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特表2024-532138ＨＤＬＢＰ／ＶＩＧＩＬＩＮの人為的な同時発現によるタンパク質発現及び分泌の増加
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】ＨＤＬＢＰ／ＶＩＧＩＬＩＮの人為的な同時発現によるタンパク質発現及び分泌の増加
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20240829BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/19 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/23 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/16 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/17 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240829BHJP
C07K 14/575 20060101ALI20240829BHJP
C07K 14/62 20060101ALI20240829BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240829BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240829BHJP
C07K 14/555 20060101ALI20240829BHJP
C07K 14/57 20060101ALI20240829BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240829BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240829BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20240829BHJP
A61K 38/28 20060101ALI20240829BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240829BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 C
C12N15/13 ZNA
C12N15/19
C12N15/23
C12N15/16
C12N15/17
C12N15/62 Z
C07K14/575
C07K14/62
C07K16/00
C07K19/00
C07K14/555
C07K14/57
C12N5/10
C12N15/85 Z
A61K38/17
A61K38/21
A61K38/28
A61P43/00 101
A61K39/395 D
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509087
(86)(22)【出願日】2022-08-18
(85)【翻訳文提出日】2024-04-11
(86)【国際出願番号】 EP2022073116
(87)【国際公開番号】W WO2023030914
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】21191935.2
(32)【優先日】2021-08-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510101631
【氏名又は名称】マックス－デルブルック－セントラム フール モレクラーレ メディツィン（エムディーシー）
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＸ－ＤＥＬＢＲＵＣＫ－ＣＥＮＴＲＵＭ ＦＵＲ ＭＯＬＥＫＵＬＡＲＥ ＭＥＤＩＺＩＮ（ＭＤＣ）
(71)【出願人】
【識別番号】520106862
【氏名又は名称】フンボルト‐ウニヴェルズィテート ズ ベルリン
【氏名又は名称原語表記】ＨＵＭＢＯＬＤＴ－ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴ ＺＵ ＢＥＲＬＩＮ
【住所又は居所原語表記】Ｕｎｔｅｒ ｄｅｎ Ｌｉｎｄｅｎ ６， １００９９ Ｂｅｒｌｉｎ， （ＤＥ）
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】ラントターラー， マルクス
(72)【発明者】
【氏名】ツィナル， ウルリケ
(72)【発明者】
【氏名】ミニア， イゴール
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG10
4B064AG15
4B064AG16
4B064AG18
4B064CA01
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065BB40
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA60
4C084AA02
4C084BA01
4C084DA23
4C084DB34
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB21
4C085AA13
4C085AA14
4C085CC01
4C085DD21
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045DA01
4H045DA17
4H045DA18
4H045DA30
4H045DA37
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞において目的の分泌組換えタンパク質を産生するための方法であって、上記目的の分泌組換えタンパク質とは異なるタンパク質を人為的に同時発現させる工程を含み、この同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、又はこの同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項2】
上記同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、好ましくは、上記同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
上記同時発現タンパク質が、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、好ましくは、上記同時発現タンパク質が、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
上記目的の分泌組換えタンパク質が、タンパク質ベースの治療に好適であり、好ましくは、上記分泌組換えタンパク質が、治療用抗体等の抗体、その抗原結合フラグメント、ナノボディ、抗体薬物複合体、組換え融合タンパク質、エクソソーム、ＩＦＮ－β等のサイトカイン、インスリン等のホルモン、又はＧｎＲＨ類似体等のホルモン類似体からなる群より選択され、より好ましくは、上記目的の分泌組換えタンパク質がＥＰＯ－Ｆｃである、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
上記目的の分泌組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、野生型配列と比較して増加したＣＵ含量を有するように最適化されているＰｒｏ、Ｓｅｒ又はＬｅｕをコードするコドンを少なくとも１つ有し、好ましくは、Ｌｅｕをコードする少なくとも１つのコドンがＣＵＵに最適化されているか、又はＰｒｏをコードする少なくとも１つのコドンがＣＣＵに最適化されているか、又はＳｅｒをコードする少なくとも１つのコドンがＵＣＵに最適化されており、より好ましくは、Ｌｅｕをコードする少なくとも１つのＣＵＧコドンがＣＵＵに最適化されているか、又はＰｒｏをコードする少なくとも１つのＣＣＣコドンがＣＣＵに最適化されているか、又はＳｅｒをコードする少なくとも１つのＵＣＡコドンがＵＣＵに最適化されており、さらにより好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つのコドンがこのように最適化されている、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
上記細胞が真核細胞である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
上記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ１２７、Ａ５４９、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０、ＳＦ－９細胞、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６、及びそれらの任意の誘導体からなる群より選択される、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
