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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】血友病Ａの治療における使用のための修飾コロイド粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 47/24 20060101AFI20240829BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20240829BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20240829BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20240829BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20240829BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240829BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240829BHJP
A61K 38/37 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
A61K47/24
A61P7/04
A61K9/10
A61K9/127
A61K47/10
A61K47/26
A61K47/34
A61K38/37
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509467
(86)(22)【出願日】2022-08-17
(85)【翻訳文提出日】2024-04-16
(86)【国際出願番号】 EP2022073001
(87)【国際公開番号】W WO2023021109
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】2111757.7
(32)【優先日】2021-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512279958
【氏名又は名称】カンタブ バイオファーマシューティカルズ パテンツ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ウォルフ－ギャラウェイ，リチャード
(72)【発明者】
【氏名】トッデンハム，エドワード
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA16
4C076AA19
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC14
4C076DD09
4C076DD15
4C076DD63
4C076EE23
4C076EE24
4C076FF16
4C076FF31
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA44
4C084DC15
4C084MA21
4C084MA24
4C084MA66
4C084NA12
4C084NA13
4C084ZA531
4C084ZA532
(57)【要約】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を有するまたは抗体阻害剤を発生させた病歴を有する患者における血友病Ａの治療のためのコロイド粒子の使用に関する。本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を有するまたは抗体阻害剤を発生させた病歴を有する患者における血友病Ａを治療するための、コロイド粒子を含む方法、キット、および剤形にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における血友病Ａの治療における使用のための、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質を含むコロイド粒子を含む組成物であって、前記第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含み、
前記対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある、
組成物。
【請求項2】
前記生体適合性親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項3】
前記生体適合性親水性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１または請求項２に記載の使用のための組成物。
【請求項4】
前記ポリエチレングリコールは、約５００～約５０００ダルトンの分子量を有する、請求項３に記載の使用のための組成物。
【請求項5】
前記ポリエチレングリコールは、約２０００ダルトンまたは約５０００ダルトンの分子量を有する、請求項４に記載の使用のための組成物。
【請求項6】
前記リン脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項7】
前記リン脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）またはＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項8】
前記ホスファチジルコリン（ＰＣ）は、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）である、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項9】
９０～９９：１０～１のモル比で前記第１の両親媒性脂質および前記第２の両親媒性脂質を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項10】
９７：３のモル比で前記第１の両親媒性脂質および前記第２の両親媒性脂質を含む、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項11】
前記コロイド粒子は、（ｉｉｉ）ポリオキシエチレンソルビタン、ポリヒドロキシエチレンステアレート、およびポリヒドロキシエチレンラウリルエーテルからなる群から選択される非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項12】
前記非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートである、請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項13】
前記コロイド粒子は、３０：１～２：１ｗ／ｗの比で前記第１の両親媒性脂質および前記第２の両親媒性脂質対前記非イオン性界面活性剤を含む、請求項１１または請求項１２に記載の使用のための組成物。
【請求項14】
１０～４０：１：０～４ｗ／ｗの比で前記第１の両親媒性脂質対前記第２の両親媒性脂質対前記非イオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項15】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項16】
１～９０：１の化学量論比で前記コロイド粒子および前記第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子を含む、請求項１５に記載の使用のための組成物。
【請求項17】
１０～２０：１または５～１０：１の化学量論比で前記コロイド粒子および前記第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子を含む、請求項１５または請求項１６に記載の使用のための組成物。
【請求項18】
前記血友病Ａは先天性血友病Ａ（ｃＨＡ）である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項19】
前記血友病Ａは後天性血友病Ａ（ａＨＡ）である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項20】
治療活性化合物をさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項21】
賦形剤、希釈剤、またはアジュバントをさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項22】
前記対象は小児対象である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項23】
（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質を含むコロイド粒子を含む組成物を投与する工程を含む、対象における血友病Ａを治療する方法であって、前記第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含み、
前記対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある、
方法。
【請求項24】
前記生体適合性親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記生体適合性親水性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ポリエチレングリコールは、約５００～約５０００ダルトンの分子量を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記ポリエチレングリコールは、約２０００ダルトンまたは約５０００ダルトンの分子量を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記ホスファチジルコリン（ＰＣ）は、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）である、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記リン脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）である、請求項２３～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記リン脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）またはＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００）である、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項２３～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記組成物は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子をさらに含む、請求項２３～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子を含む組成物を別個にまたは後続して投与するさらなる工程を含む、請求項２３～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記血友病Ａは先天性血友病Ａ（ｃＨＡ）である、請求項２３～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記血友病Ａは後天性血友病Ａ（ａＨＡ）である、請求項２３～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記対象は小児対象である、請求項２３～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
対象における血友病Ａの治療における使用のための、（ｉ）コロイド粒子を含む組成物、および（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子を含む組成物を含むキットであって、前記対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがあり、
前記コロイド粒子は、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質を含み、
前記第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む、
キット。
【請求項38】
前記コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項39】
対象における血友病Ａの治療における別個の、同時の、または後続の使用のための、（ｉ）コロイド粒子を含む組成物、および（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子を含む組成物を含むキットであって、前記対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがあり、前記コロイド粒子は、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質を含み、
前記第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む、
キット。
【請求項40】
前記コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項41】
対象における血友病Ａの治療における使用のための、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質を含むコロイド粒子を含む医薬組成物の剤形であって、前記第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含み、
前記対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある、
剤形。
【請求項42】
前記コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項４１に記載の剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を有するまたは抗体阻害剤を発生させた病歴を有する患者における血友病Ａの治療のためのコロイド粒子の使用に関する。コロイド粒子は、第１および第２の両親媒性脂質を含み、第２の両親媒性脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分であり得る。本発明は、コロイド粒子を含む方法、キット、および剤形にも関する。
【背景技術】
【0002】
血液凝固につながる凝固カスケードは、損傷の場合に凝血の安全な形成を可能にする調節性フィードバックメカニズムと連動して、多くの異なるタンパク質および因子を伴う多工程の過程である。血友病等の血液の障害において、これらの因子の１種または複数は、欠陥があり得または不在であり得、欠陥のあるまたは低品質の凝血につながる。
【0003】
凝血第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）は、凝固カスケードの二次止血過程における増幅相に関わる血中タンパク質である。カスケードの究極の目標は、フィブリンを生成して凝血を形成して出血を止めることである。損傷時、血小板は裏返しになり、「活性化され」、他の因子が結合する反応面を曝露し、そこでそれらはそれらの特異的作用に着手する。ＦＸからＦＸａ因子への活性化につながる「開始」または「外因性」相は、組織因子（ＴＦ）によるＦＶＩＩの変換後に、ＴＦ－ＦＶＩＩａによってこの反応面で全面的に媒介され得、プロトロンビンからのトロンビンの産生およびフィブリノーゲンからフィブリンへの変換につながり、それはＦＸＩＩＩの作用により架橋されて凝血を形成する。この開始後、良質な凝血は、通常、他の因子の中でもＦＶＩＩＩを含むさらなる「増幅」または「内因性」相に起因して急速に形成され：この相の間にＦＶＩＩＩは活性型（ＦＶＩＩＩａ）になり、血小板の反応面に結合され、ＦＩＸａに結合して内因性「テナーゼ」複合体を形成し、それは次いでＦＸをＦＸａに変換する。ＦＩＸからのＦＩＸａの形成も、ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体によって触媒される（ＦＩＸが失われている血友病Ｂの場合を除いて）。開始相の間に産生されたトロンビンは、増幅相を触媒するのを助け、最適な凝血形成にはＴＦ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、およびＦＶＩＩＩの存在が要されることを意味する。
【0004】
先天性血友病Ａにおいて等、ＦＶＩＩＩの不在下で、反応は、ＦＸからＦＸａのへ変換を触媒するのに開始相のみに依存しなければならないことから、はるかによりゆっくりと進む。この経路（「外因性テナーゼ」経路）は、十分なＦＶＩＩＩを欠如し、特に、外部ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩで治療されたことがある先天性血友病患者の場合）または彼ら自身のＦＶＩＩＩ（後天性血友病ａＨＡの場合）のいずれかに対して抗体（「阻害剤」）を発生させたことがある血友病Ａ患者において、ＦＶＩＩａの外部投与により強化される。
【0005】
先天性血友病Ａ（ｃＨＡ）または後天性血友病Ａ（ａＨＡ）のいずれかを治療するための、供与された血漿由来または組み換え供給源由来の補充ＦＶＩＩＩの使用は、臨床実践において非常によく確立されている。しかしながら、そのような産物の効力は、一部の患者に存在している阻害性抗体（「阻害剤」）の出現に起因して限定され、それは、外在的に送達された第ＶＩＩＩ因子の有効性を低下させる。阻害剤は、彼らが受ける外在性ＦＶＩＩＩに対する応答として、ｃＨＡ罹患者（「阻害剤患者」）の２５～３５％において生じ；ａＨＡでは、患者は自己免疫に起因して彼ら自身のＦＶＩＩＩに対する阻害剤を発生させることから、疾患が生じる。
【0006】
該タンパク質は、阻害剤抗体によって結合され、中和され、循環から迅速に取り除かれることから、阻害剤の存在は、外在性ＦＶＩＩＩで阻害剤患者を治療する有効性を低下させ、補充ヒトＦＶＩＩＩを用いた予防的治療を非常に困難にするまたは通常不可能にする。ＦＶＩＩＩの準最適な分量とは、たとえ凝血が仮に形成され得るとしても、それはゆっくりと形成される、または形成され次第迅速に壊れる低品質のものであることを意味する。
【0007】
野生型ＦＶＩＩＩ分子は、６個のドメイン：Ａ１－Ａ２－Ｂ－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２に編成された２３３２個のアミノ酸を含む。Ａ１－Ａ２－Ｂドメインは、一緒になって、「重鎖」（ＨＣ）を含み、Ａ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインは「軽鎖」（ＬＣ）を含み、これらの鎖は非共有結合的に連結される。生命体において、ＦＶＩＩＩは、通常、循環中でフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）と結び付くであろう。ＶＷＦはＦＶＩＩＩの輸送を促し、ＦＶＩＩＩを時期尚早な不活性化およびクリアランスから保護する（Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｐ．Ｍ．ら（２０１４）Ｎｏｖｅｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．２０（補足６）、２～１６．）。ＶＷＦとの結び付きは、免疫原性の低下、阻害剤の存在下での効力、および免疫寛容治療における実用性とも関連する。ＶＷＦを含有する血漿由来ＦＶＩＩＩ（ｐｄＦＶＩＩＩ）の商業的濃縮物の使用は、ＳＩＰＰＥＴ治験において、ＦＶＩＩＩの組み換え濃縮物（ｒＦＶＩＩＩ）よりも免疫原性が低いことが示された（Ｐｅｙｖａｎｄｉ，Ｆ．ら（２０１６）Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７４、２０５４～６４）。ｐｄＦＶＩＩＩ濃縮物の免疫原性の低下はＶＷＦシャペロンと関連し、それは、ＦＶＩＩＩ分子上の重大なエピトープを覆い、かつ／または樹状細胞によるそのエンドサイトーシスを阻止すると考えられる（Ａｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｊ．（２０１５）ＦＶＩＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ａｖｏｉｄａｎｃｅ．Ｂｌｏｏｄ．１２５（１３）、２０４５～５１）。また、組み換えＦＶＩＩＩ分子は、これらの分子の大部分はヒト化されず、非ヒト細胞株において産生され、それらの免疫原性を潜在的に増強する非ヒトグリカンエピトープの存在をもたらすという付加的な複雑性を有する。
【0008】
ＦＶＩＩＩにおけるこれらのエピトープに対する阻害剤の発生は、依然として血友病治療の最も頻度の高い副作用である（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（２０２０）．ＩＴＩ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｓ ｎｏｔ ａ ｆｉｒｓｔ－ｃｈｏｉｃｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ ａｎｄ ｌｏｗ－ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ａ ＰｅｄＮｅｔ ｓｔｕｄｙ．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．１２０、１１６６～１１７２）。リスクは、最高４０％の全発生率を有して、以前に治療されていない患者（ＰＵＰ）において高く（同書）、ＦＶＩＩＩ活性を不活性化し、これらの患者を保護するのに代替的でかつ費用のかかる方策を要する。一部の患者において、長くかつ費用のかかる技法である免疫寛容誘導療法の使用は、阻害剤を根絶し得るが、該技法はすべての患者に対して働くわけではなく、彼らが補充ＦＶＩＩＩ療法を使用するのを妨げる。阻害剤発生のリスクは、補充ＦＶＩＩＩへの最初の２０日間の曝露日（ＥＤ）の間に最も高く、最高７５ＥＤ持続する（Ｌｉｅｓｎｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら（２０２１）Ｓｉｍｏｃｔｏｃｏｇ ａｌｆａ（Ｎｕｗｉｑ（商標））ｉｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ：ｆｉｎａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮｕＰｒｏｔｅｃｔ ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．オンライン）。患者は、この期間にわたって阻害剤の発生に関してモニターされなければならない。
