特表 2024-532005 ラグランジュ点Ｌ１上の衛星アレイによる電波光学による流行モニタリングのための量子戦略酵母成分法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-04

(54)【発明の名称】ラグランジュ点Ｌ１上の衛星アレイによる電波光学による流行モニタリングのための量子戦略酵母成分法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/19 20060101AFI20240828BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20240828BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240828BHJP

【ＦＩ】

C12N1/19 ZNA

C12Q1/02

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580433

(86)(22)【出願日】2022-06-29

(85)【翻訳文提出日】2024-02-22

(86)【国際出願番号】 EP2022067960

(87)【国際公開番号】W WO2023275176

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】21183136.7

(32)【優先日】2021-07-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523462871

【氏名又は名称】キャンベル・ファリダ・ハンナ

(74)【代理人】

【識別番号】110002424

【氏名又は名称】ケー・ティー・アンド・エス弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】キャンベル・ファリダ・ハンナ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ07

4B063QQ13

4B063QS40

4B063QX10

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA60

(57)【要約】

本発明は、ＥｃｆＧ結合モチーフを含むＰｅｒ－ＡＲＮＴ－Ｓｉｍ（ＰＡＳ）遺伝子配列を備えたKomagataella phaffiiを提供する。このＰＡＳ遺伝子配列は、少なくとも１つのＰＡＳドメインをコード化する、および／または、ＰＡＳ遺伝子はKomagataella phaffiiに対して組替えまたは外因性である。 Komagataella phaffiiは好ましくは一般ストレス応答（ＧＳＲ）に利用され得、および／または、Komagataella phaffiiは好ましくはＧＳＲ誘導シグナル伝達経路を有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＥｃｆＧ結合モチーフをコード化する少なくとも１つの配列を含むＰｅｒ－ＡＲＮＴ－Ｓｉｍ（ＰＡＳ）遺伝子配列を備え、前記ＥｃｆＧ結合モチーフをコード化する前記配列は、配列ＩＤ番号１～５０（SEQ ID NO:1-50）のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する、Komagataella phaffii。

【請求項2】

前記ＰＡＳ遺伝子配列は少なくとも１つのＰＡＳドメインをコード化する、および／または、前記ＰＡＳ遺伝子はKomagataella phaffiiに対して組替えまたは外因性である、請求項１に記載のKomagataella phaffii。

【請求項3】

前記Komagataella phaffiiは一般ストレス応答（ＧＳＲ）に利用され得、および／または、前記Komagataella phaffiiはＧＳＲ誘導シグナル伝達経路を有する、請求項１または２に記載のKomagataella phaffii。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、人畜共通感染性病原体の流行を検出する方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

本特許発明に関連する重要な概念の定義は、次の通りである。

【0003】

＜Komagataella phaffii＞
Bernauer et al (2020) は、複数のバイオテクノロジーおよび製薬産業用途におけるKomagataella phaffii（Pichia pastoris 属に属すると誤って考えられている）酵母について、その古代の祖先と今日の後生動物の細胞の両方から真核生物の分子細胞生物学において意味のある特徴を共有していると説明している（Bernauer et al. 2020）。メチロトローフ酵母である K. phaffii は、メタノール同化、ペルオキシソーム生合成、ペキソファジーに関する研究に使用されている（Bernauer et al. 2020）。酵母の遺伝学の研究は、交配と胞子形成の行動と、タンパク質分泌、脂質生合成、細胞壁生合成などの細胞プロセスとを含む（Bernauer et al. 2020）。バイオテクノロジーで使用されるすべての株は、ここではすべてのKomagataella種の同義語として確立された名前Pichia pastorisを使用し、特定の研究実験で異なる株の異なる種を参照している。

【0004】

Komagataella pastoris（フランス株を含む）とK. phaffii（アメリカ分離株を含む）は、約１０％のＤＮＡ配列の相違と２つの相互転座で異なり（Dalvie et al. 2020）、それでも、両方の株がP. pastorisという名称のもとで組換えタンパク質生産に使用されている。K. phaffiiは、Phillips Petroleum Company（米国オクラホマ州バートルズビル）などを含め、メタノールからのバイオマスおよび単細胞タンパク質の生産において商業的に利用されている。正確な株の同定は、CBS2612（NRRL Y-7556）またはCBS7435を含む（Bernauer et al. 2020）。

【0005】

＜センサ＞
センサは、特に環境内での非生物的および生物的事象の新規または増加の開始時に、周囲環境内の熱力学的平衡に向かう推進力の証拠を記述する。機械センサは、温度、ｐＨ、湿度などの環境変動の物理的または化学的属性を標的とでき、バイオセンサーは、健康および／または病気の尺度として、成長速度、代謝、土壌栄養素の利用可能性、生物間の相互作用の速度、および、環境内での変動に対する耐性の発現を標的とできる。したがって、相互作用および／または成長は熱力学的特性であり、古典ではギブス・エネルギー、量子ではハミルトニアンと称される。生態学的センサは、生態学的炭素循環、および、メチル還元メタン生成とギ酸、電子、酢酸の三者による取り込みによって駆動されるＨ_２酸化プロセスなど、種間のＨ_２の共生相互作用を含むメタン生成環境を直接的または間接的に記述する（Nobu et al. 2020）。干ばつなどの環境ストレスに対する生物の耐性は、種の進化における適応性（adaptability）（適応性fitnessとも呼ばれる）につながる。細菌は、環境ストレス条件に応答するために、ＲＮＡポリメラーゼのコア酵素に結合する代替シグマ因子を使用する。シグマ因子ＥｃｆＧは、細菌の転写制御を変更し、生産能力に影響を与える標的の１つである。環境ストレスに対する生物の耐性、タンパク質に対する感受性、および一般ストレス応答（ＧＳＲ）の特性を測定するには、必須である。