上記方法がインビトロで実施される、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
上記細胞がさらに、フィトヘマグルチニン、テストステロンＣ、β－エストラジオール、スペルミジン、又はコレステロールで処理され、好ましくは、上記細胞がさらに、フィトヘマグルチニン又はスペルミジンで処理される、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
目的の分泌組換えタンパク質を産生するように改変され、上記目的の分泌組換えタンパク質とは異なるタンパク質を人為的に同時発現する真核細胞であって、この同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するか、又はこの同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、真核細胞。
【請求項11】
上記目的の分泌組換えタンパク質が、一過的に、恒常的に、及び／又は誘導的に／条件的に発現される、請求項１０に記載の真核細胞。
【請求項12】
上記細胞が、上記目的の分泌組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列を含み、好ましくは、上記細胞が、上記目的の分泌組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む非ゲノム組換えポリヌクレオチド配列、発現カセット又はベクターを含む、請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項13】
上記目的の分泌組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列が、コード配列内に組込まれたＣＵリッチな同義コドンを含む、請求項１２に記載の真核細胞。
【請求項14】
上記組換えポリヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列である、請求項１２に記載の真核細胞。
【請求項15】
上記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０、ＳＦ－９細胞、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、及びそれらの任意の誘導体からなる群より選択される、請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項16】
上記目的の分泌組換えタンパク質が、タンパク質ベースの治療に好適であり、好ましくは、上記分泌組換えタンパク質が、治療用抗体等の抗体、その抗原結合フラグメント、ナノボディ、抗体薬物複合体、組換え融合タンパク質、エクソソーム、ＩＦＮ－β等のサイトカイン、インスリン等のホルモン、又はＧｎＲＨ類似体等のホルモン類似体からなる群より選択される、請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項17】
目的の分泌組換えタンパク質をインビトロで産生する方法における請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の真核細胞の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、目的の分泌組換えタンパク質を産生するための方法、及び目的の分泌タンパク質の産生に使用される細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
真核細胞では、機能性タンパク質産物の最終的な局在は、その翻訳部位によって大部分が決定される。可溶性タンパク質はサイトゾルにおいて翻訳されるが、翻訳と同時の小胞体（ＥＲ）への標的化によって、新たに合成されたタンパク質が分泌経路に入ることができ、その分泌又は膜挿入が生じる。
【0003】
古典的分泌経路は、サイトゾルにおいて疎水性標的シグナル（シグナルペプチド又は膜貫通型ドメイン）の合成から開始される。その後、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）が新生ペプチドに結合すると、リボソームの伸長停止が生じ、リボソーム新生鎖複合体（ＲＮＣ）が形成される。これにより、サイトゾルのＳＲＰ－ＲＮＣがＳＲＰ受容体を介してＥＲ膜に再局在し、新生ペプチドがＥＲ内腔に転移することが可能になる。
【0004】
近年、リボソーム結合前のｍＲＮＡへのＳＲＰの動員及びＳＲＰ非依存性ＥＲ標的化についてのエビデンスとともに、非古典的ＳＲＰ非依存性経路が酵母において発見された。このことは、膜結合ｍＲＮＡの認識に関する未知のメカニズムが存在する可能性を提起している。
【0005】
リボソームの伸長停止及び新生鎖の認識におけるｍＲＮＡ配列中の調節エレメントの潜在的な役割は、よく理解されていない。幾つかの研究では、ＥＲ結合ｍＲＮＡとサイトゾルｍＲＮＡとを区別し得る、コード配列（ＣＤＳ）及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内のエレメントが確認されている。しかしながら、このようなエレメントの認識を担い得るトランス作用因子は未知である。
【0006】
最近、可溶性タンパク質をコードするｍＲＮＡの小さなサブセットもＥＲに局在し、翻訳され得ることが観察され、局在するｍＲＮＡの運命を調節する更なるメカニズムが示された。筋肉においてピルビン酸キナーゼと相互作用するＥＲ関連リボソームのサブプールについてのエビデンスはあるが、サイトゾルリボソーム及びＥＲ結合リボソームの構成、アセンブリ及び活性翻訳状態の総合的な差異は確認されていない。
【0007】
さらに、リボソーム依存性ナンセンス介在的分解（ＮＭＤ）経路の新規な変異体がＥＲで発見され、ＥＲ結合ｍＲＮＡの調節の新たな層が示唆された。要約すると、可溶性タンパク質及び膜タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳運命は、古典的ＳＲＰ依存性モデルの域を超えて機能し得るＲＮＡ結合タンパク質等のトランス作用因子によって厳密に調節されている可能性がある。
【0008】
バイオテクノロジー並びに生物医学の分野では、治療用抗体、ホルモン、酵素等の分泌タンパク質の生産及び入手容易性が、大きな経済的関心事である。このようなタンパク質ベースの化合物、特に医療目的に使用できるものの生産を最適化し向上させる手段は、社会的にも経済的にも非常に重要である。
【0009】
したがって、細胞発現系においてこのようなタンパク質ベースの化合物の産生、発現、及び分泌を改善し増加させるための新たな戦略及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
したがって、本発明の目的は、細胞において目的の分泌組換えタンパク質を発現及び分泌させるための新規で有利な方法を提供することである。
【0011】
本発明の別の目的は、分泌組換えタンパク質の発現のための改良された細胞発現系を提供することである。
【0012】
さらに、目的の分泌組換えタンパク質を産生する方法におけるこのような改良された細胞発現系の使用を提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【0013】
上記目的は、以下に明記する本発明の態様によって解決される。
【0014】
本発明の第一の態様によれば、細胞において目的の分泌組換えタンパク質を産生するための方法であって、上記目的の分泌組換えタンパク質とは異なるタンパク質を人為的に同時発現させる工程を含み、この同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、又はこの同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、方法が提供される。
【0015】
本発明の第一の態様の好ましい実施形態では、上記同時発現タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、より好ましくは、上記同時発現タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0016】
本発明の第一の態様の別の好ましい実施形態では、上記同時発現タンパク質は、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、上記同時発現タンパク質は、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる。
【0017】
本発明の第一の態様の好ましい一実施形態では、上記目的の分泌組換えタンパク質は、タンパク質ベースの治療に好適であり、より好ましくは、上記分泌組換えタンパク質は、治療用抗体等の抗体、その抗原結合フラグメント、ナノボディ、抗体薬物複合体、組換え融合タンパク質、エクソソーム、ＩＦＮ－β等のサイトカイン、インスリン等のホルモン、又はＧｎＲＨ類似体等のホルモン類似体からなる群より選択される。
【0018】
本発明の第一の態様の好ましい実施形態では、上記細胞は真核細胞である。
