特表2024-532238抗体薬物複合体のフロースルー陽イオン交換クロマトグラフィー精製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】抗体薬物複合体のフロースルー陽イオン交換クロマトグラフィー精製方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20240829BHJP
C07K 1/18 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00
C07K1/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024510666
(86)(22)【出願日】2022-08-22
(85)【翻訳文提出日】2024-03-28
(86)【国際出願番号】 US2022075252
(87)【国際公開番号】W WO2023028446
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】63/236,170
(32)【優先日】2021-08-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ヘンドリックス， レイチェル
(72)【発明者】
【氏名】ハッチンソン， マシュー ヘンリー
(72)【発明者】
【氏名】フェデスコ， マーク フレデリック
(72)【発明者】
【氏名】トラン， ベンジャミン フー
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA72
4H045DA75
4H045EA20
4H045GA23
(57)【要約】
本発明は、ＡＤＣの臨界品質特性（ＣＱＡ）を変更することなく、抗体中間体の精製条件を活用するフロースルーモードでの陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する、抗体薬物複合体の精製方法を開発する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
システイン指向性抗体薬物複合体（ｃｙｓ ＡＤＣ）中のタンパク質凝集体の濃度を低下させるための方法であって、前記方法が、ａ．第１のセットの精製条件を使用して陽イオン交換クロマトグラフィー材料で抗体の第１の精製を実施して、精製された抗体中間体を得る工程；
ｂ．前記精製された抗体中間体を細胞毒性薬と結合させて、ｃｙｓ ＡＤＣおよびタンパク質凝集体を含む粗調製物を形成する工程；および
ｃ．前記第１のセットの精製条件を使用してフロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィー材料により前記粗調製物の第２の精製を実施して、精製されたｃｙｓ ＡＤＣを生成する工程
を含み、
前記第１のセットの精製条件が、緩衝系の負荷密度、緩衝種、ｐＨおよび導電率を含む、方法。
【請求項2】
前記陽イオン交換クロマトグラフィー材料を洗浄して精製されたｃｙｓ ＡＤＣを回収する、追加の工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記精製されたｃｙｓ ＡＤＣの収率が９８重量％を超える、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記精製されたｃｙｓ ＡＤＣ中のタンパク質凝集体の濃度が、前記ｃｙｓ ＡＤＣの臨界品質特性（ＣＱＡ）を変更することなく、ｃｙｓ ＡＤＣおよびタンパク質凝集体の粗混合物中のタンパク質凝集体の濃度に対して少なくとも８５％低下する、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記タンパク質凝集体が、超高分子量種（ｖＨＭＷＳ）および高分子量種（ＨＭＷＳ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記タンパク質凝集体がｖＨＭＷＳである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ｖＨＭＷＳがオリゴマーである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記精製されたｃｙｓ ＡＤＣ中の前記ｖＨＭＷＳが０．１％未満に減少する、請求項２に記載の方法。
【請求項9】
前記ｃｙｓ ＡＤＣ中の前記ｖＨＭＷＳが０．０２％未満に減少する、請求項２に記載の方法。
【請求項10】
システイン指向性抗体薬物複合体（ｃｙｓ ＡＤＣ）を精製する方法であって、前記方法が、ａ．第１のセットの精製条件を使用して陽イオン交換クロマトグラフィー材料で抗体の第１の精製を実施して、精製された抗体中間体を得る工程；
ｂ．前記精製された抗体中間体を細胞毒性薬と結合させて、ｃｙｓ ＡＤＣの粗調製物を形成する工程；および
ｃ．前記第１のセットの精製条件を使用してフロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィー材料により前記粗調製物の第２の精製を実施して、精製されたｃｙｓ ＡＤＣを生成する工程
を含み、
前記第１のセットの精製条件が、緩衝系の負荷密度、緩衝種、ｐＨおよび導電率を含む、方法。
【請求項11】
前記陽イオン交換クロマトグラフィー材料を洗浄して精製されたｃｙｓ ＡＤＣを回収する、追加の工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記精製されたｃｙｓ ＡＤＣの収率が９８重量％を超える、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ｃｙｓ ＡＤＣが、天然システインを標的とする操作されたシステインおよび鎖間システイン複合体を介した部位特異的複合体からなる群から選択される、請求項１または請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記ｃｙｓ ＡＤＣが、操作されたシステインを介した部位特異的複合体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ｃｙｓ ＡＤＣが、天然システインを標的とする鎖間システイン複合体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記陽イオン交換材料が樹脂である、請求項１または請求項１０に記載の方法。
【請求項17】
前記樹脂が、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳ、ＰＯＲＯＳ ＸＳ、およびＳＰＦＦ樹脂からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記樹脂がＰＯＲＯＳ ＸＳである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記樹脂がＳＰＦＦである、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
ｃｙｓ ＡＤＣおよびタンパク質凝集体の粗混合物の前記第２の精製における前記負荷密度が１００ｇ／Ｌｒ～１０００ｇ／Ｌｒである、請求項１または請求項１０に記載の方法。
【請求項21】
ｃｙｓ ＡＤＣおよびタンパク質凝集体の前記粗混合物の前記第２の精製における前記負荷密度が５００ｇ／Ｌｒである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
精製された抗体中間体を得るための第１のセットの精製条件を使用する前記抗体の前記第１の精製が、結合－溶出モードで実施される、請求項１または請求項１０に記載の方法。
【請求項23】
前記細胞毒性薬が、アウリスタチン、メイタンシノイドおよびＤＮＡ損傷剤からなる群から選択される、請求項１または請求項１０に記載の方法。
【請求項24】
前記ＤＮＡ損傷剤が、カリケアマイシン、アントラサイクリンおよびピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択される誘導体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記細胞毒性薬がピロロベンゾジアゼピン誘導体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞毒性薬がピロロベンゾジアゼピンモノアミドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記細胞毒性薬がアウリスタチンの誘導体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項28】
前記細胞毒性薬がＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞毒性薬がリンカー薬物複合体を形成する、請求項１または請求項１０に記載の方法。
【請求項30】