【0009】
現在、阻害剤の発生に対処する２つの主な方法：阻害剤寛容誘導（ＩＴＩ）の使用、または迂回療法の使用が存在する。ＩＴＩは、患者が通常の投薬レジメンに戻ることを可能にするという目標を有して、数カ月にわたるＦＶＩＩＩの大量の反復投薬を利用して、ＦＶＩＩＩに対して免疫系において寛容を誘導する。療法は必ずしも有効ではなく、数カ月にわたるＦＶＩＩＩの反復の高用量注射は、患者にとって不快でもあり、極めて費用もかかり、相当な医療制度費用になる。したがって、「阻害剤患者」とは、彼らの医療歴において、治療用血液因子の適用に応答して阻害性抗体（「阻害剤」）を発生させたことがある個体（先天性血友病の場合）、または彼ら自身のＦＶＩＩＩに対して阻害剤を発生させたことがある（後天性血友病の場合）個体である。彼らは、現在、阻害剤を有してまたは有しないで存在し得るが、後者の場合には、ＩＴＩによりおそらく寛容化されておらず、ＦＶＩＩＩを再提示された場合に依然として阻害剤を生成し得るであろう。
【0010】
迂回療法は、増幅相を完全に「迂回する」ことによって、阻害剤の問題を回避する。最も一般的な治療は、単独での（例えば、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）、またはプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）（例えば、活性化ＰＣＣであるＦＥＩＢＡ）としての組合せでのＦＶＩＩａであり、それは、上で記載されるように、凝血カスケードの開始相を支援するのを助ける。これらの特殊な治療も高価であり、必要に応じた使用はＩＴＩ療法と大体等価である。予防的使用は極めて高価であり、これらの患者は、予防的治療が約束する心の平安を受ける可能性が低いことを意味する。より最近の開発は、二重特異性抗体の使用によりＦＩＸａとＦＸとを一つにまとめることにおいて、ＦＶＩＩＩａの役割を置き換えようと試みている。
【0011】
ＦＶＩＩＩの連続的な不在下における単独での迂回法は、増幅相を可能にしないことから、それは準最適な解決策であり、他の治療は、ブタＦＶＩＩＩ等のヒトＦＶＩＩＩの偽物および模倣体、または活性型ヒトＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）と同様の結合機能を果たし得る、抗体等の他の分子の使用により、内因性テナーゼ複合体を引き付けようと試みている。これらは通常のＦＶＩＩＩ阻害剤抗体によって認識され得ないものの、それらは、身体にとって異物であるタンパク質産物であることから、これらは引き続いては、それら自身に対する抗体の生成を引き起こすであろうという懸念が依然として残る。また、それらの作用の様態は、全身循環におけるトロンビンの過度の産生を阻止するように高度に適応される天然の第ＶＩＩＩ因子の調節機能を完全には再現しない。破綻出血が生じた場合、模倣体の貯蔵との組合せでの救援療法（通常、阻害剤患者においてＦＶＩＩａまたはａＰＣＣ複合体）の投与は、患者を血栓性事象の危険に置き得ることから、抗体ベースの産物の一部についての長い半減期も懸念であり得る。
【0012】
「リバランス剤」という別のクラスの新規の作用物質は、凝固が達成され次第、凝固カスケードを減速させることによって、不要な血栓性事象を通常では阻止するであろうフィードバックループを下方調節することに焦点を当てている。現在の３つの手法は、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、抗トロンビン、または活性化プロテインＣを攻撃することを伴う。書かれた時点で、市場に到達していない、より進歩したプログラムが、治験の間に血栓性事象の困難に直面している。
【0013】
ｃＨＡ患者に関しては、これらの患者が、彼らの人生において初めて十分な量の彼ら自身のＦＶＩＩＩを生成することを可能にする遺伝子療法の長期にわたる希望が依然としてあり：これは、十分なＦＶＩＩＩを生成するが、彼ら自身のＦＶＩＩＩに対する阻害剤を発生させたことがあるａＨＡ患者にとっては選択肢ではない。この療法は、肝臓細胞に遺伝子コードを送達するウイルスベクターを通常使用して、肝臓からのＦＶＩＩＩ発現を刺激する。送達ベクターに対して抗体が発生するであろうかどうかは依然として不明であり、いまだ懸念されている。
【0014】
いくつかのグループによって取られた代替的手法は、巨核球（骨髄）における発現を標的にすることであり、それにより、結果として生じた血小板細胞は、それらのα－顆粒内に保管されたＦＶＩＩＩを有する。Ｓｈｉら（２００６）（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６、１９７４～１９８２）によって最初に提唱されたこの手法は、任意の阻害剤および他のクリアランスメカニズムからＦＶＩＩＩを隠すという、ならびに凝固カスケードに対する正しい位置に分子を置くという二重の利点を有する。同じグループによるより最近の仕事（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら（２０１５）（Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１３、２２１０～２２１９）は、血小板由来ＦＶＩＩＩ（「２ｂＦ８」）および血漿ＦＶＩＩＩ（ｒｈＦＶＩＩＩ－Ｘｙｎｔｈａ、Ｐｆｉｚｅｒ）の相対的効力を比較した。この仕事は、広範な用量にわたるトロンビン生成に目を向け、両方とも同様のレベルのトロンビンを生成するものの、血小板関連ＦＶＩＩＩは、トロンビン生成を有意に加速させるだけでなく、トロンビン生成の始まりおよびピークを刺激するのに、用量の１０分の１を要することを見出した。グループは、因子補充療法と比較した２ｂＦ８のより高い治療効力は、トロンビン生成の加速に起因するように思われると結論付けた。
【0015】
ＷＯ２００９／１４０５９８は、ＦＶＩＩＩと血小板とを結び付ける手法の例示として、Ｓｈｉグループの遺伝子療法血小板由来の仕事を記載する。その出願の明記される目的は、免疫原性を低下させること、副作用を低下させること、およびインビボにおけるその作用の部位のすぐ近くに治療用タンパク質を放出することによって、さらなる利点を獲得することである。主張される因子は、２種の中核となる市販の外在的に投与される因子としてのＦＶＩＩＩおよびＦＩＸである。標的化の方法は、比較的特異的であり、血液細胞上の膜タンパク質に特異的に結合する因子の構造内にドメインを操作する工程を伴う。この手法は、該タンパク質の正常な構造を変更する工程を伴い、それは、それが異物として認識されるという、および抗体の生成を刺激するという危険性を持つ。
【0016】
本発明は、血小板と他の細胞体とを融合しかつまたは別様に結び付けることによって増幅相を再び可能にすることを追求し、それによって、外在的に適用されたＦＶＩＩＩ（血友病Ａの場合）を血小板に結び付けかつ／またはそれが血小板内に貪食されることを可能にし、ゆえに、それが必要とされるであろう部位にそれを置きもし、阻害性抗体またはメモリーＢもしくはＴ細胞による認識およびダメージからそれを保護もする。それゆえ、本明細書に記載される本発明との関連を可能にするために、ＦＶＩＩＩのさらなる修飾は必要でないはずである。
【0017】
本発明は、血小板への患者自身のＦＶＩＩ（およびＦＶＩＩａ）の付加的な結び付きを可能にし、かつ／またはそれが血小板内に貪食されることを可能にし、ゆえにまた、それが最も必要とされる部位にそれを置いて、トロンビンバーストを提供して、増幅相を刺激する。ＦＶＩＩａが迂回剤として外在的に投与される対象となった場合、本発明の使用を使用して、ＦＶＩＩａを標的にして、血小板、および血小板活性化の後に生じるＴＦ担持凝固促進性微粒子と結び付くようにもなり得る。
【0018】
本発明は、血小板への患者自身のＦＶＩＩＩの付加的な結び付きを可能にし（これは、不在までは欠損していない場合）、かつ／またはそれが血小板内に貪食されることを可能にし、ゆえにまた、それが最も必要とされる部位にそれを置いて、トロンビンバーストを提供して、増幅相を刺激する。
【0019】
本発明は、血小板およびそれが融合する他の細胞体の断絶（disruption）を可能にし、ＦＶＩＩからＴＦ－ＦＶＩＩａへの変換を触媒する長寿命のＴＦ担持凝固促進性微粒子（ＴＦＢＰＭ）を作り出し、それはまた、ＦＩＸからＦＩＸａへのおよびＦＸからＦＸａへの変換を触媒し、それによって、外因性経路の効能を長期間増強し、より大きなトロンビンバーストおよびより継続したＦＶＩＩＩ非依存的トロンビン産生をもたらす。
【0020】
血小板上および／または中のＦＶＩＩＩの両方（およびその後、活性化後のそれらの活性化形態）を濃縮しかつ固定することによって、ならびにＴＦ担持凝固促進性微粒子（ＴＦＢＰＭ）の迂回する作用産生により、本発明の究極の目的は、損傷の始まりにトロンビン生成の異常に迅速なバーストを可能にしかつ維持して、分解に抵抗性である頑丈で良質な凝血に急速に安定化され得る凝血の形成を加速させることである。
【0021】
治療される対象となる疾患において、正常なレベルよりも低くある限定された量のＦＶＩＩＩの効果を濃縮しかつ増幅することによって、本発明は、ＦＶＩＩＩ倹約的であると考えられ、血友病患者において、および特に、ＦＶＩＩＩを、それらの阻害性抗体が該タンパク質を破壊し、それらを非保護の状態にするであろうことから、通常では投与され得ない阻害剤患者において、より低い用量が投与されることを可能にし、かつ／または止血を達成するために通常要される注射の回数を低下させると予測される。
【0022】
本発明は、限定された量のＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩに対する阻害剤の両方の存在下で、ＦＸからＦＸａへの変換を向上させる複数のやり方で作用し得る。第１に、ＦＩＸａとのテナーゼ複合体を形成し得る限定された量のＦＶＩＩＩの潜在性を保護し、増強し、かつ最大限に高めて、ＦＸからＦＸａへの変換を触媒することによって；第２に、ＦＶＩＩＩを模倣しかつＦＩＸａに結合して、代用テナーゼ複合体を提供して、ＦＸおよびＦＸａの変換を触媒することによって；第３に、ＴＦＢＰＭの産生により、およびＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを濃縮して、外因性テナーゼ複合体によるＦＸからＦＸａへの変換を刺激することの両方により、外因性経路を上方調節することによって；ならびに最後に、上方調節された外因性経路を介して、ＦＩＸからＦＩＸａへの変換を増強して、内因性テナーゼ複合体の形成を増大させることによって。これらの作用を通じて、本発明は、内因性経路のテナーゼ複合体におけるＦＶＩＩＩの活性を保護し、保存し、かつ最大限に高め、一方で、テナーゼ複合体におけるＦＶＩＩＩａの機能性を模倣し、また外因性経路の上方調節を通じてその経路を同時に迂回することによる、複数の作用の様態を有する。
【0023】
標的血液因子（例えば、血友病Ａの場合にはＦＶＩＩＩ）の標準的な血漿由来の形態または組み換えで産生された形態の使用を可能にすることによって、本発明が、阻害剤を有する血友病Ａ患者においてＦＶＩＩＩを用いた予防的治療を可能にすることに対する費用効果の高い解決策を可能にすることは究極の目的である。
【0024】
本発明は、本発明（多特異性脂質小胞）と標的血液因子との共投与または別個の投与を可能にし、標準ケアの外在的に適用される因子（血友病Ａの場合にはＦＶＩＩＩである）と並行してそれが使用されるのを可能にする。本発明の別個の投与は、少量であるが準最適な量の標的血液因子が内在的に存在する患者において、例えば、中等度の血友病患者、または遺伝子療法後に彼ら自身の標的血液因子を生成する限定された能力を回復している患者においても有用であり得る。
【発明の概要】
【0025】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を有するまたは抗体阻害剤を発生させた病歴を有する血友病患者、例えばＦＶＩＩＩに対する阻害剤を有する後天性血友病（ａＨＡ）または先天性血友病（ｃＨＡ）を有する者を治療するための、コロイド粒子を含む組成物、方法、キット、および剤形を提供する。
【0026】
本発明の第１の態様において、対象における血友病Ａの治療における使用のための、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質を含むコロイド粒子を含む組成物であって、前記第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む、組成物が提供される。対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある。
【0027】
生体適合性親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸からなる群から選択され得、好ましくは、生体適合性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは、約５００～約５０００ダルトン、好ましくは約２０００ダルトンまたは約５０００ダルトンの分子量を有し得る。
【0028】
第２の両親媒性脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）またはＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００）等のＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）であり得る。
【0029】
ホスファチジルコリン（ＰＣ）は、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）であり得る。
【0030】
第１の両親媒性脂質および第２の両親媒性脂質は、１００：３または９７：３等、９０～１１０：１０～１、または９０～９９：１０～１のモル比にあり得る。
【0031】
コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン、ポリヒドロキシエチレンステアレート、およびポリヒドロキシエチレンラウリルエーテルからなる群から選択され得る。非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートであり得る。コロイド粒子は、３０：１～２：１ｗ／ｗの比で第１の両親媒性脂質および第２の両親媒性脂質対非イオン性界面活性剤を含み得る（｛第１の両親媒性脂質＋第２の両親媒性脂質｝：｛非イオン性界面活性剤｝）。
【0032】
第１の両親媒性脂質対第２の両親媒性脂質対非イオン性界面活性剤は、１０～４０：１：０～４ｗ／ｗの比にあり得る（｛第１の両親媒性脂質｝：｛第２の両親媒性脂質｝：｛非イオン性界面活性剤｝）。
【0033】
組成物は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子をさらに含み得る。コロイド粒子および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子は、１０～２０：１または５～１０：１等、１～９０：１の化学量論比にあり得る。
【0034】
血友病Ａは、先天性血友病Ａ（ｃＨＡ）または後天性血友病Ａ（ａＨＡ）であり得る。
【0035】
組成物は、治療活性化合物をさらに含み得る。組成物は、賦形剤、希釈剤、および／またはアジュバントもさらに含み得る。
【0036】
対象は小児患者であり得る。
【0037】
本発明の組成物は、すぐに使用できる水性懸濁液に製剤化され得る、または組成物は、凍結乾燥製剤として調製され得る。本発明の凍結乾燥製剤は、同様に提供される適切な希釈剤、アジュバント、または賦形剤、例えば生理学的に許容される緩衝剤と併せて、別個の剤形として供給され得る。本明細書に記載されるように、そのような組成物は、別個の剤形として第ＶＩＩＩ因子を付加的に含み得る、または本明細書に記載されるコロイド粒子とともに製剤化され得る。
【0038】
本発明の第２の態様において、コロイド粒子を含む組成物を投与する工程を含む、対象における血友病Ａを治療する方法が提供される。コロイド粒子は、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質を含む。第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む。対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある。
【0039】
生体適合性親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸からなる群から選択され得、好ましくは、生体適合性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは、約５００～約５０００ダルトン、好ましくは約２０００ダルトンまたは約５０００ダルトンの分子量を有し得る。
【0040】
ホスファチジルコリン（ＰＣ）は、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）であり得る。
【0041】
第２の両親媒性脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）またはＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００）等のＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）であり得る。
【0042】
コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。
【0043】
組成物は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をさらに含み得る。代替的に、方法は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を含む組成物を別個にまたは後続して投与するさらなる工程を含み得る。
【0044】
血友病は、先天性血友病Ａ（ｃＨＡ）；または後天性血友病Ａ（ａＨＡ）であり得る。
【0045】
対象は小児患者であり得る。
【0046】
本発明の第３の態様において、対象における血友病Ａの治療における使用のための、（ｉ）コロイド粒子を含む組成物、および（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子を含む組成物を含むキットが提供される。対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある。コロイド粒子は、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質から構成される。第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む。
【0047】
コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。
【0048】
本発明の第４の態様において、対象における血友病Ａの治療における別個の、同時の、または後続の使用のための、（ｉ）コロイド粒子を含む組成物、および（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子を含む組成物を含むキットが提供される。対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある。コロイド粒子は、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質から構成される。第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む。
【0049】
コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。
【0050】
本発明の第５の態様において、対象における血友病Ａの治療における使用のための、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質を含むコロイド粒子を含む医薬組成物の剤形であって、前記第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む、剤形が提供される。対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある。
【0051】
コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。
【0052】
一実施形態において、コロイド粒子は、非共有結合的に、可逆的にＦＶＩＩＩの能力があり、ならびに血小板および血液の他の細胞要素と結合しかつ融合し得、それにより、限定された量の外在的に適用された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、血小板の表面でおよび／またはその中で、他の内在性血液因子（例えば、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ）とともに濃縮されるであろう、ならびにこの結び付きは、阻害剤による分解および通常のクリアランスメカニズムから第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（通常の濃度よりも低く存在する）を保護もし、組織因子（ＴＦ）担持凝固促進性微粒子（ＴＦＢＰＭ）の並行した産生に起因して、損傷時の凝血カスケードの迅速な始まりおよび加速を可能にもするであろう。これは、血友病患者において、およびとりわけ、保護されていない標的血液因子（すなわち、ＰＥＧＬｉＰなしの、例えば血友病Ａの場合にはＦＶＩＩＩ）が迅速に取り除かれるであろう阻害剤を有する者において、より良質な凝血のより速い形成をもたらし、これらの患者に対してはるかにより安全な治療選択肢を提供する。
【0053】
本発明は、補充因子の使用が通常では無効であろうような、凝血因子を欠損もしておりかつ阻害剤患者でもある患者において、生体適合性ポリマーで誘導体化されたリン脂質が、血液因子を欠損しておりかつその血液因子に対する抗体を産生した病歴を有する患者において、それらが、失われた因子の投与とともに共製剤化されてまたはそれに対して別個の注射として投与される場合、凝固カスケードに対する２つの有益な効果を有するという驚くべきかつ予想外の発見に基づく。第１に、それらは、その標的血液因子（例えば、血友病Ａの場合にはＦＶＩＩＩ）に対する阻害剤の存在下で、外在的に適用された標的血液因子の見かけの半減期を延長し得、長期の止血被覆を提供する。第２に、それらは、ＦＶＩＩＩ非依存的様式で凝固カスケードを増強し、例えば凝固の始まり（「凝血時間」）および凝血品質（「最大凝血硬度」）を低下させる。理論によって拘束されることを望むことなく、後者の効果は、多様な原因、例えば、凝固カスケード内の複数の実体との可逆的非共有結合性アフィニティーを有することによる、血小板でのおよびその中での、既存の内在性血液因子、例えばＦＶＩＩ、およびＦＩＸ（血友病Ａの場合）の結合およびゆえに濃縮；本発明と血液の細胞構成要素との融合によって刺激された、組織因子を担持する凝固促進性微粒子の産生による、外因性凝固経路の上方調節であって、微粒子は、凝血カスケードの構成要素に対する拡大した反応面としての役割も果たし、ならびにＴＦを提供もして、他の迂回剤と同様の形式で外因性経路をブーストする、上方調節；ＦＩＸａとともに働いて、ＦＸからＦＸａへの触媒のための代用テナーゼ複合体を形成すること；外因性経路の上方調節を通じて、ＦＩＸａの産生を増強して、テナーゼ複合体を増大させること、に起因し得る。
