUGACACUUCCUGGGACUGGAAAGUAAAAAAAAUCCAAGUACUGUGUAGAAUUAAGCAAACAAGUGAUGUUUCAGAAGUAACCCAUUACUGCUUAAAAUAAAGCCUACAUC

【0300】

配列番号15 PPIA circ-arRNA_151-AΔ8の標的化RNA配列
CAGUUGCUGCCUACAUUUUCAAUAUUCCACUCAACAAACAUUGACACUUCCUGGGACUGGAAAGAAAAAAAAUCCAAGUACUGUGUAGAAUAAGCAAACAAGGAUGUCAGAAGAACCCAUACUGCUAAAAUAAAGCCUACAUC

【0301】

配列番号16 TP53標的配列
CUACUUCCUGAAAACAACGUUCUGUCCCCCUUGCCGUCCCAAGCAAUGGAUGAUUUGAUGCUGUCCCCGGACGAUAUUGAACAAUGGUUCACUGAAGACCCAGGUCCAGAUGAAGCUCCCAGAAUGCCAGAGGCUGCUCCCCCCGUGGCCC

【0302】

配列番号17 TP53 circ-arRNA₁₅₁の標的化RNA配列
GCUGGUGCAGGGGCCACGGGGGGAGCAGCCUCUGGCAUUCUGGGAGCUUCAUCUGGACCUGGGUCUUCAGUGAACCAUUGUUCAAUAUCGUCCGGGGACAGCAUCAAAUCAUCCAUUGCUUGGGACGGCAAGGGGGACAGAACGUUGUUUU

【0303】

配列番号18 TP53 circ-arRNA_151-AG1の標的化RNA配列
GCUGGUGCAGGGGCCACGGGGGGAGCAGCCUCUGGCAUUCUGGGAGCUUCAUCUGGACCUGGGUCUUCAGUGAACCAUUGUUCAAGAUCGUCCGGGGACAGCAUCAAAUCAUCCAUUGCUUGGGACGGCAAGGGGGACAGAACGUUGUUUU

【0304】

配列番号19 TP53 circ-arRNA_151-AG4の標的化RNA配列
GCUGGUGCAGGGGCCACGGGGGGAGCAGCCUCUGGCAGUCGGGGAGCUUCAUCUGGACCUGGGUCUUCAGUGAACCAUUGUUCAAGAUCGUCCGGGGACAGCAUCAAAUCAUCCAGUGCUUGGGACGGCAAGGGGGACAGAACGUUGUUUU

【0305】

配列番号20 TP53 circ-arRNA_151-AΔ1の標的化RNA配列
GCUGGUGCAGGGGCCACGGGGGGAGCAGCCUCUGGCAUUCUGGGAGCUUCAUCUGGACCUGGGUCUUCAGUGAACCAUUGUUCAAAUCGUCCGGGGACAGCAUCAAAUCAUCCAUUGCUUGGGACGGCAAGGGGGACAGAACGUUGUUUU

【0306】

配列番号21 TP53 circ-arRNA_151-AΔ4の標的化RNA配列
GCUGGUGCAGGGGCCACGGGGGGAGCAGCCUCUGGCAUCGGGAGCUUCAUCUGGACCUGGGUCUUCAGUGAACCAUUGUUCAAAUCGUCCGGGGACAGCAUCAAAUCAUCCAUGCUUGGGACGGCAAGGGGGACAGAACGUUGUUUU

【0307】

配列番号22 AC50リンカー配列
AAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACA

【0308】

配列番号23 IDUA pre-mRNA配列
AGGAAGCCAGAUGCUAGGUAUGAGAGAGCCAACAGCCUCAGCCCUCUGCUUGGCUUAUAGAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGUGUCCUGGCCAGCACCCAUCACCC

【0309】

配列番号24 IDUA pre-mRNA配列に使用されるcirc-arRNA₁₅₁の標的化RNA配列(下線Cは標的Aに対向する)
GGGUGAUGGGUGCUGGCCAGGACACCCACUGUAUGAUUGCUGUCCAACACAGCCCCAGCCUUUGAGACCUCUGCCCAGAGUUGUUCUCCAUCUAUAAGCCAAGCAGAGGGCUGAGGCUGUUGGCUCUCUCAUACCUAGCAUCUGGCUUCCU

