特表 2024-532168 抗菌化合物およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-05

(54)【発明の名称】抗菌化合物およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20240829BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20240829BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 31/4196 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 31/505 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20240829BHJP

   A01N 37/46 20060101ALI20240829BHJP

   A01N 43/90 20060101ALI20240829BHJP

   A01N 43/653 20060101ALI20240829BHJP

   A01N 43/54 20060101ALI20240829BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20240829BHJP

   C07D 249/08 20060101ALN20240829BHJP

   C07D 239/47 20060101ALN20240829BHJP

   C07H 17/08 20060101ALN20240829BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06

A61K38/08

A61P31/10

A61P31/04

A61P43/00 121

A61K31/4196

A61K31/505

A61K31/7048

A01N37/46

A01N43/90 101

A01N43/653 G

A01N43/54 F

A01P3/00

C07D249/08 521

C07D239/47 Z

C07H17/08 K

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024509490

(86)(22)【出願日】2022-08-15

(85)【翻訳文提出日】2024-04-09

(86)【国際出願番号】 US2022040309

(87)【国際公開番号】W WO2023022969

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】63/233,522

(32)【優先日】2021-08-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524060588

【氏名又は名称】ミドル テネシー ステイト ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ビッカー， ケビン リー

(72)【発明者】

【氏名】グリーン， ロバート マディソン

【テーマコード（参考）】

4C057

4C084

4C086

4H011

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C057BB02

4C057CC04

4C057DD01

4C057KK24

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA16

4C084BA23

4C084BA31

4C084MA01

4C084MA02

4C084NA14

4C084ZB35

4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC42

4C086BC60

4C086EA15

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA07

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB35

4C086ZC75

4H011AA01

4H011AA03

4H011BA06

4H011BB06

4H011BB08

4H011BB09

4H011DA13

4H011DD03

4H011DD04

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA13

4H045BA50

4H045DA83

4H045EA20

4H045FA30

(57)【要約】

抗菌ペプトイド、その組成物、および使用方法。抗菌ペプトイドまたはその組成物は、脊椎動物における真菌感染症を処置または予防するために使用することができる。抗菌ペプトイドまたはその組成物は、植物における真菌感染症を処置または予防するために使用することができる。本開示は、抗菌ペプトイド、その組成物、ならびに脊椎動物または植物における真菌および／または細菌感染症を処置および／または予防するために抗菌ペプトイドを使用する方法を記載する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式

【化20】

｛式中、
Ａ^Ｘは、Ｈまたは直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキルまたは直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルケニルであり、前記アルキルまたは前記アルケニルは、必要に応じてカルボニル基を含み；
Ｔは、直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキルまたは直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルケニルであり、前記アルキルまたは前記アルケニルは、必要に応じてカルボニル基を含み；
Ｑは、ヒドロキシルまたはＮＨ_２であり；かつ
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、各々独立して

【化21】

または一般式Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３のアルキルアミンであり、
（式中、
各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各ｎは、０、１、または２であり；
ＮｃｐｅｎＷである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｗは独立にＮ、Ｓ、またはＯであり；
ＮｌｉｎＷである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｗは独立にＮ、Ｓ、またはＯであり；
ＮｐｈＸである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｘは独立にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり；
ＮａｐｅｎＺである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｚは独立にＳ、またはＯであり；
Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３である各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、Ｒ^１０は直鎖（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキレンであり；かつ
Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３である各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、各々独立にＨまたは（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルである）｝
の化合物。

【請求項2】

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４が各々独立に

【化22-1】

【化22-2】

である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ｒ^１およびＲ^４が各々独立に、Ｎｖａｌ、Ｎｈｅｘ、Ｎｌｅｕ、Ｎｃｐｅｎ、ＮｃｅｐｎＷ、ＮｌｉｎＷ、Ｎｐｈｎ、Ｎｘｘ、ＮｐＯＨ、ＮｐｈＸ、Ｎｎａｐｎ、Ｎｎａｉｎ、Ｎｉｎｄｎ、ＮａｐｅｎＺ、またはサルコシンであり、Ｒ^２およびＲ^４が各々独立に、Ｎａｒｇ、または前記一般式Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３のアルキルアミンである、請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

Ｔが直鎖（Ｃ_６）アルキル、直鎖（Ｃ_１３）アルキル、直鎖（Ｃ_１５）アルキル、直鎖（Ｃ_１７）アルキル、シトリル、ファルネシルであるか、またはＲ^２０が（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキルである一般式（ＣＯ）－Ｒ^２０のものである、請求項１に記載の化合物。

【請求項5】

Ａ^Ｘが直鎖（Ｃ_６）アルキル、直鎖（Ｃ_６）アルキル、直鎖（Ｃ_１３）アルキル、直鎖（Ｃ_１５）アルキル、直鎖（Ｃ_１７）アルキルであるか、またはＲ^２０が（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキルである一般式（ＣＯ）－Ｒ^２０のものである、請求項１に記載の化合物。

【請求項6】

Ａ^ＸがＨではなく、Ａ^ＸとＴが同じである、請求項１に記載の化合物。

【請求項7】

Ａ^ＸがＨであり、Ｔが直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱがＮＨ_２である、請求項１に記載の化合物。

【請求項8】

Ｒ^１０が直鎖（Ｃ_２～Ｃ_４）アルキレンである、請求項１に記載の化合物。

【請求項9】

Ｒ^１１、Ｒ^１２、およびＲ^１３がメチルである、請求項１に記載の化合物。

【請求項10】

少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３および／またはＲ^４がＮｌｙｓであり、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３および／またはＲ^４がＮａｅである、請求項１に記載の化合物。

【請求項11】

少なくとも２つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３および／またはＲ^４がＮｃｈａである、請求項１に記載の化合物。

【請求項12】

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つがＮｌｙｓであり；Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つがＮｃｈａであり；Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つがＮａｅである、請求項１に記載の化合物。

【請求項13】

Ａ^ＸがＨであり、Ｔが直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱがＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つがＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つがＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つがＮａｅである、請求項１に記載の化合物。

【請求項14】

Ａ^ＸがＨであり、Ｔが直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱがＮＨ_２であり、Ｒ^１がＮｃｈａであり、Ｒ^２がＮｌｙｓであり、Ｒ^３がＮａｅであり、Ｒ^４がＮｃｈａである、請求項１に記載の化合物。

【請求項15】

請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容され得る塩を含む医薬組成物。

【請求項16】

請求項１５に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。

【請求項17】

前記対象がヒトまたは動物である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記方法が、前記対象の真菌感染症を処置または予防することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

追加の抗真菌化合物を投与することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

前記追加の抗真菌化合物の前記投与が前記組成物の前記投与と同時に行われる、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記追加の抗真菌化合物がフルコナゾール、フルシトシン、アムホテリシンＢ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記真菌感染症がＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓまたはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

前記方法が、前記対象の細菌感染症を処置または予防することを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項24】

前記細菌感染がグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記グラム陽性細菌がＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、黄色ブドウ球菌またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記グラム陰性細菌が、緑膿菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、肺炎桿菌、大腸菌、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

前記細菌感染症が結核を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項28】

請求項１の化合物またはその塩を含む殺真菌組成物。

【請求項29】

請求項２８に記載の組成物を植物、植物の種子、または植物が生育する土壌に投与することを含む方法。

【請求項30】

前記方法が、前記植物の真菌感染症を処置または予防することを含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

追加の抗真菌化合物を投与することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記追加の抗真菌化合物の前記投与が、前記組成物の前記投与と同時に行われる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記真菌感染が、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ、Ｐｈｏｍａ ｃｌｅｍａｔｉｄｉｎａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ ｒｏｓａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ、Ｐｈｙｓｏｄｅｒｍａ、Ｌａｅｔｉｓａｒｉａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｅｒｐｕｌａ ｌａｃｒｙｍａｎｓ、Ｓｙｎｃｈｙｔｒｉｕｍ ｅｎｄｏｂｉｏｔｉｃｕｍ、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔａｐｈｒｉｎａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｂｉｄｗｅｌｌｉｉ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｆｉｂｒｏｐｏｒｉａ ｖａｉｌｌａｎｔｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｏｘｙｃｏｃｃｉ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｃｏｎｉｏｐｈｏｒａ ｐｕｔｅａｎａ、Ｐｏｒｉａ ｖａｉｌｌａｎｔｉｉ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ、またはＰｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ－ｒｅｐｅｎｔｉｓａを含む、請求項３０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照

【0002】

本出願は、２０２１年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２３３，５２２号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

政府の資金提供

【0004】

本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＡＩ１４６３９３－０１Ａ１の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

【0005】

分野

【0006】

本開示は、一般に、抗菌ペプトイド化合物、それを含有する組成物、および化合物を使用する方法に関する。

【背景技術】

【0007】

緒言

【0008】

Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなどの病原真菌によって引き起こされる感染症は、特に臨床用抗真菌剤が不足しており、病原真菌の中で抗真菌耐性が上昇していることを考えると、ヒトの健康に深刻なリスクをもたらす。カンジダ種は、真菌性院内感染の主な原因であり、年間７００万件を超える症例があり、死亡率は３３％である（Ｐｆａｌｌｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０，１３３－１６３（２００７））。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、鵞口瘡（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，９０５－９２７（２０１６））、膣カンジダ症（Ｇｏｎｃａｌｖｅｓら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，９０５－９２７（２０１６））、および健康な個体における死亡率が４０～６０％である血流の感染症であるカンジダ血症（Ｓａｒｍａ ｅｔ ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．１０，１５５－１６５（２０１７））を含むいくつかの疾患を引き起こす。

【0009】

Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓは、胞子形成酵母であり、このカプセルは、免疫細胞による食作用を回避することを可能にすることによって病原性の増加に寄与する（Ｂｕｃｈａｎａｎら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｊｏｕｒｎａｌ４，７１（１９９８）；Ｄｏｅｒｉｎｇ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６３，２２３－２４７（２００９））。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓは、中枢神経系などの他の感受性領域への拡散を促進することができる大量の莢膜物質を体内に放出することができる（Ｂｕｃｈａｎａｎら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｊｏｕｒｎａｌ ４，７１（１９９８））。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓが中枢神経系に浸潤すると、クリプトコッカス髄膜炎（ＣＭ）と呼ばれる髄膜の感染が起こることがある（Ｓｌｏａｎら、Ｃｌｉｎ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ ６，１６９－１８２（２０１４））。ＣＭは、世界中でほぼ１００万人が罹患しており、年間数十万人が死亡している（Ｒａｊａｓｉｎｇｈａｍら、Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７，８７３－８８１（２０１７））。例えば、２０１７年には２２０，０００例のクリプトコッカス髄膜炎があり、死亡率は８２％であった（Ｒａｊａｓｉｎｇｈａｍら、Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７，８７３－８８１（２０１７））。ＣＭは世界的な疾患であるが、低所得国および中所得国がその影響の矢面に立たされている（Ｒａｊａｓｉｎｇｈａｍら、Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７，８７３－８８１（２０１７））。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、クリプトコッカス感染の最も一般的な前駆症状であり、ＡＩＤＳ関連死の約１５～２０％クリプトコッカス症によって引き起こされている（Ｒａｊａｓｉｎｇｈａｍら、Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７，８７３－８８１（２０１７）；Ｍｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ６２，１５６４－１５６８（２０１６））。ありがたいことに、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ処置の改善により、過去数年間で症例数と死亡数は減少したが、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓは依然として免疫不全者にとって致命的な脅威である（Ｓｌｏａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．６，１６９－１８２（２０１４））。

【0010】

現在の臨床用抗真菌剤には、アムホテリシンＢ（ＡｍｐＢ）、アゾール（例えば、フルコナゾールおよびイトラコナゾール）、エキノキャンディン（例えば、カスポファンギンおよびミカファンギン）、およびフルシトシンが含まれる（Ｃｈｅｎら、Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．１８７，４０４－４０９（２００７））。真菌は真核生物であるため、真菌細胞に対して活性な薬剤は、宿主細胞に対しても活性である傾向がある（Ｓｅｇａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ ４，１３５（２０１８））。そのため、残念ながら、これらの臨床用抗真菌剤は重度のネフローゼ毒性や肝臓毒性を示すことが多く、長期的な副作用を誘発する可能性がある（Ｌｅｗｉｓら、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８６，８０５－８１７（２０１１））。例えば、ＡｍｐＢで処置された患者の最大５０％が急性腎不全を経験する（Ｐａｐｐａｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４８，５０３－５３５（２００９）；Ｐｅｒｆｅｃｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５０，２９１－３２２（２０１０））。ＡｍｐＢは哺乳動物毒性が高いため、クリプトコッカス髄膜炎などの重度の全身感染の場合にのみ投与される。フルシトシンは、しばしばＡｍｐＢと一緒に投与されるが、哺乳動物細胞には極めて毒性が強く、真菌細胞による取り込みが不十分である（Ｖｅｒｍｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４６，１７１－１７９（２０００））。フルシトシンは胃腸毒性および肝毒性を特徴とするが、依然として市場で最も効果的な抗真菌剤の１つである。フルコナゾールは、ＡｍｐＢおよびフルシトシンよりも大幅に毒性が低いが、広域処置にはそれほど有効ではなく、単剤療法として使用すると再発率は最大２０％である（Ｐａｐｐａｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４８，５０３－５３５（２００９）；Ｂｅｎ－Ａｍｉら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ３５，２７９－３１１（２０２１））。このため、フルコナゾールは、他のより強力な薬物による初期処置後に投与されることが最も多く、維持治療または予防治療として最良である（Ｐｅｒｆｅｃｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５０，２９１－３２２（２０１０））。上記の薬剤の中で、エキノキャンディンは毒性が最も低く、耐性が観察されているが、それらは合成が困難であり、その大きく複雑な構造のためにバイオアベイラビリティが低い。

【0011】

微生物感染症と戦うための新しい治療法は大きく進歩したが、多くの病原体は臨床用抗真菌薬などの現在の処置に耐性を獲得している（（Ｈａｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ（ｅｄ．Ｍａｙｅｒｓ，Ｄ．Ｌ．）９６７－９８５（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００９）．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６０３２７－５９５－８＿２０；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｊ．ｆｕｎｇｉ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）３，１４（２０１７））。抗菌剤耐性（ＡＭＲ）により、医学界はこれらの感染性病原体と戦うための新しい治療法を発見し、創出する必要に迫られている。病原性細菌および真菌は、抗菌薬療法を効かなくするメカニズムを、一過性と遺伝性の両方で発達させてきた（Ｗｉｅｄｅｒｈｏｌｄ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ １０，２４９－２５９（２０１７））。研究により、フルコナゾールとフルシトシンの併用治療による処置を必要とする高濃度のフルコナゾールを投与された場合に、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓは耐性を示すことが示されている（Ｚａｆａｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２，１５８－１６４（２０１９））。さらに、一部のＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ株は、肺に感染すると、チタン細胞として知られる拡大したカプセルを産生し、ＡｍｐＢに対する耐性を示している（Ｚａｆａｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２，１５８－１６４（２０１９））。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｐｆａｌｌｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０，１３３－１６３（２００７）

【非特許文献2】Ｓｉｎｇｈら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，９０５－９２７（２０１６）

【非特許文献3】Ｇｏｎｃａｌｖｅｓら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，９０５－９２７（２０１６）

【非特許文献4】Ｓａｒｍａ ｅｔ ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．１０，１５５－１６５（２０１７）

【非特許文献5】Ｂｕｃｈａｎａｎら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｊｏｕｒｎａｌ４，７１（１９９８）

【非特許文献6】Ｄｏｅｒｉｎｇ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６３，２２３－２４７（２００９）

【非特許文献7】Ｓｌｏａｎら、Ｃｌｉｎ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ ６，１６９－１８２（２０１４）

【非特許文献8】Ｒａｊａｓｉｎｇｈａｍら、Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７，８７３－８８１（２０１７）

【非特許文献9】Ｍｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ６２，１５６４－１５６８（２０１６）

【非特許文献10】Ｃｈｅｎら、Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．１８７，４０４－４０９（２００７）

【非特許文献11】Ｓｅｇａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ ４，１３５（２０１８）

【非特許文献12】Ｌｅｗｉｓら、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８６，８０５－８１７（２０１１）

【非特許文献13】Ｐａｐｐａｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４８，５０３－５３５（２００９）

【非特許文献14】Ｐｅｒｆｅｃｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５０，２９１－３２２（２０１０）

【非特許文献15】Ｖｅｒｍｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４６，１７１－１７９（２０００）

【非特許文献16】Ｂｅｎ－Ａｍｉら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ３５，２７９－３１１（２０２１）

【非特許文献17】Ｈａｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ（ｅｄ．Ｍａｙｅｒｓ，Ｄ．Ｌ．）９６７－９８５（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００９）．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６０３２７－５９５－８＿２０

【非特許文献18】Ｐｉｅｒｃｅら、Ｊ．ｆｕｎｇｉ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）３，１４（２０１７）

【非特許文献19】Ｗｉｅｄｅｒｈｏｌｄ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ １０，２４９－２５９（２０１７）

【非特許文献20】Ｚａｆａｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２，１５８－１６４（２０１９）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

本出願の概要
本開示は、抗菌ペプトイド、その組成物、ならびに脊椎動物または植物における真菌および／または細菌感染症を処置および／または予防するために抗菌ペプトイドを使用する方法を記載する。

【0014】

一態様では、本開示は、一般式

【化1】

の化合物を記載する。

【0015】

Ａ^Ｘは、Ｈまたは直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキルまたは直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルケニルであり、前記アルキルまたは前記アルケニルは、必要に応じてカルボニル基を含む。Ｔは、直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキルまたは直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルケニルであり、前記アルキルまたは前記アルケニルは、必要に応じてカルボニル基を含む。Ｑは、ヒドロキシルまたはＮＨ_２である。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、各々独立に

【化2】

【0016】

または一般式Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３のアルキルアミンである。各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各ｎは、０、１、または２である。ＮｃｐｅｎＷである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｗは独立にＮ、Ｓ、またはＯである。ＮｌｉｎＷである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｗは独立にＮ、Ｓ、またはＯである。ＮｐｈＸである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｘは独立にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。ＮａｐｅｎＺである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｚは独立にＳ、またはＯである。Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３である各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、Ｒ^１０は直鎖（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキレンである。Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３である各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、各々独立にＨまたは（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルである。

【0017】

別の態様では、本開示は、一般式または前述の態様を有する抗菌ペプトイドの医薬組成物および殺真菌組成物を記載する。

【0018】

さらに別の態様では、本開示は、細菌および／または真菌感染を予防および／または処置するために、前の態様の医薬組成物および／または殺真菌組成物を脊椎動物および／または植物に投与する方法を記載する。
定義

【0019】

本明細書で使用される用語は、特に指定されない限り、関連技術における通常の意味を有するものと理解される。本明細書で使用されるいくつかの用語およびそれらの意味を以下に示す。

【0020】

特に明記しない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「少なくとも１つの」は互換的に使用され、１つまたは複数を意味する。

【0021】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される「または」という用語は、一般に、その内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、「および／または」を含む意味で使用される。「および／または」という用語は、列挙された要素の１つまたはすべて、または列挙された要素の任意の２またはそれを超える組み合わせを意味する。ある場合における「および／または」の使用は、他の場合における「または」の使用が「および／または」を意味しないことを意味するものではない。

【0022】

「好ましい」および「好ましくは」という用語は、特定の状況下で特定の利益をもたらし得る本開示の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況下では、他の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１またはそれを超える好ましい実施形態を列挙することは、他の実施形態が有用でないことを意味するものではなく、他の実施形態を本開示の範囲から除外することを意図するものではない。

【0023】

本明細書で使用される場合、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、オープンエンドの包括的な意味で使用され、一般に「含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」、「含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」、または「含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する。

【0024】

実施形態が「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの言語を用いて本明細書に記載されている場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」に関して記載されている他の類似の実施形態も提供されることが理解される。「からなる」という用語は、「からなる」という語句に続くものを含み、それに限定されることを意味する。つまり、「からなる」は、列挙された要素が必要であるかまたは必須であり、その他の要素が存在しないことを示す。「から本質的になる」という用語は、その語句の後に列挙された任意の要素が含まれること、および、列挙された要素について本開示で指定された活性または作用に干渉または寄与しない限り、列挙された要素以外の他の要素が含まれ得ることを示す。