【0054】
一実施形態において、患者の血友病の重症度に適当な量であるべきである、注射されるＰＥＧＬｉｐの量、ならびに特定の標的血液因子（例えば、血友病Ａの場合にはＦＶＩＩＩ）の特徴、とりわけその特異的活性（ＩＵ／ｍｇ）および分子質量（ｇ／ｍｏｌまたはｋＤａ）に関して、ＰＥＧＬｉＰ粒子の理想化された製剤が提供される。注射の前に共製剤化する場合、いくつかのＰＥＧＬｉＰ粒子は、これらの標的血液因子分子に可逆的に結合するであろう。標的血液因子非依存的作用、例えば血友病Ａの場合には、血流からの充分な患者のＦＶＩＩおよびＦＩＸの可逆的捕捉を可能にして、外因性経路を増強して、または代用テナーゼ複合体；もしくは外因性経路を増強するのに十分なＴＦＢＰＭを産生するための、血小板および他の細胞構成要素との適度な相互作用を形成して、本発明の利益を最大限に高めるために、注射の時点で十分なＰＥＧＬｉＰが遊離のままの状態であり、標的血液因子に結合していないことは、本発明の重大な態様である。
【0055】
一実施形態において、それゆえ、標的血液因子単独について予想されるものを超えて、止血被覆を増強しかつ延長するそのＦＶＩＩＩ非依存的作用を効果的に可能にするのに十分な結び付いていないＰＥＧＬｉＰを残す、投与前のＰＥＧＬｉＰ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比での、標的血液因子、例えば血友病Ａの場合にはＦＶＩＩＩに対する阻害剤を有する患者に投与される対象となる、第ＶＩＩＩ因子と混ぜられた懸濁液ＰＥＧＬｉｐ（コロイド粒子）を含む組成物が提供される。
【0056】
準最適な内在的濃度の標的血液因子を有する患者に、標的血液因子（例えば、血友病Ａの場合にはＦＶＩＩＩ）が別個に投与される予定である場合、または本発明を単独で投与することが意図される場合、血中におけるＰＥＧＬｉｐ対標的血液因子の最適な比は、ａ）投与される対象となる標的血液因子の量、または準最適な濃度の標的血液因子による患者の現在についての査定；ｂ）使用される特定のタンパク質の特異的活性；およびｃ）使用される特定のタンパク質の分子質量に基づいて、注射の前に計算され得る。
【発明を実施するための形態】
【0057】
本発明は、対象における血友病Ａの治療における使用のための、コロイド粒子を含む組成物、方法、キット、および剤形であって、対象は、重大な内因性血液因子に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある、組成物、方法、キット、および剤形を提供する。コロイド粒子は、凝血因子にも結合し、血小板とも結合しかつ融合して、血友病Ａの治療において凝血の形成を加速させ得かつ向上させ得る。
【0058】
ＦＶＩＩＩに対する阻害剤または抗体阻害剤とは、ＦＶＩＩＩに対する、抗体阻害剤または中和抗体としても互換可能に知られる、抗体を指す。抗体は、内在性ＦＶＩＩＩに対する自己抗体、または外在性ＦＶＩＩＩに対する抗体であり得る。
【0059】
上で記載される第１の態様によれば、コロイド粒子は、（ｉ）第１の両親媒性脂質、および（ｉｉ）第２の両親媒性脂質を含む。第１の両親媒性脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分であり得る。ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分の適切な例は、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）であり得る。第２の両親媒性脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分である。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の適切な例は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノール－３５アミン（ＤＳＰＥ）であり得る。アミノプロパンジオールジステアロイル（ＤＳ）脂質は、両親媒性脂質でもあるカルバメート連結非荷電リポポリマーである。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の他の例は、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、およびＤＯＰＥを含む。
【0060】
本発明のコロイド粒子は、典型的に、脂質小胞またはリポソームの形態にあり、当技術分野において周知である。本明細書におけるコロイド粒子への言及は、文脈が別様に指定しない限り、リポソームおよび脂質小胞を含む。
【0061】
第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分である。
【0062】
生体適合性親水性ポリマーの目的は、コロイド粒子を立体的に安定化し、ゆえにインビトロにおいてコロイド粒子の融合を阻止し、コロイド粒子がインビボにおいて細網内皮系による吸着を逃れるのを可能にすることである。生体適合性親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸からなる群から選択され得る。生体適合性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。ポリエチレングリコールは、分岐状または非分岐状であり得る。生体適合性ポリマーは、約１００Ｄａ、２５０Ｄａ、３５０Ｄａ、５５０Ｄａ、７５０Ｄａ、１０００Ｄａ、１５００Ｄａ、２０００Ｄａ、２５００Ｄａ、３０００Ｄａ、３５００Ｄａ、４０００Ｄａ、４５００Ｄａ、５０００Ｄａ、５５００Ｄａ、６０００Ｄａ、６５００Ｄａ、７０００Ｄａ、７５００Ｄａ、８０００Ｄａ、８５００Ｄａ、９５００Ｄａ、および１０，０００Ｄａの好ましい値を有して、約１００～約１０，０００Ｄａ、適切には約２０００～約５０００Ｄａの分子量を有し得る。生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質の適切な例は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００）等のＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）であり得る。
【0063】
第１の両親媒性脂質および第２の両親媒性脂質は、９０～１１０：１０～１、９０～１００：１０～１、９０～９９：１０～１、９３～９９：７～１、９５～９９：５～１、適切には１００：３、１００：３、９９：３、９８：３、９７：３、９６：３、または９５：３のモル比で提供され得る。９７．３というモル比は、３２．４：１というモル比としても表現され得、同じように１００：３というモル比は、３３．２：１というモル比として表現され得る。第１の両親媒性脂質および第２の両親媒性脂質の比は、重量／重量比、例えば１：１～２０：１ｗ／ｗ、適切には２：１～１２：１ｗ／ｗまたは４：１～９：１ｗ／ｗ、例えば４：１、５：１、６：１、９：１、または１２：１ｗ／ｗとしても表現され得る。適切には、組成物は、９０～９９：１０～１、９３～９９：７～１、９５～９９：５～１、適切には９７：３のモル比（ＰＯＰＣ：ＤＳＰＥ）の、パルミトイル－オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）と１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノール－アミン（ＤＳＰＥ）との混合物から構成されるコロイド粒子を含み得る。重量／重量比として表現すると、これは、例えば１：１～２０：１ｗ／ｗ、適切には２：１～１２：１ｗ／ｗ、例えば４：１、５：１、６：１、９：１、または２：１ｗ／ｗであり得る。
【0064】
１つの例では、コロイド粒子は、９７：３モル比または９：１ｗ／ｗ比の、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００））から構成され得る。
【0065】
コロイド粒子は、０．０５～０．０．３μｍ径、適切には０．１、０．１５、０．２、または０．２５ミクロン（μｍ）前後に及ぶ平均粒子サイズ（平均的粒子サイズ）を有し得る。平均的粒子サイズ（平均粒子サイズ）は、１００～１３０ナノメートル（ｎｍ）、適切には１１０～１２０ｎｍ、１１２～１１８ｎｍ、１５０～１７０ｎｍ、１５５～１６５ｎｍ、より適切には１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、または１７０ｎｍであり得る。
【0066】
平均粒子サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ ＺＳＵ ５７００を使用して測定され得る。この機器は光散乱によって粒子サイズを判定し、レーザー光からの後方散乱がサンプルに差し込み、衝突粒子が１７３°の角度で検出される（１７３°は、それ自身のほぼ後部であり、それゆえ後方散乱という用語）。粒子のブラウン運動は、光を種々の強度で散乱させる。ブラウン運動の速さは粒子サイズに関係するため、粒子サイズは、ストークス・アインシュタインの関係性により推測され得る。
【0067】
平均粒子サイズは、コロイド粒子の平均径に対応する。粒子サイズ測定との関連で引き合いに出される多分散性指数（ＰＤＩ）は、コロイド粒子の平均径周辺の分布の大きさに対応する。例えば、本発明において、多分散性指数は、最大０．２、適切には０．１５、０．１２、０．１、または０．５であり得る。
【0068】
ＰＤＩは、標準偏差／平均の平方、すなわちＰＤＩ＝（ｓ／ｍ）２として計算される。
【0069】
平均粒子サイズおよび多分散性指数から、標準偏差が計算され得る。標準偏差の２倍は、粒子サイズ周辺の９５％信頼区間、すなわちサンプルにおけるコロイド粒子の９５％が存在する域の計算を容易にする。
【0070】
適切には、９５％平均粒子サイズは、５０～５００ｎｍ、適切には５０～２９０ｎｍ、５０～２８５ｎｍ、６５～２６５ｎｍ、６５～２６０ｎｍ、６５～１８０ｎｍ、６５～１７５ｎｍ、６５～１７０ｎｍ、６５～１６５ｎｍ、６５～１６０ｎｍ、より適切には６５～１７３ｎｍ、６４～１６１ｎｍ、６５～２６３ｎｍ、または５４～２８２ｎｍであり得る。
【0071】
コロイド粒子は、水性クエン酸塩緩衝液中９％（ｗ／ｖ）総脂質の懸濁液として保管され得、適切には、粒子は、７％、６％、５％、４％（ｗ／ｖ）総脂質の懸濁液として保管され得る。
【0072】
コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤等の界面活性剤をさらに含み得る。非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン、ポリヒドロキシエチレンステアレート、およびポリヒドロキシエチレンラウリルエーテルからなる群から選択され得る。非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０としても公知）であり得る。第１の両親媒性脂質および第２の両親媒性脂質対非イオン性界面活性剤は、３０：１～２：１ｗ／ｗ、適切には２５：１、２０：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、または５：１ｗ／ｗ（｛第１の両親媒性脂質＋第２の両親媒性脂質｝：｛非イオン性界面活性剤｝）の比で提供され得る。モル比として表現すると、これは、例えば１０～２０：１、１２～１８：１、１４～１６：１、適切には１４：１、１５：１、または１６：１であり得る。界面活性剤濃度は、０．２５重量％～５重量％、例えば１％～３％、１～２％であり得、一部の例示的な値は、０．４７％、０．８５％、または３．５％であり得る。
【0073】
非イオン性界面活性剤はＰＥＧ化もされ得る。ＰＥＧ化非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０としても公知）であり得る。ポリエチレングリコールは、分岐状または非分岐状であり得る。生体適合性ポリマーは、約１００Ｄａ、２５０Ｄａ、３５０Ｄａ、５５０Ｄａ、７５０Ｄａ、１０００Ｄａ、１５００Ｄａ、２０００Ｄａ、２５００Ｄａ、３０００Ｄａ、３５００Ｄａ、４０００Ｄａ、４５００Ｄａ、５０００Ｄａ、５５００Ｄａ、６０００Ｄａ、６５００Ｄａ、７０００Ｄａ、７５００Ｄａ、８０００Ｄａ、８５００Ｄａ、９５００Ｄａ、および１０，０００Ｄａの好ましい値を有して、約１００～約１０，０００Ｄａ、適切には約２０００～約５０００Ｄａの分子量を有し得る。
【0074】
非イオン性界面活性剤は、コロイド粒子と結び付けられ得る、コロイド粒子の脂質二重膜に組み入れられ得る、コロイド粒子の脂質二重膜の外層に組み入れられ得る、またはコロイド粒子の内層脂質二重膜に組み入れられ得る。
【0075】
したがって、第１の両親媒性脂質対第２の両親媒性脂質対非イオン性界面活性剤は、２～１０：１：０～２、３～９：１：０．５～１．５、４～９：１：０．５～１ｗ／ｗ、適切には９：１：０、９：１：１、４：１：０、または４：１：０．５ｗ／ｗ（｛第１の両親媒性脂質｝：｛第２の両親媒性脂質｝：｛非イオン性界面活性剤｝）の比で提供され得る。モル比として表現すると、これは、例えば３０～４０：１：０～５、３０～３５：１：０～２．５、３０～３５：１：０～２．５、適切には３３：１：０、３３：１：２、または３２：１：３であり得る。
【0076】
組成物は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子またはその断片をさらに含み得る。組成物が第ＶＩＩＩ因子の断片を含む場合、第ＶＩＩＩ因子断片は、適切には、断片が、生物学的活性、または天然の第ＶＩＩＩ因子分子と実質的に同じ生物学的活性を保持する活性断片であり得る。例えば、１種のそのような活性断片は、Ｂドメイン短縮第ＶＩＩＩ因子である。組成物は、天然の血液因子およびその断片の両方を含み得ることがさらに可能である。コロイド粒子および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子は、１０～２０：１および５～１０：１等、１～９０：１、適切には２～９０：１、５～８５：１、６～１０：１、７～８：１、７．５～２０：１、１０～８０：１、１０～１５：１、１０～１６：１、１０～２０：１、１３～１９：１、１５～１６：１、１５～７５：１、２０～７０：１、２５～６５：１、３０～６０：１、３５～５５：１、４０～５０：１の化学量論比で提供され得る。代替的に表現すると、コロイド粒子および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子は、１５．５：１、１３：１、８：１、７．７：１、７：１等、１：１、２：１、５：１、７．５：１、１０：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２２：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、８６：１、９０：１の化学量論比で提供され得る。全長ＦＶＩＩＩ分子に関してより具体的には、化学量論比は、１０：１～１９：１、および任意選択で１０～１５：１または５～１０：１、および任意選択で７．５：１であり得る。ベータドメイン欠失またはベータドメイン短縮ＦＶＩＩＩ分子に関して、域は、１３～１９：１、および任意選択で１０～１６：１または６～１０：１、および任意選択で８：１であり得る。
【0077】
理論によって拘束されることを望むことなく、組成物に存在する過度のコロイド粒子は、遊離コロイド粒子を、他の中核になる血液因子（例えば、血友病Ａの場合にはＦＶＩＩおよびＦＩＸ）に可逆的に結合させるのに十分な量にあり、それは、粒子と結び付いたある量の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）とともに、投与後に血小板に捕捉されかつ可逆的に結合されて、血小板で因子を濃縮し得、外因性血液凝固経路をブーストし得るという推定がある。
【0078】
第ＶＩＩＩ因子は、任意の適切な供給源由来であり得、分子生物学的技法を使用した組み換えＤＮＡ技術によって産生される組み換えタンパク質であり得る、もしくは化学的に合成され得る、もしくは哺乳類の母乳においてトランスジェニック的に産生され得る、または第ＶＩＩＩ因子は、天然の供給源から単離され得る（例えば、血漿から精製される）。適切には、第ＶＩＩＩ因子は、ヒト第ＶＩＩＩ因子等の哺乳類第ＶＩＩＩ因子である。
【0079】
第ＶＩＩＩ因子等の血液因子は、表面付着の特性によって特徴付けられる。これは、酵素および補因子が、カスケードにおける他の参加者に、血小板の表面に、および損傷の部位における組織に付着することを要する凝固カスケードの必要な特質である。凝血が損傷の部位にとどまり、漂流して危険な血栓形成を引き起こさないことが特に重要である。第ＶＩＩＩ因子等の血液因子は、任意のガラスおよびプラスチック表面に過度に吸着するであろうことから、この特性は、薬物産物の製剤化において課題を提示する。実践的観点から、これは、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）等の非イオン性界面活性剤の大量使用によって軽減される。
【0080】
コロイド粒子対第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子の化学量論比を判定するために、以下の計算が実施されるべきである。第１に、ＦＶＩＩＩのＩＵあたりのＦＶＩＩＩの分子が判定されるべきである。注記、ＦＶＩＩＩの質量は、ＦＶＩＩＩの変異型（例えば、全長対βドメイン欠失）に応じて変動する。第２に、コロイド粒子のグラムあたりの粒子の数が判定されるべきである。最後に、化学量論比がそれに従って判定され得る。３５ＩＵ／ｋｇ ＦＶＩＩＩ（ベータドメイン欠失および全長の両方）および２２ｍｇ／ｋｇコロイド（ＰＥＧＬｉｐ）を用いた例となる計算は、以下のとおりである：
計算例１、ベータドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩ
計算例１、ベータドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩ
【0081】
【表1】
【0082】
計算例２、全長ｒＦＶＩＩＩ
【0083】
【表2】
【0084】
組成物は、さらなる治療活性化合物または分子、例えば抗炎症薬、鎮痛剤、もしくは抗生物質、または第ＶＩＩＩ因子の活性を促進し得るもしくは増強し得る他の薬学的活性剤を含み得る。
【0085】
本発明の組成物は、標準的実践に従って、本明細書に記載される投与に適切な医薬組成物として製剤化され得る。例えば、組成物は、任意の適切な賦形剤、希釈剤、および／またはアジュバントをさらに含み得る。緩衝剤等の適切な希釈剤は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水溶性塩、および適切な酸とともに製剤化され得る。適切な緩衝溶液は、アミノ酸（例えば、ヒスチジン）、無機酸（例えば、クエン酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、およびリン酸からなる群から選択される酸）の塩、およびアルカリ金属またはアルカリ土類金属、（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムとして例示される、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、リチウム塩、またはカルシウム塩）を含み得るが、それらに限定されない。そのような賦形剤、緩衝剤、および／またはアジュバントの例は、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、および／またはクエン酸ナトリウムを含む。他の生物学的緩衝剤は、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ等を含み得る。
【0086】
適切な水性クエン酸塩緩衝液は、クエン酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸カリウム緩衝液、例えば５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液であり得る。適切なリン酸塩緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液、例えば２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液であり得る。
【0087】
組成物に対する適切なｐＨ値は、例えばｐＨ５．０～ｐＨ９．０、適切にはｐＨ６．７～ｐＨ７．４、またはｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．２等、インビボにおける投与のための、任意の一般的に許容されるｐＨ値を含む。ｐＨは、適切な酸またはアルカリ、例えば塩酸を用いて、それに応じて調整され得る。
【0088】
本発明の組成物は、すぐに使用できる水性懸濁液に製剤化され得る、または組成物は、凍結乾燥製剤として調製され得る。本発明の凍結乾燥製剤は、同様に提供される適切な希釈剤、アジュバント、または賦形剤、例えば生理学的に許容される緩衝剤と併せて、別個の剤形として供給され得る。本明細書に記載されるように、そのような組成物は、別個の剤形として第ＶＩＩＩ因子を付加的に含み得る、または本明細書に記載されるコロイド粒子とともに製剤化され得る。典型的には、再構成のために、凍結乾燥された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）のバイアル、およびコロイド粒子（ＰＥＧＬｉｐ）溶液の別個のバイアルが提供されるであろう。
【0089】
コロイド粒子は、水性クエン酸塩緩衝液中９％（ｗ／ｖ）総脂質の懸濁液として保管され得、適切には、粒子は、７％、６％、５％、４％（ｗ／ｖ）総脂質の懸濁液として保管され得る。外在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の要される濃度が患者に対してわかり次第、バルク溶液を、必要な場合には５０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液で希釈して、コロイド粒子の濃度を調整し得、それにより、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）が添加される場合、コロイド粒子対第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子の所望の比が獲得される。
【0090】
