特表 2024-532262 最適化第ＶＩＩＩ因子遺伝子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-05

(54)【発明の名称】最適化第ＶＩＩＩ因子遺伝子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20240829BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 14/755 20060101ALI20240829BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240829BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K14/755

C12P21/02 C

A61P7/04

A61K31/7088

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024512006

(86)(22)【出願日】2022-08-22

(85)【翻訳文提出日】2024-04-10

(86)【国際出願番号】 US2022075282

(87)【国際公開番号】W WO2023028456

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】63/236,225

(32)【優先日】2021-08-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512147244

【氏名又は名称】バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】アジャイ・メゴディア

(72)【発明者】

【氏名】トンヤオ・リウ

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ・ザカス

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064BJ12

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA08

4B064CA09

4B064CA10

4B064CA11

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA86X

4B065AA87X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086NA13

4C086ZA53

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA66

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、コドン最適化第ＶＩＩＩ因子配列、コドン最適化第ＶＩＩＩ因子配列を含むベクターおよび宿主細胞、コドン最適化第ＶＩＩＩ因子配列によりコードされるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを作製する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号９と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を伴うポリペプチドをコードする、単離核酸分子。

【請求項2】

ヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の単離核酸分子。

【請求項3】

ヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である、請求項１に記載の単離核酸分子。

【請求項4】

配列番号９のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子活性を伴うポリペプチドをコードする、単離核酸分子。

【請求項5】

ヌクレオチド配列は、配列番号９のヌクレオチド５８～４８２４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項6】

ヌクレオチド配列は、配列番号９のヌクレオチド５８～４８２４を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項7】

ヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項8】

ヌクレオチド配列は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項9】

ヌクレオチド配列は、配列番号３２と比べて少数のＣｐＧモチーフを含有するようにコドン最適化されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項10】

配列番号３３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を伴うポリペプチドをコードする、単離核酸分子。

【請求項11】

ヌクレオチド配列は、配列番号３３と少なくとも９０％同一である、請求項１０に記載の単離核酸分子。

【請求項12】

ヌクレオチド配列は、配列番号３３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である、請求項１０に記載の単離核酸分子。

【請求項13】

配列番号３３のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子活性を伴うポリペプチドをコードする、単離核酸分子。

【請求項14】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、配列番号１４と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。

【請求項15】

遺伝子カセットは、配列番号１４と少なくとも約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の単離核酸分子。

【請求項16】

遺伝子カセットは、配列番号１４と少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の単離核酸分子。

【請求項17】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。

【請求項18】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、配列番号３５と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。

【請求項19】

遺伝子カセットは、配列番号３５と少なくとも約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の単離核酸分子。

【請求項20】

遺伝子カセットは、配列番号３５と少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の単離核酸分子。

【請求項21】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。

【請求項22】

（ａ）配列番号９または配列番号３３と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ヌクレオチド配列の転写を制御するプロモーター；および
（ｃ）転写終結配列
を含む、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子。

【請求項23】

プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである、請求項２２に記載の単離核酸分子。

【請求項24】

プロモーターは、マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである、請求項２２～２３のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項25】

プロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項26】

プロモーターは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項27】

プロモーターは、ヒトアルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターである、請求項２３に記載の単離核酸分子。

【請求項28】

プロモーターは、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の単離核酸分子。

【請求項29】

転写終結配列は、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列である、請求項１８～２８のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項30】

転写終結配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナル配列である、請求項１８～２３のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項31】

転写終結配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項１８～２４のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項32】

エンハンサーエレメントをさらに含む、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項33】

エンハンサーエレメントは、Ａ１ＭＢ２エンハンサーエレメントである、請求項２６に記載の単離核酸分子。

【請求項34】

Ａ１ＭＢ２エンハンサーエレメントは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項２６または２７に記載の単離核酸分子。

【請求項35】

イントロン配列をさらに含む、請求項１４～２４のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項36】

イントロン配列は、キメライントロン、ハイブリッドイントロン、または合成イントロンである、請求項２５に記載の単離核酸分子。

【請求項37】

イントロン配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項２５または２６に記載の単離核酸分子。

【請求項38】

転写後調節エレメントをさらに含む、請求項１８～３１のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項39】

転写後調節エレメントは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項３２に記載の単離核酸分子。

【請求項40】

ＷＰＲＥは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の単離核酸分子。

【請求項41】

遺伝子カセットを挟む、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）および第２のＩＴＲをさらに含む、請求項１８～３４のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項42】

第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、パルボウイルス科のメンバーに由来する、請求項３５に記載の単離核酸分子。

【請求項43】

第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）、ヒトエリスロウイルス（Ｂ１９）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、これらの変異体、またはこれらの組合せに由来する、請求項３５または３６に記載の単離核酸分子。

【請求項44】

第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１、２、または２１～３０と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の単離核酸分子。

【請求項45】

第１のＩＴＲは、配列番号１と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、第２のＩＴＲは、配列番号２と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の単離核酸分子。

【請求項46】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、５’側から３’側へと、
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド配列を含むＡ１ＭＢ２エンハンサーエレメント；
（ｂ）配列番号１６のヌクレオチド配列を含む肝臓特異的改変マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター；
（ｃ）配列番号１７のヌクレオチド配列を含むキメライントロン；
（ｄ）配列番号９または配列番号３３と少なくとも８５％同一である核酸配列を含むＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１８のヌクレオチド配列を含むウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）；および
（ｆ）配列番号１９のヌクレオチド配列を含むウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナル
を含む、単離核酸分子。

【請求項47】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、５’側から３’側へと、
（ａ）配列番号３６のヌクレオチド配列を含むヒトアルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター；
（ｂ）配列番号１７のヌクレオチド配列を含むキメライントロン；
（ｃ）配列番号９または配列番号３３と少なくとも８５％同一である核酸配列を含むＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１８のヌクレオチド配列を含むウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）；および
（ｅ）配列番号１９のヌクレオチド配列を含むウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナル
を含む、単離核酸分子。

【請求項48】

遺伝子カセットを挟む、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲをさらに含み、第１のＩＴＲは、配列番号１と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、第２のＩＴＲは、配列番号２と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項４６または４７に記載の単離核酸分子。

【請求項49】

請求項１～４８のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項50】

請求項１～４８のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項４２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項51】

請求項５０に記載の宿主細胞により作製されるポリペプチド。

【請求項52】

昆虫細胞内において作製される、請求項１～４８のいずれか１項に記載の核酸分子を作製するためのバキュロウイルス系。

【請求項53】

ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドを作製する方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドが作製される条件下において請求項５０に記載の宿主細胞を培養する工程、およびＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドを回収する工程を含む方法。

【請求項54】

請求項１～４８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む医薬組成物。

【請求項55】

請求項４９に記載のベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項56】

請求項１～４８のいずれか１項に記載の核酸分子と、核酸分子を、それを必要とする対象へと投与するための指示書とを含むキット。

【請求項57】

対象におけるＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドの発現を増大させる方法であって、配列番号９、配列番号３３、配列番号３５、または配列番号１４と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与する工程を含む方法。

【請求項58】

対象における出血障害を処置する方法であって、配列番号９、配列番号３３、配列番号３５、または配列番号１４と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与する工程を含む方法。

【請求項59】

対象における出血障害を処置する方法であって、請求項５４または５５に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。

【請求項60】

出血障害は、Ａ型血友病である、請求項５８または５９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる、２０２１年８月２３日に出願された、米国特許仮出願第６３／２３６，２２５号に対する優先権を主張する。

【0002】

電子的に提出された配列表への言及
ＸＭＬフォーマットにより電子的に提出された配列表（名称：ＳＡ９－４８４＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ；サイズ：１１７，２４０バイト；作成日：２０２２年８月２２日）の内容は、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる。

【背景技術】

【0003】

廉価な組換えＦＶＩＩＩタンパク質を患者に提供する際の主要な障害は、市販品の高価格である。異種発現系における、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現は不良であり、サイズが同程度のタンパク質２～３桁低度である（非特許文献１）。ＦＶＩＩＩの発現不良は、ＦＶＩＩＩコード配列内の、転写サイレンサーエレメント（非特許文献２）、マトリックス結合領域様配列（ＭＡＲ）（非特許文献３）、および転写伸張阻害エレメント（非特許文献４）など、ＦＶＩＩＩの発現を阻害するシス活性化エレメントの存在に部分的に起因する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｌｙｎｃｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、４：２５９～７２（１９９３）

【非特許文献2】Ｈｏｅｂｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、８５：２４４７～２４５４（１９９５）

【非特許文献3】Ｆａｌｌｕｘら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１６：４２６４～４２７２（１９９６）

【非特許文献4】Ｋｏｅｂｅｒｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、６：４６９～４７９（１９９５）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、当技術分野では、異種系内において効率的に発現するＦＶＩＩＩ配列に対する必要が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドをコードする、コドン最適化核酸分子が開示される。

【0007】

本明細書のある特定の態様では、配列番号９と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を伴うポリペプチドをコードする、単離核酸分子が開示される。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも５０％同一である。

【0008】

本明細書ではまた、配列番号９のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子活性を伴うポリペプチドをコードする、単離核酸分子も開示される。

【0009】

本明細書ではまた、配列番号９のヌクレオチド５８～４８２４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も開示される。一部の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号９のヌクレオチド５８～４８２４を含む。

【0010】

本明細書のある特定の態様では、配列番号３３と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を伴うポリペプチドをコードする、単離核酸分子が開示される。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３３と少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３３と少なくとも５０％同一である。

【0011】

一部の実施形態では、本明細書で開示される単離核酸分子は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

【0012】

一部の実施形態では、本明細書で開示される単離核酸分子は、配列番号３２より少数のＣｐＧモチーフを含有するようにコドン最適化されている。一部の実施形態では、本明細書で開示される単離核酸分子は、配列番号３２と比べて欠失した、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを有する。

【0013】

本明細書の別の態様では、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、配列番号１４と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子が開示される。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１４と少なくとも約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１４と少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１４と少なくとも５０％同一である。

【0014】

本明細書ではまた、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子も開示される。

【0015】

本明細書の別の態様では、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、配列番号３５と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子が開示される。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号３５と少なくとも約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号３５と少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３５と少なくとも５０％同一である。

【0016】

本明細書ではまた、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子も開示される。

【0017】

本明細書の別の態様では、配列番号９または配列番号３３と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列；ヌクレオチド配列の転写を制御するプロモーター；および転写終結配列を含む、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子が開示される。

【0018】

一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。

【0019】

一部の実施形態では、転写終結配列は、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列である。一部の実施形態では、転写終結配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナル配列である。一部の実施形態では、転写終結配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。

【0020】

一部の実施形態では、単離核酸分子は、エンハンサーエレメントをさらに含む。一部の実施形態では、エンハンサーエレメントは、Ａ１ＭＢ２エンハンサーエレメントである。一部の実施形態では、Ａ１ＭＢ２エンハンサーエレメントは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。

【0021】

一部の実施形態では、単離核酸分子は、イントロン配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、キメライントロン、ハイブリッドイントロン、または合成イントロンである。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。

【0022】

一部の実施形態では、単離核酸分子は、転写後調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。一部の実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。

【0023】

本明細書の別の態様では、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセット、遺伝子カセットを挟む、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）および第２のＩＴＲを含む単離核酸分子が開示される。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、パルボウイルス科のメンバーに由来する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）、ヒトエリスロウイルス（Ｂ１９）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、またはこれらの変異体に由来する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１、２、または２１～３０と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、第２のＩＴＲは、配列番号２と少なくとも約７５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１と少なくとも約５０％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、第２のＩＴＲは、配列番号２と少なくとも約５０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含み、第２のＩＴＲは、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含む。

【0024】

本明細書の別の態様では、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを発現する遺伝子カセットを含む単離核酸分子であって、遺伝子カセットは、５’側から３’側へと、配列番号１５のヌクレオチド配列を含むＡ１ＭＢ２エンハンサーエレメント；配列番号１６のヌクレオチド配列を含む肝臓特異的改変マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター（ｍＴＴＲ）；配列番号１７のヌクレオチド配列を含むキメライントロン；配列番号９または配列番号３３と少なくとも８５％同一である核酸配列を含むＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列；配列番号１８のヌクレオチド配列を含むウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）；および配列番号１９のヌクレオチド配列を含むウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルを含む、単離核酸分子が開示される。

【0025】

本明細書の別の態様では、本明細書で開示される核酸分子を含むベクターが開示される。

【0026】

本明細書の別の態様では、本明細書で開示される核酸分子を含む宿主細胞が開示される。本明細書ではまた、宿主細胞により作製されるポリペプチドも開示される。一部の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。

【0027】

本明細書の別の態様では、本明細書で開示される核酸分子を作製するためのバキュロウイルス系が開示される。一部の態様では、核酸分子は、昆虫細胞内において作製される。

【0028】

本明細書の別の態様では、本明細書で開示される核酸分子を含む医薬組成物が開示される。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書で開示される核酸分子を含むベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

【0029】

本明細書の別の態様では、本明細書で開示される核酸分子と、核酸分子を、それを必要とする対象へと投与するための指示書とを含むキットが開示される。

【0030】

本明細書の別の態様では、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドを作製する方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドが作製される条件下において本明細書で開示される宿主細胞を培養する工程、およびＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドを回収する工程を含む方法が開示される。

【0031】

本明細書の別の態様では、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドの発現を増大させる方法であって、配列番号９、配列番号３３、配列番号３５、または配列番号１４と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与する工程を含む方法が開示される。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む。

【0032】

本明細書の別の態様では、対象における出血障害を処置する方法であって、配列番号９、配列番号３３、配列番号３５、または配列番号１４と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与する工程を含む方法が開示される。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む。

【0033】

本明細書の別の態様では、対象における出血障害を処置する方法であって、配列番号９、配列番号３３、配列番号３５、または配列番号１４と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含む医薬組成物を投与する工程を含む方法が開示される。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む。

