知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】臓器保存のためのＨ－ＮＯＸタンパク質
(51)【国際特許分類】
A01N 1/02 20060101AFI20240829BHJP
A01N 63/50 20200101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
A01N1/02
A01N63/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024510306
(86)(22)【出願日】2022-08-18
(85)【翻訳文提出日】2024-04-10
(86)【国際出願番号】 US2022075179
(87)【国際公開番号】W WO2023023627
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】63/234,454
(32)【優先日】2021-08-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524062560
【氏名又は名称】オムニオックス インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100196977
【弁理士】
【氏名又は名称】上原 路子
(72)【発明者】
【氏名】ジョナサン ウィンガー
(72)【発明者】
【氏名】アナ クルトリカ
(72)【発明者】
【氏名】フランシス アレクサンドラ ルークス
【テーマコード（参考）】
4H011
【Ｆターム（参考）】
4H011BB20
4H011CA01
4H011CB05
(57)【要約】
本発明は、移植用臓器の保存のための重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する。移植用の臓器を保存するための重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む方法及び組成物も開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ドナーの脳死又は心臓死後に提供用臓器を保存する方法であって、少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質、安定化溶液、及び／又は臓器保存溶液を含む組成物をドナーに投与することを含み、前記組成物が０℃～３７℃の温度にある上記方法。
【請求項2】
前記安定化溶液が、塩を含み、ｐＨが６．５～７．６である水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記溶液がナトリウムイオンを含む水溶液である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記安定化溶液が、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのグルタチオン、及び０．１％のポロキサマー１８８を含む、ｐＨ６．８±０．２の水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記臓器保存液が、ｐＨ６．５～７．５の塩を有し、塩、砂糖、酸化防止剤、活性剤を含む水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記溶液が、塩化物、硫酸塩、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、又はカリウムイオン；マンニトール、ラフィノース、スクラーゼ、グルコース、フルクトース、ラクトビオネート、及びグルコン酸塩から選択される糖類；グルタチオン；キサンチンオキシダーゼ阻害剤、乳酸塩、及びアミノ酸から選択される活性剤、及び任意選択的にヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、及びデキストランから選択されるコロイドを含む水溶液である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記Ｈ－ＮＯＸタンパク質が、組成物の最終容量に対して０．００１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、前記組成物が２５０～３５０ｍＯｓｍ／１のオスモル濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｈ－ＮＯＸタンパク質が、前記組成物の最終容量と比較して、０．５ｍｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌで存在し、前記組成物が２７５～３１０ｍＯｓｍ／ｌのオスモル濃度を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
脳死後提供ドナー又は心臓死後提供ドナーの臓器を原位置外で保存する方法であって、以下の工程を含む方法：ａ）請求項１で定義された組成物による前記死亡したドナーを灌流する工程；次に
ｂ）移植すべき臓器を採取する工程；次に
ｃ）工程ｂ）で得られた前記臓器を、０℃～３７℃の温度で、前記臓器に応じて所定の時間、工程ａ）で定義された組成物又は水溶液中で静的又は動的灌流保存する工程。
【請求項10】
少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質、安定化溶液、及び／又は臓器保存溶液を含む組成物の使用であって、脳死又は心停止で死亡したドナーの臓器を保存するために、前記組成物が０℃～３７℃の温度を有する、上記使用。
【請求項11】
前記Ｈ－ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸ、Ｌ．ニューモフィラ2 Ｈ－ＮＯＸ、ホモ・サピエンス β1、ドブネズミ β1、オオカミ Ｈ－ＮＯＸドメイン、ショウジョウバエβ１、ショウジョウバエＣＧ１４８８５－ＰＡ、Ｃ．エレガンスＧＣＹ－３５、藍藻類Ｈ－ＮＯＸ、Ｃ．クレセンタスＨ－ＮＯＸ、Ｓ．オネイデンシスＨ－ＮＯＸ、又はＣ．アセトブチリカムＨ－ＮＯＸであることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
前記安定化溶液が、塩、好ましくはナトリウムイオンを含む水溶液であり、本発明による組成物に６．５～７．６のｐＨを与えることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項13】
前記安定化溶液が、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのグルタチオン、及び０．１％のポロキサマー１８８を含む、ｐＨ６．８±０．２の水溶液であることを特徴とする、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項14】
前記臓器保存溶液が、６．５～７．５のｐＨを有し、そして塩、好ましくは塩化物、硫酸塩、ナトリウムイオン及びカルシウムイオン、マグネシウム及びカリウム；糖、好ましくはマンニトール、ラフィノース、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトビオネート、又はグルコン酸塩；抗酸化剤、好ましくはグルタチオン；活性剤、好ましくはキサンチンオキシダーゼ阻害剤、例えばアロプリノール、乳酸塩、又はアミノ酸、例えばヒスチジン、グルタミン酸（又はグルタミン酸塩）、トリプトファン；及び任意選択的に、コロイド、例えばヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、又はデキストランを含むことを特徴とする、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項15】
前記Ｈ－ＮＯＸタンパク質が、組成物の最終容量に対して、０．００１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００５ｍｇ／ｍｌ～２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、そして前記組成物のオスモル濃度が、２５０～３５０ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは２７５～３１０ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは約３０２ｍＯｓｍ／Ｌであることを特徴とする、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項16】
脳死又は心停止状態で死亡した死亡ドナーの臓器を原位置外で保存する方法であって、以下の工程を含む方法：ａ）前記死亡したドナーに請求項１０～１５のいずれか１項に記載の組成物、又は請求項１２～１５のいずれか１項に記載の水溶液を注入する工程；次に
ｂ）移植すべき臓器を取り出す工程；次に
ｃ）工程ｂ）で得られた前記臓器を、静的又は動的灌流状態で、０℃から３７℃、好ましくは２℃～２５℃、より好ましくは約４℃又は３７℃の温度で、前記臓器に応じて決定される時間、工程ａ）で定義された組成物又は水溶液中で維持する工程。
【請求項17】
死亡したドナーの臓器を原位置外で保存する方法であって、以下の工程を含む方法：ａ）移植すべき臓器を取り出す工程、及び
ｂ）工程ａ）で得られた前記臓器を、静的又は動的灌流状態で、０℃から３７℃、好ましくは２℃～２５℃、より好ましくは約４℃又は３７℃の温度で、前記臓器に応じて決定される時間、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の組成物中で、又は請求項１２～１５のいずれか１項に記載の水溶液を用いて維持する工程。
【請求項18】
臓器を原位置外で保存するための方法であって、以下の工程を含む方法：ａ）移植すべき臓器を採取する工程；次に
ｂ）工程ａ）で得られた前記臓器を、静的又は動的灌流状態で０℃～３７℃の温度で、前記臓器に応じて所定の時間、請求項１に記載の組成物又は水溶液中で維持する工程。
【請求項19】
６．５～７．６のｐＨを有し、以下を含む組成物：少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質；
好ましくは０～０．５ｍＭの量のカルシウムイオン；
好ましくは２０～１００ｍＭの量のＫＯＨ；
好ましくは２０～１２５ｍＭの量のＮａＯＨ；
好ましくは２０～２５ｍＭの量のＫＨ２ＰＯ４；
好ましくは３～５ｍＭの量のＭｇＣｌ２；
好ましくは５～２００ｍＭの量のラフィノース及びグルコースから選択される少なくとも１つの糖；
好ましくは３～５ｍＭの量のアデノシン；
好ましくは２～４ｍＭの量のグルタチオン；
好ましくは０～１ｍＭの量のアロプリノール；及び、
好ましくは１～５０ｇ／ｌの量の、ヒドロキシエチルデンプン、様々な分子量のポリエチレングリコール、及びヒト血清アルブミンから選択される少なくとも１つの化合物。
【請求項20】
６．５～７．６のｐＨを有し、以下を含む組成物：少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質；
好ましくは０～０．５ｍＭの量のカルシウムイオン；
好ましくは１５～３０ｍＭの量のＮａＯＨ；
好ましくは２～１０ｍＭの量のヘペス；
好ましくは２０～２５ｍＭの量のＫＨ２ＰＯ４；
好ましくは２０～３５ｍＭの量のマンニトール；
好ましくは３～１０ｍＭの量のグルコース；
好ましくは５０～１００ｍＭの量のグルコン酸ナトリウム；
好ましくは１～５ｍＭの量のグルコン酸マグネシウム；
好ましくは２～５ｍＭの量のリボース；
好ましくは１～５０ｇ／ｌの量の、ヒドロキシエチルデンプン、様々な分子量のポリエチレングリコール、及びヒト血清アルブミンから選択される少なくとも１つの化合物
好ましくは２～４ｍＭの量のグルタチオン；及び
好ましくは３～５ｍＭの量のアデニン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年８月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／２３４，４５４号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年８月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／２３４，４５４号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
技術分野
本出願は、ドナーの脳死後の提供、又はドナーの心臓死後の提供において、少なくとも１つの臓器を原位置又は原位置外で保存する方法における重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の使用に関する。
本出願は、ドナーの脳死後の提供、又はドナーの心臓死後の提供において、少なくとも１つの臓器を原位置又は原位置外で保存する方法における重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
Ｈ－ＮＯＸタンパク質［ヘム一酸化窒素及びＯＸｙｇｅｎ結合ドメイン（Heme-Nitric oxide and OXygen binding domain）にちなんで命名された］は、高度に保存され、よく特性評価されたヘムタンパク質ファミリーのメンバーである（Iyer, LM et al. (2003) BMC Genomics 4(1):5; Karow, DS et al. (2004) Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, EM et al. (2005) Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, EM et al. (2005) Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, EM et al. (2005) J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902; Cary, SP et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(37):13064-9; Karow DS et al. (2005) Biochemistry 44(49):16266-74; Cary, SP et al. (2006) Trends Biochem Sci 31(4):231-9; Boon, EM et al. (2006) J Biol Chem 281(31):21892-902; Winger, JA et al. (2007) J Biol Chem. 282(2):897-907）。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は一酸化窒素中性であり、これまでのヘモグロビンベースの酸素担体とは異なり、循環する一酸化窒素を除去しないため、高血圧や腎臓の副作用とは関係がない。本質的に低いＮＯ反応性（及び高いＮＯ安定性）により、野生型及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は望ましい血液代替物となっている。これは、内因性ＮＯによるＨ－ＮＯＸタンパク質の不活化の可能性が低く、Ｈ－ＮＯＸタンパク質による内因性ＮＯの除去の可能性が低いためである。重要なことに、一部のＨ－ＮＯＸタンパク質における遠位ポケットチロシンの存在（Pellicena, P. et al. (2004) Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):12854-12859）は、望ましくない高いＮＯ反応性を示唆しており、血液代替品としての使用を禁止している。例えば、類推すると、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のヘモグロビンタンパク質は、構造的に類似した遠位ポケットチロシンを有し、ＮＯと極めて迅速に反応し、そして結核菌によって使用されて、感染した宿主によって生成される防御的ＮＯを効果的に除去し回避する（Ouellet, H. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci.U S A 99(9):5902-5907）。しかし、驚くべきことに、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は実際にはヘモグロビンよりもＮＯ反応性がはるかに低く、血液代替物としての使用が可能であることが発見された。
Ｈ－ＮＯＸタンパク質［ヘム一酸化窒素及びＯＸｙｇｅｎ結合ドメイン（Heme-Nitric oxide and OXygen binding domain）にちなんで命名された］は、高度に保存され、よく特性評価されたヘムタンパク質ファミリーのメンバーである（Iyer, LM et al. (2003) BMC Genomics 4(1):5; Karow, DS et al. (2004) Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, EM et al. (2005) Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, EM et al. (2005) Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, EM et al. (2005) J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902; Cary, SP et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(37):13064-9; Karow DS et al. (2005) Biochemistry 44(49):16266-74; Cary, SP et al. (2006) Trends Biochem Sci 31(4):231-9; Boon, EM et al. (2006) J Biol Chem 281(31):21892-902; Winger, JA et al. (2007) J Biol Chem. 282(2):897-907）。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は一酸化窒素中性であり、これまでのヘモグロビンベースの酸素担体とは異なり、循環する一酸化窒素を除去しないため、高血圧や腎臓の副作用とは関係がない。本質的に低いＮＯ反応性（及び高いＮＯ安定性）により、野生型及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は望ましい血液代替物となっている。これは、内因性ＮＯによるＨ－ＮＯＸタンパク質の不活化の可能性が低く、Ｈ－ＮＯＸタンパク質による内因性ＮＯの除去の可能性が低いためである。重要なことに、一部のＨ－ＮＯＸタンパク質における遠位ポケットチロシンの存在（Pellicena, P. et al. (2004) Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):12854-12859）は、望ましくない高いＮＯ反応性を示唆しており、血液代替品としての使用を禁止している。例えば、類推すると、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のヘモグロビンタンパク質は、構造的に類似した遠位ポケットチロシンを有し、ＮＯと極めて迅速に反応し、そして結核菌によって使用されて、感染した宿主によって生成される防御的ＮＯを効果的に除去し回避する（Ouellet, H. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci.U S A 99(9):5902-5907）。しかし、驚くべきことに、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は実際にはヘモグロビンよりもＮＯ反応性がはるかに低く、血液代替物としての使用が可能であることが発見された。
【0004】
ＮＯには結合するがＯ２には結合しないＨ－ＮＯＸタンパク質は、単一のアミノ酸変異の導入によりＮＯとＯ２の両方に結合するＨ－ＮＯＸタンパク質に変換することができることが発見された（ＷＯ２００７／１３９７９１号及びＷＯ２００７／１３９７６７号を参照）。従って、Ｏ２及びＮＯに対するＨ－ＮＯＸタンパク質の親和性、及びＯ２とＮＯリガンドを区別するＨ－ＮＯＸタンパク質の能力は、１つ又はそれ以上のアミノ酸変異の導入によって変更でき、Ｈ－ＮＯＸタンパク質が所望の親和性でＯ２又はＮＯと結合するように調整することができる。追加の突然変異を導入して、Ｏ２及び／又はＮＯに対する親和性をさらに改変することができる。従って、Ｈ－ＮＯＸタンパク質ファミリーは、Ｏ２送達に関して改善された又は最適な速度論的及び熱力学的特性を示すように操作することができる。例えば、Ｏ２結合の解離定数及び／又は解離速度を改変した変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質が生成されており、これにより、様々な臨床及び産業用途におけるＨ－ＮＯＸタンパク質の有用性が向上する。Ｈ－ＮＯＸタンパク質を調整してＯ２に結合し送達する能力は、現在のＯ２担体の主要な欠点に対処し、克服する治療手段である。
【0005】
臓器提供とは、臓器が重篤な損傷を受けた患者（レシピエント）を治療する目的で、ドナーと呼ばれるヒトの体から臓器を採取することである。
【0006】
この提供の難しさの１つは依然として、臓器の保存期間である。実際、正常体温（３７℃）では、ドナーから採取する前及び／又は採取した後に、臓器は温虚血期間、すなわち臓器がもうドナーの血液によって灌流されていないのに、まだ冷蔵されていない期間を経験する。臓器は急速に劣化し、酸素が供給されなくなる。移植臓器が低体温下（すなわち、約４℃）で保存される場合、移植臓器のその後の機能の再開を保証する許容可能な時間は、臓器によって異なる。例えば、心臓や肺の場合は約４～６時間、肝臓の場合は８～１２時間、腎臓の場合は２４～４８時間、膵臓や腸の場合は８～１０時間程度である。従って、臓器の機能を確実に維持するために、移植は明確に定められた期間内に実施する必要がある。
【0007】
さらに、低体温は保存の重要な要素である。移植臓器は摘出されると、温度が３７℃から４℃に急速に下げるためにすぐに冷却される。このため、臓器は容器を介して保存液で洗われ、次に、保証された無菌条件に従って砕いた氷によって低温に維持されたこの保存液に単純に浸される。組織の温度の低下は、細胞代謝の低下、すなわち細胞の生存に必要な触媒酵素活性の減速につながるが、それを止めることはない（Belzer F. O., Southard J. H. Principles of solid-organ preservation by cold storage. Transplantation 1988; 45(4): 673-676）。４℃に置かれた移植臓器は、代謝が約８５％低下する。従って、低体温は、血液循環の停止によって引き起こされる酸素欠乏と栄養欠乏の有害な影響と戦うことを可能にし、組織壊死の原因となる細胞死を遅らせる。
【0008】
提供数の不足に直面しているため、長期間にわたる移植臓器の保存とその酸素供給は不可欠な関心事であり、これにより、臓器の品質が維持され、臓器の生存期間が延長されるため、移植の成功が可能になる。実際、４℃で保存された移植臓器の代謝は低下するが、すべての好気性組織と同様に、依然として酸素を必要とする。
【0009】
さらに、パーフルオロカーボン（ＰＦＣ）、ＨＢＯＣ、ヒトの血液などの現在入手可能な血液代替品の大部分は臓器に酸素を供給することができるが、どの温度でも使用することができるわけではない。特に、これらは４℃では機能しない。さらに、ＰＦＣは酸素輸送体ではないが、酸素分圧に応じて大量の酸素を溶解することができる溶質である。従って、単純に使用することはできず、酸化ストレスの問題を引き起こす可能性がある。
【0010】
特許出願及び刊行物を含む、本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
要約
本開示は、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質が、虚血性脳卒中時の脳又は全体的低酸素血症時の心臓などの病的低酸素組織に優先的に酸素を供給し、そして単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質と比較して、より長い循環半減期によってより長い酸素化ウィンドウを提供するという驚くべき発見に一部基づいている。従って、本開示は、臓器がドナーから採取される前に臓器の機能を維持するために、例えば、ドナーの臓器を最適な条件下で保存し酸素を供給するために、酸素の送達のためのタンパク質、組成物、キット、及び方法を提供する。
本開示は、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質が、虚血性脳卒中時の脳又は全体的低酸素血症時の心臓などの病的低酸素組織に優先的に酸素を供給し、そして単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質と比較して、より長い循環半減期によってより長い酸素化ウィンドウを提供するという驚くべき発見に一部基づいている。従って、本開示は、臓器がドナーから採取される前に臓器の機能を維持するために、例えば、ドナーの臓器を最適な条件下で保存し酸素を供給するために、酸素の送達のためのタンパク質、組成物、キット、及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
少なくとも１つの実施態様において、本開示はドナーの脳死又は心臓死の後に提供用臓器を保存する方法であって、少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質、安定化溶液、及び／又は臓器保存溶液を含む組成物をドナーに投与することを含む方法に関し、ここで、組成物は０℃～３７℃の温度にある。
【0013】
少なくとも１つの実施態様において、安定化溶液は塩を含み、ｐＨが６．５～７．６である水溶液である。少なくとも１つの実施態様において、溶液はナトリウムイオンを含む水溶液である。
【0014】
少なくとも１つの実施態様において、安定化溶液は、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのグルタチオン、及び０．１％のポロキサマー１８８を含む、ｐＨ６．８±０．２の水溶液である。
【0015】
少なくとも１つの実施態様において、臓器保存溶液は、６．５～７．５のｐＨを有し、塩、砂糖、酸化防止剤、活性剤を含む水溶液である。少なくとも１つの実施態様において、前記溶液は、塩化物、硫酸塩、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、又はカリウムイオン；マンニトール、ラフィノース、スクラーゼ、グルコース、フルクトース、ラクトビオネート、及びグルコン酸塩から選択される糖類；グルタチオン；キサンチンオキシダーゼ阻害剤、乳酸塩、及びアミノ酸から選択される活性剤、及び任意選択的にヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、及びデキストランから選択されるコロイドを含む水溶液である。
【0016】
少なくとも１つの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、組成物の最終容量に対して０．００１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、組成物は２５０～３５０ｍＯｓｍ／ｌのオスモル濃度を有する。少なくとも１つの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、組成物の最終容量と比較して、０．５ｍｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌで存在し、組成物は２７５～３１０ｍＯｓｍ／ｌのオスモル濃度を有する。
【0017】
少なくとも１つの実施態様において、本開示は、脳死後提供ドナー又は心臓死後提供ドナーにおいて臓器を原位置外で保存するための方法であって、ａ）前記死亡したドナーを組成物で灌流する工程、次にｂ）移植すべき臓器を採取する工程、次にｃ）工程ｂ）で得られた前記臓器を、工程ａ）で規定された組成物又は水溶液中で、前記臓器に応じて所定の時間０℃～３７℃の温度で静的又は動的灌流保存する工程を含む方法に関する。
【0018】
少なくとも１つの実施態様において、本開示は、少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質、安定化溶液、及び／又は臓器保存溶液を含む組成物の使用に関し、前記組成物は、脳死又は心停止で死亡した死亡ドナーの臓器を保存するために、０℃～３７℃の温度を有する。
【0019】
少なくとも１つの実施態様において、使用は、Ｈ－ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．テンコンジェンシス（T. tengcongensis）Ｈ－ＮＯＸ、Ｌ．ニューモフィラ（L. pneumophilia）2 Ｈ－ＮＯＸ、ホモ・サピエンス（H. sapiens） β1、ドブネズミ（R. norvegicus） β1、オオカミ（C. lupus） Ｈ－ＮＯＸドメイン、ショウジョウバエ（D. melangaster）β１、ショウジョウバエＣＧ１４８８５－ＰＡ、エレガンス線虫（C. elegans）ＧＣＹ－３５、藍藻類（N. punctiforme）Ｈ－ＮＯＸ、Ｃ．クレセンタス（C. crescentus）Ｈ－ＮＯＸ、Ｓ．オネイデンシス（S. oneidensis）Ｈ－ＮＯＸ、又はＣ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）Ｈ－ＮＯＸであることを特徴とする。少なくとも１つの実施態様において、使用は、安定化溶液が、塩、好ましくはナトリウムイオンを含む水溶液であり、本発明による組成物に６．５～７．６のｐＨを与えることを特徴とする。少なくとも１つの実施態様において、使用は、安定化溶液が、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのグルタチオン、及び０．１％のポロキサマー１８８を含む、ｐＨ６．８±０．２の水溶液であることを特徴とする。少なくとも１つの実施態様において、使用は、臓器保存溶液が、６．５～７．５のｐＨを有し、そして塩、好ましくは塩化物、硫酸塩、ナトリウムイオン及びカルシウムイオン、マグネシウム及びカリウム；糖、好ましくはマンニトール、ラフィノース、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトビオネート、又はグルコン酸塩；抗酸化剤、好ましくはグルタチオン；活性剤、好ましくはキサンチンオキシダーゼ阻害剤、例えばアロプリノール、乳酸塩、又はアミノ酸、例えばヒスチジン、グルタミン酸（又はグルタミン酸塩）、トリプトファン；及び任意選択的に、コロイド、例えばヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、又はデキストランを含むことを特徴とする。少なくとも１つの実施態様において、使用は、Ｈ－ＮＯＸタンパク質が、組成物の最終容量に対して、０．００１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００５ｍｇ／ｍｌ～２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、そして組成物のオスモル濃度が、２５０～３５０ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは２７５～３１０ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは約３０２ｍＯｓｍ／Ｌであることを特徴とする。
【0020】
少なくとも１つの実施態様において、本開示は、脳死又は心停止状態で死亡した死亡ドナーの臓器を原位置外で保存する方法であって、ａ）前記死亡したドナーに、本開示の組成物又は本開示の水溶液を注入する工程と、次に、ｂ）移植すべき臓器を取り出す工程と、次に、ｃ）工程ｂ）で得られた前記臓器を、静的又は動的灌流状態で、０℃～３７℃、好ましくは２℃～２５℃、より好ましくは約４℃又は３７℃の温度で、前記臓器に応じて決定される時間、工程ａ）で定義された組成物又は水溶液中で維持する工程とを含む方法に関する。
【0021】
少なくとも１つの実施態様において、本開示は、死亡したドナーの原位置外の臓器を保存する方法であって、ａ）移植すべき臓器を取り出す工程、ｂ）工程ａ）で得られた前記臓器を、静的又は動的灌流状態で０℃～３７℃、好ましくは２℃～２５℃、より好ましくは約４℃又は３７℃の温度で、前記臓器に従って決定される時間、本開示の組成物中で、又は本開示の水溶液と共に、維持する工程とを含む方法に関する。
【0022】
少なくとも１つの実施態様において、本開示は、臓器を原位置外で保存するための方法であって、ａ）移植すべき臓器を採取する工程、次に、ｂ）工程ａ）で得られた前記臓器を、静的又は動的灌流状態で０℃～３７℃の温度で、前記臓器に従って所定の時間、本開示の組成物又水溶液中で維持する工程を含む方法に関する。
【0023】
少なくとも１つの実施態様において、本開示は、６．５～７．６のｐＨを有する組成物に関し、この組成物は、少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質；好ましくは０～０．５ｍＭの量のカルシウムイオン；好ましくは２０～１００ｍＭの量のＫＯＨ；好ましくは２０～１２５ｍＭの量のＮａＯＨ；好ましくは２０～２５ｍＭの量のＫＨ２ＰＯ４；好ましくは３～５ｍＭの量のＭｇＣｌ２；好ましくは５～２００ｍＭの量のラフィノース及びグルコースから選択される少なくとも１つの糖；好ましくは３～５ｍＭの量のアデノシン；好ましくは２～４ｍＭの量のグルタチオン；好ましくは０～１ｍＭの量のアロプリノール；及び、好ましくは１～５０ｇ／ｌの量の、ヒドロキシエチルデンプン、様々な分子量のポリエチレングリコール、及びヒト血清アルブミンから選択される少なくとも１つの化合物を含む。
【0024】
少なくとも１つの実施態様において、本開示は、６．５～７．６のｐＨを有する組成物に関し、この組成物は、少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質；好ましくは０～０．５ｍＭの量のカルシウムイオン；好ましくは１５～３０ｍＭの量のＮａＯＨ；好ましくは２～１０ｍＭの量のヘペス；好ましくは２０～２５ｍＭの量のＫＨ２ＰＯ４；好ましくは２０～３５ｍＭの量のマンニトール；好ましくは３～１０ｍＭの量のグルコース；好ましくは５０～１００ｍＭの量のグルコン酸ナトリウム；好ましくは１～５ｍＭの量のグルコン酸マグネシウム；好ましくは２～５ｍＭのリボース；好ましくは１～５０ｇ／ｌの量のヒドロキシエチルデンプン、様々な分子量のポリエチレングリコール、及びヒト血清アルブミンから選択される少なくとも１つの化合物；好ましくは２～４ｍＭの量のグルタチオン；及び好ましくは３～５ｍＭの量のアデニンを含む。