第ＶＩＩＩ因子は、完全に外在性であり得、例えば阻害剤を有する重度の血友病患者の場合には、注射の前に本発明とともに製剤化され得、その使用に関して、それは血漿濃縮物に由来し得る、または組み換えで産生され得る。代替的に、患者が第ＶＩＩＩ因子を自己製造する一部の能力を保持する場合（例えば、軽度もしくは中等度血友病患者、または後天性血友病を有する患者）、より低い量の外在性第ＶＩＩＩ因子が投与されるであろう、または外在性第ＶＩＩＩ因子は投与されないであろう。
【0091】
理論によって拘束されることを望むことなく、組成物に存在する過度のコロイド粒子は、遊離コロイド粒子を、他の中核になる血液因子（例えば、血友病Ａの場合にはＦＶＩＩおよびＦＩＸ）に可逆的に結合させるのに十分な量にあり、それは、粒子と結び付いたある量の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）とともに、投与後に血小板に捕捉されかつ可逆的に結合されて、血小板で因子を濃縮し得、外因性血液凝固経路をブーストし得るという推定がある。
【0092】
注射されると、コロイド粒子は、血小板の表面に可逆的に結合し、他の膜と融合するであろう。コロイド粒子がすでに外在性第ＶＩＩＩ因子と結合している場合、これは、血小板の表面で第ＶＩＩＩ因子を濃縮すると考えられ、一部は、血小板内に貪食され得、または産生されるＴＦ担持凝固促進性微粒子ともしくはその中で結び付き得、阻害剤およびまた通常のクリアランスメカニズムから該タンパク質を保護し、例えばＬＲＰ－１、該タンパク質により長い半減期を付与する。中等度または軽度の血友病を有する患者において、コロイド粒子は、任意の循環第ＶＩＩＩ因子も捕捉すると考えられ、血小板でもしくはその中で、または生じたＴＦ担持凝固促進性微粒子の中でそれを濃縮する。注射時に第ＶＩＩＩ因子と結び付いていないコロイド粒子は、血小板の表面でＦＶＩＩならびに他の内在性血液因子（例えば、ＦＩＸ）を捕捉しかつ濃縮し始め、これらと、産生された任意のＴＦ担持凝固促進性微粒子とを結び付け始めると考えられ；接着した因子を有しない粒子も血小板の表面に結合しかつ融合し、凝血カスケードの混乱の間に血小板反応面で、ＴＦ担持凝固促進性微粒子を形成もし、活性形態、ＦＶＩＩａ、およびＦＩＸａを含めたさらなる因子を捕捉しかつ濃縮する日和見性トラップとして作用もすることも実現可能である。
【0093】
通常では、内皮への損傷時、組織因子はＦＶＩＩをＦＶＩＩａに変換し、それと結合する。次いで、ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体は、活性化血小板の表面へ移動しかつその表面に結合し、ＦＸをＦＸａに変換し始めて、プロトロンビンを切断してトロンビンを生成し、その過程は、ＦＸａがＦＶＩＩａ（活性化血小板から放出された）と複合して、プロトロンビナーゼ複合体を形成する場合に最適化され、それは、活性化血小板およびそれらに由来するＴＦ担持凝固促進性微粒子の曝露された膜表面でも会合する。本発明は、ＦＶＩＩをこの反応面にごく接近して置き、それは、多くのＴＦ担持凝固促進性微粒子に粉砕されていてもよい。ゆえに、ＦＶＩＩａ（コロイド粒子、ゆえに血小板および微粒子に結合したままである）への変換、およびＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体の形成は、２つの重要でかつ即時の効果を有して、血小板およびそれらの微粒子の反応面で生じる：
１）ＦＸからＦＸａへの限局性変換であって、これらの血小板およびＴＦ担持凝固促進性微粒子表面でも、それはＦＶと結合して（「プロトロンビナーゼ複合体」）、高度に限局性のトロンビンバーストを生じさせ、それはフィブリンの産生を開始もし、増幅相を触媒もするであろう、限局性変換；ならびに同時に、
２）ＦＩＸからＦＩＸａへの限局性変換であって、それは次いで、コロイド粒子により共局在化しているＦＶＩＩＩと結び付いて、同じ膜表面でテナーゼ複合体を形成し得、ゆえに、上の（１）において目下強化された開始相からのトロンビンによって触媒されている増幅相を増大しかつ最適化する、限局性変換。代替的にかつ付加的に、コロイド粒子膜は、代用テナーゼ複合体を形成し得、引き付け、ＦＸをＦＸａに変換する。
１）ＦＸからＦＸａへの限局性変換であって、これらの血小板およびＴＦ担持凝固促進性微粒子表面でも、それはＦＶと結合して（「プロトロンビナーゼ複合体」）、高度に限局性のトロンビンバーストを生じさせ、それはフィブリンの産生を開始もし、増幅相を触媒もするであろう、限局性変換；ならびに同時に、
２）ＦＩＸからＦＩＸａへの限局性変換であって、それは次いで、コロイド粒子により共局在化しているＦＶＩＩＩと結び付いて、同じ膜表面でテナーゼ複合体を形成し得、ゆえに、上の（１）において目下強化された開始相からのトロンビンによって触媒されている増幅相を増大しかつ最適化する、限局性変換。代替的にかつ付加的に、コロイド粒子膜は、代用テナーゼ複合体を形成し得、引き付け、ＦＸをＦＸａに変換する。
【0094】
凝血カスケードが開始しかつフィブリンが産生され次第、血小板は通常では凝固してフィブリンメッシュを塞ぐ。血小板と結合しかつ融合するコロイド粒子の能力は、メッシュにおいて一緒に血小板の付着性を強めることにおいてここで果たす最終的な役割を有して、凝血を安定化する。
【0095】
本発明は、限定された量のＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩに対する阻害剤の両方の存在下で、ＦＸからＦＸａへの変換を向上させる複数のやり方で作用し得る。第１に、ＦＩＸａとのテナーゼ複合体を形成し得る限定された量のＦＶＩＩＩの潜在性を保護し、増強し、かつ最大限に高めて、ＦＸからＦＸａへの変換を触媒することによって；第２に、ＦＶＩＩＩの作用を模倣しかつＦＩＸａに結合して、代用テナーゼ複合体を提供して、ＦＸからＦＸａへの変換を触媒することによって；第３に、ＴＦ担持凝固促進性微粒子の産生により、およびＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを濃縮して、外因性テナーゼ複合体によるＦＸからＦＸａへの変換を刺激することの両方により、外因性経路を上方調節することによって；ならびに最後に、上方調節された外因性経路を介して、ＦＩＸからＦＩＸａへの変換を増強して、内因性テナーゼ複合体の形成を増大させることによって。これらの作用を通じて、本発明は、内因性経路のテナーゼ複合体におけるＦＶＩＩＩの活性を保護し、保存し、かつ最大限に高め、一方で、テナーゼ複合体におけるＦＶＩＩＩａの機能性を模倣し、また外因性経路の上方調節を通じてその経路を同時に迂回することによる、複数の作用の様態を有する。
【0096】
コロイド粒子は、外因性経路を介してＦＸからＦＸａへの変換を増強する迂回剤として、ならびにＦＶＩＩＩの保護およびＦＩＸ／ＦＩＸａを濃縮することの両方により内因性経路を増幅する、二重の作用を有し、テナーゼ複合体の形成を加速させる、またはＦＩＸａとＦＶＩＩＩ非依存的テナーゼ複合体を形成する。増強された開始（外因性）および増幅（内因性）相は、一緒になって、とりわけ阻害性抗体の存在下における、そのような低下した量の第ＶＩＩＩ因子を用いて通常考え得るであろうよりも、凝血のより迅速な始まり、およびより硬い凝血に結合され得るフィブリンのより速い生成の両方を可能にし、患者の出血のより速い解決につながる。
【0097】
本発明は、ゆえに、血小板表面でおよび血小板の内側で内在性および外在性第ＶＩＩＩ因子の両方の正しい量を濃縮するために、コロイド粒子の能力、および特にコロイド粒子対第ＶＩＩＩ因子のその特異的製剤比の両方に依存し、ならびにＴＦ担持凝固促進性微粒子の産生を刺激し、それにより、凝血カスケードのＴＦ－ＦＶＩＩａ中心の開始相および増幅相の両方とも、血友病Ａ）の場合には第ＶＩＩＩ因子に対する阻害剤の存在下で、限定された量の第ＶＩＩＩ因子を用いて、トロンビン生成の始まりを加速させる相乗効果とともに最適化される。
【0098】
注射された外在性第ＶＩＩＩ因子は、阻害剤および通常のクリアランスメカニズムの両方による分解から保護されるため、ならびに血小板で因子を濃縮しかつＴＦ担持凝固促進性微粒子の効果を加速させることの両方により、より良質な凝血がより速く形成されるため、本発明は、遺伝子療法による血小板における異所性ＦＶＩＩＩの産生によって見出される、第ＶＩＩＩ因子を供給する他の方法と比べて第ＶＩＩＩ因子倹約的であろう。この利益は、患者にとってより少量のまたはより低頻度の注射として現れると考えられ、既定の治療の順守を増加させ、偶発的および場合によっては致命的な出血の可能性を減少させる。
【0099】
遺伝子療法により血小板において異所的にＦＶＩＩＩを産生しようとする試みの成功とは異なり、本発明は、血小板でおよび血小板中で、外在性第ＶＩＩＩ因子および内在性因子（ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａおよびＦＩＸ／ＦＩＸａ）を濃縮するものの、それは、ウイルス媒介性導入遺伝子療法の長い開発プログラム、規制の負担、または不可逆的性質を要しない。
【0100】
治療される対象となる疾患において、正常なレベルよりも低くある限定された量の第ＶＩＩＩ因子の効果を濃縮しかつ増幅することによって（例えば、血友病Ａ（ＨＡ）の場合にはＦＶＩＩＩ）、本発明は、第ＶＩＩＩ因子倹約的であると考えられ、血友病患者において、および特に、第ＶＩＩＩ因子を、それらの阻害性抗体が該タンパク質を破壊し、それらを非保護の状態にするであろうことから、通常では投与され得ない阻害剤患者において、より低い用量が投与されることを可能にし、かつ／または止血を達成するために通常要される注射の回数を低下させると予測される。
【0101】
新規の操作された第ＶＩＩＩ因子分子もしくはこれらの分子の模倣体またはそれらの活性化形態を作り出す手法とは異なり、本発明は、分子内、例えば組み換えヒトＦＶＩＩＩ（ｒｈＦＶＩＩＩ）に外来配列を操作する必要なく、任意の現在の血漿由来のまたは組み換えの第ＶＩＩＩ因子とともに使用され得る。このことは、新規の認識されていないタンパク質に対して生じる免疫調節応答の危険性を低下させる。
【0102】
これらの手法、すなわち血小板におけるＦＶＩＩＩの産生または模倣体の使用の両方とは異なり、本発明は、外因性の加速的経路の外在的に適用された構成要素を濃縮するだけでなく、内在性因子を濃縮もしかつＴＦ担持凝固促進性微粒子の産生を刺激もして、迅速なトロンビンバーストに対する内因性経路、および外因性経路の他の主要な構成要素（ＦＩＸａ）の局所的生成を増幅し、それは、第ＶＩＩＩ因子レベルは再度落ちることから、トロンビン産生の共通の経路を推進し続け得る、新規でかつ非常に必要な二重の作用を有する。
【0103】
本発明の使用は、遊離第ＶＩＩＩ因子と比べて第ＶＩＩＩ因子倹約的である。このことは、患者にとってより多くの利便性（より少量の注射）、より良好な順守（予防的注射のより少ない失念）、およびより良好な医療経済学（より低費用の第ＶＩＩＩ因子、血友病患者が順守しておらず出血を有した場合の、より低い緊急度の注入）を意味する。
【0104】
第ＶＩＩＩ因子の標準的な血漿由来の形態または組み換えで産生された形態の使用を可能にすることによって、本発明が、阻害剤を有する血友病Ａ患者においてＦＶＩＩＩを用いた予防的治療を可能にすることに対する費用効果の高い解決策を可能にすることは究極の目的である。
【0105】
本発明の使用は、阻害剤を有する血友病患者において、迂回剤としての外在性ＦＶＩＩａの使用と比べて倹約的である。本発明は、患者自身のＦＶＩＩを使用するだけでなく、血小板でこれを濃縮もしかつＴＦ担持凝固促進性微粒子の産生を刺激もして、ＦＶＩＩの有効性を最大限に高め、ゆえに外在性ＦＶＩＩａの費用、および該タンパク質の過剰摂取に起因した血栓性反応の任意の懸念を回避する。
【0106】
組成物は、注射または注入によって、好ましくは静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与され得る。注射は、組成物の単回投薬の投与を含む。注入は、長期間にわたる組成物の投与を含む。
【0107】
本発明の組成物は、１日あたり少なくとも１回、１日あたり少なくとも２回、１週間あたり約１回、１週間あたり約２回、２週間あたり約１回、または１カ月あたり約１回の投与のためのものであり得る。組成物は、また、ＦＶＩＩＩの血中濃度を一貫したレベルで維持させる間隔で投与され得かつ／または再投薬され得、患者の血中におけるＦＶＩＩＩの濃度が、治療量以下のまたは治療上非関連のレベルに到達するまで再投薬するのを待つ必要なく、継続的で、一定で、かつ予測可能な治療効果を提供する。伝統的実践では、「健常なレベル」または治療上有効な／関連するレベルのＦＶＩＩＩが血流になおも存在する間、ＦＶＩＩＩの後続投薬は、通常では患者に与えられない。ゆえに、本発明は、予防にとってより理想的に適している、血流におけるより一貫した治療レベルのＦＶＩＩＩを提供する。
【0108】
患者の血中におけるＦＶＩＩＩの治療量以下のまたは治療上非関連のレベルは、患者が、２０分間以下、１５分間以下、または１２分間以下の全血凝固時間を維持することができない場合であると特徴付けられ得る。
【0109】
本発明は、患者が、多くとも（ｎｏ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ）２０分間、多くとも１５分間、または多くとも１２分間の全血凝固時間を維持することができる組成物を提供する。
【0110】
生体適合性ポリマーで誘導体化されたコロイド粒子（リポソーム）を伴った血液因子の製剤は、上手く皮下投与され得、血友病に罹患した対象に治療有効用量の血液因子をもたらし得ることが驚くべきことに見出された。
【0111】
本発明の実施例において、ＰＥＧは、血液因子との結び付きの前に、小胞形成の間にコロイド粒子内に組み入れられる。血液因子上の特異的アミノ酸配列が、リポソームの外側にあるＰＥＧ分子のカルバメート官能基に非共有結合的に結合し得ると思われる。
【0112】
コロイド粒子は血液因子をカプセル化しない。血液因子は、リポソームの外面上のポリマー鎖と非共有結合的に相互作用し、ポリマー鎖を活性化する化学反応は行われない。血液因子と生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリポソームとの間の相互作用の性質は、イオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合、およびファンデルワールス力等の任意の非共有結合性メカニズムによるものであり得る（Ａｒａｋａｗａ，Ｔ．およびＴｉｍａｓｈｅｆｆ，Ｓ．Ｎ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４：６７５６～６７６２（１９８５）；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．およびＬｅｅ，Ｌ．Ｌ．Ｙ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：６２５～６３１（１９８１））。そのようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【0113】
親水性ポリマーで誘導体化された脂質を形成する小胞を調製するために、多様な公知のカップリング反応が使用され得る。例えば、ポリマー（ＰＥＧ等）は、塩化シアヌル基を通じて、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）等の脂質に誘導体化され得る。代替的に、キャップ付きＰＥＧをカルボニルジイミダゾールカップリング試薬で活性化して、活性化イミダゾール化合物を形成し得る。カルバメート連結化合物は、ＭＰＥＧ（メトキシＰＥＧ）の末端ヒドロキシルとクロロギ酸ｐ－ニトロフェニルとを反応させて炭酸ｐ－ニトロフェニルを得ることによって調製され得る。次いで、この産物を１－アミノ－２，３－プロパンジオールと反応させて、カルバメート中間体を得る。ジオールのヒドロキシル基をアシル化して最終産物を得る。ＷＯ０１／０５８７３に記載されるように、１－アミノ－２，３－プロパンジオールの代わりにグリセロールを使用した同様の合成を使用して、カルボネート連結産物を産生し得る。他の反応が周知であり、例えばＵＳ５，０１３，５５６に記載される。
【0114】
コロイド粒子（リポソーム）は、様々なパラメーターに従って分類され得る。例えば、ラメラのサイズおよび数（構造的パラメーター）をパラメーターとして使用する場合には、３種の主要なタイプのリポソームが記載され得る：多重層小胞（ＭＬＶ）、小さな単層小胞（ＳＵＶ）、および大きな単層小胞（ＬＷ）。
【0115】
ＭＬＶは、それらのゲル－液晶相転移温度（Ｔｍ）よりも上で、乾燥リン脂質の水和時に自然発生的に形成される種である。ＭＬＶのサイズは不均一であり、それらの構造は、交互の同心円状の水層および脂質層のタマネギの皮に似ている。
【0116】
ＳＵＶは、超音波処理、または押出、高圧ホモジナイゼーション、もしくは高剪断混合等の他の方法によってＭＬＶから形成され、単一層である。それらは、高い表面対容積比を有する最も小さな種であり、それゆえ、脂質の重量に対して最も低い捕捉容積の水性空間を有する。
【0117】
第３のタイプのリポソームＬＵＶは、大きな水性コンパートメントおよび単一（単層）のまたはごくわずかな（オリゴラメラの）脂質層を有する。さらなる詳細は、Ｄ．ＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇおよびＹ．Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、第３３巻、３３７～４６２頁（１９８８）に開示される。
【0118】
本明細書において使用されるとき、「搭載」という用語は、搭載される対象となるバイオポリマー物質の任意の種類の相互作用、例えば、バイオポリマー物質の押出の有無にかかわらない、カプセル化、付着（小胞の内壁または外壁への）、または壁内への埋め込み等の相互作用を意味する。
【0119】
本明細書において使用されかつ上で示されるとき、「リポソーム」という用語は、コロイド粒子を指し、自然発生的にまたは非自然発生的に小胞を生じ得る任意の両親媒性化合物のすべての球体または小胞、例えば少なくとも１個のアシル基が、複雑なリン酸エステルによって置き換えられているリン脂質を含むことを意図される。リポソームは、ガラス状態から液晶までの任意の物理的状態で存在し得る。ほとんどのトリアシルグリセリドが適切であり、本発明における使用に適切な最も一般的なリン脂質は、レシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）とも称される）であり、それは、リン酸のコリンエステルに連結した、ステアリン酸、パルミチン酸、およびオレイン酸のジグリセリドの混合物である。レシチンは、卵、大豆、および動物組織（脳、心臓等）等、すべての動物および植物に見出され、合成でも産生され得る。リン脂質の供給源またはその合成の方法は重大ではなく、任意の天然に存在するまたは合成のホスファチドが使用され得る。
【0120】
具体的なホスファチドの例は、Ｌ－ａ－（ジステアロイル）レシチン、Ｌ－ａ－（ジパルミトイル）レシチン、Ｌ－ａ－ホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｅ ａｃｉｄ）、Ｌ－ａ－（ジラウロイル）－ホスファチジン酸、Ｌ－ａ（ジミリストイル）ホスファチジン酸、Ｌ－ａ（ジオレオイル）ホスファチジン酸、ＤＬ－ａ（ジ－パルミトイル）ホスファチジン酸、Ｌ－ａ（ジステアロイル）ホスファチジン酸、および脳、肝臓、卵黄、心臓、大豆等から、または合成で調製された様々なタイプのＬ－ａ－ホスファチジルコリン、ならびにその塩である。他の適切な修飾は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）における脂肪アシル残基架橋剤の制御性過酸化、およびそれら自身で、またはＰＣのアルキル類似体等のＰＣと混合された場合にミセルを形成する双性イオン性両親媒性物質（ａｍｐｈｉｐａｔｈａｔｅ）を含む。
【0121】
リン脂質は、純度が変動し得、完全にまたは部分的に水素化もされ得る。水素化は、不要な過酸化のレベルを低下させ、パッキングおよび漏出をもたらすゲル－液体／結晶相転移温度（Ｔｍ）を修正しかつ制御する。
【0122】
リポソームは、様々な生物学的流体を含む任意の特異的貯蔵庫の要件に「合わせ」られ得、凝集またはクロマトグラフ分離なしでそれらの安定性を維持し、注射される流体中に十分に分散しかつ懸濁されたままの状態である。インサイチューにおける流動性は、組成、温度、塩分濃度、２価イオン、およびタンパク質の存在に起因して変化する。リポソームは、任意の他の溶媒または界面活性剤の有無にかかわらず使用され得る。
【0123】
一般的に適切な脂質は、少なくとも、卵または大豆ＰＣにおけるアシル鎖構成要素の転移温度（Ｔｍ）に関して特徴的であるアシル鎖組成を有し得る、すなわち１本の鎖が飽和でありかつ１本が不飽和である、または両方が不飽和である。しかしながら、２本の飽和鎖を使用する可能性が除外されない。
【0124】
リポソームは、これらが、不安定性および／または凝集および／またはクロマトグラフ分離を誘導しない限りにおいて、他の脂質構成要素を含有し得る。これは、ルーチン実験によって判定され得る。
【0125】
ＰＥＧ化リン脂質は、コロイド粒子の表面に物理的に接着され得る、またはコロイド粒子の膜に挿入され得る。ポリマーは、それゆえ、コロイド粒子に共有結合され得る。
【0126】
単層または多重層である修飾コロイド粒子を産生するための多様な方法が公知であり、使用可能である（ＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇおよびＢａｒｅｎｈｏｌｚ、（１９８８）を参照されたい）：
１．リン脂質の薄膜を水性媒体で水和し、その後に機械的振とうおよび／もしくは超音波照射および／もしくは適切なフィルターを通した押出が続く；
２．適切な有機溶媒中でのリン脂質の溶解、水性媒体との混合、その後に溶媒の除去が続く；
３．その臨界点を上回る気体の使用（すなわち、フロン、およびＣＯ２、またはＣＯ２と他のガス状炭化水素との混合物等の他の気体）、または
４．脂質洗剤混合ミセルを調製し、次いで洗剤の濃度を、リポソームが形成されるその臨界濃度を下回るレベルまで下げる。
１．リン脂質の薄膜を水性媒体で水和し、その後に機械的振とうおよび／もしくは超音波照射および／もしくは適切なフィルターを通した押出が続く；
２．適切な有機溶媒中でのリン脂質の溶解、水性媒体との混合、その後に溶媒の除去が続く；
３．その臨界点を上回る気体の使用（すなわち、フロン、およびＣＯ２、またはＣＯ２と他のガス状炭化水素との混合物等の他の気体）、または
４．脂質洗剤混合ミセルを調製し、次いで洗剤の濃度を、リポソームが形成されるその臨界濃度を下回るレベルまで下げる。
【0127】
一般的に、そのような方法は、約０．０２～１０μｍ以上の不均一なサイズを有するコロイド粒子を産生する。比較的小さくかつサイズが十分に規定されるコロイド粒子が、本発明における使用に好ましいことから、「コロイド粒子小型化」として規定される第２のプロセシング工程は、コロイド粒子懸濁液のサイズおよびサイズ不均一性を低下させるために使用され得る。
【0128】