【0025】

本明細書で使用される場合、「感染」という用語は、対象の体内の微生物の存在および増殖を指す。感染は臨床的には明らかでないこともあれば、微生物によって引き起こされる疾患に関連する症候をもたらすこともある。感染は、初期段階であっても後期段階であってもよい。微生物の例には、真菌および細菌が含まれる。

【0026】

本明細書を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、または「いくつかの実施形態」などへの言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構成、組成、または特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所に出現するそのような語句は、必ずしも本開示の同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、特定の特徴、構成、組成、または特性は、１またはそれを超える実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。

【0027】

本明細書で使用される場合、「アルキル」は、アルカンのラジカルである一価の基を指し、直鎖、分枝鎖、環式、および二環式アルキル基、ならびに非置換アルキル基と置換アルキル基の両方を含むそれらの組み合わせを含む、一価の基を指す。別段示されない限り、アルキル基は、通常、１～３０個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１～２０個の炭素原子、１～１０個の炭素原子、１～６個の炭素原子、１～４個の炭素原子、または１～３個の炭素原子を含む。「アルキル」基の例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソブチル、ｔ－ブチル、イソプロピル、ｎ－オクチル、ｎ－ヘプチル、エチルヘキシル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0028】

「アルキレン」という用語は、アルカンのラジカルである二価の基を指し、直鎖、分枝、環式、二環式、またはそれらの組み合わせである基を含む。別段示されない限り、アルキレン基は、通常、１～３０個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、アルキレン基は、１から２０個の炭素原子、１から１０個の炭素原子、１から６個の炭素原子または１から４個の炭素原子を有する。「アルキレン」基の例には、メチレン、エチレン、プロピレン、１，４－ブチレン、１，４－シクロヘキシレン、および１，４－シクロヘキシルジメチレンが含まれる。

【0029】

「アルケニル」という用語は、アルケンのラジカルである一価の基を指し、したがって直鎖、分枝鎖、環式、または組み合わせである基を含む。別段示されない限り、アルケニル基は、通常、１～３０個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、１から２０個の炭素原子、１から１０個の炭素原子、１から６個の炭素原子または１から４個の炭素原子を有する。アルケニル基は、１またはそれを超える二重結合を有する。二重結合の位置は、アルケニルに沿ったどこであってもよい。

【0030】

「主鎖」という用語は、最も長い連続した鎖を指す。１またはそれを超える分枝が主鎖に共有結合されていてもよい。

【0031】

本開示を通して、本開示の様々な態様は範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜のためおよび簡潔にするためのものであり、本開示の範囲を柔軟性なく限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を具体的に開示していると考えられるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0032】

本明細書の説明では、明確にするために特定の実施形態を単独で説明することがある。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と互換性がないことが特に明示的に指定されない限り、特定の実施形態は、１またはそれを超える実施形態に関連して本明細書に記載された互換性のある特徴の組み合わせを含むことができる。

【0033】

個別のステップを含む本明細書に開示される任意の方法について、ステップは任意の実行可能な順序で実行され得る。また、必要に応じて、２またはそれを超えるステップの任意の組み合わせが同時に実行されてもよい。

【0034】

本開示の上記の概要は、開示された各実施形態または本開示のすべての実施態様を説明することを意図するものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本出願全体のいくつかの場所では、様々な組み合わせで使用することができる例のリストを通してガイダンスが提供される。各例において、列挙されたリストは代表的な群としてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない。

【0035】

本開示の例示的な実施形態の以下の詳細な説明は、以下の図面と併せて読むと最もよく理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】図１Ａは、同一のαおよびβペプトイド鎖を示すＰＬＡＤリンカー上のコンビナトリアルペプトイドライブラリーＲＧＬ８の一般構造を示す。図１Ｂは、ライブラリーに一般的なカチオン性／両親媒性設計を与える、ＲＧＬ８に組み込まれたＲ基を示す。ペプトイドモノマーの略記号が記載されている。図１Ｃは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対するＲＧＬ８のＰＬＡＤスクリーニングからの、ＲＭＧ８－８を含有するビーズの周囲の阻害域を示す。図１Ｄは、位置番号およびペプトイドモノマーの略号を示したＲＭＧ８－８の構造を示す。

【0037】

【図2】図２Ａは、ＲＭＧ８－８の一般化された構造を示し、脂肪族Ｒ基およびカチオン性Ｃ基がペプトイドに使用するための可能なＮ－置換グリシン側鎖として示される。図２Ｂは、記載されたペプトイド化学を用いてＲＭＧ８－８誘導体に組み込むことができる、可能なＲおよびＣ官能基を示す。

【0038】

【図3】図３Ａは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対するＲＭＧ８－８の死滅動態研究の４回の反復からの、個々の増殖曲線を示す。挿入グラフは、研究の最初の３０分間を示し、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの生存集団が急速に減少している。図３Ｂは、図３ＡのＲＭＧ８－８死滅動態の半減期（ｔ_１／２）を得るための、時間に対する平均（ｎ＝４）増殖率のプロットを示す。

【0039】

【図4】図４Ａは、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムトレースを示す。図４Ｂは、２５％ヒト血清とともに０時間および２４時間インキュベートしたＲＭＧ８－８についての図４ＡのＨＰＬＣトレースの曲線下面積（ＡＵＣ）分析を示す（ｎｓ＝有意ではない（対応のあるｔ検定ｐ値＞０．１は有意差がないことを示す））。

【0040】

【図5】図５Ａは、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムトレースを示す。図５Ｂは、トリプシンとともに０時間および２４時間インキュベートしたＲＭＧ８－８についての図５ＡのＨＰＬＣトレースの曲線下面積（ＡＵＣ）分析を示す（ｎｓ＝有意ではない（対応のあるｔ検定ｐ値＞０．１は有意差がないことを示す））。

【0041】

【図6】図６は、陽性対照および陰性対照と比較した、様々な濃度のＲＭＧ８－８またはフルシトシンによるリポソームの平均（ｎ＝３）溶解率を示す。エラーバーは標準偏差を表す。^＊＊ｐ値≦０．０５；ｎｓ＝有意でない（ビヒクル対照と比較した対応のあるｔ検定は０％溶解を表す）。

【0042】

【図7】図７はＲＭＧ８－８の質量スペクトルである。

【0043】

【図8】図８は、化合物ＦＭＧ８－８およびペプトイド化合物１～７の構造を示す。

【0044】

【図9】図９は、ペプトイド化合物８～１３の構造を示す。

【0045】

【図10】図１０は、ペプトイド化合物１４～２５の構造を示す。

【発明を実施するための形態】

【0046】

詳細な説明
抗菌ペプトイド、その組成物、ならびに抗菌剤ペプトイドを作製および使用する方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、抗菌ペプトイドを含む組成物は、例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉもしくはＣ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、またはそれらの組み合わせを含むカンジダ属の種による感染；Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａによる感染；および／またはクリプトコッカス属の種、例えばＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓもしくはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ、またはそれらの組み合わせによる感染を含む、病原性真菌に感染しているか、または感染するリスクがある対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、抗菌ペプトイドを含む組成物は、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、黄色ブドウ球菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、緑膿菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、肺炎桿菌、大腸菌、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉもしくは結核菌、またはそれらの組み合わせを含む病原性細菌に感染しているか、または感染するリスクがある対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、抗菌ペプトイドを含む組成物は、例えばＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ、Ｐｈｏｍａ ｃｌｅｍａｔｉｄｉｎａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ ｒｏｓａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ、Ｐｈｙｓｏｄｅｒｍａ、Ｌａｅｔｉｓａｒｉａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｅｒｐｕｌａ ｌａｃｒｙｍａｎｓ、Ｓｙｎｃｈｙｔｒｉｕｍ ｅｎｄｏｂｉｏｔｉｃｕｍ、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔａｐｈｒｉｎａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｂｉｄｗｅｌｌｉｉ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｆｉｂｒｏｐｏｒｉａ ｖａｉｌｌａｎｔｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｏｘｙｃｏｃｃｉ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｃｏｎｉｏｐｈｏｒａ ｐｕｔｅａｎａ、Ｐｏｒｉａ ｖａｉｌｌａｎｔｉｉ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ、またはＰｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ－ｒｅｐｅｎｔｉｓａまたはそれらの組み合わせを含む病原性真菌に感染しているか、または感染するリスクがある植物、植物の種子、または植物が生育する土壌に投与することができる。

【0047】

抗菌ペプチドおよび抗菌ペプトイド

【0048】

科学界は、現代の医薬品の開発のためにエミュレートする天然に存在する化合物を広く探してきた。そのような群の１つが抗菌ペプチド（ＡＭＰ）である。これらのユビキタス化合物は、ほぼ１００年前にＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｆｌｅｍｉｎｇ（Ｎａｋａｔｓｕｊｉら、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １３２，８８７－８９５（２０１２））によって最初に発見された。ヒトを含む多くの生物が、病原性細菌および真菌に対する自然免疫系の一部としてＡＭＰを使用しているため（Ｚａｓｌｏｆｆ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２００２，４１５（６８７０），３８９－３９５）、ＡＭＰの毒性は低いと考えられ、多くの人々によって広く研究され続けている。ＡＭＰは、哺乳動物細胞よりも微生物に対する特異性が比較的高く、おそらく一般に認められている作用様式に起因する薬物耐性が観察されないことを考慮すると、臨床用抗菌剤として有利であり得る。一般に、ＡＭＰは、カチオン性残基ならびに疎水性領域を有し、全体的な両親媒性構造を形成する（Ｎａｋａｔｓｕｊｉら、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １３２，８８７－８９５（２０１２））。ＡＭＰはカチオン性であるため、微生物のアニオン性膜に結合し、細胞質成分の漏出をもたらす孔形成などの膜破壊機構を介して病原体を排除するように働き、最終的に病原体を死滅させる（Ｍａｔｅｊｕｋら、Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ３５ ３，１９７（２０１０））。ＡＭＰは潜在的な抗菌剤として有望であるが、臨床使用を妨げる欠点を有する。ＡＭＰは体内の分解性タンパク質分解酵素によって迅速に認識されて除去されるため、インビボでの半減期は短く、平均で１時間未満である（Ｃｈｏｎｇｓｉｒｉｗａｔａｎａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０５，２７９４－２７９９（２００８）；Ｇｒｅｅｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ，１０６０４８（２０２０））。この特性は、低いバイオアベイラビリティと相まって、ＡＭＰを臨床用抗菌剤の開発にとって困難なプラットフォームとなっている。

【0049】

ペプチド模倣薬の使用は、ＡＭＰの不十分さを克服する１つの方法である。Ｎ－置換オリゴグリシン、またはペプトイドは、側鎖をα－炭素上ではなくアミド主鎖の窒素上に置く。この独特の構造のために、ペプトイドはプロテアーゼによって認識されず、それらのペプチドカウンターパートよりも良好なインビボ安定性を有するが、依然として低い毒性を維持する（Ｃｈｏｎｇｓｉｒｉｗａｔａｎａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０５，２７９４－２７９９（２００８）；Ｅｖａｎｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２５、（２０２０）；Ｇｏｍｅｓ Ｖｏｎ Ｂｏｒｏｗｓｋｉら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９、（２０１８）；Ｍｏｊｓｏｓｋａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５９，４１１２－４１２０（２０１５）；Ｍｒｏｚら、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２、１－８（２０１９））。２０年以上前にペプトイドの抗菌活性が最初に実証されて以来（Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４３，１４２９－１４３４（１９９９））、多数の細菌、真菌、寄生虫、およびウイルスに対して抗菌ペプトイドが開発されている（Ｂｉｃｋｅｒら、Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）５６，１１１５８－１１１６８（２０２０）；Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２２，（２０１７））。有望な抗菌ペプトイドは、ＥＳＫＡＰＥ細菌（Ｃｈｏｎｇｓｉｒｉｗａｔａｎａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０５，２７９４－２７９９（２００８）；Ｃｈｏｎｇｓｉｒｉｗａｔａｎａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５５，４１７－４２０（２０１０）；Ｃｚｙｚｅｗｓｋｉら、ＰＬＯＳ ＯＮＥ １１，ｅ０１３５９６１（２０１６）；Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ，（２０２２）；Ｋａｐｏｏｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５５，３０５４－３０５７（２０１１）；Ｋｈａｒａら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１，（２０２０）；Ｍｏｊｓｏｓｋａら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，４２３３２（２０１７）；Ｐａｔｃｈら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５，１２０９２－１２０９３（２００３）；Ｔｕｒｋｅｔｔら、ＡＣＳ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９，２２９－２３３（２０１７）），Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｋａｐｏｏｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５５，３０５８－３０６２（２０１１）），ｆｕｎｇｉ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ，Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ，ａｎｄ Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ（Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ，（２０２２）；Ｃｏｒｓｏｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ７ １２，１１３９－１１４４（２０１６）；Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ １２ ９，１４７０－１４７７（２０２１）；Ｌｕｏら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ １８，１１１－１１８（２０１７）；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ２８ ２２，３５１４－３５１９（２０１８）；Ｓｐｉｃｅｒら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，ｅ２３２７６（２０１９）；Ｕｃｈｉｄａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０６，１９３７５－１９３８０（２００９））、ならびにＨＳＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むウイルス（Ｄｉａｍｏｎｄら、１４，（２０２１））に対して活性を有するものが開発されている。

【0050】

抗菌ペプトイド

【0051】

一態様では、本開示は、一般式Ｉ：

【化3】

の抗菌ペプトイドまたはその薬学的に許容され得る塩を記載する。

【0052】

式Ｉは、４つのＮ－置換グリシンリピートを有する抗菌ペプトイドである。各リピートは、抗菌ペプトイド主鎖のアミド窒素に結合した１つの側鎖（Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３またはＲ^４）を有する。抗菌ペプトイドは、Ｎ末端キャップ基Ｔ、任意の第２のＮ末端キャップ基Ａ^Ｘ（例えば、Ａ^Ｘは、ＨまたはＮ末端キャップ基Ｔであってよい）、およびＣ末端キャップ基Ｑを有する。

【0053】

一般に、Ｔは疎水性である。Ｔは、直鎖もしくは分枝鎖アルキル、または直鎖もしくは分枝鎖アルケニルであってよい。アルキルまたはアルケニルは、必要に応じてカルボニルを含んでもよい。好ましくは、カルボニル含有アルキルまたはアルケニル基は、一般式（ＣＯ）－Ｒ^２０の基であり、式中、Ｒ^２０はアルキルまたはアルケニル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ^２０は、少なくともＣ_６、少なくともＣ_１０または少なくともＣ_１５の直鎖アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^２０は、Ｃ_２０以下、Ｃ_１５以下またはＣ_１０以下の直鎖アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^２０は、（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキル、（Ｃ_６～Ｃ_１５）アルキルまたは（Ｃ_６～Ｃ_１０）アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^２０は、（Ｃ_１０～Ｃ_２０）アルキルまたは（Ｃ_１５～Ｃ_２０）アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^２０は、（Ｃ_１０～Ｃ_１５）アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^２０は、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシル、ｎ－トリデシル、ｎ－テトラデシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－ヘプタデシル、ｎ－オクタデシル、ｎ－ノナデシルおよびｎ－エイコサニルから選択される直鎖アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｔはパルミチン酸に由来する。そのような実施形態では、Ｔは、Ｒ^２０がｎ－ヘキシル（Ｃ_６Ｈ_１３）である、一般式（ＣＯ）－Ｒ^２０を有する。いくつかの実施形態において、Ｔはミリスチン酸に由来する。そのような実施形態では、Ｔは、Ｒ^２０がｎ－トリデシルである、一般式（ＣＯ）－Ｒ^２０を有する。いくつかの実施形態において、Ｔは、Ｒ^２０が直鎖（Ｃ_１５）アルキルである一般式（ＣＯ）－Ｒ^２０Ｒ^２０を有する。いくつかの実施形態において、Ｔは、Ｒ^２０が、直鎖（Ｃ_１３）アルキルである、一般式（ＣＯ）－Ｒ^２０を有する。

【0054】

いくつかの実施形態において、Ｔは、少なくともＣ_６、少なくともＣ_１０または少なくともＣ_１５の直鎖アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、Ｃ_２０以下、Ｃ_１５以下またはＣ_１０以下の直鎖アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、直鎖（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキル、直鎖（Ｃ_６～Ｃ_１５）アルキルまたは直鎖（Ｃ_６～Ｃ_１０）アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、直鎖（Ｃ_１０～Ｃ_２０）アルキルまたは直鎖（Ｃ_１５～Ｃ_２０）アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、直鎖（Ｃ_１０～Ｃ_１５）アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、直鎖アルキルであり、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシル、ｎ－トリデシル、ｎ－テトラデシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－ヘプタデシル、ｎ－オクタデシル、ｎ－ノナデシルまたはｎ－エイコサニルである。いくつかの実施形態によれば、Ｔは、ｎ－トリデシル（直鎖（Ｃ_１３）アルキル；Ｃ_１３Ｈ_２７；Ｎｔｒｉと呼ばれることもある）である。いくつかの実施形態によれば、Ｔは、ｎ－オクチル（直鎖（Ｃ_８）アルキル；Ｃ_８Ｈ_１７）である。いくつかの実施形態によれば、Ｔは、ｎ－ヘキシル（直鎖（Ｃ_６）アルキル；Ｃ_６Ｈ_１３）である。

【0055】

いくつかの実施形態において、Ｔは、分枝アルキルである。分枝アルキルは、主鎖と、主鎖に共有結合した１またはそれを超える分枝とを有する。いくつかの実施形態において、主鎖は、少なくともＣ_６、少なくともＣ_１０または少なくともＣ_１５のアルキルである。いくつかの実施形態において、主鎖は、Ｃ_２０以下、Ｃ_１５以下またはＣ_１０以下であるアルキルである。いくつかの実施形態において、主鎖は、（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキル、（Ｃ_６～Ｃ_１５）アルキルまたは（Ｃ_６～Ｃ_１０）アルキルである。いくつかの実施形態において、主鎖は、（Ｃ_１０～Ｃ_２０）アルキルまたは（Ｃ_１０～Ｃ_１５）アルキルである。いくつかの実施形態において、主鎖は、（Ｃ_１５～Ｃ_２０）アルキルである。

【0056】

１またはそれを超えるアルキル分枝は、分枝アルキルの主鎖に共有結合している。いくつかの実施形態において、分枝は、少なくともＣ_１、少なくともＣ_５、または少なくともＣ_１０のアルキルである。いくつかの実施形態において、分枝は、Ｃ_１０以下、Ｃ_５以下またはＣ_１以下であるアルキルである。いくつかの実施形態において、分枝は、（Ｃ_１～Ｃ_１０）アルキルまたは（Ｃ_１～Ｃ_５）アルキルである。いくつかの実施形態において、分枝は、（Ｃ_５～Ｃ_１０）アルキルである。いくつかの実施形態において、分枝アルキルのアルキル分枝は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシルである。いくつかの実施形態において、分枝アルキルは、主鎖に共有結合した単一のアルキル分枝を有する。主鎖に共有結合した単一のアルキル分枝を有する分枝アルキルの例としては、２－メチル－３－オクチル、４－メチル－４－デシル、または５－メチル－１０－オクタデシルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、分枝アルキルは、主鎖に共有結合した２またはそれを超える分枝を有する。主鎖に共有結合した２またはそれを超えるアルキル分枝を有する分枝アルキルの例としては、限定されないが、３，４－ジメチル－５－オクチル、１，３，４－トリメチル－５－デカリー、または３，４，５，６－テトラメチル－３－ヘキサデシルが挙げられる。