【0034】

本明細書の別の態様では、対象におけるＡ型血友病を処置する方法であって、配列番号９、配列番号３３、配列番号３５、または配列番号１４と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含む医薬組成物を投与する工程を含む方法が開示される。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】本発明の実施形態に従う、ヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現構築物についての線形概略マップである。Ｖ１．０カセットは、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）プロモーター、イントロン、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルの調節下にある、ＸＴＥＮ １４４ペプチド（ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ）と融合された、Ｂドメイン欠失型ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩｃｏ６）（米国公開第２０１９０１８５５４３号を参照されたい）をコードする、コドン最適化ｃＤＮＡクローン６を含む。Ｖ２．０カセット（配列番号１４）は、エンハンサーエレメント（Ａ１ＭＢ２）を伴う、肝臓特異的改変マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター（ｍＴＴＲ４８２）、ハイブリッド合成イントロン（キメライントロン）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルの調節下にある、ＸＴＥＮ １４４ペプチド（ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）と融合された、Ｂドメイン欠失型（ＢＤＤ）コドン最適化ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＢＤＤｃｏＦＶＩＩＩ）をコードする、ＣｐＧモチーフをさらに除去した、コドン最適化ｃＤＮＡを含む。Ｖ３．０カセット（配列番号３５）は、肝臓特異的アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、ハイブリッド合成イントロン（キメライントロン）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルの調節下にある、ＸＴＥＮ １４４ペプチド（ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）と融合された、Ｂドメイン欠失型（ＢＤＤ）コドン最適化ヒト第ＶＩＩＩ因子（Ｃｏ－ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）をコードする、ＣｐＧモチーフをさらに除去した、コドン最適化ｃＤＮＡを含む。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットは、パルボウイルスＩＴＲにより挟まれる。

【図2】パルボウイルスＩＴＲにより挟まれたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを、ＩＴＲ類縁配列を認識し、平滑末端ＤＮＡをもたらす制限酵素により消化し、消化による二本鎖ＤＮＡ産物（ＦＶＩＩＩ発現カセットおよびプラスミド骨格）を、９５℃で熱変性させる（変性）のに続き、４℃で冷却して（再生）、回文ＩＴＲ配列が、フォールディングすることを可能とする、ｓｓＤＮＡ作出のために使用されたアプローチについての概略表示を示す図である。結果として得られるｓｓ（ｓｓＤＮＡ）ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを、ＨｅｍＡマウスにおける、流体尾静脈注射を介する全身送達のために使用した。

【図3】Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイにより測定された、血漿ＦＶＩＩＩ活性レベルについてのグラフ表示である。血液サンプルは、流体尾静脈注射を介して、Ｂ１９ ＩＴＲにより挟まれた、１ｋｇ当たりのＶ１．０または一本鎖Ｖ２．０ ｓｓ（ｓｓＤＮＡ）ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ８００μｇを全身注射されたｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスから、異なる間隔で回収した。誤差バーは、標準偏差を表す。

【図4】Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイにより測定された、血漿ＦＶＩＩＩ活性レベルについてのグラフ表示である。血漿サンプルは、流体尾静脈注射を介して、表示の通り、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）、ヒトエリスロウイルス（Ｂ１９）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、もしくはこれらの変異体のＩＴＲ、またはこれらの組合せにより挟まれた、１ｋｇ当たりの一本鎖Ｖ２．０ ｓｓ（ｓｓＤＮＡ）ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ２００、８００、または１６００μｇを全身注射されたｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスから、異なる間隔で回収した。２つハイブリッドＩＴＲセットについてもまた調べた（５’側Ｂ１９－３’側ＧＰＶおよび５’側ＧＰＶ－３’側Ｂ１９）。誤差バーは、標準偏差を表す。ＩＴＲ配列およびそれらの変異体については、既往の米国特許出願第６３／０６９，１１４号において記載された。

【図5A】バキュロウイルス系から得られた、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）、およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの効能についての表示である。図５Ａは、米国特許出願第６３／０６９，０７３号に記載される、連続溶出電気泳動から得られた、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＩＴＲを伴う、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）に対する、アガロースゲル電気泳動についての画像を示す。純度は、出発材料（ＳＭ）と比較して示され、矢印は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドを指し示す。

【図5B】バキュロウイルス系から得られた、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）、およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの効能についての表示である。図５Ｂは、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイにより測定された、血漿ＦＶＩＩＩ活性レベルについてのグラフ表示を示す。血漿サンプルは、流体尾静脈注射を介して、表示の通り、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＩＴＲにより挟まれた、１ｋｇ当たりのｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）８０、４０、または１２μｇを全身注射されたｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスから、異なる間隔で回収した。誤差バーは、標準偏差を表す。ＩＴＲ配列およびそれらの変異体については、既往の米国特許出願第６３／０６９，０７３号において記載された。

【図6A】ＨＢｏＶ１ ＩＴＲ構築物内における、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの発現を駆動する、肝臓特異的ｍＴＴＲプロモーターおよびヒトＡ１ＡＴプロモーターについての試験を示す図である。図６Ａは、ＨＢｏＶ１ ＷＴ ＩＴＲにより挟まれた、肝臓特異的ｍＴＴＲ（配列番号３）またはＡ１ＡＴプロモーターのいずれかを伴う、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットについての概略図を示す。

【図6B】ＨＢｏＶ１ ＩＴＲ構築物内における、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの発現を駆動する、肝臓特異的ｍＴＴＲプロモーターおよびヒトＡ１ＡＴプロモーターについての試験を示す図である。図６Ｂは、記載される通り、制限酵素消化により作出された、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１についての、アガロースゲル電気泳動画像である。

【図6C】ＨＢｏＶ１ ＩＴＲ構築物内における、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの発現を駆動する、肝臓特異的ｍＴＴＲプロモーターおよびヒトＡ１ＡＴプロモーターについての試験を示す図である。図６Ｃは、図６Ａに描示された、ｍＴＴＲプロモーター構築物またはＡ１ＡＴプロモーター構築物を注射されたマウスにおいて、正常のパーセントに照らして正規化されたＦＶＩＩＩ発現レベルを示す。誤差バーは、標準偏差を表す。

【図7A】バキュロウイルス系から得られた、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮＡＡＶ２（ｃｅＤＮＡ）分子種についての研究結果を示す図である。図７Ａは、連続溶出電気泳動から得られた、ＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲを伴う、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）の、全長（８．３ｋｂ）分子種および切断型（６．０ｋｂ）分子種を示す、アガロースゲル電気泳動画像を描示する。

【図7B】バキュロウイルス系から得られた、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮＡＡＶ２（ｃｅＤＮＡ）分子種についての研究結果を示す図である。図７Ｂは、ＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲを伴う、８．３ｋｂの全長ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（上パネル）、および６．０ｋｂの切断型ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（下パネル）についての、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）解析を示す。

【図7C】バキュロウイルス系から得られた、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮＡＡＶ２（ｃｅＤＮＡ）分子種についての研究結果を示す図である。図７Ｃは、全長ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２構築物または切断型ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２構築物を、８０または４０μｇ／ｋｇで注射されたマウスにおいて、正常のパーセントに照らして正規化されたＦＶＩＩＩ発現レベルを示す。誤差バーは、標準偏差を表す。

【図8A】バキュロウイルス系から得られた、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）、およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの効能についての表示である。図８Ａは、米国特許出願第６３／０６９，０７３号に記載される、連続溶出電気泳動から得られた、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＩＴＲを伴う、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）に対する、アガロースゲル電気泳動についての画像を示す。純度は、出発材料（ＳＭ）と比較して示され、矢印は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドを指し示す。

【図8B】バキュロウイルス系から得られた、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）、およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの効能についての表示である。図８Ｂは、表示の通り、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＩＴＲにより挟まれた、１ｋｇ当たりのｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）８０または４０μｇを注射されたマウスにおいて、正常のパーセントに照らして正規化されたＦＶＩＩＩ発現レベルを示す。誤差バーは、標準偏差を表す。

【発明を実施するための形態】

【0036】

本開示は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を伴うポリペプチドをコードする、コドン最適化遺伝子について記載する。本開示は、第ＶＩＩＩ因子活性を伴うポリペプチドをコードする、コドン最適化核酸分子、ベクター、および最適化核酸分子を含む宿主細胞、最適化核酸分子によりコードされるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを作製する方法を対象とする。本開示はまた、血友病などの出血障害を処置する方法であって、対象へと、最適化第ＶＩＩＩ因子核酸配列、最適化核酸配列を含むベクター、またはポリこれによりコードされるペプチドを投与する工程を含む方法も対象とする。

【0037】

本開示は、宿主細胞内における発現の増大、組換えＦＶＩＩＩを作製する方法における、ＦＶＩＩＩタンパク質の収量の改善を裏付け、遺伝子治療法において使用された場合に、潜在的に、治療的効能の増大を結果としてもたらす、最適化ＦＶＩＩＩ配列を提供することにより、当技術分野における、重要な必要を満たす。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号９のヌクレオチド配列に対する配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子について記載する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号３３のヌクレオチド配列に対する配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子について記載する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号１４のヌクレオチド配列に対する配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子について記載する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号３５のヌクレオチド配列に対する配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子について記載する。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＸＴＥＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

【0038】

本明細書および特許請求の範囲の明確な理解のために、下記に、以下の定義が提供される。

【0039】

定義
「ある（ａ）」実体または「ある（ａｎ）」実体という用語は、この実体のうちの１つまたはそれ以上を指すことが注目される：例えば、「あるヌクレオチド配列」とは、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を表すことが理解される。このように、本明細書では、「ある（ａ）」（または「ある（ａｎ）」）、「１つまたはそれ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、互換的に使用される。

【0040】

本明細書では、「約」という用語は、約、およそ、ほぼ、またはこれらの近傍にあることを意味するように使用される。数値範囲と共に使用される場合、「約」という用語は、境界を、示された数値の上側および下側に拡張することにより、この範囲を修飾する。本明細書では一般に、「約」という用語は、数値を、上方または下方（高値または低値）における１０パーセントの変動により、言明された値の上側および下側に修飾するように使用される。

【0041】

本開示の目的のための、「単離された」という用語は、その元の環境（それが天然において存在する環境）から取り出されている、生物学的素材（細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはこれらの断片、変異体、もしくは誘導体）を指示する。例えば、植物または動物において、天然状態で存在するポリヌクレオチドは、単離されていないが、それが天然において存在する、隣接する核酸から分離された、同じポリヌクレオチドは、「単離された」と考えられる。特定レベルの精製は、要求されない。組換えにより作製されたポリペプチド、および宿主細胞内において発現させたタンパク質は、本開示の目的では、任意の適切な技法により分離されるか、分画されるか、または部分的に、もしくは実質的に精製された、天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様に、「単離された」と考えられる。

【0042】

「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「ＲＮＡ分子」）、もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、またはホスホロチオエートおよびチオエステルなど、一本鎖形態にあるか、もしくは二本鎖ヘリックス内にある、これらの任意のリン酸エステル類似体を指す。二本鎖である、ＤＮＡ－ＤＮＡヘリックス、ＤＮＡ－ＲＮＡヘリックス、およびＲＮＡ－ＲＮＡヘリックスも可能である。核酸分子という用語、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次構造および二次構造だけを指し、分子を、いかなる特定の三次形態にも限定しない。したがって、この用語は、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ分子または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、超らせんＤＮＡ、および染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について論じる場合、本明細書では、配列は、通常の慣行に従い、５’側から３’側の方向に、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿った配列だけを示して記載される。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡを含むがこれらに限定されない。本開示の「核酸組成物」は、本明細書で記載される、１つまたはそれ以上の核酸を含む。

【0043】

本明細書で使用される、「コード領域」または「コード配列」とは、アミノ酸へと翻訳可能なコドンからなる、ポリヌクレオチドの部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、典型的に、アミノ酸へと翻訳されないが、コード領域の部分と考えられるのに対し、任意の隣接する配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合性部位、転写終結因子、イントロンなどは、コード領域の部分ではない。コード領域の境界は、典型的に、結果として得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端における開始コドンと、結果として得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端における翻訳終止コドンとにより決定される。２つまたはそれ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物内に存在しうる、例えば、単一のベクター上に存在する場合もあり、別個のポリヌクレオチド構築物内、例えば、別個の（異なる）ベクター上に存在する場合もある。したがって、単一のベクターは、単一のコード領域だけを含有する場合もあり、２つまたはそれ以上のコード領域を含む場合もある。

【0044】

哺乳動物細胞により分泌される、ある特定のタンパク質は、増殖するタンパク質鎖の、粗面小胞体を越える移出が誘発されたら、成熟タンパク質から切断される、分泌型シグナルペプチドと関連する。当業者は、シグナルペプチドが、一般に、ポリペプチドのＮ末端へと融合され、完全ポリペプチドまたは「全長」ポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態または「成熟」形態をもたらすことを承知している。ある特定の実施形態では、この配列の天然シグナルペプチドまたは機能的誘導体は、それと作動可能に関連するポリペプチドの分泌を方向付ける能力を保持する。代替的に、異種哺乳動物シグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、またはマウスβ－グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはその機能的な誘導体が使用される。

【0045】

「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して３’側に配置されたヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流のヌクレオチド配列は、転写の起始部に後続する配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に配置される。

【0046】

「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して５’側に配置されたヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流のヌクレオチド配列は、コード領域の５’側、または転写の起始部に配置された配列に関する。例えば、大半のプロモーターは、転写開始部位の上流に配置される。

【0047】

本明細書で使用される、「遺伝子カセット」という用語は、適切な宿主細胞内の、特定のポリヌクレオチド配列の発現を方向付けることが可能なＤＮＡ配列であって、目的のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ配列を意味する。遺伝子カセットは、コード領域の上流（５’側非コード配列）、コード領域内、またはコード領域の下流（３’側非コード配列）に配置され、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を包含しうる。コード領域が、真核細胞内の発現のために意図される場合、ポリアデニル化シグナル配列および転写終結配列は、通例、コード配列に対して３’側に配置されるであろう。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、異種ポリヌクレオチド配列を含む。産物、例えば、ｍｉＲＮＡまたは遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質などのポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、１つまたはそれ以上のコード領域と作動可能に関連する、プロモーターおよび／または他の発現（例えば、転写または翻訳）制御配列を含みうる。作動可能な関連にある場合、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域は、遺伝子産物の発現を、調節領域（複数可）の影響下または制御下に置くような形で、１つまたはそれ以上の調節領域と関連する。例えば、プロモーター機能の誘導が、コード領域によりコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を結果としてもたらし、プロモーターと、コード領域との間の連結の性格が、遺伝子産物の発現を方向付けるプロモーターの能力に干渉しないか、またはＤＮＡ鋳型が転写される能力に干渉しない場合、コード領域と、プロモーターとは、「作動可能に関連する」。プロモーター以外の、他の発現制御配列、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルもまた、遺伝子産物の発現を方向付けるように、コード領域と作動可能に関連しうる。

【0048】

「発現制御配列」とは、宿主細胞内のコード配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、終結因子などの調節性ヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、一般に、作動可能に連結されたコード核酸の、効率的な転写および翻訳を容易とする、任意の調節性ヌクレオチド配列を包含する。発現制御配列の非限定例は、プロモーター、エンハンサー、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合性部位、またはステム－ループ構造を含む。当業者には、様々な発現制御配列が公知である。これらは、限定せずに述べると、サイトメガロウイルス（イントロンＡを伴う、最初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）に由来する、プロモーターセグメントおよびエンハンサーセグメントなどであるがこれらに限定されない、脊椎動物細胞内において機能する発現制御配列を含む。他の発現制御配列は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ－グロビンのほか、真核細胞内の遺伝子発現を制御することが可能な他の配列など、脊椎動物遺伝子に由来する発現制御配列を含む。さらなる適切な発現制御配列は、組織特異的プロモーターおよび組織特異的エンハンサーのほか、リンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導されるプロモーター）を含む。他の発現制御配列は、イントロン配列、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化シグナルを含む。さらなる例示的発現制御配列については、本開示の他の箇所で論じられる。

