特表 2024-532221 免疫原性組成物及びそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-05

(54)【発明の名称】免疫原性組成物及びそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/145 20060101AFI20240829BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 14/11 20060101ALN20240829BHJP

   C07K 14/46 20060101ALN20240829BHJP

【ＦＩ】

A61K39/145

A61P31/16

A61K38/16

A61K9/08

A61K47/02

A61K47/26

A61K47/20

C07K19/00 ZNA

C07K14/11

C07K14/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024510494

(86)(22)【出願日】2022-08-24

(85)【翻訳文提出日】2024-04-09

(86)【国際出願番号】 EP2022073630

(87)【国際公開番号】W WO2023025864

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】21306142.7

(32)【優先日】2021-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21196968.8

(32)【優先日】2021-09-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21212974.6

(32)【優先日】2021-12-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22161930.7

(32)【優先日】2022-03-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22305655.7

(32)【優先日】2022-05-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22306128.4

(32)【優先日】2022-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524063969

【氏名又は名称】オシバックス

【氏名又は名称原語表記】ＯＳＩＶＡＸ

(71)【出願人】

【識別番号】524063970

【氏名又は名称】オシバックス ベルジーク

【氏名又は名称原語表記】ＯＳＩＶＡＸ Ｂｅｌｇｉｑｕｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ル ヴェール， アレクサンドル

(72)【発明者】

【氏名】ブーリー， ジュリアン

(72)【発明者】

【氏名】ニコラス， フローランス

(72)【発明者】

【氏名】ウィレムス， ポール

(72)【発明者】

【氏名】ギュイヨン‐ジェラン， デルフィーヌ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076BB11

4C076BB15

4C076CC06

4C076CC35

4C076DD24

4C076DD55S

4C076DD67D

4C076EE23Z

4C076FF12

4C076FF14

4C076FF51

4C076FF61

4C076GG43

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084CA01

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB331

4C084ZB332

4C085AA03

4C085BA55

4C085CC08

4C085EE05

4C085GG03

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA01

4H045CA40

4H045DA86

4H045EA31

(57)【要約】

本発明は、免疫原性組成物、及びヒト対象におけるインフルエンザ疾患の予防のためのワクチンとしての上記免疫原性組成物の使用に関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ疾患の予防又は処置を必要とするヒト対象におけるインフルエンザ疾患の予防又は処置におけるワクチン又は免疫療法としての免疫原性組成物の使用の方法であって、前記免疫原性組成物が、（ｉ）インフルエンザ核タンパク質抗原と、（ｉｉ）Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する自己組織化ポリペプチド及び正に帯電した尾部を含むキャリアタンパク質とを含む融合タンパク質を含み、１８０μｇ以上の量の前記融合タンパク質が前記ヒト対象に投与される、方法に関する。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インフルエンザ疾患の予防又は処置を必要とするヒト対象におけるインフルエンザ疾患の予防又は処置におけるワクチン又は免疫療法としての使用のための免疫原性組成物であって、
（ｉ）インフルエンザ核タンパク質抗原と、
（ｉｉ）Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する自己組織化ポリペプチド及び正に帯電した尾部を含むキャリアタンパク質と
を含む融合タンパク質を含み、１８０μｇ以上の量の前記融合タンパク質が前記ヒト対象に投与される、例えば２００μｇ、２４０μｇの量が前記ヒト対象に投与される、使用のための免疫原性組成物。

【請求項2】

３００μｇ以上又は４８０μｇ以上の量の前記融合タンパク質が前記ヒト対象に投与される、請求項１に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項3】

前記キャリアタンパク質が、Ｃ末端で前記核タンパク質抗原と、任意選択でグリシン－セリンリンカーを介して融合している、請求項１又は２に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項4】

前記融合タンパク質が、自己組織化後に七量体粒子を形成する、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項5】

前記インフルエンザ核タンパク質抗原が、インフルエンザ株Ａ、Ｂ、又はＣ由来の少なくとも１種の核タンパク質抗原を含む、例えば、前記インフルエンザ核タンパク質抗原が、インフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｌｓｏｎ－Ｓｍｉｔｈ／１９３３ Ｈ１Ｎ１のＮＰ抗原から本質的になる、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項6】

前記インフルエンザ核タンパク質抗原が、
（ｉ）配列番号１のポリペプチド、又は
（ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する抗原性ポリペプチドバリアント
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項7】

Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する前記自己組織化ポリペプチドが、配列番号２、又は配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列番号２の機能的バリアントを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項8】

前記正に帯電した尾部が、配列ＺＸＢＢＢＢＺ（配列番号３）（ここで、（ｉ）Ｚは存在しないか又は任意のアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｘは任意のアミノ酸であり、（ｉｉｉ）Ｂはアルギニン又はリジンである）を含み、好ましくは、前記正に帯電した尾部が、配列番号４の配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項9】

前記キャリアタンパク質が、配列番号５から本質的になるか、又は前記キャリアタンパク質が、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列番号５の機能的バリアントである、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項10】

前記融合タンパク質が、配列番号６を含むか若しくは配列番号６から本質的になるか、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列番号６の機能的バリアントである、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項11】

前記量の融合タンパク質が筋肉内経路を介して投与される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項12】

前記量の融合タンパク質が単回注射として、好ましくは筋肉内経路を介して、前記ヒト対象に投与される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項13】

前記対象が５０歳未満である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項14】

前記対象が少なくとも５０歳である、又は５０歳を超えている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【請求項15】

前記使用が、ＮＰに特異的な総Ｔ細胞応答、ＮＰに特異的なＣＤ４ Ｔ細胞応答、ＮＰに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答、抗ＮＰ ＩｇＧ（抗体応答）、及び／又はインフルエンザ症状（インフルエンザ様疾病）、特にインフルエンザ株Ａ若しくはＢによるインフルエンザ感染症に対する防御若しくは交差防御をもたらす、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、免疫原性組成物、及びヒト対象におけるインフルエンザ疾患（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防のためのワクチンとしての上記免疫原性組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

季節性インフルエンザは、世界中で毎年、約２９０，０００～６５０，０００の死亡例を伴う約３～５００万の重度の疾病の症例をもたらし、死亡の大半は６５歳以上の人々に起こると推定されている［Ｉｕｌｉａｎｏ ＡＤら、Ｌａｎｃｅｔ．２０１８；３９１：１２８５～１３００］。

【0003】

毎年のワクチン接種は、インフルエンザを予防するための最も効果的な手段であると考えられている。米国の一般集団の間では、三価又は四価季節性インフルエンザワクチンの効力は、過去１０年にわたって平均して４２％（高齢者では３２％）に限定されている［ＣＤＣ － Ｐａｓｔ Ｓｅａｓｏｎｓ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｆｌｕ／ｖａｃｃｉｎｅｓ－ｗｏｒｋ／ｐａｓｔ－ｓｅａｓｏｎｓ－ｅｓｔｉｍａｔｅｓ．ｈｔｍｌから入手可能。２０２１年５月２１日アクセス］。同様のデータは欧州でも入手可能である［Ｋｒａｍｍｅｒ Ｆら、Ｉｎｆｌｕ Ｒｅｓｐｉｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０２０；１４：２３７～２４３］。循環ウイルスがワクチンウイルスと一致しない場合、２０１４～２０１５年のシーズンのように、効力はわずか１０～２０％まで低下する場合がある。したがって、インフルエンザワクチン有効性を向上させる医学的必要性が存在する。

【0004】

ウイルス表面のヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対する抗体閾値は、現在の大半のワクチンに関する臨床試験において有効性の代替／相関物として認識されているが、細胞応答、特にＣＤ４及びＣＤ８媒介応答は、特に高齢者集団において防御に寄与する可能性が非常に高い［ＭｃＥｌｈａｎｅｙ ＪＥら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；７：４１。Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ ＣＭら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１６；１５：９６７～９７６。Ｐｌｅｇｕｅｚｕｅｌｏｓ Ｏら、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；２２：９４９～９５６、Ｓａｖｉｃ Ｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６；１４７：１６５～１７７］。

【0005】

現在利用可能なインフルエンザワクチンを、Ｔ細胞応答を介して改良する試みにおいて、ウイルス核タンパク質（ＮＰ）は、好まれる標的として出現する。この内部タンパク質は、Ａ株の間、及びＡ株とＢ株との間で高度に保存されており、ウイルス複製機構に対する構造的及び機能的支持をもたらす［Ｙｅ Ｑ、Ｋｒｕｇ ＲＭ、Ｔａｏ ＹＪ．Ｎａｔｕｒｅ．２００６；４４４：１０７８～１０８２］。ヒトにおいて、保存されている内部抗原に対するＴ細胞免疫の、インフルエンザからの防御における役割に関する証拠が増えてきている。２００９年のＨ１Ｎ１パンデミックの間に行われた前向きコホート研究は、より高い頻度の、保存されているＣＤ８エピトープに特異的な既存のＴ細胞が、より低い重症度の疾病を発症した個体に見出されたことを示した［Ｓｒｉｄｈａｒ Ｓら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１３；１９：１３０５～１３１２］。Ｆｌｕ Ｗａｔｃｈコホート研究は、内部ウイルスタンパク質を標的とする既存のＴ細胞応答がパンデミック及び季節性インフルエンザに対する防御免疫をもたらすことを示唆している。ウイルスへの曝露前のＮＰ特異的Ｔ細胞の存在（２０スポット形成単位［ＳＦＣ］／１００万末梢血単核細胞［ＰＢＭＣ］の閾値を超える）は、パンデミックインフルエンザ期間中及び季節性インフルエンザ期間中の両方において、より少ない症候性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）陽性インフルエンザＡの症例と相関した［Ｈａｙｗａｒｄ ＡＣら、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１５；１９１：１４２２～１４３１．］。これらの結果は、インフルエンザに対するＮＰベースのワクチンを開発することに関する理論的根拠を提供する。

【0006】

ＯＶＸ８３６（ＯＳＩＶＡＸ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）は、全てのインフルエンザ株に対する広域スペクトルワクチンとして開発された組換えタンパク質である。抗原性部分は、Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスのＮＰ配列に対応する。ＯＶＸ８３６タンパク質は７コピーのＮＰを含有し、それぞれがＯＶＸ３１３と融合している。ＯＶＸ３１３配列は、ヒトＣ４ｂ結合タンパク質（ｈＣ４ＢＰ）のＣ末端オリゴマー化ドメインに由来するが［Ｈｏｆｍｅｙｅｒ Ｔら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１３；４２５：１３０２～１３１７］、ヒト配列との相同性を最小化するように改変されている（ハイブリッドニワトリ配列；２０％未満の相同性）。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）操作によって抗原と融合された場合、タンパク質発現後に、ＯＶＸ３１３は抗原を七量体化する固有の特性を有し、したがって、免疫系にとっての抗原のアクセス可能性を改善し、免疫系の液性及び細胞性免疫応答を高める［Ｄｅｌ Ｃａｍｐｏ Ｊ．ら、ｎｐｊ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１９；４：４］。ＮＰが抗原変異を受けていない場合、ＯＶＸ８３６は、現在の季節性インフルエンザワクチンに関して必要とされているように毎年適合させる必要はない。動物研究は、ＯＶＸ８３６の、液性及び細胞性免疫（肺におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）を誘発する能力、並びにマウス［Ｄｅｌ Ｃａｍｐｏ Ｊ．ら、ｎｐｊ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１９；４：４］及びフェレット［Ｄｅｌ Ｃａｍｐｏ Ｊら、Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ－Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ ２０１９；要約番号１０９３６：４５６］におけるインフルエンザ負荷に対する防御を実証している。重要なことに、ＯＶＸ８３６は、数十年の間隔が空いて単離された３つの異なるインフルエンザＡ亜型を用いたウイルス負荷からマウスを防御し、この防御は、ウイルス量の減少を伴った。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が感染細胞破壊に関与し得るが、近年のマウスにおけるＯＶＸ８３６の非臨床実験は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を最も効果的な免疫応答として支持している［Ｄｅｌ Ｃａｍｐｏ Ｊら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２１。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎ．ｏｒｇ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２１．６７８４８３／ａｂｓｔｒａｃｔ。２０２１年５月２１日アクセス］。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ヒトにおける最初の臨床研究が、ＯＶＸ８３６の安全性及び免疫原性を評価するために実施された。

【0008】

ＯＶＸ８３６融合タンパク質又はそれらの機能的バリアントを含む免疫原性組成物の投与レジメン及び製剤をさらに改良する必要性が依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本開示の一態様は、インフルエンザ疾患の予防又は処置を必要とするヒト対象におけるインフルエンザ疾患の予防又は処置におけるワクチン又は免疫療法としての使用のための免疫原性組成物であって、
（ｉ）インフルエンザ核タンパク質抗原と、
（ｉｉ）Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する自己組織化ポリペプチド及び正に帯電した尾部を含むキャリアタンパク質と
を含む融合タンパク質を含み、１８０μｇ以上の量、例えば１８０μｇ～１０００μｇの間に含まれる量の前記融合タンパク質が前記ヒト対象に投与される、使用のための免疫原性組成物に関する。

【0010】

本開示の別の態様は、特にインフルエンザ疾患の予防又は処置を必要とするヒト対象におけるインフルエンザ疾患の予防又は処置におけるワクチン又は免疫療法としての使用のための、３００μｇ／ｍＬ以上の濃度の上で定義された融合タンパク質と、１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤とを含む免疫原性組成物を対象とする。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ワクチン接種前のベースライン時（１日目）の、４つの処置群におけるＮＰ特異的ＩＦＮγスポット形成Ｔ細胞の数（ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣ）の平均値、中央値、及びＳＤ。

【図2】ワクチン接種後８日目の、４つの処置群におけるＮＰ特異的ＩＦＮγスポット形成Ｔ細胞の数（ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣ）の平均値、中央値、及びＳＤ。

【図3】ワクチン接種後３６日目（すなわち、２回目のワクチン接種の８日後）の、４つの処置群における各時点のＮＰ特異的ＩＦＮγスポット形成Ｔ細胞の数（ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣ）の平均値、中央値、及びＳＤ。

【図4】ベースライン（１日目、ワクチン接種前）から１５０日目（２回目の投与の４カ月後）までの、プールされたプラセボ及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン接種群（３０μｇ、９０μｇ、及び１８０μｇ）における、ＮＰ特異的ＩＦＮ－γスポット形成Ｔ細胞（ＳＦＣ）／１０^６細胞の数の経時的展開。結果は算術平均±標準誤差として示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定が有意であった場合、プラセボと比較するドゥワス、スティール、クリッチロウ－フリグナーの事後検定。