【0057】

いくつかの実施形態において、Ｔは、直鎖アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、少なくともＣ_６、少なくともＣ_１０または少なくともＣ_１５の直鎖アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、Ｃ_２０以下、Ｃ_１５以下又はＣ_１０以下の直鎖アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、直鎖（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルケニル、直鎖（Ｃ_６～Ｃ_１５）アルケニルまたは直鎖（Ｃ_６～Ｃ_１０）アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、直鎖（Ｃ_１０～Ｃ_２０）アルケニルまたは直鎖（Ｃ_１０～Ｃ_１５）アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、直鎖（Ｃ_１５～Ｃ_２０）アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｔは、ｎ－ヘキセニル、ｎ－ヘプテニル、ｎ－オクテニル、ｎ－ノネニル、ｎ－デセニル、ｎ－ウンデセニル、ｎ－ドデセニル、ｎ－トリデセニル、ｎ－テトラデセニル、ｎ－ペンタデセニル、ｎ－ヘキサデセニル、ｎ－ヘプタデセニル、ｎ－オクタデセニル、ノナデセニルおよびｎ－エイコセニルである。いくつかの実施形態において、直鎖アルケニルは、単一の二重結合を有し得る。単一の二重結合を有する直鎖アルケニルの例としては、３－ヘキセニル、５－オクテニル、１０－テトラデセニルまたは１５－ノナデセニルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、直鎖アルケニルは、２またはそれを超える二重結合を有し得る。炭素の総数（Ｃ_ｎ）が偶数である直鎖アルケニルの最大不飽和度、したがって最大二重結合数は、Ｃ_ｎ／２である。炭素の総数（Ｃ_ｎ）が奇数である直鎖アルケニルの最大不飽和度は、（Ｃ_ｎ－１）／２である。直鎖アルケニルが２またはそれを超える二重結合を有する実施形態では、二重結合はアルケニルに沿った任意の位置に配置され得る。２またはそれを超える二重結合を有する直鎖アルケニルの例としては、２，４－オクタデセニル、２，４，７－ヘプタデセニル、または３，５，７，９－エイコセニル（ｅｃｉｏｓｅｎｙｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0058】

いくつかの実施形態において、Ｔは、分枝アルケニルである。分枝アルケニルは、主鎖と、主鎖に共有結合した１またはそれを超える分枝とを有する。いくつかの実施形態において、主鎖は、少なくともＣ_６、少なくともＣ_１０、または少なくともＣ_１５のアルケニルである。いくつかの実施形態において、主鎖は、Ｃ_２０以下、Ｃ_１５以下またはＣ_１０以下であるアルケニルである。いくつかの実施形態において、主鎖は、（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルケニル、（Ｃ_６～Ｃ_１５）アルケニルまたは（Ｃ_６～Ｃ_１０）アルケニルである。いくつかの実施形態において、主鎖は、（Ｃ_１０～Ｃ_２０）アルケニルまたは（Ｃ_１０～Ｃ_１５）アルケニルである。いくつかの実施形態において、主鎖は、（Ｃ_１５～Ｃ_２０）アルケニルである。いくつかの実施形態において、主鎖は、（Ｃ_８）アルケニルである。いくつかの実施形態において、主鎖は、（Ｃ_１２）アルケニルである。いくつかの実施形態において、分枝アルケニルのアルケニル主鎖は、単一の二重結合を有し得る。単一の二重結合を有するアルケニル主鎖を有する分枝アルケニルの例としては、３－ヘキセニル、５－オクテニル、１０－テトラデセニルまたは１５－ノナデセニルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、分枝アルケニルのアルケニル主鎖は、２またはそれを超える二重結合を有する。炭素の総数（Ｃ_ｎ）が偶数であるアルケニル主鎖の最大不飽和度、したがって二重結合の最大数は、Ｃ_ｎ／２である。炭素の総数（Ｃ_ｎ）が奇数であるアルケニル主鎖の最大不飽和度は、（Ｃ_ｎ－１）／２である。分枝アルケニルのアルケニル主鎖が２またはそれを超える二重結合を有する実施形態では、二重結合は鎖に沿った任意の位置に配置され得る。いくつかの実施形態において、分枝アルケニルのアルケニル主鎖は、２つの二重結合を有する。いくつかの実施形態において、分枝アルケニルのアルケニル主鎖は、３つの二重結合を有する。

【0059】

１つまたはそれを超えるアルキル分枝は、分枝アルケニルの主鎖に共有結合している。いくつかの実施形態において、分枝は、少なくともＣ_１、少なくともＣ_５、または少なくともＣ_１０のアルキルである。いくつかの実施形態において、分枝は、Ｃ_１０以下、Ｃ_５以下またはＣ_１以下であるアルキルである。いくつかの実施形態において、分枝は、（Ｃ_１～Ｃ_１５）アルキルまたは（Ｃ_１～Ｃ_１０）アルキルである。いくつかの実施形態において、分枝は、（Ｃ_５～Ｃ_１０）アルキルである。いくつかの実施形態において、分枝は直鎖アルキルである。いくつかの実施形態において、分枝は、分枝アルキルである。いくつかの実施形態において、分枝は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルおよびドデシルから選択される。いくつかの実施形態において、分枝アルケニルの主鎖は、単一のアルキル分枝を有する。いくつかの実施形態において、分枝アルケニルの主鎖は、２またはそれを超えるアルキル分枝を有する。いくつかの実施形態において、分枝アルケニルのアルケニル主鎖は、２またはそれを超える二重結合および２またはそれを超える共有結合したアルキル分枝を有する。いくつかの実施形態において、Ｔは、シトリルである。いくつかの実施形態において、Ｔはファルネシルである。

【0060】

Ａ^Ｘは、第２のＮ末端キャップ基または水素原子（Ｈ）である。いくつかの実施形態において、Ａ^ＸはＨである。Ａ^ＸがＨでない実施形態では、Ａ^Ｘは、Ｔに関して説明した任意のＮ末端キャップ基であってよい。Ａ^ＸがＨでない実施形態では、Ａ^ＸおよびＴは同じであってよい。例えば、いくつかの実施形態において、Ａ^ＸとＴは両方ともｎ－トリデシル（Ｃ_１３Ｈ_２７）である。他の実施形態において、Ａ^ＸとＴの両方がｎ－ヘキシル（Ｃ_６Ｈ_１３）であり、Ｎｄｈａと呼ばれることもある。他の実施形態において、Ａ^ＸとＴの両方がｎ－オクチル（Ｃ_８Ｈ_１７）であり、Ｎｄｏａと呼ばれることもある。Ａ^ＸがＨでない実施形態では、Ａ^ＸとＴは同じでなくてもよい。

【0061】

いくつかの実施形態において、Ｑは水素である。

【0062】

いくつかの実施形態において、ＱはＮＨ_２である。

【0063】

式Ｉにおいて、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は各々独立に、抗菌ペプトイド主鎖の窒素に共有結合したＮ置換グリシン側鎖から選択される。

【0064】

一般に、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、各々独立に、Ｎｖａｌ、Ｎｈｅｘ、Ｎｌｅｕ、Ｎｃｐｅｎ、Ｎｃｈｅｘ、ＮｃｐｅｎＷ、ＮｌｉｎＷ、Ｎｐｈｎ、Ｎｘｘ、ＮｐｈＯ、ＮｐｈＸ、Ｎｎａｐｎ、Ｎｎａｉｎ、Ｎｉｎｄｎ、ＮａｐｅｎＺ、Ｎａｒｇ、サルコシン、または一般式Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３のアルキルアミンである。

【化4】

【0065】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせは、各々独立に、Ｎｃｐｅｎ、Ｎｃｈｅｘ、ＮｃｐｅｎＷ、Ｎｐｈｎ、ＮｐｈＯＨ、ＮｐｈＸ、Ｎｎａｐｎ、Ｎｎａｉｎ、Ｎｉｎｄｎ、ＮａｐｅｎＺ、またはそれらの組み合わせであり、各ｎは独立して０、１、または２である。

【0066】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｃｐｅｎＷまたはＮｌｉｎＷである場合、ＷはＯ、Ｓ、またはＮであり得る。

【0067】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｐｈＸである場合、Ｘはハロゲン、例えばフルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードである。環の周りのハロゲンのあらゆる置換パターンが許容される。例えば、ハロゲンは、抗菌ペプトイド主鎖に直接（例えば、ｎは０）または間接的に（例えば、ｎは１または２）結合しているフェニル環の炭素原子に対してオルト、メタまたはパラに位置することができる。少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｐｈＸである実施形態では、ＮｐｈＸはＮｐｆｂである。少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｐｈＸである実施形態では、ＮｐｈＸはＮｐｃｂである。少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｐｈＸである実施形態では、ＮｐｈＸはＮｐｂｂである。少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｐｈＸである実施形態では、ＮｐｈＸはＮｐｉｂである。

【化5】

【0068】

少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｐｈＯＨであるいくつかの実施形態において、環の周囲のヒドロキシル（ＯＨ）のあらゆる置換パターンが許容される。例えば、ヒドロキシルは、抗菌ペプトイド主鎖に直接（例えば、ｎは０）または間接的に（例えば、ｎは１または２）結合しているフェニル環の炭素原子に対してオルト、メタまたはパラに位置することができる。一実施形態によれば、ヒドロキシルは、抗菌ペプトイド主鎖に直接（例えば、ｎは０）または間接的に（例えば、ｎは１または２）結合しているフェニル環の炭素原子に対してパラである。少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｐｈＸである実施形態では、ＮｐｈＸはＮｔｙｒである。

【化6】

【0069】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｃｐｅｎである場合、ＮｃｐｅｎはＮｃｐａである。

【0070】

【化7】

【0071】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｃｈｅｘである場合、ＮｃｈｅｘはＮｃｈａである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｃｈｅｘである場合、ＮｃｈｅｘはＮＣｈｍである。

【化8】

【0072】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｃｐｅｎＷである場合、ＮｃｐｅｎＷはＮｔｈｆである。

【化9】

【0073】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｌｉｎＷである場合、ＮｌｉｎＷはＮｍｅａである。

【化10】

【0074】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｐｈｎである場合、ＮｐｈｎはＮａｉｎである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｐｈｎである場合、ＮｐｈｎはＮｐｈｅである。

【化11】

【0075】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｎａｐｎである場合、ＮｎａｐｎはＮｎａｐである。

【化12】

【0076】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｎａｉｎである場合、ＮｎａｉｎはＮａｉｎである。

【化13】

【0077】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｉｎｄｎである場合、ＮｉｎｄｎはＮｈｔｒｐである。

【化14】

【0078】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮａｐｅｎＺである場合、ＮａｐｅｎＺはＮｆｕｒである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮａｐｅｎＺである場合、ＮａｐｅｎＺはＮｔｍａである。

【化15】

【0079】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｘｘである場合、メチル基が結合している炭素は、Ｒ立体化学（ＮｘｘＩ）を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせがＮｘｘである場合、メチル基が結合している炭素は、Ｓ立体化学（Ｎｓｐｅ）を有する。

【0080】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、またはそれらの組み合わせは、一般式Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３のアルキルアミンである。Ｒ^１０は、抗菌ペプトイドの主鎖の窒素に共有結合しているアルキレンである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１０は、少なくともＣ_１または少なくともＣ_３のものである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１０は、Ｃ_６以下またはＣ_３以下である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１０は、（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキレンである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１０は、（Ｃ_１～Ｃ_３）アルキレンである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１０は、（Ｃ_３～Ｃ_６）アルキレンである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１０は、（Ｃ_２）アルキレン、（Ｃ_３）アルキレンまたは（Ｃ_４）アルキレンである。Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、各々独立に、Ｈまたは（Ｃ_１～Ｃ_３）アルキルから選択される。いくつかの実施形態において、アルキル鎖は、メチル、エチルまたはｎ－プロピルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２は、Ｈであり、Ｒ^１３は、（Ｃ_１～Ｃ_３）アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１は、Ｈであり、Ｒ^１２およびＲ^１３は、各々独立に、（Ｃ_１～Ｃ_３）アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、各々独立に、（Ｃ_１～Ｃ_３）アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１は、Ｈであり、Ｒ^１２およびＲ^１３は、メチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、メチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２は、Ｈであり、Ｒ^１３は、メチルである。一実施形態によれば、アルキルアミンはＮｌｙｓである。一実施形態によれば、アルキルアミンはＮａｐである。一実施形態によれば、アルキルアミンはＮａｅである。一実施形態によれば、アルキルアミンはＮｌｙｓ（ｍｅ）_３である。一実施形態によれば、アルキルアミンはＮａｅである。一実施形態によれば、アルキルアミンは、Ｎａｐ（ｍｅ）_３である。一実施形態によれば、アルキルアミンはＮａｅである。一実施形態によれば、アルキルアミンはＮａｅ（ｍｅ）_３である。いくつかの実施形態において、Ｎｌｙｓ、Ｎａｐ、および／またはＮａｅの窒素はプロトン化されていてもよく、したがって形式電荷を有することがある。

【化16】

【0081】

式Ｉの抗菌ペプトイドは、本明細書に記載の任意のＴ、本明細書に記載の任意のＡ^Ｘを有することができ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４の各々は、各々独立に、本明細書に記載の任意の基であってよい。

【0082】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な一実施形態では、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３および／またはＲ^４がＮｌｙｓであり、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３および／またはＲ^４がＮａｅである。

【0083】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な一実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３および／またはＲ^４のうち少なくとも２つがＮｃｈａである。

【0084】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ｒ^１およびＲ^４は、各々独立に、Ｎｖａｌ、Ｎｈｅｘ、Ｎｌｅｕ、Ｎｃｐｅｎ、ＮｃｅｐｎＷ、ＮｌｉｎＷ、Ｎｐｈｎ、Ｎｘｘ、ＮｐＯＨ、ＮｐｈＸ、Ｎｎａｐｎ、Ｎｎａｉｎ、Ｎｉｎｄｎ、ＮａｐｅｎＺ、またはサルコシンであり、Ｒ^２およびＲ^４は、各々独立に、Ｎａｒｇであるか、または一般式Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３のアルキルアミンであり、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、本明細書に記載のように提供される。

【0085】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれかはサルコシンであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓである。

【0086】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、Ｑはヒドロキシルであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0087】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0088】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか２つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか２つはＮｃｈａである。

【0089】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓ（ｍｅ）_３であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅ（ｍｅ）_３である。

【0090】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のうちのいずれか２つはＮａｅ（ｍｅ）_３である。

【0091】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のうちのいずれか２つはＮｖａｌであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0092】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｌｅｕであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0093】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のうちのいずれか２つはＮｈｅｘであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0094】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のうちのいずれか２つはＮｃｐａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0095】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のうちのいずれか２つはＮｃｈｍであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0096】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｔｈｆであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0097】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか２つはＮａｉｎであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0098】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｐｈｅであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0099】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のうちのいずれか２つはＮｘｘ（Ｓ）であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0100】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｐｆｂであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0101】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｐｃｂであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0102】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｐｂｂであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0103】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｐｉｂであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0104】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のうちのいずれか２つはＮｎａｐであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0105】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のうちのいずれか２つはＮｎａｉｎであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0106】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｈｔｒｐであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0107】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｆｕｒであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0108】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｔｍａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0109】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_６）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0110】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_８）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0111】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１５）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0112】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは直鎖（Ｃ_１７）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0113】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^Ｘは直鎖（Ｃ_６）アルキルであり、Ｔは直鎖（Ｃ_６）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0114】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^Ｘは直鎖（Ｃ_８）アルキルであり、Ｔは直鎖（Ｃ_８）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0115】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは、－Ｃ（Ｏ）－直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0116】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態では、Ａ^ＸはＨであり、Ｔは、－Ｃ（Ｏ）－直鎖（Ｃ_１７）アルキルであり、ＱはＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４のいずれか２つはＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つはＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のいずれか１つはＮａｅである。

【0117】

式Ｉの抗菌ペプトイドの例示的な実施形態を表１に示す。

【表1-1】

【表1-2】

【0118】

抗菌ペプトイドの作製方法

【0119】

一般に、抗菌ペプトイドは、サブモノマープロトコルを用いてＮ末端からＣ末端に合成される（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，１０６４６－１０６４７（１９９２））。抗菌ペプトイドは、マイクロ波支援を用いて樹脂上で合成してもよいし、マイクロ波支援を用いずに樹脂上で合成してもよいし、マイクロ波支援を用いて溶液中で合成してもよいし、マイクロ波支援を用いずに溶液中で合成してもよい。ペプトイド合成は、一般に、６つの工程：樹脂調製、アシル化、アミンカップリング、切断、保護基が存在する場合は随意の保護基の脱保護、および末端官能化を含む。本開示の抗菌ペプトイドは、マイクロ波支援を用いて樹脂上で合成することができる。一般式Ｉの化合物のペプトイド合成の例示的な方法は以下の通りである。Ｆｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で樹脂を膨潤させることにより調製される。Ｆｍｏｃ保護基は、ＤＭＦ中１０～４０％ピペリジンを用いて５～６０分間樹脂を撹拌することによって除去することができ、遊離アミンを得ることができる。いくつかの実施形態において、Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで樹脂を２０分間撹拌することにより行われる。遊離アミンは、樹脂、１～４Ｍブロモ酢酸、１～６ＭジイソプロピルカルボジイミドおよびＤＭＦを混合することによりアシル化されて、β炭素上にブロモ基を有するアミドを得ることができる。いくつかの実施形態において、樹脂上のアミンは、樹脂、２Ｍブロモ酢酸、３．２ＭジイソプロピルカルボジイミドおよびＤＭＦを混合することによってアシル化される。アシル化に続いて、一般式ＮＨ_２－Ｒで表されるアミン１～６Ｍを樹脂に添加する。置換反応が起こり、ブロモ基がβ炭素上のＮＨ_２－Ｒ基によって置換され、それにより、アミンがアシル化工程で形成されたアミドにカップリングされる。いくつかの実施形態において、２Ｍの一般式ＮＨ_２－Ｒのアミンを樹脂に添加して、置換反応を完了させる。アシル化およびアミンカップリング工程は、所望の抗菌ペプトイド配列に達するまで繰り返される。樹脂からの切断の前または後に、Ｃ末端を官能化することができる。ペプトイドは、トリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシランのカクテルを使用して樹脂から切断することができる。樹脂からの切断した後、Ｎ末端を官能化することができる。

【0120】

抗菌ペプトイドの試験方法

【0121】

本開示の抗菌ペプトイドは、生物活性を有し得る。生物活性は、微生物、例えば病原真菌、病原細菌、またはそれらの組み合わせに対する抗菌活性であり得る。ペプトイドライブラリー寒天拡散（ＰＬＡＤ）アッセイを使用して、抗菌活性を有するペプトイド（Ｆｉｓｃｈｅｒら、ＡＣＳ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．１８，２８７－２９１（２０１６）；Ｃｏｒｓｏｎら、ＡＣＳ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７，１１３９－１１４４（２０１６）；Ｔｕｒｋｅｔｔら、ＡＣＳ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．１８，２８７－２９１（２０１６））を同定することができる。ＰＬＡＤアッセイは、ＰＬＡＤ化学リンカーを使用する。ＰＬＡＤ化学リンカーは、目的のペプトイドの２つの同一の鎖、αおよびβを提示し、各鎖は、異なる化学刺激に応答して放出され得る（Ｆｉｓｃｈｅｒら、ＡＣＳ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．１８，２８７－２９１（２０１６））。ＰＬＡＤ結合ペプトイドを含有するビーズを寒天培地に埋め込み、その寒天培地に目的の微生物を接種する。β鎖ペプトイドは還元試薬によって放出される。還元剤は、ＰＬＡＤリンカー内のジスルフィドを切断し、β鎖ペプトイドがビーズの周囲の微生物と相互作用することを可能にする。放出されたペプトイドが抗菌活性を有する場合、増殖阻害域が存在することになる。α鎖ペプトイドは、スクリーニングプロセスの間はビーズに付着したままである。α鎖ペプトイドは、増殖阻害域を示すビーズから切断される。α鎖ペプトイドの化学的切断は、臭化シアンを用いてＰＬＡＤリンカーのＣ末端メチオニンで達成される。質量分析配列決定を使用して、増殖阻害域を示したβ鎖ペプトイドに対応するα鎖ペプトイドの構造を決定する。ＰＬＡＤアッセイは、アッセイパラメータのわずかな改変によって、さまざまな種類の目的の微生物に対して目的のペプトイドをスクリーニングするように適合させることができる。ＰＬＡＤアッセイで用いることのできる微生物の例としては、病原真菌および病原細菌が挙げられる。