【0049】

同様に、当業者には、様々な翻訳制御エレメントも公知である。これらは、リボソーム結合性部位、翻訳開始／終結コドン、およびピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位、またはＩＲＥＳ）を含むがこれらに限定されない。

【0050】

本明細書で使用される、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが、遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドをもたらす過程を指す。「発現」は、限定せずに述べると、ポリヌクレオチドの、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または他の任意のＲＮＡ産物への転写、およびｍＲＮＡの、ポリペプチドへの翻訳を含む。発現は、「遺伝子産物」をもたらす。本明細書で使用された、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドでありうる。本明細書で記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化またはスプライシングを伴う核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、またはタンパク質分解性切断を伴うポリペプチドをさらに含む。本明細書で使用される、「収量」という用語は、遺伝子の発現によりもたらされるポリペプチドの量を指す。

【0051】

「ベクター」とは、核酸の、宿主細胞へのクローニングおよび／または導入のための、任意の媒体を指す。ベクターは、別の核酸セグメントが、接合されたセグメントの複製をもたらすように接合されたレプリコンでありうる。「レプリコン」とは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、自律的複製単位として機能する、すなわち、それ自身による制御下における複製が可能である、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、核酸を、細胞へと導入するためのウイルスおよび非ウイルス媒体を含む。当技術分野では、例えば、プラスミド、改変真核生物ウイルス、または改変細菌ウイルスを含む、多数のベクターが公知であり、使用されている。ポリヌクレオチドの、適切なベクターへの挿入は、適切なポリヌクレオチド断片を、相補性の粘着末端を有する、選び出されたベクターへとライゲーションすることにより達せられる。

【0052】

ベクターは、ベクターを組み込んだ細胞の選択または同定をもたらす、選択用マーカーまたは選択用レポーターをコードするように操作される。選択用マーカーまたは選択用レポーターの発現は、ベクター上に含有された、他のコード領域を組み込み、発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能とする。当技術分野で公知であり、使用される、選択用マーカー遺伝子の例は、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、除草剤であるビアラフォス、スルホンアミドなどに対する耐性をもたらす遺伝子；および表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節的遺伝子、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｓｏｐｅｎｔａｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子などを含む。当技術分野で公知であり、使用される、レポーターの例は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択用マーカーはまた、レポーターであるとも考えられる。

【0053】

「選択用マーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生剤に対する耐性、除草剤に対する耐性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づく選択が可能である同定因子、通例、抗生剤耐性遺伝子または化学物質耐性遺伝子を指し、この場合、効果は、目的の核酸の継承を跡付け、かつ／または目的の核酸を継承した細胞もしくは生物を同定するのに使用される。当技術分野で公知であり、使用される、選択用マーカー遺伝子の例は、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、除草剤であるビアラフォス、スルホンアミドなどに対する耐性をもたらす遺伝子；および表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節的遺伝子、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｓｏｐｅｎｔａｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子などを含む。

【0054】

「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター遺伝子の効果に基づく同定が可能である同定因子をコードする核酸を指し、この場合、効果は、目的の核酸の継承を跡付け、目的の核酸を継承した細胞もしくは生物を同定し、かつ／または遺伝子発現の誘導もしくは遺伝子の転写を測定するのに使用される。当技術分野で公知であり、使用される、レポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択用マーカー遺伝子もまた、レポーター遺伝子であると考えられる。

【0055】

「プロモーター」および「プロモーター配列」は、互換的に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に配置される。プロモーターは、それらの全体において、天然の遺伝子に由来するか、または天然において見出される、異なるプロモーターに由来する、異なるエレメントから構成されるか、なおまたは合成ＤＮＡセグメントを含む。当業者により、異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型における遺伝子の発現を方向付ける場合もあり、異なる発生段階にある遺伝子の発現を方向付ける場合もあり、異なる環境条件もしくは生理学的条件に応答する遺伝子の発現を方向付ける場合もあることが理解される。遺伝子を、大半の細胞型内において、大半の時点において発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と称される。遺伝子を、特異的細胞型内において発現させるプロモーターは、一般に、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と称される。遺伝子を、発生または細胞分化の特異的段階において発現させるプロモーターは、一般に、「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と称される。プロモーターを誘導する薬剤、生体分子、化学物質、リガンド、光などへの細胞の曝露、またはこれらによる細胞の処置の後において、遺伝子を発現するように誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「誘導的プロモーター」または「調節的プロモーター」と称される。大半の場合に、調節的配列の正確な境界は、完全に規定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有しうることが、さらに認識される。さらなる例示的プロモーターについては、本開示の他の箇所で論じられる。

【0056】

プロモーター配列は、典型的に、その３’末端において、転写開始部位により結合され、バックグラウンドを上回る、検出可能なレベルにおいて転写を誘発するのに必要である、最小限の数の塩基またはエレメントを組み入れるように、上流（５’方向）に伸張する。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を伴うマッピングにより規定されると好都合である）のほか、ＲＮＡポリメラーゼの結合の一因となる、タンパク質結合性ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。

【0057】

「プラスミド」という用語は、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通例、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある遺伝子を保有することが多い、染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を、適切な３’側非翻訳配列と共に、細胞へと導入することが可能である、固有の構築物へと、多数のヌクレオチド配列が接続されるか、または組み換えられた、任意の供給源に由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖状、環状、または超らせん状である、自律複製型配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列でありうる。

【0058】

使用される、真核生物用ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。非ウイルスベクターは、プラスミド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ－タンパク質複合体、および生体ポリマーを含む。

【0059】

「クローニングベクター」とは、別の核酸セグメントが、接合されたセグメントの複製をもたらすように接合される、プラスミド、ファージ、またはコスミドなど、逐次的に複製される単位長の核酸であり、複製起点を含む、「レプリコン」を指す。ある特定のクローニングベクターは、１つの細胞型、例えば、細菌における複製、および別の細胞、例えば、真核細胞における発現が可能である。クローニングベクターは、典型的に、目的の核酸配列の挿入のための、ベクターおよび／または１つもしくはそれ以上の複数のクローニング部位を含む細胞の選択のために使用される、１つまたはそれ以上の配列を含む。

【0060】

「発現ベクター」という用語は、宿主細胞への挿入の後に、挿入された核酸配列の発現を可能とするようにデザインされた媒体を指す。挿入された核酸配列は、上記で記載された通り、調節領域との作動可能な関連下に置かれる。

【0061】

ベクターは、当技術分野で周知の方法、例えば、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターにより、宿主細胞へと導入される。

【0062】

本明細書で使用される、「培養物」、「～を培養するために」、「～を培養すること」とは、細胞を、細胞の増殖もしくは分裂を可能とするｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下においてインキュベートするか、または細胞を、生存状態に維持することを意味する。本明細書で使用される、「培養細胞」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて繁殖された細胞を意味する。

【0063】

本明細書で使用される、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」のほか、複数形の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（また、ペプチド結合としても公知である）により、直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つまたはそれ以上のアミノ酸による、１つまたはそれ以上の任意の鎖を指し、具体的長さの産物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つもしくはそれ以上のアミノ酸による、１つもしくはそれ以上の鎖を指すのに使用される、他の任意の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のうちのいずれかの代わりに使用される場合もあり、これらと互換的に使用される場合もある。「ポリペプチド」という用語はまた、限定せずに述べると、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、または非自然発生アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾産物を指すことも意図される。ポリペプチドは、天然の生体供給源に由来する場合もあり、組換え技術により作製される場合もあるが、必ずしも、指示された核酸配列から翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成による作出を含む、任意の方式により作出される。

【0064】

「アミノ酸」という用語は、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リシン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）を含む。非常套的アミノ酸もまた、本開示の範囲内にあり、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、２０２：３０１～３３６（１９９１）において記載されているアミノ酸残基類似体など、他のアミノ酸残基類似体を含む。このような非自然発生のアミノ酸残基を作出するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１８２（１９８９）；およびＥｌｌｍａｎら、前出の手順が使用される。略述すると、これらの手順は、非自然発生アミノ酸残基を伴うサプレッサーｔＲＮＡの化学的活性化に続き、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ＲＮＡの転写および翻訳を伴う。非常套的アミノ酸の導入はまた、当技術分野で公知のペプチド化学反応を使用しても達成される。本明細書で使用される、「極性アミノ酸」という用語は、正味の電荷はゼロであるが、それらの側鎖の異なる部分において、ゼロでない部分電荷を有するアミノ酸（例えば、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）を含む。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に参与しうる。本明細書で使用される、「帯電アミノ酸」という用語は、それらの側鎖上において、ゼロでない正味電荷を有しうるアミノ酸（例えば、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）を含む。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に参与しうる。

【0065】

本開示にはまた、ポリペプチドの断片または変異体、およびこれらの任意の組合せも含まれる。本開示のポリペプチド結合性ドメインまたはポリペプチド結合性分子に言及する場合における、「断片」または「変異体」という用語は、参照ポリペプチドの特性（例えば、ＦｃＲｎ結合性ドメインまたはＦｃ変異体に対する、ＦｃＲｎの結合アフィニティー、ＦＶＩＩＩ変異体についての凝固活性、またはＶＷＦ断片に対する、ＦＶＩＩＩの結合活性）のうちの、少なくとも一部を保持する、任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、本明細書の他の箇所で論じられる、特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解性断片のほか、欠失断片を含むが、自然発生の全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）を含まない。本開示のポリペプチド結合性ドメインまたはポリペプチド結合性分子の変異体は、上記で記載された断片を含み、また、アミノ酸の置換、欠失、または挿入のために、アミノ酸配列が変更されたポリペプチドも含む。変異体は、天然変異体の場合もあり、非自然発生変異体の場合もある。非自然発生変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発法を使用して作製される。変異体ポリペプチドは、保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を含む場合もあり、非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を含む場合もある。

【0066】

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられるアミノ酸置換である。当技術分野では、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝型側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。したがって、ポリペプチド内のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸により置き換えられる場合、置換は、保存的であると考えられる。別の実施形態では、アミノ酸の連なりは、側鎖ファミリーメンバーの、順序および／または組成が異なる、構造的に類似する連なりにより保存的に置き換えられる。

【0067】

当技術分野で公知である、「同一性パーセント」という用語は、配列を比較することにより決定される、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列、または２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当技術分野において、「同一性」とはまた、場合によって、このような配列の連なりの間のマッチにより決定される、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の間の配列類縁性の程度も意味する。「同一性」は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ」、Ｉ部（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）において記載された方法を含むがこれらに限定されない、公知の方法により、たやすく計算される。同一性を決定する、好ましい方法は、被験配列の間の最も良好なマッチをもたらすようにデザインされる。同一性を決定する方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムにおいてコード化されている。配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算ソフトパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の、Ｍｅｇａｌｉｇｎプログラム、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３（１９９０））；およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ）などの配列解析ソフトウェアを使用して実施される。本出願の文脈では、解析のために、配列解析ソフトウェアが使用される場合、解析の結果は、そうでないことが指定されない限りにおいて、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されるであろう。本明細書で使用される、「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときに、ソフトウェアにより元からロードされていた、値またはパラメータの任意のセットを意味する。本開示の最適化ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ配列と、参照配列との同一性パーセントを決定する目的では、本開示の最適化ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ配列内のヌクレオチドに対応する、参照配列内のヌクレオチドだけが、同一性パーセントを計算するのに使用される。例えば、Ｂドメインを含有する、全長ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列を、本開示の最適化Ｂドメイン欠失型（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列と比較する場合、アライメントのうちのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインを含む部分が、同一性パーセントを計算するのに使用されるであろう。Ｂドメインをコードする全長ＦＶＩＩＩ配列の部分内のヌクレオチド（アライメント内において、大きな「ギャップ」を結果としてもたらす）は、ミスマッチとしてカウントされないであろう。加えて、本開示の最適化ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ配列、または指示されたその部分（例えば、配列番号１４のヌクレオチド２１８３～４４７４および４９２４～７００６）と、参照配列との同一性パーセントの決定では、同一性パーセントは、マッチしたヌクレオチドの数を、本明細書で列挙される、最適化ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ配列、または指示されたその部分の、完全配列内のヌクレオチドの総数で除することにより計算される。

【0068】

本明細書で使用される、「挿入部位」という用語は、異種部分が挿入される位置のすぐ上流である、ＦＶＩＩＩポリペプチド、またはその断片、変異体、もしくは誘導体内の位置を指す。「挿入部位」は、挿入位置に対して、すぐのＮ末端側である、挿入部位が対応する、成熟天然ＦＶＩＩＩ（配列番号２０）内のアミノ酸の番号に対応する番号である番号として指定される。例えば、「ａ３は、配列番号２４のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位において、異種部分を含む」という語句は、異種部分が、配列番号２０のアミノ酸１６５６およびアミノ酸１６５７に対応する、２つのアミノ酸の間に配置されることを指し示す。

【0069】

本明細書で使用される、「アミノ酸のすぐ下流」という語句は、アミノ酸の末端カルボキシル基にじかに隣接する位置を指す。同様に、「アミノ酸のすぐ上流」とは、アミノ酸の末端アミン基にじかに隣接する位置を指す。

【0070】

本明細書で使用される、「挿入された」、「～は、挿入される」、「～へと挿入された」という用語、または文法的に類縁の用語は、天然成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号２０）内の相似位置と比べた、組換えＦＶＩＩＩポリペプチド内の異種部分の位置を指す。

【0071】

本明細書で使用される、「半減期」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、対象へと投与された半量が、動物における循環および／または他の組織からクリアランスされるのに要求される時間により表される。所与のポリペプチドについてのクリアランス曲線が、時間の関数として構築される場合、曲線は、通例、急速なα相と、緩徐なβ相とを伴う、二相型である。α相は、典型的に、投与されたＦｃポリペプチドの、血管内腔と、血管外腔とにおける平衡を表し、部分的に、ポリペプチドのサイズにより決定される。β相は、典型的に、血管内腔における、ポリペプチドの異化を表す。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、単相性であるので、アルファ相を有さず、単一のベータ相だけを有する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で使用される、「半減期」という用語は、β相におけるポリペプチドの半減期を指す。

