特表 2024-531980 ＦＧＦ２１変異タンパク質及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-03

(54)【発明の名称】ＦＧＦ２１変異タンパク質及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/50 20060101AFI20240827BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240827BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240827BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240827BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20240827BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240827BHJP

【ＦＩ】

C07K14/50 ZNA

C12N15/12

C12N15/09 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/63 Z

A61P3/10

A61P3/06

A61P3/04

A61K38/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024513063

(86)(22)【出願日】2022-08-03

(85)【翻訳文提出日】2024-02-26

(86)【国際出願番号】 CN2022110072

(87)【国際公開番号】W WO2023035817

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】202111048898.6

(32)【優先日】2021-09-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522118506

【氏名又は名称】リートー ラボラトリーズ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＬＥＴＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ ＣＯ．， ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ４， Ｂｅｉｌｕｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ， ９ Ｎｏｒｔｈ Ｙｏｎｇｔｅｎｇ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９４ Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001841

【氏名又は名称】弁理士法人ＡＴＥＮ

(72)【発明者】

【氏名】ガオ シァン

(72)【発明者】

【氏名】ジャオ ヤオ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン ジェンジュン

(72)【発明者】

【氏名】ガオ ジャン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン ユィ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA701

4C084ZA702

4C084ZC331

4C084ZC332

4C084ZC351

4C084ZC352

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA27

4H045FA74

4H045GA23

4H045GA25

(57)【要約】

本発明はＦＧＦ２１変異タンパク質及びその応用を提供する。該変異タンパク質は野生型ヒトＦＧＦ２１配列に基づいていくつかの変更を有する：１７１位のプロリン残基が欠失、又は一つ又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、又は添加により１７１位のプロリン残基の前後に一対のジスルフィド結合を形成する。本発明のＦＧＦ２１変異タンパク質は、線維芽細胞活性化プロテアーゼ（ＦＡＰ）がそのＣ末端に対する酵素切断分解を抵抗することができ、Ｃ末端がβ－ｋｌｏｔｈｏ受容体と結合する活性を保持し、それによりその体内半減期と薬効を延長することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＦＧＦ２１変異タンパク質であって、
野生型ヒトＦＧＦ２１配列に基づいて以下のａ又はｂの変更を有するアミノ酸配列を含み、
ａ．１７１位のプロリン残基を削除し、
ｂ．１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、削除、又は添加により、１７１位のプロリン残基又はその前後に一対のジスルフィド結合を形成する、ことを特徴とするＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項2】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１０、１６、及び２２で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項3】

１７１位のプロリン残基の前後三つの部位以内に置換及び／又は添加によって二つのシステイン残基を導入する、ことを特徴とする請求項１に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項4】

ジスルフィド結合を形成する二つのシステイン残基の間は、１個、２個、又は３個のアミノ酸で隔てる、ことを特徴とする請求項３に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項5】

置換されたシステイン残基又は導入されたシステイン残基の二つの部位の間は、１個、２個、又は３個のアミノ酸で隔て、或いは置換されたシステイン残基又は導入されたシステイン残基の二つの部位の間は、アミノ酸残基を添加する方式によって１個、２個、又は３個のアミノ酸で隔てる、ことを特徴とする請求項４に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項6】

ａ、１７１位の前の三つの部位以内に一つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換え、
ｂ、１７１位の後の三つの部位以内に一つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換え、
ｃ、１７１位と、１７１位の前のシステイン残基に置換する部位との間に一又は二個のアミノ酸残基を添加し、及び／又は１７１位と、１７１位の後のシステイン残基に置換する部位との間に一又は二個のアミノ酸残基を添加する、ことを特徴とする請求項３に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項7】

添加された前記一つ又は二つのアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、又はセリンから選択される、ことを特徴とする請求項６に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項8】

ａ、１７０Ｇを１７０Ｃに置き換え、
ｂ、１７２Ｓを１７２Ｃに置き換え、
ｃ、１７１Ｐと１７２Ｃとの間に一つ又は二つのアミノ酸残基を挿入する、ことを特徴とする請求項６に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項9】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、及び２７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項３に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項10】