前記リンカー薬物複合体がｖｃＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ、バリン－シトルリン（ｖｃ－）リンカーを有する細胞毒素）である、請求項２９に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月２３日に出願された米国仮出願第６３／２３６，１７０号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年８月２３日に出願された米国仮出願第６３／２３６，１７０号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
一般に、本発明は、フロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する抗体薬物複合体の精製方法を開発する方法に関する。特に、本発明は、フロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィーを使用するシステイン標的化抗体薬物複合体の精製方法に関する。より詳細には、本発明は、抗体中間体の精製条件を活用するフロースルーモードでの陽イオン交換クロマトグラフィーを使用するシステイン標的化抗体薬物複合体の精製方法に関する。
一般に、本発明は、フロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する抗体薬物複合体の精製方法を開発する方法に関する。特に、本発明は、フロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィーを使用するシステイン標的化抗体薬物複合体の精製方法に関する。より詳細には、本発明は、抗体中間体の精製条件を活用するフロースルーモードでの陽イオン交換クロマトグラフィーを使用するシステイン標的化抗体薬物複合体の精製方法に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
抗体分子は、タンパク質医薬群の一部として、物理的および化学的な分解を非常に受けやすい。化学的な分解は、結合形成または開裂を介するタンパク質の修飾を含む任意のプロセスを含み、新しい化学物質が得られる。種々の化学反応は、タンパク質に影響を与えることが知られている。これらの反応は、ペプチド結合の開裂を含む加水分解、ならびに脱アミド化、異性化、酸化および分解を含んでいてもよい。物理的な分解は、より高次の構造の変化を指し、変性、表面への吸着、凝集および沈殿を含む。タンパク質の安定性は、例えば、アミノ酸配列、グリコシル化パターンなどのタンパク質自体の特徴によって影響され、温度、溶媒、ｐＨ、賦形剤、界面、または剪断速度などの外的な影響によって影響される。
抗体分子は、タンパク質医薬群の一部として、物理的および化学的な分解を非常に受けやすい。化学的な分解は、結合形成または開裂を介するタンパク質の修飾を含む任意のプロセスを含み、新しい化学物質が得られる。種々の化学反応は、タンパク質に影響を与えることが知られている。これらの反応は、ペプチド結合の開裂を含む加水分解、ならびに脱アミド化、異性化、酸化および分解を含んでいてもよい。物理的な分解は、より高次の構造の変化を指し、変性、表面への吸着、凝集および沈殿を含む。タンパク質の安定性は、例えば、アミノ酸配列、グリコシル化パターンなどのタンパク質自体の特徴によって影響され、温度、溶媒、ｐＨ、賦形剤、界面、または剪断速度などの外的な影響によって影響される。
【0004】
抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）は、従来の小分子および抗体癌化学療法と比較して非特異的毒性を減少させ、有効性を増加させるように設計された標的化抗癌治療薬である。それらは、モノクローナル抗体の強力な標的能力を用いて、効力の高い複合体化小分子療法薬を癌細胞に特異的に送達する。ＡＤＣは、抗体に複合体化された強力な小分子薬物からなり、腫瘍細胞への標的化送達を可能にする。複合体化プロセスは、所望の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を達成するための抗体および細胞毒性薬の化学反応を含む。（Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉ，Ｍ．Ｌ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．Ｃ．Ｗｉｄｄｉｓｏｎ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｐｔ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｎｇｅ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５３（２０１４）３７９６－３８２７；Ｐ．Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１６），３－１９）．ＤＡＲは安全性および有効性の両方に直接影響を及ぼすため、厳密に制御する必要がある。ＤＡＲはまた、製品の一貫性を確保するために適切に狭い仕様に制御される必要がある。
【0005】
抗体－薬物複合体を形成するために必要な化学反応工程は、タンパク質凝集をもたらし得る長い保持時間、高いｐＨ、溶媒バックグラウンドなどの反応条件を必要とする場合がある。最終原薬として、複合体中の凝集体のレベルは、要求される仕様内で制御されなければならない。凝集体の総レベルに加えて、非常に高分子量の種（ｖＨＭＷＳ）と呼ばれることが多い二量体よりも大きい生成物多量体に特に焦点を当てる必要があり得る。特に超高分子量種（ｖＨＭＷＳ）では、タンパク質凝集体からの免疫原性のリスクが増大するため、この特定の凝集体種の形成を減少させるための協調的な努力がなされてきた（Ｗ．Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｎｇｈ，Ｎ．Ｌｉ，Ｍ．Ｒ．Ｔｏｌｅｒ，Ｋ．Ｒ．Ｋｉｎｇ，Ｓ．Ｎｅｍａ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ－－ｃｏｎｃｅｒｎｓ ａｎｄ ｒｅａｌｉｔｉｅｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．４３１（２０１２）１－１１）。
【0006】
出発モノクローナル抗体（ｍＡｂ）中間体は、標準的な生物学的治療薬と同様の製品品質を達成するために製造および精製される（Ａ．Ａ．Ｓｈｕｋｌａ，Ｂ．Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｔ．Ｔｒｅｓｓｅｌ，Ｓ．Ｇｕｈａｎ Ｓ，Ｄ．Ｌｏｗ，Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－－ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｆｏｒｍ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８４８（２００７）２８－３９）；Ｐ．Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ，Ｒ．Ｄｉｔｚ，Ｊ．Ｓｔｒｕｂｅ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｎｄ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｓｅｌ）１（２０１４）１８８－２１２）。
【0007】
抗体の精製は、典型的には、結合－溶出クロマトグラフィーまたはフロースルークロマトグラフィーを用いて行われる。弱分配クロマトグラフィー（Ｋｅｌｌｅｙ，ＢＤら，２００８ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０１（３）：５５３－５６６；米国特許出願公開第２００７／００６０７４１号）および過負荷クロマトグラフィー（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３７９７７）は、それぞれ陰イオン交換樹脂（ＡＥＸ）および陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂に対して、抗体精製を強化するために使用されている。
【0008】
プラットフォームプロセスおよびＨＴＳ法を活用する精製方法は、典型的には、抗体精製方法における凝集体および不純物の除去に一般的に使用される陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いた抗体精製の開発に使用される。ＣＥＸは、典型的には、比較的低い目標負荷密度結合－溶出モードで運転される（Ｈ．Ｆ．Ｌｉｕ，Ｊ．Ｍａ，Ｃ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｒ．Ｂａｙｅｒ，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｍＡｂｓ，２（２０１０）４８０－４９９）。