【0310】

配列番号25 IDUA mRNA配列
CCCACGUGCAGUUGCUGCGAAAGCCAGUACUCACAGUCAUGGGGCUCAUGGCCCUGUUGGAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGUGUCCUGGCCAGCACCCAUCACCC

【0311】

配列番号26 IDUA mRNA配列に使用されるcirc-arRNA₁₅₁の標的化RNA配列(下線Cは標的Aに対向する)
GGGUGAUGGGUGCUGGCCAGGACACCCACUGUAUGAUUGCUGUCCAACACAGCCCCAGCCUUUGAGACCUCUGCCCAGAGUUGUUCUCCAUCUAUAAGCCAAGCAGAGGGCUGAGGCUGUUGGCUCUCUCAUACCUAGCAUCUGGCUUCCU

【0312】

配列番号27 mf-PPIA-UTR2
GGCCACCAUGCCCAGCUGCUGCCUACAUUUUCAAUAUUCUACUCAACAAACAUUGAGACUUCCUGGGUCUGGAAAGAAAGAAAUCCAAGUAUUAUGUAGACUUAAGCAAACAAGUGAUGUUUCAGAAGUAACCCAUUACUGCUUAAAAUAAAGCCUACAUCAACACUCUAA

【0313】

配列番号28 mf-PPIA-3
CAUGGAACCCAAAGGGAACUGCAGCGAGAGCACAAAGAUUCUAGGAUACUGCGAGCAAAUGGGGUGGAGGGGUGCUCUCCUGAGCCACAGAAGGAAUGGUCUGGUGGUUAAGAUAAAACACAAGUCAAACUUAUUCGAGUUGUCCACAGUCAGCAAUGGUGAUCUUCUUGC

【0314】

配列番号29 mf-IDUA-1
UAAAAGAAAAUAAUAAAAUAUAAAAAUAUAUUGCAAAGGAGGUGAUGAGAGGGCAGCGUGGGCACAGUGCAACCCCAGCUCGCCGACCGCCAGUGGAGGUGCAGCCCAGUGGGGCUCAGCACAGGCUCAUGGAUUUCCAGGGGCUGGAGGCCCUCUUGGCACAGGGACCUC

【0315】

配列番号30 mf-PPIA-3 circ-arRNA-1
CAUGGAACCCAAAGGGAACUGCAGCGAGAGCACAAAGAUUCUAGGAUACUGCGAGCAAAUGGGGUGGAGGGGGCUCUCCUGAGCCACAGAAGGAAUGGUCUGGUGGUUAAGAUAAAACACAAGUCAAACUUAUUCGAGUUGUCCACAGUCAGCAAUGGUGAUCUUCUUGC

【0316】

配列番号30 mf-PPIA-3 circ-arRNA-2
CAUGGAACCCAAAGGGAACUGCAGCGAGAGCACAAAGAUUCUAGGAUACUGCGAGCAAAUGGGGUGGAGGGGUGCUCUCCGAGCCACAGAAGGAAUGGUCUGGUGGUUAAGAUAAAACACAAGUCAAACUUAUUCGAGUUGUCCACAGUCAGCAAUGGUGAUCUUCUUGC

【0317】

配列番号32 mf-PPIA-3 circ-arRNA-3
CAUGGAACCCAAAGGGAACUGCAGCGAGAGCACAAAGAUUCUAGGAUACUGCGAGCAAAUGGGGUGGAGGGGUGCUCUCCUGAGCCACAGAAGGAAUGGUCUGGUGGUAAGAUAAAACACAAGUCAAACUUAUUCGAGUUGUCCACAGUCAGCAAUGGUGAUCUUCUUGC