【0122】

最小阻害濃度（ＭＩＣ）アッセイを使用して、目的の微生物に対するペプトイドの活性を決定することができる。ＭＩＣアッセイは、臨床検査標準協会に整理されているガイドラインを介して行うことができる。ＭＩＣアッセイの例では、目的のペプトイドは、目的の微生物を含有する溶液に希釈される。ペプトイド－微生物溶液は、設定温度、例えば３７℃で設定された時間インキュベートされる。インキュベーション後の微生物の増殖または増殖の欠如は、手動観察によって、または細胞生存性色素および蛍光測定の助けを借りて決定することができる。ＭＩＣアッセイは、技術的および生物学的複製物を用いて実施することができる。目的の微生物を死滅させることが知られている化合物を陽性対照として含めることができる。ＭＩＣは、一般に、微生物の増殖を防ぐ、目的のペプトイドの最低濃度として定義される。ＭＩＣアッセイで用いることのできる微生物の例としては、病原真菌および病原細菌が挙げられる。

【0123】

死滅時間アッセイを使用して、目的のペプトイドが目的の微生物を死滅させるのにかかる時間を測定することができる。死滅時間アッセイの一例では、目的のペプトイドは、目的の微生物の溶液に希釈される。溶液は、ある温度で一定時間インキュベートされる。様々な時点で、溶液から試料が収集され、希釈され、洗浄され、再懸濁され、寒天プレート上にプレーティングされる。プレートは、ある温度で一定時間インキュベートすることができる。インキュベーション後、プレート上のコロニーを計数して、採取した各時点で１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を決定する。死滅率は、ＣＦＵ／ｍＬ対時間をプロットすることによって計算される。

【0124】

相乗作用アッセイを使用して、ＭＩＣアッセイを介して、目的の微生物に対する目的のペプトイドと追加の目的の化合物の相乗作用を決定することができる。相乗作用アッセイ形式の例では、目的のペプトイドおよび追加の目的の化合物を、目的の微生物とともに一定時間インキュベートする。ＭＩＣは、微生物の増殖を阻害する個々の化合物または組み合わせた化合物の最低濃度として定義される。部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）は、以下の式を使用して決定される。

【数1】

【0125】

ＦＩＣｉ値は以下のように解釈される：ＦＩＣｉ＜０．５相乗的；０．５≦ＦＩＣｉ≦４無関係；ＦＩＣｉ＞４拮抗的。ＭＩＣアッセイで用いることのできる微生物の例としては、病原真菌および病原細菌が挙げられる。相乗作用アッセイの実施の詳細については、実施例１を参照されたい。

【0126】

目的のペプトイドは、治療処置としてのそれらの使用を評価するためにインビボ実験によって評価することもできる。インビボ生物モデルには、植物、マウス、ラット、ネコ、ブタ、ウシ、サル、およびヒトが含まれ得るが、これらに限定されない。

【0127】

組成物および方法

【0128】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の少なくとも１つの抗菌ペプトイド、またはその塩を有効成分として含む組成物を記載する。本開示の文脈内で、抗菌ペプトイドの記載には、抗菌ペプトイドの遊離塩基および／または薬学的に許容され得る塩としての抗菌ペプトイドが含まれると理解される。「遊離塩基」という用語は、１つまたは複数のアミンの共役塩基（非プロトン化）を指す。抗菌ペプトイドの薬学的に許容され得る塩は、適切な対イオン（例えば、アニオンまたはカチオン）への１またはそれを超えるイオン結合を介して中和されたイオン化原薬またはイオン化可能な原薬を指す。本明細書に記載の任意の抗菌ペプトイドは、本明細書に記載の任意の組成物中の活性成分であり得る。

【0129】

複数の実施形態では、組成物は、医薬組成物である。医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体とともに製剤化されてよい。本明細書で使用される場合、「担体」には、任意の溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質のためのそのような媒体および／または薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図される。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る」は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない材料を指し、例えば、その材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、または、それが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、抗菌ペプトイドまたはその薬学的に許容される塩とともに個体に投与され得る。

【0130】

少なくとも１つの抗菌ペプトイドは、医薬組成物に製剤化され、次いで、本開示の方法に従って、脊椎動物、特にヒト患者、コンパニオンアニマル、または飼育動物などの哺乳動物に、選択された投与経路に適合した様々な形態で投与される。製剤には、経口、直腸、膣、局所、経鼻、眼または非経口（皮下、筋肉内、腹腔内、および静脈内を含む）投与に適したものが含まれる。製剤は、所与投与経路による送達に適した形態で好都合に提供されてよく、薬学の分野で周知の方法によって調製されてよい。

【0131】

いくつかの実施形態において、抗菌剤は、抗真菌化合物などの１またはそれを超える追加の活性剤と組み合わせて製剤化される。本質的に、任意の公知の治療剤を追加の活性剤として含めることができる。併用治療における追加の活性剤の作用は、抗菌ペプトイドに対して累積的であってもよく、または例えば、患者の医学的症状の副作用または他の態様を管理するために補完的であってもよい。いくつかの態様では、併用治療は、アゾール、ポリエン、フルオロシトシン、アムホテリシンＢ、フルコナゾール、および／またはエキノキャンディンを含む。

【0132】

いくつかの実施形態において、組成物は殺真菌組成物である。殺真菌組成物には、活性剤として、本明細書に記載の抗菌ペプトイドまたはその塩、および殺真菌性の許容され得る担体が含まれる。本開示の少なくとも１つの抗菌ペプトイドは、殺真菌組成物中に製剤化され、その後、本開示の方法に従って、植物、植物の種子、または植物が生育する土壌に投与される。製剤には、植物が成長する土壌を処置するかまたは植物を直接処置するために適したものが含まれる。製剤の種類には、ベイト、ゲル、粉末、水分散性顆粒、乾燥粉末、可溶性粉末、乾燥顆粒、ペレット、エマルジョン、溶液、懸濁液、含浸製品、肥料の組み合わせ、またはエアロゾルが含まれ得る。

【0133】

殺真菌剤の許容され得る担体には、賦形剤が含まれていてもよい。賦形剤は、例えば、希釈剤、溶媒またはアジュバントが含まれ得る。アジュバントには、相溶化剤、活性化剤、緩衝剤、消泡剤、スプレー着色剤、ドリフト制御剤、水質調整剤および界面活性剤が含まれ得る。

【0134】

いくつかの実施形態において、抗菌ペプトイドは、１またはそれを超える追加の活性剤、例えば殺真菌化合物と組み合わせて製剤化される。任意の公知の植物処置剤が、追加の活性剤として含められてよい。併用治療における追加の活性剤の作用は、抗菌ペプトイドに対して累積的であってもよいし、補完的であってもよい。いくつかの実施形態において、併用治療は、１またはそれを超える殺真菌剤、例えば、アゾキシストロビン、ベノミル、プロピコナゾール、トリシクラゾール、カルベンダジム、メタラキシル、ジフェノカナゾール、ヘキサコナゾール、アシベンゾラル、ポリオキシンＤ塩、フルオキサストロビン、炭酸、リン酸の一および二カリウム塩、シモキサニル、クロロタロニル、テブコナゾール、塩化銅、水酸化銅、鉱油、ピラクロストロビン、硫酸銅、シモキサニル、マンコゼブ、ボスカリド、トリフルキシストロビン、ジメトモルフ、過炭酸ナトリウム、チオファネートメチル、酢酸銅アンモニウム、硫黄、テブコナゾール、ホセチル－Ａｌ、ミクロブタニル、ジアゾファミド、フェナミドン、ミクロブタニル、クレソキシムメチルまたはメトラフェノンを含むがこれに限定されない。

【0135】

実施形態では、抗菌ペプトイド、またはこれを含有する医薬組成物は、ヒト患者、コンパニオンアニマル、または飼育動物を含むがこれらに限定されない脊椎動物における真菌または細菌の感染および疾患の処置、制御または予防に有用であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、有効量の少なくとも１つの抗菌ペプトイドを含む組成物（例えば、医薬組成物）を対象に投与することを含む方法を記載する。

【0136】

抗菌ペプトイドまたはこれを含有する医薬組成物を使用して、真菌感染症を処置または予防することができる。例示的な真菌感染症には、例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、またはＣ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、またはそれらの組み合わせを含む、カンジダ属の種による感染；Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａによる感染症；および／またはクリプトコッカス属の種、例えばＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓもしくはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ、またはそれらの組み合わせによる感染症を含むがこれらに限定されない。

【0137】

式Ｉの抗菌ペプトイドまたはこれを含有する医薬組成物を使用して、細菌感染症を処置または予防することができる。細菌感染には、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、またはマイコバクテリウムによる感染が含まれ得る。いくつかの実施形態において、グラム陰性細菌には、緑膿菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、肺炎桿菌、大腸菌、もしくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。いくつかの実施形態において、グラム陽性細菌には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、黄色ブドウ球菌、もしくはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。いくつかの実施形態において、マイコバクテリウムには、結核菌が含まれる。

【0138】

本開示は、抗菌ペプトイド、またはそれを含有する医薬組成物を対象に投与することによって、真菌または細菌による感染症に罹患している対象を処置する治療方法を提供する。治療的処置は、真菌もしくは細菌による感染の症候の発症前、診断前、診断後、または感染の症候の発症後に開始することができる。

【0139】

抗菌ペプトイドまたはこれを含有する医薬組成物は、真菌または細菌による感染の発生を予防または遅延させるために、予防的に投与することもできる。例えば予防的な処置は、リスクのある対象が真菌または細菌による感染の症候を呈する前に開始することができる。本明細書で使用される場合、「リスクがある」という用語は、記載されたリスクを実際に有していても有していなくてもよい対象を指す。したがって、例えば、感染症状の「リスクがある」対象は、他の個体が感染症状を有すると同定されている領域に存在する対象、および／または、微生物による感染の検出可能な徴候を対象がまだ示していなくても、また、対象が不顕性量の微生物を有しているかどうかにかかわらず、感染病原体に曝露される可能性が高い対象である。真菌または細菌による感染症を発症するリスクが特にある対象の例は、免疫不全の人である。処置は、感染の症候の診断もしくは発症の前、間、または後に行うことができる。症候の発症後に処置を開始すると、いずれかの症状の症候の重症度が軽減されるか、または症状が完全に除去されることがある。抗菌ペプトイドまたはこれを含有する医薬組成物は、真菌もしくは細菌感染症のどの段階でも、脊椎動物、例えば哺乳動物に導入することができる。

【0140】

抗菌ペプトイドまたはこれを含有する医薬組成物の投与は、他の処置の前、間および／または後に行うことができる。そのような併用治療は、他の抗真菌剤または抗菌剤の使用中および／または使用後に、抗菌ペプトイドまたはこれを含有する医薬組成物の投与を伴い得る。抗菌ペプトイドまたはこれを含有する医薬組成物の投与は、他の抗真菌剤の投与から数時間、数日、または数週間、時間が離れていてもよい。

【0141】

抗菌ペプトイドまたはこれを含有する組成物は、ヒトだけでなく動物においても、真菌もしくは細菌の感染および疾患の処置、制御または予防に有用であり得る。抗菌ペプトイドまたはこれを含有する医薬組成物は、コンパニオンアニマル、家畜などの飼育動物、研究に使用される動物、または野生動物に投与することができる。コンパニオン動物には、イヌ、ネコ、ハムスター、スナネズミおよびモルモットが含まれるが、これらに限定されない。飼育動物には、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびラマが含まれるが、これらに限定されない。研究動物には、マウス、ラット、イヌ、類人猿およびサルが含まれるが、これらに限定されない。投与は、例えば、小規模または大規模な公衆衛生感染制御プログラムの一部であり得る。抗菌ペプトイドまたはこれを含有する組成物は、例えば、野生動物または飼育動物集団における真菌感染を低減、制御または除去するための予防手段として動物飼料に添加され得る。抗菌ペプトイドまたはこれを含有する組成物は、例えば、コンパニオンアニマルまたは飼育動物または動物集団の日常的なまたは特殊な獣医学的処置の一部として投与され得る。化合物の投与は、真菌もしくは細菌感染症またはそれに関連する症候を軽減または除去するため；対象内の感染または症候の進行を停止または遅延させるため；および／または集団内の感染の拡大、または別の集団への感染の移動を制御、制限、または防止するために有効であり得ることを理解されたい。

【0142】

実施形態では、抗菌ペプトイドまたはこれを含有する殺真菌組成物は、植物の真菌感染の処置、防除または予防に有用であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、有効量の抗菌ペプトイドを含む殺真菌組成物、またはこれを含有する殺真菌組成物を植物に投与することを含む方法を記載する。
例示的な真菌感染症には、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ、Ｐｈｏｍａ ｃｌｅｍａｔｉｄｉｎａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ ｒｏｓａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ、Ｐｈｙｓｏｄｅｒｍａ、Ｌａｅｔｉｓａｒｉａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｅｒｐｕｌａ ｌａｃｒｙｍａｎｓ、Ｓｙｎｃｈｙｔｒｉｕｍ ｅｎｄｏｂｉｏｔｉｃｕｍ、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔａｐｈｒｉｎａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｂｉｄｗｅｌｌｉｉ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｆｉｂｒｏｐｏｒｉａ ｖａｉｌｌａｎｔｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｏｘｙｃｏｃｃｉ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｃｏｎｉｏｐｈｏｒａ ｐｕｔｅａｎａ、Ｐｏｒｉａ ｖａｉｌｌａｎｔｉｉ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ、またはＰｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ－ｒｅｐｅｎｔｉｓａ、またはそれらの組み合わせによる感染を含むがこれらに限定されない。本開示は、真菌感染症を有するか、または真菌感染症を発症するリスクがある植物を、抗菌ペプトイドまたはこれを含有する殺真菌組成物を対象に投与することによって処置する治療方法を提供する。治療的処置は、診断前、真菌による感染の症候の発症前、診断後、または真菌による感染の症候の発症後に開始することができる。

【0143】

抗菌ペプトイドまたはこれを含有する殺真菌組成物はまた、真菌による感染の発生を予防または遅延させるために予防的に投与することもできる。例えば、予防的な処置は、植物が真菌による感染の症候を呈する前に開始することができる。抗菌ペプトイドまたはこれを含有する殺真菌組成物は、真菌感染のどの段階でも植物に導入することができる。

【0144】

抗菌ペプトイドまたはこれを含有する殺真菌組成物の植物への投与は、小規模または大規模な植物健康感染制御プログラムの一部となり得る。ペプトイドまたはこれを含有する殺真菌組成物は、例えば、作物集団における真菌感染を低減、防除または除去するための予防手段として肥料に添加することができる。ペプトイドまたはこれを含有する殺真菌組成物の投与は、真菌感染症またはそれに関連する症候を軽減または除去するため；対象内の感染または症候の進行を停止または遅延させるため；および／または集団内の感染の拡大、または別の集団への感染の移動を制御、制限、または防止するために有効であり得ることを理解されたい。
実施形態では、抗菌ペプトイドまたはこれを含有する組成物は、健康または栄養補助食品として有用であり得る。したがって、抗菌ペプトイドまたはこれを含有する組成物は、栄養補助食品、健康補助食品または栄養補助食品として（例えば、丸剤またはカプセル剤の形態で）包装されてもよい。さらに、抗菌ペプトイドまたはこれを含有する組成物を食品に添加して、一般に「栄養補助」食品または「機能性」食品と呼ばれるものを得ることができる。抗菌ペプトイドまたはこれを含有する組成物が添加され得る食品としては、動物飼料、シリアル、ヨーグルト、カッテージチーズ、および他の乳製品、硬化油または部分硬化油を含む油、スープ、および飲料が挙げられるが、これらに限定されない。１またはそれを超える親油性または疎水性置換を有する抗菌ペプトイドは、可溶化を促進するために、油性または脂肪性食品に組み込まれることが好ましい。

【0145】

本発明は、特許請求の範囲で定義される。しかしながら、以下に、非限定的な例示的態様の非網羅的なリストを提供する。これらの態様の任意の１またはそれを超える特徴は、本明細書に記載の別の例、実施形態、または態様の任意の１またはそれを超える特徴と組み合わせることができる。
例示的な態様

【0146】

態様１．態様１は、一般式

【化17】

｛式中、
Ａ^Ｘは、Ｈまたは直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキルまたは直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルケニルであり、前記アルキルまたは前記アルケニルは、必要に応じてカルボニル基を含み；
Ｔは、直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキルまたは直鎖もしくは分枝鎖の（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルケニルであり、前記アルキルまたは前記アルケニルは、必要に応じてカルボニル基を含み；
Ｑは、ヒドロキシルまたはＮＨ_２であり；かつ
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、各々独立して

【化18】

または一般式Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３のアルキルアミンであり、
（式中、
各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各ｎは、０、１、または２であり；
ＮｃｐｅｎＷである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｗは独立にＮ、Ｓ、またはＯであり；
ＮｌｉｎＷである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｗは独立にＮ、Ｓ、またはＯであり；
ＮｐｈＸである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｘは独立にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり；
ＮａｐｅｎＺである各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、各Ｚは独立にＳ、またはＯであり；
Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３である各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、Ｒ^１０は直鎖（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキレンであり；かつ
Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３である各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、および／またはＲ^４について、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、各々独立にＨまたは（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルである）｝
の化合物である。

【0147】

態様２．態様２は、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４が各々独立に

【化19-1】

【化19-2】

である、請求項１に記載の化合物である。

【0148】

態様３．態様３は、Ｒ^１およびＲ^４が各々独立に、Ｎｖａｌ、Ｎｈｅｘ、Ｎｌｅｕ、Ｎｃｐｅｎ、ＮｃｅｐｎＷ、ＮｌｉｎＷ、Ｎｐｈｎ、Ｎｘｘ、ＮｐＯＨ、ＮｐｈＸ、Ｎｎａｐｎ、Ｎｎａｉｎ、Ｎｉｎｄｎ、ＮａｐｅｎＺ、またはサルコシンであり、Ｒ^２およびＲ^４が各々独立に、Ｎａｒｇ、または一般式Ｒ^１０ＮＲ^１１Ｒ^１２Ｒ^１３のアルキルアミンである、態様１～２のいずれか１つの化合物である。

【0149】

態様４．態様３は、Ｔが直鎖（Ｃ_６）アルキル、直鎖（Ｃ_１３）アルキル、直鎖（Ｃ_１５）アルキル、直鎖（Ｃ_１７）アルキル、シトリル、ファルネシルであるか、または一般式（ＣＯ）－Ｒ^２０（式中、Ｒ^２０は（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキルである）のものである、態様１～３のいずれか１つの化合物である。

【0150】

態様５．態様３は、Ａ^Ｘが直鎖（Ｃ_６）アルキル、直鎖（Ｃ_６）アルキル、直鎖（Ｃ_１３）アルキル、直鎖（Ｃ_１５）アルキル、直鎖（Ｃ_１７）アルキルであるか、またはＲ^２０が（Ｃ_６～Ｃ_２０）アルキルである一般式（ＣＯ）－Ｒ^２０のものである、態様１～４のいずれか１つの化合物である。

【0151】

態様６．態様６は、Ａ^ＸがＨではなく、Ａ^ＸとＴが同じである、態様１～５のいずれか１つの化合物である。

【0152】

態様７．態様６は、Ａ^ＸがＨであり、Ｔが直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱがＮＨ_２である、態様１～６のいずれか１つの化合物である。

【0153】

態様８．態様８は、Ｒ^１０が直鎖（Ｃ_２～Ｃ_４）アルキレンである、態様１～７のいずれか１つの化合物である。

【0154】

態様９．態様９は、Ｒ^１１、Ｒ^１２、およびＲ^１３がメチルである、態様１～８のいずれか１つの化合物である。

【0155】

態様１０．態様１０は、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３および／またはＲ^４がＮｌｙｓであり、少なくとも１つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３および／またはＲ^４がＮａｅである、態様１～９のいずれか１つの化合物である。

【0156】

態様１１．態様１１は、少なくとも２つのＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３および／またはＲ^４がＮｃｈａである、態様１～１０のいずれか１つの化合物である。