【図面の簡単な説明】
【0025】
本開示の特徴は、特に添付の特許請求の範囲で詳細に記載される。本開示の特徴及び利点は、本開示の原理が利用される例示的な実施態様を説明する以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって、よりよく理解されるであろう。
【0026】
【0027】
【0028】
【図3】病理組織学的評価を示す。ドナー＃１及びドナー＃２からの遺伝的に適合制御された腎臓の両方について、細胞骨格の乱れを、０、１、２、３、４、６、８、及び１０時間目に評価した。
【発明を実施するための形態】
【0029】
詳細な説明
以下の説明及び実施例は、本開示の実施態様を詳細に説明する。
以下の説明及び実施例は、本開示の実施態様を詳細に説明する。
【0030】
本開示は、本明細書に記載される特定の実施態様に限定されず、従って、変更し得ることを理解されたい。当業者は、本開示の変更及び修正が存在し、それらが本開示の範囲内に包含されることを認識するであろう。
【0031】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、整理のみを目的としており、説明されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0032】
本開示の様々な特徴は、単一の実施態様に関連して説明することができるが、それらの特徴は、個別に、又は任意の適切な組み合わせで提供することもできる。逆に、本開示は、明確にするために本明細書では別個の実施態様に関連して説明することができるが、本開示は単一の実施態様で実施することもできる。
【0033】
本開示は、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質が、虚血性脳卒中時の脳又は全体的低酸素血症時の心臓などの病的低酸素組織に優先的に酸素を供給し、そして単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質と比較して、より長い循環半減期によってより長い酸素化ウィンドウを提供するという驚くべき発見に一部基づいている。従って、本開示は、臓器がドナーから採取される前に臓器の機能を維持するために、例えば、ドナーの臓器を最適な条件下で保存し酸素を供給するために、酸素の送達のためのタンパク質、組成物、キット、及び方法を提供する。
【0034】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語の意味は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものである。当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、本開示を実施又は試験するために使用することができることを理解するであろう。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語の意味は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものである。当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、本開示を実施又は試験するために使用することができることを理解するであろう。
【0035】
本明細書で使用する場合、特に他に明記しない限り、用語「ａ」、「ａｎ」などの使用は、１つ又はそれ以上を指す。
【0036】
本出願において、「又は」の使用は、明示的に記載されないか又は当業者によって理解されない限り、「及び／又は」を意味する。複数の従属請求項の文脈において、「又は」の使用は、先行する複数の独立請求項又は従属請求項を指す。
【0037】
本明細書における値又はパラメータの「約」への言及には、その値又はパラメータ自体を対象とする実施態様を含む（及び説明する）。例えば、「約Ｘ」という記述は、「Ｘ」の説明を含む。
【0038】
本明細書に記載される開示の態様及び実施態様は、態様及び実施態様を「含む」、「からなる」、及び「本質的にからなる」ことを含むことが理解される。
【0039】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、最小の長さに限定されない。このようなアミノ酸残基のポリマーは、天然又は非天然のアミノ酸残基を含むことができ、限定されるものではないが、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、及びポリマーを含む。全長タンパク質とその断片の両方がこの定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本開示の目的上、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対して欠失、付加、及び置換（一般的に、本来保存的）などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発による意図的な場合もあれば、タンパク質を生成する宿主の突然変異やＰＣＲ増幅のエラーなどの偶発的な場合もある。本明細書で使用されるタンパク質は、共有結合又は非共有結合で会合した２つ又はそれ以上のサブユニットを含み得る。例えば、タンパク質は２つ又はそれ以上の会合した単量体を含み得る。
【0040】
「核酸分子」、「核酸」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用することができ、ヌクレオチドのポリマーを指す。このようなヌクレオチドのポリマーは、天然及び／又は非天然のヌクレオチドを含むことができ、及び、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＰＮＡを含む。「核酸配列」とは、核酸分子又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの線状配列を指す。
【0041】
本明細書で使用される「Ｈ－ＮＯＸタンパク質」は、Ｈ－ＮＯＸドメイン（ヘム一酸化窒素及びＯＸγ結合ドメイン（Heme-Nitric oxide and OXygen結合ドメイン）にちなんで命名）を有するタンパク質を意味する。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈ－ＮＯＸドメインに加えて１つ又はそれ以上の他のドメインを含むこともあれば含まないこともある。いくつかの例において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質はグアニリルシクラーゼドメインを含まない。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、重合ドメインを含むこともあれば含まないこともある。
【0042】
本明細書で使用される「重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質」は、２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインを含むＨ－ＮＯＸタンパク質である。Ｈ－ＮＯＸドメインは、共有的に又は非共有的に会合していてもよい。
【0043】
本明細書で使用される「Ｈ－ＮＯＸドメイン」は、ヘムを介して一酸化窒素及び／又は酸素に結合するタンパク質の全部又は一部である。Ｈ－ＮＯＸドメインはヘムを含んでもよいし、ヘムに結合することができるアポプロタンパク質として見出され得る。いくつかの例において、Ｈ－ＮＯＸドメインは６つのアルファらせん、それに続く２つのベータ鎖、その後に１つのアルファらせん、その後に２つのベータ鎖を含む。いくつかの例において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、配列番号２に記載のサーモアナエロバクター・テンコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）Ｈ－ＮＯＸのＨ－ＮＯＸドメインに対応する。例えば、Ｈ－ＮＯＸドメインは、配列番号２に記載のサーモアナエロバクター・テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＨ－ＮＯＸドメインと、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％同一であり得る。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、配列番号２に記載のサーモアナエロバクター・テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＨ－ＮＯＸドメインと、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～９５％、９５％～９９％又、は１００％同一であり得る。
【0044】
本明細書で使用される「重合ドメイン」は、単量体部分の会合を促進してポリマー構造を形成するドメイン（例えば、ポリペプチドドメイン）である。例えば、重合ドメインは、単量体Ｈ－ＮＯＸドメインの会合を促進して、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を生成し得る。例示的な重合ドメインは、三量体ポリペプチドの形成を促進するＴ４バクテリオファージのフォルドン（foldon）ドメインである。重合ドメインの他の例には、限定されるものではないが、Ａｒｃ、ＰＯＺ、コイルドコイルドメイン（ＧＣＮ４、ロイシンジッパー、ベルクロを含む）、ウテログロビン、コラーゲン、３本鎖コイルドコイル（マトリリン－１）、トロンボスポンジン類ＴＲＰＶ１－Ｃ、Ｐ５３、Ｍｎｔ、アビジン、ストレプトアビジン、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＣＯＭＰ、ベロ毒素サブユニットＢ、ＣａｍＫＩＩ、ＲＣＫ、及びＮエチルマレイミド感受性融合タンパク質のドメイン、ＳＴＭ３５４８、ＫａｉＣ、ＴｙｒＲ、Ｈｃｐ１、ＣｃｍＫ４、ＧＰ４１、炭疽菌防御抗原、アエロリシン、α溶血素、Ｃ４ｂ結合タンパク質、Ｍｉ－ＣＫ、アリールスルファターゼＡ、及びウイルスキャプシドタンパク質が含まれる。
【0045】
本明細書で使用される「アミノ酸リンカー配列」又は「アミノ酸スペーサー配列」は、タンパク質の２つのドメインを連結するために使用され得る短いポリペプチド配列である。いくつかの実施態様において、アミノ酸リンカー配列は、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるアミノ酸である。例示的なアミノ酸リンカー配列には、限定されるものではないが、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ配列及びＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ配列が含まれる。
【0046】
本明細書で使用される「Ｈｉｓ６タグ」は、ポリペプチドに結合した６つのＨｉｓ残基を含むペプチドを指す。Ｈｉｓ６タグはタンパク質の精製を容易にするために使用でき、例えば、Ｈｉｓ６タグに特異的なクロマトグラフィーが使用される。精製後、エキソペプチダーゼを使用してＨｉｓ６タグを切断することができる。
【0047】
本明細書で使用される「実質的に類似」又は「実質的に同じ」という用語は、２つ又はそれ以上の数値間の十分に高い類似性を意味し、従って、当業者は、２つ又はそれ以上の数値間の差異が、前記値によって測定される生物学的特性の文脈内で、ほとんど又はまったく統計的に有意ではないと考えるであろう。いくつかの実施態様において、２つ又はそれ以上の実質的に同様の値は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％のいずれか１つ以下だけ異なる。
【0048】
本明細書で使用される「実質的に低下している」又は「実質的に異なる」という用語は、２つの数値間の十分に高い程度の差異を意味し、従って、当業者は、２つの値間の差異が、前記値によって測定される生物学的特性の文脈内で、統計的に有意であると考えるであろう。いくつかの実施態様において、２つの実質的に異なる数値は、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のいずれか１つを超えて異なる。いくつかの実施態様において、２つの実質的に異なる数値は、約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～９５％、９５％～９９％、又は１００％のいずれか１つだけ異なる。
【0049】
「天然配列」ポリペプチドは、自然界に見出されるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。従って、天然配列ポリペプチドは、任意の生物由来の天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。そのような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することができ、あるいは組換え若しくは合成手段によって生成することができる。「天然配列」ポリペプチドという用語は、ポリペプチドの天然に存在する末端切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変種型（例えば、選択的スプライシング型）、及びポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変種を特に包含する。
【0050】
ポリペプチド「変種」とは、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない場合に、天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変種には、例えば、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が付加又は欠失されているポリペプチドが含まれる。いくつかの実施態様において、変種は、天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、又は９５％のアミノ酸配列同一性のいずれかを有するであろう。いくつかの実施態様において、変種は、天然配列ポリペプチドと約８０％～９０％、９０％～９５％、又は９５％～９９％のアミノ酸配列同一性のいずれかを有する。
【0051】
本明細書で使用される「変異体タンパク質」とは、天然に存在するタンパク質と比較して、１つ又はそれ以上の変異を有するタンパク質を意味する。１つの実施態様において、変異タンパク質は、天然に存在するすべてのタンパク質の配列とは異なる配列を有する。様々な実施態様において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質の対応する領域のアミノ酸配列と、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９、又は９９．５％同一である。いくつかの実施態様において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質の対応する領域のアミノ酸配列と、少なくとも約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～９５％、９５％～９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施態様において、変異体タンパク質は、全長タンパク質からの少なくとも約２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、又は４００個の連続アミノ酸のいずれかを含むタンパク質断片である。いくつかの実施態様において、変異体タンパク質は、全長タンパク質由来の約２５～５０、５０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、又は３００～４００個の連続アミノ酸のいずれかを含むタンパク質断片である。配列同一性は、例えば、その中で特定されたデフォルトパラメータを用いる配列解析ソフトウェア（例えばUniversity of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705の Genetics Computer Group の配列解析ソフトウェアパッケージ）を使用して測定することができる。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸の置換、欠失、その他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、類似した配列を照合する。
【0052】
本明細書で使用される「突然変異」は、天然に存在する参照核酸又はアミノ酸配列における変化を意味する。例示的な核酸変異には、挿入、欠失、フレームシフト変異、サイレント変異、ナンセンス変異、又はミスセンス変異が含まれる。いくつかの実施態様において、核酸変異はサイレント変異ではない。例示的なタンパク質変異としては、１つ又はそれ以上のアミノ酸の挿入（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸の挿入）、１つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、及び／又は内部残基の欠失、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００個、又は１つ又はそれ以上のアミノ酸のいずれかの欠失、又は約５～１０、１０～１５、１５～２５、２５～５０、５０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、若しくは３００～４００個のアミノ酸のいずれかの欠失）、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸の置換）、又は前述の２つ又はそれ以上の組み合わせが含まれる。特定のアミノ酸変異を指す際に使用される命名法では、最初に野生型アミノ酸が特定され、続いて残基番号、そして最後に置換アミノ酸が続く。例えば、Ｙ１４０Ｌは、チロシンが残基番号１４０でロイシンに置換されていることを意味する。同様に、変種Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のアミノ酸変種によって呼ばれることがある。例えば、Ｔ．テンコンジェンシスＹ１４０Ｌ Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、位置番号１４０のチロシン残基がロイシン残基に置換されたＴ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸタンパク質を指し、及びＴ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｙ１４０Ｌ Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、９位のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基で置換され、１４０位のチロシン残基がロイシン残基で置換されたＴ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸタンパク質を指す。
【0053】
「進化的に保存された突然変異」とは、あるタンパク質内のアミノ酸が、同じタンパク質ファミリー内の別のタンパク質の対応する位置にあるアミノ酸によって置換されることである。
【0054】
本明細書で使用される「に由来する」とは、１つ又はそれ以上の変異が導入されるタンパク質の供給源を指す。例えば、「哺乳類タンパク質に由来する」タンパク質は、野生型（すなわち、天然に存在する配列）哺乳類タンパク質の配列に１つ又はそれ以上の変異を導入することによって生じる目的のタンパク質を指す。
【0055】
ペプチド、ポリペプチド、又は抗体配列に関して、本明細書で使用される「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後の、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない場合の、特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列の同一性パーセントを決定するための整列は、当業者の技術の範囲内である様々な方法、例えば公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【0056】
本明細書で使用される「ｋｏｆｆ」とは、「タンパク質からのＯ２又はＮＯの放出速度などの解離速度を指す。ｋｏｆｆの数値が低いほど、解離速度が遅いことを示す。
【0057】
本明細書で使用される「ｋｏｎ」は、タンパク質へのＯ２又はＮＯの結合速度などの会合速度を指す。ｋｏｎの数値が低いほど、会合速度が遅いことを示す。
【0058】
本明細書で使用される「解離定数」は、「速度論的解離定数」又は「計算された解離定数」を指す。「速度論的解離定数」又は「ＫＤ」は、速度論的オフレート（ｋｏｆｆ）と速度論的オンレート（ｋｏｎ）との比であり、例えば当業者に公知の方法及び／又は本明細書に記載の方法を含む標準的な方法（例えば、標準的な分光法、ストップフロー法、又はフラッシュ光分解法）を使用して絶対値として決定されるＫＤ値を指す。「計算された解離定数」又は「計算されたＫＤ」は、測定されたｋｏｆｆに基づく速度論的解離定数の近似値を指す。ｋｏｎの値は、本明細書に記載されるように、速度論的ＫＤとｋｏｆｆとの間の相関を介して導かれる。
【0059】
本明細書で使用される「酸素親和性」は、タンパク質のヘム部分への酸素結合の強さを指す定性的な用語である。この親和性は、酸素のｋｏｆｆとｋｏｎの両方の影響を受ける。数値的に低い酸素ＫＤ値は、より高い親和性を意味する。
【0060】
本明細書で使用される「ＮＯ親和性」は、タンパク質へのＮＯ結合（ヘム基への結合、又はタンパク質に会合したヘム基に結合した酸素への結合など）の強さを指す定性的な用語である。この親和性は、ＮＯのｋｏｆｆとｋｏｎの両方の影響を受ける。ＮＯＫＤ値が数値的に低いほど、親和性が高いことを意味する。
【0061】
本明細書で使用される「ＮＯ安定性」とは、酸素の存在下のＮＯによる酸化に対するタンパク質の安定性又は耐性を指す。例えば、酸素の存在下でタンパク質がＮＯに結合しても酸化されない能力は、タンパク質のＮＯ安定性を示す。いくつかの実施態様において、２０℃で約１、２、４、６、８、１０、１５、又は２０時間のいずれかのインキュベーション後に、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の約５０、４０、３０、１０、又は５％未満のいずれかが酸化される。
【0062】
本明細書で使用される「ＮＯ反応性」とは、ヘム結合タンパク質のヘム中の鉄が酸素の存在下でＮＯによって酸化される速度を指す。ｓ－１の単位で表されるＮＯ反応性の数値が低いほど、ＮＯ反応性が低いことを示す。
【0063】
本明細書で使用される「自己酸化速度」は、ヘム結合タンパク質のヘム中の鉄が自己酸化される速度を指す。ｓ－１単位で表される低い自己酸化の数値が低いほど、自己酸化速度が低いことを示す。
【0064】
「ベクター」という用語は、宿主細胞内で増殖され得るクローン化ポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドを含むように工学作成され得るポリヌクレオチドを説明するために使用される。ベクターは、以下の要素のうちの１つ又はそれ以上を含み得る：複製開始点、目的のポリペプチドの発現を調節する１つ又はそれ以上の調節配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーなど）、及び／又は１つ又はそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子、及び比色アッセイで使用され得る遺伝子、例えば、β－ガラクトシダーゼ）。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞内で目的のポリペプチドを発現させるために使用されるベクターを指す。
【0065】
「宿主細胞」とは、ベクター又は単離されたポリヌクレオチドの受容体であり得るか又は受容体であった細胞を指す。宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。例示的な真核細胞には、哺乳動物細胞、例えば霊長類又は非霊長類動物細胞；真菌細胞、例えば酵母；植物細胞；及び昆虫細胞が含まれる。例示的な原核細胞には細菌細胞、例えば大腸菌細胞が含まれる。
【0066】
本明細書で使用される用語「単離されている」とは、通常天然に存在するか又は生成される成分の少なくとも一部から分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドが、それが生成された細胞の成分の少なくとも一部から分離されている場合、それは「単離されている」と呼ばれる。発現後にポリペプチドが細胞によって分泌される場合、ポリペプチドを産生した細胞からポリペプチドを含む上清を物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離する」こととみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが通常天然に存在するより大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合、ゲノムＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡ）の一部ではない場合、又は、例えばＲＮＡポリヌクレオチドの場合、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離されている場合、「単離されている」と呼ばれる。従って、宿主細胞内のベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離されている」と呼ぶことができる。
【0067】
「個体」又は「被験体」という用語は、本明細書では哺乳動物などの動物を指すために互換的に使用される。いくつかの実施態様において、限定されるものではないが、ヒト、げっ歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳動物実験動物、哺乳動物家畜、哺乳動物スポーツ動物、及び哺乳動物ペットを含む哺乳動物を治療する方法が提供される。いくつかの例において、「個体」又は「被験体」は、疾患又は障害の治療を必要とする個体又は被験体を指す。
【0068】
「疾患」又は「障害」とは、治療が必要な状態を指す。
【0069】
「阻害」又は「阻害する」という用語は、任意の表現型特徴の減少若しくは停止、又はその特徴の発生率、程度、若しくは可能性の減少若しくは停止を指す。「低下させる」又は「阻害する」とは、基準と比較して、活性、機能、及び／又は量を減少させる、低下させる、又は停止させることを意味する。特定の実施態様において、「低下させる」又は「阻害する」とは、全体として２０％以上の減少を引き起こす能力を意味する。別の実施態様において、「低下させる」又は「阻害する」とは、全体として５０％以上の減少を引き起こす能力を意味する。さらに別の実施態様において、「低下させる」又は「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。
【0070】
「基準」とは、比較目的で使用される任意の試料、標準、又はレベルを指す。基準は、健康な試料及び／又は病気でない試料から取得され得る。いくつかの例において、基準は未処理の試料から取得され得る。いくつかの例において、基準は、被験個体の非罹患かつ未治療の試料から得られる。いくつかの例において、基準は、被験体又は患者ではない１人又はそれ以上の健康な個人から取得される。
【0071】
本明細書で使用される「予防する」とは、疾患に対する素因を有するが、まだ疾患を有すると診断されていない被験体における疾患の発生又は再発に関して予防を提供することが含まれる。
【0072】
薬剤の「有効量」とは、所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び期間で有効な量を指す。
【0073】
「医薬製剤」及び「医薬組成物」という用語は、有効成分の生物学的活性が効果的であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される被験体に対して許容できないほど有毒である追加の成分を含まない製剤を指す。このような製剤は無菌であり、エンドトキシンを本質的に含まないものであり得る。
【0074】
「医薬的に許容し得る担体」とは、被験体への投与のための「医薬組成物」を一緒に含む治療薬とともに使用するための当技術分野の、非毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、配合補助剤、又は担体を指す。医薬的に許容し得る担体は、使用される用量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合性がある。医薬的に許容し得る担体は、使用される製剤に適切である。
【0075】
「無菌」製剤は無菌であるか、又は生きた微生物とその胞子を本質的に含まないものである。
【0076】
１つ又はそれ以上のさらなる治療薬と「と一緒の」投与には、同時（同時）及び任意の順序の連続的又は逐次的投与が含まれる。
【0077】
「同時に」という用語は、本明細書では、２つ又はそれ以上の治療薬の投与を指すために使用され、ここで、投与の少なくとも一部は時間的に重複するか、又は一方の治療薬の投与が他方の治療薬の投与と比較して短期間内に収まる。例えば、２つ又はそれ以上の治療薬は、約６０分以下、例えば約３０、１５、１０、５、又は１分以下のいずれかの時間間隔で投与される。
【0078】
「逐次」という用語は、本明細書では、２つ以上の治療薬の投与を指すために使用されし、ここで、１つ又はそれ以上の他の薬剤の投与を中止した後、１つ又はそれ以上の薬剤の投与が継続する。例えば、２つ又はそれ以上の治療薬の投与は、約１５分を超える時間間隔、例えば、約２０、３０、４０、５０、又は６０分、１日、２日、３日、１週間、２週間、又は１か月のいずれかを超える時間間隔で投与される。
【0079】
本明細書で使用される「と共に」とは、別の治療様式に加えて、ある治療様式を実施することを指す。従って、「と共に」とは、個体への他の治療法の実施前、実施中、又は実施後の、ある治療法の実施を指す。
【0080】
「添付文書」という用語は、治療用製品の市販パッケージに慣例的に含まれる説明書を指すために使用され、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌、及び／又は警告に関する情報を含む。
【0081】
「製品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、本明細書に記載の、疾患又は障害（例えば、癌）の治療用の薬剤、又はバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造品（例えば、パッケージ又は容器）、又はキットである。特定の実施態様において、製造品又はキットは、本明細書に記載の方法を実施するためのユニットとして宣伝、配布、又は販売される。
【0082】
Ｈ－ＮＯＸタンパク質
Ｈ－ＮＯＸタンパク質ファミリーの概要
他に指示がない限り、任意の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を、本明細書に記載の組成物、キット、及び方法において使用することができる。本明細書で使用される「Ｈ－ＮＯＸタンパク質」は、Ｈ－ＮＯＸドメイン（Heme-Nitric oxide and OXygen結合ドメインにちなんで命名）を有するタンパク質を意味する。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈ－ＮＯＸドメインに加えて１つ又はそれ以上の他のドメインを含むことも含まないこともある。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、高度に保存され、よく特徴付けられたヘムタンパク質ファミリーのメンバーである（Iyer, L. M. et al. (February 3, 2003). BMC Genomics 4(1):5; Karow, D. S. et al. (August 10, 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902）。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｐｆａｍ０７７００タンパク質又はＨＮＯＢタンパク質とも呼ばれる（Ｐｆａｍ－タンパク質ドメインファミリー整列と隠れマルコフモデル（Hidden Markov Models）のデータベース、著作権（Ｃ）1996-2006 The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc., 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, USA）。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、６つのアルファらせんの後に２つのベータ鎖、その後に１つのアルファらせん、その後に２つのベータ鎖を含む二次構造を有するか又は有すると予測されている。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、ヘムと結合することができるアポタンパク質、又はヘムが結合したホロタンパク質であり得る。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、ヘム基に共有結合又は非共有結合することができる。Ｈ－ＮＯＸタンパク質には、ＮＯには結合するがＯ２には結合しないものもあれば、ＮＯとＯ２の両方に結合するものもある。単離された通性好気性菌由来のＨ－ＮＯＸドメインは、ＮＯには結合するがＯ２には結合しない。偏性好気性原核生物であるＣ．エレガンス及びＤ．メンランガスターのＨ－ＮＯＸタンパク質は、ＮＯ及びＯ２に結合する。哺乳動物は２つのＨ－ＮＯＸタンパク質（β１とβ２）を有する。マウス、ラット、ウシ、ヒトのＨ－ＮＯＸ配列を整列させると、これらの種が９９％超の同一性を共有していることがわかる。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメイン又はＨ－ＮＯＸタンパク質全体は、天然に存在するサーモアナエロバクター・テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸタンパク質（例えば、配列番号２）又は天然に存在するｓＧＣタンパク質（例えば、天然に存在するｓＧＣβ１タンパク質）の対応する領域のものと、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９又は９９．５％のいずれか同一である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメイン又はＨ－ＮＯＸタンパク質全体は、天然に存在するサーモアナエロバクター・テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸタンパク質（例えば、配列番号２）又は天然に存在するｓＧＣタンパク質（例えば、天然に存在するｓＧＣβ１タンパク質）の対応する領域のものと、少なくとも約１０～２０％、２０～３０％、３０ｗｗ４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９９％、又は９９～９９．９％のいずれか同一である。本明細書でさらに議論されるように、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、対応する天然に存在するＨ－ＮＯＸタンパク質と比較して、任意選択的に１つ又はそれ以上の突然変異を含み得る。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈ－ＮＯＸドメインに加えて１つ又はそれ以上のドメインを含む。特定の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、１つ又はそれ以上のドメイン、又は別のタンパク質からの配列全体を含む。例えば、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈ－ＮＯＸドメインと、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などの別のタンパク質の一部又は全部を含む融合タンパク質であり得る。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのみが存在する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質はグアニリルシクラーゼドメインを含まない。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質はタグ、例えばＨｉｓ６タグを含む。