【0318】

配列番号33 mf-PPIA-3 circ-arRNA-4
CAUGGAACCCAAAGGGAACUGCAGCGAGAGCACAAAGAUUCUAGGAUACUGCGAGCAAAUGGGGUGGAGGGGUGCUCUCCUGAGCCACAGAAGGAAUGGUCUGGUGGUUAAGAAAAACACAAGUCAAACUUAUUCGAGUUGUCCACAGUCAGCAAUGGUGAUCUUCUUGC

【0319】

配列番号34 mf-PPIA-3 circ-arRNA-43
CAUGGAACCCAAAGGGAACUGCAGCGAGAGCACAAAGAUUCUAGGAUACUGCGAGCAAAUGGGGUGGAGGGGUGCUCUCCUGAGCCACAGAAGGAAUGGUCUGGUGGUAAGAAAAACACAAGUCAAACUUAUUCGAGUUGUCCACAGUCAGCAAUGGUGAUCUUCUUGC

【0320】

配列番号35 mf-PPIA-3 circ-arRNA-432
CAUGGAACCCAAAGGGAACUGCAGCGAGAGCACAAAGAUUCUAGGAUACUGCGAGCAAAUGGGGUGGAGGGGUGCUCUCCGAGCCACAGAAGGAAUGGUCUGGUGGUAAGAAAAACACAAGUCAAACUUAUUCGAGUUGUCCACAGUCAGCAAUGGUGAUCUUCUUGC

【0321】

配列番号36 mf-PPIA-3 circ-arRNA-4321
CAUGGAACCCAAAGGGAACUGCAGCGAGAGCACAAAGAUUCUAGGAUACUGCGAGCAAAUGGGGUGGAGGGGGCUCUCCGAGCCACAGAAGGAAUGGUCUGGUGGUAAGAAAAACACAAGUCAAACUUAUUCGAGUUGUCCACAGUCAGCAAUGGUGAUCUUCUUGC

【0322】

配列番号37 mf-IDUA-1 circ-arRNA-1
UAAAAGAAAAUAAUAAAAUAUAAAAAUAUAUUGCAAAGGAGGUGAUGAGAGGGCAGCGUGGGCACAGUGCAACCCCAGCUCGCCGACCGCCAGUGGAGGGCAGCCCAGUGGGGCUCAGCACAGGCUCAUGGAUUUCCAGGGGCUGGAGGCCCUCUUGGCACAGGGACCUC

【0323】

配列番号38 mf-IDUA-1 circ-arRNA-2
UAAAAGAAAAUAAUAAAAUAUAAAAAUAUAUUGCAAAGGAGGUGAUGAGAGGGCAGCGUGGGCACAGUGCAACCCCAGCUCGCCGACCGCCAGUGGAGGUGCAGCCCAGUGGGGCCAGCACAGGCUCAUGGAUUUCCAGGGGCUGGAGGCCCUCUUGGCACAGGGACCUC

【0324】

配列番号39 mf-IDUA-1 circ-arRNA-3
UAAAAGAAAAUAAUAAAAUAUAAAAAUAUAUUGCAAAGGAGGUGAUGAGAGGGCAGCGUGGGCACAGUGCAACCCCAGCUCGCCGACCGCCAGUGGAGGUGCAGCCCAGUGGGGCUCAGCACAGGCCAUGGAUUUCCAGGGGCUGGAGGCCCUCUUGGCACAGGGACCUC

【0325】

配列番号40 mf-IDUA-1 circ-arRNA-4
UAAAAGAAAAUAAUAAAAUAUAAAAAUAUAUUGCAAAGGAGGUGAUGAGAGGGCAGCGUGGGCACAGUGCAACCCCAGCUCGCCGACCGCCAGUGGAGGUGCAGCCCAGUGGGGCUCAGCACAGGCUCAUGGAUUUCCAGGGGCUGGAGGCCCUCUGGCACAGGGACCUC

