特表 2024-532261 操作ＩＴＲ配列および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-05

(54)【発明の名称】操作ＩＴＲ配列および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/35 20060101AFI20240829BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240829BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20240829BHJP

   C12N 15/16 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/866 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240829BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 9/72 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 38/37 20060101ALN20240829BHJP

   A61K 38/36 20060101ALN20240829BHJP

   A61K 38/18 20060101ALN20240829BHJP

   A61K 38/22 20060101ALN20240829BHJP

   A61K 38/19 20060101ALN20240829BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20240829BHJP

【ＦＩ】

C12N15/35 ZNA

C12N15/85 Z

C12N15/19

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/113 130Z

C12N15/113 Z

C12N15/864 100Z

C12N5/10

C12N5/07

C12N15/16

C12N15/113 140Z

C12N15/88 Z

C12N15/866 Z

A61P7/04

A61K35/76

A61K47/46

A61K47/24

A61K9/51

A61K9/72

A61K31/7105

A61P43/00 105

A61K38/37

A61K38/36

A61K38/18

A61K38/22

A61K38/19

A61K39/395 D

A61K39/395 N

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024512004

(86)(22)【出願日】2022-08-19

(85)【翻訳文提出日】2024-04-10

(86)【国際出願番号】 US2022075187

(87)【国際公開番号】W WO2023028441

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】PCT/US2021/047207

(32)【優先日】2021-08-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/310,042

(32)【優先日】2022-02-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512147244

【氏名又は名称】バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】アジャイ・メゴディア

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ・ザカス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA93Y

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA44

4C076AA19

4C076AA65

4C076AA93

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB27

4C076BB31

4C076CC14

4C076EE57

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA01

4C084DB01

4C084DB52

4C084DC10

4C084DC15

4C084MA52

4C084MA57

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZA531

4C085AA13

4C085AA14

4C085CC01

4C085CC07

4C085CC08

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG08

4C085GG10

4C086AA01

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA52

4C086MA57

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA24

4C087MA52

4C087MA57

4C087MA63

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA53

(57)【要約】

本開示は、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）、第２のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含む核酸分子を提供する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）以外のウイルスのＩＴＲである。また、遺伝子治療適用において核酸分子を使用する方法も開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットを挟む、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）および第２のＩＴＲを含む核酸分子であって、
第１のＩＴＲは、
配列番号１のヌクレオチド１～４９、５０～５８、および５９～１２５、
配列番号１５のヌクレオチド１～２７および５０～１１４、または
配列番号２５
と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含み；
第２のＩＴＲは、
配列番号２のヌクレオチド１～６７、６８～７６、および７７～１２５、
配列番号１６のヌクレオチド１～６５および８８～１１４、または
配列番号２６
と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。

【請求項2】

第１のＩＴＲは、
配列番号１のヌクレオチド１～４９、５０～５８、および５９～１２５、
配列番号１５のヌクレオチド１～２７および５０～１１４、または
配列番号２５
と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

第１のＩＴＲは、配列番号１のヌクレオチド１～４９、５０～５８、および５９～１２５、配列番号１５のヌクレオチド１～２７および５０～１１４、または配列番号２５を含む、請求項１または２に記載の核酸分子。

【請求項4】

第１のＩＴＲは、配列番号１に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項5】

第１のＩＴＲは、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項6】

第１のＩＴＲは、配列番号５に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項7】

第１のＩＴＲは、配列番号９に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項8】

第１のＩＴＲは、配列番号１３に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項9】

第１のＩＴＲは、配列番号１５に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項10】

第１のＩＴＲは、配列番号１７に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項11】

第１のＩＴＲは、配列番号１９に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項12】

第１のＩＴＲは、配列番号２１に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項13】

第１のＩＴＲは、配列番号２５に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項14】

第２のＩＴＲは、
配列番号２のヌクレオチド１～６７、６８～７６、および７７～１２５、
配列番号１６のヌクレオチド１～６５および８８～１１４、または
配列番号２６
と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項15】

第２のＩＴＲは、配列番号２のヌクレオチド１～６７、６８～７６、および７７～１２５、配列番号１６のヌクレオチド１～６５および８８～１１４、または配列番号２６を含む、請求項１２または１４に記載の核酸分子。

【請求項16】

第２のＩＴＲは、配列番号２に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項17】

第２のＩＴＲは、配列番号４に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項18】

第２のＩＴＲは、配列番号６に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項19】

第２のＩＴＲは、配列番号１０に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項20】

第２のＩＴＲは、配列番号１４に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項21】

第２のＩＴＲは、配列番号１６に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項22】

第２のＩＴＲは、配列番号１８に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項23】

第２のＩＴＲは、配列番号２０に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項24】

第２のＩＴＲは、配列番号２２に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項25】

第２のＩＴＲは、配列番号２６に示されたポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項26】

異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットを挟む、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）および第２のＩＴＲを含む核酸分子であって、第１のＩＴＲは、配列番号１、３、５、９、１３、１５、１７、１９、２１、２３、または２５に示されたポリヌクレオチド配列から選択され、第２のＩＴＲは、配列番号２、４、６、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６に示されたポリヌクレオチド配列から選択される、核酸分子。

【請求項27】

遺伝子カセットは、プロモーターをさらに含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項28】

プロモーターは、組織特異的プロモーターである、請求項２７に記載の核酸分子。

【請求項29】

プロモーターは、器官または組織内における異種ポリヌクレオチド配列の発現を駆動し、器官または組織は、筋肉、中枢神経系（ＣＮＳ）、眼、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、肺、皮膚、膀胱、尿路、脾臓、骨髄系およびリンパ系細胞系列、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項２７または２８に記載の核酸分子。

【請求項30】

プロモーターは、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、類洞細胞、求心性ニューロン、遠心性ニューロン、介在ニューロン、グリア細胞、星状細胞、希突起膠細胞、ミクログリア、上衣細胞、肺上皮細胞、シュワン細胞、サテライト細胞、光受容体細胞、網膜神経節細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの任意の組合せにおける異種ポリヌクレオチド配列の発現を駆動する、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項31】

プロモーターは、異種ポリヌクレオチド配列に対して５’側に配置される、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項32】

プロモーターは、マウストランスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、天然ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ヒトアルファ１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、筋クレアチニンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）プロモーター、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター、デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、２Ｒ５Ｓｃ５－１２プロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項33】

遺伝子カセットは、イントロン配列をさらに含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項34】

イントロン配列は、異種ポリヌクレオチド配列に対して５’側に配置される、請求項３３に記載の核酸分子。

【請求項35】

イントロン配列は、プロモーターに対して３’側に配置される、請求項３３または３４に記載の核酸分子。

【請求項36】

イントロン配列は、合成イントロン配列を含む、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項37】

遺伝子カセットは、転写後調節エレメントをさらに含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項38】

転写後調節エレメントは、異種ポリヌクレオチド配列に対して３’側に配置される、請求項３７に記載の核酸分子。

【請求項39】

転写後調節エレメントは、突然変異型ウッドチャック肝炎ウイルス調節エレメント（ＷＰＲＥ）、マイクロＲＮＡ結合性部位、ＤＮＡ核ターゲティング配列、ＴＬＲ９阻害配列、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項３７または３８に記載の核酸分子。

【請求項40】

遺伝子カセットは、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列をさらに含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項41】

３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列は、ｂＧＨポリ（Ａ）、アクチンポリ（Ａ）、ヘモグロビンポリ（Ａ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４０に記載の核酸分子。

【請求項42】

遺伝子カセットは、エンハンサー配列をさらに含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項43】

エンハンサー配列は、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲとの間に配置される、請求項４２に記載の核酸分子。

【請求項44】

核酸分子は、５’側から３’側へと、第１のＩＴＲ、遺伝子カセット、および第２のＩＴＲを含み、遺伝子カセットは、組織特異的プロモーター配列、イントロン配列、異種ポリヌクレオチド配列、転写後調節エレメント、および３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項45】

遺伝子カセットは、５’側から３’側へと、組織特異的プロモーター配列、イントロン配列、異種ポリヌクレオチド配列、転写後調節エレメント、および３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列を含む、請求項４４に記載の核酸分子。

【請求項46】

遺伝子カセットは、一本鎖核酸である、請求項１～４５のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項47】

遺伝子カセットは、二本鎖核酸である、請求項１～４５のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項48】

異種ポリヌクレオチド配列は、治療用タンパク質をコードする、請求項１～４７のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項49】

異種ポリヌクレオチド配列は、凝固因子、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、その断片、またはこれらの任意の組合せをコードする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項50】

異種ポリヌクレオチド配列は、増殖因子をコードする、請求項１～４９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項51】

異種ポリヌクレオチド配列は、ホルモンをコードする、請求項１～４９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項52】

異種ポリヌクレオチド配列は、サイトカインをコードする、請求項１～４９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項53】

異種ポリヌクレオチド配列は、抗体またはその断片をコードする、請求項１～４９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項54】

異種ポリヌクレオチド配列は、Ｘ連鎖ジストロフィン、ＭＴＭ１（ミオチュブラリン）、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、シクロヒドロラーゼ、ＳＭＮ１、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＦＨ、ＨＴＲＡ、ＡＲＭＳ、ＣＦＢ／ＣＣ２、ＣＮＧＡ／ＣＮＧＢ、Ｐｒｆ６５、ＡＲＳＡ、ＰＳＡＰ、ＩＤＵＡ（ＭＰＳ Ｉ）、ＩＤＳ（ＭＰＳ ＩＩ）、ＰＡＨ、ＧＡＡ（酸性アルファグルコシダーゼ）、ＧＡＬＴ、ＯＴＣ、ＣＭＤ１Ａ、ＬＡＭＡ２、またはこれらの任意の組合せをコードする、請求項１～４９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項55】

異種ポリヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする、請求項１～４９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項56】

ｍｉＲＮＡは、ＳＯＤ１、ＨＴＴ、ＲＨＯ、ＣＤ３８、またはこれらの任意の組合せを含む標的遺伝子の発現を下方調節する、請求項５５に記載の核酸分子。

【請求項57】

異種ポリヌクレオチド配列は、凝固因子をコードし、凝固因子は、第Ｉ因子（ＦＩ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第ＩＩＩ因子（ＦＩＩＩ）、第ＩＶ因子（ＦＩＶ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第ＶＩ因子（ＦＶＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、フォンウィレブラント因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２アンチプラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２（ＰＡＩ－２）、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１～４９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項58】

異種ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている、請求項１～５７のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項59】

異種ポリヌクレオチド配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている、請求項５８に記載の核酸分子。

【請求項60】

送達剤と共に製剤化される、請求項１～５９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項61】

送達剤は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、請求項６０に記載の核酸分子。

【請求項62】

送達剤は、リポソーム、非脂質ポリマー分子、エンドソーム、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項６０に記載の核酸分子。

【請求項63】

静脈内投与、経皮投与、皮内投与、神経内投与、眼内投与、髄腔内投与、皮下投与、肺内投与、経口投与、またはこれらの任意の組合せのために製剤化される、請求項１～６２のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項64】

静脈内投与のために製剤化される、請求項６３に記載の核酸分子。

【請求項65】

ｉｎ ｓｉｔｕ注入による投与のために製剤化される、請求項１～６２のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項66】

吸入による投与のために製剤化される、請求項１～６２のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項67】

請求項１～５９のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項68】

請求項１～５９のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項６７に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項69】

請求項１～６６のいずれか１項に記載の核酸を含む医薬組成物。

【請求項70】

請求項６７に記載のベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項71】

請求項６８に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項72】

請求項１～６６のいずれか１項に記載の核酸分子と、核酸分子を、それを必要とする対象へと投与するための指示書とを含むキット。

【請求項73】

請求項１～５９のいずれか１項に記載の核酸分子を作製するためのバキュロウイルス系。

【請求項74】

請求項１～５９のいずれか１項に記載の核酸分子は、昆虫細胞内において作製される、請求項７３に記載のバキュロウイルス系。

【請求項75】

請求項１～６６のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ナノ粒子送達系。

【請求項76】

それを必要とする対象において、異種ポリヌクレオチド配列を発現させる方法であって、対象へと、請求項１～６６のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項６７に記載のベクター、または請求項６９～７１のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。

【請求項77】

それを必要とする対象における疾患または障害を処置する方法であって、対象へと、請求項１～６６のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項６７に記載のベクター、または請求項６９～７１のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。

【請求項78】

核酸分子は、静脈内投与、経皮投与、皮内投与、神経内投与、眼内投与、髄腔内投与、またはこれらの任意の組合せにより投与される、請求項７６または７７に記載の方法。

【請求項79】

核酸分子は、静脈内投与される、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

核酸分子は、ｉｎ ｓｉｔｕ注入により投与される、請求項７８に記載の方法。

【請求項81】

核酸分子は、吸入により投与される、請求項７８に記載の方法。

【請求項82】

対象は、哺乳動物である、請求項７６～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項83】

対象は、ヒトである、請求項７６～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

遺伝子カセットは、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の核酸分子。

【請求項85】

異種ポリヌクレオチド配列は、凝固因子をコードする、請求項１～４９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項86】

昆虫細胞である、請求項６８に記載の宿主細胞。

【請求項87】

第１のＩＴＲは、第２のＩＴＲと異なるウイルスゲノムに由来する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の核酸分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、それらの開示が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み入れられる、２０２１年８月２３日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０４７２０７号、２０２２年２月１４日に出願された、米国特許仮出願第６３／３１０，０４２号に対する優先権を主張する。

【0002】

電子的に提出された配列表への言及
ＡＳＣＩＩテキストファイルにより電子的に提出された配列表（名称：７３２８７１＿ＳＡ９＿４７８ＢＰＣ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ．ｘｍｌ；サイズ：９０．１ＫＢ；作成日：２０２２年８月１７日）の内容は、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる。

【背景技術】

【0003】

遺伝子治療は、様々な疾患を処置する持続的手段に対する、潜在的可能性をもたらす。過去において、多くの遺伝子治療による処置は、典型的に、ウイルスの使用に依拠する。この目的のために選択される、各々が、それらを、多かれ、少なかれ、遺伝子治療に適するものとする、顕著に異なる特性を伴う、多数のウイルス性作用物質が存在する。しかし、一部のウイルスベクターの、所望されない特性は、臨床安全性についての懸念を結果としてもたらし、それらの治療的使用を制限している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一般的な遺伝子治療用ベクターであるが、その欠点を伴わない。ＡＡＶゲノムのコード配列は、ウイルスの複製およびパッケージングのほか、導入遺伝子の発現に要求される、逆位末端反復（ＩＴＲ）により挟まれる。ＡＡＶ ＩＴＲのＴ字形ヘアピン構造は、ＡＡＶベクター内における、導入遺伝子の発現を阻害する、宿主細胞タンパク質による結合を受けやすい。既存のＡＡＶベクター技術の限界を回避しながら、標的配列の効率的かつ持続的発現をもたらすことが必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本明細書では、異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットを挟む、第１の改変逆位末端反復（ＩＴＲ）および／または第２の改変ＩＴＲを含む、核酸分子およびその使用が開示される。本明細書で開示される改変ＩＴＲは、野生型ＩＴＲの機能的特性を保持しながら、野生型ＩＴＲに対する、短鎖ＩＴＲおよび／または代替的ＩＴＲを提供する。本明細書で開示される改変ＩＴＲはまた、遺伝子カセットにより作製されるタンパク質の機能的特性を保持しながら、野生型ＩＴＲに対する、短鎖ＩＴＲおよび／または代替的ＩＴＲも提供する。

【0006】

本明細書の一態様では、異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットを挟む、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）および第２のＩＴＲを含む核酸分子であって、第１のＩＴＲは、配列番号１のヌクレオチド１～４９、５０～５８、および５９～１２５、または配列番号１５のヌクレオチド１～２７および５０～１１４と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含み；第２のＩＴＲは、配列番号２のヌクレオチド１～６７、６８～７６、および７７～１２５、または配列番号１６のヌクレオチド１～６５および８８～１１４、または配列番号２５もしくは２６と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子が提供される。

【0007】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１のヌクレオチド１～４９、５０～５８、および５９～１２５、または配列番号１５のヌクレオチド１～２７および５０～１１４、または配列番号２５と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１のヌクレオチド１～４９、５０～５８、および５９～１２５、または配列番号１５のヌクレオチド１～２７および５０～１１４、または配列番号２５を含む。

【0008】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号５に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号９に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１３に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１５に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１７に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１９に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号２１に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号２５に示されたポリヌクレオチド配列を含む。

【0009】

一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号２のヌクレオチド１～６７、６８～７６、および７７～１２５、または配列番号１６のヌクレオチド１～６５および８８～１１４、または配列番号２６と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号２のヌクレオチド１～６７、６８～７６、および７７～１２５、または配列番号１６のヌクレオチド１～６５および８８～１１４、または配列番号２６を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。

【0010】

一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号２に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号４に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号６に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号１０に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号１４に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号１６に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号１８に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号２０に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号２２に示されたポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、配列番号２６に示されたポリヌクレオチド配列を含む。

【0011】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１、３、５、９、１３、１５、１７、１９、２１、２３、または２５に示されたポリヌクレオチド配列から選択され、第２のＩＴＲは、配列番号２、４、６、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６に示されたポリヌクレオチド配列から選択される。

【0012】

一部の実施形態では、核酸分子は、プロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、器官内または組織内における、異種ポリヌクレオチド配列の発現を駆動し、器官または組織は、筋肉、中枢神経系（ＣＮＳ）、眼、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、肺、皮膚、膀胱、尿路、脾臓、骨髄系細胞系列、およびリンパ系細胞系列、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、類洞細胞、求心性ニューロン、遠心性ニューロン、介在ニューロン、グリア細胞、星状細胞、希突起膠細胞、ミクログリア、上衣細胞、肺上皮細胞、シュワン細胞、サテライト細胞、光受容体細胞、網膜神経節細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの任意の組合せにおける異種ポリヌクレオチド配列の発現を駆動する。一部の実施形態では、プロモーターは、異種ポリヌクレオチド配列に対して５’側に配置される。一部の実施形態では、プロモーターは、マウストランスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、天然ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ヒトアルファ１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、筋クレアチニンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）プロモーター、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター、デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、２Ｒ５Ｓｃ５－１２プロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号３１の核酸配列を含む。

【0013】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、イントロン配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、異種ポリヌクレオチド配列に対して５’側に配置される。一部の実施形態では、イントロン配列は、プロモーターに対して３’側に配置される。一部の実施形態では、イントロン配列は、合成イントロン配列を含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号３２の核酸配列を含む。

【0014】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、転写後調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、転写後調節エレメントは、異種ポリヌクレオチド配列に対して、３’側に配置される。一部の実施形態では、調節エレメントは、突然変異型ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、マイクロＲＮＡ結合性部位、ＤＮＡ核ターゲティング配列、ＴＬＲ９阻害性配列、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、転写後調節エレメントは、配列番号３３の核酸配列を含む。

【0015】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列をさらに含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列は、ｂＧＨポリ（Ａ）、アクチンポリ（Ａ）、ヘモグロビンポリ（Ａ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0016】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、エンハンサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、エンハンサー配列は、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲとの間に配置される。一部の実施形態では、エンハンサーは、配列番号３０の核酸配列を含む。