【0019】
本発明の第一の態様の別の好ましい実施形態では、上記細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ１２７、Ａ５４９、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０、ＳＦ－９細胞、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、及びそれらの任意の誘導体からなる群より選択される。
【0020】
本発明の第一の態様の好ましい一実施形態では、上記方法はインビトロで実施される。
【0021】
本発明の第二の態様によれば、目的の分泌組換えタンパク質を産生するように改変され、上記目的の分泌組換えタンパク質とは異なるタンパク質を人為的に同時発現する真核細胞であって、この同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するか、又はこの同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、真核細胞が提供される。
【0022】
本発明の第二の態様の好ましい実施形態では、上記目的の分泌組換えタンパク質は、一過的に、恒常的に、及び／又は誘導的に／条件的に発現される。
【0023】
本発明の第二の態様の別の好ましい実施形態では、上記細胞は、上記目的の分泌組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、上記細胞は、上記目的の分泌組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む非ゲノム組換えポリヌクレオチド配列、発現カセット又はベクターを含む。
【0024】
本発明の第二の態様の好ましい一実施形態では、上記目的の分泌組換えタンパク質をコードし、上記細胞において発現された組換えポリヌクレオチド配列は、コード配列内に組込まれたＣＵリッチな同義コドンを含み、好ましくは、上記組換えポリヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列である。
【0025】
本発明の第二の態様の好ましい実施形態では、上記細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ１２７、Ａ５４９、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０、ＳＦ－９細胞、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、及びそれらの任意の誘導体からなる群より選択される。
【0026】
本発明の第二の態様の別の好ましい実施形態では、上記目的の分泌組換えタンパク質は、タンパク質ベースの治療に好適であり、より好ましくは、上記分泌組換えタンパク質は、治療用抗体等の抗体、その抗原結合フラグメント、ナノボディ、抗体薬物複合体、組換え融合タンパク質、エクソソーム、ＩＦＮ－β等のサイトカイン、インスリン等のホルモン、又はＧｎＲＨ類似体等のホルモン類似体からなる群より選択される。
【0027】
本発明の第三の態様によれば、目的の分泌組換えタンパク質をインビトロで産生する方法における本発明の第二の態様に係る真核細胞の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】標準的なタンパク質産生プロセスと比較して、ＨＤＬＢＰ／Ｖｉｇｉｌｉｎの過剰発現（ＶｇＳＥＣプラットフォーム）により分泌タンパク質の分泌が向上したことを示す図である。
【図2】誘導量のドキシサイクリンの存在下（＋ＤＯＸ）及び非存在下（－ＤＯＸ）での親ＨＥＫ２９３（ＷＴ）、及びドキシサイクリン誘導性ＨＤＬＢＰを持つｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンを安定的にトランスフェクトした細胞におけるＳＥＡＰ及びガウシアルシフェラーゼ活性測定を示す図である。ＳＥＡＰ及びガウシアルシフェラーゼシグナルを細胞培地中で定量し、細胞内ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）活性に対して標準化した（実験は、少なくとも５回の技術反復により５回実施した）。
【図3】（Ａ）野生型Ａ５４９細胞（ＷＴ）、及びＨＤＬＢＰを過剰発現するｐｉｇｇｙｂａｃｋコンストラクトを安定的にトランスフェクトしたＡ５４９細胞（ＯＥ）のウエスタン分析を示す図である。（Ｂ）Ａ４５９野生型細胞（ＷＴ）、Ｖｉｇｉｌｉｎ／ＨＤＬＢＰノックアウト細胞（ＫＯ）、及びＶｉｇｉｌｉｎ／ＨＤＬＢＰ過剰発現細胞（ＯＥ）におけるＳＥＡＰ活性測定を示す図である。
【図4】（Ａ）野生型（ＷＴ）及びコドン最適化バージョンのＳＥＡＰ（ｏｐｔ１及びｏｐｔ２）を示す図である。（Ｂ）ＳＥＡＰ ＷＴ又はコドン最適化ＳＥＡＰタンパク質を発現するＨＥＫ２９３ ＷＴ細胞及びＨＤＬＢＰ過剰発現細胞における発現及び分泌を反映する相対的なＳＥＡＰ酵素活性を示す図である。
【図5】ＨＤＬＢＰ及びＥＰＯ－ＦＣの誘導性過剰発現を有するＣＨＯ細胞株を生成するための戦略を示す図であり、ここで、ＥＰＯ－Ｆｃ Ｏｐｔ遺伝子は、よりＣＵリッチなＬｅｕ、Ｓｅｒ及びＰｒｏコドンを含む。
【図6】（Ａ）抗ＧＡＰＤＨ抗体、抗ＨＤＬＢＰ抗体及び抗Ｆｃ抗体；ローディングコントロールとしてポンソー染色を用いた、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）誘導性ＥＰＯ－Ｆｃ（ＥＰＯ ＷＴ）遺伝子及びコドン最適化されたＥＰＯ－Ｆｃ（ＥＰＯ Ｏｐｔ）遺伝子のみを発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ細胞ＷＴ）、並びにＥＰＯ ＷＴ遺伝子及びＥＰＯ Ｏｐｔ遺伝子を発現するドキシサイクリン誘導性ＨＤＬＢＰ過剰発現コンストラクトを有するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ細胞ＨＤＬＢＰ ＯＥ）のウエスタン分析を示す図である。（Ｂ）ＨＤＬＢＰ過剰発現のないＣＨＯ細胞（コントロール）、並びにＥＰＯ－Ｆｃ（ＥＰＯ－ＷＴ）及びコドン最適化されたＥＰＯ－Ｆｃコンストラクト（ＥＰＯ Ｏｐｔ）を安定的にトランスフェクトしたＨＤＬＢＰ過剰発現ＣＨＯ細胞（ＨＤＬＢＰ ＯＥ）の上清中のＥＰＯ－ＦｃについてのＥＬＩＳＡを示す図である。
【図7】（Ａ）抗ＧＡＰＤＨ抗体、抗ＨＤＬＢＰ抗体及び抗Ｆｃ抗体；ローディングコントロールとしてポンソー染色を用いた、未処理（コントロール）ＣＨＯ細胞、及び示した各濃度の様々な化合物（ＰＨＡ－Ｐ：フィトヘマグルチニン；ＴＳＣ：テストステロンＣ；β－ＥＤ：β－エストラジオール；ＳＰＤ：スペルミジン；ＣＳ：コレステロール）で処理した細胞におけるＥＰＯ－Ｆｃ発現についてのウエスタン分析を示す図である。（Ｂ）未処理コントロール細胞、及び示した各濃度の様々な化合物（ＰＨＡ－Ｐ：フィトヘマグルチニン；ＴＳＣ：テストステロンＣ；β－ＥＤ：β－エストラジオール；ＳＰＤ：スペルミジン；ＣＳ：コレステロール）で処理した細胞の上清中のＥＰＯ－ＦｃについてのＥＬＩＳＡを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明は、真核細胞におけるＨＤＬＢＰ（高密度リポタンパク質結合タンパク質）／Ｖｉｇｉｌｉｎの（同時）発現の増加が、特に分泌タンパク質の組換え発現のための細胞発現系において、この細胞からの分泌タンパク質の発現及び分泌を向上させるという認識に基づくものである。本発明者らは、分泌経路を鋭意研究し、ＨＤＬＢＰ／Ｖｉｇｉｌｉｎ、並びに真核細胞における分泌タンパク質の翻訳、発現及び分泌の効率のためのその重要な役割を確認することに成功した。
【0030】
ＨＤＬＢＰ（Ｖｉｇｉｌｉｎとしても知られている；本明細書ではＶｉｇｉｌｉｎ及びＨＤＬＢＰは交換可能に用いられ得る）は、サイトゾル及びＥＲ膜の両方に局在する保存された遍在的に発現するＲＮＡ結合タンパク質である。ヒトでは、アイソフォームａ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１３０７８９４．１；配列番号１）、アイソフォームｂ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２３０８２９．１；配列番号２）及びアイソフォームｃ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１３０７８９６．１；配列番号３）と呼ばれる３つの主要なアイソフォームが存在する。
【0031】
キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ドデカ－サテライト結合タンパク質１、アイソフォームＡ；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿９９５８８６．１；配列番号４）、マウス（Ｖｉｇｉｌｉｎ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿５９８５６９．１；配列番号５）、チャイニーズハムスター（Ｖｉｇｉｌｉｎ、ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿０２７２５３４６５．１；配列番号６）、ミドリザル（ＶｉｇｉｌｉｎアイソフォームＸ１、ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿０３７８５６５１９．１；配列番号７）、及び他の種に由来する相同タンパク質も知られている。これらの相同タンパク質のいずれも、例えば同一又は近縁の生物に由来する発現系において各相同体を同時発現させることによって、本発明の文脈において使用され得る。
