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特表2024-532133組換えアデノ随伴ウイルスの精製のためのアニオン交換クロマトグラフィー方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】組換えアデノ随伴ウイルスの精製のためのアニオン交換クロマトグラフィー方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/02 20060101AFI20240829BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20240829BHJP
【ＦＩ】
C12N7/02
C12N7/01
C12N15/864 100Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509051
(86)(22)【出願日】2022-08-17
(85)【翻訳文提出日】2024-04-12
(86)【国際出願番号】 US2022075056
(87)【国際公開番号】W WO2023023541
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】63/234,059
(32)【優先日】2021-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513252910
【氏名又は名称】ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】チェン， デニス ペリー
(72)【発明者】
【氏名】ディ， ウェン－ジュン
(72)【発明者】
【氏名】ファン， チャオ
(72)【発明者】
【氏名】ツァイ， イン
(72)【発明者】
【氏名】ウォーレン， ジェイムズ シー．
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065BD14
4B065BD22
4B065BD50
4B065CA44
(57)【要約】
アニオン交換媒体を使用してウイルスキャプシド調製物中の完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離する方法が提供される。方法は、四級アンモニウム塩を含む洗浄溶液を使用する工程を伴い得る。方法は、多数の四級アンモニウム塩洗浄溶液と組み合わせて、ウイルスキャプシド調製物をアニオン交換媒体に付与する工程を包含する。本開示は、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを使用するウイルスキャプシド調製物（例えば、ｒＡＡＶ調製物）中の完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子の分離が、四級アンモニウム（ＱＡ）クロリド（例えば、テトラエチルアンモニウムクロリド［ＴＥＡＣ］）が分離のために使用される溶液のうちの１またはこれより多くのものの中に含まれる場合に改善され得る；さらなる改善は、マグネシウム塩（例えば、塩化マグネシウム［ＭｇＣｌ２］）とともに使用される場合に特に認められるという洞察に一部基づく。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルスキャプシド調製物中の完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離する方法であって、前記方法は、（ａ）前記ウイルスキャプシド調製物をアニオン交換媒体に付与する工程；
（ｂ）四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を前記アニオン交換媒体に通過させて、空のウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分を得る工程；
（ｃ）第２の洗浄溶液を前記アニオン交換媒体に通過させて、前記四級アンモニウム塩を含む第２の洗浄画分を得る工程；
（ｄ）溶離溶液を前記アニオン交換媒体に通過させて、前記完全キャプシド粒子を溶離する工程；および
（ｅ）完全キャプシド粒子を含む溶離画分を収集する工程；
を包含し、それによって完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離し、
ここで（ｉ）前記第１の洗浄溶液中の前記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）前記溶離溶液の塩組成は工程（ｄ）の間中一定のままである、
方法。
【請求項2】
工程（ｂ）を１回またはこれより多く反復する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程（ｃ）を１回またはこれより多く反復する工程を包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
（ｄ）を１回またはこれより多く反復する工程を包含する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
溶離方法であって、前記方法は、（ａ）アニオン交換媒体と完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物とを接触させる工程；
（ｂ）前記アニオン交換媒体に、四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を付与して、第１の洗浄画分を得る工程；
（ｃ）前記アニオン交換媒体を第２の洗浄溶液に付与して、第２の洗浄画分を得る工程；ならびに
（ｄ）前記アニオン交換媒体に溶離溶液を付与し、溶離画分を収集する工程、
を包含し、ここで前記第１の洗浄溶液中の前記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）前記溶離溶液の塩組成は、工程（ｄ）の間中一定のままである、方法。
【請求項6】
工程ｂ）を１回またはこれより多く反復する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
工程ｃ）を１回またはこれより多く反復する工程を包含する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
ｄ）を１回またはこれより多く反復する工程を包含する、請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記第２の洗浄溶液および前記溶離溶液は、四級アンモニウム塩を含まない、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記第１の洗浄溶液は別として、前記四級アンモニウム塩を含む他の溶液は、前記アニオン交換媒体を通過しないかまたは前記アニオン交換媒体に付与されない、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記第１の洗浄溶液は別として、任意の四級アンモニウム塩を含む他の溶液をも、前記アニオン交換媒体を通過しないかまたは前記アニオン交換媒体に付与されない、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記第１の洗浄溶液は、約９０ｍＭ～約１３０ｍＭの濃度の四級アンモニウム塩を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記第１の洗浄溶液は、約１１０ｍＭ 四級アンモニウム塩の濃度を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムクロリドである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記テトラアルキルアンモニウムクロリドは、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）、テトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰＡＣ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記テトラアルキルアンモニウムクロリドはＴＥＡＣである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムアセテートである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記四級アンモニウム塩は、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ－Ａｃ）、テトラプロピルアンモニウムアセテート、テトラブチルアンモニウムアセテート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記四級アンモニウム塩は、ＴＥＡ－Ａｃである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記四級アンモニウム塩は、塩化コリンである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記第１の洗浄溶液、前記第２の洗浄溶液、および／または前記溶離溶液のうちのいずれか１つまたはこれより多くのものは、二価塩をさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記第１の洗浄溶液は、二価塩をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記二価塩は、ＭｇＣｌ２である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記第１の洗浄溶液は、約１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記第１の洗浄溶液は、約２ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記第１の洗浄溶液は、約３０ｍＭ～約２００ｍＭの濃度のＴＥＡＣを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項27】
前記第１の洗浄溶液は、約１１０ｍＭの濃度のＴＥＡＣを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記第１の洗浄溶液は、二価塩をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記二価塩は、ＭｇＣｌ２である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記第１の洗浄溶液は、約１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記第１の洗浄溶液は、約２ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記第２の洗浄溶液および／または前記溶離溶液は、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記第２の洗浄溶液は、ＮａＣｌを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記第２の洗浄溶液は、約２５ｍＭ～約３７５ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記第２の洗浄溶液は、約７０ｍＭ～約１４０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記溶離溶液は、ＮａＣｌを含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記溶離溶液は、約２５ｍＭ～約３７５ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記溶離溶液は、約９０ｍＭ～約１４０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記溶離溶液は、アニオン種を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記アニオン種は、テトラフルオロボレート（ＢＦ４）、ブロミド（Ｂｒ）、およびアセテート（Ａｃ）からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記アニオン種は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）と会合される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項42】
前記溶離溶液は、ＭｇＣｌ２を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記溶離溶液は、少なくとも１ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記溶離溶液は、約１ｍＭ～約５ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項45】
前記溶離溶液は、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、または約５ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項46】
前記第１の洗浄溶液、前記第２の洗浄溶液、および／または前記溶離溶液は各々、ｐＨ約９の緩衝液系を含む、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記第１の洗浄溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記空のキャプシド粒子のうちの少なくとも６０％を溶離する、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記第１の洗浄溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記空のキャプシド粒子のうちの少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％、例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）を溶離する、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記第１の洗浄溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子を実質的に溶離しない、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
前記第１の洗浄溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子のうちの３０％またはこれ未満（例えば、０～３０％、例えば、約０、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％）を溶離する、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記第１の洗浄溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子のうちの１％またはこれ未満を溶離する、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記第２の洗浄画分は、四級アンモニウム塩を含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
前記第２の洗浄溶液は、前記第１の洗浄溶液に存在する前記四級アンモニウム塩のうちの少なくとも５０％を溶離する、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
前記第２の洗浄溶液は、前記第１の洗浄溶液に存在する前記四級アンモニウム塩のうちの少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％、例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）を溶離する、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記第２の洗浄溶液は、前記第１の洗浄溶液に存在する前記四級アンモニウム塩のうちの少なくとも９９％を溶離する、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記第２の洗浄溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子を実質的に溶離しない、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
前記第２の洗浄溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子のうちの２０％またはこれ未満（例えば、０～２０％、例えば、約０、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）を溶離する、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記第２の洗浄溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子のうちの１％またはこれ未満を溶離する、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記溶離溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子を実質的に溶離する、請求項１～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
前記溶離溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子のうちの少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％、例えば、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）を溶離する、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記溶離溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子のうちの少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％、例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）を溶離する、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記溶離溶液は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子のうちの少なくとも９９％を溶離する、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記溶離画分は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子のうちの少なくとも５０％を含む、請求項１～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項64】
前記溶離画分は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子のうちの少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％、例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記溶離画分は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記完全キャプシド粒子のうちの少なくとも９９％を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記溶離画分に存在する前記キャプシド粒子のうちの少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％、例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である、請求項１～６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
前記溶離画分に存在する前記キャプシド粒子のうちの少なくとも４０％（例えば、４０％～１００％、例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記溶離画分に存在する前記キャプシド粒子のうちの少なくとも４５％（例えば、４５％～１００％、例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
前記溶離画分に存在する前記キャプシド粒子のうちの少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％、例えば、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記溶離画分に存在する前記キャプシド粒子のうちの５０％超（例えば、５０％超かつ１００％まで、例えば、約５１％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記溶離画分は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記空のキャプシド粒子のうちの５０％以下を含み、それによって、前記ウイルスキャプシド調製物から前記完全キャプシド粒子を実質的に精製する、請求項１～７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項72】
前記溶離画分は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記空のキャプシド粒子のうちの１０％以下を含み、それによって、前記ウイルスキャプシド調製物から前記完全キャプシド粒子を実質的に精製する、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記溶離画分は、前記ウイルスキャプシド調製物に存在する前記空のキャプシド粒子のうちの１％以下を含み、それによって、前記ウイルスキャプシド調製物から前記完全キャプシド粒子を実質的に精製する、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
前記第１の洗浄溶液中の前記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項75】
前記第１の洗浄溶液の塩組成は、工程（ｂ）の間中一定のままである、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
前記第２の洗浄溶液の塩組成は、工程（ｃ）の間中一定のままである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項77】
前記溶離溶液の塩組成は、工程（ｄ）の間中一定のままである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項78】
１～２０ 全カラム容積が溶離される、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
１～１０ 全カラム容積が溶離される、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
前記第１の洗浄溶液の塩組成、前記第２の洗浄溶液の塩組成、および前記溶離溶液の塩組成は、各個々の洗浄または溶離工程の間中一定のままである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項81】
前記第１の洗浄溶液の組成は、工程（ｂ）の間に変動する、請求項１～７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項82】
前記第２の洗浄溶液の組成は、工程（ｃ）の間に変動する、請求項１～７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項83】
前記第２の洗浄物内の塩の濃度は、工程（ｃ）の間中経時的に連続して増大する、請求項８２に記載の方法。
【請求項84】
前記第２の洗浄溶液内の塩の濃度は、工程（ｃ）の間中経時的に直線的に増大する、請求項８３に記載の方法。
【請求項85】
前記溶離溶液の組成は、工程（ｄ）の間に変動する、請求項１～７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項86】