Ｈ－ＮＯＸタンパク質ファミリーの概要
他に指示がない限り、任意の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を、本明細書に記載の組成物、キット、及び方法において使用することができる。本明細書で使用される「Ｈ－ＮＯＸタンパク質」は、Ｈ－ＮＯＸドメイン（Heme-Nitric oxide and OXygen結合ドメインにちなんで命名）を有するタンパク質を意味する。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈ－ＮＯＸドメインに加えて１つ又はそれ以上の他のドメインを含むことも含まないこともある。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、高度に保存され、よく特徴付けられたヘムタンパク質ファミリーのメンバーである（Iyer, L. M. et al. (February 3, 2003). BMC Genomics 4(1):5; Karow, D. S. et al. (August 10, 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902）。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｐｆａｍ０７７００タンパク質又はＨＮＯＢタンパク質とも呼ばれる（Ｐｆａｍ－タンパク質ドメインファミリー整列と隠れマルコフモデル（Hidden Markov Models）のデータベース、著作権（Ｃ）1996-2006 The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc., 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, USA）。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、６つのアルファらせんの後に２つのベータ鎖、その後に１つのアルファらせん、その後に２つのベータ鎖を含む二次構造を有するか又は有すると予測されている。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、ヘムと結合することができるアポタンパク質、又はヘムが結合したホロタンパク質であり得る。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、ヘム基に共有結合又は非共有結合することができる。Ｈ－ＮＯＸタンパク質には、ＮＯには結合するがＯ２には結合しないものもあれば、ＮＯとＯ２の両方に結合するものもある。単離された通性好気性菌由来のＨ－ＮＯＸドメインは、ＮＯには結合するがＯ２には結合しない。偏性好気性原核生物であるＣ．エレガンス及びＤ．メンランガスターのＨ－ＮＯＸタンパク質は、ＮＯ及びＯ２に結合する。哺乳動物は２つのＨ－ＮＯＸタンパク質（β１とβ２）を有する。マウス、ラット、ウシ、ヒトのＨ－ＮＯＸ配列を整列させると、これらの種が９９％超の同一性を共有していることがわかる。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメイン又はＨ－ＮＯＸタンパク質全体は、天然に存在するサーモアナエロバクター・テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸタンパク質（例えば、配列番号２）又は天然に存在するｓＧＣタンパク質（例えば、天然に存在するｓＧＣβ１タンパク質）の対応する領域のものと、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９又は９９．５％のいずれか同一である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメイン又はＨ－ＮＯＸタンパク質全体は、天然に存在するサーモアナエロバクター・テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸタンパク質（例えば、配列番号２）又は天然に存在するｓＧＣタンパク質（例えば、天然に存在するｓＧＣβ１タンパク質）の対応する領域のものと、少なくとも約１０～２０％、２０～３０％、３０ｗｗ４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９９％、又は９９～９９．９％のいずれか同一である。本明細書でさらに議論されるように、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、対応する天然に存在するＨ－ＮＯＸタンパク質と比較して、任意選択的に１つ又はそれ以上の突然変異を含み得る。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈ－ＮＯＸドメインに加えて１つ又はそれ以上のドメインを含む。特定の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、１つ又はそれ以上のドメイン、又は別のタンパク質からの配列全体を含む。例えば、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈ－ＮＯＸドメインと、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などの別のタンパク質の一部又は全部を含む融合タンパク質であり得る。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのみが存在する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質はグアニリルシクラーゼドメインを含まない。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質はタグ、例えばＨｉｓ６タグを含む。
【0083】
重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質
いくつかの態様において、本開示は、２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する。２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインは、共有結合又は非共有結合していてもよい。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、又は十量体の形態である。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は相同Ｈ－ＮＯＸドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、異種Ｈ－ＮＯＸドメインを含む。例えば、Ｈ－ＮＯＸドメインは、Ｈ－ＮＯＸドメインの特定の種のアミノ酸変異体を含んでもよく、又は異なる種に由来するＨ－ＮＯＸドメインを含んでもよい。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメインの少なくとも１つは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の少なくとも１つのＨ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、１つ又はそれ以上の重合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、少なくとも１つの三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つのＴ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸドメインは、３つのＴ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸドメインは、３つのＴ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメインを含む。
いくつかの態様において、本開示は、２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する。２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインは、共有結合又は非共有結合していてもよい。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、又は十量体の形態である。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は相同Ｈ－ＮＯＸドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、異種Ｈ－ＮＯＸドメインを含む。例えば、Ｈ－ＮＯＸドメインは、Ｈ－ＮＯＸドメインの特定の種のアミノ酸変異体を含んでもよく、又は異なる種に由来するＨ－ＮＯＸドメインを含んでもよい。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメインの少なくとも１つは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の少なくとも１つのＨ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、１つ又はそれ以上の重合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、少なくとも１つの三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つのＴ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸドメインは、３つのＴ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸドメインは、３つのＴ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメインを含む。
【0084】
本開示のいくつかの態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、２つ又はそれ以上の会合した単量体を含む。単量体は共有結合していても非共有結合していてもよい。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の単量体サブユニットが生成され、ここで、単量体サブユニットがインビトロ又はインビボで会合して重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を形成する。いくつかの実施態様において、単量体は、Ｈ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合ドメインはＨ－ＮＯＸドメインに共有結合している。例えば、Ｈ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＮ末端又はＣ末端に共有結合している。他の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＮ末端又はＣ末端に共有結合している。いくつかの実施態様において、アミノ酸スペーサーは、Ｈ－ＮＯＸドメインと重合ドメインとの間で共有結合している。「アミノ酸スペーサー」及び「アミノ酸リンカー」は、本明細書では互換的に使用される。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の少なくとも１つの単量体サブユニットは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の少なくとも１つの単量体サブユニットは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質である。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｔ４バクテリオファージのＨ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は３つの単量体を含み、各単量体はＴ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー（例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を用いてフォルドンドメインに連結される。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのＨ－ＮＯＸドメインはタグを含む。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのＨ－ＮＯＸドメインはＨｉｓ６タグを含む。いくつかの実施態様において、Ｈｉｓ６タグは、アミノ酸リンカー（例えば、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー）を用いてフォルドンドメインに連結される。いくつかの実施態様において、全てのＨ－ＮＯＸドメインはＨｉｓ６タグを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６、又は配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む。
【0085】
Ｔ．テンコンジェンシス由来の例示的なＨ－ＮＯＸドメインは約２６．７ｋＤａｌである。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、約５０ｋＤａｌ、７５ｋＤａｌ、１００ｋＤａｌ、１２５ｋＤａｌ、最大約１５０ｋＤａｌのいずれよりも大きい原子質量を有する。
【0086】
Ｈ－ＮＯＸタンパク質とＨ－ＮＯＸドメインの供給源
任意の属又は種に由来するＨ－ＮＯＸタンパク質及びＨ－ＮＯＸドメインを、本明細書に記載の組成物、キット、及び方法に使用することができる。様々な実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインは、哺乳動物［例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、若しくはネコ科の動物］、昆虫、酵母若しくは細菌由来のタンパク質又はドメイン、又はそのようなタンパク質に由来する。例示的な哺乳類Ｈ－ＮＯＸタンパク質には、野生型のヒト及びラットの可溶性グアニル酸シクラーゼ（β１サブユニットなど）が含まれる。Ｈ－ＮＯＸタンパク質の例には、野生型哺乳動物類Ｈ－ＮＯＸタンパク質［例えば、ホモ・サピエンス（H. sapiens）、ハツカネズミ（M. musculus）、イエイヌ（C. familiaris）、ウシ（B. Taurus）、オオカミ（C. lupus）、及びドブネズミ（R. norvegicus）］、及び野生型の非哺乳動物脊椎動物Ｈ－ＮＯＸタンパク質［例えば、アフリカツメガエル（X. laevis）、ミナミメダカ（O. latipes）、Ｏ．クリバトゥス（O. curivatus）、及びＦ．ルブリペス（F. rubripes）］が含まれる。非哺乳動物の野生型ＮＯ結合Ｈ－ＮＯＸタンパク質の例には、キイロショウジョウバエ、ガンビエハマダラカ（A. gambiae）、及びタバコスズメガ（M. sexta）の野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質が含まれる。非哺乳動物の野生型Ｏ２結合Ｈ－ＮＯＸタンパク質の例には、エレガンス線虫ｇｃｙ－３１、ｇｃｙ－３２、ｇｃｙ－３３、ｇｃｙ－３４、ｇｃｙ－３５、ｇｃｙ－３６、及びｇｃｙ－３７；キイロショウジョウバエ ＣＧ１４８８５、ＣＧ１４８８６、及びＣＧ４１５４；及びタバコスズメガベータ－３の野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質が含まれる。原核生物の野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の例には、Ｔ．テンコンジェンシス、Ｖ．コレラ（V. cholera）、Ｖ．フィシェリ（V. fischerii）、Ｎ．プンクチフォルメ（N. punctiforme）、Ｄ．デスルフリカンス（D. desulfuricans）、Ｌ．ニューモフィラ 1、Ｌ．ニューモフィラ 2、及び Ｃ．アセトブチリクム（C. acetobutylicum）のＨ－ＮＯＸタンパク質が含まれる。
任意の属又は種に由来するＨ－ＮＯＸタンパク質及びＨ－ＮＯＸドメインを、本明細書に記載の組成物、キット、及び方法に使用することができる。様々な実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインは、哺乳動物［例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、若しくはネコ科の動物］、昆虫、酵母若しくは細菌由来のタンパク質又はドメイン、又はそのようなタンパク質に由来する。例示的な哺乳類Ｈ－ＮＯＸタンパク質には、野生型のヒト及びラットの可溶性グアニル酸シクラーゼ（β１サブユニットなど）が含まれる。Ｈ－ＮＯＸタンパク質の例には、野生型哺乳動物類Ｈ－ＮＯＸタンパク質［例えば、ホモ・サピエンス（H. sapiens）、ハツカネズミ（M. musculus）、イエイヌ（C. familiaris）、ウシ（B. Taurus）、オオカミ（C. lupus）、及びドブネズミ（R. norvegicus）］、及び野生型の非哺乳動物脊椎動物Ｈ－ＮＯＸタンパク質［例えば、アフリカツメガエル（X. laevis）、ミナミメダカ（O. latipes）、Ｏ．クリバトゥス（O. curivatus）、及びＦ．ルブリペス（F. rubripes）］が含まれる。非哺乳動物の野生型ＮＯ結合Ｈ－ＮＯＸタンパク質の例には、キイロショウジョウバエ、ガンビエハマダラカ（A. gambiae）、及びタバコスズメガ（M. sexta）の野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質が含まれる。非哺乳動物の野生型Ｏ２結合Ｈ－ＮＯＸタンパク質の例には、エレガンス線虫ｇｃｙ－３１、ｇｃｙ－３２、ｇｃｙ－３３、ｇｃｙ－３４、ｇｃｙ－３５、ｇｃｙ－３６、及びｇｃｙ－３７；キイロショウジョウバエ ＣＧ１４８８５、ＣＧ１４８８６、及びＣＧ４１５４；及びタバコスズメガベータ－３の野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質が含まれる。原核生物の野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の例には、Ｔ．テンコンジェンシス、Ｖ．コレラ（V. cholera）、Ｖ．フィシェリ（V. fischerii）、Ｎ．プンクチフォルメ（N. punctiforme）、Ｄ．デスルフリカンス（D. desulfuricans）、Ｌ．ニューモフィラ 1、Ｌ．ニューモフィラ 2、及び Ｃ．アセトブチリクム（C. acetobutylicum）のＨ－ＮＯＸタンパク質が含まれる。
【0087】
例示的Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＮＣＢＩ登録番号には以下が含まれる：ホモ・サピエンスβ１［ｇｉ：２７４６０８３］、ドブネズミβ１［ｇｉ：２７１２７３１８］、キイロショウジョウバエβ１［ｇｉ：８６１２０３］、キイロショウジョウバエＣＧ１４８８５－ＰＡ［ｇｉ：２３１７１４７６］、エレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）ＧＣＹ－３５［ｇｉ：５２７８２８０６］、ノストック・プンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）［ｇｉ：２３１２９６０６］、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）［ｇｉ：１６１２７２２２］、シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）［ｇｉ：２４３７３７０２］、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）（ＯＲＦ２）［ＣＵＣＧＣ＿２７２６２４］、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）［ｇｉ：１５８９６４８８］、及びサーモアナエロバクター・テンコンジェンシス［ｇｉ：２０８０７１６９］。タイリクオオカミ（Canis lupus）Ｈ－ＮＯＸは、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れＤＱ００８５７６によって提供される。例示的なＨ－ＮＯＸタンパク質及びドメインの核酸配列及びアミノ酸配列が図３７に提供される。
【0088】
例示的なＨ－ＮＯＸタンパク質にはまた、それらの遺伝子名、次にそれらの種の略語、及びＧｅｎｂａｎｋ識別子によって列挙される以下のＨ－ＮＯＸタンパク質も含まれる（例えば、２００６年５月２１日、２００６年５月２２日、２００７年５月２１日、２００７年５月２２日の時点で利用可能な以下のタンパク質配列など、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）：Ｎｐｕｎ５９０５＿Ｎｐｕ＿２３１２９６０６、ａｌｒ２２７８＿Ａｎａ＿１７２２９７７０、ＳＯ２１４４＿Ｓｏｎｅ＿２４３７３７０２、Ｍｄｅｇ１３４３＿Ｍｄｅ＿２３０２７５２１、ＶＣＡ０７２０＿Ｖｃｈ＿１５６０１４７６，ＣＣ２９９２＿Ｃｃｒ＿１６１２７２２２、Ｒｓｐｈ２０４３＿Ｒｈｓｐ＿２２９５８４６３ （ｇｉ：４６１９２７５７）、Ｍｍｃ１０７３９＿Ｍｃｓｐ＿２２９９９０２０、Ｔａｒ４＿Ｔｔｅ＿２０８０７１６９，Ｄｄｅｓ２８２２＿Ｄｄｅ＿２３４７５９１９，ＣＡＣ３２４３＿Ｃａｃ＿１５８９６４８８ ，ｇｃｙ－３１＿Ｃｅ＿１７５６８３８９、ＣＧ１４８８５＿Ｄｍ＿２４６４７４５５，ＧＵＣＹ１Ｂ３＿Ｈｓ＿４５０４２１５、ＨｐＧＣＳ－ｂｅｔａ１＿Ｈｐｕｌ＿１４２４５７３８、Ｇｙｃｂｅｔａ１００Ｂ＿Ｄｍ＿２４６５１５７７、ＣＧ４１５４＿Ｄｍ＿２４６４６９９３（ｇｉ：ＮＰ＿６５０４２４．２、ｇｉ：６２４８４２９８）、ｇｃｙ－３２＿Ｃｅ＿１３５３９１６０，ｇｃｙ－３６＿Ｃｅ＿１７５６８３９１（ｇｉ：３２５６６３５２、ｇｉ：８６５６４７１３）、ｇｃｙ－３５＿Ｃｅ－１７５０７８６１（ｇｉ：７１９９０１４６）、ｇｃｙ－３７＿Ｃｅ＿１７５４０９０４（ｇｉ：７１９８５５０５）、ＧＣＹ１ａ３＿Ｈｓ＿２０５３５６０３、ＧＣＹ１ａ２－Ｈｓ＿８９９４７７、又はＧＹＣａ－９９Ｂ＿Ｄｍ＿７２９２７０（ｇｉ：６８０６７７３８）（Lakshminarayan et al. (2003). BMG Genomics 4:5-13）。これらの名前に使用される種の略語には、Ａｎａ－アナベナ属（Anabaena Sp）、Ｃｃｒ－カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）、Ｃａｃ－クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、Ｄｄｅ－デスルホビブリオ・デスルフリカンス（Desulfovibrio desulfuricans）、Ｍｃｓｐ－マグネトコッカス属（Magnetococcus sp.）、Ｍｄｅ－ミクロブルビフェル・デグラダンス（Microbulbifer degradans）、Ｎｐｕ－ノストック・プンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）、Ｒｈｓｐ－ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、Ｓｏｎｅ－シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）、Ｔｔｅ－サーモアナエロバクター・テンコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）、Ｖｃｈ－コレラ菌（Vibrio cholerae）、Ｃｅ－エレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）、Ｄｍ－キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、Ｈｐｕｌ－バフンウニ（Hemicentrotus pulcherrimus）、Ｈｓ－ホモ・サピエンス（Homo sapiens）が含まれる。
【0089】
他の例示的なＨ－ＮＯＸタンパク質には、生物名及びＰｆａｍデータベース登録番号によって列挙される以下のＨ－ＮＯＸタンパク質が含まれる（例えば、２００６年５月２１日、２００６年５月２２日、２００７年５月１７日、２００７年５月２１日、又は２００７年５月２２日の時点で利用可能な以下のタンパク質配列など、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）：ブリグサ線虫（Caenorhabditis briggsae）Ｑ６２２Ｍ５＿ＣＡＥＢＲ、ブリグサ線虫Ｑ６１Ｐ４４＿ＣＡＥＢＲ、ブリグサ線虫Ｑ６１Ｒ５４＿ＣＡＥＢＲ、ブリグサ線虫Ｑ６１Ｖ９０＿ＣＡＥＢＲ、ブリグサ線虫Ｑ６１Ａ９４＿ＣＡＥＢＲ、ブリグサ線虫Ｑ６０ＴＰ４＿ＣＡＥＢＲ、ブリグサ線虫Ｑ６０Ｍ１０＿ＣＡＥＢＲ、エレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）ＧＣＹ３７＿ＣＡＥＥＬ、エレガンス線虫ＧＣＹ３１＿ＣＡＥＥＬ、エレガンス線虫ＧＣＹ３６＿ＣＡＥＥＬ、エレガンス線虫ＧＣＹ３２＿ＣＡＥＥＬ、エレガンス線虫ＧＣＹ３５＿ＣＡＥＥＬ、エレガンス線虫ＧＣＹ３４＿ＣＡＥＥＬ、エレガンス線虫ＧＣＹ３３＿ＣＡＥＥＬ、ハイナンメダカ（Oryzias curvinotus）Ｑ７Ｔ０４０＿ＯＲＹＣＵ、ハイナンメダカＱ７５ＷＦ０＿ＯＲＹＣＵ、ミナミメダカＰ７９９９８＿ＯＲＹＬＡ、ミナミメダカＱ７ＺＳＺ５＿ＯＲＹＬＡ、ミドリフグ（Tetraodon nigroviridis）Ｑ４ＳＷ３８＿ＴＥＴＮＧ、ミドリフグＱ４ＲＺ９４＿ＴＥＴＮＧ、ミドリフグＱ４Ｓ６Ｋ５＿ＴＥＴＮＧ、トラフグ（Fugu rubripes）Ｑ９０ＶＹ５＿ＦＵＧＲＵ、アフリカツメガエルＱ６ＩＮＫ９＿ＸＥＮＬＡ、ホモ・サピエンスＱ５Ｔ８Ｊ７＿ＨＵＭＡＮ、ホモ・サピエンスＧＣＹＡ２＿ＨＵＭＡＮ、ホモ・サピエンスＧＣＹＢ２＿ＨＵＭＡＮ、ホモ・サピエンスＧＣＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ゴリラゴリラ（Gorilla gorilla）Ｑ９Ｎ１９３＿９ＰＲＩＭ、ポンゴ・ピグマアス（Pongo pygmaeus）Ｑ５ＲＡＮ８＿ＰＯＮＰＹ、パン・トログロダイト（Pan troglodytes）Ｑ９Ｎ１９２＿ＰＡＮＴＲ、アカゲザル（Mus musculus）Ｑ９Ｎ１９４＿ＭＡＣＭＵ、シロテテナガザル（Hylobates lar）Ｑ９Ｎ１９１＿ＨＹＬＬＡ、ハツカネズミＱ８ＢＸＨ３＿ＭＯＵＳＥ、ハツカネズミＧＣＹＢ１＿ＭＯＵＳＥ、ハツカネズミＱ３ＵＴＩ４＿ＭＯＵＳＥ、ハツカネズミＱ３ＵＨ８３＿ＭＯＵＳＥ、ハツカネズミＱ６ＸＥ４１＿ＭＯＵＳＥ、ハツカネズミＱ８０ＹＰ４＿ＭＯＵＳＥ、ドブネズミＱ８０ＷＸ７＿ＲＡＴ、ドブネズミＱ８０ＷＸ８＿ＲＡＴ、ドブネズミＱ９２０Ｑ１＿ＲＡＴ、ドブネズミＱ５４Ａ４３＿ＲＡＴ、ドブネズミＱ８０ＷＹ０＿ＲＡＴ、ドブネズミＱ８０ＷＹ４＿ＲＡＴ、ドブネズミＱ８ＣＨ８５＿ＲＡＴ、ドブネズミＱ８０ＷＹ５＿ＲＡＴ、ドブネズミＧＣＹＢ１＿ＲＡＴ、ドブネズミＱ８ＣＨ９０＿ＲＡＴ、ドブネズミＱ９１ＸＪ７＿ＲＡＴ、ドブネズミＱ８０ＷＸ９＿ＲＡＴ、ドブネズミＧＣＹＢ２＿ＲＡＴ、ドブネズミＧＣＹＡ２＿ＲＡＴ、イエイヌ（Canis familiaris）Ｑ４ＺＨＲ９＿ＣＡＮＦＡ、ウシ（Bos taurus）ＧＣＹＢ１＿ＢＯＶＩＮ、イノシシ（Sus scrofa）Ｑ４ＺＨＲ７＿ＰＩＧ、フタホシコオロギ（Gryllus bimaculatus）Ｑ５９ＨＮ５＿ＧＲＹＢＩ、タバコスズメガ（Manduca sexta ）Ｏ７７１０６＿ＭＡＮＳＥ、タバコスズメガＯ７６３４０＿ＭＡＮＳＥ、セイヨウミツバチ（Apis mellifera）Ｑ５ＵＡＦ０＿ＡＰＩＭＥ、セイヨウミツバチＱ５ＦＡＮ０＿ＡＰＩＭＥ、セイヨウミツバチＱ６Ｌ５Ｌ６＿ＡＰＩＭＥ、ガンビアハマダラカ（Anopheles gambiae）株ＰＥＳＴ Ｑ７ＰＹＫ９＿ＡＮＯＧＡ、ガンビアハマダラカ株ＰＥＳＴ Ｑ７Ｑ９Ｗ６＿ＡＮＯＧＡ、ガンビアハマダラカ株ＰＥＳＴ Ｑ７ＱＦ３１＿ＡＮＯＧＡ、ガンビアハマダラカ株ＰＥＳＴ Ｑ７ＰＳ０１＿ＡＮＯＧＡ、ガンビアハマダラカ株ＰＥＳＴ Ｑ７ＰＦＹ２＿ＡＮＯＧＡ、ガンビアハマダラカＱ７ＫＱ９３＿ＡＮＯＧＡ、キイロショウジョウバエＱ２４０８６＿ＤＲＯＭＥ、キイロショウジョウバエＧＣＹＨ＿ＤＲＯＭＥ、キイロショウジョウバエＧＣＹ８Ｅ＿ＤＲＯＭＥ、キイロショウジョウバエＧＣＹＤＡ＿ＤＲＯＭＥ、キイロショウジョウバエＧＣＹＤＢ＿ＤＲＯＭＥ、キイロショウジョウバエＱ９ＶＡ０９＿ＤＲＯＭＥ、ウスグロショウジョウバエ（Drosophila pseudoobscura）Ｑ２９ＣＥ１＿ＤＲＯＰＳ、ウスグロショウジョウバエＱ２９６Ｃ７＿ＤＲＯＰＳ、ウスグロショウジョウバエＱ２９６Ｃ８＿ＤＲＯＰＳ、ウスグロショウジョウバエＱ２９ＢＵ７＿ＤＲＯＰＳ、ジャンボアメフラシ（Aplysia californica）Ｑ７ＹＷＫ７＿ＡＰＬＣＡ、バフンウニ（Hemicentrotus pulcherrimus）Ｑ９５ＮＫ５＿ＨＥＭＰＵ、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）Ｑ５ＹＬＣ２＿ＣＨＬＲＥ、アナベナ属Ｑ８ＹＵＱ７＿ＡＮＡＳＰ、フラボバクテリウム科細菌（Flavobacteria bacterium）ＢＢＦＬ７ Ｑ２６ＧＲ８＿９ＢＡＣＴ、好冷性海洋細菌（Psychroflexus torquis）ＡＴＣＣ ７００７５５ Ｑ１ＶＱＥ５＿９ＦＬＡＯ、海洋性ガンマプロテオバクテリウム（marine gamma proteobacterium）ＨＴＣＣ２２０７ Ｑ１ＹＰＪ５＿９ＧＡＭＭ、海洋ガンマプロテオバクテリウムＨＴＣＣ２２０７ Ｑ１ＹＴＫ４＿９ＧＡＭＭ、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）Ｑ９Ａ４５１＿ＣＡＵＣＲ、アシジフィリウム・クリプタム（Acidiphilium cryptum）ＪＦ－５ Ｑ２ＤＧ６０＿ＡＣＩＣＹ、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）Ｑ３Ｊ０Ｕ９＿ＲＨＯＳ４、シリシバクター・ポメロイ（Silicibacter pomeroyi）Ｑ５ＬＰＶ１＿ＳＩＬＰＯ、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）ＰＤ１２２２、Ｑ３ＰＣ６７＿ＰＡＲＤＥ、シリシバクター属ＴＭ１０４０ Ｑ３ＱＮＹ２＿９ＲＨＯＢ、ヤナスキア属（Jannaschia sp）Ｑ２８ＭＬ８＿ＪＡＮＳＣ、磁気球菌属（Magnetococcus sp）ＭＣ－１Ｑ３ＸＴ２７＿９ＰＲＯＴ、レジオネラ・ニューモフィラＱ５ＷＸＰ０＿ＬＥＧＰＬ、レジオネラ・ニューモフィラＱ５ＷＴＺ５＿ＬＥＧＰＬ、レジオネラ・ニューモフィラＱ５Ｘ２６８＿ＬＥＧＰＡ、レジオネラ・ニューモフィラＱ５Ｘ２Ｒ２＿ＬＥＧＰＡ、レジオネラ・ニューモフィラ亜種ニューモフィラＱ５ＺＷＭ９＿ＬＥＧＰＨ、レジオネラ・ニューモフィラ亜種ニューモフィラＱ５ＺＳＱ８＿ＬＥＧＰＨ、海洋性好冷性細菌（Colwellia psychrerythraea）Ｑ４７Ｙ４３＿ＣＯＬＰ３、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）Ｔ６ｃ Ｑ３ＣＳＺ５＿ＡＬＴＡＴ、シュワネラ・オネイデンシスＱ８ＥＦ４９＿ＳＨＥＯＮ、サッカロファガス・デグラダンス（Saccharophagus degradans）Ｑ２１Ｅ２０＿ＳＡＣＤ２、サッカロファガス・デグラダンスＱ２１ＥＲ７＿ＳＡＣＤ２、ビブリオ・アングスタム（Vibrio angustum）Ｓ１４ Ｑ１ＺＷＥ５＿９ＶＩＢＲ、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）Ｑ８ＤＡＥ２＿ＶＩＢＶＵ、ビブリオ・アルギノリティクス（Vibrio alginolyticus）１２Ｇ０１ Ｑ１ＶＣＰ６＿ＶＩＢＡＬ、ビブリオ属ＤＡＴ７２２ Ｑ２ＦＡ２２＿９ＶＩＢＲ、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）Ｑ８７ＮＪ１＿ＶＩＢＰＡ、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）Ｑ５Ｅ１Ｆ５＿ＶＩＢＦ１、ビブリオ・バルニフィカスＱ７ＭＪＳ８＿ＶＩＢＶＹ、光細菌属ＳＫＡ３４ Ｑ２Ｃ６Ｚ５＿９ＧＡＭＭ、ハヘラ・チェジュエンシス（Hahella chejuensis）Ｑ２ＳＦＹ７＿ＨＡＨＣＨ、オセアノスピリルム属（Oceanospirillum sp）ＭＥＤ９２ Ｑ２ＢＫＶ０＿９ＧＡＭＭ、オセアノバクター属（Oceanobacter sp）ＲＥＤ６５ Ｑ１Ｎ０３５＿９ＧＡＭＭ、デスルフォビブリオ・デスルフリカンス（Desulfovibrio desulfuricans）Ｑ３１０Ｕ７＿ＤＥＳＤＧ、ハロサーモトリクス・オレニ（Halothermothrix orenii）Ｈ１６８ Ｑ２ＡＩＷ５＿９ＦＩＲＭ、サーモアナエロバクター・テンコンゲンシスＱ８ＲＢＸ６＿ＴＨＥＴＮ、カルディセルロシルプトル・サッカロリティクス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）ＤＳＭ ８９０３ Ｑ２ＺＨ１７＿ＣＡＬＳＡ、クロストリジウム・アセトブチリカムＱ９７Ｅ７３＿ＣＬＯＡＢ、アルカリフィルス・メタリレディゲネス（Alkaliphilus metalliredigenes）ＱＹＭＦ Ｑ３Ｃ７６３＿９ＣＬＯＴ、破傷風菌（Clostridium tetani）Ｑ８９９Ｊ９＿ＣＬＯＴＥ、及びクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerincki）ＮＣＩＭＢ ８０５２ Ｑ２ＷＶＮ０＿ＣＬＯＢＥ。これらの配列は、本明細書に記載のＰｆａｍデータベースを使用するＨ－ＮＯＸタンパク質ファミリーに属するものとしてのこれらのタンパク質の同定に基づいて、Ｈ－ＮＯＸタンパク質をコードすると予測される。