【図5A】パネルＡ。ベースライン（１日目）、並びに１回目の投与の８日後（８日目）及び２回目の投与の８日後（３６日目）の、プールされたプラセボ及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン接種群（３０μｇ、９０μｇ、及び１８０μｇ）における、ＮＰ特異的ＩＦＮ－γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６細胞の数。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ドゥワス、スティール、クリッチロウ－フリグナーの検定。Ｄ１＝ワクチン接種前ベースライン、Ｄ８＝１回目のワクチン接種の８日後、Ｄ３６＝２回目のワクチン接種の８日後。パネルＢ。８日目の異なる群におけるＳＦＣ／１０^６細胞の数。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定が有意であったため（ｐ＝０．００２）、ドゥワス、スティール、クリッチロウ－フリグナーの事後検定。両方のパネルにおいて、結果は、中央値（箱内の横線）、四分位範囲（箱の両端）、並びに最小及び最大値（下側及び上側のエラーバー）を示す箱ひげ図として示す。

【図5B】パネルＡ。ベースライン（１日目）、並びに１回目の投与の８日後（８日目）及び２回目の投与の８日後（３６日目）の、プールされたプラセボ及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン接種群（３０μｇ、９０μｇ、及び１８０μｇ）における、ＮＰ特異的ＩＦＮ－γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６細胞の数。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ドゥワス、スティール、クリッチロウ－フリグナーの検定。Ｄ１＝ワクチン接種前ベースライン、Ｄ８＝１回目のワクチン接種の８日後、Ｄ３６＝２回目のワクチン接種の８日後。パネルＢ。８日目の異なる群におけるＳＦＣ／１０^６細胞の数。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定が有意であったため（ｐ＝０．００２）、ドゥワス、スティール、クリッチロウ－フリグナーの事後検定。両方のパネルにおいて、結果は、中央値（箱内の横線）、四分位範囲（箱の両端）、並びに最小及び最大値（下側及び上側のエラーバー）を示す箱ひげ図として示す。

【図6A】パネルＡ。プールされたプラセボ及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（３０μｇ、９０μｇ、及び１８０μｇ）における、ベースライン（１日目、ワクチン接種前）から１５０日目（２回目の投与の４カ月後）までの、ＮＰ特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）幾何平均力価（ＧＭＴ±９５％信頼区間［ＣＩ］）の経時的展開。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定が有意であったため、ドゥワス、スティール、クリッチロウ－フリグナーの事後検定。パネルＢ。プールされたプラセボ及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（３０μｇ、９０μｇ、及び１８０μｇ）における、ベースライン（１日目、ワクチン接種前）と２９日目（１回目の投与の２８日後）との間でのＮＰ特異的ＩｇＧ力価の４倍の増加を示す対象の百分率。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１、フィッシャーの正確確率検定。

【図6B】パネルＡ。プールされたプラセボ及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（３０μｇ、９０μｇ、及び１８０μｇ）における、ベースライン（１日目、ワクチン接種前）から１５０日目（２回目の投与の４カ月後）までの、ＮＰ特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）幾何平均力価（ＧＭＴ±９５％信頼区間［ＣＩ］）の経時的展開。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定が有意であったため、ドゥワス、スティール、クリッチロウ－フリグナーの事後検定。パネルＢ。プールされたプラセボ及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（３０μｇ、９０μｇ、及び１８０μｇ）における、ベースライン（１日目、ワクチン接種前）と２９日目（１回目の投与の２８日後）との間でのＮＰ特異的ＩｇＧ力価の４倍の増加を示す対象の百分率。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１、フィッシャーの正確確率検定。

【図7】ＯＶＸ８３６ １８０μｇ群における２名の外れ値対象（１日目に高いベースライン値：それぞれ９５７及び１６３０を示した対象１２８－０９５及び２３２－３６５）を除外した後のプールされた年齢層（治療企図（Ｉｎｔｅｎｔ－Ｔｏ－Ｔｒｅａｔ、ＩＴＴ）コホートにおける、３つの処置群の１日目及び８日目それぞれのＮＰ特異的ＩＦＮγスポット形成Ｔ細胞（ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣ）の数の平均。

【図8】プールされた年齢層（プロトコル適合２９日目（ＰＰ－Ｄ２９）コホート）における、３つの処置群の、ベースライン（１日目）、８日目、２９日目、及び１８０日目にＩＦＮγについて陽性であったＮＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率。

【図9】インフルエンザシーズン（２０１９年１２月０２日～２０２０年３月０９日）中のワクチン接種からＩＬＩ開始日までの時間の関数としての非特異的ＩＬＩの累積ハザード － ＩＴＴ（治療企図コホート）。

【図10】インフルエンザシーズン（２０１９年１２月０２日～２０２０年３月０９日）中のワクチン接種からＩＬＩ開始日までの時間の関数としての、ワクチン接種の１４日後から生じた非特異的ＩＬＩの累積ハザード － ＩＴＴ（治療企図コホート）。

【図11】インフルエンザシーズン中（３月９日以前）の、ワクチン接種から１４日超経過後のＩＬＩの数 － ＩＴＴ（治療企図コホート）。

【図12】ベースライン時にＣＤ８＋応答について最低四分位に属していた対象の、１日目及び８日目に少なくともＩＦＮγについて陽性であったＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率の中央値。

【図13】プラセボ及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）における、ベースライン（１日目、ワクチン接種前）から２９日目（免疫化の１カ月後）までの、ＮＰ特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）幾何平均力価（ＧＭＴの経時的展開。＊＊＊ｐ＜０．００１、プラセボと比較；Ａｎｏｖａ検定が有意であったため、ボンフェローニの群間事後ペアワイズ比較。

【図14A】パネルＡ：プラセボ群及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）における、８日目の、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価されたＮＰ特異的総Ｔ細胞応答の、１日目に対する平均変化 － 統計量：群間のＡＮＯＶＡ検定が有意である（ｐ＜０．０５）ことを確認した後の、フィッシャーのＬＳＤによるペアワイズ比較；エラーバーは標準誤差を表す。パネルＢ：プラセボ群及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）における、８日目の、ＩＦＮγについて陽性であったＮＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率の、１日目に対する平均変化 － 統計量：群間のＡＮＯＶＡ検定が有意である（ｐ＜０．０５）ことを確認した後の、フィッシャーのＬＳＤによるペアワイズ比較；エラーバーは標準誤差を表す。パネルＣ：プラセボ群及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）における、８日目の、少なくともＩＦＮγについて陽性であったＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率の、１日目に対する平均変化 － 統計量：群間のＡＮＯＶＡ検定が有意である（ｐ＜０．０５）ことを確認した後の、フィッシャーのＬＳＤによるペアワイズ比較；エラーバーは標準誤差を表す。

【図14B】パネルＡ：プラセボ群及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）における、８日目の、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価されたＮＰ特異的総Ｔ細胞応答の、１日目に対する平均変化 － 統計量：群間のＡＮＯＶＡ検定が有意である（ｐ＜０．０５）ことを確認した後の、フィッシャーのＬＳＤによるペアワイズ比較；エラーバーは標準誤差を表す。パネルＢ：プラセボ群及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）における、８日目の、ＩＦＮγについて陽性であったＮＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率の、１日目に対する平均変化 － 統計量：群間のＡＮＯＶＡ検定が有意である（ｐ＜０．０５）ことを確認した後の、フィッシャーのＬＳＤによるペアワイズ比較；エラーバーは標準誤差を表す。パネルＣ：プラセボ群及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）における、８日目の、少なくともＩＦＮγについて陽性であったＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率の、１日目に対する平均変化 － 統計量：群間のＡＮＯＶＡ検定が有意である（ｐ＜０．０５）ことを確認した後の、フィッシャーのＬＳＤによるペアワイズ比較；エラーバーは標準誤差を表す。

【図14C】パネルＡ：プラセボ群及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）における、８日目の、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価されたＮＰ特異的総Ｔ細胞応答の、１日目に対する平均変化 － 統計量：群間のＡＮＯＶＡ検定が有意である（ｐ＜０．０５）ことを確認した後の、フィッシャーのＬＳＤによるペアワイズ比較；エラーバーは標準誤差を表す。パネルＢ：プラセボ群及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）における、８日目の、ＩＦＮγについて陽性であったＮＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率の、１日目に対する平均変化 － 統計量：群間のＡＮＯＶＡ検定が有意である（ｐ＜０．０５）ことを確認した後の、フィッシャーのＬＳＤによるペアワイズ比較；エラーバーは標準誤差を表す。パネルＣ：プラセボ群及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）における、８日目の、少なくともＩＦＮγについて陽性であったＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率の、１日目に対する平均変化 － 統計量：群間のＡＮＯＶＡ検定が有意である（ｐ＜０．０５）ことを確認した後の、フィッシャーのＬＳＤによるペアワイズ比較；エラーバーは標準誤差を表す。

【図15】ＰＣＲで確認されたＩＬＩの累積ハザード － ＯＶＸ８３６－００３研究のプールされたＯＶＸ８３６群（１８０μｇ、３００μｇ、及び４８０μｇ）並びにプールされた非処置（ＦＬＵ－００１研究）及びプラセボ群（ＯＶＸ８３６－００３研究）のＩＴＴ － 治療企図は、ＯＶＸ８３６及びＦＬＵ－００１研究のコホートを統合した。

【発明を実施するための形態】

【0012】

〔詳細な説明〕
定義
本開示がより容易に理解されるようにするために、ある特定の用語を初めに定義する。追加の定義は詳細な説明全体にわたって記載される。

【0013】

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸並びに非天然型アミノ酸（ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）（本明細書では「天然に存在しないアミノ酸」とも称される）、例えば、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸ミメティックを指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるもの、並びに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ－カルボキシグルタミン酸、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素に結合しているアルファ炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有し得るが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学的化合物を指す。「アミノ酸」及び「アミノ酸残基」という用語は、全体にわたって交換可能に使用される。

【0014】

置換とは、天然に存在するアミノ酸を、別の天然に存在するアミノ酸又は非天然型アミノ酸のいずれかで置き換えることを指す。

【0015】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、１本又は複数本の直鎖に配置されたアミノ酸（「ポリペプチド」とも称される）から作られ、球形に折り畳まれている任意の有機化合物を指す。「タンパク質」という用語には、タンパク質性物質又は融合タンパク質が含まれる。そのようなポリペプチド鎖におけるアミノ酸は、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって一緒に結合し得る。「タンパク質」という用語には、限定されないが、ペプチド、一本鎖ポリペプチド、又はアミノ酸の２本以上の鎖から主になる任意の複合タンパク質がさらに含まれる。「タンパク質」という用語には、限定されないが、糖タンパク質又は他の公知の翻訳後修飾がさらに含まれる。「タンパク質」という用語には、天然タンパク質の公知の天然又は人工化学修飾、例えば、限定されないが、糖鎖改変、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化、ＰＡＳ化等、非天然アミノ酸の組込み、化学的コンジュゲーション又は他の分子のためのアミノ酸修飾等がさらに含まれる。

【0016】

「組換えタンパク質」という用語には、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作出、又は単離されたタンパク質、例えば、対応するタンパク質を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された融合タンパク質等が含まれる。

【0017】

本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、遺伝子融合によって、例えば、別個のタンパク質の別々の機能ドメインをコードする少なくとも２つの遺伝子断片の遺伝子融合によって取得されるか又は取得可能な少なくとも１本のポリペプチド鎖を含む組換えタンパク質を指す。本開示のタンパク質融合体には、例えば、少なくともインフルエンザ核タンパク質抗原と少なくとも１種の他の部分とが含まれ、上記他の部分は、以下に記載されるような、Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する自己組織化ポリペプチド及びその正に帯電した尾部を含むキャリアタンパク質である。

【0018】

本明細書で使用される場合、「抗原性」ポリペプチドという用語には、特定のポリペプチド（例えばインフルエンザウイルスの核タンパク質ＮＰ）の免疫原性断片及びエピトープであって、少なくともそのような抗原性ポリペプチドが本明細書に開示されるキャリアタンパク質と融合された場合に、そのような抗原性ポリペプチドに対する免疫応答（例えばＮＰ特異的免疫応答）を誘導することができる、免疫原性断片及びエピトープが含まれる。

【0019】

本明細書で使用される場合、２つの配列間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、以下に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

【0020】

２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮＥＥＤＬＥＭＡＮ、及びＷｕｎｓｃｈ）を使用して決定することができる。

【0021】

２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ペアワイズアラインメント；ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋにおいて利用可能、Ｒｉｃｅら、２０００ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １６：２７６～２７７）等のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅは、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、１０の「ギャップオープンペナルティ」、０．５の「ギャップ伸長ペナルティ」、偽の「エンドギャップペナルティ」、１０の「エンドギャップオープンペナルティ」、及び０．５の「エンドギャップ伸長ペナルティ」で使用され得る。一般的に、「同一性パーセント」は、比較した位置の数で割られ、１００を掛けられる、一致した位置の数の関数である。例えば、アラインメント後の２つの比較された配列の間で、１０の配列位置のうち６つが同一である場合、同一性は６０％である。同一性％は、典型的には、解析が実施される問合せ配列の全長にわたって決定される。同じ一次アミノ酸配列又は核酸配列を有する２つの分子は、任意の化学的及び／又は生物学的修飾にかかわらず同一である。

【0022】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語には、任意のヒト又は非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語には、好ましくは、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ等が含まれる。

【0023】

本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「バリアント」とは、対応する天然ポリペプチドと比較される、例えば典型的にはアミノ酸置換、欠失、又は挿入によって取得される天然又は人工変異体バリアントであり得る。ある特定の実施形態では、バリアントは、親ポリペプチドと比較して、バリアントの配列全体にわたってアミノ酸欠失、挿入、又は置換の組合せを有し得る。

【0024】

本開示の文脈では、保存的置換とは、以下：
脂肪族残基Ｉ、Ｌ、Ｖ、及びＭ
シクロアルケニル会合残基Ｆ、Ｈ、Ｗ、及びＹ
疎水性残基Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹ
負に帯電した残基Ｄ及びＥ
極性残基Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＴ
正に帯電した残基Ｈ、Ｋ、及びＲ
小さな残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、及びＶ
非常に小さな残基Ａ、Ｇ、及びＳ
回転に関与する残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ、及び形成に関与する残基Ｔ
柔軟な残基Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、及びＲ
の通りに示されるアミノ酸のクラス内での置換によって定義することができる。

【0025】

「機能的バリアント」とは、天然ポリペプチドの目的の特性を保持するバリアントである。

【0026】

好ましい実施形態では、バリアントは、天然ポリペプチド配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0027】

