特表 2024-532019 アルファ－１アンチトリプシン発現を阻害するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-05

(54)【発明の名称】アルファ－１アンチトリプシン発現を阻害するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240829BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 19/04 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240829BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 9/72 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240829BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61P1/16

A61P19/04

A61P35/00

A61K48/00

A61K31/713

A61P43/00 111

A61K31/712

A61K31/7125

A61K47/54

A61K9/51

A61K9/12

A61K9/10

A61K9/72

A61P11/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022578621

(86)(22)【出願日】2021-10-29

(85)【翻訳文提出日】2022-12-19

(86)【国際出願番号】 US2021072116

(87)【国際公開番号】W WO2023027759

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】63/236,786

(32)【優先日】2021-08-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】323007098

【氏名又は名称】ノボ ノルディスク エー／エス

【氏名又は名称原語表記】Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏｖｏ ａｌｌｅ １ ＤＫ－２８８０ Ｂａｇｓｖａｅｒｄ Ｄｅｎｍａｒｋ

(74)【代理人】

【識別番号】100150142

【弁理士】

【氏名又は名称】相原 礼路

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン， ボブ デール

(72)【発明者】

【氏名】パーセル， ナタリー ウェイン

(72)【発明者】

【氏名】ライ， チェンジュン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA16

4C076AA65

4C076AA93

4C076BB01

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB27

4C076BB29

4C076BB30

4C076BB31

4C076CC09

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC29

4C076CC41

4C076DD69

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4C084AA13

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4C084MA16

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4C084MA52

4C084MA56

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4C084MA63

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4C084NA14

4C084ZA59

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4C084ZA96

4C084ZB26

4C084ZC02

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA16

4C086MA38

4C086MA52

4C086MA56

4C086MA60

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA59

4C086ZA75

4C086ZA96

4C086ZB26

4C086ZC02

(57)【要約】

本開示は、ｄｓＲＮＡ、例えばダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）剤の使用を通じて、α－１アンチトリプシン標的ＲＮＡ及びタンパク質レベルを低減させるのに有用な化合物、組成物、及び方法に関する。
【選択図】図１－１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが１５～３０ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び１５～５０ヌクレオチドのセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、及び３２から選択されるヌクレオチド配列を有し、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖に相補性の領域を有し、必要に応じて前記センス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記オリゴヌクレオチド。

【請求項2】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ配列番号１及び２、
（ｂ）それぞれ配列番号３及び４、
（ｃ）それぞれ配列番号５及び６、
（ｄ）それぞれ配列番号７及び８、
（ｅ）それぞれ配列番号９及び１０、
（ｆ）それぞれ配列番号１１及び１２、
（ｇ）それぞれ配列番号１３及び１４、
（ｈ）それぞれ配列番号１５及び１６、
（ｉ）それぞれ配列番号１７及び１８、
（ｊ）それぞれ配列番号１９及び２０、
（ｋ）それぞれ配列番号２１及び２２、
（ｌ）それぞれ配列番号２３及び２４、
（ｍ）それぞれ配列番号２５及び２６、
（ｎ）それぞれ配列番号２７及び２８、
（ｏ）それぞれ配列番号２９及び３０、及び
（ｐ）それぞれ配列番号３１及び３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項3】

α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは、１５～３０のヌクレオチドのアンチセンス鎖及び１５～５０ヌクレオチドのセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列とは３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも連続する１９ヌクレオチドを含み、前記センス鎖は、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列を含む、前記オリゴヌクレオチド。

【請求項4】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖は、長さが１９～３０ヌクレオチドである、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項5】

前記アンチセンス鎖は、配列番号２６のヌクレオチド配列とは２ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも連続する１９ヌクレオチドを含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項6】

前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項7】

前記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが修飾される、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項8】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－修飾を含む、請求項６または７に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項9】

前記２’－修飾は、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾から選択されるか、または両方である、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項10】

前記アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチドを含み、前記センス鎖は、３６ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖は、５’～３’に番号付けされ、前記センス鎖の１、２、４、６、７、１２、１４、１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／または前記アンチセンス鎖の１、６、８、１１～１３、１５、１７、もしくは１９～２２位の１つ以上の位置が、２’－Ｏ－メチルで修飾される、請求項１～６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項11】

前記アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチドを含み、前記センス鎖は、３６ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖は、５’～３’に番号付けされ、前記センス鎖の３、５、８～１１、１３、１５、もしくは１７位、及び／または前記アンチセンス鎖の２～５、７、９、１０、１４、１６、もしくは１８位の１つ以上は、２’－フルオロで修飾される、請求項１～６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項12】

前記アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチドを含み、前記センス鎖は、３６ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖は、５’～３’に番号付けされ、前記センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／または前記アンチセンス鎖の１、４、６、８～１１、１３、１５、１７、１８、もしくは２０～２２位の１つ以上の位置が、２’－Ｏ－メチルで修飾され、前記センス鎖の３、８～１０、１２、１３、及び１７位、及び／または前記アンチセンス鎖の２、３、５、７、１２、１４、１６、及び１９位の１つ以上の位置が、２’－フルオロで修飾される、請求項１～６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項13】

前記アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチドを含み、前記センス鎖は、３６ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖は、５’～３’に番号付けされ、前記センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／または前記アンチセンス鎖の１、４、６、８、９、１１～１３、１５、１８、もしくは２０～２２位の１つ以上の位置が、２’－Ｏ－メチルで修飾され、前記センス鎖の３、８～１０、１２、１３、もしくは１７位、及び／または前記アンチセンス鎖の２、３、５、７、１０、１４、１６、１７、もしくは１９位の１つ以上の位置が、２’－フルオロで修飾される、請求項１～６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項14】

前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項15】

前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオアート結合である、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項16】

前記オリゴヌクレオチドは、前記センス鎖の１位と２位、前記アンチセンス鎖の１位と２位、前記アンチセンス鎖の２位と３位、前記アンチセンス鎖の３位と４位、前記アンチセンス鎖の２０位と２１位、及び前記アンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有する、請求項１～１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項17】

前記アンチセンス鎖の第１の位置のウリジンはリン酸類似体を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項18】

前記アンチセンス鎖の１位に以下の構造：

【化1】

を含む、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項19】

前記センス鎖は、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを含み、Ｓ１は、Ｓ２に相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３～５ヌクレオチドのループを形成し、必要に応じてＬはテトラループである、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項20】

前記テトラループは配列５’－ＧＡＡＡ’３’を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項21】

前記オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分に付着している、請求項１～２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項22】

前記センス鎖上の－ＧＡＡＡ－配列の１つ以上のヌクレオチドが、一価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項23】

前記－ＧＡＡＡ－配列は以下の構造を含み、

【化2】

Ｌは、置換及び非置換アルキレン、置換及び非置換アルケニレン、置換及び非置換アルキニレン、置換及び非置換ヘテロアルキレン、置換及び非置換ヘテロアルケニレン、置換及び非置換ヘテロアルキニレン、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、結合、クリックケミストリーハンドル、または長さが１～２０の連続した共有結合原子を含むリンカーを表し、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮである、請求項２２または２２に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項24】

Ｌは、アセタールリンカーである、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項25】

Ｘは、Ｏである、請求項２３または２４に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項26】

前記－ＧＡＡＡ－配列は以下の構造：

【化3】

を含む、請求項２０及び請求項２２～２５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項27】

α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが１５～３０ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び１５～５０ヌクレオチドのセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、及び１０４から選択されるヌクレオチド配列を有し、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖に相補性の領域を有し、必要に応じて前記センス鎖は、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、及び１０３から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記オリゴヌクレオチド。

【請求項28】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ配列番号３３及び３４、
（ｂ）それぞれ配列番号３５及び３６、
（ｃ）それぞれ配列番号３７及び３８、
（ｄ）それぞれ配列番号３９及び４０、
（ｅ）それぞれ配列番号４１及び４２、
（ｆ）それぞれ配列番号４３及び４４、
（ｇ）それぞれ配列番号４５及び４６、
（ｈ）それぞれ配列番号４７及び４８、
（ｉ）それぞれ配列番号４９及び５０、
（ｊ）それぞれ配列番号５１及び５２、
（ｋ）それぞれ配列番号５３及び５４、
（ｌ）それぞれ配列番号５５及び５６、
（ｍ）それぞれ配列番号５７及び５８、
（ｎ）それぞれ配列番号５９及び６０、
（ｏ）それぞれ配列番号６１及び６２、
（ｐ）それぞれ配列番号６３及び６４、
（ｑ）それぞれ配列番号６５及び６６、
（ｒ）それぞれ配列番号６７及び６８、
（ｓ）それぞれ配列番号６９及び７０、
（ｔ）それぞれ配列番号７１及び７２、
（ｕ）それぞれ配列番号７３及び７４、
（ｖ）それぞれ配列番号７５及び７６、
（ｗ）それぞれ配列番号７７及び７８、
（ｘ）それぞれ配列番号７９及び８０、
（ｙ）それぞれ配列番号８１及び８２、
（ｚ）それぞれ配列番号８３及び８４、
（ａａ）それぞれ配列番号８５及び８６、
（ｂｂ）それぞれ配列番号８７及び８８、
（ｃｃ）それぞれ配列番号８９及び９０、
（ｄｄ）それぞれ配列番号９１及び９２、
（ｅｅ）それぞれ配列番号９３及び９４、
（ｆｆ）それぞれ配列番号９５及び９６、
（ｇｇ）それぞれ配列番号９７及び９８、
（ｈｈ）それぞれ配列番号９９及び１００、
（ｉｉ）それぞれ配列番号１０１及び１０２、及び
（ｊｊ）それぞれ配列番号１０３及び１０４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項29】

Ａ１ＡＴの発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２６に示される配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号１０５に示される配列を含むセンス鎖を含み、
前記センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び前記アンチセンス鎖の１、４、６、８～１１、１３、１５、１７、１８もしくは２０～２２位の全ての位置が２’－Ｏ－メチルで修飾され、前記センス鎖の３、８～１０、１２、１３、及び１７位、ならびに前記アンチセンス鎖の２、３、５、７、１２、１４、１６、及び１９位の全ての位置が２’－フルオロで修飾され、
前記オリゴヌクレオチドは、前記センス鎖の１位と２位、前記アンチセンス鎖の１位と２位、前記アンチセンス鎖の２位と３位、前記アンチセンス鎖の３位と４位、前記アンチセンス鎖の２０位と２１位、及び前記アンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有し、
前記オリゴヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖の１位に以下の構造を含み、

【化4】

前記センス鎖上の－ＧＡＡＡ－配列の各ヌクレオチドは、一価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされており、前記－ＧＡＡＡ－配列は以下の構造：

【化5】

を含む、前記オリゴヌクレオチド。

【請求項30】

Ａ１ＡＴの発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１０３のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、及び配列番号１０４のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、Ａ１ＡＴ ＲＮＡ転写物に相補性の領域を有し、前記オリゴヌクレオチドは、以下の構造：

【化6】

を有するコンジュゲート形態である、前記オリゴヌクレオチド。

【請求項31】

先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。

【請求項32】

Ｎａ^＋対イオンをさらに含む、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

請求項１～３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドと、
薬学的に許容可能な担体または希釈剤と、を含む組成物。

【請求項34】

アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡが、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２６のヌクレオチド配列とは４ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも連続した１５ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は長さが１９～３５ヌクレオチドである、前記二本鎖リボ核酸剤。

【請求項35】

前記二本鎖領域の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、前記修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド及び２’－フルオロ修飾ヌクレオチドからなる群より選択され、前記ｄｓＲＮＡは、１つ以上のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分に付着している、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項36】

前記アンチセンス鎖は、長さが１９～３０ヌクレオチドであり、前記センス鎖は長さが３２～８０ヌクレオチドの間であり、かつテトラループを含む、請求項３４または３５に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項37】

前記センス鎖は、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項３４～３６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項38】

前記アンチセンス鎖は、配列番号１０４に示される配列を含み、前記センス鎖は、配列番号１０３に示される配列を含む、請求項３４～３７のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項39】

請求項３４～３８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む組成物。

【請求項40】

Ｎａ^＋対イオンをさらに含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

請求項３４～３８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤と、
薬学的に許容可能な担体または希釈剤と、を含む組成物。

【請求項42】

対象にオリゴヌクレオチドを送達する方法であって、請求項１～３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の組成物、請求項３４～３８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項３９～４１のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項43】

前記オリゴヌクレオチド、前記組成物、または前記ｄｓＲＮＡ剤を送達して、前記対象における肝疾患もしくは障害を治療または予防し、前記肝疾患もしくは障害は、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝線維症、及び肝細胞癌からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記対象がヒトである、請求項４２または４３に記載の方法。

【請求項45】

前記オリゴヌクレオチド、前記組成物、または前記ｄｓＲＮＡ剤は、前記対象に静脈内または皮下投与される、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

哺乳動物において標的α－１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現を低減させる方法であって、請求項１～３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の組成物、請求項３４～３８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項３９～４１のいずれか１項に記載の組成物を、前記哺乳動物における標的α－１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現を低減させるのに十分な量で、投与することを含む、前記方法。

【請求項47】

前記オリゴヌクレオチドは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化される、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記オリゴヌクレオチドまたは前記ｄｓＲＮＡ剤は、１日につき、前記哺乳動物１キログラム当たり１マイクログラム～５ミリグラム、１キログラム当たり１００マイクログラム～０．５ミリグラム、１キログラム当たり０．００１～０．２５ミリグラム、１キログラム当たり０．０１～２０マイクログラム、１キログラム当たり０．０１～１０マイクログラム、１キログラム当たり０．１０～５マイクログラム、及び１キログラム当たり０．１～２．５マイクログラムからなる群から選択される投与量で投与される、請求項４２～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記哺乳動物の組織では、前記オリゴヌクレオチド、前記組成物、または前記ｄｓＲＮＡ剤を前記哺乳動物に投与してから少なくとも３日後、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％の量（％で表する）が減少する、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記組織は肝臓組織である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記投与ステップは、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、注入、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣、局所、経口、及び吸入送達からなる群から選択される投与経路を含む、請求項４２～４４及び４６～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

動物の肝疾患もしくは障害を治療または予防する方法であって、請求項１～３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の組成物、請求項３４～３８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項３９～４１のいずれか１項に記載の組成物を、前記対象における前記肝疾患もしくは障害を治療または予防するのに十分な量で、前記対象に投与することを含み、前記肝疾患もしくは障害が、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、ＣＯＰＤ、肺気腫、肝線維症、及び肝細胞癌からなる群から選択される、前記方法。

【請求項53】

前記動物がヒトである、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

請求項１～３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の組成物、請求項３４～３８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項３９～４１のいずれか１項に記載の組成物と、α－１アンチトリプシン発現の低減を必要とする対象においてそれを行うための説明書と、を含むキット。

【請求項55】

請求項１～３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の組成物、請求項３４～３８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項３９～４１のいずれか１項に記載の組成物の、α－１アンチトリプシン発現の低減を必要とする対象においてそれを行う薬物の製造における使用。

【請求項56】

前記対象が肝疾患もしくは障害を有する、請求項５４に記載のキットまたは請求項５５に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

アルファ１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ、またはＳＥＲＰＩＮＡ１、またはＳｅｒｐｉｎａ１もしくはＡＡＴ）は、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤である。一般的に血清トリプシン阻害剤として知られている。アルファ１－アンチトリプシンは、様々なプロテアーゼを阻害することから、アルファ１プロテイナーゼ阻害剤（Ａ１ＰＩ）とも呼ばれている（Ｇｅｔｔｉｎｓ Ｐ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０２：４７５１－８０４）。アルファ１－アンチトリプシンは、炎症細胞の酵素、特に好中球エラスターゼから組織を保護し、血液の参考基準値が１．５～３．５グラム／リットルである。しかしながら、急性炎症時には数倍のレベル上昇が起こる可能性がある（Ｋｕｓｈｎｅｒ ａｎｄ Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ，ＡＣＵＴＥ－ＰＨＡＳＥ ＰＲОＴＥＩＮＳ：МОＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩОＬОＧＹ，ＢＩОＣＨＥМＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩОＮＳ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）；１９９３，Ｃｈａｐｔｅｒ １， ｐｐ．３－１９）。ＡＡＴが存在しない場合、ＡＡＴと酵素エラスターゼのバランスが崩れ、損傷を引き起こす可能性がある。通常、酵素エラスターゼは、感染症と戦う上で重要な役割を果たすものであるが、多すぎると健康な組織に害を及ぼす可能性もある。高濃度では、肺の内側及び肺胞に損傷を与え、より具体的には、そのような状況では、エラスターゼが自由に肺の弾力性に寄与するエラスチンを分解する。その結果、成人には肺気腫もしくは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び成人もしくは子供には肝硬変などの呼吸器合併症を引き起こす（Ｇａｄｅｋ ＪＥ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｎｇ，１９９０，１６８ Ｓｕｐｐｌ：５５２－６４；Ｂｉｒｒｅｒ Ｐ，ＡＧＥＮＴＳ ＡＣＴＩОＮＳ ＳＵＰＰＬ．，１９９３，４０：３－１２）。さらに、ＡＡＴ欠損は肝臓に影響を与え、機能低減につながり、肝硬変や肝癌のリスクを増加させる。人生の最初の３０年間は、ＡＡＴ欠損症を有する人にとって肺疾患よりも肝臓疾患の方が一般的である（Ｇａｄｅｋ ＪＥ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｎｇ，１９９０）。何人かの個体において、ＡＡＴ欠損は、皮膚に痛みを伴う赤い結節を頻繁に発生し得る。ＡＡＴ遺伝子の１つまたは両方のコピーに変異がある人は、アルファ－１抗トリプシン欠損症に苦しむ可能性があり、これは、肺と肝臓のエラスターゼ活性が通常よりも高いため、肺気腫または慢性肝疾患を発症するリスク（ＤｅＭｅｏ ＤＬ，ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＥＫ（Ｍａｒｃｈ ２００４）、Ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． ２：ｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｐｈａ（１）－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ｏｆ ｅｍｐｈｙｓｅｍａ ｒｉｓｋ，ＴＨОＲＡＸ５９（３）：２５９－６４）として表れる。ＳＥＲＰＩＮＡ１は、染色体１４ｑ３２に局在し、７５個を超えるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異が特定されており、多く人々に臨床的に重大な影響を及ぼしている（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ Ｅ．Ｋ．，Ｓａｎｄｈａｕｓ ＲＡ（２００９），Ａｌｐｈａ１－Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６０ （２６）：２７４９－５７）。最も一般的な重度欠損の原因であるＰｉＺは、３４２位のグルタミン酸からリジンへの変異（ｄｂＳＮＰ：ｒｓ２８９２９４７４）をもたらす単一塩基対置換であり、ＰｉＳは、２６４位のグルタミン酸からバリンへの変異（ｄｂＳＮＰ：ｒｓ１７５８０）によってもたらされる。

【0002】

罹患者におけるアルファ－１アンチトリプシンの欠損は、野生型の機能的なアルファ－１アンチトリプシンの欠損である。しかしながら、場合によっては、個体がかなりの量のアルファ－１アンチトリプシンを産生していても、産生されるアルファ－１アンチトリプシンタンパク質の一部がミスフォールドされているか、またはタンパク質の本来の機能を損なうかもしくは排除する変異を含んでいる。場合によっては、個体は、体内の合成部位から作用部位に適切に輸送できない、ミスフォールドタンパク質を生成する。

【0003】

アルファ－１アンチトリプシン欠損症に起因する肝疾患は、このようなミスフォールドタンパク質によって誘発される可能性がある。アルファ－１アンチトリプシンの突然変異形態、（例えば、３４２位（前処理された形態では３６６位）のグルタミン酸からリジンへの変異を有する一般的なＰｉＺバリアント）は、肝細胞内で産生され（肝臓の肝実質細胞は、通常、大量の循環ＡＡＴを産生する）、ミスフォールド構成では、そのような形態は細胞から容易に輸送されない。これにより、肝細胞にミスフォールドタンパク質が蓄積され（肝実質細胞、変異型Ｚタンパク質の負担が最も大きい肝細胞は、最終的にアポトーシスをもたらす細胞内損傷のカスケードを受ける可能性がある。肝細胞のアポトーシスと再生のこの慢性的なサイクルは、最終的には線維症及び臓器損傷を引き起こし得る。）、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌を含むがこれらに限定されない１つ以上の肝疾患もしくは障害が誘発される可能性がある（Ｒｕｄｎｉｃｋ ＤＡ，ａｎｄ Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ ＤＨ．，Ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ａ ｎｅｗ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；２００５，４２（３）：５１４－２１）。ＡＡＴ欠損症を有するヒトには、息切れ、痰もしくは喀痰の産生を伴う過度の咳、喘鳴、運動能力の低下及び持続的な低エネルギー状態または疲労、息を吸うときの胸の痛みの増加を含み他の症状が現れることがある。これらの症状は慢性的であるか、風邪もしくはインフルエンザなどの急性呼吸器感染症と共に発生し得る。まれに、ＡＡＴは脂肪織炎と呼ばれる皮膚疾患を引き起こす場合があり、その結果、硬化した斑点や痛みを伴う赤いしこりが生じることがある（Ｇａｄｅｋ ＪＥ ｅｔ ａｌ．，ＬＵＮＧ，１９９０）。

【0004】

現在、アルファ－１アンチトリプシン欠損症に関連する肝疾患の患者をうまく治療するための選択肢はほとんどなく、そのような選択肢には、肝炎ワクチン接種、支持療法、及び有害物質（例えば、アルコール及びＮＳＡＩＤ）の回避が含まれるが、いずれも標的療法を提供していない。アルファ－１アンチトリプシンの置換は、これらの患者の肝疾患に影響しないが、肝移植は効果的であり得る。したがって、アルファ－１アンチトリプシン欠損症に関連する肝疾患を有する患者を治療する組成物及び方法が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、肝臓におけるアルファ－１アンチトリプシン（α－１アンチトリプシンまたはＡ１ＡＴもしくはＳＥＲＰＩＮＡ１）の発現を低減させるように機能するオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）の発見に部分的に基づいている。具体的には、アルファ－１アンチトリプシンｍＲＮＡ内の標的配列が同定され、これらの標的配列に結合してアルファ－１アンチトリプシンｍＲＮＡ発現を阻害するオリゴヌクレオチドが生成された。本明細書に示されるように、オリゴヌクレオチドは、マウスアルファ－１アンチトリプシンの発現を阻害し、及び／または肝臓におけるサル及びヒトアルファ－１アンチトリプシンの発現を阻害した。理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、アルファ－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害または状態（例えば、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫及び／または慢性肝疾患、例えば、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌）の治療に有用である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、α－１アンチトリプシンの変異に関連する疾患、障害または状態の治療に有用である。アルファ－１アンチトリプシンの発現を低減させるオリゴヌクレオチドは、米国特許第９，４５８，４５７号に記載されており、その内容は、本参照により本明細書に組み込まれる。

【0006】

いくつかの態様において、本開示は、α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが１５～３０ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び１５～５０ヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２から選択されるヌクレオチド配列を有し、センス鎖は、アンチセンス鎖に相補性の領域を有し、必要に応じてセンス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１から選択されるヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。

【0007】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、センス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号１及び２
（ｂ）それぞれ配列番号３及び４
（ｃ）それぞれ配列番号５及び６
（ｄ）それぞれ配列番号７及び８
（ｅ）それぞれ配列番号９及び１０
（ｆ）それぞれ配列番号１１及び１２
（ｇ）それぞれ配列番号１３及び１４
（ｈ）それぞれ配列番号１５及び１６
（ｉ）それぞれ配列番号１７及び１８
（ｊ）それぞれ配列番号１９及び２０
（ｋ）それぞれ配列番号２１及び２２
（ｌ）それぞれ配列番号２３及び２４
（ｍ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｎ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｏ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｐ）それぞれ配列番号３１及び３２