【0009】
結合－溶出クロマトグラフィー：結合－溶出クロマトグラフィーでは、生成物は通常、クロマトグラフィー材料への動的結合容量（ＤＢＣ）が最大になるように負荷され、次いで、溶出液において最大の生成物純度が達成されるように洗浄および溶出条件が特定される。結合－溶出クロマトグラフィーの限界は、実際の樹脂ＤＢＣに対する負荷密度の制限である。したがって、結合－溶出クロマトグラフィー精製は、負荷密度が低いために、より大きなカラムサイズを必要とする。結合－溶出モードの精製工程は、製造段階で開発および実施するためにより複雑である。結合溶出精製工程のプール基準は重要なパラメータであり得、収率の低下および設備適合の課題をもたらす可能性がある。
【0010】
フロースルークロマトグラフィー：フロースルークロマトグラフィーを使用して、生成物が流れる間に不純物がクロマトグラフィー材料に強く結合する負荷条件が特定される。フロースルークロマトグラフィーにより、標準抗体の高負荷密度が可能になる。
【0011】
過負荷クロマトグラフィー：このクロマトグラフィーのモードでは、目的の生成物は、生成物に対するクロマトグラフィー材料の動的結合容量を超えて負荷され、したがって過負荷と呼ばれる。操作様式は、陽イオン交換（ＣＥＸ）媒体、特に膜を用いた抗体精製を提供することが実証されている。しかし、この手法の限界は、溶出相が存在しないため、樹脂では収率が低くなる可能性がある。過負荷クロマトグラフィーのさらなる課題は、高力価のための設備および適切な負荷条件を含む適切な重要なプロセスパラメータである。
【0012】
標準的なモノクローナル抗体の精製開発に典型的に使用されるハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）ロボット装置。しかし、そのようなハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）ロボット装置は、細胞毒性化合物の取り扱いには適切でないか、安全でない可能性がある（Ｊ．Ｌ．Ｃｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ｆ．Ｋｒａｍａｒｃｚｙｋ，Ｂ．Ｄ．Ｋｅｌｌｅｙ，Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ｉ．Ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｌｕｍｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１００（２００８）６０５－６１８；Ｍ．Ｉ．Ｈｅｎｓｇｅｎ，Ｂ．Ｓｔｕｍｐ，Ｓａｆｅ Ｈａｎｄｌｉｎｇ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｉｎ：Ｄｕｃｒｙ Ｌ．（編），Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），１０４５（２０１３）；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．２０１３，ｐｐ．１３０－１４２）。これにより、ＡＤＣの精製のためにＨＴＳを使用する際の課題がもたらされる。
【0013】
ＡＤＣを形成するための複合体化反応中に凝集体の形成を確実に制御できない場合、原薬凝集体の仕様を達成するために、複合体化後に精製工程を実施しなければならない。精製は、強力な化合物を取り扱う安全性要件を損なうことなく、ＤＡＲおよび薬物負荷分布などの所望のＡＤＣ製品の品質に影響を与えることなく行われなければならない。ＡＤＣ精製技術はまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用する。ＨＩＣは、分子の疎水性に基づいて分子を分離するための有用なツールである。通常、高塩緩衝液中のサンプル分子がＨＩＣカラムに負荷される。緩衝液中の塩は水分子と相互作用して溶液中の分子の溶媒和を減少させ、それによってサンプル分子中の疎水性領域を露出させ、その結果ＨＩＣカラムに吸着する。分子の疎水性が高いほど、結合を促進するために必要な塩は少なくなる。通常、減少する塩勾配を使用して、カラムからサンプルを溶出する。イオン強度が低下すると、分子の親水性領域の露出が増加し、疎水性が高い順に分子がカラムから溶出する。サンプルの溶出は、穏やかな有機改質剤または界面活性剤を溶出緩衝液に添加することによっても達成され得る。ＨＩＣは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第１７６－１７９頁（１９８８）に概説されている。
【0014】
しかし、高塩濃度の存在下でほぼ中性のｐＨで一般的に実施されるＨＩＣ技術は、ＡＤＣの沈殿ならびにフィルタの汚染による強力な化合物の取り扱いにおける安全性の問題をもたらし得る。（Ｂｅｃｋｅｒ Ｃ．Ｌ．，Ｄｕｆｆｙ Ｒ．Ｊ．，Ｇａｎｄａｒｉｌｌａ Ｊ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｓ．Ｍ．（２０２０）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＣｓ ｂｙ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｉｎ：Ｔｕｍｅｙ Ｌ．（編）Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ２０７８．Ｈｕｍａｎａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－１－４９３９－９９２９－３＿１９）
【0015】
一般に、ＡＤＣ精製の開発は、細胞毒性化合物を取り扱う安全性要件のためにより困難である。ヒト治療薬として使用するのに十分な純度までのＡＤＣの大規模で費用効果の高い精製は、依然として困難な課題である。
【0016】
種々のＡＤＣ精製技術が文献で説明されている。例えば、ＣＮ１０４２０８７１９には、ＡＤＣ精製のための溶出および過負荷が記載されている。しかし、ＣＮ１０４２０８７１９には、フロースルーモードでの精製についての教示は提供されていない。さらに、ＣＮ１０４２０８７１９は、抗体精製を論じておらず、抗体中間体精製中に開発された精製条件をＡＤＣの精製に活用するための教示も提供していない。別の例では、米国特許出願公開第２０１３２４５１３９号では、抗体の凝集体精製のためにＣＥＸ膜が使用されている。しかし、米国特許出願公開第２０１３２４５１３９号は、ＡＤＣの精製、特に抗体中間体精製中に開発された精製条件をＡＤＣの精製に活用するための教示を提供していない。
【0017】
したがって、本発明の目的は、抗体中間体の精製条件を活用するフロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する抗体薬物複合体の精製方法を開発する方法を提供することである。
【0018】
ＤＡＲおよび薬物負荷分布などのＡＤＣ製品の重要な品質特性（ＣＱＡ）にも影響を及ぼさない凝集体を除去するための精製中の条件を特定することも本発明の目的である。
【0019】
本発明の別の目的は、フロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する抗体薬物複合体の迅速かつ堅牢な精製工程の開発を提供することである。
【0020】
本発明のさらなる目的は、フロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する抗体薬物複合体のための低コストで堅牢な精製工程を提供することである。
【0021】
本発明の目的はまた、ｖＨＭＷＳを特異的に除去することである。
【0022】
単純化されたＡＤＣ精製方法およびＡＤＣ精製プロセスは、ｖＨＭＷＳを有意に減少させ、一貫して高い収率を達成し、ＡＤＣ生成物の重要な品質特性（ＣＱＡ）を変化させなかった。この精製アプローチはまた、最小限の発達でＡＤＣのためのｖＨＭＷＳ除去のための精製方法を開発するために使用し得る。
【発明の概要】
【0023】
概要
本発明は、抗体中間体精製中に開発された精製条件をＡＤＣの精製のために活用するための方法を提供する。
本発明は、抗体中間体精製中に開発された精製条件をＡＤＣの精製のために活用するための方法を提供する。
【0024】
一態様では、本発明は、システイン指向性抗体薬物複合体（ＡＤＣ）中の超高分子量種（ｖＨＭＷＳ）の濃度を低下させるための改良された方法であって、本方法が、
ａ．第１のセットの精製条件を使用して陽イオン交換クロマトグラフィー材料で抗体の第１の精製を実施して、精製された抗体中間体を得る工程；
ｂ．精製された抗体中間体を細胞毒性薬と結合させて、ｃｙｓ ＡＤＣおよびタンパク質凝集体を含む粗調製物を形成する工程；および