したがって、参照配列、特に本明細書に開示されるＮＰ融合タンパク質に対して置換、挿入及び／又は付加、欠失、並びに共有結合修飾を含有するポリペプチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグ又はアミノ酸、例えば１つ若しくは複数のリジンは、ペプチド配列に（例えば、Ｎ末端又はＣ末端において）付加することができる。配列タグは、ペプチド検出、精製、又は局在化のために使用され得る。リジンは、ペプチド溶解性を高めるため、又はビオチン化を可能にするために使用され得る。或いは、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基は、任意選択で、切断型配列をもたらすように欠失していてもよい。或いは、ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基又はＮ末端残基）は、例えば、可溶性であるか又は固体支持体に連結されるより大きな配列の一部としての配列の発現などの、配列の使用に応じて欠失していてもよい。
インフルエンザ核タンパク質抗原
本明細書で使用される場合、「インフルエンザ核タンパク質抗原」という用語は、任意の天然インフルエンザ核タンパク質又はそれらの抗原性バリアントを指す。

【0028】

天然インフルエンザ核タンパク質としては、インフルエンザウイルスのＡ、Ｂ、及びＣ型の３つのいずれか、好ましくはＡ型の核タンパク質が挙げられる。

【0029】

一部の実施形態では、核タンパク質抗原（ＮＰ）は、インフルエンザＡ若しくはインフルエンザＢのウイルス株、又はそれらの組合せに由来する。一部の実施形態では、インフルエンザＡ又はインフルエンザＢの株は、トリ、ブタ、ウマ、イヌ、ヒト、又は非ヒト霊長類に関連する。一部の実施形態では、ウイルス株は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９、及びＨ１０Ｎ８からなる群から選択される。

【0030】

具体的な実施形態では、インフルエンザ核タンパク質抗原は、配列番号１のポリペプチドを含む、インフルエンザウイルスＡの、より具体的には、株Ａ／Ｗｉｌｓｏｎ－Ｓｍｉｔｈ／１９３３ Ｈ１Ｎ１由来のＮＰ抗原である。

【0031】

具体的な実施形態では、抗原性バリアントは、好ましくは配列番号１に由来する、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ、又はＣの野生型核タンパク質の少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、４９０の連続するアミノ酸残基を有するインフルエンザ核タンパク質抗原の断片である。インフルエンザ核タンパク質抗原の断片は、定義上、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ、又はＣの全長野生型核タンパク質よりも少なくとも１アミノ酸短い。

【0032】

具体的な実施形態では、インフルエンザ核タンパク質抗原の抗原性バリアントは、好ましくは、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ、又はＣの核タンパク質の対応する野生型配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する抗原性ポリペプチドバリアントである。好ましくは、インフルエンザ核タンパク質抗原の抗原性バリアントは、配列番号１に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する抗原性ポリペプチドバリアントである。

【0033】

特定の実施形態では、前記バリアントは、特に配列番号１の天然インフルエンザＮＰ抗原と比較した場合、天然又は非天然アミノ酸（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）でのアミノ酸置換のみ、好ましくは天然アミノ酸での１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換のみによって、対応するインフルエンザ核タンパク質天然抗原と異なる。具体的な実施形態では、バリアントは、配列番号１の天然インフルエンザＮＰ抗原と比較して、天然アミノ酸での１、２、又は３つのアミノ酸置換を有する変異体バリアントである。

【0034】

より具体的な実施形態では、前記変異体バリアントのアミノ酸配列は、大半が保存的アミノ酸置換によって天然インフルエンザＮＰ抗原と異なっていてもよく、例えば、バリアントにおける置換のうちの少なくとも１０、例えば少なくとも９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つが保存的アミノ酸残基置換えである。

【0035】

より保存的な置換の分類としては、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンが挙げられる。任意のインフルエンザＮＰ抗原の、典型的には配列番号１の親ポリペプチドと比較される、疎水性親水性指標／親水性特性及び残基重量／サイズの点での保存もまた、バリアント変異体ポリペプチドに実質的に保持され得る。

【0036】

具体的な実施形態では、変異体バリアントは、上で定義された保存的アミノ酸置換によって別の天然アミノ酸と置き換えられている１、２、又は３つのアミノ酸残基を除いて、配列番号１と同一であるポリペプチドを含む。

【0037】

具体的な実施形態では、ＮＰ抗原のバリアントは、例えばｗｗｗ．ＩＥＤＢ．ｏｒｇでアクセス可能なＩＥＤＢデータベース（免疫エピトープデータベース）に記載されているような、ヒト免疫系によって認識されるエピトープにおいて、配列番号１の親ポリペプチドと比較していかなる変異も含まない。具体的な実施形態では、ＮＰ抗原のバリアントは、株ＡのＮＰと株ＢのＮＰとの間で保存されているアミノ酸残基において、配列番号１の親ポリペプチドと比較していかなる変異も含まない。本明細書で使用される場合、「保存されているアミノ酸残基」は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するもの等の標準的な配列タンパク質アラインメントを使用してアラインメントした場合に株ＡのＮＰと株ＢのＮＰとの間で同一であるアミノ酸残基に対応する。

【0038】

アミノ酸残基Ｅ_３３９及びＲ_４１６（Ｎ末端メチオニンをＭ_１として付番）は、ＮＰの自己組織化に必須であり、且つインフルエンザＡウイルスの遺伝的多様性の影響を受けない。したがって、具体的な実施形態では、ＮＰ抗原のバリアントはＥ３３９及びＲ４１６を含む。

【0039】

キャリアタンパク質
本明細書で使用される場合、「キャリアタンパク質」という用語は、概して、抗原がコンジュゲート又は融合し、それによって抗原をより免疫原性にするタンパク質を示す。本明細書では、「キャリアタンパク質」という用語は、抗原を運搬するタンパク質という意味で具体的に使用される。キャリアタンパク質の機能は、キャリアタンパク質がコンジュゲート又は融合する前記抗原の免疫原性を高めることである。

【0040】

融合タンパク質における使用のためのキャリアタンパク質は、Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する自己組織化ポリペプチド及び正に帯電した尾部を含む。補体阻害因子であるＣ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）は、マウスで最初に発見された豊富な血漿タンパク質である。Ｃ４ｂｐの天然の機能は、補体活性化の古典的経路及びレクチン経路を阻害することである。Ｃ４ｂｐアルファ鎖遺伝子の最後のエクソンは、補体制御タンパク質ファミリーに属していないタンパク質における唯一のドメインをコードする。この非補体制御タンパク質ドメインは、ヒトでは５７のアミノ酸残基、マウスでは５４のアミノ酸残基を含有し、Ｃ４ｂｐのオリゴマー化に必要且つ十分である。抗原と融合した場合、前記自己組織化ポリペプチドもまた、結果として得られる融合タンパク質のオリゴマー化に必要且つ十分であることが見出されている。

【0041】

国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２７１７及び国際出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０８９２６は、哺乳動物における抗原の免疫原性を高めるための、哺乳動物Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインの使用を記載している。国際公開第２００７／０６２８１９号は、ニワトリ種のＣ４ｂｐオリゴマー化ドメイン及びそのバリアントをさらに記載している。

【0042】

好ましい実施形態では、自己免疫反応を最小化するために、自己組織化ポリペプチドは、３０％未満、好ましくは２０％未満のヒトＣ４ｂｐに対する同一性を有する。

【0043】

特に、具体的な実施形態では、Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する前記自己組織化ポリペプチドは、配列番号２を含むか又は配列番号２から本質的になる。

【0044】

具体的な実施形態では、自己組織化ポリペプチドの機能的バリアントは、配列番号２に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する。

【0045】

機能的バリアントには、配列番号２と比較して１つ又は複数のアミノ酸付加、欠失、及び／又は置換を有する、配列番号２のポリペプチドの自己組織化特性を保持する任意のバリアントが含まれ得る。

【0046】

特定の実施形態では、前記バリアントは、天然又は非天然アミノ酸でのアミノ酸置換のみ、好ましくは天然アミノ酸での１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換のみによって、配列番号２と異なる。具体的な実施形態では、バリアントは、配列番号２と比較して、天然アミノ酸での１、２、又は３つのアミノ酸置換を有する変異体バリアントである。

【0047】

より具体的な実施形態では、前記変異体バリアントのアミノ酸配列は、大半が保存的アミノ酸置換によって配列番号２の自己組織化ポリペプチドと異なっていてもよく、例えば、バリアントにおける置換のうちの少なくとも１０、例えば少なくとも９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つが保存的アミノ酸残基置換えである。

【0048】

キャリアタンパク質は、正に帯電したペプチドからなるＣ末端尾部をさらに含む。Ｃ末端尾部は、好ましくは、少なくとも５０％が正に帯電したアミノ酸である６～１０アミノ酸からなるペプチドである。正電荷を有するアミノ酸としては、アルギニン又はリジンが挙げられる。そのような正に帯電したペプチドの例は、国際公開第２０１４／０９０９０５号及び同第２０１４／１４７０８７号に開示されている。

【0049】

好ましい実施形態では、前記正に帯電した尾部は、配列ＺＸＢＢＢＢＺ（配列番号３）（ここで、（ｉ）Ｚは存在しないか又は任意のアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｘは任意のアミノ酸であり、（ｉｉｉ）Ｂはアルギニン又はリジンである）を含み、好ましくは、前記正に帯電した尾部は、配列番号４の配列を含むか又は配列番号４の配列から本質的になる。

【0050】

より好ましい実施形態では、前記キャリアタンパク質は、配列番号５のポリペプチドに対応するＯＶＸ３１３ポリペプチドから本質的になる。

【0051】

具体的な実施形態では、前記キャリアタンパク質は、配列番号５に対して少なくとも７０％、８０％、又はより好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する、配列番号５のＯＶＸ３１３ポリペプチドの機能的バリアントである。

【0052】

他の実施形態では、前記キャリアタンパク質は、アミノ酸置換によって１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸のみが配列番号５と異なる、配列番号５のＯＶＸ３１３ポリペプチドの機能的バリアントである。他の実施形態では、前記キャリアタンパク質は、保存的アミノ酸置換によって１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸のみが配列番号５と異なる、配列番号５のＯＶＸ３１３ポリペプチドの機能的バリアントである。

【0053】

ＮＰ融合タンパク質
本開示に記載の使用のための融合タンパク質は、
（ｉ）上で定義されたインフルエンザ核タンパク質抗原と、
（ｉｉ）Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する自己組織化ポリペプチド及び正に帯電した尾部を含む、上で定義されたキャリアタンパク質と
を含む。

【0054】

結果として得られる、核タンパク質抗原を有する融合タンパク質は、読みやすさのために、以降では「ＮＰ融合タンパク質」と称す。

【0055】

具体的な実施形態では、キャリアタンパク質は、Ｃ末端で核タンパク質抗原と、任意選択でペプチドリンカーを介して融合している。ペプチドリンカーは、融合タンパク質に対して一般的に使用される任意の短いペプチドリンカーであり得る。好ましいペプチドリンカーとしては、グリシン－セリンリンカー、例えばジペプチドｇｌｙ－ｓｅｒ、又はｇｌｙ－ｓｅｒ－ｓｅｒ－ｓｅｒ、又は（ｇｌｙ－ｓｅｒ－ｓｅｒ－ｓｅｒ）ｎ（ここで、ｎは１～４の間の整数である）が挙げられる。

【0056】

具体的な実施形態では、前記ＮＰ融合タンパク質は、自己組織化後に七量体粒子を形成する。

【0057】

具体的な実施形態では、前記ＮＰ融合タンパク質は、自己組織化後に１５～１００ｎｍの間の直径を有する粒子を形成する。前記粒子の直径は、例えば動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定され得る。ＤＬＳは、おおよそ０．３ｎｍ～１０μｍのサイズ範囲の粒子の流体力学的直径を測定する。ＤＬＳ測定は、温度及び分散媒粘度に非常に感受性である。したがって、温度は２５℃で一定に保つ必要があり、分散媒の粘度も把握している必要がある。

【0058】

具体的な実施形態では、前記ＮＰ融合タンパク質は、４４０～２２００ｋＤａの間の分子量を有する粒子を形成する。

【0059】

より好ましい実施形態では、前記ＮＰ融合タンパク質は、配列番号６のポリペプチドに対応するＯＶＸ８３６ポリペプチドから本質的になる。

【0060】

具体的な実施形態では、前記ＮＰ融合タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも７０％、８０％、又はより好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するＯＶＸ８３６ポリペプチドの機能的バリアントである。

【0061】

他の実施形態では、前記ＮＰ融合タンパク質は、アミノ酸置換によって１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸のみが配列番号６と異なる、配列番号６のＯＶＸ８３６ポリペプチドの機能的バリアントである。他の実施形態では、前記ＮＰ融合タンパク質は、保存的アミノ酸置換によって１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸のみが配列番号６と異なる、ＯＶＸ８３６ポリペプチドの機能的バリアントである。

【0062】

ＮＰ融合タンパク質を調製するための方法
本開示に記載の使用のためのＮＰ融合タンパク質は、遺伝暗号を使用して、及び任意選択で宿主細胞種に応じたコドンバイアスを考慮してヌクレオチド配列が容易に得られる前記ＮＰ融合タンパク質をコードする核酸分子を使用する、組換えタンパク質を調製するための任意の従来の方法によって調製することができる。

【0063】

ＮＰ融合タンパク質を調製するために使用することができるヌクレオチド配列の例は、典型的には表２及び３に記載されている配列番号１～６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。

【0064】

核酸分子は、アミノ酸配列から得られ、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるタンパク質発現について最適化され得る。

【0065】

核酸は、細胞溶解液中の全細胞に存在し得るか、又は部分的に精製されたか若しくは実質的に純粋な形態の核酸であり得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法によって他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製された場合、「単離される」か又は「実質的に純粋になる」。本開示の核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含有していてもしていなくてもよい。一実施形態では、核酸は、ベクター、例えば組換えプラスミドベクターに存在してもよい。

【0066】

核酸は、標準的な分子生物学的技法を使用して取得することができる。核タンパク質抗原をコードするＤＮＡ断片が取得された後、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ技法によってさらに操作することができる。これらの操作において、例えば核タンパク質抗原をコードするＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ分子、例えばキャリアタンパク質をコードする断片及び任意選択でリンカーに作動的に連結され得る。

【0067】

「作動的に連結」という用語は、上記文脈で使用される場合、例えば、２つのＤＮＡ断片によってコードされているアミノ酸配列がインフレームのままとなるように、又はタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現するように、２つのＤＮＡ断片が機能的に結合されることを意味することが意図される。

【0068】

次いで、本開示に記載の使用のためのＮＰ融合タンパク質（特にＯＶＸ８３６）は、例えば、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法と遺伝子トランスフェクション法との組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて作製することができる。

【0069】

例えば、ＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）、その対応する断片を発現させるために、部分又は全長組換えタンパク質をコードするＤＮＡが、標準的な分子生物学的又は生化学的技法（例えば、ＤＮＡ化学合成、ＰＣＲ増幅、又はｃＤＮＡクローニング）によって取得され得、上記ＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動的に連結されるように発現ベクターに挿入され得る。