１７１位のプロリン残基を置換し、またその近傍部位の一つ又は複数のアミノ酸残基を置換、削除、又は添加した後、１７１位及びその近傍部位の間にジスルフィド結合を形成する、ことを特徴とする請求項１に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項11】

１２１Ｎを１２１Ｑに、１６８Ｍを１６８Ｌに置き換え、
及び／又は、野生型ヒトＦＧＦ２１配列の第一位のヒスチジン残基の前に、１つのアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基を添加する、ことを特徴とする請求項１に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項12】

さらに化学修飾を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質をコードする、ことを特徴とする核酸分子。

【請求項14】

請求項１３に記載の核酸分子を含む、ことを特徴とする担体。

【請求項15】

請求項１４に記載の担体を含む、ことを特徴とする遺伝子操作された細胞。

【請求項16】

薬物組成物であって、
請求項１～１２のいずれか一項に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質及び薬学的に許容される賦形剤を含む、ことを特徴とする薬物組成物。

【請求項17】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のＦＧＦ２１変異タンパク質又は請求項１６に記載の薬物組成物が血糖、血中脂質の制御及び体重の低減における応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はＦＧＦ２１変異タンパク質及びその応用に関し、バイオ技術分野に属する。

【背景技術】

【0002】

ヒト線維芽細胞増殖因子２１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２１，ＦＧＦ２１）は２０９個のアミノ酸で構成されるポリペプチドであり、そのうちＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端に２８個のアミノ酸で構成されるシグナルペプチドを含み、そのためシグナルペプチドに剪断された後に形成された成熟ＦＧＦ２１は１８１個のアミノ酸で構成される（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。

【0003】

ＦＧＦ２１は、肝臓、膵臓、脂肪組織など、ヒトの様々な臓器や組織において発現する。人体において、ＦＧＦ２１は血液循環に分泌し、且つ肝臓、膵臓及び脂肪組織における複数種類の信号通路及び機能活動を誘導することができ、さらに糖脂質代謝の調節及び膵島β細胞を保護する生理機能を実現する。研究により、食事誘導又は遺伝子操作により生成された肥満マウスにおいて、ＦＧＦ２１タンパク質を注射することによりマウスの体重及び血糖レベルを顕著に低下させることができ、同時にマウス血清中のトリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）含有量も顕著に低下することが示される。さらに検討した結果、ＦＧＦ２１は肝臓のインスリン感受性を向上させ、ブドウ糖不耐症を緩和することができることがわかった。ヒトにより近い哺乳類動物の研究により、ＦＧＦ２１は用量依存的に実験動物の体重及び体脂肪を減少することができ、例えば糖尿病に罹患したアカゲザルにＦＧＦ２１を投与すれば、その空腹血漿ブドウ糖及びトリグリセリドレベルはいずれも顕著に低下することが分かる。また、ＦＧＦ２１はさらに外分泌膵臓細胞及び肝細胞信号通路を活性化することができ、肝グリコーゲン出力を抑制する。

【0004】

ＦＧＦ２１はＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）ファミリーメンバーであるが、大多数のＦＧＦが有する広域スペクトルの有糸分裂促進能力とは異なり、顕著な細胞増殖促進能力はない。研究により、ＦＧＦ２１トランスジェニックマウスは全ライフサイクル内に、体内に腫瘍及び組織増殖等の異常状況が発見されない。同時に、薬物動態学及び薬物安全性実験により、薬理学的用量を超えるＦＧＦ２１は低血糖症が発生せず、これはＦＧＦ２１が潜在的な糖尿病及び肥満等の疾患を理想的に治療する薬物であることを示す。

【0005】

多くのＦＧＦファミリーメンバーと異なり、ＦＧＦ２１が下流信号通路を活性化することは、同時にＦＧＦ受容体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＦＧＦＲｓ）及び補助受容体β－ｋｌｏｔｈｏによって実現する必要があり、単独のβ－ｋｌｏｔｈｏ又はＦＧＦＲはいずれもＦＧＦ２１信号を活性化することができない。構造生物学的研究により、ＦＧＦ２１の構造は二つの部分に分けることができ、そのうちＮ末端構造ドメインは主にＦＧＦＲの結合に関連し、Ｃ末端構造ドメインは相対的に柔軟な配列であり、β－ｋｌｏｔｈｏの結合に関連する。ＦＧＦ２１はβ－ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦＲと一つの三元複合体を形成した後、下流に関連する信号通路を活性化することができ、さらにその生物効果を発揮する。