前記溶離溶液内の塩の濃度は、工程（ｄ）の間中経時的に連続して増大する、請求項８５に記載の方法。
【請求項87】
前記溶離溶液内の塩の濃度は、工程（ｄ）の間中経時的に直線的に増大する、請求項８６に記載の方法。
【請求項88】
０～２００ 全カラム容積が溶離される、請求項８５～９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項89】
５０～１５０ 全カラム容積が溶離される、請求項８８に記載の方法。
【請求項90】
約９０ 全カラム容積が溶離される、請求項８８に記載の方法。
【請求項91】
前記キャプシドは、ＡＡＶ８またはその改変体に由来する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項92】
前記アニオン交換媒体は、モノリシックカラムである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項93】
前記モノリシックカラムは、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムである、請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
前記方法は、ＭｇＣｌ２のイソクラティック溶離勾配を使用する工程を含まない、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項95】
前記第１の洗浄溶液は、ＭｇＣｌ２をさらに含み、ＭｇＣｌ２の濃度が一定である場合、ＭｇＣｌ２の濃度は、工程（ｂ）の間中一定であるに過ぎない、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項96】
ウイルスキャプシド調製物中の完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離する方法であって、前記方法は、（ａ）前記ウイルスキャプシド調製物をアニオン交換媒体に付与する工程；
（ｂ）四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を前記アニオン交換媒体に通過させて、空のウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分を得る工程；
（ｃ）第２の洗浄溶液を前記アニオン交換媒体に通過させて、前記四級アンモニウム塩を含む第２の洗浄画分を得る工程；
（ｄ）溶離溶液を前記アニオン交換媒体に通過させて、前記完全キャプシド粒子を溶離する工程；および
（ｅ）完全キャプシド粒子を含む溶離画分を収集する工程；
を包含し、それによって、完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離し、
ここで前記第１の洗浄溶液中の前記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままであり、
ここで前記キャプシドは、ＡＡＶ８またはその改変体であり、
ここで前記溶離画分に存在する前記キャプシド粒子のうちの少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％、例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である、方法。
【請求項97】
前記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムクロリドである、請求項９６に記載の方法。
【請求項98】
前記テトラアルキルアンモニウムクロリドは、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）、テトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰＡＣ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項99】
前記テトラアルキルアンモニウムクロリドは、ＴＥＡＣである、請求項９８に記載の方法。
【請求項100】
前記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムアセテートである、請求項９６に記載の方法。
【請求項101】
前記四級アンモニウム塩は、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ－Ａｃ）、テトラプロピルアンモニウムアセテート，テトラブチルアンモニウムアセテート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項102】
前記四級アンモニウム塩は、ＴＥＡ－Ａｃである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項103】
前記四級アンモニウム塩は、塩化コリンである、請求項９６に記載の方法。
【請求項104】
完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシド粒子を製造するための方法であって、前記方法は、（ａ）完全ｒＡＡＶキャプシド粒子および空のｒＡＡＶキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、培養された哺乳動物細胞または昆虫細胞から生成する工程；
（ｂ）前記ウイルスキャプシド調製物をアニオン交換媒体に付与する工程；
（ｃ）四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を前記アニオン交換媒体に通過させて、空のｒＡＡＶウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分を得る工程；
（ｄ）第２の洗浄溶液を前記アニオン交換媒体に通過させて、前記四級アンモニウム塩を含む第２の洗浄画分を得る工程；
（ｅ）溶離溶液を前記アニオン交換媒体に通過させて、前記完全ｒＡＡＶキャプシド粒子を溶離する工程；および
（ｆ）完全ｒＡＡＶキャプシド粒子を含む溶離画分を収集する工程、
を包含し；
ここで（ｉ）前記第１の洗浄溶液中の前記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｃ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）前記溶離溶液の塩組成は、工程（ｅ）の間中一定のままである、方法。
【請求項105】
完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシド粒子を製造するための方法であって、前記方法は、（ａ）完全ｒＡＡＶキャプシド粒子および空のｒＡＡＶキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、培養された哺乳動物細胞または昆虫細胞から生成する工程；
（ｂ）アニオン交換媒体と前記ウイルスキャプシド調製とを接触させる工程；
（ｃ）前記アニオン交換媒体に四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を付与して、第１の洗浄画分を得る工程；
（ｄ）前記アニオン交換媒体に第２の洗浄溶液を付与して、第２の洗浄画分を得る工程；および
（ｅ）前記アニオン交換媒体に溶離溶液を付与し、溶離画分を収集する工程、
を包含し、
ここで（ｉ）前記第１の洗浄溶液中の前記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｃ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ） 前記溶離溶液の塩組成は、工程（ｅ）の間中一定のままである、
ここで前記溶離画分は、完全ｒＡＡＶキャプシド粒子を含む、方法。
【請求項106】
前記第１の洗浄溶液中の前記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｃ）の間中一定のままである、請求項１０４または１０５に記載の方法。
【請求項107】
前記ｒＡＡＶキャプシド粒子は、ｒＡＡＶ８キャプシド粒子である、請求項１０４、１０５、または１０６に記載の方法。
【請求項108】
前記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムクロリドである、請求項１０４～１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項109】
前記テトラアルキルアンモニウムクロリドは、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）、テトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰＡＣ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項110】
前記テトラアルキルアンモニウムクロリドはＴＥＡＣである、請求項１０９に記載の方法。
【請求項111】
前記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムアセテートである、請求項１０４～１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項112】
前記四級アンモニウム塩は、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ－Ａｃ）、テトラプロピルアンモニウムアセテート、テトラブチルアンモニウムアセテート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項113】
前記四級アンモニウム塩は、ＴＥＡ－Ａｃである、請求項１１２に記載の方法。
【請求項114】
前記四級アンモニウム塩は、塩化コリンである、請求項１０４～１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項115】
前記溶離画分中のｒＡＡＶキャプシド粒子のうちの少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％、例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全ｒＡＡＶキャプシド粒子である、請求項１０４～１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項116】
請求項１０４～１１５のいずれか１項に記載の方法によって生成される、完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシド粒子を含む組成物。
【請求項117】
前記組成物中のｒＡＡＶキャプシド粒子のうちの少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％、例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全ｒＡＡＶキャプシド粒子である、請求項１１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年８月１７日出願の米国仮特許出願第６３／２３４，０５９号（その内容全体は、全ての目的のためにその全体において本明細書に参考として援用される）に基づく利益および優先権を主張する。
本出願は、２０２１年８月１７日出願の米国仮特許出願第６３／２３４，０５９号（その内容全体は、全ての目的のためにその全体において本明細書に参考として援用される）に基づく利益および優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
背景
種々の遺伝子治療製品が、ヒト疾患を処置するために現在開発されている最中である。これらの治療剤のうちの多くは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶｓ）を使用し、これは、目的の異種核酸（例えば、治療用タンパク質をコードする遺伝子、アンチセンス核酸分子、リボザイム、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸など）を、患者の病的な標的細胞に送達するために操作されている。
種々の遺伝子治療製品が、ヒト疾患を処置するために現在開発されている最中である。これらの治療剤のうちの多くは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶｓ）を使用し、これは、目的の異種核酸（例えば、治療用タンパク質をコードする遺伝子、アンチセンス核酸分子、リボザイム、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸など）を、患者の病的な標的細胞に送達するために操作されている。
【0003】
これらのｒＡＡＶｓは、全体的にまたは部分的に、ＡＡＶゲノムの内部部分を欠失させ、目的の異種核酸を逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）の間に挿入することによって操作される。上記ＩＴＲｓは、このようなベクターの中で機能的なままであり、上記ＡＡＶキャプシド内に封入された核酸カーゴを含むＡＡＶ粒子の複製およびパッケージングを可能にする。代表的には、上記異種核酸は、患者の標的細胞において上記カーゴの発現を駆動し得る調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）に作動可能に連結される。
【0004】
種々の方法が、大量のこれらｒＡＡＶｓを製造するために開発されている。これらの方法は、代表的には、上記ｒＡＡＶｓが宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）内で生成される「上流」の作業および上記ｒＡＡＶｓが収集および精製される「下流」の作業を伴う。代表的には、上記上流段階の間の上記核酸カーゴのパッケージングにおける非効率は、「完全」ＡＡＶ粒子（すなわち、目的の核酸を含む粒子）および「空の」ＡＡＶ粒子（すなわち、上記核酸カーゴを全体的にまたは部分的に欠いているＡＡＶ粒子）の混合物を含むｒＡＡＶ調製物をもたらす。
【0005】
遺伝子治療製品中の空のＡＡＶ粒子の存在は、治療有効性を達成するために必要とされる全体的な用量を増大させ得、患者への投与の際に、免疫応答（例えば、中和抗体またはＴ細胞活性化の発生）を促進し得る。
【0006】
従って、現在の上流のプロセスによって生成されるｒＡＡＶ調製物において完全ＡＡＶ粒子を空のＡＡＶ粒子から分離するために使用され得る下流の精製法は、当該分野で必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
要旨
本開示は、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを使用するウイルスキャプシド調製物（例えば、ｒＡＡＶ調製物）中の完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子の分離が、四級アンモニウム（ＱＡ）クロリド（例えば、テトラエチルアンモニウムクロリド［ＴＥＡＣ］）が、分離のために使用される溶液のうちの１またはこれより多くのものの中に含まれる場合に改善され得る；さらなる改善は、マグネシウム塩（例えば、塩化マグネシウム［ＭｇＣｌ２］）とともに使用される場合に特に認められるという洞察に一部基づく。
本開示は、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを使用するウイルスキャプシド調製物（例えば、ｒＡＡＶ調製物）中の完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子の分離が、四級アンモニウム（ＱＡ）クロリド（例えば、テトラエチルアンモニウムクロリド［ＴＥＡＣ］）が、分離のために使用される溶液のうちの１またはこれより多くのものの中に含まれる場合に改善され得る；さらなる改善は、マグネシウム塩（例えば、塩化マグネシウム［ＭｇＣｌ２］）とともに使用される場合に特に認められるという洞察に一部基づく。
【0008】
一局面において、ウイルスキャプシド調製物中の完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離する方法であって、上記方法は、
ａ）上記ウイルスキャプシド調製物をアニオン交換媒体に付与する工程；
ｂ）四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、空のウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分を得る工程；
ｃ）第２の洗浄溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、上記四級アンモニウム塩を含む第２の洗浄画分を得る工程；
ｄ）溶離溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、上記完全キャプシド粒子を溶離する工程；および
ｅ）完全キャプシド粒子を含む溶離画分を収集する工程；
を包含し、それによって、完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離し、
ここで（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程（ｄ）の間中一定のままである方法が提供される。
ａ）上記ウイルスキャプシド調製物をアニオン交換媒体に付与する工程；
ｂ）四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、空のウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分を得る工程；
ｃ）第２の洗浄溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、上記四級アンモニウム塩を含む第２の洗浄画分を得る工程；
ｄ）溶離溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、上記完全キャプシド粒子を溶離する工程；および
ｅ）完全キャプシド粒子を含む溶離画分を収集する工程；
を包含し、それによって、完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離し、
ここで（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程（ｄ）の間中一定のままである方法が提供される。
【0009】
いくつかの実施形態において、上記方法は、工程ｂ）、工程ｃ）、および工程ｄ）のうちの１またはこれより多くのものを、１回またはこれより多く反復する工程を包含する。
【0010】
一局面において、溶離方法であって、上記方法は、
（ａ）アニオン交換媒体と完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物とを接触させる工程；
（ｂ）上記アニオン交換媒体に、四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を付与して、第１の洗浄画分を得る工程；
（ｃ）上記アニオン交換媒体に第２の洗浄溶液を付与して、第２の洗浄画分を得る工程；ならびに
（ｄ）上記アニオン交換媒体に溶離溶液を付与し、溶離画分を収集する工程、
を包含し、
ここで（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程（ｄ）の間中一定のままである方法が、提供される。
（ａ）アニオン交換媒体と完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物とを接触させる工程；
（ｂ）上記アニオン交換媒体に、四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を付与して、第１の洗浄画分を得る工程；
（ｃ）上記アニオン交換媒体に第２の洗浄溶液を付与して、第２の洗浄画分を得る工程；ならびに
（ｄ）上記アニオン交換媒体に溶離溶液を付与し、溶離画分を収集する工程、
を包含し、
ここで（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程（ｄ）の間中一定のままである方法が、提供される。
【0011】
いくつかの実施形態において、上記方法は、工程ｂ）、工程ｃ）、および工程ｄ）のうちの１またはこれより多くのものを、１回またはこれより多く反復する工程を包含する。
【0012】
いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液および上記溶離溶液は、四級アンモニウム塩を含まない。
【0013】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は別として、上記四級アンモニウム塩を含む他の溶液は、上記アニオン交換媒体を通過しないかまたは上記アニオン交換媒体に付与されない。
【0014】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は別として、任意の四級アンモニウム塩を含む他の溶液をも、上記アニオン交換媒体を通過しないかまたは上記アニオン交換媒体に付与されない。
【0015】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、約９０ｍＭ～約１３０ｍＭの濃度、例えば、約１１０ｍＭの四級アンモニウム塩を含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムクロリドである。例えば、例えば、いくつかの実施形態において、上記テトラアルキルアンモニウムクロリドは、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）、テトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰＡＣ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記テトラアルキルアンモニウムクロリドはＴＥＡＣである。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩はテトラアルキルアンモニウムアセテートである。
【0017】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ－Ａｃ）、テトラプロピルアンモニウムアセテート、テトラブチルアンモニウムアセテート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。例えば、いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩はＴＥＡ－Ａｃである。
【0018】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、塩化コリンである。
【0019】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液、上記第２の洗浄溶液、および／または上記溶離溶液のうちの任意の１またはこれより多くのものは、二価塩をさらに含む。
【0020】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、二価塩、例えば、ＭｇＣｌ２をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、約１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度、例えば、約２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む。
【0021】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、約３０ｍＭ～約２００ｍＭの濃度、例えば、約１１０ｍＭのＴＥＡＣを含む。いくつかのこのような実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、二価塩、例えば、ＭｇＣｌ２をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、約１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度、例えば、約２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液および／または上記溶離溶液は、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、例えば、約２５ｍＭ～約３７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約７０ｍＭ～約２００ｍＭ、約７０ｍＭ～約１４０ｍＭ、または約９０ｍＭ～約１４０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、例えば、約２５ｍＭ～約３７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約７０ｍＭ～約２００ｍＭ、約７０ｍＭ～約１４０ｍＭ、または約９０ｍＭ～約１４０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。