ｃ．第１のセットの精製条件を使用してフロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィー材料により粗調製物の第２の精製を実施して、精製されたｃｙｓ ＡＤＣを生成する工程
を含み、
セットの精製条件が、緩衝系の負荷密度、緩衝種、ｐＨおよび導電率を含む、方法を提供する。
ａ．第１のセットの精製条件を使用して陽イオン交換クロマトグラフィー材料で抗体の第１の精製を実施して、精製された抗体中間体を得る工程；
ｂ．精製された抗体中間体を細胞毒性薬と結合させて、ｃｙｓ ＡＤＣおよびタンパク質凝集体を含む粗調製物を形成する工程；および
ｃ．第１のセットの精製条件を使用してフロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィー材料により粗調製物の第２の精製を実施して、精製されたｃｙｓ ＡＤＣを生成する工程
を含み、
セットの精製条件が、緩衝系の負荷密度、緩衝種、ｐＨおよび導電率を含む、方法を提供する。
【0025】
別の態様では、本発明は、ｃｙｓＡＤＣの重要な品質特性（ＣＱＡ）を変更することなく、溶出液中のｖＨＭＷＳの濃度を、ｃｙｓＡＤＣおよびタンパク質凝集体の粗混合物中のタンパク質凝集体の濃度に対して少なくとも８５％低下させることを提供する。
【0026】
さらに別の態様では、本発明は、ＡＤＣ中のｖＨＭＷＳを０．１％未満に減少させる方法を提供する。
【0027】
さらに別の態様では、本発明は、陽イオン交換カラムに使用される樹脂がＰＯＲＯＳ ５０ＨＳ、ＰＯＲＯＳ ＸＳ、およびＳＰＦＦ樹脂から選択される方法を提供する。
【0028】
さらなる態様では、本発明は、システイン指向性抗体薬物複合体（ｃｙｓ ＡＤＣ）を精製する方法であって、本方法が、
ａ．第１のセットの精製条件を使用して陽イオン交換クロマトグラフィー材料で抗体の第１の精製を実施して、精製された抗体中間体を得る工程；
ｂ．精製された抗体中間体を細胞毒性薬と結合させて、ｃｙｓ ＡＤＣの粗調製物を形成する工程；および
ｃ．第１のセットの精製条件を使用してフロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィー材料により粗調製物の第２の精製を実施して、精製されたｃｙｓ ＡＤＣを生成する工程
を含み、
セットの精製条件が、緩衝系の負荷密度、緩衝種、ｐＨおよび導電率を含む、方法を提供する。
ａ．第１のセットの精製条件を使用して陽イオン交換クロマトグラフィー材料で抗体の第１の精製を実施して、精製された抗体中間体を得る工程；
ｂ．精製された抗体中間体を細胞毒性薬と結合させて、ｃｙｓ ＡＤＣの粗調製物を形成する工程；および
ｃ．第１のセットの精製条件を使用してフロースルーモードで陽イオン交換クロマトグラフィー材料により粗調製物の第２の精製を実施して、精製されたｃｙｓ ＡＤＣを生成する工程
を含み、
セットの精製条件が、緩衝系の負荷密度、緩衝種、ｐＨおよび導電率を含む、方法を提供する。
【0029】
ｃｙｓ ＡＤＣを精製する方法の一実施形態では、細胞毒性子は、アウリスタチン、メイタンシノイドおよびＤＮＡ損傷剤からなる群から選択される。
【0030】
Ｃｙｓ ＡＤＣを精製する方法の別の実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、カリケアマイシン、アントラサイクリンおよびピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択される誘導体である、請求項２３に記載の方法。
【0031】
本発明のなおさらなる実施形態では、ｃｙｓ ＡＤＣの形成に使用される抗体は、結合－溶出モードで精製される。
【0032】
本発明の別の実施形態では、精製抗体中間体を得るための第１の精製は、段階溶出を含む。
【0033】
本発明のさらに別の実施形態では、精製抗体中間体を得るための第１の精製は、勾配溶出を含む。
【0034】
抗体を精製する方法の別の実施形態では、抗体の結合挙動を決定するスクリーニング方法はハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）である。
【0035】
本発明の別の実施形態では、抗体の精製において使用されるＨＴＳは、ｐＨおよび対イオン濃度の関数としての抗体の結合挙動をマッピングするために使用される。
【0036】
別の実施形態では、抗体の結合挙動をマッピングするために使用される抗体ＨＴＳの結果を活用して、ＡＤＣ精製のためのフロースルー条件を特定する。
【0037】
本発明のさらなる実施形態では、抗体またはｃｙｓ ＡＤＣの精製中に除去されるタンパク質凝集種は、抗体またはｃｙｓ ＡＤＣの超高分子量種（ｖＨＭＷＳ）および高分子量種（ＨＭＷＳ）を含む。
【0038】
本発明のなおさらなる実施形態では、精製中に除去されるタンパク質凝集種は、超高分子量種（ｖＨＭＷＳ）である。
【0039】
本発明の別の実施形態では、ｃｙｓ ＡＤＣは、天然システインを標的とする操作されたシステインおよび鎖間システイン複合体を介して部位特異的複合体から選択される。
【0040】
別の実施形態では、ｃｙｓ ＡＤＣは、操作されたシステインを介した部位特異的複合体である。
【0041】
さらに別の実施形態では、ｃｙｓ ＡＤＣは、天然システインを標的とする鎖間システイン複合体である。
【0042】
本発明のなおさらなる実施形態では、精製方法を開発する方法は、チオマブ抗生物質抗体複合体（ＡＡＣ）を含む。
【0043】
本発明の別の実施形態では、ｃｙｓ ＡＤＣのプール基準は０．５ＯＤ～０．５ＯＤである。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【発明を実施するための形態】
【0049】
発明の詳細な説明
本発明は、抗体を精製し、ＡＤＣ精製のための抗体中間体凝集体種の結合挙動を活用することを含む、システイン指向性抗体薬物複合体の精製を開発する方法およびシステイン指向性抗体薬物複合体の精製方法を開発する方法に関する。
本発明は、抗体を精製し、ＡＤＣ精製のための抗体中間体凝集体種の結合挙動を活用することを含む、システイン指向性抗体薬物複合体の精製を開発する方法およびシステイン指向性抗体薬物複合体の精製方法を開発する方法に関する。
【0050】
本明細書および特許請求の範囲の目的のために、特に指示しない限り、成分の量、材料の割合または比率、反応条件、ならびに本明細書および特許請求の範囲で使用される他の数値を表す全ての数字は、明示的に示されているか否かにかかわらず、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、一般に、列挙された値と等価であると考えられる数の範囲を指す。多くの場合、「約」という用語は、最も近い有効数字に四捨五入された数字を含み得る。さらに、本明細書に開示される全ての範囲は、その中に包含される全ての下位範囲を包含すると理解されるべきである。
【0051】
本明細書に引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
【0052】
本発明を更に詳細に説明する前に、いくつかの用語を定義する。これらの用語の使用は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の説明を容易にするためにのみ役立つ。
定義：
定義：
【0053】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、無傷のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を包含する。
【0054】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、一般に無傷の抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【0055】
本明細書で使用される場合、「抗体中間体」は、細胞毒性薬と複合体化させて抗体薬物複合体を生成するために使用される、第１のセットの精製条件を使用して第１の精製を行うことによって精製された精製抗体を指す。
【0056】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ（１つの）」、「ｏｒ（または）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【0057】
本明細書で使用される場合、「結合挙動」は、ｐＨおよび対イオン濃度を含む特定の条件での抗体、抗体中間体またはＡＤＣの樹脂への結合または非結合を指す。
【0058】