【0032】
ヒトのアイソフォームは、１５個のｈｎＲＮＰ Ｋ相同性（ＫＨ）ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。ＫＨドメインは、高親和性ＲＮＡ認識エレメント（ＲＲＥ）であり、最も一般的には、ＦＭＲＰ２７、ＳＦ１、ＨＮＲＮＰＫ等に観察されるようなテトラヌクレオチドである。ＨＤＬＢＰ及びその酵母オルソログであるＳＣＰ１６０は、翻訳又はタンパク質凝集等の多くの生物学的プロセスに寄与することが分かっており、発癌とも関連付けられている。
【0033】
最近、ＨＤＬＢＰは、フラビウイルスＺＩＫＶ及びＤＥＮＶの複製に必要であることが示されている。動脈硬化を起こす傾向があるＬｄｌｒ－／－マウスで肝臓ＨＤＬＢＰをノックダウンすると、動脈硬化プラークが減少すると考えられるため、ＨＤＬＢＰは心血管系研究の有望な標的でもある。しかしながら、ＲＮＡに結合するＨＤＬＢＰの機能的側面、及び翻訳中のメカニズム的イベントは、依然として不明である。
【0034】
本発明の一部として、ＨＤＬＢＰ結合部位をＰＡＲ－ＣＬＩＰによりトランスクリプトームワイドにアッセイし、ＥＲ結合ｍＲＮＡの選択的な配列決定因子としてのその潜在的な機能を発見した。ＨＤＬＢＰは、全ＥＲ局在ｍＲＮＡの少なくとも８０％という高い割合と直接的かつ特異的に相互作用し、主にそのコード配列中の長いＣＵリッチモチーフに結合したが、これは、サイトゾルｍＲＮＡと比較して膜結合ｍＲＮＡにおいてはるかに多く見られるユニークな特徴である。
【0035】
生化学的方法、トランスクリプトーム方法及びプロテオミクス方法を用いて、ＨＤＬＢＰの非存在がＥＲの翻訳効率、タンパク質合成及び分泌に対して及ぼす機能的な影響を評価したところ、これらの生物学的プロセスのためのその必要性が浮き彫りになった。
【0036】
これらの考察に基づき、本発明者らは、分泌タンパク質の産生の増加のための、ＨＤＬＢＰを過剰発現する細胞発現系の関連性及び適合性を認識した。
【0037】
したがって、発明の第一の態様において、細胞において目的の分泌組換えタンパク質を産生するための方法であって、上記目的の分泌組換えタンパク質とは異なるタンパク質を人為的に同時発現させる工程を含み、この同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、又はこの同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、方法が提供される。
【0038】
本明細書で用いる「産生」という用語は、ヌクレオチド配列の翻訳によって目的のタンパク質を産生することが可能な真核細胞を用いたこの組換えタンパク質の産生を意味する。「組換え」ポリヌクレオチド又はタンパク質として、トランスフェクション、形質導入、又は当技術分野で一般的に知られている遺伝子工学の他の手段によって産生細胞に導入されたポリヌクレオチド又はタンパク質が記載され得る。さらに、「組換え」ポリヌクレオチド又はタンパク質は、産生細胞において天然には存在しないものであり得る。
【0039】
例えば、目的のタンパク質を産生するために、１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列を細胞に導入することができ、その後、このタンパク質が、通常の細胞転写／翻訳プロセスの一環として上記細胞によって産生される。このような核酸は、当技術分野で一般的に知られている様々な経路により細胞内に導入することができる。
【0040】
タンパク質産生のために細胞によって転写及び／又は翻訳される核酸を導入するのに好適な輸送媒体としては、例えば、ＤＮＡを含むベクターが挙げられる。さらに、ＲＮＡ等の一本鎖核酸、好ましくは、導入される一本鎖核酸がｍＲＮＡであるものも、本発明の範囲内で想定される。あるいは、目的のタンパク質をコードするこのような核酸は、タンパク質産生に使用される真核細胞のゲノム内に（単一コピー又は複数コピーとして）安定的に組込まれ得る。
【0041】
発現系として使用される真核細胞は、産生するタンパク質をコードする核酸を取込む必要がある。この取込みは、当業者には周知の様々な遺伝子形質転換経路によって媒介され得る。非制限的な例としては、真核細胞のエレクトロポレーション、化学物質ベースのトランスフェクション、粒子ベースのトランスフェクション、注入及び／又は形質導入が挙げられる。
【0042】
原則として、本発明の方法は、任意の発現系の文脈において、また任意の目的の分泌タンパク質の産生のために適用することができる。このため、本発明の恩恵を得るために、分泌タンパク質のための既存の発現系を採用し、ＨＤＬＢＰの過剰発現を達成するように改変してもよい。これらのタンパク質産生経路は、任意の規模で実施可能であり、また、目的のタンパク質を大量に生成するのにも好適である。
【0043】
「分泌タンパク質」は、細胞によって分泌される任意のタンパク質として理解されるべきであり、これは、細胞が、産生した目的のタンパク質を細胞外又は外部媒体中に送達することを意味する。
【0044】
「目的の組換えタンパク質」は、細胞によって発現される任意のタンパク質であってもよく、上記細胞は、上記細胞内に上記タンパク質をコードする異種又は組換えポリヌクレオチド配列が存在することによって特徴付けられる。
【0045】
特に、上記組換えポリヌクレオチド配列に含まれるコード配列は、細胞内の相同性コード配列と同一であってもよいが、細胞内の相同性配列に対する他の差異が、組換えポリヌクレオチド配列内、例えばエンハンサー、プロモーター、又は他のこのような領域等のポリヌクレオチド配列の調節領域に、存在することが好ましい。
【0046】
また、組換えポリヌクレオチド配列は、発現系として使用される真核細胞に対して異種の及び／又は外来性のコード配列を含んでいてもよい。一実施形態では、ポリシストロニック発現系を採用してもよく、好ましくは、ポリシストロニック発現系が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は２Ａペプチドを用いたベクターを含んでいてもよい。
【0047】
このようなエレメントは、Ｙｅｏ ＪＨＭ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１８；１８２７：３３５－３４９．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－４９３９－８６４８－４；Ｃｒｕｚ ＴＡ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ ４２，２５１１－２５２２（２０２０）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０５２９－０２０－０２９５２－８、又はＣｈｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１５；７（２）：４０３－４１２．ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１５．１００８３５１において例示的に記載されているが、当技術分野においても、また当業者にも周知である。
【0048】
本明細書で用いる「人為的に」及び「人為的に同時発現させる」という用語は、未改変の真核細胞又は発現系では自然に起こらない同時発現タンパク質の発現、特にその増加又は向上した発現として理解されるとみなされる。
【0049】
したがって、本発明による同時発現タンパク質の人為的な同時発現によって、天然の又は未改変の真核細胞における上記タンパク質レベルと比較して、真核細胞内でより高いレベルの上記タンパク質が得られることが好ましい。このため、目的の分泌組換えタンパク質とは異なる同時発現タンパク質の天然の細胞発現が、人為的な同時発現とは独立して、やはり上記細胞内で生じ得る。
【0050】
本明細書で用いる「同時発現された」又は「同時発現」とは、２つ（又はそれ以上）の異なる遺伝子、特に２つ以上の異なる組換え遺伝子の、同時の発現として定義される。目的の同時発現タンパク質は、細胞内で一過的に、恒常的に、及び／又は誘導的に／条件的に発現されてもよく、好ましくは、同時発現タンパク質は恒常的に発現される。
【0051】
本発明によれば、同時発現タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、又は同時発現タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0052】