【0157】

態様１２．態様１２は、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つがＮｌｙｓであり；Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つがＮｃｈａであり；Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つがＮａｅである、態様１～１１のいずれか１つの化合物である。

【0158】

態様１３．態様１３は、Ａ^ＸがＨであり、Ｔが直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱがＮＨ_２であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つがＮｌｙｓであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか２つがＮｃｈａであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のいずれか１つがＮａｅである、態様１～１２のいずれか１つの化合物である。

【0159】

態様１４．態様１４は、Ａ^ＸがＨであり、Ｔが直鎖（Ｃ_１３）アルキルであり、ＱがＮＨ_２であり、Ｒ^１がＮｃｈａであり、Ｒ^２がＮｌｙｓであり、Ｒ^３がＮａｅであり、Ｒ^４がＮｃｈａである、態様１～１３のいずれか１つの化合物である。

【0160】

態様１５．態様１４は、態様１～１４のいずれか１つの化合物またはその薬学的に許容され得る塩を含む医薬組成物である。

【0161】

態様１６．態様１５は、態様１５の組成物を対象に投与することを含む方法である。

【0162】

態様１７．態様１７は、対象がヒトまたは動物である、態様１６の方法である。

【0163】

態様１８．態様１８は、対象の真菌感染症を処置または予防することをさらに含む、態様１６～１７のいずれか１つの方法である。

【0164】

態様１９．態様１９は、追加の抗真菌化合物を投与することをさらに含む、態様１６～１８のいずれか１つの方法である。

【0165】

態様２０．態様２０は、追加の抗真菌化合物の投与が組成物の投与と同時に行われる、態様１６～１９のいずれか１つの方法である。

【0166】

態様２１．態様２１は、追加の抗真菌化合物がフルコナゾール、フルシトシン、アムホテリシンＢ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、態様１６～２０のいずれか１つの方法である。

【0167】

態様２２．態様２２は、真菌感染症がＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓまたはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを含む、態様１６～２１のいずれか１つの方法である。

【0168】

態様２３．態様２３は、対象の細菌感染を処置または予防することを含む、態様１６～２２のいずれか１つの方法である。

【0169】

態様２４．態様２４は、細菌感染がグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌を含む、態様１６～２３のいずれか１つの方法である。

【0170】

態様２５．態様２５は、グラム陽性細菌がＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、黄色ブドウ球菌またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓを含む、態様１６～２４のいずれか１つの方法である。

【0171】

態様２６．態様２６は、グラム陰性細菌が、緑膿菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、肺炎桿菌、大腸菌、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを含む、態様１６～２５のいずれか１つの方法である。

【0172】

態様２７．態様２７は、細菌感染が結核を含む、態様１６～２６のいずれか１つに記載の方法である。

【0173】

態様２８．態様２８は、態様１～１４の化合物またはその塩を含む殺真菌組成物である。

【0174】

態様２９．態様２９は、態様２８の組成物を植物、植物の種子、または植物が生育する土壌に投与することを含む方法である。

【0175】

態様３０．態様３０は、植物における真菌感染を処置または予防することを含む、態様２９の方法である。

【0176】

態様３１．態様３１は、追加の抗真菌化合物を投与することをさらに含む、態様２９～３０のいずれか１つの方法である。

【0177】

態様３２．態様３２は、追加の抗真菌化合物の投与が組成物の投与と同時に行われる、態様２９～３１のいずれか１つの方法である。

【0178】

態様３３．態様３３は、真菌感染が、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ、Ｐｈｏｍａ ｃｌｅｍａｔｉｄｉｎａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ ｒｏｓａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ、Ｐｈｙｓｏｄｅｒｍａ、Ｌａｅｔｉｓａｒｉａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｅｒｐｕｌａ ｌａｃｒｙｍａｎｓ、Ｓｙｎｃｈｙｔｒｉｕｍ ｅｎｄｏｂｉｏｔｉｃｕｍ、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔａｐｈｒｉｎａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｂｉｄｗｅｌｌｉｉ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｆｉｂｒｏｐｏｒｉａ ｖａｉｌｌａｎｔｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｏｘｙｃｏｃｃｉ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｃｏｎｉｏｐｈｏｒａ ｐｕｔｅａｎａ、Ｐｏｒｉａ ｖａｉｌｌａｎｔｉｉ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ、またはＰｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ－ｒｅｐｅｎｔｉｓａを含む、態様２９～３２のいずれか１つの方法である。

【実施例】

【0179】

実施例

【0180】

本開示は、以下の実施例によって説明される。特定の例、材料、量、および手順は、本明細書に記載の本開示の範囲および精神に従って広く解釈されるべきであることを理解されたい。

【0181】

実施例１

【0182】

ＰＬＡＤアッセイを用いて、低栄養のロズウェルパーク記念研究所３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸ナトリウム塩（ＲＰＭＩ－ＭＯＰＳ）培地を使用してＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対するペプトイドライブラリーをスクリーニングしたところ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖が遅延し、抗カンジダペプトイドの同定が可能になった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して中程度の活性を有するリード化合物が同定され、ＲＭＧ８－８と名づけられたが、このペプトイドは最終的にＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対して優れた活性を有していた（ＭＩＣ＝１．６μｇ／ｍＬ）。ＲＭＧ８－８の哺乳動物細胞毒性は最小であり、ＨｅｐＧ２肝細胞に対するＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの選択比は１２０であった。さらに、このペプトイドは、優れたタンパク質分解安定性を有し、急速な死滅動態を示し、生存真菌細胞の集団を７分以内に５０％減少させた。

【0183】

最初に、様々な長さおよび組成のいくつかのコンビナトリアルペプトイドライブラリーをＰＬＡＤ化学リンカー上で合成した。これらのライブラリーは、４～６のランダム化された位置の範囲であり、多様性を与えるための様々なサブモノマー構成要素（一般的なＡＭＰに見られる部分およびその他の未探索の機能性を含む）を含んでいた。増殖培地としてＹＰＤを用いた以前に報告されたＰＬＡＤ法を使用して、これらのライブラリーをすべてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対してスクリーニングした（Ｍｏｊｓｏｓｋａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５９，４１１２－４１２０（２０１５））。しかしながら、いくつかのペプトイドライブラリーのスクリーニングは、ヒットも、真菌の増殖が阻害された観察可能なゾーン含むビーズも生成しなかった。ペプトイドライブラリーＲＧＬ８（図１Ａ）は、合成中に使用したカチオン性および疎水性アミン構成要素からのカチオン性／両親媒性設計を有する天然ＡＭＰを模倣するように設計された（図１Ｂ）。ＲＧＬ８の最初のスクリーニングは以前の真菌ＰＬＡＤアッセイ法に従ったものであったが、やはりヒットは生成しなかった。ＹＰＤ培地中のＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓと比較してＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの旺盛な増殖は、ＰＬＡＤスクリーニングの時間経過中にこの真菌の過剰増殖をもたらし、抗カンジダペプトイドの同定を妨げる可能性があると合理的に考えられた。したがって、本発明者らは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）試験に使用される培地であるＲＰＭＩ－ＭＯＰＳ培地を探索した。培地の調整により、スクリーニング中に名目上のヒット率（５～１０％）が得られ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対するその後のすべてのＰＬＡＤスクリーニングにＲＰＭＩ－ＭＯＰＳを使用した。

【0184】

ＰＬＡＤアッセイを用いたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対するライブラリーＲＧＬ８のスクリーニングは、２つのヒットをもたらした。最初のヒット配列は、シクロヘキシルアミンの反復配列（Ｎｔｒｉ－Ｎｃｈａ－Ｎｃｈａ－Ｎｃｈａ－Ｎｃｈａ）であったが、これは、カチオン性基を欠く他の高度に疎水性の化合物に見られるように哺乳動物毒性が高いという仮説のために、それ以上追求されなかった（Ｐｆａｌｌｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０，１３３－１６３（２００７））。２番目のヒットはＲＭＧ８－８（Ｎｔｒｉ－Ｎｃｈａ－Ｎｌｙｓ－Ｎａｅ－Ｎｃｈａ；図１Ｃおよび図１Ｄ）であり、比較的低い哺乳動物細胞毒性を保持しながら、微生物と戦うのに有益であることが証明されている全体的な両親媒性構造のために、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する抗真菌化合物として有望であった（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｐａｔｈｏｌ．１８，Ｓ８１－Ｓ８５（２０１４））。ＲＭＧ８－８の初期プロファイリングでは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対するＭＩＣ値は２５μｇ／ｍＬで中程度の有効性が示され、確立されたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのバイオフィルムに対するＭＩＣは４倍増加した（ＭＢＩＣ＝１００μｇ／ｍＬ；表２）。真菌の増殖をもたらさないペプトイドの最低濃度をＭＩＣ値として記録した。本発明者らは、バイオフィルムに対するＭＩＣ値の大きな増加は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ多糖類バイオフィルムの保護的性質によるものであると仮説を立てた（Ｇｏｎｃａｌｖｅｓら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，９０５－９２７（２０１６））。ＲＭＧ８－８をＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対して評価した場合、１．５６μｇ／ｍＬのＭＩＣ値が観察され、これは臨床用抗真菌剤フルコナゾールおよびフルシトシンの報告されたＭＩＣよりも低い（Ｌｅｎｎｏｘら、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０，１４３（２００４））。したがって、ＲＭＧ８－８は、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ抗真菌ペプトイドとしてさらに特徴付けられ、開発された。

【0185】

ＲＭＧ８－８の広範な適用性を探索するために、このペプトイドをＥＳＫＡＰＥ細菌に対して評価した（表２）。ＭＩＣ値を、すべての細菌増殖を阻害するペプトイドの最低濃度として決定した。ＲＭＧ８－８は、グラム陰性細菌と比較して、グラム陽性細菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖を阻害するのにより有効であり、ＭＩＣ値は６．２５μｇ／ｍＬであった。グラム分類有効性におけるこの傾向は、一般的な両親媒性構造およびカチオン性を有する化合物で以前に観察されている（Ｓｔｏｎｅら、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６２，６２７６－６２８６（２０１９））。グラム陽性細菌が有する厚いペプチドグリカン細胞壁は全体的に負に帯電しており（Ｎｅｕｈａｕｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６７，６８６ ＬＰ－７２３（２００３））、理論的にはＲＭＧ８－８のようなカチオン性ペプトイドにとってより魅力的である。グラム陰性病原体は、１２．５から１００μｇ／ｍＬの範囲のＭＩＣ値を有し、肺炎桿菌および緑膿菌が最も高い値を有していた。また、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（結核菌の代用菌）に対する有効性も評価され、ＲＭＧ８－８が結核の潜在的な処置に可能であるかどうかが判定された。この試験では、ＲＭＧ８－８は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに対して３．１３～６．２５のＭＩＣ範囲を示し、これは臨床抗マイコバクテリア剤に匹敵し（Ｗｏｏｄｓら、Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｎｏｃａｒｄｉａｅ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｅｒｏｂｉｃ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ。（２０１１））、調査の検討に値する。細菌について報告された全ての値は、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓのＭＩＣ（１．５６μｇ／ｍＬ）よりも依然として高かったため、ＲＭＧ８－８は、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対する抗真菌剤としてさらに特徴付けられた。

【表2】

【0186】

哺乳動物細胞毒性を、肝細胞（ＨｅｐＧ２）、肺上皮（ＨＰＬ１Ａ）、線維芽細胞（３Ｔ３）、およびケラチノサイト（ＨａＣａｔ）不死化細胞株、ならびに初代ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対して評価した（表３）。不死化細胞株において５０％の細胞死（毒性用量５０％；ＴＤ_５０）をもたらすＲＭＧ８－８濃度は、ＭＴＴを使用した細胞生存率分析の前に、様々な濃度のＲＭＧ８－８を各細胞株とともに７２時間インキュベートすることによって決定した。ＨｅｐＧ２細胞は、ＲＭＧ８－８による影響を最小限に抑え、ＴＤ_５０値は１８９μｇ／ｍＬであった。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ感染の主な部位は肺であるため、興味深いのは、哺乳動物肺細胞株であるＨＰＬ１Ａであった。この肺系統に対するＴＤ_５０は７４μｇ／ｍＬであった。毒性プロファイルを完成させるために、ＲＭＧ８－８を３Ｔ３線維芽細胞およびＨａＣａｔ皮膚細胞株に対して評価した。ＲＭＧ８－８は、３Ｔ３およびＨａＣａｔ細胞と同等の毒性を有することが証明され、ＴＤ_５０値はそれぞれ５９および５４μｇ／ｍＬであった。ＲＢＣ（ＨＣ１０）の１０％溶解をもたらすＲＭＧ８－８の濃度は７７μｇ／ｍＬであった。これまでに報告されている他の抗真菌ペプトイドと同等またはそれ以上である（Ｃｈｏｎｇｓｉｒｉｗａｔａｎａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５５，４１７－４２０（２０１１）；Ｃｏｒｓｏｎら、ＡＣＳ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７，１１３９－１１４４（２０１６）；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２８，３５１４－３５１９（２０１８）。

【表3】

【0187】

ＴＤ_５０値を決定した後、化合物毒性（ＴＤ_５０またはＨＣ_１０）を化合物有効性（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対するＭＩＣ）で割ることによって選択比（ＳＲ）を計算した。したがって、ＳＲが高いほど、化合物の選択性が高く、治療域が良好であることを示す。１０を超えるＳＲ値はリード化合物の特徴であるが、前臨床評価に進む化合物では、１００を超えるＳＲ値が達成されるべきである。ＲＭＧ８－８のＳＲ値は３４から１２０の範囲であり（図３）、リード化合物としては優れた値である。ＨｅｐＧ２肝細胞は、１２１のＳＲで試験した他のすべての細胞株と比較して最も影響を受けなかったが、ＨａＣａｔ皮膚細胞は、３４のＳＲで試験した最も感受性の高い株であった。

【0188】

各サブモノマーの薬理学的重要性を判断するために、サルコシンスキャンを行った。ＲＭＧ８－８の誘導体を、アラニンのペプトイド模倣物を表すサルコシンで各位置を置き換えて合成した。この研究は、ペプチド中のアミノ酸位置の薬理学的重要性を決定する場合のアラニンスキャンに類似している（Ｍｉｇｏｎら、Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１，１０４２－１０５４（２０１９））。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対するＲＭＧ８－８サルコシン誘導体のＭＩＣおよびＨｅｐＧ２細胞に対する細胞毒性を評価し、可能な場合はＳＲを計算した（表４）。以前の研究（Ｃｈｏｎｇｓｉｒｉｗａｔａｎａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５５，４１７－４２０（２０１１）；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２８，３５１４－３５１９（２０１８）；Ｔｕｒｋｅｔｔら、ＡＣＳ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．１９，２２９－２３３（２０１７）に一致して、Ｎ末端の親油性の１３炭素尾部をサルコシンに変更すると、最大の薬理学的効果が得られ、試験した最高濃度を超えて抗真菌効果および細胞毒性が低下した。いずれの位置（２位または５位）のシクロヘキシルアミンの除去も同じ効果があり、効力を４倍減少させ、２００μｇ／ｍＬを超える細胞毒性を改善した。カチオン性サブモノマー（３位および４位）を置換するとどちらも、長さに関係なく、ＭＩＣが２倍減少し、細胞毒性が２倍増加するという同じ効果があった。以前の報告では、全体的な正電荷の減少により哺乳動物毒性が増加することも観察されている（Ｍｏｊｓｏｓｋａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５９、４１１２－４１２０（２０１５）；Ｍｉｄｄｅｌｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２８、３５１４－３５１９（２０１８）；Ｌｅｅら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２８、１７０－１７３（２０１７））。

【表5】

【0189】

可能なＲＭＧ８－８誘導体は、サルコシンスキャンから得られた薬理学的重要性データに基づいて設計されている（図２）。これらの化合物は、ＲＭＧ８－８の合理的な構造誘導体と考えられる。側鎖アミンのメチル化をこれらの誘導体のいずれかに実施すると、以前に観察されたように効力が改善された第３世の代誘導体を得ることができる（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２８、３５１４－３５１９（２０１８）。

【0190】

ＲＭＧ８－８による真菌死滅率は、ＹＰＤブロス中のＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対して、４倍のＭＩＣ濃度（１２．５μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で真菌をインキュベートすることによって測定した。より高濃度のペプトイドを使用したのは、以前に行われたＭＩＣ条件と比較して、より高い開始細胞数（１×１０^５細胞／ｍＬ）およびより堅牢な増殖条件を使用したためであった（Ｓｐｉｃｅｒら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １１０、ｅ２３２７６（２０１９））。アリコートを様々な時点で取り出し、洗浄してペプトイドを取り出し、連続希釈し、ＹＰＤ寒天プレートにスポットプレーティングした。インキュベーションの後、コロニー計数を行って、経時的に残存する生存ＣＦＵ／ｍＬを測定した。最初の実験で３０分ごとに試料を採取すると細胞集団の半分以上が３０分までに死滅したことが示されたので、より正確な細胞死の測定値を得るために、より短い時間増分を分析した。ＧｒａＦｉｔを使用して真菌死滅の半減期を計算すると、ＲＭＧ８－８が６．５分以内に生存真菌の集団を５０％減少させ、１時間以内に生存細胞の完全な除去が達成されたことが示された（図３Ａ、図３Ｂ）。これは、アムホテリシンＢよりもはるかに速い減少速度である（Ｇｒａｙら、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｋｉｌｌｓ ｙｅａｓｔ ｂｙ ｓｉｍｐｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ．１０９，（２０１２））。アムホテリシンＢは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ感染症を処置するために一般的に使用されるサードラインの非常に強力な抗真菌剤であり、真菌死滅の半減期は４～６時間である。以前の研究で、異なるペプトイドであるＡＥＣ５の急速な死滅動態が報告されており、生存Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓが約３０分で半減した（Ｓｐｉｃｅｒら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １１０，ｅ２３２７６（２０１９））。ペプトイドの急速な死滅動態は、Ｍｏｊｓｏｓｋａらによって大腸菌に対する抗菌性ペプトイドでも観察されている（Ｍｏｊｓｏｓｋａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５９，４１１２－４１２０（２０１５））。ＲＭＧ８－８は、以前に抗菌ペプトイドで観察された急速な死滅動態を裏付けており、これは最終的に真菌感染症を処置するために使用される可能性のある化合物には好ましい特性である。さらに、ペプトイドを洗い流した後のＹＰＤプレートで真菌の増殖が回復しないことは、ＲＭＧ８－８がおそらく殺真菌性であり、静真菌性ではないことを示している。

【0191】

薬物耐性真菌感染症は、しばしば、重度の毒性を有し、ヒトの健康にそれら自体の有害な影響を及ぼし得る高用量の抗真菌剤の使用を必要とする。抗真菌薬の相乗効果により、より低用量の強力で有毒な抗真菌薬と併用して毒性の低い化合物の使用が可能になり、それによって現在高用量の臨床用抗真菌薬で見られる毒性の一部が軽減される。チェッカーボードアッセイは、組み合わせて使用される２つの化合物が相乗的に作用するか、無関係に作用するか、または拮抗的に作用するかを判定する。チェッカーボードアッセイを使用して、ＲＭＧ８－８を３つの一般的な臨床用抗真菌薬（アムホテリシンＢ、フルコナゾールおよびフルシトシン）と組み合わせて評価した。部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）値を計算し、以下のように解釈した：ＦＩＣｉ＜０．５相乗的；０．５≦ＦＩＣｉ≦４無関係；ＦＩＣｉ＞４拮抗的（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８，６９３－７１５（２００４））。フルコナゾールまたはフルシトシンと組み合わせたＲＭＧ８－８の全ての化合物のＭＩＣ値は変化しないままであり、ＦＩＣｉ値は２となり（表６）、ＲＭＧ８－８がこれらの化合物と無関係の関係を有することを示した。ＲＭＧ８－８およびアムホテリシンＢのＭＩＣ値は、組み合わせて使用した場合にわずかに改善し、ＦＩＣｉ値は０．７５であった。この値は相乗効果の基準を満たさないが、ＲＭＧ８－８とアムホテリシンＢが一緒に使用された場合に軽度の相加効果を有することを示している。この臨床的意義は、ＲＭＧ８－８をアムホテリシンＢと組み合わせて使用すると、この強力な臨床用抗真菌剤の投与量を減らすことができ、それによってアムホテリシンＢに関連する重篤な毒性の一部を軽減することができ得るということである。