【0008】

別の態様において、本開示は、α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドは、１５～３０ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び１５～５０ヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列とは３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも連続した１９ヌクレオチドを含み、センス鎖は、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。別の態様において、本開示は、α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドは、１５～３０のヌクレオチドのアンチセンス鎖及び１５～５０ヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列とは３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも連続する１９ヌクレオチドを含み、センス鎖は、配列番号１０５に示されるヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。

【0009】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖は、長さが１９～３０ヌクレオチドである。別の態様において、アンチセンス鎖は、配列番号２６のヌクレオチド配列とは２ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも連続する１９ヌクレオチドを含む。

【0010】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが修飾される。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾を含む。いくつかの態様において、２’－修飾は、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾から選択されるか、または両方である。

【0011】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチドを含み、センス鎖は、３６ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、５’～３’に番号付けされ、センス鎖の１、２、４、６、７、１２、１４、１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、６、８、１１～１３、１５、１７、もしくは１９～２２位の１つ以上の位置が、２’－Ｏ－メチルで修飾される。別の態様において、センス鎖の３、５、８～１１、１３、１５、もしくは１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２～５、７、９、１０、１４、１６、もしくは１８位の１つ以上は、２’－フルオロで修飾される。さらに別の態様において、センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、４、６、８～１１、１３、１５、１７、１８、もしくは２０～２２位の１つ以上の位置が、２’－Ｏ－メチルで修飾され、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、及び１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２、３、５、７、１２、１４、１６、及び１９位の１つ以上の位置が、２’－フルオロで修飾される。別の態様において、センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、４、６、８、９、１１～１３、１５、１８、もしくは２０～２２位の１つ以上の位置が、２’－Ｏ－メチルで修飾され、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、もしくは１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２、３、５、７、１０、１４、１６、１７、もしくは１９位の１つ以上の位置が、２’－フルオロで修飾される。

【0012】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有する。

【0013】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、アンチセンス鎖の第１の位置のウリジンはリン酸類似体を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１位に以下の構造を有する。

【化1】

【0014】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分に付着している。

【0015】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、センス鎖は、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを含み、Ｓ１は、Ｓ２に相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３～５ヌクレオチドのループを形成する。いくつかの態様において、Ｌはテトラループである。いくつかの態様において、テトラループは配列５’－ＧＡＡＡ’３’を含む。いくつかの態様において、センス鎖上の－ＧＡＡＡ－配列の１つ以上のヌクレオチドが、一価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートしている。いくつかの態様において、－ＧＡＡＡ－配列は以下の構造を含み、

【化2】

式中、
Ｌは、置換及び非置換アルキレン、置換及び非置換アルケニレン、置換及び非置換アルキニレン、置換及び非置換ヘテロアルキレン、置換及び非置換ヘテロアルケニレン、置換及び非置換ヘテロアルキニレン、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、結合、クリックケミストリーハンドル、または長さが１～２０個の連続した共有結合原子を含むリンカーを表し、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮである。いくつかの態様において、Ｌは、アセタールリンカーである。いくつかの態様において、Ｘは、Ｏである。

【0016】

いくつかの態様において、－ＧＡＡＡ－配列は以下の構造を有する。

【化3】

【0017】

別の態様において、本開示は、α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが１５～３０ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び１５～５０ヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、及び１０４から選択されるヌクレオチド配列を有し、センス鎖は、アンチセンス鎖に相補性の領域を有し、必要に応じてセンス鎖は、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、及び１０３から選択されるヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。

【0018】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、センス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号３３及び３４
（ｂ）それぞれ配列番号３５及び３６
（ｃ）それぞれ配列番号３７及び３８
（ｄ）それぞれ配列番号３９及び４０
（ｅ）それぞれ配列番号４１及び４２
（ｆ）それぞれ配列番号４３及び４４
（ｇ）それぞれ配列番号４５及び４６
（ｈ）それぞれ配列番号４７及び４８
（ｉ）それぞれ配列番号４９及び５０
（ｊ）それぞれ配列番号５１及び５２
（ｋ）それぞれ配列番号５３及び５４
（ｌ）それぞれ配列番号５５及び５６
（ｍ）それぞれ配列番号５７及び５８
（ｎ）それぞれ配列番号５９及び６０
（ｏ）それぞれ配列番号６１及び６２
（ｐ）それぞれ配列番号６３及び６４
（ｑ）それぞれ配列番号６５及び６６
（ｒ）それぞれ配列番号６７及び６８
（ｓ）それぞれ配列番号６９及び７０
（ｔ）それぞれ配列番号７１及び７２
（ｕ）それぞれ配列番号７３及び７４
（ｖ）それぞれ配列番号７５及び７６
（ｗ）それぞれ配列番号７７及び７８
（ｘ）それぞれ配列番号７９及び８０
（ｙ）それぞれ配列番号８１及び８２
（ｚ）それぞれ配列番号８３及び８４
（ａａ）それぞれ配列番号８５及び８６
（ｂｂ）それぞれ配列番号８７及び８８
（ｃｃ）それぞれ配列番号８９及び９０
（ｄｄ）それぞれ配列番号９１及び９２
（ｅｅ）それぞれ配列番号９３及び９４
（ｆｆ）それぞれ配列番号９５及び９６
（ｇｇ）それぞれ配列番号９７及び９８
（ｈｈ）それぞれ配列番号９９及び１００
（ｉｉ）それぞれ配列番号１０１及び１０２
（ｊｊ）それぞれ配列番号１０３及び１０４

【0019】

さらなる態様において、本開示は、Ａ１ＡＴの発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２６に示される配列を含むアンチセンス鎖と、配列番号１０５に示される配列を含むセンス鎖とを有し、
センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及びアンチセンス鎖の１、４、６、８～１１、１３、１５、１７、１８もしくは２０～２２位の全ての位置が２’－Ｏ－メチルで修飾され、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、及び１７位、ならびにアンチセンス鎖の２、３、５、７、１２、１４、１６、及び１９位の全ての位置が２’－フルオロで修飾され、
当該オリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有し、
当該オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１位に以下の構造を含み、

【化4】

センス鎖上の－ＧＡＡＡ－配列の各ヌクレオチドは、一価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされており、－ＧＡＡＡ－配列は以下の構造を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。

【化5】

【0020】

さらなる態様において、本開示は、Ａ１ＡＴの発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１０３のヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１０４のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含み、アンチセンス鎖は、Ａ１ＡＴ ＲＮＡ転写物に相補性の領域を有し、当該オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有するコンジュゲート形態である、オリゴヌクレオチドを提供する。

【化6-1】

【化6-2】

【0021】

別の態様において、本開示は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はＮａ^＋対イオンを含む。別の態様において、本開示は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物と、薬学的に許容される担体または希釈剤を提供する。

【0022】

なおさらなる態様において、本開示は、アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡが、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２６のヌクレオチド配列とは４ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも連続した１５ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は長さが１９～３５ヌクレオチドである、二本鎖リボ核酸剤を提供する。いくつかの態様において、二本鎖領域の全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド及び２’－フルオロ修飾ヌクレオチドからなる群より選択され、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分に付着している。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は長さが１９～３０ヌクレオチドであり、センス鎖は長さが３２～８０ヌクレオチドの間であり、かつテトラループを含む。いくつかの態様において、センス鎖は、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、センス鎖は、配列番号１０５に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、配列番号１０４に示される配列を含み、センス鎖は、配列番号１０３に示される配列を含む。

【0023】

さらなる態様において、本開示は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はＮａ^＋対イオンを含む。別の実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。

【0024】

いくつかの態様において、本開示は、対象にオリゴヌクレオチドを送達する方法であって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ剤、または組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド、組成物、またはｄｓＲＮＡ剤を送達して、当該対象における肝疾患もしくは障害を治療または予防し、当該肝疾患もしくは障害は、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝線維症、及び肝細胞癌からなる群から選択される。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド、組成物、またはｄｓＲＮＡ剤は、対象に静脈内または皮下投与される。

【0025】

別の態様において、本開示は、哺乳動物において標的α－１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現を低減させる方法であって、当該哺乳動物における標的α－１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現を低減させるのに十分な量で、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ剤、または組成物を投与することを含む当該方法を提供する。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化される。

【0026】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドまたはｄｓＲＮＡ剤は、１日につき、当該哺乳動物１キログラム当たり１マイクログラム～５ミリグラム、１キログラム当たり１００マイクログラム～０．５ミリグラム、１キログラム当たり０．００１～０．２５ミリグラム、１キログラム当たり０．０１～２０マイクログラム、１キログラム当たり０．０１～１０マイクログラム、１キログラム当たり０．１０～５マイクログラム、及び１キログラム当たり０．１～２．５マイクログラムからなる群から選択される投与量で投与される。

【0027】

前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、当該哺乳動物の組織では、オリゴヌクレオチド、組成物、またはｄｓＲＮＡ剤を当該哺乳動物に投与してから少なくとも３日後、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％の量（％で表する）が減少する。いくつかの態様において、組織は肝臓組織である。

【0028】

前述または関連する態様のいずれかにおいて、当該投与ステップは、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、注入、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣、局所、経口、及び吸入送達からなる群から選択される投与経路を含む。

【0029】

別の態様において、本開示は、動物の肝疾患もしくは障害を治療または予防する方法であって、対象における肝疾患もしくは障害を治療または予防するのに十分な量で本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ剤、または組成物を当該対象に投与することを含み、肝疾患もしくは障害が、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、ＣＯＰＤ、肺気腫、肝線維症、及び肝細胞癌からなる群から選択される、方法を提供する。いくつかの態様において、動物はヒトである。

【0030】

さらなる態様において、本開示は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ剤、または組成物と、α－１アンチトリプシン発現の低減を必要とする対象においてそれを行うための説明書とを含むキットを提供する。いくつかの態様において、対象は肝疾患もしくは障害を有する。

【0031】

またさらなる態様において、本開示は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ剤、または組成物を、α－１アンチトリプシン発現の低減を必要とする対象においてそれを行う薬物の製造において使用することを提供する。いくつかの態様において、当該対象は肝疾患もしくは障害を有する。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1-1】表２に提供したように、示されたＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの１、０．１、または０．０１ｎＭの処置の２４時間後、Ｈｕｈ７細胞中に残存するヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの残存率（％）を示すグラフを提供する。試料は、モックのトランスフェクト対照に対して正規化された。

【図1-2】表２に提供したように、示されたＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの１、０．１、または０．０１ｎＭの処置の２４時間後、Ｈｕｈ７細胞中に残存するヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの残存率（％）を示すグラフを提供する。試料は、モックのトランスフェクト対照に対して正規化された。

【図2A】Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）コンジュゲート二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドである、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の配列及び化学修飾パターンを示す概略図を提供する。２’－ＯＭｅ＝２’－Ｏ－メチル、２’－Ｆ＝２’－フルオロ。出現順に配列番号１０３～１０４をそれぞれ開示する。

【図2B】ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９オリゴヌクレオチド（図２Ａに示す）の用量応答を示すグラフを提供する。血清中に残っているヒトＺ－ＡＡＴタンパク質の割合（％）は、ＰＢＳ処理マウスのＺ－ＡＡＴタンパク質の％に対して、ＰＢＳ中で製剤化された１、３、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）のＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を皮下（ＳＣ）注射した後、表示した時間にＰｉＺマウスで測定した。＊＝独立ｔ検定によるＰ≦０．０５、＊＊＝独立ｔ検定によるＰ≦０．０１、＊＊＊＝独立ｔ検定によるＰ≦０．００１、＊＊＊＊＝独立ｔ検定によるＰ＜０．０００１

【図2C】決定された５０％有効用量（ＥＤ５０）（Ｃ）を示すグラフを提供する。血清中に残っているヒトＺ－ＡＡＴタンパク質の割合（％）は、ＰＢＳ処理マウスのＺ－ＡＡＴタンパク質の％に対して、ＰＢＳ中で製剤化された１、３、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）のＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を皮下（ＳＣ）注射した後、表示した時間にＰｉＺマウスで測定した。＊＝独立ｔ検定によるＰ≦０．０５、＊＊＝独立ｔ検定によるＰ≦０．０１、＊＊＊＝独立ｔ検定によるＰ≦０．００１、＊＊＊＊＝独立ｔ検定によるＰ＜０．０００１

【図3】３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回、２２週間にわたって６回投与（すなわち、０日目に初回投与、４、８、１２、１６、２０週目に投与）した後の、ＰｉＺマウスの肝臓に残っているヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの割合（％）を示すグラフを提供する。治療は、５、１２、または４９週齢で開始され、研究の完了時（それぞれ、２７、３４、または７１週齢）に肝臓の末端試料を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。＊＝生理食塩水処理対照と比較してＰ＜０．０５、＊＊＊＊＝生理食塩水処理対照と比較してＰ≦０．０００１。

【図4】図３に説明されたように処理されたＰｉＺマウスの血液中に残っているヒトＺ－ＡＡＴタンパク質の割合（％）を示すグラフを提供する。研究の４、８、１２、１６、２０週目、及び研究終了時に血液を採取した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。＊＝生理食塩水処理対照と比較してＰ＜０．０５、＊＊＊＝生理食塩水処理対照と比較してＰ≦０．００１、＊＊＊＊＝生理食塩水処理対照と比較してＰ≦０．０００１。

【図5】３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回、２２週間にわたって６回投与（すなわち、０日目に初回投与、４、８、１２、１６、２０週目に投与）した後の、ＰｉＺマウスの肝臓に残っているヒトＺ－ＡＡＴタンパク質を測定したウェスタンブロット画像を提供する。治療は、５週齢で開始され、研究の完了時（２７週齢）に肝臓の末端試料を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。

【図6】図５のウェスタンブロットに基づいて測定したヒトＺ－ＡＡＴタンパク質レベルを定量化したグラフを提供する。＊＝生理食塩水処理対照と比較してＰ＜０．０５、＊＊＊＊＝生理食塩水処理対照と比較してＰ≦０．０００１。

【図7】３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回、２２週間にわたって６回投与した後（すなわち、０日目に初回投与、４、８、１２、１６、２０週目に投与）の、ＰｉＺマウスの肝臓に残っている総ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質を測定（総Ａ１ＡＴタンパク質抗体を使用して測定）した免疫組織化学画像を提供する。治療は、５週齢で開始され、研究の完了時（２７週齢）に肝臓の試料を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。ベースライン試料は、５週齢のマウスから収集した。

【図8】３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回、２２週間にわたって６回投与（すなわち、０日目に初回投与、４、８、１２、１６、２０週目に投与）した後の、ＰｉＺマウスの肝臓におけるヒトＺ－ＡＡＴポリマー負荷を測定した免疫組織化学画像を提供する。治療は、５週齢で開始され、研究の完了時（２７週齢）に肝臓の末端試料を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。ベースライン試料は、５週齢のマウスから収集した。

【図9】３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回、２２週間にわたって６回投与（すなわち、０日目に初回投与、４、８、１２、１６、２０週目に投与）した後の、ＰｉＺマウスの肝臓におけるヒトＺ－ＡＡＴポリマー負荷を測定した免疫組織化学画像を提供する。治療は、４９週齢で開始され、研究の完了時（７１週齢）に肝臓の末端試料を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。ベースライン試料は、４９週齢のマウスから収集した。

【図10】３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回、２２週間にわたって６回投与（すなわち、０日目に初回投与、４、８、１２、１６、２０週目に投与）した後の、ＰｉＺマウスの肝臓における肝細胞内小球形成を測定した過ヨウ素酸シッフジアスターゼ（ＰＡＳ－Ｄ）画像を提供する。治療は、５週齢で開始され、研究の完了時（２７週齢）に肝臓の末端試料を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。ベースライン試料は、５週齢のマウスから収集した。

【図11】３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回、２２週間にわたって６回投与（すなわち、０日目に初回投与、４、８、１２、１６、２０週目に投与）した後の、ＰｉＺマウスの肝臓における細胞増殖（Ｋｉ６７）を測定した免疫組織化学画像を提供する。治療は、５週齢で開始され、研究の完了時（２７週齢）に肝臓の末端試料を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。ベースライン試料は、５週齢のマウスから収集した。

【図12】３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回、２２週間にわたって６回投与（すなわち、０日目に初回投与、４、８、１２、１６、２０週目に投与）した後の、ＰｉＺマウスの肝臓における肝線維症の免疫組織化学像（シリウスレッド染色）を提供する。治療は、５週齢で開始され、研究の完了時（２７週齢）に肝臓の末端試料を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。ベースライン試料は、５週齢のマウスから収集した。

【図13】３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回、２２週間にわたって６回投与（すなわち、０日目に初回投与、４、８、１２、１６、２０週目に投与）した後の、ＰｉＺマウスの肝臓におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びアルカリホスファターゼのレベルを示すグラフを提供する。治療は、５、１２、または４９週齢で開始され、研究の完了時（それぞれ２７、３４、または７１週齢）に血液の末端試料を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。＊＝生理食塩水処理対照と比較してＰ＜０．０５、＊＊＊＊＝生理食塩水処理対照と比較してＰ≦０．０００１。

【図14】ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９で処理したＰｉＺマウスにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡ、血清Ｚ－ＡＡＴタンパク質、肝臓のＺ－ＡＡＴタンパク質、及び肝小球の用量依存的ノックダウンを示すグラフを示す。治療は、５週齢で開始され、０、０．３、１、または３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４回投与した後、１８週齢に検体を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。

【図15】０、０．３、１、または３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回で４回投与した後、ＰｉＺマウスの肝臓の過ヨウ素酸シッフジアスターゼ（ＰＡＳ－Ｄ）染色による用量依存的肝細胞内小球形成を測定した肝臓組織試料の画像を提供する。治療は、５週齢で開始され、１８週齢の研究の完了時に肝臓の末端試料を収集した。生理食塩水処理マウスを対照として使用した。

【図16】１、３、または１０ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の単回皮下（ＳＣ）投与で処理した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の平均及び個別体重を示すグラフを提供する。

【図17A】１、３、または１０ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の単回皮下（ＳＣ）投与後の、ＮＨＰの血中に残っているＡ１ＡＴタンパク質（すなわち、循環Ａ１ＡＴタンパク質）の割合（％）（すなわち、循環Ａ１ＡＴタンパク質）を示すグラフを提供する。

【図17B】１、３、または１０ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の単回皮下（ＳＣ）投与後の、ＮＨＰの血中に残っているＡ１ＡＴタンパク質（すなわち、循環Ａ１ＡＴタンパク質）の割合（％）を示すグラフを提供する。血清は、２９、５７、８５、及び１２７日目に収集した。対照血清（投与前に収集）を使用した。

【図18】０、３０、１００、または３００ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を繰り返し投与（４週間ごと、４回投与）した後のカニクイザルの循環Ａ１ＡＴタンパク質の濃度を示すグラフを示す。Ａ１ＡＴタンパク質は、若年または若い成体のサルでは８７日目に、若年サルでは１４１日目に測定された。対照血清（非処理）を使用した。

【図19】０、２０、６０、または１８０ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を繰り返し投与（４週間ごと、１０回投与）した後のカニクイザルの肝臓に残っているＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの割合（％）を示すグラフを提供する。「主要研究群」は、最終用量の投与の２日後に剖検されており、「Ｒ」は、対象をＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の最終投与から８週間後に剖検した回復時の剖検を表す。

【図20】ニックの入ったテトラループ構造の模式図を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0033】

長さが２５～３５ヌクレオチド鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤が、哺乳類細胞での標的遺伝子発現の効果的な阻害剤として記述されている（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００５／０２４４８５８号及びＵＳ２００５／０２７７６１０）。このような長さのｄｓＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路のＤｉｃｅｒ酵素によって処理されると考えられており、このような薬剤は「Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ」（「ＤｓｉＲＮＡ」）剤と呼ばれている。ＤｓｉＲＮＡ剤のさらなる修飾構造は、従来より記述されている（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００７／０２６５２２０号）。効果的なＤｉｃｅｒ基質の伸長形態についても、近年記述されている（例えば、Ｂｒｏｗｎ，米国特許第８，３４９，８０９号、米国特許第１０，３７０，６５５号、及びＵＳ２０１０／０１７３９７４）。本明細書で提供されるのは、α－１アンチトリプシンを標的とする改善された核酸剤である。α－１アンチトリプシンを標的とするものは、具体的に例示されている。

【0034】

いくつかの態様によると、本開示は、肝臓におけるα－１アンチトリプシンまたはＳＥＲＰＩＮＡ１発現を低減させるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、肝臓におけるα－１アンチトリプシン発現に関連する疾患を治療するように設計される。いくつかの点において、本開示は、細胞（例えば、肝細胞）または臓器（例えば、肝臓）におけるα－１アンチトリプシン発現を低減させることによって、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患を治療する方法を提供する。

【0035】

いくつかの態様において、本開示は、α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、及び３２、ならびに配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１に示される５’～３’配列をそれぞれ有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾を含む。いくつかの実施形態において、２’－修飾は、２’－フルオロまたは２’－Ｏ－メチルである。

【0036】

いくつかの態様において、本開示は、α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２６に示される５’～３’配列を含むアンチセンス鎖と、配列番号２５に示される５’～３’配列を含むセンス鎖とを有する。別の態様において、本開示は、α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２６に示される５’～３’配列を含むアンチセンス鎖と、配列番号１０５に示される５’～３’配列を含むセンス鎖とを有する。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾を含む。いくつかの実施形態において、２’－修飾は、２’－フルオロまたは２’－Ｏ－メチルである。

【0037】

いくつかの実施形態において、センス鎖は、５’～３’に番号付けられた３６ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５～３’に番号付けられた２２ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、センス鎖の１、２、４、６、７、１２、１４、１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、６、８、１１～１３、１５、１７、もしくは１９～２２位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の３、５、８～１１、１３、１５、もしくは１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２～５、７、９、１０、１４、１６、もしくは１８位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－フルオロで修飾される。

【0038】

特定の実施形態において、センス鎖の１、２、４、６、７、１２、１４、１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、３、５、８、１０～１２、１４、１５、１７、１９、もしくは２２位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の３、５、８～１１、１３、１５、もしくは１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２～４、６、７、９、１３、１６、１８、２０、もしくは２１位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－フルオロで修飾される。

【0039】

特定の実施形態において、センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、４、６、８、９、１１～１３、１５、１８、もしくは２０～２２位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、もしくは１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２、３、５、７、１０、１４、１６、１７、もしくは１９位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－フルオロで修飾される。

【0040】

特定の実施形態において、センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、４、６、８～１１、１３、１５、１７、１８、もしくは２０～２２位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、もしくは１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２、３、５、７、１２、１４、１６、もしくは１９位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－フルオロで修飾される。

【0041】

特定の追加の実施形態において、センス鎖の１～７、及び１２～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、６、８～１３、及び１５～２２位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の８～１１位、及び／またはアンチセンス鎖の２～５、７、及び１４位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－フルオロで修飾される。

【0042】

いくつかの実施形態において、センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、４、６、９、１１、１３、１５、１７、１８、もしくは２０～２２位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、及び１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２、３、５、７、８、１０、１２、１４、１６、及び１９位の位置にある１つ以上のヌクレオチドが、２’－フルオロで修飾される。

【0043】

特定の実施形態において、本開示は、α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、及び１０４、ならびに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、及び１０３から選択される配列をそれぞれ有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。