【0006】

＜一般ストレス応答（ＧＳＲ）＞
ＧＳＲは、細菌のシグマ因子媒介転写制御を介したさまざまな環境シグナルの包括的な指標であり、特にストレス依存性代替シグマ因子を含む。このシグマ因子は、健全な腸内微生物叢関連細菌が宿主に影響を与える環境ストレス、例えば、食物ストレス、制限ストレス、渇水ストレスなど、により病原性となるとき、ＲＮＡポリメラーゼへの結合においてハウスキーピングシグマ因子と競合して、転写をストレス応答遺伝子に向かわせる。調節因子は、細胞生理機能に対するストレス関連の影響の結果に反応することも、周囲環境の変化そのものへの直接的な感度により反応することもできる。これらのそれぞれの応答を提供する次の２つのファミリーがある。１．センサ・ヒスチジン・キナーゼおよび同族応答調節因子を含む２成分系、および、２．プロモータ認識を媒介するＲＮＡポリメラーゼホロ酵素のサブユニットである代替シグマ因子（σｓ）。代替の非ハウスキーピングσｓは、ストレス応答性シグナル伝達経路で広く使用されている。すべてのプロテオバクテリア種がこれらの各ファミリーの複数のメンバーを含むため、K.phaffiiの設計を計画する最初のステップの１つは、細菌内で周囲環境シグナルを新規の転写後タンパク質に変換するＧＳＲ関連転写応答を測定できるかどうか、または、どのように測定できるか、そして、それらのタンパク質の程度に基づいて高低としてそのストレスの重大性を測定できるかどうか、または、どのように測定できるかを検討することである。ストレスの有害な影響を感知して軽減する能力は、遺伝的に迅速かつ正確であるため、１つの方法は、K.phaffiiがストレス生存を求める細菌生物の行動応答経路を複製するように遺伝子を挿入することを含む。他の２成分システムは、光、酸化還元電位および代謝産物の変化からそれ以外のものまで含む範囲の信号に対するフィード・フォワード・センサを提供するＰｅｒ－ＡＲＮＴ－Ｓｉｍ（ＰＡＳ）ドメインを含む。したがって、ＧＳＲの最初のステップは、転写に関連した運動性とバイオフィルム形成の遺伝的調節を含み、ストレスの強い変化中の環境における資源の最適化、その割り当て、および細胞の快復力に関わるキナーゼのレンダリングにより（Gottschlich et al. 2019）、細菌のヒスチジンキナーゼに応答するＰＡＳ関連遺伝子の使用が簡潔およびより好ましくなる。また、これにより、膜貫通自己リン酸化経路のために常に要求される環境ストレス検知の早期警告としての即時の応答を報告することとなる。このことは、追加の応答調節因子タンパク質がその生物の代謝、位置などを変更するさらなる転写因子として機能することを含む（Chauhan and Calderone 2008）。このプロセスの時間枠は文字通り１時間以内であり、組換えK.phaffii種の使用は、手頃な価格で簡単に増殖できる分散型生息地監視センサとして非常に有益である。Clusters of Orthologous Groups （ＣＯＧ）カテゴリ６１を伴う低ストレス条件下でのＥｃｆＧ調節遺伝子の分類は、Integrated Microbiome Genomes with Microbiome Samples システムから抽出された（IMG/M: https://img.jqi.doe.gov/m/）。

【0007】

＜病原性ウイルス＞
パンデミックの感染結果の一部であるウイルスは、毒性必須遺伝子産物に依存しており、一般的な増殖を記述するものではない（Cauhan and Calderone 2008）。現在、環境からの毒性を記述する遺伝子産物用のセンサはない。環境関連ストレス事象は、通常、ＲＮＡウイルス感染およびストレス応答宿主（細菌）の再感染を引き起こす。組換えは、すべての多様な種に対する栄養素のアクセス可能性のレベル内で優勢な宿主を減らすことに成功するために、急速かつ大規模に発生する。ウイルスの活動は、ミクロスケールからマクロスケールで相互に依存する、相互に関連するすべての生態学的種の持続可能性を表す。ＲＮＡ組換えおよび再集合は、単一のゲノム・セグメント内（ＲＮＡ組換え）またはセグメント化されたゲノムを介するかにかかわらず、ウイルス間（再集合）の全体のゲノム・セグメントの交換の一環として、混合起源の親ゲノムからのキメラ分子の形成を介して宿主障壁および耐性を確実にバイパスする。ウイルスは、深刻なまたは重大な環境ストレスが普遍的持続可能性を脅かす場合、個々の種が互いに生存できるようにするために、より大きな食物連鎖の中で、組換えおよび再集合により、変化の広範囲への伝搬を実行しているのではないかと考えられる。

【0008】

＜遺伝子組換え＞
酵母の遺伝子組換えの最先端の方法は、二本鎖断裂修復機構、Cre-loxP部位により媒介された組換え、Delitto perfetto、メガヌクレアーゼにより媒介された二重鎖断裂、または、CRISPR/Cas9 システムを含む。遺伝子工学の方法および技術は、新たに統合された配列の有効化および維持のために、薬物選択可能で栄養要求性の栄養マーカーの使用を要し得る（Fraczek et al. 2018）。

【0009】

＜クォータニオン＞
クォータニオン（Ｈ）は、複素数の振幅を含む３次元ベクトルの乗算に対する４次元の解である。２つ（またはそれ以上）の振幅の乗算は、ベクトルの回転となり、その過程でそれらの角度を足すことになる。したがって、ａ＋ｂｉ＋ｃｊ＋ｄｋによりクォータニオンが与えられると、以下となる。

【0010】

【数1】

【0011】

これらの関係の逆は、以下となる。

【0012】

【数2】

【0013】

これらの関係は、クォータニオンの非可換特性を示し、この特性は、それらを場（Field）により表されることから取り除き、それゆえ、複素数から分離する。

【0014】

しかし、クォータニオンを乗算することにより、ベクトルのドット積およびクロス積として、各ベクトルを扱うことにより３次元空間で作業を続けることができる。これは、ギブス・ヘビサイド方程式で記述される。

【0015】

【数3】

【0016】

いかなる量子ゲートも現実のゲートのみで表現され得る。

【0017】

量子計算では、ゲートは、ｎ個のレジスタのキュービット配列における各キュービット（スピノール）の振幅および位相を変更する行列である。これはパウリ行列と称される。全体的な商用量子回路開発およびシミュレーションのリソースは、IBM Qiskit、D-Wave、および、政府系機関などで利用可能である。

【0018】

＜クォータニオン回路＞
Fernandez and Schneeberger (2008) (Fernandez and Schneeberger 2003)および Bolokhov (2019) (Bolokhov 2019) などは、量子回路および波動関数に対するクォータニオン回路およびクォータニオン波動関数の導出および相関をそれぞれ説明している。クォータビットは、クォータニオン振幅を伴う２レベルシステムである。これは、２次元クォータニオン・ヒルベルト空間における単位ベクトル｜Φ＞により表される。