【0070】

上記文脈において、「作動的に連結」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、組換えＮＰ融合タンパク質の転写及び翻訳を調節するという所期の機能を果たすように、コードポリペプチド配列がベクターにライゲーションされることを意味することが意図される。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合性となるように選択される。タンパク質コード遺伝子は、標準によって発現ベクターに挿入される。

【0071】

組換え発現ベクターは、宿主細胞からの組換え融合タンパク質の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。ＮＰ融合タンパク質コード遺伝子は、シグナルペプチドが組換えタンパク質のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、Ｃ４ｂｐの天然シグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非Ｃ４ｂｐタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。具体的な実施形態では、シグナルペプチドはメチオニンアミノ酸である。

【0072】

ＮＰ融合タンパク質コード配列に加えて、本明細書に開示される組換え発現ベクターは、宿主細胞における組換え融合タンパク質の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー、及びタンパク質コード遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれることが意図される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベル等のような因子に依存し得ることは、当業者によって理解されるだろう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列としては、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが挙げられる。或いは、ユビキチンプロモーター又はＰ－グロビンプロモーター等の非ウイルス調節配列が使用されてもよい。さらに、異なる供給源由来の配列から構成された調節エレメント、例えばＳＶ４０初期プロモーター由来の配列とヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長鎖末端反復配列とを含有するＳＲａプロモーターシステムが使用されてもよい。

【0073】

ＮＰ融合タンパク質コード配列及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）及び選択マーカー遺伝子を保有してもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらの、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、及び同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキセート等の薬物に対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ－宿主細胞におけるメトトレキセート選択／増幅との使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。

【0074】

ＮＰ融合タンパク質の発現のために、組換えタンパク質をコードする発現ベクター（複数可）は、標準的な技法によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形は、外来ＤＮＡの原核又は真核宿主細胞への導入のために一般的に使用される多種多様な技法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション等を包含することが意図される。本開示のタンパク質を原核宿主細胞又は真核宿主細胞のいずれかにおいて発現させることは理論的に可能である。ＮＰタンパク質の発現は、原核細胞、例えば大腸菌宿主細胞において実行され得る。次いで、ＮＰ融合タンパク質は、細菌細胞の溶解、及び標準的な精製手順を使用したさらなる精製によって回収され得る。具体的な実施形態では、ＮＰ融合タンパク質は、ＤｅｌＣａｍｐｏ ２０２１（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｄｏｉ：１０／３３８９／ｆｉｍｍ．２０２１．６７８４８３に開示されている方法に従って作製される。

【0075】

免疫原性組成物
別の態様では、本開示は、組成物、例えば、３００μｇ／ｍＬ以上の濃度の先の節に記載されているＮＰ融合タンパク質と、１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤とを含有する免疫原性組成物を提供する。

【0076】

免疫原性組成物は、非経口、鼻腔内、筋肉内、又は皮下投与（例えば、筋肉内注射による）に好適な任意の水性ビヒクルを含む。これらの水性ビヒクルは、特に等張滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、塩化カルシウム若しくはマグネシウム等、又はそのような塩の混合物）であり得る。

【0077】

具体的な実施形態では、前記ＮＰ融合タンパク質は、少なくとも４００のアミノ酸残基、例えば４００～６００の間のアミノ酸残基、例えば５４０～５６０の間のアミノ酸残基を含み、任意選択で、前記ＮＰ融合タンパク質は、本明細書に開示されるように、前記免疫原性組成物において、１５～１００ｎｍの間の直径を有する粒子を形成する、及び／又は４４０～２２００ｋＤａの間の分子量を有する。

【0078】

例えば、前記免疫原性組成物は、１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤と一緒に製剤化された、３００μｇ／ｍＬ以上の濃度の、配列番号６のポリペプチド（ＯＶＸ８３６）又は配列番号６に対して少なくとも７０％、８０％、好ましくは少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有するバリアントを含む水性組成物である。

【0079】

具体的な実施形態では、前記免疫原性組成物は、以下の賦形剤、例えば、緩衝液、塩、浸透圧調節物質、抗酸化剤、並びにバイアル表面におけるタンパク質喪失及び／又はタンパク質凝集を予防するための界面活性剤又は他の薬剤のうちの１つ又は複数をさらに含み得る。

【0080】

医薬組成物の形態、投与経路、投薬量、及びレジメンは、処置される状態、疾病の重症度、患者の年齢、体重、及び性別等に当然依存する。

【0081】

筋肉内投与の場合、例えば、組成物は、必要に応じて好適に緩衝され得る水性溶液、及び初めに十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にされる液体希釈剤である。これに関連して、用いられ得る滅菌水性媒体は、本開示を考慮することで当業者に知られるだろう。例えば、１回分の投薬量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され得る。注射溶液の製剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２３版、２０２０年に提供されている。投薬量のある程度の変更は、処置されている対象の状態に応じて行ってもよい。

【0082】

具体的な実施形態では、前記組成物のｐＨは、６．０～７．０の間、好ましくは６．３～６．６の間、例えば約６．５である。

【0083】

具体的な実施形態では、前記免疫原性組成物は、３００～６００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは４００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、例えば約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度を有する。
具体的な実施形態では、前記免疫原性組成物は、
（ｉ）６．０～７．０の間、好ましくは６．３～６．６の間、例えば約６．５のｐＨのための緩衝剤と、
（ｉｉ）３００～６００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは４００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、例えば約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度の有効量の浸透圧調節物質と
を有する。

【0084】

６．０～７．０の間のｐＨのための緩衝剤の例としては、クエン酸ナトリウム又はリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液が挙げられる。
具体的な実施形態では、前記免疫原性組成物は、ＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）に加えて、少なくとも
塩、例えば硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウム、好ましくは硫酸ナトリウム、
浸透圧調節物質、例えば糖、例えばトレハロース又はマルトース、好ましくはトレハロース、
緩衝液、例えばリン酸緩衝液及び／又はクエン酸緩衝液、
任意選択で、抗酸化剤、例えばメチオニン、
任意選択で、界面活性剤、例えばポリソルベート８０
をさらに含み、組成物のｐＨは、６．０～７．０の間、典型的には６．３～６．６の間であり、重量モル浸透圧濃度は、３００～６００ｍＯｓｍ／ｋｇの間である。

【0085】

具体的な実施形態では、前記免疫原性組成物は、ＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）に加えて、少なくとも
塩、
トレハロース、
６．０～７．０の間のｐＨのための緩衝剤、例えばリン酸緩衝液及び／又はクエン酸緩衝液、
任意選択で、抗酸化剤、例えばメチオニン、
任意選択で、界面活性剤、例えばポリソルベート８０
をさらに含む。

【0086】

より具体的な実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、少なくともＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）に加えて、
硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウム、好ましくは硫酸ナトリウム、
糖、好ましくはトレハロース、
リン酸緩衝液及び／又はクエン酸緩衝液、
任意選択で、抗酸化剤、例えばメチオニン、
任意選択で、界面活性剤、例えばポリソルベート８０
を含み、重量モル浸透圧濃度は、３００～６００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは４００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、典型的には４５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。

【0087】

好ましい実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、少なくともＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）に加えて、
約７５ｍＭの濃度の硫酸ナトリウム、
約２００ｍＭの濃度のトレハロース、
任意選択で、０．０２％～０．０８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の間、例えば約０．０４％の濃度の界面活性剤、例えばポリソルベート８０、
任意選択で、約５ｍＭの濃度の抗酸化剤、例えばＬ－メチオニン
を含む。

【0088】

好ましい実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、少なくともＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）に加えて、
約７５ｍＭの濃度の硫酸ナトリウム、
約２００ｍＭの濃度のトレハロース、
０．０２％～０．０８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の間、例えば約０．０４％の濃度のポリソルベート８０
約５ｍＭの濃度のＬ－メチオニン
を含む。

【0089】

具体的な実施形態では、前記免疫原性組成物は、いかなるアジュバントも含まない。

【0090】

具体的な実施形態では、免疫原性組成物は、直ちに使用できる滅菌注射溶液として製剤化されている。

【0091】

滅菌注射溶液は、必要とされる量の活性化合物、すなわちＮＰ融合タンパク質を、上に列挙された様々な他の成分を含有する適切な溶媒に必要に応じて組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。

【0092】

ＮＰ融合タンパク質及びＮＰ融合タンパク質の免疫原性組成物の使用の方法
先の節に記載されているＮＰ融合タンパク質（特にＯＶＸ８３６）及びＮＰ融合タンパク質（特にＯＶＸ８３６）の免疫原性組成物（特に少なくとも３００μｇ／ｍＬのＯＶＸ８３６を含む）は、インフルエンザ疾患の予防又は処置を必要とするヒト対象におけるインフルエンザ疾患の予防又は処置におけるワクチン又は免疫療法として有用である。

【0093】

したがって、本開示は、ヒト及び他の哺乳動物におけるインフルエンザウイルスの予防及び／又は処置のための、組成物（例えば、先の節に記載されている免疫原性組成物）、方法、キット、及び試薬を提供する。本明細書に開示される免疫原性組成物は、治療剤又は予防剤として使用することができる。本明細書に開示される免疫原性組成物は、インフルエンザ疾患を予防及び／又は処置するための医薬に使用されてもよい。例示的な態様では、本開示の免疫原性組成物は、インフルエンザウイルスからの予防的防御を実現するために使用される。インフルエンザウイルスからの予防的防御は、典型的には１８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２４０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、３００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、又は４８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６を有する本開示の免疫原性組成物の投与後に達成することができる。免疫原性組成物は、１回、２回、３回、又は４回以上、好ましくは単回用量として投与され得る。あまり望ましいことではないが、免疫原性組成物を感染した個体に投与して、治療反応を達成することは可能である。投薬は、適宜調整が必要となる場合がある。

【0094】

一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、対象におけるインフルエンザウイルス感染症を予防する方法であって、前記対象に、典型的には１８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２４０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、３００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、又は４８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６を有する本明細書において提供される少なくとも１種の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法として使用することができる。

【0095】

一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、対象における一次インフルエンザウイルス感染症を阻害する方法であって、前記対象に、典型的には１８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２４０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、３００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、又は４８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６を有する本明細書において提供される少なくとも１種の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法として使用することができる。一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、対象におけるインフルエンザウイルス感染症を処置する方法であって、前記対象に、典型的には１８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２４０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、３００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、又は４８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６を有する本明細書において提供される少なくとも１種の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法として使用することができる。

【0096】

一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、対象におけるインフルエンザウイルス感染症の発生率を低下させる方法であって、前記対象に、典型的には１８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２４０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、３００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、又は４８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６を有する本明細書において提供される免疫原性組成物を少なくとも投与するステップを含む方法として使用することができる。

【0097】

一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、インフルエンザウイルスに感染した第１の対象からインフルエンザウイルスに感染していない第２の対象へのインフルエンザウイルスの伝播を阻害する方法であって、前記第１の対象及び前記第２の対象の少なくとも一方に、典型的には１８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２４０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、３００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、又は４８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６を有する本明細書において提供される少なくとも１種の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法として使用することができる。

【0098】

本開示の一部の実施形態は、対象において抗原ＮＰ特異的免疫応答を誘導する方法であって、対象に、ＮＰ特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量の本明細書において提供される免疫原性組成物のいずれか（好ましくはＯＶＸ８３６を有する免疫原性組成物）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、抗原ＮＰ特異的免疫応答は、総Ｔ細胞応答（特にＣＤ４又はＣＤ８ ＮＰ特異的Ｔ細胞応答）又はＢ細胞応答（特異的抗ＮＰ ＩｇＧ応答）を含む。

【0099】

一部の実施形態では、抗原ＮＰ特異的免疫応答を生じさせる方法は、対象に、単回用量の本開示の免疫原性組成物（典型的にはＯＶＸ８３６を有する、例えば１８０μｇ以上、２００μｇ以上、２４０μｇ以上、３００μｇ以上、又は４８０μｇ以上の単回用量）を投与するステップを含む。

【0100】

一部の実施形態では、免疫原性組成物（典型的にはＯＶＸ８３６を有する）は、対象に、皮内注射、筋肉内注射、又は鼻腔内投与によって投与される。一部の実施形態では、免疫原性組成物（典型的にはＯＶＸ８３６を有する）は、対象に、筋肉内注射によって投与される。

【0101】

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、対象において抗原ＮＰ特異的免疫応答を生じさせる有効量のＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）において製剤化される。

【0102】

実施例に示されるデータは、特に１８０μｇの単回用量のＯＶＸ８３６を有する本明細書に開示される免疫原性組成物を使用して、有意な増強された免疫応答を実証する。

【0103】

一部の実施形態では、ＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）の有効量は、１８０μｇ～１０００μｇ、２００μｇ～１０００μｇ、２４０μｇ～１０００μｇ、又は３００μｇ～１０００μｇ、又は４８０μｇ～１０００μｇの単回用量である。一部の実施形態では、ＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）の有効量は、ヒト対象に投与される１８０μｇ超の単回用量である。一部の実施形態では、ＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）の有効量は、ヒト対象に投与される２００μｇ以上である。一部の実施形態では、ＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）の有効量は、ヒト対象に投与される２４０μｇ以上である。一部の実施形態では、ＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）の有効量は、ヒト対象に投与される３００μｇ以上である。一部の実施形態では、ＮＰ融合タンパク質（典型的にはＯＶＸ８３６）の有効量は、ヒト対象に投与される４８０μｇ以上である。

【0104】

具体的な実施形態では、免疫応答は、注射日（１日目）におけるＮＰ特異的ＩＦＮ－γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６ＰＢＭＣのベースライン数と比較した、１回目の注射の少なくとも８日後（８日目又は２９日目）におけるＮＰ特異的ＩＦＮ－γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６ＰＢＭＣの増加を測定することによって決定され得る。

【0105】

一部の実施形態では、前記対象は、免疫原性組成物の１回目の投薬、例えば、１８０μｇ以上のＯＶＸ８３６を含む免疫原性組成物の１回目の投薬から８日目の後に、ベースライン（１日目、注射前）と比較して、ＮＰ特異的ＩＦＮ－γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６ＰＢＭＣの少なくとも５０％、７０％、９０％、１１０％、１３０％の増加を呈する。

【0106】

具体的な実施形態では、免疫応答は、注射日（１日目）におけるベースライン数と比較した、１回目の注射の少なくとも８日後（８日目又は２９日目）におけるＮＰ特異的ＣＤ４＋Ｔスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６ＰＢＭＣの増加を測定することによって決定され得る。