【0044】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

【0045】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有する。

【0046】

いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の第１の位置のウリジンはリン酸類似体を含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１位に以下の構造を有する。

【化7】

【0047】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２に示されるステムループを有するセンス鎖を含み、Ｓ１はＳ２に相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３～５ヌクレオチドのループを形成し、必要によってＬは、テトラループである。いくつかの実施形態において、テトラループは配列５’－ＧＡＡＡ－３’を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖上の－ＧＡＡＡ－配列の１つ以上のヌクレオチドが、一価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。

【0048】

上記の開示された実施形態のいずれかにおいて、－ＧＡＡＡ－配列は以下の構造を有する。

【化8】

式中、
Ｌは、置換及び非置換アルキレン、置換及び非置換アルケニレン、置換及び非置換アルキニレン、置換及び非置換ヘテロアルキレン、置換及び非置換ヘテロアルケニレン、置換及び非置換ヘテロアルキニレン、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、結合、クリックケミストリーハンドル、または長さが１～２０個の連続した共有結合原子を含むリンカーを表し、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮである。

【0049】

特定の実施形態において、Ｌはアセタールリンカーである。いくつかの実施形態において、Ｘは、Ｏである。

【0050】

一部の実施形態において、－ＧＡＡＡ－配列は、以下の構造を有する。

【化9】

【0051】

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド及びＮａ^＋対イオンを含む組成物を提供する。

【0052】

いくつかの態様において、本開示は、図２Ａに示される化学構造を有する組成物を提供する。

【0053】

いくつかの態様において、本開示は、Ａ１ＡＴの発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２６に示される配列を含むアンチセンス鎖と、配列番号１０５に示される配列を含むセンス鎖とを有し、

【0054】

センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及びアンチセンス鎖の１、４、６、８～１１、１３、１５、１７、１８もしくは２０～２２位の全ての位置が２’－Ｏ－メチルで修飾され、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、及び１７位、ならびにアンチセンス鎖の２、３、５、７、１２、１４、１６、及び１９位の全ての位置が２’－フルオロで修飾され、

【0055】

当該オリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有し、

【0056】

当該オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１位に以下の構造を含み、

【化10】

【0057】

センス鎖上の－ＧＡＡＡ－配列の各ヌクレオチドは、以下の構造を有する一価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている、オリゴヌクレオチドと、

【化11】

薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む組成物を提供する。

【0058】

別の態様において、本開示は、対象にオリゴヌクレオチドを送達する方法であって、本明細書に記載の組成物またはオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む方法を提供する。

【0059】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを送達して当該対象における肝疾患もしくは障害を治療または予防し、当該肝疾患もしくは障害は、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝線維症、及び肝細胞癌からなる群から選択される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。特定の例において、オリゴヌクレオチドまたは組成物は、対象に静脈内または皮下投与される。

【0060】

いくつかの態様において、本開示は、Ａ１ＡＴの発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２６に示される配列を含むアンチセンス鎖と、配列番号１０５に示される配列を含むセンス鎖とを有し、

【0061】

センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及びアンチセンス鎖の１、４、６、８～１１、１３、１５、１７、１８もしくは２０～２２位の全ての位置が２’－Ｏ－メチルで修飾され、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、及び１７位、ならびにアンチセンス鎖の２、３、５、７、１２、１４、１６、及び１９位の全ての位置が２’－フルオロで修飾され、

【0062】

当該オリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有し、

【0063】

当該オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１位に以下の構造を含み、

【化12】

【0064】

センス鎖上の－ＧＡＡＡ－配列の各ヌクレオチドは、以下の構造を有する一価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている、オリゴヌクレオチド。

【化13】

【0065】

別の態様において、本開示は、Ａ１ＡＴの発現を低減させるオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２６に示される配列を含むアンチセンス鎖と、配列番号１０５に示される配列を含むセンス鎖とを有し、

【0066】

センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、４、６、８、９、１１～１３、１５、１８、もしくは２０～２２位の全ての位置が２’－Ｏ－メチルで修飾され、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、もしくは１７位、ならびにアンチセンス鎖の２、３、５、７、１０、１４、１６、１７、もしくは１９位の全ての位置が２’－フルオロで修飾され、

【0067】

当該オリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有し、

【0068】

当該オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１位に以下の構造を含み

【化14】

センス鎖上の－ＧＡＡＡ－配列の各ヌクレオチドは、以下の構造を有する一価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている、オリゴヌクレオチド。

【化15】

【0069】

特定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、当該組成物はさらにＮａ^＋対イオンを含む。

【0070】

特定の実施形態において、本開示は、哺乳動物において標的α－１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現を低減させる方法であって、当該哺乳動物における標的α－１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現を低減させるのに十分な量で、本明細書に記載されたように投与することを含む当該方法を提供する。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１日につき、当該哺乳動物１キログラム当たり１マイクログラム～５ミリグラム、１キログラム当たり１００マイクログラム～０．５ミリグラム、１キログラム当たり０．００１～０．２５ミリグラム、１キログラム当たり０．０１～２０マイクログラム、１キログラム当たり０．０１～１０マイクログラム、１キログラム当たり０．１０～５マイクログラム、及び１キログラム当たり０．１～２．５マイクログラムからなる群から選択される投与量で投与される。

【0071】

いくつかの実施形態において、当該哺乳動物の組織では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを当該哺乳動物に投与してから少なくとも３日後、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％の量（％で表する）が減少する。いくつかの実施形態において、当該組織は肝臓組織である。

【0072】

特定の実施形態において、当該投与ステップは、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、注入、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣、局所、経口、及び吸入送達からなる群から選択される投与モードを含む。

【0073】

別の態様において、本開示は、対象の肝疾患もしくは障害を治療または予防する方法であって、当該対象における肝疾患もしくは障害を治療または予防するのに十分な量で本明細書に記載のオリゴヌクレオチドまたは組成物を当該対象に投与することを含み、肝疾患もしくは障害が、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝線維症、及び肝細胞癌からなる群から選択される、方法を提供する。特定の実施形態において、当該対象は、ヒトである。
α－１アンチトリプシン発現のオリゴヌクレオチド阻害剤
α－１アンチトリプシン標的配列

【0074】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを含む標的配列を標的とする。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、またはその一部、断片、もしくは鎖（例えば、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）は、α－１アンチトリプシン発現を阻害することで、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを含む標的配列に結合またはアニールする。

【0075】

いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、α－１アンチトリプシン発現をインビボで阻害する目的で、α－１アンチトリプシン標的配列を標的とする。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシン標的配列を標的とするオリゴヌクレオチドによるα－１アンチトリプシン発現の阻害量またはその程度は、オリゴヌクレオチドの効力と相関する。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシン標的配列を標的とするオリゴヌクレオチドによるα－アンチトリプシン発現の阻害量またはその程度は、当該オリゴヌクレオチドで治療される、α－アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象または患者における治療上の有効量またはその程度と相関する。

【0076】

複数の異なる種のｍＲＮＡを含む（例えば、ヒト、カニクイザル、マウス、及びラット、例えば、実施例２及び３を参照）、α－１アンチトリプシンをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列の検査を通じて、ならびにインビトロ及びインビボ試験の結果として（例えば、実施例２～８を参照）、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡの特定のヌクレオチド配列が、他のヌクレオチド配列よりもオリゴヌクレオチドに基づく阻害を受けやすく、したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの標的配列として有用であることを見出した。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）のセンス鎖は、α－１アンチトリプシン標的配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）のセンス鎖の一部または領域は、α－１アンチトリプシン標的配列を含む。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシン標的配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１のうちのいずれか１つの配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシン標的配列は、配列番号２５の配列を含むか、またはそれからなる。

【0077】

α－１アンチトリプシン標的配列
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、細胞中のα－１アンチトリプシンｍＲＮＡを標的とし、α－１アンチトリプシンの発現を阻害及び／または低減させる目的で、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡに相補性の領域（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡの標的配列内）を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、相補的な（ワトソンクリック）塩基対合によってα－１アンチトリプシン標的配列に結合またはアニールする相補性の領域を有するα－１アンチトリプシン標的配列（例えば、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）を有する。標的配列または相補性の領域は、一般的に、α－１アンチトリプシンの発現を阻害及び／または低減させる目的で、長さ及び塩基含有量がオリゴヌクレオチド（またはその鎖）のα－１アンチトリプシンｍＲＮＡへの結合またはアニーリングを可能にすることに好適である。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、長さが少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、または少なくとも約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、長さが約１２～約３０（例えば、１２～３０、１２～２２、１５～２５、１７～２１、１８～２７、１９～２７、または１５～３０）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、長さが約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、長さが１８ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、長さが１９のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、長さが２０のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、長さが２１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、長さが２２のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、長さが２３のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、長さが２４のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１のいずれか１つの配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、標的配列または相補性の領域は、長さが１８ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１のいずれか１つの配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、標的配列または相補性の領域は、長さが１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１のいずれか１つの配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、標的配列または相補性の領域は、長さが２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１のいずれか１つの配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、標的配列または相補性の領域は、長さが２１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１のいずれか１つの配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、標的配列または相補性の領域は、長さが２２ヌクレオチドである。

【0078】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、α－１アンチトリプシン標的配列に完全に相補的である標的配列または相補性の領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）を含む。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、α－１アンチトリプシン標的配列に部分的に相補的である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、α－１アンチトリプシンの配列に完全に相補的である標的配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、α－１アンチトリプシンの配列に部分的に相補的である標的配列または相補性の領域を含む。

【0079】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１のいずれか１つの配列に完全に相補的である標的配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２５に示される配列に完全に相補的である標的配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１のいずれか１つの配列に部分的に相補的である標的配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２５に示される配列に部分的に相補的である標的配列または相補性の領域を含む。

【0080】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続配列は、長さが約１２～約３０ヌクレオチド（例えば、長さが１２～３０、１２～２８、１２～２６、１２～２４、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１４～２２、１６～２０、１８～２０または１８～１９ヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続配列は、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続配列は、長さが１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続配列は、長さが２０ヌクレオチドである。

【0081】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、ヌクレオチドの連続配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、必要によってヌクレオチドの連続配列は、長さが１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの連続配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、ヌクレオチドの連続配列は、長さが１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの連続配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、ヌクレオチドの連続配列は、長さが２０ヌクレオチドである。

【0082】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）の標的配列または相補性の領域は、ヌクレオチドの連続配列に相補的であり、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、アンチセンス鎖の全長にまたがっている。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドの標的配列または相補性の領域は、ヌクレオチドの連続配列に相補的であり、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、アンチセンス鎖の全長の一部にまたがっている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１のいずれか１つに示される配列の１～２０ヌクレオチドにまたがる一続きの連続ヌクレオチドに少なくとも部分的に（例えば、完全に）相補的である（例えば、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖上の）相補性の領域を含む。

【0083】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、対応するα－１アンチトリプシン標的配列と１つ以上の塩基対（ｂｐ）ミスマッチを有する標的配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態において、標的配列または相補性の領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でα－１アンチトリプシンｍＲＮＡに結合またはアニールする標的配列または相補性の領域の能力、及び／またはα－１アンチトリプシン発現を阻害するオリゴヌクレオチドの能力が維持される場合、対応するα－１アンチトリプシン標的配列と、最大約１、最大約２、最大約３、最大約４、最大約５などのミスマッチを有し得る。あるいは、標的配列または相補性の領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でα－１アンチトリプシンｍＲＮＡに結合またはアニールする標的配列または相補性の領域の能力、及び／またはα－１アンチトリプシン発現を阻害するオリゴヌクレオチドの能力が維持される場合、対応するα－１アンチトリプシン標的配列と、１以下、２以下、３以下、４以下、または５以下のミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と１つのミスマッチを有する標的配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と２つのミスマッチを有する標的配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と３つのミスマッチを有する標的配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と４つのミスマッチを有する標的配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と５つのミスマッチを有する標的配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と、１つを超えるミスマッチ（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上のミスマッチ）を有する標的配列または相補性の領域を含み、少なくとも２つ（例えば、全て）のミスマッチが連続して配置されるか（例えば、２、３、４、５またはそれ以上の連続したミスマッチ）、またはミスマッチが標的配列または相補性の領域の全体に散在している。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と、１つを超えるミスマッチ（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上のミスマッチ）を有する標的配列または相補性の領域を含み、少なくとも２つ（例えば、全て）のミスマッチが連続して配置されるか（例えば、２、３、４、５またはそれ以上の連続したミスマッチ）、または少なくとも１つ以上のミスマッチしていない塩基対が、ミスマッチの間に位置するか、もしくはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの連続配列に相補的な標的配列または相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、標的配列または相補性の領域は、対応するα－１アンチトリプシン標的配列と、最大約１、最大約２、最大約３、最大約４、最大約５などのミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの連続配列に相補的な標的配列または相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、標的配列または相補性の領域は、対応するα－１アンチトリプシン標的配列と、１以下、２以下、３以下、４以下、または５以下のミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの連続配列に相補的な標的配列または相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、標的配列または相補性の領域は、対応するα－１アンチトリプシン標的配列と、最大約１、最大約２、最大約３、最大約４、最大約５などのミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの連続配列に相補的な標的配列または相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、標的配列または相補性の領域は、対応するα－１アンチトリプシン標的配列と、１以下、２以下、３以下、４以下、または５以下のミスマッチを有し得る。

【0084】

オリゴヌクレオチドの種類
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｍｉＲＮＡなどを含むが、これらに限定されない様々な種類及び／または構造のオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の方法においてα－１アンチトリプシンを標的とすることに有用である。α－１アンチトリプシン発現を阻害するために、本明細書またはその他に記載されているオリゴヌクレオチドの種類のいずれも、α－１アンチトリプシン標的配列を本明細書に組み込むフレームワークとして使用することが意図されている。

【0085】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ダイサー介入の上流または下流のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与することによって、α－１アンチトリプシン発現を阻害する。例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、各鎖が約１９～２５ヌクレオチドのサイズを有し、１～５ヌクレオチドの少なくとも１つの３’オーバーハングを有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号を参照）。ダイサーによって処理されて活性ＲＮＡｉ産物を生成する、より長いオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号を参照）。さらなる研究により、鎖のうちの１つが熱力学的に安定するテトラループ構造を含む構造を含む、少なくとも１つの鎖の少なくとも１つの末端が二重鎖標的領域を超えて伸長された伸長ｄｓＲＮＡが生成された（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号及び第８，９２７，７０５号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０３３２２５号を参照）。このような構造には、一本鎖（ｓｓ）伸長（分子の片側または両側）及び二本鎖（ｄｓ）伸長が含まれ得る。

【0086】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ダイサー介入（例えば、ダイサー切断）の下流でＲＮＡｉ経路に関与する。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、センス鎖の３’末端にオーバーハング（例えば、長さが１、２、または３ヌクレオチド）を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡに対してアンチセンスである２１ヌクレオチドのガイド鎖及び相補的なパッセンジャー鎖を含み、両方の鎖がアニールして１９ｂｐの二重鎖、及びいずれか一方または両方の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを形成する。２３ヌクレオチドのガイド鎖及び２１ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を含むオリゴヌクレオチドを含む、より長いオリゴヌクレオチド設計も可能であり、分子の右側に平滑末端（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）があり、かつ分子の左側に２ヌクレオチドの３’－ガイド鎖オーバーハング（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）がある。このような分子には、２１ｂｐの二重鎖領域がある。例えば、米国特許第９，０１２，１３８号及び第９，０１２，６２１号、ならびに第９，１９３，７５３号を参照されたい。

【0087】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、その両方の長さが約１７～３６（例えば、１７～３６、２０～２５、または２１～２３）ヌクレオチドの範囲にある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、その両方の長さが約１９～２２ヌクレオチドの範囲にある。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は等しい長さを有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか一方、またはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に３’－オーバーハングがある。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドがセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、両方とも長さが約２１～２３ヌクレオチドの範囲にある場合、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方上の３’オーバーハングは、長さが１または２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、２２ヌクレオチドのガイド鎖及び２０ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を含み、分子の右側に平滑末端（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）があり、かつ分子の左側に２ヌクレオチドの３’－ガイド鎖オーバーハング（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）がある。このような分子には、２０ｂｐの二重鎖領域がある。

【0088】

本明細書の組成物及び方法で使用する他のオリゴヌクレオチド設計には、１６量体ｓｉＲＮＡ（例えば、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＩＮ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＹ． Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（ｅｄ．），Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６を参照）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ以下のステムを有する、例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０） ＭＥＴＨＯＤＳ ＭＯＬ． ＢＩＯＬ． ６２９：１４１－１５８を参照）、平滑末端ｓｉＲＮＡ（例えば、長さ１９ｂｐｓ、例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ ＆ Ｂａｋｅｒ（２００６） ＲＮＡ １２：１６３－１７６を参照）、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ、例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００８） ＮＡＴ． ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ． ２６：１３７９－１３８２を参照）、非対称短二重鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９） ＭＯＬ． ＴＨＥＲ． １７：７２５－３２を参照）、フォークｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ（２００４） ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ． ５５７：１９３－１９８を参照）、ｓｓ ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ（２０１２） ＮＡＴ． ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ． ３０：１０６３）、ダンベル型の環状ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｊ． ＡＭ． ＣＨＥＭ． ＳＯＣ． １２９：１５１０８－０９を参照）、及び小さな内部セグメント干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７） ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ． ３５：５８８６－９７を参照）が含まれる。α－１アンチトリプシンの発現を低減または阻害するいくつかの実施形態で使用され得るオリゴヌクレオチド構造のさらなる非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び短鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２） ＥＭＢＯ Ｊ． ２１：４６７１－７９を参照し、米国特許出願公開第２００９／００９９１１５も参照されたい）。

【0089】

さらに、いくつかの実施形態において、本明細書におけるα－１アンチトリプシン発現を低減または阻害するオリゴヌクレオチドは一本鎖（ｓｓ）である。このような構造は、一本鎖ＲＮＡｉ分子を含むが、それに限定されない。最近の取り組みにより、ｓｓ ＲＮＡｉ分子の活性が実証されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６） ＭＯＬ． ＴＨＥＲ． ２４：９４６－５５を参照）。しかしながら、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に書かれた場合、特定の核酸の標的セグメントの逆相補体を含み、適切に修飾された（例えば、Ｇａｐｍｅｒ型）核酸塩基配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、細胞内でその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介切断を誘導するか、または（例えば、ｍｉｘｍｅｒ型）細胞内で標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。本明細書で使用するＡＳＯは、例えば、米国特許第９，５６７，５８７号に示されているものを含んで、当技術分野で知られている任意の適切な方法で修飾され得る（例えば、長さ、核酸塩基（ピリミジン及びプリン）の糖部分、及び核酸塩基の複素環部分の改変を含む）。さらに、ＡＳＯは、特定の標的遺伝子の発現を低減させるために何十年も使用されている（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＡＮＮＵ． ＲＥＶ．ＰＨＡＲＭＡＣＯＬ．５７：８１－１０５）。

【0090】

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡと相補性の領域を共有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１を標的とする。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５～５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５～２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが２２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも連続１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも連続１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも連続２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列とは、１、２、または３ヌクレオチドが異なる。

【0091】

二本鎖オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、本開示は、センス鎖（本明細書ではパッセンジャー鎖とも呼ばれる）及びアンチセンス鎖（本明細書ではガイド鎖とも呼ばれる）を含む、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを標的とし、（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）α－１アンチトリプシン発現を阻害する二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は別々の鎖であり、共有結合していない。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は共有結合している。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は二重鎖領域を形成し、センス鎖及びアンチセンス鎖、またはその一部は、互いに相補的な方法で（例えば、ワトソンクリック塩基対形成によって）結合する。

【0092】

いくつかの実施形態において、センス鎖は、第１の領域（Ｒ１）及び第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｒ２は、第１のサブ領域（Ｓ１）、テトラループ（Ｌ）もしくはトリループ（ｔｒｉＬ）、及び第２のサブ領域（Ｓ２）を含み、ＬまたはｔｒｉＬは、Ｓ１及びＳ２の間に位置し、Ｓ１及びＳ２は、第２の二重鎖（Ｄ２）を形成する。Ｄ２は、様々な長さを有してもよい。いくつかの実施形態において、Ｄ２は、長さが約１～６ｂｐである。いくつかの実施形態において、Ｄ２は、長さが２～６、３～６、４～６、５～６、１～５、２～５、３～５、または４～５ｂｐである。いくつかの実施形態において、Ｄ２は、長さが１、２、３、４、５、または６ｂｐである。いくつかの実施形態において、Ｄ２は、長さが６ｂｐである。

【0093】

いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖のＲ１は、第１の二重鎖（Ｄ１）を形成する。いくつかの実施形態において、Ｄ１は、長さが少なくとも約１５（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｄ１は、長さが約１２～３０ヌクレオチド（例えば、長さが１２～３０、１２～２７、１５～２２、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、または２１～３０ヌクレオチド）の範囲内である。いくつかの実施形態において、Ｄ１は、長さが少なくとも１２ヌクレオチド（例えば、長さが少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、Ｄ１は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｄ１は、長さが２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の全長にまたがっていない。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか、または両方の全長にまたがっている。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の全長にまたがっている。

【0094】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つの配列を含むセンス鎖と、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２から選択される相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含み、それらは、表１に示す。

【0095】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、以下から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
（ｅ）それぞれ配列番号９７及び９８
（ｆ）それぞれ配列番号９９及び１００
（ｇ）それぞれ配列番号１０１及び１０２
（ｈ）それぞれ配列番号１０３及び１０４

【0096】

いくつかの態様において、センス鎖は、配列番号３１の配列を有し、アンチセンス鎖は、配列番号３２の配列を含む。いくつかの態様において、センス鎖は、配列番号２５の配列を有し、アンチセンス鎖は、配列番号２６の配列を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、配列番号２５の配列を有し、アンチセンス鎖は、配列番号１０５の配列を含む。

【0097】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）または他の核酸の構造を説明する際に、配列表に示される配列を参照し得ることを理解されたい。そのような実施形態において、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、特定の配列と本質的に同一もしくは類似の相補的特性を保持しながら、当該特定の配列と比較したときに、１つ以上の代替ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ対応物またはＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ対応物）及び／または１つ以上の修飾ヌクレオチド及び／または１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合及び／または１つ以上の他の修飾を有し得る。

【0098】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、２５ヌクレオチドのセンス鎖及び２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ダイサー酵素によって作用されると、アンチセンス鎖が成熟ＲＩＳＣに組み込まれる。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２７ヌクレオチドよりも長い（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド）。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２５ヌクレオチドよりも長い（例えば、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１から選択されるヌクレオチド配列を有し、当該ヌクレオチド配列は、２７ヌクレオチドよりも長い（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド）。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１から選択されるヌクレオチド配列を有し、当該ヌクレオチド配列は、２５ヌクレオチドよりも長い（例えば、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）。

【0099】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、他の５’末端と比較したとき、熱力学的に不安定な１つの５’末端を有する。いくつかの実施形態において、センス鎖の３’末端に平滑末端を含み、アンチセンス鎖の３’末端に３’オーバーハングを含む非対称オリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖上の３’オーバーハングは、長さが約１～８ヌクレオチドである（例えば、長さが１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド）。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端に二つ（２）のヌクレオチドを含むオーバーハングを有する。ただし、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、長さが１～６のヌクレオチド、必要に応じて、長さが１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６ヌクレオチド、または１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドを含む３’－オーバーハングである。しかしながら、いくつかの実施形態において、当該オーバーハングは、長さが１～６のヌクレオチド、必要に応じて、長さが１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６ヌクレオチド、または１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドを含む５’－オーバーハングである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含み、当該オリゴヌクレオチドは、長さが１～６のヌクレオチドを含む５’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み、当該オリゴヌクレオチドは、長さが１～６のヌクレオチドを含む５’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを有し、当該オリゴヌクレオチドは、長さが１～６のヌクレオチドを含む５’－オーバーハングを含む。