【0019】

【数4】

【0020】

ここで、以下が任意のクォータニオン位相ファクタまでとなるようにされる（Fernandez and Schneeberger 2003）。

【0021】

【数5】

【0022】

これは、以下を意味する。

【0023】

【数6】

【0024】

クォータニオンは、量子キュービットのクォータビットｎ＋１の変数を表す。クォータニオン回路は、ｎ個のクォータビットを利用するクォータニオン計算のためのゲートの配列である。クォータニオン回転は、回転運動ベースの相互作用モデル変数のための自然な利用から、標準キュービット計算ゲート行列の代わりに、理想的である。これは、動的に移動するモバイルデバイス、および、関連するゲーミングソフトウェアアルゴリズムを含む（Lanzinger 2020）。クォータニオンは、また、より高次の８次元数体系、オクトニアンに相関し得る（Conway and Smith 2003）。それをする施設は、地球と月の間のラグランジュ点Ｌ１でのシステムにおける衛星の配列から送信された電波を利用して実現可能である。これらの電波は、対応する電磁的周波数変調により物理的なキュービットゲートを置き換え、同様の情報伝送の干渉および変更を引き起こす。

【0025】

複素数 （ルネ・デカルト）は、人間およびその他の地上の種が人畜共通疾患の伝搬および感染に対して社会的に脆弱であるとして説明されるところでの人間のチューインガムおよびその他の媒介物のような地上量子戦略センサ酵母から収集された画像の処理を提供する電波量子ゲートの物理的形態において代数幾何学の基礎である（Wildberger 2005）。多項式Ｐ（ｘ，ｙ）＝０において、座標は曲線を満足する点のセットを表す。線形は、１次の多項式に対応する。２次多項式は、楕円および双曲線のような２次の円錐曲線に対応する。３次曲線（３次方程式）がさらにある。３次曲線は、線形ファクタの積を取ることにより生成される。Ｐ（ｘ，ｙ）＝（ａ_１，ｘ＋ｂ_１，ｙ＋ｃ_１）×（ａ_２ｘ＋ｂ_２ｙ＋Ｃ_２）×・・・×（ａ_ｎｘ＋ｂ_ｎｙ＋ｃ_ｎ）。これは、方程式のそれぞれが線を決定し、そして互いに乗算されたとき、それらがそれらの線の交点のグラフを生成することを意味する。すなわち、多項式曲線は、線の積である。さらに一般的に、この種の多項式が最初に形成され、そして、係数が変化して代数的曲線を導く（Stillwell 2012）。例えば、ｎ＝３の場合、多項式は３次であり、３つの線形ファクタの積である。それらは、無限への方向への追加の双曲線状の分岐を伴う連続曲線を生成するための係数を変更する。アフィン平面よりもむしろ射影平面内にある曲線の例では、Mobious （同次座標）によるこれらの曲線の評価は、３次元空間の利用、および、例えばｚ＝１の点を通る平面の観察を含む。しかし、多項式曲線を記述する実数としてのｘ，ｙの代わりに、複素数は、電波と量子ゲートの特性において、射影幾何および同次座標を満足する（Moebius and Pluecker, 1830s）。クォータ回路は、量子戦略情報に応じて、画像ごとに自動的に電波により設計される。画像は、ＧＳＲデータは、何百万もの地球上の量子戦略酵母により送信され感知される。各可能なゲート順序へのクォータ回路の動作は、ｎ＋１個のキュービットでシミュレートされ得る。電波は、地球と月の間のラグランジュ点Ｌ１での衛星から出射され受信される。これは、量子計算に理想的な温度であり、電波ベースのクォータニオンゲートの回路が自然の多次元物理で進化された量子電子ストレージを利用し得る。これは、そのような計算がこのシステムへの将来の適応において非電波周辺機器を含む場所を含む、地球上では不可能なことである。この情報を使用すると、変数を簡単に操作するだけで、容易に解釈できる結果が得られる。特に、相互に直角位相にある変数の場合はそうである。

【0026】

量子計算（ＱＣ）は、状態の重ね合わせおよび／または（キュービット）ビットもつれに基づいて、高速量子情報問題解決のために量子状態に関連するビットを表す。

【0027】

したがって、キュービットベースの計算は、量子ゲートを介した情報処理を表し、多項式時間（ＢＱＰ）における有界誤差量子多項式時間クラスを解く（Yamamoto et al. 2015）。

【0028】

結果は、各キュービットを介したデータの回転の複素空間における粒子の位相と配向を投影する量子回路シミュレーションを通じて、熱力学共役変数の複素系のハミルトニアンによって記述され得る。

【発明の概要】

【0029】

本開示は、遺伝子組換えKomagataella phaffii酵母および地球と月のラグランジュ点Ｌ１の位置における電波写真撮像衛星アレイを使用する方法を提供する。量子戦略酵母成分とそのような長波光学法の目的は、人畜共通感染症病原体の流行の脅威が、現在、そして潜在的に他の観察方法では気づかれずに突然現れる可能性がある生息地全域の微生物叢における初期のストレス応答を検出することである。環境気候ストレス条件に応答して、ＤＮＡウイルスまたはエピデミックおよびパンデミックに関連するＲＮＡウイルスの人畜共通感染症ウイルス・ベクトルが潜在的に関与し、その後、同じ生息地の人間集団を脅かし得る。

【0030】

本開示は、特に、少なくとも１つのＥｃｆＧ結合モチーフを含む少なくとも１つ（または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０）（外因性／組換え）のヌクレオチド配列を含むKomagataella phaffiiを提供する。ヌクレオチド配列は、好ましくは、組換え遺伝子、および／または、Komagataella phaffiiの外因性のものである。したがって、このヌクレオチド配列は、好ましくは、Komagataella phaffiiには天然には存在しない。追加的または代替的に、ヌクレオチド配列は、Ｐｅｒ－ＡＲＮＴ－Ｓｉｍ（ＰＡＳ）遺伝子であり、すなわち、少なくとも１つのＰＡＳドメインをコードする。

【0031】

好ましくは、Komagataella phaffiiは、一般ストレス応答を利用することができ、および／または、Komagataella phaffiiは、ＧＳＲ誘導シグナル伝達経路を有する。

【0032】

好ましい実施形態では、ＥｃｆＧ結合モチーフは、表１に示された配列ＩＤ番号（SEQ ID NO）１～５０のいずれか、好ましくは、配列ＩＤ番号（SEQ ID NO）１と、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の配列同一性を伴う配列を有する（である）。

【0033】

好ましくは、本発明の文脈におけるＥｃｆＧ結合モチーフは、１５～３５のヌクレオチドの長さを伴うヌクレオチド配列を有し、好ましくは、２０～３０のヌクレオチドであり、さらに好ましくは、２３～２８のヌクレオチドである。

【0034】

【表1】

【0035】

【0036】

実施形態では、ここに開示されたK. phaffiiは、例えば、本発明の文脈における推定上のＥｃｆＧの転写（ｍＲＮＡレベル）を測定することにより、一般ストレス応答の度合いに関してストレスの重大さ（例えば、高低ベースまたは無のような）を測定する。追加的または代替的に、転写されたタンパク質の量は、ＵＶ吸収などにより測定され得る。