本発明によれば、同時発現タンパク質は、ヒトにおけるＶｉｇｉｌｉｎ又はＨＤＬＢＰと呼ばれるタンパク質に対して相同性のタンパク質であってもよい。本発明の一実施形態では、同時発現タンパク質は、発現系として用いた真核細胞と同じ種の各Ｖｉｇｉｌｉｎ／ＨＤＬＢＰ相同体であるか、又は各Ｖｉｇｉｌｉｎ／ＨＤＬＢＰ相同体のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質である。
【0053】
本発明の一実施形態によれば、タンパク質配列は、本明細書に開示される参照タンパク質配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％同一であるタンパク質配列からなるか、又は該タンパク質配列を含む同時発現タンパク質として本発明の一部を構成する。
【0054】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌの数学的アルゴリズムを使用することにより、本発明に従って達成される（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３－５８７７）。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムのベースとなっている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３－４１０）。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行われる。比較目的でギャップ有りアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌらにより記載されるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用される（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９－３４０２）。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメーターが使用される。
【0055】
本発明の特定の一実施形態によれば、Ｖｉｇｉｌｉｎ／ＨＤＬＢＰ相同体の個別化された配列に対する所定の同一性パーセントによって上で定義した本発明の一部を構成するタンパク質配列は、各Ｖｉｇｉｌｉｎ／ＨＤＬＢＰ相同体の機能を維持するものである。
【0056】
一実施形態では、例えば本開示に従って測定した場合に、同一細胞において同時発現された際に目的の分泌組換えタンパク質の産生を増加させることが可能なタンパク質配列のみが包含される。
【0057】
一実施形態では、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号１のタンパク質配列であってよい。別の実施形態では、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号２のタンパク質配列であってよい。さらに別の実施形態では、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号３のタンパク質配列であってよい。
【0058】
一実施形態では、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号４のタンパク質配列であってよい。一実施形態では、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号５のタンパク質配列であってよい。一実施形態では、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号６のタンパク質配列であってよい。一実施形態では、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号７のタンパク質配列であってよい。特定の実施形態では、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、本発明の方法で使用される発現系又は真核細胞の種に対応する。
【0059】
したがって、一実施形態では、ヒト細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞、その誘導体、又は他のヒト由来の細胞株を使用する場合、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３のタンパク質配列であってよい。
【0060】
異なる実施形態では、昆虫細胞、好ましくはＳｆ－９細胞、その誘導体、又は他の昆虫由来の細胞株を使用する場合、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号４のタンパク質配列であってよい。
【0061】
別の実施形態では、マウス、ラット又はハムスター細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＢ２／０細胞、又はＮＳ０細胞を使用する場合、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号５又は６のタンパク質配列であってよい。
【0062】
一実施形態では、サル細胞、好ましくはＶｅｒｏ細胞を使用する場合、同時発現タンパク質のタンパク質配列は、配列番号７のタンパク質配列であってよい。
【0063】
異なる種におけるＶｉｇｉｌｉｎ／ＨＤＬＰＢＰの実質的な相同性を考慮すると、任意の哺乳動物由来の真核細胞において配列番号１、２、３、５、６及び７のタンパク質配列を有するタンパク質のいずれかを使用することが好ましい場合もある。
【0064】
好ましい一実施形態では、同時発現タンパク質は、本明細書に開示されるＶｉｇｉｌｉｎ／ＨＤＬＰＢＰ相同体配列のいずれかからなり、より好ましくは、同時発現タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【0065】
以下に、特定のＶｉｇｉｌｉｎ／ＨＤＬＢＰ相同体のアミノ酸配列を共通の１文字コードで示す。
【0066】
配列番号１（ヒトアイソフォームａ）
＞ＮＰ＿００１３０７８９４ ＨＤＬＢＰ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Ｉｓｏｆｏｒｍ ａ
＞ＮＰ＿００１３０７８９４ ＨＤＬＢＰ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Ｉｓｏｆｏｒｍ ａ
【0067】
【数1】
【0068】
配列番号２（ヒトアイソフォームｂ）
＞ＮＰ＿００１２３０８２９ ＨＤＬＢＰ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Ｉｓｏｆｏｒｍ ｂ
＞ＮＰ＿００１２３０８２９ ＨＤＬＢＰ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Ｉｓｏｆｏｒｍ ｂ
【0069】
【数2】
【0070】
配列番号３（ヒトアイソフォームｃ）
＞ＮＰ＿００１３０７８９６ ＨＤＬＢＰ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ
＞ＮＰ＿００１３０７８９６ ＨＤＬＢＰ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ
【0071】
【数3】
【0072】
配列番号４（キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来Ｄｐ１）
＞ＮＰ＿９９５８８６．１ Ｄｏｄｅｃａ－ｓａｔｅｌｌｉｔｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １，ｉｓｏｆｏｒｍ Ａ［Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ］
＞ＮＰ＿９９５８８６．１ Ｄｏｄｅｃａ－ｓａｔｅｌｌｉｔｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １，ｉｓｏｆｏｒｍ Ａ［Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ］
【0073】
【数4】
【0074】
配列番号５（ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来Ｖｉｇｉｌｉｎ）
＞ＮＰ＿５９８５６９．１ ｖｉｇｉｌｉｎ［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］
＞ＮＰ＿５９８５６９．１ ｖｉｇｉｌｉｎ［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］
【0075】
【数5】
【0076】
配列番号６（チャイニーズハムスター（Ｃ．ｇｒｉｓｅｕｓ）由来Ｖｉｇｉｌｉｎ）
＞ＸＰ＿０２７２５３４６５．１ ｖｉｇｉｌｉｎ［Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ］
＞ＸＰ＿０２７２５３４６５．１ ｖｉｇｉｌｉｎ［Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ］
【0077】
【数6】
【0078】
配列番号７（ミドリザル（Ｃ．ｓａｂａｅｕｓ）由来Ｖｉｇｉｌｉｎ）