コロイド粒子懸濁液のサイズを測って、約５μｍ未満のサイズ域、例えば＜０．４μｍにある小胞の選択的サイズ分布を達成し得る。本発明の１つの実施形態において、コロイド粒子は、約０．０３～０．４ミクロン（μｍ）、適切には０．１ミクロン（μｍ）前後の平均的粒子サイズ径を有する。
【0129】
この域にあるコロイド粒子は、適切なフィルターを通した濾過によって容易に滅菌され得る。より小さな小胞ほど、保管時に凝集する傾向がより低いことも示し、ゆえに、リポソームが静脈内にまたは皮下に注射される場合、潜在的に深刻な閉塞または詰まり問題を低下させる。最後に、サブミクロン域まで小型化されているリポソームは、より均一な分布を示す。
【0130】
いくつかの技法が、本発明に適切な様式で、コロイド粒子のサイズおよびサイズ不均一性を低下させるために使用可能である。標準的な水槽またはプローブ超音波装置によるコロイド粒子懸濁液の超音波照射は、サイズが０．０２～０．０８μｍの小さな単層小胞（ＳＵＶ）への漸進的サイズ低下をもたらす。
【0131】
ホモジナイゼーションは、大きなコロイド粒子をより小さなものに断片化するために剪断エネルギーに依存する別の方法である。典型的なホモジナイゼーション手順では、選択されたリポソームサイズ、典型的には０．１～０．５μｍが観察されるまで、コロイド粒子懸濁液を標準的エマルジョンホモジナイザーを通して再循環させる。両方法において、粒子サイズ分布は、従来のレーザービーム粒子サイズ判定によってモニターされ得る。
【0132】
小細孔ポリカーボネートフィルターまたは等価の膜を通したコロイド粒子の押出も、膜の細孔サイズに応じて、平均が約０．０２～５μｍの域にある、比較的十分に規定されたサイズ分布までコロイド粒子サイズを低下させるための有効な方法である。
【0133】
典型的に、所望のコロイド粒子サイズ分布が達成されるまで、懸濁液を１枚または２枚の積層膜を通して数回循環させる。コロイド粒子を連続してより小さな細孔膜を通して押出して、リポソームサイズの段階的低下を達成し得る。
【0134】
遠心分離および分子篩クロマトグラフィーは、１μｍ未満の選択閾値を下回る粒子サイズを有するリポソーム懸濁液を産生するために使用可能である他の方法である。これら２つのそれぞれの方法は、大きな粒子からより小さなものへの変換よりもむしろ、大きなリポソームの優先的除去を伴う。コロイド粒子収率は、それに応じて低下する。
【0135】
サイズ処理されたコロイド粒子懸濁液は、従来の０．４５μｍデプス膜フィルター等、約０．４μｍの粒子識別サイズを有する滅菌膜を通過することによって容易に滅菌され得る。リポソームは、凍結乾燥形態で安定であり、水中に取り込ませることによって使用の直前に再構成され得る。
【0136】
コロイド粒子を形成するための適切な脂質は、上で記載される。適切な例は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ｄｉｍｉｒｙｓｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＭＰＣ）および／またはジミリストイル（ｄｉｍｉｒｙｓｔｏｙｌ）－ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）等のリン脂質、直接的にまたは部分的なもしくは完全な水素化が後に続く、部分的なまたは完全な精製の後に獲得される卵および大豆由来のリン脂質を含むが、それらに限定されない。
【0137】
以下の４つの方法は、ＷＯ９５／０４５２４に記載され、概して、本発明に従って使用されるコロイド粒子（リポソーム）の調製に適切である。
方法Ａ
ａ）水不混和性有機溶媒中で小胞を形成するのに適切な脂質等、両親媒性物質を混合する
ｂ）固体支持体の存在下で溶媒を除去し、代替的に、乾燥両親媒性物質またはその混合物が、直接任意の形態（粉末、顆粒等）で使用され得る、
ｃ）生理学的適合性溶液中のバイオポリマー物質の溶液に、工程ｂ）の産物を取り込ませる
ｄ）可溶化または分散特性を有する有機溶媒を添加する、ならびに
ｅ）バイオポリマー物質の機能を保持する条件下で、工程ｄ）において獲得された画分を乾燥させる。
方法Ａ
ａ）水不混和性有機溶媒中で小胞を形成するのに適切な脂質等、両親媒性物質を混合する
ｂ）固体支持体の存在下で溶媒を除去し、代替的に、乾燥両親媒性物質またはその混合物が、直接任意の形態（粉末、顆粒等）で使用され得る、
ｃ）生理学的適合性溶液中のバイオポリマー物質の溶液に、工程ｂ）の産物を取り込ませる
ｄ）可溶化または分散特性を有する有機溶媒を添加する、ならびに
ｅ）バイオポリマー物質の機能を保持する条件下で、工程ｄ）において獲得された画分を乾燥させる。
【0138】
方法Ａの工程ａ）に従って、上で挙げられる小胞を形成するのに適切な両親媒性物質を、水不混和性有機溶媒中で混合する。水不混和性有機溶媒は、フッ素化炭化水素、塩素化炭化水素等の極性プロトン性溶媒であり得る。
【0139】
本発明の方法の工程ｂ）において、溶媒を、固体支持体の存在下で除去する。固体支持体は、ビーズ様構造を有する不活性有機または無機材料であり得る。無機支持体材料の材料はガラスであり得、有機材料は、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）または他の同様のポリマーであり得る。
【0140】
本発明の方法Ａの工程ｃ）は、生理学的適合性溶液中のカプセル化される対象となる物質の溶液に、工程ｂ）の産物を取り込ませるためのものである。
【0141】
生理学的適合性溶液は、重量で最高約１．５までの塩化ナトリウム溶液と等価であり得る。他の塩を、それらが、例えば凍結保護剤として生理学的に適合性である限りにおいて、使用することも可能である、例えば糖類および／またはアミノ酸。例えば、ラクトース、スクロース、またはトレハロースが、凍結保護剤として使用され得る。
【0142】
任意選択で、工程ａ）とｂ）との間に、工程ａ）の画分等のウイルス不活性化、滅菌、脱パイロジェン化、濾過の工程が提供され得る。これは、調製の初期段階で薬学的に許容される溶液を有するために有利であり得る。
【0143】
方法Ａの工程ｄ）は、可溶化または分散特性を有する有機溶媒を添加する工程である。
【0144】
有機溶媒は、水と混和性の有機極性プロトン性溶媒であり得る。第３級ブタノール（ｔｅｒｔ－ブタノール）等、アルキル鎖に１～５個の炭素原子を有する低級脂肪族アルコールも使用され得る。水と混和性の有機極性プロトン性溶媒の量は、リポソームに搭載される対象となる物質へのその干渉に強く依存している。例えば、タンパク質が搭載される対象となる場合、上限は、タンパク質の活性が影響を受ける溶媒の量によって設定される。これは、搭載される対象となる物質の性質によって強く変動し得る。例えば、凝血因子が第ＩＸ因子を含む場合には、ｔｅｒｔ－ブタノールのおよその量は３０％前後であり、一方で、第ＶＩＩＩ因子に関しては、１０％未満の量のｔｅｒｔ－ブタノールが適切である（第ＶＩＩＩ因子は、ｔｅｒｔ－ブタノールの影響にはるかに感受性が高い）。これらの例におけるｔｅｒｔ－ブタノールのパーセンテージは、最終濃度に対して計算される容積でのパーセントに基づく。
【0145】
任意選択で、工程ｄ）に続いて、工程ｄ）の後に得られた画分のウイルス不活性化滅菌、および／または分配が行われ得る。
【0146】
本発明の工程ｅ）は、搭載される対象となる物質の機能を保持する条件下で、工程ｄ）において獲得された画分を乾燥させる工程である。混合物を乾燥させるための１つの方法は凍結乾燥である。凍結乾燥は、凍結保護剤、例えばラクトースもしくは他のサッカリド、またはアミノ酸の存在下で行われ得る。代替的に、蒸発または噴霧乾燥が使用され得る。
【0147】
乾燥した残留物は、次いで、使用前に水性媒体に取り込まれ得る。固体の取り込み後、それは、それぞれのリポソームの分散体を形成する。水性媒体は生理食塩溶液を含有し得、形成された分散体は、必要な場合には、任意選択で適切なフィルターに通されて、リポソームを小型化し得る。適切には、リポソームは、０．０２～５μｍ、例えば＜０．４μｍの域にあるサイズを有し得る。
【0148】
方法Ａによって獲得可能なリポソームは、血液因子の高い搭載を示す。
【0149】
本発明の組成物は、方法Ａの工程ｃ）またはｄ）のいずれかの画分の単離によって獲得可能な中間産物でもあり得る。したがって、本発明の製剤は、分散体の形態の、水中に方法Ａの工程ｅ）の産物を取り込ませた後に獲得可能な水性分散体も含む（水性媒体中のリポソーム）。
【0150】
代替的に、本発明の医薬組成物は、方法Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと称される以下の方法によっても獲得可能である。
方法Ｂ
この方法も、方法Ａの工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を含む。しかしながら、方法Ａの工程ｄ）およびｅ）は省かれる。
方法Ｃ
方法Ｃでは、方法Ａの工程ｄ）は、凍結および融解サイクルによって置き換えられ、それは少なくとも２回反復される必要がある。この工程は、リポソームを産生する先行技術において周知である。
方法Ｄ
方法Ｄは、いかなる浸透性構成要素の使用も除外する。小胞の調製の工程である方法Ｄでは、搭載される対象となる物質の実質的に塩不含の溶液を混ぜる工程、およびこのようにして獲得された画分を共乾燥する工程を伴う。
方法Ｅ
方法Ｅは、上で記載される方法Ａ～Ｄよりも簡単である。それは、ｔｅｒｔ－ブタノール等の極性プロトン性水混和性溶媒に、リポソーム調製に使用される化合物（脂質酸化防止剤等）を溶解する工程を要する。次いで、この溶液を、血液因子を含有する水溶液または分散体と混合する。混合は、作用物質の生物学的および薬理学的活性を維持するために要される最適な容積比で実施される。
方法Ｂ
この方法も、方法Ａの工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を含む。しかしながら、方法Ａの工程ｄ）およびｅ）は省かれる。
方法Ｃ
方法Ｃでは、方法Ａの工程ｄ）は、凍結および融解サイクルによって置き換えられ、それは少なくとも２回反復される必要がある。この工程は、リポソームを産生する先行技術において周知である。
方法Ｄ
方法Ｄは、いかなる浸透性構成要素の使用も除外する。小胞の調製の工程である方法Ｄでは、搭載される対象となる物質の実質的に塩不含の溶液を混ぜる工程、およびこのようにして獲得された画分を共乾燥する工程を伴う。
方法Ｅ
方法Ｅは、上で記載される方法Ａ～Ｄよりも簡単である。それは、ｔｅｒｔ－ブタノール等の極性プロトン性水混和性溶媒に、リポソーム調製に使用される化合物（脂質酸化防止剤等）を溶解する工程を要する。次いで、この溶液を、血液因子を含有する水溶液または分散体と混合する。混合は、作用物質の生物学的および薬理学的活性を維持するために要される最適な容積比で実施される。
【0151】
次いで、混合物を、凍結保護剤の存在または不在下で凍結乾燥する。リポソーム製剤の使用前に、再水和が要される。これらのリポソームは多重層であり、それらの小型化は、ＷＯ９５／０４５２４に記載される方法の１つによって達成され得る。
【0152】
本発明の第１の態様の対象における血友病Ａの治療における使用のための組成物は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある対象に使用され得る。本発明の第１の態様の対象における血友病Ａの治療における使用のための組成物は、外在的に投与された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する免疫応答を開始するまたは生成する対象に使用され得る。本発明の第１の態様の対象における血友病Ａの治療における使用のための組成物は、外在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を用いた治療、すなわち第ＶＩＩＩ因子療法に抵抗性である対象に使用され得る。別のやり方で表現すると、本発明の第１の態様の対象における血友病Ａの治療における使用のための組成物は、ＦＶＩＩＩに対する阻害剤（抗体）に試験で陽性を示している対象に使用され得る。本発明を踏まえて、患者は、それゆえ、本発明に従った治療の前に、ＦＶＩＩＩ阻害剤（ＦＶＩＩＩに対する抗体）の存在について試験され得る。任意選択で、それゆえ、本発明に従った治療の方法は、本明細書に規定される組成物を用いて対象を治療する工程の前に、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体の生成について対象を試験する工程を含み得る。
【0153】
適切には、対象を免疫負荷アッセイにおいて試験して、対象が、外在的に投与された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する免疫応答を開始するかどうかを判定し得る。漸増量の外在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を、規定された回数の曝露にわたって対象に投与して、対象が、外在的に投与された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する免疫応答を開始するかどうかを判定し得、例えば、外在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）への曝露の回数は５０回以下の曝露であり得る。漸増量の外在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、滴定曲線の一部、すなわち５０回の曝露にわたって投与された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の量として計算され得る。
【0154】
本発明の第１の態様の対象における血友病Ａの治療における使用のための組成物は、小児対象に使用され得る。小児患者は、出生～１８歳の集団のその部分として欧州連合（ＥＵ）において定義される。小児集団は、いくつかのサブセットを包含する。小児患者の適用される年齢分類は：
・０～２７日間の満期前および満期新生児；
・１カ月～２３カ月の乳児（または幼児）；
・２歳～１１歳の子ども；および
・１２～１８歳未満の青少年。
（ｈｔｔｐ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｈｅａｌｔｈ／ｓｉｔｅｓ／ｈｅａｌｔｈ／ｆｉｌｅｓ／ｆｉｌｅｓ／ｅｕｄｒａｌｅｘ／ｖｏｌ－１／２０１４ ｃ３３８ ０１／２０１４ ｃ３３８ ０１ ｅｎ．ｐｄｆを参照されたい）。
・０～２７日間の満期前および満期新生児；
・１カ月～２３カ月の乳児（または幼児）；
・２歳～１１歳の子ども；および
・１２～１８歳未満の青少年。
（ｈｔｔｐ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｈｅａｌｔｈ／ｓｉｔｅｓ／ｈｅａｌｔｈ／ｆｉｌｅｓ／ｆｉｌｅｓ／ｅｕｄｒａｌｅｘ／ｖｏｌ－１／２０１４ ｃ３３８ ０１／２０１４ ｃ３３８ ０１ ｅｎ．ｐｄｆを参照されたい）。
【0155】
血友病は、先天性血友病Ａ（ｃＨＡ）または後天性血友病Ａ（ａＨＡ）であり得る。先天性血友病は、凝血第ＶＩＩＩ因子の不在または低下したレベルによって特徴付けられる遺伝性出血性障害である。後天性血友病は、出血のいかなる個人のまたは家族の病歴なく、個体において自己抗体阻害剤の突然の産生がある自己免疫病態である。身体は、血友病Ａにおいて内在性第ＶＩＩＩ因子に対する自己抗体を産生する。
【0156】
「阻害剤患者」とは、彼らの医療歴において、外在性の治療用血液因子の適用に応答して阻害性抗体（「阻害剤」）を発生させたことがある者（先天性血友病の場合）、または彼ら自身の内在性ＦＶＩＩＩに対して阻害剤を発生させたことがある者（後天性血友病の場合）として定義される。彼らは、阻害剤を有してまたは有しないで現在存在し得るが、後者の場合には、ＩＴＩによりおそらく寛容化されておらず、ＦＶＩＩＩを再提示された場合に依然として阻害剤を生成し得るであろう。そのような対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）療法に対して非ナイーブである患者であるとも見なされ得る。
【0157】
阻害剤患者は、５ベセスダ単位未満のＦＶＩＩＩ阻害剤（抗体）活性を有し得る。患者の血中の抗体阻害剤は、ベセスダ法を使用して定量され、患者における阻害剤のレベルについて話す場合、専門的には「ベセスダ単位」を共通して使用する。５ベセスダ単位を上回る値のＦＶＩＩＩ阻害剤は、高力価の阻害剤と見なされる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｅｎ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ－ｈｕｍａｎ－ｐｌａｓｍａ－ｄｅｒｉｖｅｄ－ｆａｃｔｏｒ－ｖｉｉｉ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ｒｅｖｉｓｉｏｎ－２＿ｅｎ．ｐｄｆを参照されたい）。
【0158】
本発明の第１の態様の対象における血友病Ａの治療における使用のための組成物は、５ベセスダ単位を上回るまたはそれに等しいＦＶＩＩＩ阻害剤（抗体）活性を有する対象にも使用され得る。本発明の第１の態様の対象における血友病Ａの治療における使用のための組成物は、５ベセスダ単位未満のＦＶＩＩＩ阻害剤（抗体）活性を有する対象にも使用され得る。
【0159】
ベセスダ単位（ＢＵ）は、血液凝固阻害剤活性の尺度である。実践的止血によれば、「１ベセスダ単位（Ｂｕ）とは、３７℃における２時間のインキュベーション後の正常血漿における１単位の第ＶＩＩＩ因子：Ｃの５０％を中和するであろう、血漿サンプルにおける阻害剤の量として定義される」（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｈａｒｏｌｄ Ｒｏｂｅｒｔ（２０００）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、５８３頁）。１単位の第ＶＩＩＩ因子は、１ＩＵ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子に等しい。
【0160】
ベセスダアッセイは、試験血漿の希釈後に残る残留ＦＶＩＩＩ活性を測定することに基づく。アッセイは、３７℃で２時間インキュベートされた、試験血漿および正常血漿の試験混合物と、正常血漿および緩衝液の対照混合物との比較を要する。試験混合物における残留活性パーセントは、ベセスダ単位（ＢＵ）に変換される。
【0161】
ベセスダアッセイは、以下のとおりに実施される：
１．試験（患者）血漿の倍加希釈［通常１／２～１／１０２４］を、イミダゾール緩衝生理食塩水において作製し、等容積の正常血漿プールと３７℃でインキュベートする。ナイメゲン変法では、患者血漿の希釈は、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿において作製される。
２．イミダゾール緩衝生理食塩水（または、ナイメゲン変法の場合、免疫枯渇した第ＶＩＩＩ因子欠損血漿）と混合された等容積の正常血漿からなる対照混合物を調製する。正常血漿プールは、約１００％［１００ＩＵ／ｄＬ］の第ＶＩＩＩ因子を含有するであろう。この混合物は、実際には、５０％［５０ＩＵ／ｄＬ］の第ＶＩＩＩ因子の開始濃度を有する（緩衝液を用いた５０：５０希釈を実施しているため）が、これは、同じ供給源および容積がすべてのインキュベーション混合物に添加されるため問題ではない。対照の使用は、インキュベーション期間の間の第ＶＩＩＩおよびＶ因子の劣化を補う。
３．インキュベーション期間の終わりに、残留第ＶＩＩＩ因子を、インキュベートされた対照を１００％［１００ＩＵ／ｄＬ］標準物質として使用した、標準的１段階ＡＰＴＴベースのアッセイを使用してアッセイする。
４．阻害剤濃度を、残留第ＶＩＩＩ因子活性対阻害剤単位のグラフから計算する。５０％に最も近いが３０～６０％域内にある残留第ＶＩＩＩ因子を与える試験血漿の希釈を、阻害剤の計算に選定する。各希釈に対する阻害剤力価を計算し、平均を取ることも可能である。＜２５％［２５ＩＵ／ｄＬ］または＞７５％［７５ＩＵ／ｄＬ］のいかなる残留第ＶＩＩＩ因子も、阻害剤レベルの計算に使用されるべきではない。
５．残留第ＶＩＩＩ因子活性が８０～１００％［８０～１００ＩＵ／ｄＬ］にある場合、サンプルは阻害剤を含有しない。
６．グラフから阻害剤力価を導き出し、希釈を掛けて最終力価を与える。既知の阻害剤力価の陽性対照血漿が含まれるべきである。
１．試験（患者）血漿の倍加希釈［通常１／２～１／１０２４］を、イミダゾール緩衝生理食塩水において作製し、等容積の正常血漿プールと３７℃でインキュベートする。ナイメゲン変法では、患者血漿の希釈は、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿において作製される。
２．イミダゾール緩衝生理食塩水（または、ナイメゲン変法の場合、免疫枯渇した第ＶＩＩＩ因子欠損血漿）と混合された等容積の正常血漿からなる対照混合物を調製する。正常血漿プールは、約１００％［１００ＩＵ／ｄＬ］の第ＶＩＩＩ因子を含有するであろう。この混合物は、実際には、５０％［５０ＩＵ／ｄＬ］の第ＶＩＩＩ因子の開始濃度を有する（緩衝液を用いた５０：５０希釈を実施しているため）が、これは、同じ供給源および容積がすべてのインキュベーション混合物に添加されるため問題ではない。対照の使用は、インキュベーション期間の間の第ＶＩＩＩおよびＶ因子の劣化を補う。
３．インキュベーション期間の終わりに、残留第ＶＩＩＩ因子を、インキュベートされた対照を１００％［１００ＩＵ／ｄＬ］標準物質として使用した、標準的１段階ＡＰＴＴベースのアッセイを使用してアッセイする。
４．阻害剤濃度を、残留第ＶＩＩＩ因子活性対阻害剤単位のグラフから計算する。５０％に最も近いが３０～６０％域内にある残留第ＶＩＩＩ因子を与える試験血漿の希釈を、阻害剤の計算に選定する。各希釈に対する阻害剤力価を計算し、平均を取ることも可能である。＜２５％［２５ＩＵ／ｄＬ］または＞７５％［７５ＩＵ／ｄＬ］のいかなる残留第ＶＩＩＩ因子も、阻害剤レベルの計算に使用されるべきではない。
５．残留第ＶＩＩＩ因子活性が８０～１００％［８０～１００ＩＵ／ｄＬ］にある場合、サンプルは阻害剤を含有しない。
６．グラフから阻害剤力価を導き出し、希釈を掛けて最終力価を与える。既知の阻害剤力価の陽性対照血漿が含まれるべきである。
【0162】
血液凝固カスケードにおける活性のレベルは、任意の適切なアッセイ、例えば全血凝固時間（ＷＢＣＴ）試験、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、またはＲＯＴＥＭによって測定され得る。１段階および２段階／発色アッセイにおいて、主にアッセイ方法は分光光度法を伴い、そのためサンプルは透明である必要があるため、血液サンプルは、細胞断片を除去するために遠心分離によって調製される必要がある。下の包括的な凝血アッセイは、凝血の物理的形成の時間経過を査定し、ゆえに、凝血に寄与するすべての構成要素、例えば血小板が含まれることから、「本物の生命体」により近い。
【0163】
全血凝固時間（ＷＢＣＴ）試験は、全血が、外部環境、通常ガラスチューブまたはディッシュにおいて凝血を形成するのにかかる時間を測定する。ＷＢＣＴは、回収の直後に採取され、２本のガラスチューブに分けられた２ｍｌの全血を用いて査定され得る。これら２本のチューブを、次いで３７℃の水槽に置き、穏やかに傾転させることによっておよそ２０～３０秒ごとにチェックする。チューブを水平に転倒させることができ、血漿の流出がなく、固形の凝血が保持される場合、凝血が判定される。