【0006】

ＦＧＦ２１の血糖制御及び体重低減等の生理機能は関連疾患の治療に期待をもたらし、しかし野生型ＦＧＦ２１はプロテアーゼに加水分解されやすく、分子量が小さすぎる等の欠点が存在し、その半減期が０．５～２時間のみであり、直接薬物とすることに適しない。同時に、ＦＧＦ２１タンパク質のＣ末端に含まれるβ－ｋｌｏｔｈｏ受容体と結合することを担当するフレキシブル領域は、繊維芽細胞活性化プロテアーゼ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＦＡＰ）に分解されやすく、その主な分解部位はＰｒｏ１７１周囲である。Ｐ１７１がＦＡＰプロテアーゼによって切断された後、ＦＧＦ２１分子はβ－ｋｌｏｔｈｏ補助受容体と結合できなくなり、さらにＦＧＦ２１分子の不活性化を引き起こす。このような困難に対して、医学界は酵素切断部位アミノ酸部位特異的変異を行って長時間作用融合タンパク質を調製し、又はポリエチレングリコール、脂肪酸鎖等をポリペプチド骨格に接続する等の方法によりＦＧＦ２１の半減期を向上させる。ＵＳ ８，０３４，７７０ Ｂ２にいくつかのヒト野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列に基づく変異体が記述され、そのうちＰ１７１Ｇ又はＰ１７１Ａは、ＦＡＰプロテアーゼがＦＧＦ２１タンパク質Ｃ末端への加水分解を効果的に低減することができるが、該特許の報告によっても我々の体外実験においても、Ｐ１７１Ｇは依然としてある程度のＦＡＰ加水分解されて不活性化される形態が存在し、新たなより効果的な変異体を探してＦＡＰプロテアーゼの加水分解を低減することはＦＧＦ２１タンパク質の創薬可能性（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）をさらに向上させることに大きな意義を有する。

【発明の概要】

【0007】

天然の野生型ヒトＦＧＦ２１タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すようなアミノ酸配列を有し、該タンパク質の１７１位プロリン残基（Ｐｒｏ）はＦＡＰプロテアーゼの酵素切断部位である。本発明の目的は、野生型ＦＧＦ２１の酵素切断部位及び／又はその近傍の構造を変更することによりＦＧＦ２１の加水分解率を低下させ、その体内半減期及び薬効を延長することである。

【0008】

上記目的を達成するために、本発明の一態様はＦＧＦ２１変異タンパク質を提供する。一つの具体的な実施形態において、それは野生型ヒトＦＧＦ２１配列に基づいて以下のａ又はｂの変更を有するアミノ酸配列を含む。
ａ．１７１位のプロリン残基を削除する。
ｂ．１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、削除、又は添加により、１７１位のプロリン残基又はその前後に一対のジスルフィド結合を形成する。

【0009】

本発明の一つの態様は１７１位のプロリン残基（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１０、１６、及び２２に示される配列）を直接削除し、ＦＧＦ２１タンパク質がＦＡＰの酵素切断部位を失い、従って加水分解されない。選択的に、ＦＧＦ２１変異タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

本発明の別の態様は、１７１位のプロリン残基の近傍部位に置換及び／又は添加によって二つのシステイン残基を導入する。

【0011】

選択的に、Ｐｒｏ１７１の両側に隣接するアミノ酸残基の置換、削除、又は添加により、Ｐｒｏ１７１の前後に、該部位を跨ぐ一対のジスルフィド結合を形成し、Ｐｒｏ１７１の酵素切断部位を遮断し、それによりそれが加水分解されにくい。

【0012】

選択的に、上記ジスルフィド結合は直接１７１部位に形成することができ、すなわち１７１位のプロリン残基を置換し、及びその近傍部位の一つ又は複数のアミノ酸残基を置換、削除、又は添加した後、１７１位及びその近傍部位の間にジスルフィド結合を形成する。

【0013】

選択的に、上記近傍部位は前後三つの部位以内を指す。さらに好ましくは、前後二つの部位以内である。

【0014】

本発明の別の実施形態において、上記ＦＧＦ２１変異タンパク質は１７１位のプロリン残基の前後三つの部位以内に置換及び／又は添加によって、それぞれ二つのシステイン残基を導入する。