【0023】
いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、アニオン種を含み、例えば、アニオン種は、テトラフルオロボレート（ＢＦ４）、ブロミド（Ｂｒ）、およびアセテート（Ａｃ）からなる群より選択される。
【0024】
いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、ＭｇＣｌ２、例えば、少なくとも１ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、または約５ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む。
【0025】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液、上記第２の洗浄溶液、および／または上記溶離溶液は各々、ｐＨ約９の緩衝液系を含む。
【0026】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記空のキャプシド粒子のうちの少なくとも６０％または少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％、例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）を溶離する。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子を実質的に溶離しない。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの３０％もしくはこれ未満（例えば、０～３０％、例えば、約０、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％）または１％もしくはこれ未満を溶離する。
【0027】
いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄画分は、上記四級アンモニウム塩を含む。いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、上記第１の洗浄溶液に存在する上記四級アンモニウム塩のうちの少なくとも５０％、少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％、例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）、または少なくとも９９％を溶離する。
【0028】
いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子を実質的に溶離しない。いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの２０％もしくはこれ未満（例えば、０～２０％、例えば、約０， １％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）または１％もしくはこれ未満を溶離する。
【0029】
いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子を実質的に溶離する。いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの少なくとも５０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％を溶離する。
【0030】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％、例えば、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）、少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％、例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）、または少なくとも９９％を含む。
【0031】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記空のキャプシド粒子のうちの５０％もしくはこれ未満、１０％もしくはこれ未満、または１％もしくはこれ未満を含み、それによって、上記完全キャプシド粒子を上記ウイルスキャプシド調製物から実質的に精製する。
【0032】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分に存在する上記キャプシド粒子のうちの少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％、例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である。
【0033】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分に存在する上記キャプシド粒子のうちの少なくとも４０％（例えば、４０％～１００％、例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である。
【0034】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分に存在する上記キャプシド粒子のうちの少なくとも４５％（例えば、４５％～１００％、例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である。
【0035】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分に存在する上記キャプシド粒子のうちの少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％、例えば、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である。
【0036】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分に存在する上記キャプシド粒子のうちの５０％超（例えば、５０％超かつ１００％まで、例えば、約５１％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である。
【0037】
ある特定の実施形態において、上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままである。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液の塩組成は、工程（ｂ）の間中一定のままである。いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液の塩組成は、工程（ｃ）の間中一定のままである。
【0038】
いくつかの実施形態において、上記溶離溶液の塩組成は、工程（ｄ）の間中一定のままである。いくつかの実施形態において、１～２０ 全カラム容積、 例えば、１～１０ 全カラム容積が溶離される。
【0039】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液の塩組成、上記第２の洗浄溶液の塩組成、および上記溶離溶液の塩組成は、各個々の洗浄または溶離工程の間中一定のままである。
【0040】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液の組成は、工程（ｂ）の間に変動する。
【0041】
いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液の組成は、工程（ｃ）の間に変動する。例えば、いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液内の塩の濃度は、工程（ｃ）の間中経時的に連続して増大する。いくつかの実施形態において、この連続的増大は、工程（ｃ）の間中経時的に直線的である。
【0042】
いくつかの実施形態において、上記溶離溶液の組成は、工程（ｄ）の間に変動する。例えば、いくつかの実施形態において、上記溶離溶液内の塩の濃度は、工程（ｄ）の間中経時的に連続して増大する。いくつかの実施形態において、この連続的増大は、工程（ｄ）の間中経時的に直線的である。
【0043】
いくつかの実施形態において、０～２００ 全カラム容積、例えば、５０～１５０ 全カラム容積、例えば、約９０ 全カラム容積が溶離される。
【0044】
いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８またはその改変体に由来する。
【0045】
いくつかの実施形態において、上記アニオン交換媒体は、モノリシックカラムである。例えば、いくつかの実施形態において、上記モノリシックカラムは、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムである。
【0046】
いくつかの実施形態において、上記方法は、ＭｇＣｌ２のイソクラティック溶離勾配を使用する工程を含まない。
【0047】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液のうちの１またはこれより多くのものがＭｇＣｌ２を含み、上記第１の洗浄溶液中のＭｇＣｌ２の濃度が一定である場合、ＭｇＣｌ２の濃度は、工程（ｂ）の間中一定であるに過ぎない。
【0048】
一局面において、ウイルスキャプシド調製物中の完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離する方法であって、上記方法は、
（ａ）上記ウイルスキャプシド調製物をアニオン交換媒体に付与する工程；
（ｂ）四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、空のウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分を得る工程；
（ｃ）第２の洗浄溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、上記四級アンモニウム塩を含む第２の洗浄画分を得る工程；
（ｄ）溶離溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、上記完全キャプシド粒子を溶離する工程；および
（ｅ）完全キャプシド粒子を含む溶離画分を収集する工程；
を包含し、
それによって、完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離し、
ここで（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままであり、
ここで上記キャプシドは、ＡＡＶ８またはその改変体に由来し、
ここで上記溶離画分に存在する上記キャプシド粒子のうちの少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％、例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である方法が提供される。
（ａ）上記ウイルスキャプシド調製物をアニオン交換媒体に付与する工程；
（ｂ）四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、空のウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分を得る工程；
（ｃ）第２の洗浄溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、上記四級アンモニウム塩を含む第２の洗浄画分を得る工程；
（ｄ）溶離溶液を上記アニオン交換媒体に通過させて、上記完全キャプシド粒子を溶離する工程；および
（ｅ）完全キャプシド粒子を含む溶離画分を収集する工程；
を包含し、
それによって、完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離し、
ここで（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｂ）の間中一定のままであり、
ここで上記キャプシドは、ＡＡＶ８またはその改変体に由来し、
ここで上記溶離画分に存在する上記キャプシド粒子のうちの少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％、例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全キャプシド粒子である方法が提供される。
【0049】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムクロリドであり、例えば、テトラアルキルアンモニウムクロリドは、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）、テトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰＡＣ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記テトラアルキルアンモニウムクロリドは、ＴＥＡＣである。
【0050】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムアセテートであり、例えば、テトラアルキルアンモニウムアセテートは、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ－Ａｃ）、テトラプロピルアンモニウムアセテート、テトラブチルアンモニウムアセテート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、ＴＥＡ－Ａｃである。
【0051】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、塩化コリンである。
【0052】
一局面において、完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシド粒子を製造するための方法であって、上記方法は、
（ａ）完全ｒＡＡＶキャプシド粒子および空のｒＡＡＶキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、培養された哺乳動物細胞または昆虫細胞から生成する工程；
（ｂ）上記ウイルスキャプシド調製物をアニオン交換媒体に付与する工程；
（ｃ）四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を上記アニオン交換体に通過させて空のｒＡＡＶウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分を得る工程；
（ｄ）第２の洗浄溶液を上記アニオン交換体に通過させて、上記四級アンモニウム塩を含む第２の洗浄画分を得る工程；
（ｅ）溶離溶液を上記アニオン交換体に通過させて、上記完全ｒＡＡＶキャプシド粒子を溶離する工程；および
（ｆ）完全ｒＡＡＶキャプシド粒子を含む溶離画分 を収集する工程、
を包含し；
ここで（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｃ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程（ｅ）の間中一定のままである方法が提供される。
（ａ）完全ｒＡＡＶキャプシド粒子および空のｒＡＡＶキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、培養された哺乳動物細胞または昆虫細胞から生成する工程；
（ｂ）上記ウイルスキャプシド調製物をアニオン交換媒体に付与する工程；
（ｃ）四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を上記アニオン交換体に通過させて空のｒＡＡＶウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分を得る工程；
（ｄ）第２の洗浄溶液を上記アニオン交換体に通過させて、上記四級アンモニウム塩を含む第２の洗浄画分を得る工程；
（ｅ）溶離溶液を上記アニオン交換体に通過させて、上記完全ｒＡＡＶキャプシド粒子を溶離する工程；および
（ｆ）完全ｒＡＡＶキャプシド粒子を含む溶離画分 を収集する工程、
を包含し；
ここで（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｃ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程（ｅ）の間中一定のままである方法が提供される。
【0053】
一局面において、完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシド粒子を製造するための方法であって、上記方法は、
（ａ）完全ｒＡＡＶキャプシド粒子および空のｒＡＡＶキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、培養された哺乳動物細胞または昆虫細胞から生成する工程；
（ｂ）アニオン交換媒体と上記ウイルスキャプシド調製物とを接触させる工程；
（ｃ）上記アニオン交換体に四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を付与して、第１の洗浄画分を得る工程；
（ｄ）上記アニオン交換体に第２の洗浄溶液を付与して、第２の洗浄画分を得る工程；および
（ｅ）上記アニオン交換体に溶離溶液を付与して、溶離画分を収集する工程、
を包含し、
ここで（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｃ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程（ｅ）の間中一定のままである、
ここで上記溶離画分は、完全ｒＡＡＶキャプシド粒子を含む方法が提供される。
（ａ）完全ｒＡＡＶキャプシド粒子および空のｒＡＡＶキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、培養された哺乳動物細胞または昆虫細胞から生成する工程；
（ｂ）アニオン交換媒体と上記ウイルスキャプシド調製物とを接触させる工程；
（ｃ）上記アニオン交換体に四級アンモニウム塩を含む第１の洗浄溶液を付与して、第１の洗浄画分を得る工程；
（ｄ）上記アニオン交換体に第２の洗浄溶液を付与して、第２の洗浄画分を得る工程；および
（ｅ）上記アニオン交換体に溶離溶液を付与して、溶離画分を収集する工程、
を包含し、
ここで（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｃ）の間中一定のままである、および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程（ｅ）の間中一定のままである、
ここで上記溶離画分は、完全ｒＡＡＶキャプシド粒子を含む方法が提供される。
【0054】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、工程（ｃ）の間中一定のままである
【0055】
いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶキャプシド粒子は、ｒＡＡＶ８キャプシド粒子である。
【0056】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムクロリドであり、例えば、テトラアルキルアンモニウムクロリドは、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）、テトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰＡＣ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩はＴＥＡＣである。
【0057】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウムアセテートであり、例えば、テトラアルキルアンモニウムアセテートは、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ－Ａｃ）、テトラプロピルアンモニウムアセテート、テトラブチルアンモニウムアセテート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩はＴＥＡ－Ａｃである。
【0058】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は塩化コリンである。
【0059】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分中のｒＡＡＶキャプシド粒子のうちの少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％、例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全ｒＡＡＶキャプシド粒子である。
【0060】
一局面において、本明細書で開示されるとおりの製造方法によって生成される完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシド粒子を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、上記組成物中のｒＡＡＶキャプシド粒子のうちの少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％、例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）は、完全ｒＡＡＶキャプシド粒子である。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【図1A-B】図１Ａおよび１Ｂは、例示的なクロマトグラムを示し、これは、種々のタイプの定常相に対してＮａＣｌ勾配を使用する、空のＡＡＶ粒子の完全ＡＡＶ８粒子からの分離を示す。図１Ａは、ＰＯＲＯＳＴＭ ５０ ＨＱカラムまたはＣＩＭ－Ｑカラムのいずれかを使用する、ＡＡＶ８－１粒子に対する実験からのクロマトグラムを示す。図１Ｂは、ＮｕｖｉａＴＭ ＱカラムまたはＣＩＭ－Ｑカラムのいずれかを使用する、ＡＡＶ８－２粒子に対する実験からのクロマトグラムを示す。「Ｅ」は、空のキャプシドの高い相対的量に相当する画分を示し、「Ｆ」は、完全キャプシドの高い相対的量に相当する画分を示す。上昇する直線は、ＮａＣｌ濃度における相当する増大によって引き起こされる溶液導電率における増大を示す（実施例１を参照のこと）。
【0062】
【0063】
【0064】
【0065】
【0066】
【0067】
【図7A-D】図７Ａ～７Ｄは、官能基のサイズが増大するとともに、ＱＡ塩勾配に関して完全ＡＡＶ粒子に対する空のＡＡＶ粒子分離の増大を実証する例示的なクロマトグラムを示す。上から下に、溶離は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（図７Ａ）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）（図７Ｂ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）（図７Ｃ）、およびベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）（図７Ｄ）勾配から得られる。ＮａＣｌ勾配のクロマトグラムは、「空の」および「完全」画分分離を比較するための参照として示される。上記クロマトグラムは、グラジエント溶離の間の溶離液のＡ２８０測定値を示す。上昇する直線は、溶離液濃度における相当する増大によって引き起こされる溶液導電率における増大を示す（実施例５を参照のこと）。
【0068】
【0069】
【0070】
【0071】
【0072】
【図12A-E】図１２Ａ～１２Ｅは、空のおよび完全ＡＡＶ８－２粒子を分離するために、ＭｇＳＯ４を使用する種々のプロトコールを使用する実験からの例示的なクロマトグラムを示す。上から下に、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラム、および１）グラジエント溶離（図１２Ａ）； ２）勾配洗浄、続いて、イソクラティック溶離（図１２Ｂ）； ３）１回のイソクラティック洗浄（図１２Ｃ）； ４）３回の洗浄を伴うイソクラティック溶離（図１２Ｄ）；または５）２回の洗浄を伴うイソクラティック溶離（図１２Ｅ）を使用する実験からのクロマトグラムが示される。各クロマトグラムにある橙色の線は、塩濃度に相当する溶液導電率を示す（実施例９を参照のこと）。