【0017】

一部の実施形態では、核酸分子は、５’側から３’側へと、第１のＩＴＲ、遺伝子カセット、および第２のＩＴＲを含み、この場合遺伝子カセットは、組織特異的プロモーター配列、イントロン配列、異種ポリヌクレオチド配列、転写後調節エレメント、および３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列を含む。

【0018】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、５’側から３’側へと、組織特異的プロモーター配列、イントロン配列、異種ポリヌクレオチド配列、転写後調節エレメント、および３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列を含む。

【0019】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、一本鎖核酸を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、二本鎖核酸を含む。

【0020】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、治療用タンパク質をコードする。

【0021】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、凝固因子、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、その断片、またはこれらの任意の組合せをコードする。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、増殖因子をコードする。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、ホルモンをコードする。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、サイトカインをコードする。

【0022】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、抗体またはその断片をコードする。

【0023】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、Ｘ連鎖ジストロフィン、ＭＴＭ１（ミオチュブラリン）、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、シクロヒドロラーゼ、ＳＭＮ１、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＦＨ、ＨＴＲＡ、ＡＲＭＳ、ＣＦＢ／ＣＣ２、ＣＮＧＡ／ＣＮＧＢ、Ｐｒｆ６５、ＡＲＳＡ、ＰＳＡＰ、ＩＤＵＡ（ＭＰＳ Ｉ）、ＩＤＳ（ＭＰＳ ＩＩ）、ＰＡＨ、ＧＡＡ（酸性アルファグルコシダーゼ）、ＧＡＬＴ、ＯＴＣ、ＣＭＤ１Ａ、ＬＡＭＡ２、またはこれらの任意の組合せをコードする。

【0024】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＳＯＤ１、ＨＴＴ、ＲＨＯ、ＣＤ３８、またはこれらの任意の組合せを含む標的遺伝子の発現を下方調節する。

【0025】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、凝固因子をコードし、この場合、凝固因子は、第Ｉ因子（ＦＩ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第ＩＩＩ因子（ＦＩＩＩ）、第ＩＶ因子（ＦＩＶ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第ＶＩ因子（ＦＶＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、フォンウィレブラント因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２アンチプラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２（ＰＡＩ２）、またはこれらの任意の組合せを含む。

【0026】

一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。

【0027】

一部の実施形態では、核酸分子は、送達剤と共に製剤化される。一部の実施形態では、送達剤は、脂質ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、送達剤は、リポソーム、非脂質ポリマー分子、エンドソーム、またはこれらの任意の組合せを含む。

【0028】

一部の実施形態では、核酸分子は、静脈内投与、経皮投与、皮内投与、神経内投与、眼内投与、髄腔内投与、皮下投与、肺内投与、もしくは経口投与、またはこれらの任意の組合せのために製剤化される。一部の実施形態では、核酸分子は、静脈内投与のために製剤化される。一部の実施形態では、核酸分子は、ｉｎ ｓｉｔｕ注入による投与のために製剤化される。一部の実施形態では、核酸分子は、吸入による投与のために製剤化される。

【0029】

本明細書の別の態様では、本明細書で記載される核酸分子を含むベクターが提供される。

【0030】

本明細書の別の態様では、本明細書で記載される核酸分子、または本明細書で記載されるベクターを含む宿主細胞が提供される。

【0031】

本明細書の別の態様では、本明細書で記載される核酸分子を含む医薬組成物が提供される。

【0032】

本明細書の別の態様では、本明細書で記載されるベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0033】

本明細書の別の態様では、本明細書で記載される宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0034】

本明細書の別の態様では、本明細書で記載される核酸分子と、核酸分子を、それを必要とする対象へと投与するための指示書とを含むキットが提供される。

【0035】

本明細書の別の態様では、本明細書で記載される核酸分子を作製するためのバキュロウイルス系が提供される。

【0036】

一部の実施形態では、核酸分子は、昆虫細胞内において作製される。

【0037】

本明細書の別の態様では、本明細書で記載される核酸分子を含む、ナノ粒子送達系が提供される。

【0038】

本明細書の別の態様では、それを必要とする対象において、異種ポリヌクレオチド配列を発現させる方法であって、対象へと、本明細書で記載される核酸分子、本明細書で記載されるベクター、または本明細書で記載される医薬組成物を投与する工程を含む方法が提供される。

【0039】

本明細書の別の態様では、それを必要とする対象における疾患または障害を処置する方法であって、対象へと、本明細書で記載される核酸分子、本明細書で記載されるベクター、または本明細書で記載される医薬組成物を投与する工程を含む方法が提供される。

【0040】

一部の実施形態では、核酸分子は、静脈内投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、肺内投与、神経内投与、眼内投与、髄腔内投与、またはこれらの任意の組合せにより投与される。一部の実施形態では、核酸分子は、静脈内投与される。一部の実施形態では、核酸分子は、ｉｎ ｓｉｔｕ注入により投与される。一部の実施形態では、核酸分子は、吸入により投与される。

【0041】

一部の実施形態では、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】図１Ａは、野生型Ｂ１９ ＩＴＲおよび切断型Ｂ１９Δ１３５ ＩＴＲの、予測される構造についてのグラフ描示である。影を付された領域は、Ｂ１９のＲｅｐ結合性エレメント（ＲＢＥ）を指し示す。ギブスの自由エネルギー（ΔＧ）は、各ＩＴＲ配列について提供される。注：図解は、ＩＴＲ内における、ＲＢＥの正確な位置を表さない。図１Ｂは、野生型ＧＰＶ ＩＴＲおよび切断型ＧＰＶΔ１６２ ＩＴＲの、予測される構造についてのグラフ描示である。影を付された領域は、ＧＰＶのＲｅｐ結合性エレメント（ＲＢＥ）を指し示す。ギブスの自由エネルギー（ΔＧ）は、各ＩＴＲ配列について提供される。注：図解は、ＩＴＲ内における、ＲＢＥの正確な位置を表さない。

【図2A】野生型Ｂ１９ ＩＴＲ、切断型Ｂ１９Δ１５１ ＩＴＲ、切断型Ｂ１９Δ２２３ ＩＴＲ、および切断型Ｂ１９＿ｍｉｎｉｍａｌの、予測される構造についてのグラフ描示である。影を付された領域は、Ｂ１９のＲｅｐ結合性エレメント（ＲＢＥ）を指し示す。ギブスの自由エネルギー（ΔＧ）は、各ＩＴＲ配列について提供される。注：図解は、ＩＴＲ内における、ＲＢＥの正確な位置を表さない。

【図2B】野生型ＧＰＶ ＩＴＲ、切断型ＧＰＶΔ１２０ ＩＴＲ、切断型ＧＰＶΔ１８６ ＩＴＲ、および切断型ＧＰＶ＿ｍｉｎｉｍａｌの、予測される構造についてのグラフ描示である。影を付された領域は、ＧＰＶのＲｅｐ結合性エレメント（ＲＢＥ）を指し示す。ギブスの自由エネルギー（ΔＧ）は、各ＩＴＲ配列について提供される。注：図解は、ＩＴＲ内における、ＲＢＥの正確な位置を表さない。

【図3】改変ＩＴＲであるＢ１９＿ｍｉｎにより挟まれたＦＶＩＩＩ発現構築物のうち、３４．７μｇのｓｓＦＶＩＩＩ－ＤＮＡ（丸）、またはｄｓＦＶＩＩＩ－ＤＮＡ（四角）を施されたＨｅｍＡマウスにおいて測定されたＦＶＩＩＩ活性を示す図である。血液サンプルは、注射の３および７日後に採取した。

【図4】配列番号１～２２に従う改変ＩＴＲの予測ＤＮＡ構造についてのグラフ描示である。予測構造は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して作出した。

【図5】配列番号１～２２に従う改変ＩＴＲの予測ＤＮＡ構造についてのグラフ描示である。予測構造は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して作出した。

【図6】配列番号１～２２に従う改変ＩＴＲの予測ＤＮＡ構造についてのグラフ描示である。予測構造は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して作出した。

【図7】配列番号１～２２に従う改変ＩＴＲの予測ＤＮＡ構造についてのグラフ描示である。予測構造は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して作出した。

【図8】配列番号１～２２に従う改変ＩＴＲの予測ＤＮＡ構造についてのグラフ描示である。予測構造は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して作出した。

【図9】配列番号１～２２に従う改変ＩＴＲの予測ＤＮＡ構造についてのグラフ描示である。予測構造は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して作出した。

【図10】図１０Ａ～１０Ｄは、本発明の実施形態に従う改変パルボウイルスＩＴＲを伴う、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットについての概略表示である。図１０Ａは、ＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲ（ＵＳＰＴＯ出願第６３／０６９，０７３号において記載されている）により挟まれた、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットについての線形概略マップを示す。図１０Ｂは、ＨＢｏＶ１ ＷＴ ＩＴＲにより挟まれた、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットについての線形概略マップを示す。図１０Ｃは、Ｂ１９ ＷＴ（ＵＳＰＴＯ出願第６３／０６９，０７３号において記載されている）、またはＢ１９ Ｍｉｎｉｍａｌ（配列番号１、配列番号２）ＩＴＲにより挟まれた、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットについての線形概略マップを示す。図１０Ｄは、ＧＰＶΔ１８６ ＩＴＲ（配列番号９、配列番号１０）、ＧＰＶΔ１２０ ＩＴＲ（配列番号１３、配列番号１４）、またはＧＰＶ Ｍｉｎｉｍａｌ ＩＴＲ（配列番号１５、配列番号１６）により挟まれた、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットについての線形概略マップを示す。

【図11】パルボウイルスＩＴＲにより挟まれたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを、ＩＴＲ類縁配列を認識し、平滑末端ＤＮＡをもたらす制限酵素により消化する、ｓｓＤＮＡ作出のために使用された手法についての概略表示である。消化による二本鎖ＤＮＡ産物（ＦＶＩＩＩ発現カセットおよびプラスミド骨格）を、９５℃で熱変性させる（変性）のに続き、４℃で冷却して（再生）、回文ＩＴＲ配列が、ヘアピンを形成することを可能とした。結果として得られるｓｓ（ｓｓＤＮＡ）ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを、ＨｅｍＡマウスにおける、流体尾静脈注射を介する全身送達のために使用した。

【図12】Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイにより測定された、血漿ＦＶＩＩＩ活性レベルについてのグラフ表示である。血漿サンプルは、流体尾静脈注射を介して、表示の通り、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）、ヒトエリスロウイルス（Ｂ１９）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、もしくはこれらの変異体、またはこれらの組合せ（「ハイブリッド体」）により挟まれた、１ｋｇ当たりの一本鎖Ｖ２．０ ｓｓ（ｓｓＤＮＡ）ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ２００、８００、または１６００μｇを全身注射されたｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスから、異なる間隔で回収した。誤差バーは、標準偏差を表す。

【図13】図１３Ａ～１３Ｂは、バキュロウイルス系から得られた、精製ｃｅ（ｃｅＤＮＡ）ＦＶＩＩＩＸＴＥＮについての表示、およびそれらについてのｉｎ ｖｉｖｏ効能研究を示す図である。図１３Ａは、連続溶出電気泳動法から得られた、ＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＷＴ ＩＴＲにより挟まれた、精製ｃｅ（ｃｅＤＮＡ）ＦＶＩＩＩＸＴＥＮについてのアガロースゲル画像を示す。純度は、出発材料（ＳＭ）と比較して示され、矢印は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドを指し示す。図１３Ｂは、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイにより測定された、血漿ＦＶＩＩＩ活性レベルについてのグラフ表示を示す。血漿サンプルは、流体尾静脈注射を介して、表示の通り、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＩＴＲにより挟まれた、１ｋｇ当たりのｃｅ（ｃｅＤＮＡ）ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ８０、４０、または１２μｇを全身注射されたｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスから、異なる間隔で回収した。誤差バーは、標準偏差を表す。

【発明を実施するための形態】

【0043】

本明細書では、異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットを挟む、第１の改変逆位末端反復（ＩＴＲ）および／または第２の改変ＩＴＲを含む、核酸分子およびその使用が開示される。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、パルボウイルスＢ１９またはガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）に由来する。本明細書で開示される改変ＩＴＲは、野生型ＩＴＲの機能的特性を保持しながら、野生型ＩＴＲに対する、短鎖ＩＴＲおよび／または代替的ＩＴＲを提供する。本明細書で開示される改変ＩＴＲはまた、遺伝子カセットにより作製されるタンパク質の機能的特性を保持しながら、野生型ＩＴＲに対する、短鎖ＩＴＲおよび／または代替的ＩＴＲも提供する。

【0044】

本開示の例示的構築物は、付属の図面および配列表に例示される。本明細書および特許請求の範囲の明確な理解のために、下記に、以下の定義が提供される。

【0045】

Ｉ．定義
「ある（ａ）」実体または「ある（ａｎ）」実体という用語は、この実体のうちの１つまたはそれ以上を指すことが注目される：例えば、「あるヌクレオチド配列」とは、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を表すことが理解される。同様に、「ある治療用タンパク質」および「あるｍｉＲＮＡ」とは、それぞれ、１つまたはそれ以上の治療用タンパク質、および１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡを表すことが理解される。このように、本明細書では、「ある（ａ）」（または「ある（ａｎ）」）、「１つまたはそれ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、互換的に使用される。

【0046】

本明細書では、「約」という用語は、約、およそ、ほぼ、またはこれらの近傍にあることを意味するように使用される。数値範囲と共に使用される場合、「約」という用語は、境界を、示された数値の上側および下側に拡張することにより、この範囲を修飾する。本明細書では一般に、「約」という用語は、数値を、上方または下方（高値または低値）における１０パーセントの変動により、言明された値の上側および下側に修飾するように使用される。

【0047】

本明細書で使用される、「および／または」とはまた、選択的に（「または」）解釈される場合に、関連する列挙項目のうちの１つまたはそれ以上の、任意の／全ての可能な組合せ、ならびに組合せの欠如も指し、これを包含する。

【0048】

「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド（複数可）配列」、および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「ＲＮＡ分子」）、もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、またはホスホロチオエートおよびチオエステルなど、一本鎖形態にあるか、もしくは二本鎖ヘリックス内にある、これらの任意のリン酸エステル類似体を指す。一本鎖核酸配列とは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖である、ＤＮＡ－ＤＮＡヘリックス、ＤＮＡ－ＲＮＡヘリックス、およびＲＮＡ－ＲＮＡヘリックスも可能である。核酸分子という用語、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次構造および二次構造だけを指し、分子を、いかなる特定の三次形態にも限定しない。したがって、この用語は、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ分子または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、超らせんＤＮＡ、および染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について論じる場合、本明細書では、配列は、通常の慣行に従い、５’側から３’側の方向に、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿った配列だけを示して記載される。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡを含むがこれらに限定されない。本開示の「核酸組成物」は、本明細書で記載される、１つまたはそれ以上の核酸を含む。

【0049】

本明細書で使用される、「逆位末端反復」（または「ＩＴＲ」）とは、下流において、その逆相補体、すなわち、回文配列を後続させた、ヌクレオチド（初期配列）のセットを含む、一本鎖核酸配列の５’末端または３’末端に配置された、核酸部分配列を指す。初期配列と、逆相補体との間に介在するヌクレオチド配列は、ゼロを含む、任意の長さでありうる。一実施形態では、本開示に有用なＩＴＲは、１つまたはそれ以上の「回文配列」を含む。ＩＴＲは、任意の数の機能を有しうる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、Ｔ字形ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、Ｔ字形以外のヘアピン構造、例えば、Ｕ字形ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の生存を、長期間にわたり促進する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の、恒久的生存（例えば、細胞の全寿命にわたり）を促進する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の安定性を促進する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の保持を促進する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の存続を促進する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の分解を阻害または阻止する。

【0050】

一実施形態では、ＩＴＲの初期配列および／または逆相補体は、約２～６００ヌクレオチド、約２～５５０ヌクレオチド、約２～５００ヌクレオチド、約２～４５０ヌクレオチド、約２～４００ヌクレオチド、約２～３５０ヌクレオチド、約２～３００ヌクレオチド、または約２～２５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、初期配列および／または逆相補体は、約５～６００ヌクレオチド、約１０～６００ヌクレオチド、約１５～６００ヌクレオチド、約２０～６００ヌクレオチド、約２５～６００ヌクレオチド、約３０～６００ヌクレオチド、約３５～６００ヌクレオチド、約４０～６００ヌクレオチド、約４５～６００ヌクレオチド、約５０～６００ヌクレオチド、約６０～６００ヌクレオチド、約７０～６００ヌクレオチド、約８０～６００ヌクレオチド、約９０～６００ヌクレオチド、約１００～６００ヌクレオチド、約１５０～６００ヌクレオチド、約２００～６００ヌクレオチド、約３００～６００ヌクレオチド、約３５０～６００ヌクレオチド、約４００～６００ヌクレオチド、約４５０～６００ヌクレオチド、約５００～６００ヌクレオチド、または約５５０～６００ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、初期配列および／または逆相補体は、約５～５５０ヌクレオチド、約５～５００ヌクレオチド、約５～４５０ヌクレオチド、約５～４００ヌクレオチド、約５～３５０ヌクレオチド、約５～３００ヌクレオチド、または約５～２５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、初期配列および／または逆相補体は、約１０～５５０ヌクレオチド、約１５～５００ヌクレオチド、約２０～４５０ヌクレオチド、約２５～４００ヌクレオチド、約３０～３５０ヌクレオチド、約３５～３００ヌクレオチド、または約４０～２５０ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、初期配列および／または逆相補体は、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５２５ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約５７５ヌクレオチド、または約６００ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、初期配列および／または逆相補体は、約４００ヌクレオチドを含む。

【0051】

他の実施形態では、ＩＴＲの初期配列および／または逆相補体は、約２～２００ヌクレオチド、約５～２００ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約２０～２００ヌクレオチド、約３０～２００ヌクレオチド、約４０～２００ヌクレオチド、約５０～２００ヌクレオチド、約６０～２００ヌクレオチド、約７０～２００ヌクレオチド、約８０～２００ヌクレオチド、約９０～２００ヌクレオチド、約１００～２００ヌクレオチド、約１２５～２００ヌクレオチド、約１５０～２００ヌクレオチド、または約１７５～２００ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、初期配列および／または逆相補体は、約２～１５０ヌクレオチド、約５～１５０ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約２０～１５０ヌクレオチド、約３０～１５０ヌクレオチド、約４０～１５０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約７５～１５０ヌクレオチド、約１００～１５０ヌクレオチド、または約１２５～１５０ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、初期配列および／または逆相補体は、約２～１００ヌクレオチド、約５～１００ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約２０～１００ヌクレオチド、約３０～１００ヌクレオチド、約４０～１００ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、または約７５～１００ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、初期配列および／または逆相補体は、約２～５０ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約２０～５０ヌクレオチド、約３０～５０ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約３～３０ヌクレオチド、約４～２０ヌクレオチド、または約５～１０ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、初期配列および／または逆相補体は、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、または２０ヌクレオチドからなる。他の実施形態では、初期配列と、逆相補体との間に介在するヌクレオチドは、０ヌクレオチド、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、または２０ヌクレオチドである（例えば、これらからなる）。