【0015】

選択的に、１７１位のプロリン残基の前後三つの部位以内に、一つ又は二つのアミノ酸残基によって置換及び／又は添加して、それぞれ一つのシステイン残基を導入する。

【0016】

選択的に、ジスルフィド結合を形成する二つのシステイン残基の間は、１個、２個、又は３個のアミノ酸で隔てる。

【0017】

置換されたシステイン残基又は導入されたシステイン残基の二つの部位の間は、１個、２個、又は３個のアミノ酸で隔て、或いは置換されたシステイン残基又は導入されたシステイン残基の二つの部位の間は、アミノ酸残基を添加する方式によって１個、２個、又は３個のアミノ酸で隔てる。

【0018】

選択的に、１７１位の前の三つの部位以内、又は前後二つの部位以内に、一つのアミノ酸残基をシステイン残基に置換し、１７１位の後の三つの部位以内、又は前後二つの部位以内に一つのアミノ酸残基をシステイン残基に置換する。１７１位と、１７１位の前のシステイン残基に置換する部位との間に一又は二個のアミノ酸残基を添加し、及び／又は１７１位と、１７１位の後のシステイン残基に置換する部位との間に一又は二個のアミノ酸残基を添加する。

【0019】

選択的に、添加された上記１つ又は２つのアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、及びセリンから選択される。好ましくは、添加されたアミノ酸残基はグリシンである。

【0020】

ジスルフィド結合を形成する二つのシステイン残基の間を二つ又は三つのアミノ酸残基で間隔させることにより、上記間隔を形成して導入されたアミノ酸がグリシン、アラニン、又はセリン（好ましくはグリシン）である場合、ＦＧＦ２１変異体がミスマッチ二量体の形成を減少させることができる。

【0021】

選択的に、１７０Ｇを１７０Ｃに、１７２Ｓを１７２Ｃに置き換え、１７１Ｐと１７２Ｃとの間に一つ又は二つのアミノ酸残基を挿入する。

【0022】

選択的に、ＦＧＦ２１変異タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、及び２７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。そのうち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１６、２２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の基礎でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の第１位ヒスチジンの前にそれぞれ１つのアラニン残基、セリン残基、グリシン残基を増加して形成された配列である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１７、２３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１８、２４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１９、２５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、２０、２６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、２１、２７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の関係は類似し、ここで説明を省略する。

【0023】

他の実施例において、１７１位のプロリン残基を置換し、またその近傍部位の一つ又は複数のアミノ酸残基を置換、削除、又は添加した後、１７１位及びその近傍部位の間にジスルフィド結合を形成する。

【0024】

選択的に、１２１Ｎを１２１Ｑに、１６８Ｍを１６８Ｌに置き換えると、１２１位の脱アミノ基反応と１６８位の酸化反応を弱めることができる。

【0025】

選択的に、野生型ヒトＦＧＦ２１配列の第一位のヒスチジン残基の前に１つのアラニン残基、グリシン残基又はセリン残基を添加し、原核発現（例えば大腸菌発現）時の開始コドンメチオニンを除去するために用いることができる。

【0026】

さらに、本発明の上記ＦＧＦ２１変異タンパク質はさらに化学修飾を有し、上記修飾はＰＥＧと脂肪酸鎖を含むが、それらに限定されない。

【0027】

本発明の第二態様では、上記ＦＧＦ２１変異タンパク質のいずれかをコードする核酸分子を提供する。

【0028】

本発明の第三態様では、上記の核酸分子を含む担体を提供する。

【0029】

本発明の第四態様では、上記担体を含む遺伝子操作された細胞を提供する。

【0030】

本発明の第五態様では、タンパク質の調製方法を提供し、以下のステップを含む。
１）上記担体を構築する。
２）構築された担体を宿主細胞にトランスフェクションする。
３）発現に適する条件で、上記宿主細胞を培養する。
４）培養物から本発明のＦＧＦ２１変異タンパク質を分離する。