【0037】

酵母の遺伝子組換えの最新の方法がそのようなK. phaffiiを得ることに利用可能であり、それは、二重鎖断裂修復機構、Cre-loxP部位により媒介された組換え、Delitto perfetto、メガヌクレアーゼにより媒介された二重鎖断裂、または、CRISPR/Cas9 システムを含む。

【0038】

実施形態では、ここに記述されるＰＡＳドメイン配列は、ＰＡＳ遺伝子配列、好ましくは、ＥｃｆＧ結合モチーフをコード化する少なくとも１つの配列を備える核酸輸送構築物を利用してK. phaffiiに導入される。本発明の文脈における核酸輸送構築物は、好ましくは、プラスミド、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、および、ワクシニアウイルスの１または複数から選択され、好ましくは、レンチウイルスである。

【0039】

少なくとも１つのＥｃｆＧ結合モチーフを備えた組換えＰｅｒ－ＡＲＮＴ－Ｓｉｍ（ＰＡＳ）遺伝子配列を備えたKomagataella phaffiiは、メタン生成環境において細菌のストレス状態を検知できることが判明している。これらの知見は、イン・ビトロ実験室設定で確立され得るが、本発明の含意は、実験室環境で容易に実証できるものを超えている。例えば、本発明は、病原体の進化に標的特異的であり、核酸、タンパク質、ウイルス粒子の変化を含む病原体の生態および生存能力を与えるために必要な生息地での使用と適合する高度な検出技術と組み合わせて使用される場合に特に効果的である（それは実験室環境では再現できない）。このような条件は、実験室環境で決定することは、さらに困難であるか、不可能である。例えば、ここでは本発明の文脈において使用することができ、ストレス変数の発生時のＰＡＳ遺伝子発現に伴うＲＮＡ転写制御に関連するタンパク質の波長を検出できる長波光学的方法が提示される。長波最適法の適用可能性は、実験室環境での検証に適した検出法を超えているとも考えられる。本発明は、また、ある生息地における病原体の自然な遺伝子形質転換に必要なエフェクタ遺伝子の誘導または遮断を示すために使用することもできる。このような遺伝子は、非自然条件下では形質転換不可能なままであると思われるため、実験室条件下で研究するのは困難である。

【0040】

ここで教示される検出方法の波長範囲は、選択された各遺伝子のヌクレオチドコドン（またはアンチコドン）の期間に起こるＵＶＣ光子散逸によって表されるＵＶＣ波長に対応し得る。

【0041】

また、ストレス変数発生時のＰＡＳ遺伝子発現に伴うＲＮＡ転写制御に関連するタンパク質の波長を検出する検出手段も提供される。波長の範囲は、選択された各遺伝子のヌクレオチドコドン（またはアンチコドン）の期間に起こるＵＶＣ光子散逸によって表されるＵＶＣ波長に対応し得る。

【0042】

ある実施形態では、ＥｃｆＧ結合モチーフにより、ストレスのレベルおよび／または一般ストレス応答を決定することができる。

【0043】

ある実施形態では、ＥｃｆＧ結合モチーフをコードする配列の転写により、ストレスのレベルおよび／または一般ストレス応答を決定することができる。

【0044】

好ましい実施形態は、地表上の（拡張された）領域および／または複数の場所にわたって酵母を分布および／または増殖させることである。

【0045】

ここで使用される「配列同一性」または「配列類似率」という用語は、アミノ酸または核酸配列が別の参照アミノ酸または核酸配列と配列同一性または配列類似性を有する状況を指す。「配列同一性」または「配列類似性」は、グローバルまたはローカル・アラインメント・アルゴリズムを使用した２つのポリペプチドまたは２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定できる。次いで、配列が（例えば、デフォルトパラメータを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適にアラインメントされた場合）少なくとも特定の最小割合の配列同一性を共有する場合、配列は「実質的に同一」または「本質的に類似」と呼ばれる場合がある（以下に定義される）。ＧＡＰは、Needleman and Wunsch のグローバル・アラインメント・アルゴリズムを使用して２つの配列を全長にわたって位置合わせし、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小限に抑える。一般に、ギャップ作成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）およびギャップ拡張ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）のＧＡＰデフォルト パラメータが使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトのスコアリング行列はnwsgapdnaで、タンパク質の場合、デフォルトのスコアリング行列は Blosum62 である（Henikoff & Henikoff、1992、PNAS 89、915-919）。配列アラインメントおよび配列同一性割合のスコアは、Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USAから入手可能なGCG Wisconsin Package、バージョン10.3、または、EmbossWin、バージョン2.10.0などのコンピュータプログラムを使用して決定され得る（プログラム「needle」を使用）。あるいは、FASTA、BLASTなどのアルゴリズムを使用してデータベースを検索することによって、類似性または同一性のパーセントを決定することもできる。好ましくは、配列同一性は、配列の全長にわたる配列同一性を指す。

【0046】

本特許では、遺伝子組換えの目的は、K. phaffiiを、後続の受信画像解析装置、つまり地球と月の軌道のラグランジュ点Ｌ１における衛星間の電波駆動クォータ回路へのＧＳＲ活性化ストレス信号の中間センサ送信器として使用できるようにすることである。上述のように、ＧＳＲの早期検出は、K. phaffiiに挿入されたＰＡＳ遺伝子を使用してのＧＳＲ活性化の１時間以内での細菌ストレスシグナル活性化とのK. phaffiiの直接の同期により実行可能である。これらの遺伝子組換え生物は、ＧＳＲ機能に関与するＥｃｆＧ依存遺伝子であるＲｈｙＲ、ＮｅｐＲおよびＰｈｙＴ（Kaczmarczyk et al. 2011）（Gottschlich et al. 2018）、および、低ストレス条件下およびシグマ因子競合を介した重要なオーファンシグナル検出ハイブリッドヒスチジンキナーゼ（#1746）を含む追加の制御因子からの活性に加わる（Gottschlich 3t al. 2019）。これには、「ＦｅｃＲスーパーファミリー」（ＮＣＢＩ保存ドメイン検索）内の膜結合Ｆｅ^２＋－２クエン酸センサ（#1210）として注釈が付けられているタンパク質をコードする強力な機会が含まれていることは注目に値する（Gottschlich et al. 2019）。ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子（シグマ-70ファミリー）（#1209）と、ferrienterochelinおよびコリシン（colicin）の外膜受容体として注釈が付けられたタンパク質（#1208）である（Gottschlich et al. 2019）。これらの遺伝子は、鉄恒常性の直接制御に役割を果たし、野生でのＧＳＲ活性化中の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成に対抗するようである（発表された研究による）。これは、組換えK. Phaffii成分は、リモートイメージングではなく、共有微生物叢環境における他の種との競合の評価や、微生物叢ごとの種間コミュニケーションの認識など、追加情報を明らかにするなど、他の目的の媒体として使用される。これは、例えば、一般に種の自己防衛（Sharifi and Ryu 2021）で遭遇するシグナル伝達カスケードの活性化や遺伝子発現などの追加情報を明らかにする。