【0073】
【図13A-B】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対してグラジエント溶離またはイソクラティック溶離プロトコールを使用してＡＡＶ８－１材料に対して実行された分離実験からの結果を示す（実施例１０を参照のこと）。図１３Ａは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）法によって決定される場合、工程収量、すなわち、装填材料の量に対するプールした画分中の目的のゲノムの量を示す。図１３Ｂは、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって決定される場合、溶離液に存在する完全キャプシド粒子のパーセンテージを示す。図１３Ａおよび１３Ｂの両方における値は、グラジエント溶離プロトコールで観察されたものに対して正規化されている（実施例９を参照のこと）。
【0074】
【0075】
【0076】
【0077】
【0078】
【0079】
【図18A-C】図１８Ａ～１８Ｃは、３つの条件： １）ＮａＣｌ、グラジエント溶離を伴う（図１８Ａ）； ２）テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）勾配および２ｍＭ ＭｇＣｌ２（図１８Ｂ）；ならびに３）テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）および２ｍＭ ＭｇＣｌ２、イソクラティック溶離を伴う（図１８Ｃ）のうちの１つを使用してＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して実行された完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルに対する実験からの代表的クロマトグラムを示す。「Ｅ」は、空のキャプシドの高い相対的量に相当する画分を示し、「Ｆ」は、完全キャプシドの高い相対的量に相当する画分を示す（実施例１３を参照のこと）。
【0080】
【0081】
【0082】
【図21】図２１は、上記溶離溶液中のＭｇＣｌ２の種々の濃度（０、０．２ｍＭ、１ｍＭ、および５ｍＭ）を使用してＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して実行された、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルに対する実験からの代表的クロマトグラムを示す。トレース（実線）は、２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）を表し、アスタリスクは、１ｍＭまたは５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む溶離溶液を使用する実行からのトレースにおいて明らかに目に見えない第３の集団を示す。「空」ピーク（各クロマトグラムにおいて最も左側のピーク）の溶離プールにおいて測定される粒子力価は、それらの相当する溶離プロフィールの隣に示される（実施例１５を参照のこと）。
【0083】
【図22A-B】図２２Ａ～２２Ｄは、グラジエント溶離プロトコール（図２２Ａおよび２２Ｂ）またはイソクラティック溶離プロトコール（図２２Ｃおよび２２Ｄ）を使用してＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して実行された、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルに対する実験からの代表的クロマトグラムを示す。図２２Ｂおよび２２Ｄは、それぞれ、図２２Ａおよび２２Ｃからのピークの拡大画像を示す。各クロマトグラム内では、薄い実線は、２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）に相当し、濃い実線は、２５４ｎｍでの吸光度（Ａ２５４）に相当する／図２２Ａおよび２２Ｃにおける破線は、上記システムを通ってポンプ輸送される泳動緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、およびｐＨ９の２００ｍＭ ＮａＣｌ）の容積画分に相当する。図２２Ｂおよび２２Ｄ中の破線は、溶液導電率に相当する（実施例１６を参照のこと）。
【図22C-D】図２２Ａ～２２Ｄは、グラジエント溶離プロトコール（図２２Ａおよび２２Ｂ）またはイソクラティック溶離プロトコール（図２２Ｃおよび２２Ｄ）を使用してＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して実行された、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルに対する実験からの代表的クロマトグラムを示す。図２２Ｂおよび２２Ｄは、それぞれ、図２２Ａおよび２２Ｃからのピークの拡大画像を示す。各クロマトグラム内では、薄い実線は、２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）に相当し、濃い実線は、２５４ｎｍでの吸光度（Ａ２５４）に相当する／図２２Ａおよび２２Ｃにおける破線は、上記システムを通ってポンプ輸送される泳動緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、およびｐＨ９の２００ｍＭ ＮａＣｌ）の容積画分に相当する。図２２Ｂおよび２２Ｄ中の破線は、溶液導電率に相当する（実施例１６を参照のこと）。
【0084】
【発明を実施するための形態】
【0085】
ある特定の実施形態の詳細な説明
本開示は、ウイルスキャプシド調製物内の集団を分離するための、例えば、完全キャプシド粒子を空のキャプシド粒子から分離するための改善された方法を提供する。完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシド粒子を製造するための方法がまた、提供される。
本開示は、ウイルスキャプシド調製物内の集団を分離するための、例えば、完全キャプシド粒子を空のキャプシド粒子から分離するための改善された方法を提供する。完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシド粒子を製造するための方法がまた、提供される。
【0086】
定義
用語「約（ａｂｏｕｔ）」が定量的値の前に使用されている場合、本発明はまた、別段具体的に述べられなければ、その特定の定量的値自体を含む。本明細書で使用される場合、用語「約」とは、別段示されるかまたは推論されなければ、名目上の値から±１０％の変動に言及する。
用語「約（ａｂｏｕｔ）」が定量的値の前に使用されている場合、本発明はまた、別段具体的に述べられなければ、その特定の定量的値自体を含む。本明細書で使用される場合、用語「約」とは、別段示されるかまたは推論されなければ、名目上の値から±１０％の変動に言及する。
【0087】
本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）」とは、ヒトおよびいくらかの他の霊長類種に感染する小さな複製欠損性のエンベロープのないウイルスに言及する。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘起する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂中の細胞および静止期の細胞両方に感染し得、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、染色体外状態で生き残り得る。これらの特徴は、ＡＡＶを遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターにしている。ＡＡＶの血清型に関しては、現在、１３が認識されている（ＡＡＶ１～１３）。
【0088】
別段注記されなければ、用語「の間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」が数値範囲に言及するために使用される場合、その範囲は、その特定された端点を含む。例えば、「１ｍＭ～１０ｍＭの間の（ｂｅｔｗｅｅｎ １ｍＭ ａｎｄ １０ｍＭ）」範囲は、１ｍＭ、１０ｍＭ、および１ｍＭより大きいが１０ｍＭより小さい値を含む。
【0089】
本明細書で使用される場合、用語「キャプシド粒子（ｃａｐｓｉｄｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」は、（ｉ）核酸、例えば、ベクターゲノムもしくはその一部をキャプシドで被包する、および／または（ｉｉ）コアの周りに構造体を形成する少なくとも１つのウイルスキャプシドタンパク質を含む粒子に言及する。空のキャプシド粒子の場合には、本明細書で記載されるように、上記コアは、空もしくはつぶれていてもよいし、ベクターゲノムの一部のみを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、キャプシド粒子は、ベクターゲノムおよび／または目的の遺伝子である核酸をキャプシドで被包する。いくつかの実施形態において、キャプシド粒子は、目的のベクターゲノムもしくは遺伝子、例えば、プラスミドもしくは宿主細胞ＤＮＡ、またはその一部ではない核酸種をキャプシドで被包する。
【0090】
本明細書で使用される場合、用語「完全キャプシド粒子（ｆｕｌｌ ｃａｐｓｉｄｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」とは、完全ベクターゲノム、すなわち、両側にＡＡＶ ＩＴＲが隣接している目的の異種核酸を含むベクターゲノムを含むキャプシド粒子に言及する。
【0091】
本明細書で使用される場合、用語「空のキャプシド粒子（ｅｍｐｔｙ ｃａｐｓｉｄｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」とは、少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含み、かつ完全ベクターゲノムを欠いている、例えば、両側にＡＡＶ ＩＴＲが隣接している目的の異種核酸を全体的にもしくは部分的に欠いているか、または上記ベクターゲノムの別の部分を全体的にもしくは部分的に欠いているキャプシド粒子に言及する。
【0092】
別段注記されなければ、用語「から（ｆｒｏｍ）」および「まで（ｔｏ）」は、数値範囲に言及するために使用され、その範囲は、その特定の端点を含む。例えば、「１ｍＭから１０ｍＭまで、１ｍＭ～１０ｍＭ（ｆｒｏｍ １ｍＭ ｔｏ １０ｍＭ）」の範囲は、１ｍＭ、１０ｍＭ、および１ｍＭより大きいが１０ｍＭより小さい値、ならびに１ｍＭ～１０ｍＭを含みかつその間にある全ての整数を含む。
【0093】
本明細書で使用される場合、用語「グラジエント溶離（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ）」または「勾配分離（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）」とは、分離媒体に付与される上記溶離溶液中の１種またはこれより多くの塩の濃度を、その分離の間に徐々に変化させるクロマトグラフィー分離のモードに言及する。
【0094】
本明細書で使用される場合、用語「逆方向末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）」（「ＩＴＲ」と省略される）とは、効率的複製のために必要とされるアデノ随伴ウイルスのゲノム中の対称的な核酸配列に言及する。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。上記ＩＴＲｓは、ウイルスＤＮＡ合成のための複製起点として働き、ＡＡＶ組み込みベクターを生成するための必須のｃｉｓ構成要素である。
【0095】
用語「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の使用は、その文法上の等価物を含め、制限のない、かつ非限定的、例えば、別段具体的に述べられなければ、または文脈から別段理解されなければ、さらなる記載されていない要素または工程を排除しないと概して理解されるべきである。
【0096】
本明細書で使用される場合、用語「イソクラティック溶離（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ）」または「イソクラティック分離（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）」とは、溶液中の全ての塩の濃度が規定の分離期間中に一定に維持されるクロマトグラフィー分離のモード（例えば、「洗浄」工程の間の「洗浄」溶液および「溶離」工程の間の「溶離」溶液）に言及する。いくつかの実施形態において、イソクラティック溶離は、分離の間に一連の２種またはこれより多くの分離溶液を使用し、その分離溶液の各々は、その一連の中で別の溶液に対して１種またはこれより多くの塩の種々の固定された濃度を有し得る。
【0097】
本明細書で使用される場合、語句「イソクラティック溶離勾配（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ）」とは、移動相の組成が、１回のクロマトグラフィー実行の間の工程の中で変化する勾配に言及する。イソクラティック溶離勾配の各工程において、その移動相は、クロマトグラフィー実行におけるその後の工程まで同じ組成（例えば、一定濃度）で維持され、そのときに、移動相の組成は、その移動相の構成要素の濃度が以前の工程における構成要素の濃度に対して増大されるように変化される。従って、例えば、ＭｇＣｌ２のイソクラティック溶離勾配は、各ここの工程において一定のＭｇＣｌ２濃度で、しかし１つの工程からその後の工程へと漸増するＭｇＣｌ２濃度で種々の工程を使用することを伴う。
【0098】
本明細書で使用される場合、画分、例えば、溶液をアニオン交換媒体に通過させるまたは付与する工程の後の洗浄画分を「得る工程（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）」または「得る（ｔｏ ｏｂｔａｉｎ）」とは、上記画分がその工程の後に生成されることを意味する。「得られる」画分は、収集されてもよいしそうでなくてもよい。
【0099】
本明細書で使用される場合、用語「四級アンモニウム塩（quaternary ammonium salt）」とは、四級アンモニウム窒素、そのアンモニウム窒素に接続された４個の基（例えば、アルキルまたはアリール基）、およびアニオン性イオン（例えば、アセテート、ブロミド、またはクロリド）を有するイオン性化合物をいう。
【0100】
本明細書で使用される場合、用語「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」とは、例えば、天然に存在しない配列を有するか、または２つの別の方法で分離された配列セグメントの人為的な組み合わせによって作製される配列を有する核酸分子を記載するために使用され得る。この人為的な組み合わせは、化学合成によって、または核酸分子の単離されたセグメントの人為的な操作によって（例えば、遺伝子操作技術によって）達成され得る。
【0101】
「組換え随伴アデノウイルス調製物（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」または「ｒＡＡＶ調製物」とは、宿主細胞において（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞において）組換えＡＡＶを生成する（例えば、製造する）方法から生じる生成物に言及する。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶ調製物は、完全ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子の混合物を含む。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶ調製物は、当業者に周知のように、最初の上流の作業、例えば、ヌクレアーゼ処理、宿主細胞不純物を除去するための濾過、および／またはＡＡＶキャプシドを結合するリガンドを使用するアフィニティー精製後の１またはこれより多くの下流の作業に供されている。
【0102】
本明細書で使用される場合、用語「塩組成（ｓａｌｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、溶液を参照して使用される場合、その溶液中の全ての塩が何であるかおよびその量に言及する。従って、溶液の「塩組成」が特定の継続時間の間中一定のままであるといわれる場合、その溶液中の全ての塩が何であるかおよびその量が、その特定の継続時間の間中一定のままであることを意味する。
【0103】
本明細書で使用される場合、用語「分離化学現象（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」とは、活性リガンド（例えば、四級アミン）または分離媒体の混合マトリクスおよび支持マトリクスに言及する。
【0104】
本明細書で使用される場合、用語「分離媒体（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）」とは、ｒＡＡＶ調製物が、その調製物のある特定の画分の分離を達成するために付与される樹脂またはモノリスまたは膜が充填されたカラムのような物理的構造体に言及する。例えば、ｒＡＡＶ調製物は、カラムに付与され得、そのカラムは、次いで、１種またはこれより多くの溶液で洗浄されて、空のおよび完全ＡＡＶ粒子が互いから分離される（および分離した画分が収集される）。いくつかの実施形態において、分離媒体は、アニオン交換媒体である。いくつかの実施形態において、分離媒体は、アニオン交換媒体として働き得る混合モーダル媒体（ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄａｌ ｍｅｄｉｕｍ）である。いくつかの実施形態において、分離媒体は、カラム（例えば、モノリシックカラムまたは充填されたカラム中の粒子）である。いくつかの実施形態において、分離媒体は、膜である。
【0105】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、ベクターが宿主細胞において複製および／または組み込む能力を破壊することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、これを宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターはまた、１またはこれより多くの選択マーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントを含み得る。発現ベクターは、挿入される遺伝子の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。本明細書でのいくつかの実施形態において、上記ベクターは、ＡＡＶベクターである。
【0106】
ウイルスキャプシド調製
本開示の方法は、ウイルスキャプシド調製物、例えば、異種核酸を含む組換えウイルスを生成することが意図されるプロセスから生じるウイルスキャプシド調製物中の完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離するために有用である。
本開示の方法は、ウイルスキャプシド調製物、例えば、異種核酸を含む組換えウイルスを生成することが意図されるプロセスから生じるウイルスキャプシド調製物中の完全キャプシド粒子および空のキャプシド粒子を分離するために有用である。
【0107】
ウイルスキャプシド調製の生成
ウイルスキャプシド調製は、培養された宿主細胞から生成（例えば、「製造」）され得る。非常に大きな範囲の宿主細胞が使用され得る（例えば、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞など）。いくつかの実施形態において、上記培養された宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞または昆虫宿主細胞である。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の生成または製造のために適した細胞（または細胞株）（例えば、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞）であり得る。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞である。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
ウイルスキャプシド調製は、培養された宿主細胞から生成（例えば、「製造」）され得る。非常に大きな範囲の宿主細胞が使用され得る（例えば、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞など）。いくつかの実施形態において、上記培養された宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞または昆虫宿主細胞である。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の生成または製造のために適した細胞（または細胞株）（例えば、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞）であり得る。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞である。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
【0108】
組換え核酸分子またはベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）は、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、宿主細胞培養へと送達され得る。いくつかの実施形態において、ゲノムの中に組み込まれる組換え核酸分子またはベクターを有する安定な宿主細胞株が、生成される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるＡＡＶベクターを含む安定な宿主細胞株が生成される。ＡＡＶベクターの宿主培養物へのトランスフェクション後、宿主ゲノムへのｒＡＡＶの組み込みは、Ｎａｋａｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２００３） ３４， ２９７－３０２； Ｐｈｉｌｐｏｔｔら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００２） ７６（１１）：５４１１－５４２１、およびＨｏｗｄｅｎら， Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００８； １０：４２－５０に記載されるように、種々の方法（例えば、抗生物質選択、蛍光活性化セルソーティング、サザンブロット、ＰＣＲベースの検出、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによってアッセイされ得る。さらに、安定な細胞株は、当該分野で周知のプロトコール（例えば、Ｃｌａｒｋ， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｏｌ ６１ （２００２）：Ｓ９－Ｓｌ５、およびＹｕａｎら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１ Ｍａｙ； ２２（５）：６１３－２４に記載されるもの）に従って樹立され得る。
【0109】
ウイルスキャプシド調製物を生成するにあたって、宿主細胞には、代表的には、ウイルスベクターが供給され得る。例えば、ＡＡＶキャプシド調製物を生成（例えば、製造）するために、宿主細胞には、ＡＡＶベクター、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子機能、ならびにさらなるヘルパー機能が供給され得る。ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子機能は、種々の手段によって（例えば、野生型ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むプラスミドまたは任意のタイプのベクター、ならびにＲｅｐおよびＣａｐ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによって）、宿主細胞に提供され得る。さらなるヘルパー機能は、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）感染によって、必要とされるＡＶヘルパー機能遺伝子の全てを運ぶプラスミドによって、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）もしくはバキュロウイルスのような他のウイルスによって、提供され得る。任意の遺伝子、遺伝子機能、または宿主細胞によるｒＡＡＶ生成のために必要な他の遺伝物質は、宿主細胞内に一過性に存在してもよいし、宿主細胞ゲノムへと安定して挿入されてもよい。ウイルスキャプシド調製を生成するために適したｒＡＡＶ生成法としては、Ｃｌａｒｋら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１３２９－１３４１（１９９５）、Ｍａｒｔｉｎら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３－２６９（２０１３）、Ｔｈｏｒｎｅら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：７０７－７１４ （２００９）、Ｆｒａｓｅｒ Ｗｒｉｇｈｔ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：６９８－７０６（２００９）、およびＶｉｒａｇら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：８０７－８１７（２００９）に開示されるものが挙げられる。