【0072】

本明細書で使用される、「連結された」とは、それぞれ、第２のアミノ酸配列または第２のヌクレオチド配列へと、共有結合的に、または非共有結合的に接続された、第１のアミノ酸配列または第１のヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸配列または第１のヌクレオチド配列は、第２のアミノ酸配列または第２のヌクレオチド配列へと、直接接続または併置される場合もあり、代替的に、介在配列が、第１の配列を、第２の配列へと、共有結合的に接続する場合もある。「連結された」という用語は、Ｃ末端またはＮ末端における、第１のアミノ酸配列の、第２のアミノ酸配列への融合だけを意味するのではなく、また、第１の全アミノ酸配列（または第２の全アミノ酸配列）のそれぞれの、第２のアミノ酸配列内（または第１のアミノ酸配列内）の、任意の２つのアミノ酸への挿入も含む。一実施形態では、第１のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーにより、第２のアミノ酸配列へと連結される。第１のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーにより、第２のアミノ酸配列へと連結される。リンカーは、ペプチドまたはポリペプチド（ポリペプチド鎖について）の場合もあり、ヌクレオチドまたはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖について）の場合もあり、任意の化学的部分（ポリペプチド鎖およびポリヌクレオチド鎖の両方について）の場合もある。「連結された」という用語はまた、ハイフン（－）によっても指し示される。

【0073】

本明細書で使用される、「～と会合する」という用語は、第１のアミノ酸鎖と、第２のアミノ酸鎖との間に形成される、共有結合または非共有結合を指す。一実施形態では、「～と会合する」という用語は、共有結合、非ペプチド結合、または非共有結合を意味する。この会合は、コロン、すなわち、（：）により指し示される。別の実施形態では、この用語は、ペプチド結合を除く共有結合を意味する。例えば、アミノ酸であるシステインは、第２のシステイン残基上のチオール基と共に、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋を形成しうるチオール基を含む。大半の自然発生ＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域と、ＣＬ領域とは、ジスルフィド結合により会合し、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、２３９および２４２位（２２６または２２９位；ＥＵ番号付けシステム）に対応する位置における、２つのジスルフィド結合により会合する。共有結合の例は、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、アゴスティック結合、ベント結合、双極性結合、パイ逆供与結合、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役、超共役、芳香族性、ハプト数、または反結合性を含むがこれらに限定されない。非共有結合の非限定例は、イオン結合（例えば、カチオン－パイ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素複合体、低－障壁水素結合、または対称性水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、力学的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力、または化学極性を含む。

【0074】

本明細書で使用される、「止血」とは、出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇまたはｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）の停止もしくは緩徐化；または血管もしくは身体部分を通る血流の停止もしくは緩徐化を意味する。

【0075】

本明細書で使用される、「止血障害」とは、フィブリン凝固物を形成する能力の障害、またはフィブリン凝固物を形成できないことのために、自発的に、または外傷の結果として、出血する傾向により特徴づけられる、先天的状態または後天的状態を意味する。このような障害の例は、血友病を含む。３つの主要形態は、Ａ型血友病（第ＶＩＩＩ因子欠損症）、Ｂ型血友病（第ＩＸ因子欠損症または「クリスマス病」）およびＣ型血友病（第ＸＩ因子欠損症、軽度の出血傾向）である。他の止血障害は、例えば、フォンウィレブラント病、第ＸＩ因子欠損症（ＰＴＡ欠損症）、第ＸＩＩ因子欠損症、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、または第ＸＩＩＩ因子の欠陥または構造的異常、ＧＰＩｂの欠陥または欠損である、ベルナール－スーリエ症候群を含む。ｖＷＦの受容体であるＧＰＩｂは、欠損する場合があり、一次凝固物形成（一次止血）の欠如、および出血傾向の増大、ならびにグランツマン／ネーゲリ血小板無力症（グランツマン血小板無力症）をもたらしうる。肝不全（急性形態および慢性形態）では、肝臓による凝固因子の産生が不十分であり；これは、出血の危険性を増大させうる。

【0076】

本開示の単離核酸分子、単離ポリペプチド、または単離核酸分子を含むベクターは、予防的に使用される。本明細書で使用される、「予防処置」という用語は、出血挿間の前における、分子の投与を指す。一実施形態では、一般的止血剤を必要とする対象は、手術を受けつつあるか、または手術を受けようとするところである。本開示のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクターは、手術の前または後において、予防剤として投与される。本開示のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクターは、手術の前または後において、急性出血挿間をコントロールするのに投与される。手術は、肝移植、肝切除、歯科手順、または幹細胞移植を含みうるがこれらに限定されない。

【0077】

本開示の単離核酸分子、単離ポリペプチド、またはベクターはまた、オンデマンド処置のためにも使用される。「オンデマンド処置」という用語は、出血挿間の症状に応答するか、または出血を引き起こしうる活動の前における、単離核酸分子、単離ポリペプチド、またはベクターの投与を指す。一態様では、オンデマンド処置は、損傷の後など、出血が始まる場合に、または手術の前など、出血が予測される場合に、対象へと施される。別の態様では、オンデマンド処置は、接触運動競技など、出血の危険性を増大させる活動の前に施される。

【0078】

本明細書で使用される、「急性出血」という用語は、基礎原因に関わらず、出血挿間を指す。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血障害（例えば、第ＶＩＩ因子欠損症）血小板障害、または凝固因子に対する抗体の発生に起因する耐性を有しうる。

【0079】

本明細書で使用される、「～を処置する」、「処置」、「～を処置すること」とは、例えば、疾患もしくは状態の重症度の軽減；疾患経過の持続期間の短縮；疾患もしくは状態と関連する、１つもしくはそれ以上の症状の改善；疾患もしくは状態を伴う対象への、必ずしも、疾患もしくは状態の治癒を伴わない、有益な効果の施与；または疾患もしくは状態と関連する、１つもしくはそれ以上の症状の予防を指す。一実施形態では、「～を処置すること」または「処置」という用語は、本開示の単離核酸分子、単離ポリペプチド、またはベクターを投与することにより、対象におけるＦＶＩＩＩのトラフレベルを、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、または２０ＩＵ／ｄＬに維持することを意味する。別の実施形態では、「～を処置すること」または「処置」とは、ＦＶＩＩＩのトラフレベルを、約１～約２０ＩＵ／ｄＬ、約２～約２０ＩＵ／ｄＬ、約３～約２０ＩＵ／ｄＬ、約４～約２０ＩＵ／ｄＬ、約５～約２０ＩＵ／ｄＬ、約６～約２０ＩＵ／ｄＬ、約７～約２０ＩＵ／ｄＬ、約８～約２０ＩＵ／ｄＬ、約９～約２０ＩＵ／ｄＬ、または約１０～約２０ＩＵ／ｄＬの間に維持することを意味する。疾患または状態の処置またはこれらを処置することはまた、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を、非血友病性対象におけるＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％と同等なレベルに維持することも含みうる。処置に要求される、最小限のトラフレベルは、１つまたはそれ以上の公知の方法により測定され、各患者のために調整される（増大または減少させる）。

【0080】

本明細書で使用される、「～を投与すること」とは、薬学的に許容される経路を介して、薬学的に許容される第ＶＩＩＩ因子コード核酸分子、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、または本開示の第ＶＩＩＩ因子コード核酸分子を含むベクターを、対象へと施すことを意味する。投与経路は、静脈内、例えば、静脈内注射および静脈内注入でありうる。さらなる投与経路は、例えば、皮下投与、筋内投与、経口投与、経鼻投与、および肺内投与を含む。核酸分子、ポリペプチド、およびベクターは、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の部分として投与される。

【0081】

本明細書で使用される、「それを必要とする対象」という語句は、本開示の核酸分子、ポリペプチド、またはベクターの投与から、例えば、止血を改善する利益を得る、哺乳動物対象などの対象を含む。一実施形態では、対象は、血友病を伴う個体を含むがこれらに限定されない。別の実施形態では、対象は、ＦＶＩＩＩ阻害剤を発生させたため、バイパス療法を必要とする個体を含むがこれらに限定されない。対象は、成人の場合もあり、年少者（例えば、１２歳未満）の場合もある。

【0082】

本明細書で使用される、「凝固因子」という用語は、対象における出血挿間の持続を防止するか、またはこれを減少させる、自然発生であるか、または組換えにより作製された分子またはその類似体を指す。言い換えると、「凝固因子」という用語は、凝固促進活性を有する分子、すなわち、血液を凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｅまたはｃｌｏｔ）させる、フィブリノーゲンの、不溶性フィブリンのメッシュへの転換の一因となる分子を意味する。「活性化可能凝固因子」とは、活性形態へと転換されることが可能である、不活性形態にある（例えば、そのチモーゲン形態にある）凝固因子である。

【0083】

本明細書で使用される、「凝固活性」とは、フィブリン凝固物の形成に至る生化学的反応のカスケードに参与し、かつ／または出血もしくは出血挿間の重症度、持続、もしくは頻度を低減する能力を意味する。

【0084】

本明細書で使用される、「異種」または「外因性」という用語は、所与の文脈において、例えば、細胞内またはポリペプチド内に、通常見出されない分子を指す。例えば、外因性分子または異種分子は、細胞へと導入され、例えば、トランスフェクションまたは遺伝子操作の他の形態による、細胞の操作後だけにおいて存在するが、異種アミノ酸配列は、それが、天然において見出されないタンパク質内に存在する場合もある。

【0085】

本明細書で使用される、「異種ヌクレオチド配列」という用語は、所与のポリヌクレオチド配列を伴っては自然発生しないヌクレオチド配列を指す。一実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩの半減期を延長することが可能なポリペプチドをコードする。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩの流体力学半径を増大させるポリペプチドをコードする。他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、その生体活性または機能（例えば、その凝固促進活性）に著明な影響を及ぼさずに、ＦＶＩＩＩの１つまたはそれ以上の薬物動態特性を改善するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、リンカーにより、異種ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドへと連結または接続される。

【0086】

本開示のヌクレオチド配列との比較として、本明細書で使用される場合における、「参照ヌクレオチド配列」は、ＦＶＩＩＩ配列に対応する部分が、最適化されていないことを除き、本開示のヌクレオチド配列と、本質的に同一であるポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子のための、参照ヌクレオチド配列は、配列番号３２である。

【0087】

ヌクレオチド配列に関して、本明細書で使用される、「最適化された」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指し、この場合、ポリヌクレオチド配列は、このポリヌクレオチド配列の特性を増強するように突然変異している。一部の実施形態では、最適化は、転写レベルを上昇させるか、翻訳レベルを上昇させるか、定常状態におけるｍＲＮＡレベルを上昇させるか、基本転写因子などの調節タンパク質への結合を増大もしくは低下させるか、スプライシングを増大もしくは低下させるか、またはポリヌクレオチド配列によりもたらされるポリペプチドの収量を増大させるようになされる。ヌクレオチド配列を最適化するように、ポリヌクレオチド配列に対してなされる変化の例は、コドン最適化、Ｇ／Ｃ含量最適化、リピート配列の除去、ＡＴリッチエレメントの除去、潜在スプライス部位の除去、転写または翻訳を抑制するシス活性化エレメントの除去、ｐｏｌｙ－Ｔまたはｐｏｌｙ－Ａ配列の付加または除去、コザックコンセンサス配列など、転写を増強する転写開始部位の近傍における配列の付加、ステムループ構造を形成しうる配列の除去、不安定化配列の除去、ＣｐＧモチーフの除去、および２つまたはそれ以上のこれらの組合せを含む。

【0088】

ポリヌクレオチド配列
本開示のある特定の態様は、遺伝子治療のためのＡＡＶベクターの欠陥を克服することを目的とする。特に、本開示の一部の態様は、例えば、治療用タンパク質および／または治療用ｍｉＲＮＡをコードする、遺伝子カセットを含む核酸分子を対象とする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、凝固因子を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ｍｉＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つの非コード領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの非コード領域は、プロモーター配列、イントロン、調節エレメント、３’ＵＴＲポリ（Ａ）配列、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、調節エレメントは、転写後調節エレメントである。

【0089】

一実施形態では、遺伝子カセットは、一本鎖核酸である。別の実施形態では、遺伝子カセットは、二本鎖核酸である。別の実施形態では、遺伝子カセットは、クローズドエンド二本鎖ｃｅＤＮＡである。

【0090】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ｍＴＴＲプロモーターにより駆動される、コドン最適化ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列と、合成イントロンとを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、参照によりその全体において組み入れられる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１５８７９号において開示されているヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１５８７９において記載されている遺伝子カセットである、「ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ」である。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号３２を含む。

【0091】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＸＴＥＮ １４４ペプチドと融合された、Ｂドメイン欠失型（ＢＤＤ）コドン最適化ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＢＤＤｃｏＦＶＩＩＩ）をコードする、コドン最適化ｃＤＮＡを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号９として示された、ヌクレオチド配列のセットを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１４として示された、ヌクレオチド配列のセットを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号３３として示された、ヌクレオチド配列のセットを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号３５として示された、ヌクレオチド配列のセットを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＸＴＥＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

【0092】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ｍＴＴＲプロモーターにより駆動される、コドン最適化ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列と、合成イントロンとを含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルをさらに含む。

【0093】

一部の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドをコードする、コドン最適化核酸分子を対象とする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、全長ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。他の実施形態では、核酸分子は、ＦＶＩＩＩのＢドメインの全部または一部が欠失した、Ｂドメイン欠失型（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。特定の一実施形態では、核酸分子は、配列番号１０またはその断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。

【0094】

一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、シグナルペプチドまたはその断片を含むＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。他の実施形態では、核酸分子は、シグナルペプチドを欠くＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

【0095】

本明細書で使用される、「ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチド」とは、そうでないことが指定されない限りにおいて、凝固におけるその正常の役割下にある、機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。「ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチド」という用語は、凝固経路における、全長野生型第ＶＩＩＩ因子の機能を保持する、その機能的断片、変異体、類似体、または誘導体を含む。「ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチド」は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩＩポリペプチド、またはＦＶＩＩＩと互換的に使用される。ＦＶＩＩＩ機能の例は、凝固を活性化させる能力、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、またはＣａ２^＋およびリン酸脂質の存在下において、第ＩＸ因子と共に、テナーゼ複合体を形成し、次いで、テナーゼ複合体が、第Ｘ因子を、活性化形態であるＸａへと転換する能力を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、第１の鎖が、ＦＶＩＩＩ重鎖を有し、第２の鎖が、ＦＶＩＩＩ軽鎖を有する、２つのポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、単鎖ＦＶＩＩＩである。単鎖ＦＶＩＩＩは、成熟ヒトＦＶＩＩＩ配列（配列番号２０）に対応する、アミノ酸残基１６４５および／または１６４８において、１つまたはそれ以上の突然変異または置換を含有しうる。参照によりその全体において本明細書に組み入れられる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４５７８４号を参照されたい。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスのＦＶＩＩＩタンパク質でありうる。加えて、ヒトに由来するＦＶＩＩＩと、他の種に由来するＦＶＩＩＩとの間の比較は、機能に要求される可能性が高い、保存的残基を同定した。例えば、Ｃａｍｅｒｏｎら（１９８５）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、７９：３１７～２２；および米国特許第６，２５１，６３２号を参照されたい。