【0100】

いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の二つ（２）の末端ヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の二つ（２）の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ）と相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の二つ（２）の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端の二つ（２）の末端ヌクレオチドは、不対である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端の二つ（２）の末端ヌクレオチドは、不対のＧＧを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端の二つ（２）の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに相補的ではない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの各３’末端の二つ（２）の末端ヌクレオチドはＧＧである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの各３’末端の１つまたは二つ（２）両方の末端ＧＧヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの連続配列に相補的な標的配列または相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１から選択され、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端の二つ（２）の末端ヌクレオチドは、不対のＧＧを含む。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端の二つ（２）の末端ヌクレオチドは、不対ＧＧを含む。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを有し、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端の二つ（２）の末端ヌクレオチドは、不対ＧＧを含む。

【0101】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を含むセンス鎖とアンチセンス鎖との間には、１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５）のミスマッチ（複数可）が存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に１つを超えるミスマッチが存在する場合、それらは連続して（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上連続して）配置されるか、または相補性の領域全体に散在し得る。いくつかの実施形態において、センス鎖の３’末端は、１つ以上のミスマッチを含む。いくつかの実施形態において、二つ（２）のミスマッチがセンス鎖の３’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端における塩基ミスマッチまたはセグメントの不安定化は、オリゴヌクレオチドの効力を改善または増加させる。

【0102】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
（ｅ）それぞれ配列番号９７及び９８
（ｆ）それぞれ配列番号９９及び１００
（ｇ）それぞれ配列番号１０１及び１０２
（ｈ）それぞれ配列番号１０３及び１０４

【0103】

当該センス鎖とアンチセンス鎖との間に１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５）のミスマッチ（複数可）が存在する。

【0104】

アンチセンス鎖
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）のアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれる。例えば、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に係合し、Ａｇｏ２などのアルゴノートタンパク質に結合して、または１つ以上の同様の因子に係合もしくは結合して、標的遺伝子のサイレンシングを導く場合、ガイド鎖と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ガイド鎖に対して相補性の領域を有するセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれる。

【0105】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、長さが最大で５０ヌクレオチド（例えば、長さが最大５０、最大４０、最大３５、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、または最大１２ヌクレオチド）であるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが、少なくとも約１２ヌクレオチド（例えば、長さが少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも３８ヌクレオチド）であるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが、約１２～約４０（例えば、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～２８、１７～２２、１７～２５、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０または３２～４０）ヌクレオチドの範囲にあるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１５～３０ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つのアンチセンス鎖は、長さが、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが２２ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。

【0106】

いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンを標的とする本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２のいずれか１つに示される配列の、少なくとも約１２（例えば、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３）連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンを標的とする本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２のいずれか１つに示される配列の、少なくとも約１２（例えば、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３）連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンを標的とする本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、または３２のいずれか１つに示される配列の、少なくとも約１２（例えば、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３）連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。

【0107】

センス鎖
いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを標的とし、α－１アンチトリプシン発現を阻害する本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに示されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに示される配列の、少なくとも約１２（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３）連続ヌクレオチドを含むセンス鎖を有する。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを標的とし、α－１アンチトリプシン発現を阻害する本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに示されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに示される配列の、少なくとも約１２（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３）連続ヌクレオチドを含むセンス鎖を有する。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを標的とし、α－１アンチトリプシン発現を阻害する本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに示されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに示される配列の、少なくとも約１２（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３）連続ヌクレオチドを含むセンス鎖を有する。

【0108】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、長さが最大で５０ヌクレオチド（例えば、長さが最大５０、最大４０、最大３６、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、または最大１２ヌクレオチド）であるセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、長さが、少なくとも約１２ヌクレオチド（例えば、長さが少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３６、または少なくとも３８ヌクレオチド）であるセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、長さが、約１２～約５０（例えば、１２～５０、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～２８、１７～２１、１７～２５、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０または３２～４０）ヌクレオチドの範囲にあるセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、長さが１５～５０ヌクレオチドのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、長さが１８～３６ヌクレオチドのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、長さが、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、長さが３６ヌクレオチドのセンス鎖を含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖の３’末端にステムループ構造を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループは、鎖内塩基対形成によって形成される。いくつかの実施形態において、センス鎖は、その５’末端にステムループ構造を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが２ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが３ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが４ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが５ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが６ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが７ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが８ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが９ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが１０ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが１１ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが１２ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが１３ヌクレオチドの二重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ステムループのステムは、長さが１４ヌクレオチドの二重鎖を含む。

【0110】

いくつかの実施形態において、ステムループは、分解（例えば、酵素分解）に対するオリゴヌクレオチド保護を提供し、標的細胞、組織、もしくは臓器（例えば、肝臓）への標的化及び／または送達を促進し、もしくはその両方である。例えば、いくつかの実施形態において、ステムループのループは、標的ｍＲＮＡ（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ）への標的化、標的遺伝子発現（例えば、α－１アンチトリプシン発現）の阻害、及び／または標的細胞、組織、もしくは臓器（例えば、肝臓）への送達、取り込み、及び／または浸透、またはそれらの組み合わせを促進、改善、または増加させる１つ以上の修飾を含むヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ステムループ自体またはステムループへの修飾（複数可）は、オリゴヌクレオチドの固有の遺伝子発現阻害活性に影響を与えないか、または実質的に影響を与えないが、標的細胞、組織、または臓器（例えば、肝臓）へのオリゴヌクレオチドの安定性（例えば、分解に対する保護を提供）及び／または送達、取り込み、及び／または浸透を促進、改善、または増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを（例えば、その３’末端に）含むセンス鎖を含み、Ｓ１はＳ２に相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に、長さが最大約１０ヌクレオチド（例えば、長さ３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド）の連結ヌクレオチドの一本鎖ループを形成する。いくつかの実施形態において、当該ループ（Ｌ）は、長さが３ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該ループ（Ｌ）は、長さが４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該ループ（Ｌ）は、長さが５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該ループ（Ｌ）は、長さが６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該ループ（Ｌ）は、長さが７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該ループ（Ｌ）は、長さが８ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該ループ（Ｌ）は、長さが９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、当該ループ（Ｌ）は、長さが１０ヌクレオチドである。

【0111】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、標的配列またはヌクレオチドの連続配列に相補的である相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、オリゴヌクレオチドは、（例えば、その３’末端に）Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを含むセンス鎖を含み、Ｓ１は、Ｓ２に相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に、長さが最大約１０ヌクレオチド（例えば、長さが３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド）の一本鎖ループを形成する。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、標的配列またはヌクレオチドの連続配列に相補的である相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択され、オリゴヌクレオチドは、（例えば、その３’末端に）Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを含むセンス鎖を含み、Ｓ１は、Ｓ２に相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に、長さが４ヌクレオチドの一本鎖ループを形成する。

【0112】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構造Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステムループのループ（Ｌ）は、トリループである。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの連続配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１、ならびにトリループから選択される。いくつかの実施形態において、トリループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、リガンド（例えば、送達リガンド）、及びそれらの組み合わせを含む。

【0113】

いくつかの実施形態において、上記に記載の構造Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステムループのループ（Ｌ）は、テトラループである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの連続配列に相補的である標的配列または相補性の領域を含み、標的領域または相補性の領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１、ならびにテトラループから選択される。いくつかの実施形態において、テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、リガンド（例えば、送達リガンド）、及びそれらの組み合わせを含む。

【0114】

二重鎖の長さ
いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが少なくとも約１２（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１２～３０ヌクレオチド（例えば、長さが１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１８～３０、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、１９～３０、または２１～３０ヌクレオチド）の範囲内である。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１３ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１８ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが２１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが２２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが２３ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが２４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが２６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが２７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが２８ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが２９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の全長にまたがっていない。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの全長にまたがっている。いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の全長にまたがっている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス及びアンチセンス鎖は、それぞれ配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、及び１０３、ならびに配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、及び１０４から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
（ｅ）それぞれ配列番号９７及び９８
（ｆ）それぞれ配列番号９９及び１００
（ｇ）それぞれ配列番号１０１及び１０２
（ｈ）それぞれ配列番号１０３及び１０４
当該センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１２～３０ヌクレオチド（例えば、長さが１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１８～３０、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、１９～３０、または２１～３０ヌクレオチド）の範囲内である。

【0115】

オリゴヌクレオチド末端
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、一方または両方の鎖の末端は平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、一方または両方の鎖の末端は、１つ以上のヌクレオチドを含むオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、オーバーハングを構成する１つ以上のヌクレオチドは、不対ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端は平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端は平滑末端を含む。

【0116】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、一方または両方の鎖の３’末端は、１つ以上のヌクレオチドを含む３’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、当該センス鎖は、１つ以上のヌクレオチドを含む３’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、当該アンチセンス鎖は、１つ以上のヌクレオチドを含む３’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、当該センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ以上のヌクレオチドを含む３’－オーバーハングを含む。

【0117】

いくつかの実施形態において、３’－オーバーハングは、長さが約一（１）～二十（２０）ヌクレオチド（例えば、長さが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０ヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが約一（１）～十九（１９）、一（１）～十八（１８）、一（１）～十七（１７）、一（１）～十六（１６）、一（１）～十五（１５）、一（１）～十四（１４）、一（１）～十三（１３）、一（１）～十二（１２）、一（１）～十一（１１）、一（１）～十（１０）、一（１）～九（９）、一（１）～八（８）、一（１）～七（７）、一（１）～六（６）、一（１）～五（５）、一（１）～四（４）、一（１）～三（３）、または約一（１）～二（２）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが一（１）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが二（２）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが三（３）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが四（４）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが五（５）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが六（６）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが七（７）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが八（８）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが九（９）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが十（１０）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが十一（１１）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが十二（１２）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが十三（１３）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが十四（１４）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが十五（１５）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが十六（１６）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが十七（１７）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが十八（１８）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが十九（１９）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが二十（２０）ヌクレオチドである。

【0118】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は３’オーバーハングを含み、オリゴヌクレオチドのセンス及びアンチセンス鎖は、それぞれ配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、及び１０３、ならびに配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、及び１０４から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0119】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は３’オーバーハングを含み、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
また、当該アンチセンス鎖は、長さが約一（１）～二十（２０）ヌクレオチド（例えば、長さが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０ヌクレオチド）である３’オーバーハングを含み、必要に応じて、３’オーバーハングは、長さが二（２）ヌクレオチドである。

【0120】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、一方または両方の鎖の５’末端は、１つ以上のヌクレオチドを含む５’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、当該センス鎖は、１つ以上のヌクレオチドを含む５’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、当該アンチセンス鎖は、１つ以上のヌクレオチドを含む５’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、当該センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ以上のヌクレオチドを含む５’－オーバーハングを含む。

【0121】

いくつかの実施形態において、５’－オーバーハングは、長さが約一（１）～二十（２０）ヌクレオチド（例えば、長さが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０ヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが約一（１）～十九（１９）、一（１）～十八（１８）、一（１）～十七（１７）、一（１）～十六（１６）、一（１）～十五（１５）、一（１）～十四（１４）、一（１）～十三（１３）、一（１）～十二（１２）、一（１）～十一（１１）、一（１）～十（１０）、一（１）～九（９）、一（１）～八（８）、一（１）～七（７）、一（１）～六（６）、一（１）～五（５）、一（１）～四（４）、一（１）～三（３）、または約一（１）～二（２）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが一（１）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが二（２）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが三（３）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが四（４）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが五（５）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが六（６）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが七（７）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが八（８）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが九（９）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが十（１０）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが十一（１１）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが十二（１２）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが十三（１３）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが十四（１４）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが十五（１５）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが十六（１６）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが十七（１７）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが十八（１８）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが十九（１９）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’オーバーハングは、長さが二十（２０）ヌクレオチドである。

【0122】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は５’オーバーハングを含み、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
また、当該アンチセンス鎖は、長さが約一（１）～二十（２０）ヌクレオチド（例えば、長さが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０ヌクレオチド）である５’オーバーハングを含み、必要に応じて、５’オーバーハングは、長さが二（２）ヌクレオチドである。

【0123】

いくつかの実施形態において、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端を含む１つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）のヌクレオチドが修飾されている。例えば、いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の１つまたは２つの末端ヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオチドが修飾されており、例えば、２’－修飾、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１つまたは２つの末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１つまたは２つのヌクレオチドは、標的と相補的ではない。

【0124】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖の３’末端は本明細書に記載のステムループを含み、アンチセンス鎖の３’末端は、本明細書に記載の３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、本明細書に記載のニックの入ったテトラループ構造を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖の３’末端は本明細書に記載のステムループを含み、ループは、本明細書に記載のテトラループであり、アンチセンス鎖の３’末端は、本明細書に記載の３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、長さが二（２）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングを含む二つ（２）のヌクレオチドは、両方ともグアニン（Ｇ）核酸塩基を含む。典型的には、アンチセンス鎖の３’オーバーハングを含むヌクレオチドの一方または両方が標的ｍＲＮＡと相補的ではない。例示的なオリゴヌクレオチド構造を図２０に提供する。

【0125】

オリゴヌクレオチド修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は修飾を含む。オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、特異性、安定性、送達性、生物学的利用能、ヌクレアーゼ分解耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布及び細胞内取り込み、ならびに治療もしくは研究用途に関連するその他の特徴を改善または制御するために、様々な方法で修飾され得る。

【0126】

いくつかの実施形態において、修飾は修飾糖である。いくつかの実施形態において、修飾は５’末端リン酸基である。いくつかの実施形態において、修飾は、修飾されたヌクレオチド間結合である。いくつかの実施形態において、修飾は修飾塩基である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾のいずれか１つまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖、５’末端リン酸基、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合、及び少なくとも１つの修飾塩基を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
当該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖、５’末端リン酸基、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合、及び少なくとも１つの修飾塩基を含む。

【0127】

オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）上の修飾の数及びそれらのヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を与える可能性がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）または類似の担体にコンジュゲートもしくは内包することにより、インビボで送達し得る。しかしながら、オリゴヌクレオチドがＬＮＰまたは類似の担体により保護されていない場合、そのヌクレオチドの少なくとも一部が修飾されていることが有利であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの全てまたは実質的に全てが修飾されている。いくつかの実施形態において、半分を超えるヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態において、半分未満のヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを含む全てのヌクレオチドの糖部分は、２’位で修飾される。修飾は、可逆的であってもよく、または不可逆的であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、酵素分解からの保護、インビボ投与後に所望の細胞を標的とする能力、及び／または熱力学的安定性）を引き起こすのに十分な数及びタイプの修飾ヌクレオチドを有する。

【0128】

糖修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は修飾糖を含む。いくつかの実施形態において、修飾糖（本明細書では糖類似体とも呼ばれる）は、例えば、１つ以上の修飾が、糖の２’、３’、４’、及び／または５’炭素位置に生じる修飾デオキシリボースまたはリボース部分を含む。また、いくつかの実施形態において、修飾糖は、ロックド核酸（「ＬＮＡ」、例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８） ＴＥＴＲＡＨＥＤＯＮ ５４：３６０７－３０を参照）、アンロックド核酸（「ＵＮＡ」、例えば、Ｓｎｅａｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３） ＭＯＬ． ＴＨＥＲ－ＮＵＣＬ． ＡＣＩＤＳ ２：ｅ１０３を参照）、及びブリッジ核酸（「ＢＮＡ」、例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ ＆ Ｏｂｉｋａ（２００２） ＣＨＥＭ ＣＯＭＭＵＮ．（ＣＡＭＢ） ２１：１６５３－５９を参照）に提示されているものなどの非天然代替炭素構造を含んでいてもよい。

【0129】

いくつかの実施形態において、糖のヌクレオチド修飾は、２’－修飾を含む。いくつかの実施形態において、２’－修飾は、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、または２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）であってもよい。いくつかの実施形態において、修飾は、２’－Ｆ、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥである。いくつかの実施形態において、糖の修飾は、糖環の１つ以上の炭素の修飾を含んでいてもよい糖環の修飾を含む。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の１’－炭素もしくは４’－炭素に連結されている糖の２’－酸素、またはエチレンもしくはメチレン架橋を介して１’－炭素もしくは４’－炭素に連結されている２’－酸素を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２’－炭素から３’－炭素の結合を欠如する非環式糖を有する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。

【0130】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、少なくとも約１修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、またはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、少なくとも約１修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、またはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、少なくとも約１修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、またはそれ以上）を含む。

【0131】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド（すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方）が修飾される。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾（例えば、２’－Ｆもしくは２’－ＯＭｅ、２’－ＭＯＥ、及び２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸酸）を含む。

【0132】

いくつかの実施形態において、本開示は、異なる修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、実施例及び配列表に示される修飾パターンを有するセンス鎖と、実施例及び配列表に示される修飾パターンを有するアンチセンス鎖とを含む。

【0133】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、２’－Ｆで修飾されたヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆ及び２’－ＯＭｅで修飾されたヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたヌクレオチドを有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆ及び２’－ＯＭｅで修飾されたヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。

【0134】

いくつかの実施形態において、センス鎖の８、９、１０、または１１位の１つ以上が、２’－Ｆ基で修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の３、８、９、１０、１２、１３、及び１７位の１つ以上が、２’－Ｆ基で修飾される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の２、３、４、５、７、１０、及び１４位の１つ以上が、２’－Ｆ基で修飾される。いくつかの実施形態において、２、３、４、５、７、８、１０、１４、１６、及び１９位の１つ以上が２’－Ｆ基で修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の１～７位及び１２～２０位のヌクレオチドのそれぞれの糖部分が２’－ＯＭｅで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の１～７位、１２～２７位、及び３１～３６位のヌクレオチドのそれぞれの糖部分が２’－ＯＭｅで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の６、９、１１～１３、１５、１７、１８、及び２０～２２位のヌクレオチドのそれぞれの糖部分が２’－ＯＭｅで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の１、２、４、６、７、１２、１４、１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、６、８、１１～１３、１５、１７、もしくは１９～２２位の位置にある１つ以上が、２’－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の３、５、８～１１、１３、１５、もしくは１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２～５、７、９、１０、１４、１６、もしくは１８位の位置にある１つ以上が２’－フルオロで修飾される。

【0135】

いくつかの実施形態において、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、及び１７位のヌクレオチドが２’－Ｆ基で修飾される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の２、３、５、７、１２、１４、１６、及び１９位のヌクレオチドが２’－Ｆ基で修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、及び３１～３６位のヌクレオチドが２’－ＯＭｅで修飾される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１、４、６、８～１１、１３、１５、１７、１８、及び２０～２２位のヌクレオチドが２’－ＯＭｅで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、及び３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、４、６、８～１１、１３、１５、１７、１８、及び２０～２２位の位置にあるヌクレオチドが、２’－Ｏ－Ｍｅで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の３、８、９、１０、１２、１３、及び１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２、３、５、７、１２、１４、１６、及び１９位の位置にあるヌクレオチドが、２’－フルオロで修飾される。

【0136】

いくつかの実施形態において、センス鎖の１～７、及び１２～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、６、８～１３、及び１５～２２位の位置にある１つ以上が、２’－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の８～１１位、及び／またはアンチセンス鎖の２～５、７、及び１４位の位置にある１つ以上が、２’－フルオロで修飾される。

【0137】

いくつかの実施形態において、センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、４、６、８～１１、１３、１５、１７、１８、もしくは２０～２２位の位置にある１つ以上が、２’－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、及び１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２、３、５、７、１２、１４、１６、及び１９位の位置にある１つ以上が、２’－フルオロで修飾される。

【0138】

いくつかの実施形態において、センス鎖の１、２、４～７、１１、１４～１６、１８～２６、もしくは３１～３６位、及び／またはアンチセンス鎖の１、４、６、８、９、１１～１３、１５、１８、もしくは２０～２２位の位置にある１つ以上が、２’－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態において、センス鎖の３、８～１０、１２、１３、もしくは１７位、及び／またはアンチセンス鎖の２、３、５、７、１０、１４、１６、１７、もしくは１９位の位置にある１つ以上が、２’－フルオロで修飾される。

【0139】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
当該センス鎖の３、８～１０、１２、１３、もしくは１７位の位置にある１つ以上が、２’－Ｆ基で修飾される。

【0140】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドに糖部分を有するアンチセンス鎖を含む。糖部分は、２’－Ｆで修飾されるか、または２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、及び２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）からなる群から選択される修飾のいずれかで修飾される。

【0141】

５’末端リン酸
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、当該アンチセンス鎖は５’末端リン酸を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの５’末端リン酸基は、Ａｇｏ２との相互作用を増強する。しかしながら、５’－リン酸基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼまたは他の酵素による分解に感受性である場合があり、インビボでのそれらの性能及び／または生物学的利用能が制限され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、そのような分解に耐性のある５’リン酸類似体を含む。いくつかの実施形態において、リン酸類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、もしくはマロニルホスホネート、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然５’－リン酸基の静電気的及び立体的特性を模倣する化学部分（「リン酸模倣体」）に付着されている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、及び３２から選択されるヌクレオチド配列をそれぞれ含む。

【0142】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
当該オリゴヌクレオチドは、５’末端リン酸を含み、必要に応じて、５’末端リン酸類似体を含む。

【0143】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、糖の４’－炭素位置にリン酸類似体を有する（「４’－リン酸類似体」と呼ばれる）。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０４５３１７号を参照されたい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’－リン酸類似体を含む。いくつかの実施形態において、リン酸類似体は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’－炭素）またはその類似体に結合しているオキシメチルホスホネートである。別の実施形態において、４’－リン酸類似体は、チオメチルホスホネートまたはアミノメチルホスホネートであり、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子は、糖部分の４’－炭素またはその類似体に結合している。いくつかの実施形態において、４’－リン酸類似体は、オキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態において、オキシメチルホスホネートは、式－Ｏ－ＣＨ_２－ＰＯ（ＯＨ_２）、－Ｏ－ＣＨ_２－ＰＯ（ＯＲ）_２、または－Ｏ－ＣＨ２－ＰＯＯＨ（Ｒ）で表され、Ｒは、独立に、Ｈ、ＣＨ_３、アルキル基、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＣＨ_２ＯＣＯＣ（ＣＨ_３）_３、ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、または保護基から選択される。いくつかの実施形態において、アルキル基はＣＨ_２ＣＨ_３である。より典型的には、Ｒは、独立に、Ｈ、ＣＨ_３、またはＣＨ_２ＣＨ_３から選択される。いくつかの実施形態において、ＲはＣＨ３である。いくつかの実施形態において、４’－リン酸類似体は、４’－オキシメチルホスホネートである。

【0144】

いくつかの実施形態において、４’－リン酸類似体は、４’－（メトキシホスホネートメチル）である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’－リン酸類似体を含むアンチセンス鎖を含み、５’末端ヌクレオチドは、以下の構造を含む。

【化16】

４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’Ｏ－メチルウリジンホスホロチオエート［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ］［ＭｅＭＯＰ］

【0145】

修飾ヌクレオチド間結合
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態において、リン酸修飾または置換によって、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも５）修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、約１～約１０（例えば、１～１０、２～８、４～６、３～１０、５～１０、１～５、１～３、または１～２）修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０修飾ヌクレオチド間結合を含む。

【0146】

修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオンアルキルホスホトリエステル結合、ホスホルアミダイト結合、ホスホネート結合、またはボラノホスフェート結合であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