＞ＸＰ＿０３７８５６５１９．１ ｖｉｇｉｌｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ１［Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｓａｂａｅｕｓ］
＞ＸＰ＿０３７８５６５１９．１ ｖｉｇｉｌｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ１［Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｓａｂａｅｕｓ］
【0079】
【数7】
【0080】
本発明によれば、目的の分泌組換えタンパク質は、分泌経路に対して標的化された任意のタンパク質であってよい。一実施形態では、目的の分泌組換えタンパク質は、治療用途に好適なタンパク質性化合物である。特定の実施形態では、分泌組換えタンパク質は、治療用抗体等の抗体、その抗原結合フラグメント、ＩＦＮ－β等のサイトカイン、インスリン等のホルモン、又はＧｎＲＨ類似体等のホルモン類似体からなる群より選択される。
【0081】
本明細書で用いる「サイトカイン」は、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、及びケモカイン等の全てのクラスのサイトカインを含む。
【0082】
インターフェロンの非限定的な例としては、例えば、ＩＦＮ－α（ＩＦＮ－α－２ａ及びＩＦＮ－α－２ｂ）、ＩＦＮ－β（ＩＦＮ－β－１ａ及びＩＦＮ－β－１ｂ）、並びにＩＦＮ－γが挙げられる。インターロイキンの非限定的な例としては、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１６、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２３が挙げられる。コロニー刺激因子の非限定的な例としては、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、及びＭ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）が挙げられる。腫瘍壊死因子の非限定的な例としては、例えば、ＴＮＦ－α及びＴＮＦ－βが挙げられる。
【0083】
ホルモンの非限定的な例としては、ペプチドホルモン（タンパク質ホルモン）及び糖タンパク質ホルモンが挙げられる。
【0084】
ペプチドホルモンとしては、アディポネクチン、アディウレチン（Ａｄｉｕｒｅｔｉｎ）（バソプレシン、ＡＤＨ）、アドレノメデュリン、アグーチ関連ペプチド（ＡＧＲＰ）、アンジオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、抗ミュラー菅ホルモン（ＡＭＨ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ボンベシン、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、カルシトニン（ＣＴ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ＣＲＨ、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、エンテログルカゴン（ＧＬＩ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ガストリン、グレリン、ＧＨＲＨ、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、グルカゴン、ＧｎＲＨ、ヘプシジン、ＨＧＨ（ＧＨ、ＳＴＨ）、恒常性胸腺ホルモン（ＨＴＨ）、ＩＧＦ １、ＩＧＦ ２、インヒビン、インスリン、レプチン、ＭＣＨ、メラトニン、モチリン、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、ニューロテンシン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）、胎盤成長ホルモン（ｈＧＨ－Ｖ）、オメンチン、オステオカルシン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、プロオピオメラノコルチン誘導体（α－ＭＳＨ、β－ＭＳＨ、γ－ＭＳＨ、ＣＬＩＰ、エンドルフィン、エンケファリン、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、β－リポトロピン等）、リラキシン、レジスチン、セクレチン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、チモシン（チモシンα－１及びチモシンβ－４）、チムリン、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、バスピン、及びビスファチンが挙げられる。
【0085】
糖タンパク質ホルモンとしては、例えば、ＦＳＨ、ＨＣＧ（β－ＨＣＧ）、ＬＨ、サイロスティムリン（ＴＳＨ ２）、及びＴＳＨ（ＴＳＨ １）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0086】
本明細書において、「ホルモン類似体」という用語は、対応するホルモンと同様の化学（「類似体」）構造を有し、よって、対応する受容体に結合して対応するホルモンと同じ効果を達成することができる物質として理解されるとみなされる。ホルモン類似体の非限定的な例としては、例えば、ＧｎＲＨ類似体（ゴナドトロピン放出ホルモン）が挙げられる。
【0087】
本発明の範囲内で使用される目的の分泌組換えタンパク質の特定の一例として、エリスロポエチンと抗体のＦｃ（フラグメント結晶化可能）ドメインとの融合タンパク質であるＥＰＯ－Ｆｃが挙げられる。そのため、ＥＰＯ－Ｆｃは、サイトカインや、免疫グロブリンベースの治療薬又は抗体薬物複合体の発現のための代表例である。
【0088】
治療用免疫グロブリン、サイトカイン等の目的のタンパク質の発現及び分泌に対する本発明の効果を評価するために、まずは細胞にＨＤＬＢＰ過剰発現コンストラクトをトランスフェクトした。
【0089】
次の工程で、ＨＤＬＢＰ過剰発現細胞に、ＥＰＯ－Ｆｃ ＷＴコンストラクト（ＥＰＯ－Ｆｃ ＷＴをコードするヌクレオチド配列については配列番号８）又はＥＰＯ－Ｆｃ Ｏｐｔコンストラクト（ここでは、配列は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ及びＰｒｏコドンをよりＣＵリッチにすることによってコドン最適化されている。この特定の配列では、１６個のＰｒｏコドン、２０個のＬｅｕコドン、及び７個のＳｅｒコドンがそれに応じて最適化されている。ＥＰＯ－Ｆｃ Ｏｐｔをコードするヌクレオチド配列については配列番号９）のいずれかをさらにトランスフェクトした。これらの細胞を樹立するための戦略を図５に図示する。
【0090】
以下に、ＥＰＯ－Ｆｃ ＷＴコンストラクト及びＥＰＯ－Ｆｃ Ｏｐｔコンストラクトのヌクレオチド配列を共通の１文字コードで示すが、ここでは、最適化されたコドンを認識することができる。
【0091】
配列番号８（ＥＰＯ－Ｆｃ ＷＴコンストラクト）
【0092】
【数8】
【0093】
配列番号９（ＥＰＯ－Ｆｃ Ｏｐｔコンストラクト）
【0094】
【数9】
【0095】
ＥＰＯ－Ｆｃの発現量の分析により、ＥＰＯ－Ｆｃ ＷＴとともにＨＤＬＢＰを過剰発現させると、ＨＤＬＢＰを過剰発現しないコントロールと比べて７５％を超える、タンパク質の発現及び分泌の増加が既に得られることが示されている（図６Ｂの左側部分を参照）。
【0096】
驚くほどに、より多数のＣＵリッチなコドンを有するコドン最適化バージョンのＥＰＯ－Ｆｃを使用すると、ＨＤＬＢＰ過剰発現がない場合でも、約１１５％のタンパク質の発現及び分泌の増加が既に得られる。この増加は、細胞において自然に存在するＨＤＬＢＰに対して著しい効果を有するコドン最適化のみによって既にもたらされると考えられる。
【0097】
そして、コドン最適化とＨＤＬＢＰ過剰発現との組合せにより、ＨＤＬＢＰを過剰発現せず、コドン最適化コンストラクトを使用しないコントロールと比べて２９０％を超える増加が得られる（図６Ｂの右側部分を参照）。
【0098】
翻訳を伴うタンパク質の産生には、必然的に産生細胞又は細胞株の提供が必要となる。原則として、組換え特定タンパク質の人為的な発現に使用できる全ての細胞株が、この目的のために好適である。本発明の一実施形態では、細胞は真核細胞である。
【0099】
真核細胞としては、ハムスター細胞株（ＣＨＯ及びその誘導体）、マウス細胞株（Ｃ１２７、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＸＢ２／０９、及びそれら全ての誘導体等）、又はヒト細胞株（ＨＥＫ２９３及びその誘導体、ＨＴ－１０８０、ＰＥＲ．Ｃ６、もしくはＨｕｈ－７等）等が挙げられるが、これらに限定されない。また、Ｖｅｒｏ細胞及びその誘導体等のサル由来の細胞株、又はＳＦ－９細胞及びその誘導体等の昆虫由来の細胞株も含まれる。
【0100】
本明細書で用いる「誘導体」とは、それらから誘導されたか、又は改変もしくはさらなる開発によりそれらから出現した全ての子孫細胞株として理解されるべきである。
【0101】