【0031】

本発明の第六態様では、上記ＦＧＦ２１変異タンパク質と薬学的に許容される賦形剤とを含有する医薬組成物を提供する。

【0032】

本発明の第七の態様では、上記ＦＧＦ２１変異タンパク質が血糖、血中脂質の制御及び体重の低減における応用を提供する。

【0033】

本発明の提供するＦＧＦ２１変異タンパク質はＦＡＰ酵素がそのＣ末端に対する酵素切断分解を抵抗し且つＣ末端の活性を保持することができ、すなわちβ－ｋｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）受容体との結合であり、それによりその体内半減期及び薬効を延長することができる。且つ変異体Ｐ１７１Ｇに比べ、本発明の具体的な実施形態におけるＦＧＦ２１変異体はＦＡＰプロテアーゼ加水分解を遅くするより強い能力を有する。

【0034】

本発明に関する全てのアミノ酸配列番号はいずれも野生型ＦＧＦ２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を基準とし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１において第一アミノ酸部位番号は１であり、第二は２であり、このように最後のアミノ酸まで類推する。

【0035】

以下では、本発明の目的、特徴及び効果を十分に理解するために、本発明の構想、具体的な構造及び得られる技術的効果について、図面と関連してさらに説明する。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】は、１７１位のプロリン残基の両側（１７０Ｃ／１７３Ｃを例とし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）にジスルフィド結合を形成する分子シミュレーション構造概略図である。

【図2】は、実施例２におけるタンパク質が発現精製された後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、そのうちＭはＭａｒｋｅｒである。

【発明を実施するための形態】

【0037】

実施例１ 組換え発現担体の構築及び発現
１．１、発現プラスミドの構築
以下に示す番号１４１４、１４０７、１４０８、１４０９、１４１０、１４１１、１４１２、及び１４１３のタンパク質を発現する遺伝子をそれぞれ、「蘇州金唯智生物科技有限公司」が合成し、ｐＥＴ２１ｂ担体にクローニングした後、ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換する。
ＦＧＦ２１（１２１Ｑ，１６８Ｌ）変異体１４１４は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるように、変異部位１２１Ｑ及び１６８Ｌが１２１位の脱アミノ基反応及び１６８位の酸化反応を弱めるためのものであり、それ自体はその活力や他の機能（ＷＯ２０１１１５４３４９Ａ２、ＣＮ１１３７２８０１３Ａに開示されている）に影響を与えない。従って、実施例では変異体１４１４をコントロールとし、その実験結果は野生型ＦＧＦ２１の結果を示す。なお、ＦＧＦ２１野生型の第１位ヒスチジン残基の前に１個アラニン残基を添加し、原核発現時の開始コドンメチオニンを除去するために用いる。ＦＧＦ２１（Ｐ１７１Ｇ）変異体１４０７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示す。ＦＧＦ２１（Ｄｅｌ－Ｐ１７１）変異体１４０８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示す。ＦＧＦ２１（１７０Ｃ／Ｉｎｓ－１７２Ｇ／１７３Ｃ）変異体１４０９のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示す。ＦＧＦ２１（１７０Ｃ／１７２Ｃ）変異体１４１０のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示す。ＦＧＦ２１（１７０Ｃ／１７３Ｃ）変異体１４１１のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示す。ＦＧＦ２１（１７０Ｃ／Ｉｎｓ－１７２Ａ／１７３Ｃ）変異体１４１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示す。ＦＧＦ２１（１７０Ｃ／Ｉｎｓ－１７２Ｓ／１７３Ｃ）変異体１４１３のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示す。

【0038】

１．２、発現
一晩培養した種子は１：５０の体積比でＫａｎａ耐性を有する５００ｍＬ ＴＢ培地の三角フラスコに移し、初期ＯＤ６００は約０．１、３７℃、２２０ｒｐｍであり、ＯＤ６００が２．０になるまで培養し、ＩＰＴＧ（最終濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌである）を加え、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した後に菌を回収する。タンパク質は封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ、ＩＢ）の形式で発現される。

【0039】

実施例２ ＦＧＦ２１及び変異体タンパク質のリフォールディングと精製
２．１ 封入体の変性溶解
実施例１において細胞破砕と洗浄を経て得られた封入体を、８Ｍ尿素と１０ｍＭ ＤＴＴを用いて溶解する。封入体の溶解は室温で行い、時間は４時間である。