【0147】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位の１つ以上の位置の間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
当該オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合を含む。

【0148】

塩基修飾
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に結合する。いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は窒素塩基である。いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２７４４６２号を参照されたい。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドはユニバーサル塩基を含む。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは核酸塩基を含まない（脱塩基）。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
当該オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。

【0149】

いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチドのヌクレオチド糖部分の１’位に、または二重鎖に存在する場合は、二重鎖の構造を実質的に変更することなく１つよりも多くのタイプの塩基の反対側に位置していることができるヌクレオチド糖部分置換の等価位置に位置するヘテロ環部分である。いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、標的核酸（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ）と完全に相補的な参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、相補的な核酸とで形成される二重鎖よりも低いＴ_ｍを有する標的核酸との二重鎖を形成する。いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ユニバーサル塩基が単一のミスマッチを生成する塩基と置換されている参照一本鎖核酸と比較して、ミスマッチ塩基を含む核酸とで形成される二重鎖よりも高いＴ_ｍを有する標的核酸との二重鎖を形成する。

【0150】

ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１－β－Ｄ－リボフラノシル－５－ニトロインドール、及び／または１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－ニトロピロールが挙げられるが、これらに限定されない（米国特許出願公開第２００７／０２５４３６２号、Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５） ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ． ２３：４３６３－４３７０、Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５） ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ． ２３：２３６１－６６、及びＬｏａｋｅｓ ＆ Ｂｒｏｗｎ（１９９４） ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ． ２２：４０３９－４３を参照）。

【0151】

標的指向性リガンド
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を、１つ以上の細胞もしくは細胞タイプ、組織、臓器、または解剖学的領域もしくは区画に標的化することが望ましい。このような戦略は、オリゴヌクレオチドもしくはその効果（例えば、α－１アンチトリプシン発現の阻害または減少）から利益を得ない細胞、組織、臓器、または解剖学的領域もしくは区画への、望ましくない影響及び／またはオリゴヌクレオチドの過度の損失を避けるのに役立ち得る。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、特定の細胞もしくは細胞タイプ、組織、臓器、または解剖学的領域もしくは区画への標的化及び／または送達の促進のために（肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするために）修飾される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的指向性リガンド（複数可）にコンジュゲートされた少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
当該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドにコンジュゲートされた標的指向性リガンドを含む。

【0152】

いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質の一部（例えば、抗体もしくは抗体断片）、または脂質を含む。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分を含む炭水化物である。

【0153】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または６）のヌクレオチドは、それぞれ別の標的指向性リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの２～４ヌクレオチドがそれぞれ別の標的指向性リガンドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、標的指向性リガンドが歯ブラシの毛のようであり、オリゴヌクレオチドが歯ブラシのようであるように、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの末端で２～４ヌクレオチドにコンジュゲートされる（例えば、標的指向性リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’もしくは３’末端の２～４ヌクレオチドのオーバーハングまたは伸長にコンジュゲートされる）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端または３’末端のいずれかにステムループを含み得、ステムのループの１、２、３、または４ヌクレオチドは、標的指向性リガンドに個別にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、本開示によって提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖の３’末端にステムループを含み、ステムループのループは、トリループまたはテトラループを含み、トリループまたはテトラループを含む３または４ヌクレオチドは、それぞれ標的指向性リガンドに個別にコンジュゲートされる。

【0154】

ＧａｌＮＡｃは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）の高親和性炭水化物リガンドであり、主に肝実質細胞の表面に発現し、末端ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ残基（アシアロ糖タンパク質）を含む循環糖タンパク質の結合、内在化、及びその後の除去に主要な役割を果たす。本開示のオリゴヌクレオチドへのＧａｌＮＡｃ部分のコンジュゲーション（間接的または直接的のいずれか）を用いて、これらのオリゴヌクレオチドを細胞上に発現するＡＳＧＰＲに標的化することができる。いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、少なくとも１つ以上のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされ、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチドをヒト肝細胞（例えば、ヒト肝実質細胞）上に発現するＡＳＧＰＲに標的化する。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチドを肝臓に標的化する。

【0155】

いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、一価のＧａｌＮＡｃ部分に直接的または間接的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つを超える一価のＧａｌＮＡｃに直接的にまたは間接的にコンジュゲートされている（すなわち、２つ、３つ、または４つの一価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされており、典型的に３つまたは４つの一価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている）。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の二価のＧａｌＮＡｃ、三価のＧａｌＮＡｃ、または四価のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされる。

【0156】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）の一つ（１）以上（例えば、１、２、３、４、５、または６）のヌクレオチドが、それぞれＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、テトラループの二つ（２）～四つ（４）のヌクレオチドが、それぞれ別個のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、トリループの一つ（１）～三つ（３）のヌクレオチド、それぞれ別個のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分が歯ブラシの毛のようであり、オリゴヌクレオチドが歯ブラシのようであるように、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの末端で二つ（２）～四つ（４）のヌクレオチドにコンジュゲートされる（例えば、リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’もしくは３’末端の二つ（２）～四つ（４）のヌクレオチドのオーバーハングまたは伸長にコンジュゲートされる）。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされる。例えば、三つ（３）または四つ（４）のＧａｌＮＡｃ部分をセンス鎖のテトラループ内のヌクレオチドにコンジュゲートさせることができ、各ＧａｌＮＡｃ部分は一つ（１）のヌクレオチドにコンジュゲートされる。

【0157】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、テトラループを含み、当該テトラループ（Ｌ）は、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）ヌクレオチドの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、テトラループ（Ｌ）は、以下に示すように、本明細書に記載の任意のリンカーを介してテトラループの任意の１つ以上のグアニン（Ｇ）ヌクレオチドに結合した一価のＧａｌＮＡｃ部分を含む（Ｘ＝ヘテロ原子）。

【化17】

【0158】

いくつかの実施形態において、テトラループ（Ｌ）は、以下に示すように、本明細書に記載の任意のリンカーを介してテトラループの任意の１つ以上のアデニンヌクレオチドに結合した一価のＧａｌＮＡｃを有する（Ｘ＝ヘテロ原子）。

【化18】

【0159】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、以下に示すように、［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－グアニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、グアニン（Ｇ）ヌクレオチドに結合された一価のＧａｌＮＡｃ部分を含む。

【化19】

【0160】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、以下に示すように、［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、アデニンヌクレオチドに結合された一価のＧａｌＮＡｃ部分を含む。

【化20】

【0161】

そのような結合の例を、５’から３’方向にヌクレオチド配列ＧＡＡＡを含むループについて下記に示す（Ｌ＝リンカー、Ｘ＝ヘテロ原子）。このようなループは、例えば、図２０に示される、本明細書で提供されるセンス鎖の２７～３０位に存在し得る。化学式中、

【化21】

はオリゴヌクレオチド鎖への結合点を表すために用いられている。

【化22】

【0162】

適当な方法または化学的手法（例えば、クリックケミストリー）を用いて標的指向性リガンドをヌクレオチドに連結することができる。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、クリックリンカーを使用して本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を含むヌクレオチドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、アセタールベースのリンカーを用いて標的指向性リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドにコンジュゲートする。アセタールベースのリンカーは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／１００４０１号に開示される。いくつかの実施形態において、リンカーは、不安定なリンカーである。しかしながら、別の実施形態において、リンカーは安定している。ＧａｌＮＡｃ部分がアセタールリンカーを使用してループのヌクレオチドに結合されている、５’から３’方向にヌクレオチドＧＡＡＡを含むループの例を以下に示す。このようなループは、例えば、図２０に示されるセンス鎖のいずれか１つの２７～３０位に存在し得る。化学式中、

【化23】

は、オリゴヌクレオチド鎖への結合点である。

【0163】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、テトラループを有するセンス鎖を含み、四つ（４）のＧａｌＮＡｃ部分がテトラループを含むヌクレオチドにコンジュゲートされ、各ＧａｌＮＡｃ部分は、一つ（１）のヌクレオチドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチドを含むテトラループを有するセンス鎖を含み、テトラループは以下の構造を含む。

【化24】

【0164】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、テトラループを有するセンス鎖を含み、三つ（３）のＧａｌＮＡｃ部分がテトラループを含むヌクレオチドにコンジュゲートされ、各ＧａｌＮＡｃ部分は、一つ（１）のヌクレオチドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチドを含むテトラループを有するセンス鎖を含み、テトラループは以下の構造を含む。

【化25】

【0165】

上述したように、様々な適切な方法または化学合成技術（例えば、クリックケミストリー）を用いて、標的指向性リガンドをヌクレオチドに連結させることができる。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、アセタールベースのリンカーを用いて標的指向性リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドにコンジュゲートする。アセタールベースのリンカーは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／１００４０１号に開示される。いくつかの実施形態において、リンカーは、不安定なリンカーである。しかしながら、別の実施形態において、リンカーは安定したリンカーである。

【0166】

いくつかの実施形態において、二重鎖伸長部分（例えば、長さが最大ｂｐ３、４、５、または６）が、標的指向性リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）とオリゴヌクレオチドとの間に提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、それにコンジュゲートされたＧａｌＮＡｃを有さない。

【0167】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号２５及び２６
（ｂ）それぞれ配列番号２７及び２８
（ｃ）それぞれ配列番号２９及び３０
（ｄ）それぞれ配列番号３１及び３２
当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を含む。

【0168】

α－１アンチトリプシン発現を低減させるための例示的なオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本開示は、α－１アンチトリプシン発現を低減させるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を提供し、当該オリゴヌクレオチドは、以下に示すセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。
センス鎖：５’－［ｍＡｓ］［ｍＡ］［ｆＡ］［ｍＣ］［ｍＣ］［ｍＣ］［ｍＵ］［ｆＵ］［ｆＵ］［ｆＧ］［ｍＵ］［ｆＣ］［ｆＵ］［ｍＵ］［ｍＣ］［ｍＵ］［ｆＵ］［ｍＡ］［ｍＡ］［ｍＡ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＡ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＣ］［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ｍＧ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＵ］［ｍＧ］［ｍＣ］－３’（配列番号：１０１）、
以下にハイブリダイズされる：
アンチセンス鎖：５’［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ］［ｆＵｓ］［ｆＵｓ］［ｍＡ］［ｆＡ］［ｍＧ］［ｆＡ］［ｍＡ］［ｍＧ］［ｍＡ］［ｍＣ］［ｆＡ］［ｍＡ］［ｆＡ］［ｍＧ］［ｆＧ］［ｍＧ］［ｍＵ］［ｆＵ］［ｍＵｓ］［ｍＧｓ］［ｍＧ］－３’（配列番号：１０４）、
ここで、ｍＸ＝２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、ｆＸ＝２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、－Ｓ－＝ホスホロチオエート結合、－＝ホスホジエステル結合、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］＝５’－メトキシホスホネート－４－オキシ修飾ヌクレオチド、及びａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ＝アデニンヌクレオチドに結合したＧａｌＮＡｃ、ならびにａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ＝グアニンヌクレオチドに結合したＧａｌＮＡｃ。

【0169】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、以下から選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ａ）それぞれ配列番号３３及び３４
（ｂ）それぞれ配列番号３５及び３６
（ｃ）それぞれ配列番号３７及び３８
（ｄ）それぞれ配列番号３９及び４０
（ｅ）それぞれ配列番号４１及び４２
（ｆ）それぞれ配列番号４３及び４４
（ｇ）それぞれ配列番号４５及び４６
（ｈ）それぞれ配列番号４７及び４８
（ｉ）それぞれ配列番号４９及び５０
（ｊ）それぞれ配列番号５１及び５２
（ｋ）それぞれ配列番号５３及び５４
（ｌ）それぞれ配列番号５５及び５６
（ｍ）それぞれ配列番号５７及び５８
（ｎ）それぞれ配列番号５９及び６０
（ｏ）それぞれ配列番号６１及び６２
（ｐ）それぞれ配列番号６３及び６４
（ｑ）それぞれ配列番号６５及び６６
（ｒ）それぞれ配列番号６７及び６８
（ｓ）それぞれ配列番号６９及び７０
（ｔ）それぞれ配列番号７１及び７２
（ｕ）それぞれ配列番号７３及び７４
（ｖ）それぞれ配列番号７５及び７６
（ｗ）それぞれ配列番号７７及び７８
（ｘ）それぞれ配列番号７９及び８０
（ｙ）それぞれ配列番号８１及び８２
（ｚ）それぞれ配列番号８３及び８４
（ａａ）それぞれ配列番号８５及び８６
（ｂｂ）それぞれ配列番号８７及び８８
（ｃｃ）それぞれ配列番号８９及び９０
（ｄｄ）それぞれ配列番号９１及び９２
（ｅｅ）それぞれ配列番号９３及び９４
（ｆｆ）それぞれ配列番号９５及び９６
（ｇｇ）それぞれ配列番号９７及び９８
（ｈｈ）それぞれ配列番号９９及び１００
（ｉｉ）それぞれ配列番号１０１及び１０２
（ｊｊ）それぞれ配列番号１０３及び１０４

【0170】

いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１０３のヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１０４のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドを提供する。

【0171】

いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１０３のヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１０４のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）であって、以下の構造を有するコンジュゲート形態である、当該オリゴヌクレオチドを提供する。

【化26-1】

【化26-2】

【0172】

製剤
オリゴヌクレオチドの使用のための種々の製剤（例えば、医薬製剤）が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、分解を最小限に抑え、送達及び／または取り込みを促進し、または製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を与える製剤を使用して対象または細胞環境に送達することができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を含む本明細書に記載の組成物は、α－１アンチトリプシンの発現を低減させる。そのような組成物は、対象の標的細胞の近接環境または全身のいずれかへと投与されると、オリゴヌクレトチドの十分な部分が細胞内に進入し、α－１アンチトリプシンの発現を低減するように、好適に製剤化することができる。様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤のいずれかを使用して、本明細書で開示されるα－１アンチトリプシンを低減させるオリゴヌクレオチドを送達することができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドなどの緩衝溶液で製剤化されている。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドはいずれも、核酸としてだけでなく、薬学的に許容される塩の形態で提供されてもよい。

【0173】

カチオン性脂質を用いたオリゴヌクレオチドの製剤を使用して、細胞内へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを容易にすることができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリジン）などのカチオン性脂質を使用することができる。好適な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、またはＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられ、これらはいずれも製造元の指示に従って使用することができる。

【0174】

したがって、いくつかの実施形態において、製剤は脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、もしくはナノ粒子を含むか、またはそれを必要とする対象の細胞、組織、臓器、もしくは体内への投与用に別様に製剤化してもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１３を参照）。

【0175】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の製剤は、賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、賦形剤は、組成物に、安定性の向上、吸収の向上、溶解度の向上、及び／または活性成分の治療上の増強を付与する。いくつかの実施形態において、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、もしくは水酸化ナトリウム）または媒体（例えば、緩衝溶液、ペトロラタム、ジメチルスルホキシド、もしくは鉱油）である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、その貯蔵寿命を延長するために凍結乾燥され、その後、使用（例えば、対象への投与）前に溶液化される。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つを含む組成物中の賦形剤は、凍結乾燥保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、もしくはポリビニルピロリドン）または崩壊温度調節剤（例えば、デキストラン、フィコール（商標）、もしくはゼラチン）であってもよい。

【0176】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、その意図されている投与経路と適合するように製剤化されている。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸内投与が挙げられる。

【0177】

注射使用に好適な医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性である）または無菌注射溶液もしくは分散剤の即時調製用の分散物及び無菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）及びそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。多くの場合、組成物には、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムが含まれていることが好ましいだろう。無菌注射溶液は、必要量のオリゴヌクレオチドを、上記に列挙されている成分の１つまたは組み合わせを有する選択された溶媒に組み込み、必要に応じて、その後ろ過滅菌することにより調製することができる。

【0178】

いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多くの治療剤（例えば、α－１アンチトリプシンの発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を含んでいてもよいが、活性成分（複数可）のパーセンテージは、全組成物の重量または体積の約１％～約８０％またはそれよりも多くてもよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命などの要因、ならびに他の薬学的考慮項目が、そのような医薬品製剤を調製する当業者により企図されるだろう。したがって、様々な投薬量及び治療レジメンが妥当であり得る。

【0179】

使用方法
α－１アンチトリプシン発現の低減
いくつかの実施形態において、本開示は、α－１アンチトリプシン発現を低減する有効量の本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を細胞もしくは細胞集団に接触または送達するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシン発現の低減は、細胞におけるα－１アンチトリプシンｍＲＮＡ、α－１アンチトリプシンタンパク質、またはα－１アンチトリプシン活性の量またはレベルの低減を測定することによって決定される。これらの方法は、本明細書に記載され、当業者に知られているものを含む。

【0180】

本明細書で提供される方法は、任意の適切な細胞タイプに有用である。いくつかの実施形態において、細胞は、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを発現する任意の細胞（例えば、肝実質細胞）である。いくつかの実施形態において、細胞は、対象から得られた初代細胞である。いくつかの実施形態において、初代細胞は、細胞が天然表現型特性を実質的に維持するように継代の回数が限定されている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は、エクスビボまたはインビトロである（すなわち、培養中の細胞に、または細胞が存在する生物に送達することができる）。

【0181】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、オリゴヌクレオチドを含む溶液を注射すること、オリゴヌクレオチドで覆われている粒子で衝撃すること、オリゴヌクレオチドを含む溶液に細胞もしくは細胞集団を露出させること、またはオリゴヌクレオチドの存在下で細胞膜をエレクトロポレーションすることを含むが、これらに限定されない当業者に知られている核酸送達法を使用して、細胞もしくは細胞集団に送達される。脂質媒介性担体輸送、化学媒介性輸送、及びリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどの、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための当業者に知られている他の方法を使用してもよい。

【0182】

いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンの発現の低減は、α－１アンチトリプシンの発現に関連する細胞もしくは細胞集団の１つ以上の分子、特性、または特徴を評価するアッセイまたは技術によって、または細胞もしくは細胞集団内のα－１アンチトリプシンの発現を直接的に示す分子（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡまたはα－１アンチトリプシンタンパク質）を評価するアッセイまたは技術によって決定される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドが、α－１アンチトリプシンの発現を低減する程度は、オリゴヌクレオチドと接触した細胞もしくは細胞集団におけるα－１アンチトリプシンの発現と、適切な対照（例えば、オリゴヌクレオチドと接触していない適切な細胞もしくは細胞集団、または対照オリゴヌクレオチドと接触した適切な細胞もしくは細胞集団）とを比較することによって評価される。いくつかの実施形態において、対照細胞もしくは細胞集団におけるα－１アンチトリプシンの発現の対照量もしくはレベルは、その対照量もしくはレベルをアッセイまたは技術を行うごとに測定しなくてもよいように、予め定められる。所定のレベルまたは値は、様々な形態をとることができる。いくつかの実施形態において、所定のレベルまたは値は、中央値または平均などの、単一のカットオフ値であり得る。

【0183】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を細胞もしくは細胞集団に接触または送達すると、オリゴヌクレオチドと接触していないかまたは対照オリゴヌクレオチドと接触した細胞もしくは細胞集団におけるα－１アンチトリプシンの発現が減少する。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンの発現の低減は、α－１アンチトリプシンの発現の対照量もしくはレベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンの発現の対照量もしくはレベルは、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ及び／または本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞もしくは細胞集団中のα－１アンチトリプシンタンパク質の量もしくはレベルである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法による細胞もしくは細胞集団に本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを送達する効果は、任意の有限期間または時間（例えば、分、時間、日、週、月）の後に評価される。例えば、いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンの発現は、オリゴヌクレオチドを細胞もしくは細胞集団に接触または送達してから、少なくとも約４時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、または少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約２１日、約２８日、約３５日、約４２日、約４９日、約５６日、約６３日、約７０日、約７７日、または約８４日以上の時間が経過した後の細胞もしくは細胞集団で決定する。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンの発現は、オリゴヌクレオチドを細胞もしくは細胞集団に接触または送達してから、少なくとも約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、または約６ヶ月以上の時間が経過した後の細胞もしくは細胞集団で決定する。

【0184】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む鎖（例えば、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖）を細胞内で発現するように操作された導入遺伝子の形態で送達される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される任意のオリゴヌクレオチドを発現するように操作された導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、もしくは単純ヘルペスウイルス）または非ウイルスベクター（例えば、プラスミドもしくは合成ｍＲＮＡ）を使用して送達され得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、対象に直接注入することができる。

【0185】

治療方法
本開示は、α－１アンチトリプシンの発現に関連する疾患、障害、及び状態の治療方法で使用する医薬品として使用されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を提供する。また、本開示は、α－１アンチトリプシン発現を低減させることから利益を得る対象（例えば、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態を有するヒト）を治療するため、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの点において、本開示は、α－１アンチトリプシンの発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するため、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドを提供する。また、本開示は、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態を治療するための医薬品もしくは医薬組成物の製造に、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドは、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを標的とし、（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）α－１アンチトリプシン発現を低減する。いくつかの実施形態において、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドは、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを標的とし、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ、α－１アンチトリプシンタンパク質、及び／またはα－１アンチトリプシン活性の量もしくはレベルを低減させる。

【0186】

さらに、本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態を有するか、またはこれらの素因がある対象は、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を用いて治療のために選択される。いくつかの実施形態において、当該方法は、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ、α－１アンチトリプシンタンパク質、またはそれらの組み合わせなど、α－１アンチトリプシン発現に関連するか、またはその素因がある疾患、障害、または状態のマーカー（例えば、バイオマーカー）を有する個体を選択することを含むが、これらに限定されない。同様に、以下に詳述するように、本開示で提供される方法のいくつかの実施形態は、α－１アンチトリプシン発現のマーカー（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ）のベースライン値を測定または取得するなどのステップと、その後、そのように取得した値を１つ以上の他のベースライン値またはオリゴヌクレオチドを投与した後に得られる値と比較し、治療の有効性を評価するステップとを含み得る。

【0187】

本開示は、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドを用いて、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態を有するか、有することが疑われるか、または発症する危険性がある対象を治療する方法も提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを用いて、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態の発症もしくは進行を治療もしくは減弱する方法を提供する。別の態様において、本開示は、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドを用いて、α－１ンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象が１つ以上の治療的利益を受ける方法を提供する。本明細書の方法のいくつかの実施形態において、対象は、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つ以上を治療有効量で投与することによって治療される。いくつかの実施形態において、治療は、α－１アンチトリプシンの発現を低減させることを含む。いくつかの実施形態において、対象は治療的に処置を受ける。いくつかの実施形態において、対象は予防的に処置を受ける。

【0188】

いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態を有する患者は、少なくとも１つの突然変異対立遺伝子を含む。突然変異対立遺伝子は遺伝するため、患者はα－１アンチトリプシンをコードする突然変異対立遺伝子の１つまたは２つのコピーを有し得る。Ｍ遺伝子／対立遺伝子は、α－１アンチトリプシン遺伝子の最も一般的な対立遺伝子であり、正常レベルのα－１アンチトリプシンタンパク質を産生する。Ｚ遺伝子／対立遺伝子は、遺伝子の最も一般的なバリアントであり、α－１アンチトリプシン欠損症を引き起こす。いくつかの実施形態において、Ｚ対立遺伝子は、Ｅ３４２Ｋ変異の存在によるものである。Ｓ遺伝子／対立遺伝子は、α－１アンチトリプシン欠損症を引き起こすあまり一般的ではない別のバリアントである。いくつかの実施形態において、Ｓ対立遺伝子は、Ｅ２６４Ｖ変異の存在によるものである。