【0107】

一部の実施形態では、前記対象は、免疫原性組成物の１回目の投薬、例えば、１８０μｇ以上のＯＶＸ８３６を含む免疫原性組成物の１回目の投薬から８日目の後に、ベースライン（１日目、注射前）と比較して、ＮＰ特異的ＣＤ４＋スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６ＰＢＭＣの少なくとも１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％の増加を呈する。

【0108】

一部の実施形態では、前記対象は、免疫原性組成物の１回目の投薬、例えば、１８０μｇ以上のＯＶＸ８３６を含む免疫原性組成物の１回目の投薬から８日目の後に、ベースライン（１日目、注射前）と比較して、ＮＰ特異的ＣＤ８＋スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６ＰＢＭＣの少なくとも２０％、３０％、５０％、７５％、又は１００％の増加を呈する。

【0109】

実施例に示されるデータはまた、症候性インフルエンザを防御しない９０μｇの単回用量と比較した、特に症候性インフルエンザ（ＩＬＩ）の新たな症例の発生を予防する１８０μｇ以上の単回用量のＯＶＸ８３６を有する本明細書に開示される免疫原性組成物を使用したワクチンの有意な向上した有効性を実証する。

【0110】

一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、インフルエンザ疾患、好ましくは重度のインフルエンザに対する有効性を必要とする対象に、インフルエンザ疾患、好ましくは重度のインフルエンザに対する有効性をもたらす方法であって、前記対象に、１８０μｇ以上、２００μｇ以上、２４０μｇ以上、３００μｇ以上、又は４８０μｇ以上の用量の本明細書において提供される免疫原性組成物（典型的にはＯＶＸ８３６を有する）を投与するステップを含む方法として使用することができる。

【0111】

一部の実施形態では、ワクチン有効性は、プラセボ又は９０μｇの用量のＯＶＸ８３６と比較した、典型的には１８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、２４０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、３００μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６、又は４８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６を有する本開示の免疫原性組成物を用いて処置された患者集団における注射の１４日後のインフルエンザ様疾病（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｌｉｋｅ ｉｌｌｎｅｓｓ）の数の有意な減少によって決定され得る。

【0112】

本明細書で使用される場合、「インフルエンザ様疾病」又は「ＩＬＩ」という用語は、発熱の臨床観察、又は以下の症状：悪寒、頭痛、倦怠感、筋肉痛、咳、咽頭炎、及び他の呼吸器愁訴のうちの２つ以上の突発の臨床観察を指す。

【0113】

一部の実施形態では、患者集団は、典型的には１８０μｇ以上の用量のＯＶＸ８３６を有する本開示の免疫原性組成物を用いて処置された場合、プラセボ又は９０μｇの用量のＯＶＸ８３６を投与された患者集団と比較して、注射の１４日後にインフルエンザ様疾病の少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、又は９５％の低下を呈する。

【0114】

一部の実施形態では、ワクチンとしての使用のための本開示の免疫原性組成物（典型的にはＯＶＸ８３６を含む）は、対象を重度のインフルエンザから防御する。

【0115】

本明細書で使用される場合、「重度のインフルエンザ」という用語は、以下の臨床像：
呼吸困難、頻呼吸、又は低酸素
下気道疾患の放射線学的徴候
中枢神経系合併症（例えば、脳症、脳炎）
重度の脱水
急性腎不全
敗血症性ショック
喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性肝若しくは腎不全、糖尿病、又は他の心血管状態を含む慢性基礎疾患の急性憎悪
入院を必要とする任意の他のインフルエンザ関連状態又は臨床像
のうちの少なくとも１つを示す、インフルエンザ様疾病（ＩＬＩ；発熱及び咳又は咽喉痛の突然発症）の定義を指す。

【0116】

一部の実施形態では、ワクチンとしての使用のための本開示の免疫原性組成物（典型的にはＯＶＸ８３６を含む）は、対象を、重度のインフルエンザ疾患の１つ又は複数の重度の症状から防御する。

【0117】

一部の実施形態では、ワクチンとしての使用のための免疫原性組成物は、対象をインフルエンザに対して最大２年間免疫化する。一部の実施形態では、ワクチンとしての使用のための免疫原性組成物は、対象をインフルエンザに対して２年超、３年超、４年超、又は５～１０年間免疫化する。

【0118】

一部の実施形態では、対象は、約２０歳～約５０歳の間の年齢（例えば、約２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０歳）の若年成人である。

【0119】

一部の実施形態では、対象は５０歳超、例えば、約６０歳又は約７０歳以上（例えば、約６０、６５、７０、７５、８０、８５、又は９０歳）の高齢対象である。

【0120】

一部の実施形態では、対象はインフルエンザに曝露されたことがあるか、対象はインフルエンザに感染しているか、又は対象はインフルエンザによる感染のリスクがある。

【0121】

他の態様では、本開示は、ワクチンとしての使用のための免疫原性組成物、又は対象にワクチン接種する方法であって、対象に、典型的にはＯＶＸ８３６を含む、より好ましくは少なくとも３００μｇ／ｍＬの濃度で製剤化された本明細書に開示される免疫原性組成物を投与するステップを含み、１８０μｇ～３００μｇ、３００μｇ～４８０μｇ、若しくは４８０μｇ～１０００μｇの単回用量の前記ＮＰ融合タンパク質、典型的にはＯＶＸ８３６が対象に投与される、方法に関する。好ましくは、前記方法では、前記免疫原性ワクチンは筋肉内注射によって投与される。

【0122】

他の態様では、本開示は、ヒト対象におけるインフルエンザの予防に使用するためのワクチンの調製における、上に記載した融合タンパク質の使用であって、１８０μｇ以上の量、例えば１８０μｇ～１０００μｇの間に含まれる量の前記融合タンパク質が前記ヒト対象に投与される、使用に関する。

【0123】

一部の実施形態では、免疫原性組成物（典型的にはＯＶＸ８３６を有する）は、インフルエンザの１種若しくは複数種の不活化株、及び／又は１種若しくは複数種のインフルエンザ株由来の効率的な量のヘマグルチニンＨＡ抗原を含む、インフルエンザに対する第２の免疫原性組成物と組み合わされて、同時に又は逐次に、好ましくは同時に対象に投与される。例えば、前記第２の免疫原性組成物は、インフルエンザウイルス株Ａ及びＢの不活化株の混合物、例えば株Ａ Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、及びＢの混合物を含む。具体的な実施形態では、前記第２の免疫原性組成物はフルアリックスである。

【0124】

本明細書で使用される場合、「組合せ」、「併用投与」、又は「同時投与」という用語は、少なくとも２種の有効成分、例えば別個の抗原又は抗原決定基を有する２種の免疫原性組成物の併用投与を指し、ここで、本明細書に開示されるＮＰ融合タンパク質を含む第１の免疫原性組成物は、第２のワクチン又は免疫原性組成物と同時に又は時間間隔内に別個に、それらを必要とする同じ対象に投与され、上記時間間隔は、組み合わされた有効成分がインフルエンザ、典型的にはインフルエンザ障害に対する免疫応答又は防御に関する協同又は相乗効果を示すことを可能にする。同時の又は時間間隔内の別個の送達方法は本明細書に記載される範囲に含まれるが、免疫原性組成物が同時に投与されなければならない、及び／又は送達のために一緒に製剤化されなければならない、ということを含意することは意図されていない。「組合せ」、「併用投与」、又は「同時投与」という用語が、活性（免疫原性）剤が必ずしも同じ投与経路によって投与されるわけではないレジメンを包含することもまた意図される。

【0125】

具体的な実施形態では、１用量の、３００又は４８０μｇのＯＶＸ８３６の免疫原性組成物は、筋肉内注射によって、１用量の、インフルエンザの１種若しくは複数種の不活化株又はインフルエンザヘマグルチニン抗原を含む第２の免疫原性組成物（例えばフルアリックスワクチン）（第２の免疫原性組成物もまた筋肉内注射を介して投与され得る）と同時に投与される。

【0126】

本発明を、以下の図面及び実施例によってさらに示す。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いかなる点においても本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0127】

具体的な実施形態
Ｅ１．インフルエンザ疾患の予防又は処置を必要とするヒト対象におけるインフルエンザ疾患の予防又は処置におけるワクチン又は免疫療法としての使用のための免疫原性組成物であって、
（ｉ）インフルエンザ核タンパク質抗原と、
（ｉｉ）Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する自己組織化ポリペプチド及び正に帯電した尾部を含むキャリアタンパク質と
を含む融合タンパク質を含み、１８０μｇ以上の量、例えば１８０μｇ～１０００μｇの間に含まれる量の前記融合タンパク質が前記ヒト対象に投与される、使用のための免疫原性組成物。

【0128】

Ｅ２．２００μｇ以上又は２４０μｇ以上の量の前記融合タンパク質が前記ヒト対象に投与される、実施形態Ｅ１に記載の使用のための免疫原性組成物。

【0129】

Ｅ３．３００μｇ以上の量の前記融合タンパク質が前記ヒト対象に投与される、実施形態Ｅ１に記載の使用のための免疫原性組成物。

【0130】

Ｅ４．４８０μｇ以上の量の前記融合タンパク質が前記ヒト対象に投与される、実施形態Ｅ１に記載の使用のための免疫原性組成物。

【0131】

Ｅ５．キャリアタンパク質が、Ｃ末端で核タンパク質抗原と、任意選択でグリシン－セリンリンカーを介して融合している、実施形態Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0132】

Ｅ６．前記融合タンパク質が、自己組織化後に七量体粒子を形成する、実施形態Ｅ１～Ｅ５のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0133】

Ｅ７．前記インフルエンザ核タンパク質抗原が、インフルエンザ株Ａ、Ｂ、又はＣ由来の少なくとも１種の核タンパク質抗原を含む、例えば、前記インフルエンザ核タンパク質抗原が、インフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｌｓｏｎ－Ｓｍｉｔｈ／１９３３ Ｈ１Ｎ１のＮＰ抗原から本質的になる、実施形態Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0134】

Ｅ８．前記インフルエンザ核タンパク質抗原が、
（ｉ）配列番号１のポリペプチド、又は
（ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する抗原性ポリペプチドバリアント
を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ７のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0135】

Ｅ９．Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する前記自己組織化ポリペプチドが、配列番号２、又は配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列番号２の機能的バリアントを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0136】

Ｅ１０．前記正に帯電した尾部が、配列ＺＸＢＢＢＢＺ（配列番号３）（ここで、（ｉ）Ｚは存在しないか又は任意のアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｘは任意のアミノ酸であり、（ｉｉｉ）Ｂはアルギニン又はリジンである）を含み、好ましくは、前記正に帯電した尾部が、配列番号４の配列を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ９のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0137】

Ｅ１１．前記キャリアタンパク質が、配列番号５から本質的になるか、又は前記キャリアタンパク質が、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列番号５の機能的バリアントである、実施形態Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0138】

Ｅ１２．前記融合タンパク質が、配列番号６を含むか若しくは配列番号６から本質的になるか、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列番号６の機能的バリアントである、実施形態Ｅ１～Ｅ１１のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0139】

Ｅ１３．前記量の融合タンパク質が筋肉内経路を介して投与される、実施形態Ｅ１～Ｅ１２のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0140】

Ｅ１４．前記量の融合タンパク質が単回注射として、好ましくは筋肉内経路を介して、前記ヒト対象に投与される、実施形態Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0141】

Ｅ１５．前記対象が５０歳未満である、実施形態Ｅ１～Ｅ１４のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0142】

Ｅ１６．前記対象が少なくとも５０歳である、又は５０歳を超えている、実施形態Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0143】

Ｅ１７．前記使用が、ＮＰに特異的な総Ｔ細胞応答、ＮＰに特異的なＣＤ４ Ｔ細胞応答、抗ＮＰ ＩｇＧ（抗体応答）、及び／又はインフルエンザ症状（インフルエンザ様疾病）、特にインフルエンザ株Ａ若しくはＢによるインフルエンザ感染症に対する有効性、防御、若しくは交差防御をもたらす、実施形態Ｅ１～Ｅ１６のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0144】

Ｅ１８．前記免疫原性組成物が、インフルエンザの１種若しくは複数種の不活化株、及び／又は１種若しくは複数種のインフルエンザ株由来の効率的な量のヘマグルチニンＨＡ抗原を含む、インフルエンザに対する第２の免疫原性組成物と組み合わされて、同時に又は逐次に、好ましくは同時に対象に投与され、好ましくは前記第２の免疫原性組成物がフルアリックスワクチン組成物である、実施形態Ｅ１～Ｅ１７のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

【0145】

Ｅ１９．３００μｇ／ｍＬ以上の濃度の実施形態Ｅ１～Ｅ１２のいずれか１つに規定の融合タンパク質と、１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤とを含む免疫原性組成物。

【0146】

Ｅ２０．前記融合タンパク質が、少なくとも４００のアミノ酸残基、例えば４００～６００の間のアミノ酸残基、例えば５４０～５６０の間のアミノ酸残基を含み、任意選択で、前記融合タンパク質が、２０～１００ｎｍに含まれる直径及び／又は４４０～２２００ｋＤａの間の分子量を有するタンパク質ナノ粒子を形成する、実施形態Ｅ１９に記載の免疫原性組成物。

【0147】

Ｅ２１．少なくとも
ｉ．塩、例えば硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウム、好ましくは硫酸ナトリウム、
ｉｉ．浸透圧調節物質、例えば糖、例えばトレハロース、
ｉｉｉ．緩衝液、例えばリン酸緩衝液及び／又はクエン酸緩衝液、
ｉｖ．任意選択で、抗酸化剤、例えばメチオニン、
ｖ．任意選択で、界面活性剤、例えばポリソルベート８０
をさらに含み、組成物のｐＨが、６．０～７．０の間、典型的には６．３～６．６の間であり、重量モル浸透圧濃度が、３００～６００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは４００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、例えば約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇである、実施形態Ｅ１９又はＥ２０に記載の免疫原性組成物。

【0148】

Ｅ２２．
ｉ．約７５ｍＭの濃度の硫酸ナトリウム、
ｉｉ．約２００ｍＭの濃度のトレハロース、
ｉｉｉ．０．０２％～０．０８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の間、例えば約０．０４％の濃度のポリソルベート８０
ｉｖ．約５ｍＭの濃度のＬ－メチオニン
を含む、実施形態Ｅ１９～Ｅ２１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。

【0149】

Ｅ２３．いかなるアジュバントも含まない、実施形態Ｅ１９～Ｅ２２のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。

【0150】

Ｅ２４．直ちに使用できる滅菌溶液として製剤化されている、実施形態Ｅ１９～Ｅ２３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。

【0151】

Ｅ２５．インフルエンザ疾患の予防又は処置を必要とするヒト対象におけるインフルエンザ疾患の予防又は処置におけるワクチン又は免疫療法としての使用のため、特に実施形態Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに規定の使用のための、実施形態Ｅ１９～Ｅ２４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。