【0052】

したがって、本明細書で使用される「ＩＴＲ」は、それ自身に折り返しフォールディングし、二本鎖セグメントを形成する場合がある。例えば、配列であるＧＡＴＣＸＸＸＸＧＡＴＣは、フォールディングされると、二重ヘリックスを形成するように、ＧＡＴＣの初期配列と、その相補体（３’ＣＴＡＧ５’）とを含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、初期配列と、逆相補体との間に、連続回文配列（例えば、ＧＡＴＣＧＡＴＣ）を含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、初期配列と、逆相補体との間に、中断回文配列（例えば、ＧＡＴＣＸＸＸＸＧＡＴＣ）を含む。一部の実施形態では、連続回文配列または中断回文配列の相補性部分は、互いと相互作用して、「ヘアピンループ」構造を形成する。一本鎖ヌクレオチド分子上の少なくとも２つの相補性配列が塩基対合して二本鎖部分を形成すると、本明細書で使用される、「ヘアピンループ」構造が生じる。一部の実施形態では、ＩＴＲの一部だけが、ヘアピンループを形成する。他の実施形態では、ＩＴＲの全体が、ヘアピンループを形成する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、それが由来する野生型ＩＴＲの、Ｒｅｐ結合性エレメント（ＲＢＥ）を保持する。ＲＢＥの保存は、ＩＴＲの安定性および製造目的のために重要でありうる。

【0053】

本明細書で使用される、「パルボウイルス」という用語は、自律複製型である、パルボウイルスおよびディペンドウイルスを含むがこれらに限定されないパルボウイルス科を包含する。自律性パルボウイルスは、例えば、ボカウイルス属、ディペンドウイルス属、エリスロウイルス属、アムドウイルス属、パルボウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、コントラウイルス属、アベパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、テトラパルボウイルス属、アンビデンソウイルス属、ブレビデンソウイルス属、ヘパンデンソウイルス属、およびペンスチルデンソウイルス属のメンバーを含む。例示的な自律性パルボウイルスは、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、イヌパルボウイルス、ミンク腸炎ウイルス、ウシパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、Ｈ１パルボウイルス、マスコビーダックパルボウイルス、ヘビパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスを含むがこれらに限定されない。当業者には、他の自律性パルボウイルスも公知である。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２巻、６９章（４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。

【0054】

本明細書で使用される、「ＡＡＶ以外の」という用語は、パルボウイルス科のうちの、任意のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を除外する、パルボウイルス科に由来する核酸、タンパク質、およびウイルスを包含する。「ＡＡＶ以外の」は、ボカウイルス属、ディペンドウイルス属、エリスロウイルス属、アムドウイルス属、パルボウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、コントラウイルス属、アベパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、テトラパルボウイルス属、アンビデンソウイルス属、ブレビデンソウイルス属、ヘパンデンソウイルス属、およびペンスチルデンソウイルス属の自律複製型メンバーを含むがこれらに限定されない。

【0055】

本明細書で使用される、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ（３Ａおよび３Ｂ型を含む）、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、１２型ＡＡＶ、１３型ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、Ｇａｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７８：６３８１（２００４））およびＭｏｒｉｓら（Ｖｉｒｏｌ．、３３：３７５（２００４））により開示されている、ＡＡＶ血清型およびクレード、ならびに現在公知であるか、またはその後において発見された、他の任意のＡＡＶを含むがこれらに限定されない。例えば、ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、２巻、６９章（４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。

【0056】

本明細書で使用される、「～から誘導された」という用語は、指定された分子もしくは生物、または指定された分子もしくは生物に由来する情報（例えば、アミノ酸配列または核酸配列）から単離されるか、またはこれらを使用して作製された成分を指す。例えば、第２の核酸配列（例えば、ＩＴＲ）に由来する核酸配列（例えば、ＩＴＲ）は、第２の核酸配列のヌクレオチド配列と同一であるか、または実質的に同様であるヌクレオチド配列を含みうる。ヌクレオチドまたはポリペプチドの場合、誘導された分子種は、例えば、自然発生の突然変異誘発、人工の指向性突然変異誘発、または人工のランダム突然変異誘発により得られる。ヌクレオチドまたはポリペプチドを誘導するのに使用される突然変異誘発は、意図的に方向付けられる場合もあり、意図的にランダムである場合もあり、各々の混合の場合もある。第１のヌクレオチドまたはポリペプチドから誘導される、異なるヌクレオチドまたはポリペプチドを創出する、ヌクレオチドまたはポリペプチドの突然変異誘発は、第１のヌクレオチドまたはポリペプチドから誘導される、異なるヌクレオチドまたはポリペプチドの場合があり、誘導されたヌクレオチドまたはポリペプチドの同定は、例えば、本明細書で論じられる、適切なスクリーニング法によりなされる。ポリペプチドの突然変異誘発は、典型的に、ポリヌクレオチドをコードするポリペプチドの操作を伴う。

【0057】

「カプシド非含有」または「カプシドなし」のベクターまたは核酸分子とは、カプシドを含まないベクター構築物を指す。

【0058】

本明細書で使用される、「コード領域」または「コード配列」とは、アミノ酸へと翻訳可能なコドンからなる、ポリヌクレオチドの部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、典型的に、アミノ酸へと翻訳されないが、コード領域の部分と考えられるのに対し、任意の隣接する配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合性部位、転写終結因子、イントロンなどは、コード領域の部分ではない。コード領域の境界は、典型的に、結果として得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端における開始コドンと、結果として得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端における翻訳終止コドンとにより決定される。２つまたはそれ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物内に存在しうる、例えば、単一のベクター上に存在する場合もあり、別個のポリヌクレオチド構築物内、例えば、別個の（異なる）ベクター上に存在する場合もある。したがって、単一のベクターは、単一のコード領域だけを含有する場合もあり、２つまたはそれ以上のコード領域を含む場合もある。

【0059】

哺乳動物細胞により分泌される、ある特定のタンパク質は、増殖するタンパク質鎖の、粗面小胞体を越える移出が誘発されたら、成熟タンパク質から切断される、分泌型シグナルペプチドと関連する。当業者は、シグナルペプチドが、一般に、ポリペプチドのＮ末端へと融合され、完全ポリペプチドまたは「全長」ポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態または「成熟」形態をもたらすことを承知している。ある特定の実施形態では、この配列の天然シグナルペプチドまたは機能的誘導体は、それと作動可能に関連するポリペプチドの分泌を方向付ける能力を保持する。代替的に、異種哺乳動物シグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、またはマウスβ－グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはその機能的な誘導体が使用される。

【0060】

「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して３’側に配置されたヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流のヌクレオチド配列は、転写の起始部に後続する配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に配置される。

【0061】

「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して５’側に配置されたヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流のヌクレオチド配列は、コード領域の５’側、または転写の起始部に配置された配列に関する。例えば、大半のプロモーターは、転写開始部位の上流に配置される。

【0062】

本明細書で使用される、「遺伝子カセット」または「発現カセット」という用語は、適切な宿主細胞内の、特定のポリヌクレオチド配列の発現を方向付けることが可能なＤＮＡ配列であって、目的のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ配列を意味する。遺伝子カセットは、コード領域の上流（５’側非コード配列）、コード領域内、またはコード領域の下流（３’側非コード配列）に配置され、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を包含しうる。コード領域が、真核細胞内の発現のために意図される場合、ポリアデニル化シグナル配列および転写終結配列は、通例、コード配列に対して３’側に配置されるであろう。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、異種ポリヌクレオチド配列を含む。

【0063】

産物、例えば、ｍｉＲＮＡまたは遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質などのポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、１つまたはそれ以上のコード領域と作動可能に関連する、プロモーターおよび／または他の発現（例えば、転写または翻訳）制御配列を含みうる。作動可能な関連にある場合、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域は、遺伝子産物の発現を、調節領域（複数可）の影響下または制御下に置くような形で、１つまたはそれ以上の調節領域と関連する。例えば、プロモーター機能の誘導が、コード領域によりコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を結果としてもたらし、プロモーターと、コード領域との間の連結の性格が、遺伝子産物の発現を方向付けるプロモーターの能力に干渉しないか、またはＤＮＡ鋳型が転写される能力に干渉しない場合、コード領域と、プロモーターとは、「作動可能に関連する」。プロモーター以外の、他の発現制御配列、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルもまた、遺伝子産物の発現を方向付けるように、コード領域と作動可能に関連しうる。

【0064】

「発現制御配列」とは、宿主細胞内のコード配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、終結因子などの調節性ヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、一般に、作動可能に連結されたコード核酸の、効率的な転写および翻訳を容易とする、任意の調節性ヌクレオチド配列を包含する。発現制御配列の非限定例は、プロモーター、エンハンサー、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合性部位、またはステム－ループ構造を含む。当業者には、様々な発現制御配列が公知である。これらは、限定せずに述べると、サイトメガロウイルス（イントロンＡを伴う、最初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）に由来する、プロモーターセグメントおよびエンハンサーセグメントなどであるがこれらに限定されない、脊椎動物細胞内において機能する発現制御配列を含む。他の発現制御配列は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ－グロビンのほか、真核細胞内の遺伝子発現を制御することが可能な他の配列など、脊椎動物遺伝子に由来する発現制御配列を含む。さらなる適切な発現制御配列は、組織特異的プロモーターおよび組織特異的エンハンサーのほか、リンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導されるプロモーター）を含む。他の発現制御配列は、イントロン配列、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化シグナルを含む。さらなる例示的発現制御配列については、本開示の他の箇所で論じられる。

【0065】

同様に、当業者には、様々な翻訳制御エレメントも公知である。これらは、リボソーム結合性部位、翻訳開始／終結コドン、およびピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位、またはＩＲＥＳ）を含むがこれらに限定されない。

【0066】

本明細書で使用される、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが、遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドをもたらす過程を指す。「発現」は、限定せずに述べると、ポリヌクレオチドの、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または他の任意のＲＮＡ産物への転写、およびｍＲＮＡの、ポリペプチドへの翻訳を含む。発現は、「遺伝子産物」をもたらす。本明細書で使用された、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドでありうる。本明細書で記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化またはスプライシングを伴う核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、またはタンパク質分解性切断を伴うポリペプチドをさらに含む。本明細書で使用される、「収量」という用語は、遺伝子の発現によりもたらされるポリペプチドの量を指す。

【0067】

「ベクター」とは、核酸の、宿主細胞へのクローニングおよび／または導入のための、任意の媒体を指す。ベクターは、別の核酸セグメントが、接合されたセグメントの複製をもたらすように接合されたレプリコンでありうる。「レプリコン」とは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、自律的複製単位として機能する、すなわち、それ自身による制御下における複製が可能である、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、核酸を、細胞へと導入するための媒体を含む。当技術分野では、例えば、プラスミド、改変真核生物ウイルス、または改変細菌ウイルスを含む、多数のベクターが公知であり、使用されている。ポリヌクレオチドの、適切なベクターへの挿入は、適切なポリヌクレオチド断片を、相補性の粘着末端を有する、選び出されたベクターへとライゲーションすることにより達せられる。

【0068】

ベクターは、ベクターを組み込んだ細胞の選択または同定をもたらす、選択用マーカーまたは選択用レポーターをコードするように操作される。選択用マーカーまたは選択用レポーターの発現は、ベクター上に含有された、他のコード領域を組み込み、発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能とする。当技術分野で公知であり、使用される、選択用マーカー遺伝子の例は、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、除草剤であるビアラフォス、スルホンアミドなどに対する耐性をもたらす遺伝子；および表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節的遺伝子、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｓｏｐｅｎｔａｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子などを含む。当技術分野で公知であり、使用される、レポーターの例は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択用マーカーはまた、レポーターであるとも考えられる。

【0069】

本明細書で使用される、「宿主細胞」という用語は、ｓｓＤＮＡまたはベクターのレシピエントとして使用されるか、または使用されている、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を指す。「宿主細胞」という用語は、形質導入された元の細胞の後代を含む。したがって、本明細書で使用される、「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列を形質導入された細胞を指す。単一の親細胞の後代は、天然の突然変異、偶発的な突然変異、または意図的な突然変異のために、形状またはゲノムＤＮＡ相補体もしくは全ＤＮＡ相補体において、必ずしも、元の親と、完全に同一ではないことが理解される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける宿主細胞でありうる。

【0070】

「選択用マーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生剤に対する耐性、除草剤に対する耐性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づく選択が可能である同定因子、通例、抗生剤耐性遺伝子または化学物質耐性遺伝子を指し、この場合、効果は、目的の核酸の継承を跡付け、かつ／または目的の核酸を継承した細胞もしくは生物を同定するのに使用される。当技術分野で公知であり、使用される、選択用マーカー遺伝子の例は、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、除草剤であるビアラフォス、スルホンアミドなどに対する耐性をもたらす遺伝子；および表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節的遺伝子、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｓｏｐｅｎｔａｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子などを含む。

【0071】

「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター遺伝子の効果に基づく同定が可能である同定因子をコードする核酸を指し、この場合、効果は、目的の核酸の継承を跡付け、目的の核酸を継承した細胞もしくは生物を同定し、かつ／または遺伝子発現の誘導もしくは遺伝子の転写を測定するのに使用される。当技術分野で公知であり、使用される、レポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択用マーカー遺伝子もまた、レポーター遺伝子であると考えられる。

【0072】

「プロモーター」および「プロモーター配列」は、互換的に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に配置される。プロモーターは、それらの全体において、天然の遺伝子に由来するか、または天然において見出される、異なるプロモーターに由来する、異なるエレメントから構成されるか、なおまたは合成ＤＮＡセグメントを含む。当業者により、異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型における遺伝子の発現を方向付ける場合もあり、異なる発生段階にある遺伝子の発現を方向付ける場合もあり、異なる環境条件もしくは生理学的条件に応答する遺伝子の発現を方向付ける場合もあることが理解される。遺伝子を、大半の細胞型内において、大半の時点において発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と称される。遺伝子を、特異的細胞型内において発現させるプロモーターは、一般に、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と称される。遺伝子を、発生または細胞分化の特異的段階において発現させるプロモーターは、一般に、「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と称される。プロモーターを誘導する薬剤、生体分子、化学物質、リガンド、光などへの細胞の曝露、またはこれらによる細胞の処置の後において、遺伝子を発現するように誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「誘導的プロモーター」または「調節的プロモーター」と称される。大半の場合に、調節的配列の正確な境界は、完全に規定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有しうることが、さらに認識される。さらなる例示的プロモーターについては、本開示の他の箇所で論じられる。

【0073】

プロモーター配列は、典型的に、その３’末端において、転写開始部位により結合され、バックグラウンドを上回る、検出可能なレベルにおいて転写を誘発するのに必要である、最小限の数の塩基またはエレメントを組み入れるように、上流（５’方向）に伸張する。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を伴うマッピングにより規定されると好都合である）のほか、ＲＮＡポリメラーゼの結合の一因となる、タンパク質結合性ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。

【0074】

一部の実施形態では、核酸分子は、組織特異的プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、組織特異的プロモーターは、肝臓、肝細胞、および／または内皮細胞における、治療用タンパク質の発現を駆動する。特定の一実施形態では、プロモーターは、ＴＴＰプロモーターを含む。特定の一実施形態では、プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。

【0075】

「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ内の特異的ヌクレオチド配列に結合し、この中で切断する酵素を指す。

【0076】

「プラスミド」という用語は、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通例、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある遺伝子を保有することが多い、染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を、適切な３’側非翻訳配列と共に、細胞へと導入することが可能である、固有の構築物へと、多数のヌクレオチド配列が接続されるか、または組み換えられた、任意の供給源に由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖状、環状、または超らせん状である、自律複製型配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列でありうる。

【0077】

使用される、真核生物用ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。非ウイルスベクターは、プラスミド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ－タンパク質複合体、および生体ポリマーを含む。

【0078】

「クローニングベクター」とは、別の核酸セグメントが、接合されたセグメントの複製をもたらすように接合される、プラスミド、ファージ、またはコスミドなど、逐次的に複製される単位長の核酸であり、複製起点を含む、「レプリコン」を指す。ある特定のクローニングベクターは、１つの細胞型、例えば、細菌における複製、および別の細胞、例えば、真核細胞における発現が可能である。クローニングベクターは、典型的に、目的の核酸配列の挿入のための、ベクターおよび／または１つもしくはそれ以上の複数のクローニング部位を含む細胞の選択のために使用される、１つまたはそれ以上の配列を含む。

【0079】

「発現ベクター」という用語は、宿主細胞への挿入の後に、挿入された核酸配列の発現を可能とするようにデザインされた媒体を指す。挿入された核酸配列は、上記で記載された通り、調節領域とのとの作動可能な関連下に置かれる。

【0080】

ベクターは、当技術分野で周知の方法、例えば、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターにより、宿主細胞へと導入される。本明細書で使用される、「培養物」、「～を培養するために」、「～を培養すること」とは、細胞を、細胞の増殖もしくは分裂を可能とするｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下においてインキュベートするか、または細胞を、生存状態に維持することを意味する。本明細書で使用される、「培養細胞」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて繁殖された細胞を意味する。

【0081】

本明細書で使用される、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」のほか、複数形の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（また、ペプチド結合としても公知である）により、直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つまたはそれ以上のアミノ酸による、１つまたはそれ以上の任意の鎖を指し、具体的長さの産物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つもしくはそれ以上のアミノ酸による、１つもしくはそれ以上の鎖を指すのに使用される、他の任意の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のうちのいずれかの代わりに使用される場合もあり、これらと互換的に使用される場合もある。「ポリペプチド」という用語はまた、限定せずに述べると、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、または非自然発生アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾産物を指すことも意図される。ポリペプチドは、天然の生体供給源に由来する場合もあり、組換え技術により作製される場合もあるが、必ずしも、指示された核酸配列から翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成による作出を含む、任意の方式により作出される。

【0082】

「アミノ酸」という用語は、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リシン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）を含む。非常套的アミノ酸もまた、本開示の範囲内にあり、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、２０２：３０１～３３６（１９９１）において記載されているアミノ酸残基類似体など、他のアミノ酸残基類似体を含む。このような非自然発生のアミノ酸残基を作出するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１８２（１９８９）；およびＥｌｌｍａｎら、前出の手順が使用される。略述すると、これらの手順は、非自然発生アミノ酸残基を伴うサプレッサーｔＲＮＡの化学的活性化に続き、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ＲＮＡの転写および翻訳を伴う。非常套的アミノ酸の導入はまた、当技術分野で公知のペプチド化学反応を使用しても達成される。本明細書で使用される、「極性アミノ酸」という用語は、正味の電荷はゼロであるが、それらの側鎖の異なる部分において、ゼロでない部分電荷を有するアミノ酸（例えば、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）を含む。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に参与しうる。本明細書で使用される、「帯電アミノ酸」という用語は、それらの側鎖上において、ゼロでない正味電荷を有しうるアミノ酸（例えば、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）を含む。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に参与しうる。