好ましい一実施形態では、目的の分泌組換えタンパク質は、一過的に、恒常的に、及び／又は誘導的に／条件的に発現される。
【0102】
本明細書で用いる「一過的に発現される」とは、一定の期間及び規定された継続時間に限定される発現として理解されるべきである。例えば、一過性発現は、核酸をコードするｍＲＮＡ等のＲＮＡ又はコード核酸を含むベクターにより生じさせることができ、該ベクターは、細胞内に導入されて特定の期間維持される。
【0103】
一方、「恒常的に発現される」とは、タンパク質の発現が一定であるか、不変であるか、又は連続的であることを意味する。これは、例えば発現させるタンパク質をコードする核酸を細胞のゲノムＤＮＡに挿入することによって、得ることができる。
【0104】
本明細書で用いる「誘導的に／条件的に発現される」とは、発現が条件的及び／又は活性化依存的であるとして理解されるべきである。例えば、このような誘導性発現は、細胞培地に添加される物質によって惹起することができる。誘導性発現を、本明細書で定義する一過性発現又は恒常的発現と組合せることができることが当業者には明らかである。
【0105】
別の好ましい実施形態では、細胞は、目的の分泌及び／又は同時発現組換えタンパク質をコードする人為的な組換えポリヌクレオチド配列を含み、好ましくは、細胞は、該目的の分泌及び／又は同時発現組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む別個の組換えポリヌクレオチド配列、発現カセット又はベクターを含む。
【0106】
これによれば、さらなる好ましい実施形態では、目的の分泌組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列は、コード配列内に組込まれた最適化されたＣＵリッチな同義コドンを含む。最適化されたＣＵリッチな同義コドンの非限定的な好ましい例としては、例えば、Ｌｅｕ：ＣＵＧ→ＣＵＵ、ＣＵＣ→ＣＵＵ；Ｐｒｏ：ＣＣＧ→ＣＣＵ、ＣＣＡ→ＣＣＵ、ＣＣＣ→ＣＣＵ、Ｓｅｒ：ＡＧＵ→ＵＣＵ、ＵＣＧ→ＵＣＵ、ＵＣＡ→ＵＣＵが挙げられる。
【0107】
【0108】
組換えポリヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である場合、その配列は、転写されたｍＲＮＡ配列内で最適化されたＣＵリッチな同義コドンに転写される組込まれたコドンを含む。
【0109】
ＣＵリッチな配列は、各種タンパク質の結合能力に影響を及ぼすことが当技術分野において知られている。好ましい一実施形態では、目的のタンパク質のコード配列内にＣＵリッチな同義コドンを組込むと、ＨＤＬＢＰとのｍＲＮＡ相互作用が増加し、さらには、本発明に従ってその翻訳及び産生を増加させるように機能し得る。
【0110】
上述のとおり、細胞は、産生する目的のタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列を取込む必要がある。これによれば、より好ましい実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列である。
【0111】
これに関連して、別の好ましい実施形態では、上記方法は、タンパク質発現を改善するためのプラットフォームとして機能し得る（図１も参照）。この点について、本明細書では２つの戦略が想定される。第一に、目的の特定の分泌タンパク質の発現のために樹立細胞株を、上記細胞内でＨＤＬＢＰの過剰発現又は強制発現を引起こすポリヌクレオチド配列を導入することにより改変することで、樹立細胞株又は親細胞株と比較して、目的のタンパク質の発現の増加を得てもよい。
【0112】
第二に、ＨＤＬＢＰを人為的に同時発現及び過剰発現するように改変された標準的な真核細胞株を、目的の分泌組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の導入のために使用してもよい。上記細胞株により、標準的な又は未改変のＨＤＬＢＰ発現を有する他の細胞株と比較して、分泌タンパク質の発現レベルの増加が得られることになる。
【0113】
いずれの戦略によっても、高度な柔軟性、及び所望の目的の分泌タンパク質への適応が可能になる。
【0114】
別の好ましい実施形態では、上記方法はインビトロで実施される。本明細書で用いる「インビトロで実施される」とは、上記方法が、生きているヒト又は動物生物体外で行われるとして理解されるべきである。好ましくは、上記方法は、細胞培養系において実施される。
【0115】
本発明の第一の態様の一実施形態では、細胞は、フィトヘマグルチニン、テストステロンＣ、β－エストラジオール、スペルミジン、又はコレステロール、好ましくはフィトヘマグルチニン又はスペルミジンで処理される。このような処理は、未処理コントロールと比較して、目的のタンパク質の発現及び分泌を最大２５０％までさらに増加させることが可能である（図７参照）。
【0116】
特定の一実施形態では、細胞は、フィトヘマグルチニン、好ましくは１μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５μｇ／ｍｌ～５００μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは８μｇ／ｍｌ～２００μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニンで処理される。
【0117】
別の特定の実施形態では、細胞は、０．２～１０ｍＭのスペルミジン、好ましくは０．５～５ｍＭ、より好ましくは０．８～２ｍＭのスペルミジンで処理される。
【0118】
これらの物質による細胞のさらなる処理によって、さらに９６％（１ｍＭスペルミジンを使用）、又は９５％及び最大２５０％（それぞれ１０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニンを使用）のタンパク質分泌の増加を得ることができる（図７参照）。このような増加は、ＨＤＬＢＰ過剰発現細胞系においても目的のタンパク質の発現及び分泌に影響を及ぼすと考えられる。
【0119】
本発明の第二の態様では、目的の分泌組換えタンパク質を産生するように改変され、上記目的の分泌組換えタンパク質とは異なるタンパク質を人為的に同時発現する真核細胞であって、この同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するか、又はこの同時発現タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、真核細胞が、本明細書において提供される。
【0120】
一実施形態では、上記真核細胞は、上記目的の分泌組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列を含み、好ましくは、上記細胞は、上記目的の分泌組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む非ゲノム組換えポリヌクレオチド配列、発現カセット又はベクターを含む。
【0121】
特定の実施形態では、上記真核細胞における上記目的の分泌組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド配列は、コード配列内に組込まれたＣＵリッチな同義コドンを含む。
【0122】
本発明の一実施形態では、上記組換えポリヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列である。
【0123】
本発明に係る真核細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０、ＳＦ－９細胞、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、及びそれらの任意の誘導体からなる群より選択されてもよい。
【0124】
本発明の真核細胞の一実施形態では、上記目的の分泌組換えタンパク質は、タンパク質ベースの治療に好適であり、好ましくは、上記分泌組換えタンパク質は、治療用抗体等の抗体、その抗原結合フラグメント、ナノボディ、抗体薬物複合体、組換え融合タンパク質、エクソソーム、ＩＦＮ－β等のサイトカイン、インスリン等のホルモン、又はＧｎＲＨ類似体等のホルモン類似体からなる群より選択される。
【0125】
本発明の第三の態様では、目的の分泌組換えタンパク質をインビトロで産生する方法における本発明の第二の態様に係る真核細胞の使用が提供される。
【0126】
本明細書に開示及び記載される本発明の全ての実施形態は、当業者が技術的な意味を有さないと考えない限り、任意の組合せで組合せることが可能であるとみなされる。
【0127】
次に、本発明を個々の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は例示を目的とし、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【0128】
先の知見に基づき、本発明者らは、ＥＲ関連翻訳及び分泌におけるＨＤＬＢＰの機能を調査した。このため、まずは、２種類のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＨＤＬＢＰノックアウト（ＫＯ）細胞株を生成することによって、ＨＤＬＢＰの非存在下での活性翻訳のプロセスを研究した。