【0096】

多数の試験：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭアッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験（また、国際標準比（ＩＮＲ）を決定するのにも使用される）、フィブリノーゲン試験（クラウス法を介することが多い）、血小板カウント、血小板機能試験（ＰＦＡ－１００を介することが多い）、ＴＣＴ、出血時間、混合試験（患者の血漿が、正常血漿と混合された場合に、異常性が是正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、アンチリン酸脂質抗体、Ｄ－二量体、遺伝子的試験（例えば、第Ｖ因子ライデン突然変異である、プロトロンビン突然変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセルヘビ毒時間（ｄＲＶＶＴ）、その他の血小板機能試験、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）、例えば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、またはユーグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）が、ポリペプチドのＦＶＩＩＩ活性について評価するのに利用可能である。

【0097】

ａＰＴＴ試験は、「内因性」経路（また、接触活性化経路とも称される）および共通凝固経路の両方の効能を測定する、性能指標である。この試験は、一般に、市販の組換え凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの凝固活性を測定するのに使用される。ａＰＴＴ試験は、外因性経路を測定する、プロトロンビン時間（ＰＴ）と共に使用される。

【0098】

ＲＯＴＥＭ（登録商標）解析は、止血の全動態：凝固時間、凝固物の形成、凝固物の安定性、および溶解についての情報をもたらす。トロンボエラストメトリーにおける、異なるパラメータは、血漿凝固系の活性、血小板機能、線維素溶解、またはこれらの相互作用に影響を及ぼす、多くの因子に依存する。このアッセイは、二次止血についての全体像をもたらしうる。

【0099】

本明細書で使用される、ＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」は、内部のアミノ酸配列同一性、およびトロンビンによるタンパク質分解性切断の部位により規定される、当技術分野で公知のＢドメイン、例えば、全長ヒトＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ７４１～Ａｒｇ１６４８（配列番号２０）と同じである。他のヒトＦＶＩＩＩドメインは、以下のアミノ酸残基：Ａ１：残基Ａｌａ１～Ａｒｇ３７２；Ａ２：残基Ｓｅｒ３７３～Ａｒｇ７４０；Ａ３：残基Ｓｅｒ１６９０～Ｉｌｅ２０３２；Ｃ１：残基Ａｒｇ２０３３～Ａｓｎ２１７２；Ｃ２：残基Ｓｅｒ２１７３～Ｔｙｒ２３３２により規定される。Ａ３－Ｃ１－Ｃ２の配列は、残基Ｓｅｒ１６９０～Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列である、残基Ｇｌｕ１６４９～Ａｒｇ１６８９は、通例、ＦＶＩＩＩ軽鎖活性化ペプチドと称される。当技術分野では、ブタ、マウス、およびイヌのＦＶＩＩＩについて、Ｂドメインを含むドメインの全てのための境界の位置もまた、公知である。ＢＤＤ ＦＶＩＩＩの例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）である。

【0100】

「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」は、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる、米国特許第６，３１６，２２６号、同第６，３４６，５１３号、同第７，０４１，６３５号、同第５，７８９，２０３号、同第６，０６０，４４７号、同第５，５９５，８８６号、同第６，２２８，６２０号、同第５，９７２，８８５号、同第６，０４８，７２０号、同第５，５４３，５０２号、同第５，６１０，２７８号、同第５，１７１，８４４号、同第５，１１２，９５０号、同第４，８６８，１１２号、および同第６，４５８，５６３号において開示されている、完全な欠失または部分的欠失を有しうる。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩの他の例については、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる、Ｈｏｅｂｅｎ Ｒ．Ｃ．ら（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５（１３）：７３１８～７３２３；Ｍｅｕｌｉｅｎら（１９８８）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、２（４）：３０１～６；Ｔｏｏｌｅら（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８３、５９３９～５９４２；Ｅａｔｏｎら（１９８６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５：８３４３～８３４７；Ｓａｒｖｅｒら（１９８７）、ＤＮＡ、６：５５３～５６４；欧州特許第２９５５９７号；および国際公開第ＷＯ９１／０９１２２号、同第ＷＯ８８／００８３１号、および同第ＷＯ８７／０４１８７号において開示されている。前出の欠失の各々は、なされる。任意のＦＶＩＩＩ配列内において施される。

【0101】

コドン最適化
一実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、核酸配列がコドン最適化された、単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドをコードし、コドン最適化にかけられる、出発核酸配列は、配列番号３２である。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドをコードする配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドをコードする配列は、マウスにおける発現のためにコドン最適化されている。

【0102】

多様な宿主の形質転換のための、遺伝子または核酸分子のコード領域を指す場合における、「コドン最適化された」という用語は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを変更せずに、宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための、遺伝子内または核酸分子のコード領域内における、コドンの変更を指す。このような最適化は、少なくとも１つのコドン、または１つを超えるコドン、または著明数のコドンを、この生物の遺伝子内において、より高頻度で使用される、１つまたはそれ以上のコドンにより置き換えることを含む。

【0103】

任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列内の逸脱は、遺伝子をコードする配列の変異を可能とする。各コドンは、３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを含むヌクレオチドは、４つの特異的塩基に限定されるので、６４の可能なヌクレオチドの組合せが存在し、このうちの６１は、アミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは、翻訳を終止させるシグナルをコードする）。結果として、多くのアミノ酸は、１つを超えるコドンにより指示される。例えば、アミノ酸である、アラニンおよびプロリンは、４つのトリプレットによりコードされ、セリンおよびアルギニンは、６つのトリプレットによりコードされるのに対し、トリプトファンおよびメチオニンは、１つだけのトリプレットによりコードされる。この縮重は、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更せずに、ＤＮＡの塩基組成が、広範にわたり変動することを可能とする。

【0104】

多くの生物は、成長するペプチド鎖内における、特定のアミノ酸の挿入をコードする、特定のコドンの使用についてのバイアスを提示する。生物間における、コドンの優先性、またはコドン使用の差違である、コドンバイアスは、遺伝子コードの縮重によりもたらされ、多くの生物の間で、十分に記録されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、ｍＲＮＡの翻訳の効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性、および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子のアベイラビリティーに依存すると考えられる。細胞内において選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において、最も高頻度で使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき、所与の生物における最適の遺伝子発現について微調整される。

【0105】

多種多様な動物種、植物種、および微生物種について利用可能な、多数の遺伝子配列を踏まえ、コドン使用の相対頻度が計算されている。コドン使用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２０１２年６月１８日閲覧）において閲覧可能な「コドン使用データベース」において利用可能である。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８：２９２（２０００）を参照されたい。

【0106】

所与のポリペプチド配列をコードする、最適化された頻度における、ランダムなコドンの割当ては、各アミノ酸について、コドン頻度を計算し、次いで、コドンを、ポリペプチド配列へと、ランダムに割り当てることにより、手作業でなされる。加えて、多様なアルゴリズムおよびコンピュータソフトウェアプログラムは、最適の配列を計算するのに使用される。

【0107】

他の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、１つもしくはそれ以上のＣｐＧモチーフの除去、および／または少なくとも１つのＣｐＧモチーフのメチル化によりさらに最適化される。本明細書で使用される、「ＣｐＧモチーフ」とは、グアノシンへのリン酸結合により連結された、非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列を指す。「ＣｐＧモチーフ」という用語は、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの両方を包含する。非メチル化ＣｐＧモチーフは、細菌由来の核酸およびウイルス由来の核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）内では一般的であるが、脊椎動物ＤＮＡでは、抑制され、大部分がメチル化される。したがって、非メチル化ＣｐＧモチーフは、迅速な炎症応答を惹起するように、哺乳動物宿主を刺激する。Ｋｌｉｎｍａｎら（１９９６）、ＰＮＡＳ、９３：２８７９～２８８３。ＣｐＧ除去の例示的方法については、Ｙｅｗ，Ｎ．Ｓ．ら（２００２）、ＭｏｌＴｈｅｒ．、５（６）：７３１～７３８；および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０１０３０９号において記載されている。一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、少数のＣｐＧモチーフを含有するように修飾されている（すなわち、「ＣｐＧ低減型」または「ＣｐＧ欠失型」）。一実施形態では、選択されたアミノ酸のためのコドントリプレット内に配置されたＣｐＧモチーフは、ＣｐＧモチーフを欠く、同じアミノ酸のためのコドントリプレットへと変化させる。一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、自然免疫応答を低減するように最適化されている。

【0108】

本明細書の一部の実施形態では、配列番号９に対する、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子が開示される。

【0109】

本明細書の一部の実施形態では、配列番号３３に対する、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子が開示される。

【0110】

本明細書の一部の実施形態では、配列番号１４に対する、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子が開示される。

【0111】

本明細書の一部の実施形態では、配列番号３５に対する、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子が開示される。

【0112】

異種ヌクレオチド配列
一部の実施形態では、本開示の単離核酸分子は、異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、本開示の単離核酸分子は、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列をさらに含む。異種ヌクレオチド配列は、５’末端、３’末端において、本開示の最適化ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列と連結される場合もあり、最適化ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列の中央部へと挿入される場合もある。したがって、一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によりコードされる異種アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列によりコードされるＦＶＩＩＩアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端へと連結される場合もあり、ＦＶＩＩＩアミノ酸配列内の、２つのアミノ酸の間に挿入される場合もある。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、１つまたはそれ以上の挿入部位において、２つのアミノ酸の間に挿入される。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、それらの各々が、参照によりその全体において組み入れられる、国際公開第ＷＯ２０１３／１２３４５７Ａ１号、同第ＷＯ２０１５／１０６０５２Ａ１号、または米国公開第２０１５／０１５８９２９Ａ１号において開示されている、任意の部位において、本開示の核酸分子によりコードされるＦＶＩＩＩポリペプチド内に挿入される。

【0113】

一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によりコードされる異種アミノ酸配列は、Ｂドメイン内またはその断片内に挿入される。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、野生型成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号２０）のアミノ酸７４５に対応するアミノ酸のすぐ下流のＦＶＩＩＩ内に挿入される。特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩは、野生型成熟ヒトＦＶＩＩＩに対応する、アミノ酸７４６～１６３７（配列番号２０）の欠失を含み、異種ヌクレオチド配列によりコードされる異種アミノ酸配列は、野生型成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号２０）に対応する、アミノ酸７４５のすぐ下流に挿入される。本明細書で言及されるＦＶＩＩＩの挿入部位は、野生型成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号２０）のアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置を指し示す。

【0114】

一部の実施形態では、異種部分は、本開示のタンパク質内に組み込まれた場合における、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の延長と関連する、非構造的特徴または構造的特徴を伴うペプチドまたはポリペプチドである。非限定例は、アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンのＦｃ断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＨＡＰ配列、ＸＴＥＮ配列、トランスフェリンまたはその断片、ＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、アルブミン結合性部分、またはこれらのポリペプチドの、任意の断片、誘導体、変異体、もしくは組合せを含む。特定の一実施形態では、異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン定常領域もしくはその部分、トランスフェリン、アルブミン、またはＰＡＳ配列である。他の関連の態様では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらのエレメントの任意の誘導体、変異体、もしくは組合せなどの非ポリペプチド部分のための接合部位（例えば、アミノ酸であるシステイン）を含みうる。一部の態様では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらのエレメントの任意の誘導体、変異体、もしくは組合せなどの非ポリペプチド部分のための接合部位として機能するアミノ酸である、システインを含む。

【0115】

ある特定の実施形態では、異種部分は、その生体活性または機能に著明に影響を及ぼさずに、ＦＶＩＩＩタンパク質の１つまたはそれ以上の薬物動態特性を改善する。一部の実施形態では、異種部分は、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質の、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける半減期を延長する。ＦＶＩＩＩタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期は、当業者に公知である、任意の方法、例えば、活性アッセイ（発色アッセイまたは１ステップ凝固ａＰＴＴアッセイ）、ＥＬＩＳＡ、ＲＯＴＥＭ（商標）などにより決定される。

【0116】

他の実施形態では、異種部分は、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質またはその断片（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質のタンパク質分解性切断の後において、異種部分を含む断片）の安定性を増大させる。本明細書で使用される、「安定性」という用語は、環境条件（例えば、温度の上昇または低下）に応答した、ＦＶＩＩＩタンパク質の１つまたはそれ以上の物理的特性の維持についての、当技術分野で認識されている尺度を指す。ある特定の態様では、物理的特性は、ＦＶＩＩＩタンパク質の、共有結合構造の維持（例えば、タンパク質分解性切断、望ましくない酸化または脱アミド化の非存在）でありうる。他の態様では、物理的特性はまた、適正なフォールディング状態にあるＦＶＩＩＩタンパク質の存在（例えば、可溶性または不溶性の凝集物または沈殿物の非存在）でもありうる。一態様では、ＦＶＩＩＩタンパク質の安定性は、ＦＶＩＩＩタンパク質の生物物理特性、例えば、熱安定性、ｐＨによるアンフォールディングプロファイル、グリコシル化の安定的除去、可溶性、生化学的機能（例えば、タンパク質、受容体、またはリガンドに結合する能力）など、および／またはこれらの組合せをアッセイすることにより測定される。別の態様では、生化学的機能は、相互作用の結合アフィニティーにより裏付けられる。一態様では、タンパク質の安定性の尺度は、熱安定性、すなわち、熱負荷に対する耐性である。安定性は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ除外クロマトグラフィー）、ＤＬＳ（動的光散乱）など、当技術分野で公知の方法を使用して測定される。熱安定性を測定する方法は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）、円偏光二色性（ＣＤ）、および熱負荷アッセイを含むがこれらに限定されない。

【0117】

一部の実施形態では、異種部分は、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列、断片、変異体、またはこれらの誘導体を含む。本明細書で使用される、「ＸＴＥＮ配列」とは、小型の親水性アミノ酸から主に構成される、非自然発生の、実質的に繰り返しのない配列であって、生理学的条件下において、低度の二次構造または三次構造を有するか、またはこれらを有さない配列により長さが伸張されたポリペプチドを指す。異種部分として、ＸＴＥＮは、半減期延長部分として用いられる。加えて、ＸＴＥＮは、薬物動態パラメータおよび可溶性特徴の増強を含むがこれらに限定されない、所望の特性をもたらしうる。ＸＴＥＮ配列を導入することにより付与される、他の有利な特性は、コンフォメーション柔軟性の増強、水溶性の増強、プロテアーゼ耐性の増大、免疫原性の低下、哺乳動物受容体への結合の低下、または流体力学（またはストークス）半径の増大を含む。