【0090】
本明細書に記載の医薬組成物及び方法での使用に適し得る追加のＨ－ＮＯＸタンパク質、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメイン、及び核酸は、標準的な方法を使用して同定することができる。例えば、標準的な配列整列及び／又は構造予測プログラムを使用して、予測されたタンパク質の一次構造及び二次構造と既知のＨ－ＮＯＸタンパク質及び核酸との類似性に基づいて、追加のＨ－ＮＯＸタンパク質及び核酸を同定することができる。例えば、Ｐｆａｍデータベースは、定義された整列アルゴリズムと隠れマルコフモデル（Ｐｆａｍ２１．０など）を使用して、タンパク質をＨ－ＮＯＸタンパク質ファミリーなどのファミリーに分類する（Pfam - A database of protein domain family alignments and Hidden Markov Models, 著作権 (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc., 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, USA）。スイスプロット－ｔｒｅｍｂｌデータベース（ワールドワイドウェブ「expasy.org」、Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4, Switzerland）などの標準データベースも、Ｈ－ＮＯＸタンパク質ファミリーのメンバーの同定に使用することができる。Ｈ－ＮＯＸタンパク質の二次構造及び／又は三次構造は、PredictProtein（630 West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, USA）などの標準構造予測プログラムのデフォルト設定を使用して予測することができる。あるいは、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の実際の二次構造及び／又は三次構造は、標準的な方法を使用して決定することもできる。
【0091】
いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸにおける以下の遠位ポケット残基のいずれかと対応する位置に同じアミノ酸を有する：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、Ｌｅｕ１４４、又はこれらの２つ又はそれ以上の任意の組み合わせ。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、アミノ酸配列の配列整列に基づいて、それぞれＴ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＰｒｏ１１５又はＡｒｇ１３５の位置に対応する位置に、プロリン又はアルギニンを有する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、ドブネズミ β１ Ｈ－ＮＯＸのＨｉｓ１０５に対応するヒスチジンを有する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、６つのアルファらせん、続いて２つのベータ鎖、続いて１つのアルファらせん、続いて２つのベータ鎖を含む二次構造を有するか又は有すると予測される。この二次構造は、Ｈ－ＮＯＸタンパク質について報告されている。
【0092】
所望であれば、新たに同定されたＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインを試験して、標準的な方法を使用してヘムに結合するかどうかを決定することができる。Ｈ－ＮＯＸドメインがＯ２担体として機能する能力は、本明細書に記載されるような標準的な方法を用いてＨ－ＮＯＸドメインがＯ２に結合するかどうかを決定することによって試験することができる。所望であれば、本明細書に記載の変異のうちの１つ又はそれ以上をＨ－ＮＯＸドメインに導入して、Ｏ２担体としての特性を最適化することができる。例えば、１つ又はそれ以上の突然変異を導入して、そのＯ２解離定数、酸素のｋｏｆｆ、ヘムの自己酸化速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性、又は上記の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせを変更することができる。本明細書に記載されているような標準的な技術を使用して、これらのパラメータを測定することができる。
【0093】
変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質
本明細書でさらに議論されるように、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインは、対応する野生型タンパク質と比較して、１つ又はそれ以上の突然変異、例えば、Ｏ２解離定数、酸素のｋｏｆｆ、ヘムの自己酸化速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性、又は前述の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせを変化させる突然変異を含み得る。いくつかの実施態様において、本開示は、対応する野生型タンパク質と比較して、１つ又はそれ以上の突然変異、例えば、Ｏ２解離定数、酸素のｋｏｆｆ、ヘムの自己酸化速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性、又は前述の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせを変化させる突然変異などを含む１つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する。工学作成されたＨ－ＮＯＸドメインのパネルは、ランダム突然変異誘発と、それに続く必要な又は所望の解離定数、解離速度、ＮＯ反応性、安定性、物理的適合性、又は前述の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせについて、本明細書に提供される教示の観点から、本明細書に記載の、及びさらには当業者に公知の技術を使用して、経験的スクリーニングを行うことによって生成され得る。あるいは、突然変異誘発は、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の実験的に決定又は予測される三次元構造（例えば、特に野生型及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質の配列に関して、Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）から、又は配列整列から同定される進化的に保存された残基から明らかな遠位ポケット残基などの特定の領域又は残基を選択的に標的とすることができる（例えば、特に野生型及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質の配列に関して、Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書でさらに議論されるように、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインは、対応する野生型タンパク質と比較して、１つ又はそれ以上の突然変異、例えば、Ｏ２解離定数、酸素のｋｏｆｆ、ヘムの自己酸化速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性、又は前述の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせを変化させる突然変異を含み得る。いくつかの実施態様において、本開示は、対応する野生型タンパク質と比較して、１つ又はそれ以上の突然変異、例えば、Ｏ２解離定数、酸素のｋｏｆｆ、ヘムの自己酸化速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性、又は前述の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせを変化させる突然変異などを含む１つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する。工学作成されたＨ－ＮＯＸドメインのパネルは、ランダム突然変異誘発と、それに続く必要な又は所望の解離定数、解離速度、ＮＯ反応性、安定性、物理的適合性、又は前述の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせについて、本明細書に提供される教示の観点から、本明細書に記載の、及びさらには当業者に公知の技術を使用して、経験的スクリーニングを行うことによって生成され得る。あるいは、突然変異誘発は、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の実験的に決定又は予測される三次元構造（例えば、特に野生型及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質の配列に関して、Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）から、又は配列整列から同定される進化的に保存された残基から明らかな遠位ポケット残基などの特定の領域又は残基を選択的に標的とすることができる（例えば、特に野生型及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質の配列に関して、Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0094】
本開示のいくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質又は変異体Ｈ－ＮＯＸドメインは、天然に存在するすべてのＨ－ＮＯＸタンパク質又はドメインの配列とは異なる配列を有する。様々な実施態様において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在するＨ－ＮＯＸタンパク質の対応する領域と、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９、又は９９．５％のいずれかで同一である。様々な実施態様において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在するＨ－ＮＯＸタンパク質の対応する領域と、約１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０％～約９０％、９０～９５％、９５～９９％、又は９９．５％同一である。いくつかの実施態様において、変異体タンパク質は、全長タンパク質からの少なくとも約２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、又は４００個の連続アミノ酸のいずれかを含むタンパク質断片である。いくつかの実施態様において、変異体タンパク質は、全長タンパク質からの２５～５０、５０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、又は３００～４００個の連続アミノ酸を含むタンパク質断片である。配列同一性は、例えば、その中で指定されたデフォルトパラメータを用いて配列解析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）を使用して測定することができる。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸の置換、欠失、その他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、類似した配列を照合する。
【0095】
本開示のいくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質又は変異体Ｈ－ＮＯＸドメインは、１つ又はそれ以上のアミノ酸の挿入（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸の挿入）を含む。本開示のいくつかの実施態様において、変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質又は変異体Ｈ－ＮＯＸドメインは、１つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、及び／又は内部残基、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００個、若しくはそれ以上のアミノ酸のいずれかの欠失、又は５～１０、１０～１５、１５～２５、２５～５０、５０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、又は３００～４００個のアミノ酸の欠失）を含む。本開示のいくつかの実施態様において、変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質又は変異体Ｈ－ＮＯＸドメインは、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸の置換）、又は前述の２つ又はそれ以上の組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、変異体タンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する。いくつかの実施態様において、変異体核酸配列は、天然に存在するタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施態様において、核酸は、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、天然に存在する核酸の縮重バージョンではない。
【0096】
いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインにおける変異は、進化的に保存された変異（クラスＩ変異とも呼ばれる）である。クラスＩ変異の例を表１Ａに示す。表１Ａでは、変異はヒトβ１ Ｈ－ＮＯＸの配列に従って番号付け／注釈付けされているが、すべてのＨ－ＮＯＸ配列について類似している。従って、任意の他のＨ－ＮＯＸタンパク質中の対応する位置は、指定された残基に変異する可能性がある。例えば、他のＨ－ＮＯＸタンパク質はこの位置にチロシンを有するため、ヒトβ１ Ｈ－ＮＯＸのＰｈｅ４はチロシンに変異する可能性がある。任意の他のＨ－ＮＯＸタンパク質では、対応するフェニルアラニン残基はチロシンに変異する可能性がある。特定の実施態様において、１つ又はそれ以上の変異は進化的に保存された残基に限定される。いくつかの実施態様において、１つ又はそれ以上の変異は、少なくとも１つの進化的に保存された変異及び少なくとも１つの非進化的に保存された変異を含み得る。所望であれば、これらの変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、本明細書で提供される教示を考慮して、ＮＯ／Ｏ２解離定数、ＮＯ反応性、安定性、及び物理的適合性についての経験的スクリーニングに供される。
【表1A】
【0097】
いくつかの実施態様において、変異は、アルファらせんＡ、Ｄ、Ｅ、又はＧにおける残基の変異などの遠位ポケット変異である（Pellicena, P. et al. (August 31, 2004). Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):12854-12859）。例示的な遠位ポケット変異（クラスＩＩ変異とも呼ばれる）を表１Ｂに列挙する。表１Ｂでは、変異はヒトβ１ Ｈ－ＮＯＸの配列に従って番号付け／注釈付けされているが、すべてのＨ－ＮＯＸ配列について類似している。いくつかの置換により、列挙された各残基に実行可能な変異がもたらされるため、示された各位置の残基を他の天然又は非天然アミノ酸（「Ｘ」で示される）に変更することができる。このような変異により、様々な望ましい親和性、安定性、及び反応性特性を備えたＨ－ＮＯＸタンパク質を生成することができる。
【表1B】
【0098】
特定の実施態様において、変異はヘム遠位ポケット変異である。本明細書に記載されるように、Ｈ－ＮＯＸファミリーのＮＯ結合メンバーにおけるＯ２結合を妨げる重要な分子決定因子は、ヘムの遠位ポケットにおけるＨ結合供与体の欠如である。従って、いくつかの実施態様において、変異は、遠位ポケット内のＨ－ＮＯＸドメインとリガンドとのＨ結合を変化させる。いくつかの実施態様において、変異は、遠位ポケットの水素結合ドナーを破壊し、及び／又は対応する野生型Ｈ－ＮＯＸドメインと比較して低下したＯ２リガンド結合を与える。例示的な遠位ポケット残基には、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＴｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、及びＬｅｕ１４４、及び任意の他のＨ－ＮＯＸタンパク質における対応する残基が含まれる。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインは、１つ又はそれ以上の遠位ポケット変異を含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超える遠位ポケット変異を含む。いくつかの実施態様において、遠位ポケット変異は、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する。いくつかの実施態様において、遠位ポケット変異は、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異である。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインは、２つの遠位ポケット変異を含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異である。
【0099】
遠位ポケットにない残基もヘム基の三次元構造に影響を与える可能性がある。この構造は、次にヘム基の鉄へのＯ２及びＮＯの結合に影響を与える。従って、いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインは、遠位ポケットの外側に１つ又はそれ以上の変異を有する。変異する可能性があるが遠位ポケットにはない残基の例には、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸのＰｒｏ１１５及びＡｒｇ１３５が含まれる。いくつかの実施態様において、変異は、ヘム鉄に連結する残基としてＨｉｓ１０５を含む近位ポケット内にある。
【0100】
いくつかの実施態様において、２つ又はそれ以上の変異が存在する場合。少なくとも１つの変異は遠位ポケット内にあり、少なくとも１つの変異は遠位ポケットの外側にある（例えば、近位ポケット内の変異）。いくつかの実施態様において、すべての変異は遠位ポケット内にある。
【0101】
ヒト以外の起源に由来するＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインの免疫原性を低下させるために、Ｈ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインのアミノ酸をヒトＨ－ＮＯＸの対応するアミノ酸に変異させることができる。例えば、非ヒトＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインの三次構造の表面上の１つ又はそれ以上のアミノ酸を、ヒトＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインの対応するアミノ酸に変異させることができる。いくつかの変更態様において、１つ又はそれ以上の表面アミノ酸の変異は、２つ又はそれ以上の遠位ポケット残基の変異、遠位ポケットの外側の１つ又はそれ以上の残基の変異（例えば、近位ポケットにおける変異）、又は上記のうち２つ又はそれ以上の組み合わせと組み合わされてもよい。
【0102】
本開示はまた、二重、三重、又はそれ以上の多重変異などの本明細書に記載される変異の任意の組み合わせにも関する。例えば、本明細書に記載の変異のいずれかの組み合わせを、同じＨ－ＮＯＸタンパク質内で作製することができる。本開示には、他の哺乳動物又は非哺乳動物のＨ－ＮＯＸタンパク質における同等の位置における変異も包含されることに留意されたい。例示的な変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質又は変異体Ｈ－ＮＯＸドメインは、対応する野生型Ｈ－ＮＯＸドメインと比較して改変されたＯ２又はＮＯリガンド結合を付与し、生理学的に適合する哺乳動物のＯ２血液ガス担体として機能する１つ又はそれ以上の変異を含む。
【0103】
変異の残基番号は、記載されている特定のＨ－ＮＯＸタンパク質の配列内の位置を示す。例えば、Ｔ．テンコンジェンシスＩ５Ａは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸの５番目の位置におけるイソロイシンのアラニンによる置換を指す。同じイソロイシンからアラニンへの変異は、任意の他のＨ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインの対応する残基で作成することができる（この残基は、他のＨ－ＮＯＸタンパク質の配列の５番目の残基であってもそうでなくてもよい）。哺乳類のβ１ Ｈ－ＮＯＸドメインのアミノ酸配列の違いは最大２つのアミノ酸であるため、野生型ラットβ１ Ｈ－ＮＯＸタンパク質に導入された場合に望ましい変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインを生成する変異は、ヒトなどの他の哺乳動物由来の野生型β１ Ｈ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインに導入された場合も、望ましい変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインを生成することが期待される。
【0104】
いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つのＴ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及び３つのフォルドンドメインを含む三量体である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つのＴ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及び３つのフォルドンドメインを含む三量体である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つのＴ．テンコンジェンシス野生型Ｈ－ＮＯＸドメイン及び３つのフォルドンドメインを含む三量体である。
【0105】
Ｈ－ＮＯＸタンパク質の修飾
重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質はいずれも、標準的な方法を使用して修飾及び／又は製剤化して、治療又は産業への応用を強化することができる。例えば、特に異種の工学作成Ｈ－ＮＯＸタンパク質に適用される場合、かかる薬剤を免疫追跡から切り離すために、架橋、ＰＥＧ化、炭水化物修飾などを含む様々な方法［例えば、 Rohlfs, R. J. et al. (May 15, 1998). J. Biol. Chem. 273(20):12128-12134; Migita, R. et al. (June 1997). J. Appl. Physiol. 82(6):1995-2002; Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1):183-189、これらはそれぞれ、特にタンパク質の修飾に関して、その全体が参照により本明細書に組み入れられる］、並びに当業者に公知の他の技術が当技術分野で知られている。重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質をヒト血清アルブミンなどのヒトタンパク質と融合させると、血清半減期、粘度、及びコロイド浸透圧を上昇させることができる。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、その免疫原性を減少させ、及び／又はその血漿保持時間を増加させるために、その合成中又は合成後に修飾される。Ｈ－ＮＯＸタンパク質はまたカプセル化することもできる（例えば、リポソーム又はナノ粒子内へのカプセル化）。
重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質はいずれも、標準的な方法を使用して修飾及び／又は製剤化して、治療又は産業への応用を強化することができる。例えば、特に異種の工学作成Ｈ－ＮＯＸタンパク質に適用される場合、かかる薬剤を免疫追跡から切り離すために、架橋、ＰＥＧ化、炭水化物修飾などを含む様々な方法［例えば、 Rohlfs, R. J. et al. (May 15, 1998). J. Biol. Chem. 273(20):12128-12134; Migita, R. et al. (June 1997). J. Appl. Physiol. 82(6):1995-2002; Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1):183-189、これらはそれぞれ、特にタンパク質の修飾に関して、その全体が参照により本明細書に組み入れられる］、並びに当業者に公知の他の技術が当技術分野で知られている。重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質をヒト血清アルブミンなどのヒトタンパク質と融合させると、血清半減期、粘度、及びコロイド浸透圧を上昇させることができる。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、その免疫原性を減少させ、及び／又はその血漿保持時間を増加させるために、その合成中又は合成後に修飾される。Ｈ－ＮＯＸタンパク質はまたカプセル化することもできる（例えば、リポソーム又はナノ粒子内へのカプセル化）。
【0106】
いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、例えば、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の精製を補助するために１つ又はそれ以上のタグを含む。タグの例には、限定されるものではないが、Ｈｉｓ６、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ、及びＭＢＰが含まれる。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は１つ又はそれ以上のＨｉｓ６タグを含む。この１つ又はそれ以上のＨｉｓ６タグは、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の使用前に、例えばエキソペプチダーゼで処理することにより除去することができる。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つのＴ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン、３つのフォルドンドメイン、及び３つのＨｉｓ６タグを含む三量体である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つのＴ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン、３つのフォルドンドメイン、及び３つのＨｉｓ６タグを含む三量体である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つのＴ．テンコンジェンシス野生型Ｈ－ＮＯＸドメイン、３つのフォルドンドメイン、及び３つのＨｉｓ６タグを含む三量体である。
【0107】
重合ドメイン
いくつかの態様において、本開示は、２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメイン及び１つ又はそれ以上の重合ドメインを含む重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する。重合ドメインは、２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインを連結して重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を形成するために使用される。１つ又はそれ以上の重合ドメインを使用して、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体などを生成することができる。重合ドメインは当技術分野で公知であり、例えば、Ｔ４バクテリオファージフィブリチンのフォルドン、Ａｒｃ、ＰＯＺ、コイルドコイルドメイン（ＧＣＮ４、ロイシンジッパー、ベルクロを含む）、ウテログロビン、コラーゲン、３本鎖コイルドコイル（マトリリン－１）、トロンボスポンジン、ＴＲＰＶ１－Ｃ、Ｐ５３、Ｍｎｔ、アビジン、ストレプトアビジン、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＣＯＭＰ、ベロ毒素サブユニットＢ、ＣａｍＫＩＩ、ＲＣＫ、及びＮエチルマレイミド感受性融合タンパク質由来のドメイン、ＳＴＭ３５４８、ＫａｉＣ、ＴｙｒＲ、Ｈｃｐ１、ＣｃｍＫ４、ＧＰ４１、炭疽菌防御抗原、アエロリシン、α溶血素、Ｃ４ｂ結合タンパク質、Ｍｉ－ＣＫ、アリールスルファターゼＡ、及びウイルスキャプシドタンパク質が知られている。重合ドメインは、Ｈ－ＮＯＸドメインに共有結合又は非共有結合していてもよい。いくつかの実施態様において、重合ドメインはＨ－ＮＯＸドメインに連結されて単量体サブユニットを形成し、こうして、複数の単量体サブユニットからの重合ドメインが会合して重合体型Ｈ－ＮＯＸドメインが形成される。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。他の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。
いくつかの態様において、本開示は、２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメイン及び１つ又はそれ以上の重合ドメインを含む重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する。重合ドメインは、２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインを連結して重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を形成するために使用される。１つ又はそれ以上の重合ドメインを使用して、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体などを生成することができる。重合ドメインは当技術分野で公知であり、例えば、Ｔ４バクテリオファージフィブリチンのフォルドン、Ａｒｃ、ＰＯＺ、コイルドコイルドメイン（ＧＣＮ４、ロイシンジッパー、ベルクロを含む）、ウテログロビン、コラーゲン、３本鎖コイルドコイル（マトリリン－１）、トロンボスポンジン、ＴＲＰＶ１－Ｃ、Ｐ５３、Ｍｎｔ、アビジン、ストレプトアビジン、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＣＯＭＰ、ベロ毒素サブユニットＢ、ＣａｍＫＩＩ、ＲＣＫ、及びＮエチルマレイミド感受性融合タンパク質由来のドメイン、ＳＴＭ３５４８、ＫａｉＣ、ＴｙｒＲ、Ｈｃｐ１、ＣｃｍＫ４、ＧＰ４１、炭疽菌防御抗原、アエロリシン、α溶血素、Ｃ４ｂ結合タンパク質、Ｍｉ－ＣＫ、アリールスルファターゼＡ、及びウイルスキャプシドタンパク質が知られている。重合ドメインは、Ｈ－ＮＯＸドメインに共有結合又は非共有結合していてもよい。いくつかの実施態様において、重合ドメインはＨ－ＮＯＸドメインに連結されて単量体サブユニットを形成し、こうして、複数の単量体サブユニットからの重合ドメインが会合して重合体型Ｈ－ＮＯＸドメインが形成される。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。他の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。
【0108】
リンカー、例えばアミノ酸リンカーを使用して、重合ドメインをＨ－ＮＯＸドメインに結合させることができる。いくつかの実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるアミノ酸のいずれか１つを含むリンカーは、重合ドメインとＨ－ＮＯＸドメインとの間に配置され得る。リンカーの例には、限定されるものではないが、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ及びＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーが含まれる。