【0047】

本特許では、物理モデルではなく電波を使用する点を除き、従来の物理システムの最先端のキュービットベースの回路アルゴリズムを使用したクォータニオン回路の方法が構想されている。さらに、地球と月のラグランジュ点Ｌ１に位置するアレイ内の電波送信衛星により伝送される電波ゲートにより計算されるべき量子画像分析が構想されている。この位置は、理想的かつ不可欠な深い温度、および、ＩＢＭ、Ｇｏｏｇｌｅなどのような小さなキュービット範囲のために商業的に提供されている高コストリソースである地上量子シミュレーションコンピュータ等価物に見られる障害エラー管理からの自由度を提供する。ラグランジュ点は、２つの物体の間に作用する全ての重力が互いに打ち消し合い、宇宙船を「ホバリング」させるのに利用され得る場所である。Ｌ１は、ＧＳＲ応答の大規模な次元の分析のために多次元の量子情報ストレージを活用する機会を含む、画像の無制限の量子画像処理を提供する機会を与える。

【0048】

電波では、波長が１ｍ（テレビまたはラジオ波）から１０^５ｍ（長波ラジオ）まであり、周波数レートはそれぞれ１０^８．５Ｈｚから１０^３キロサイクル以上であり、情報は、電波衛星による画像として、数百万から数兆の生態生息地全体のＰＡＳ組換えK. phaffiiシグナル伝達に変換される。一般に、電磁搬送波は、振幅変調（ＡＭ）、周波数変調（ＦＭ）、または、デジタル形式（パルス変調）として動作する。周波数帯域幅は、１０，０００Ｈｚを超える情報密度に比例する。

【0049】

本特許では、電波送受信衛星アレイは、それゆえ、キュービットの重ね合わせおよびもつれを管理する量子ゲートからなる回路を量子光学と同じくらい効率的かつ正確にシミュレートできるアルゴリズムをホストするのに適している。実際、電波幅制御絞りを提供しする現行の最先端の衛星間の関係性が、モニタリングが要求される生息地の環境の特定の特徴にそれぞれ応じて多数のＰＡＳ組換えK. phaffiiストレス型センサのためのようなストレス応答画像の異なる多次元層の研究を促進する。このように、生息地内の条件に基づく猛毒の病原体の発生源および到来を調査するための基礎が、ＧＳＲ応答が始まるまさにその時間における粒度の細かな詳細で観測され得る。それに比べて、分析の種類は、実験室環境でグローバルかつ継続的に生成するには厳しく制限されているか不可能である。

【0050】

＜ラグランジュ点Ｌ１＞
本特許は、各キュービットにかかる重力がゼロで温度がクォータ回路に理想的な２．７ケルビンである位置での電波駆動量子ゲートを含む量子ゲートアセンブリの創造を構想している。月とラグランジュ点Ｌ１の間の距離は、６１３５０ｋｍにほぼ等しく、地球とラグランジュ点Ｌ１の間の距離は３２３０５０ｋｍに等しい。低エネルギー電波伝送研究が存在するためのさらなるラグランジュ点がある。

【0051】

＜クォータニオンゲートへの月電波＞
従来の量子コンピュータでは、ナノサイズの量子ドットなどの半導体構造が、対応する量子回路にｎ個のキュービットゲートを提供するために、標準的なコンピュータチップと同等のトランジスタのようなものにスケールされ得る（Hendrickx et al. 2021）。

【0052】

量子回路の原理は同じである。つまり、回路の最終結果は、状態ベクトルが常に実数振幅を有することを保証し、しかし、その最終結果が実数振幅ベクトルである限り、ゲートを表すユニタリ変換（複素ヒルベルト空間での）が許容される。これは、遺伝子組換えK. phaffii信号入力により駆動された電波回路アルゴリズム出力を検証および最適化するために成されなければならない古典信号評価の完全性を保証する。

【0053】

月のクォータ回路構築電波は、特定の電波波長範囲（絞り）を合成できる多数の衛星からなる最先端の宇宙ベースのアンテナアレイの配備を要する。

【0054】

ＰＡＳは、光、塩、酸化応答、酸などを含む注目している特定の環境応答パラメータに関連するゲノム挿入であり得る。一般に、衛星アレイは、光学フォトンを運ぶ電波を送受信する。電波反射鏡は、電波を特定のアンテナに集束させて、各ＰＡＳ組換えK. phaffii生命体（通常は絞りのサイズで割られたフォトンの波長により制限される）からの画像から取得される詳細の量が、数百ナノメータサイズで光よりも数千倍長い波長を伴う光学フォトンにより検知可能である。加えて、本特許は、衛星アレイにより「見られる」画像または地図が、１キュービットの等価物としての各ＰＡＳ組換えK. phaffii成分の量子回路シミュレーションを利用することにより、ストレスの勾配に応じた画像のデスクランブリングを容易にすることを説明する。衛星軸の方位は、量子回路が生息地およびクォータビット、ＰＡＳ組換えK. phaffii種のクォータ画像に基づく、アルゴリズム内のクォータ回路シミュレーションとして記述されることを意味する。クォータ回路としての量子回路の電波シミュレーションの出力は、風景や海洋の従来のマッピング画像での２次元拡大の単純なマッピングよりも、生息地ごとの宿主内の微生物叢の「クローズアップ」をサポートする。

【0055】

現在、本特許の起草時点では、１０ｍを超える超長波長（ＵＬＷ）領域での天体観測のための宇宙ベースの絞りアレイは、３０ＭＨｚ以下の電波にあり、１ＭＨｚの制限帯域（１ｋＨｚチャネルを伴う）は５年間のミッションで百万の天体源の検出に対応する（Rajan et al. 2016）。

【0056】

このようなＰＡＳ組換えK. phaffiiの量子画像は、任意の画像処理量子回路を利用し得る。

【0057】

キュービットは、情報伝達物の要素である。

【0058】

キュービットの状態は、その２次元状態ベクトルにより定義され、すなわち、以下である。

【0059】

【数7】

【0060】

ここで、｜０＞および｜１＞は、２つの正準基底ベクトルであり、以下が成立する。

【0061】

【数8】

【0062】

＜詳細＞
本特許では、ＧＳＲ勾配は、メタノール炭素源からの成長がある生息地内で支持されうる場所であればどこでも、生態学的に関連する培地内の成分として使用されるK. phaffiiセンサにより測定される。