本明細書で使用される場合、「緩衝液」とは、その酸－塩基複合体成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する緩衝溶液を指す。本発明のＣＥＸクロマトグラフィー態様の緩衝液は、約４．５～６．５、好ましくは約５．３～５．７の範囲のｐＨを有する。ｐＨをこの範囲内に調整する緩衝液の例としては、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩もしくはアンモニウム緩衝液、または２つ以上の緩衝液が挙げられる。好ましいそのような緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩およびアンモニウム緩衝液であり、最も好ましくは酢酸ナトリウム緩衝液である。「負荷緩衝液」は、ＡＤＣと不純物／汚染物質との混合物をＣＥＸカラムに充填するために使用されるものであり、「平衡／洗浄緩衝液」は、不純物／汚染物質がカラムに保持されている間に抗体を回収するためにカラムからＡＤＣを洗浄するために使用されるものである。多くの場合、負荷緩衝液および平衡／洗浄緩衝液は、同じｐＨおよび／または導電率条件を有する。
【0059】
クロマトグラフィーに関して本明細書で使用される「連続的（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）」という用語は、第１のクロマトグラフィーに続いて第２のクロマトグラフィーを有することを指す。さらなる工程が第１のクロマトグラフィーと第２のクロマトグラフィーとの間に含まれていてもよい。
【0060】
クロマトグラフィーに関して本明細書で使用される「継続的」という用語は、直接接続されているか、または２つのクロマトグラフィー材料の間の継続流を可能にする何らかの他の機構を介して接続された第１のクロマトグラフィー材料と第２のクロマトグラフィーとを有することを指す。
【0061】
本明細書で使用される操作されたシステインという用語は、部位特異的複合体化のための操作された反応性システイン残基を有し、均一な複合体化を示す抗体を指す。
【0062】
本明細書で使用されるシステイン指向性抗体薬物複合体（ｃｙｓ ＡＤＣ）という用語は、細胞毒性薬との複合体化に利用可能なシステイン残基を有する抗体の複合体を指す。
【0063】
本明細書で使用される天然システインという用語は、鎖間ジスルフィド結合を指し、０、２、４、６、および８－ＤＡＲ形態からなる不均一な複合体をもたらす部分還元によって生成される。
【0064】
本明細書で使用される場合、「細胞毒性薬」という用語は、細胞機能を阻害もしくは防止し、および／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性薬としては、アウリスタチン、メイタンシノイド、ならびにカリケアマイシン、アントラサイクリンおよびピロロベンゾジアゼピンを含むＤＮＡ損傷剤、放射性同位体；化学療法剤または薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；毒素、例えば細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素、例えばその断片および／またはバリアント；ならびに様々な抗腫瘍剤または抗癌剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0065】
本明細書で使用される場合、「ＤＡＲ」という用語は、平均薬物抗体比である。ＤＡＲはＡＤＣの安全性および有効性に直接影響し、ＡＤＣ製造方法中に直接制御される。
【0066】
本明細書で使用される場合「薬物負荷分布」という用語は、抗体に複合体化された薬物の数を指す。
【0067】
重要な品質特性（ＣＱＡ）という用語は、平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）および薬物負荷分布を含み、ＡＤＣによって送達され得る細胞毒性薬の量を決定する。
【0068】
クロマトグラフィー材料の「動的結合容量」は、生成物、例えばポリペプチドの量であり、物質は、未結合生成物の有意なブレークスルーが起こる前に実際の流動条件下で結合する。
【0069】
本明細書で使用される場合、「分配係数」、Ｋｐは、固定相中の生成物、例えばポリペプチドのモル濃度を移動相中の生成物のモル濃度で割ったものを指す。
【0070】
「負荷密度」は、クロマトグラフィー材料の体積（例えば、リットル）と接触した組成物の量（例えば、グラム）を指す。いくつかの例では、負荷密度はｇ／Ｌｒで表される。
【0071】
本明細書で使用される場合、「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、目的の抗体または抗体薬物複合体が固相イオン交換材料に連結された荷電化合物と相互作用するか、または相互作用しないクロマトグラフィー法を指し、その結果、混合物中の不純物または凝集物が、目的の抗体または抗体薬物複合体よりも速くまたは遅くイオン交換材料のカラムから溶出し、不純物または凝集物と比較して樹脂に結合するか、または樹脂から排除される。「イオン交換クロマトグラフィー」には、具外的に、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーが挙げられる。
【0072】
本明細書で使用される場合、「陰イオン交換樹脂」または「ＡＥＸ」という用語は、正に帯電している固相を指し、例えば、それに結合した第四級アミノ基などの１つ以上の正に帯電したリガンドを有する。市販の陰イオン交換樹脂としては、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴ Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、標的分子に結合し、続いて溶出させることが可能であり、または標的抗体もしくは抗体薬物複合体がカラムを通過する間に、主に不純物を結合させ得る。
【0073】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、負に帯電した固相であり、固相を通過する水溶液（抗体および不純物を含む組成物など）中の陽イオンと交換するための遊離陰イオンを有する。本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態では、陽イオン交換材料は、膜、モノリス、または樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、陽イオン交換材料は、樹脂であり得る。陽イオン交換材料は、例えば、スルホン酸塩、カルボキシル、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル、またはオルトリン酸塩であるが、これらに限定されないカルボン酸官能基またはスルホン酸官能基を含み得る。上述のいくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムである。上述のいくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィー膜である。樹脂を含む陽イオン交換材料の例は、当技術分野で公知であり、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓ、Ｓ０３Ｍｏｎｏｌｉｔｈ（例えば、ＣＩＭ（登録商標）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）およびＣＩＭａｃ（登録商標）Ｓ０３）、Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＳ ５０、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＳ ２０、ｓｕｌｐｈｏｐｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＳＰＳＦＦ）、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬ（ＳＰＸＬ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ Ｓｅ Ｈｉｃａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ Ｓ０３、またはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＣＯＯが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーは「結合－溶出液」モードで実施される。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーは「フロースルー」モードで実施される。上記のいくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー材料はカラム内にある。上記のいくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は膜中にある。
【0074】