【実施例】

【0152】

実施例１：３００μｇ／ｍＬのＯＶＸ８３６の安定な製剤の開発
ＯＶＸ８３６（配列番号６）は、ＯＶＸ３１３キャリアタンパク質（配列番号５）と、ＯＶＸ３１３キャリアタンパク質と融合した季節性インフルエンザ核タンパク質（ＮＰインフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｌｓｏｎ－Ｓｍｉｔｈ／１９３３）との融合タンパク質を含む候補ワクチンの原薬である。

【0153】

ＯＶＸ８３６原薬は、安定化製剤緩衝液中の濃縮溶液として供給される。第１の目的は、最大１８０μｇのＯＶＸ８３６の筋肉内経路を介した単回注射と適合性の目標濃度を有する安定な製剤を開発することであった。

【0154】

開発製剤に関連する技術的な課題としては、目標となる異常に高い濃度（３００μｇ／ｍＬ）、並びに七量体（４４０ｋＤａ）及び小さなオリゴ七量体（ジ、トリ、テトラ、又はペンタ七量体）の動的平衡であるＯＶＸ８３６の四次配置に言及することができ、ＯＶＸ８３６の四次配置の特徴は、ＮＰの自己会合特性に関する。実際、ＮＰは、ウイルス複製機構に対する構造的及び機能的支持をもたらす高度に塩基性の内部タンパク質である。ウイルス複製機構に対する構造的及び機能的支持をもたらすという目的を達成するために、ＮＰはホモオリゴマーを形成し、複数コピーのＮＰはゲノムＲＮＡを包んでいる。したがって、ＯＶＸ８３６の四次構造は、凝集体への重合を引き起こし得る、小さなオリゴ七量体を含む多様な形態をもたらす。この凝集現象に影響を及ぼし得るいくつかの因子、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、タンパク質の濃度が存在する。

【0155】

第１の開発製剤は、推奨されるｐＨ及び容積モル浸透圧濃度、それぞれ７．４付近のｐＨ及び３００ｍＯｓｍ付近の容積モル浸透圧濃度に従って調製した。

【0156】

以下の表１に示すように、製剤Ｆ１は安定ではなく、凝集体を形成した。より酸性のｐＨのための異なる緩衝液を用いたさらなる製剤を、同様の容積モル浸透圧濃度において調製した（製剤Ｆ２、Ｆ３、及びＦ４を参照されたい）。しかしながら、試験した全てのｐＨは不十分な安定性及びオリゴマー化を示した。

【0157】

【表1】

【0158】

次いで、本発明者らは、製剤の重量モル浸透圧濃度を上昇させることを選択した。結果は、ｐＨ６．５において生成物分解及び生成物オリゴマー化の両方の有意な向上を示した。

【0159】

【表2】

【0160】

異なる製剤緩衝液、賦形剤、及びｐＨをスクリーニングした後、安定性に最適な以下の製剤を最終的に開発した。

【0161】

【表3】

【0162】

より具体的には、最適な可溶化は、５．５～７．０の間のわずかに酸性のｐＨ（６．４～６．６の間のｐＨが好ましい）において達成された。加えて、スクリーニングは、２０ｍＭクエン酸Ｎａ系緩衝液（６．６の最終ｐＨ値）の使用が医薬用生成物における高分子量オリゴマーの出現を予防したことを示した。

【0163】

さらに、開発研究では、トレハロースの存在がＯＶＸ８３６のオリゴマー形成を遅延させる（サイズ排除クロマトグラフィー分析によって測定される場合、オリゴマー化を減少させる）ことが主に見出され、２００ｍＭの濃度が最適であることが見出された。

【0164】

塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウム等の塩もまた、ＯＶＸ８３６を安定化させることができると示されたが、示差走査熱量測定（ＤＳＣサーモグラム）によって示唆されたように、硫酸ナトリウムが非常に好ましかった。

【0165】

選択された最適な製剤の利用可能な安定性データは、５℃で保存した場合は少なくとも３６カ月にわたって、また２５℃では３カ月にわたって、ＯＶＸ８３６医薬品の有意な分解がないことを示した。最終製剤の重量モル浸透圧濃度は、４４０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、典型的には４６５～４８０Ｏｓｍ／ｋｇの間であった。

【0166】

そのような高い重量モル浸透圧濃度及び高いタンパク質濃度を有する製剤は、ヒト対象において安全ではなく、良好な忍容性も示さない場合がある。下記の実施例２に詳述する研究において、この製剤を評価した。
実施例２：第１相 － 核タンパク質ベースのインフルエンザワクチンとしてのＯＶＸ８３６を評価する無作為化、プラセボ対照、容量漸増研究：筋肉内結果

【0167】

【表4】

【0168】

方法
この無作為化、プラセボ対照、観察者盲検、逐次、用量漸増第１相研究は、医薬品の臨床試験の実施基準に従って、アントワープ大学（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｗｅｒｐ）（Ａｎｔｗｅｒｐｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）において行われた。この研究は、アントワープ大学病院（ｔｈｅ Ａｎｔｗｅｒｐ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）及びアントワープ大学の倫理委員会、並びにベルギー連邦医薬品局（ｔｈｅ Ｂｅｌｇｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＦＡＭＨＰ）によって承認された。独立のデータ安全性モニタリング委員会がデータを定期的に審査した。書面によるインフォームドコンセントは、全ての参加対象から取得された。ＥｕｄｒａＣＴ番号は２０１８－０００３４１－３９であり、Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ番号はＮＣＴ０３５９４８９０であった。

【0169】

１８～２５ｋｇ／ｍ^２の間のボディマス指数の、１８～４９歳の健康な成人が研究に適格であった。主な除外基準は、スクリーニング前６カ月以内に過去のインフルエンザワクチン接種をしていること、妊娠しているか又は避妊を実施する意思がないこと、ヒト免疫不全ウイルス又はＢ／Ｃ型肝炎ウイルスに関する試験が陽性であること、ワクチン接種の当日に急性熱性疾患があること、全身性コルチコステロイド、細胞毒性薬、抗炎症薬、及び他の免疫調節薬等の免疫応答に影響を及ぼす可能性がある処置をしていること、並びに自己免疫障害、コントロール不良糖尿病、又は高血圧症、心疾患、腎疾患、又は肝疾患等の重要な内科的疾病の病歴があることであった。

【0170】

１２名の対象を、３つの逐次コホート（低用量３０μｇ、中用量９０μｇ、高用量１８０μｇ）のそれぞれに含めた。各コホートを３：１の比にて、ＯＶＸ８３６ワクチン（Ｎ＝９）とプラセボ（Ｎ＝３）との間で無作為化した。研究は観察者盲検であった。研究者及び対象は、研究の終了（５カ月目）まで、対象が割り付けられた処置群（プラセボ／ワクチン）を無視した。研究品（プラセボ又はワクチン）を含有するシリンジは、非盲検化チームによって調製及び投与された。

【0171】

ワクチン（３００μｇ／ｍＬの活性物質）又はプラセボ（塩化ナトリウム０．９％からなる）を、低（０．１ｍＬ中３０μｇ）、中（０．３ｍＬ中９０μｇ）、又は高（０．６ｍＬ中１８０μｇ）用量で非利き腕の三角筋に投与した。研究を２つの期間、すなわち、２回の筋肉内ワクチン接種とその後の各２８日の追跡とからなる１日目～５７日目までの積極的処置期間と、１回目の投与後５８日目～１５０日目（５カ月目）までの追跡期間とに分けた。

【0172】

日誌カードを使用して、各投与後７日以内に生じた非自発的（ｓｏｌｉｃｉｔｅｄ）な局所（投与部位疼痛、発赤、腫脹、及び硬結）及び全身（発熱、咳、頭痛、関節痛、筋肉痛、倦怠感／疲れ、及び嘔吐）症状を収集した。自発的有害事象（ＡＥ）は、各投与後２８日間にわたって、自由回答形式の質問を使用して記録した。ＡＥの強度は、軽度、中等度、重度、又は生命を脅かす可能性がある、として段階分けし、積極的期間全体にわたってモニタリングした。重篤なＡＥ（ＳＡＥ）は、研究全体にわたって５カ月目までモニタリングした。予め定められたセットの安全性実験室解析（凝固パラメータ及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の評価を含む血液学及び臨床化学）を、スクリーニング時、並びにその後の８、２９、３６、及び５７日目に実施した。

【0173】

全血試料を、ＰＢＭＣの単離、及び酵素連結免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を使用するＮＰ特異的インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）Ｔ細胞応答の決定のために、１、８、２９、３６、５７、及び１５０日目に採取した。血清試料を、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用する抗ＮＰ、抗ＯＶＸ３１３、及び抗ｈＣ４ＢＰ ＩｇＧの決定のために、１、２９、５７、及び１５０日目に採取した。免疫アッセイは補足的方法に記載されている。

【0174】

標本サイズは、研究の純粋に探索的な性質を考慮して、十分であると考えられた。研究はいかなる統計的仮説検定のための検出力も有さなかった。記述統計量を使用して、全ての関連パラメータ：別々の変数の数及び百分率並びに平均値（算術又は幾何）、中央値、標準偏差、９５％信頼区間（ＣＩ）、連続変数の最小及び最大を要約した。免疫原性データに対する探索的推論解析を、処置群間の全体的な差を検定する各時点におけるクラスカル・ウォリスの検定と、有意であった場合における、それに続く、各ペアワイズ比較を検定するドゥワス、スティール、クリッチロウ－フリグナーの事後検定とを使用して実施した。群内比較を、ウィルコクソンの対応のある検定を使用して実施した。フィッシャーの正確確率検定を使用して、応答者の百分率の点から処置群間の差を評価した。エンドポイント及び比較の多重性を考慮した補正を適用しなかったため、５％未満のｐ値は潜在的な統計的有意差を示しているに過ぎないと考えなければならない。

【0175】

合計で３６名の対象を含め、３３名の対象（９１．７％）が全研究を完了した。
第１部：予備解析
第１相の結果の第１の解析を行った。全ての群は、ワクチン接種前の１日目に類似したベースラインを有し、このことは、全ての群を比較することが可能であったことを意味する（図１）。

【0176】

８及び３６日目において、全てのＯＶＸ８３６群は、プラセボよりも高い応答を示した。８日目において、９０μｇ群と１８０μｇ群との間に差は存在しなかったが、３０μｇはわずかに最適以下であるように思われる（図２）。３６日目（２回目のワクチン接種の８日後）において、９０μｇと１８０μｇとの間に統計的有意差は存在せず、９０μｇ群は１８０μｇ群よりもわずかに良好な応答を示しさえした（図３）。

【0177】

図４は、ベースライン（１日目、ワクチン接種前）から１５０日目（２回目の投与の４カ月後）までの、プールされたプラセボ及び３つのＯＶＸ８３６ワクチン接種群（３０μｇ、９０μｇ、及び１８０μｇ）における、ＮＰ特異的ＩＦＮ－γスポット形成Ｔ細胞（ＳＦＣ）／１０^６細胞の数の経時的展開を示した。結果は、９０μｇが、２９日目におけるその他に対する持続性応答によって示されるように、一度の単回注射後に１８０μｇよりも良好に働くことさえあることを示唆する。

【0178】

要約すると、第Ｉ相研究の予備解析は、以下のことを実証した：
３０μｇよりも高い用量が必要である；
２回目の注射の有意な利点は存在しなかった；
９０μｇ用量及び１８０μｇ用量の両方が安全且つ良好な忍容性を示し、用量効果はなかった；
９０μｇ用量と比較して１８０μｇ用量の明確な利点は存在せず、有効性は９０μｇ用量においてすでにプラトーに達していた可能性があることを示唆した；
９０μｇの２回目の投薬は、１８０μｇよりも高いＴ細胞免疫応答となり得ることを引き起こし、９０μｇが１８０μｇ用量レベルよりも良好であり得ることを示唆した。

【0179】

第２部：第Ｉ相結果の詳細な解析
第１相結果に対するさらなる解析は、製剤並びに９０及び１８０μｇを用いる投薬レジメンの安全性を実証し、驚くべきことに、以降に詳述するように、９０～１８０μｇにおける免疫応答に対する用量反応効果の傾向を暗示した。

【0180】

反応原性及び安全性
非自発的な局所症状は、プラセボ対象では報告されなかったが、ＯＶＸ８３６を用いてワクチン接種された大半の対象は、注射部位に軽度～中等度の一過性疼痛を示した。非自発的な局所症状の数においても影響を受けた対象の数においても（３０μｇでは８名の対象において１３の症状、９０μｇでは７名の対象において２２の症状、及び１８０μｇでは７名の対象において１６の症状）、明確なＯＶＸ８３６用量－効果関係は存在しなかった。２回目のワクチン接種後の非自発的な局所症状の、１回目のワクチン接種と比較した明らかな増加もまた存在しなかった。コホート１（３０μｇ）及び３（１８０μｇ）では、非自発的な局所症状はいずれも重度（グレード３）ではなかった。コホート２（９０μｇ）の１名の対象（１１．１％）では、２つの非自発的な局所症状（硬結及び浮腫）が重度であった。いずれのワクチン接種後の観察期間の終了時においても、非自発的な局所症状はいずれも進行中ではなかった。

【0181】

非自発的な全身症状の数においても影響を受けた対象の数においても（３０μｇでは４名の対象において１２の症状、９０μｇでは６名の対象において１３の症状、及び１８０μｇでは６名の対象において１５の症状）、用量－効果関係は存在しなかった。比較すると、９名のプラセボ対象のうち５名によって、１２の非自発的な全身症状が報告された。ＯＶＸ８３６を用いてワクチン接種された２名の対象において、それぞれ１回目のワクチン接種後に２つの重度の非自発的な全身症状が報告され、１つはコホート１（３０μｇ）における重度の倦怠感（疲れ）であり、１つはコホート３（１８０μｇ）における重度の発熱（３９℃以上）であり、後者は２回目の投与の中止を引き起こした。いずれのワクチン接種後の観察期間の終了時においても、非自発的な全身症状はいずれも進行中ではなかった。

【0182】

各ワクチン接種後の２８日の期間の間に自発的なＡＥを報告した対象の百分率が報告されたが、明確なＯＶＸ８３６用量－効果関係は観察することができなかった。１回目のワクチン接種後に対する、２回目のワクチン接種後の自発的なＡＥの増加もまた存在しなかった。