【0164】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験は、凝血経路の一部のパラメーターを測定する。それは、血友病においておよび静脈内ヘパリン療法によって異常に上昇する。ＡＰＴＴは、静脈由来の数ミリリットルの血液を要する。ＡＰＴＴ時間は、「内因性経路」として公知の凝血系の一部についての尺度である。ＡＰＴＴ値は、検査室試験において生じる特異的凝血過程に関する秒単位の時間である。この結果は、正常血液の「対照」サンプルと必ず比較される。試験サンプルが、対照サンプルよりも長くかかる場合、それは、内因性経路における凝血機能の減少を示す。一般的な内科療法は、通常、４５～７０秒間の規模のＡＰＴＴの域を目指すが、値は、試験対正常の比、例えば正常の１．５倍としても表現され得る。ヘパリン治療の不在下における高いＡＰＴＴは、血友病に起因し得、それはさらなる試験を要し得る。
【0165】
ＲＯＴＥＭ（回転式トロンボエラストメトリー）は、ＲＯＴＥＭ Ｄｅｌｔａ ２．７．２システムを使用して、ＮＡＴＥＭアッセイにより血液サンプルの凝固能を査定する（再石灰化のみによって活性化される）。測定に関しては、２０ｕＬのＣａＣｌ２および３４０ｕＬのクエン酸全血サンプルを装置に置く。アッセイは、新たな血液サンプルを採取した１５分以内に実施される。アッセイは、他の中でも凝血時間（ＣＴ－血液が凝血を始める時間）、凝血形成時間（ＣＦＴ－最大凝血硬度までの時間）を含めた、凝血の形成の間に多数の統計値をもたらす。
【0166】
本発明は、対象が、２０分間未満、１５分間未満、または適切には１２分間未満の全血凝固時間を維持することを可能にする組成物を提供する。
【0167】
以下は、ＦＶＩＩＩ濃度を査定するための発色アッセイ（「２段階アッセイ」と呼ばれることもある）を記載する。
【0168】
ＦＶＩＩＩ血漿活性は、以下のような供給された方法の修正を有して、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｍａｔｉｃ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ、Ｋ８２２５８５）を使用して判定され得る：
ｉ．血漿サンプル希釈との比較可能性をもたらすための、ＦＶＩＩＩ標準物質調製におけるある量のナイーブ血漿の内包、
ｉｉ．各試験品目に特異的なＦＶＩＩＩ標準物質の使用（Ｎｕｗｉｑ（商標）またはＦａｃｔａｎｅ（商標））、
ｉｉｉ．２つの標準曲線域内への付加的なＦＶＩＩＩ活性値の内包。
Ｎｕｗｉｑ（商標）およびＦａｃｔａｎｅ（商標）ＦＶＩＩＩ標準物質ストック溶液の調製：
各試験品目のバイアルは、精製水で１００ＩＵ／ｍｌに再構成され得、－７０℃にて小さなアリコートで冷凍されて保管され得、アリコートは、アッセイの日に３７℃で融解され得る。調査試験品目に適当なストック溶液が、対応する血漿サンプルの分析に使用される。
ｉ．血漿サンプル希釈との比較可能性をもたらすための、ＦＶＩＩＩ標準物質調製におけるある量のナイーブ血漿の内包、
ｉｉ．各試験品目に特異的なＦＶＩＩＩ標準物質の使用（Ｎｕｗｉｑ（商標）またはＦａｃｔａｎｅ（商標））、
ｉｉｉ．２つの標準曲線域内への付加的なＦＶＩＩＩ活性値の内包。
Ｎｕｗｉｑ（商標）およびＦａｃｔａｎｅ（商標）ＦＶＩＩＩ標準物質ストック溶液の調製：
各試験品目のバイアルは、精製水で１００ＩＵ／ｍｌに再構成され得、－７０℃にて小さなアリコートで冷凍されて保管され得、アリコートは、アッセイの日に３７℃で融解され得る。調査試験品目に適当なストック溶液が、対応する血漿サンプルの分析に使用される。
【0169】
概略的アッセイ方法は、以下のとおりであった：
１．Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｓｍａ（ｎａｔｉｖｅ；Ｄｉａｐｈａｒｍａ ５１５４００７）のバイアルを、１ｍｌ精製水中で新たに再構成した、
２．０．９９０ｍＬ ＦＶＩＩＩ欠損血漿への０．０１０ｍＬの適当なＦＶＩＩＩ標準物質ストック溶液（１００ＩＵ／ｍｌ）の添加によって、ＦＶＩＩＩ標準物質ワーキングストック溶液（１ＩＵ／ｍＬ）を新たに調製した、
３．ＣｏａｍａｔｉｃキットＦａｃｔｏｒ試薬、Ｓ－２７６５＋Ｉ－２５８１基質、および緩衝液ワーキング溶液を、キット使用説明書に従って調製し、３７℃に予熱した、
４．２０％酢酸停止溶液を調製した、
５．調査サンプルに適当なＦＶＩＩＩ域を使用して、ＦＶＩＩＩワーキングストック溶液（１ＩＵ／ｍｌ）から標準曲線を作成した（表１および２を参照されたい）、
６．各試験血漿サンプルの１つのアリコートを、３７℃で急速に融解した。
７．２５μｌの融解された試験血漿サンプルを、２０００μｌの緩衝液ワーキング溶液で希釈した。
８．５０μｌの希釈されたＦＶＩＩＩ標準物質および希釈された試験血漿サンプルを、プレートマップに従って９６ウェルプレートのウェルに添加し、３７℃で４分間インキュベートした。
９．５０μＩのＦａｃｔｏｒ試薬を各ウェルに添加し、３７℃で２分間（高域の標準曲線）または３７℃で４分間（低域の標準曲線）インキュベートした。
１０．５０μｌのＳ－２７６５＋Ｉ－２５８１基質を各ウェルに添加し、３７℃で２分間（高域の標準曲線）または３７℃で１０分間（低域の標準曲線）インキュベートした。
１１．５０μｌの２０％酢酸停止溶液を各ウェルに添加した。ウェル内の色はわずかに黄色になり、光学密度を吸光度４０５ｎｍでマイクロプレートリーダーによって測定した。
１２．最良にフィットした線形曲線を使用して、ＦＶＩＩＩ標準物質活性（ＩＵ／ｍｌ）を４０５ｎｍにおける吸光度に対してプロットした。
１３．試験血漿サンプル吸光度を標準曲線に対して読み取り、ＦＶＩＩＩ活性をＩＵ／ｍｌ単位で報告した。
１４．平均（および、個々の調査において示される場合には中央値）ＦＶＩＩＩ活性結果を、各時点における３つのマウス試験血漿サンプルから計算し、データを薬物動態学的分析に供した。
１．Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｓｍａ（ｎａｔｉｖｅ；Ｄｉａｐｈａｒｍａ ５１５４００７）のバイアルを、１ｍｌ精製水中で新たに再構成した、
２．０．９９０ｍＬ ＦＶＩＩＩ欠損血漿への０．０１０ｍＬの適当なＦＶＩＩＩ標準物質ストック溶液（１００ＩＵ／ｍｌ）の添加によって、ＦＶＩＩＩ標準物質ワーキングストック溶液（１ＩＵ／ｍＬ）を新たに調製した、
３．ＣｏａｍａｔｉｃキットＦａｃｔｏｒ試薬、Ｓ－２７６５＋Ｉ－２５８１基質、および緩衝液ワーキング溶液を、キット使用説明書に従って調製し、３７℃に予熱した、
４．２０％酢酸停止溶液を調製した、
５．調査サンプルに適当なＦＶＩＩＩ域を使用して、ＦＶＩＩＩワーキングストック溶液（１ＩＵ／ｍｌ）から標準曲線を作成した（表１および２を参照されたい）、
６．各試験血漿サンプルの１つのアリコートを、３７℃で急速に融解した。
７．２５μｌの融解された試験血漿サンプルを、２０００μｌの緩衝液ワーキング溶液で希釈した。
８．５０μｌの希釈されたＦＶＩＩＩ標準物質および希釈された試験血漿サンプルを、プレートマップに従って９６ウェルプレートのウェルに添加し、３７℃で４分間インキュベートした。
９．５０μＩのＦａｃｔｏｒ試薬を各ウェルに添加し、３７℃で２分間（高域の標準曲線）または３７℃で４分間（低域の標準曲線）インキュベートした。
１０．５０μｌのＳ－２７６５＋Ｉ－２５８１基質を各ウェルに添加し、３７℃で２分間（高域の標準曲線）または３７℃で１０分間（低域の標準曲線）インキュベートした。
１１．５０μｌの２０％酢酸停止溶液を各ウェルに添加した。ウェル内の色はわずかに黄色になり、光学密度を吸光度４０５ｎｍでマイクロプレートリーダーによって測定した。
１２．最良にフィットした線形曲線を使用して、ＦＶＩＩＩ標準物質活性（ＩＵ／ｍｌ）を４０５ｎｍにおける吸光度に対してプロットした。
１３．試験血漿サンプル吸光度を標準曲線に対して読み取り、ＦＶＩＩＩ活性をＩＵ／ｍｌ単位で報告した。
１４．平均（および、個々の調査において示される場合には中央値）ＦＶＩＩＩ活性結果を、各時点における３つのマウス試験血漿サンプルから計算し、データを薬物動態学的分析に供した。
【0170】
ＦＶＩＩＩ濃度を査定するためのさらなる試験は、以下のものを含む：
発色性ＦＶＩＩＩ活性アッセイ
Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩＩ：ＣアッセイキットＲｅｆ＃２２１４０６を、アッセイ緩衝液に１：１０で希釈された血漿サンプルとともに使用し、Ｎｕｗｉｑ（商標）およびヒト血漿参照標準曲線の両方に対してランした。各曲線を、イヌＦＶＩＩＩ欠損血漿の連続希釈、次いでアッセイ緩衝液における１：１０希釈によって作成した。両曲線における標準域は０．００３～０．４Ｕ／ｍＬであり、線形域は０．１３～１．００Ｕ／ｍＬであった。アッセイをキットプロトコールのとおりに実施した。
１段階第ＶＩＩＩ因子アッセイ－Ｓｉｅｍｅｎｓ ＢＣＳ－ＸＰシステム
２．５％イヌＦＶＩＩＩ欠損血漿を含有するオーレンベロナール緩衝液に希釈された正常イヌプール血漿を使用して作成されたイヌＦＶＩＩＩ参照曲線に対して、サンプルを測定した。曲線の域は５～２００％である。血漿サンプルをオーレンベロナール緩衝液に１：１０で希釈し、ＦＶＩＩＩ欠損血漿と混合し、次いでＡｃｔｉｎ ＦＳを添加した。３分間のインキュベーションの後、ＣａＣｌ２での活性化を開始し、凝血するまでの時間を４０５ｎｍで測定した。
発色性ＦＶＩＩＩ活性アッセイ
Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩＩ：ＣアッセイキットＲｅｆ＃２２１４０６を、アッセイ緩衝液に１：１０で希釈された血漿サンプルとともに使用し、Ｎｕｗｉｑ（商標）およびヒト血漿参照標準曲線の両方に対してランした。各曲線を、イヌＦＶＩＩＩ欠損血漿の連続希釈、次いでアッセイ緩衝液における１：１０希釈によって作成した。両曲線における標準域は０．００３～０．４Ｕ／ｍＬであり、線形域は０．１３～１．００Ｕ／ｍＬであった。アッセイをキットプロトコールのとおりに実施した。
１段階第ＶＩＩＩ因子アッセイ－Ｓｉｅｍｅｎｓ ＢＣＳ－ＸＰシステム
２．５％イヌＦＶＩＩＩ欠損血漿を含有するオーレンベロナール緩衝液に希釈された正常イヌプール血漿を使用して作成されたイヌＦＶＩＩＩ参照曲線に対して、サンプルを測定した。曲線の域は５～２００％である。血漿サンプルをオーレンベロナール緩衝液に１：１０で希釈し、ＦＶＩＩＩ欠損血漿と混合し、次いでＡｃｔｉｎ ＦＳを添加した。３分間のインキュベーションの後、ＣａＣｌ２での活性化を開始し、凝血するまでの時間を４０５ｎｍで測定した。
【0171】
上で記載される第２の態様によれば、対象における血友病Ａを治療する方法は、コロイド粒子を含む組成物を投与する工程を含む。コロイド粒子は、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質を含む。第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む。対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある。
【0172】
生体適合性親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸からなる群から選択され得、好ましくは、生体適合性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは、約５００～約５０００ダルトン、好ましくはおよそ２０００ダルトンまたは５０００ダルトンの分子量を有し得る。
【0173】
ホスファチジルコリン（ＰＣ）は、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）であり得る。
【0174】
第２の両親媒性脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）またはＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００）等のＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）であり得る。
【0175】
コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。
【0176】
組成物は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子をさらに含み得る。代替的に、方法は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子を含む組成物を別個にまたは後続して投与するさらなる工程を含み得る。
【0177】
コロイド粒子および第ＶＩＩＩ因子を含む組成物は、治療レジメンの一部として投与され得る。コロイド粒子および第ＶＩＩＩ因子を含む組成物は、適切には、２～２１日間、４～１４日間、４～７日間等、２、３、４、５、６、７、１４、２１日ごとに、ＦＶＩＩＩの血中濃度を一貫したレベルで維持させる間隔で投与され得かつ／または再投薬され得、患者の血中におけるＦＶＩＩＩの濃度が、治療量以下のまたは治療上非関連のレベルに到達するまで再投薬するのを待つ必要なく、継続的で、一定で、かつ予測可能な治療効果を提供する。
【0178】
そのような治療レジメンは、血友病Ａに罹患した患者を治療するために要されるＦＶＩＩＩの量を低下させる。
【0179】
血友病は、先天性血友病Ａ（ｃＨＡ）または後天性血友病Ａ（ａＨＡ）であり得る。
【0180】
対象は小児患者であり得る。
【0181】
本発明は、対象における血友病Ａの治療のための医薬の製造における、コロイド粒子を含む組成物の使用であって、対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある、使用も含む。
【0182】
上で記載される第３の態様によれば、キットは、対象における血友病Ａの治療における使用のための、（ｉ）コロイド粒子を含む組成物、および（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子を含む組成物を含む。対象は、重大な内因性血液因子に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある。コロイド粒子は、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質から構成される。第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む。
【0183】
本発明の凍結乾燥製剤は、同様に提供される適切な希釈剤、アジュバント、または賦形剤、例えば生理学的に許容される緩衝剤と併せて、別個の剤形として供給され得る。キットのコロイド粒子および／または第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、凍結乾燥製剤として提供され得る。代替的に、キットの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は凍結乾燥製剤として提供され得、コロイド粒子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の再構成のための溶液として提供され得る。本明細書に記載されるように、そのような組成物は、別個の剤形として第ＶＩＩＩ因子を付加的に含み得る、または本明細書に記載されるコロイド粒子とともに製剤化され得る。凍結乾燥形態は、５００ＩＵバイアルで提供され得る。キットのコロイド粒子および／または第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、すぐに使用できる水性形態で提供され得る。
【0184】
コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。
【0185】
キットは、任意選択で、使用のための使用説明書も含む。
【0186】
上で記載される第４の態様によれば、キットは、対象における血友病Ａの治療における別個の、同時の、または後続の使用のための、（ｉ）コロイド粒子を含む組成物、および（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子を含む組成物を含む。対象は、重大な内因性血液因子に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある。コロイド粒子は、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質から構成される。第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む。
【0187】
本発明の凍結乾燥製剤は、同様に提供される適切な希釈剤、アジュバント、または賦形剤、例えば生理学的に許容される緩衝剤と併せて、別個の剤形として供給され得る。キットのコロイド粒子および／または第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、凍結乾燥製剤として提供され得る。代替的に、キットの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は凍結乾燥製剤として提供され得、コロイド粒子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の再構成のための溶液として提供され得る。本明細書に記載されるように、そのような組成物は、別個の剤形として第ＶＩＩＩ因子を付加的に含み得る、または本明細書に記載されるコロイド粒子とともに製剤化され得る。凍結乾燥形態は、５００ＩＵバイアルで提供され得る。キットのコロイド粒子および／または第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、すぐに使用できる水性形態で提供され得る。
【0188】
コロイド粒子は、（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。
【0189】
キットは、任意選択で、使用のための使用説明書も含む。
【0190】
上で記載される第５の態様によれば、医薬組成物の剤形は、対象における血友病の治療における使用のための、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびに（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質を含むコロイド粒子を含み、前記第２の両親媒性脂質は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を含む。対象は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある。
【0191】
コロイド粒子は、非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。
【0192】
剤形は、患者に対する適当な用量を含有する適切な容器またはバイアルとして、例えば２５０ＩＵ、５００ＩＵ、７５０ＩＵ、または１０００ＩＵバイアルとして提供され得る。剤形は、錠剤としてまたは液体形態でも提供され得る。剤形は、凍結乾燥形態にもあり得る。
【0193】
本発明によって実証される驚くべき技術的効果は、免疫応答、および抗ＦＶＩＩＩ抗体の後続の産生を通常では誘発するであろう、ＦＶＩＩＩのエピトープを覆うことによって達成される。
【0194】
理論によって拘束されることを望むことなく、これらの利益は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインへのＰＥＧＬｉｐの非共有結合的結び付きに由来し、ゆえに、身体の免疫系による認識から、ＦＶＩＩＩの軽鎖ドメインにおけるエピトープを守り；かつ／または樹状細胞によるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスを阻止すると考えられる。
【0195】
この効果は、組み換えＦＶＩＩＩ分子においてより顕著であり、それは、野生型ＦＶＩＩＩにおけるこれらのエピトープを天然には保護するであろうＶＷＦとともに典型的には投与されない。
【0196】
エピトープの保護に加えて、ＰＥＧＬｉｐとの結び付きは、通常のタンパク質分解クリアランスメカニズムからＦＶＩＩＩを保護することによってＦＶＩＩＩの半減期を延長もし得、投薬間隔を延長し、経時的なＦＶＩＩＩへの患者の総曝露を低下させる。
【0197】
驚くべき観察結果は、以下のとおり記載される：
臨床試験を立案して、阻害剤を有する患者におけるＰＥＧＬｉｐ＋ＦＶＩＩＩの使用を検討し、組合せは、既存の抗体がＦＶＩＩＩを攻撃するのを阻止するであろうと期待した。既存の抗体を有する患者と同様に、ＦＶＩＩＩを提示された場合に抗体を発生させた病歴を有するが、現在は抗体を呈していない一部の患者が含まれた。
臨床試験を立案して、阻害剤を有する患者におけるＰＥＧＬｉｐ＋ＦＶＩＩＩの使用を検討し、組合せは、既存の抗体がＦＶＩＩＩを攻撃するのを阻止するであろうと期待した。既存の抗体を有する患者と同様に、ＦＶＩＩＩを提示された場合に抗体を発生させた病歴を有するが、現在は抗体を呈していない一部の患者が含まれた。
【0198】
これらの患者は、１５：１～１６：１のコロイド粒子対ＦＶＩＩＩ分子比を有するＰＥＧＬｉｐ＋ＦＶＩＩＩ組合せを提示された場合に、新しい抗体を発生させないことが驚くべきことに見出され、ＰＥＧＬｉｐは、樹状／Ｂ細胞からエピトープを守り得、かつ／またはＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスを阻止し得ることを暗示した。
【0199】
１５：１～１６：１のコロイド粒子対ＦＶＩＩＩ分子比を有する対照としてのＰＥＧＬｉｐ＋ヒトＦＶＩＩＩを用いたＩＶ投薬を伴って、血友病Ａイヌにおいても実験を行った。動物の免疫系は、天然には、抗体を産生することによって外来（ヒト）タンパク質に対して反応することから、そのような実験は通常困難である。驚くべきことに、この場合、動物は、それがＰＥＧＬｉｐの存在下で投与された場合、ヒトタンパク質に対する抗体を産生しなかった。
【0200】
本発明に従って、以下のサンプルを作製しかつ試験する：
１．ＰＥＧはＰＥＧ－２０００である、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ対ＰＯＰＣのより高い比を含む一連のコロイド粒子（ＰＥＧＬｉｐ）。
２．ＰＥＧはＰＥＧ－５０００である、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ対ＰＯＰＣの比を含む一連のコロイド粒子（ＰＥＧＬｉｐ）。
３．ポリソルベート８０をさらに含む、ポイント１．およびポイント２．に従ったコロイド粒子。
４．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ対ＰＯＰＣのより高い比および／または高い分子量ＰＥＧを含む一連のコロイド粒子（Ｆ－ＰＥＧＬｉｐ）。