【0083】

本開示にはまた、ポリペプチドの断片または変異体、およびこれらの任意の組合せも含まれる。本開示のポリペプチド結合性ドメインまたはポリペプチド結合性分子に言及する場合における、「断片」または「変異体」という用語は、参照ポリペプチドの特性（例えば、ＦｃＲｎ結合性ドメインまたはＦｃ変異体に対する、ＦｃＲｎの結合アフィニティー、ＦＶＩＩＩ変異体についての凝固活性、またはＶＷＦ断片に対する、ＦＶＩＩＩの結合活性）のうちの、少なくとも一部を保持する、任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、本明細書の他の箇所で論じられる、特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解性断片のほか、欠失断片を含むが、自然発生の全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）を含まない。本開示のポリペプチド結合性ドメインまたはポリペプチド結合性分子の変異体は、上記で記載された断片を含み、また、アミノ酸の置換、欠失、または挿入のために、アミノ酸配列が変更されたポリペプチドも含む。変異体は、天然変異体の場合もあり、非自然発生変異体の場合もある。非自然発生変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発法を使用して作製される。変異体ポリペプチドは、保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を含む場合もあり、非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を含む場合もある。

【0084】

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられるアミノ酸置換である。当技術分野では、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝型側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。したがって、ポリペプチド内のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸により置き換えられる場合、置換は、保存的であると考えられる。別の実施形態では、アミノ酸の連なりは、側鎖ファミリーメンバーの、順序および／または組成が異なる、構造的に類似する連なりにより保存的に置き換えられる。

【0085】

当技術分野で公知である、「同一性パーセント」という用語は、配列を比較することにより決定される、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列、または２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当技術分野において、「同一性」とはまた、場合によって、このような配列の連なりの間のマッチにより決定される、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の間の配列類縁性の程度も意味する。「同一性」は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ」、Ｉ部（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）において記載された方法を含むがこれらに限定されない、公知の方法により、たやすく計算される。同一性を決定する、好ましい方法は、被験配列の間の最も良好なマッチをもたらすようにデザインされる。同一性を決定する方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムにおいてコード化されている。配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算ソフトパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の、Ｍｅｇａｌｉｇｎプログラム、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３（１９９０））；およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ）などの配列解析ソフトウェアを使用して実施される。本出願の文脈では、解析のために、配列解析ソフトウェアが使用される場合、解析の結果は、そうでないことが指定されない限りにおいて、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されるであろう。本明細書で使用される、「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときに、ソフトウェアにより元からロードされていた、値またはパラメータの任意のセットを意味する。クエリー配列（例えば、核酸配列）と、参照配列との同一性パーセントを決定する目的では、参照配列内のヌクレオチドにマッチするクエリー配列内のヌクレオチドだけが、同一性パーセントを計算するのに使用される。したがって、クエリー配列またはその指定部分（例えば、ヌクレオチド１～５２２）と、参照配列との同一性パーセントの決定において、同一性パーセントは、マッチしたヌクレオチドの数を、完全クエリー配列内のヌクレオチド総数により除することにより計算されるであろう。

【0086】

本明細書で使用された、本開示の特定の配列内のヌクレオチドに対応するヌクレオチドは、本開示の配列のアライメントにより、参照配列に照らした同一性を最大化するように同定される。参照配列内の、同等のアミノ酸を同定するのに使用される番号は、本開示の配列内の、対応するアミノ酸を同定するのに使用される番号に基づく。

【0087】

本明細書で使用される、～を処置する、処置、～を処置することとは、例えば、疾患もしくは状態の重症度の軽減；疾患経過の持続期間の短縮；疾患もしくは状態と関連する、１つもしくはそれ以上の症状の改善；疾患もしくは状態を伴う対象への、必ずしも、疾患もしくは状態の治癒を伴わない、有益な効果の施与；または疾患もしくは状態と関連する、１つもしくはそれ以上の症状の予防を指す。

【0088】

本明細書で使用される、「～を投与すること」とは、薬学的に許容される核酸分子、これから発現されるポリペプチド、または本開示の核酸分子を含むベクターを、薬学的に許容される経路を介して、対象へと施すことを意味する。投与経路は、静脈内、例えば、静脈内注射および静脈内注入でありうる。さらなる投与経路は、例えば、皮下投与、筋内投与、経口投与、経鼻投与、および肺内投与を含む。核酸分子、ポリペプチド、およびベクターは、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の部分として投与される。

【0089】

本明細書で使用される、「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容可能であり、典型的に、ヒトへと投与された場合に、胸焼け、めまいなど、毒性もしくはアレルギー性または類似する望ましくない反応をもたらさない、分子実体および組成物を指す。場合により、本明細書で使用される、「薬学的に許容される」という用語は、動物における使用について、より特定すると、ヒトにおける使用について、米国連邦政府もしくは州政府の規制機関により承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認識された薬局方に収載されていることを意味する。

【0090】

本明細書で使用される、「それを必要とする対象」という語句は、本開示の核酸分子、ポリペプチド、またはベクターの投与から利益を得る、哺乳動物対象などの対象を含む。一部の実施形態では、対象は、ヒト対象である。一部の実施形態では、対象は、血友病を伴う個体である。対象は、成人の場合もあり、年少者（例えば、１２歳未満）の場合もある。

【0091】

本明細書で使用される、「治療用タンパク質」という用語は、対象へと投与される、当技術分野で公知である、任意のポリペプチドを指す。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、凝固因子、増殖因子、抗体、これらの機能的断片、またはこれらの組合せから選択されるタンパク質を含む。本明細書で使用される、「凝固因子」という用語は、対象における出血挿間の持続を防止するか、またはこれを減少させる、自然発生であるか、または組換えにより作製された分子またはその類似体を指す。言い換えると、「凝固因子」という用語は、凝固促進活性を有する分子、すなわち、血液を凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｅまたはｃｌｏｔ）させる、フィブリノーゲンの、不溶性フィブリンのメッシュへの転換の一因となる分子を意味する。本明細書で使用される、「凝固因子」は、活性化型凝固因子、そのチモーゲン、または活性化可能凝固因子を含む。「活性化可能凝固因子」とは、活性形態へと転換されることが可能である、不活性形態にある（例えば、そのチモーゲン形態にある）凝固因子である。「凝固因子」という用語は、第Ｉ因子（ＦＩ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第ＩＩＩ因子（ＦＩＩＩ）、第ＩＶ因子（ＦＩＶ）第Ｖ因子（ＦＶ）、第ＦＶＩ因子（ＦＶＩ）第ＦＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＦＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＦＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、フォンウィレブラント因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２アンチプラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２（ＰＡＩ－２）、これらのチモーゲン、これらの活性化形態、またはこれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない。

【0092】

本明細書で使用される、「凝固活性」とは、フィブリン凝固物の形成に至る生化学的反応のカスケードに参与し、かつ／または出血もしくは出血挿間の重症度、持続、もしくは頻度を低減する能力を意味する。

【0093】

本明細書で使用される、「増殖因子」という用語は、サイトカインおよびホルモンを含む、当技術分野で公知である、任意の増殖因子を含む。

【0094】

一部の実施形態では、治療用タンパク質は、Ｘ連鎖遺伝子ジストロフィン、ＭＴＭ１（ミオチュブラリン）、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、シクロヒドロラーゼ、ＳＭＮ１、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＦＨ、ＨＴＲＡ、ＡＲＭＳ、ＣＦＢ／ＣＣ２、ＣＮＧＡ／ＣＮＧＢ、Ｐｒｆ６５、ＡＲＳＡ、ＰＳＡＰ、ＩＤＵＡ（ＭＰＳ Ｉ）、ＩＤＳ（ＭＰＳ ＩＩ）、ＰＡＨ、ＧＡＡ（酸性アルファグルコシダーゼ）、またはこれらの任意の組合せから選択される遺伝子によりコードされる。

【0095】

本明細書で使用される、「異種」または「外因性」という用語は、所与の文脈において、例えば、細胞内またはポリペプチド内に、通常見出されない分子を指す。例えば、外因性分子または異種分子は、細胞へと導入され、例えば、トランスフェクションまたは遺伝子操作の他の形態による、細胞の操作後だけにおいて存在するが、異種アミノ酸配列は、それが、天然において見出されないタンパク質内に存在する場合もある。

【0096】

ヌクレオチド配列に関して、本明細書で使用される、「最適化された」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指し、この場合、ポリヌクレオチド配列は、このポリヌクレオチド配列の特性を増強するように突然変異している。一部の実施形態では、最適化は、転写レベルを上昇させるか、翻訳レベルを上昇させるか、定常状態におけるｍＲＮＡレベルを上昇させるか、基本転写因子などの調節タンパク質への結合を増大もしくは低下させるか、スプライシングを増大もしくは低下させるか、またはポリヌクレオチド配列によりもたらされるポリペプチドの収量を増大させるようになされる。ヌクレオチド配列を最適化するように、ポリヌクレオチド配列に対してなされる変化の例は、コドン最適化、Ｇ／Ｃ含量最適化、リピート配列の除去、ＡＴリッチエレメントの除去、潜在スプライス部位の除去、転写または翻訳を抑制するシス活性化エレメントの除去、ｐｏｌｙ－Ｔまたはｐｏｌｙ－Ａ配列の付加または除去、コザックコンセンサス配列など、転写を増強する転写開始部位の近傍における配列の付加、ステムループ構造を形成しうる配列の除去、不安定化配列の除去、および２つまたはそれ以上のこれらの組合せを含む。

【0097】

ＩＩ．核酸分子
本開示のある特定の態様は、遺伝子治療のためのＡＡＶベクターの欠陥を克服することを目的とする。特に、本開示のある特定の態様は、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および遺伝子カセットを含む核酸分子を対象とし、例えば、治療用タンパク質および／または治療用ｍｉＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲは、異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットを挟む。一部の実施形態では、核酸分子は、カプシドタンパク質、複製タンパク質、および／またはアセンブリータンパク質をコードする遺伝子を含まない。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、凝固因子を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ｍｉＲＮＡをコードする。ある特定の実施形態では、遺伝子カセットは、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲとの間に配置される。一部の実施形態では、核酸分子は、１つまたはそれ以上の非コード領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、１つまたはそれ以上の非コード領域は、プロモーター配列、イントロン、転写後調節エレメント、３’ＵＴＲポリ（Ａ）配列、またはこれらの任意の組合せを含む。

【0098】

一実施形態では、遺伝子カセットは、一本鎖核酸である。別の実施形態では、遺伝子カセットは、二本鎖核酸である。別の実施形態では、遺伝子カセットは、クローズドエンド二本鎖ｃｅＤＮＡである。

【0099】

一部の実施形態では、核酸分子は、（ａ）パルボウイルス科の、ＡＡＶ以外のメンバー（例えば、Ｂ１９またはＧＰＶ ＩＴＲ）に由来するＩＴＲである、第１のＩＴＲ；（ｂ）組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーターまたはＴＴＲプロモーター；（ｃ）イントロン、例えば、合成イントロン；（ｄ）ｍｉＲＮＡまたは治療用タンパク質、例えば、凝固因子をコードするヌクレオチド；（ｅ）転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；（ｆ）３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；（ｇ）パルボウイルス科の、ＡＡＶ以外のメンバー（例えば、Ｂ１９またはＧＰＶ ＩＴＲ）に由来するＩＴＲである、第２のＩＴＲを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、（ａ）パルボウイルス科の、ＡＡＶ以外のメンバー（例えば、Ｂ１９またはＧＰＶ ＩＴＲ）に由来するＩＴＲである、第１のＩＴＲ；（ｂ）組織特異的プロモーター配列、例えば、ｍＴＴＲプロモーター；（ｃ）イントロン、例えば、合成イントロン；（ｄ）ｍｉＲＮＡまたは治療用タンパク質、例えば、凝固因子をコードするヌクレオチド；（ｅ）転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；（ｆ）３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；（ｇ）パルボウイルス科の、ＡＡＶ以外のメンバー（例えば、Ｂ１９またはＧＰＶ ＩＴＲ）に由来するＩＴＲである、第２のＩＴＲを含む。

【0100】

一部の実施形態では、核酸分子は、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含み、この場合、標的配列は、治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを含む。

【0101】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ｍＴＴＲプロモーターにより駆動される、コドン最適化ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｍＴＴＲプロモーターは、配列番号３１の核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、Ａ１ＭＢ２エンハンサーエレメントをさらに含む。一部の実施形態では、Ａ１ＭＢ２エンハンサーエレメントは、配列番号３０の核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、キメライントロンまたは合成イントロンをさらに含む。一部の実施形態では、キメライントロンは、ニワトリベータ－アクチンイントロン／ウサギベータ－グロビンイントロンからなり、５つの既存のＡＴＧ配列を消失させて、偽翻訳開始を低減するように修飾されている。一部の実施形態では、イントロン配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列に対して、５’側に配置される。一部の実施形態では、キメライントロンは、ｍＴＴＲプロモーターなどのプロモーター配列に対して、５’側に配置される。一部の実施形態では、キメライントロンは、配列番号３２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号３３の核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、ｂＧＨｐＡシグナルは、配列番号３４の核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号２７に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む。

【0102】

本明細書の一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする単離核酸分子が開示される。本明細書の一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号２８と少なくとも約７５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子が開示される。本明細書の一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号２８に示されたヌクレオチド配列を含む単離核酸分子が開示される。

【0103】

本明細書の一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする単離核酸分子が開示される。本明細書の一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号２９と少なくとも約７５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子が開示される。本明細書の一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードし、配列番号２９に示されたヌクレオチド配列を含む単離核酸分子が開示される。

【0104】

Ａ．逆位末端反復（ＩＴＲ）
本開示のある特定の態様は、第１のＩＴＲ、例えば、５’側ＩＴＲと、第２のＩＴＲ、例えば、３’側ＩＴＲとを含む核酸分子を対象とする。典型的に、ＩＴＲは、原核生物プラスミドからの、パルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ＤＮＡの複製およびレスキューまたは切出しに関与する（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８３、１９８７；Ｓｅｎａｐａｔｈｙら、１９８４；ＧｏｔｔｌｉｅｂａｎｄＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８８）。加えて、ＩＴＲは、ＡＡＶプロウイルスの組込み、およびＡＡＶ ＤＮＡの、ビリオンへのパッケージングに要求される、最小限の配列であるとも考えられる（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９）。これらのエレメントは、パルボウイルスゲノムの効率的複製に不可欠である。ＩＴＲ機能に必須である、最小限の規定的エレメントは、Ｒｅｐ結合性部位および末端分離部位＋ヘアピン形成を可能とする可変性回文配列であることが仮定される。回文ヌクレオチド領域は、通常、シス側において、ＤＮＡ複製起点、およびウイルスのためのパッケージングシグナルとして、一体に機能する。ＩＴＲ内の相補性配列は、ＤＮＡ複製時に、ヘアピン構造へとフォールディングする。一部の実施形態では、ＩＴＲは、Ｔ字形ヘアピン構造へとフォールディングする。他の実施形態では、ＩＴＲは、Ｔ字形以外のヘアピン構造、例えば、Ｕ字形ヘアピン構造へとフォールディングする。データは、ＡＡＶ ＩＴＲのＴ字形ヘアピン構造が、ＩＴＲにより挟まれた導入遺伝子の発現を阻害しうることを示唆する。例えば、Ｚｈｏｕら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、７：５４３２（２０１７年７月１４日）を参照されたい。Ｔ字形ヘアピン構造を形成しないＩＴＲを利用することにより、この阻害形態は回避される。したがって、ある特定の態様では、ＡＡＶ以外のＩＴＲを含むポリヌクレオチドは、Ｔ字形ヘアピンを形成するＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドと比較して、導入遺伝子の発現を改善した。

【0105】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲを含む、例えば、ＩＴＲは、パルボウイルス科のメンバーに由来するＩＴＲの全部または一部を含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、合成配列を含む。一実施形態では、第１のＩＴＲまたは第２のＩＴＲは、合成配列を含む。別の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲの各々は、合成配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲまたは第２のＩＴＲは、自然発生配列を含む。別の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲの各々は、自然発生配列を含む。

【0106】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの部分、例えば、切断型ＩＴＲを含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの断片を含むか、またはこれからなり、この場合、断片は、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１２５ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１７５ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２２５ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約２７５ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３２５ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、少なくとも約３７５ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約４２５ヌクレオチド、少なくとも約４５０ヌクレオチド、少なくとも約４７５ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約５２５ヌクレオチド、少なくとも約５５０ヌクレオチド、少なくとも約５７５ヌクレオチド、または少なくとも約６００ヌクレオチドを含み；ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの機能的特性を保持する。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの断片を含むか、またはこれからなり、この場合、断片は、少なくとも約１２９ヌクレオチドを含み；ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの機能的特性を保持する。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの断片を含むか、またはこれからなり、この場合、断片は、少なくとも約１０２ヌクレオチドを含み；ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、それが由来する野生型ＩＴＲの、Ｒｅｐ結合性エレメント（ＲＢＥ）を保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、それが由来する野生型ＩＴＲのＲＢＥのうちの少なくとも１つを保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、それが由来する野生型ＩＴＲのＲＢＥまたはその機能的部分のうちの少なくとも１つを保持する。ＲＢＥの保存は、ＩＴＲの安定性および製造目的のために重要でありうる。

【0107】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの部分を含むか、またはこれからなり、この場合、断片は、自然発生ＩＴＲの長さのうちの、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含み；断片は、自然発生ＩＴＲの機能的特性を保持する。

【0108】

ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、適正にアライメントされた場合に、相同な自然発生ＩＴＲの部分に対する、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこれからなり；この場合、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの機能的特性を保持する。他の実施形態では、ＩＴＲは、適正にアライメントされた場合に、相同な自然発生ＩＴＲの部分に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこれからなり；この場合、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、適正にアライメントされた場合に、相同な自然発生ＩＴＲの部分に対する、少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこれからなり；この場合、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、適正にアライメントされた場合に、相同な自然発生ＩＴＲの部分に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこれからなり；この場合、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、適正にアライメントされた場合に、相同な自然発生ＩＴＲの部分に対する、少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこれからなり；この場合、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、適正にアライメントされた場合に、相同な自然発生ＩＴＲの部分に対する、少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこれからなり；この場合、ＩＴＲは、自然発生ＩＴＲの機能的特性を保持する。

【0109】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来するＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびこれらの任意の組合せから選択されるＡＡＶゲノムのＩＴＲである。一部の実施形態では、ＩＴＲは、天然単離物、例えば、天然ヒト単離物を含む、当業者に公知である、任意のＡＡＶゲノムのＩＴＲである。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ゲノムのＩＴＲである。別の実施形態では、ＩＴＲは、その５’末端および３’末端において、ＡＡＶゲノムのうちの１つまたはそれ以上に由来するＩＴＲを含むように遺伝子操作された合成配列である。