【0063】

図１は、処理の概略を示す。

【0064】

その生息地は、人間の安全性が、自然と人工の両方で、病気の拡大やその他の広範な脅威のリスクを宿すと疑われる場所を表し得る。ＰＡＳ組換えK. phaffiiのための基礎は、１または複数のＰＡＳ環境センサ準備を支持する任意のＥｃｆＧ遺伝子の組合わせで組換えられたK. phaffiiゲノムである。ここでは、環境ストレスは、酸化ストレス、酸ストレス、塩ストレス、光ストレス、干ばつストレスまたは任意の種類の全ての界（kingdom）の種にわたるストレス応答に関連する遺伝子関連ＰＡＳモジュールの組合わせを含み得る。これは、源から標的まで１または複数の生息地にわたる周囲病原体行動開始およびそれに引き続く経路の監視（拡大）の代りに標準的な遺伝子組換え方法によりゲノム内に挿入され得る。これらのＰＡＳ組換えK. phaffiiセンサの使用は、地球と月の軌道のラグランジュ点Ｌ１上に位置する衛星アレイの対応する電波衛星に画像を提供する。したがって、その電波は、周囲環境ストレスへのＰＡＳ組換えK. phaffiiセンサの反応に感度を有し、多様な細菌種の微生物叢内での低ストレス、中程度ストレスまたは高ストレスに基づく全体の生息地の画像を描くための光学フォトニックスケールを微調整するために、十分に長い波長でこれらのセンサのための生息地のスキャンでの電波に利用可能である。したがって、電波設計方法は、既に過去の特許に存在しており、それらは本発明者によるものではないが、光学スケールを開発するのに適用可能な現行の最新技術であると考えられる。しかしながら、ＧＳＲ中の共通遺伝信号のセットを含むセンサタンパク質の性質は、バイオフィルムの移動性および生成を表すものの代りとなる。それらは、病原性ウイルスの宿主となるプロテオバクテリアの本来備わっている拡散、そのようなウイルスに対する人間の感染拡大および人間の拡散発現の機構である。したがって、感染が既に移動性またはＧＳＲ応答のその他の種類の特徴に対する拡散行動を明らかにした後の、ウイルス評価の古典的システムよりも、ラグランジュ点Ｌ１での衛星アレイは、微生物叢種のストレス信号が対応する回路（クォータ回路）内のクォータニオンゲートに基づく画像内で分析され得るようなｎ個のレジスタのクォータビットとしてのＰＡＳ組換えK phaffiiから画像を受信するのに組み立てられている。この回路は、変換が非可換であり、各ゲートに２ビット加算のレジストレーションを要すること以外は、量子回路と異なることはない。このように、画像は、平均ＧＳＲ応答が続く同時間における瞬間的で完全な感度でのわずか３つのグレースケールを利用して多様な種にわたり細菌レベルでのストレスによる変化の拡大の向きについて分析され得る。そして、これは他のいかなる古典的な生息地監視システムでは認識することができない。これらのナノサイズの信号の収集は、それゆえ、時間単位の地理的タイムスタンプをもって表現される。

【0065】

＜実施形態＞
１．環境ストレスマッピングのためにK. phaffii酵母を組換える方法である。

【0066】

ａ．単一または共有の環境細菌ストレスＰＡＳ変数および対応する転写因子（ＰＡＳ）を選択する。

【0067】

ｂ．ＢａｃＴＦＤＢデータベースを使用して、対応するＥｃｆＧ遺伝子を選択する。

【0068】

ｃ．最適なゲノム組換え技術である二本鎖断裂修復機構、Cre-loxP部位により媒介された組換え、Delitto perfetto、メガヌクレアーゼにより媒介された二重鎖断裂、または、CRISPR/Cas9 システムを用いて、遺伝子をKomagataella phaffii生物に挿入する。

【0069】

ｄ．この新規開発のK. phaffii変異体の少なくとも５０％の分布を保証して、それが自立した生息地にわたる成長速度でのＰＡＳ組換えＥｃｆＧモジュールを発現するようにする。これは、それがメタノールまたは対応する炭素源を要し、同じ微生物叢環境の生きたエコセンサへのアクセスを要することを意味する。

【0070】

２．生息地の細菌レベルでストレス応答と関連病原体の拡大報告のためのクォータ回路生成アルゴリズムを構成する。

【0071】

ａ．以下の規則で、量子画像生成のための標準ｎレジスタキュービットベースの回路をｎ＋１レジスタキュービットベースの回路に置き換える。

【0072】

ｉ．回路を初期化する。

【0073】

ｉｉ．回路をシミュレートする。Fernandez and Schneeberger (2003) (Fernandez and Schneeberger 2003)からの例では、以下の通りである。

【0074】

１．ｓ個の基本ゲートからなる演算子Ｕ_ｃを伴う一般のｎ＋１個のキュービット量子回路について、ゲートを順序づけして回路を直列化する。例えば、Ｕ_ｃ＝Ｕ（ｓ）Ｕ^{（Ｓ－１）}・・・Ｕ^（２）Ｕ^（１）である。

【0075】

２．以下の各ゲートについて、ｇ番目のゲートに対応するｎ変数の演算子Ｕ^（ｇ）を、それをシミュレートする適切な現実回路Ｏ^（ｇ）に置き換える。

【0076】

【数9】

【0077】

３．ステップ１と同順に各レベルｇの回路を連結することにより、全体の現実回路Ｃ（ｇ）を構築する。すなわち、もしＯ_ｃがＣ^（ｇ）の演算子であれば、Ｏ_ｃ＝Ｏ^（ｇ）・・・Ｏ^（２）Ｏ^（１）とする。

【0078】

ａ．回路Ｃ^（ｇ）の初期化に使用される画像は、単純に｜Ψ_０＞および｜Ψ_１＞として定義されるべきである。

【0079】

４．現実回路Ｃ^（ｇ）およびその入力状態の説明を書き、現実の計算「oracle」を尋ねてその最終状態についての測定の結果を提供する。

【0080】

５．その測定の結果について古典的な後処理を実施して古典的な答えを提供する。

【0081】

ｂ．未知の可変生息地サイズにわたり回路の測定については次の通りである。

【0082】

ｉ．幅は常に１だけ増加するが、回路の深さは、最悪の場合での回路サイズに等しくなり得る。

【0083】

ｉｉ．与えられたオリジナル回路は、いくつかのユニバーサルゲートのセットで構築されており、専用衛星または地球からの画像を収集および準備する共有の衛星間において電磁的に変更された電波により形成される。もしそうなら、これらの衛星またはその衛星による回路シミュレーションは、K. phaffiiにより流れるクォータビットの数ｄに依存するであろう。これは、最大のゲート内で、ユニバーサルセット内で、回路内での量子画像の量子戦略またはクォータ戦略の酵母としてこの時点から知られる。特に、ｄ＞３の場合、ゲートは、それが簡単な２ｄ×２ｄのクォータニオン行列であるとき、一般性を失うことなく、量子計算に普遍的な基本３キュービットゲート、基本２キュービットゲートまたは基本１キュービットゲートのセットであるＱ_ｇに分解され得る。