１．ＰＥＧはＰＥＧ－２０００である、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ対ＰＯＰＣのより高い比を含む一連のコロイド粒子（ＰＥＧＬｉｐ）。
２．ＰＥＧはＰＥＧ－５０００である、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ対ＰＯＰＣの比を含む一連のコロイド粒子（ＰＥＧＬｉｐ）。
３．ポリソルベート８０をさらに含む、ポイント１．およびポイント２．に従ったコロイド粒子。
４．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ対ＰＯＰＣのより高い比および／または高い分子量ＰＥＧを含む一連のコロイド粒子（Ｆ－ＰＥＧＬｉｐ）。
【0201】
ある特定の実施形態において、以下の製剤が提供される：
１５～１６：１製剤
１５～１６：１のＰＥＧＬｉｐ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比の、ＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＡＧ）とともに製剤化された、９％懸濁での５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００））から構成されたＰＥＧＬｉｐ粒子。
７～８：１製剤
７～８：１のＰＥＧＬｉｐ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比の、ＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＡＧ）とともに９％懸濁で製剤化された、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００））から構成されたＰＥＧＬｉｐ粒子。
１５～１６：１製剤
１５～１６：１のＰＥＧＬｉｐ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比の、ＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＡＧ）とともに製剤化された、９％懸濁での５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００））から構成されたＰＥＧＬｉｐ粒子。
７～８：１製剤
７～８：１のＰＥＧＬｉｐ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比の、ＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＡＧ）とともに９％懸濁で製剤化された、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００））から構成されたＰＥＧＬｉｐ粒子。
【0202】
代替的な実施形態において、以下の製剤が提供される：
１５～１６：１製剤
１５～１６：１のＰＥＧＬｉｐ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比の、ＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＡＧ）とともに製剤化された、９％懸濁での５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００））、および９：１ｗ／ｗ比（ＰＯＰＣ＋ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）：ポリソルベート８０）のポリソルベート８０から構成されたＰＥＧＬｉｐ粒子。
７～８：１製剤
７～８：１のＰＥＧＬｉｐ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比の、ＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＡＧ）とともに９％懸濁で製剤化された、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００））、および９：１ｗ／ｗ比（ＰＯＰＣ＋ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）：ポリソルベート８０）のポリソルベート８０から構成されたＰＥＧＬｉｐ粒子。
１５～１６：１製剤
１５～１６：１のＰＥＧＬｉｐ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比の、ＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＡＧ）とともに製剤化された、９％懸濁での５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００））、および９：１ｗ／ｗ比（ＰＯＰＣ＋ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）：ポリソルベート８０）のポリソルベート８０から構成されたＰＥＧＬｉｐ粒子。
７～８：１製剤
７～８：１のＰＥＧＬｉｐ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比の、ＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＡＧ）とともに９％懸濁で製剤化された、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００））、および９：１ｗ／ｗ比（ＰＯＰＣ＋ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）：ポリソルベート８０）のポリソルベート８０から構成されたＰＥＧＬｉｐ粒子。
【0203】
本発明の１つの特定の実施形態において、以下のような、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある対象における血友病Ａの治療における使用のための組成物が提供される：
・９７：３モル比（９：１ｗ／ｗ）の、ホスファチジルコリン部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびにホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質、例えば、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、またはより重いＰＥＧ化脂質の等価のモル比が使用される場合には重量補正比、例えば４：１～５：１のｗ／ｗ比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００）から構成されたコロイド粒子。
・緩衝剤等の希釈剤（適切には、生理学的に許容されるｐＨ、例えばｐＨ６．７の）、例えば、任意選択で５０ｍＭの濃度のクエン酸塩緩衝液。
・９７：３モル比（９：１ｗ／ｗ）の、ホスファチジルコリン部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびにホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質、例えば、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、またはより重いＰＥＧ化脂質の等価のモル比が使用される場合には重量補正比、例えば４：１～５：１のｗ／ｗ比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００）から構成されたコロイド粒子。
・緩衝剤等の希釈剤（適切には、生理学的に許容されるｐＨ、例えばｐＨ６．７の）、例えば、任意選択で５０ｍＭの濃度のクエン酸塩緩衝液。
【0204】
代替的な実施形態において、以下のような、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体阻害剤を以前に生成したことがある対象における血友病Ａの治療における使用のための組成物が提供される：
・９７：３モル比（９：１ｗ／ｗ）の、ホスファチジルコリン部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびにホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質、例えば、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、またはより重いＰＥＧ化脂質の等価のモル比が使用される場合には重量補正比、例えば４：１～５：１のｗ／ｗ比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００）から構成されたコロイド粒子。ポリオキシエチレンソルビタン、ポリヒドロキシエチレンステアレート、およびポリヒドロキシエチレンラウリルエーテルからなる群から選択される非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートをさらに含むコロイド粒子。
・緩衝剤等の希釈剤（適切には、生理学的に許容されるｐＨ、例えばｐＨ６．７の）、例えば、任意選択で５０ｍＭの濃度のクエン酸塩緩衝液。
・９７：３モル比（９：１ｗ／ｗ）の、ホスファチジルコリン部分を含む第１の両親媒性脂質、ならびにホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からなる群から選択されるリン脂質部分を含む第２の両親媒性脂質、例えば、９７：３モル比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、またはより重いＰＥＧ化脂質の等価のモル比が使用される場合には重量補正比、例えば４：１～５：１のｗ／ｗ比の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびＮ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００）から構成されたコロイド粒子。ポリオキシエチレンソルビタン、ポリヒドロキシエチレンステアレート、およびポリヒドロキシエチレンラウリルエーテルからなる群から選択される非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートをさらに含むコロイド粒子。
・緩衝剤等の希釈剤（適切には、生理学的に許容されるｐＨ、例えばｐＨ６．７の）、例えば、任意選択で５０ｍＭの濃度のクエン酸塩緩衝液。
【0205】
本発明の第２のおよび後続の態様に関する好ましい特質は、必要な変更を加えて、第１の態様に関するとおりである。
【0206】
本発明は、ここで、単なる例示の目的のために提示され、本発明に対する限定として解釈されるべきではない以下の実施例を参照して記載されるであろう。参照は、以下の図面に対してもなされる：
【図面の簡単な説明】
【0207】
【実施例】
【0208】
以下の実施例は、回転式トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）として公知の技法を使用して、凝血カスケードおよび凝血形成の様々なパラメーターを査定する。以下の略語が使用される。
【0209】
【表3】
【0210】
【表4】
【0211】
実施例１
阻害剤を含有する血友病血小板リッチなヒト血漿（ＰＲＰ）における、単独でのおよびＰＥＧＬｉｐ（ＰＬＰ－００）との組合せでの、ｒＦＶＩＩＩの凝血形成能の比較。
ＰＲＰモデルの調製：
血漿プールの調製
重度の血友病患者からの血漿アリコート（「ＳＨＰ」シングルドナー、２ｍｌ／アリコート）を３７℃で４分間融解し、プールした。阻害剤血漿をＳＨＰプールに添加して、１０ベセスダ単位（ＢＵ）／ｍｌの最終阻害剤濃度を有する阻害剤ＳＨＰ（Ｉ－ＳＨＰ）を調製した。一部の実験では、７ＢＵ／ｍｌを含有するドナー阻害剤血漿を、ＳＨＰにおけるさらなる希釈なしで使用した。
血小板洗浄
血小板濃縮物アリコート（０．５ｍｌ／チューブ）に、血小板活性化阻害剤（ＰＧＥ１－５０ｎｇ／ｍｌ、クエン酸５ｍＭ）を補給し、回転しながら１分間および室温（１５～２５℃）で静置して付加的な７分間インキュベートし、次いで室温で５分間８００ｇにて遠心分離した。血小板ペレットを、血小板活性化阻害剤を補給された４ｍｌリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、上記のように再遠心分離した。
阻害剤－ＰＲＰ（Ｉ－ＰＲＰ）モデルの調製
洗浄された血小板ペレットを、生理学的な数（２５０個の血小板／ｎＬ）まで阻害剤－ＳＨＰ（Ｉ－ＳＨＰ）に再懸濁して、阻害剤血小板リッチな血漿（Ｉ－ＰＲＰ）を作り出した。Ｉ－ＰＲＰアリコートをプールした。産物をＩ－ＰＲＰと１０分間インキュベートした実験に関しては、単一個体由来の阻害剤血漿（１４８ＢＵ／ｍｌ）を使用した。Ｉ－ＰＲＰへの３０分間の曝露がＲＯＴＥＧ分析に先行した実験に関しては、３人の異なるドナー由来の阻害剤血漿（１４８ＢＵ／ｍｌ、１０６ＢＵ／ｍｌ、および７ＢＵ／ｍｌ）を使用した。
結果：
実験（ａ）：この実験は、注射から少し経過した後の、阻害剤陽性血漿におけるＦＶＩＩＩ依存的凝固活性を調査した。Ｉ－ＰＲＰに、遊離ｒＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｂａｙｅｒ）またはＰＥＧＬｉＰ：ｒＦＶＩＩＩを、それぞれ１．０または１．５ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌ、２６：１および１７：１ ＰＥＧＬｉＰ粒子対ＦＶＩＩＩ分子でスパイクした。ＲＯＴＥＭ分析を１０分後に開始した。結果は表２に示される：
阻害剤を含有する血友病血小板リッチなヒト血漿（ＰＲＰ）における、単独でのおよびＰＥＧＬｉｐ（ＰＬＰ－００）との組合せでの、ｒＦＶＩＩＩの凝血形成能の比較。
ＰＲＰモデルの調製：
血漿プールの調製
重度の血友病患者からの血漿アリコート（「ＳＨＰ」シングルドナー、２ｍｌ／アリコート）を３７℃で４分間融解し、プールした。阻害剤血漿をＳＨＰプールに添加して、１０ベセスダ単位（ＢＵ）／ｍｌの最終阻害剤濃度を有する阻害剤ＳＨＰ（Ｉ－ＳＨＰ）を調製した。一部の実験では、７ＢＵ／ｍｌを含有するドナー阻害剤血漿を、ＳＨＰにおけるさらなる希釈なしで使用した。
血小板洗浄
血小板濃縮物アリコート（０．５ｍｌ／チューブ）に、血小板活性化阻害剤（ＰＧＥ１－５０ｎｇ／ｍｌ、クエン酸５ｍＭ）を補給し、回転しながら１分間および室温（１５～２５℃）で静置して付加的な７分間インキュベートし、次いで室温で５分間８００ｇにて遠心分離した。血小板ペレットを、血小板活性化阻害剤を補給された４ｍｌリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、上記のように再遠心分離した。
阻害剤－ＰＲＰ（Ｉ－ＰＲＰ）モデルの調製
洗浄された血小板ペレットを、生理学的な数（２５０個の血小板／ｎＬ）まで阻害剤－ＳＨＰ（Ｉ－ＳＨＰ）に再懸濁して、阻害剤血小板リッチな血漿（Ｉ－ＰＲＰ）を作り出した。Ｉ－ＰＲＰアリコートをプールした。産物をＩ－ＰＲＰと１０分間インキュベートした実験に関しては、単一個体由来の阻害剤血漿（１４８ＢＵ／ｍｌ）を使用した。Ｉ－ＰＲＰへの３０分間の曝露がＲＯＴＥＧ分析に先行した実験に関しては、３人の異なるドナー由来の阻害剤血漿（１４８ＢＵ／ｍｌ、１０６ＢＵ／ｍｌ、および７ＢＵ／ｍｌ）を使用した。
結果：
実験（ａ）：この実験は、注射から少し経過した後の、阻害剤陽性血漿におけるＦＶＩＩＩ依存的凝固活性を調査した。Ｉ－ＰＲＰに、遊離ｒＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｂａｙｅｒ）またはＰＥＧＬｉＰ：ｒＦＶＩＩＩを、それぞれ１．０または１．５ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌ、２６：１および１７：１ ＰＥＧＬｉＰ粒子対ＦＶＩＩＩ分子でスパイクした。ＲＯＴＥＭ分析を１０分後に開始した。結果は表２に示される：
【0212】
【表5】
【0213】
【表6】
【0214】
実験（ｂ）：この実験は、注射されたＦＶＩＩＩを阻害性抗体に長期間曝露した場合の、ＦＶＩＩＩ依存的凝固活性を調査した。Ｉ－ＰＲＰに、遊離ｒＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｂａｙｅｒ）またはＰＥＧＬｉＰ：ｒＦＶＩＩＩ（ＰＬＰ－００）を、それぞれ１．５または２．０ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌ、１７：１および１３：１ ＰＥＧＬｉＰ粒子対ＦＶＩＩＩ分子でスパイクした。３人の異なるドナー由来の阻害性血漿を使用した。
考察：
１０分後に査定した場合、ＰＥＧＬｉＰ：ｒＦＶＩＩＩ製剤は、ｒＦＶＩＩＩ単独よりも、凝血のより速い開始（ＣＴ、３３～４０％低下）、より速い増幅（ＣＦＴ、３４～３５％低下）、およびより硬くより良質な凝血（ＭＣＦ、１１～６７％増加）を示した。３０分後に査定した場合、ＰＥＧＬｉＰ：ｒＦＶＩＩＩ製剤は、ｒＦＶＩＩＩ単独よりも、凝血のより速い開始（ＣＴ、１３～２２％低下）、より速い増幅（ＣＦＴ、３４～５６％低下）、およびより硬くより良質な凝血（ＭＣＦ、８～１３％増加）を示した。凝血形成の速度の大きな増加（アルファ、８０～２７５％増加）は特に印象的であった。
考察：
１０分後に査定した場合、ＰＥＧＬｉＰ：ｒＦＶＩＩＩ製剤は、ｒＦＶＩＩＩ単独よりも、凝血のより速い開始（ＣＴ、３３～４０％低下）、より速い増幅（ＣＦＴ、３４～３５％低下）、およびより硬くより良質な凝血（ＭＣＦ、１１～６７％増加）を示した。３０分後に査定した場合、ＰＥＧＬｉＰ：ｒＦＶＩＩＩ製剤は、ｒＦＶＩＩＩ単独よりも、凝血のより速い開始（ＣＴ、１３～２２％低下）、より速い増幅（ＣＦＴ、３４～５６％低下）、およびより硬くより良質な凝血（ＭＣＦ、８～１３％増加）を示した。凝血形成の速度の大きな増加（アルファ、８０～２７５％増加）は特に印象的であった。
【0215】
より長いインキュベーション実験において、ＰＥＧＬｉＰは、複数の供給源由来の阻害に対してｒＦＶＩＩＩの効力を増加させた。
結論：
ＰＥＧＬｉＰおよびｒＦＶＩＩＩの組合せの使用は、以下によって例示されるように、ＦＶＩＩＩ単独よりも、ＦＶＩＩＩ阻害性抗体の存在下でより効率的な凝血形成をもたらす：
－ 凝血形成のより速い始まり
－ 凝血カスケードのより迅速な増幅
－ より良質でより強い凝血
－ これらの増強は、３０分後になおも明白である
－ これらの増強は、３つの異なる供給源由来の阻害剤に対して見られ、ＰＥＧＬｉＰが、広範なエピトープ特異性を有する抗体に対して有効であり、患者の幅広い集団においてその潜在的実用性を示すことを暗示する。
結論：
ＰＥＧＬｉＰおよびｒＦＶＩＩＩの組合せの使用は、以下によって例示されるように、ＦＶＩＩＩ単独よりも、ＦＶＩＩＩ阻害性抗体の存在下でより効率的な凝血形成をもたらす：
－ 凝血形成のより速い始まり
－ 凝血カスケードのより迅速な増幅
－ より良質でより強い凝血
－ これらの増強は、３０分後になおも明白である
－ これらの増強は、３つの異なる供給源由来の阻害剤に対して見られ、ＰＥＧＬｉＰが、広範なエピトープ特異性を有する抗体に対して有効であり、患者の幅広い集団においてその潜在的実用性を示すことを暗示する。
【0216】
実施例２
抗ＦＶＩＩＩ抗体を含有する全血における、ＰＥＧＬｉＰ－ｒＦＶＩＩＩおよび遊離ｒＦＶＩＩＩの全血凝固時間の比較。
抗ＦＶＩＩＩ抗体を含有する全血における、ＰＥＧＬｉＰ－ｒＦＶＩＩＩおよび遊離ｒＦＶＩＩＩの全血凝固時間の比較。
【0217】
この調査は、３つの別個の実験においてヒト全血を使用して、阻害剤を含有する全血における凝血効力を増強することにおけるＰＥＧＬｉＰ産物（ＰＬＰ－００）の有効性を検討した。これは、重要なことには、凝血カスケードのより多くの構成要素を付加し、後天性血友病のモデルをシミュレーションもする。３つの実験は：
ａ）阻害剤を含有する全血に添加されるＦＶＩＩＩの凝血能を増強するＰＥＧＬｉＰの能力についての検討
ｂ）ＦＶＩＩＩ投薬に対する暗示を有して、ＰＥＧＬｉＰを添加することによって達成された効果サイズの定量
ｃ）凝血増強の大きさに対する、ＰＥＧＬｉＰ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比を変動させる効果についての検討
であった。
血液サンプリング：
血液サンプルを、健常ドナーからクエン酸チューブに回収した。血液を使用前に室温で１５分間置いておき、次いで回収の４時間以内に分析した。全血（「ＷＢ」、２５０μｌ）を、約１５ＢＵ／ｍｌの最終阻害剤濃度まで、重度の血友病患者血漿（ＳＨＰ）または阻害剤血漿（５０μｌ）と混合して、全血（ＷＢ）または阻害剤－全血（Ｉ－ＷＢ）基質を作り出し、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、試験品目（ｒＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｂａｙｅｒ）またはＰＥＧＬｉＰ：ｒＦＶＩＩＩ）およびＣａＣｌ２溶液を添加し、ＲＯＴＥＭ分析を直ちに始めた。
結果：
実験（ａ）：この試行は、全血（ＷＢ）または阻害剤－全血（Ｉ－ＷＢ）の凝血パラメーター、およびｒＦＶＩＩＩ単独（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｂａｙｅｒ）、または１３：１ ＰＥＧＬｉＰ粒子対ｒＦＶＩＩＩ分子の比（１３：１ ＰＥＧＬｉＰ－ＦＶＩＩＩ）のｒＦＶＩＩＩ＋ＰＥＧＬｉＰのいずれかを用いて獲得された凝血向上を比較した。実験を２回反復し、２回の反復についての平均的結果は表４に示される：
ａ）阻害剤を含有する全血に添加されるＦＶＩＩＩの凝血能を増強するＰＥＧＬｉＰの能力についての検討
ｂ）ＦＶＩＩＩ投薬に対する暗示を有して、ＰＥＧＬｉＰを添加することによって達成された効果サイズの定量
ｃ）凝血増強の大きさに対する、ＰＥＧＬｉＰ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の比を変動させる効果についての検討
であった。
血液サンプリング：
血液サンプルを、健常ドナーからクエン酸チューブに回収した。血液を使用前に室温で１５分間置いておき、次いで回収の４時間以内に分析した。全血（「ＷＢ」、２５０μｌ）を、約１５ＢＵ／ｍｌの最終阻害剤濃度まで、重度の血友病患者血漿（ＳＨＰ）または阻害剤血漿（５０μｌ）と混合して、全血（ＷＢ）または阻害剤－全血（Ｉ－ＷＢ）基質を作り出し、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、試験品目（ｒＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｂａｙｅｒ）またはＰＥＧＬｉＰ：ｒＦＶＩＩＩ）およびＣａＣｌ２溶液を添加し、ＲＯＴＥＭ分析を直ちに始めた。
結果：
実験（ａ）：この試行は、全血（ＷＢ）または阻害剤－全血（Ｉ－ＷＢ）の凝血パラメーター、およびｒＦＶＩＩＩ単独（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｂａｙｅｒ）、または１３：１ ＰＥＧＬｉＰ粒子対ｒＦＶＩＩＩ分子の比（１３：１ ＰＥＧＬｉＰ－ＦＶＩＩＩ）のｒＦＶＩＩＩ＋ＰＥＧＬｉＰのいずれかを用いて獲得された凝血向上を比較した。実験を２回反復し、２回の反復についての平均的結果は表４に示される：