【表6】

【0192】

ＲＭＧ８－８のバイオアベイラビリティを予測するために、血漿タンパク質結合アッセイを生物学的および分析的に実施した。インビトロ血漿タンパク質結合アッセイは、治療用途が見出され得るあらゆる化合物の開発の重要な部分であるが、この種の研究はインビボでの化合物の利用可能性を常に予測するとは限らないことに留意することが有用である（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．９，９２９－９３９（２０１０））。血漿タンパク質結合は複雑なシナリオであり、血漿タンパク質への化合物の結合はすべてが良いわけでも悪いわけでもない。血漿タンパク質が大量に結合すると、抗菌化合物が病原体に関与するのを防ぐことができるが、体内が増加し、肝臓の排出が遅くなり、半減期の延長につながる可能性がある（Ｚｅｉｔｌｉｎｇｅｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５５，３０６７ ＬＰ－３０７４（２０１１））。ＲＭＧ８－８血漿タンパク質結合の生物学的効果を試験するために、ＲＭＧ８－８のストックをヒト血清（１：１ ｖ／ｖ）と１時間インキュベートし、続いてヒト血清とインキュベートしていないＲＭＧ８－８のストックと並べてＭＩＣ分析を実施した。ヒト血清をＭＩＣ培地に添加する代わりにプレインキュベートするこの方法は、血清がＭＩＣ中にＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの病原性または増殖に及ぼし得る、血漿タンパク質の結合について誤った結論を与える影響を防ぐために行われた（Ｚｅｉｔｌｉｎｇｅｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５５，３０６７ ＬＰ－３０７４（２０１１））。ヒト血清とのインキュベーションにより、１．５６から３．１３μｇ／ｍＬへのＭＩＣのわずかな増加が引き起こされ、ＲＭＧ８－８による血漿タンパク質結合の程度が小さいことが示された。血清タンパク質結合および血清プロテアーゼ安定性も、ＲＭＧ８－８をヒト血清（２５％）とインキュベートすることによって分析的に調べた。アリコートを０および２４時間で収集し、トリクロロ酢酸（最終２５％）を添加することによってタンパク質を沈殿させた後、上清をＲＰ－ＨＰＬＣで分析した。ＲＭＧ８－８のタンパク質分解も有意なタンパク質結合も２４時間で観察されなかった（図４）。これらのデータは、ＲＭＧ８－８がヒト血清中で比較的安定であり、最小限の血漿タンパク質結合を示すことを示している。

【0193】

ペプチドに対するペプトイドの主な利点は、プロテアーゼに対するそれらの固有の安定性であり、インビボでのその半減期が延長されることである。ＲＭＧ８－８のタンパク質分解安定性を、トリプシンとともに３７℃で２４時間インキュベートし、アリコートを０および２４時間の時点で分析することにより決定した（図５）。トリプシンは、特に、ＲＭＧ８－８などのカチオン性構成要素を含有する化合物で、ペプチドおよびペプトイドの安定性を決定する際に使用される一般的なプロテアーゼである。以前にペプトイド（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４，２６５７－２６６２（１９９４）；Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ８，４（２０１８））で観察されたように、ＲＭＧ８－８は２４時間にわたってタンパク質分解を示さず、この一般的なプロテアーゼに対するＲＭＧ８－８の安定性を実証した。

【0194】

ほとんどの抗菌ペプチドおよびペプトイドについて一般的に認められている作用機序は、孔形成または膜流動性の変化による膜破壊であるが、細胞内標的および免疫調節などの代替的な作用機序も発見されている（Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ８，４（２０１８）；Ｍｏｊｓｏｓｋａら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７，４２３３２（２０１７）；Ｇｒｅｃｏら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．９，３６７９（２０１９））。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対するＲＭＧ８－８の可能な作用機序としての膜透過処理を、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ膜のリン脂質およびエルゴステロール含有量を模倣するように設計されたカルセイン担持リポソームとともにＲＭＧ８－８をインキュベートすることによって調べた（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，５８，２０１７～２０３６（２０１７））。同様のカルセイン担持リポソームアッセイを使用して、抗菌性ペプトイドと、哺乳動物膜を模倣するリポソームとの相互作用を調べることにより、ペプトイドの毒性様式への洞察が得られた（Ｍｏｊｓｏｓｋａら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７，４２３３２（２０１７））。高濃度のカルセインでは、非放射性コロイド消光のために蛍光が消光される。リポソームを文献のプロトコルに従って作製し、６０ｍＭカルセインを担持させた（Ｍａｋｏｖｉｔｚｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４，９７７５－９７８４（２００５））。次いで、カルセインを担持したリポソームを、最大カルセイン放出に達するのに十分な時間量であると以前に決定されたＲＭＧ８－８の濃度を増加させながら１時間インキュベートした（データは示さず）。膜透過性でなく核酸合成の阻害を介して抗真菌活性を発揮する化合物である、様々な濃度のフルシトシンで処置したリポソームを陰性対照とした。ビヒクル単独または０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００を含むリポソームをそれぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。これらの対照の蛍光を使用して、それぞれ０％および１００％のリポソーム溶解を設定した。予想されるように、フルシトシンの濃度を増加させても、認識できるリポソーム溶解は観察されなかった（図６）。しかしながら、ＲＭＧ８－８濃度の増加に伴い、より多くの蛍光が観察され、リポソーム膜溶解を示している（図６）。これは、ＲＭＧ８－８がほとんどのＡＭＰおよび抗菌ペプトイド、膜溶解および／または膜流動性の破壊と同じ作用機序を有する可能性が高いという主要な文献仮説と一致する。

【0195】

実施例１の材料および方法

【0196】

試薬は、フィッシャー・サイエンティフィック（マサチューセッツ州ウォルサム）、アルファ・エイサー（マサチューセッツ州ヘイバーヒル）、Ａｍｒｅｓｃｏ（オハイオ州ソロン）、ＴＣＩアメリカ（オレゴン州ポートランド）、Ａｎａｓｐｅｃ（カリフォルニア州フレモント）、ＥＭＤミリポア（マサチューセッツ州ビレリカ）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ケンタッキー州ルイビル）、およびＣｈｅｍ－Ｉｍｐｌｅｘ（イリノイ州ウッドデール）から購入した。使用した試薬はすべて純度９５％超であった。ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）はイノベイティブリサーチ（ミシガン州ノバイ）から入手した。Ｂｏｃ保護ジアミンは、以前に記載されているように合成した（Ｆｉｓｈｅｒら、ＡＣＳ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．１８，２８７－２９１（２０１６））。全ての質量スペクトルは、イオン移動度を用いたＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ ＨＤＭＳ ＱｔｏＦで取得した。全ての蛍光および吸光度の読み取り値はＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５プレートリーダーで取得した。化合物の精製は、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｃ１８カラム（５μＭ；２５ｃｍ×２１．２ｍｍ；シグマ・アルドリッチ５８１３４７－Ｕ）および０．０５％トリフルオロ酢酸を含む水からアセトニトリルまでの０～１００％勾配を用いて、Ｖａｒｉａｎ Ｐｒｅｐｓｔａｒ ＳＤ－１によって達成した。Ｈ１ ＮＭＲは、Ｊｏｅｌ ５００ＭＨｚ ＦＴ－ＮＭＲモデルＥＣＡ－５００ Ｊｏｅｌ（Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＳ）で行った。

【0197】

ＰＬＡＤリンカーは、以前に報告されたように合成した（Ｆｉｓｈｅｒら、ＡＣＳ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．１８，２８７－２９１（２０１６））。手短に言えば、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で膨潤させた。Ｆｍｏｃ保護固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して、Ｆｍｏｃ保護メチオニン（Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ）を結合させた（Ａｍｂｌａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，２３９－２５４（２００６））。Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（４モル当量）を、５％ Ｎ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）ＤＭＦ中のＯ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；４モル当量）で１０分間活性化した。次いで、溶液を樹脂に添加し、４５分間撹拌した後、真空吸引によって溶液を除去し、樹脂をＤＭＦで３回洗浄した。アミド結合形成の成功は、遊離アミンの比色試験であるカイザー試験によって決定した（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ １９７，１３０５－１３０６（１９６３））。Ｆｍｏｃは、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて樹脂を１０分間２回撹拌することによって除去し、続いてＤＭＦで洗浄し、カイザー試験によって脱保護の成功を判定した。メチオニンをＰＬＡＤリンカーのＣ末端に添加して、ＰＬＡＤスクリーニング後の臭化シアンによるα－ペプトイド鎖の放出のための切断点として機能させた。Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨは、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨについて記載したのと同じ方法を用いてカップリングさせた。Ｂｏｃ－シスタミンは、ペプトイドサブモノマー合成を使用して添加した。４８ 手短に言えば、無水ＤＭＦ中のブロモ酢酸（２Ｍ）およびジイソプロピルカルボジイミド（３．２Ｍ）を樹脂と合わせ、従来の電子レンジで１０％出力で３０秒間加熱し、１５分間撹拌した。反応が完了した後、樹脂をＤＭＦで洗浄し、カイザー試験によってアシル化を確認した。無水ＤＭＦ中のＢｏｃ－シスタミン（２Ｍ）を樹脂に添加し、電子レンジで加熱し、３０分間撹拌し、洗浄し、上記のようにカイザー試験によって試験した。次に、Ｆｍｏｃ－アミノヘキサン酸をＳＰＰＳを使用して結合させて、ペプトイドのα鎖とβ鎖との間にスペーサーを得た。Ｂｏｃは、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％水、および２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）で１時間処理し、続いてジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄することによってシスタミンから脱保護された。最後に、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで樹脂を１０分間２回撹拌することによってアミノヘキサン酸のＮ末端からＦｍｏｃを除去し、続いてＤＭＦで洗浄して完全なＰＬＡＤリンカーを得た。品質管理のために、ＰＬＡＤリンカーは、１：１水：アセトニトリル中０．１Ｍ ＨＣｌ中の臭化シアン（４０ｍｇ／ｍＬ）を使用して、樹脂の少量のアリコートから切断され、電子スプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ－ＭＳ）によって、Ｍ＋Ｈの予測値（７００．８９ｍ／ｚ）、観測値（７００．１８ｍ／ｚ）が確認された。

【0198】

コンビナトリアルペプトイドライブラリーＲＧＬ８を、以前に報告されたようにスプリットアンドプール合成を使用して合成した（Ｃｏｒｓｏｎら、ＡＣＳ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７，１１３９－１１４４（２０１６））。ＰＬＡＤリンカーは、以前に記載されているようにＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上に調製した。樹脂を一緒にプールし、無水ＤＭＦ中のブロモ酢酸（２Ｍ）とジイソプロピルカルボジイミド（３．２Ｍ）を使用してアシル化し、１０％出力で３０秒間電子レンジで加熱し、次いで１０分間撹拌した。アシル化はカイザー試験によって確認した。樹脂をＤＭＦに再懸濁し、等量を独立したアミン反応バイアルに移した。ＤＭＦを除去し、無水ＤＭＦ中のアミン溶液（２Ｍ）を反応バイアルに添加した。バイアルを電子レンジで加熱し、４５分間攪拌した後、すべての樹脂を一緒にプールし、ＤＭＦで洗浄した。このプロセスを３回繰り返して、４つのランダム化された位置を作成した。すべての樹脂を最後にブロモアシル化し、続いてトリデシルアミン（２Ｍ）でアミノ化した。樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、次いでＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄した。９５％ ＴＦＡ、２．５％水、および２．５％ ＴＩＳを使用して樹脂をＢｏｃ脱保護し、１時間撹拌した。樹脂をＤＭＦでさらに３回洗浄し、次いでＰＢＳ中で平衡化した。

【0199】

一晩画線したプレートからＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの単一コロニーをＰＢＳに添加し、濁度がＯＤ５３０＝０．１５～０．２５になるようにした。ＲＰＭＩ－ＭＯＰＳ軟寒天（０．７５％ ｗ／ｖ）を煮沸し、次いで冷却し、４２℃に維持した。ＴＣＥＰ（１００ｍＭ；５８０μｌ）、細胞溶液（１００μＬ）およびライブラリー（５００μＬ ＰＢＳ中２～５ｍｇ）をＲＰＭＩ－ＭＯＰＳ軟寒天に添加し、ＲＰＭＩ－ＭＯＰＳ寒天（１．５％ ｗ／ｖ）プレートに注ぎ入れ、冷却して固化させ、３７℃で一晩インキュベートした。増殖阻害域を含む樹脂を手動で抽出し、個々のチューブに入れ、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の１％ ＳＤＳで１０分間煮沸し、続いてＰＢＳで最終洗浄した。α鎖ペプトイドは、暗所で一晩、アセトニトリル：水（１：１）中の０．１Ｍ ＨＣｌ中の臭化シアン（４０ｍｇ／ｍＬ）を用いて樹脂から切断した。溶媒および臭化シアンを真空中で除去し、ペプトイドを０．０５％ ＴＦＡを含むアセトニトリル：水（１：１）に再懸濁し、タンデムＥＳＩ－ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳを用いて配列決定した。

【0200】

継続的な特性評価のために合成された、ＰＬＡＤアッセイを介して同定されたペプチド配列は、サブモノマーアプローチを使用して、以前に公開されたように合成した（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，１０６４６－１０６４７（１９９２））。手短に言えば、Ｆｍｏｃ保護ポリスチレンＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で３０分間膨潤させた。ＤＭＦ中２０％ピペリジンで樹脂を１０分間２回撹拌することによってＦｍｏｃを除去した。ペプトイド合成のステップ１であるブロモアシル化は、ジイソプロピルカルボジイミド（３．２Ｍ）で活性化したブロモ酢酸（２Ｍ）を含む無水ＤＭＦを樹脂に添加し、続いてマイクロ波支援（１０％；１５秒２回）を行い、１５分間撹拌することによって達成した。ＤＭＦで洗浄した後、カイザー試験による比色分析により、ブロモアシル化が成功したかどうかを決定した。アミンは、所望のアミンの２Ｍ溶液を樹脂に添加し、２０分間撹拌し、続いてＤＭＦで洗浄し、カイザー試験によって比色確認することにより、マイクロ波支援（１０％電力；１５秒２回）を用いて結合させた。この２段階プロセスを、所望のペプトイド配列が達成されるまで繰り返した。トリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシラン（それぞれ９５％、２．５％、２．５％）で処置し、１時間撹拌することによって、樹脂からペプトイドを切断した。この溶液を濾過によって回収し、ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製の前に空気流でバブリングすることによって酸を除去した。ＲＭＧ８－８をこの様式で合成し、ＨＰＬＣで９５％超の純度で精製した。ＲＭＧ８－８の構造および配列をＥＳＩ－ＭＳにより確認した（図Ｓ１）。

【0201】

病原真菌Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対するペプトイドの最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、ＣＬＳＩガイドライン（ＣＬＳＩ．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ；ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ－ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；ＣＬＳＩ ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｍ２７－Ａ３．（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２００８））に従って決定した。コロニーを、画線したＹＰＤプレートから０．８５％生理食塩水に移して、ＯＤ５３０を０．１８から０．２５の間に達するようにした。この接種材料をＲＰＭＩ－ＭＯＰＳに１：１００希釈し、次いでＲＰＭＩ－ＭＯＰＳにさらに１：２０希釈した。１９８μＬの接種剤を９６ウェル黒壁プレートの各ウェルに播種した。１００倍ペプトイド溶液の２倍連続希釈液を水中で調製し、２μＬのペプトイドを各ウェルに３連で添加した。プレートを３７℃でＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの場合は７２時間、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの場合は２４時間インキュベートした後、手動観察によってＭＩＣを評価した。ＭＩＣを、真菌の増殖を防止する化合物の最低濃度と定義した。このアッセイを、各化合物を用いて別々の日に３回繰り返した。

【0202】

病原真菌Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対するペプトイドのバイオフィルム最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、ＣＬＳＩガイドライン（ＣＬＳＩ．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ；ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ－ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；ＣＬＳＩ ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｍ２７－Ａ３．（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２００８））に従って決定した。コロニーを、画線したＹＰＤプレートから０．８５％生理食塩水に移して、ＯＤ５３０を０．１５から０．２５の間に達するようにした。この接種材料をＲＰＭＩ－ＭＯＰＳに１：１００希釈し、次いでＲＰＭＩ－ＭＯＰＳにさらに１：２０希釈した。２００μＬの接種剤を９６ウェル黒壁プレートの各ウェルに播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。培地を穏やかに除去し、ＰＢＳで３回穏やかに洗浄した。ＲＰＭＩ－ＭＯＰＳ（１９８μＬ）を各ウェルに添加した。１００倍ペプトイド溶液の２倍連続希釈液を水中で調製し、２μＬのペプトイドを各ウェルに３連で添加し、次いで、３７℃で２４時間インキュベートした。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（２０μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで蛍光を測定した（Ｅｘ．５５５ｎｍ；Ｅｍ．５８５ｎｍ）。

【0203】

ＥＳＫＡＰＥ細菌に対するペプトイドの最小阻害濃度（ＭＩＣ）（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＡＴＣＣ ６５６９；黄色ブドウ球菌 ＡＴＣＣ ２９２１３；肺炎桿菌 ＡＴＣＣ １３８８３；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ５５ａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １９６０６；緑膿菌 ＡＴＣＣ ２５６１９；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９２１２；および大腸菌 ＡＴＣＣ ２５９２２）を、ＣＬＳＩガイドライン（ＣＬＳＩ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｔｈａｔ Ｇｒｏｗ Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ，１１^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．（ＣｌｉｎｉｃａｌおよびＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、２０１８）に従って決定した。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓに対するＭＩＣも、ＣＬＳＩガイドラインに従って決定した（Ｗｏｏｄｓら、Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｎｏｃａｒｄｉａｅ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｅｒｏｂｉｃ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．（２０１１））。画線したトリプシン大豆寒天プレートから採取したコロニーをトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）に添加して、ＯＤ６００＝０．０８～０．１５の濁度を達成した。接種材料をカチオン調整ミューラーヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ）に１：２００に希釈し、９０μＬを９６ウェル黒壁プレートの各ウェルにプレーティングした。１０倍ペプトイドの２倍連続希釈液（１０μＬ）を各ウェルに３連で添加し、ＥＳＫＡＰＥ細菌の場合は２４時間、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの場合は７２時間、３７℃でインキュベートした。テトラサイクリン（２０μｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用し、ＤＩ水をビヒクル対照として使用した。ＥＳＫＡＰＥ細菌のインキュベーションの後、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（１０μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで蛍光を測定した（Ｅｘ．５５５ｎｍ；Ｅｍ．５８５ｎｍ）。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのインキュベーションの後、ウェルをＣＬＳＩガイドラインに従ってスコア化してＭＩＣを決定した。このアッセイを別々の日に３回繰り返した。

【0204】

肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）、マウス線維芽細胞（３Ｔ３）、ヒト肺（ＨＰＬ１Ａ）およびヒトケラチノサイト（ＨａＣａｔ）細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミン（ＰＳＧ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃および５％ ＣＯ２で培養した。細胞を収集し、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ中で１×１０５～４×１０５細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートにプレーティングした（１００μＬ）。１０倍ペプトイドの２倍連続希釈液（１１．１μＬ）を各ウェルに３連で添加した。水（ビヒクル）を陰性対照として使用した。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で７２時間インキュベートした。チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を各ウェルに添加し（５ｍｇ／ｍＬ；２０μＬ）、３時間インキュベートした。培地を除去し、ＤＭＳＯ（１００μＬ）を添加し、プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで読み取った（Ａｂｓ．５７０ｎｍ）。対照と比較して増殖を５０％減少させる化合物の濃度（毒性用量５０％；ＴＤ５０）は、ＧｒａＦｉｔを使用して決定した。この手順を別々の日に３回繰り返した。