「不純物」とは、所望のポリペプチド産物とは異なる物質を指す。不純物は、ワンアーム抗体および誤って組み立てられた抗体などの産物特異的なポリペプチド、塩基性バリアントおよび酸性バリアントを含む抗体バリアント、ならびに凝集体を指し得る。他の不純物としては、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などの宿主細胞材料を含むプロセス特異的不純物；浸出プロテインＡ；核酸；別のポリペプチド；内毒素；ウイルス汚染物質；細胞培養培地成分などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、不純物は、例えば、大腸菌細胞（ＥＣＰ）などの細菌細胞、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞からのＨＣＰであり得るが、これらに限定されない。いくつかの例では、不純物は、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞からのＨＣＰ、すなわち、ＣＨＯ細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）であり得る。不純物は、多重特異性抗体の発現、折り畳み、または組み立てを促進するために使用されるアクセサリータンパク質；例えば、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣなどの原核生物シャペロンなどを指す場合がある。
【0075】
本明細書で使用される場合、高分子量物質（ＨＭＷＳ）は、ＡＤＣのタンパク質二量体または抗体のタンパク質二量体を指す。
【0076】
本明細書で使用される場合、超高分子量物質は、ＡＤＣのオリゴマーまたは抗体のオリゴマーを指す。
【0077】
本明細書で使用される場合、タンパク質という用語は、抗体およびＡＤＣを含む。
【0078】
純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度を意味するわけではない。本明細書で互換的に使用される「精製」、「分離」または「単離」という用語は、所望の分子および１つ以上の不純物を含む組成物またはサンプルから所望の分子の純度を増加させることを指す。典型的には、組成物から少なくとも１つの不純物を（完全にまたは部分的に）除去することによって、所望の分子の純度の程度が高められる。
【0079】
精製条件も相対的な用語であり、これらの条件は精製方法ごとに異なり得る。精製条件は、緩衝系の負荷密度、緩衝種、ｐＨおよび導電率を含み得る。
【0080】
材料および方法
ａ．薬物複合体
ａ．薬物複合体
【0081】
複合体化は、複合体設計に基づいて異なっていてもよいタンパク質を改変するための多段階プロセスである。天然システインを標的とする操作されたシステインおよび鎖間システイン複合体を介した２種類の複合体：部位特異的複合体を用いて精製を検討した。
【0082】
部位特異的複合体の場合、精製中間体を還元剤と共に一晩インキュベートして、抗体の天然のシステインおよび操作されたシステインを完全に還元し、操作されたシステインから全てのシステインまたはグルタチオンキャップを除去する。還元された抗体を緩衝液交換して、残留還元体およびキャップ種を除去する。鎖間ジスルフィド結合は、再酸化工程を介して再形成され、操作されたシステインがリンカー－薬物との複合体化に利用可能になる。過剰なリンカー－薬物を添加して、全ての遊離チオールとの完全な複合体化を確実にする（Ｊ．Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｈ．Ｒａａｂ，Ｓ．Ｃｌａｒｋ，ら、Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇ ｔｏ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２６（２００８）９２５－９３２）。リンカー－薬物に応じて、複合体化は、反応のｐＨを低下させることによってクエンチまたは停止される。最後に、残留遊離薬物を除去する。
【0083】
鎖間システイン複合体の場合、抗体中間体の天然システインは、リンカー薬物との複合体化の前に、予め定義された量の還元剤で部分的に還元される（Ｍ．Ｍ．Ｃ．Ｓｕｎ，Ｋ．Ｓ．Ｂｅａｍ，Ｃ．Ｇ．Ｃｅｒｖｅｎｙ，Ｋ．Ｊ．Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｒ．Ｓ．Ｂｌａｃｋｍｏｒｅ，Ｍ．Ｙ．Ｔｏｒｇｏｖ，Ｆ．Ｇ．Ｍ．Ｈａｎｄｌｅｙ，Ｎ．Ｃ．Ｉｈｌｅ，Ｐ．Ｄ．Ｓｅｎｔｅｒ，Ｓ．Ｃ．Ａｌｌｅｙ，Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ－Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６（２００５）１２８２－１２９０）。過剰なリンカー薬物をクエンチし、残留遊離薬物を除去する。
【0084】
ｂ．複合体カラム精製
カラムクロマトグラフィー実験は、陽イオン交換樹脂を充填した様々なサイズのカラムを備えたＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００を使用して行った。調整した荷重を様々な荷重密度で平衡化カラムに適用し、フロースルーを収集した。負荷段階の後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄して、ＡＤＣの回収率を増大させた。プールを洗浄段階の終了時またはＯＤが０．５未満になったときに終了した。カラムを０．５Ｎ ＮａＣｌで再生し、０．５Ｎ ＮａＯＨで清潔にし、０．１Ｎ ＮａＯＨ中で保存した。
カラムクロマトグラフィー実験は、陽イオン交換樹脂を充填した様々なサイズのカラムを備えたＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００を使用して行った。調整した荷重を様々な荷重密度で平衡化カラムに適用し、フロースルーを収集した。負荷段階の後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄して、ＡＤＣの回収率を増大させた。プールを洗浄段階の終了時またはＯＤが０．５未満になったときに終了した。カラムを０．５Ｎ ＮａＣｌで再生し、０．５Ｎ ＮａＯＨで清潔にし、０．１Ｎ ＮａＯＨ中で保存した。
【0085】
ｃ．抗体中間体精製開発
抗体中間体について、公知の方法（Ｐ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｂ．Ｔｒａｎ，Ｃ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｚｈａｏ，Ｂ．Ｄ．Ｋｅｌｌｅｙ，Ｐ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃａｔｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｒｅｓｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１４３３（２０１６）６６－７４）を用いてハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実施した。ＨＴＳは、ｐＨおよび緩衝液濃度の関数として抗体の結合挙動をマッピングする（Ｊ．Ｌ．Ｃｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ｆ．Ｋｒａｍａｒｃｚｙｋ，Ｂ．Ｄ．Ｋｅｌｌｅｙ，Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ｉ．Ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｌｕｍｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１００（２００８）６０５－６１８）。陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂上での結合および溶出条件を開発するために、Ｔｅｃａｎ Ｒｏｂｏｔｉｃ液体取り扱いシステムまたはマルチチャネルピペットを使用する９６ウェルフィルタープレートを備えたＨＴＳをバッチ結合実験に使用した。条件を確認および最適化するために、充填床実験室規模のカラムを使用した。