【0183】

全体として、プールされたプラセボ群の６名の対象における２５のＡＥに対して、コホート１（３０μｇ）では８名の対象において２３の自発的なＡＥ、コホート２（９０μｇ）では８名の対象において２１のＡＥ、及びコホート３（１８０μｇ）では８名の対象において２１のＡＥが報告された。以下のＡＥはワクチンに関連すると考えられた：（ｉ）コホート１ － ３０μｇ：注射部位出血、ワクチン接種部位発疹、筋骨格硬直、ＣＲＰ上昇；（ｉｉ）コホート２ － ９０μｇ：注射部位出血、悪心 中咽頭疼痛、失神性めまいの２つの症例、ＣＲＰ上昇、好中球数減少（重度）、白血球（ＷＢＣ）数減少、及び（ｉｉｉ）コホート３ － １８０μｇ：鼻咽頭炎（重度）、筋骨格疼痛、首疼痛、失神性めまい、中咽頭疼痛、鼻閉の２つの事象、ＣＲＰ上昇、リンパ球数減少、好中球数増加、ＷＢＣ数増加。

【0184】

２回目のワクチン接種のおよそ４０日後に生じた尿路感染症からなる１つのＳＡＥが１名のＯＶＸ８３６ ９０μｇレシピエントにおいて報告された。ＳＡＥは１１日間続き、ワクチンとは関連がないと考えられた。

【0185】

結論として、ＯＶＸ８３６は、３０μｇ～１８０μｇの用量範囲において、筋肉内投与経路による安全且つ良好な忍容性を示す候補ワクチンと考えられた。明確な用量－効果関係は実証されず、１８０μｇ用量は最大耐用量ではないと考えられた。

【0186】

ＮＰ特異的Ｔ細胞免疫応答
プラセボに対する３つのＯＶＸ８３６ワクチン接種群の、１日目、８日目（１回目のワクチン接種の１週間後）、及び３６日目（２回目のワクチン接種の１週間後）に検出されたＮＰ特異的ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の数を図５に示す。全ての対象は、ベースライン時に、５～４７８ＮＰ特異的ＩＦＮ－γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６ＰＢＭＣの範囲の既存のＮＰ特異的ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞を有しており、群間に有意差は存在しなかった。１回目のワクチン接種後８日目において、１日目に対して（図５Ａ）、及びプラセボと比較して（図５Ｂ）、３つのＯＶＸ８３６ワクチン群のそれぞれにおいて、ＳＦＣ／１０^６ＰＢＭＣの平均の有意な増加が存在した。８日目において、ＯＶＸ８３６用量レベルに応じた応答の増加傾向が存在したが、この効果は有意ではなかった。２回目のワクチン接種は、ＯＶＸ８３６ ９０μｇ群を除いて、３６日目（２回目のワクチン接種の１週間後）における応答をさらに高めることができなかった。５７日目（２回目のワクチン接種の２８日後）において、３つのワクチン群においてプラセボに対する有意差が見出され（全体のｐ＝０．００２；クラスカル・ウォリス検定）、ＯＶＸ８３６群間に有意差は存在しなかった。１５０日目（２回目のワクチン接種の４カ月後）において、ＮＰ特異的ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の数は、３つのＯＶＸ８３６群において、依然としてプラセボよりも多かったが、差は、より統計的に有意とはならなかった（全体のｐ＝０．２９５；クラスカル・ウォリス検定）。

【0187】

ＮＰ特異的液性免疫応答
３つのＯＶＸ８３６ワクチン群及びプラセボ群における抗ＮＰ ＩｇＧ幾何平均力価（ＧＭＴ）の経時的展開を図６（パネルＡ）に示す。全ての対象は、ベースライン時に既存の抗ＮＰ ＩｇＧを示し、個々の力価は１，６００～２５，６００の範囲であり、群間に有意差は存在しなかった。１回目のワクチン接種後２９日目に、３つのワクチン群において、プラセボと比較して有意なＧＭＴの増加が存在した（全体のｐ＝０．０００８；クラスカル・ウォリス検定）。２９日目の２回目のワクチン接種は、５７日目（２回目のワクチン接種の２８日後）における抗ＮＰ ＩｇＧ ＧＭＴをさらに高めることができなかったが、抗ＮＰ ＩｇＧ ＧＭＴは１５０日目（２回目のワクチン接種の４カ月後）において高いままであり、３つのワクチン群において、プラセボと比較して依然として有意に高かった（全体のｐ＝０．００１；クラスカル・ウォリス検定）。ＯＶＸ８３６用量レベルに応じた抗ＮＰ ＩｇＧ ＧＭＴの増加傾向が存在したが、この効果は有意ではなかった。

【0188】

ワクチン接種後の異なる時点における、抗ＮＰ ＩｇＧ力価のベースラインに対する４倍の増加を有する対象の百分率を図６（パネルＢ）に示す。２９日目（１回目のワクチン接種後）及び５７日目（２回目のワクチン接種の２８日後）において、プラセボ群における０％に対して、４４．４％～８７．５％の間のＯＶＸ８３６ワクチン接種対象が、ベースライン力価に対して４倍の増加を示した。群間の全体的な差は、２９日目及び５７日目の２つの時点において有意であり（２９日目においてｐ＝０．０３５、及び５７日目においてｐ＝０．００１；クラスカル・ウォリス検定）、統計的事後検定は、ＯＶＸ８３６ ９０μｇ及びＯＶＸ８３６ １８０μｇとプラセボとの間の有意差を示した。１５０日目（２回目のワクチン接種の４カ月後）において、プラセボ群における０％に対して、３７．５～５０．０％の間のＯＶＸ８３６ワクチン接種対象は、依然としてベースライン力価に対して４倍の増加を示したが、４つの群の間の差は、より統計的に有意とはならなかった（ｐ＝０．１２８；クラスカル・ウォリス検定）。

【0189】

要約すると、第Ｉ相研究の結果の詳細な解析は、以下のことを実証した：
筋肉内経路は鼻腔内経路と同様に好ましい；
３０μｇよりも高い用量が必要である；
９０μｇ用量及び１８０μｇ用量の両方が安全且つ良好な忍容性を示し、用量効果はなかった；
２回目の注射の有意な利点は存在しなかった；
９０～１８０μｇの間に用量反応の傾向が存在した。

【0190】

実施例３：第２ａ相研究
Ａ．研究の概要

【0191】

【表5】

【0192】

Ｂ．結果の概要
第Ｉ相結果の予備解析とは対照的に、第２ａ相は、９０～１８０μｇにおける免疫応答に対する有意な用量反応効果を明確に実証した。

【0193】

特に、ＮＰ特異的Ｔ細胞応答、より詳細にはＮＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の強力な増加が、注射の８日後に、９０～１８０μｇの間の用量反応と共に観察された。

【0194】

ＯＶＸ８３６ １８０μｇ群における２名の外れ値対象（１日目に高いベースライン値：それぞれ９５７及び１６３０を示した対象１２８－０９５及び２３２－３６５）を除外した後のＩＴＴコホート（治療企図コホート）において、ＯＶＸ８３６ ９０μｇ群における応答動態（プールされた年齢層）に関して、平均は、ベースライン時の１３０ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣから８日目の２２２ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣに増加した。ＯＶＸ８３６ １８０μｇ群では、平均は、ベースライン時の１４９から８日目の２８８ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣに増加した。インフルバックテトラ群では、平均は、比較的安定したままであり、ベースライン時に１３１ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣであり、８日目に１４７ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣであった。８日目において、ＯＶＸ８３６ １８０μｇはＯＶＸ８３６ ９０μｇと有意に異なり（ｐ＝０．０３５）、全ての対象においてＯＶＸ８３６群における用量－反応関係を支持した。図７は、１日目及び８日目の結果を示す。

【0195】

プロトコル適合－Ｄ２９（ＰＰ－Ｄ２９）コホートにおいて、ＯＶＸ８３６ ９０μｇ群における応答動態（プールされた年齢層）に関して、中央値（平均±ＳＤ）は、ベースライン時の９０（１３１±１５３）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣから８及び２９日目のそれぞれ１６７（２２３±１９１）及び１６３（２０８±１８３）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣに増加した。ＯＶＸ８３６ １８０μｇ群では、中央値（平均±ＳＤ）は、ベースライン時の９５（１６８±２４２）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣから８及び２９日目のそれぞれ２００（２９４±２７５）及び１９０（２７８±２４５）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣに増加した。その後、両方のＯＶＸ８３６群において、応答は、１８０日目にベースラインまで低下した。インフルバックテトラ群では、中央値（平均±ＳＤ）は、比較的安定したままであり、ベースライン時に９６（１３７±１５３）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣであり、８、２９、及び１８０日目にそれぞれ１０８（１４７±１４９）、９４（１６２±２０６）、及び８１（１２１±１３１）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣであった。ＰＰ－Ｄ２９コホートの１８～４９歳の対象：ＯＶＸ８３６ ９０μｇ群では、中央値（平均±ＳＤ）は、ベースライン時の１０２（１３８±１４８）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣから８及び２９日目のそれぞれ１９８（２５２±２０８）及び１７５（２０５±１６９）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣに増加した。ＯＶＸ８３６ １８０μｇ群では、中央値（平均±ＳＤ）は、ベースライン時の９７（１５２±１７４）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣから８及び２９日目のそれぞれ１９８（２７５±２３９）及び２０２（２６０±２１０）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣに増加した。インフルバックテトラ群では、中央値（平均±ＳＤ）は、比較的安定したままであり、ベースライン時に１０２（１３８±１５５）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣであり、８及び２９日目にそれぞれ１０８（１３７±１３４）及び１０６（１６９±２２１）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣであった。統計的観点から、時間（ｐ＜０．０００１）、処置（ｐ＝０．０４７１）、及び時間－処置相互作用（ｐ＜０．０００１）の効果は有意であった。１日目の群平均の間に有意差は存在しなかった（全てｐ＞０．０５）。８日目において、ＯＶＸ８３６ ９０μｇとインフルバックテトラとの間（ｐ＝０．００１７）、及びＯＶＸ８３６ １８０μｇとインフルバックテトラとの間（ｐ＝０．０００１）の差は有意であった。２９日目においては、ＯＶＸ８３６ １８０μｇとインフルバックテトラとの間の差のみが有意であった（ｐ＝０．０２０２）。

【0196】

ＰＰ－Ｄ２９コホートの５０～６５歳の対象：ＯＶＸ８３６ ９０μｇ群では、中央値（平均±ＳＤ）は、ベースライン時の６２（１１４±１６８）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣから８及び２９日目のそれぞれ１０７（１５２±１１３）及び１３３（２１６±２１９）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣに増加した。ＯＶＸ８３６ １８０μｇ群では、中央値（平均±ＳＤ）は、ベースライン時の９３（２０９±３７０）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣから８及び２９日目のそれぞれ２２２（３４５±３５４）及び１７１（３２８±３２１）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣに増加した。インフルバックテトラ群では、中央値（平均±ＳＤ）は、比較的安定したままであり、ベースライン時に８４（１３７±１５１）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣであり、８及び２９日目にそれぞれ１０３（１７２±１８６）及び７９（１４４±１５９）ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣであった。統計的観点から、時間（ｐ＝０．０００４）及び時間－処置相互作用（ｐ＝０．０４７９）の効果は有意であった。処置の効果は有意ではなかった（ｐ＝０．０９６４）。１日目の群平均の間に有意差は存在しなかった（全てｐ＞０．０５）。８日目において、両方のＯＶＸ８３６用量レベルの間の差のみが有意であった（ｐ＝０．０２１７）。２９日目においては、ＯＶＸ８３６ １８０μｇとインフルバックテトラとの間の差のみが有意であった（ｐ＝０．０３７２）。

【0197】

統計的観点から有意ではなかったが、全ての対象においてＯＶＸ８３６群における用量－効果関係に関する傾向が存在した（どちらの年齢層においても観察された）。

【0198】

プロトコル適合－Ｄ２９（ＰＰ－Ｄ２９）コホートにおいて、ＩＦＮγを発現するＮＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のベースライン（ワクチン接種前）百分率は低く、処置群間で非常に類似していた。インフルバックテトラ群ではワクチンの効果は全く存在しなかった。ＯＶＸ８３６ ９０μｇ群では、中央値（平均±ＳＤ）は、ベースライン時の０．０２２％（０．０３４±０．０４３％）から、８日目では０．０７５％（０．０８８±０．０６３％）、及び２９日目では０．０７５％（０．０８９±０．０５７％）に増加した。ＯＶＸ８３６ １８０μｇ群では、ベースライン時の０．０２８％（０．０３４±０．０２７％）から、８日目では０．０８３％（０．１０６±０．０７６％）、及び２９日目では０．０９６％（０．１０７±０．０７０％）に増加した。その後、両方のＯＶＸ８３６群において、応答は、１８０日目にベースラインよりも依然としてわずかに高い値まで低下した（ＯＶＸ８３６ ９０μｇ群では０．０４０％［０．０４８％±０．０２８％］、及びＯＶＸ８３６ １８０μｇ群では０．０５０％［０．０５５％±０．０３２％］）。図８に示すように、８及び２９日目において、ＯＶＸ８３６ １８０μｇはＯＶＸ８３６ ９０μｇと有意に異なり（それぞれｐ＝０．０４０６及びｐ＝０．０３５３）、総Ｔ細胞応答について、上ですでに言及された用量－反応関係を支持した（５０歳未満の年齢層においても５０歳超の年齢層においても観察された）。そのようなＮＰ特異的多機能性ＣＤ４ Ｔ細胞応答は、ワクチン接種後６カ月間持続した。結果はまた、ＯＶＸ８３６の全ての用量について、抗ＮＰ ＩｇＧの強力且つ長期の増加を示した。

【0199】

安全性結果
加えて、第２ａ相は、安全性に対する用量－反応効果の非存在を確認し、９０及び１８０μｇの両方の試験用量について、認可された季節性インフルエンザワクチンと同様の優れた安全性プロファイルを示した。

【0200】

有効性結果
最も興味深いことに、１８０μｇのＯＸＶ８３６のインフルエンザ様疾病（ＩＬＩ）症状に対する防御有効性に関して、閾値効果が示された。

【0201】

より具体的には、カプラン・マイヤー生存分析を使用して、非特異的ＩＬＩの累積ハザードをインフルエンザシーズン中の時間の関数として評価した。２回の分析を実施した。１回目は、２０２０年３月０９日までの２０１９～２０２０年のインフルエンザシーズン中に生じた全てのＩＬＩを考慮し（図９）、２回目は、同じ期間中の、ワクチン接種の１４日後から生じたＩＬＩを考慮した（図１０）。実際、ワクチンは、ワクチン接種のおおよそ２週間後に対象の防御を開始することが一般的に認められている。ログランク検定を使用して、３つの処置群を比較した。インフルエンザシーズン中に生じた全てのＩＬＩを考慮した場合、処置群間の全ての比較は有意ではなかった（ｐ＝０．３２５）。同じ期間中の、ワクチン接種の１４日後から生じたＩＬＩを考慮した場合、統計的に有意ではなかったが（ｐ＝０．０８８）、３つの群の間の差、特にＯＶＸ８３６ ９０μｇとＯＶＸ８３６ １８０μｇとの間の差（ｐ＝０．０５４）、及びＯＶＸ８３６ ９０μｇとインフルバックテトラとの間の差（ｐ＝０．１３０）に関する傾向が存在し、他方、ＯＶＸ８３６ １８０μｇ及びインフルバックテトラは非常に類似したプロファイルを有した（ｐ＝０．６５０）。