【0118】

ＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩへの挿入または連結のための長さが変動する。一部の実施形態では、本開示に有用なＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００を超えるアミノ酸残基を有する、ペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約２０を超える残基～約３０００アミノ酸残基、３０を超える残基～約２５００残基、４０を超える残基～約２０００残基、５０を超える残基～約１５００残基、６０を超える残基～約１０００残基、７０を超える残基～約９００残基、８０を超える残基～約８００残基、９０を超える残基～約７００残基、１００を超える残基～約６００残基、１１０を超える残基～約５００残基、または１２０を超える残基～約４００残基を有する、ペプチドまたはポリペプチドである。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、長さが４２アミノ酸より長く、かつ、１４４アミノ酸より短いアミノ酸配列を含む。

【0119】

本開示のＸＴＥＮ配列は、５～１４（例えば、９～１４）アミノ酸残基の１つまたはそれ以上の配列モチーフ、または配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む場合があり、モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択される４～６種類のアミノ酸（例えば、５つのアミノ酸）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。ＵＳ２０１０－０２３９５５４Ａ１を参照されたい。

【0120】

本開示のキメラタンパク質内の異種部分として使用されるＸＴＥＮ配列の例については、例えば、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる、米国特許公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９Ａ１号、もしくは同第２０１１／０１７２１４６Ａ１号、または国際公開第ＷＯ２０１００９１１２２Ａ１号、同第ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２号、同第ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８２２８Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１号、または同第ＷＯ２０１１０２８３４４Ａ２号において開示されている。

【0121】

１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列は、ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に挿入される場合もあり、ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列内の、２つのアミノ酸の間に挿入される場合もある。例えば、ＸＴＥＮは、１つまたはそれ以上の挿入部位において、２つのアミノ酸の間に挿入される。ＸＴＥＮの挿入のために許容可能な、ＦＶＩＩＩ内の部位の例は、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み入れられる、国際公開第ＷＯ２０１３／１２３４５７Ａ１号、または米国公開第２０１５／０１５８９２９Ａ１号において見出される。

【0122】

ある特定の実施形態では、異種部分は、ペプチドリンカーである。

【0123】

本明細書で使用される、「ペプチドリンカー」または「リンカー部分」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列内の２つのドメインを接続する、ペプチド配列またはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチド配列または合成ポリペプチド配列）を指す。

【0124】

一部の実施形態では、ペプチドリンカーをコードする、異種ヌクレオチド配列は、本開示の最適化ＦＶＩＩＩポリヌクレオチド配列と、例えば、アルブミンなど、上記で記載された異種部分のうちの１つをコードする、異種ヌクレオチド配列との間に挿入される。ペプチドリンカーは、キメラポリペプチド分子に対して、柔軟性をもたらしうる。リンカーは、典型的に、切断されないが、このような切断が所望される場合もある。一実施形態では、これらのリンカーは、プロセシング時に除去されない。

【0125】

本開示のキメラタンパク質内に存在するリンカーの種類は、切断部位（すなわち、プロテアーゼ切断部位である基質、例えば、第ＸＩａ因子、第Ｘａ因子、またはトロンビン切断部位）を含む、プロテアーゼ切断型リンカーであり、これは、Ｎ末端側もしくはＣ末端側、またはこれらの両側において、さらなるリンカーを含みうる。これらの切断型リンカーは、本開示の構築物へと組み込まれると、異種切断部位を有するキメラ分子を結果としてもたらす。

【0126】

一実施形態では、本開示の核酸分子によりコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖内に組み入れられたＦｃ領域を形成するように、ｃｓｃＦｃリンカーを介して連結された、２つまたはそれ以上のＦｃドメインまたはＦｃ部分を含む。ｃｓｃＦｃリンカーは、少なくとも１つの細胞内プロセシング部位、すなわち、細胞内酵素により切断される部位により挟まれる。少なくとも１つの細胞内プロセシング部位におけるポリペプチドの切断は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むポリペプチドを結果としてもたらす。

【0127】

本開示の構築物内では、場合により、例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質を、Ｆｃ領域へと接続する、他のペプチドリンカーも使用される。本開示との関連で使用される、一部の例示的リンカーは、例えば、下記でより詳細に記載されるアミノ酸である、ＧｌｙＳｅｒを含むポリペプチドを含む。

【0128】

一実施形態では、ペプチドリンカーは、合成ペプチドリンカー、すなわち、非自然発生のペプチドリンカーである。一実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直鎖状配列を、それが、天然において連結されたり、天然において遺伝子融合されたりしない、アミノ酸の第２の直鎖状配列へと連結するか、または遺伝子融合させるアミノ酸配列を含む、ペプチド（またはポリペプチド）（自然発生の場合もあり、自然発生でない場合もある）を含む。例えば、一実施形態では、ペプチドリンカーは、自然発生のポリペプチドの修飾形態（例えば、付加、置換、または欠失などの突然変異を含む）である、非自然発生のポリペプチドを含みうる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、非自然発生のアミノ酸を含みうる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、天然において生じない、直鎖状配列内において生じる、自然発生のアミノ酸を含みうる。さらに別の実施形態では、ペプチドリンカーは、自然発生のポリペプチド配列を含みうる。

【0129】

別の実施形態では、ペプチドリンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを含むか、またはこれらからなる。本明細書で使用される、「ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。ある特定の実施形態では、前記ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーの、他の２つの配列の間に挿入される。他の実施形態では、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーのうちの別の配列の一方または両方の末端において接合される。さらに他の実施形態では、２つまたはそれ以上のｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカー内に、直列で組み込まれる。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、上部ヒンジ領域のうちの少なくとも一部（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子に由来する）、中央部ヒンジ領域のうちの少なくとも一部（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子に由来する）、および一連のｇｌｙ／ｓｅｒアミノ酸残基を含む。

【0130】

本開示のペプチドリンカーは、少なくとも１アミノ酸の長さであり、長さが変動するペプチドリンカーでありうる。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１～約５０アミノ酸の長さである。この文脈で使用される、「約」という用語は、±２アミノ酸残基を指し示す。リンカー長は、正の整数であるので、約１～約５０アミノ酸の長さは、１～３から４８～５２アミノ酸の長さを意味する。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１０～約２０アミノ酸の長さである。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１５～約５０アミノ酸の長さである。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約２０～約４５アミノ酸の長さである。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１５～約３５または約２０～約３０アミノ酸の長さである。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、または２０００アミノ酸の長さである。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、２０または３０アミノ酸の長さである。

【0131】

一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸を含みうる。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１，０００アミノ酸を含みうる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００アミノ酸を含みうる。ペプチドリンカーは、１～５アミノ酸、１～１０アミノ酸、１～２０アミノ酸、１０～５０アミノ酸、５０～１００アミノ酸、１００～２００アミノ酸、２００～３００アミノ酸、３００～４００アミノ酸、４００～５００アミノ酸、５００～６００アミノ酸、６００～７００アミノ酸、７００～８００アミノ酸、８００～９００アミノ酸、または９００～１０００アミノ酸を含みうる。

【0132】

ペプチドリンカーは、当技術分野で公知の技法を使用して、ポリペプチド配列へと導入される。修飾は、ＤＮＡ配列解析により確認される。プラスミドＤＮＡは、作製されるポリペプチドの安定的作製のために、宿主細胞を形質転換するのに使用される。

【0133】

発現制御配列
一部の実施形態では、本開示の核酸分子またはベクターは、少なくとも１つの発現制御配列をさらに含む。例えば、本開示の単離核酸分子は、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結される。発現制御配列は、例えば、プロモーター配列、またはプロモーター－エンハンサーの組合せでありうる。

【0134】

構成的哺乳動物プロモーターは、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼのためのプロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、および他の構成的プロモーターを含むがこれらに限定されない。真核細胞内で構成的に機能する、例示的なウイルスプロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長鎖末端反復（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルス、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターに由来するプロモーターを含む。当業者には、他の構成的プロモーターも公知である。本開示の遺伝子発現配列に有用なプロモーターはまた、誘導的プロモーターも含む。誘導的プロモーターは、誘導剤の存在下において発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下において、転写および翻訳を促進するように誘導される。当業者には、他の誘導的プロモーターも公知である。

【0135】

一実施形態では、本開示は、組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下における、導入遺伝子の発現を含む。別の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝細胞における、導入遺伝子の発現を選択的に増強する。ある特定の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝細胞、類洞細胞、および／または内皮細胞における、導入遺伝子の発現を選択的に増強する。特定の一実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、内皮細胞における、導入遺伝子の発現を選択的に増強する。ある特定の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、筋細胞、中枢神経系、眼、肝臓、心臓、またはこれらの任意の組合せにおける、導入遺伝子の発現を選択的に増強する。肝臓特異的プロモーターの例は、マウストランスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、天然ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ヒトアルファ１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、ｍＴＴＲプロモーターを含む。ｍＴＴＲプロモーターについては、Ｃｏｓｔａら（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：４６９７において記載されている。ＦＶＩＩＩプロモーターについては、ＦｉｇｕｅｉｒｅｄｏおよびＢｒｏｗｎｌｅｅ、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：１１８２８～１１８３８において記載されている。一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーター（例えば、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター）、筋特異的プロモーター（例えば、筋クレアチニンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）プロモーター、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター、およびデスミン（ＤＥＳ）プロモーター）、合成プロモーター（例えば、ＳＰｃ５－１２プロモーター、２Ｒ５Ｓｃ５－１２プロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、およびｔＭＣＫプロモーター）、またはこれらの任意の組合せから選択される。

【0136】

一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、肝臓へとターゲティングされる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子の発現は、肝細胞へとターゲティングされる。他の実施形態では、導入遺伝子の発現は、内皮細胞へとターゲティングされる。特定の一実施形態では、導入遺伝子の発現は、内因性ＦＶＩＩＩを天然において発現する任意の組織へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、中枢神経系へとターゲティングされる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子の発現は、ニューロンへとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、求心性ニューロンへとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、遠心性ニューロンへとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、介在ニューロンへとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、グリア細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、星状細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、希突起膠細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、ミクログリアへとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、上衣細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、シュワン細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、サテライト細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、筋組織へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、平滑筋へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、心筋へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、骨格筋へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、眼へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、光受容体細胞へとターゲティングされる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、網膜神経節細胞へとターゲティングされる。

【0137】

本明細書で開示される核酸分子内において有用である、他のプロモーターは、マウストランスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、天然ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ヒトアルファ１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン（ＴＴＰ；また、ＺＦＰ３６としても公知である）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、筋クレアチニンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）プロモーター、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター、デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、２Ｒ５Ｓｃ５－１２プロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、およびｔＭＣＫプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、またはこれらの任意の組合せを含む。

【0138】

一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。ｍＴＴＲプロモーターの非限定例は、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる、米国公開第ＵＳ２０１９／００４８３６２号において開示されている、ｍＴＴＲ２０２プロモーター、ｍＴＴＲ２０２ｏｐｔプロモーター、およびｍＴＴＲ４８２プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的改変マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的改変マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。ｍＴＴＲ４８２プロモーターの例については、Ｋｙｏｓｔｉｏ－Ｍｏｏｒｅら（２０１６）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．、３：１６００６；およびＮａｍｂｉａｒ Ｂ．ら（２０１７）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８（１）：２３～２８において記載されている。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号１６の核酸配列を含む、肝臓特異的改変マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。

【0139】

治療効能を達成するように、発現レベルは、１つまたはそれ以上のエンハンサーエレメントを使用して、さらに増強される。１つまたはそれ以上のエンハンサーは、単独で施される場合もあり、１つまたはそれ以上のプロモーターエレメントと併せて施される場合もある。典型的に、発現制御配列は、複数のエンハンサーエレメント、および組織特異的プロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサーは、α－１－マイクログロビン／ビクニンエンハンサーの、１つまたはそれ以上のコピーを含む（Ｒｏｕｅｔら（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２０７６５～２０７７３；Ｒｏｕｅｔら（１９９５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２３：３９５～４０４；Ｒｏｕｅｔら（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４：５７７～５８４；Ｉｌｌら（１９９７）、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、８：Ｓ２３～Ｓ３０）。一部の実施形態では、エンハンサーは、ＨＮＦ１、（センス）－ＨＮＦ３、（センス）－ＨＮＦ４、（アンチセンス）－ＨＮＦ１、（アンチセンス）－ＨＮＦ６、（センス）－ＥＢＰ、（アンチセンス）－ＨＮＦ４（アンチセンス）を含む、Ｅｎｈ１を伴う、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６などの肝臓特異的転写因子結合性部位に由来する。

【0140】

一部の実施形態では、エンハンサーエレメントは、１つまたは２つの改変プロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１つまたは２つのアルファ１ミクロビクニンエンハンサー（Ａ１ＭＢ２）、改変マウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）、またはＣＲＭ８エンハンサーを含む。一部の実施形態では、Ａ１ＭＢ２エンハンサーは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５５９１７号において開示されているエンハンサーである。一部の実施形態では、エンハンサーエレメントは、Ａ１ＭＢ２である。一部の実施形態では、エンハンサーエレメントは、複数コピーのＡＩＭＢ２エンハンサー配列を含む。一部の実施形態では、Ａ１ＭＢ２エンハンサーは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列に対して５’側に配置される。一部の実施形態では、Ａ１ＭＢ２エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターなどのプロモーター配列に対して５’側に配置される。一部の実施形態では、エンハンサーエレメントは、配列番号１５の核酸配列を含むＡ１ＭＢ２エンハンサーである。

【0141】

一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、イントロンまたはイントロン配列を含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、自然発生イントロン配列である。一部の実施形態では、イントロン配列は、合成配列である。一部の実施形態では、イントロン配列は、自然発生イントロン配列に由来する。一部の実施形態では、イントロン配列は、ハイブリッド合成イントロンまたはキメライントロンである。一部の実施形態では、イントロン配列は、ニワトリベータ－アクチンイントロン／ウサギベータ－グロビンイントロンからなり、５つの既存のＡＴＧ配列を消失させて、偽翻訳開始を低減するように修飾されたキメライントロンである。ある特定の実施形態では、イントロン配列は、ＳＶ４０小型Ｔイントロンを含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列に対して５’側に配置される。一部の実施形態では、キメライントロンは、ｍＴＴＲプロモーターなどのプロモーター配列に対して５’側に配置される。一部の実施形態では、キメライントロンは、配列番号１７の核酸配列を含む。

【0142】

一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、転写後調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、突然変異型ウッドチャック肝炎ウイルス調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。ＷＰＲＥは、ウイルスベクターにより送達される導入遺伝子の発現を増強すると考えられる。ＷＰＲＥの例については、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９９）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、７３（４）：２８８６～２８９２；Ｌｏｅｂら（１９９９）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０（１４）：２２９５～２３０５において記載されている。一部の実施形態では、ＷＰＲＥは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列に対して３’側に配置される。一部の実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号１８の核酸配列を含む。