【0110】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来しない（すなわち、ＩＴＲは、ＡＡＶではないウイルスに由来する）。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ以外のＩＴＲである。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ボカウイルス属、ディペンドウイルス属、エリスロウイルス属、アムドウイルス属、パルボウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、コントラウイルス属、アベパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、テトラパルボウイルス属、アンビデンソウイルス属、ブレビデンソウイルス属、ヘパンデンソウイルス属、ペンスチルデンソウイルス属、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択されるがこれらに限定されないパルボウイルス科に由来する、ＡＡＶゲノム以外のＩＴＲである。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、パルボウイルスである、エリスロウイルスＢ１９（ヒトウイルス）に由来する。別の実施形態では、ＩＴＲは、マスコビーダックパルボウイルス（ＭＤＰＶ）株に由来する。ある特定の実施形態では、ＭＤＰＶ株は、弱毒化ＭＤＰＶ株、例えば、ＭＤＰＶ ＦＺ９１－３０株である。他の実施形態では、ＭＤＰＶ株は、病原性ＭＤＰＶ株、例えば、ＭＤＰＶ ＹＹ株である。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ブタパルボウイルス、例えば、ブタパルボウイルスＵ４４９７８株に由来する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、マウス微小ウイルス、例えば、マウス微小ウイルスＵ３４２５６株に由来する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、イヌパルボウイルス、例えば、イヌパルボウイルスＭ１９２９６株に由来する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ミンク腸炎ウイルス、例えば、ミンク腸炎ウイルスＤ００７６５株に由来する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ディペンドパルボウイルス属に由来する。一実施形態では、ディペンドパルボウイルス属は、ディペンドウイルス属ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）株である。具体的な実施形態では、ＧＰＶ株は、弱毒化ＧＰＶ株、例えば、ＧＰＶ ８２－０３２１Ｖ株である。別の特異的実施形態では、ＧＰＶ株は、病原性ＧＰＶ株、例えば、ＧＰＶ Ｂ株である。

【0111】

核酸分子の第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、同じゲノム、例えば、同じウイルスのゲノムに由来する場合もあり、異なるゲノム、例えば、（また「ハイブリッド」ＩＴＲとしても公知である）２つまたはそれ以上の異なるウイルスゲノムのゲノムに由来する場合もある。ある特定の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、同じＡＡＶゲノムに由来する。具体的な実施形態では、本発明の核酸分子内に存在する、２つのＩＴＲは、同じであり、特に、ＡＡＶ２ ＩＴＲでありうる。他の実施形態では、第１のＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来し、第２のＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来しない（例えば、ＡＡＶ以外のゲノムに由来する）。他の実施形態では、第１のＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来せず（例えば、ＡＡＶ以外のゲノムに由来し）、第２のＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来する。さらに他の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲのいずれも、ＡＡＶゲノムに由来しない（例えば、ＡＡＶ以外のゲノムに由来する）。特定の一実施形態では、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲとは、同一である。

【0112】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、ＡＡＶ以外のゲノムに由来し、第２のＩＴＲは、ＡＡＶ以外のゲノムに由来し、この場合、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、同じゲノムに由来する。ＡＡＶ以外のウイルスゲノムの非限定例は、ボカウイルス属、ディペンドウイルス属、エリスロウイルス属、アムドウイルス属、パルボウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、コントラウイルス属、アベパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、テトラパルボウイルス属、アンビデンソウイルス属、ブレビデンソウイルス属、ヘパンデンソウイルス属、およびペンスチルデンソウイルス属に由来する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、ＡＡＶ以外のゲノムに由来し、第２のＩＴＲは、ＡＡＶ以外のゲノムに由来し、この場合、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、異なるウイルスゲノム（また、「ハイブリッド」ＩＴＲとしても公知である）に由来する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、Ｂ１９ゲノムに由来し、第２のＩＴＲは、ＧＰＶに由来する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、ＧＰＶゲノムに由来し、第２のＩＴＲは、Ｂ１９に由来する。

【0113】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来し、第２のＩＴＲは、パルボウイルスである、エリスロウイルスＢ１９（ヒトウイルス）に由来する。他の実施形態では、第２のＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来し、第１のＩＴＲは、パルボウイルスである、エリスロウイルスＢ１９（ヒトウイルス）に由来する。

【0114】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、ＡＡＶゲノムまたはＡＡＶ以外のゲノムに由来するＩＴＲの全部または一部を含むか、またはこれからなり、第２のＩＴＲは、ＡＡＶゲノムまたはＡＡＶ以外のゲノムに由来するＩＴＲの全部または一部を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムまたはＡＡＶ以外のゲノムに由来するＩＴＲの一部は、自然発生のＡＡＶゲノムまたはＡＡＶ以外のゲノムに由来するＩＴＲの切断形である。一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムまたはＡＡＶ以外のゲノムに由来するＩＴＲの一部は、自然発生のＡＡＶゲノムまたはＡＡＶ以外のゲノムに由来するＩＴＲの一部を含む。例えば、ＡＡＶゲノムまたはＡＡＶ以外のゲノムに由来するＩＴＲの一部は、自然発生のＡＡＶゲノムまたはＡＡＶ以外のゲノムに由来するＩＴＲの一部を含み、少なくとも１つのＲＢＥまたはその機能的部分は、保存的である。

【0115】

ある特定の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、Ｂ１９に由来するＩＴＲの全部または一部を含むか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、Ｂ１９に由来するＩＴＲの全部または一部を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、第１のＩＴＲの逆相補体である。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、第２のＩＴＲの逆相補体である。一部の実施形態では、Ｂ１９に由来する、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成することが可能である。ある特定の実施形態では、ヘアピン構造は、Ｔ字形ヘアピンを含まない。

【0116】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１～８、１７、または１８に示されたヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなり、この場合、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、それが由来するＢ１９ ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１～８、１７、または１８から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなり、この場合、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成することが可能である。ある特定の実施形態では、ヘアピン構造は、Ｔ字形ヘアピンを含まない。

【0117】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１～８、１７、または１８から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号２に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号３に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号４に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号５に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号６に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号７に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号８に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１７に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１８に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。

【0118】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来し、第２のＩＴＲは、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）に由来する。他の実施形態では、第２のＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来し、第１のＩＴＲは、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）に由来する。

【0119】

ある特定の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ＧＰＶに由来するＩＴＲの全部または一部を含むか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ＧＰＶに由来するＩＴＲの全部または一部を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、第１のＩＴＲの逆相補体である。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、第２のＩＴＲの逆相補体である。一部の実施形態では、ＧＰＶに由来する、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成することが可能である。ある特定の実施形態では、ヘアピン構造は、Ｔ字形ヘアピンを含まない。

【0120】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号９～１６または１９～２２に示されたヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなり、この場合、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、それが由来するＧＰＶ ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号９～１６または１９～２２から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなり、この場合、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成することが可能である。ある特定の実施形態では、ヘアピン構造は、Ｔ字形ヘアピンを含まない。

【0121】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号９～１６または１９～２２から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号９に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１０に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１１に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１２に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１３に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１４に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１５に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１６に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１９に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号２０に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号２１に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号２２に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号２３に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号２４に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号２５に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号２６に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。

【0122】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１のヌクレオチド１～４９、５０～５８、および５９～１２５、または配列番号１５のヌクレオチド１～２７および５０～１１４、配列番号２３、または配列番号２５と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番２のヌクレオチド１～６７、６８～７６、および７７～１２５、または配列番号１６のヌクレオチド１～６５および８８～１１４、配列番号２３、または配列番号２６と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0123】

当業者に、本明細書で記載される、第１のＩＴＲ配列のうちのいずれかは、本明細書で記載される、第２のＩＴＲ配列のうちのいずれかとマッチされることが察知されるであろう。一部の実施形態では、本明細書で記載される、第１のＩＴＲ配列は、５’側ＩＴＲ配列である。一部の実施形態では、本明細書で記載される、第２のＩＴＲ配列は、３’側ＩＴＲ配列である。一部の実施形態では、本明細書で記載される、第２のＩＴＲ配列は、５’側ＩＴＲ配列である。一部の実施形態では、本明細書で記載される、第１のＩＴＲ配列は、３’側ＩＴＲ配列である。当業者は、遺伝子カセットの構成に関して、本明細書で記載される、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲの適切な配向性を決定することができるであろう。

【0124】

別の特定の実施形態では、ＩＴＲは、その５’末端および３’末端において、ＡＡＶゲノムに由来しないＩＴＲを含むように遺伝子操作された合成配列である。別の特定の実施形態では、ＩＴＲは、その５’末端および３’末端において、ＡＡＶ以外のゲノムのうちの１つまたはそれ以上に由来するＩＴＲを含むように遺伝子操作された合成配列である。本発明の核酸分子内に存在する、２つのＩＴＲは、同じＡＡＶ以外のゲノムの場合もあり、異なるＡＡＶ以外のゲノムの場合もある。特に、ＩＴＲは、同じＡＡＶ以外のゲノムに由来しうる。具体的な実施形態では、本発明の核酸分子内に存在する、２つのＩＴＲは、同じであり、特に、ＡＡＶ２ ＩＴＲでありうる。

【0125】

一部の実施形態では、ＩＴＲ配列は、１つまたはそれ以上の回文配列を含む。本明細書で開示されるＩＴＲの回文配列は、天然の回文配列（すなわち、天然において見出される配列）、偽回文配列などの合成配列（すなわち、天然において見出されない配列）、およびこれらの組合せまたは修飾形態を含むがこれらに限定されない。「偽回文配列」とは、二次構造を形成する、天然ＡＡＶ内の配列、またはＡＡＶ以外の回文配列に対する、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、もしくは５％未満を含む、８０％未満の核酸配列同一性を共有するか、またはこれを共有しない、不完全回文配列を含む、回文ＤＮＡ配列である。天然回文配列は、本明細書で開示される、任意のゲノムから得られるか、またはこれらに由来する。合成回文配列は、本明細書で開示される、任意のゲノムに基づきうる。

【0126】

回文配列は、連続配列の場合もあり、中断配列の場合もある。一部の実施形態では、中断配列であり、この場合、回文配列は、第２の配列の挿入を含む。一部の実施形態では、第２の配列は、プロモーター、エンハンサー、インテグラーゼのための組込み部位（例えば、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐリコンビナーゼのための部位）、遺伝子産物のためのオープンリーディングフレーム、またはこれらの組合せを含む。

【0127】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピンループ構造を形成する。一実施形態では、第１のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。別の実施形態では、第２のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。さらに別の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲのいずれも、ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、Ｔ字形ヘアピン構造を形成しない。ある特定の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、Ｔ字形以外のヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、Ｔ字形以外のヘアピン構造は、Ｕ字形ヘアピン構造を含む。

【0128】

一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸分子内のＩＴＲは、転写活性化ＩＴＲでありうる。転写活性化ＩＴＲは、少なくとも１つの転写活性エレメントの組入れにより転写活性化された、野生型ＩＴＲの全部または一部を含みうる。多様な種類の転写活性エレメントが、この文脈における使用のために適する。一部の実施形態では、転写活性エレメントは、構成的転写活性エレメントである。構成的転写活性エレメントは、持続レベルの遺伝子転写をもたらし、導入遺伝子が、持続ベースで発現されることが所望される場合に好ましい。他の実施形態では、転写活性エレメントは、誘導的転写活性エレメントである。誘導的転写活性エレメントは、一般に、誘導因子（または誘導条件）の非存在下において、低活性を呈し、誘導因子（または誘導条件への切換え）の存在下において、上方調節される。発現が、ある特定の時点もしくはある特定の位置に限り所望されるか、または誘導剤を使用して、発現レベルを滴定することが所望される場合に、誘導的転写活性エレメントは、好ましい場合がある。転写活性エレメントはまた、組織特異的でもありうる；すなわち、ある特定の組織または細胞型だけにおいて活性を呈する。

【0129】

転写活性エレメントは、様々な形で、ＩＴＲへと組み込まれる。一部の実施形態では、転写活性エレメントは、ＩＴＲの任意の部分に対して５’側、またはＩＴＲの任意の部分に対して３’側に組み込まれる。他の実施形態では、転写活性化ＩＴＲの転写活性エレメントは、２つのＩＴＲ配列の間にある。転写活性エレメントが、隔てられなければならない、２つまたはそれ以上のエレメントを含む場合、これらのエレメントは、ＩＴＲの部分と交互に存在する。一部の実施形態では、ＩＴＲのヘアピン構造は、欠失し、転写エレメントの逆位リピートにより置き換えられる。この後者の配置ならば、構造内の欠失部分を模倣するヘアピンを創出するであろう。転写活性化ＩＴＲ内に、複数のタンデム転写活性エレメントが存在する場合もあり、これらは、隣接する場合もあり、隔てられる場合もある。加えて、タンパク質結合性部位（例えば、Ｒｅｐ結合性部位）も、転写活性化ＩＴＲの転写活性エレメントへと導入される。転写活性エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの転写の制御が、ＲＮＡを形成することを可能とする、任意の配列を含む場合があり、例えば、下記に規定される、転写活性エレメントを含みうる。

【0130】

転写活性化ＩＴＲは、比較的限定的なヌクレオチド配列の長さにおいて、核酸分子へと、転写活性化およびＩＴＲ機能の両方をもたらし、これは、核酸分子から運ばれ、発現される導入遺伝子の長さを効果的に最大化する。転写活性エレメントの、ＩＴＲへの組込みは、様々な形で達せられる。ＩＴＲ配列、および転写活性エレメントの配列要件の比較は、ＩＴＲ内のエレメントをコードする方式に対する洞察をもたらしうる。例えば、転写活性は、転写活性エレメントの機能的エレメントを複製するＩＴＲ配列内における、特異的変化の導入を介して、ＩＴＲへと付加される。当技術分野では、特異的部位において、特定のヌクレオチド配列を、効率的に付加し、欠失させ、かつ／または変化させる、多数の技法が存在する（例えば、ＤｅｎｇおよびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ（１９９２）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００：８１～８８を参照されたい）。転写活性化ＩＴＲを創出する、別の方式は、ＩＴＲ内の所望の位置における、制限部位の導入を伴う。加えて、当技術分野で公知の方法を使用して、複数の転写活性化エレメントが、転写活性化ＩＴＲへと組み込まれる。

【0131】

例示を目的として述べると、転写活性化ＩＴＲは、ＴＡＴＡｂｏｘ、ＧＣｂｏｘ、ＣＣＡＡＴｂｏｘ、Ｓｐ１部位、Ｉｎｒ領域、ＣＲＥ（ｃＡＭＰ調節エレメント）部位、ＡＴＦ－１／ＣＲＥ部位、ＡＰＢβｂｏｘ、ＡＰＢαｂｏｘ、ＣＡｒＧｂｏｘ、ＣＣＡＣｂｏｘ、または当技術分野で公知の、転写に関与する、他の任意のエレメントなど、１つまたはそれ以上の転写活性エレメントの組入れにより作出される。

【0132】

本開示の態様は、本明細書で記載される核酸分子をクローニングする方法であって、複雑な二次構造が可能な核酸分子を、適切なベクターへと挿入する工程と、結果として得られるベクターを、適切な細菌宿主株へと導入する工程とを含む方法をもたらす。当技術分野で公知の通り、核酸の複雑な二次構造（例えば、長い回文領域）は、不安定であり、細菌宿主株内のクローニングが困難な場合がある。例えば、本開示の第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ以外のパルボウイルスＩＴＲ、例えば、Ｂ１９ ＩＴＲまたはＧＰＶ ＩＴＲ）を含む核酸分子は、常套的方法を使用するクローニングが困難な場合がある。長いＤＮＡ回文配列は、ＤＮＡの複製を阻害し、大腸菌、バチルス属、連鎖球菌属、ストレプトミセス属、出芽酵母、マウス、およびヒトのゲノム内において不安定である。これらの影響は、鎖内塩基対合による、ヘアピンまたは十字型構造の形成から生じる。大腸菌内では、ＤＮＡ複製の阻害は、ＳｂｃＣ突然変異体またはＳｂｃＤ突然変異体において、著明に克服される場合がある。ＳｂｃＤは、ＳｂｃＣＤ複合体のヌクレアーゼサブユニットであり、ＳｂｃＣは、ＡＴＰアーゼサブユニットである。大腸菌ＳｂｃＣＤ複合体は、長い回文配列の複製を阻止する一因となる、エクソヌクレアーゼ複合体である。ＳｂｃＣＤ複合体は、ＡＴＰ依存性二本鎖ＤＮＡエクソヌクレアーゼ活性、およびＡＴＰ非依存性一本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を伴う核である。ＳｂｃＣＤは、ＤＮＡ回文配列を認識し、生じるヘアピン構造を攻撃することにより、複製フォークを崩壊させうる。

【0133】

ある特定の実施形態では、適切な細菌宿主株は、十字型ＤＮＡ構造を分解することが不可能である。ある特定の実施形態では、適切な細菌宿主株は、ＳｂｃＣＤ複合体内の破壊を含む。一部の実施形態では、ＳｂｃＣＤ複合体内の破壊は、ＳｂｃＣ遺伝子内および／またはＳｂｃＤ遺伝子内の遺伝子破壊を含む。ある特定の実施形態では、ＳｂｃＣＤ複合体内の破壊は、ＳｂｃＣ遺伝子内の遺伝子破壊を含む。当技術分野では、ＳｂｃＣ遺伝子内の遺伝子破壊を含む、多様な細菌宿主株が公知である。例えば、限定せずに述べると、細菌宿主株である、ＰＭＣ１０３は、遺伝子型である、ｓｂｃＣ、ｒｅｃＤ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦを含み；細菌宿主株である、ＰＭＣ１０７は、遺伝子型である、ｒｅｃＢＣ、ｒｅｃＪ、ｓｂｃＢＣ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦを含み；細菌宿主株である、ＳＵＲＥは、遺伝子型である、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＪ、ｓｂｃＣ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦ、ｕｍｕＣ、ｕｖｒＣを含む。したがって、一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸分子をクローニングする方法は、複雑な二次構造が可能な核酸分子を、適切なベクターへと挿入する工程と、結果として得られるベクターを、宿主株である、ＰＭＣ１０３、ＰＭＣ１０７、またはＳＵＲＥへと導入する工程とを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される核酸分子をクローニングする方法は、複雑な二次構造が可能な核酸分子を、適切なベクターへと挿入する工程と、結果として得られるベクターを、宿主株である、ＰＭＣ１０３へと導入する工程とを含む。

【0134】

当技術分野では、適切なベクターが公知であり、本明細書の他の箇所で記載されている。ある特定の実施形態では、本開示のクローニング法における使用に適するベクターは、低コピー量ベクターである。ある特定の実施形態では、本開示のクローニング法における使用に適するベクターは、ｐＢＲ３２２である。

【0135】

したがって、本開示は、核酸分子をクローニングする方法であって、複雑な二次構造が可能な核酸分子を、適切なベクターへと挿入する工程と、結果として得られるベクターを、ＳｂｃＣＤ複合体内の破壊を含む、細菌宿主株へと導入する工程とを含み、核酸分子は、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）、および第２のＩＴＲを含み、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１～２２またはこれらの機能的誘導体と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む方法を提供する。

【0136】

Ｂ．治療用タンパク質
本開示のある特定の態様は、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含み、標的配列は、治療用タンパク質をコードする、核酸分子を対象とする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、１つの治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、１つを超える治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、同じ治療用タンパク質の、２つまたはそれ以上のコピーをコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、同じ治療用タンパク質の、２つまたはそれ以上の変異体をコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、２つまたはそれ以上の、異なる治療用タンパク質をコードする。