【0110】
ウイルスキャプシドを宿主細胞から放出するために、種々の方法が使用され得る。例えば、ウイルスに感染した細胞（例えば、ＡＡＶに感染した細胞）の溶解は、感染性ウイルス粒子を放出するために、上記細胞を化学的にまたは酵素により処理する方法によって達成され得る．これらの方法としては、ヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼもしくはＤＮＡｓｅ）、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）、または洗浄剤もしくは界面活性剤の使用が挙げられる。物理的破壊（例えば、ホモジナイゼーションまたは粉砕）、または細胞に圧力をかけるマイクロフルイダイザーを介する圧力の印加、または凍結融解サイクルがまた、使用され得る。
【0111】
あるいは、上清は、細胞を溶解する必要性なしに、ＡＡＶに感染した細胞から収集され得る。
【0112】
ウイルスキャプシドの放出後に、サンプルは、本開示の方法とともに使用される前に、１またはこれより多くのプロセス（例えば、細胞デブリおよび／もしくはヘルパーウイルス粒子を除去するための精製、ならびに／またはヘルパーウイルスの熱不活性化）に供され得る。
【0113】
ウイルスキャプシド調製物の特性
代表的には、所定のウイルスキャプシド調製物中の完全および空のキャプシド粒子は、同じウイルスおよび同じ血清型のキャプシド粒子である。いくつかの実施形態において、上記キャプシド粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ））のキャプシドを含む。ＡＡＶキャプシド血清型の例としては、血清型８、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、ｒｈ１０、ｈｕ３７、またはこれらのいずれか１つの改変体が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８またはその改変体に由来する。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９またはその改変体に由来する。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶｒｈ１０またはその改変体に由来する。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶｈｕ３７またはその改変体に由来する。
代表的には、所定のウイルスキャプシド調製物中の完全および空のキャプシド粒子は、同じウイルスおよび同じ血清型のキャプシド粒子である。いくつかの実施形態において、上記キャプシド粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ））のキャプシドを含む。ＡＡＶキャプシド血清型の例としては、血清型８、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、ｒｈ１０、ｈｕ３７、またはこれらのいずれか１つの改変体が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８またはその改変体に由来する。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９またはその改変体に由来する。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶｒｈ１０またはその改変体に由来する。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶｈｕ３７またはその改変体に由来する。
【0114】
アニオン交換媒体
本開示の方法は、任意の特定のカラム構成もしくは寸法、分離媒体のタイプ、または分離化学現象のタイプに限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、上記アニオン交換媒体は、弱イオン交換体である。いくつかの実施形態において、上記アニオン交換媒体は、強イオン交換体である。
本開示の方法は、任意の特定のカラム構成もしくは寸法、分離媒体のタイプ、または分離化学現象のタイプに限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、上記アニオン交換媒体は、弱イオン交換体である。いくつかの実施形態において、上記アニオン交換媒体は、強イオン交換体である。
【0115】
いくつかの実施形態において、上記アニオン交換体は、充填されたベッドの形態にある。
【0116】
いくつかの実施形態において、上記アニオン交換体は、クロマトグラフィーのモノリシックカラムである。一例として、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） モノリシックカラム（例えば、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） モノリシックＱＡカラム）が使用され得る。
【0117】
洗浄溶液および画分
本開示の方法における使用に適合性の洗浄溶液は、一般に、１種またはこれより多くの塩および必要に応じて緩衝液（例えば、本明細書で記載される緩衝液）を含む。
本開示の方法における使用に適合性の洗浄溶液は、一般に、１種またはこれより多くの塩および必要に応じて緩衝液（例えば、本明細書で記載される緩衝液）を含む。
【0118】
第１の洗浄溶液
本開示の方法は、一般に、アニオン交換媒体に第１の洗浄溶液を通過させるかまたは付与して、例えば、第１の洗浄画分（例えば、空のウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分）を得る工程を包含する。このような洗浄溶液は、一般に、四級アンモニウム塩を含む。多くの実施形態では、（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の四級塩の濃度は、工程の間中一定のままであり、その間に、上記第１の洗浄溶液が上記アニオン交換媒体に通過させられるかまたは付与される；および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程の間中一定のままであり、その間に上記溶離溶液が上記アニオン交換媒体に通過させられるかまたは付与される。
本開示の方法は、一般に、アニオン交換媒体に第１の洗浄溶液を通過させるかまたは付与して、例えば、第１の洗浄画分（例えば、空のウイルスキャプシド粒子を含む洗浄画分）を得る工程を包含する。このような洗浄溶液は、一般に、四級アンモニウム塩を含む。多くの実施形態では、（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の四級塩の濃度は、工程の間中一定のままであり、その間に、上記第１の洗浄溶液が上記アニオン交換媒体に通過させられるかまたは付与される；および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程の間中一定のままであり、その間に上記溶離溶液が上記アニオン交換媒体に通過させられるかまたは付与される。
【0119】
いくつかの実施形態において、上記洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、３０ｍＭ～２００ｍＭ（例えば、５０ｍＭ～１８０ｍＭ、７０ｍＭ～１６０ｍＭ、９０ｍＭ～１５０ｍＭ、１００ｍＭ～１３０ｍＭ、または１００ｍＭ～１２０ｍＭおよび３０ｍＭ～２００ｍＭを含み、その間になる全ての整数を含む）である。
【0120】
いくつかの実施形態において、上記洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも９０ｍＭ、または少なくとも１００ｍＭである。
【0121】
いくつかの実施形態において、上記洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、２００ｍＭ以下、１８０ｍＭ以下、１６０ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１４０ｍＭ以下、１３０ｍＭ以下、または１２０ｍＭ以下である。
【0122】
いくつかの実施形態において、上記洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、３０ｍＭ～２００ｍＭ（例えば、５０ｍＭ～１８０ｍＭ、７０ｍＭ～１６０ｍＭ、９０ｍＭ～１５０ｍＭ、１００ｍＭ～１４０ｍＭ、１００ｍＭ～１３０ｍＭ、または１００ｍＭ～１２０ｍＭおよび３０ｍＭ～２００ｍＭを含みかつその間にある全ての整数を含む）である。
【0123】
いくつかの実施形態において、上記洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、約１１０ｍＭである。
【0124】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウム塩、例えば、テトラアルキルアンモニウムクロリドまたはテトラアルキルアンモニウムアセテートである。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）、テトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰＡＣ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるテトラアルキルアンモニウムクロリドである。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）である。
【0125】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ－Ａｃ）、テトラプロピルアンモニウムアセテート、テトラブチルアンモニウムアセテート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるテトラアルキルアンモニウムアセテートである。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、ＴＥＡ－Ａｃである。
【0126】
いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩は、塩化コリンである。
【0127】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、本明細書でさらに記載されるとおり、二価塩、例えば、ＭｇＣｌ２をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、１ｍＭ～１０ｍＭ、例えば、１ｍＭ～５ｍＭ（例えば、約２ｍＭおよび１ｍＭ～１０ｍＭの中のおよび間の全ての数字を含む）の濃度のＭｇＣｌ２を含む。
【0128】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する空のキャプシド粒子を溶離し、例えば、ウイルスキャプシド調製物中に存在する空のキャプシド粒子が上記第１の洗浄画分中に出てくるようにする。例えば、いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記空のキャプシド粒子のうちの５０％もしくはこれより高い（例えば、５０％～１００％（５０％～１００％の中のおよび間の全ての数字を含む））、６０％もしくはこれより高い（例えば、６０％～１００％）、７０％もしくはこれより高い（例えば、７０％～１００％）、７５％もしくはこれより高い（例えば、７５％～１００）、８０％もしくはこれより高い（例えば、８０％～１００％）、８５％もしくはこれより高い（例えば、８５％～１００％）、９０％もしくはこれより高い（例えば、９０％～１００％）、９５％もしくはこれより高い（例えば、９５％～１００％）、または９９％もしくはこれより高い（例えば、９９％～１００％）ものを含む。
【0129】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄画分は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記空のキャプシド粒子のうちの５０％もしくはこれより高い（例えば、５０％～１００％（５０％～１００％の中のおよび間の全ての整数を含む））、６０％もしくはこれより高い（例えば、６０％～１００％）、７０％もしくはこれより高い（例えば、７０％～１００％）、７５％もしくはこれより高い（例えば、７５％～１００％）、８０％もしくはこれより高い（例えば、８０％～１００％）、８５％もしくはこれより高い（例えば、８５％～１００％）、９０％もしくはこれより高い（例えば、９０％～１００％）、９５％もしくはこれより高い（例えば、９５％～１００％）、または９９％もしくはこれより高い（例えば、９９％～１００％）ものを含む。
【0130】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する完全キャプシド粒子を実質的に溶離しない。例えば、いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの５０％もしくはこれ未満（例えば、０～５０％（０～５０％中のおよび間の全ての整数を含む））、４５％もしくはこれ未満（例えば、０～４０％）、４０％もしくはこれ未満（例えば、０～４０％）、３５％もしくはこれ未満（例えば、０～３５％）、３０％もしくはこれ未満（例えば、０～３０％）、２５％もしくはこれ未満（例えば、０～２５％）、２０％もしくはこれ未満（例えば、０～２０％）、１５％もしくはこれ未満（例えば、０～１５％）、１０％もしくはこれ未満（例えば、０～１０％）、５％もしくはこれ未満（例えば、０～５％）、または１％もしくはこれ未満（例えば、０～１％）を溶離する。
【0131】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄画分は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの５０％もしくはこれ未満、例えば、０～５０％（０～５０％の中のおよび間の全ての整数を含む）、４５％もしくはこれ未満（例えば、０～４５％）、４０％もしくはこれ未満（例えば、０～４０％）、３５％もしくはこれ未満（例えば、０～３５％）、３０％もしくはこれ未満（例えば、０～３０％）、２５％もしくはこれ未満（例えば、０～２５％）、２０％もしくはこれ未満（例えば、０～２０％）、１５％もしくはこれ未満（例えば、０～１５％）、１０％もしくはこれ未満（例えば、０～１０％）、５％もしくはこれ未満（例えば、０～５％）、または１％もしくはこれ未満（例えば、０～１％）を含む。
【0132】
第２の洗浄溶液
本開示の方法は、一般に、アニオン交換媒体に第２の洗浄溶液を通過させるかまたは付与して、例えば、第２の洗浄画分（例えば、上記第１の洗浄溶液に存在する上記四級アンモニウム塩を含む洗浄画分）を得る工程を包含する。多くの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、四級アンモニウム塩を含まない。
本開示の方法は、一般に、アニオン交換媒体に第２の洗浄溶液を通過させるかまたは付与して、例えば、第２の洗浄画分（例えば、上記第１の洗浄溶液に存在する上記四級アンモニウム塩を含む洗浄画分）を得る工程を包含する。多くの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、四級アンモニウム塩を含まない。
【0133】
いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、またはこれらの任意の組み合わせを含む。例えば、いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、例えば、２５ｍＭ～３７５ｍＭ、５０ｍＭ～２５０ｍＭ、７０ｍＭ～２００ｍＭ、７０ｍＭ～１４０ｍＭ、または９０ｍＭ～１４０ｍＭ（および２５ｍＭ～３７５ｍＭの中のおよび間の全ての整数を含む）の濃度のＮａＣｌを含む。
【0134】
いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、上記第１の洗浄溶液に存在する上記四級アンモニウム塩のうちの少なくとも３０％（例えば、３０％～１００％（および３０％～１００％の中のおよび間の全ての整数を含む））、少なくとも４０％（例えば、４０％～１００％）、少なくとも４５％（例えば、４５％～１００％）、少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％）、少なくとも５５％（例えば、５５％～１００％）、少なくとも６０％（例えば、６０％～１００％）、少なくとも６５％（例えば、６５％～１００％）、少なくとも７０％（例えば、７０％～１００％）、少なくとも７５％（例えば、７５％～１００％）、少なくとも８０％（例えば、８０％～１００％）、少なくとも８５％（例えば、８５％～１００％）、少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％）、少なくとも９５％（例えば、９５％～１００％）、または少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）を溶離する。
【0135】
いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄画分は、上記第１の洗浄溶液に存在する上記四級アンモニウム塩のうちの少なくとも３０％（例えば、３０％～１００％および３０％～１００％の中のおよび間の全ての整数を含む）、少なくとも４０％（例えば、４０％～１００％）、少なくとも４５％（例えば、４５％～１００％）、少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％）、少なくとも５５％（例えば、５５％～１００％）、少なくとも６０％（例えば、６０％～１００％）、少なくとも６５％（例えば、６５％～１００％）、少なくとも７０％（例えば、７０％～１００％）、少なくとも７５％（例えば、７５％～１００％）、少なくとも８０％（例えば、８５％～１００％）、少なくとも８５％（例えば、８５％～１００％）、少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％）、少なくとも９５％（例えば、９５％～１００％）、または少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）を含む。
【0136】
いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する完全キャプシド粒子を実質的に溶離しない。例えば、いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの３０％もしくはこれ未満（例えば、０～３０％および０～３０％の中のおよび間の全ての整数を含む）、２５％もしくはこれ未満（例えば、０～２５％）、２０％もしくはこれ未満（例えば、０～３０％）、１５％もしくはこれ未満（例えば、０～１５％）、１０％（例えば、０～１０％）、８％もしくはこれ未満（例えば、０～８％）、５％（例えば、０～５％）、３％もしくはこれ未満（例えば、０～３％）、２％（例えば、０～２％）、または１％（例えば、０～１％）を溶離する。
【0137】
いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄画分は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの３０％もしくはこれ未満（例えば、０～３０％および０～３０％の中のおよび間の全ての整数を含む）、２５％もしくはこれ未満（例えば、０～２５％）、２０％もしくはこれ未満（例えば、０～２０％）、１５％もしくはこれ未満（例えば、０～１５％）、１０％もしくはこれ未満（例えば、０～１０％）、８％もしくはこれ未満（例えば、０～８％）、５％もしくはこれ未満（例えば、０～５％）、３％もしくはこれ未満（例えば、０～３％）、２％もしくはこれ未満（例えば、０～２％）、または１％もしくはこれ未満（例えば、０～１％）を含む。
【0138】
溶離溶液および画分
本開示の方法は、一般に、アニオン交換媒体に溶離溶液を通過させるかまたは付与して、例えば、溶離画分中の完全キャプシド粒子を溶離する工程を包含する。多くの実施形態において、上記溶離溶液は、四級アンモニウム塩を含まない。
本開示の方法は、一般に、アニオン交換媒体に溶離溶液を通過させるかまたは付与して、例えば、溶離画分中の完全キャプシド粒子を溶離する工程を包含する。多くの実施形態において、上記溶離溶液は、四級アンモニウム塩を含まない。
【0139】
いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、またはこれらの任意の組み合わせを含む。例えば、いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、例えば、２５ｍＭ～３７５ｍＭ（例えば、２５ｍＭ～３７５ｍＭの中のおよび間の全ての整数を含む）、５０ｍＭ～２５０ｍＭ、７０ｍＭ～２００ｍＭ、または７０ｍＭ～１４０ｍＭ、または９０ｍＭ～１４０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。
【0140】
いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、アニオン種、テトラフルオロボレート（ＢＦ４）、ブロミド（Ｂｒ）、またはアセテート（Ａｃ）を含む。いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）と会合したアニオン種、例えば、ＴＥＡ－ＢＦ４、ＴＥＡ－Ｂｒ、またはＴＥＡ－Ａｃを含む。
【0141】
いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、上記第２の洗浄溶液と共通するが、異なる濃度の少なくとも１種の塩を含む。いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、上記第２の洗浄溶液に存在するものとは異なる塩を含む。
【0142】
いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子を実質的に溶離する。例えば、いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの少なくとも１５％（例えば、１５％～１００％（１５％～１００％の中のおよび間の全ての整数を含む））、少なくとも２０％（例えば、２０％～１００％）、少なくとも２５％（例えば、２５％～１００％）、少なくとも３０％（例えば、３０％～１００％）、少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％）、少なくとも４０％（例えば、４０％～１００％）、少なくとも４５％（例えば、４５％～１００％）、少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％）、少なくとも５５％（例えば、５５％～１００％）、少なくとも６０％（例えば、６０％～１００％）、少なくとも６５％（例えば、６５％～１００％）、少なくとも７０％（例えば、７０％～１００％）、少なくとも７５％（例えば、７５％～１００％）、少なくとも８０％（例えば、８０％～１００％）、少なくとも８５％（例えば、８５％～１００％）、少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％）、少なくとも９５％（例えば、９５％～１００％）、または少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）を溶離する。いくつかの実施形態において、上記溶離溶液は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの１５％～７５％を溶離する。