【0040】

２．２ リフォールディング
以上の溶解した封入体溶液をリフォールディング液に加え、リフォールディング液に２Ｍ尿素、１０ｍＭ ｃｙｓｔｅｉｎｅ及びｐＨが８．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液を含み、室温で一晩インキュベートする。リフォールディング期間には連続的に撹拌する必要があり、回転数は２００回転／分である。

【0041】

２．３ ＦＧＦ２１及び変異体タンパク質に対して疎水性作用クロマトグラフィーＰｈｅｎｙｌ精製を行う
終濃度が２Ｍ ＮａＣｌと２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌの緩衝液を加えた後に疎水性クロマトグラフィーｐｈｅｎｙｌ柱（ＧＥから購入する）を流れ、続いてＮａＣｌ溶液勾配溶出を行い、勾配が２Ｍから０Ｍである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥに基づいて目的タンパク質が位置する収集管を選択して合併して保存し、このステップは目的タンパク質を捕捉し且ついくつかのヘテロタンパク質を除去することができる。

【0042】

２．４ ＦＧＦ２１及び変異体タンパク質に対してイオン交換クロマトグラフィーＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑ精製を行う
疎水性作用クロマトグラフィー後に合併されたタンパク質を１０倍希釈した後にＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑイオン交換クロマトグラフィーを行い、ＮａＣｌ溶液を用いて勾配溶出し、勾配が０Ｍから１．０Ｍであり、核酸といくつかのタンパク質高重合体とヘテロタンパク質をさらに除去する。

【0043】

２．５ ＦＧＦ２１及び変異体タンパク質に対して分子篩の微細精製を行う
イオン交換クロマトグラフィーｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ精製後に合併したタンパク質を濃縮し、続いて分子篩Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ微細精製を行い、ＰＢＳを緩衝液とし、このステップで精製したタンパク質を最終サンプルとする。

【0044】

精製情報は表１に示すように、全てのタンパク質が電気泳動純の純度に達する。

【0045】

【表1】

【0046】

最終的なＦＧＦ２１変異体１４１４及び変異体の精製で得られたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析図（図２）から分かるように、ＦＧＦ２１変異体１４１４及び変異体１４０７、１４０８、１４０９はいずれも単体で存在する。そのうちＦＧＦ２１変異体１４０９に追加導入されたジスルフィド結合は既に完全に分子内ジスルフィド結合を形成し、誤って分子間ジスルフィド結合を形成してＦＧＦ２１二量体の形成を引き起こすことはない。ＦＧＦ２１変異体１４１０は二量体を大量に形成し、該分子が追加的に導入したジスルフィド結合は正確な分子内ジスルフィド結合を形成することができず、大量の分子間ジスルフィド結合を誤って形成することを示す。１４０９と１４１０の分子設計を比較し、１４０９はＰ１７１位の後に一つのグリシン（Ｉｎｓ－Ｇ１７２）を挿入し、Ｇ１７２の挿入によりＣ１７０－Ｃ１７３の間により多くの空間が分子内ジスルフィド結合を形成することができる。挿入するグリシンＧ１７２をＡ１７２（ＦＧＦ２１変異体１４１２）又はＳ１７２（ＦＧＦ２１変異体１４１３）に置換すれば類似の技術的効果を奏するが、少量の誤った二量体を形成してしまう。ＦＧＦ２１変異体１４１１は、Ｐ１７１の後の変異を１７３位（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：７）に移行したものであり、この変異体は微量の誤った二量体しか発生しない。

【0047】

実施例３ 体外でＦＡＰ酵素切断試験を行う
ＦＡＰは、体内に存在するプロテアーゼであり、ＦＧＦ２１の第１７１－１７２の間のアミノ酸を特異的に切断することができ、体内に注射された又は体内に存在するＦＧＦ２１のＣ末端を不完全にさせ、さらに体内β－ｋｌｏｔｈｏ受容体と結合せず、活性及び組織特異性を失わせる。本実施例はこの特性を利用し、体外ＦＡＰ（「北京百普賽斯生物科技股▲ふん▼有限公司」から購入し、カタログ番号ＦＡＰ－Ｈ５２４４）の酵素切断実験を行い、酵素切断されないＦＧＦ２１変異体を選別する。実験は文献（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｍｅｔ．２０１６．０７．００３）に従って行い、結果を表２に示すように、ネガティブコントロールＦＧＦ２１変異体１４１４が完全にＦＡＰで酵素切断された場合、ＦＧＦ２１変異体Ｐ１７１Ｇ（１４０７）はこの実験条件でも約半分が酵素切断されたが、この発明で設計した変異体１４０８－１４１３（１４１０未検出）は微量しか酵素切断されていないか、酵素切断されていない。