【0189】

いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態は、Ｚ対立遺伝子の１つのコピー及びＭ対立遺伝子の１つのコピーの存在によるものである（すなわち、ＰｉＭＺ患者と呼ばれるＺ対立遺伝子ヘテロ接合体）。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態は、Ｚ対立遺伝子の２つのコピーの存在によるものである（すなわち、ＰｉＺＺ患者と呼ばれるＺ対立遺伝子ホモ接合体）。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態は、Ｓ対立遺伝子の１つのコピー及びＭ対立遺伝子の１つのコピーの存在によるものである（すなわち、ＰｉＳＺ患者と呼ばれるＳ対立遺伝子ヘテロ接合体）。

【0190】

本明細書の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、または１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与し、当該対象においてα－１アンチトリプシンの発現が減少し、それによって当該対象が治療される。いくつかの実施形態において、対象におけるα－１アンチトリプシンｍＲＮＡの量またはレベルが低減する。いくつかの実施形態において、対象におけるα－１アンチトリプシンタンパク質の量またはレベルが低減する。いくつかの実施形態において、対象におけるα－１アンチトリプシン活性の量またはレベルが低減する。

【0191】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、または当該オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、１つ以上のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のα－１アンチトリプシン発現に比べ、α－１アンチトリプシンに関連する疾患、障害、または状態を有する対象のα－１アンチトリプシンの発現が、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超減少するように、当該対象に投与される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象、または対照オリゴヌクレオチドもしくは複数の対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物もしくは治療を受けた対象（例えば、参照もしくは対照対象）におけるα－１アンチトリプシン発現に比べ、対象のα－１アンチトリプシン発現が、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超減少する。

【0192】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、または当該オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、当該オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のα－１アンチトリプシンｍＲＮＡの量もしくはレベルに比べ、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象のα－１アンチトリプシンｍＲＮＡの量もしくはレベルが、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超減少するように、当該対象に投与される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象、または対照オリゴヌクレオチドもしくは複数の対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物もしくは治療を受けた対象（例えば、参照もしくは対照対象）におけるα－１アンチトリプシンｍＲＮＡの量もしくはレベルに比べ、対象のα－１アンチトリプシンｍＲＮＡの量もしくはレベルが、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超減少する。

【0193】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド、または当該オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、当該オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のα－１アンチトリプシンタンパク質の量もしくはレベルに比べ、α－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象のα－１アンチトリプシンタンパク質の量もしくはレベルが、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超減少するように、当該対象に投与される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象、または対照オリゴヌクレオチド、複数の対照オリゴヌクレオチド、または医薬組成物もしくは治療を受けた対象（例えば、参照もしくは対照対象）におけるα－１アンチトリプシンタンパク質の量もしくはレベルに比べ、対象のα－１アンチトリプシンタンパク質の量もしくはレベルが、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超減少する。

【0194】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、または当該オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、当該オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のα－１アンチトリプシン活性の量もしくはレベルに比べ、α－１アンチトリプシンに関連する疾患、障害、または状態を有する対象のα－１アンチトリプシン活性／発現の量もしくはレベルが、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超減少するように、当該対象に投与される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を受けていない対象、または対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物もしくは治療を受けた対象（例えば、参照もしくは対照対象）におけるα－１アンチトリプシン活性の量もしくはレベルに比べ、対象のα－１アンチトリプシン活性の量もしくはレベルが、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超減少する。

【0195】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、または当該オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を、投与前のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルに比べてＡＳＴが減少するように、α－１アンチトリプシンに関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与する。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、または当該オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を、投与前のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルに比べてＡＬＴが減少するように、α－１アンチトリプシンに関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与する。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、または当該オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を、投与前のアルカリホスファターゼレベルに比べてアルカリホスファターゼが減少するように、α－１アンチトリプシンに関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与する。

【0196】

対象または対象から得られる試料におけるα－１アンチトリプシンの発現、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ、α－１アンチトリプシンタンパク質、α－１アンチトリプシン活性の量もしくはレベル、またはα－１アンチトリプシン発現の調節に関連するか、もしくは影響を受けるバイオマーカー（例えば、血漿バイオマーカー）を決定する好適な方法は、当技術分野で知られている。さらに、本明細書に記載の実施例は、α－１アンチトリプシンの発現を決定する方法を例示する。

【0197】

いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンの発現、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ、α－１アンチトリプシンタンパク質、α－１アンチトリプシン活性の量もしくはレベル、またはα－１アンチトリプシン発現の調節に関連するか、もしくは影響を受けるバイオマーカー、またはそれらの任意の組み合わせは、細胞（例えば、肝実質細胞）、細胞集団もしくは細胞群（例えば、オルガノイド）、臓器（例えば、肝臓）、血液もしくはその分画（例えば、血漿）、組織（例えば、肝臓組織）、試料（例えば、肝生検試料）、または対象から取得もしくは単離された任意の他の適切な生物学的材料において減少する。いくつかの実施形態において、α－１アンチトリプシンの発現、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ、α－１アンチトリプシンタンパク質、α－１アンチトリプシン活性の量もしくはレベル、またはα－１アンチトリプシン発現の調節に関連するか、もしくは影響を受けるバイオマーカー、またはそれらの任意の組み合わせは、１つを超えるタイプ（複数可）の細胞（例えば、肝実質細胞及び１つ以上の他のタイプ（複数可）の細胞）、１つを超える細胞群、１つを超える臓器（例えば、肝臓及び１つ以上の他の臓器（複数可））、１つを超える血液の分画（例えば、血漿及び１つ以上の他の血液分画（複数可））、１つを超えるタイプの組織（例えば、肝臓組織及び１つ以上の他のタイプ（複数可）の組織）、または１つを超えるタイプの試料（例えば、肝生検試料及び１つ以上の他のタイプ（複数可）の生検試料）において減少する。

【0198】

それらの高い特異性のため、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、細胞及び組織（複数可）、または臓器（複数可）（例えば、肝臓）の標的遺伝子（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ）のｍＲＮＡを特異的に標的とする。疾患の予防において、標的遺伝子は、疾患の開始もしくは維持のために必要とされたか、またはより高い疾患にかかるリスクと関連するとして同定されたものでもよい。疾患の治療において、オリゴヌクレオチドは、疾患を示すか、または媒介する役割を果たす細胞、組織（複数可）、もしくは臓器（複数可）（例えば、肝臓）と接触することができる。例えば、α－１アンチトリプシン発現に関連する障害もしくは状態に関連する野生型（すなわち、ネイティブ）または変異遺伝子の全部または一部と実質的に同一のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を、肝実質細胞もしくはその他の肝細胞などの目的の細胞もしくは組織タイプと接触させるか、またはそれらに導入してもよい。

【0199】

いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ヒト標的などの任意の哺乳動物由来の標的遺伝子であり得る。本明細書に記載の方法によって、任意の標的遺伝子をサイレンシングしてもよい。

【0200】

本明細書に記載の方法は、典型的には、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を有効量、すなわち、望ましい治療結果を生み出すか、または生じる量で対象に投与することに関連している。治療上許容される量は、疾患または障害を治療することが可能な量であり得る。任意の１人の対象に対する適切な投与量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される組成物、組成物中の活性成分（複数可）、投与の時間及び経路、一般的な健康状態、及び同時に投与されている他の薬剤を含む特定の因子に応じて決められる。

【0201】

いくつかの実施形態において、本明細書の組成物（例えば、本明細書に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含む組成物）のいずれか１つを、経腸的に（例えば、経口、胃栄養チューブによって、十二指腸栄養チューブによって、胃瘻を介して、または直腸に）、非経口的に（例えば、皮下注射、静脈内注射もしくは注入、動脈内注射もしくは注入、骨内注入、筋肉内注射、脳内注射、脳室内注射、髄腔内注射）、局所的に（例えば、経皮、吸入、点眼、または粘膜を介して）、または標的臓器への直接注射（例えば、対象の肝臓）することによって、対象に投与する。典型的には、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、静脈内にまたは皮下に投与される。

【0202】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、または当該オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、単独でまたは組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、同時、連続（任意の順序）、または断続的な組み合わせで投与される。例えば、２つのオリゴヌクレオチドを同時投与してもよい。あるいは、１つのオリゴヌクレオチドを投与し、任意の時間（例えば、１時間、１日、１週、または１ヶ月）後に、２番目のオリゴヌクレオチドを投与してもよい。

【0203】

いくつかの実施形態において、治療される対象は、ヒトもしくは非ヒト霊長類または他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象としては、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜、ならびにマウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの動物が挙げられる。

【0204】

キット
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を含むキット及び使用説明書を提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと、キットの使用説明書を含む添付文書と、及び／またはその任意の構成要素を含む。いくつかの実施形態において、キットは、好適な容器内に、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、１つ以上の対照物、ならびに様々な緩衝剤、試薬、酵素、及び当該技術分野で周知の他の標準的な構成要素を含む。いくつかの実施形態において、上記容器は、オリゴヌクレオチドを投入し、場合によっては、適切に分注する、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含む。追加の構成要素を提供するいくつかの実施形態においては、キットは、この構成要素が配置される追加の容器を含む。また、キットは、オリゴヌクレオチド及び任意の他の試薬を商業販売のために厳重に封じ込める手段を含む。このような容器は、所望のバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形のプラスチック容器を含み得る。容器及び／またはキットは、使用説明及び／または警告を載せたラベルを含み得る。

【0205】

いくつかの実施形態においては、キットは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）及び医薬的に許容可能な担体、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、及びα－１アンチトリプシン発現に関連する疾患、障害、または状態の治療もしくは進行の遅延を必要とする対象においてそれを行うための説明書を含む。

【0206】

定義
本明細書で用いられる用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的とするｍＲＮＡ、特に、ｍＲＮＡのシード配列の全部または一部と相補的な配列を有しているため、ｍＲＮＡと二重鎖を形成し得る核酸を基盤とする分子を網羅するものである。したがって、本明細書で用いられる用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、「相補的な核酸を基盤とする抑制剤」と表され得る。

【0207】

本明細書で使用される「およそ」または「約」は、１つ以上の目的の値に適用される場合、記載されている参照値と同様の値を指す。いくつかの実施形態において、「約」は、別様の記述がない限りもしくは文脈からそうでないことが明白でない限り（そのような数値が、考え得る値の１００％を超えることになる場合を除き）、記載されている参照値のいずれかの方向の（それを超えるかまたはその未満）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の値内に入る値の範囲を指す。

【0208】

本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与すること」、「投与」などは、薬学的に有用な形で（例えば、対象の疾患、障害、または状態を治療するために）対象に物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を与えることを意味する。

【0209】

本明細書で使用される場合、「減弱する」、「減弱すること」、「減弱」などは、減少または効果的に停止することを指す。非限定的な例として、本明細書における治療の１つ以上は、肝疾患及び／または肺疾患の発症もしくは進行を低減または効果的に停止させ得る。肝疾患としては、対象の慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌が挙げられるがこれらに限定されなく、肺疾患としては、対象の喘息、気管支拡張症、呼吸不全、血管炎、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫が挙げられるが、これらに限定されない。この減弱は、例えば、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝線維症、肝細胞癌、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び／または肺気腫の１つ以上の態様（例えば、症状、組織特性、及び細胞、炎症、または免疫学的活性など）の軽減、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝線維症、肝細胞癌、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び／または肺気腫の１つ以上の態様の検出可能な進行（悪化）がないこと、または対象においてそうではない場合に予想される慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝線維症、肝細胞癌、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び／または肺気腫の検出可能な態様がないことによって例示され得る。

【0210】

本明細書で使用する場合、「相補的」は、２つのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能とする２つのヌクレオチド間（例えば、２つの反対の核酸または単一の核酸鎖の反対の領域について）の構造的関係を指す。例えば、一方の核酸のプリンヌクレオチドは、反対の核酸のピリミジンヌクレオチドと相補的であり、互いに水素結合を形成することによって一緒に塩基対を形成し得る。いくつかの実施形態において、相補的なヌクレオチドは、ワトソンクリック法または安定な二重鎖の形成を可能とする他のいずれかの方法で塩基対を形成し得る。いくつかの実施形態において、２つの核酸は、本明細書に記載の相補性の領域を形成するように、互いに相補的な複数のヌクレオチドの領域を有し得る。

【0211】

本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドに比べ、その五炭糖の２’位にヒドロキシルの代わりに水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、リン酸基、もしくは塩基におけるまたは糖、リン酸基、もしくは塩基の修飾もしくは置換を含む、２’位以外での原子の１以上の修飾または置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。

【0212】

本明細書で使用される場合、「二本鎖オリゴヌクレオチド」または「ｄｓオリゴヌクレオチド」は、実質的に二重鎖形態のオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的な塩基対合は、共有結合的に分離された核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的な塩基対合は、共有結合的に連結された核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的な塩基対合は、折り畳まれた（例えば、ヘアピンを介して）単一の核酸鎖から形成され、一緒に塩基対を形成するヌクレオチドの相補的な逆平行配列を提供する。いくつかの実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全に二重鎖を形成した２つの共有結合的に分離された核酸鎖を含む。しかしながら、いくつかの実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、（例えば一端または両端にオーバーハングを有する）部分的に二重鎖を形成した、２つの共有結合的に分離された核酸鎖を含む。いくつかの実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的なヌクレオチドの逆平行配列を含み、したがって、１以上のミスマッチを有し得、これらは内部ミスマッチまたは末端ミスマッチを含み得る。

【0213】

本明細書で使用する場合、「二重鎖」は、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合を介して形成された構造を指す。

【0214】

本明細書で使用する場合、「賦形剤」は、例えば、所望の稠度もしくは安定化効果を提供するか、またはそれに寄与するために組成物に含まれ得る非治療剤を指す。

【0215】

本明細書で使用する場合、「肝実質細胞」または「複数の肝実質細胞」は、肝臓の実質組織の細胞を指す。これらの細胞は、肝臓の質量の約７０％～８５％を構成し、血清アルブミン、ＦＢＮ、及びプロトロンビン群の凝固因子（第３因子及び第４因子を除く）を産生する。肝細胞系譜細胞のマーカーとしては、限定されるものではないが、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミンシンセターゼ（Ｇｌｕｌ）、肝細胞核因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、及び肝細胞核因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）を含む。成熟肝細胞のマーカーとしては、限定されるものではないが、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）、グルコース６－リン酸（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、及びＯＣ２－２Ｆ８を含み得る。例えば、Ｈｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３） ＮＡＴＵＲＥ ４９４：２４７－５０を参照されたい。

【0216】

本明細書で使用される場合、「肝毒性剤」は、肝臓に対してそれ自体が毒性であるか、またはプロセシングされて、肝臓に対して毒性である代謝物質を形成し得る化学的化合物、ウイルス、または他の物質を指す。肝毒性剤としては、限定されるものではないが、四塩化炭素（ＣＣｌ_４）、アセトアミノフェン（パラセタモール）、塩化ビニル、ヒ素、クロロホルム、非ステロイド系抗炎症薬（アスピリン及びフェニルブタゾンなど）を含み得る。

【0217】

本明細書で使用される「ＳＥＲＰＩＮＡ１」もしくは「Ａ１ＡＴ」または「アルファ１－アンチトリプシン」という用語は、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤を指す。「ＳＥＲＰＩＮＡ１」という用語は、特に明記しない限り、全てのアイソフォームを指すことを意図している。また、「ＳＥＲＰＩＮＡ１」は、タンパク質をコードする遺伝子を指す場合もある。一般的に血清トリプシン阻害剤として知られている。アルファ１－アンチトリプシンは、様々なプロテアーゼを阻害することから、アルファ１－プロテイナーゼ阻害剤（Ａ１ＰＩ）とも呼ばれている（Ｇｅｔｔｉｎｓ Ｐ Ｇ． Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０２：４７５１－０４）。それは、組織を炎症細胞の酵素、特に好中球エラスターゼから保護し、１．５～３．５グラム／リットルの血中の基準範囲を有するが、急性炎症の際に、何倍ものレベル上昇が起こり得る（Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ，Ａｃｕｔｅ－ｐｈａｓｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）． ｐｐ． ３－１９）。ＡＡＴが存在しない場合、好中球エラスターゼは、肺の弾性に寄与するエラスチンを無制限に破壊し、成人の肺気腫または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び成人または小児の肝硬変などの呼吸器合併症を生じる。ＡＡＴ遺伝子の一方または両方のコピーに突然変異を有する個体は、アルファ－１アンチトリプシン欠損症に罹患する可能性があり、それは、肺及び肝臓の正常なエラスターゼ活性よりも大きいことによる、肺気腫または慢性肝臓疾患発症のリスクとして現れる。

【0218】

前述のように、α－１アンチトリプシン発現に関連する特定の疾患状態において、個体がかなりの量のアルファ－１アンチトリプシンを産生していても、産生されるα－１アンチトリプシンタンパク質のかなりの割合がミスフォールドされているか、またはタンパク質の機能を損なう突然変異を含んでいる。そのような特定の場合、個体は、体内の合成部位から作用部位に適切に輸送できない、ミスフォールドタンパク質を生成する。

【0219】

α－１アンチトリプシン欠損症に起因する肝疾患は、このようなミスフォールドタンパク質によって誘発される可能性がある。α－１アンチトリプシンの突然変異形態、（例えば、３４２位（前処理された形態では３６６位）のグルタミン酸からリジンへの変異を有する一般的なＰｉＺバリアント）は、肝細胞内で産生され（肝臓の肝実質細胞は、通常、大量の循環ＡＡＴを産生する）、ミスフォールド構成では、そのような形態は細胞から容易に輸送されない。これにより、肝細胞内にミスフォールドタンパク質が蓄積され、限定されるものではないが、慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌を含む１種以上の肝疾患もしくは障害を誘発し得る。

【0220】

本明細書で使用される場合、「不安定なリンカー」は、（例えば、酸性ｐＨによって）切断され得るリンカーを指す。「かなり安定なリンカー」とは、切断できないリンカーを指す。

【0221】

本明細書で使用される場合、「肝臓炎症」または「肝炎」は、肝臓が、特に、傷害または感染の結果として、肝毒性剤への曝露により引き起こされ得るように、腫大し、機能障害を起こし、及び／または苦痛を起こす身体状態を指す。症状としては、黄疸（皮膚または目が黄色になること）、疲労、虚弱、悪心、嘔吐、食欲減退、及び体重減少を含み得る。肝炎は、治療せずにおくと、線維症、肝硬変、肝不全、または肝臓癌へと進行し得る。

【0222】

本明細書で使用される場合、「肝線維症」または「肝臓の線維症」は、炎症及び肝臓細胞死に起因するコラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ、及びＩＶ）、ＦＢＮ、ウンズリン、エラスチン、ラミニン、ヒアルロナン、及びプロテオグリカンを含んでいてもよい細胞外マトリックスタンパク質の肝臓における過剰蓄積を指す。肝線維症は、治療せずにおくと、肝硬変、肝不全、または肝臓癌へと進行し得る。

【0223】

本明細書で使用される場合、「ループ」は、（例えば、リン酸緩衝液中、細胞内など）適切なハイブリダイゼーション条件下で、非対合領域に隣接する２つの逆平行領域がハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成するように、互いに十分に相補的である核酸の２つの逆平行領域により隣接されている核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の非対合領域を指す。

【0224】

本明細書で使用する場合、「メタボリック症候群」または「代謝性肝疾患」とは、限定されるものではないが、腹部肥満、血圧上昇、空腹時血漿グルコースの上昇、高血清トリグリセリド、肝線維症、及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルの低レベルの病状を含む関連病状及び関連する病理のクラスターを特徴とする障害を指す。本明細書で使用される場合、メタボリック症候群または代謝性肝疾患という用語は、メタボリック症候群及び代謝性肝疾患に関連する広範な直接的及び間接的な症状、疾患、及び病理を網羅し、文書全体で使用される条件の拡張リストを含む。

【0225】

本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド間結合」は、ホスホジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間結合に比べ、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、天然に存在しない結合である。典型的には、修飾ヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合が存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチド間結合は、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低減などを向上し得る。

【0226】

本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドに比べ、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び／またはリン酸基に１つ以上の化学修飾を有する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドにコンジュゲートされた１つ以上の化学部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低減などを向上し得る。

【0227】

本明細書で使用される場合、「ニックの入ったテトラループ構造」は、個別のセンス（パッセンジャー）鎖及びアンチセンス（ガイド）鎖により特徴付けられるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造を指しており、センス鎖は、アンチセンス鎖と相補的な領域を有し、鎖の少なくとも一方が、一般にセンス鎖が、この少なくとも一方の鎖内に形成される隣接ステム領域を安定させるように構成されているテトラループを有する。

【0228】

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、（例えば、長さが約１００未満のオリゴヌクレオチドの）短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、一本鎖（ｓｓ）であってもよくまたはｄｓであってもよい。オリゴヌクレオチドは、二重鎖領域を有していてもよくまたは有していなくてもよい。一組の非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、またはｓｓ ｓｉＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。

【0229】

本明細書で使用される場合、「オーバーハング」は、一方の鎖または領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を超えて、その一方の鎖または領域が伸長することに起因する末端非塩基対合ヌクレオチド（複数可）を指す。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端の二重鎖領域から伸長する１つ以上の非対合ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはセンス鎖の３’または５’オーバーハングである。

【0230】

本明細書で使用される場合、「リン酸類似体」は、リン酸基の静電特性及び／または立体特性を模倣する化学部分を指す。いくつかの実施形態において、リン酸類似体は、しばしば酵素的除去を受けやすい５’－リン酸の代わりに、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに配置される。いくつかの実施形態において、５’リン酸類似体は、ホスファターゼ耐性結合を含む。リン酸類似体の例としては、限定されるものではないが、５’メチレンホスホネート（５’－ＭＰ）及び５’－（Ｅ）－ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）などの５’ホスホネートが挙げられる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドの糖の４’位の炭素にリン酸類似体を有する（「４’－リン酸類似体」と呼ばれる）。４’－リン酸類似体の例としては、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’－炭素）に結合したオキシメチルホスホネートまたはその類似体が挙げられる。例えば、米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号（２０１６年９月２日出願）及び米国特許仮出願第６２／３９３，４０１号（２０１６年９月１２日出願）を参照されたい。オリゴヌクレオチドの５’末端に対する他の修飾が開発されている（例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１１／１３３８７１号、米国特許第８，９２７，５１３号、及びＰｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４３：２９９３－３０１１を参照）。

【0231】

本明細書で使用される場合、ある遺伝子（例えば、α－１アンチトリプシン）の「発現の低減」は、適切な参照（例えば、参照細胞、細胞集団、試料、または対象）に比べ、その遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写産物（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ）またはタンパク質の量もしくはレベルの減少、及び／または細胞、細胞集団、試料、または対象におけるその遺伝子の活性量もしくはレベルの減少を指す。例えば、細胞を本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド）と接触させる行為は、オリゴヌクレオチドで処理されていない細胞に比べ、（例えば、ＲＮＡｉ経路によるα－１アンチトリプシンｍＲＮＡの分解を介して）α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ、タンパク質、及び／または活性の量もしくはレベルの減少をもたらし得る。同様に、本明細書で使用される場合、「発現の低減」は、遺伝子（例えば、α－１アンチトリプシン）の発現の低減をもたらす行為を指す。

【0232】

本明細書で使用される場合、「α－１アンチトリプシン発現の低減」は、適切な参照（例えば、参照細胞、細胞集団、試料、または対象）に比べ、細胞、細胞集団、試料、または対象におけるα－１アンチトリプシンｍＲＮＡ、α－１アンチトリプシンタンパク質、及び／またはα－１アンチトリプシン活性の量もしくはレベルの減少を指す。