【0143】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの少なくとも１５％（例えば、１５％～１００％（１５％～１００％の中のおよび間の全ての整数を含む））、少なくとも２０％（例えば、２０％～１００％）、少なくとも２５％（例えば、２５％～１００％）、少なくとも３０％（例えば、３０％～１００％）、少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％）、少なくとも４０％（例えば、４０％～１００％）、少なくとも４５％（例えば、４５％～１００％）、少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％）、少なくとも５５％（例えば、５５％～１００％）、少なくとも６０％（例えば、６０％～１００％）、少なくとも６５％（例えば、６５％～１００％）、少なくとも７０％（例えば、７０％～１００％）、少なくとも７５％（例えば、７５％～１００％）、少なくとも８０％（例えば、８０％～１００％）、少なくとも８５％（例えば、８５％～１００％）、少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％）、少なくとも９５％（例えば、９５％～１００％）、または少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）を含む。いくつかの実施形態において、上記溶離画分は、上記ウイルスキャプシド調製物に存在する上記完全キャプシド粒子のうちの１５％～７５％を含む。
【0144】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分に存在する上記キャプシド粒子のうちの少なくとも３５％（例えば、３５％～１００％（３５％～１００％の中のおよび間の全ての整数を含む））、少なくとも４０％（例えば、４０％～１００％）、少なくとも４５％（例えば、４５％～１００％）、または少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％）は、完全キャプシド粒子である。いくつかの実施形態において、上記溶離画分に存在する上記キャプシド粒子のうちの少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％）は、完全キャプシド粒子である。
【0145】
いくつかの実施形態において、上記溶離画分は、ウイルスキャプシド調製からの空のキャプシド粒子のうちの６５％以下（例えば、０～６５％（０～６５％の中のおよび間の全ての整数を含む））、６０％以下（例えば、０～６０％）、５５％以下（例えば、０～５５％）、５０％以下（例えば、０～５０％）、４５％以下（例えば、０～４５％）、４０％以下（例えば、０～４０％）、３５％以下（例えば、０～３５％）、３０％以下（例えば、０～３０％）、２５％以下（例えば、０～２５％）、２０％以下（例えば、０～２０％）、１５％以下（例えば、０～１５）％、１０％以下（例えば、０～１０％）、５％以下（例えば、０～５％）、または１％以下（例えば、０～１％）を含む。
【0146】
緩衝液系および他の溶液構成要素
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液、上記第２の洗浄溶液、および上記溶離溶液のうちの１またはこれより多くのものは、緩衝液系を含む。例えば、上記緩衝液系は、ある特定の値あたりのまたはある特定の範囲内のｐＨ（６．０～１０．０、例えば、７．０～９．０のｐＨ）を維持し得る。いくつかの実施形態において、含まれる緩衝液は、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、または約１０．０において溶液のｐＨを維持する。いくつかの実施形態において、含まれる緩衝液は、約ｐＨ９．０において溶液のｐＨを維持する。
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液、上記第２の洗浄溶液、および上記溶離溶液のうちの１またはこれより多くのものは、緩衝液系を含む。例えば、上記緩衝液系は、ある特定の値あたりのまたはある特定の範囲内のｐＨ（６．０～１０．０、例えば、７．０～９．０のｐＨ）を維持し得る。いくつかの実施形態において、含まれる緩衝液は、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、または約１０．０において溶液のｐＨを維持する。いくつかの実施形態において、含まれる緩衝液は、約ｐＨ９．０において溶液のｐＨを維持する。
【0147】
適切な緩衝液系の非限定的な例としては、ビス－トリス－プロパンベースの緩衝液（例えば、２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン系）が挙げられる。
【0148】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液、上記第２の洗浄溶液、および上記溶離溶液のうちの１またはこれより多くのものは、二価塩、例えば、ＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液、上記第２の洗浄溶液、および上記溶離溶液のうちの１またはこれより多くのものは、０．５ｍＭ～１０ｍＭ、例えば、１ｍＭ～１０ｍＭ、または１ｍＭ～５ｍＭ（例えば、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、または約１０ｍＭ）の濃度のＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液、上記第２の洗浄溶液、および上記溶離溶液のうちの１またはこれより多くのものは、約２ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液、上記第２の洗浄溶液、および上記溶離溶液のうちの１またはこれより多くのものは、少なくとも１ｍＭまたは少なくとも２ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液、上記第２の洗浄溶液、および上記溶離溶液のうちの１またはこれより多くのものは、５ｍＭ以下の濃度のＭｇＣｌ２を含む。
【0149】
いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液、上記第２の洗浄溶液、および上記溶離溶液のうちの１またはこれより多くのものは、安定化剤または界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤を含む。適切な非イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記安定化剤または界面活性剤は、約０．０００１％、約０．０００５％、または約０．００１％の濃度において溶液に存在する。いくつかの実施形態において、上記安定化剤または界面活性剤は、約０．００１％以下の濃度で溶液に存在する。
【0150】
分離法
本開示の方法は、代表的には、四級アンモニウム塩を含む洗浄溶液を使用する洗浄工程であって、その洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、洗浄工程の間中一定のままである（すなわち、イソクラティックに保持される）洗浄工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩を含む上記洗浄溶液中の全ての塩の濃度は、洗浄工程の間中イソクラティックに保持される。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩を含む上記洗浄溶液中の全ての構成要素の濃度は、洗浄工程の間中イソクラティックに保持される。
本開示の方法は、代表的には、四級アンモニウム塩を含む洗浄溶液を使用する洗浄工程であって、その洗浄溶液中の上記四級アンモニウム塩の濃度は、洗浄工程の間中一定のままである（すなわち、イソクラティックに保持される）洗浄工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩を含む上記洗浄溶液中の全ての塩の濃度は、洗浄工程の間中イソクラティックに保持される。いくつかの実施形態において、上記四級アンモニウム塩を含む上記洗浄溶液中の全ての構成要素の濃度は、洗浄工程の間中イソクラティックに保持される。
【0151】
本開示の方法の他の工程、例えば、さらなる洗浄工程または溶離工程は、本明細書でさらに記載されるように、イソクラティック分離または勾配分離を伴い得る。
【0152】
イソクラティック分離
言及されるように、多くの実施形態において、（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の四級塩の濃度は、工程の間中一定のままであり、その間に、上記第１の洗浄溶液は、上記アニオン交換体に通過させられるかもしくは付与される、および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程の間中一定のままであり、その間に、上記溶離溶液は、上記アニオン交換体に通過させられるかもしくは付与される。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液のさらなる構成要素の濃度は、工程の間中一定のままである。例えば、いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液の塩組成は、工程の間中一定のままである。
言及されるように、多くの実施形態において、（ｉ）上記第１の洗浄溶液中の四級塩の濃度は、工程の間中一定のままであり、その間に、上記第１の洗浄溶液は、上記アニオン交換体に通過させられるかもしくは付与される、および／または（ｉｉ）上記溶離溶液の塩組成は、工程の間中一定のままであり、その間に、上記溶離溶液は、上記アニオン交換体に通過させられるかもしくは付与される。いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液のさらなる構成要素の濃度は、工程の間中一定のままである。例えば、いくつかの実施形態において、上記第１の洗浄溶液の塩組成は、工程の間中一定のままである。
【0153】
いくつかの実施形態において、（１）上記第２の洗浄溶液を上記アニオン交換体に通過させるかまたは付与する工程および（２）上記溶離溶液を上記アニオン交換体に通過させるかまたは付与する工程のうちの一方または両方が、イソクラティック分離を伴う。いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄溶液の塩組成および／または上記溶離溶液の塩組成は、工程の間中一定のままであり、その間に、上記溶液は、上記アニオン交換体に通過させられるかまたは付与される。
【0154】
いくつかの実施形態において、第１の洗浄溶液の塩組成、上記第２の洗浄溶液の塩組成、および上記溶離溶液の塩組成は、各個々の洗浄または溶離工程の間中一定のままである。
【0155】
勾配分離
ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法における１またはこれより多くの工程（例えば、洗浄工程および／または溶離工程）は、溶液を使用する工程を包含し、その溶液の組成は、その工程またはそれらの工程の間に変動する。例えば、勾配分離工程において、上記溶液中の塩の濃度は、工程の間中経時的に徐々にかつ連続して（例えば、直線的に）増大し得る。
ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法における１またはこれより多くの工程（例えば、洗浄工程および／または溶離工程）は、溶液を使用する工程を包含し、その溶液の組成は、その工程またはそれらの工程の間に変動する。例えば、勾配分離工程において、上記溶液中の塩の濃度は、工程の間中経時的に徐々にかつ連続して（例えば、直線的に）増大し得る。
【0156】
ウイルスキャプシド調製物および／または画分の評価
ある特定の実施形態において、上記ウイルスキャプシド調製物および／もしくは上記溶離画分、またはそのサンプルは、評価される。上記第１のおよび第２の洗浄画分は、収集されてもよいしそうでなくてもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも、一方または両方の洗浄画分のサンプルは、例えば、品質管理目的のために、収集されかつ評価される。
ある特定の実施形態において、上記ウイルスキャプシド調製物および／もしくは上記溶離画分、またはそのサンプルは、評価される。上記第１のおよび第２の洗浄画分は、収集されてもよいしそうでなくてもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも、一方または両方の洗浄画分のサンプルは、例えば、品質管理目的のために、収集されかつ評価される。
【0157】
完全および空のキャプシド粒子
いくつかの実施形態において、上記ウイルスキャプシド調製物中の完全および／もしくは空のキャプシド粒子、ならびに／または１もしくはこれより多くの画分（例えば、溶離画分）の存在および／または量は、評価される。種々の方法が、完全または空のキャプシドの存在を決定するために当該分野で公知であり；これらの方法のうちの多くのものはまた、完全および空のキャプシドの量、例えば、相対的な量を決定するために使用され得る。このような方法の例としては、透過型電子顕微鏡検査法（ＴＥＭ）、沈降速度－分析用超遠心分離（ＳＶ－ＡＵＣ）、電荷検出質量分析法（ｃｈａｒｇｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＣＤＭＳ）、アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ－ＨＰＬＣ）、ＵＶ分光測光法、ならびに例えば、品質管理目的のためのＥＬＩＳＡおよびｑＰＣＲによるキャプシドおよびゲノムコピーの測定が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、上記ウイルスキャプシド調製物中の完全および／もしくは空のキャプシド粒子、ならびに／または１もしくはこれより多くの画分（例えば、溶離画分）の存在および／または量は、評価される。種々の方法が、完全または空のキャプシドの存在を決定するために当該分野で公知であり；これらの方法のうちの多くのものはまた、完全および空のキャプシドの量、例えば、相対的な量を決定するために使用され得る。このような方法の例としては、透過型電子顕微鏡検査法（ＴＥＭ）、沈降速度－分析用超遠心分離（ＳＶ－ＡＵＣ）、電荷検出質量分析法（ｃｈａｒｇｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＣＤＭＳ）、アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ－ＨＰＬＣ）、ＵＶ分光測光法、ならびに例えば、品質管理目的のためのＥＬＩＳＡおよびｑＰＣＲによるキャプシドおよびゲノムコピーの測定が挙げられるが、これらに限定されない。
【0158】
いくつかの実施形態において、超遠心分離法は、ウイルスキャプシド調製物および／または画分（例えば、溶離画分）を評価するために使用される。例えば、ＳＶ－ＡＵＣは、遠心力を印加する高いスピン速度に供する場合に、分子の沈降速度を測定する溶液状態の方法である。沈降速度は、沈降係数ｓによって測定され、その製剤マトリクス中の分子の浮力 質量、密度、比容積、および摩擦力に関連する。そのｓ値は、２０℃の水の標準的溶液条件（標準温度および圧力）に対して正規化される場合、ｓ２０， ｗ値として公知であり、質量および形状ならびに分子のコンホメーションを定義する基本的分子パラメーターである。沈降係数分布は、ピーク下面積によって定量され得、これは、その沈降係数における分子の量に直接的に関連する。真の集団を表すピーク面積の正確度は、検出システムの適切性、および集められるデータ点の数に部分的に依存する。
【0159】
ＳＶ－ＡＵＣは、例えば、異なるタイプのキャプシド粒子を、例えば、完全キャプシド粒子を空のキャプシド粒子から分離するために付与され得る。同じウイルスタイプおよび血清型を有するウイルス粒子の質量は、完全ベクターゲノムの存在（完全キャプシド粒子と同様）、またはベクターゲノムの一部のみの存在またはベクターゲノムの完全な非存在（空のキャプシド粒子と同様）に依存して異なり得る。例えば、空のキャプシド粒子は、完全キャプシドより少ないＤＮＡを有し、完全キャプシドより軽く、完全キャプシドよりゆっくりと沈降する。従って、ＳＶ－ＡＵＣ方法におけるｓ値は、ウイルスキャプシド粒子内にパッケージされたＤＮＡのサイズを反映する。
【0160】
いくつかの実施形態において、ＵＶ分光測光法は、ウイルスキャプシド調製物および／または画分（例えば、溶離画分）を評価するために使用される。例えば、サンプルによって吸収される２５４ｎｍおよび／または２６０ｎｍのまたはそのあたりの波長の光の量は、上記サンプル中の核酸の濃度に概して比例する。さらに、タンパク質は、２５４ｎｍ（Ａ２５４）または２６０ｎｍ（Ａ２６０）で有するよりも２８０ｎｍで有する吸光度（Ａ２８０）の方が大きい；その逆は核酸にあてはまり、核酸は、Ａ２８０よりもＡ２５４またはＡ２６０の方が大きい。従って、完全キャプシド粒子（これは、空のキャプシド粒子が有するより多くの量のＤＮＡを有する）は、空のキャプシド粒子が有するより大きなＡ２５４／Ａ２８０またはＡ２６０／Ａ２８０比を有する。この差異は、サンプル中の完全および空の粒子の相対的な量を評価するために利用され得る。いくつかの実施形態において、Ａ２５４、Ａ２６０、Ａ２８０、Ａ２５４／Ａ２８０比、またはＡ２６０／Ａ２８０比のうちの１またはこれより多くのものが評価される。
【0161】
さらに、サンプル中のいくらかの不純物が、２３０ｎｍの波長の光を吸収することもある；これらの夾雑物は、代表的には、２８０ｎｍで吸収されるそれらの夾雑物より数が多い。従って、Ａ２６０／Ａ２３０比は、サンプルの純度のある種の示度を提供し得る。いくつかの実施形態において、Ａ２３０および／またはＡ２６０／Ａ２３０値が評価される。
【0162】
例えば、いくつかの実施形態において、空のキャプシド粒子は、完全キャプシド粒子が放出される前に、ＡＥＸ媒体から優先的に放出される。これらの実施形態において、１つの画分（ここで空のキャプシド粒子が優先的に放出される）のＡ２５４／Ａ２８０またはＡ２６０／Ａ２８０比は、その後の画分（ここで完全キャプシド粒子が優先的に放出される）のものより低い（例えば、図１に示されるとおり）。
【0163】
いくつかの実施形態において、完全キャプシド粒子は、空のキャプシド粒子が放出される前に、ＡＥＸ媒体から優先的に放出される。これらの実施形態において、１つの画分（ここで完全キャプシド粒子が優先的に放出される）のＡ２５４／Ａ２８０比またはＡ２６０／Ａ２８０比は、その後の画分（ここで空のキャプシド粒子が優先的に放出される）のものより高い。
【0164】
優先的な放出の順序は、例えば、ａ）核酸ペイロードの特性、ｂ）キャプシド血清型、ｃ）ウイルスキャプシド（例えば、ｒＡＡＶ）調製条件、およびｄ）ＡＥＸ媒体の特性が挙げられるが、これらに限定されない種々の局面のうちの１またはこれより多くのものと関連し得る。
【0165】
他の評価
いくつかの実施形態において、画分またはそのサンプルは、分析物、例えば、洗浄溶液の構成要素の存在または量を決定するために評価される。例えば、いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄画分のサンプルは、上記サンプル中の四級アンモニウム塩の存在または量を決定するために評価される。四級アンモニウム塩を検出または定量する方法は、当該分野で公知であり、例えば、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）および逆相高速液体クラマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、画分またはそのサンプルは、分析物、例えば、洗浄溶液の構成要素の存在または量を決定するために評価される。例えば、いくつかの実施形態において、上記第２の洗浄画分のサンプルは、上記サンプル中の四級アンモニウム塩の存在または量を決定するために評価される。四級アンモニウム塩を検出または定量する方法は、当該分野で公知であり、例えば、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）および逆相高速液体クラマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）が挙げられる。
【実施例】
【0166】
実施例１： ＮａＣｌ勾配法における空のおよび完全キャプシド粒子の分離に対する定常相の影響
空のおよび完全キャプシド粒子の分離に対する定常相のタイプの影響を試験するために、完全および空のＡＡＶキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、異なるタイプの定常相に関してＮａＣｌグラジエント溶離条件に供した。
空のおよび完全キャプシド粒子の分離に対する定常相のタイプの影響を試験するために、完全および空のＡＡＶキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、異なるタイプの定常相に関してＮａＣｌグラジエント溶離条件に供した。
【0167】
モノリシックおよびビーズベースのアニオン交換媒体の両方を試験した。ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラム（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、四級アミンで官能化されたモノリシックポリ（グリシジルメタクリレート－ｃｏ－エチレンジメタクリレート）カラムであり、強アニオン交換体である。ＰＯＲＯＳＴＭ ５０ ＨＱカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、四級化ポリエチレンイミンで官能化されたポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）ビーズ、強アニオン交換体に基づく。ＮｕｖｉａＴＭ Ｑ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）カラムは、四級アミンで官能化されたポリ（メタクリレート）ビーズ、強アニオン交換体に基づく。
【0168】
空のおよび完全キャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料を、ＰＯＲＯＳＴＭ ５０ ＨＱカラムに対して、および別個に実験において、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して、ＮａＣｌ勾配に供した。空のおよび完全キャプシド粒子を含むＡＡＶ８．２材料を、ＮｕｖｉａＴＭ Ｑカラムに対して、および別個に実験において、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して、ＮａＣｌ勾配に供した。
【0169】
図１Ａは、ＡＡＶ８．１材料に対する分離実験からの代表的クロマトグラムを示す。
【0170】
図１Ｂは、ＡＡＶ８．２材料に対する分離実験からの代表的クロマトグラムを示す。図２Ａは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）法によって決定される場合、工程収量、すなわち、装填材料中の量に対するプールした画分中の目的のゲノムの量を示す。図２Ｂは、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって決定される場合、溶離液に存在する完全キャプシド粒子のパーセンテージを示す。図２Ａおよび２Ｂの両方における値は、ＮｕｖｉａＴＭ Ｑカラムで観察されたものに対して正規化されている。
【0171】
ＡＡＶ８－１に関しては、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） Ｑカラムを使用すると、ＰＯＲＯＳＴＭ ５０ ＨＱカラムを使用するよりも完全キャプシド（高量が「Ｆ」によって示される画分中に見出される）からの空のキャプシド（高量が「Ｅ」によって示される画分中に見出される）のより良好な分離が生じた。ＡＡＶ８－２に関しては、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムを使用すると、ＮｕｖｉａＴＭ Ｑカラムを使用するよりも完全キャプシド（高量が「Ｆ」によって示される画分中に見出される）からの空のキャプシド（高量が「Ｅ」によって示される画分中に見出される）のより良好な分離が生じた。さらに、ＡＡＶ８－２に関しては、工程収量および完全キャプシド粒子のパーセンテージの両方が、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） Ｑカラムを使用する実験においてより高かった。
【0172】
実施例２： 空のおよび完全キャプシド粒子の分離に対するプロデューサー細胞株およびＡＡＶ血清型の影響
空のおよび完全キャプシド粒子の分離に対する装填材料（プロデューサー細胞株およびＡＡＶ血清型）の影響を試験するために、完全および空のウイルス粒子を含む種々のウイルスキャプシド調製物を、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対してＮａＣｌグラジエント溶離条件に供した。