【0326】

配列番号41 mf-IDUA-1 circ-arRNA-43
UAAAAGAAAAUAAUAAAAUAUAAAAAUAUAUUGCAAAGGAGGUGAUGAGAGGGCAGCGUGGGCACAGUGCAACCCCAGCUCGCCGACCGCCAGUGGAGGUGCAGCCCAGUGGGGCUCAGCACAGGCCAUGGAUUUCCAGGGGCUGGAGGCCCUCUGGCACAGGGACCUC

【0327】

配列番号42 mf-IDUA-1 circ-arRNA-432
UAAAAGAAAAUAAUAAAAUAUAAAAAUAUAUUGCAAAGGAGGUGAUGAGAGGGCAGCGUGGGCACAGUGCAACCCCAGCUCGCCGACCGCCAGUGGAGGUGCAGCCCAGUGGGGCCAGCACAGGCCAUGGAUUUCCAGGGGCUGGAGGCCCUCUGGCACAGGGACCUC

【0328】

配列番号43 mf-IDUA-1 circ-arRNA-4321
UAAAAGAAAAUAAUAAAAUAUAAAAAUAUAUUGCAAAGGAGGUGAUGAGAGGGCAGCGUGGGCACAGUGCAACCCCAGCUCGCCGACCGCCAGUGGAGGGCAGCCCAGUGGGGCCAGCACAGGCCAUGGAUUUCCAGGGGCUGGAGGCCCUCUGGCACAGGGACCUC

【0329】

配列番号44 KRASの標的配列
ACUGAAGGCGGCGGCGGGGCCAGAGGCUCAGCGGCUCCCAGGCCUGCUGAAAAUGACUGAAUAUAAACUUGUGGUAGUUGGAGCUGGUGGCGUAGGCAAGAGUGCCUUGACGAUACAGCUAAUUCAGAAUCAUUUUGUGGACGAAUAUGAU

【0330】

配列番号45 RAB7Aの標的配列
AAUGCAGGCCUGUAAGGUGGAGGGUUGAACCCUGUUUGGAUUGCAGAGUGUUACUCAGAAUUGGGAAAUCCAGCUAGCGGCAGUAUUCUGUACAGUAGACACAAGAAUUAUGUACGCCUUUUAUCAAAGACUUAAGAGCCAAAAAGCUUUU

【0331】

配列番号46 FANCCの標的配列
CUGCGGAGGUCCCUUUGAGAGCUGGUUCCUGUUCAUUCACUUCGGAGGAUGGGCUGAGAUGGUGGCAGAGCAAUUACUGAUGUCGGCAGCCGAACCCCCCACGGCCCUGCUGUGGCUCUUGGCCUUCUACUACGGCCCCCGUGAUGGGAGG

【0332】

配列番号47 MALAT1の標的配列
UCAGUUGCGUAAUGGAAAGUAAAGCCCUGAACUAUCACACUUUAAUCUUCCUUCAAAAGGUGGUAAACUAUACCUACUGUCCCUCAAGAGAACACAAGAAGUGCUUUAAGAGGUAUUUUAAAAGUUCCGGGGGUUUUGUGAGGUGUUUGAU

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図2L】

【図2M】

【図2N】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図5J】

【図5K】

【図5L】

【図5M】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図9A】

【図9B】

【配列表】

2024531966000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-05-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含み、前記二本鎖ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含み、かつ
（２）前記ｄＲＮＡが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、方法。

【請求項2】

前記二本鎖ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の各非標的アデノシンにバルジを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標的化ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側の１つ以上のヌクレオチドを欠いていることを除いて、前記標的ＲＮＡに相補的である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ｄＲＮＡが線形ＲＮＡであり、好ましくは、前記ｄＲＮＡが環状ＲＮＡを形成することができる、若しくは、前記ｄＲＮＡが環状ＲＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、前記リンカー核酸配列が、前記ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しないか、若しくは、前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の末端を置換するリンカー核酸配列を含み、前記リンカー核酸配列が、前記ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しない、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ｄＲＮＡ、またはｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接するリンカー核酸配列を含み、前記リンカー核酸配列が、前記ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、
（２）前記ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員することができ、かつ
（３）前記ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、線形ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成し得る線形ＲＮＡである、方法。