【0137】

本開示のある特定の実施形態は、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および治療用タンパク質をコードする遺伝子カセットを含み、治療用タンパク質は、凝固因子を含む、核酸分子を対象とする。一部の実施形態では、凝固因子は、ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩ、ＦＩＶ、ＦＶ、ＦＶＩ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、ＶＷＦ、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２アンチプラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２（ＰＡＩ２）、これらの任意のチモーゲン、これらの任意の活性形態、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩＩまたはその変異体もしくは断片を含む。別の実施形態では、凝固因子は、ＦＩＸまたはその変異体もしくは断片を含む。別の実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩまたはその変異体もしくは断片を含む。別の実施形態では、凝固因子は、ＶＷＦまたはその変異体もしくは断片を含む。

【0138】

一部の実施形態では、核酸分子は、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含み、この場合、標的配列は、治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含む。本明細書で使用される通り、本出願を通して、「ＦＶＩＩＩ」と略記される、「第ＶＩＩＩ因子」とは、そうでないことが指定されない限りにおいて、凝固におけるその正常の役割下にある、機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。したがって、「ＦＶＩＩＩ」という用語は、機能的である、変異体ポリペプチドを含む。「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、ＦＶＩＩＩポリペプチド（またはタンパク質）またはＦＶＩＩＩと互換的に使用される。ＦＶＩＩＩ機能の例は、凝固を活性化させる能力、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、またはＣａ２^＋およびリン酸脂質の存在下において、第ＩＸ因子と共に、テナーゼ複合体を形成し、次いで、テナーゼ複合体が、第Ｘ因子を、活性化形態であるＸａへと転換する能力を含むがこれらに限定されない。

【0139】

本明細書で使用される治療用タンパク質内のＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩ活性を有する。ＦＶＩＩＩ活性は、当技術分野で公知である、任意の方法により測定される。多数の試験：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭアッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験（また、ＩＮＲを決定するのにも使用される）、フィブリノーゲン試験（クラウス法を介することが多い）、血小板カウント、血小板機能試験（ＰＦＡ－１００を介することが多い）、ＴＣＴ、出血時間、混合試験（患者の血漿が、正常血漿と混合された場合に、異常性が是正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、アンチリン酸脂質抗体、Ｄ－二量体、遺伝子的試験（例えば、第Ｖ因子ライデン突然変異である、プロトロンビン突然変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセルヘビ毒時間（ｄＲＶＶＴ）、その他の血小板機能試験、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）、例えば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、またはユーグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）が、凝固系の機能について評価するのに利用可能である。

【0140】

ａＰＴＴ試験は、「内因性」経路（また、接触活性化経路とも称される）および共通凝固経路の両方の効能を測定する、性能指標である。この試験は、一般に、市販の組換え凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの凝固活性を測定するのに使用される。ａＰＴＴ試験は、外因性経路を測定する、プロトロンビン時間（ＰＴ）と共に使用される。

【0141】

ＲＯＴＥＭ解析は、止血の全動態：凝固時間、凝固物の形成、凝固物の安定性、および溶解についての情報をもたらす。トロンボエラストメトリーにおける、異なるパラメータは、血漿凝固系の活性、血小板機能、線維素溶解、またはこれらの相互作用に影響を及ぼす、多くの因子に依存する。このアッセイは、二次止血についての全体像をもたらしうる。

【0142】

発色アッセイ機構は、活性化ＦＶＩＩＩが、活性化第ＩＸ因子、リン酸脂質、およびカルシウムイオンの存在下において、第Ｘ因子の、第Ｘａ因子への転換を加速化させる、血液凝固カスケードの原理に基づく。第Ｘａ因子活性は、第Ｘａ因子に特異的な、ｐ－ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質の加水分解により評価される。４０５ｎＭにおいて測定される、ｐ－ニトロアニリンの初期放出速度は、第Ｘａ因子活性と正比例するので、サンプル中のＦＶＩＩＩ活性とも正比例する。発色アッセイは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｔｓｉｓ（ＩＳＴＨ）の、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＳＳＣ）の、ＦＶＩＩＩ ａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより推奨されている。１９９４年以来、発色アッセイはまた、ＦＶＩＩＩ濃縮物の効力割当てのための、欧州薬局方による参照法ともなっている。

【0143】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ｍＴＴＲプロモーターにより駆動される、コドン最適化ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列と、合成イントロンとを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、参照によりその全体において組み入れられる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１５８７９号において開示されているヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１５８７９において記載されている遺伝子カセットである、「ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ」である。

【0144】

一部の実施形態では、核酸分子は、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含み、標的配列は、治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質は、増殖因子を含む。増殖因子は、当技術分野で公知である、任意の増殖因子から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、ホルモンである。他の実施形態では、増殖因子は、サイトカインである。一部の実施形態では、増殖因子は、ケモカインである。

【0145】

一部の実施形態では、増殖因子は、アドレノメジュリン（ＡＭ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、アンジオポエチン（Ａｎｇ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、自己分泌型運動因子である。一部の実施形態では、増殖因子は、骨形成性タンパク質（ＢＭＰ）である。一部の実施形態では、ＢＭＰは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ７から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバーである。一部の実施形態では、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバーは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害性因子（ＬＩＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、コロニー刺激因子である。一部の実施形態では、コロニー刺激因子は、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、表皮増殖因子（ＥＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、エフリンである。一部の実施形態では、エフリンは、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、およびエフリンＢ３から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である。一部の実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、ウシ胎仔ソマトトロフィン（ＦＢＳ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、ＧＤＮＦファミリーメンバーである。一部の実施形態では、ＧＤＮＦファミリーメンバーは、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、ペルセフィン、およびアルテミンから選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、増殖分化因子９（ＧＤＦ９）である。一部の実施形態では、増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、ヘパトーマ由来増殖因子（ＨＤＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、インスリンである。一部の実施形態では、増殖因子は、インスリン様増殖因子である。一部の実施形態では、インスリン様増殖因子は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）またはＩＧＦ－２である。一部の実施形態では、増殖因子は、インターロイキン（ＩＬ）である。一部の実施形態では、ＩＬは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、およびＩＬ－７から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、遊走刺激因子（ＭＳＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）または肝細胞増殖因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）である。一部の実施形態では、増殖因子は、ニューレグリンである。一部の実施形態では、ニューレグリンは、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、神経栄養因子である。一部の実施形態では、増殖因子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、神経増殖因子（ＮＧＦ）である。一部の実施形態では、ＮＧＦは、神経栄養因子３（ＮＴ－３）またはＮＴ－４である。一部の実施形態では、増殖因子は、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、形質転換増殖因子である。一部の実施形態では、形質転換増殖因子は、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ－α）またはＴＧＦ－βである。一部の実施形態では、増殖因子は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）である。一部の実施形態では、増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。

【0146】

Ｃ．発現制御配列
一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、少なくとも１つの発現制御配列をさらに含む。本明細書で使用される発現制御配列は、作動可能に連結されたコード核酸の、効率的な転写および翻訳を容易とする、プロモーター配列またはプロモーター－エンハンサーの組合せなど、任意の調節性ヌクレオチド配列である。例えば、本開示の核酸分子は、少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結される。遺伝子発現制御配列は、例えば、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターなど、哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーターでありうる。

【0147】

構成的哺乳動物プロモーターは、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼのためのプロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、および他の構成的プロモーターを含むがこれらに限定されない。真核細胞内で構成的に機能する、例示的なウイルスプロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長鎖末端反復（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルス、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターに由来するプロモーターを含む。当業者には、他の構成的プロモーターも公知である。本開示の遺伝子発現配列に有用なプロモーターはまた、誘導的プロモーターも含む。誘導的プロモーターは、誘導剤の存在下において発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下において、転写および翻訳を促進するように誘導される。当業者には、他の誘導的プロモーターも公知である。

【0148】

一実施形態では、本開示は、組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下における、導入遺伝子の発現を含む。別の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝細胞における、導入遺伝子の発現を選択的に増強する。ある特定の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝細胞、類洞細胞、および／または内皮細胞における、導入遺伝子の発現を選択的に増強する。特定の一実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、内皮細胞における、導入遺伝子の発現を選択的に増強する。ある特定の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、筋細胞、中枢神経系、眼、肝臓、心臓、またはこれらの任意の組合せにおける、導入遺伝子の発現を選択的に増強する。肝臓特異的プロモーターの例は、マウスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ヒトアルファ１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターを含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。ｍＴＴＲプロモーターについては、Ｒ．Ｈ．Ｃｏｓｔａら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：４６９７において記載されている。ＦＶＩＩＩプロモーターについては、ＦｉｇｕｅｉｒｅｄｏおよびＢｒｏｗｎｌｅｅ、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：１１８２８～１１８３８において記載されている。一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーター（例えば、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター）、筋特異的プロモーター（例えば、筋クレアチニンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）プロモーター、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター、およびデスミン（ＤＥＳ）プロモーター）、合成プロモーター（例えば、ＳＰｃ５－１２プロモーター、２Ｒ５Ｓｃ５－１２プロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、およびｔＭＣＫプロモーター）、およびこれらの任意の組合せから選択される。

【0149】

一実施形態では、プロモーターは、マウストランスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、天然ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ヒトアルファ１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、ＴＴＰｐ、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、筋クレアチニンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）プロモーター、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター、デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、２Ｒ５Ｓｃ５－１２プロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、およびｔＭＣＫプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、プロモーターは、ＴＴＰプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、マウストランスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）プロモーターである。

【0150】

治療効能を達成するように、発現レベルは、１つまたはそれ以上のエンハンサーエレメントを使用して、さらに増強される。１つまたはそれ以上のエンハンサーは、単独で施される場合もあり、１つまたはそれ以上のプロモーターエレメントと併せて施される場合もある。典型的に、発現制御配列は、複数のエンハンサーエレメント、および組織特異的プロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサーは、α－１－マイクログロビン／ビクニンエンハンサーの１つまたはそれ以上のコピーを含む（Ｒｏｕｅｔら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２０７６５～２０７７３；Ｒｏｕｅｔら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２３：３９５～４０４；Ｒｏｕｅｔら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４：５７７～５８４；Ｉｌｌら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、８：Ｓ２３～Ｓ３０）。別の実施形態では、エンハンサーは、ＨＮＦ１、（センス）－ＨＮＦ３、（センス）－ＨＮＦ４、（アンチセンス）－ＨＮＦ１、（アンチセンス）－ＨＮＦ６、（センス）－ＥＢＰ、（アンチセンス）－ＨＮＦ４（アンチセンス）を含む、Ｅｎｈ１を伴う、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６などの肝臓特異的転写因子結合性部位に由来する。

【0151】

一実施形態では、本開示の核酸分子は、イントロン配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列に対して５’側に配置される。一部の実施形態では、イントロン配列は、自然発生イントロン配列である。一部の実施形態では、イントロン配列は、合成配列である。一部の実施形態では、イントロン配列は、自然発生イントロン配列に由来する。ある特定の実施形態では、イントロン配列は、ＳＶ４０小型Ｔイントロンを含む。

【0152】

一部の実施形態では、核酸分子は、転写後調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。一部の実施形態では、ＷＰＲＥは、突然変異型である。

【0153】

一部の実施形態では、核酸分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合性部位を含む。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合性部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐに対する、ｍｉＲＮＡ結合性部位である。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合性部位は、Ｒｅｎｎｉｅら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．、１３（６）：５５４～５６０（２０１６）により開示されているｍｉＲＮＡ結合性部位、および、参照によりそれらの全体において本明細書に組み入れられる、ｈｔｔｐ：／／ｓｆｏｌｄ．ｗａｄｓｗｏｒｔｈ．ｏｒｇ／ｓｔａｒｍｉｒＤＢ．ｐｈｐにおいて入手可能である、ＳＴａｒＭｉｒＤＢから選択される。

【0154】

一部の実施形態では、核酸分子は、１つまたはそれ以上のＤＮＡ核ターゲティング配列（ＤＴＳ）を含む。ＤＴＳは、このような配列を含有するＤＮＡ分子の、核への移動を促進する。ある特定の実施形態では、ＤＴＳは、ＳＶ４０エンハンサー配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＴＳは、ｃ－Ｍｙｃエンハンサー配列を含む。一部の実施形態では、ＤＴＳは、第１のＩＴＲと、第２のＩＴＲとの間にある。一部の実施形態では、ＤＴＳは、第１のＩＴＲに対して３’側にあり、かつ、治療用タンパク質に対して５’側にある。他の実施形態では、ＤＴＳは、治療用タンパク質に対して３’側にあり、かつ、第２のＩＴＲに対して５’側にある。

【0155】

一部の実施形態では、核酸分子は、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列をさらに含む。一実施形態では、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列は、ｂＧＨポリ（Ａ）を含む。一実施形態では、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テールは、アクチンポリ（Ａ）部位を含む。一実施形態では、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テールは、ヘモグロビンポリ（Ａ）部位を含む。

【0156】

一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、肝臓へとターゲティングされる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子の発現は、肝細胞へとターゲティングされる。他の実施形態では、導入遺伝子の発現は、内皮細胞へとターゲティングされる。特定の一実施形態では、導入遺伝子の発現は、内因性ＦＶＩＩＩを天然において発現する任意の組織へとターゲティングされる。

【0157】

一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、中枢神経系へとターゲティングされる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子の発現は、ニューロンへとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、求心性ニューロンへとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、遠心性ニューロンへとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、介在ニューロンへとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、グリア細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、星状細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、希突起膠細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、ミクログリアへとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、上衣細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、シュワン細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、サテライト細胞へとターゲティングされる。

【0158】

一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、筋組織へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、平滑筋へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、心筋へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、骨格筋へとターゲティングされる。

【0159】

一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、眼へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、光受容体細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、網膜神経節細胞へとターゲティングされる。

【0160】

ＩＩＩ．宿主細胞
本開示はまた、本開示の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供する。本明細書で使用される、「形質転換」という用語は、広義において、レシピエント宿主細胞への、ＤＮＡの導入であって、遺伝子型を変化させ、結果として、レシピエント細胞の変化をもたらす導入を指すように使用されるものとする。

【0161】

「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ法を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターにより形質転換された細胞を指す。本開示の宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物由来であり；最も好ましくは、ヒト由来またはマウス由来である。当業者は、それらの目的に最も良く適した、特定の宿主細胞株を、優先的に決定する能力を伴うと見なされている。例示的宿主細胞株は、ＣＨＯ、ＤＧ４４、およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣細胞株、ＤＨＦＲ欠失）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓細胞株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を伴う、ＣＶＩ細胞の派生細胞）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓細胞株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３－Ａｇ８．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＮＳ０、ＣＡＰ、ＢＨＫ２１、およびＨＥＫ２９３（ヒト腎臓）を含むがこれらに限定されない。特定の一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＮＳ０細胞、ＣＡＰ細胞、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、昆虫由来である。特定の一実施形態では、宿主細胞は、ＳＦ９細胞である。宿主細胞株は、典型的に、商業サービスである、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公刊された文献から入手可能である。

【0162】

本開示の核酸分子またはベクターの、宿主細胞への導入は、当業者に周知である、多様な技法により達せられる。これらは、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡを伴う細胞融合、マイクロインジェクション、および無傷ウイルスによる感染を含むがこれらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、２４．２章、４７０～４７２頁、「Ｖｅｃｔｏｒｓ」、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．１９８８）を参照されたい。最も好ましくは、宿主へのプラスミド導入は、電気穿孔を介する。形質転換細胞は、軽鎖および重鎖の作製に適切な条件下において増殖させ、重鎖タンパク質および／または軽鎖タンパク質の合成についてアッセイされる。例示的アッセイ法は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞分取解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などを含む。

【0163】

本開示の単離核酸分子またはベクターを含む宿主細胞は、適切な増殖培地中において増殖させる。本明細書で使用される、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖に要求される栄養物質を含有する培地を意味する。細胞の増殖に要求される栄養物質は、炭素供給源、窒素供給源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、および増殖因子を含みうる。場合により、培地は、１つまたはそれ以上の選択因子を含有しうる。場合により、培地は、子ウシ血清またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有しうる。一実施形態では、培地は、実質的に、ＩｇＧを含有しない。増殖培地は、一般に、例えば、ＤＮＡ構築物上の選択用マーカーにより補完されるか、またはＤＮＡ構築物を共トランスフェクトされた、薬物選択または必須栄養物質の欠損により、ＤＮＡ構築物を含有する細胞について選択するであろう。培養された哺乳動物細胞は、一般に、市販の血清含有培地または無血清培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中において増殖させる。一実施形態では、培地は、ＣＤｏｐｔｉＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）である。別の実施形態では、培地は、ＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）である。使用される特定の細胞株に適切な培地の選択は、当業者の水準内にある。

【0164】

ＩＶ．医薬組成物
本開示の核酸分子、核酸分子によりコードされる、ポリペプチド、ベクター、または宿主細胞を含有する組成物は、適切な、薬学的に許容される担体を含有しうる。例えば、組成物は、活性化合物の、作用部位への送達のためにデザインされる製造物への処理を容易とする賦形剤および／または補助剤を含有しうる。

【0165】

一実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書で開示される核酸分子、ベクター、ポリペプチド、または宿主細胞と；（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を対象とする。

【0166】

一部の実施形態では、医薬組成物は、送達剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、送達剤は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、リポソーム、他のポリマー分子、およびエクソソームをさらに含む。

【0167】

本明細書で使用される、「脂質ナノ粒子」とは、分子間力により互いと物理的に会合する、複数の脂質分子を含むナノ粒子を指す。脂質ナノ粒子は、例えば、マイクロスフェア（単相小胞および多層小胞、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相でありうる。

【0168】

一部の実施形態では、本開示は、本発明の核酸分子を封入する脂質ナノ粒子を含みうる、封入核酸分子組成物を提供する。脂質ナノ粒子は、１つまたはそれ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ改変脂質）を含みうる。ある特定の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、１つまたはそれ以上の本発明の核酸分子を、１つまたはそれ以上の標的細胞へと送達するように製剤化される。適切な脂質の例は、限定せずに述べると、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ガングリオシド、およびセレブロシド）を含む。「カチオン性脂質」とは、ある特定のｐＨ（例えば、生理学的ｐＨ）において、正味の正電荷を運ぶ、任意の脂質分子種を指す。

【0169】

ある特定の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、ある特定のＮ／Ｐ比を有する。本明細書で使用される、「Ｎ／Ｐ比」または「ＮＰ比」とは、正帯電性ポリマーアミン基の、負帯電性核酸リン酸基に対する比を指す。脂質ナノ粒子／核酸分子複合体のＮ／Ｐ特徴は、正味の表面電荷、安定性、およびサイズなどの特性に影響を及ぼしうる。本明細書で記載される脂質ナノ粒子のＮＰ比は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、およびこれらの間の任意の比でありうる。例えば、本明細書で記載される脂質ナノ粒子のＮＰ比は、約１８、約３６、または約７２でありうる。

【0170】

したがって、ある特定の実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内に封入された、本開示の核酸分子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。