空のおよび完全キャプシド粒子の分離に対する装填材料（プロデューサー細胞株およびＡＡＶ血清型）の影響を試験するために、完全および空のウイルス粒子を含む種々のウイルスキャプシド調製物を、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対してＮａＣｌグラジエント溶離条件に供した。
【0173】
血清型ＡＡＶ８－１、ＡＡＶ８－２、ＡＡＶ８－３、およびｈｕ３７のＨＥＫが生成したＡＡＶ、ならびにＨｅＬａが生成したＡＡＶ９を、ＮａＣｌグラジエント溶離条件に供した。その結果を図３および表１に示す。図３は、種々のＡＡＶ材料を使用する実験からの代表的クロマトグラムを示す。「Ｅ」は、空のキャプシドの高い相対的量に相当する画分を示し、「Ｆ」は、完全キャプシドの高い相対的量に相当する画分を示す。
【0174】
【表1】
【0175】
図４は、ＨＥＫが生成したＡＡＶ８－１およびＡＡＶ８－２に対して実行した実験からの結果を比較するグラフを示す。これは、装填材料中の完全キャプシド粒子のパーセンテージ（ｘ軸）と比較して、溶離液中の完全キャプシド粒子の正規化したパーセンテージ（ｙ軸）を示す。
【0176】
実施例３： 空のおよび完全キャプシド粒子の分離に対する装填塩濃度の影響
空のおよび完全キャプシド粒子の分離に対する装填塩濃度の影響を試験するために、完全および空の、ＨｅＬａが生成したＡＡＶ８．２キャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、種々の量のＭｇＣｌ２を伴う下流のプロセスに供した。
空のおよび完全キャプシド粒子の分離に対する装填塩濃度の影響を試験するために、完全および空の、ＨｅＬａが生成したＡＡＶ８．２キャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、種々の量のＭｇＣｌ２を伴う下流のプロセスに供した。
【0177】
最初のクロマトグラフィープロセスの後に、ＨｅＬａ細胞から生成されるＡＡＶ材料を熱不活性化して、いかなるヘルパーウイルスをも不活性化し、サンプルに、２００ｍＭ ＭｇＣｌ２から６７ｍＭ（「装填において希釈なし」）または６～７ｍＭ（「装填において希釈」あり）のいずれかの最終濃度までを添加した。別のサンプルには、いかなるＭｇＣｌ２をも添加しなかった（「装填においてＭｇなし」）。図５の左側は、そのプロセスの概説を示す。
【0178】
次いで、サンプルを、ＰＯＲＯＳＴＭ ＸＱカラムに対してＮａＣｌグラジエント溶離条件に供した。この実験からの代表的クロマトグラムを、図５の右側に示す。図５では、「Ｅ」は、空のキャプシドの高い相対的量に相当する画分を示し、「Ｆ」は、完全キャプシドの高い相対的量に相当する画分を示す。
【0179】
図５に示されるように、「装填において希釈なし」（６７ｍＭ ＭｇＣｌ２）サンプルに関しては溶離ピークが検出されなかったのに対して、ＭｇＣｌ２濃度を６～７ｍＭへと希釈して下げた場合、溶離ピークが検出された。
【0180】
実施例４： 種々のテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）でのグラジエント溶離
この実施例では、完全および空のウイルスキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、種々のテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）濃度を使用するグラジエント溶離条件に供した。比較として、ＮａＣｌを使用して類似の溶離実験を行った。ＴＭＡＣまたはＮａＣｌの濃度を、経時的に増大させた。
この実施例では、完全および空のウイルスキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、種々のテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）濃度を使用するグラジエント溶離条件に供した。比較として、ＮａＣｌを使用して類似の溶離実験を行った。ＴＭＡＣまたはＮａＣｌの濃度を、経時的に増大させた。
【0181】
材料および方法
ＡＡＶ材料をパイロットスケールの２５０Ｌ バイオリアクター作業から得た。清澄化した採取物をアフィニティー捕捉し、アフィニティー溶離液サンプルを実験スケールのＡＥＸ実行のために保持した。アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（ＮａＣｌ緩衝液： ２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、ｐＨ ９．０； ＴＭＡＣ緩衝液： ２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＴＭＡＣ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、ｐＨ ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５ｍＭ～約１８２．５ｍＭ ＮａＣｌおよび約２５ｍＭ～約３２６．７ｍＭ ＴＭＡＣへの直線勾配（９０ＣＶに対して生成）をそれぞれ、ＮａＣｌおよびＴＭＡＣの場合に付与した。その溶離液を画分で収集し、「空」および「完全」ピークに相当する画分を、それに応じてプールした。
ＡＡＶ材料をパイロットスケールの２５０Ｌ バイオリアクター作業から得た。清澄化した採取物をアフィニティー捕捉し、アフィニティー溶離液サンプルを実験スケールのＡＥＸ実行のために保持した。アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（ＮａＣｌ緩衝液： ２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、ｐＨ ９．０； ＴＭＡＣ緩衝液： ２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＴＭＡＣ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、ｐＨ ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５ｍＭ～約１８２．５ｍＭ ＮａＣｌおよび約２５ｍＭ～約３２６．７ｍＭ ＴＭＡＣへの直線勾配（９０ＣＶに対して生成）をそれぞれ、ＮａＣｌおよびＴＭＡＣの場合に付与した。その溶離液を画分で収集し、「空」および「完全」ピークに相当する画分を、それに応じてプールした。
【0182】
次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、その後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0183】
各ピークにおいて溶離した空のウイルスキャプシド粒子に対する完全ウイルスキャプシド粒子の相対的な量を、２５４ｎｍにおける吸光度（Ａ２５４）および２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を決定することによって評価した。
【0184】
結果および考察
図６は、これらの実験からの例示的なクロマトグラムを示す。
図６は、これらの実験からの例示的なクロマトグラムを示す。
【0185】
図１のクロマトグラムは、グラジエント溶離の間の溶離液のＡ２５４およびＡ２８０測定値を示す。示されるように、第１の画分は、「空の」ＡＡＶ粒子が豊富である（第１の溶離ピークのＡ２５４／Ａ２８０比は通常、１以下である）。その一方で、第２の、後の溶離画分は、「完全」ＡＡＶ粒子が豊富である（第２の溶離ピークのＡ２５４／Ａ２８０比は、通常１より大きい）。上昇する直線は、溶離液濃度における相当する増大によって引き起こされる溶液導電率における増大を示す。
【0186】
本実施例は、ＴＭＡＣを使用するグラジエント溶離法が、ＮａＣｌを使用する相当のグラジエント溶離法より優れた空のおよび完全キャプシドの分離を達成することを実証する。
【0187】
実施例５：種々のテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）、またはベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）および一定のＭｇＣｌ
２
濃度でのグラジエント溶離
この実施例では、完全および空のウイルスキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、一連のテトラアルキルアンモニウム塩を使用するグラジエント溶離条件に供し、完全ウイルスキャプシド粒子の収量を評価した。
この実施例では、完全および空のウイルスキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、一連のテトラアルキルアンモニウム塩を使用するグラジエント溶離条件に供し、完全ウイルスキャプシド粒子の収量を評価した。
【0188】
材料および方法
ＡＡＶ材料を、実施例１に記載されるのと同様に得た。アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体（この場合には、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラム）に装填した。ＮａＣｌでの溶離に関しては、１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５ｍＭ～約１８２．５ｍＭ ＮａＣｌへの直線勾配（９０ＣＶに対して生成）を付与した。ＱＡ塩（ＴＭＡＣ、ＴＢＡＣ、またはＢＴＢＡＣ）での溶離に関しては、１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５ｍＭ～約３３７．５ｍＭ ＱＡへの直線勾配（９０ＣＶに対して生成）を付与した。その溶離液を画分で収集し、「空」および「完全」ピークに相当する画分を、それに応じてプールした。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、およびその後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
ＡＡＶ材料を、実施例１に記載されるのと同様に得た。アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体（この場合には、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラム）に装填した。ＮａＣｌでの溶離に関しては、１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５ｍＭ～約１８２．５ｍＭ ＮａＣｌへの直線勾配（９０ＣＶに対して生成）を付与した。ＱＡ塩（ＴＭＡＣ、ＴＢＡＣ、またはＢＴＢＡＣ）での溶離に関しては、１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５ｍＭ～約３３７．５ｍＭ ＱＡへの直線勾配（９０ＣＶに対して生成）を付与した。その溶離液を画分で収集し、「空」および「完全」ピークに相当する画分を、それに応じてプールした。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、およびその後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0189】
結果および考察
図７Ａ～７Ｄは、ＮａＣｌまたは官能基のサイズサイズを漸増させた種々のＱＡでのグラジエント溶離を使用する空のＡＡＶ粒子から完全ＡＡＶ粒子分離に関する例示的なクロマトグラムを示す。上から下に、溶離を、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（図７Ａ）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）（図７Ｂ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）（図７Ｃ）、またはベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）（図７Ｄ）勾配から得た。ＮａＣｌ勾配のクロマトグラムを、空のおよび完全分画分離を比較するための基準として示す。そのクロマトグラムは、グラジエント溶離の間の溶離液のＡ２５４およびＡ２８０測定値を示す。上昇する直線は、溶離液濃度における相当する増大によって引き起こされる溶液導電率における増大を示す。
図７Ａ～７Ｄは、ＮａＣｌまたは官能基のサイズサイズを漸増させた種々のＱＡでのグラジエント溶離を使用する空のＡＡＶ粒子から完全ＡＡＶ粒子分離に関する例示的なクロマトグラムを示す。上から下に、溶離を、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（図７Ａ）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）（図７Ｂ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）（図７Ｃ）、またはベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＢＴＢＡＣ）（図７Ｄ）勾配から得た。ＮａＣｌ勾配のクロマトグラムを、空のおよび完全分画分離を比較するための基準として示す。そのクロマトグラムは、グラジエント溶離の間の溶離液のＡ２５４およびＡ２８０測定値を示す。上昇する直線は、溶離液濃度における相当する増大によって引き起こされる溶液導電率における増大を示す。
【0190】
図８は、陽イオンのサイズの関数として第１のおよび第２のピークのイオン強度（ｘ軸）をプロットするグラフを示す。図７および８において認められ得るように、上記ピーク間の差異の増大が、陽イオンのサイズの増大とともに観察される。
【0191】
この実施例は、溶離液に添加されるカチオン（ＮａまたはＱＡ）のサイズが増大するにつれて、完全および空のウイルスキャプシド粒子の増大された分離を実証する。
【0192】
実施例６：種々のテトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）および一定のＭｇＣｌ
２
濃度でのグラジエント溶離
この実施例では、空のおよび完全ＡＡＶ粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、ｐＨ９において２ｍＭの一定の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）濃度でＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対してテトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）勾配でのグラジエント溶離を使用して分離した。
この実施例では、空のおよび完全ＡＡＶ粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、ｐＨ９において２ｍＭの一定の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）濃度でＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対してテトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）勾配でのグラジエント溶離を使用して分離した。
【0193】
材料および方法
アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＴＥＡＣ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５～約３３７．５ｍＭ ＴＥＡＣ（ＭｇＣｌ２の濃度は、２ｍＭで一定に保持される）の直線勾配（９０ＣＶに対して生成）を付与した。その溶離液を画分で収集し、「空」および「完全」ピークに相当する画分を、それに応じてプールした。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、およびその後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＴＥＡＣ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５～約３３７．５ｍＭ ＴＥＡＣ（ＭｇＣｌ２の濃度は、２ｍＭで一定に保持される）の直線勾配（９０ＣＶに対して生成）を付与した。その溶離液を画分で収集し、「空」および「完全」ピークに相当する画分を、それに応じてプールした。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、およびその後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0194】
結果および考察
図９は、この実験からのクロマトグラムを示す。上記クロマトグラムは、グラジエント溶離の間の溶離液のＡ２５４およびＡ２８０測定値を示す。上昇する直線は、ＴＥＡＣ濃度における相当する増大によって引き起こされる溶液導電率における増大を示す。
図９は、この実験からのクロマトグラムを示す。上記クロマトグラムは、グラジエント溶離の間の溶離液のＡ２５４およびＡ２８０測定値を示す。上昇する直線は、ＴＥＡＣ濃度における相当する増大によって引き起こされる溶液導電率における増大を示す。
【0195】
この実施例は、ＴＥＡＣグラジエント溶離を使用する空のおよび完全ＡＡＶ粒子の分離を実証する。
【0196】
実施例７： 種々のテトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ－Ａｃ）および一定のＭｇＣｌ
２
濃度でのグラジエント溶離
この実施例では、完全および空のウイルスキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、テトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ－Ａｃ）を使用するグラジエント溶離条件に供した。ＴＥＡ－Ａｃの濃度を経時的に増大させ、ＭｇＣｌ２濃度は、２ｍＭ ＭｇＣｌ２で一定のままであった。
材料および方法
この実施例では、完全および空のウイルスキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、テトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ－Ａｃ）を使用するグラジエント溶離条件に供した。ＴＥＡ－Ａｃの濃度を経時的に増大させ、ＭｇＣｌ２濃度は、２ｍＭ ＭｇＣｌ２で一定のままであった。
材料および方法
【0197】
アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５ｍＭ～約３３７．５ｍＭ ＴＥＡ－Ａｃへの直線勾配（９０ＣＶに対して生成）を付与した。その溶離液を画分で収集し、「空」および「完全」ピークに相当する画分を、それに応じてプールした。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、その後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0198】
結果および考察
図１０は、この実験からのクロマトグラムを示す。上記クロマトグラムは、グラジエント溶離の間の溶離液のＡ２５４およびＡ２８０測定値を示す。上昇する直線は、ＴＥＡ－Ａｃ濃度における相当する増大によって引き起こされる溶液導電率における増大を示す。
図１０は、この実験からのクロマトグラムを示す。上記クロマトグラムは、グラジエント溶離の間の溶離液のＡ２５４およびＡ２８０測定値を示す。上昇する直線は、ＴＥＡ－Ａｃ濃度における相当する増大によって引き起こされる溶液導電率における増大を示す。
【0199】
この実施例は、ＴＥＡ－Ａｃ勾配を使用する、ウイルスキャプシド調製物からの完全および空のＡＡＶ粒子の分離を実証する。
【0200】
実施例８： 洗浄溶液、第２の洗浄溶液、および溶離溶液を使用するテトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＣ）でのイソクラティック溶離
この実施例では、完全および空のウイルスキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物は、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）での初期洗浄、続いて、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）およびＭｇＣｌ２での２連続工程洗浄、続いて、ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ２での溶離を伴うイソクラティック溶離に供した。
この実施例では、完全および空のウイルスキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物は、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）での初期洗浄、続いて、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）およびＭｇＣｌ２での２連続工程洗浄、続いて、ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ２での溶離を伴うイソクラティック溶離に供した。
【0201】
材料および方法
アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、ＴＥＡＣ（２０ｍＭ ＢＴＰ、１２４．７５ｍＭ ＴＥＡＣ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）での第１の１０ＣＶ イソクラティック洗浄を付与して、空のキャプシドをＡＥＸ媒体から洗い流した。第１の洗浄後、ＮａＣｌのみを含む第２のイソクラティック洗浄（２０ｍＭ ＢＴＰ、６８．７５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ９．０）を付与して、残留ＴＥＡＣ塩をＡＥＸ媒体から除去した。最後に、上記ＡＡＶ粒子（完全キャプシド富化）を、溶離緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、１０９．３５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）によってＡＥＸ媒体から溶離し、収集した。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、およびその後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、ＴＥＡＣ（２０ｍＭ ＢＴＰ、１２４．７５ｍＭ ＴＥＡＣ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）での第１の１０ＣＶ イソクラティック洗浄を付与して、空のキャプシドをＡＥＸ媒体から洗い流した。第１の洗浄後、ＮａＣｌのみを含む第２のイソクラティック洗浄（２０ｍＭ ＢＴＰ、６８．７５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ９．０）を付与して、残留ＴＥＡＣ塩をＡＥＸ媒体から除去した。最後に、上記ＡＡＶ粒子（完全キャプシド富化）を、溶離緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、１０９．３５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）によってＡＥＸ媒体から溶離し、収集した。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、およびその後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0202】
結果および考察
図１１は、これらの実験からのクロマトグラムを示す。完全および空のＡＡＶ粒子に相当するピークは、図１１に示され、明らかに分離されている。破線は、ポンプ「Ａ」（すなわち、平衡化緩衝液を供給するポンプ）に対するポンプ「Ｂ」の（すなわち、洗浄緩衝液および溶離緩衝液を供給するポンプ）の容積出力に相当する。
図１１は、これらの実験からのクロマトグラムを示す。完全および空のＡＡＶ粒子に相当するピークは、図１１に示され、明らかに分離されている。破線は、ポンプ「Ａ」（すなわち、平衡化緩衝液を供給するポンプ）に対するポンプ「Ｂ」の（すなわち、洗浄緩衝液および溶離緩衝液を供給するポンプ）の容積出力に相当する。
【0203】
この実施例は、ＴＥＡＣでのイソクラティック溶離を使用する空のおよび完全ウイルスキャプシド粒子の成功裡の分離を実証する。
【0204】
実施例９： 完全および空のキャプシド粒子の分離に対する種々の勾配およびイソクラティックプロトコールの比較