抗体中間体について、公知の方法（Ｐ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｂ．Ｔｒａｎ，Ｃ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｚｈａｏ，Ｂ．Ｄ．Ｋｅｌｌｅｙ，Ｐ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃａｔｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｒｅｓｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１４３３（２０１６）６６－７４）を用いてハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実施した。ＨＴＳは、ｐＨおよび緩衝液濃度の関数として抗体の結合挙動をマッピングする（Ｊ．Ｌ．Ｃｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ｆ．Ｋｒａｍａｒｃｚｙｋ，Ｂ．Ｄ．Ｋｅｌｌｅｙ，Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ｉ．Ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｌｕｍｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１００（２００８）６０５－６１８）。陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂上での結合および溶出条件を開発するために、Ｔｅｃａｎ Ｒｏｂｏｔｉｃ液体取り扱いシステムまたはマルチチャネルピペットを使用する９６ウェルフィルタープレートを備えたＨＴＳをバッチ結合実験に使用した。条件を確認および最適化するために、充填床実験室規模のカラムを使用した。
【0086】
抗体中間体精製方法は、凝集物および宿主細胞不純物の除去のためにＣＥＸを実施し、１００ｇ／Ｌｒ未満の負荷密度で結合－溶出モードで操作する（Ｈ．Ｆ．Ｌｉｕ，Ｂ．ＭｃＣｏｏｅｙ，Ｔ．Ｄｕａｒｔｅ，Ｄ．Ｅ．Ｍｙｅｒｓ，Ｔ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ａ．Ａｍａｎｕｌｌａｈ，Ｒ．ｖａｎ Ｒｅｉｓ，Ｂ．Ｄ．Ｋｅｌｌｅｙ，Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｅｒｌｏａｄｅｄ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１２１８（２０１１）６９４３－５２）。生成物を負荷し、カラムを洗浄した後、モノマーを溶出緩衝液で溶出した。抗体中間体凝集種の結合挙動をＡＤＣ精製開発のために活用した。
【0087】
ｄ．分析方法
タンパク質の濃度を、ＵＶ－ｖｉｓ分光光度法（Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３）によって定量した。タンパク質濃度は、光散乱を補正するために３２０ｎｍまたは４００ｎｍのいずれかの吸光度を差し引いた２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。サンプルの消衰係数εを以下の式で使用した。ここで、
はサンプル経路長であり、Ａ２８０およびＡ３２０はそれぞれ２８０ｎｍおよび３２０ｎｍでの測定吸光度値である。
タンパク質の濃度を、ＵＶ－ｖｉｓ分光光度法（Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３）によって定量した。タンパク質濃度は、光散乱を補正するために３２０ｎｍまたは４００ｎｍのいずれかの吸光度を差し引いた２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。サンプルの消衰係数εを以下の式で使用した。ここで、
【0088】
タンパク質不純物を、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘＬカラム（７．８×３００ｍｍ、日本東京都東ソーバイオサイエンス）を使用するＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した。ピークを、１５％ ＩＰＡおよび８５％の０．２Ｍリン酸カリウム、０．２５Ｍ塩化カリウム、ｐＨ ６．９５の移動相を使用した定組成分離で分離した。流速を周囲温度で０．５ｍＬ／分に維持し、２８０ｎｍでＵＶ検出した。クロマトグラムの例が図１に示されており、両方の複合体のタイプを代表している。検出された２つの主な凝集種には、ｖＨＭＷＳおよびＨＭＷＳが含まれる。ＨＭＷＳはタンパク質二量体であり、ｖＨＭＷＳは抗体／ＡＤＣのオリゴマーである。
【0089】
平均ＤＡＲおよび薬物負荷分布は、図２および図３に示すように、分析的疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法を使用して測定した。サンプルを東ソーバイオサイエンスＢｕｔｙｌ－ＮＰＲカラム（４．６ｍｍ×３．５ｃｍ、２．５μｍ）に注入し、０．８ｍＬ／分の流量で溶媒Ｂを用いて直線勾配にわたって溶出させ、２８０ｎｍで吸光度をモニターした。個々の複合体の勾配および溶媒Ｂを表１に示す。
【表1】
【0090】
ＡＤＣの精製方法は、それらのそれぞれの抗体中間体の開発に基づいて開発された。抗体中間体のそれぞれは、それらの特性（例えば、ｐＩ、結合特性など）に基づいて独立した精製方法開発が行われ、わずかに異なる精製プロセスおよび操作様式をもたらした（表２）。異なる抗体精製工程に基づいて、異なるアプローチを使用して、本明細書に記載の複合体分子のフロースルー精製条件を開発した。
【0091】
ＡＤＣ－１：抗体－１は勾配溶出を利用したので、手動の樹脂スクリーニングをＡＤＣ－１を用いて実施し、抗体－１についてのＨＴＳの結果と比較した。カラムを通ってモノマーが流れるように凝集体を強く結合するがモノマーを結合しない、０．７５～１．２５のＬｏｇＫｐ（抗体）を有する条件およびｐＨ／導電率条件を含む有望な条件が選択された。充填床カラム実験を用いて有望な条件を試験して、最適なフロースルー条件を決定した。
【0092】
ＡＤＣ－２：ＨＴＳはＡＤＣに対して実施されず、代わりに抗体－２の開発ＨＴＳ結果が活用された。抗体中間工程溶出条件は、凝集体を保持したままモノマーがカラムから溶出するように開発された。これらの条件を複合体に適用して、カラム負荷材料が凝集種を除去しながら生成物のフロースルーをもたらすようにした。精製能力に対する負荷条件のロバスト性を、充填床カラム実験を用いて評価し、製造規模で性能を評価した。
【0093】
ＡＤＣ－３：抗体精製条件をＡＤＣに適用し得るという理論を、第３の生成物を用いて試験した。抗体－２と同様に、ＨＴＳをＡＤＣ－３について実施せず、抗体－３からの段階溶出条件をＡＤＣに適用して、フロースルーで凝集種を除去した。単一充填カラム実験を実施して、複合体の精製能力を確認した。
【表2】
【0094】
特に明記しない限り、ＡＤＣ精製操作には、０．６６ｃｍ内径（ＩＤ）×１．０ｃｍ床高さ（ＢＨ）の小規模カラムを使用した。また、平衡／洗浄緩衝液条件を負荷条件に適合するように調整した。ＡＤＣ精製の焦点はｖＨＭＷＳの除去であったが、ＨＭＷＳ除去も監視した。さらに、精製工程にわたってＤＡＲまたは薬物負荷分布を変更することは望まれなかった。
【0095】
実施例１：ＡＤＣ－１精製方法
【0096】
ＡＤＣ－１のフロースルー条件を決定するために、マルチチャネルピペットおよび９６ウェルプレートを使用してＣＥＸ樹脂を用いて手動バッチ結合スクリーニングを実施した。複合体スクリーニングの結果は、同様の結合挙動を有する抗体と複合体との間で同等であった（図４）。約１のＬｏｇＫｐ値に対応する２１４ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５の負荷条件を、凝集体が樹脂に結合したままモノマーをフロースルーさせる目標条件として選択した。
【0097】
精製工程をフロースルーモードで実行できるように、選択された標的精製条件をＡＤＣ－１に適用した。ＡＤＣ負荷を目標の導電率およびｐＨに滴定し、５００ｇ／Ｌｒの負荷密度までカラムに負荷した。カラムを１０ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄してＡＤＣ－１を回収した。負荷およびプールを、凝集体についてはＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析し、ＤＡＲへの影響についてはＨＩＣ－ＨＰＬＣによって分析した（表３）。
【表3】
【0098】
フロースルー精製条件は、ＡＤＣ－１についてｖＨＭＷＳを０．１０％に減少させることに成功した。８９％の収率が達成され、平均ＤＡＲまたは薬物分布に対する影響はなかった。抗体－１は精製のために段階溶出を使用しなかったが、この研究は、抗体ＨＴＳをＡＤＣ精製開発のために活用し得、複合体を用いた手動バッチ結合スクリーニングが不要であることが実証された。抗体ＨＴＳの結果を活用してＡＤＣ精製のためのフロースルー条件を同定し得るという理論を更に試験するために、２つのさらなる生成物を評価した。
【0099】
実施例２：ＡＤＣ－２精製方法
ｉ．抗体２のハイスループットスクリーニング
ａ．抗体－２のＣＥＸ工程の展開は、ＨＴＳを用いて実施した。これらの実験により、凝集不純物が樹脂に結合したままでモノマーを溶出すると予測された有望な段階溶出条件の特定を支持するＬｏｇＫｐ等高線図が生成された。これらのデータに基づいて、標的溶出緩衝液を抗体－２のために選択し、その後のロバスト性研究により、段階溶出精製のロバスト性が確認された。
ｉｉ．ＡＤＣ－２の精製開発