【0205】

溶血活性は、単一ドナーヒト赤血球（ｈＲＢＣ）を使用して測定した。ｈＲＢＣをＰＢＳで洗浄し、３回遠心分離し（１０００ＲＰＭ；１０分）、ＰＢＳに再懸濁し、９６ウェルプレートに分注した（１００μＬ）。ＰＢＳ中の１０倍ペプトイド最終濃度の２倍連続希釈液を調製し、ウェルに３連で加えた。ＰＢＳをビヒクル対照として使用し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を陽性対照として使用した。プレートを１時間インキュベートし（３７℃；５％ ＣＯ２）、次いで遠心分離し（１０００ＲＰＭ；１０分）、上清を新しい９６ウェルプレート内のＰＢＳで１：２０に希釈した。プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで読み取った（Ａｂｓ．４０５ｎｍ）。溶血率は、以下の式によって決定した。

【数2】

ＧｒａＦｉｔを使用して、５０％溶血活性の濃度（ＨＣ_５０）およびヒル係数（Ｈ）を決定した。次いで、１０％（ＨＣ_１０）での溶血活性を以下の式によって決定した。

【数3】

【0206】

死滅時間アッセイでは、酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）ブロスに、ＲＭＧ８－８（６．２５μｇ／ｍＬ）のＭＩＣの４倍を含むまたは含まない１×１０５細胞のＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを二連で接種した。細胞を振盪インキュベーター（３５℃、２５０ＲＰＭ）内で２４時間増殖させ、０、６、１２、１８、３０、６０、１２０、２４０、および１４４０分の時点で試料を収集した。試料を直ちにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳ（１ｍＬ）に再懸濁し、ＰＢＳ（１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５）で段階希釈し、ＹＰＤプレートにプレーティングし、３５℃で７２時間インキュベートした。コロニーを計数し、各時点のＣＦＵ／ｍＬを決定した。この手順を別々の日に３回繰り返した。次いで、ＧｒａＦｉｔを使用して、時間に対してＣＦＵ／ｍＬをプロットすることにより真菌死滅率を計算した。

【0207】

血清タンパク質結合アッセイでは、高濃度のＲＭＧ８－８（１０ｍｇ／ｍＬストック）を、２５％プールヒト血清（イノベイティブリサーチ）とともに、またはこれを加えずに、３７℃で１時間インキュベートした。ＲＭＧ８－８のこれらの溶液を２倍に連続希釈し、所望の１００倍の最終濃度とした。次いで、ＲＭＧ８－８のこれらの試料を、並列比較のために上記のようにＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対するＭＩＣによって評価した。ＲＭＧ８－８血清の安定性は、ＲＭＧ８－８（１００μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ中の２５％プールヒト血清とともに３７℃でインキュベートすることによっても分析した。試料を０および２４時間の時点で収集した。トリクロロ酢酸（１００％）を試料（最終濃度２５％）に添加してタンパク質を沈殿させた。試料を氷上に５分間置いて沈殿を完了させ、続いて遠心分離した（１７，０００×ｇ；５分）。ＲＭＧ８－８のタンパク質分解またはタンパク質結合をモニターするために、ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃ１８（２５ｃｍ×２１．２ｍｍ、５μｍ）カラムにフォトダイオードアレイ検出器を備えたＶａｒｉａｎ Ｐｒｅｓｔａｒ）によって上清を分析した。溶液中に残っている無傷のペプトイドに対応する曲線下面積（ＡＵＣ）を、Ｅｘｃｅｌを使用して計算した。これらの手順を別々の日に３回繰り返した。

【0208】

酵素トリプシンに対するタンパク質分解安定性を、以前に公開された方法（Ｇｒｅｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ５６，１０６０４８（２０２０））を使用して決定した。手短に言えば、ＲＭＧ８－８（２ｍｇ／ｍＬ）を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中のトリプシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）とともに３７℃でインキュベートした。アリコート（０．２５ｍＬ）を０および２４時間の時点で取り出し、０．０５％トリフルオロ酢酸（０．７５ｍＬ）を含む６０：４０アセトニトリル／水に添加してトリプシンを不活性化した。試料を上記のようにＲＰ－ＨＰＬＣによって分析して、無傷のペプトイドの量を定量した。データは生物学的に３連で収集された。リポソームアッセイ

【0209】

考えられる作用機序としての膜透過化は、以前に公開された手順（Ｍａｋｏｖｉｔｚｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４，９７７５－９７８４（２００５））に従ってリポソームアッセイを使用して決定した。手短に言えば、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルセリン（ＰＣ）、１－パルミトイル－３－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－２－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびホスファチジルコリン（ＰＳ）のそれぞれ（１０ｍｇ）をクロロホルム／メタノール（２：１ ｖ／ｖ；１ｍＬ）に溶解した。エルゴステロール（１ｍｇ）をクロロホルム／メタノール（２：１ ｖ／ｖ）１ｍＬに溶解した。脂質を４：２：１：０．１のＰＣ：ＰＥ：ＰＳ：エルゴステロール比で一緒に超音波処理し、溶媒を真空中で一晩除去した。カルセイン（６０ｍＭ；自己消光）を、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）および塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）の緩衝液中で調製した。このカルセイン溶液（１ｍＬ）を乾燥脂質に添加し、溶液をボルテックスし、透明になるまで超音波処理して、自己消光カルセインを担持したＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ膜を模倣するように設計されたリポソームを形成した。ＲＭＧ８－８を１００倍ストック濃度で調製し、２倍段階希釈液を作製した。カルセイン担持リポソーム（０．５ｍｇ／ｍＬ）を９６ウェル黒壁プレート中でＲＭＧ８－８とともに３７℃で１時間インキュベートした。１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００およびＨＥＰＥＳ緩衝液をそれぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｅｘ．４９０ｎｍ．Ｅｍ．５２０ｎｍ）でプレートを読み取り、透過膜を有するリポソームから放出されたカルセインを検出した。

【0210】

チェッカーボードアッセイを使用して、アムホテリシンＢ、フルコナゾールおよびフルシトシンの３つの臨床用抗真菌化合物とＲＭＧ８－８の相乗効果を決定した。画線したＹＰＤプレートからＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓコロニーを生理食塩水（０．８５％）に添加して、ＯＤ５３０＝０．１５～０．２５の濁度を達成した。細胞溶液をＲＰＭＩ－ＭＯＰＳ（１：１００）に希釈した後、ＲＰＭＩ－ＭＯＰＳ（１：２０）にさらに希釈した。希釈した細胞溶液（１９６μＬ）を９６ウェルプレートに添加した。ＲＭＧ９－１１の２倍連続希釈液を、１２．５μｇ／ｍＬ～０．２μｇ／ｍＬの範囲の１００倍ストックとして作製し、各ウェルに２μＬずつ添加した。臨床用抗真菌化合物は、公表されているＭＩＣ値（アムホテリシンＢ（２～０．０３μｇ／ｍＬ）、フルコナゾール（３２～０．５μｇ／ｍＬ）、フルシトシン（１６～０．２５μｇ／ｍＬ））に基づいて適切な範囲で同様に添加し、意図するウェルに２μＬを添加した。プレートを３５℃で７２時間インキュベートした。ＭＩＣを、病原体の増殖を阻害する個々の化合物または組み合わせた化合物の最低濃度として決定した。部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）は、以下の式を使用して決定した。

【数4】

ＦＩＣｉ値は、以下のように解釈した：ＦＩＣｉ＜０．５相乗的；０．５≦ＦＩＣｉ≦４無関係；ＦＩＣｉ＞４拮抗的（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８，６９３－７１５（２００４））。

【0211】

実施例２

【0212】

潜在的に効果的な抗菌ペプトイドの設計、合成、およびスクリーニングは面倒な作業であるため、コンビナトリアルライブラリーとハイスループットスクリーニング法が迅速な同定に役立つ。ペプトイドライブラリー寒天拡散（ＰＬＡＤ）アッセイは、コンビナトリアルペプトイドライブラリーを調べて、有望な抗菌活性を有する化合物を同定するために開発された（Ｃｏｒｓｏｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ７ １２，１１３９－１１４４（２０１６）；Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ １２ ９，１４７０－１４７７（２０２１）；Ｆｉｓｈｅｒら、ＡＣＳ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １８ ６，２８７－２９１（２０１６））。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する１つの特定のＰＬＡＤスクリーニングにより、ＲＭＧ８－８（図１２）と呼ばれる、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して中程度の活性を有するペプトイドが発見された（Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ １２ ９，１４７０－１４７７（２０２１））。２５μｇ／ｍＬの最小阻害濃度（ＭＩＣ）およびヒト肝細胞に対する低い哺乳動物細胞毒性（ＴＤ_５０＝１８９μｇ／ｍＬ）により、ＲＭＧ８－８をさらに特徴付けた。このリード化合物は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対しては中程度の活性しかないが、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対してはＭＩＣが１．５６μｇ／ｍＬと高い活性であることがわかった。これはフルコナゾールまたはフルシトシンよりも強力である（Ａｎｄｒｅｅｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ １８６０ ６、１４１４～１４２３（２０１８））。さらなる特徴付けにより、ＲＭＧ８－８が真菌を急速に死滅させ（ｔ_１／２＝６．５分）、タンパク質分解的に安定であり、膜破壊を通して抗真菌活性を発揮する可能性が高いことが示された（Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ １２ ９，１４７０－１４７７（２０２１））。

【0213】

任意の有望なリード化合物の発見後の自然な次のステップは、生物学的活性を改善するための構造修飾である。ペプトイドの構造活性相関（ＳＡＲ）研究は、構造を改変するために反復設計を利用し、各ペプトイドモノマーの薬理学的意義を決定するのに役立ち得る（Ｍｏｊｓｏｓｋａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５９，４１１２－４１２０（２０１５））。全体的な生物学的活性における各モノマーの役割を決定するために用いられる１つの方法は、サルコシンスキャンと呼ばれる。サルコシンはＮ－メチルグリシンであるため、ペプトイドでのサルコシンスキャンはペプチドでのアラニンスキャンと同等である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，１０８１－１０８５（１９８９））。ペプトイドの各モノマーを一度に１つずつサルコシンで置き換えて、化合物の全体的な薬理活性に対する単一残基の影響を決定する。このタイプのサルコシンスキャンは、以前は抗真菌ペプトイドＡＥＣ５を用いて行われた（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ２８ ２２，３５１４－３５１９（２０１８））。モノマーを薬理学的に重要な順に最適化し、最適化されたモノマーを後続のラウンドに繰り越す、その後のＡＥＣ５のモジュール式ＳＡＲ研究により、リード化合物であるＡＥＣ５と比較して抗真菌活性が増加し、毒性が減少したペプトイドβ－５が得られた（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ２８ ２２，３５１４－３５１９（２０１８））。

【0214】

ＲＭＧ８－８のサルコシンスキャンは、発見および最初の特徴付けの直後に完了し、ＲＭＧ８－８の親油性尾部が最も薬理学的に重要であり、続いてシクロヘキシル基、続いて主に細胞毒性の軽減に関与するカチオン性部分であることが明らかになった（Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ １２ ９，１４７０－１４７７（２０２１））。ＲＭＧ８－８の最適化を、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対する反復ＳＡＲ研究によって試みた。３ラウンドのモジュール式ＳＡＲ研究により、種々の親油性尾部、シクロヘキシル基の脂肪族および芳香族置換、ならびにカチオン性アミノ側鎖のトリメチル化を含有する、２５種の異なる分析用化合物が得られた。最終的に、試験した化合物はいずれも、ＲＭＧ８－８と比較して、肝細胞に対するＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの選択比によって決定される全体的な生物学的活性を改善しなかった。この結果であっても、この研究は、致命的な真菌感染症の処置に向けたＲＭＧ８－８の開発における重要かつ必要なステップである。

【0215】

すべてのＲＭＧ８－８誘導体は、ポリスチレンＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂上の固相サブモノマー合成法によって合成した（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １１４，１０６４６－１０６４７（１９９２））。合成中に使用したアミンおよび各モノマーのペプトイドの略号表記をそれぞれ表７および表８に示す。化合物はＲＰ－ＨＰＬＣによって９５％を超えるまで精製し、化合物の同一性をＥＳＩ－ＴＯＦ ＭＳによって確認した（表９）。ｐＨ７．４で計算された分配係数（ｃＬｏｇＤ_７．４）（ｖｉａ Ｃｈｅｍａｘｏｎ．ＭａｒｖｉｎＳｋｅｔｃｈ １９．１７．０，２０１９）およびＨＰＬＣ精製中の溶出時のアセトニトリルパーセントを記録し、疎水性の尺度として用いた（表１０）。ｃＬｏｇＤ_７．４およびアセトニトリルパーセントの値が高いほど、化合物の疎水性の増加していることを示す。抗菌ペプトイドでは、疎水性は抗菌活性と細胞毒性の両方に直接関係している（Ａｎｄｒｅｅｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ １８６０ ６，１４１４－１４２３（２０１８）；Ｂｏｌｔら、Ｍｅｄｃｈｅｍｃｏｍｍ ８、８８６－８９６（２０１７）；Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２４，（２０１９））。これらのパラメータの理想的なバランスは、一般に実験的に決定されなければならない。抗真菌活性を測定するために、真菌増殖の９０％を阻害するのに必要な化合物の濃度として定義される最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、ブロス微量希釈法を使用してＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対して決定した。哺乳動物細胞毒性は、ＨｅｐＧ２肝癌細胞を用いた細胞代謝活性アッセイによって評価し、潜在的に有望な化合物を選択して、ヒト赤血球に対する望ましくない溶血活性について試験した。

【表7】

【表8-1】

【表8-2】

【表9-1】

【表9-2】

【表10-1】

【表10-2】

【0216】

モジュール式ＳＡＲのラウンド１には、過去の研究で有益であることが証明されている種々の変更、および最も薬理学的に重要なモノマーである１位の親油性尾部の修飾が含まれていた（図８）（Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ １２ ９，１４７０－１４７７（２０２１））。種々の変更には、側鎖アミンのトリメチル化（１）、ＮａｅモノマーのＮｌｙｓによる置換（２）、およびＲＭＧ８－８配列の再配列（３）が含まれる。側鎖アミンのトリメチル化はカチオン電荷を固定するために行われる。これは以前のペプトイドＳＡＲ（（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ２８ ２２，３５１４－３５１９（２０１８））に一致し、化合物の毒性を低下させるであろうという仮説が立てられた。４位のＮａｅ残基のＮｌｙｓへの置換は、わずかに長いカチオン性側鎖が哺乳動物細胞毒性を減少させたことを示す同じ以前のＳＡＲ研究によって正当化された（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ２８ ２２，３５１４－３５１９（２０１８））。さらに、２位および５位を３位および４位で反転させて、モノマーの順序が生物学的活性にとって重要であるかどうかを決定した。化合物４～７はすべて、異なる親油性尾部、すなわち、それぞれミリスチン酸、パルミチン酸、ジヘキシルアミンおよびジオクチルアミンを含んでいた。以前の研究で、脂肪酸尾部を有するリポペプトイドが脂肪族アミン尾部を有するリポペプトイドよりも毒性が低いことが実証されたため、脂肪酸誘導体を探索した（Ｇｒｅｅｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ，１０６０４８（２０２０））。化合物６および７の二重の尾部は、単一の尾部よりも真菌膜とのより多くの相互作用を提供することができ、より多くの真菌細胞膜破壊を引き起こす可能性があるため、潜在的に効力を増加させるという仮説が立てられた。

【0217】

物理化学的測定により、化合物の最初のラウンドでは、ロックされたカチオンのために化合物１が最も親水性であり、一方、１６個の炭素パルミチン酸尾部を有する化合物５とジオクチル尾部を有する化合物７が最も疎水性であることが示された（表１０）。ブロス微量希釈法により、抗真菌活性の尺度がＭＩＣとして提供され、細胞毒性はＨｅｐＧ２細胞に対して測定され、生存細胞の５０％阻害をもたらす化合物の濃度（毒性用量５０％またはＴＤ_５０と呼ばれる）として計算された。選択比（ＳＲ）は、毒性（ＴＤ５０）を効力（ＭＩＣ）で割ることによって計算され、これを使用して化合物の全体的な治療域の全体像を把握した（表１０）。トリメチル化化合物１は、試験した最高濃度（＞２００μｇ／ｍＬ）を超えて細胞毒性を実際に減少させたが、抗真菌活性は８倍減少し、トリメチル化がＲＭＧ８－８を改善するための有用な戦略ではなかったことを示した。化合物２は、活性の２倍の低下と、細胞毒性のわずかしか変化を示し、使用されるジアミンの長さは重要ではないことを示した。化合物３は、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対するＭＩＣの２倍の減少と、細胞毒性の中程度の増加を示した。この効果の理由は不明であるが、モノマーの順序が細胞毒性に及ぼす影響を観察し、注目することは興味深い。化合物４は、ＲＭＧ８－８よりも疎水性が高いものの、脂肪酸尾部を調査した以前の研究（Ｇｒｅｅｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ，１０６０４８（２０２０））に一致して細胞毒性の低下を示したが、抗真菌活性も弱まっていた。より長い脂肪酸尾部で修飾された化合物５は、化合物４と比較して抗真菌活性が向上していたが、ＲＭＧ８－８と比較するとまだ低下していた。さらに、化合物５の細胞毒性は、ラウンド１で試験したどの化合物よりも大きかった。化合物６の計算された疎水性はＲＭＧ８－８にと同様であったが、化合物６は、おそらく６炭素鎖が短いため、抗真菌活性の劇的な低下を示し、ＭＩＣは１００μｇ／ｍＬであった。このことは、本明細書で、および他者が試験したもののような、長い脂肪族尾部を含むリポペプトイドの抗真菌活性が、必ずしもその尾部によって提供される全体的な疎水性に起因するのではなく、より重要なことに、尾部の長さが微生物膜を破壊する方法に起因することを示している。ジオクチルテールを有する化合物７も、ＲＭＧ８－８と比較して抗真菌活性が低下し、細胞毒性は同等であった。全体として、ラウンド１では、これまでに価値のあった多くの修飾およびユニークな新しい尾部修飾を探索したが、ＲＭＧ８－８と比較して活性または選択性が改善された化合物は得られなかった。

【0218】

１位のトリデシルアミン尾部が最適な選択肢であることが確認されたため、これはラウンド２の全ての誘導体に引き継がれた。ラウンド２では、ＲＭＧ８－８の位置が同一であり、サルコシンで置換した場合に同一の結果が得られたため（図９）、２位と５位の様々な脂肪族側鎖誘導体を同時に探索した（Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ １２ ９，１４７０－１４７７（２０２１））。これらの側鎖は、サイズ、環式か非環式か、および複素環の効果を含む複数のパラメータを探索するために選択された。化合物８および９は、それぞれ小さなイソプロピル基とイソブチル基を含有しており、全体的な疎水性および毒性を低下させると仮説が立てられた。化合物１０は、ＲＭＧ８－８に見られるシクロヘキシル基の代わりに直鎖ヘキシル基を含有していた。化合物１１および１２は、それぞれシクロペンチル基とシクロヘキシルメチル基を含有しており、これらの位置における側鎖の環状の性質が重要であり得るが最適化可能であり得ることを合理的に示した。最後に、化合物１３は、テトラヒドロフルフリル基を組み込むことによって複素環を探索した。

【0219】

物理化学的分析により、ラウンド２では、直鎖ヘキシル基を含有する化合物１０が最も疎水性が高く、シクロヘキシル基を含有するＲＭＧ８－８よりも有意に疎水性が高いことが示された（表１０）。化合物８および１３は、各化合物のイソプロピル部分とテトラヒドロフラン部分がそれぞれメチレンの数を減らし、ヘテロ原子を加えたため、最も疎水性が低かった。生物学的特性評価により、化合物１０および１２がＲＭＧ８－８と同様の抗真菌活性を保持したが、顕著に高い細胞毒性を有し、選択比が低いことが示された（表１０）。これらの化合物はいずれも、生物学的活性に影響を及ぼす構造的なニュアンスを示し、リードペプトイド最適化の課題を強調している。化合物１０はヘキシル側鎖の環状の性質のみが異なり、化合物１２はアミド主鎖と側鎖との間のメチレンの付加のみが異なるが、これらの特性はＲＭＧ８－８の優れた選択性に関連している。化合物８、１１および１３は、ＲＭＧ８－８と比較していずれも疎水性が低く、２００μｇ／ｍＬを超える細胞毒性値を有していた。しかしながら、これらの化合物はそれぞれ、抗真菌効果の４～１６倍の減少も示した。イソブチル側鎖を有する化合物９は、最も有望であり、抗真菌活性は２倍しか低下せず、細胞毒性は中程度であったが、この化合物は依然としてＲＭＧ８－８のＳＲにははるかに及ばなかった。最終的に、ラウンド２の誘導体は、ＲＭＧ８－８と比較して改善された生物学的選択性を示さなかったため、ラウンド３は次に芳香族側鎖誘導体を探索するように設計された。