【0129】
Ｅｄｉｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｇｅｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇキット（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を製造業者の指示書に従って使用して、ＨＥＫ２９３及びＡ５４９ ＨＤＬＢＰノックアウト細胞株を作製した。簡潔に説明すると、合成ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｕ－００２０００－０５）、ｈＣＭＶ－ＰｕｒｏＲ－Ｃａｓ９（Ｕ－００５１００－１２０）及び予め設計したＨＤＬＢＰ ｃｒＲＮＡ（ガイド１（ＣＲ－０１９９５６－０１－０００５）もしくはガイド２（ＣＲ－０１９９５６－０４－０００５）のどちらか）、又は非標的コントロール（Ｕ－００７５０１－０５）のトランスフェクションを、１２ウェルプレートにおいてＤｈａｒｍａＦＥＣＴ Ｄｕｏトランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｔ２０１０－０１）を用いて実施した。
【0130】
２日後、細胞を１０ｃｍディッシュに再播種し、ピューロマイシン（ＨＥＫ２９３細胞については２μｇ／ｍｌ、Ａ５４９細胞については１μｇ／ｍｌ）で処理した。生存コロニーを選択し、ウエスタン分析を行った（例えば、Ａ５４９ ＫＯ細胞株については図３Ａを参照）。
【0131】
ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ－Ｉｎ Ｔ－ＲＥｘ（ＨＥＫ２９３）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＨＥＫ２９３安定細胞株、及びＡ５４９細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１％Ｌ－グルタミン（２００ｍＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した標準ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において培養した。
【0132】
ＨＥＫ２９３ ＨＤＬＢＰノックアウト細胞は明らかな増殖欠陥を示さず、ＥＲの電子顕微鏡イメージングでは形態変化は見られなかった（データは示さず）。ＨＤＬＢＰが存在しない場合、概して、膜結合ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のタンパク質合成の減少が生じ、減少の程度は、このようなｍＲＮＡへのＨＤＬＢＰ架橋のレベルに依存していた（データは示さず）。
【0133】
したがって、ＨＤＬＢＰは、その標的ｍＲＮＡの効率的なタンパク質合成に必要であることを立証することができた。
【0134】
ＨＤＬＢＰがある一定のタンパク質の分泌に影響を与えているかどうかを理解するために、レポータータンパク質として分泌型ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）及びアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を使用し、ＷＴ（野生型）条件及びＯＥ（過剰発現）条件でＨＥＫ２９３細胞において発現させて、培地中の酵素活性を定量した。
【0135】
１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを培地に添加し、１６時間インキュベートすることによって、安定細胞株の誘導を達成した。
【0136】
予想通り、親ＷＴ細胞を比較すると、ドキシサイクリンで誘導されていても誘導されていなくても、ＳＥＡＰ及びガウシアルシフェラーゼレポータータンパク質の分泌の変化は極めて小さいことが示された（図２を参照）。
【0137】
対照的に、ｐｉｇｇｙｂａｃをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるドキシサイクリン誘導によるＨＤＬＢＰの誘導性過剰発現により、増殖培地中のＳＥＡＰ及びガウシアルシフェラーゼがそれぞれ約１．８倍及び１．４倍増加した（図２）。
【0138】
ＨＤＬＢＰノックアウト細胞株では、Ｇｌｕｃ活性及びＳＥＡＰ活性は、ＨＤＬＢＰ ＷＴと比較して２０～４０％と著しく減少したため、ＨＤＬＢＰの欠乏により２つのレポータータンパク質の分泌が低下することが示された（図３ＢにＡ５４９細胞におけるＳＥＡＰ測定について例示）。
【0139】
ＨＤＬＢＰの欠乏により分泌が低下したことから、ＨＤＬＢＰ過剰発現の影響も試験した。この目的のために、ドキシサイクリン誘導性ＨＤＬＢＰを持つｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンを用いて、Ａ５４９細胞でＨＤＬＢＰを安定的に過剰発現させた。
【0140】
このように、直接的な比較によって、Ａ５４９細胞におけるＨＤＬＢＰの過剰発現によりＳＥＡＰ分泌の約２倍の増加が得られることが実証できた一方で、Ａ５４９細胞におけるＨＤＬＢＰのノックアウトにより分泌が約３０％低下したため、ＨＤＬＢＰ発現レベルがタンパク質分泌の程度に直接影響を与えることが確認された（図３Ｂを参照）。
【0141】
これらの知見に基づき、本発明者らは、治療用タンパク質であるＥＰＯ－Ｆｃの分泌におけるＨＤＬＢＰの機能を調査した。ＣＨＯ細胞に、ｐｉｇｇｙｂａｃｋ転位により誘導性ＨＬＤＢＰコンストラクトを安定的にトランスフェクトした。これらのＨＤＬＢＰ過剰発現ＣＨＯ細胞に、誘導性ＥＰＯ－Ｆｃ発現又はコドン最適化された誘導性ＥＰＯ－Ｆｃ ｏｐｔ発現を可能にするコンストラクトをさらに安定的にトランスフェクトした。親ＣＨＯ細胞に、誘導性ＥＰＯ－Ｆｃ発現又はコドン最適化された誘導性ＥＰＯ－Ｆｃ ｏｐｔ発現を可能にするコンストラクトを安定的にトランスフェクトして、ＥＰＯ－Ｆｃ及びＥＰＯ－Ｆｃ ｏｐｔの分泌に対するＨＤＬＢＰ発現の効果を調査した（図５）。
【0142】
それぞれのＣＨＯ細胞株におけるＨＤＬＢＰ及びＥＰＯ－Ｆｃ又はＥＰＯ－Ｆｃ ｏｐｔの細胞内発現を、ドキシサイクリンによる誘導を２４時間行った後に抗ＨＤＬＢＰ抗体及び抗Ｆｃ抗体を用いてウエスタン分析により調査した。ウエスタン分析では、抗ＧＡＰＤＨ抗体及びポンソー染色を用いてタンパク質サンプルの同等のローディングを制御した（図６Ａ）。
【0143】
ＥＰＯ－Ｆｃ又はＥＰＯ－Ｆｃ ｏｐｔ遺伝子のみを発現するコントロールＣＨＯ細胞（コントロール）と比較して、細胞培地中のＥＰＯ－Ｆｃの産生／分泌に対するＨＤＬＢＰ過剰発現（ＨＤＬＢＰ ＯＥ）の効果を決定するために、細胞培地中のＥＰＯ－Ｆｃ量を、抗Ｆｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。分泌されたＥＰＯ－Ｆｃの相対量は、ＥＰＯ－Ｆｃタンパク質量をコントロール細胞に対して標準化することによって決定した（図６Ｂ）。ＨＤＬＢＰの過剰発現により、ＥＰＯ－Ｆｃ分泌は７５％増加した。興味深いことに、コドン最適化により、最適化されていないＥＰＯ－Ｆｃコンストラクトを発現する親コントロール細胞と比較して、ＨＤＬＢＰの過剰発現無しでは１１５％、ＨＤＬＢＰ過剰発現有りでは２９０％増加した。
【0144】
ＥＰＯ－Ｆｃ発現に対する天然化合物の効果を調査するために、ＥＰＯ－Ｆｃ発現コンストラクトを安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、示した各濃度のフィトヘマグルチニン、テストステロンＣ、β－エストラジオール、スペルミジン、又はコレステロールで２４時間処理した。ＥＰＯ－Ｆｃの発現は、天然化合物の添加とともにドキシサイクリンの添加によって誘導した。
【0145】
それぞれのＣＨＯ細胞株におけるＨＤＬＢＰ及びＥＰＯ－Ｆｃの細胞内発現を、化合物処理及びドキシサイクリンによる誘導を２４時間行った後に抗ＨＤＬＢＰ抗体及び抗Ｆｃ抗体を用いてウエスタン分析により調査した。ウエスタン分析では、抗ＧＡＰＤＨ抗体及びポンソー染色を用いてタンパク質サンプルの同等のローディングを制御した（図７Ａ）。
【0146】
未処理ＥＰＯ－Ｆｃ発現ＣＨＯ細胞（コントロール）と比較して、細胞培地中のＥＰＯ－Ｆｃの産生／分泌に対する天然化合物の効果を決定するために、細胞培地中のＥＰＯ－Ｆｃ量を、抗Ｆｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。処理細胞から分泌されたＥＰＯ－Ｆｃの相対量は、ＥＰＯ－Ｆｃタンパク質量を未処理コントロール細胞に対して標準化することによって決定した（図７Ｂ）。興味深いことに、フィトヘマグルチニン及びスペルミジンによる処理により、ＥＰＯ－Ｆｃ分泌がそれぞれ２５０％及び９６％増加した。
【0147】
まとめると、これらの結果は、ＨＤＬＢＰが真核生物発現系において分泌タンパク質の分泌の程度に直接影響を与えることを実証している。さらには、真核細胞におけるＨＤＬＢＰの過剰発現／強制発現により、組換え分泌タンパク質の産生の著しい増加が得られることを示すことができた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】