【0109】
バクテリオファージＴ４フィブリチン三量体化ドメイン
例示的な重合ドメインは、バクテリオファージＴ４のフォルドンドメインである。バクテリオファージＴ４由来のｗａｃ遺伝子は、Ｃ末端三量体化ドメイン（残基４５７～４８３）を有する４８６アミノ酸のタンパク質であるフィブリチンタンパク質をコードする（Efimov, V. P. et al. (1994) J Mol Biol 242:470-486）。このドメインは、インビトロ及びインビボの両方でフィブリチンを三量体化することができる（Boudko, S. P. et al. (2002) Eur J Biochem 269:833-841; Letarov, A. V., et al., (1999) Biochemistry (Mosc)64:817-823; Tao, Y., et al., (1997) Structure 5:789-798）。単離された２７残基の三量体化ドメインは「フォルドンドメイン」と呼ばれることが多く、多くの異なるタンパク質［ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（Yang, X. et al., (2002) J Virol 76:4634-4642）、アデノウイルスアドヘシン（Papanikolopoulou, K., et al., (2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Papanikolopoulou, K. et al. (2004) J Mol Biol 342:219-227)、コラーゲン (Zhang, C., et al. (2009) Biotechnol Prog 25:1660-1668）、ファージＰ２２ｇｐ２６（Bhardwaj, A., et al. (2008) Protein Sci 17:1475-1485）、及び狂犬病ウイルス糖タンパク質（Sissoeff, L., et al. (2005) J Gen Virol 86:2543-2552］でキメラ三量体を構築するために使用されている。フォルドンドメインの例示的な配列は図１に示され、配列番号４に提供される。
例示的な重合ドメインは、バクテリオファージＴ４のフォルドンドメインである。バクテリオファージＴ４由来のｗａｃ遺伝子は、Ｃ末端三量体化ドメイン（残基４５７～４８３）を有する４８６アミノ酸のタンパク質であるフィブリチンタンパク質をコードする（Efimov, V. P. et al. (1994) J Mol Biol 242:470-486）。このドメインは、インビトロ及びインビボの両方でフィブリチンを三量体化することができる（Boudko, S. P. et al. (2002) Eur J Biochem 269:833-841; Letarov, A. V., et al., (1999) Biochemistry (Mosc)64:817-823; Tao, Y., et al., (1997) Structure 5:789-798）。単離された２７残基の三量体化ドメインは「フォルドンドメイン」と呼ばれることが多く、多くの異なるタンパク質［ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（Yang, X. et al., (2002) J Virol 76:4634-4642）、アデノウイルスアドヘシン（Papanikolopoulou, K., et al., (2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Papanikolopoulou, K. et al. (2004) J Mol Biol 342:219-227)、コラーゲン (Zhang, C., et al. (2009) Biotechnol Prog 25:1660-1668）、ファージＰ２２ｇｐ２６（Bhardwaj, A., et al. (2008) Protein Sci 17:1475-1485）、及び狂犬病ウイルス糖タンパク質（Sissoeff, L., et al. (2005) J Gen Virol 86:2543-2552］でキメラ三量体を構築するために使用されている。フォルドンドメインの例示的な配列は図１に示され、配列番号４に提供される。
【0110】
単離されたフォルドンドメインは折り畳まれて単一のβ－ヘアピン構造になり、三量体化して３つのヘアピンを含むβ－プロペラ構造になる（Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915）。フォルドンドメイン単独の構造はＮＭＲ（Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915）によって決定されており、フォルドンドメインで三量体化されたいくつかのタンパク質の構造がＸ線結晶学によって解明されている（Papanikolopoulou, K., et al., (2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Stetefeld, J. et al. (2003) Structure 11:339-346; Yokoi, N. et al. (2010) Small 6:1873-1879）。ドメインは折り畳まれ及び三量体化されて、中間体又は経路外のオリゴマー化産物のミスフォールディングの機会を急速に減少させる（Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915）。フォルドンドメインは非常に安定であり、＞１０％ＳＤＳ、６．０Ｍ塩酸グアニジン、又は８０℃において三次構造及びオリゴマー化を維持することができ（Bhardwaj, A., et al. (2008) Protein Sci 17:1475-1485; Bhardwaj, A., et al. (2007) J Mol Biol 371:374-387）、及びフォルドンドメインに融合した配列の安定性を改善することができる（Du, C. et al. (2008) Appl Microbiol Biotechnol 79:195-202）。
【0111】
いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＣ末端はフォルドンドメインのＮ末端に連結される。他の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＮ末端はフォルドンドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＣ末端はフォルドンドメインのＣ末端に連結される。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインのＮ末端はフォルドンドメインのＣ末端に連結される。
【0112】
いくつかの実施態様において、リンカーは、フォルドンドメインをＨ－ＮＯＸドメインに結合させるために使用される。いくつかの実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるアミノ酸のいずれか１つを含むリンカーは、重合ドメインとＨ－ＮＯＸドメインとの間に配置され得る。リンカーの例には、限定されるものではないが、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ及びＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーが含まれる。いくつかの実施態様において、本開示は、Ｎ末端からＣ末端へ以下を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する：Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー、及びフォルドンドメイン。いくつかの実施態様において、本開示は、Ｎ末端からＣ末端へ以下を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する：Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー、フォルドンドメイン、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒアミノ酸リンカー、及びＨｉｓ６タグ。いくつかの実施態様において、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインはＬ１４４Ｆ変異を含む。いくつかの実施態様において、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインは、Ｗ９Ｆ変異及びＬ１４４Ｆ変異を含む。いくつかの実施態様において、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインは野生型Ｈ－ＮＯＸドメインである。
【0113】
単量体Ｈ－ＮＯＸドメインサブユニット
１つの態様において、本開示は、会合して重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を形成することができる組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質（すなわち、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の単量体Ｈ－ＮＯＸサブユニット）を提供する。いくつかの実施態様において、本開示は、本明細書に記載のＨ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む組換えＨ－ＮＯＸタンパク質を提供する。Ｈ－ＮＯＸドメインと重合ドメインは共有結合していても非共有結合していてもよい。いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。他の実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
１つの態様において、本開示は、会合して重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を形成することができる組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質（すなわち、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の単量体Ｈ－ＮＯＸサブユニット）を提供する。いくつかの実施態様において、本開示は、本明細書に記載のＨ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む組換えＨ－ＮＯＸタンパク質を提供する。Ｈ－ＮＯＸドメインと重合ドメインは共有結合していても非共有結合していてもよい。いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。他の実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＨ－ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
【0114】
いくつかの実施態様において、単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は野生型Ｈ－ＮＯＸドメインを含む。本開示のいくつかの実施態様において、単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈ－ＮＯＸドメインに１つ又はそれ以上の変異を含む。いくつかの実施態様において、１つ又はそれ以上の変異は、対応する野生型Ｈ－ＮＯＸドメインと比較して、Ｏ２解離定数、酸素のｋｏｆｆ、ヘムの自己酸化速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性、又はこれらの２つ又はそれ以上の任意の組み合わせを改変する。いくつかの実施態様において、変異は遠位ポケット変異である。いくつかの実施態様において、変異は遠位ポケット内にない変異を含む。いくつかの実施態様において、遠位ポケット変異は、Ｔ．テンコンジェンシスのＬ１４４変異（例えば、Ｌ１４４Ｆ変異）に対応する。いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．テンコンジェンシスのＷ９及びＬ１４４変異（例えば、Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異）に対応する２つの遠位ポケット変異を含む。
【0115】
いくつかの態様において、本開示は、会合して三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を形成する組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する。いくつかの実施態様において、組換えＨ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈ－ＮＯＸドメイン及び三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインは、本明細書で論じられるようなフォルドンドメインである。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインである。いくつかの実施態様において、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、フォルドンドメインのＮ末端に共有結合している。いくつかの実施態様において、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインのＣ末端は、フォルドンドメインのＣ末端に共有結合している。いくつかの実施態様において、Ｔ．テンコンジェンシスドメインはＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメインである。いくつかの実施態様において、Ｔ．テンコンジェンシスドメインはＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメインである。いくつかの実施態様において、Ｔ．テンコンジェンシスドメインは野生型Ｈ－ＮＯＸドメインである。
【0116】
いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー配列を使用して重合ドメインに共有結合している。いくつかの実施態様において、アミノ酸リンカー配列は、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるアミノ酸である。例示的なアミノ酸リンカー配列には、限定されるものではないが、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ配列及びＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ配列が含まれる。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つのＨ－ＮＯＸドメイン及び３つの三量体化配列を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質であり、ここで、Ｈ－ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー配列を介して三量体化ドメインに共有結合している。いくつかの実施態様において、単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ以下を含む：Ｌ１４４Ｆ Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、及びフォルドンドメイン。いくつかの実施態様において、単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ以下を含む：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、及びフォルドンドメイン。いくつかの実施態様において、単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ以下を含む：野生型Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、及びフォルドンドメイン。
【0117】
いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質はタグ、例えば、Ｈｉｓ６、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ、又はＭＢＰタグを含む。いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｈｉｓ６タグを含む。いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質はタグを含まない。いくつかの実施態様において、タグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）は、アミノ酸スペーサー配列を使用して重合ドメインに共有結合している。いくつかの実施態様において、アミノ酸リンカー配列は、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるアミノ酸である。例示的なアミノ酸リンカー配列には、限定されるものではないが、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ配列及びＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ配列が含まれる。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つのＨ－ＮＯＸドメイン、３つの三量体化配列、及び３つのＨｉｓ６タグを含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質であり、ここで、Ｈ－ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー配列を介して三量体化ドメインに共有結合しており、及び三量体化ドメインは、アミノ酸リンカー配列を介してＨｉｓ６タグに共有結合している。いくつかの実施態様において、単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ以下を含む：Ｌ１４４Ｆ Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー配列、及びＨｉｓ６タグ。いくつかの実施態様において、単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ以下を含む：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー配列、及びＨｉｓ６タグ。いくつかの実施態様において、単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ以下を含む：野生型Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー配列、及びＨｉｓ６タグ。
【0118】
いくつかの実施態様において、組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【0119】
野生型及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質の特徴
本明細書に記載されるように、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、いくつかの範囲のＮＯ及びＯ２の解離定数、Ｏ２ｋｏｆｆ、ＮＯ反応性、及び安定性を提供する多数の多様なＨ－ＮＯＸ変異体タンパク質を作製されている。機能的な血液ガス担体を提供するために、Ｈ－ＮＯＸタンパク質を使用して、ヘモグロビンなどの内因性Ｏ２担体を機能的に置き換えるか又は補足することができる。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質などのＨ－ＮＯＸタンパク質は、放射線療法又は化学療法の補助として低酸素腫瘍組織（例えば神経膠芽腫）にＯ２を送達するために使用される。従って、いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビンなどの内因性Ｏ２担体と比較して、同様の又は改善されたＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合の解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、自己酸化速度、血漿保持時間、又は上記の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせを有する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。
本明細書に記載されるように、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、いくつかの範囲のＮＯ及びＯ２の解離定数、Ｏ２ｋｏｆｆ、ＮＯ反応性、及び安定性を提供する多数の多様なＨ－ＮＯＸ変異体タンパク質を作製されている。機能的な血液ガス担体を提供するために、Ｈ－ＮＯＸタンパク質を使用して、ヘモグロビンなどの内因性Ｏ２担体を機能的に置き換えるか又は補足することができる。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質などのＨ－ＮＯＸタンパク質は、放射線療法又は化学療法の補助として低酸素腫瘍組織（例えば神経膠芽腫）にＯ２を送達するために使用される。従って、いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビンなどの内因性Ｏ２担体と比較して、同様の又は改善されたＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合の解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、自己酸化速度、血漿保持時間、又は上記の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせを有する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。
【0120】
様々な実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質のＯ２のｋｏｆｆは、２０℃で約０．０１～約２００ｓ－１、例えば約０．１～約２００ｓ－１、約０．１～１００ｓ－１、約１．０～約１６．０ｓ－１、約１．３５～約２３．４ｓ－１、約１．３４～約１８ｓ－１、約１．３５～約１４．５ｓ－１、約０．２１～約２３．４ｓ－１、約１．３５～約２．９ｓ－１、約２～約３ｓ－１、約５～約１５ｓ－１、又は約０．１～約１ｓ－１である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、２０℃で約０．６５ｓ－１以下（例えば、２０℃で約０．２１ｓ－１～約０．６５ｓ－１）の酸素のｋｏｆｆを有する。
【0121】
様々な実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質のＯ２のｋｏｎは、２０℃で約０．１４～約６０μＭ－１ｓ－１、例えば、約６～約６０μＭ－１ｓ－１、約６～１２μＭ－１ｓ－１、約１５～約６０μＭ－１ｓ－１、約５～約１８μＭ－１ｓ－１、又は約６～約１５μＭ－１ｓ－１である。
【0122】
様々な実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質によるＯ２結合の速度論的又は計算されたＫＤは、約１ｎＭ～１ｍＭ、約１μＭ～約１０μＭ、又は約１０μＭ～約５０μＭである。いくつかの実施態様において、Ｏ２結合の計算されたＫＤは、２０℃で約２ｎＭ～約２μＭ、約２μＭ～約１ｍＭ、約１００ｎＭ～約１μＭ、約９μＭ～約５０μＭ、約１００μＭ～約１ｍＭ、約５０ｎＭ～約１０μＭ、約２ｎＭ～約５０μＭ、約１００ｎＭ～約１．９μＭ、約１５０ｎＭ～約１μＭ、又は約１００ｎＭ～約２５５ｎＭ、約２０ｎＭ～約２μＭ、２０ｎＭ～約７５ｎＭ、約１μＭ～約２μＭ、約２μＭ～約１０μＭ、約２μＭ～約９μＭ、又は約１００ｎＭ～５００ｎＭのいずれか１つである。いくつかの実施態様において、Ｏ２結合の速度論的又は計算されたＫＤは、２０℃で約１００ｎＭ、８０ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のいずれかである。
【0123】
様々な実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質によるＯ２結合の速度論的又は計算されたＫＤは、同じ条件下（例えば２０℃）でヘモグロビンの約０．０１～約１００倍以内、例えば同じ条件下（例えば２０℃）でヘモグロビンの約０．１～約１０倍又は約０．５～約２倍である。様々な実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質によるＮＯ結合の速度論的又は計算されたＫＤは、同じ条件下（例えば２０℃）でヘモグロビンの約０．０１～約１００倍以内、例えば同じ条件下（例えば２０℃）でヘモグロビンの約０．１～約１０倍又は約０．５～約２倍である。
【0124】
いくつかの実施態様において、２０℃で約１、２、４、６、８、１０、１５、又は２０時間のいずれかの時間インキュベーション後に、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質の約５０、４０、３０、１０、又は５％未満のいずれかが酸化される。
【0125】
様々な実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ－１未満、例えば、２０℃で約６００ｓ－１、５００ｓ－１、４００ｓ－１、３００ｓ－１、２００ｓ－１、１００ｓ－１、７５ｓ－１、５０ｓ－１、２５ｓ－１、２０ｓ－１、１０ｓ－１、５０ｓ－１、３ｓ－１、２ｓ－１、１．８ｓ－１、１．５ｓ－１、１．２ｓ－１、１．０ｓ－１、０．８ｓ－１、０．７ｓ－１、又は０．６ｓ－１未満である。様々な実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約０．１～約６００ｓ－１、例えば、２０℃で約０．５～約４００ｓ－１、約０．５～約１００ｓ－１、約０．５～約５０ｓ－１、約０．５～約１０ｓ－１、約１～約５ｓ－１、又は約０．５～約２．１ｓ－１である。様々な実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の反応性は、例えば２０℃の同じ条件下でヘモグロビンの反応性よりも、少なくとも約１０、１００、１，０００、又は１０，０００倍低い。
【0126】
様々な実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質のヘムの自己酸化の速度は、３７℃で約１．０ｈ－１未満、例えば、３７℃で約０．９ｈ－１、０．８ｈ－１、０．７ｈ－１、０．６ｈ－１、０．５ｈ－１、０．４ｈ－１、０．３ｈ－１、０．２ｈ－１、０．１ｈ－１、又は０．０５ｈ－１未満のいずれかである。様々な実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のヘムの自己酸化の速度は、３７℃で約０．００６～約５．０ｈ－１、例えば３７℃で約０．００６～約１．０ｈ－１、０．００６～約０．９ｈ－１、又は約０．０６～約０．５ｈ－１である。
【0127】
様々な実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、（ａ）ヘモグロビンのそれの２桁以内の、Ｏ２又はＮＯ解離定数、会合速度（Ｏ２又はＮＯのｋｏｎ）、又は解離速度（Ｏ２又はＮＯのｋｏｆｆ）、（ｂ）それぞれ、ｓＧＣ１のそれよりも弱いＮＯ親和性（例えば、少なくとも約１０倍、１００倍、又は１０００倍弱い）、（ｃ）ヘモグロビンより少なくとも１０００倍低い結合Ｏ２とのＮＯ反応性、（ｄ）ヘモグロビンのそれより少なくとも２、１０、１００、又は１０００倍大きいインビボ血漿保持時間、又は（ｅ）前述の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせ、を有する。
【0128】
例示的な適切なＯ２担体は、ヘモグロビンの解離定数の２桁以内、すなわちヘモグロビンの約０．０１～１００倍、例えば約０．１～１０倍、又は約０．５～２倍の解離定数を提供する。解離定数を定量するために、本明細書に記載の技術などの様々な確立された技術［Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1):183-189, これらはそれぞれ、特に解離定数の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる］、並びに当業者に知られている技術を使用することができる。例示的なＯ２担体は、結合Ｏ２とのＨ－ＮＯＸタンパク質の低い又は最小限のＮＯ反応性、例えばヘモグロビンのＮＯ反応性よりも低いＮＯ反応性を提供する。いくつかの実施態様において、ＮＯ反応性は、ヘモグロビンのそれよりもはるかに低く、例えば、ヘモグロビンのそれよりも少なくとも約１０、１００、１，０００、又は１０，０００倍低い。ＮＯ反応性を定量するために、確立された様々な技術［Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1):183-189、これらはそれぞれ、特にＮＯ反応性の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる］、並びに当業者に知られている技術を使用することができる。野生型Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸは非常に低いＮＯ反応性を有するため、他の野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質も同様に低いＮＯ反応性を有する可能性がある。例えば、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸ Ｙ１４０Ｈは、野生型Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸの反応性と同様のＮＯ反応性を有する。
【0129】
さらに、適切なＯ２担体は、高い安定性又は最大の安定性、特にインビボ安定性を提供する。酸化安定性（例えば、自己酸化又はＮＯによる酸化に対する安定性）、温度安定性、及びインビボ安定性などの様々な安定性測定基準を使用することができる。安定性を定量するために、本明細書に記載の技術などの様々な確立された技術（Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902）、並びに当業者に知られている技術を使用することができる。血漿、血液、又は組織におけるインビボ安定性の場合、例示的な安定性測定基準には、保持時間、クリアランス速度、及び半減期が含まれる。好熱性生物由来のＨ－ＮＯＸタンパク質は、高温でも安定であると予測される。様々な実施態様において、血漿保持時間は、ヘモグロビンの保持時間より少なくとも約２倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍長い（例えば、Bobofchak, K. M. et al. (August 2003). Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285(2):H549-H561）。当業者には理解されるように、ヘモグロビンベースの血液代替物は、血漿から無細胞ヘモグロビンを除去するヘモグロビンに対する受容体の存在のために、血漿からの無細胞ヘモグロビンの急速なクリアランスによって制限される。血漿中にはＨ－ＮＯＸタンパク質の受容体が存在しないため、野生の及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質はヘモグロビンよりも血漿保持時間が長いと予測される。所望であれば、血漿保持時間は、標準的な方法（例えば、本明細書に記載される方法及び当業者に知られている方法）を使用して、Ｈ－ＮＯＸタンパク質をＰＥＧ化若しくは架橋するか、又はＨ－ＮＯＸタンパク質を別のタンパク質と融合させることによって延長することができる。
【0130】