【0143】

一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、転写終結因子を含む。一部の実施形態では、転写終結因子は、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列である。転写終結因子の非限定例は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）、サルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐＡ）、または合成ポリアデニル化シグナルに由来する転写終結因子を含む。一実施形態では、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テールは、アクチンポリ（Ａ）部位を含む。一実施形態では、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テールは、ヘモグロビンポリ（Ａ）部位を含む。一部の実施形態では、転写終結因子は、ＢＧＨｐＡである。ＢＧＨｐＡ転写終結因子の例については、Ｗｏｙｃｈｉｋら（１９８４）、ＰＮＡＳ、８１：３９４４～３９４８において記載されている。一部の実施形態では、転写終結因子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列をコードする遺伝子カセットの３’末端に配置される。一部の実施形態では、転写終結因子は、配列番号１９の核酸配列を含むＢＧＨｐＡである。

【0144】

一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、１つまたはそれ以上のＤＮＡ核ターゲティング配列（ＤＴＳ）を含む。ＤＴＳは、このような配列を含有するＤＮＡ分子の、核への移動を促進する。ある特定の実施形態では、ＤＴＳは、ＳＶ４０エンハンサー配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＴＳは、ｃ－Ｍｙｃエンハンサー配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲとの間に配置されたＤＴＳを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、第１のＩＴＲに対して３’側に配置され、かつ、導入遺伝子（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質）に対して５’側に配置されたＤＴＳを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、導入遺伝子に対して３’側に配置され、かつ、核酸分子上の第２のＩＴＲに対して５’側に配置されたＤＴＳを含む。

【0145】

一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）阻害配列を含む。例示的ＴＬＲ９阻害配列については、例えば、Ｔｒｉｅｕら（２００６）、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６（６）：５２７～４４；Ａｓｈｍａｎら、Ｉｎｔ’ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２３（３）：２０３～１４において記載されている。

【0146】

逆位末端反復（ＩＴＲ）配列
本開示のある特定の態様は、第１のＩＴＲ、例えば、５’側ＩＴＲと、第２のＩＴＲ、例えば、３’側ＩＴＲとを含む核酸分子を対象とする。典型的に、ＩＴＲは、原核生物プラスミドからの、パルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ＤＮＡの複製およびレスキューまたは切出しに関与する（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８３、１９８７；Ｓｅｎａｐａｔｈｙら、１９８４；ＧｏｔｔｌｉｅｂａｎｄＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８８）。加えて、ＩＴＲは、ＡＡＶプロウイルスの組込み、およびＡＡＶ ＤＮＡの、ビリオンへのパッケージングに要求される、最小限の配列であるとも考えられる（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９）。これらのエレメントは、パルボウイルスゲノムの効率的複製に不可欠である。ＩＴＲ機能に必須である、最小限の規定的エレメントは、Ｒｅｐ結合性部位および末端分離部位＋ヘアピン形成を可能とする可変性回文配列であることが仮定される。回文ヌクレオチド領域は、通常、シス側において、ＤＮＡ複製起点、およびウイルスのためのパッケージングシグナルとして、一体に機能する。ＩＴＲ内の相補性配列は、ＤＮＡ複製時に、ヘアピン構造へとフォールディングする。一部の実施形態では、ＩＴＲは、Ｔ字形ヘアピン構造へとフォールディングする。他の実施形態では、ＩＴＲは、Ｔ字形以外のヘアピン構造、例えば、Ｕ字形ヘアピン構造へとフォールディングする。データは、ＡＡＶ ＩＴＲのＴ字形ヘアピン構造が、ＩＴＲにより挟まれた導入遺伝子の発現を阻害しうることを示唆する。例えば、Ｚｈｏｕら（２０１７）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、７：５４３２を参照されたい。Ｔ字形ヘアピン構造を形成しないＩＴＲを利用することにより、この阻害形態は回避される。したがって、ある特定の態様では、ＡＡＶ以外のＩＴＲを含むポリヌクレオチドは、Ｔ字形ヘアピンを形成するＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドと比較して、導入遺伝子の発現を改善した。

【0147】

本明細書で使用される、「逆位末端反復」（または「ＩＴＲ」）とは、下流において、その逆相補体、すなわち、回文配列を後続させた、ヌクレオチド（初期配列）のセットを含む、一本鎖核酸配列の５’末端または３’末端に配置された、核酸部分配列を指す。初期配列と、逆相補体との間に介在するヌクレオチド配列は、ゼロを含む、任意の長さでありうる。一実施形態では、本開示に有用なＩＴＲは、１つまたはそれ以上の「回文配列」を含む。ＩＴＲは、任意の数の機能を有しうる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、Ｔ字形ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、Ｔ字形以外のヘアピン構造、例えば、Ｕ字形ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の生存を、長期間にわたり促進する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の、恒久的生存（例えば、細胞の全寿命にわたり）を促進する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の安定性を促進する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の保持を促進する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の存続を促進する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、細胞核内の核酸分子の分解を阻害または阻止する。

【0148】

したがって、本明細書で使用される「ＩＴＲ」は、それ自身に折り返しフォールディングし、二本鎖セグメントを形成する場合がある。例えば、配列であるＧＡＴＣＸＸＸＸＧＡＴＣは、フォールディングされると、二重ヘリックスを形成するように、ＧＡＴＣの初期配列と、その相補体（３’ＣＴＡＧ５’）とを含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、初期配列と、逆相補体との間に、連続回文配列（例えば、ＧＡＴＣＧＡＴＣ）を含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、初期配列と、逆相補体との間に、中断回文配列（例えば、ＧＡＴＣＸＸＸＸＧＡＴＣ）を含む。一部の実施形態では、連続回文配列または中断回文配列の相補性部分は、互いと相互作用して、「ヘアピンループ」構造を形成する。一本鎖ヌクレオチド分子上の少なくとも２つの相補性配列が塩基対合して二本鎖部分を形成すると、本明細書で使用される、「ヘアピンループ」構造が生じる。一部の実施形態では、ＩＴＲの一部だけが、ヘアピンループを形成する。他の実施形態では、ＩＴＲの全体が、ヘアピンループを形成する。

【0149】

本開示では、少なくとも１つのＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス以外の（ＡＡＶ以外の）ＩＴＲである。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、パルボウイルス科の、ＡＡＶ以外のメンバーのＩＴＲである。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ディペンドウイルス属またはエリスロウイルス属の、ＡＡＶ以外のメンバーのＩＴＲである。

【0150】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、ボカウイルス属、ディペンドウイルス属、エリスロウイルス属、アムドウイルス属、パルボウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、コントラウイルス属、アベパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、テトラパルボウイルス属、アンビデンソウイルス属、ブレビデンソウイルス属、ヘパンデンソウイルス属、ペンスチルデンソウイルス属、ならびにこれらの任意の組合せに由来する、ＡＡＶ以外のゲノムのＩＴＲである。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）に由来する。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、パルボウイルスである、エリスロウイルスＢ１９（ヒトウイルス）に由来する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ディペンドパルボウイルス属に由来する。一実施形態では、ディペンドパルボウイルス属は、ディペンドウイルス属ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）株である。具体的な実施形態では、ＧＰＶ株は、弱毒化ＧＰＶ株、例えば、ＧＰＶ ８２－０３２１Ｖ株である。別の特異的実施形態では、ＧＰＶ株は、病原性ＧＰＶ株、例えば、ＧＰＶ Ｂ株である。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）またはマスコビーダックパルボウイルス（ＭＤＰＶ）のＩＴＲである。

【0151】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、パルボウイルスである、エリスロウイルスＢ１９（また、パルボウイルスＢ１９としても公知である（本明細書ではまた、「Ｂ１９」、霊長動物１型エリスロパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、およびエリスロウイルスとも称される））のＩＴＲである。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）のＩＴＲである。

【0152】

ある特定の実施形態では、２つのＩＴＲのうちの１つのＩＴＲは、ＡＡＶのＩＴＲである。他の実施形態では、構築物内の２つのＩＴＲのうちの１つのＩＴＲは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、およびこれらの任意の組合せから選択されるＡＡＶ血清型のＩＴＲである。特定の一実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２、例えば、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲに由来する。

【0153】

本開示のある特定の態様では、核酸分子は、５’側ＩＴＲおよび３’側ＩＴＲである、２つのＩＴＲを含み、５’側ＩＴＲは、核酸分子の５’末端に配置され、３’側ＩＴＲは、核酸分子の３’末端に配置される。核酸分子の第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、同じゲノム、例えば、同じウイルスのゲノムに由来する場合もあり、異なるゲノム、例えば、２つまたはそれ以上の異なるウイルスゲノムのゲノム（また、「ハイブリッド」ＩＴＲとしても公知である）に由来する場合もある。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、Ｂ１９ゲノムに由来し、第２のＩＴＲは、ＧＰＶに由来する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、ＧＰＶゲノムに由来し、第２のＩＴＲは、Ｂ１９に由来する。

【0154】

ある特定の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）に由来するＩＴＲの全部または一部を含むか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ＨＢｏＶ１に由来するＩＴＲの全部または一部を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、第１のＩＴＲの逆相補体である。一部の実施形態では、第１のＩＴＲは、第２のＩＴＲの逆相補体である。一部の実施形態では、ＨＢｏＶ１に由来する、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成することが可能である。ある特定の実施形態では、ヘアピン構造は、Ｔ字形ヘアピンを含まない。

【0155】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１、２、２１～３０に示されたヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなり、この場合、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、それが由来する野生型ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、野生型ＨＢｏＶ１ ＩＴＲに由来する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、野生型Ｂ１９ ＩＴＲに由来する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、野生型ＧＰＶ ＩＴＲに由来する。

【0156】

一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１、２、２１～３０に示されたヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなり、この場合、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成することが可能である。ある特定の実施形態では、ヘアピン構造は、Ｔ字形ヘアピンを含まない。

【0157】

当業者に、本明細書で記載される、第１のＩＴＲ配列のうちのいずれかは、本明細書で記載される、第２のＩＴＲ配列のうちのいずれかとマッチされることが察知されるであろう。一部の実施形態では、本明細書で記載される、第１のＩＴＲ配列は、５’側ＩＴＲ配列である。一部の実施形態では、本明細書で記載される、第２のＩＴＲ配列は、３’側ＩＴＲ配列である。一部の実施形態では、本明細書で記載される、第２のＩＴＲ配列は、５’側ＩＴＲ配列である。一部の実施形態では、本明細書で記載される、第１のＩＴＲ配列は、３’側ＩＴＲ配列である。当業者は、遺伝子カセットの構成に関して、本明細書で記載される、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲの適切な配向性を決定することができるであろう。

【0158】

別の特定の実施形態では、ＩＴＲは、その５’末端および３’末端において、ＡＡＶゲノムに由来しないＩＴＲを含むように遺伝子操作された合成配列である。別の特定の実施形態では、ＩＴＲは、その５’末端および３’末端において、ＡＡＶ以外のゲノムのうちの１つまたはそれ以上に由来するＩＴＲを含むように遺伝子操作された合成配列である。本発明の核酸分子内に存在する、２つのＩＴＲは、同じＡＡＶ以外のゲノムの場合もあり、異なるＡＡＶ以外のゲノムの場合もある。特に、ＩＴＲは、同じＡＡＶ以外のゲノムに由来しうる。具体的な実施形態では、本発明の核酸分子内に存在する、２つのＩＴＲは、同じであり、特に、ＡＡＶ２ ＩＴＲでありうる。

【0159】

一部の実施形態では、ＩＴＲ配列は、１つまたはそれ以上の回文配列を含む。本明細書で開示されるＩＴＲの回文配列は、天然の回文配列（すなわち、天然において見出される配列）、偽回文配列などの合成配列（すなわち、天然において見出されない配列）、およびこれらの組合せまたは修飾形態を含むがこれらに限定されない。

【0160】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピンループ構造を形成する。一実施形態では、第１のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。別の実施形態では、第２のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。さらに別の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲのいずれも、ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、Ｔ字形ヘアピン構造を形成しない。ある特定の実施形態では、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、Ｔ字形以外のヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、Ｔ字形以外のヘアピン構造は、Ｕ字形ヘアピン構造を含む。

【0161】

一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸分子内のＩＴＲは、転写活性化ＩＴＲでありうる。転写活性化ＩＴＲは、少なくとも１つの転写活性エレメントの組入れにより転写活性化された、野生型ＩＴＲの全部または一部を含みうる。多様な種類の転写活性エレメントが、この文脈における使用のために適する。一部の実施形態では、転写活性エレメントは、構成的転写活性エレメントである。構成的転写活性エレメントは、持続レベルの遺伝子転写をもたらし、導入遺伝子が、持続ベースで発現されることが所望される場合に好ましい。他の実施形態では、転写活性エレメントは、誘導的転写活性エレメントである。誘導的転写活性エレメントは、一般に、誘導因子（または誘導条件）の非存在下において、低活性を呈し、誘導因子（または誘導条件への切換え）の存在下において、上方調節される。発現が、ある特定の時点もしくはある特定の位置に限り所望されるか、または誘導剤を使用して、発現レベルを滴定することが所望される場合に、誘導的転写活性エレメントは、好ましい場合がある。転写活性エレメントはまた、組織特異的でもありうる；すなわち、ある特定の組織または細胞型だけにおいて活性を呈する。

【0162】

転写活性エレメントは、様々な形で、ＩＴＲへと組み込まれる。一部の実施形態では、転写活性エレメントは、ＩＴＲの任意の部分に対して５’側、またはＩＴＲの任意の部分に対して３’側に組み込まれる。他の実施形態では、転写活性化ＩＴＲの転写活性エレメントは、２つのＩＴＲ配列の間にある。転写活性エレメントが、隔てられなければならない、２つまたはそれ以上のエレメントを含む場合、これらのエレメントは、ＩＴＲの部分と交互に存在する。一部の実施形態では、ＩＴＲのヘアピン構造は、欠失し、転写エレメントの逆位リピートにより置き換えられる。この後者の配置ならば、構造内の欠失部分を模倣するヘアピンを創出するであろう。転写活性化ＩＴＲ内に、複数のタンデム転写活性エレメントが存在する場合もあり、これらは、隣接する場合もあり、隔てられる場合もある。加えて、タンパク質結合性部位（例えば、Ｒｅｐ結合性部位）も、転写活性化ＩＴＲの転写活性エレメントへと導入される。転写活性エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの転写の制御が、ＲＮＡを形成することを可能とする、任意の配列を含む場合があり、例えば、下記に規定される、転写活性エレメントを含みうる。