【0233】

本明細書で使用される場合、「相補性の領域」は、ヌクレオチドの逆平行配列と十分に相補的であることにより、（例えば、リン酸緩衝液中、細胞内など）適切なハイブリダイゼーション条件下で２つのヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションを可能にするような、核酸のヌクレオチド配列（例えば、オリゴヌクレオチド）を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的配列に相補的な領域を有する標的配列を含む。

【0234】

本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、そのペントース糖として、２’位にヒドロキシル基を有するリボースを有するヌクレオチドを指す。修飾されたリボヌクレオチドとは、リボース、リン酸基、もしくは塩基に、またはリボース、リン酸基、もしくは塩基の修飾または置換を含む、２’位以外の原子の１つ以上の修飾または置換を有するリボヌクレオチドである。

【0235】

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）とアンチセンス鎖（ガイド）とを有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖またはアンチセンス鎖の一部がアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡ（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ）の切断に使用される二本鎖オリゴヌクレオチド、または（ｂ）一本のアンチセンス鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンス鎖（またはそのアンチセンス鎖の一部）が、Ａｇｏ２エンドヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡ（例えば、α－１アンチトリプシンｍＲＮＡ）の切断に使用される一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。

【0236】

本明細書で使用される場合、「鎖」は、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合、またはホスホロチオエート結合）を介して互いに連結されたヌクレオチドの一本の連続した配列を指す。いくつかの実施形態において、鎖は、２つの遊離末端（例えば、５’末端及び３’末端）を有する。

【0237】

本明細書で使用される場合、「対象」は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトまたはＮＨＰである。さらに、「個体」または「患者」は、「対象」と互換的に用いられる場合がある。

【0238】

本明細書で使用される場合、「合成」は、人工的に合成された（例えば、仕組み（例えば、固体核酸合成装置）を使用して）、またはそれ以外でその分子を通常生成する天然のソース（例えば、細胞または生物）に由来していない核酸または他の分子を指す。

【0239】

本明細書で使用される場合、「標的指向性リガンド」は、目的の組織または細胞の同種分子（例えば、受容体）に選択的に結合し、別の物質を目的の組織または細胞に対して標的化するためにその別の物質に結合することができる分子（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、または脂質）を指す。例えば、いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドを目的の特定の組織または細胞に標的化するためにそのオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよい。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、細胞表面受容体に選択的に結合する。したがって、いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている場合、細胞の表面に発現される受容体に選択的に結合し、オリゴヌクレオチド、標的指向性リガンド、及び受容体を含む複合体が細胞によりエンドソーム内部移行されることによって、特定の細胞内へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。いくつかの実施形態において、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドが、細胞内で標的指向性リガンドから放出されるように、細胞内部移行後にまたは細胞内部移行中に切断されるリンカーを介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。

【0240】

本明細書で使用される場合、「テトラループ」は、ヌクレオチドの隣接配列のハイブリダイゼーションにより形成される隣接二重鎖の安定性を増加させるループを指す。安定性の増加は、無作為に選択されたヌクレオチドの配列からなる同等の長さの一組のループから平均的に予想される隣接ステム二重鎖のＴ_ｍよりも高い隣接ステム二重鎖の融解温度（Ｔ_ｍ）の上昇として検出可能である。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基対（ｂｐ）の長さの二重鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４中で、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、少なくとも約５８℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、または少なくとも約７５℃のＴ_ｍをもたらし得る。いくつかの実施形態では、テトラループは、少なくとも２塩基対（ｂｐ）の長さの二重鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４中で、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、少なくとも約５８℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、または少なくとも約７５℃のＴｍをもたらし得る。いくつかの実施形態において、テトラループは、スタッキング相互作用によって、隣接したステム二重鎖のｂｐを安定化し得る。また、テトラループのヌクレオチド間の相互作用としては、限定されるものではないが、非ワトソンクリック型塩基対形成、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用が挙げられる（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＮＡＴＵＲＥ ３４６：６８０－８２、Ｈｅｕｓ＆Ｐａｒｄｉ（１９９１）ＳＣＩＥＮＣＥ．２５３：１９１－９４）。いくつかの実施形態において、テトラループは、３～６ヌクレオチドを含むかまたはそれらからなり、典型的には４～５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、テトラループは、３、４、５、または６ヌクレオチドを含むかまたはそれからなり、修飾されていてもよく、または修飾されていなくてもよい（例えば、標的指向性部分にコンジュゲートされていてもよく、またはコンジュゲートされていなくてもよい）。いくつかの実施形態において、テトラループは、４ヌクレオチドからなる。テトラループでは任意のヌクレオチドを使用することができ、Ｃｏｒｎｉｓｈ－Ｂｏｗｄｅｎ（１９８５）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．１３：３０２１－３０に記載されるようにそのようなヌクレオチドの標準的なＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ記号を使用し得る。例えば、文字「Ｎ」は、任意の塩基がその位置にあり得ることを意味するために使用されてもよく、文字「Ｒ」は、Ａ（アデニン）またはＧ（グアニン）がその位置にあり得ることを示すために使用されてもよく、「Ｂ」は、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、またはＴ（チミン）がその位置にあり得ることを示すために使用されてもよい。テトラループの例としては、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＰＲＯＣ． ＮＡＴＬ． ＡＣＡＤ． ＳＣＩ． ＵＳＡ ８７：８４６７－７１、Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．１９：５９０１－０５）。ＤＮＡテトラループの例としては、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ）ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、及びテトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。例えば、Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＢＩＯＣＨＥＭ．４１：１４２８１－９２、Ｓｈｉｎｊｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＮＩＰＰＯＮ ＫＡＧＡＫＫＡＩ ＫＯＥＮ ＹＯＫＯＳＨＵ ７８：７３１を参照されたい。いくつかの実施形態において、テトラループは、ニックの入ったテトラループ構造に含まれる。

【0241】

本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」は、例えば、既存の状態（例えば、疾患、障害）に関して対象の健康及び／または福祉を向上させるために、または状態が発生する可能性を予防または減少させるために、治療剤（例えば、本明細書のオリゴヌクレオチド）を対象に投与することにより、ケアの提供を必要とする対象にそれを行う行為を指す。いくつかの実施形態において、治療は、対象が経験する状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状、または寄与要因の頻度または重症度を低減することを含む。

【実施例】

【0242】

実施例１：ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチド合成及び精製
前述の実施例に記載のオリゴヌクレオチド（ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、本明細書に記載の方法を使用して化学合成される。一般に、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、既知のホスホルアミダイト合成（例えば、Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ（２０１７） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ． ９（１）：ａ０２３８１２、及び、Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ．Ｈ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖ：Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ－Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｋｅｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴ． １９８１；２２：１８５９－６２を参照）を用いることに加え、１９～２３量体のｓｉＲＮＡについて説明した固相オリゴヌクレオチド合成法を使用して合成される（例えば、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．１８：５４３３－４１、及びＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０９：７８４５－４５を参照。また、米国特許第５，８０４，６８３号、米国特許第５，８３１，０７１号、米国特許第５，９９８，２０３号、米国特許第６，００８，４００号、米国特許第６，１１１，０８６号、米国特許第６，１１７，６５７号、米国特許第６，３５３，０９８号、米国特許第６，３６２，３２３号、米国特許第６，４３７，１１７号、及び米国特許第６，４６９，１５８号を参照）。

【0243】

標準方法（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に従って、個々のＲＮＡ鎖を合成してＨＰＬＣ精製した。例えば、固相ホスホラミダイト化学反応を使用してＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護し、標準技法（Ｄａｍｈａ＆Ｏｌｇｉｖｉｅ（１９９３）ＭＥＴＨＯＤＳ ＭＯＬ． ＢＩＯＬ．２０：８１－１１４、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２３：２６７７－８４）を使用してＮＡＰ－５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）上で脱塩した。１５分間の段階的線形勾配を使用したＡｍｅｒｓｈａｍ Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上でイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ－ＨＰＬＣ）を使用して、オリゴマーを精製した。勾配は、緩衝液Ａ：Ｂ ９０：１０から緩衝液Ａ：Ｂ ５２：４８に変化させたが、ここで緩衝液Ａは、１００ｍＭのトリスｐＨ８．５、緩衝液Ｂは、１００ｍＭのトリスｐＨ８．５、１ＭのＮａＣｌであった。２６０ｎｍで試料をモニタリングし、全長オリゴヌクレオチド種に相当するピークを回収してまとめ、ＮＡＰ－５カラムで脱塩して凍結乾燥した。

【0244】

Ｂｅｃｋｍａｎ ＰＡＣＥ ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）上のキャピラリ電気泳動（ＣＥ）によって、各オリゴマーの純度を決定した。ＣＥキャピラリは、１００μｍの内径を有し、ｓｓＤＮＡ １００Ｒゲル（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含有する。典型的には、約０．６ｎｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドが、キャピラリに注入され、４４４Ｖ／ｃｍの電場で泳動し、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって検出された。変性Ｔｒｉｓ－ホウ酸塩－７Ｍ－尿素泳動緩衝剤をＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。以下で説明される実験で使用するためにＣＥによって評価されるように、少なくとも９０％純粋であるオリゴリボヌクレオチドが得られた。製造業者の推奨プロトコルに従って、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ（商標）Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋ ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上でのマトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法によって、化合物の同一性を検証した。しばしば期待分子量の０．２％以内で、全てのオリゴマーの相対分子量が得られた。

【0245】

二本鎖の調製
例えば、一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５からなる二重鎖緩衝液中（例えば、１００μＭ濃度で）再懸濁させた。相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖を、等モル量で混合して、例えば５０μＭ二重鎖の、最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中、１００℃に５分間加熱し、使用前に室温まで放冷した。ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを－２０℃で貯蔵した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを凍結乾燥して貯蔵するか、またはヌクレアーゼを含まない水中、－８０℃で貯蔵した。

【表1】

【0246】

表１に提供されるオリゴヌクレオチド配列を使用して、３６量体のパッセンジャー鎖及び２２量体のガイド鎖を有するニックの入ったテトラループ構造を含む修飾オリゴヌクレオチドを生成した。具体的に、表３に提供されるＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、それぞれ修飾ヌクレオチド及びホスホロチオエート結合の異なるパターンを含む（配列番号３３～１０２）。修飾されたヌクレオチド及びホスホロチオエート結合のパターンを以下に示す。
パターンＡ（ＳＭ１０４７／ＡＳＭ１５０８）
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＡ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＡ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＣ］［ｐｒｇＧ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｍＧ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＵ］［ｍＧ］［ｍＣ］
アンチセンス鎖
［ホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸｓ］［ｍＧｓ］［ｍＧ］
パターンＢ（ＳＭ９８８／ＡＳＭ１２６６）
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＡ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＣ］［ｐｒｇＧ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｍＧ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＵ］［ｍＧ］［ｍＣ］
アンチセンス鎖
［ホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸｓ］［ｍＧｓ］［ｍＧ］
パターンＣ（ＳＭ１２１８／ＡＳＭ１５０８）
センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ［ｍＸ］［ｍＡ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＣ］［ｐｒｇＧ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｍＧ］［ｍＧ］［ｍＣ］
アンチセンス鎖
［ホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸｓ］［ｍＧｓ］［ｍＧ］
パターンＤ（ＳＭ１１７８／ＡＳＭ１２６６）
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＡ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＣ］［ｐｒｇＧ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｐｒｇＡ－ｐｅｇ－ＧａｌＮＡｃ］［ｍＧ］［ｍＧ］［ｍＣ］
アンチセンス鎖
［ホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸｓ］［ｍＧｓ］［ｍＧ］
パターンＥ（ＳＭ１２１７／ＡＳＭ１５０８）
センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＡ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＣ］［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ｍＧ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＵ］［ｍＧ］［ｍＣ］
アンチセンス鎖：
［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸｓ］［ｍＧｓ］［ｍＧ］
パターンＦ（ＳＭ１２１７／ＡＳＭ１７０４）
センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＡ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＣ］［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ｍＧ］［ｍＧ］［ｍＣ］［ｍＵ］［ｍＧ］［ｍＣ］
アンチセンス鎖：
［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸｓ］［ｍＧｓ］［ｍＧ］

【表2】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0247】

実施例２：インビトロでのＡ１ＡＴ／ＳＥＲＰＩＮＡ１発現のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害
Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）にコンジュゲートするＳＥＲＰＩＮＡ１特異的低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が開発されている。ＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）戦略を使用して（ＭｃＭａｎｕｓ Ｍ．Ｔ．，ａｎｄ Ｐ．Ａ． Ｓｈａｒｐ． ２００２．‘Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ’，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，３（１０）：７３７－４７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡ、及びアルファ－１アンチトリプシン欠損症（Ａ１ＡＴＤ）を有する対象の肝臓における突然変異形態アルファ－１アンチトリプシン（Ｚ－ＡＡＴ）タンパク質の蓄積を減少させる。これは、ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされる非常に強力なｓｉＲＮＡを使用することによって達成され、皮下（ＳＣ）投与後に肝実質細胞によって選択的に取り込まれて肝臓のＺ－ＡＡＴタンパク質の濃度を低減させる。肝臓での凝集したＺ－ＡＡＴタンパク質の分解障害は、Ｚ－ＡＡＴタンパク質の毒性蓄積とＡ１ＡＴＤ関連の肝疾患を誘発する。したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子発現を標的とすることによって肝臓のＺ－ＡＡＴタンパク質のレベルを直接低減させることは、治療上の利益を提供する。

【0248】

この研究の目的は、ヒト肝癌細胞株ＨｕＨ－７におけるインビトロでのヒトＳＥＲＰＩＮＡ１転写産物を標的とする（修飾パターンＡ～Ｄを有する）ＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの活性を比較することであった。

【0249】

材料及び方法
試験品の調製
表３に記載のＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、固相合成によって調製し、強陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＭＡ）を使用して精製された。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ ＭＳ）を使用して、配列の同一性を確認した。ＲＮＡ二重鎖は、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって濃度正規化された。

【0250】

ＨｕＨ－７細胞の細胞培養及びトランスフェクション
ヒト肝細胞癌細胞株であるＨｕＨ－７（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ＪＣＲＢ，Ｊａｐａｎ）は、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含むＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で保持された。細胞を、５％ＣＯ２及び３７℃で加湿インキュベータ内で一晩保持した。リポフェクタミンＲＮＡｉ ＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及び指定試験品をＯｐｔｉＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈した。希釈試薬と希釈試験品（表３）を混合し、室温で１５分間インキュベートして複合体を形成した。この複合体を細胞に添加し、２４時間インキュベートした。ＨｕＨ－７細胞は、製造業者のプロトコルに従って、ＯｐｔｉＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に３つの濃度の指定試験品を含むリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆トランスフェクトした。被験品の最終濃度は、１、０．１、及び０．０１ｎＭであった。最終的な細胞濃度は、９６ウェルモートプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において２×１０^４細胞／ウェルであった。

【0251】

ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
トランスフェクション複合体との２４時間インキュベーションの後、細胞を１× ＰＢＳで１回洗浄し、ｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ｑＰＣＲ溶解緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して溶解した。ライセート中のＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従って、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して逆転写した。

【0252】

リアルタイムｑＰＣＲ及びデータ解析
合成されたｃＤＮＡは、ｉＱ Ｐｏｗｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）による定量的ＰＣＲに使用された。プライマー及びプローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。ｑＰＣＲ反応は、ＣＦＸ－３８４システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で実行され、データをＤＤＣ_ｔ法を使用して分析した。遺伝子発現データをモックのトランスフェクトされた試料に対して正規化した。

【0253】

結果及び結論
複数のコンジュゲートは、ＨｕＨ－７細胞におけるＳＥＲＰＩＮＡ１発現の良好なノックダウンを示した（図１）。

【0254】

実施例３：マウスにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の薬力学的有効性、用量反応、及び持続時間の評価
実施例２の結果に基づいて、配列番号１０５のセンス鎖及び配列番号２５のアンチセンス鎖を含むＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を、さらなる研究のために選択した。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９は、修飾パターンＦ（図２Ａに示す配列番号１０３に示されるセンス鎖及び配列番号１０４に示されるアンチセンス鎖）を用いて生成された。この実施例及び以下の実施例において、「ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９」はこれらの修飾配列を指す。具体的に、この研究は、アルファ－１－アンチトリプシン欠損症（Ａ１ＡＴＤ）のＰｉＺマウスモデルへの単回ボーラス皮下（ＳＣ）注射後の薬力学的有効性、用量反応、及び修飾ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９活性の持続時間を評価するために設計され、このモデルは、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の突然変異を保有し、ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質を発現する。

【0255】

具体的には、肝臓のヒトＺ－ＡＡＴタンパク質を発現する雄のＰｉＺマウスは、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＪ．Ｔｅｃｋｍａｎ博士の実験室で提供した株からのマウスを使用して確立した繁殖コロニーから得られた（Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｉＺ ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｌｉｖｅｒ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，（Ｍａｙ １９８９），ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＴＩＯＮ ８３（４）：１１８３－９０、Ｒｕｄｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ． ３９，Ｎｏ． ４，２００４）。マウス（４週齢）は、特定の病原体のない畜産条件下で飼育され、実験用飼料と水は自由に摂取した。雄のＰｉＺマウスは、研究の開始の際に、無作為に研究群に分けられた（ｎ＝群当たり５）。

【0256】

１、３、もしくは１０ｍｇ／ｋｇの投与群について、各試験品をＰＢＳで０．１、０．３、もしくは１．０ｍｇ／ｍＬの濃度にそれぞれ希釈した。投与量は、投与日（１日目）にＳＣ投与前に採取したマウスの個々の体重に基づいて計算された。用量製剤化は、使い捨ての１．０ｍＬ注射器を使用してマウスの背中に投与された。研究１日目に、マウスに０（リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を１回皮下（ＳＣ）注射した。ビヒクル対照マウスには、試験品と等体積及び方法でＰＢＳを投与した（１０ｍＬ／ｋｇ）。

【0257】

血液試料は、投与前及び研究期間全体（１及び３ｍｇ／ｋｇ投与群では８週間及びＰＢＳ及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群では１０週間）にわたって毎週収集された。対照パラメータは、投与前の測定からのものとした。血液試料は尾静脈から採取した。９６ウェルｖ底プレートの各ウェルには、ヒトＡ１ＡＴ ＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からの９８μＬの希釈剤ＮＳが事前に充填されていた。マウスを加熱ランプの下で予熱し、拘束器に入れた。尾静脈に小さな穴を開け、２０μＬシングルチャンネルピペットを使用して２μＬの血液を取り出した。２００μＬのシングルチャンネルピペットを使用して、試料を完全に混合した。試料を等分し、－８０℃で保存した。肝臓におけるＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９活性のバイオマーカーである血清Ｚ－ＡＡＴ濃度は、血清試料中の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定された。

【0258】

アッセイの日に、血液試料を氷上で解凍し、希釈剤ＮＳでさらに希釈した（最終希釈：１：５，０００）。製造業者の指示に従って、ヒトアルファ１アンチトリプシン検出用の市販のＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、カタログ番号ａｂ１８９５７９）を使用して、５０μＬの希釈血液中のＺ－ＡＡＴタンパク質濃度を測定した。試料は、ＥＬＩＳＡによって二重に分析した。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処理後の循環Ｚ－ＡＡＴタンパク質濃度の減少は、投与前及び時間一致したＰＢＳ Ｚ－ＡＡＴタンパク質濃度に対する循環Ｚ－ＡＡＴタンパク質濃度の減少率として計算された。

【0259】

ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の投与（図２Ａ）により、図２Ｂに示すように、１ｍｇ／ｋｇ投与群の単回ＳＣ投与の１週後に最大の減少を伴う循環Ｚ－ＡＡＴタンパク質濃度の確実かつ用量依存的な減少をもたらした。この時点で、ベースラインと比較した循環Ｚ－ＡＡＴタンパク質濃度の最大減少は２．１倍（５１％減少、Ｐ≦０．０１）であった。循環Ｚ－ＡＡＴタンパク質濃度の最大の減少は、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群の単回ＳＣ投与の２週後であった。この時点で、ベースラインと比較した循環Ｚ－ＡＡＴタンパク質濃度の最大減少は、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれぞれに対して６．６倍（８５％減少）及び３３．３倍（９７％減少）（Ｐ＜０．０００１、両方の群）であった。Ｚ－ＡＡＴタンパク質の循環濃度は、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれぞれにおいて、３、７、または９週後にゆっくりとベースライン濃度に戻ってきた。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９によるマウスの循環Ｚ－ＡＡＴタンパク質濃度の減少に対する５０％有効用量（ＥＤ_５０）は、ＰｉＺマウスにおいて１ｍｇ／ｋｇと推定された（図２Ｃ）。したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９投与後に観察された循環Ｚ－ＡＡＴレベルの低減は、最大応答及びその応答の持続時間の両方の点において用量依存的であった。

【0260】

Ａ１ＡＴＤ患者の肝疾患の進行は、肝実質細胞におけるＺ－ＡＡＴの進行性蓄積に関連している。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９は、ＰｉＺＺ（重度のアルファ１アンチトリプシン欠損症）患者の肝疾患の進行を遅延させたり、停止させたり、場合によっては逆行させたりする有意義な治療的介入を生み出す可能性がある。したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９は、肝疾患のＰｉＺＺ患者の生命を救う治療的介入を表している可能性がある。

【0261】

実施例４：ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を用いた治療後のＡ１ＡＴＤ関連肝疾患表現型に対する肝臓のヒトＺ－ＡＡＴノックダウンの有効性評価
Ａ１ＡＴＤ関連肝疾患表現型に対するヒトＺ－ＡＡＴノックダウンの有効性を評価するために、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の有効性を雄雌ＰｉＺマウスで評価した（実施例３に記載）。

【0262】

具体的に、マウス（５～４９週齢）は、特定の病原体のない畜産条件下で飼育され、実験用飼料と水は自由に摂取した。合計４４匹のＰｉＺマウスが最初に研究に割り当てられた。マウス遺伝子型の最終確認により、９匹のマウスがヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を発現していないことが明らかになり、よって研究から除外された。マウスには、３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに１回、２２週間にわたって６回ＳＣ投与（すなわち、０日目に初回投与、４、８、１２、１６、２０週目に投与）した。投与は、５、１２、及び４９週齢の雄雌ＰｉＺマウスで開始され、それぞれ２７、３４、または７１週齢で研究が終了した。