【0171】

医薬組成物は、ボーラス注射による非経口投与（すなわち、静脈内投与、皮下投与、または筋内投与）のために製剤化される。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプルまたは保存剤を添加された複数回投与用容器により提示される。組成物は、油性媒体中または水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取り、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤など、製剤化剤を含有しうる。代替的に、有効成分は、適切な媒体、例えば、発熱物質非含有水による構成のための粉末形態の場合もある。

【0172】

非経口投与に適する製剤はまた、水溶性形態、例えば、水溶性塩形態にある活性化合物の水溶液も含む。加えて、適切な油性注射用懸濁液としての、活性化合物の懸濁液も投与される。適切な親油性溶媒または媒体は、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドを含む。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘稠度を増大させる物質であって、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、およびデキストランを含む物質を含有しうる。場合により、懸濁液はまた、安定化剤も含有しうる。リポソームもまた、細胞または間質腔への送達のために、本開示の分子を封入するのに使用される。例示的な、薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性である溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、水、生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。一部の実施形態では、組成物は、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、組成物は、保湿剤など、薬学的に許容される物質、または有効成分の保管寿命または効能を増強する、保湿剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤など、少量の補助物質を含む。

【0173】

本開示の組成物は、例えば、液体（例えば、注射用溶液および注入用溶液）剤形、分散液剤形、懸濁液剤形、半固体剤形、および固体剤形を含む、様々な形態でありうる。好ましい形態は、投与方式および治療適用に依存する。

【0174】

組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高薬物濃度に適する、他の秩序構造として製剤化される。滅菌注射用溶液は、有効成分を、適切な溶媒中に、要求量において、要求に応じて、上記で列挙された成分のうちの１つまたは組合せと共に組み込むのに続き、濾過滅菌を行うことにより製造される。一般に、分散液は、有効成分を、塩基性分散媒と、上記で列挙された成分に由来する、他の要求される成分とを含有する滅菌媒体へと組み込むことにより製造される。滅菌注射用溶液を製造するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、あらかじめ滅菌濾過された溶液から、有効成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持される場合もあり、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持することにより維持される場合もあり、界面活性剤を使用することにより維持される場合もある。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。

【0175】

有効成分は、制御放出製剤またはデバイスにより製剤化される。このような製剤およびデバイスの例は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む。生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸が使用される。当技術分野では、このような製剤およびデバイスを製造するための方法が公知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。

【0176】

注射用デポ製剤は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマー中において、薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより作製される。薬物対ポリマー比、および援用されるポリマーの性格に応じて、薬物放出速度が制御される。他の例示的生体分解性ポリマーは、ポリオルトエステルおよびポリ無水物である。注射用デポ製剤はまた、薬物を、リポソーム内またはマイクロエマルジョン内に封入することによっても製造される。

【0177】

組成物へは、補助活性化合物が組み込まれる場合もある。一実施形態では、本開示の核酸分子は、凝固因子、またはその変異体、断片、類似体、もしくは誘導体と共に製剤化される。例えば、凝固因子は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン、フォンウィレブラント因子、もしくは組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）、または前出のうちのいずれかの活性化形態を含むがこれらに限定されない。止血剤の凝固因子はまた、抗フィブリン溶解薬、例えば、イプシロン－アミノカプロン酸、トラネキサム酸も含みうる。

【0178】

投与レジメンは、所望の最適の応答をもたらすように調整される。例えば、単回ボーラスが投与される場合もあり、時間経過にわたり、何回分かに分割された用量が投与される場合もあり、治療状況の緊急性により指し示される通り、用量は、これに応じて、低減される場合もあり、増大される場合もある。投与の容易さ、および投与量の均一性のために、非経口組成物を、単位剤形において製剤化することが有利である。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８０）を参照されたい。

【0179】

活性化合物に加えて、液体剤形は、水、エチルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドルフルルリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルなどの不活性成分を含有しうる。

【0180】

適切な医薬担体の非限定例もまた、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」において記載されている。賦形剤の一部の例は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物はまた、ｐＨ緩衝試薬および保湿剤または乳化剤も含有しうる。

【0181】

経口投与のために、医薬組成物は、常套的手段により製造される、錠剤またはカプセルの形態を取りうる。組成物はまた、液体、例えば、シロップまたは懸濁液としても製造される。液体は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化可食性脂肪）、乳化薬剤（レシチンまたはアカシアガム）、非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）、および保存剤（例えば、メチル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸）を含みうる。製剤はまた、芳香剤、着色剤、および甘味剤も含みうる。代替的に、組成物は、水または別の適切な媒体により構成するための、乾燥生成物として提供される。

【0182】

口腔内投与のために、組成物は、常套的プロトコールに従う、錠剤またはトローチ剤の形態を取りうる。

【0183】

吸入投与のために、本開示に従う使用のための化合物は、賦形剤を伴うか、またはこれを伴わない、噴霧化エアゾールの形態において、または、場合により、高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、または他の適切なガスによる、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレーの形態において送達されると好都合である。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、計量された量を送達するバルブを装備することにより決定される。インヘラーまたは吸入器における使用のための、化合物と、ラクトースまたはデンプンなど、適切な粉末基剤とによる粉末ミックスを含有する、例えば、ゼラチンによるカプセルおよびカートリッジが製剤化される。

【0184】

医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなど、常套的な座剤用基剤を含有する、座剤または停留浣腸として、直腸内投与のためにも製剤化される。

【0185】

一部の実施形態では、組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、および経口投与からなる群から選択される経路により投与される。非経口投与は、静脈内投与または皮下投与でありうる。

【0186】

Ｖ．処置法
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、本明細書で開示される核酸分子、ベクター、ポリペプチド、または医薬組成物を投与する工程を含む方法を対象とする。

【0187】

一部の実施形態では、本開示は、出血障害を処置する方法を対象とする。一部の実施形態では、本開示は、Ａ型血友病を処置する方法を対象とする。

【0188】

単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、静脈内投与、皮下投与、筋内投与されるか、または任意の粘膜表面を介して、例えば、経口、舌下、口腔内、舌下、鼻腔内、直腸内、膣内、または肺内経路を介して投与される。凝固因子タンパク質は、キメラタンパク質の、所望の部位への徐放を可能とする、生体ポリマーによる固体支持体内に植え込まれる場合もあり、これへと連結される場合もある。

【0189】

経口投与のために、医薬組成物は、常套的手段により製造される、錠剤またはカプセルの形態を取りうる。組成物はまた、液体、例えば、シロップまたは懸濁液としても製造される。液体は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化可食性脂肪）、乳化薬剤（レシチンまたはアカシアガム）、非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）、および保存剤（例えば、メチル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸）を含みうる。製剤はまた、芳香剤、着色剤、および甘味剤も含みうる。代替的に、組成物は、水または別の適切な媒体により構成するための、乾燥生成物として提供される。

【0190】

口腔内投与および舌下投与のために、組成物は、常套的プロトコールに従う、錠剤、トローチ剤、または速溶性薄膜の形態を取りうる。

【0191】

吸入投与のために、本開示に従う使用のための、凝固因子活性を有するポリペプチドは、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、または他の適切なガスによる、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレーの形態（例えば、ＰＢＳ中の）において送達されると好都合である。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、計量された量を送達するバルブを装備することにより決定される。インヘラーまたは吸入器における使用のための、化合物と、ラクトースまたはデンプンなど、適切な粉末基剤とによる粉末ミックスを含有する、例えば、ゼラチンによるカプセルおよびカートリッジが製剤化される。

【0192】

一実施形態では、単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドの投与経路は、非経口経路である。本明細書で使用される、「非経口」という用語は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋内投与、皮下投与、直腸内投与、または膣内投与を含む。非経口投与のうちの静脈内形態が好ましい。これらの投与形態の全ては、本開示の範囲内にあることが、明確に想定されるが、投与のための形態は、特に、静脈内注射または動脈内注射または滴下のための注射用溶液であろう。通例、注射に適する医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により、安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含みうる。しかし、本明細書の教示と適合性である、他の方法では、単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、有害な細胞集団の部位へと、直接送達され、これにより、罹患組織の、治療剤への曝露を増大させる。

【0193】

非経口投与のための製造物は、滅菌水溶液または滅菌非水溶液、滅菌水性懸濁液または滅菌非水性懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、または生理食塩液および緩衝媒体を含む懸濁液を含む。本開示では、薬学的に許容される担体は、０．０１～０．１Ｍであり、好ましくは、０．０５Ｍであるリン酸緩衝液、または０．８％の生理食塩液を含むがこれらに限定されない。他の一般的な非経口媒体は、リン酸ナトリウム液、デキストロース加リンゲル液、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油を含む。静脈内媒体は、デキストロース加リンゲル液などに基づく静脈内媒体などの流体および栄養物質補充剤、電解質補充剤を含む。保存剤および例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどなど、他の添加剤もまた存在しうる。

【0194】

より特定すると、注射用使用に適する医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または分散液、および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液の即席製造のための滅菌粉末を含む。このような場合、組成物は、滅菌組成物でなければならず、容易な注射針通過可能性が存在する程度に、流体組成物であるべきである。組成物は、製造条件下および保管条件下において、安定的であるべきであり、好ましくは、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐性であるものとする。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒でありうる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持される場合もあり、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持することにより維持される場合もあり、界面活性剤を使用することにより維持される場合もある。

【0195】

医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなど、常套的な座剤用基剤を含有する、座剤または停留浣腸として、直腸内投与のためにも製剤化される。

【0196】

状態の処置のための、本開示の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者が、ヒトであるのか、動物であるのか、投与される他の医薬、および処置が、予防処置であるのか、治療処置であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変動する。通例、患者は、ヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む、非ヒト哺乳動物もまた、処置される場合がある。処置投与量は、安全性および効能を最適化する、当業者に公知である、規定の方法を使用して滴定される。

【0197】

本開示の核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、場合により、処置（例えば、予防的処置または治療的処置）を必要とする障害または状態の処置において効果的である、他の薬剤と組み合わせて投与される。

【0198】

本明細書で使用された、補助療法を伴うか、またはこれらと組み合わせた、本開示の単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドの投与とは、治療および開示されるポリペプチドの、逐次投与もしくは逐次適用、同時投与もしくは同時適用、併存投与もしくは併存適用、併用投与もしくは併用適用、共時投与もしくは共時適用、または並行投与もしくは並行適用を意味する。当業者は、組合せ療法レジメンの、多様な成分の投与または適用が、処置の効能を増強するようなタイミングでなされることを察知するであろう。当業者（例えば、医師）であれば、効果的な組合せ療法レジメンを、選択された補助療法、および本明細書の教示に基づき、不要な実験を伴わずに、たやすく識別することが可能であろう。

【0199】

本開示の単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、１つまたはそれ以上の薬剤と共に、またはこれらと組み合わせて（例えば、組合せ治療レジメンをもたらすように）使用されることも、さらに察知されるであろう。本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと組み合わされる、例示的薬剤は、処置される特定の障害のための、現行の標準治療を表す薬剤を含む。このような薬剤は、化学物質の場合もあり、天然におけるバイオ医薬品の場合もある。「バイオ医薬品」または「バイオ医薬剤」という用語とは、治療剤としての使用のために意図される、生物および／またはそれらの産物から作製される、任意の薬学的活性剤を指す。

【0200】

本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと組み合わせて使用される薬剤の量は、対象により変動する場合もあり、当技術分野で公知の内容に従い投与される場合もある。例えば、Ｂｒｕｃｅ Ａ Ｃｈａｂｎｅｒら、「Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」、ＧＯＯＤＭＡＮおよびＧＩＬＭＡＮ、「ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ」、１２３３～１２８７（Ｊｏｅｌ Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、９版、１９９６）を参照されたい。別の実施形態では、標準治療と符合する、このような薬剤の量が投与される。

【0201】

一実施形態では、本明細書ではまた、本明細書で開示される核酸分子と、核酸分子を、それを必要とする対象へと投与するための指示書とを含むキットも開示される。本明細書の別の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子を作製するためのバキュロウイルス系が開示される。核酸分子は、昆虫細胞内において作製される。別の実施形態では、発現構築物のためのナノ粒子送達系が提供される。発現構築物は、本明細書で開示される核酸分子を含む。

【0202】

ＶＩ．遺伝子治療
本開示のある特定の態様は、対象において、遺伝子発現構築物を発現させる方法であって、本開示の単離核酸分子を、それを必要とする対象へと投与する工程を含む方法を提供する。一部の態様では、本開示は、対象におけるポリペプチドの発現を増大させる方法であって、本開示の単離核酸分子を、それを必要とする対象へと投与する工程を含む方法を提供する。

【0203】

Ａ型血友病を含むがこれらに限定されない、様々な状態のための可能な処置として探索されている。遺伝子治療は、ベクターの単回投与の後に、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの持続的な内因性産生を介して、疾患を治癒させる、その潜在的可能性のために、血友病のための、特に魅力的な処置である。Ａ型血友病は、その臨床症状が、血漿中において、微量（２００ｎｇ／ｍｌ）で循環する、単一の遺伝子産物（例えば、ＦＶＩＩＩ）の欠如に、完全に帰せられるため、遺伝子置換アプローチに十分に適する。

【0204】

本明細書で記載される、多様な態様、実施形態、および選択肢の全ては、任意の変化形および全ての変化形において組み合わされる。

【0205】

本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許適用が、参照により組み入れられるように、具体的、かつ、個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

【0206】

実施例
前出の開示を提供したが、本明細書で提供される実施例への参照により、さらなる理解が得られる。これらの実施例は、例示だけを目的とするものであり、限定的であることは意図されない。

【実施例1】

【0207】

改変ＧＰＶ ＩＴＲおよび改変Ｂ１９ ＩＴＲのデザインおよび構築
ＡＡＶ２（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＣ＿００１４０１．２）、ディペンドウイルスＧＰＶ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：Ｕ２５７４９．１）、およびエリスロウイルス属Ｂ１９（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＫＹ９４０２７３．１）のＩＴＲ配列について解析した。この解析に基づき、ＧＰＶ ＩＴＲおよびＢ１９ ＩＴＲのうちのどの核酸配列が、改変ＩＴＲを保有する遺伝子的構築物による真核細胞の持続的形質導入のために要求されるのかについて探索するように、野生型ＧＰＶ ＩＴＲおよび野生型Ｂ１９ ＩＴＲの改変誘導体をデザインした。例示的改変ＩＴＲの核酸配列を、表２に提示する。改変ＩＴＲの各々について予測されるＤＮＡ構造を、図４～９に示す。

【0208】

配列番号１～８の改変ＩＴＲ配列は、野生型Ｂ１９ ＩＴＲの切断型誘導体である。切断型Ｂ１９ ＩＴＲ誘導体の予測構造についてのグラフ描示を、図１Ａおよび２Ａに示す。配列番号９～１６の改変ＩＴＲ配列は、野生型ＧＰＶ ＩＴＲの切断型誘導体である。切断型ＧＢＶ ＩＴＲ誘導体の予測構造についてのグラフ描示を、図１Ｂおよび２Ｂに示す。野生型ＩＴＲのヘアピン構造を維持し、配列内の、Ｒｅｐ結合性エレメント（ＲＢＥ）のうちの１つまたはそれ以上を保存するように、これらの切断型ＩＴＲをデザインした。これらの配列内において除去された塩基は、ＲＢＥと、ヘアピンの他の側における、それらの対応する結合パートナーを伴うダイアドとの間に配置されたヌクレオチドである。配列番号１～１６の改変ＩＴＲ配列は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性および効能のほか、製造可能性および産物安定性の改善に寄与することが予測される範囲のヘアピン長および熱力学的安定性を有する。

【0209】

配列番号１および２の改変ＩＴＲ配列（Ｂ１９＿ｍｉｎ）は、Ｂ１９ ＩＴＲ配列の、さらなる切断を含有する。誘導体であるＢ１９＿ｍｉｎ ＩＴＲの予測構造についてのグラフによる描示を、図２Ａに示す。

【0210】

配列番号１５および１６の改変ＩＴＲ配列（ＧＰＶ＿ｍｉｎ）は、ＲＢＥの間にあるが、これに寄与しないヌクレオチドを除去する、ＧＰＶ ＩＴＲ配列の、さらなる切断を含有する。誘導体であるＧＰＶ＿ｍｉｎ ＩＴＲの予測構造についてのグラフによる描示を、図２Ｂに示す。

【0211】

配列番号１７～２２の改変ＩＴＲ配列は、デノボの合成および後続のクローニングの試みを改善するために、ダイアドにおいて、追加のヌクレオチドが挿入された、切断型ＩＴＲ配列を含有する。

【0212】

ＩＴＲ内において保持されたＲＢＥの存在に起因して、これらの改変誘導体ＩＴＲを保有する遺伝子発現構築物は、機能を維持し、真核細胞を効果的に形質導入することが仮定された。

【実施例2】

【0213】

改変ＩＴＲを伴うＦＶＩＩＩ発現構築物の作出
遺伝子構築物は、コドン最適化ＦＶＩＩＩを、ｍＴＴＲプロモーターおよび合成イントロンと共に含む、ＦＶＩＩＩ遺伝子カセットをコードするプラスミドを使用して創出した。

【0214】

５’側ＩＴＲ位置または３’側ＩＴＲ位置の一方または両方において、配列番号１～２２に示された改変ＩＴＲにより挟まれた、コドン最適化ＦＶＩＩＩ遺伝子カセットを含む、新規構築物を作出した。例示的構築物および改変ＩＴＲ対を、表１に示す。

【0215】

これらの新規構築物は、十字型ＤＮＡ構造を認識し、消失させる、エクソヌクレアーゼをコードする、欠失型ｓｂｃＣ遺伝子を含有する大腸菌株ＰＭＣ１０３内において増殖され、維持された。ＰＭＣ１０３大腸菌は、細菌培養物の温度および増殖条件を最適化した後に、改変ＩＴＲを伴う、コドン最適化ＦＶＩＩＩ構築物の増殖を支援することが可能であった。全ての新規構築物は、アンピシリン耐性プレート上において選択し、正確な遺伝子構造を確認するように、制限酵素マッピングによりスクリーニングした。改変ＩＴＲはまた、制限消化およびゲル抽出の後に、サンガーシーケンシングにもかけた。

【0216】

【表1】

【実施例3】

【0217】

改変ＩＴＲにより挟まれた、ＦＶＩＩＩ発現カセットを含有する、一本鎖ＤＮＡ断片の製造
コドン最適化ＦＶＩＩＩ発現カセットを挟む、ＩＴＲ領域内における、ヘアピン構造の形成が、標的細胞の持続的形質導入を駆動することを仮定した。各プラスミド構築物について、ヘアピンＩＴＲ構造が形成された一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ断片は、ＰｖｕＩＩ消化またはＬｇｕＩ消化による二本鎖ＤＮＡ断片産物（ＦＶＩＩＩ発現カセットおよびプラスミド骨格）を、９５℃で変性させ、次いで、４℃で冷却して、回文ＩＴＲ配列が、ヘアピンを形成することを可能とすることにより作出した。