【0218】
【表7】
【0219】
考察：
結果は、全血への阻害剤の添加が、凝血カスケードを重度に遅延させることを示している。これは、ｒＦＶＩＩＩの添加である程度矯正される。１３：１比のＰＥＧＬｉＰ粒子対ｒＦＶＩＩＩ分子で、ｒＦＶＩＩＩにＰＥＧＬｉＰを供給することは、ＦＶＩＩＩ単独よりもなおさらに凝血までの時間を短くし、より良質な凝血を産生する（ＭＣＦの増加）。
結果は、全血への阻害剤の添加が、凝血カスケードを重度に遅延させることを示している。これは、ｒＦＶＩＩＩの添加である程度矯正される。１３：１比のＰＥＧＬｉＰ粒子対ｒＦＶＩＩＩ分子で、ｒＦＶＩＩＩにＰＥＧＬｉＰを供給することは、ＦＶＩＩＩ単独よりもなおさらに凝血までの時間を短くし、より良質な凝血を産生する（ＭＣＦの増加）。
【0220】
実験（ｂ）：この試行は、１３：１の、１ＩＵ／ｍｌのＰＥＧＬｉＰ：ｒＦＶＩＩＩ対１．０ＩＵ／ｍｌおよび４．０ＩＵ／ｍｌの濃度の遊離ｒＦＶＩＩＩの組合せについての、阻害剤－全血（Ｉ－ＷＢ）における相対的凝血効力を比較した。
【0221】
【表8】
【0222】
考察：結果は、１３：１製剤においてｒＦＶＩＩＩとともにＰＥＧＬｉＰを投与することによって、１ＩＵ／ｍｌ濃度のｒＦＶＩＩＩの効力は向上し、それにより、それは４倍の大きさの濃度の効力に達する。このことは、ＨＡ阻害剤患者においてこれらの比でｒＦＶＩＩＩとの組合せでＰＥＧＬｉＰを投与することが、ＦＶＩＩＩ倹約的であり得、より少量でかつ／またはより低頻度の注射につながることを暗示する。
【0223】
実験（ｃ）：ＰＥＧＬｉＰ粒子対ｒＦＶＩＩＩの比が１３：１または１：１である、２つの試行を実施した。結果は、下の表６に与えられる。
【0224】
【表9】
【0225】
考察：
ＰＥＧＬｉＰを含有する両製剤は、ｒＦＶＩＩＩ単独を用いた製剤と比べて、凝血過程の増強を示した。ＰＥＧＬｉＰのより大きな割合（１３：１）を有する製剤は、１：１製剤と比較して、より大きな増強を示した。特に、凝血過程の始まりにトロンビンバーストの指標を提供するアルファパラメーターは、１：１製剤と比べて、１３：１製剤を用いた増強を示している。
結論：
（ａ）ｒＦＶＩＩＩと結び付いたＰＥＧＬｉＰは、全血において、阻害剤の存在下でｒＦＶＩＩＩの効力を増強し得る。このことは、後天性血友病ならびに先天性血友病における潜在的実用性を暗示する。
ＰＥＧＬｉＰを含有する両製剤は、ｒＦＶＩＩＩ単独を用いた製剤と比べて、凝血過程の増強を示した。ＰＥＧＬｉＰのより大きな割合（１３：１）を有する製剤は、１：１製剤と比較して、より大きな増強を示した。特に、凝血過程の始まりにトロンビンバーストの指標を提供するアルファパラメーターは、１：１製剤と比べて、１３：１製剤を用いた増強を示している。
結論：
（ａ）ｒＦＶＩＩＩと結び付いたＰＥＧＬｉＰは、全血において、阻害剤の存在下でｒＦＶＩＩＩの効力を増強し得る。このことは、後天性血友病ならびに先天性血友病における潜在的実用性を暗示する。
【0226】
（ｂ）ｒＦＶＩＩＩ投薬のサイズおよび頻度に対する重要な暗示を有して、増強のサイズは、ｒＦＶＩＩＩの用量の４倍とほぼ等価である。
【0227】
（ｃ）ＰＥＧＬｉＰは天然ＦＶＩＩ（および、後にＦＶＩＩａ）に付加的に結合し、これを血小板と結び付けるため、ＰＥＧＬｉＰ粒子対ＦＶＩＩＩ分子の濃度を低下させることはこの能力を低下させ、凝血開始までの時間およびトロンビンバーストの両方を低下させ、カスケードの増幅を低下させる。
【0228】
実施例３
阻害剤を有する重度の血友病患者血液のモデルにおける、凝固に対するＰＥＧＬｉｐ＋ＦＶＩＩＩの効果についてのエクスビボ調査。
阻害剤を有する重度の血友病患者血液のモデルにおける、凝固に対するＰＥＧＬｉｐ＋ＦＶＩＩＩの効果についてのエクスビボ調査。
【0229】
この調査は、ヒト全血を使用して、阻害剤を含有する全血における凝血効力を増強することにおけるＦ－ＰＥＧＬｉＰ産物（ＰＬＰ－０１）の有効性を検討した。
方法：
健常ボランティアから採血された正常な全血（ＷＢ）のサンプルに、阻害剤を有する７０ＢＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ欠損血漿（７０ＢＵ／ｍｌ、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を投薬することによって、阻害剤を有する重度の血友病Ａ血液のシミュレーションされた溶液を作り出した。十分な阻害剤血漿を添加し、混合物をインキュベートして、血液からＦＶＩＩＩを枯渇させ、阻害剤血液（ＩＢ）のシミュレーションとして１５ベセスダ単位／ｍｌとした。
方法：
健常ボランティアから採血された正常な全血（ＷＢ）のサンプルに、阻害剤を有する７０ＢＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ欠損血漿（７０ＢＵ／ｍｌ、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を投薬することによって、阻害剤を有する重度の血友病Ａ血液のシミュレーションされた溶液を作り出した。十分な阻害剤血漿を添加し、混合物をインキュベートして、血液からＦＶＩＩＩを枯渇させ、阻害剤血液（ＩＢ）のシミュレーションとして１５ベセスダ単位／ｍｌとした。
【0230】
ＷＢ、ＩＢ、または試験品目をスパイクされたＩＢのサンプル（表７を参照されたい）を、少量の組織因子活性化因子を使用して、ＲＯＴＥＭによる分析に供した。
結果
結果
【0231】
【表10】
【0232】
全血にＦＶＩＩＩに対する阻害剤をスパイクして阻害剤血液のモデルを作り出すことは、阻害剤全血（Ｉ－ＷＢ）において凝血時間の延長をもたらした。凝血時間は、ＦＶＩＩＩまたはＰＥＧＬｉｐ単独に関して回復しなかった。ＦＶＩＩＩをＦ－ＰＥＧＬｉｐ（ＰＬＰ－０１）と共投与した場合、凝血時間の低下を有して凝固は回復した。ＦＶＩＩＩ＋Ｆ－ＰＥＧＬｉｐ（ＰＬＰ－０１）を用いた、阻害剤を有するＨＡモデルにおける凝血時間の低下が観察された。図１も参照されたい。
結論：
ＰＬＰ－００およびＰＬＰ－０１の両方とも、より高いＰＥＧＬｉＰ：ＦＶＩＩＩ比で、阻害剤血液における凝固のより有効な回復の傾向を示す。
結論：
ＰＬＰ－００およびＰＬＰ－０１の両方とも、より高いＰＥＧＬｉＰ：ＦＶＩＩＩ比で、阻害剤血液における凝固のより有効な回復の傾向を示す。
【0233】
実施例４
阻害剤を有する重度の血友病患者の血液における、凝固に対するＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩの効果についてのエクスビボ調査。
阻害剤を有する重度の血友病患者の血液における、凝固に対するＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩの効果についてのエクスビボ調査。
【0234】
これらの実験は、ヒト（５．６ＢＵ）およびイヌ（３．２ＢＵ）ＦＶＩＩＩの両方に対する低力価の抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて、血友病Ａイヌ由来のクエン酸塩抗凝固全血サンプルへの、ＦＶＩＩＩ、ＰＥＧＬｉｐ（ＰＬＰ－００）、様々な比のＰＥＧＬｉｐ（ＰＬＰ－００）：ＦＶＩＩＩ（１０：１、２９：１、８６：１）、またはＦ－ＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩ（ＰＬＰ－０１）の２８：１混合物の添加の効果を評価した。試験産物のサンプルを阻害剤血液に添加し、穏やかに混合し、次いでＲＯＴＥＭカップに添加し、その後に１０μｌ ＣａＣｌ２が続いた。ＮＡＴＥＭプログラムを使用して、凝固を６０分間追跡した。
試験品目：
ＦＶＩＩＩ：１０００ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ：Ｎｕｗｉｑ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、０．５ｍｌ滅菌水を用いて再構成された５００ＩＵバイアル）
ＰＬＰ－００：５０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．７中、９０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧＬｉｐ：９％ＰＥＧ化リポソーム（バッチ１９－７４０）
ＰＬＰ－０１：５０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．７中、６８ｍｇ／ｍｌ Ｆ－ＰＥＧＬｉｐ：６．８％Ｔｗｅｅｎ化ＰＥＧ化リポソーム（バッチ０９－０１－２０２０）
対照：５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．７
結果：
試験品目：
ＦＶＩＩＩ：１０００ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ：Ｎｕｗｉｑ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、０．５ｍｌ滅菌水を用いて再構成された５００ＩＵバイアル）
ＰＬＰ－００：５０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．７中、９０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧＬｉｐ：９％ＰＥＧ化リポソーム（バッチ１９－７４０）
ＰＬＰ－０１：５０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．７中、６８ｍｇ／ｍｌ Ｆ－ＰＥＧＬｉｐ：６．８％Ｔｗｅｅｎ化ＰＥＧ化リポソーム（バッチ０９－０１－２０２０）
対照：５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．７
結果：
【0235】
【表11】
【0236】
任意の処理の前に、対象の阻害剤血液は、要される時間尺度内に凝血しなかった。これは、阻害剤血液にＦＶＩＩＩ単独をまたはＰＬＰ－００単独をスパイクした場合、解消されなかった。同様に、阻害剤血液にＰＬＰ－００＋ＦＶＩＩＩの１０：１混合物をスパイクした場合、凝固時間の補正はなかった。
【0237】
しかしながら、２９：１および８６：１のＰＬＰ－００＋ＦＶＩＩＩおよび２８：１のＰＬＰ－０１＋ＦＶＩＩＩの混合物はすべて、阻害剤血液の凝固時間を有意に低下させた。図２も参照されたい。
【0238】
結論として、２９：１以上の比でのＦＶＩＩＩへのＰＬＰ－００の添加は、血中における阻害剤によるＦＶＩＩＩの作用の阻害を阻止した。しかしながら、低レベルのＰＬＰ－００（１０：１）は、阻害からＦＶＩＩＩを保護することはできなかった。このことは、ＰＥＧＬｉｐが抗体阻害剤からの保護を提供する、１０：１～２９：１の間にＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩの臨界比があることを暗示する。
【0239】
付加的なＰＥＧを組み入れたＰＥＧ化リポソームの第２の製剤（Ｆ－ＰＥＧＬｉｐ／ＰＬＰ－０１）も、２８：１のＰＬＰ－０１：ＦＶＩＩＩ比で、阻害剤抗体分解からの保護をＦＶＩＩＩに提供した。
【0240】
実施例５
阻害剤患者におけるＰＥＧＬｉＰ＋ＦＶＩＩＩの臨床調査
調査は、規定された比のＰＥＧＬｉｐ－ＦＶＩＩＩが、阻害剤患者において凝固を回復させることを実証するために進行中である。
阻害剤患者におけるＰＥＧＬｉＰ＋ＦＶＩＩＩの臨床調査
調査は、規定された比のＰＥＧＬｉｐ－ＦＶＩＩＩが、阻害剤患者において凝固を回復させることを実証するために進行中である。
【0241】
阻害剤が発生しやすいＨＡ患者は、ＰＥＧＬｉＰ＋ＦＶＩＩＩ（ＰＬＰ－００）を注射された場合に阻害剤を生成せず、一方で凝固補正をなおも示した。
【0242】
ＦＶＩＩＩに対する抗体阻害剤を生成した病歴を有する４人の重度の血友病患者が、治験を受けた。彼らの病歴に起因して、これらの患者は、彼らが阻害剤を生成するリスクに起因して、予防的療法として補充ＦＶＩＩＩを受けることができない。治験において、これらの患者のうちの３人は、当初阻害剤なしを提示し、１人は低い力価（＜５ＢＵ）を提示した。すべての患者に、２２ｍｇ／ｋｇ ＰＥＧＬｉｐおよび３５ＩＵ／ｋｇ組み換えヒト化ＦＶＩＩＩのＰＥＧＬｉｐ＋ＦＶＩＩＩ（１５：１～１６：１のコロイド粒子：ＦＶＩＩＩ比）を投薬した。査定の最初の週にわたって、すべての患者は、相当な凝固補正を経験し、続く６週間にわたって平均で６日（域４～７日）ごとに彼らに投薬することを可能にした。６週間にわたる週１回ベースでの再投薬にもかかわらず、阻害剤なしを提示した３人の阻害剤が発生しやすい患者の誰も、治療に対して阻害剤を生成しなかった。低力価の阻害剤を提示した１人の患者は、最初の段階の間にわずかな臨床的に重要ではない上昇を経験し、それは、第２相での反復投薬の間に実際には低下した。阻害剤が発生しやすい個体においてＰＥＧＬｉｐ－ＦＶＩＩＩが阻害剤生成を刺激することができないことは、以前に治療されていない患者または最小限に治療された患者の治療に例外的に適切な産物を作製して、これらの脆弱な個体において阻害剤の生成を阻止するであろうことが提唱される。
【0243】
【表12】
【0244】
結論：
１５：１～１６：１の比のＰＥＧＬｉＰ対ＦＶＩＩＩは両方とも、さらなる相当量の阻害剤の産生を刺激することなく、ＦＶＩＩＩに対する阻害剤を有する患者において、ならびにＦＶＩＩＩに対する阻害剤を発生させやすい患者において、出血性事象のリスクを下げる。
実施例の概要
１０：１以下のＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩの比（実施例１、実施例２－実験ｃ、実施例３、および実施例４）は、より高い比（１３：１以上）よりも、凝固を向上させることにおいて効果が低い。臨床実験は、１５：１～１６：１の比が、血友病Ａを有する阻害剤患者において出血を阻止するだけでなく、この製剤が阻害剤の存在下でも有効であり、阻害剤が発生しやすい患者においても阻害剤の生成を阻止することを示している。
１５：１～１６：１の比のＰＥＧＬｉＰ対ＦＶＩＩＩは両方とも、さらなる相当量の阻害剤の産生を刺激することなく、ＦＶＩＩＩに対する阻害剤を有する患者において、ならびにＦＶＩＩＩに対する阻害剤を発生させやすい患者において、出血性事象のリスクを下げる。
実施例の概要
１０：１以下のＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩの比（実施例１、実施例２－実験ｃ、実施例３、および実施例４）は、より高い比（１３：１以上）よりも、凝固を向上させることにおいて効果が低い。臨床実験は、１５：１～１６：１の比が、血友病Ａを有する阻害剤患者において出血を阻止するだけでなく、この製剤が阻害剤の存在下でも有効であり、阻害剤が発生しやすい患者においても阻害剤の生成を阻止することを示している。
【0245】
実施例６
阻害剤を有する重度の血友病患者の血液における、凝固に対するＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩの効果についてのエクスビボ調査。
阻害剤を有する重度の血友病患者の血液における、凝固に対するＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩの効果についてのエクスビボ調査。
【0246】
これらの実験は、ヒト（５．６ＢＵ）およびイヌ（３．２ＢＵ）ＦＶＩＩＩの両方に対する低力価の抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて、血友病Ａイヌ由来のクエン酸塩抗凝固全血サンプルへの、ＦＶＩＩＩ、ＰＥＧＬｉｐ（ＰＬＰ－００）、様々な比のＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩ（ＰＬＰ－００；１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、９０：１）、および様々な比のＦ－ＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩ（ＰＬＰ－０１；１０：１、２０：１、３０：１）の添加の効果を評価した。試験産物のサンプルを阻害剤血液に添加し、穏やかに混合し、次いでＲＯＴＥＭカップに添加し、その後に１０μｌ ＣａＣｌ２が続いた。ＮＡＴＥＭプログラムを使用して、凝固を６０分間追跡した。有効性を、未治療の血友病患者阻害剤血液についてのパーセンテージとして、各治療を用いて達成された凝血時間によって判断した。
試験品目：
ＦＶＩＩＩ：１０００ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ：Ｎｕｗｉｑ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、０．５ｍｌ滅菌水を用いて再構成された５００ＩＵバイアル）
ＰＬＰ－００：５０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．７中、９０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧＬｉｐ：９％ＰＥＧ化リポソーム（バッチ１９－７４０）
ＰＬＰ－０１：５０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．７中、６８ｍｇ／ｍｌ Ｆ－ＰＥＧＬｉｐ：６．８％Ｔｗｅｅｎ化ＰＥＧ化リポソーム（バッチ０９－０１－２０２０）
対照：５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．７
結果：
試験品目：
ＦＶＩＩＩ：１０００ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ：Ｎｕｗｉｑ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、０．５ｍｌ滅菌水を用いて再構成された５００ＩＵバイアル）
ＰＬＰ－００：５０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．７中、９０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧＬｉｐ：９％ＰＥＧ化リポソーム（バッチ１９－７４０）
ＰＬＰ－０１：５０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．７中、６８ｍｇ／ｍｌ Ｆ－ＰＥＧＬｉｐ：６．８％Ｔｗｅｅｎ化ＰＥＧ化リポソーム（バッチ０９－０１－２０２０）
対照：５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．７
結果：
【0247】
【表13】
【0248】
任意の処理の前に、対象の阻害剤血液は、要される時間尺度内に凝血しなかった。これは、阻害剤血液にＦＶＩＩＩ単独をまたはＰＬＰ－００単独をスパイクした場合、解消されなかった。同様に、阻害剤血液にＰＬＰ－００＋ＦＶＩＩＩの１０：１混合物をスパイクした場合、凝固時間の補正はなかった。
【0249】
しかしながら、≧１５：１のＰＬＰ－００＋ＦＶＩＩＩおよび３０：１のＰＬＰ－０１＋ＦＶＩＩＩの混合物はすべて、阻害剤血液の凝固時間を有意に低下させた。図３も参照されたい。
【0250】
結論として、１５：１以上の比でのＦＶＩＩＩへのＰＬＰ－００の添加は、血中における阻害剤によるＦＶＩＩＩの作用の阻害を阻止した。しかしながら、低レベルのＰＬＰ－００（１０：１）は、阻害からＦＶＩＩＩを保護することはできなかった。このことは、ＰＥＧＬｉｐが抗体阻害剤からの保護を提供し始める、１０：１～１５：１の間にＰＥＧＬｉｐ：ＦＶＩＩＩの臨界比があることを暗示する。９０：１の比は、３０：１の比と比べてわずかな利益しか提供せず、１５：１～３０：１の間に最適なＰＥＧＬｉｐ倹約的比があることを暗示する。
【0251】
付加的なＰＥＧ（Ｆ－ＰＥＧＬｉｐ／ＰＬＰ－０１）を組み入れたＰＥＧ化リポソームの第２の製剤も、３０：１のＰＬＰ－０１：ＦＶＩＩＩ比で、阻害剤抗体分解からの保護をＦＶＩＩＩに提供し、とはいえ、この製剤の有効性の下限は、ＰＬＰ－００がいくらかの効力をなおも提供する比である２０：１よりも高い。
【0252】
実施例７
阻害剤患者におけるＰＥＧＬｉＰ＋ＦＶＩＩＩの臨床調査
第２相臨床試験に着手して、規定された比のＰＥＧＬｉｐ－ＦＶＩＩＩが、阻害剤患者において凝固を回復させることを実証した。調査は、実施例５に記載される知見を踏まえた。
阻害剤患者におけるＰＥＧＬｉＰ＋ＦＶＩＩＩの臨床調査
第２相臨床試験に着手して、規定された比のＰＥＧＬｉｐ－ＦＶＩＩＩが、阻害剤患者において凝固を回復させることを実証した。調査は、実施例５に記載される知見を踏まえた。
【0253】
スクリーニング時に阻害剤を有した、または臨床記録が彼らはＦＶＩＩＩへの曝露で阻害剤を発生させやすいことを示した重度のＨＡ患者は、ＰＥＧＬｉＰ＋ＦＶＩＩＩ（ＰＬＰ－００＋シモクトコグアルファ）を注射された場合に、それぞれ彼らの阻害剤力価を増加させずまたは阻害剤を生成せず、一方で凝固補正および出血頻度の低下をなおも示した。
【0254】
ＦＶＩＩＩに対する抗体阻害剤を生成した病歴を有する１３人の重度の血友病患者が、治験を受けた。彼らの病歴に起因して、これらの患者のうちの８人は、彼らが阻害剤を生成するリスクに起因して、予防的療法として補充ＦＶＩＩＩを受けることができない。他の５人の患者は、活性な阻害剤力価（平均２．４ベセスダ単位）をスクリーニング時に提示した。すべての患者に、２２ｍｇ／ｋｇ ＰＥＧＬｉｐおよび３５ＩＵ／ｋｇ組み換えヒト化ＦＶＩＩＩのＰＥＧＬｉｐ＋ＦＶＩＩＩ（シモクトコグアルファ）（１５：１～１６：１のコロイド粒子：ＦＶＩＩＩ比）を投薬した。査定の最初の週にわたって、すべての患者は、相当な凝固補正を経験し、投薬間隔の相当な延長を表す（シモクトコグアルファに関する通常の投薬間隔は、１日おきまたは週あたり２～３回である）、続く６週間にわたって平均で５．５日（域３．０～７．４日）ごとに彼らに投薬することを可能にした。
【0255】
このより低い投薬の頻度にもかかわらず、出血性事象は患者において有意に低下し、平均的な月の出血率は、月あたり平均１回（年あたり１２．３回）から月あたり０．３回（年あたり３．２回）に落ちた。
【0256】
６週間にわたる週１回ベースでの再投薬にもかかわらず、阻害剤なしを提示した８人の阻害剤が発生しやすい患者の誰も、治療に対して阻害剤を生成しなかった。加えて、阻害剤を提示した５人の患者は、その治験の６週間の予防的段階の間に阻害剤力価の有意な上昇を経験しなかった。阻害剤を提示するおよび阻害剤が発生しやすい患者に対する治療と同様に、阻害剤が発生しやすい個体においてＰＥＧＬｉｐ－ＦＶＩＩＩが阻害剤生成を刺激することができないことは、以前に治療されていない患者または最小限に治療された患者の治療に例外的に適切な産物を付加的に作製して、これらの脆弱な個体において阻害剤の生成を阻止するであろうことが提唱される。
【0257】
【表14】
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】