種々の勾配およびイソクラティック溶離プロトコールを、それらが完全および空の粒子を分離する能力に関して比較するために、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８－１材料を、全てＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して、ＭｇＳＯ４を使用する種々のプロトコールに供した。
種々の勾配およびイソクラティック溶離プロトコールを、それらが完全および空の粒子を分離する能力に関して比較するために、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８－１材料を、全てＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して、ＭｇＳＯ４を使用する種々のプロトコールに供した。
【0205】
以下のプロトコールを試験した： １）グラジエント溶離； ２）勾配洗浄、続いて、イソクラティック溶離工程； ３）１回のイソクラティック洗浄； ４）３回のイソクラティック洗浄、続いて、イソクラティック溶離；および５）２回のイソクラティック洗浄、続いて、イソクラティック溶離。
【0206】
図１２Ａ～１２Ｅは、これらの実験からの例示的なクロマトグラムを示す。図１２Ａ～１２Ｅに示されるように、上記イソクラティック溶離ストラテジーは、グラジエント溶離法より、収集された完全キャプシド粒子のより良好なパーセンテージおよびより良好な工程収量（目的のゲノムの）を生じた。
【0207】
図１３Ａおよび１３Ｂは、イソクラティック溶離プロトコールからの結果と比較して、グラジエント溶離プロトコールからの結果を比較するグラフを示す。図１３Ａは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）法によって決定される場合、工程収量、すなわち、装填材料の量に対するプールした画分中の目的のゲノムの量を示す。図１３Ｂは、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって決定される場合、溶離液に存在する完全キャプシド粒子のパーセンテージを示す。図１３Ａおよび１３Ｂの両方における値は、グラジエント溶離プロトコールで観察されたものに対して正規化されている。
【0208】
実施例１０： 種々の塩化コリン濃度および一定のＭｇＣｌ
２
濃度でのグラジエント溶離
この実施例では、完全および空のウイルスキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、塩化コリンを使用するグラジエント溶離条件に供した。塩化コリンの濃度は経時的に増大させ、ＭｇＣｌ２濃度は、２ｍＭ ＭｇＣｌ２において一定のままであった。
この実施例では、完全および空のウイルスキャプシド粒子を含むウイルスキャプシド調製物を、塩化コリンを使用するグラジエント溶離条件に供した。塩化コリンの濃度は経時的に増大させ、ＭｇＣｌ２濃度は、２ｍＭ ＭｇＣｌ２において一定のままであった。
【0209】
材料および方法
アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５ｍＭ～約３４０ｍＭ 塩化コリンへの直線勾配（９０ＣＶに対して生成）を付与した。その溶離液を画分で収集し、「空」および「完全」ピークに相当する画分を、それに応じてプールした。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、およびその後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。１０カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄した後、約２５ｍＭ～約３４０ｍＭ 塩化コリンへの直線勾配（９０ＣＶに対して生成）を付与した。その溶離液を画分で収集し、「空」および「完全」ピークに相当する画分を、それに応じてプールした。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、およびその後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0210】
【0211】
実施例１１： 宿主細胞タンパク質、および完全キャプシドの溶離に関する最適化
溶離液中の宿主細胞タンパク質のおよび完全キャプシド粒子の量に対するカラム装填および装填物滞留時間の効果を試験するために、異なる実行条件を、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ材料で試験した。
溶離液中の宿主細胞タンパク質のおよび完全キャプシド粒子の量に対するカラム装填および装填物滞留時間の効果を試験するために、異なる実行条件を、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ材料で試験した。
【0212】
図１５Ａは、この実験セットにおいて試験した５種の異なる実行に関するパラメーターを示す。カラムには、１×、１／２×、または１／４×の滞留時間で１×、６×、および１２×量のＡＡＶ８－２材料を装填した。サンプルを、ＮａＣｌ勾配を使用してＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。図１５Ｂは、種々の実行からのクロマトグラムを示し、その条件は、図１５Ａに示される。「Ｅ」は、空のキャプシドの高い相対的量に相当する画分を示し、「Ｆ」は、完全キャプシドの高い相対的量に相当する画分を示す。
【0213】
図１５Ｃは、 キャプシド装填、溶離液中の正規化した宿主細胞タンパク質量、および溶離液中の完全キャプシドの正規化したパーセンテージのような変数に関して、ＪＭＰ（登録商標）ソフトウェアを使用する望ましさの分析からのプロットを示す。
【0214】
図１５Ｃに示されるように、キャプシド装填の増大は、溶離液中の完全キャプシドのパーセンテージの増大をもたらしたが、溶離液中の宿主細胞タンパク質の量の増大をももたらした。
【0215】
図１６Ａおよび１６Ｂは、ＮａＣｌ勾配を使用してＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムで実行されたＡＡＶ８－１材料を使用する類似の実験からの（目的のゲノムの）収量、完全キャプシドのパーセンテージ、および宿主細胞タンパク質量を示す。図１６Ａは、画分ごとの量を示し、図１６Ｂは、累積量を示す。図１６Ａおよび１６Ｂにおいて認められ得るように、第２のピークの後の画分は、検出可能な宿主細胞タンパク質レベルを有し、収集される完全キャプシドタンパク質のパーセンテージを増大させるためにさらなる画分を収集することは、宿主細胞タンパク質の累積量をも増大させる。
【0216】
実施例１２： 空のおよび完全キャプシド粒子の分離における移動相中の二価イオンの使用
完全および空のキャプシド粒子の分離に対する二価イオンを有する移動相の使用の効果を試験するために、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８－１およびＡＡＶ８－２材料のサンプルを、ＮａＣｌ勾配またはＭｇＳＯ４を含む移動相での勾配のいずれかを使用して、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。
完全および空のキャプシド粒子の分離に対する二価イオンを有する移動相の使用の効果を試験するために、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８－１およびＡＡＶ８－２材料のサンプルを、ＮａＣｌ勾配またはＭｇＳＯ４を含む移動相での勾配のいずれかを使用して、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。
【0217】
図１７は、これらの実験からの代表的クロマトグラムを示す。図１７に示されるように、二価イオンを含む移動相を使用すると、ＡＡＶ８－１およびＡＡＶ８－２の両方に関して、完全および空のキャプシド粒子の分離が増強された。
【0218】
実施例１３： 移動相およびイソクラティック溶離の統合した最適化
完全および空のキャプシド粒子の分離に対して二価イオンおよびイソクラティック溶離の使用を組み合わせることの効果を試験するために、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルを、３つの条件： １）ＮａＣｌ、グラジエント溶離を伴う； ２）テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）勾配および２ｍＭ ＭｇＣｌ２、グラジエント溶離を伴う；ならびに３）テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）および２ｍＭ ＭｇＣｌ２、イソクラティック溶離を伴う、のうちの１つを使用して、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。
完全および空のキャプシド粒子の分離に対して二価イオンおよびイソクラティック溶離の使用を組み合わせることの効果を試験するために、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルを、３つの条件： １）ＮａＣｌ、グラジエント溶離を伴う； ２）テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）勾配および２ｍＭ ＭｇＣｌ２、グラジエント溶離を伴う；ならびに３）テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）および２ｍＭ ＭｇＣｌ２、イソクラティック溶離を伴う、のうちの１つを使用して、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。
【0219】
図１８Ａ～１８Ｃは、これらの実験からの代表的クロマトグラムを示す。「Ｅ」は、空のキャプシドの高い相対的量に相当する画分を示し、「Ｆ」は、完全キャプシドの高い相対的量に相当する画分を示す。
【0220】
図１９Ａおよび１９Ｂは、ＮａＣｌ勾配実験のレベルに対して正規化した、これらの実験からの工程収量（定量的ＰＣＲによって測定される場合の目的のゲノム）および完全キャプシド粒子のパーセンテージ（分析用超遠心分離によって測定される場合）を示すプロットを示す。
【0221】
図１８Ａに示されるように、グラジエント溶離法においてＴＥＡＣおよびＭｇＣｌ２を使用すると、工程収量が２．３倍改善した。しかし、図１８Ｂに示されるようにイソクラティック溶離法においてＴＥＡＣおよびＭｇＣｌ２を使用すると、ＮａＣｌ勾配で得られた工程収量のものに匹敵する工程収量を維持しながら、完全キャプシド粒子のパーセンテージが１．８倍改善した。
【0222】
実施例１４： 移動相におけるアニオン種の使用
完全および空のキャプシド粒子の分離に対するアニオン種を含む溶離溶液を使用することの効果を試験するために、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルを、いくつかの直線グラジエント溶離溶液のうちの１つを使用してＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。
完全および空のキャプシド粒子の分離に対するアニオン種を含む溶離溶液を使用することの効果を試験するために、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルを、いくつかの直線グラジエント溶離溶液のうちの１つを使用してＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。
【0223】
アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。上記ＡＡＶ粒子を、ＡＥＸ媒体から、９０カラム容積（ＣＶ）にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、２５～３４０ｍＭ ＴＥＡ－Ｘ（ｐＨ９．０）を含む直線グラジエント溶離によって溶離した。ここでＸは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）と会合した以下の対イオン： テトラフルオロボレート（ＢＦ４）、ブロミド（Ｂｒ）、およびアセテート（Ａｃ）のうちの１つであった。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、およびその後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0224】
これらの実験からの代表的結果を、図２０に示す。試験した全てのアニオン種で、２つの溶離ピークが観察され、これらは、主に空のキャプシド粒子（各クロマトグラムにおいて最も左のピーク）および主に完全キャプシド粒子（各クロマトグラムにおいて最も右のピーク）に相当する。上記溶離溶液でＴＥＡ－ＢＦ４を使用する場合に得られた溶離ピークと比較して、上記溶離溶液でＴＥＡ－Ｂｒを使用する場合に得られた溶離ピークは、より明瞭であり、上記溶離溶液でＴＥＡ－Ａｃを使用する場合に得られた溶離ピークは、さらにより明瞭であった。
【0225】
従って、この実施例は、アニオン種を含む溶離溶液が、空のキャプシド粒子を完全キャプシド粒子から分離する方法において使用され得ることを実証する。
【0226】
実施例１５： グラジエント溶離法におけるＭｇＣｌ
２
濃度の効果
完全および空のキャプシド粒子の分離に対する上記溶離溶液でのＭｇＣｌ２濃度の効果を試験するために、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルを、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。
完全および空のキャプシド粒子の分離に対する上記溶離溶液でのＭｇＣｌ２濃度の効果を試験するために、完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルを、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。
【0227】
アフィニティー溶離液のうちの１．５ｍＬを、ｐＨ９．０に調節した２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）で（１５ｍＬへと）８倍希釈して、装填導電率をおよそ４ｍＳ／ｃｍへと低減した。次いで、希釈したアフィニティー溶離液のうちの１０ｍＬを、ｐＨを合わせた平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）で予め平衡化したＡＥＸ媒体に装填した。上記ＡＡＶ粒子を、ＡＥＸ媒体から、９０カラム容積（ＣＶ）にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（登録商標）、２５～３４０ｍＭ ＴＥＡ－Ａｃ（ｐＨ９）を含む直線グラジエント溶離によって、ＭｇＣｌ２ありまたはなしで（上記溶離溶液中のＭｇＣｌ２濃度を、０、０．２ｍＭ、１ｍＭ、または５ｍＭで一定に保持した）溶離した。次いで、上記カラムを、１０ＣＶの高塩ストリップ溶液（２０ｍＭ ＢＴＰ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）、続いて、１０ＣＶの衛生溶液（３Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ）、およびその後、１０ＣＶのカラム保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ エタノール、ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0228】
得られた代表的クロマトグラムを図２１に示す。試験した全ての濃度で、２つの溶離ピークが観察された。これらは、主に空のキャプシド粒子（各クロマトグラムにおいて最も左のピーク）および主に完全キャプシド粒子（各クロマトグラムにおいて最も右のピーク）に相当する。しかし、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＭｇＣｌ２なしでは、ショルダーピークもまた、検出可能であった。このショルダーピークは、試験した１ｍＭおよび５ｍＭ ＭｇＣｌ２条件では消失した。上記ピーク間の距離は、ＭｇＣｌ２の濃度が１ｍＭ～５ｍＭへと増大するにつれて減少した一方で、上記２つのピークは、５ｍＭ ＭｇＣｌ２でなお識別可能であった。
【0229】
実施例１６： 空のおよび完全キャプシド粒子を分離する方法におけるイソクラティック 対 グラジエント溶離の比較
この実施例では、２つの方法を使用して、空のおよび完全キャプシド粒子を分離した：一方は、グラジエント溶離を使用し、他方は、イソクラティック溶離を使用する。両方法とも、四級アンモニウム塩を含む溶液での少なくとも１つのイソクラティック洗浄工程を使用した。
この実施例では、２つの方法を使用して、空のおよび完全キャプシド粒子を分離した：一方は、グラジエント溶離を使用し、他方は、イソクラティック溶離を使用する。両方法とも、四級アンモニウム塩を含む溶液での少なくとも１つのイソクラティック洗浄工程を使用した。
【0230】
完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルを、以下のプロトコール１またはプロトコール２のいずれかを使用して、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。
【0231】
プロトコール１（グラジエント溶離）：
－ １０カラム容積にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、および２０６．５ｍＭ ＴＥＡ－Ａｃ（ｐＨ９）を含む溶液を使用するイソクラティック洗浄
－ ３０カラム容積にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２５～１８２．５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９）を含む溶液を使用する直線グラジエント溶離。
－ １０カラム容積にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、および２０６．５ｍＭ ＴＥＡ－Ａｃ（ｐＨ９）を含む溶液を使用するイソクラティック洗浄
－ ３０カラム容積にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２５～１８２．５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９）を含む溶液を使用する直線グラジエント溶離。
【0232】
プロトコール２（イソクラティック溶離）：
－ １０カラム容積にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、および２０６．５ｍＭ ＴＥＡ－Ａｃ（ｐＨ９）を含む溶液を使用するイソクラティック洗浄
－ １０カラム容積にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９）を含む溶液を使用する第２のイソクラティック洗浄
－ １０カラム容積にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１１６．７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９）を含む溶液を使用するイソクラティック溶離。
－ １０カラム容積にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、および２０６．５ｍＭ ＴＥＡ－Ａｃ（ｐＨ９）を含む溶液を使用するイソクラティック洗浄
－ １０カラム容積にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９）を含む溶液を使用する第２のイソクラティック洗浄
－ １０カラム容積にわたって、２０ｍＭ ＢＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ－６８， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１１６．７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９）を含む溶液を使用するイソクラティック溶離。
【0233】
図２２Ａ～２２Ｄは、これらの実験からの代表的結果を示し、図２２Ａおよび２２Ｃは、それぞれ、プロトコール１（グラジエント溶離）およびプロトコール２（イソクラティック溶離）を使用する実験からのクロマトグラムを示す。図２２Ｂおよび２２Ｄは、それぞれ、図２２Ａおよび２２Ｃからのピークの左のピーク（図２２Ｂおよび２２Ｄの左のパネル）および右のピーク（図２２Ｂおよび２２Ｄの右のパネル）の拡大画像を示す。図２２Ａおよび２２Ｃの最も左のピークは、主に空のキャプシド粒子と対応し、図２２Ａおよび２２Ｃの最も右のピークは、主に完全キャプシド粒子と対応する。
【0234】
プロトコール１およびプロトコール２はともに、明らかに識別可能なピークを生じ、空のキャプシド粒子の、完全キャプシド粒子からの分離を可能にする。
【0235】
実施例１７： 溶離された完全キャプシド粒子のパーセンテージと工程収率との間のトレードオフ
この実施例に記載される実験は、溶離された完全キャプシド粒子のパーセンテージと工程収率（ゲノム回収％）との間のトレードオフを評価し、四級アンモニウム塩でのイソクラティック洗浄を使用する方法でのトレードオフを、プロセス緩衝液中でＮａＣｌを使用する方法と比較する。
この実施例に記載される実験は、溶離された完全キャプシド粒子のパーセンテージと工程収率（ゲノム回収％）との間のトレードオフを評価し、四級アンモニウム塩でのイソクラティック洗浄を使用する方法でのトレードオフを、プロセス緩衝液中でＮａＣｌを使用する方法と比較する。
【0236】
完全および空のキャプシド粒子を含むＡＡＶ８．１材料のサンプルを、（１）ＮａＣｌプロセス緩衝液または（２）ＴＥＡ－Ａｃを含む溶液を使用するイソクラティック洗浄のいずれかを使用してＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標） ＱＡカラムに対して流した。ＮａＣｌプロセスおよびイソクラティックＴＥＡ－Ａｃ洗浄プロセスの両方に関して、並行した実験セットを、ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ２を含む溶液で、イソクラティックまたはグラジエント溶離のいずれかを使用して実行した。イソクラティック溶離でのＮａＣｌプロセス実験に関しては、イソクラティックおよび洗浄工程の両方に、ＮａＣｌを含めた。グラジエント溶離でのＮａＣｌプロセス実験に関しては、溶離を、ＮａＣｌの勾配で作業し、洗浄工程を使用しなかった。
【0237】
溶離液に存在する完全キャプシド粒子のパーセンテージを、分析用超遠心分離を使用して計算した。工程収量、すなわち、装填材料中の量に対するプールした画分中の目的のゲノムの量を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）法によって決定した。
【0238】
図２３は、これらの実験から得られた完全キャプシド粒子のパーセンテージ（ｘ軸）に対する工程収率（ゲノム回収％）（ｙ軸）のプロットを示す。白抜きのマーカーは、ＮａＣｌプロセス緩衝液を使用するアニオン交換クロマトグラフィー実行からのデータを示し、塗りつぶしのマーカーは、イソクラティックＴＥＡ－Ａｃ洗浄を使用するアニオン交換クロマトグラフィー実行からのデータを示す。丸は、イソクラティック溶離を使用した実行からのデータを示す一方で、四角は、グラジエント溶離を使用した実行からのデータを示す。
【0239】
ＮａＣｌプロセス実行およびイソクラティックＴＥＡ－Ａｃ洗浄プロセス実行の両方に関して、現れた一般的傾向は、溶離液中で回収された完全キャプシド粒子のパーセンテージと工程収率との間のトレードオフを示した。しかし、工程収率および溶離液中の完全キャプシド粒子のパーセンテージはともに、イソクラティックＴＥＡ－Ａｃ洗浄で使用された実行に関して良好であった（図２３では、白抜きの丸および白抜きの四角の傾向線と比較して、塗りつぶしの丸および塗りつぶしの四角に関する傾向線の右側へのシフトを参照のこと）。
【0240】
従って、本開示の方法は、空のキャプシド粒子を完全キャプシド粒子から分離する以前開示された方法を超える改善を表す。
【図1A-B】
【図2A-B】
【図3A-E】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A-D】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A-E】
【図13A-B】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A-B】
【図17】
【図18A-C】
【図19A-B】
【図20】
【図21】
【図22A-B】
【図22C-D】
【図23】
【国際調査報告】