【0084】

ｉｉｉ．以下の画像量子演算子も基本ゲートのセット内に含まれる。

【0085】

【数10】

【0086】

Ｕ_ｇは、ここでは２（ｄ＋１）×２（ｄ＋１）行列である。

【0087】

ｉｖ．ｎクォータビットクォータニオン回路の時間チェーンσは、（ｎ＋２）個の現実（古典的）ビット回路により厳密にシミュレートされ得る。

【0088】

ｖ．位相情報は、単位クォータニオンにより定義され、単位複素数に数学的になされるように、電波投射の角度で形成される１つの電波画像では表せない量子戦略酵母から導出される。

【0089】

ｖｉ．クォータニオン回路の出力は、ゲートクォータニオン振幅、すなわち、画像を調査するための回路の「評価経路」、に依存する。ゲートの再結合の全ての可能性のある方法に対する固有回路演算子がないからである。

【0090】

ｃ．方向が遺伝的発現ＰＡＳ組換えK. phaffii信号タンパク質発現のパルス状発現に向くように、ラグランジュ点Ｌ１で必要な衛星からの超低周波数分布絞りアレイ電波光学系を使用する。

【0091】

ｉ．鉄関連の酸化反応性ストレスの発生、細菌の運動性、代謝の変化、衛星からの無線波長周波数がこれらのタンパク質の波長と一致する程度のＤＮＡ修復など、これらのタンパク質の最長１時間持続時間のパターンに従って画像をレポートする。各タンパク質は、ＲＮＡ転写が調節されており、したがって生息地全体の細胞生物内でパルスが最小限に抑えられる。

【0092】

ｄ．評価前に、ＰＡＳ組換えK.phaffii ストレス信号を、対応する電波絞りに校正する。フォトニック光学時間レンズは多用途であり、ストレスタンパク質、細菌の分散（運動性）、マルチ電波衛星スキャンでの位相変調の間の制御された相互作用を捉えるのに十分である。生物の死につながるストレスの進行も、細菌がその再配置（運動性）と生存（修復）と新しい生息地（病原性または非病原性）での増殖（バイオフィルムの付着と成長）のために持つ可能性のあるあらゆる種類のストレス信号について一貫して監視されるように、画像キャプチャが位相を保存していることが重要である。

【0093】

ｅ．量子画像処理を確立する。

【0094】

ｉ．シミュレーションアルゴリズムは、ｎ個の基本ゲートからなる演算子Ｕ_ｃを伴うｎ個のキュービット量子回路のために記載された教科書の記載に従う。

【0095】

ｉｉ．画像処理での衛星間リンク帯域の幅制御因子を含める。

【0096】

ｉｉｉ．サンプリングクォータビットの数、衛星ノードの相対速度ベクトル、軌道クォータ画像の維持および地球への達成可能なダウンリンク帯域幅に基づいた地球からの干渉レベルを含める。

【0097】

ｉｖ．ＰＡＳ組換えK. phaffiiストレス応答の報告に関与するＥｃｆＧ遺伝子発現と同じ波長範囲で、コヒーレント多レベル変調方式で電波をストリーミングする。

【0098】

ｖ．位相変調された電波を連続的に使用して、遺伝子詳細に可能な遠隔環境顕微鏡の本質的に同等物を届ける。詳細は、クォータ画像を生成するクォータ回路により処理される。クォータ画像は、細菌の成長への環境脅威のスケール、細菌死の量、または、生息地での細菌の一時的な死の証拠を、明るい灰色が成長、灰色が一時的な進行または死、黒が死または種の絶滅のような適切な地図の色分けで、予測する。