ｂ．抗体－２の工程溶出条件をＡＤＣ－２ ＣＥＸ工程の開発中に活用して、所望の生成物（モノマー）が流れる間に凝集体が樹脂に結合して除去されるような条件を特定した。これを達成するために、カラム平衡、負荷および洗浄相を、抗体－２プロセスに使用される溶出条件（ｐＨおよび導電率）に適合するように調整した。
ｃ．目標条件での凝集体除去の成功を実証した後、目標付近でのプロセスのロバスト性を様々なｐＨおよび伝導率条件で試験した（表４）。ｐＨの低下および導電率の低下によるＣＥＸカラムのより強い結合条件を表す「低」条件を選択した。逆に、生成物の結合を減少させるだけでなく、凝集体の除去も減少させる可能性が高い「高」負荷条件が特定された。様々なｐＨおよび導電率範囲で複数の「高」負荷条件を試験して、凝集体除去に関して最悪の場合の条件付近の動作のロバスト性を調査した。複合体負荷を、適切な緩衝液種を使用して所望の導電率およびｐＨに調整した。平衡化緩衝液および洗浄緩衝液を、負荷の様々な条件に適合するように調整した。負荷密度は２２０～３００ｇ／Ｌｒの範囲であった。
ｄ．「低」負荷条件は、精製の過負荷メカニズムと同様に、樹脂への初期結合およびその後のブレークスルーを示し、ＨＭＷＳもこの負荷条件で有意に減少した（Ｈ．Ｆ．Ｌｉｕ，Ｂ．ＭｃＣｏｏｅｙ，Ｔ．Ｄｕａｒｔｅ，Ｄ．Ｅ．Ｍｙｅｒｓ，Ｔ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ａ．Ａｍａｎｕｌｌａｈ，Ｒ．ｖａｎ Ｒｅｉｓ，Ｂ．Ｄ．Ｋｅｌｌｅｙ，Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｅｒｌｏａｄｅｄ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１２１８（２０１１）６９４３－５２）。質量負荷密度が高いほど収率が向上した。「高＋＋」負荷条件は、障害点を特定し、ｖＨＭＷＳを除去しなかった。しかし、負荷条件の範囲は、「低」条件から「高＋」条件の間の目標負荷条件の周りで堅牢であると実証された（±０．１ｐＨ、±０．７ｍＳ／ｃｍ）。負荷および緩衝液の仕様は、製造への堅牢な実装を保証するように設定された。
ｅ．許容可能な操作範囲が実証された後、０．６６ｃｍ ＩＤ×２０ｃｍ ＢＨカラムを使用して負荷密度を５００ｇ／Ｌｒまでで負荷した。複合体化されたプールを目標負荷ｐＨおよび導電率に調整し、カラムに５００ｇ／Ｌｒまで負荷した。
ｆ．高負荷密度実験からの収率は９６％であり、ｖＨＭＷＳはプール中で０．０２％に減少した（表５）。さらに、精製による平均ＤＡＲへの影響はなかった。抗体－２ＣＥＸ工程の溶出条件を、５００ｇ／Ｌｒの負荷密度でフロースルーモードで複合体に効果的に適用した。
ｉ．抗体２のハイスループットスクリーニング
ａ．抗体－２のＣＥＸ工程の展開は、ＨＴＳを用いて実施した。これらの実験により、凝集不純物が樹脂に結合したままでモノマーを溶出すると予測された有望な段階溶出条件の特定を支持するＬｏｇＫｐ等高線図が生成された。これらのデータに基づいて、標的溶出緩衝液を抗体－２のために選択し、その後のロバスト性研究により、段階溶出精製のロバスト性が確認された。
ｉｉ．ＡＤＣ－２の精製開発
ｂ．抗体－２の工程溶出条件をＡＤＣ－２ ＣＥＸ工程の開発中に活用して、所望の生成物（モノマー）が流れる間に凝集体が樹脂に結合して除去されるような条件を特定した。これを達成するために、カラム平衡、負荷および洗浄相を、抗体－２プロセスに使用される溶出条件（ｐＨおよび導電率）に適合するように調整した。
ｃ．目標条件での凝集体除去の成功を実証した後、目標付近でのプロセスのロバスト性を様々なｐＨおよび伝導率条件で試験した（表４）。ｐＨの低下および導電率の低下によるＣＥＸカラムのより強い結合条件を表す「低」条件を選択した。逆に、生成物の結合を減少させるだけでなく、凝集体の除去も減少させる可能性が高い「高」負荷条件が特定された。様々なｐＨおよび導電率範囲で複数の「高」負荷条件を試験して、凝集体除去に関して最悪の場合の条件付近の動作のロバスト性を調査した。複合体負荷を、適切な緩衝液種を使用して所望の導電率およびｐＨに調整した。平衡化緩衝液および洗浄緩衝液を、負荷の様々な条件に適合するように調整した。負荷密度は２２０～３００ｇ／Ｌｒの範囲であった。
【表4】
ｅ．許容可能な操作範囲が実証された後、０．６６ｃｍ ＩＤ×２０ｃｍ ＢＨカラムを使用して負荷密度を５００ｇ／Ｌｒまでで負荷した。複合体化されたプールを目標負荷ｐＨおよび導電率に調整し、カラムに５００ｇ／Ｌｒまで負荷した。
ｆ．高負荷密度実験からの収率は９６％であり、ｖＨＭＷＳはプール中で０．０２％に減少した（表５）。さらに、精製による平均ＤＡＲへの影響はなかった。抗体－２ＣＥＸ工程の溶出条件を、５００ｇ／Ｌｒの負荷密度でフロースルーモードで複合体に効果的に適用した。
【表5】
【0100】
ＡＤＣ－２精製方法は、１４ｃｍ ＩＤ×１５ｃｍ ＢＨカラムを使用して製造規模に首尾よく拡大された。目標条件での３回の実行を行い、カラムを実行あたり約２６０ｇ／Ｌｒまで充填した。原薬の結果は、検出可能なｖＨＭＷＳを示さず、他の全ての製品品質属性を満たした（表６）。さらに、３回の実行のクロマトグラムは一貫しており、負荷段階中に圧力は増加しなかった。
ａ．略語：ＮＤ＝検出されず
ａ結果は最終原薬に対するものである。プロセス中プール分析は、大規模な実行では行わなかった。
【表6】
ａ結果は最終原薬に対するものである。プロセス中プール分析は、大規模な実行では行わなかった。
【0101】
実施例３：ＡＤＣ－３精製開発
【0102】
抗体－２と同様に、抗体－３の精製方法は、凝集体および不純物を除去するための段階溶出ＣＥＸ工程を使用した。ＡＤＣ精製の開発を実施せずに、抗体－３段階溶出条件をＡＤＣ－３精製に活用した。抗体段階溶出条件を、凝集体が樹脂に結合し、所望の生成物（モノマー）が流れる間に除去されるようにＡＤＣに適用した。
【0103】
生成物のフロースルーを達成するために、複合体ＡＤＣ－３のｐＨおよび導電率を標的抗体－３溶出緩衝液条件に調整した。調整した複合体化の負荷量をＣＥＸカラムに５００ｇ／Ｌｒの負荷密度になるまで負荷した。カラムを１０ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄し、画分を５０ｇ／Ｌｒごとに回収した。画分をプールし、結果を負荷と比較した（表７）。
【表7】
【0104】
３００ｇ／Ｌｒの負荷密度で開始して、ｖＨＭＷＳの小さなブレークスルーが観察された（図５）。ｖＨＭＷＳのブレークスルーを緩和するために、より低い負荷密度またはわずかに強い結合条件を使用した。しかし、精製プール中のｖＨＭＷＳの最終レベルは、５００ｇ／Ｌｒの負荷密度に負荷した場合でも許容レベルまで低下した。
【0105】
これらの結果により、抗体中間体精製工程がＡＤＣ精製のために活用され得ることが実証される。抗体－３段階溶出条件が、フロースルーモードで実行される複合体のために首尾よく実施されたので、ＡＤＣ精製の開発は実施しなかった。フロースルー精製条件は、ＡＤＣ－３についてｖＨＭＷＳを０．３９％～０．０３％に減少させることに成功し、収率は９８％であった。さらに、平均ＤＡＲおよび薬物分布に影響はなかった。
【0106】
結論
抗体精製開発データを使用して、それぞれの複合体の単純なフロースルー精製工程の開発を合理化し得る。抗体段階溶出条件（ｐＨおよび導電率）をＡＤＣに変換して、フロースルー精製を可能にする。抗体段階溶出条件の非存在下では、抗体ＨＴＳを活用して、理想的なＡＤＣフロースルー条件を特定し得る。ＡＤＣ精製工程：
● ｖＨＭＷＳが有意に減少させ、
● 一貫して高い収率を達成したが、
● 平均ＤＡＲや薬物負荷分布に変化はなかった。
抗体精製開発データを使用して、それぞれの複合体の単純なフロースルー精製工程の開発を合理化し得る。抗体段階溶出条件（ｐＨおよび導電率）をＡＤＣに変換して、フロースルー精製を可能にする。抗体段階溶出条件の非存在下では、抗体ＨＴＳを活用して、理想的なＡＤＣフロースルー条件を特定し得る。ＡＤＣ精製工程：
● ｖＨＭＷＳが有意に減少させ、
● 一貫して高い収率を達成したが、
● 平均ＤＡＲや薬物負荷分布に変化はなかった。
【0107】
上記の開示は、独立した有用性を有する複数の別個の発明を包含し得る。多数の変形が可能であり、本明細書に開示および例示されるその特定の実施形態は、限定的な意味で考慮されるべきではない。以下の特許請求の範囲は、新規かつ非自明であると見なされる特定の組み合わせおよび部分的な組み合わせを特に指摘する。特徴、機能、要素、および／または特性の他の組み合わせおよび部分的な組み合わせで具体化された発明は、本出願または関連出願からの優先権を主張する出願において特許請求し得る。そのような請求項は、種々の発明または同じ発明を対象とするかどうか、および元の請求項の範囲より広いか、狭いか、等しいか、または異なるかどうかにかかわらず、本明細書で教示される発明の主題内に含まれると見なされる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】