様々な実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質は、２０℃で約１ｎＭ～約１ｍＭのＯ２解離定数を有し、例えば２０℃の同じ条件下でヘモグロビンの反応性より少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、２０℃で約１ｎＭ～約１ｍＭのＯ２解離定数と、２０℃で約７００ｓ－１未満（例えば、２０℃で約６００ｓ－１、５００ｓ－１、１００ｓ－１、２０ｓ－１、又は１．８ｓ－１ 未満）のＮＯ反応性を有する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビンの解離定数の２桁以内のＯ２解離定数を有し、例えば２０℃の同じ条件下でヘモグロビンよりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、２０℃で約０．０１～約２００ｓ－１の酸素のｋｏｆｆを有し、例えば２０℃の同じ条件下で、ヘモグロビンの反応性よりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、２０℃で約０．６５ｓ－１未満（例えば、２０℃で約０．２１ｓ－１～約０．６４ｓ－１）の酸素のｋｏｆｆと、例えば２０℃の同じ条件下でヘモグロビンの反応性よりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。本開示のいくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、約１ｎＭ～約１μＭ（１０００ｎＭ）、約１μＭ～約１０μＭ、又は約１０μＭ～約５０μＭである。特定の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃で約２ｎＭ～約５０μＭ、約５０ｎＭ～約１０μＭ、約１００ｎＭ～約１．９μＭ、約１５０ｎＭ～約１μＭ、又は約１００ｎＭ～約２５５ｎＭである。様々な実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃で約８０ｎＭ未満、例えば、２０℃で約２０ｎＭ～約７５ｎＭである。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、例えば２０℃の同じ条件下で、ヘモグロビンの反応性より少なくとも約１００倍又は約１，０００倍低い。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ－１未満、例えば約６００ｓ－１、５００ｓ－１、４００ｓ－１、３００ｓ－１、２００ｓ－１、１００ｓ－１、７５ｓ－１、５０ｓ－１、２５ｓ－１、２０ｓ－１、１０ｓ－１、５０ｓ－１、３ｓ－１、２ｓ－１、１．８ｓ－１、１．５ｓ－１、１．２ｓ－１、１．０ｓ－１、０．８ｓ－１、０．７ｓ－１、又は０．６ｓ－１未満である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の酸素のｋｏｆｆは、２０℃で０．０１～２００ｓ－１、例えば約０．１～約２００ｓ－１、約０．１～１００ｓ－１、約１．３５～約２３．４ｓ－１、約１．３４～約１８ｓ－１、約１．３５～約１４．５ｓ－１、約０．２１～約２３．４ｓ－１、約２～約３ｓ－１、約５～約１５ｓ－１、又は約０．１～約１ｓ－１である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃で約１００ｎＭ～約１．９μＭであり、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の酸素のｋｏｆｆは、２０℃で 約１．３５ｓ－１～約１４．５ｓ－１である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のヘムの自己酸化速度は、３７℃で約１ｈ－１未満、例えば約０．９ｈ－１、０．８ｈ－１、０．７ｈ－１、０．６ｈ－１、０．５ｈ－１、０．４ｈ－１、０．３ｈ－１、０．２ｈ－１、又は０．１ｈ－１未満のいずれかである。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の酸素のｋｏｆｆは、２０℃で約１．３５ｓ－１～約１４．５ｓ－１であり、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のヘムの自己酸化速度は、３７℃で約１ｈ－１未満である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の酸素のｋｏｆｆは、２０℃で約１．３５ｓ－１～約１４．５ｓ－１であり、Ｈ－ＮＯＸのＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ－１未満（例えば、２０℃で約６００ｓ－１、５００ｓ－１、１００ｓ－１、２０ｓ－１、又は１．８ｓ－１未満）である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のヘムの自己酸化速度は、３７℃で約１ｈ－１未満であり、Ｈ－ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃で約７００ｓ－１未満（例えば、２０℃で約６００ｓ－１、５００ｓ－１、１００ｓ－１、２０ｓ－１、又は１．８ｓ－１未満）である。
【0131】
いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質溶液を含むＨ－ＮＯＸタンパク質溶液の粘度は、１～４センチポアズ（ｃＰ）である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質溶液のコロイド浸透圧は、２０～５０ｍｍＨｇである。
【0132】
Ｏ２及び／又はＮＯ結合の測定
当業者は、当技術分野で知られている方法及び後述の非限定的な例示的な方法により、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質などの重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む任意のＨ－ＮＯＸタンパク質の酸素及び一酸化窒素結合特性を容易に決定することができる。
当業者は、当技術分野で知られている方法及び後述の非限定的な例示的な方法により、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質などの重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む任意のＨ－ＮＯＸタンパク質の酸素及び一酸化窒素結合特性を容易に決定することができる。
【0133】
速度論的ＫＤ：ｋｏｆｆとｋｏｎの比
速度論的ＫＤ値は、本質的にBoon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されているように、ポリマーＨ－ＮＯＳタンパク質を含む野生型及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質について、特に自然ケミカルバイオロジーこの文献は、特にＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合の解離定数、自己酸化速度、ＮＯ解離速度の測定に関して、決定される。
速度論的ＫＤ値は、本質的にBoon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されているように、ポリマーＨ－ＮＯＳタンパク質を含む野生型及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質について、特に自然ケミカルバイオロジーこの文献は、特にＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合の解離定数、自己酸化速度、ＮＯ解離速度の測定に関して、決定される。
【0134】
ｋｏｎ（Ｏ２会合速度）
ヘムへのＯ２結合は、２０℃でフラッシュ光分解を使用して測定される。非常に速い対再結合反応速度の結果として、ＦｅＩＩ－Ｏ２錯体をフラッシュオフすることは不可能である。従って、ＦｅＩＩ－ＣＯ錯体は、５６０ｎｍのレーザー光（Hewlett-Packard, Palo Alto, CA）を使用してフラッシュ光分解を受け、５配位のＦｅＩＩ中間体を生成し、ここへの分子Ｏ２の結合が様々な波長で追跡される。タンパク質試料は、１０ｍＭ亜ジチオン酸で嫌気性還元し、続いてＰＤ－１０カラム（Millipore, Inc., Billerica, MA）で脱塩することによって作成される。次に試料を、１００μＬ～１ｍＬのサイズで光路長１ｃｍの雰囲気制御された石英キュベット内で、５０ｍＭＴＥＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の緩衝液で希釈して２０μＭヘムにする。このキュベットのヘッドスペースにＣＯガスを１０分間流し、ＦｅＩＩ－ＣＯ錯体を形成し、その形成は紫外可視分光法（ソレット最大４２３ｎｍ）によって確認される。次に、この試料を使用して、フラッシュ光分解後のＣＯ再結合速度を１気圧のＣＯガス下で測定するか、又はフラッシュ光分解前に開封して空気中で３０分間撹拌して緩衝液を完全に酸素化した後、Ｏ２再結合イベントを観察する。Ｏ２ヘムとの会合は複数の波長対時間で追跡される。これらのトレースは、ＩｇｏｒＰｒｏソフトウェア（Wavemetrics, Inc., Oswego, OR; latest 2005 バージョン）を使用して単一の指数関数にフィッティングされる。この速度は観察波長には依存せず、Ｏ２濃度に依存する。紫外可視分光法を全体を通して使用して、すべての錯体及び中間体を確認する（Cary 3K, Varian, Inc. Palo Alto, CA）。一過性吸収データは、Dmochowski, I. J. et al. (August 31, 2000), J Inorg Biochem. 81(3):221-228（これは、特に機器に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている機器を使用して収集される。この機器の応答時間は２０ｎｓで、データは２００メガ試料ｓ－１でデジタル化される。
ヘムへのＯ２結合は、２０℃でフラッシュ光分解を使用して測定される。非常に速い対再結合反応速度の結果として、ＦｅＩＩ－Ｏ２錯体をフラッシュオフすることは不可能である。従って、ＦｅＩＩ－ＣＯ錯体は、５６０ｎｍのレーザー光（Hewlett-Packard, Palo Alto, CA）を使用してフラッシュ光分解を受け、５配位のＦｅＩＩ中間体を生成し、ここへの分子Ｏ２の結合が様々な波長で追跡される。タンパク質試料は、１０ｍＭ亜ジチオン酸で嫌気性還元し、続いてＰＤ－１０カラム（Millipore, Inc., Billerica, MA）で脱塩することによって作成される。次に試料を、１００μＬ～１ｍＬのサイズで光路長１ｃｍの雰囲気制御された石英キュベット内で、５０ｍＭＴＥＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の緩衝液で希釈して２０μＭヘムにする。このキュベットのヘッドスペースにＣＯガスを１０分間流し、ＦｅＩＩ－ＣＯ錯体を形成し、その形成は紫外可視分光法（ソレット最大４２３ｎｍ）によって確認される。次に、この試料を使用して、フラッシュ光分解後のＣＯ再結合速度を１気圧のＣＯガス下で測定するか、又はフラッシュ光分解前に開封して空気中で３０分間撹拌して緩衝液を完全に酸素化した後、Ｏ２再結合イベントを観察する。Ｏ２ヘムとの会合は複数の波長対時間で追跡される。これらのトレースは、ＩｇｏｒＰｒｏソフトウェア（Wavemetrics, Inc., Oswego, OR; latest 2005 バージョン）を使用して単一の指数関数にフィッティングされる。この速度は観察波長には依存せず、Ｏ２濃度に依存する。紫外可視分光法を全体を通して使用して、すべての錯体及び中間体を確認する（Cary 3K, Varian, Inc. Palo Alto, CA）。一過性吸収データは、Dmochowski, I. J. et al. (August 31, 2000), J Inorg Biochem. 81(3):221-228（これは、特に機器に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている機器を使用して収集される。この機器の応答時間は２０ｎｓで、データは２００メガ試料ｓ－１でデジタル化される。
【0135】
ｋｏｆｆ（Ｏ２解離速度）
ｋｏｆｆを測定するために、タンパク質のＦｅＩＩ－Ｏ２錯体（５Ｍヘム）を嫌気性の５０ｍＭＴＥＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の緩衝液で希釈し、様々な濃度の亜ジチオン酸塩及び／又は飽和ＣＯガスを含む同量の同じ緩衝液（嫌気性）と急速に混合する。データは、２０℃に設定された Neslab RTE-100 恒温槽を備えたHI-TECH Scientific SF-61ストップフロー分光光度計（TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, United Kingdom）で取得する。ヘムからのＯ２の解離は、ＦｅＩＩ－ＦｅＩＩ－Ｏ２差分スペクトルの最大値である４３７ｎｍ、又はＦｅＩＩ－ＦｅＩＩ－ＣＯの差分スペクトルの最大値である４２５ｎｍにおける吸光度の増加として追跡される。最終的なトレースは、機器の一部であるソフトウェアを使用して単一の指数関数にフィッティングされる。各実験は最低６回行われ、結果の速度が平均される。測定された解離速度は、１０ｍＭ亜ジチオン酸塩が存在する場合と存在しない場合の両方で、亜ジチオン酸濃度には依存せず、還元種のトラップとしての飽和ＣＯにも依存しない。
ｋｏｆｆを測定するために、タンパク質のＦｅＩＩ－Ｏ２錯体（５Ｍヘム）を嫌気性の５０ｍＭＴＥＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の緩衝液で希釈し、様々な濃度の亜ジチオン酸塩及び／又は飽和ＣＯガスを含む同量の同じ緩衝液（嫌気性）と急速に混合する。データは、２０℃に設定された Neslab RTE-100 恒温槽を備えたHI-TECH Scientific SF-61ストップフロー分光光度計（TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, United Kingdom）で取得する。ヘムからのＯ２の解離は、ＦｅＩＩ－ＦｅＩＩ－Ｏ２差分スペクトルの最大値である４３７ｎｍ、又はＦｅＩＩ－ＦｅＩＩ－ＣＯの差分スペクトルの最大値である４２５ｎｍにおける吸光度の増加として追跡される。最終的なトレースは、機器の一部であるソフトウェアを使用して単一の指数関数にフィッティングされる。各実験は最低６回行われ、結果の速度が平均される。測定された解離速度は、１０ｍＭ亜ジチオン酸塩が存在する場合と存在しない場合の両方で、亜ジチオン酸濃度には依存せず、還元種のトラップとしての飽和ＣＯにも依存しない。
【0136】
速度論的ＫＤ
速度論的ＫＤは、上述のｋｏｆｆ及びｋｏｎの測定値を使用して、ｋｏｆｆとｋｏｎとの比を計算することによって決定される。
速度論的ＫＤは、上述のｋｏｆｆ及びｋｏｎの測定値を使用して、ｋｏｆｆとｋｏｎとの比を計算することによって決定される。
【0137】
計算されたＫＤ
計算されたＫＤを測定するために、上記のように得られたｋｏｆｆ及び速度論的ＫＤの値がグラフ化される。ｋｏｆｆと速度論的ＫＤとの線形関係は、方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）によって定義される。次に、ｋｏｆｆ値を線に沿って補間して、エクセル：ＭＡＣ２００４（Microsoft, Redmond, WA）を使用して計算されたＫＤを得た。測定されるｋｏｎが存在しない場合、この補間はｋｏｆｆをＫＤに関連付ける方法を提供する。
計算されたＫＤを測定するために、上記のように得られたｋｏｆｆ及び速度論的ＫＤの値がグラフ化される。ｋｏｆｆと速度論的ＫＤとの線形関係は、方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）によって定義される。次に、ｋｏｆｆ値を線に沿って補間して、エクセル：ＭＡＣ２００４（Microsoft, Redmond, WA）を使用して計算されたＫＤを得た。測定されるｋｏｎが存在しない場合、この補間はｋｏｆｆをＫＤに関連付ける方法を提供する。
【0138】
自己酸化速度
自己酸化速度を測定するために、タンパク質試料を嫌気的に還元し、好気性の５０ｍＭＴＥＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の緩衝液で希釈して５μＭヘムにする。次に、これらの試料を、３７℃に設定されたNeslab RTE-100恒温槽を備えたCary3E分光光度計中でインキュベートし、定期的にスキャンする（Cary 3E, Varian, Inc., Palo Alto, CA）。自己酸化速度は、時間に対してプロットされたＦｅＩＩＩ－ＦｅＩＩ差分スペクトルの最大値と最小値の差から決定され、エクセル：ＭＡＣ２００４（Microsoft, Redmond, WA）を使用して単一の指数関数で近似される。
自己酸化速度を測定するために、タンパク質試料を嫌気的に還元し、好気性の５０ｍＭＴＥＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の緩衝液で希釈して５μＭヘムにする。次に、これらの試料を、３７℃に設定されたNeslab RTE-100恒温槽を備えたCary3E分光光度計中でインキュベートし、定期的にスキャンする（Cary 3E, Varian, Inc., Palo Alto, CA）。自己酸化速度は、時間に対してプロットされたＦｅＩＩＩ－ＦｅＩＩ差分スペクトルの最大値と最小値の差から決定され、エクセル：ＭＡＣ２００４（Microsoft, Redmond, WA）を使用して単一の指数関数で近似される。
【0139】
ＮＯとの反応速度
ＮＯ反応性は、緩衝液Ａ中２μＭで調製された精製タンパク質（Ｈ－ＮＯＸ、ポリマーＨ－ＮＯＸ、ホモサピエンスヘモグロビン（Ｈｓ Ｈｂ）など）と緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ）中２００μＭで調製されたＮＯを使用して測定される。データは、２０℃に設定された Neslab RTE-100 恒温槽を備えたHI-TECH Scientific SF-61ストップフロー分光光度計（TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, United Kingdom）で取得される。タンパク質は、０．００１２５秒の積分時間で１：１の比率でＮＯと急速に混合される。最大変化の波長は、分光計の一部であるソフトウェアを使用して単一の指数関数にフィッティングされ、基本的にＮＯによる酸化の律速段階を測定する。反応の最終生成物は、ＨＮＯＸタンパク質の場合は第二鉄ＮＯ、Ｈｓ Ｈｂの場合は第二鉄－アコ（aquo）である。
ＮＯ反応性は、緩衝液Ａ中２μＭで調製された精製タンパク質（Ｈ－ＮＯＸ、ポリマーＨ－ＮＯＸ、ホモサピエンスヘモグロビン（Ｈｓ Ｈｂ）など）と緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ）中２００μＭで調製されたＮＯを使用して測定される。データは、２０℃に設定された Neslab RTE-100 恒温槽を備えたHI-TECH Scientific SF-61ストップフロー分光光度計（TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, United Kingdom）で取得される。タンパク質は、０．００１２５秒の積分時間で１：１の比率でＮＯと急速に混合される。最大変化の波長は、分光計の一部であるソフトウェアを使用して単一の指数関数にフィッティングされ、基本的にＮＯによる酸化の律速段階を測定する。反応の最終生成物は、ＨＮＯＸタンパク質の場合は第二鉄ＮＯ、Ｈｓ Ｈｂの場合は第二鉄－アコ（aquo）である。
【0140】
ｐ５０測定値
所望であれば、変異体又は野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のｐ５０値を、Guarnone, R. et al. (September/October 1995). Haematologica 80(5):426-430（これは、特にｐ５０値の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように測定することができる。ｐ５０値は、HemOx分析装置を使用して測定される。測定チャンバーは酸素０％から開始し、酸素１００％に向かって徐々に増加する。チャンバー内の酸素プローブは酸素飽和度％を測定する。第２のプローブ（紫外－可視光）は、ヘムタンパク質（例えば、ヘムと複合体を形成したＨ－ＮＯＸなどのタンパク質）の紫外－可視スペクトルのアルファピーク及びベータピークに調整された２つの吸収波長を測定する。これらの吸収ピークは、ヘムタンパク質が酸素と結合すると直線的に増加する。次に、非結合から１００％結合への変化パーセントを酸素％値に対してプロットして、曲線を生成する。ｐ５０は、ヘムタンパク質の５０％が酸素と結合する曲線上の点である。
所望であれば、変異体又は野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のｐ５０値を、Guarnone, R. et al. (September/October 1995). Haematologica 80(5):426-430（これは、特にｐ５０値の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように測定することができる。ｐ５０値は、HemOx分析装置を使用して測定される。測定チャンバーは酸素０％から開始し、酸素１００％に向かって徐々に増加する。チャンバー内の酸素プローブは酸素飽和度％を測定する。第２のプローブ（紫外－可視光）は、ヘムタンパク質（例えば、ヘムと複合体を形成したＨ－ＮＯＸなどのタンパク質）の紫外－可視スペクトルのアルファピーク及びベータピークに調整された２つの吸収波長を測定する。これらの吸収ピークは、ヘムタンパク質が酸素と結合すると直線的に増加する。次に、非結合から１００％結合への変化パーセントを酸素％値に対してプロットして、曲線を生成する。ｐ５０は、ヘムタンパク質の５０％が酸素と結合する曲線上の点である。
【0141】
具体的には、Hemox-Analyzer（TCS Scientific Corporation, New Hope, PA）が、５０μＬの血液又はヘムタンパク質を増加する酸素分圧にさらし、これを窒素ガスで脱酸素することにより、オキシヘムタンパク質解離曲線（ＯＤＣ）を決定する。Clark 酸素電極は酸素分圧の変化を検出し、ｘ－ｙレコーダーのｘ軸上に記録される。結果として生じるオキシヘムタンパク質画分の増加は、５６０ｎｍと５７６ｎｍの二重波長分光測光法によって同時に追跡され、ｙ軸上に表示される。血液試料は前内側静脈から採取され、ヘパリンで抗凝固処理され、アッセイするまで湿った氷上で４℃に保たれる。５０μＬの全血を５μＬのHemox 溶液（溶液のｐＨを７．４±０．０１の値に保つメーカー提供の緩衝液）で希釈する。試料－緩衝液は Hemox-Analyzer の一部であるキュベットに引き込まれ、混合物の温度は平衡化されて３７℃になる。次に、試料は空気で１００％酸素化される。ｐＯ２値の調整後、試料は窒素で脱酸素される。脱酸素プロセス中に、曲線がグラフ用紙に記録される。Ｐ５０値は、Hemox-Analyzer の一部であるソフトウェアを使用して、Ｏ２飽和が５０％になる点としてｘ軸上に外挿される。完全な記録に必要な時間は約３０分である。
【0142】
Ｈ－ＮＯＸ核酸
本開示はまた、本明細書に記載の変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質、ポリマーＨ－ＮＯＸ、又は組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質サブユニットのいずれかをコードする核酸を特徴とする。
本開示はまた、本明細書に記載の変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質、ポリマーＨ－ＮＯＸ、又は組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質サブユニットのいずれかをコードする核酸を特徴とする。
【0143】
特定の実施態様において、核酸は、Ｈ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメインをコードする核酸のいずれかのセグメント又は全体の核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、核酸は、Ｈ－ＮＯＸ核酸からの少なくとも約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００個、又はそれ以上の連続ヌクレオチドを含み、１つ又はそれ以上の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の変異）を含む。様々な実施態様において、変異体Ｈ－ＮＯＸ核酸は、それが由来するＨ－ＮＯＸ核酸と比較して、約２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個少ない変異を含む。本開示はまた、変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質をコードする任意の核酸の縮重変異体を特徴とする。
【0144】
いくつかの実施態様において、核酸は、２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインをコードする核酸を含む。いくつかの実施態様において、２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメインを含む核酸は、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質が核酸から発現されるように連結される。さらなる実施態様において、核酸は、１つ又はそれ以上の重合ドメインをコードする核酸を含む。いくつかの実施態様において、２つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸドメイン及び１つ又はそれ以上の重合ドメインを含む核酸は、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質が核酸から発現されるように連結される。
【0145】
いくつかの実施態様において、核酸は、重合ドメインをコードする任意の核酸のセグメント又は核酸配列全体を含む。いくつかの実施態様において、核酸は、Ｈ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインをコードする核酸を含む。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインをコードする核酸及び重合ドメインをコードする核酸は、生成されるポリペプチドがＨ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む融合タンパク質となるように連結される。
【0146】
いくつかの実施態様において、核酸は、１つ又はそれ以上のＨｉｓ６タグをコードする核酸を含む。いくつかの実施態様において、核酸は、Ｈ－ＮＯＸドメイン、重合ドメイン、及び／又はＨｉｓ６タグをコードする核酸の間に位置するリンカー配列をコードする核酸をさらに含む。
【0147】
いくつかの実施態様において、本開示は、Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインである。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは野生型Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインである。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメインである。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメインである。
【0148】
いくつかの実施態様において、本開示は、以下の５’～３’をコードする核酸を提供する：Ｌ１４４Ｆ Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、及びフォルドンドメイン。いくつかの実施態様において、本開示は、以下の５’～３’をコードする核酸を提供する：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、及びフォルドンドメイン。いくつかの実施態様において、本開示は、以下の５’～３’をコードする核酸を提供する：野生型Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、及びフォルドンドメイン。
【0149】
いくつかの実施態様において、本開示は、以下の５’～３’をコードする核酸を提供する：Ｌ１４４Ｆ Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー配列、及びＨｉｓ６タグ。いくつかの実施態様において、本開示は、以下の５’～３’をコードする核酸を提供する：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー配列、及びＨｉｓ６タグ。いくつかの実施態様において、本開示は、以下の５’～３’をコードする核酸を提供する：野生型Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー配列、及びＨｉｓ６タグ。
【0150】
いくつかの実施態様において、核酸は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、又は配列番号１１に記載の核酸配列を含む。
【0151】
本開示はまた、本明細書に記載の変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む細胞又は細胞集団を含む。例示的な細胞には、昆虫、植物、酵母、細菌、及び哺乳動物の細胞が含まれる。これらの細胞は、本明細書に記載されるような標準的な方法を使用する変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質の産生に有用である。
【0152】
いくつかの実施態様において、本開示は、Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインをコードする核酸を含む細胞を提供する。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインである。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは野生型Ｔ．テンコンジェンシスＨ－ＮＯＸドメインである。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメインである。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸドメインは、Ｔ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメインである。いくつかの実施態様において、本開示は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、又は配列番号１１に記載の核酸配列を含む核酸を含む細胞を提供する。
【0153】
Ｈ－ＮＯＸタンパク質の製剤
本明細書に記載の任意の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質（重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む）は、医薬組成物又は非医薬組成物の製剤に使用され得る。いくつかの実施態様において、製剤は、単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質がインビトロ又はインビボで会合して重合体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を生成するように、Ｈ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む。以下でさらに説明するように、これらの製剤は様々な治療及び産業用途に有用である。
本明細書に記載の任意の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質（重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む）は、医薬組成物又は非医薬組成物の製剤に使用され得る。いくつかの実施態様において、製剤は、単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質がインビトロ又はインビボで会合して重合体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を生成するように、Ｈ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む。以下でさらに説明するように、これらの製剤は様々な治療及び産業用途に有用である。
【0154】
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む、本明細書に記載の１つ若しくはそれ以上の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質、及び医薬的に許容し得る担体又は賦形剤を含む。医薬的に許容し得る担体又は賦形剤の例には、限定されるものではないが、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、及び様々なタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体又は賦形剤のいずれかが含まれる。エアロゾル又は非経口投与のための例示的な希釈剤は、リン酸緩衝化生理食塩水又は通常（０．９％）の生理食塩水である。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000を参照、これらはそれぞれ、特に製剤に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施態様において、製剤は無菌である。いくつかの実施態様において、製剤は本質的にエンドトキシンを含まない。
【0155】
当業者に公知の任意の適切な担体を本開示の医薬組成物に使用することができるが、担体の種類は投与様式に応じて変化するであろう。組成物は、例えば、静脈内、動脈内、小胞内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、くも膜下腔内、又は経皮投与を含む、任意の適切な投与方法用に製剤化することができる。皮下注射などの非経口投与の場合、担体には、例えば、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、又は緩衝液が含まれ得る。経口投与の場合、上記担体のいずれか、又は固体担体、例えばマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、又は炭酸マグネシウムを使用することができる。生分解性微小球（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）も担体として使用することができる。
【0156】
いくつかの実施態様において、医薬組成物又は非医薬組成物には、緩衝液（例えば、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水など）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストランなど）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、グルタチオンなど）、保存剤、酸素の結合及び／又は輸送に有用な別の化合物、不活性成分（例えば、安定剤、充填剤など）、又は前述の２つ又はそれ以上の組み合わせが含まれる。いくつかの実施態様において、組成物は凍結乾燥物として製剤化される。Ｈ－ＮＯＸタンパク質はまた、周知の技術を使用してリポソーム又はナノ粒子内にカプセル化することもできる。Ｈ－ＮＯＸタンパク質に使用することができる他の例示的な配合物は、例えば、米国特許第６，９７４，７９５号及び６，４３２，９１８号に記載されており、これらはそれぞれ、特にタンパク質の製剤に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0157】