【0048】

【表2】

【0049】

実施例４ ＦＧＦ２１及び変異体と、β－Ｋｌｏｔｈｏ受容体との結合試験
ヒト由来のβ－Ｋｌｏｔｈｏ受容体細胞外末端タンパク質（Ｃ末端にＰｏｌｙ－Ｈｉｓ ｔａｇが融合される）は本社で発現及び精製され、配列はＵｎｉｐｒｏｔデータベースから由来する。アフィニティー測定はＢｉａｃｏｒｅ－８Ｋを用いて行い、具体的にはヒト由来β－Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をＮＴＡチップに固定し、固定量は１０００ＲＵであり、流動緩衝液としてＰＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有）を用いた。実験時に異なる濃度のＦＧＦ２１変異体を流すことにより、そのβ－Ｋｌｏｔｈｏへの結合状態を検出する。最終データは動力学を用いてフィッティングを行って解離定数ＫＤを算出する。具体的なアフィニティーの結果を表３に示す。１４０７－１４１３変異体（１４１０未試験）はいずれもＦＧＦ２１コントロール変異体１４１４と類似のβ－Ｋｌｏｔｈｏに対するアフィニティーを示すことが認められた。これは、各変異体のアフィニティー活性が阻害されておらず、各変異体の活性が互いに類似していることを示している。

【0050】

【表3】

【0051】

実施例５ ＦＧＦ２１及び変異体の、β－Ｋｌｏｔｈｏ－ＥＲＫ細胞活性実験
該発明におけるＦＧＦ２１及び変異体の活性をさらに検証するために、β－Ｋｌｏｔｈｏを過剰発現したＨＥＫ２９３細胞（細胞は「康龍化成（北京）新藥技術股▲ふん▼有限公司」で構築される）を用いてＦＧＦ２１及び変異のＥＲＫ信号通路に対する活性化作用をテストする。具体的な実験ステップは、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１＊ＰＳ細胞培地を用いて、β－Ｋｌｏｔｈｏを過剰発現したＨＥＫ２９３細胞を培養し、且つ細胞が指数期まで培養するときに、２０μＬ細胞懸濁液を取って白色３８４測定プレートに添加し、適切な培地及び適切な細胞密度（５０００／孔）に添加し、3７℃、５％のＣＯ_２で培養する。ＦＧＦ２１及び変異体は培地中で３ｕＭ／６ｕＭ／１５ｕＭから開始し、３倍勾配で希釈し、細胞実験プレートに１０ｕｌ化合物／孔を加える。被検タンパク質を加えた細胞を３７℃、５％のＣＯ_２の培養器に０．５時間放置する。細胞上清を除去した後、細胞溶解緩衝液１６μＬを加え、室温で３０～６０分間振とうする。４μＬの検出緩衝液中で調製したプレミックス抗体溶液を加え、実験プレートを封板で封止し、室温で一晩培養した後、６６５ｎｍと６２０ｎｍの蛍光発光を読み取り、そのＥＣ５０値を比較することにより変異体の活性を測定する。結果表４に示すように、１４０７－１４１３変異体（１４１０未試験）は、ＦＧＦ２１コントロール変異体１４１４に対して非常に類似した生物学的活性を有する。

【0052】

【表4】

【0053】

以上、本発明のより良い具体的な実施例について詳細に説明した。当業者は、創造的な労力を要することなく、本発明の構想に基づいて多くの修正及び変更を行うことができることが理解されるべきである。したがって、本技術分野において技術者が本発明の着想に基づいて先行技術に基づいて論理的な分析、推論又は限定的な実験によって得ることができる技術的解決手段は、すべて特許請求の範囲で定められた保護の範囲内にあるものとする。

【図1】

【図2】

【配列表】

2024531980000001.xml

【国際調査報告】