【実施例4】

【0218】

Ｂ１９ ｍｉｎｉｍａｌ ＩＴＲのｓｓＤＮＡ構築物およびｄｓＤＮＡ構築物からの、ＦＶＩＩＩ発現についての、ｉｎ ｖｉｖｏにおける査定
改変ＩＴＲ領域を保有する発現構築物が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、持続的導入遺伝子発現を媒介する能力を検証するために、流体力学的注射（ＨＤＩ）を介して、Ｂ１９ ｍｉｎｉｍａｌ ＩＴＲ（５’側ＩＴＲ：配列番号１および３’側ＩＴＲ：配列番号２）により挟まれた、コドン最適化ＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含有する、ｐＦＶＩＩＩ．Ｂ１９＿ｍｉｎ構築物のＤＮＡ ３４．７ｕｇを、８～１２週齢の雄血友病（ＨｅｍＡ）マウスへと、全身送達した。ＤＮＡは、ヘアピンがあらかじめ形成されていない二本鎖（ｄｓＤＮＡ）フォーマットで、または実施例３で製造された通り、ＩＴＲヘアピンがあらかじめ形成された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）として投与した。血漿サンプルは、注射の３日後および７日間後に、実験動物から回収した。血液中の血漿ＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ活性発色アッセイにより解析した。

【0219】

図３に示される通り、注射の３日後および７日間後における、血漿中ＦＶＩＩＩレベルの解析は、ｓｓＤＮＡが、ｄｓＤＮＡより高レベルのＦＶＩＩＩをもたらすことを明らかにした。７日目に、ｓｓＤＮＡからのＦＶＩＩＩレベルは、安定を維持したが、ｄｓＤＮＡからのＦＶＩＩＩレベルは、約３０％低下した。１４日目に、ＦＶＩＩＩレベルは、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡのいずれについても、ゼロに近かった。１４日目におけるサンプルについてのＥＬＩＳＡは、全てのマウスにおいて、抗ＦＶＩＩＩ抗体（阻害剤）の存在を明らかにした。理論に束縛されずに述べると、１４日目におけるゼロ近傍のレベルは、おそらく、生理学的レベルを超えるＦＶＩＩＩの発現レベルに起因して形成された、抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在のためでありうる。本実施例は、Ｂ１９ ＩＴＲなどの改変ＩＴＲを含有する、ｓｓＤＮＡ構築物およびｄｓＤＮＡ構築物が、ＦＶＩＩＩを発現させうることを裏付ける。

【実施例5】

【0220】

ｓｓＤＮＡ構築物からの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子発現についての査定
改変ＩＴＲにより挟まれたコドン最適化ＦＶＩＩＩ発現カセットを含むｓｓＤＮＡ構築物の機能性を検証するために、各ｓｓＤＮＡ構築物について、ｓｓＦＶＩＩＩ．Ｂ１９＿ｍｉｎ構築物と同様に、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて調べた（実施例４を参照されたい）。例示的ＩＴＲ配列は、表２において、配列番号１～２２として示されたセットである。ＧＰＶおよびＢ１９による、野生型ＩＴＲおよび改変ＩＴＲの組合せを作出し、調べた。

【0221】

実施例３の通りに、フランキングの改変ＩＴＲを伴う、コドン最適化ＦＶＩＩＩ発現構築物から、一本鎖ＤＮＡを作出し、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウス（５～１２週齢）において、コドン最適化ＦＶＩＩＩ発現カセット内のｍＴＴＲプロモーターにより駆動される、肝臓指向性ＦＶＩＩＩ発現について調べた。ヒトＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスに、流体力学的注射（ＨＤＩ）を介して、前述の発現カセットを含有するｓｓＤＮＡ １０、２０、３７、５０μｇ、または他の所定の数量を注射し、ＦＶＩＩＩを、注射の１、３、７、１４、２１、および２８日後、または他の所定の時間間隔で回収されたマウス血漿から測定した。改変ＩＴＲを伴う、これらの発現カセットを投与されたマウスにおける、ＦＶＩＩＩ発現および寿命を、Ｂ１９Δ１３５ ＩＴＲ、ＧＰＶΔ１６２ ＩＴＲ、および／または対応する野生型ＩＴＲ発現カセットを伴うｓｓＤＮＡ構築物を投与されたマウスにおける、ＦＶＩＩＩ発現および寿命と直接比較した。血液中のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ活性発色アッセイにより解析した。

【実施例6】

【0222】

改変ＩＴＲを保有する、ｃｅＤＮＡ発現構築物を作出する、バキュロウイルス発現系の使用
クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）発現カセットの全身送達は、肝細胞の持続的形質導入を確立し、肝臓内における、長期間にわたる、安定的な導入遺伝子の発現を駆動することが裏付けられている。形質導入効率および遺伝子発現について調べるために、ＷＯ２０２０／０３３８６３号の実施例１Ｄに記載されているバキュロウイルス発現系を、昆虫細胞内における、クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子の形態にある改変ＩＴＲを保有する遺伝子構築物のための、ＦＶＩＩＩ発現カセットの作製のために使用した。このバキュロウイルス発現系は、Ｌｉら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８（８）：ｅ６９８７９（２０１３）において記載されている系に基づく。

【実施例7】

【0223】

ＨｅｍＡマウスにおける、改変ＩＴＲを保有するｃｅＤＮＡ構築物からの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子発現についての査定
改変５’側ＩＴＲと、改変３’側ＩＴＲとにより挟まれた、最適化ＦＶＩＩＩ発現カセットを含有するｃｅＤＮＡ構築物について、ｐＦＶＩＩＩ．Ｂ１９＿ｍｉｎ構築物と同様に、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて調べた（実施例４を参照されたい）。例示的ＩＴＲ配列は、表２において、配列番号１～２２として示されたセットである。ｃｅＤＮＡ構築物は、実施例６において記載されている通りに作出した。

【0224】

フランキングの改変ＩＴＲを伴う、コドン最適化ＦＶＩＩＩ発現構築物に由来するｃｅＤＮＡを、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウス（５～１２週齢）において、肝臓指向性ＦＶＩＩＩ発現について調べた。ヒトＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスに、流体力学的注射（ＨＤＩ）を介して、前述の発現カセットを含有するｃｅＤＮＡ １０、２０、３７、５０μｇ、または他の所定の数量を注射し、ＦＶＩＩＩを、注射の１、３、７、１４、２１、および２８日後、または他の所定の時間間隔で回収されたマウス血漿から測定した。改変ＩＴＲを伴う、これらの発現カセットを投与されたマウスにおける、ＦＶＩＩＩ発現および寿命を、Ｂ１９Δ１３５ ＩＴＲ、ＧＰＶΔ１６２ ＩＴＲ、および／または対応する野生型ＩＴＲ発現カセットを伴うｃｅＤＮＡ構築物を投与されたマウスにおける、ＦＶＩＩＩ発現および寿命と直接比較した。血液中のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ活性発色アッセイにより解析した。

【実施例8】

【0225】

Ｂ１９由来のＩＴＲまたはＧＰＶ由来のＩＴＲを保有する、レポーター遺伝子構築物の作出
改変ＩＴＲベースの遺伝子発現系の、遺伝子治療適用における一般的使用のためのプラットフォームとしての有用性を裏付けるために、改変５’側ＩＴＲと、改変３’側ＩＴＲとにより挟まれた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼ（ｌｕｃ）により、レポーター構築物を含む発現カセットを作出した。実施例２と同じ手順を使用した。しかし、コドン最適化ＦＶＩＩＩ発現カセット内のＦＶＩＩＩのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、常套的な分子クローニング法により、ＧＦＰまたはｌｕｃのＯＲＦで置き換えた。

【0226】

フェニルケトン尿症についての関与性のマウスモデルにおける、ＰＡＨの発現および血液フェニルアラニン濃度の低減について査定するのに使用される、マウスフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）導入遺伝子を含有する、改変ＩＴＲにより挟まれた発現カセットもまた作出した。このモデルを使用して、肝臓内における発現のために、流体力学的注射（ＨＤＩ）を介して、ＰＫＵマウスに、改変ＩＴＲにより挟まれたｓｓＤＮＡ ２００μｇを投与した。３、７、１４、２８、４２、５６、７０、および８１日後に、血液サンプルを回収し、フェニルアラニン濃度の決定のために、血漿を単離した。肝臓内における、マウスＰＡＨタンパク質の存在を確認するために、注射後８１日目において、処置マウスから採取された肝臓溶解物に対して、ウェスタンブロット法を実施した。

【実施例9】

【0227】

改変ＩＴＲを保有するｓｓＤＮＡレポーター遺伝子構築物の製造
ｓｓＤＮＡによるレポーター構築物またはＰＡＨ構築物は、実施例３において記載されている通りに製造した。略述すると、プラスミドは、制限酵素である、ＬｇｕＩ、ＭｓｃＩ、およびＥｃｏ５３ｋＩにより消化した。ヘアピンＩＴＲ構造が形成されたｓｓＤＮＡ断片は、制限酵素消化による二本鎖ＤＮＡ断片産物（レポーター発現カセットおよびプラスミド骨格）を、９５℃で変性させ、次いで、４℃で冷却して、回文ＩＴＲ配列が、ヘアピンを形成することを可能とすることにより作出した。結果として得られるｓｓＤＮＡ構築物は、マウスにおいて、レポーター遺伝子またはＰＡＨの検出により、肝臓、筋組織、眼内の光受容体、中枢神経系（ＣＮＳ）、または他の組織の持続的形質導入を確立する能力について調べられる。

【実施例10】

【0228】

ｓｓＤＮＡ媒介レポーター発現についての、ｉｎ ｖｉｖｏにおける査定
実施例１３に記載されたｓｓＤＮＡレポーター構築物が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、導入遺伝子の持続的発現を媒介する能力を検証するために、５～１２週齢のマウス（群１つ当たりの動物少なくとも４匹）の標的組織へと、マウス１匹当たりのレポーターｓｓＤＮＡ ５、１０、または２０μｇを、全身注射および／または局所注射した。血液サンプルは、所定の時点において回収し、レポーター導入遺伝子のレベルは、常套的技法を使用して検出および／または測定した。

【実施例11】

【0229】

操作パルボウイルスＩＴＲを伴う、改変Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセット
導入遺伝子の発現レベルは、ｃＤＮＡを、標的宿主のためにコドン最適化することにより上昇させることを仮定した。米国公開第２０１９０１８５５４３号において記載されている、既往の研究では、Ｖ１．０ ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットからの、生理学的レベルのＦＶＩＩＩ発現が、裏付けられている。しかし、導入遺伝子の発現レベルをさらに改善し、免疫原性を低減するために、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを、パルボウイルスＩＴＲと共にコードするＤＮＡベクターに対して惹起される自然免疫応答を回避するように、ＣｐＧリピートを欠失させて、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃＤＮＡをコドン最適化した。エンハンサーエレメント（Ａ１ＭＢ２）を伴う、肝臓特異的改変マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター（ｍＴＴＲ４８２）、ハイブリッド合成イントロン（キメライントロン）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルの調節下にある、ＸＴＥＮ １４４ペプチド（ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）と融合された、Ｂドメイン欠失型（ＢＤＤ）コドン最適化ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＢＤＤｃｏＦＶＩＩＩ）を含む、改変Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを作出した。Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットは、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む。例示的Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットについてのグラフ描示を、図１０に示す。

【0230】

初期ｉｎ ｖｉｖｏ効能研究は、Ｖ１．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットと比較した、ＦＶＩＩＩ活性の有意な改善を示した（データは示さない）。こうして、ＩＴＲが、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを挟んでいるように、ＡＡＶ２ ＷＴ（図１０Ａ）、ＨＢｏＶ１ ＷＴ（配列番号２５、配列番号２６）（図１０Ｂ）、Ｂ１９ ＷＴ（配列番号２３、配列番号２４）、Ｂ１９ Ｍｉｎｉｍａｌ（配列番号１、配列番号２）（図１０Ｃ）、およびＧＰＶΔ１８６ ＩＴＲ（配列番号９、配列番号１０）、ＧＰＶΔ１２０ ＩＴＲ（配列番号１３、配列番号１４）、またはＧＰＶ Ｍｉｎｉｍａｌ ＩＴＲ（配列番号１５、配列番号１６）（図１０Ｄ）を含む、操作パルボウイルスＩＴＲをクローニングした。一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡまたはクローズドエンド（ｃｅ）ＤＮＡの形態にある、異なるパルボウイルスＩＴＲを伴う、改変Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける機能性はまた、下記に示される通り、流体尾静脈注射を介する全身投与により、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいても裏付けられている。

【実施例12】

【0231】

ｉｎ ｖｉｖｏにおける、一本鎖ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）ＤＮＡについての査定
ＩＴＲ領域内において形成されたヘアピンは、長期間にわたる、持続的な導入遺伝子の発現を、高レベルにおいて駆動することを仮定した。改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの機能性を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて検証するために、操作パルボウイルスＩＴＲを伴う、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ遺伝子カセットを含む、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて調べた。これらのマウスは、軽度のＡ型血友病を伴う患者において、高頻度で観察される突然変異を保有する、改変ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ｃＤＮＡの発現を駆動する、マウスアルブミン（Ａｌｂ）プロモーターを伴うようにデザインされた、ヒトＦＶＩＩＩ－Ｒ５９３Ｃ導入遺伝子を含有する。これらのマウスはまた、ＦＶＩＩＩ遺伝子のノックアウトも保有し、内因性ＦＶＩＩＩタンパク質について欠損性である。これらの二重突然変異体マウスは、ヒトＦＶＩＩＩの注射に対して忍容性であり、ＦＶＩＩＩ活性を有さない。これらの二重突然変異体マウスは、ヒトＦＶＩＩＩによる処置の後に、阻害性抗体をごく微量しか産生せず、ＦＶＩＩＩ応答性であるＴ細胞またはＢ細胞を欠く。ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスについては、Ｂｒｉｌら（２００６）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、９５（２）：３４１～７においてさらに記載されている。

【0232】

異なるパルボウイルスＩＴＲを伴うｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮは、ＩＴＲ類縁配列を認識し、平滑末端ＤＮＡをもたらす制限酵素により、プラスミドＤＮＡ構築物を消化することにより作出した。消化による二本鎖ＤＮＡ産物（ＦＶＩＩＩ発現カセットおよびプラスミド骨格）を、９５℃で熱変性させる（変性）のに続き、４℃で冷却して（再生）、回文ＩＴＲ配列が、ヘアピンを形成することを可能とした（図１１）。次いで、流体尾静脈注射を介して、結果として得られるｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｓｓＤＮＡ）を、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて、２００、８００、または１６００μｇ／ｋｇで、全身投与した。血漿サンプルは、注射されたマウスから、表示の間隔で、５．５ヶ月間にわたり回収し、ＦＶＩＩＩ活性は、製造元の指示書に従う、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイにより測定した。

【0233】

ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射された動物について、正常のパーセントに照らして正規化された、血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図１２に示す。結果は、全ての被験パルボウイルスＩＴＲにおいて、レベルは変動するが、長期間にわたる、持続的なＦＶＩＩＩＸＴＥＮの発現を示した。ＧＰＶ ＩＴＲまたはハイブリッドＧＰＶ ＩＴＲの、全ての被験変異体は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの発現レベルの、他のパルボウイルスＩＴＲと比較した持続的低下を示した。これに対して、ＨＢｏＶ１ ＩＴＲおよびＢ１９ ＩＴＲが、５６日目まで、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの初期低下を示し、次いで、１６８日目までを通して安定化したことは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ導入遺伝子の、ＩＴＲ依存的存続を示唆する。ＧＰＶ ＩＴＲと異なり、Ｂ１９ ＩＴＲおよびＨＢｏＶ１ ＩＴＲのいずれも、被験変異体に関わらず、有意に高レベルのＦＶＩＩＩ発現を示した。異なる被験パルボウイルスＩＴＲの中で、ＨＢｏＶ１ ＩＴＲは、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて、正常ＦＶＩＩＩ活性に対して、有意に高レベル（＞１０００％）を示した（図１０Ｂ）。これらの結果は、異なるパルボウイルスＩＴＲを伴う、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの機能性を検証し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＩＴＲ依存的安定性のほか、導入遺伝子発現の持続を裏付ける。

【実施例13】

【0234】

ｉｎ ｖｉｖｏにおける、クローズドエンドＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）ＤＮＡについての査定
ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｓｓＤＮＡ）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの発現において効果的であったが、非ウイルス性遺伝子治療用ベクターとして使用されるｓｓＤＮＡと関連する、いくつかの限界が存在する。それらのうちの１つは、大腸菌内の選択および増幅に必要とされる、抗生剤耐性遺伝子および原核生物複製起点などの外来配列もまた含有する、プラスミドＤＮＡを作出するために使用される、原核生物宿主（大腸菌）に起因する、内毒素夾雑のレベルである。これらの難題および限界に取り組むため、パルボウイルスＩＴＲを伴う、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットから構成されるクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の形態にあるＤＮＡ治療剤原薬を作出するように、真核細胞ベースの系を開発した。ｃｅＤＮＡによる遺伝子の組織化は、組換えＡＡＶベクターＤＮＡに相似するが、コンフォメーションが異なる。

【0235】

このＤＮＡベクターを作出するために、バイオ医薬品の製造のために、広範に使用され、ＦＤＡにより承認されている、インフルエンザワクチン製造のための、唯一のプラットフォームである、バキュロウイルス昆虫細胞株を利用した。米国特許出願第６３／０６９，０７３号において記載されている通り、ｃｅＤＮＡ作製の３つの異なる手法を、バキュロウイルス系において援用した。出発材料（ＳＭ）と比較して、ＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＷＴ ＩＴＲにより挟まれた、改変Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードする、精製ｃｅＤＮＡについての例示的アガロースゲル画像を、図１３Ａに示す。

【0236】

ｃｅＤＮＡから発現される、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの機能性を検証するために、流体尾静脈注射を介して、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮを、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて、それぞれ、１２μｇ、４０μｇ、および８０μｇ／ｋｇと同等である、マウス１匹当たり０．３μｇ、１．０μｇ、または２．０μｇで、全身注射した。注射されたマウスからの血漿サンプルは、表示の間隔で回収し、ＦＶＩＩＩ活性は、上記で記載された、発色アッセイにより測定した。

【0237】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射された動物について、正常のパーセントに照らして正規化された、血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図１３Ｂに示す。結果は、ＨｅｍＡマウスにおいて、用量依存的応答を示し、ＦＶＩＩＩ発現は、被験最高用量のＡＡＶ２ ｃｅＤＮＡまたはＨＢｏＶ１ ｃｅＤＮＡいずれにおいても、生理学的レベルを超えるレベル（正常レベルの＞５００％）が観察された。しかし、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２ ＩＴＲ注射コホートでは、注射後１４０日目まで、ＦＶＩＩＩ発現の段階的低下が観察されたが、その後、レベルが安定化した。興味深いことに、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１ ＩＴＲについて観察されたＦＶＩＩＩ発現レベルは、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２ ＩＴＲを注射されたコホートにおいて観察された傾向と同様の傾向を示した。

【0238】

これらのｉｎ ｖｉｖｏ効能研究は、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＤＮＡの機能性を検証し、パルボウイルスＩＴＲが、バキュロウイルス昆虫細胞株において、目的の導入遺伝子をコードする、機能的非ウイルス性遺伝子治療用ベクターを作製するのに使用されることの概念を実証する。

【0239】

配列

【0240】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【表2-12】

【表2-13】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】