本明細書に記載の組成物は、徐放性製剤（例えば、投与後に化合物の徐放を生じるカプセル又はスポンジなどの製剤）の一部として投与することができる。このような製剤は一般に、周知の技術を使用して調製し、例えば、経口、直腸、又は皮下の移植によって、又は所望の標的部位への移植によって投与することができる。徐放性製剤は、担体マトリックス中に分散された、及び／又は速度制御膜で囲まれたリザーバー内に含まれたＨ－ＮＯＸタンパク質を含み得る。このような製剤内で使用される担体は生体適合性があり、また生分解性であってもよい。いくつかの実施態様において、製剤は、比較的一定のレベルのＨ－ＮＯＸタンパク質放出を提供する。徐放性製剤に含まれるＨ－ＮＯＸタンパク質の量は、移植部位、放出速度と予測される放出期間、治療又は予防される症状の性質によって異なる。
【0158】
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、有効量の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、２つ又はそれ以上の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸドメインを含む有効量の重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、本明細書に記載の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む有効量の組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、製剤は、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体はＴ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、製剤は、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、製剤は、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体はＴ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。
【0159】
血液代替物としてのヘモグロビンの例示的な用量は、患者の体重１キログラム当たり約１０ｍ～約５グラム以上の細胞外ヘモグロビンである。従って、いくつかの実施態様において、ヒトに投与するためのＨ－ＮＯＸタンパク質の有効量は、数グラムから約３５０グラムを超えるまでの間である。Ｈ－ＮＯＸタンパク質の他の例示的な用量には、適切な注入速度、例えば約０．５ｍｌ／分で、約４．４、５、１０、又は１３Ｇ／ＤＬ（ここで、Ｇ／ＤＬは循環への注入前のＨ－ＮＯＸタンパク質溶液の濃度である）のいずれかを含む（例えば、Winslow, R. Chapter 12 In Blood Substitutes を参照）。必要な有効量は複数回の投与の組合わせ効果によって達成され得るため、各剤形の個々の用量に含まれる有効成分の単位含有量がそれ自体で有効量を構成する必要はないことが理解されるであろう。医薬組成物に含まれるＨ－ＮＯＸタンパク質の量の選択は、当業者の決定に従って、利用される剤形、治療される状態、及び達成される特定の目的に依存する。
【0160】
例示的な組成物には、遺伝的に工学作成された組換えＨ－ＮＯＸタンパク質が含まれ、これは、単離又は精製することができ、対応する野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質と比較して、改変されたＯ２又はＮＯリガンド結合を集合的に付与し、生理学的に適合する哺乳動物の血液ガス担体として機能する、１つ又はそれ以上の突然変異を含む。例えば、本明細書に記載の変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質である。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、本明細書に記載の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質である。いくつかの実施態様において、組成物は、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体はＴ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、組成物は、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、組成物は、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体はＴ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。
【0161】
医薬組成物を投与されたヒト被験体における免疫応答を軽減又は予防するために、ヒトＨ－ＮＯＸタンパク質若しくはドメイン（野生型ヒトタンパク質、又は１つ又はそれ以上の突然変異が導入されたヒトタンパク質のいずれか）、又は他の非抗原性Ｈ－ＮＯＸタンパク質又はドメイン（例えば、哺乳動物のＨ－ＮＯＸタンパク質）を使用することができる。ヒト以外の起源に由来するＨ－ＮＯＸタンパク質の免疫原性を軽減又は排除するために、Ｈ－ＮＯＸタンパク質又はＨ－ＮＯＸドメイン中のアミノ酸をヒトＨ－ＮＯＸの対応するアミノ酸に変異させることができる。例えば、非ヒトＨ－ＮＯＸタンパク質の三次構造の表面上の１つ又はそれ以上のアミノ酸を、ヒトＨ－ＮＯＸタンパク質の対応するアミノ酸に変異させることができる。
【0162】
Ｈ－ＮＯＸタンパク質の治療への応用
本明細書に記載の重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む野生型若しくは変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質、又は医薬組成物のいずれも、治療用途に使用することができる。
本明細書に記載の重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む野生型若しくは変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質、又は医薬組成物のいずれも、治療用途に使用することができる。
【0163】
重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む特定のＨ－ＮＯＸタンパク質は、所望のＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合の解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、自己酸化速度、血漿保持時間、又は治療される特定の症状に対する前述の２つ又はそれ以上の任意の組み合わせに基づいて、そのような用途のために選択することができる。
【0164】
細胞外Ｈ－ＮＯＸタンパク質の血管系における分布は赤血球のサイズによって制限されないため、本開示の重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を使用して、赤血球が通過できない領域にＯ２を送達することができる。これらの領域には、赤血球の流れに対する障害の下流に位置する任意の組織領域、例えば、１つ又はそれ以上の血栓、鎌状赤血球閉塞、動脈閉塞、末梢血管閉塞、血管形成バルーン、手術器具、酸素欠乏又は低酸素状態を患っている組織の下流領域などが含まれる。さらに、Ｈ－ＮＯＸタンパク質を使用して、あらゆるタイプの組織虚血を治療することができる。このような組織虚血としては、例えば、周術期虚血、脳卒中、新興脳卒中、一過性虚血発作、心筋気絶及び休止状態、急性又は不安定狭心症、新興狭心症、及び心筋梗塞（例えば、ＳＴ上昇心筋梗塞）が含まれる。Ｈ－ＮＯＸタンパク質を使用して治療することができる他の例示的な心血管適応症には、心筋麻痺及び鎌状赤血球貧血が含まれる。例示的な標的適応症には、機能的ヘモグロビン欠乏症の状態、例えば、失血、低酸素症などを含む、血液代替物又はＯ２担体が必要な場合などが含まれる。
【0165】
特定の態様において、本開示は、ドナーの脳死後の提供又はドナーの心臓死後の提供において臓器を保存するために、Ｈ－ＮＯＸタンパク質を使用してＯ２を送達する方法を提供する。従って、臓器の保存は、死亡したドナーの原位置で直接、又は原位置外（例えば、必要に応じて背面のテーブル上）で行われる。本開示による組成物は、様々な移植臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、腸、角膜など）の採取を待っているドナーに直接灌流することができる。
【0166】
本開示によれば、臓器保存はドナーの死後に直接行うことができる。死亡したドナーは脳死状態又は心停止状態にある可能性がある。後者の場合、心拍のない臓器の調達が指示される。保存液はまた、静的保存剤として、又はポンプを介して流し続ける灌流型保存剤としても使用することができる。どちらの方法も使用されているか又は使用するために開発されており、Ｈ－ＮＯＸタンパク質はどちらの方法でも使用することができる。
【0167】
本明細書に記載の方法において、不可逆性昏睡又はステージＩＶ昏睡としても知られる脳死は、血液循環が持続しているが、脳活動が完全かつ決定的に不可逆的に停止していると定義される。臓器の血行力学的活動や血管新生が一時的に持続しているにもかかわらず、脳が不可逆的に破壊されると、ドナーは脳死（brain death）又は脳死（encephalic death）の状態になる。
【0168】
本明細書に記載の方法において、心肺機能蘇生措置が中止された後にこの心停止が不可逆的である場合、ドナーは心停止している。心停止が不可逆的であるとみなされるまでの時間は、心肺機能蘇生措置が中止されてから約１分である。ただし、５分以上の時間が必要であると推奨されている。
【0169】
従って、本開示は、ドナーの脳死又は心臓死後に提供用臓器を保存する方法であって、少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質、安定化溶液、及び／又は臓器保存溶液を含む組成物をドナーに投与することを含む方法を提供し、ここで、組成物は０℃～３７℃の温度にある。
【0170】
本開示はまた、脳死後提供ドナー又は心臓死後提供ドナーにおいて臓器を原位置外で保存する方法を提供し、この方法は、ａ）本明細書に記載の組成物による前記死亡したドナーを灌流する工程、次にｂ）移植すべき臓器を採取する工程、次にｃ）工程ｂ）で得られた前記臓器を、工程ａ）で規定された組成物又は水溶液中で、０℃～３７℃の間の温度で、前記臓器に応じて所定の時間、静的又は動的灌流保存する工程を含む。
【0171】
本開示の方法では、臓器保存はまた、臓器がドナーから摘出された死後に行うこともできる。保存溶液はまた、静的保存剤として、又はポンプを介して流し続ける灌流型保存剤として使用することもできる。例として、いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸ生成物は、保管、輸送、及び最終的なレシピエントへの移植に備えてドナーから取り出されるときに、１つ又はそれ以上の臓器に投与することができる。他の実施態様において、Ｈ－ＮＯＸ生成物は、結果として１つ又はそれ以上の臓器が低酸素損傷を受けている期間、ドナーから摘出された１つ又はそれ以上の臓器に投与することができる。
【0172】
１つの態様において、本開示は、臓器を原位置外で保存するための方法を提供し、この方法は、ａ）移植すべき臓器を採取する工程、次にｂ）工程ａ）で得られた前記臓器を、本明細書に記載の組成物又は水溶液中で、０℃～３７℃の温度で、前記臓器に応じて所定の時間、静的又は動的灌流状態に維持する工程を含む。
【0173】
上述したように、本発明による組成物は、少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質と、安定化溶液、及び／又は臓器保存溶液を含む。いくつかの実施態様において、臓器保存溶液は静的ベースの保存に使用するためのものである。他の実施態様において、臓器保存溶液は、灌流ベースの保存に使用するためのものである。灌流ポンプを使用する正常体温臓器の保存などの一部の用途では、溶液はＨ－ＮＯＸベースの生成物を補足した全血でもよい。これにより、Ｈ－ＮＯＸ製品のより高いＯ２親和性を利用して、Ｏ２送達範囲を拡張することができる可能性があり、高度に低酸素の組織などで血液からのＯ２が枯渇した場合でも、Ｈ－ＮＯＸ生成物は依然としてＯ２に結合しており、従って、Ｏ２を供給し続けるであろう。
【0174】
この溶液は、移植臓器を構成する細胞の基礎代謝を維持することを可能にする。これは、３つの目的を満たす：移植臓器から動脈血を洗浄すること、移植臓器を均一に所望の保存温度にすること、及び虚血と再灌流による損傷を防御及び予防し、そして機能の再開を最適化すること。従って、臓器保存液は臨床的に許容される。
【0175】
本明細書に記載される安定化溶液は、例えば、塩を含む水溶液であり得、６．５～７．６のｐＨを含む。少なくとも１つの実施態様において、溶液はナトリウムイオンを含む水溶液である。
【0176】
少なくとも１つの実施態様において、安定化溶液は、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのグルタチオン、及び０．１％のポロキサマー１８８を含むｐＨ６．８±０．２の水溶液である。
【0177】
臓器保存溶液は、６．５～７．５のｐＨを有する水溶液であり得、塩、好ましくは好ましくは塩化物、硫酸塩、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及びカリウムイオン；糖類、好ましくはマンニトール、ラフィノース、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトビオネート（これは非透過性（imper-meant）である）、又はグルコン酸塩；抗酸化剤、好ましくはグルタチオン；活性剤、好ましくはキサンチンオキシダーゼ阻害剤、例えばアロプリノール、乳酸塩、アミノ酸、例えばヒスチジン、グルタミン酸（又はグルタミン酸塩）、又はトリプトファン；及び、任意選択的に、コロイド、例えばヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、又はデキストランを含む。
【0178】
本開示の１つの好適な実施態様によれば、臓器保存溶液は以下から選択される：
University of Wisconsin （UW又はViaspan（登録商標））溶液、これは、オスモル濃度３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ及びｐＨ７．４を有し、水１リットル当たり以下の配合を有する：
ラクトビオン酸カリウム：１００ｍＭ
ＫＯＨ：１００ｍＭ
ＮａＯＨ：２７ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：２５ｍＭ
ＭｇＳＯ４：５ｍＭ
ラフィノース：３０ｍＭ
アデノシン：５ｍＭ
グルタチオン：３ｍＭ
アロプリノール：１ｍＭ
ヒドロキシエチルデンプン：５０ｇ／１；
IGL-1（登録商標）、これは、オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ及びｐＨ７．４を有し、水１リットル当たり以下の配合を有する：
塩化ナトリウム：１２５ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：２５ｍＭ
ＭｇＳＯ４：５ｍＭ
ラフィノース：３０ｍＭ
ラクトビオン酸カリウム：１００ｍＭ
グルタチオン：３ｍＭ
アロプリノール：１ｍＭ
アデノシン：５ｍＭ
ポリエチレングリコール（分子量：３５ｋＤａ）：１ｇ／ｌ；
Celsior（登録商標）、これは、オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ及びｐＨ７．３を有し、水１リットル当たり以下の配合を有する：
グルタチオン：３ｍＭ
マンニトール：６０ｍＭ
ラクトビオン酸：８０ｍＭ
グルタミン酸：２０ｍＭ
ＮａＯＨ：１００ｍＭ
塩化カルシウム二水和物：０．２５ｍＭ
ＭｇＳＯ４：１．２ｍＭ
ＫＣ１：１５ｍＭ
塩化マグネシウム六水和物：１３ｍＭ
ヒスチジン：３０ｍＭ；
Macopharma 製の SCOT 15 Multi Organes Abdominaux（登録商標）及び SCOT 30 Greffons Vasculaires（登録商標）、両方とも、特に高分子量（２０ｋＤａ）ポリエチレングリコールを含む；BMPS Belzer（登録商標）又は Belzer 機械灌流溶液、又はKPS1、特に１００ｍＥｑ／ｌのナトリウム、２５ｍＥｑ／ｌのカリウムを含み、周囲温度でｐＨ７．４であり、及びオスモル濃度３００ｍＯｓｍ／ｌを有する；
Custodiol（登録商標）HTK溶液、これは水１リットル当たり以下の配合を有し、ｐＨは周囲温度で７．２０であり、オスモル濃度３１０ｍＯｓｍ／ｋｇを有する：
ＮａＣｌ：１８．０ｍＭ
ＫＣ１：１５．０ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：９ｍＭ
水素化２－ケトグルタル酸カリウム：１．０ｍＭ塩化マグネシウム六水和物：４．０ｍＭヒスチジン・ＨＣｌ．Ｈ２Ｏ：１８．０ｍＭ
ヒスチジン：１９８．０ｍＭ
トリプトファン：２．０ｍＭ
マンニトール：３０．０ｍＭ
塩化カルシウム二水和物：０．０１５ｍＭ；
Euro-Collins（登録商標）、これは、オスモル濃度３５５ｍＯｓｍ／ｋｇ及びｐＨ７．０を有し、水１リットル当たり以下の配合を有する：
ナトリウム：１０ｍＭ
カリウム：１１５ｍＭ
塩化物：１５ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４ －：１５ｍＭ
ＨＰＯ４ ２－：４２．５ｍＭ
ＨＣＯ３ －：１０ｍＭ
グルコース：１９４ｍＭ；
Soltran（登録商標）、これは、オスモル濃度４８６ｍＯｓｍ／ｋｇ及びｐＨ７．１を有し、水１リットル当たり以下の配合を有する：
ナトリウム：８４ｍＭ
カリウム：８０ｍＭ
マグネシウム：４１ｍＭ
硫酸塩－：４１ｍＭ
マンニトール：３３．８ｇ／１
クエン酸塩：５４ｍＭ
グルコース：１９４ｍＭ；
Perfadex（登録商標）、これは、オスモル濃度２９５ｍＯｓｍｏ１／１を有し、水中で以下の配合を有する：５０ｇ／１の デキストラン４０（分子量４０，０００）：
Ｎａ：１３８ｍＭ、
Ｋ＋：６ｍＭ、
Ｍｇ２＋：０．８ｍＭ、
Ｃ１－：１４２ｍＭ、
ＳＯ４ ２－：０．８ｍＭ、
（Ｈ２ＰＯ４ －－ＨＰＯ４ ２－）：０．８ｍＭ、及び
グルコース：５ｍＭ；
Ringer Lactate（登録商標））、これは、水中で以下の配合を有し、ｐＨは周囲温度で６．０～７．５であり、オスモル濃度２７６．８ｍＯｓｍｏ１／１を有する：
Ｎａ＋：１３０ｍＭ、
Ｋ＋：５．４ｍＭ、
Ｃａ２＋：１．８ｍＭ、
Ｃ１－：１１１ｍＭ、
乳酸塩：２７．７ｍＭ；
Plegisol（登録商標）、これは、水中で以下の配合を有する：
ＫＣ１：１．１９３ｇ／１、
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：３．２５３ｇ／ｌ、
ＮａＣｌ：６．４３ｇ／１、
ＣａＣｌ２：０．１７６ｇ／ｌ；
Edouard Henriot 病院の溶液、これは、水中で以下の配合を有し、ｐＨは周囲温度で７．４に等しく、オスモル濃度３２０ｍＯｓｍｏ１／１を有する：
ＫＯＨ：２５ｍＭ、
ＮａＯＨ：１２５ｍＭ、
ＫＨ２ＰＯ４：２５ｍＭ、
ＭｇＣｌ２：５ｍＭ、
ＭｇＳＯ４：５ｍＭ、
ラフィノース：３０ｍＭ、
ラクトビオネート：１００ｍＭ、
グルタチオン：３ｍＭ、
アロプリノール：１ｍＭ、
アデノシン：５ｍＭ、
ヒドロキシエチルデンプン：５０ｇ／１；
及び、Steen（登録商標）溶液、これは、ヒト血清アルブミン、デキストラン、及び低カリウム濃度の細胞外電解質を含む。これらの臓器保存液はいずれも市販品である。
University of Wisconsin （UW又はViaspan（登録商標））溶液、これは、オスモル濃度３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ及びｐＨ７．４を有し、水１リットル当たり以下の配合を有する：
ラクトビオン酸カリウム：１００ｍＭ
ＫＯＨ：１００ｍＭ
ＮａＯＨ：２７ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：２５ｍＭ
ＭｇＳＯ４：５ｍＭ
ラフィノース：３０ｍＭ
アデノシン：５ｍＭ
グルタチオン：３ｍＭ
アロプリノール：１ｍＭ
ヒドロキシエチルデンプン：５０ｇ／１；
IGL-1（登録商標）、これは、オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ及びｐＨ７．４を有し、水１リットル当たり以下の配合を有する：
塩化ナトリウム：１２５ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：２５ｍＭ
ＭｇＳＯ４：５ｍＭ
ラフィノース：３０ｍＭ
ラクトビオン酸カリウム：１００ｍＭ
グルタチオン：３ｍＭ
アロプリノール：１ｍＭ
アデノシン：５ｍＭ
ポリエチレングリコール（分子量：３５ｋＤａ）：１ｇ／ｌ；
Celsior（登録商標）、これは、オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ及びｐＨ７．３を有し、水１リットル当たり以下の配合を有する：
グルタチオン：３ｍＭ
マンニトール：６０ｍＭ
ラクトビオン酸：８０ｍＭ
グルタミン酸：２０ｍＭ
ＮａＯＨ：１００ｍＭ
塩化カルシウム二水和物：０．２５ｍＭ
ＭｇＳＯ４：１．２ｍＭ
ＫＣ１：１５ｍＭ
塩化マグネシウム六水和物：１３ｍＭ
ヒスチジン：３０ｍＭ；
Macopharma 製の SCOT 15 Multi Organes Abdominaux（登録商標）及び SCOT 30 Greffons Vasculaires（登録商標）、両方とも、特に高分子量（２０ｋＤａ）ポリエチレングリコールを含む；BMPS Belzer（登録商標）又は Belzer 機械灌流溶液、又はKPS1、特に１００ｍＥｑ／ｌのナトリウム、２５ｍＥｑ／ｌのカリウムを含み、周囲温度でｐＨ７．４であり、及びオスモル濃度３００ｍＯｓｍ／ｌを有する；
Custodiol（登録商標）HTK溶液、これは水１リットル当たり以下の配合を有し、ｐＨは周囲温度で７．２０であり、オスモル濃度３１０ｍＯｓｍ／ｋｇを有する：
ＮａＣｌ：１８．０ｍＭ
ＫＣ１：１５．０ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：９ｍＭ
水素化２－ケトグルタル酸カリウム：１．０ｍＭ塩化マグネシウム六水和物：４．０ｍＭヒスチジン・ＨＣｌ．Ｈ２Ｏ：１８．０ｍＭ
ヒスチジン：１９８．０ｍＭ
トリプトファン：２．０ｍＭ
マンニトール：３０．０ｍＭ
塩化カルシウム二水和物：０．０１５ｍＭ；
Euro-Collins（登録商標）、これは、オスモル濃度３５５ｍＯｓｍ／ｋｇ及びｐＨ７．０を有し、水１リットル当たり以下の配合を有する：
ナトリウム：１０ｍＭ
カリウム：１１５ｍＭ
塩化物：１５ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４ －：１５ｍＭ
ＨＰＯ４ ２－：４２．５ｍＭ
ＨＣＯ３ －：１０ｍＭ
グルコース：１９４ｍＭ；
Soltran（登録商標）、これは、オスモル濃度４８６ｍＯｓｍ／ｋｇ及びｐＨ７．１を有し、水１リットル当たり以下の配合を有する：
ナトリウム：８４ｍＭ
カリウム：８０ｍＭ
マグネシウム：４１ｍＭ
硫酸塩－：４１ｍＭ
マンニトール：３３．８ｇ／１
クエン酸塩：５４ｍＭ
グルコース：１９４ｍＭ；
Perfadex（登録商標）、これは、オスモル濃度２９５ｍＯｓｍｏ１／１を有し、水中で以下の配合を有する：５０ｇ／１の デキストラン４０（分子量４０，０００）：
Ｎａ：１３８ｍＭ、
Ｋ＋：６ｍＭ、
Ｍｇ２＋：０．８ｍＭ、
Ｃ１－：１４２ｍＭ、
ＳＯ４ ２－：０．８ｍＭ、
（Ｈ２ＰＯ４ －－ＨＰＯ４ ２－）：０．８ｍＭ、及び
グルコース：５ｍＭ；
Ringer Lactate（登録商標））、これは、水中で以下の配合を有し、ｐＨは周囲温度で６．０～７．５であり、オスモル濃度２７６．８ｍＯｓｍｏ１／１を有する：
Ｎａ＋：１３０ｍＭ、
Ｋ＋：５．４ｍＭ、
Ｃａ２＋：１．８ｍＭ、
Ｃ１－：１１１ｍＭ、
乳酸塩：２７．７ｍＭ；
Plegisol（登録商標）、これは、水中で以下の配合を有する：
ＫＣ１：１．１９３ｇ／１、
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：３．２５３ｇ／ｌ、
ＮａＣｌ：６．４３ｇ／１、
ＣａＣｌ２：０．１７６ｇ／ｌ；
Edouard Henriot 病院の溶液、これは、水中で以下の配合を有し、ｐＨは周囲温度で７．４に等しく、オスモル濃度３２０ｍＯｓｍｏ１／１を有する：
ＫＯＨ：２５ｍＭ、
ＮａＯＨ：１２５ｍＭ、
ＫＨ２ＰＯ４：２５ｍＭ、
ＭｇＣｌ２：５ｍＭ、
ＭｇＳＯ４：５ｍＭ、
ラフィノース：３０ｍＭ、
ラクトビオネート：１００ｍＭ、
グルタチオン：３ｍＭ、
アロプリノール：１ｍＭ、
アデノシン：５ｍＭ、
ヒドロキシエチルデンプン：５０ｇ／１；
及び、Steen（登録商標）溶液、これは、ヒト血清アルブミン、デキストラン、及び低カリウム濃度の細胞外電解質を含む。これらの臓器保存液はいずれも市販品である。
【0179】
別の実施態様において、臓器保存溶液は、水中で次の配合を有するUniversity of Wisconsin の機械灌流溶液であり、水中で以下の配合を有する：
塩化カルシウム（無水物）：０．５ｍＭ、
水酸化ナトリウム：１８ｍＭ、
ヘペス（遊離酸）：１０ｍＭ、
リン酸カリウム（一塩基性）：２５ｍＭ、
マンニトール（ＵＳＰ）：３０ｍＭ、
ベータＤ（＋）グルコース：１０ｍＭ、
グルコン酸ナトリウム：８０ｍＭ、
グルコン酸マグネシウムＤ（－）グルコン酸、ヘミマグネシウム塩：５ｍＭ、
リボース、Ｄ（－）：５ｍＭ、
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）：５０ｇ／ｌ、
グルタチオン、還元型：３ｍＭ、
アデニン（遊離塩基）：５ｍＭ。
塩化カルシウム（無水物）：０．５ｍＭ、
水酸化ナトリウム：１８ｍＭ、
ヘペス（遊離酸）：１０ｍＭ、
リン酸カリウム（一塩基性）：２５ｍＭ、
マンニトール（ＵＳＰ）：３０ｍＭ、
ベータＤ（＋）グルコース：１０ｍＭ、
グルコン酸ナトリウム：８０ｍＭ、
グルコン酸マグネシウムＤ（－）グルコン酸、ヘミマグネシウム塩：５ｍＭ、
リボース、Ｄ（－）：５ｍＭ、
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）：５０ｇ／ｌ、
グルタチオン、還元型：３ｍＭ、
アデニン（遊離塩基）：５ｍＭ。
【0180】
１つの好適な実施態様によれば、本開示による組成物の温度は、０℃～３７℃、好ましくは２℃～３２℃、好ましくは４℃～２５℃、及びより好ましくは約４℃である。
【0181】
本開示による組成物は、低体温条件下及び正常温度条件（生理学的温度に近い）の両方で機能することを可能にする。
【0182】
追加の組成物も本明細書で企図される。１つの態様において、本開示は、６．５～７．６のｐＨを有する組成物に関し、この組成物は以下を含む：少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質；カルシウムイオン、好ましくは０～０．５ｍＭの量；ＫＯＨ、好ましくは２０～１００ｍＭの量；ＮａＯＨ、好ましくは２０～１２５ｍＭの量；ＫＨ２ＰＯ４、好ましくは２０～２５ｍＭの量；ＭｇＣｌ２、好ましくは３～５ｍＭの量；ラフィノース及びグルコースから選択される少なくとも１つの糖、好ましくは５～２００ｍＭの量；アデノシン、好ましくは３～５ｍＭの量；グルタチオン、好ましくは２～４ｍＭの量；アロプリノール、好ましくは０～１ｍＭの量；及び、ヒドロキシエチルデンプン、様々な分子量のポリエチレングリコール、及びヒト血清アルブミンから選択される少なくとも１つの化合物、好ましくは１～５０ｇ／ｌの量。
【0183】
別の態様において、本開示は、６．５～７．６のｐＨを有する組成物に関し、この組成物は以下を含む：少なくとも１つのＨ－ＮＯＸタンパク質；カルシウムイオン、好ましくは０～０．５ｍＭの量；ＮａＯＨ、好ましくは１５～３０ｍＭの量；ヘペス、好ましくは２～１０ｍＭの量；ＫＨ２ＰＯ４、好ましくは２０～２５ｍＭの量；マンニトール、好ましくは２０～３５ｍＭの量；グルコース、好ましくは３～１０ｍＭの量；グルコン酸ナトリウム、好ましくは５０～１００ｍＭの量；グルコン酸マグネシウム、好ましくは１～５ｍＭの量；リボース、好ましくは２～５ｍＭの量；ヒドロキシエチルデンプン、様々な分子量のポリエチレングリコール、及びヒト血清アルブミンから選択される少なくとも１つの化合物、好ましくは１～５０ｇ／ｌの量；グルタチオン、好ましくは２～４ｍＭの量；及びアデニン、好ましくは３～５ｍＭの量。
【0184】
様々な実施態様において、本開示は、ドナーにＯ２を送達するのに十分な量の重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を、それを必要とするドナーに投与することにより、臓器ドナー［例えば、哺乳動物、例えば霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、又はネコ］にＯ２を送達する方法を特徴とする。いくつかの実施態様において、本開示は、哺乳動物などのドナーに血液ガスを運ぶ又は送達する方法を提供し、個体（例えば、哺乳動物）の血液に１つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸ組成物を送達（例えば、輸血など）する工程を含む。Ｏ２担体を血液又は組織（例えば、哺乳動物の血液又は組織）に送達するための方法は、当技術分野で知られている。様々な実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質、又はヘムが結合したホロタンパク質である。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、ドナーへのＨ－ＮＯＸタンパク質の投与前にヘム結合していてもしていなくてもよい。いくつかの実施態様において、Ｏ２は、ドナーに送達される前にＨ－ＮＯＸタンパク質に結合している。他の実施態様において、Ｏ２は、ドナーへのタンパク質の投与前にＨ－ＮＯＸタンパク質に結合しておらず、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、Ｏ２をドナーのある場所からドナー内の別の場所へ輸送する。
【0185】
Ｏ２に対する比較的低いＫＤ（例えば、約８０ｎＭ未満又は約５０ｎＭ未満）を有する、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む野生型及び変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、酸素分圧が低い組織（例えば、腫瘍、一部の創傷、又は酸素分圧が非常に低い、例えばｐ５０が１ｍｍＨｇ未満の他の領域）の治療に特に有用であると期待される。このようなＨ－ＮＯＸタンパク質のＯ２に対する高い親和性により、Ｏ２がＨ－ＮＯＸタンパク質に結合したままになる時間が長くなり、それによってＨ－ＮＯＸタンパク質が治療を受ける組織に到達する前に放出されるＯ２の量が減少する可能性がある。
【0186】
Ｏ２が結合したＨ－ＮＯＸタンパク質を体内の特定の部位（例えば、移植部位に必要な臓器の部位）に直接送達するためのいくつかの実施態様において、Ｏ２はすでにタンパク質に結合しており（ｋｏｎの重要性が低くなる）、酸素は体内の特定の部位又はその近くで（ｋｏｆｆの影響を受ける速度で）放出される必要があるため、Ｏ２のｋｏｆｆはＫＤ値よりも重要である。いくつかの実施態様において、ｋｏｆｆはまた、Ｈ－ＮＯＸタンパク質が循環中の赤血球の存在下にある場合にも重要である可能性があり、ここで、これらは赤血球からのＯ２の拡散を促進し、おそらく、希釈された赤血球が血管系のさらなる点にＯ２を輸送する能力を延長する。
【0187】
個体の血流中を循環するＨ－ＮＯＸタンパク質を送達するためのいくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は肺でＯ２に結合し、体内の１つ又はそれ以上の他の部位でＯ２を放出する。これらの適用の一部では、Ｏ２結合が平衡又は平衡に近いため、ＫＤ値はｋｏｆｆよりも重要である。極端な血液希釈のためのいくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質が循環中を移動する際にＯ２に結合し、継続的にＯ２を放出するため、Ｈ－ＮＯＸタンパク質が主要なＯ２担体である場合、ＫＤはｋｏｆｆよりも重要である。ヘモグロビンのｐ５０は１４ｍｍＨｇであるため、赤血球（コンデンサーのように機能する）のｐ５０は約３０ｍｍＨｇであり、ＨＢＯＣは５ｍｍＨｇ～９０ｍｍＨｇの範囲で開発されているため、いくつかの用途について、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の最適なＫＤ範囲は約２ｍｍＨｇ～約１００ｍｍＨｇである可能性がある。
【0188】
本開示の重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むＨ－ＮＯＸタンパク質及び医薬組成物は、任意の従来の手段、例えば経口、局所、眼内、くも膜下腔内、肺内、気管内、又はエアロゾル投与によって；経皮又は粘膜吸着によって；又は注射（例えば、皮下、静脈内、動脈内、小胞内、又は筋肉内注射）によって、個体に投与することができる。Ｈ－ＮＯＸタンパク質はまた、代用血液として使用するために、大量の非経口溶液に含まれる場合もある。例示的な実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、個体の血液（例えば、静脈、動脈、又は毛細血管などの血管への投与）、創傷、腫瘍、低酸素組織、又は低酸素臓器に投与される。
【0189】
いくつかの実施態様において、組成物の徐放性連続放出製剤が使用される。Ｈ－ＮＯＸタンパク質の投与は、投与の目的に応じて、例えば数秒から数時間の期間にわたって行われ得る。例えば、血液送達ビヒクルとして、例示的な投与時間経過は、可能な限り迅速である。他の例示的な時間経過には、約１０、２０、３０、４０、６０、９０、又は１２０分のいずれかが含まれる。血液代替物としてのＨ－ＮＯＸ溶液の例示的な注入速度は、約３０ｍＬ／時間～約１３，２６０ｍＬ／時間、例えば、約１００ｍＬ／時間～約３，０００ｍＬ／時間である。Ｈ－ＮＯＸタンパク質の例示的な総用量は、１３，２６０ｍＬ／時間で２０分間かけて約９００ｍｇ／ｋｇが投与される。ブタに対するＨ－ＮＯＸタンパク質の例示的な総用量は、約１８．９グラムである。
【0190】
本開示による組成物は、好ましくは注射、特に血管内注射によって投与される。これはまた、正常体温体外膜酸素化（正常体温ＥＣＭＯ）によって、すなわち、動脈カテーテル、静脈カテーテル、及びフォガティカテーテルを用いて、又はドナーの全身冷却のための低体温体外膜酸素化（低体温ＥＣＭＯ）によって投与することもできる。これはまた、ダブルバルーントリプルルーメンカテーテル又は他の同様の技術を使用して投与することもできる。
【0191】
正常体温ＥＣＭＯ又は低体温ＥＣＭＯシステムは、血液流体の体外循環のための技術である。
【0192】