【0220】

ラウンド３は最大のラウンドであり、２位と５位に芳香族誘導体からなる１２個の化合物を有していた（図１０）。フェニル、ベンジルおよびＳ－メチルベンジル側鎖をそれぞれ含有する化合物１４、１５および１６では、より単純な芳香族側鎖が最初に選択された。Ｓ－メチルベンジル側鎖は、これまでに探索された抗菌ペプトイドの中で一般的であり、普及している（Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２２，（２０１７））。ハロゲン化芳香族も、それぞれパラフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードベンジル側鎖を含有する化合物１７、１８、１９および２０で探索された。ハロゲン化側鎖は、抗菌活性および選択性を最適化するのに有用であることが以前の研究で証明されている（Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０，（２０２０））。縮合環系は、ナフチルおよびインダニル側鎖をそれぞれ組み込んだ化合物２１および２２で探索された。最後に、インドリル、フルフリルおよびチオフェニル側鎖をそれぞれ組み込んだ化合物２３、２４および２５の芳香族複素環を探索した。フルフリルおよびチオフェニル側鎖は、以前の抗真菌性ペプトイドにおいて有用であることが証明されている（Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ，（２０２２）；Ｃｏｒｓｏｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ７ １２，１１３９－１１４４（２０１６）；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ２８ ２２，３５１４－３５１９（２０１８））。

【0221】

物理化学的分析により、大きなハロゲン（１９および２０）または縮合環系（２１および２２）を含有する誘導体が最も疎水性が高いことが示された（表５）。当然のことながら、ヘテロ芳香族側鎖を含有する化合物（２４および２５）は最も疎水性が低かった。芳香族部分の付加は、以前の修飾と比較して、全体として抗真菌活性を増加させた（表１０）。これはおそらく、２位および５位のより大きく、疎水性の高い基による膜破壊の増加に起因し得る。しかしながら、いくつかの化合物はＲＭＧ８－８と比較して同様の有効性を有したが、このリードペプトイドよりも良好に機能したものはなかった。側鎖がより嵩高く、より疎水性であることの欠点の１つは、哺乳動物細胞毒性が増加することである。化合物１４、１８、１９、２０、２１、２２および２３は、不適格な細胞毒性を示し、ＴＤ _５０値はＲＭＧ８－８の１８９±４３μｇ／ｍＬのＴＤ_５０をはるかに下回った。ベンジル（１５）、メチルベンジル（１６）またはパラ－フルオロベンジル（１７）側鎖を含有する化合物は、ＲＭＧ８－８と同様の細胞毒性を示した。芳香族複素環を含有するそれらの誘導体、化合物２４および２５も同様で、これらの化合物のいくつかはＲＭＧ８－８と比較してわずかに低いＳＲしかもたらさなかった。興味深いことに、ハロゲンサイズの増加は、抗真菌活性の低下をもたらした。これは、以前に発表された抗菌性ペプトイドに関する研究とは反対である（Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０，（２０２０））。ハロゲン化ペプトイドに関連する抗菌傾向は、細菌と真菌を標的とする場合では異なる可能性がある。

【0222】

本明細書で試験したＳＡＲ誘導体には、ＲＭＧ８－８よりも活性が高く毒性が低かいものはなかったが、選択化合物はＳＲがわずかに減少しただけであった。哺乳動物細胞毒性のさらなる重要な尺度として、これらの選択化合物（９、１６、１７、２５）をヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対する溶血活性について試験した。特定の医薬品の望ましくない結果である溶血は、赤血球の分解または溶解であり、毒性の重要な指標である。^５０ 赤血球は一次ドナーに由来し、ＨｅｐＧ２細胞のように不死的に培養されていないため、溶血はドナーごとに異なり得る。したがって、ＲＭＧ８－８を、選択した誘導体とともに、ｈＲＢＣの同じドナー試料に対して再評価した（表１１）。これらのペプトイドのうち、化合物９（ＨＣ_１０＝１３０±４５μｇ／ｍＬ）は、ＲＭＧ８－８（ＨＣ_１０＝７５±３１μｇ／ｍＬ）よりも溶血性が大幅に低いため、有望な結果を示した。化合物２５は同等の溶血活性を示し、化合物１６および１７はＲＭＧ８－８よりも著しく溶血性が高かった。以前の研究で見られたように、化合物９とＲＭＧ８－８との間の溶血の減少は、化合物９のイソブチル側鎖による疎水性の全体的な減少に起因する可能性が最も高い（Ｇｒｅｅｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ，１０６０４８（２０２０）；Ｇｒｅｃｏら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ １０，１３２０６（２０２０））。化合物９の溶血活性の低下は有望であるが、ここで試験した化合物はいずれもＲＭＧ８－８と比較して選択比が有意に増加しなかった。

【表11】

【0223】

この研究の目標は、反復ＳＡＲ研究により、リード抗真菌ペプトイドであるＲＭＧ８－８を最適化することであった。３ラウンドのＳＡＲを実行し、各ラウンドでは異なる修正戦略を利用した。ラウンド１は、１位の親油性尾部誘導体と、以前に有望であることが示されていたその他の種々の変更で構成された。ラウンド２では、２位および５位に様々な脂肪族残基が含まれ、ラウンド３では、これらの同じ位置に芳香族誘導体が含まれていた。まとめると、本明細書で合成された誘導体は、ＲＭＧ８－８の生物学的活性を改善し得る修飾を試み、同定するための多様な化学空間を探索した。化合物９による改善された溶血活性は重要であり、この化合物はＲＭＧ８－８に匹敵するＭＩＣおよび細胞毒性値を有し、このペプトイドの評価を継続する価値がある。これらのデータは、既に有望な生物学的特性を有するペプトイドを同定するために大量の化学空間を調べる、ＲＭＧ８－８を発見したＰＬＡＤアッセイの力を認識している。実行可能な抗真菌治療薬としてのＲＭＧ８－８の開発は進行中であり、現在の努力は薬理学的特性と有効性特性のインビボでの特性評価に集中している。
材料および方法

【0224】

全ての試薬は、９５％よりも高い純度で購入した。試薬および材料は、フィッシャー・サイエンティフィック（マサチューセッツ州ウォルサム）、アルファ・エイサー（マサチューセッツ州ヘイバーヒル）、ＴＣＩアメリカ（オレゴン州ポートランド）、Ａｍｒｅｓｃｏ（オハイオ州ソロン）、ＥＭＤミリポア（マサチューセッツ州ビレリカ）、Ｓｕｐｒａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州ベルモント）、およびＣｈｅｍ－Ｉｍｐｌｅｘ（イリノイ州ウッドデール）から購入した。モノメトキシトリチル保護ジアミンは以前に記載されているように合成した。^１ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）は、イノベイティブリサーチ（ミシガン州ノバイ）から入手した。全ての質量スペクトルは、イオン移動度を用いたＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ ＨＤＭＳ ＱｔｏＦで取得した。化合物の精製は、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｃ１８カラム（５μＭ；２５ｃｍ×２１．２ｍｍ；シグマ・アルドリッチ５８１３４７－Ｕ）を備えたＶａｒｉａｎ Ｐｒｅｐｓｔａｒ ＳＤ－１および０．０５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルに対する水の０～１００％勾配を用いて達成した。分配係数ｃＬｏｇＤ_７．４は、ＭａｒｖｉｎＳｋｅｔｃｈ（Ｃｈｅｍａｘｏｎ．ＭａｒｖｉｎＳｋｅｔｃｈ １９．１７．０）を用いて決定した。

【0225】

ペプトイドは、実施例１に記載の方法と同様のサブモノマー手法を使用して、固相上で合成した。この方法は、本明細書で研究したペプトイドの大部分を合成するのに十分であった。特定のペプトイドに必要なよりユニークな方法を以下に説明する。Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅリンカー（担持容量：０．７５ｍｍｏｌ／ｇ）を有するポリスチレン樹脂をフリットカラムに入れ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で３０分間膨潤させ、続いてＦｍｏｃ脱保護を２０％ピペリジンでそれぞれ１０分間２回行った。カイザー試験を利用して、完全なＦｍｏｃ脱保護を決定した。ＤＭＦで３回洗浄した後、樹脂を無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の２Ｍブロモ酢酸および無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の３．２Ｍジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）でアシル化した。反応物を１０％出力で１５秒間２回電子レンジで加熱し、次いで１５分間揺動させた。溶液を樹脂から吸引し、樹脂をＤＭＦで３回洗浄した。カイザー試験を行って、反応が成功したことを確認した。サブモノマー付加のために、所望のアミン（３ｍＬ）の２Ｍ溶液を樹脂に添加し、１０％出力で１５秒間２回電子レンジで加熱し、次いで、揺動装置に３０分間置いた。これらのアシル化とアミノ化の交互の工程を、所望のペプトイド構造が達成されるまで、必要なアミンを用いて繰り返した。各化合物の合成中に使用されるアミンおよびモノマーの略記号をそれぞれ表７および８に示す。親油性尾部の最終的なサブモノマー添加を３５℃で一晩揺動させて、アミン溶解度を維持し、反応収率を向上させた。樹脂をＤＭＦで３回、ＣＨ_２Ｃｌ_２で３回洗浄し、真空下で５分間乾燥させた。化合物を樹脂から切断するために、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）：２．５％ Ｈ２Ｏの混合物を添加し、１時間揺動させた。反応溶液を樹脂から５０ｍＬコニカルチューブに排出し、ＴＦＡを空気流下で蒸発させた。得られた油を、１：１アセトニトリル（ＡＣＮ）：Ｈ２Ｏ（８ｍＬ）中で再構成し、精製に備えた。

【0226】

化合物１の合成は、親油性尾部の付加後まで一般的なペプトイド合成手順に従った。この付加の後、Ｎ末端アミンのＢｏｃ保護を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中５％ Ｎ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）中で、Ｂｏｃ無水物（４３０μＬ；１．８７ｍｍｏｌ）とともに１時間揺動させながら処置することによって達成した。樹脂をＤＭＦで３回、ＣＨ_２Ｃｌ_２で３回洗浄した。Ｍｍｔ保護基を除去するために、樹脂をＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）中１％ ＴＦＡで６回、それぞれ１０分間処置し、続いてＣＨ_２Ｃｌ_２で３回およびＤＭＦで３回洗浄した。樹脂アミンは、ＤＭＦ中５％ ＮＭＭで５分間処置し、次いで２５℃で一晩揺動しながらＤＭＦ（５ｍＬ）中ヨウ化メチル（１１８μＬ；１．９ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（６１９ｍｇ；１．９ｍｍｏｌ）でトリメチル化することによって遊離基とした。樹脂をＤＭＦで３回、水で３回、ＤＭＦで３回、次いでＣＨ_２Ｃｌ_２で３回洗浄した。化合物切断手順に従い、Ｎ末端Ｂｏｃ基も除去した。

【0227】

化合物４および５の合成は、これらのペプトイドでは脂肪酸である脂肪族尾部を付加するまで、一般的なペプトイド合成手順に従いました。Ｆｍｏｃ－グリシン－ＯＨ（２２２．７５ｍｇ；０．７５ｍｍｏｌ）は、ＤＭＦ中５％ＮＭＭ中の（７ｍＬ）３－［ビス（ジメチルアミノ）メチリウミル］－３Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、２８４．４ｍｇ；０．７５ｍｍｏｌ）で１０分間活性化した。この溶液を樹脂に添加し、１時間揺動させた。吸引し、ＤＭＦで３回洗浄した後、カイザー試験を行ってカップリングの成功を確認した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用してＦｍｏｃ保護基を除去した（それぞれ約７ｍＬを２回、各１０分間）。Ｆｍｏｃの除去を確認するために、別のカイザー試験を行った。４モル当量のミリスチン酸（化合物４）およびパルミチン酸（化合物５）を、ＤＭＦ中５％ ＮＭＭ中のＨＢＴＵ（２８４．４ｍｇ；０．７５ｍｍｏｌ）で１０分間活性化した。この溶液を樹脂に添加し、１時間揺動させた。吸引後、ＤＭＦ洗浄を３回行い、カイザー試験を用いて適切なカップリングを確認した。次いで、樹脂をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回洗浄し、真空下で５分間乾燥させた。次いで、化合物切断手順に従った。

【0228】

ペプチドは、Ｖａｒｉａｎ Ｐｒｅｐｓｔａｒ ＳＤ－１を使用して逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製した。移動相は、０．０５％ ＴＦＡを含有するアセトニトリルに対して０～１００％水の勾配で構成され、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｃ１８カラム（５μｍ；２５ｃｍ×２１．２ｍｍ；シグマ・アルドリッチ５８１３４７－Ｕ）を固定相として使用した。０．１ＡＵを超えるクロマトグラムのピークを収集し、質量分析によって分析した。所望のペプトイドを含むピーク生成物を真空中で乾燥させ、一晩凍結乾燥した。次いで、ペプトイドを滅菌１８ｍΩ脱イオン水中で再構成して、２０ｍｇ／ｍＬの化合物ストックを作製した。

【0229】

化合物を、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ ＨＤＭＳによる電子スプレーイオン化飛行時間型質量分析（ＥＳＩ－ＴＯＦ ＭＳ）で分析した。ＲＰ－ＨＰＬＣ精製生成物の分析のために、収集したピークを質量分析計に直接注入し、化合物の質量／電荷の存在を確認した（表９）。

【0230】

Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対するＭＩＣアッセイは前記ＣＬＳＩガイドラインに従って行われた（ＣＬＳＩ．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ；ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ－ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；ＣＬＳＩ ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｍ２７－Ａ３．（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、２００８；（Ｃｏｒｓｏｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ７ １２，１１３９－１１４４（２０１６））。ＹＰＤ寒天プレートにＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ凍結培養ストックを画線塗布し、３５℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、滅菌ループを使用して１～２個のコロニーを５ｍＬの０．８５％生理食塩水に移した。３０秒間ボルテックスした後、分光光度計を用いて６００ｎｍの光学密度を、０．１５～０．２５の所望の範囲で測定した。０．１ｍＬの細胞溶液を９．９ｍＬのＲＰＭＩ－ＭＯＰＳに添加すると、１：１００の細胞溶液が生成された。ボルテックス後、０．５ｍＬの１：００溶液を９．５ｍＬのＲＰＭＩ－ＭＯＰＳに添加して、１：２０細胞溶液を作製した。１９８μＬの１：２０溶液を、中間対照に指定されたウェルとは別に、不透明な９６ウェルプレートのウェルに添加した。２０ｍｇ／ｍＬの化合物ストックを使用して２倍連続希釈液を調製し、２μＬの各化合物希釈液を３連でプレーティングし、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、および１．５６μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。アムホテリシンＢを陽性対照として使用し、滅菌水をビヒクル対照として使用した。プレートを３５℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、目に見える増殖をもたらさなかった化合物の濃度をＭＩＣとして記録した。全てのアッセイは、異なる日に生物学的に３連で実施した。

【0231】

ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞に対する細胞毒性を以前に記載されているように行った（Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ，（２０２２）；Ｃｏｒｓｏｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ７ １２，１１３９－１１４４（２０１６））。ＨｅｐＧ２細胞は、フェノールレッドｐＨ指示薬を含み、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＰＳＧ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用して、Ｔ－７５フラスコ中で培養維持した。細胞は、所望の培養密度が達成されるまで、加湿インキュベーター中、３７℃および５％ ＣＯ_２でインキュベートした。培地をフラスコから除去し、細胞を１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．８ｍＭリン酸塩、１４０．４ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）で１回洗浄し、次いでこれを廃棄した。フラスコから付着細胞を除去するために、２ｍＬのトリプシンを添加し、細胞を１０分間インキュベートした。トリプシンをクエンチするために、１０％ ＦＢＳおよび１％ ＰＧＳを含む８ｍＬのフェノールレッド不含ＤＭＥＭを添加し、細胞溶液を１５ｍＬコニカルチューブに移した。１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞をペレット化した後、上清を捨て、アッセイに必要な量のフェノールレッド不含培地に細胞を再懸濁した。細胞濃度を血球計数器で計数することによって決定し、１×１０^５細胞／ｍＬの濃度が達成されるまで溶液を培地で希釈した。細胞溶液の１００μＬアリコートを、培地対照に使用した３つのウェルとは別に、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。細胞が接着するまで細胞を３７℃および５％ ＣＯ２で２～３時間インキュベートした。

【0232】

２０ｍｇ／ｍＬの化合物ストックを使用して、滅菌水中の各化合物の２倍連続希釈液を調製し、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３および１．５６μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。調製した化合物溶液１１．１μＬを適切なウェルに３連で添加した。滅菌水の陰性ビヒクル対照、ならびに前述の培地対照を使用した。プレートを３７℃および５％ ＣＯ２で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、水中５ｍｇ／ｍＬの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）２０μＬを各ウェルに添加した。プレートを３７℃および５％ ＣＯ２で３時間インキュベートした。滅菌ガラス製パスツールピペットを使用して培地を各ウェルから除去した。１００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーを使用して５７０ｎｍで吸光度を読み取った。このＭＴＴアッセイは、矛盾する結果が観察されない限り、生物学的複製で実施した。これが該当する場合、さらなる検証のためにアッセイを生物学的に３連で実施した。報告された値は、生物学的反復の平均値と標準偏差である。

【0233】

選択ペプトイドの溶血活性は、以前に行ったように決定した（Ｇｒｅｅｎら、ＡＣＳ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ １２ ９，１４７０－１４７７（２０２１）；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ２８ ２２，３５１４－３５１９（２０１８））。選択されたペプトイドを、所望の濃度のＰＢＳ中２倍連続希釈で調製した。ヒト赤血球（ｈＲＢＣ、９ｍＬ）を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を取り出して廃棄した。ＰＢＳの１０ｍＬアリコートを使用してｈＲＢＣを再懸濁し、これを再び１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。このＰＢＳ洗浄をさらに２回行い、合計３回洗浄した。ＰＢＳの９ｍＬアリコートをｈＲＢＣに添加し、１００μＬの細胞溶液を９６ウェルプレートの個々のウェルに添加した。ペプトイド溶液（１１．１μＬ）を適切なウェルに３連で添加した。ＰＢＳのビヒクル対照および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の陽性対照を３連でウェルに添加した。

【0234】

プレートを３７℃で１時間インキュベートし、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。各ウェルについて、５μＬの上清を新しい９６ウェルプレート中の９５ｕＬのＰＢＳに移した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーを使用して４０５ｎｍでの吸光度を測定し、溶血パーセントを以下のように計算した。

【数5】

この溶血アッセイは、異なる日に生物学的に３連で実施した。

【0235】

本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に利用可能な資料（例として、例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑへのヌクレオチド配列の提出、ならびに、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢへのアミノ酸配列の提出、ならびに、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、参照によりその全体が組み込まれる。刊行物（補足表、補足図、補足材料および方法、ならびに／または補足実験データなど）中で参照される補足資料も同様に、参照によりその全体が組み込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書の１または複数の開示との間に矛盾が存在する場合、本出願の開示が優先されるものとする。上記の詳細な説明および例は、理解を明確にするためにのみ与えられている。そこから不必要な限定が理解されることはない。本開示は、図示および説明された正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変形は、特許請求の範囲によって定義される本開示に含まれる。

【0236】

別段示されない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などを表す全ての数字は、いかなる場合も「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。したがって、別段示されない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本開示によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、そして均等論を特許請求の範囲に限定する試みではないが、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の桁数を考慮して、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。

【0237】

本開示の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体例に記載される数値は可能な限り正確に報告されている。しかし、すべての数値には、それぞれの試験測定で見出された標準偏差から必然的に生じる範囲が本質的に含まれる。

【0238】

すべての見出しは、読者の便宜のためのものであり、特に明記しない限り、見出しに続くテキストの意味を限定するために使用されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】