【請求項7】

前記リンカー核酸配列の長さが約５ヌクレオチド（ｎｔ）～約５００ｎｔであり、
好ましくは、前記リンカー核酸配列の長さが約５０ｎｔ～約５００ｎｔであり、
更に好ましくは、前記リンカー核酸配列の長さが７０ｎｔ以下であり、場合により、前記リンカー核酸配列の長さが１０ｎｔ～５０ｎｔ、１０ｎｔ～４０ｎｔ、１０ｎｔ～３０ｎｔ、１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～５０ｎｔ、２０ｎｔ～４０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～５０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、または４０ｎｔ～５０ｎｔの間の任意の整数であり、又は、
更に好ましくは、前記リンカー核酸配列の長さが、約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり、場合により、前記リンカー核酸配列の長さが、約３０ｎｔ、または約５０ｎｔである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記リンカー核酸配列の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれか１つがアデノシンまたはシチジンを含み、任意選択で、前記リンカー核酸配列の１００％がアデノシンまたはシチジンを含み、及び／又は、
（ｂ）前記リンカー核酸配列が、ポリアデノシン（ポリＡ）、ポリグアノシン（ポリＧ）、またはポリシトシン（ポリＣ）配列を含み、及び／又は、
（ｃ）前記リンカー核酸配列の少なくとも５０％がアデノシンを含み、及び／又は、
（ｄ）前記リンカー核酸配列がジヌクレオチド反復配列を含み、及び／又は、
（ｅ）前記リンカー核酸配列が配列番号２２を含む、
請求項６又は７に記載の方法。

【請求項9】

（ａ）前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含み、又は
（ｂ）前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第１のリンカー核酸配列と、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含み、又は
（ｃ）前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第２のリンカー核酸配列とを含み、又は
（ｄ）前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端を置換する第１のリンカー核酸配列と、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端を置換する第２のリンカー核酸配列とを含み、又は、
（ｅ）前記ｄＲＮＡが環状ＲＮＡであり、前記リンカー核酸配列が、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端と前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端とを連結する、
請求項６又は７に記載の方法。

【請求項10】

前記標的化ＲＮＡ配列の長さが５０ｎｔを超え、好ましくは、前記標的化ＲＮＡ配列の長さが約１００～約２００ｎｔである、請求項１、２、６及び７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

（ａ）ＡＤＡＲ３阻害剤及び／またはインターフェロン刺激剤を、及び／又は
（ｂ）それぞれが異なる標的ＲＮＡを標的とする複数のｄＲＮＡまたは構築物を、及び／又は
（ｃ）ＡＤＡＲを、
前記宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項１、２、６及び７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化が、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、調整的スプライシング、異常なスプライシングもしくは選択的スプライシング、または前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、調整的スプライシング、異常なスプライシングもしくは選択的スプライシングの復帰を引き起こし、
好ましくは、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化が、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点突然変異、トランケート、伸長及び／またはミスフォールディング、あるいは前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、調整的スプライシング、異常なスプライシングもしくは選択的スプライシングの復帰による機能的で、完全長の、正しくフォールディングされた、及び／または野生型タンパク質を引き起こす、
請求項１、２、６及び７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記宿主細胞が真核細胞であり、若しくは、前記宿主細胞が哺乳動物細胞であり、更に若しくは前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、請求項１、２、６及び７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

標的ＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することができる標的化ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡを編集するためのｄＲＮＡであって、前記二本鎖ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンを含有するバルジを含む、ｄＲＮＡ、又は前記ｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む、構築物。

【請求項15】

標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡを編集するためのｄＲＮＡであって、前記ｄＲＮＡが、前記標的化ＲＮＡ配列の末端に隣接する若しくは置換するリンカー核酸配列を含み、前記リンカー核酸配列が、前記ｄＲＮＡのいかなる部分とも実質的に二次構造を形成しなく、前記ｄＲＮＡが、環状ＲＮＡ、線形ＲＮＡ、または環状ＲＮＡを形成することができる線形ＲＮＡである、ｄＲＮＡ、又は前記ｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む、構築物。

【国際調査報告】