ダブルバルーントリプルルーメンカテーテルでは、腹部臓器のその場での冷却が可能になる。特に、これは大腿動脈回路に埋め込むと、腎循環を隔離することが可能になる。本開示による組成物の迅速な灌流は、ダブルバルーントリプルルーメンカテーテルを通じて実行することができる。排出ルートは大腿静脈に埋め込まれ、灌流された液体組成物の排出が可能になる。
【0193】
例示的な投与頻度には、限定されるものではないが、週に少なくとも１、２、３、４、５、６、又は７回（すなわち、毎日）が含まれる。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、１日に少なくとも２、３、４、又は６回投与される。Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、例えば、数日又は数週間の期間にわたって投与することができる。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、数ヶ月又は数年などのより長期間投与される。組成物の投与頻度は、投与する医師の判断に基づいて、治療の過程にわたって調整され得る。
【0194】
上述したように、Ｈ－ＮＯＸタンパク質の投与量の選択は、利用される剤形、投与の頻度及び回数、治療される状態、及び当業者の決定に従って達成される特定の目的に依存する。いくつかの実施態様において、ヒトに投与するためのＨ－ＮＯＸタンパク質の有効量は、数グラムから３５０グラムを超えるまでの間である。
【0195】
いくつかの実施態様において、２つ又はそれ以上の異なるＨ－ＮＯＸタンパク質が、同時に（simultaneously）、逐次的に、又は同時に（concurrently）投与される。いくつかの実施態様において、Ｏ２の送達に有用な別の化合物又は治療法は、１つ又はそれ以上のＨ－ＮＯＸタンパク質の投与と同時に、逐次的に、又は同時に施される。
【0196】
Ｈ－ＮＯＸタンパク質を使用することができる他の例示的な治療用途は、例えば、米国特許第６，９７４，７９５号及び６，４３２，９１８号に記載されており、これらはそれぞれ、特にＯ２担体の治療用途に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0197】
Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含むキット
また、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む本明細書に記載のＨ－ＮＯＸタンパク質のいずれかを含む製品及びキット、及び適切なパッケージングも提供される。いくつかの実施態様において、本開示は、（ｉ）Ｈ－ＮＯＸタンパク質（例えば、本明細書に記載の野生型若しくは変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質又は本明細書に記載のその製剤）、及び（ｉｉ）個体にＯ２を送達するためのキットの使用説明書、を含むキットを含む。
また、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む本明細書に記載のＨ－ＮＯＸタンパク質のいずれかを含む製品及びキット、及び適切なパッケージングも提供される。いくつかの実施態様において、本開示は、（ｉ）Ｈ－ＮＯＸタンパク質（例えば、本明細書に記載の野生型若しくは変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質又は本明細書に記載のその製剤）、及び（ｉｉ）個体にＯ２を送達するためのキットの使用説明書、を含むキットを含む。
【0198】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法で使用するためのキットが提供される。いくつかの実施態様において、キットは重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、キットは、２つ又はそれ以上の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸドメインを含む有効量の重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、キットは、本明細書に記載の野生型又は変異体Ｈ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む有効量の組換え単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、キットは、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸ変異に対応する変異及び三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、キットは、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸ変異に対応する変異及び三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質はヒトＨ－ＮＯＸドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質はイヌＨ－ＮＯＸドメインを含む。いくつかの実施態様において、キットは、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、キットは、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、キットは、３つの単量体を含む三量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．テンコンジェンシスＬ１４４Ｆ Ｈ－ＮＯＸドメイン及びフォルドンドメインを含む。
【0199】
本明細書に記載される組成物に適したパッケージングは当技術分野で知られており、例えば、バイアル（例えば、密封されたバイアル）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージング（例えば、密封されたマイラー又はプラスチックバッグ）などが含まれる。これらの製品はさらに滅菌及び／又は密封されてもよい。また、本明細書に記載の組成物を含む単位剤形も提供される。これらの単位剤形は、単一又は複数の単位剤形で適切なパッケージングで保存でき、さらに滅菌及び密封することもできる。本開示のキットに提供される説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）に書かれた説明書であるが、機械読み取り可能な説明書（例えば、磁気又は光学記憶ディスクに記録された説明書）もまた許容される。Ｈ－ＮＯＸタンパク質の使用に関する説明書には、通常、目的の治療又は産業上の用途のための用量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報が含まれている。キットはさらに、個体又は治療法を選択するための説明を含むこともある。
【0200】
容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）、又は部分単位用量であり得る。例えば、約１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、又はそれ以上のいずれかの長期間、個体に効果的な治療を提供するのに十分な用量の本明細書に開示されるＨ－ＮＯＸタンパク質を含むキットも提供され得る。キットには、複数の単位用量のＨ－ＮＯＸタンパク質と使用説明書も含まれており、薬局（病院薬局や調剤薬局など）での保管及び使用に十分な量でパッケージ化されている。いくつかの実施態様において、キットは、一般にＨ－ＮＯＸタンパク質の安定な水性懸濁液を形成するために、復元、再懸濁、又は再水和することができる乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を含む。
【0201】
Ｈ－ＮＯＸタンパク質の例示的な製造方法
本開示はまた、本明細書に記載の重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のいずれかを生成するための方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質をコードする核酸を有する細胞を、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の産生に適した条件下で培養することを含む。様々な実施態様において、ポリマーＨ－ＮＯＸも精製される（例えば、細胞又は培地からのＨ－ＮＯＸタンパク質の精製）。いくつかの実施態様において、この方法は、Ｈ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質をコードする核酸を有する細胞を培養することを含む。次に、単量体はインビボ又はインビトロで会合して、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を形成する。異種Ｈ－ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、所望のＨ－ＮＯＸドメインを有する単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質をコードする２つ又はそれ以上の核酸を同時導入することによって生成することができ、ここで、２つ又はそれ以上の単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、同じ重合ドメインを含む。
本開示はまた、本明細書に記載の重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質のいずれかを生成するための方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質をコードする核酸を有する細胞を、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の産生に適した条件下で培養することを含む。様々な実施態様において、ポリマーＨ－ＮＯＸも精製される（例えば、細胞又は培地からのＨ－ＮＯＸタンパク質の精製）。いくつかの実施態様において、この方法は、Ｈ－ＮＯＸドメイン及び重合ドメインを含む単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質をコードする核酸を有する細胞を培養することを含む。次に、単量体はインビボ又はインビトロで会合して、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を形成する。異種Ｈ－ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、所望のＨ－ＮＯＸドメインを有する単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質をコードする２つ又はそれ以上の核酸を同時導入することによって生成することができ、ここで、２つ又はそれ以上の単量体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、同じ重合ドメインを含む。
【0202】
いくつかの実施態様において、異種Ｈ－ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、所望のＨ－ＮＯＸドメイン及び共通の重合ドメインを含む相同単量体Ｈ－ＮＯＸサブユニットを含む重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を別々に調製することによって調製される。様々な相同Ｈ－ＮＯＸタンパク質は所望の比率の異種Ｈ－ＮＯＸサブユニットと混合され、相同重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は（例えば、熱、変性剤、高塩などにより）解離され、その後会合されて異種重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質が形成される。異種重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の混合物は、所望の比率の所望のサブユニットの存在について選択することによってさらに精製することができる。例えば、それぞれの異なるＨ－ＮＯＸ単量体は、異種重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質の精製と異種サブユニットの同定及び定量を補助するために別個のタグを有する場合がある。
【0203】
上で述べたように、いくつかの野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質及び核酸の配列は既知であり、本開示の変異体Ｈ－ＮＯＸドメイン及び核酸を生成するために使用することができる。組換えＨ－ＮＯＸタンパク質の突然変異、発現、及び精製のための技術は、例えば、Boon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59 and Karow, D. S. et al. (August 10, 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211に記載されており、これは、特に組換えＨ－ＮＯＸタンパク質の突然変異、発現、及び精製に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの技術又は他の標準的な技術を使用して、任意の変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質を生成することができる。
【0204】
特に、本明細書に記載の変異体Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、当技術分野で知られている多くの方法で生成することができる。突然変異は、アミノ酸の化学修飾によるアミノ酸レベルで、又は特定のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の改変によるコドンレベルで発生する。タンパク質内の任意の位置でのアミノ酸の置換は、そのアミノ酸をコードするコドンを改変することによって実現することができる。これは、例えば：（ｉ）Taylor, J.W. et al. (December 20, 1985). Nucleic Acids Res. 13(24):8749-8764; Taylor, J.W. et al. (December 20, 1985). Nucleic Acids Res. 13(24):8765-8785; Nakamaye, K. L. et al. (December 22, 1986). Nucleic Acids Res.14(24):9679-9698; and Dente et al. (1985). in DNA Cloning, Glover, Ed., IRL Press, pages 791-802の方法に基づく Amersham技術（Amersham 突然変異誘発キット, Amersham, Inc., Cleveland, Ohio）、（ｉｉ）Promegaキット（Promega Inc., Madison, Wis.）、又は（ｉｉｉ）Kunkel, T. A. (January 1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(2):488-492; Kunkel, T. A. (1987). Methods Enzymol. 154:367-382; Kunkel, 米国特許第４，８７３，１９２号（これらは、それぞれ、特にタンパク質の突然変異誘発に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の方法に基づく Bioradキット（Biorad Inc., Richmond, Calif.）を使用する部位特異的突然変異誘発によって達成することができる。突然変異誘発はまた、例えば、変異体オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発を利用するものなどの他の商業的に入手可能な手段又は非商業的手段によって達成することもできる。
【0205】
部位特異的突然変異誘発は、Zhengbin et al. (1992). pages 205-207 in PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Jones, D. H. et al. (February 1990). Biotechniques 8(2):178-183; Jones, D. H. et al. (January 1991). Biotechniques 10(1):62-66（これらは、それぞれ、特にタンパク質の突然変異誘発に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなＰＣＲベースの突然変異誘発を使用して達成することもできる。部位特異的突然変異誘発は、当業者に知られている技術によるカセット突然変異誘発を使用して達成することもできる。
【0206】
変異体Ｈ－ＮＯＸ核酸及び／又は重合ドメインは、標準的な技術を使用して、発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。例えば、制限酵素を使用して、変異型Ｈ－ＮＯＸ核酸及びベクターを切断することができる。次に、切断された変異体Ｈ－ＮＯＸ核酸と切断されたベクターの適合末端を連結することができる。得られたベクターは、コードされたＨ－ＮＯＸタンパク質を発現させるための標準技術（例えば、電気穿孔法）を使用して細胞（例えば、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、又は細菌細胞）に挿入することができる。
【0207】
特に、異種タンパク質は、多くの生物学的発現系、例えば昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞で発現されている。従って、任意の適切な生物学的タンパク質発現系を利用して、大量の組換えＨ－ＮＯＸタンパク質を産生することができる。いくつかの実施態様において、Ｈ－ＮＯＸタンパク質（例えば、変異体又は野生型Ｈ－ＮＯＸタンパク質）は、単離されたタンパク質である。
【0208】
所望であれば、Ｈ－ＮＯＸタンパク質は標準的な技術を使用して精製することができる。いくつかの実施態様において、タンパク質は少なくとも約６０重量％が、タンパク質が生成されるときに存在する他の成分を含まない。様々な実施態様において、タンパク質は少なくとも約７５％、９０％、又は９９重量％純粋である。精製タンパク質は、例えば、天然源、組換え発現系、又は化学合成のための反応混合物からの精製（例えば、抽出）によって得ることができる。例示的な精製方法には、免疫沈降、カラムクロマトグラフィー（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー）、磁気ビーズ免疫親和性精製、及びプレート結合抗体を用いたパニング、並びに当業者に公知の他の技術が含まれる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によってアッセイすることができる。いくつかの実施態様において、精製タンパク質は、本開示の医薬組成物に組み込まれるか、又は本開示の方法で使用される。本開示の医薬組成物は、精製タンパク質に加えて、添加剤、担体、又は他の成分を有してもよい。
【0209】
いくつかの実施態様において、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質は、１つ又はそれ以上のＨｉｓ６タグを含む。少なくとも１つのＨｉｓ６タグを含むＨ－ＮＯＸタンパク質は、クロマトグラフィー、例えばＮｉ２＋親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができる。精製後、Ｈｉｓ６タグは、例えばエキソペプチダーゼを使用して除去することができる。いくつかの実施態様において、本開示は、重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質がＨｉｓ６タグの使用を通じて精製された、精製重合体型Ｈ－ＮＯＸタンパク質を提供する。いくつかの実施態様において、精製Ｈ－ＮＯＸタンパク質はエキソペプチダーゼで処理されて、Ｈｉｓ６タグが除去される。
【実施例】
【0210】
実施例は、本開示内容の純粋に例示的なものであることを意図しており、従って、いかなる形でも本開示を限定するものとみなすべきではなく、また実施例は、上で論じた本開示の態様及び実施態様について説明及び詳述する。実施例は、以下の実験が実施されたすべての実験又は唯一の実験であることを示すことを意図したものではない。特に指示がない限り、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
【0211】
実施例１．体外の臓器保存のサポートの改善
この実施例の目的は、本明細書に開示される方法を使用した場合の、臓器移植のための体外の臓器保存の改善を証明する臓器保存研究を説明することである。
この実施例の目的は、本明細書に開示される方法を使用した場合の、臓器移植のための体外の臓器保存の改善を証明する臓器保存研究を説明することである。
【0212】
健康なミニブタから摘出した心臓、腎臓、及び／又は肝臓を洗い流して血液を除去し、標準治療のUniversity of Wisconsin（ＵＷ）冷蔵保存液単独で、又はＯＭＸ－４．８０Ｐ（０．５～２ｍｇ／ｍｌの濃度）を補足したＵＷ液で灌流し、臓器を同じ溶液に摂氏４度で最大２４時間浸す。臓器生検材料は一定間隔で採取される。例えば、時点のサブセットには、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間が含まれる。臓器生検材料は、エネルギー及び代謝状態（例えば、ＡＴＰレベル、ミトコンドリア状態のＥＭ評価、乳酸生成など）、酸化ストレスのマーカー（例えば、カタラーゼ、ＳＯＤ、脂質過酸化－ＭＤＡなど）、組織の炎症と完全性のマーカー（例えば、組織の構成と構造に関するＨ＆Ｅ染色、細胞死の存在、免疫浸潤、炎症マーカーの存在に対するＩＬ６やＴＮＦαなどのサイトカインの発現など）について分析される。
【0213】
標準治療用のＵＷ冷蔵保存液のみに同じ時間曝露された臓器と比較して、ＯＭＸ－４．８０Ｐを補足した冷蔵保存溶液に曝露された臓器は、組織構造の崩壊と細胞死のレベルが低く、ＡＴＰレベルが高く、又はより高いエネルギー状態と好気性代謝速度とミトコンドリア機能の他の指標の存在、及びより低レベルの組織の炎症及び／又は酸化ストレスを示すことが予測される。
【0214】
実施例２．移植後の臓器の成績の改善と移植後の転帰の改善
この実施例の目的は、本明細書に開示される方法を使用した場合の、移植後の移植臓器の成績の改善、並びに移植後の患者転帰の改善を証明する臓器保存研究を説明することである。
この実施例の目的は、本明細書に開示される方法を使用した場合の、移植後の移植臓器の成績の改善、並びに移植後の患者転帰の改善を証明する臓器保存研究を説明することである。
【0215】
健康なミニブタから摘出した心臓、腎臓、及び／又は肝臓を洗い流して血液を除去し、標準治療のUniversity of Wisconsin（ＵＷ）冷蔵保存液単独で、又はＯＭＸ－４．８０Ｐ（０．５～２ｍｇ／ｍｌの濃度）を補足したＵＷ液で灌流し、臓器を同じ溶液に摂４℃で４～２４時間浸す。冷溶液単独又はＯＭＸ－４．８０Ｐ補足冷溶液で体外保存後、臓器はレシピエント動物に移植される。両方の動物コホートは、臓器機能と動物の生存率について手術後最大７日間評価される。
【0216】
ＯＭＸ－４．８０Ｐ補足保存溶液中で保存された臓器のレシピエント動物は、循環器マーカー（例えば、肝臓のＡＬＴ、ＡＳＴ、心臓のトロポニン２、腎臓の尿素、ＢＵＮ）によって評価されるように、より良好な臓器機能、より低い炎症性サイトカインレベル（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ６、γＩＦＮ）、及び終末剖検における組織学的評価（例えば、Ｈ＆Ｅ染色など）によって評価されるように、より良好な組織完全性及び／又はより低い組織炎症を示すことが予測される。対照群の全体的生存率が低くても、ＯＭＸ－４．８０Ｐコホートではレシピエント動物の生存率の改善が見られることがある。
【0217】
実施例３．保存液へのＯＭＸの添加は、機械灌流腎臓における低酸素依存性の機能不全及び病態生理学を軽減及び／又は遅延させる
この進行中の研究の目的は、ＯＭＸ－４．８０Ｐ医薬品（ＯＭＸ）補足冷蔵保存溶液（ＣＳＳ）が、灌流ポンプ上に置かれたヒトの死亡ドナー腎臓を、ＣＳＳ単独よりも安全かつ効果的に保存することができるかどうかを、組織の質と機能の組織学的及び生化学的マーカーにより測定して評価することであった。現在までに、２つの対応対の腎臓（同じドナーからの遺伝的に同一の腎臓）が研究されており、各対について、一方の腎臓にはＣＳＳのみを投与し、もう一方の腎臓にはＣＳＳ＋ＯＭＸを投与した。機能的及び組織病理学的データは、ＣＳＳ単独と比較して、ＯＭＸを補足したＣＳＳが冷蔵保存中の腎機能の保存を改善するという仮説を裏付けている。この研究は進行中であり、追加のデータが入手でき次第、組み込まれるであろう。
この進行中の研究の目的は、ＯＭＸ－４．８０Ｐ医薬品（ＯＭＸ）補足冷蔵保存溶液（ＣＳＳ）が、灌流ポンプ上に置かれたヒトの死亡ドナー腎臓を、ＣＳＳ単独よりも安全かつ効果的に保存することができるかどうかを、組織の質と機能の組織学的及び生化学的マーカーにより測定して評価することであった。現在までに、２つの対応対の腎臓（同じドナーからの遺伝的に同一の腎臓）が研究されており、各対について、一方の腎臓にはＣＳＳのみを投与し、もう一方の腎臓にはＣＳＳ＋ＯＭＸを投与した。機能的及び組織病理学的データは、ＣＳＳ単独と比較して、ＯＭＸを補足したＣＳＳが冷蔵保存中の腎機能の保存を改善するという仮説を裏付けている。この研究は進行中であり、追加のデータが入手でき次第、組み込まれるであろう。
【0218】
実験計画
実験計画を表２に示す。
実験計画を表２に示す。
【表2】
【0219】
材料
ＯＭＸは、ヘム一酸化窒素／酸素（Ｈ ＮＯＸ）タンパク質ファミリーのメンバーに由来するペグ化酸素担体であり、正常酸素組織の酸素レベルを上昇させることなく、酸素を組織の低酸素（低酸素）領域に特異的に送達するように工学作成されている。この研究で使用されたＯＭＸ試験品は、大腸菌細胞培養と下流の精製及び処理を使用して調製されたバルク物質として生成され、水性緩衝液中で配合された。製品の品質と安全性は、動物試験で使用する前に、事前に定められた仕様に照らして試験することによって確認された。ＯＭＸは－８０℃で冷凍保存され、使用前に解凍された。
ＯＭＸは、ヘム一酸化窒素／酸素（Ｈ ＮＯＸ）タンパク質ファミリーのメンバーに由来するペグ化酸素担体であり、正常酸素組織の酸素レベルを上昇させることなく、酸素を組織の低酸素（低酸素）領域に特異的に送達するように工学作成されている。この研究で使用されたＯＭＸ試験品は、大腸菌細胞培養と下流の精製及び処理を使用して調製されたバルク物質として生成され、水性緩衝液中で配合された。製品の品質と安全性は、動物試験で使用する前に、事前に定められた仕様に照らして試験することによって確認された。ＯＭＸは－８０℃で冷凍保存され、使用前に解凍された。
【0220】
この研究のビヒクルは KPS-1 腎臓灌流溶液であり、これは、機械灌流用に配合されたＵＷ ＣＳＳのバージョンであり、LifePort Kidney Transporter 灌流システムを使用して送達された。KPS-1 とLifePort Kidney Transporter は両方ともOrgan Recovery Systemsから得られる。試験品を室温で解凍し、次に２～８℃で遮光して保持した。試験品を冷ＣＳＳで目標濃度まで希釈し、使用するまで２～８℃で保存した。
【0221】
ビヒクル／試験品投与
本明細書に記載のデータを生成するために使用された臓器について、以下の手順が実行された。臓器が到着する直前に、ポンプを以下のように準備した。氷チャンバーは砕いた氷と水で満たされた。主臓器チャンバーは１ＬのＣＳＳ±ＯＭＸで満たされた。そして、溶液の循環を開始して気泡を除去した。１ｍＬのＣＳＳ±ＯＭＸ溶液を採取し、試験品製剤試料として凍結した（－５０～－９０℃）。
本明細書に記載のデータを生成するために使用された臓器について、以下の手順が実行された。臓器が到着する直前に、ポンプを以下のように準備した。氷チャンバーは砕いた氷と水で満たされた。主臓器チャンバーは１ＬのＣＳＳ±ＯＭＸで満たされた。そして、溶液の循環を開始して気泡を除去した。１ｍＬのＣＳＳ±ＯＭＸ溶液を採取し、試験品製剤試料として凍結した（－５０～－９０℃）。
【0222】
臓器が到着して開梱した後、動脈と静脈を適切なカニューレに取り付け、主要臓器チャンバーラインに固定した。これが完了した後、ＣＳＳによる静圧灌流が開始され（時間０）、約１０時間続行した。各臓器に継続的にポンプを作動させた。臓器チャンバーは生検材料採取のために断続的に開けられた。
【0223】
データ収集
収縮期及び拡張期の圧力（ｍｍＨｇ）、流量（ｍＬ／分）、抵抗（ｍｍＨｇ）、及び温度（℃）を含む灌流システムの測定値をＴ＝０で記録し、最初の４時間は１時間ごとに、その後は６、８時、そして１０時間目に記録した。灌流残留液を０、１、６、及び１０時間目に収集し、６ｍｍウェッジ生検材料をＴ＝０の時点及びその後１時間ごとに採取した。
収縮期及び拡張期の圧力（ｍｍＨｇ）、流量（ｍＬ／分）、抵抗（ｍｍＨｇ）、及び温度（℃）を含む灌流システムの測定値をＴ＝０で記録し、最初の４時間は１時間ごとに、その後は６、８時、そして１０時間目に記録した。灌流残留液を０、１、６、及び１０時間目に収集し、６ｍｍウェッジ生検材料をＴ＝０の時点及びその後１時間ごとに採取した。
【0224】
灌流残留液を、臓器機能の生化学マーカーの将来の分析のために冷凍保存した（－５０～－９０℃）。より大きな生検材料をＴ＝０、６時間、及び１０時間目で採取し、分割し、半分は組織学用に固定し、残りの半分は、組織のＯＭＸレベル又は臓器の品質と機能の他のバイオマーカーの潜在的な評価のために凍結した。
【0225】
組織病理学
固定生検材料を処理し、顕微鏡評価のために盲検化した。組織はパラフィン包埋され、薄片化され、ヘマトキシリンとエオシンで染色され、認定病理学者によって顕微鏡で検査された。各生検材料は、同種移植病理学のバンフ分類（Banff Classification of Allograft Pathology） ［Roufosse et al, A 2018 Reference Guide to the Banff Classification of Renal Allograft Pathology（公表された修正は Transplantation. 2018 Dec;102(12):e497 に示されている）. Transplantation. 2018;102(11):1795-1814］に基づいてスコア付けされた。
固定生検材料を処理し、顕微鏡評価のために盲検化した。組織はパラフィン包埋され、薄片化され、ヘマトキシリンとエオシンで染色され、認定病理学者によって顕微鏡で検査された。各生検材料は、同種移植病理学のバンフ分類（Banff Classification of Allograft Pathology） ［Roufosse et al, A 2018 Reference Guide to the Banff Classification of Renal Allograft Pathology（公表された修正は Transplantation. 2018 Dec;102(12):e497 に示されている）. Transplantation. 2018;102(11):1795-1814］に基づいてスコア付けされた。
【0226】
結果
機能分析。プロトコールに従い、最初の１時間後に目標抵抗値０～０．４ｍｍＨｇ／ｍＬ／分を維持するように腎血流を調整した。流量の増加／抵抗の低下は、腎機能が良くなったことを示す。
機能分析。プロトコールに従い、最初の１時間後に目標抵抗値０～０．４ｍｍＨｇ／ｍＬ／分を維持するように腎血流を調整した。流量の増加／抵抗の低下は、腎機能が良くなったことを示す。
【0227】
図１Ａ及び１Ｃに示すように、ドナー１の両方の腎臓は、０．４ｍｍＨｇ／ｍＬ／分未満の抵抗を維持することができ、ＯＭＸ処理した腎臓は、ＣＳＳ単独の腎臓よりもわずかに高い流量に対する能力を早期に示した。ドナー２では、ＯＭＸ処理腎臓のみが０．４ｍｍＨｇ／ｍＬ／分未満の抵抗を維持でき、ＣＳＳ処理腎臓は研究全体を通じて＞０．５２の抵抗を維持した。ＯＭＸ処理した腎臓の流量も実質的に高かった（図１Ｂ及び１Ｄ）。
【0228】
病理組織学的分析。各腎臓から様々な時点で採取された生検材料は、尿細管変性、尿細管壊死、アポトーシス、及び細胞骨格の乱れについて分析された。これらは、腎機能に対する低酸素症の影響の指標の一部である（Chevalier, R. L. The proximal tubule is the primary target of injury and progression of kidney disease: role of the glomerulotubular junction, Am J Physiol Renal Physiol. 2016 Jul 1; 311(1): F145-F161; Shu, S. et al, Hypoxia and Hypoxia-Inducible Factors in Kidney Injury and Repair, Cells. 2019 Mar; 8(3): 207）。
【0229】
図２Ａ～２Ｆに示されるように、ＯＭＸ処理された機械灌流腎臓は、ＣＳＳ処理された腎臓と比較して、尿細管変性の減少、尿細管壊死レベルの低下、及びアポトーシスレベルの低下を示す。さらに、図３に示されるように、ＯＭＸ処理された機械灌流腎臓は、ＣＳＳ処理された腎臓と比較して、細胞骨格の乱れの減少及び／又は遅延を示す。
【0230】
従って、保存溶液にＯＭＸを添加すると、機械灌流腎臓における低酸素依存性の機能不全及び病態生理が軽減及び／又は延期される可能性がある。
【0231】
ＯＭＸ処理した腎臓は両方とも、目標とする抵抗を維持しながら、対応するＣＳＳ処理腎臓よりも高い腎血流速度を得ることができた。
【0232】
ＯＭＸ処理した腎臓は両方とも、対応するＣＳＳ処理した腎臓と比較して、より低レベルの尿細管変性、壊死、及びアポトーシスを示した。
【0233】
ＯＭＸ処理した腎臓は両方とも、対応するＣＳＳ処理した腎臓と比較して、より低レベルの細胞骨格の乱れを示し、細胞骨格の乱れが増加するまでの時間が遅れた。
【0234】
本開示は、特定の実施態様（そのうちのいくつかは好適な実施態様である）を参照して具体的に示し及び説明されてきたが、当業者であれば、本明細書に開示される本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、前記実施態様の形態及び詳細に様々な変更を加えることができることを理解するはずである。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【国際調査報告】