【0263】

材料及び方法
ＲＴ－ｑＰＣＲによるＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの測定
ＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡのノックダウンと、ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質の細胞内保持、細胞増殖の増加につながる対応する再生刺激、及び進行性肝線維症を含む、ＰｉＺマウスモデルで保存されていることが以前に示されたＡ１ＡＴＤ関連肝疾患の特徴に対する有効性を測定するために、末端肝組織を採取した（Ｒｕｄｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ． ｅｔ ａｌ．，ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ． ３９，Ｎｏ． ４，２００４、Ｍａｒｃｕｓ ｅｔ ａｌ． Ｈｅｐａｔｏｌ Ｒｅｓ． ２０１０ Ｊｕｎｅ，４０（６）：６４１－６５３、及びＴａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３１１：Ｇ１５６－Ｇ１６５，２０１６）。末端血清試料は、トランスアミナーゼを含む血清化学パラメータの測定のために収集された。具体的には、約５０ｍｇの試料を、Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ ＩＩを使用して０．７５ｍＬのフェノール／グアニジンベースのＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）でホモジナイズした。ホモジネートを１－ブロモ－３－クロロプロパン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で抽出した。製造業者の指示に従って、ＭａｇＭａＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、０．２ｍＬの水相からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、２６０及び２８０ナノメートルでの分光分析を使用して定量化された。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）のＲＴ－ｑＰＣＲプライマー及びプローブ、ならびにＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及びＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の試薬を使用して、ハウスキーピング遺伝子であるヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｐｒｔ）に対して正規化したＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡレベルを測定した。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置群におけるＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの減少の程度は、同齢のマウスからの生理食塩水で処置した対照群の平均発現レベルに対する発現のパーセント（Ｈｐｒｔに対して正規化）として計算されており、生理食塩水で処置した対照群のＳＥＲＰＩＮ１ ｍＲＮＡ発現は、１００％と設定された。平均±標準偏差のグラフを作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してデータを分析した。独立ｔ検定を実行して、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置群のＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡレベル（Ｈｐｒｔに対して正規化）を、同齢マウスの生理食塩水処置対照群と比較した。確認のため、ＰＣＲを２回実行した。

【0264】

Ａ１ＡＴ ＥＬＩＳＡ
製造業者の指示に従って、ヒトアルファ１アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１）ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用し、５０μＬの希釈血液試料（全血をＥＬＩＳＡキットのアッセイバッファーで１：５，０００に希釈）中のヒトＺ－ＡＡＴタンパク質濃度を二重に測定した。ＰｉＺマウスは、ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質のみを発現するため、ヒト特異的抗Ａ１ＡＴ ＥＬＩＳＡは循環ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質レベルの尺度となる。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置群におけるヒトＺ－ＡＡＴタンパク質濃度の低下は、投与前のヒトＺ－ＡＡＴ濃度に対する、及び雌雄独立して同一の日の同齢対照（生理食塩水処置）群の平均発現レベルに対する発現率として計算され、対照群のヒトＺ－ＡＡＴタンパク質濃度は１００％に設定された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で平均±標準偏差のグラフを作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータを分析した。独立ｔ検定を実行して、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置群のヒトＺ－ＡＡＴタンパク質レベルを、同時点で、同齢マウスの生理食塩水処置対照群と比較した。

【0265】

ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質のウェスタンブロット
Ｔ－ＰＥＲ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と共にＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用し、組織ライセートを調製した。総タンパク質濃度は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で測定し、推定された同等のタンパク質濃度をＮｕＰＡＧＥ ４～１２％のＢｉ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で解決した。電気泳動したタンパク質は、ｉＢｌｏｔ Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してニトロセルロース膜に転写し、非特異的結合を防ぐためにＯｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）で遮断した。次に、膜をウサギ抗ヒトＡ１ＡＴ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及びマウス抗グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）とインキュベートした。抗ウサギＩＲＤｙｅ ６８０及び抗マウスＩＲＤｙｅ ８００二次抗体（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を検出に使用し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像システム（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を使用して信号強度を測定した。ＰｉＺマウスは、ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質のみを発現するため、ヒト特異的抗Ａ１ＡＴ抗体は、ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質レベルの尺度となる。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置群におけるヒトＺ－ＡＡＴタンパク質の減少の程度は、同齢のマウスからの生理食塩水で処置した対照群の平均レベルに対する発現のパーセントとして計算されており、生理食塩水で処置した対照群のヒトＺ－ＡＡＴタンパク質レベルは、１００％と設定された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で平均±標準偏差のグラフを作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータを分析した。独立ｔ検定を実行して、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置群のヒトＺ－ＡＡＴタンパク質レベルを、同齢マウスの生理食塩水処置対照群と比較した。

【0266】

免疫組織化学
肝臓組織を採取し、１０％の中性緩衝ホルマリンで一晩固定し、７０％のエタノールに移した。Ｍａｓｓ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）で、パラフィンへの包埋とスライドの準備を完了した。製造業者の指示に従って、ジアスターゼ消化による過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ－Ｄ）及びシリウスレッド（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）染色を行った。免疫組織化学（ＩＨＣ）実験では、パラフィン切片を脱パラフィンし、再水和した。Ａ１ＡＴ、ヒトＺ－ＡＡＴポリマー、及びＫｉ６７ ＩＨＣ試料に対して、熱を介した抗原回復（クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）を実行した。内因性ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼをＢＬＯＸＡＬＬ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）でブロックした。ウサギモノクローナル抗Ａ１ＡＴ抗体（１：５００希釈、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、マウスモノクローナル抗Ｚ－ＡＡＴポリマー２Ｃ１抗体（１：５０，Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｗａｙｎｅ，ＰＡ）、及びウサギモノクローナル抗Ｋｉ６７抗体（１：１００希釈、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）をＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）抗体希釈液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）で希釈し、４℃で一晩インキュベートした。ＰｉＺマウスは、ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質のみを発現するため、ヒト特異的抗Ａ１ＡＴ抗体は、ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質レベルの尺度となる。一次抗体の結合は、ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）ＤＡＢ基質キット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いて、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｏｎｌｉｎｅ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して検出した。結果は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＶＳ－ＡＳＷ画像解析ソフトウェアを使用したＯｌｙｍｐｕｓＢＸ６１ＶＳ スライドスキャナーを使用して視覚化した。

【0267】

肝酵素の分析
最終採血は、血液化学パラメータの測定のために血清に処理した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びアルカリホスファターゼのレベルは、ＩＤＥＸＸ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｒａｆｔｏｎ，ＭＡ）によって測定された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で平均±標準偏差のグラフを作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータを分析した。独立ｔ検定を実行して、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置群のＡＬＴ、ＡＳＴ、またはＡＬＰレベルを、同齢マウスの生理食塩水処置対照群と比較した。

【0268】

結果
ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の反復投与は、ＰｉＺマウスにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡ発現を有意に減少させた（図３に示す）。４週間ごとにＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を６回投与すると、５（Ｐ＜０．０００１）及び１２（Ｐ≦０．０５）週齢のＰｉＺマウスにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの発現が有意に減少された。群ごとのマウスの数が少ないため、４９週齢のＰｉＺマウスの統計的有意性は計算できなかった。

【0269】

ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の反復投与は、ＰｉＺマウスにおける循環ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質レベルを有意に減少させた（ＥＬＩＳＡにより測定、図４）。ヒトＺ－ＡＡＴレベルは、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の単回投与後に減少し、この減少は、５、１２、及び４９週齢のＰｉＺマウスでＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週間ごとに５回追加投与しても維持された。

【0270】

ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の反復投与は、肝臓組織試料のウェスタンブロット及びＩＨＣによって示されるように、５～２７週齢の処置されたＰｉＺマウスの肝臓のヒトＺ－ＡＡＴタンパク質レベルを大幅に低減させた。ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質は、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置マウスにおいてウェスタンブロットによっては検出できず（図５及び図６）、肝臓組織のＩＨＣにおいて効果的に減少した（図７）。同様の減少が、それぞれ３４及び７１週目で組織を採取した１２及び４９週齢で治療を開始したマウスで観察された（データは示さない）。

【0271】

ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９によるＰｉＺマウスの治療は、Ａ１ＡＴ関連の肝病理を低減する。
ＰｉＺＺ患者において、突然変異型ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質は、肝実質細胞内でホモポリマーとしてミスフォールドされ、凝集する傾向がある。この凝集タンパク質の分解障害は、結果としてＡ１ＡＴＤ関連肝疾患を有する一部の患者の肝臓にヒトＺ－ＡＡＴの有毒な蓄積を誘発する。ヒトＺ－ＡＡＴポリマー特異的抗体を使用したＩＨＣ（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５ Ｊａｎ；５８：８１－９１）は、５週齢でＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９による処置を開始したＰｉＺマウスの治療によって、肝臓におけるヒトＺ－ＡＡＴポリマー負荷が効果的に減少できることを示している（図８）。

【0272】

さらに、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置は、４９週齢で処置を開始したＰｉＺマウスの肝臓における高いヒトＺ－ＡＡＴポリマー負荷を効果的に減少させた（図９）。

【0273】

ヒトで見られるように、ＰｉＺマウス肝実質細胞の小胞体（ＥＲ）における突然変異型ヒトＺ－ＡＡＴの組織病理学的特徴は、ジアスターゼ耐性（ＰＡＳ－Ｄ）である過ヨウ素酸シッフで染色される細胞内小球である（Ｒｕｄｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｔ ａｌ．， ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． ３９， Ｎｏ． ４， ２００４、Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＥＤＩＡＴＲＩＣ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｖｏｌ． ６０， Ｎｏ． ２， ２００６）。５週齢で開始したＰｉＺマウスのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置は、肝小球形成を有効に阻害することを誘発した（図１０）。

【0274】

ＰｉＺマウス肝臓における突然変異型ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質の細胞内保持は、細胞増殖の増加につながる再生刺激と関連している（Ｒｕｄｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｔ ａｌ．， ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． ３９， Ｎｏ． ４， ２００４）。５週齢でＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置を開始したＰｉＺマウスは、対照処置マウスと比較して、増殖細胞マーカーであるＫｉ－６７の免疫組織化学による評価で、細胞増殖の効果的な減少を示した（図１１）。

【0275】

ＰｉＺマウスの肝臓の慢性損傷は、加齢に伴う進行性肝線維症と関連していることが示されている（Ｂｒｕｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ ＰＥＤＩＡＴＲ ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬ ＮＵＴＲ． ２０１０ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ；５１（５）：６２６－６３０）。２７週齢のＰｉＺマウス肝臓のシリウスレッド染色は、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９で処置されたマウスの肝臓で肝線維症の発生を顕著に減少したことを示している（図１２）。

【0276】

ＰｉＺマウスにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの持続的なノックダウンは、十分に許容される。５、１２、または４９週齢でＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処理を開始したＰｉＺマウスは、ＡＬＴ、ＡＳＴ、またはアルカリホスファターゼを含む重要な血清生化学パラメータのレベルの上昇を誘発しなかった（図１３）。

【0277】

全体的に、これらの結果は、ＰｉＺマウスにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの持続的なノックダウンが十分に許容され、トランスアミナーゼ活性を含む血清生化学値に異常がないことを示している。

【0278】

実施例５：ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９で処置したＰｉＺマウスにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡ及びヒトＺ－ＡＡＴタンパク質の用量依存的ノックダウンは、肝小球の減少と相関する
この研究の目的は、突然変異ヒトＺ－ＡＡＴタンパク質を発現するＰｉＺマウスの肝小球を少なくとも５０％減少させるために必要な、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９によるＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを評価することであった。具体的には、マウス（５週齢）に０、０．３、１、または３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４週ごとに１回、４回のＳＣ投与を行った。

【0279】

ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の最終投与から１週間後、ＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡならびに循環及び肝臓のヒトＺ－ＡＡＴタンパク質レベルが用量依存的に有意に減少した（図１４）。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の最終投与から１週間後、肝小球の同様の用量依存的減少が観察された（図１４）。１または３ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４回投与した後、肝小球の少なくとも５０％の減少が観察された。

【0280】

ヒトで見られるように、ＰｉＺマウス肝実質細胞のＥＲにおける突然変異型ヒトＺ－ＡＡＴの組織病理学的特徴は、ジアスターゼ耐性（ＰＡＳ－Ｄ）である過ヨウ素酸シッフで染色される細胞内小球である（Ｒｕｄｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ， ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ， ３９：１０４８－５５、Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ， ＰＥＤＩＡＴＲ ＲＥＳ ６０（２）：２３３－８）。５週齢のＰｉＺマウスのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９による処置は、肝小球形成の用量依存的な阻害をもたらした（図１５）。

【0281】

実施例６：カニクイザルに単回ボーラス皮下（ＳＣ）注射後のＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の薬力学的有効性、用量反応、及び作用の持続時間の評価。
研究の主な目的は、カニクイザルに単回ボーラス皮下（ＳＣ）注射後のＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の薬力学的有効性、用量反応、及び作用の持続時間を決定することであった。二次的な目的は、標準的な血液学及び臨床血液化学（ＣＢＣ）パラメータ、体重、及び潜在的な注射部位反応を適切な時点でモニタリングすることにより、忍容性の予備評価を得ることであった。

【0282】

雌のカニクイザルを、研究手順を実施する前に少なくとも１週間順応させたＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，ＭＡ）にて受け取った。指定された手順中を除いて、ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ認定の霊長類の食餌を１日２回に動物に提供した。水は全ての動物に自由に与えられた。動物は社会的に収容され、環境の豊かさを提供した。プロトコルで指定された試験終了時（１６９日目）に、全てのサルは健康であり、試験コロニーに戻った。

【0283】

簡単に要約すると、２～４歳までの年齢の非ナイーブな雌のカニクイザルの３つの群（ｎ＝５、各群）は、１ｍｇ／ｋｇ（群１）、３ｍｇ／ｋｇ（群２）、または１０ｍｇ／ｋｇ（群３）のＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の単回ＳＣボーラス注射を受けた。投与後３日間、注射部位の炎症を綿密にモニターした。臨床観察を毎日記録した。

【0284】

血液試料は、２４週間の研究期間にわたって毎週収集され、血清及び血漿に処理した。具体的には、採血手順の前に、全ての動物を一晩絶食させた。臨床血液化学（ＣＢＣ）及び血液学パラメータは、投与前及び４８時間後の試料を使用してＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒで実施した。血清及び血漿は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒで２ｍＬの血液試料から処理され、複数の保存用バイアルに分割されて液体窒素で瞬間凍結された。ＣＢＣ及び血液学に使用されるものを除く全ての試料は、ドライアイスでＤｉｃｅｒｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓに出荷された。血清Ａ１ＡＴタンパク質濃度は、Ｄｉｃｅｒｎａ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓでＥＬＩＳＡによって定量化された。他の全ての試料は－８０℃でアーカイブされた。

【0285】

対照パラメータは、－５、－３日目、及び１日目の注射直前の投与前測定からのものであった。肝臓におけるＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９活性のバイオマーカーである血清アルファ－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）濃度は、血清試料中にＥＬＩＳＡによって測定された。

【0286】

毎日の臨床観察、臨床血液化学、及び血液学パラメータは目立たず、投与前の対照と変わらなかった（データは示していない）。体重は、この年齢の雌のサルの通常の歴史的成長範囲と一致する方法で研究期間にわたって増加し、どの時点でも群間で差はなかった（図１６、左側のパネルは平均パーセント変化±ＳＥＭを示し、右側のパネルは個々の動物の値を示す）。注射部位では、いずれの動物のいずれの用量レベルでも、炎症反応やその他の反応は観察されなかった。まとめると、これらの結果は、最大１０ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を単回にＳＣ投与することが、ヒト以外の霊長類で十分に許容されたことを示す。

【0287】

製造業者の指示に従って、ヒトアルファ１アンチトリプシン検出用の市販のＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して、２５μＬの血清中のＡ１ＡＴタンパク質濃度を測定した。試料は、ＥＬＩＳＡによって二重に分析した。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置後の血清中のＡ１ＡＴタンパク質濃度の減少は、投与前のＡ１ＡＴ血清タンパク質濃度のパーセント減少として計算された。

【0288】

ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の投与により、全ての群で循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度が用量依存的に確実に減少し、単回のＳＣ投与の４週後に最大の減少が見られた。この時点で、ベースラインと比較した循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度の最大減少は、１ｍｇ／ｋｇ群で２．２倍（５５％減少）、３ｍｇ／ｋｇ群で４．８倍（７９％減少）、１０ｍｇ／ｋｇ群で６．７倍（８４％減少）であった（Ｐ＜０．０００１、全群）（図１７Ａ）。４週目に観察された最大の薬力学的効果は、１ｍｇ／ｋｇ群では７週目まで、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群では８週目まで維持され、その後、Ａ１ＡＴの循環濃度はゆっくりとベースライン濃度に戻った。１ｍｇ／ｋｇ投与群では、Ａ１ＡＴタンパク質濃度は、投与後約１８週間でベースラインに戻った。３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群では、研究の最終日（２４週目）までにベースライン濃度に達しておらず、それぞれ研究終了時にベースライン血清Ａ１ＡＴ濃度の８６％及び６２％に達した。７０～８０％の循環Ａ１ＡＴが肝実質細胞によって生成されることが報告されており（Ｊａｎｃｉａｕｓｋｉｅｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１１） １０５， １１２９ｅ１１３９）、従って１０ｍｇ／ｋｇ群で達成された８４％の減少は、達成可能な最大効果に近かった可能性がある（図１７Ａ及び１７Ｂ）。これは、薬力学的反応が、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与群で用量比例よりも小さかったという観察によってさらに裏付けられている。しかしながら、１ｍｇ／ｋｇ投与群の結果は、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の５０％有効用量（ＥＤ５０）が非ヒト霊長類でおよそ１ｍｇ／ｋｇであることを示唆している。

【0289】

考察及び結論
毎日の臨床観察、ＣＢＣ、及び血液学は目立たず、投与前の対照と変わらなかった。体重は、研究期間全体にわたって各投与群で増加し、いずれの時点でも群間で差はなかった。注射後７２時間まで、いずれの動物のいずれの用量レベルでも、注射部位反応は観察されなかった。まとめると、これらの観察は、最大１０ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を単回にＳＣ投与することが、ヒト以外の霊長類で十分に許容されたことを示す。さらに、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の投与により、全ての投与群のサルで循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度が用量依存的に確実に減少した。

【0290】

一部のＰｉＺＺ患者に見られる肝臓病状の効果的な治療法は、満たされない医学的要求が高いことを示している（Ｌｏｍａｓ， ＤＡ． Ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ａｌｐｈａ－１ ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｍｉａｍｉ，Ｆｌａ．）． ２０１８；５（４）：２３３－４３）。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９は、ＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡ及びＡ１ＡＴタンパク質レベルを選択的に低減させ、肝臓のＺ－ＡＡＴタンパク質蓄積を低減させるように設計されたｓｉＲＮＡ治療薬である。肝実質細胞によって生成されたＡ１ＡＴは、循環系に分泌されるため、Ａ１ＡＴ血清濃度は、肝臓を直接サンプリングせずにＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の有効性を評価するのに有用なバイオマーカーとなる。

【0291】

Ａ１ＡＴＤ患者の肝疾患の進行は、肝実質細胞におけるＺ－ＡＡＴの進行性蓄積に関連している（Ｔｅｃｋｍａｎ， Ｊ．Ｈ．， ２０１３ ＣＯＰＤ． ２０１３ Ｍａｒ；１０ Ｓｕｐｐｌ １：３５－４３）。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９は、ＰｉＺＺ患者の肝疾患の進行を遅延させたり、停止させたり、場合によっては逆行させたりする有意義な治療的介入を生み出す可能性がある。したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９は、肝疾患及び関連症状を有するＰｉＺＺ患者の生命を救う治療的介入を表している可能性がある。

【0292】

実施例７：ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９で処置したカニクイザルにおけるＡ１ＡＴタンパク質の用量依存的ノックダウン
本研究のこの段階の目的は、この反復投与毒性試験でカニクイザルに３０、１００、または３００ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を４回ＳＣ投与した場合、８７日目及び１４１日目の循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度が減少することで評価されるＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の薬力学的効果を決定することであった。若い成体（約４２ヶ月齢）及び若年（約１５ヶ月齢）のサルに、研究の１日目及び２８日ごとにＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を投与した。

【0293】

製造業者の指示に従って、ヒトアルファ１アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１）のＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して、２５μＬの血清中のＡ１ＡＴタンパク質濃度を二重測定した。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置群におけるＡ１ＡＴタンパク質濃度の低下は、雌雄独立して同一の日の同齢対照（生理食塩水処置）群の平均発現レベルに対する発現率として計算され、対照群のＡ１ＡＴタンパク質濃度は１００％に設定された。

【0294】

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で平均±標準誤差のグラフを作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータを分析した。独立ｔ検定を用いて、同じ時点の同齢の対照群におけるＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置群のＡ１ＡＴタンパク質濃度を比較した。統計的有意性は、サルが３匹以上の群でのみ計算された。

【0295】

Ａ１ＡＴタンパク質濃度に対するＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の阻害効果を図１８に示す。８７日目に採取された血液中の循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度の薬力学的分析により、若い成体及び若年サルにおいて５７．３％～８３．８％の減少が示される。無治療期間の終了日に、若年サルの循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度の５７．８％～７５．８％の減少が持続された。雌雄の若年サルの間で、循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度の減少に有意な差は見られなかったが、循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度は、雄の若い成体サルよりも雌で大幅に減少した。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９処置により、雄の若い成体サルと比較して、雄の若年サルの循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度が大幅に減少した。用量反応は明らかではなかった。

【0296】

３ヶ月の投与期間の終了日（８７日目）に採取された血液中の循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度の薬力学的分析により、若い成体及び若年サルにおいておよそ７０％～８０％の減少が示される。無治療期間の終了日（１４１日目）に、若年サルの循環Ａ１ＡＴタンパク質濃度のおよそ６５％の減少が持続された。薬力学的効果における有意な用量、性別、または年齢に関連した違いは明らかではなかった。

【0297】

実施例８：ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の長期処置の用量反応は、ＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡノックダウン及び治療耐性を示す
本研究の目的は、カニクイザルにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の９ヶ月反復投与（４週ごと、１０回投与）皮下注射の薬力学的効果を決定することであった。

【0298】

雌雄のカニクイザル群に、対照（生理食塩水）または２０、６０、もしくは１８０ｍｇ／ｋｇのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９を皮下（ＳＣ）注射した。各群には、２５５日目に剖検を受けた主な研究動物と、２５３日目の投与後に治療を中止した回復動物（Ｒ）の両方が含まれていた。これらの動物は、３０９日目（投与８週後）に剖検された。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９は、９ヶ月間、２８日ごとに合計１０回の皮下投与を受けた。毎月のＳＣ投与量は、各投与セッションの２日前に収集された体重に基づいていた。

【0299】

検証されていない方法を使用し、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を使用してＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡ発現を測定することにより、全ての投与群の主要研究及び回復剖検の両方で、雄雌の肝臓試料を分析した。

【0300】

ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の薬力学（ＰＤ）は、全ての処置群の雄雌のカニクイザル由来の肝臓で分析された（図１９）。ＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの発現は、全てのＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９投与群の最終（主要試験）及び回復時点の両方において、対照で見られるレベルの５％未満に減少した。対照動物の変動性（１８～１８８％の範囲）にもかかわらず、ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の強力な活性は、２０ｍｇ／ｋｇを投与した回復動物を除き、最終時点及び回復時点のカニクイザルにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の全ての用量レベルで、ＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡ発現の有意な減少によって実証された。雄雌のサルの間で、発現または活性に明らかな差はなかった。主要時点及び回復時点の間でＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡ発現に有意な差はなく、ｍＲＮＡ発現が回復していないことが示唆された。ＳＥＲＰＩＮＡ１－１４５９の９ヶ月にわたる皮下反復投与（１０回投与）は、カニクイザルにおいて最大１８０ｍｇ／ｋｇのレベルで良好に忍容された。

【0301】

追加の引用
Ｄｏｎａｔｏ， Ｌ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，（２０１２）， Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｖｅ Ｒａｎｇｅｓ ｆｏｒ α１－Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ Ａｄｕｌｔ ａｎｄ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． １３８（３）：３９８－４０５。
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【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表4-6】

【表4-7】

【表4-8】

【表4-9】

【表4-10】

【表4-11】

【表4-12】

【表4-13】

【表4-14】

【表4-15】

【表4-16】

【表4-17】

【表4-18】

【表4-19】

【表4-20】

【表4-21】

【表4-22】

【表4-23】

【表4-24】

【0302】

【図1-1】

【図1-2】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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【国際調査報告】