【0202】

インフルエンザシーズン中の、ワクチン接種から１４日超経過後のＩＬＩの数の点で、ＯＶＸ８３６ ９０μｇ群は、類似したプロファイルを有したＯＶＸ８３６ １８０μｇ群及びインフルバックテトラ群と比較してより高い値に達した（ＯＶＸ８３６ ９０μｇ群、ＯＶＸ８３６ １８０μｇ群、及びインフルバックテトラ群においてそれぞれ、インフルエンザシーズン中の、ワクチン接種の１４日後からの８、２、及び３つのＩＬＩ、図１１を参照されたい）。このことは、１８０μｇの用量のＯＶＸ８３６の有効性に関する潜在的なシグナルを明らかにし得る。このシグナルは、当然、さらなる臨床試験において探索する必要がある。

【0203】

最後に、亜集団解析において、図１２は、ベースライン時にＣＤ８＋応答について最低四分位に属していた対象（ワクチン接種に先行する、インフルエンザウイルスによる直近の曝露／感染の確率が最低である可能性が最も高い対象）において、ＩＦＮγを発現するＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率の中央値がＯＶＸ８３６ １８０μｇ群のみで有意に（ｐ＝０．０２０）増加したことを示す。

【0204】

要約すると、第２ａ相の結果は、１８０μｇよりも高い用量バージョンのＯＶＸ８３６を試験することに関する強力な理論的根拠を強調する。この理論的根拠は、以下の通りに要約することができる：
１．免疫原性：ＮＰ特異的免疫応答の強力な増加
ＮＰ特異的総Ｔ細胞（ＥＬＩＳｐｏｔ）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＩＣＳ）、及びＩｇＧ（後者に関する傾向）に関する、９０μｇよりも優れた１８０μｇによる用量－反応効果
ベースライン時におけるＣＤ８＋応答の最低四分位において有意な１８０μｇによる用量－反応効果（図１２の亜集団解析）
２．有効性：ＯＶＸ８３６ ９０μｇよりも優れたＯＶＸ８３６ １８０μｇによるインフルエンザシーズン中のＩＬＩの減少
ＩＬＩの累計リスクに関する１８０μｇと９０μｇとの間の差の傾向
１８０μｇと９０μｇとの間の、インフルエンザシーズン中のＩＬＩの数の点での有意差
３．安全性：ＯＶＸ８３６は全ての患者及び全ての用量（最大１８０μｇ）において良好な忍容性を示す
ワクチンに関連する重篤な有害事象はない
商業的なワクチンに匹敵する
疾患増強に関する証拠は検出されていない
まとめると、これらのデータは、より高い用量のＯＶＸ８３６を、実施例４に記載される新たな開発プログラムとして検討することを提案した。
実施例４：第２の第Ｉ相／第２ａ相研究（ＯＶＸ８３６－００３）

【0205】

【表6】

【0206】

結果
安全性：ＯＶＸ８３６の全ての投薬量（１８０、３００、及び４８０μｇ）は、安全であり、良好な忍容性を示し、季節性四価インフルエンザワクチンであるインフルバックテトラ（商標）に匹敵することが見出された。「重度」（ワクチン臨床試験に関するＦＤＡ毒性スケールに従ってグレード３）の有害事象の低い発生率、及び存在しない用量制限効果。

【0207】

免疫原性：第Ｉ相結果の予備解析とは対照的に、この第２の第２ａ相は、１８０μｇの用量超且つ最大４８０μｇにおいて、免疫応答に対する有意な用量反応効果を明確に実証した。

【0208】

特に、ＮＰ特異的Ｔ細胞応答、より詳細にはＮＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の強力な増加が、注射の８日後に、１８０～４８０μｇの間の用量反応と共に観察された。加えて、ＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（ＩＦＮγ＋／ＩＬ２＋／ＴＮＦα－ＣＤ８ Ｔ細胞）が、注射の８日後に、３００μｇ及び４８０μｇ用量レベルにおいて観察され、この観察は、注射の８日後に応答が観察されなかった１８０μｇ用量レベルの場合の観察とは異なる。

【0209】

プロトコル適合に対するボンフェローニの群間ペアワイズ比較統計量を使用した場合、８日目において、ＯＶＸ８３６ ４８０μｇは抗ＮＰ ＩｇＧ応答の点でＯＶＸ８３６ １８０μｇと有意に異なり（ｐ＝０．０２６）、１８０μｇ用量レベル超における用量－反応関係を支持した（図１３）。統計的観点から有意ではなかったが、１日目に対する８日目の陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の％の比について、具体的には、ＩＦＮγ＋／ＩＬ２＋ＴＮＦα－ＣＤ４ Ｔ細胞（ｐ＝０．０８３）及びポリ陽性ＣＤ４ Ｔ細胞（ｐ＝０．１０２）について、ＯＶＸ８３６ ４８０μｇ群とＯＶＸ８３６ １８０μｇ群との間に用量－効果関係に関する傾向が存在した。

【0210】

さらに、処置群間及び時点間の差を検定する群間のＡＮＯＶＡ検定と、有意であった（ｐ＜０．０５）場合における、それに続く、処置群間の差を評価するフィッシャーのＬＳＤによるペアワイズ比較とを使用して免疫原性データに対する探索的推論解析を適用した場合、１日目と８日目との間でのＴ細胞応答（総Ｔ細胞、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞）の変化の点で、ＯＶＸ８３６の１８０μｇとより高い用量レベルとの間の用量－効果関係が観察された。エンドポイント及び比較の多重性を考慮した補正を適用しなかったため、５％未満のｐ値は潜在的な統計的有意差を示しているに過ぎないと考えなければならない：

【0211】

ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγ応答（図１４Ａ）：プラセボの効果は全く存在しなかった。ＯＶＸ８３６ １８０μｇ群では、１日目と８日目との間の平均変化は、１００万個のＰＢＭＣ当たり１２４個のＳＦＣであったのに対し（ｐ＝０．００２、対プラセボ）、３００μｇ及び４８０μｇ用量レベルにおいては、増加は、１００万個のＰＢＭＣ当たりそれぞれ２０１及び２２３個のＳＦＣであった（両方の用量レベルについて、ｐ＜０．００１、対プラセボ）。４８０μｇと１８０μｇとの間に有意差が観察された（ｐ＝０．０１４）

【0212】

ＣＤ４ Ｔ細胞応答（図１４Ｂ）：プラセボの効果は全く存在しなかった。ＯＶＸ８３６ １８０μｇ群では、１日目と８日目との間の、ＩＦＮγについて陽性であったＣＤ４ Ｔ細胞の％の平均変化は０．０４６であったのに対し（ｐ＜０．００１、対プラセボ）、３００μｇ及び４８０μｇ用量レベルにおいては、増加は、それぞれ０．０４８及び０．０６５であった（両方の用量レベルについて、ｐ＜０．００１、対プラセボ）。４８０μｇと１８０μｇとの間（ｐ＝０．０２２）、及び４８０μｇと３００μｇとの間（ｐ＝０．０４３）に有意差が観察された

【0213】

ＣＤ８ Ｔ細胞応答（図１４Ｃ）：プラセボの効果も、１８０μｇ又は３００μｇ用量レベルの効果も存在しなかった。ＯＶＸ８３６ ４８０μｇ群では、１日目と８日目との間の、ＩＦＮγ及びＩＬ２の両方について陽性であったＣＤ８ Ｔ細胞の％の平均変化は０．０３４であった（ｐ＝０．００６、対プラセボ）。１日目と８日目との間の、ＩＦＮγ及びＩＬ２の両方について陽性であったＣＤ８ Ｔ細胞の％の平均変化に関して、４８０μｇと１８０μｇとの間に有意差が観察された（ｐ＝０．０３６）。

【0214】

有効性：観察研究（ＦＬＵ－００１研究）を、インフルエンザが活発に循環していた場合の２つのコホートを統合して２００名の対象の平衡集団（５０％は１８０μｇよりも高い用量のＯＶＸ８３６；５０％はプラセボ又は非処置対象）におけるＩＬＩに対する解析を行うことを目的として、ＯＶＸ８３６－００３研究と並列的に実施した（同じ部位、同じ募集のタイミング、同じ選択／除外基準）。

【0215】

ＰＣＲで確認された症候性インフルエンザ（ＩＬＩ）の２つの症例がＯＶＸ８３６群（全用量レベル）において報告されたのに対し、プラセボ＋非処置コホートにおいては９つの症例であり、７９％［５．４％；９５．４％］の観察された有効性を反映した（図１５を参照されたい）。

【0216】

実施例５：第２ａ相研究（ＯＶＸ８３６－００４）

【0217】

【表7】

【0218】

結果
安全性：全ての群（四価不活化インフルエンザワクチン（ＱＩＩＶ）、ＯＶＸ８３６且つＱＩＩＶ、及びＯＶＸ８３６）は、安全且つ良好な忍容性を示すことが見出され、「重度」（ワクチン臨床試験に関するＦＤＡ毒性スケールに従ってグレード３）の有害事象の発生率は低く（ＱＩＩＶ群において１例の重度の疲労／筋肉痛、及びＯＶＸ８３６群において１例の重度の頭痛）、「重篤」（ワクチン臨床試験に関するＦＤＡ毒性スケールに従ってグレード４）な有害事象は、研究では報告されなかった。

【0219】

有効性：ＰＣＲで確認された症候性インフルエンザ（ＩＬＩ）の３つの症例がＱＩＩＶ群において報告されたのに対し、ＯＶＸ８３６群においては１つの症例であり、ＯＶＸ８３６且つＱＩＩＶ群においては２つの症例であった。

【0220】

実施例６：本発明を実施するのに有用な配列

【0221】

【表8】

【0222】

【表9】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-04-22

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インフルエンザ疾患の予防又は処置を必要とするヒト対象におけるインフルエンザ疾患の予防又は処置におけるワクチン又は免疫療法としての使用のための免疫原性組成物であって、
（ｉ）インフルエンザ核タンパク質抗原と、
（ｉｉ）Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する自己組織化ポリペプチド及び正に帯電した尾部を含むキャリアタンパク質と
を含む融合タンパク質を含み、１８０μｇ以上の量の前記融合タンパク質を前記ヒト対象に投与するためのものである、免疫原性組成物。

【請求項2】

３００μｇ以上の量の前記融合タンパク質を前記ヒト対象に投与するためのものである、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項3】

前記キャリアタンパク質が、Ｃ末端で前記核タンパク質抗原と、任意選択でグリシン－セリンリンカーを介して融合している、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

前記融合タンパク質が、自己組織化後に七量体粒子を形成する、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

前記インフルエンザ核タンパク質抗原が、インフルエンザ株Ａ、Ｂ、又はＣ由来の少なくとも１種の核タンパク質抗原を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

前記インフルエンザ核タンパク質抗原が、
（ｉ）配列番号１のポリペプチド、又は
（ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する抗原性ポリペプチドバリアント
を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来する前記自己組織化ポリペプチドが、配列番号２、又は配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列番号２の機能的バリアントを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

前記正に帯電した尾部が、配列ＺＸＢＢＢＢＺ（配列番号３）（ここで、（ｉ）Ｚは存在しないか又は任意のアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｘは任意のアミノ酸であり、（ｉｉｉ）Ｂはアルギニン又はリジンである）を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

前記正に帯電した尾部が、配列番号４の配列を含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

前記キャリアタンパク質が、配列番号５から本質的になるか、又は前記キャリアタンパク質が、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列番号５の機能的バリアントである、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

前記融合タンパク質が、配列番号６を含むか若しくは配列番号６から本質的になるか、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列番号６の機能的バリアントである、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

前記量の融合タンパク質を筋肉内経路を介して投与するためのものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項13】

前記量の融合タンパク質を単回注射として、前記ヒト対象に投与するためのものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項14】

前記量の融合タンパク質を単回注射として、筋肉内経路を介して、前記ヒト対象に投与するためのものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

前記対象が５０歳未満である、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

前記対象が少なくとも５０歳である、又は５０歳を超えている、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

前記使用が、ＮＰに特異的な総Ｔ細胞応答、ＮＰに特異的なＣＤ４ Ｔ細胞応答、ＮＰに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答、抗ＮＰ ＩｇＧ（抗体応答）、及び／又はインフルエンザ症状（インフルエンザ様疾病）に対する防御若しくは交差防御をもたらす、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項18】

前記使用が、インフルエンザ株Ａ若しくはＢによるインフルエンザ感染症に対する防御若しくは交差防御をもたらす、請求項１７に記載の免疫原性組成物。

【請求項19】

請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を３００μｇ／ｍＬ以上の濃度で含み、かつ
１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤を含む、免疫原性組成物。

【請求項20】

前記融合タンパク質が、少なくとも４００のアミノ酸残基を含み、任意選択で、前記融合タンパク質が、２０～１００ｎｍに含まれる直径及び／又は４４０～２２００ｋＤａの間の分子量を有するタンパク質ナノ粒子を形成する、請求項１９に記載の免疫原性組成物。

【請求項21】

少なくとも
ｉ．塩、
ｉｉ．浸透圧調節物質、及び
ｉｉｉ．緩衝液、
ｉｖ．任意選択で、抗酸化剤、
ｖ．任意選択で、界面活性剤をさらに含み、
組成物のｐＨが、６．０～７．０の間であり、重量モル浸透圧濃度が、３００～６００ｍＯｓｍ／ｋｇの間である、請求項１９に記載の免疫原性組成物。

【請求項22】

ｉ．７５ｍＭの濃度の硫酸ナトリウム、
ｉｉ．２００ｍＭの濃度のトレハロース、
ｉｉｉ．０．０２％～０．０８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の間の濃度のポリソルベート８０
ｉｖ．５ｍＭの濃度のＬ－メチオニン
を含む、請求項１９に記載の免疫原性組成物。

【請求項23】

いかなるアジュバントも含まない、請求項１９に記載の免疫原性組成物。

【請求項24】

直ちに使用できる滅菌溶液として製剤化されている、請求項１９に記載の免疫原性組成物。

【請求項25】

インフルエンザ疾患の予防又は処置を必要とするヒト対象におけるインフルエンザ疾患の予防又は処置におけるワクチン又は免疫療法としての使用のための、請求項１９に記載の免疫原性組成物。

【国際調査報告】