【0099】

ｆ．生息地の地域的生物熱力学と比較する。

【0100】

＜参照文献＞
Bernauer, Lukas, Astrid Radkohl, Leonie Gabriela Katharina Lehmayer, and Anita Emmerstorfer-Augustin. 2020. “Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research.” Frontiers in Microbiology 11: 607028.
Bolokhov, Pavel A. 2019. “Quaternionic Wave Function.” International Journal of Modern Physics. A, Particles and Fields, Gravitation, Cosmology 34 (02): 1950001.
Chauhan, Neeraj, and Richard Calderone. 2008. “Two-Component Signal Transduction Proteins as Potential Drug Targets in Medically Important Fungi.” Infection and Immunity 76 (11): 4795-4803.
Conway, John H., and Derek A. Smith. 2003. On Quaternions and Octonions. CRC Press.
Dalvie, Neil C., Justin Leal, Charles A. Whittaker, Yuchen Yang, Joseph R. Brady, Kerry R. Love, and J. Christopher Love. 2020. “Host-Informed Expression of CRISPR Guide RNA for Genomic Engineering in Komagataella Phaffii.” ACS Synthetic Biology 9 (1): 26-35.
Fernandez, Jose M., and William A. Schneeberger. 2003. “Quaternionic Computing.” arXiv [quant-Ph]. arXiv. http://arxiv.org/abs/quant-ph/0307017.
Fraczek, Marcin G., Samina Naseeb, and Daniela Delneri. 2018. “History of Genome Editing in Yeast.” Yeast 35 (5): 361-68.
Gottschlich, Lisa, Miriam Bortfeld-Miller, Christoph Gabelein, Sebastian Dintner, and Julia A. Vorholt. 2018. “Phosphorelay through the Bifunctional Phosphotransferase PhyT Controls the General Stress Response in an Alphaproteobacterium.” PLoS Genetics 14 (4): e1007294.
Gottschlich, Lisa, Petra Geiser, Miriam Bortfeld-Miller, Christopher M. Field, and Julia A. Vorholt. 2019. “Complex General Stress Response Regulation in Sphingomonas Melonis Fr1 Revealed by Transcriptional Analyses.” Scientific Reports 9 (1): 1-13.
Hendrickx, Nico W., William I. L. Lawrie, Maximilian Russ, Floor van Riggelen, Sander L. de Snoo, Raymond N. Schouten, Amir Sammak, Giordano Scappucci, and Menno Veldhorst. 2021. “A Four-Qubit Germanium Quantum Processor.” Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03332-6.
Kaczmarczyk, A., S. Campagne, F. Danza, L. C. Metzger, J. A. Vorholt, and A. Francez-Charlot. 2011. “Role of Sphingomonas Sp. Strain Fr1 PhyR-NepR- EcfG Cascade in General Stress Response and Identification of a Negative Regulator of PhyR.” Journal of Bacteriology. https://doi.org/10.1128/jb.06006-11.
Lanzinger, Franz. 2020. “Programming C# in Unity.” 2D Game Development with Unity. https://doi.org/10.1201/9780429328664-2.
Nobu, Masaru K., Takashi Narihiro, Ran Mei, Yoichi Kamagata, Patrick K. H. Lee, Po-Heng Lee, Michael J. McInerney, and Wen-Tso Liu. 2020. “Catabolism and Interactions of Uncultured Organisms Shaped by Eco-Thermodynamics in Methanogenic Bioprocesses.” Microbiome 8 (1): 1-16.
Rajan, Raj Thilak, Albert-Jan Boonstra, Mark Bentum, Marc Klein-Wolt, Frederik Belien, Michel Arts, Noah Saks, and Alle-Jan van der Veen. 2016. “Space-Based Aperture Array for Ultra-Long Wavelength Radio Astronomy.” Experimental Astronomy 41 (1): 271-306.
Sharifi, Rouhallah, and Choong-Min Ryu. 2021. “Social Networking in Crop Plants: Wired and Wireless Cross-Plant Communications.” Plant, Cell & Environment 44 (4): 1095-1110.
Stillwell, John. 2012. Mathematics and Its History. Springer New York.
Wildberger, Norman John. 2005. Divine Proportions: Rational Trigonometry to Universal Geometry. Wild Egg Sydney.
Yamamoto, Satoru, Shigeaki Nakazawa, Kenji Sugisaki, Kazunobu Sato, Kazuo Toyota, Daisuke Shiomi, and Takeji Takui. 2015. “Adiabatic Quantum Computing with Spin Qubits Hosted by Molecules.” Physical Chemistry Chemical Physics: PCCP 17 (4): 2742-49.
＜実施例＞
＜実施例１＞
Ｐｅｒ－Ａｒｎｔ－Ｓｉｍ（ＰＡＳ）ドメインは、温度、湿度およびｐＨなどの環境条件の分子センサである。代替シグマ因子ＥｃｆＧは、ＲＮＡポリメラーゼに結合することにより、転写制御を変更することにより、一般ストレス応答（ＧＳＲ）を誘引する。少なくとも１つのＥｃｆＧ結合モチーフを備える組換えＰｅｒ－ＡＲＮＴ－Ｓｉｍ（ＰＡＳ）遺伝子配列を備えたKomagataella phaffii （K. Phaffii）および他の酵母が一般ストレス応答（ＧＳＲ）の程度に基づいてストレスの重要性を測定することができるか調査された。

【0101】

推定上のＥｃｆＧ結合配列を有するまたは有さない（対照）ＰＡＳドメインを備えるプラスミドがK. phaffiiに導入された。次のＥｃｆＧ結合配列が試験された。

【0102】

GGAACGTTACGCCCCCGATCCGTGTT (SEQ ID NO:1)
GGAAAGATTCCGCAACCGCTGCGTT (SEQ ID NO:5)
CGATCCGCAGGCGCGCGCACGCATT (SEQ ID NO:10)
GGAACAACTCCGCCACGCCGGAGTA (SEQ ID NO:26)
GGAACCGTGCGCGTCGCCTGGGCATT (SEQ ID NO:29)
低ストレス条件は、K. phaffii を過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）に曝すことにより確立された（Lin et al. Biotechnol Biofuels. 2021 Jul 20;14(1):160)）。高ストレス条件は、K. phaffiiを高温に組合わせて曝すことにより確立された（Zhong et al. Microb Cell Fact. 2014 Nov 26;13:163）。

【0103】

表２は、ＥｃｆＧ結合配列のそれぞれの遺伝子転写物の相対的なｍＲＮＡレベルを示す。この方法は、ＧＳＲレベルおよび遺伝子転写物の間に相関があるかどうかを確立する。

【0104】

ＥｃｆＧ結合配列を備えたＰＡＳドメインを有する生成K. phaffiiが誘引されたストレスレベルの重大性を測定できることが示される。ストレスレベルの重大性は、配列GGAACGTTACGCCCCCGATCCGTGTT（すなわち、表２のグループ３のSEQ ID NO:1）を備えるＰＡＳドメインを有するK. phaffiiで最も正確に確立された。同じＰＡＳドメインを有するがＥｃｆＧ結合モチーフ無しの対照では（表２のグループ１）、転写が起きないまたは全てのストレスレベルにおけるSEQ ID NO:１，５，１０，２６および２９による配列に対して極めて低い。同様に、ＰＡＳドメインを備える芳香族炭化水素受容体を発現するように生成されたK. phaffii（Zheng et al. Protein Expr Purif . 2016 Jun;122:72-81, Vazquez-Rivera et al. Toxicol Rep. 2021 Nov 26;9:1-11によるように）では、転写が起きないまたは全てのストレスレベルにおけるSEQ ID NO:１，５，１０，２６および２９による配列に対して極めて低い（表２のグループ２）。

【0105】

表１に挙げられた他の配列は、それら全てが推定上のＥｃｆＧ結合モチーフである共通の特徴を共有していることから、同様の結果が得られることが明らかである。

【0106】

表３は、ＧＳＲレベルと遺伝子転写の間の可能性のある相関の確立の意味において、配列GGAACGTTACGCCCCCGATCCGTGTT（すなわち、SEQ ID NO:1）を備えるＰＡＳドメインを有するK. phaffii、Saccharomyces cerevisiae（S. cerevisiae）、Sphingomonas melonis（S. melonis）の比較である。ストレスレベルの重大性は、特に非メチロトローフ酵母との比較で、K. phaffiiにおいて最も正確に確立されるようである。

【0107】

理論に束縛されるものではないが、推定上のＥｃｆＧ結合モチーフの転写レベルは、ストレス条件のレベルに相関するようであり、ＥｃｆＧ結合モチーフは、それゆえ、ＧＳＲの微調整に関与され得る。転写プロファイルは、K. phaffiiでのストレス条件に最も一致するようであり、K. phaffiiが、特にメタン生成条件において、ストレスフルな条件およびＧＳＲ関連経路の伝搬の検出に最も敏感であり得る。

【0108】

【表2】

【0109】

【表3】

【図面の簡単な説明】

【0110】

【図1】

【配列表】

2024532005000001.app

【国際調査報告】