【0163】

転写活性化ＩＴＲは、比較的限定的なヌクレオチド配列の長さにおいて、核酸分子へと、転写活性化およびＩＴＲ機能の両方をもたらし、これは、核酸分子から運ばれ、発現される導入遺伝子の長さを効果的に最大化する。転写活性エレメントの、ＩＴＲへの組込みは、様々な形で達せられる。ＩＴＲ配列、および転写活性エレメントの配列要件の比較は、ＩＴＲ内のエレメントをコードする方式に対する洞察をもたらしうる。例えば、転写活性は、転写活性エレメントの機能的エレメントを複製するＩＴＲ配列内における、特異的変化の導入を介して、ＩＴＲへと付加される。当技術分野では、特異的部位において、特定のヌクレオチド配列を、効率的に付加し、欠失させ、かつ／または変化させる、多数の技法が存在する（例えば、ＤｅｎｇおよびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ（１９９２）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００：８１～８８を参照されたい）。転写活性化ＩＴＲを創出する、別の方式は、ＩＴＲ内の所望の位置における、制限部位の導入を伴う。加えて、当技術分野で公知の方法を使用して、複数の転写活性化エレメントが、転写活性化ＩＴＲへと組み込まれる。

【0164】

例示を目的として述べると、転写活性化ＩＴＲは、ＴＡＴＡｂｏｘ、ＧＣｂｏｘ、ＣＣＡＡＴｂｏｘ、Ｓｐ１部位、Ｉｎｒ領域、ＣＲＥ（ｃＡＭＰ調節エレメント）部位、ＡＴＦ－１／ＣＲＥ部位、ＡＰＢβｂｏｘ、ＡＰＢαｂｏｘ、ＣＡｒＧｂｏｘ、ＣＣＡＣｂｏｘ、または当技術分野で公知の、転写に関与する、他の任意のエレメントなど、１つまたはそれ以上の転写活性エレメントの組入れにより作出される。

【0165】

ベクター系
本開示の一部の実施形態は、本明細書で記載される、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドをコードする、１つまたはそれ以上のコドン最適化核酸分子を含むベクター、ベクターを含む宿主細胞、およびベクターを使用して、出血障害を処置する方法を対象とする。本開示は、対象における発現の増大を裏付け、遺伝子治療法において使用された場合に、潜在的に、治療的効能の増大を結果としてもたらす、最適化ＦＶＩＩＩ配列を含むベクターを提供することにより、当技術分野における、重要な必要を満たす。

【0166】

本開示に適するベクターは、発現ベクター、ウイルスベクター、およびプラスミドベクターを含む。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。

【0167】

本明細書で使用される、「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞へと導入された場合に、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメント、またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製および翻訳に必要なエレメントを含有する、任意の核酸構築物を指す。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、およびこれらの誘導体を含みうる。

【0168】

本開示の発現ベクターは、本明細書で記載されるＢＤＤ ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、最適化ポリヌクレオチドを含むであろう。一実施形態では、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩタンパク質の最適化コード配列は、発現制御配列に作動可能に連結される。本明細書で使用される、２つの核酸配列は、それらが、各構成要素の核酸配列が、その機能性を保持することを可能とするような形で、共有結合的に連結される場合に、作動可能に連結されている。コード配列と、遺伝子発現制御配列とは、それらが、コード配列の発現もしくは転写および／または翻訳を、遺伝子発現制御配列の影響下または制御下に置くような形で、共有結合的に連結される場合に、作動可能に連結されていると言われる。２つのＤＮＡ配列は、５’側遺伝子発現配列内におけるプロモーターの誘導が、コード配列の転写を結果としてもたらし、２つのＤＮＡ配列の間における連結の性格が、（１）フレームシフト突然変異の導入を結果としてもたらしたり、（２）プロモーター領域が、コード配列の転写を方向付ける能力に干渉したり、（３）対応するＲＮＡ転写物が、タンパク質へと翻訳される能力に干渉したりしない場合に、作動可能に連結されていると言われる。したがって、結果として得られる転写物が、所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳されるように、遺伝子発現配列が、このコード核酸配列の転写をもたらすことが可能であった場合に、遺伝子発現配列は、コード核酸配列に作動可能に連結されているであろう。

【0169】

ウイルスベクターは、以下のウイルス：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウスの乳腺腫瘍ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス；レンチウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン－バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；およびレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスに由来する核酸配列を含むがこれらに限定されない。当技術分野で周知である、他のベクターを、たやすく援用することができる。ある特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が、目的の遺伝子により置き換えられた、非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。一実施形態では、ウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスである、アデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であり、かつ、広範にわたる細胞型および種に感染することが可能であるように操作される。

【0170】

本開示に従い、ほぼ任意の血清型に由来する、異なるＡＡＶベクター配列のうちの１つまたはそれ以上が使用される。特定のＡＡＶベクター配列の選出しは、目的の指向性、要求されるベクター収量など、公知のパラメータにより導かれるであろう。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸レベルおよび核酸レベルにおいて、著明な相同性を有するゲノム配列を有し、類縁の遺伝子機能のセットをもたらし、類縁のビリオンを産生し、同様に複製され、アセンブルする。多様なＡＡＶ血清型のゲノム配列、およびゲノム類似性の概観については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９７）、Ｊ．Ｖｉｒ．、７１：６８２３～３３；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３）、Ｊ．Ｖｉｒ．、４５：５５５～６４；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９９）、Ｊ．Ｖｉｒ．、７３：１３０９～１３１９；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８）、Ｊ．Ｖｉｒ．、７２：３０９～３１９；またはＷｕら（２０００）、Ｊ．Ｖｉｒ．、７４：８６３５～４７を参照されたい。ＡＡＶ血清型１、２、３、４、および５は、本開示の文脈における使用のためのＡＡＶヌクレオチド配列の、例示的な供給源である。ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ９、または、例えば、カプシドシャッフリング法およびＡＡＶカプシドライブラリーにより得られるか、もしくは新規にデザインされるか、開発されるか、もしくは進化したＩＴＲに由来する、新規に開発されたＡＡＶ様粒子もまた、ある特定の開示への適用に適する。Ｄａｌｋａｒａら（２０１３）、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、５（１８９）：１８９～７６；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ ＭＡ（２０１４）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１５（７）：４５５を参照されたい。

【0171】

他のベクターは、プラスミドベクターを含む。当技術分野では、プラスミドベクターについて、広範に記載されており、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照されたい。過去数年間において、プラスミドベクターは、宿主ゲノム内における複製、および宿主ゲノムへの組込みが不可能であるために、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、遺伝子を、細胞へと送達するために、特に有利であることが見出されている。これらのプラスミド、しかし、宿主細胞と適合性のプロモーターを有することは、ペプチドを、プラスミド内に作動可能にコードされた遺伝子発現させることが可能である。市販品の供給元から入手可能であり、一般に使用される、一部のプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、多様なｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、多様なｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。具体的プラスミドについてのさらなる例は、全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）製である、ｐｃＤＮＡ３．１、型番：Ｖ７９０２０；ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、型番：Ｖ８７０２０；ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ、型番：Ｖ８６３２０；およびｐＢｕｄＣＥ４．１、型番：Ｖ５３２２０を含む。他のプラスミドも、当業者に周知である。加えて、プラスミドは、ＤＮＡの特異的断片を除去および／または付加するのに、標準的な分子生物学法を使用してデザインされた特注品でありうる。

【0172】

ある特定の実施形態では、ベクター内に、例えば、最適化ＦＶＩＩＩ導入遺伝子に作動可能に連結された、１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を組み入れることが有用であろう。ベクター内に組み入れられたｍｉＲＮＡ標的配列の１つを超えるコピーは、系の効能を増大させうる。例えば、１つを超える導入遺伝子を発現させるベクターは、同じ場合もあり、異なる場合もある、１つを超えるｍｉＲＮＡ標的配列の制御下にある導入遺伝子を有しうる。ｍｉＲＮＡ標的配列は、タンデムでありうるが、他の配置もまた、組み入れられる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含有する、導入遺伝子の発現カセットはまた、ベクター内に、アンチセンス配向性でも挿入される。ｍｉＲＮＡ標的配列の例については、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００７／０００６６８、ＷＯ２００４／０９４６４２、ＷＯ２０１０／０５５４１３、またはＷＯ２０１０／１２５４７１において記載されている。しかし、ある特定の他の実施形態では、ベクターは、任意のｍｉＲＮＡ標的配列を組み入れないであろう。ｍｉＲＮＡ標的配列を組み入れるのか、組み入れないのか（そして、どのくらい組み入れるのか）の選択は、意図される組織標的、要求される発現レベルなど、公知のパラメータにより導かれるであろう。

【0173】

宿主細胞
本開示はまた、本開示の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供する。本明細書で使用される、「形質転換」という用語は、広義において、レシピエント宿主細胞への、ＤＮＡの導入であって、遺伝子型を変化させ、結果として、レシピエント細胞の変化をもたらす導入を指すように使用されるものとする。

【0174】

「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ法を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターにより形質転換された細胞を指す。本開示の宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物由来であり；最も好ましくは、ヒト由来またはマウス由来である。当業者は、それらの目的に最も良く適した、特定の宿主細胞株を、優先的に決定する能力を伴うと見なされている。例示的宿主細胞株は、ＣＨＯ、ＤＧ４４、およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣細胞株、ＤＨＦＲ欠失）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓細胞株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を伴う、ＣＶＩ細胞の派生細胞）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓細胞株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３－Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＮＳ０、ＣＡＰ、ＢＨＫ２１、およびＨＥＫ２９３（ヒト腎臓）を含むがこれらに限定されない。特定の一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＮＳ０細胞、およびＣＡＰ細胞からなる群から選択される。宿主細胞株は、典型的に、商業サービスである、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公刊された文献から入手可能である。

【0175】

本開示の単離核酸分子またはベクターの、宿主細胞への導入は、当業者に周知である、多様な技法により達せられる。これらは、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡを伴う細胞融合、マイクロインジェクション、および無傷ウイルスによる感染を含むがこれらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、２４．２章、４７０～４７２頁、「Ｖｅｃｔｏｒｓ」、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．１９８８）を参照されたい。プラスミドは、電気穿孔を介して、宿主へと導入される。形質転換細胞は、軽鎖および重鎖の作製に適切な条件下において増殖させ、重鎖タンパク質および／または軽鎖タンパク質の合成についてアッセイされる。例示的アッセイ法は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞分取解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などを含む。

【0176】

本開示の単離核酸分子またはベクターを含む宿主細胞は、適切な増殖培地中において増殖させる。本明細書で使用される、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖に要求される栄養物質を含有する培地を意味する。細胞の増殖に要求される栄養物質は、炭素供給源、窒素供給源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、および増殖因子を含みうる。場合により、培地は、１つまたはそれ以上の選択因子を含有しうる。場合により、培地は、子ウシ血清またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有しうる。一実施形態では、培地は、実質的に、ＩｇＧを含有しない。増殖培地は、一般に、例えば、ＤＮＡ構築物上の選択用マーカーにより補完されるか、またはＤＮＡ構築物を共トランスフェクトされた、薬物選択または必須栄養物質の欠損により、ＤＮＡ構築物を含有する細胞について選択するであろう。培養された哺乳動物細胞は、一般に、市販の血清含有培地または無血清培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中において増殖させる。一実施形態では、培地は、ＣＤｏｐｔｉＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）である。別の実施形態では、培地は、ＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）である。使用される特定の細胞株に適切な培地の選択は、当業者の水準内にある。

【0177】

一部の実施形態では、本発明における使用に適する宿主細胞は、昆虫由来である。一部の実施形態では、適切な昆虫宿主細胞は、例えば、ツマジロクサヨトウ（Ｓｆ）から単離された細胞株、またはイラクサキンウワバ（Ｔｎｉ）から単離された細胞株を含む。当業者は、任意のＳｆ細胞株またはＴｎｉ細胞株の適切性をたやすく決定することが可能であろう。例示的昆虫宿主細胞は、限定せずに述べると、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞を含む。例示的昆虫宿主細胞はまた、限定せずに述べると、偶発的なウイルス夾雑を含有しない、任意のＳｆ細胞株またはＴｎｉ細胞株、例えば、Ｓｆ－ラブドウイルス陰性（Ｓｆ－ＲＶＮ）細胞およびＴｎ－ノダウイルス陰性（Ｔｎ－ＮＶＮ）細胞も含む。他の適切な宿主昆虫細胞も、当業者に公知である。特定の一実施形態では、昆虫宿主細胞は、Ｓｆ９細胞である。

【0178】

本開示の態様は、本明細書で記載される核酸分子をクローニングする方法であって、複雑な二次構造が可能な核酸分子を、適切なベクターへと挿入する工程と、結果として得られるベクターを、適切な細菌宿主株へと導入する工程とを含む方法をもたらす。当技術分野で公知の通り、核酸の複雑な二次構造（例えば、長い回文領域）は、不安定であり、細菌宿主株内のクローニングが困難な場合がある。例えば、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ以外のパルボウイルスＩＴＲ、例えば、ＨＢｏＶ１ ＩＴＲ）を含む、本開示の核酸分子は、常套的方法を使用するクローニングが困難な場合がある。長いＤＮＡ回文配列は、ＤＮＡの複製を阻害し、大腸菌、バチルス属、連鎖球菌属、ストレプトミセス属、出芽酵母、マウス、およびヒトのゲノム内において不安定である。これらの影響は、鎖内塩基対合による、ヘアピンまたは十字型構造の形成から生じる。大腸菌内では、ＤＮＡ複製の阻害は、ＳｂｃＣ突然変異体またはＳｂｃＤ突然変異体において、著明に克服される場合がある。ＳｂｃＤは、ＳｂｃＣＤ複合体のヌクレアーゼサブユニットであり、ＳｂｃＣは、ＡＴＰアーゼサブユニットである。大腸菌ＳｂｃＣＤ複合体は、長い回文配列の複製を阻止する一因となる、エクソヌクレアーゼ複合体である。ＳｂｃＣＤ複合体は、ＡＴＰ依存性二本鎖ＤＮＡエクソヌクレアーゼ活性、およびＡＴＰ非依存性一本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を伴う核である。ＳｂｃＣＤは、ＤＮＡ回文配列を認識し、生じるヘアピン構造を攻撃することにより、複製フォークを崩壊させうる。

【0179】

ある特定の実施形態では、適切な細菌宿主株は、十字型ＤＮＡ構造を分解することが不可能である。ある特定の実施形態では、適切な細菌宿主株は、ＳｂｃＣＤ複合体内の破壊を含む。一部の実施形態では、ＳｂｃＣＤ複合体内の破壊は、ＳｂｃＣ遺伝子内および／またはＳｂｃＤ遺伝子内の遺伝子破壊を含む。ある特定の実施形態では、ＳｂｃＣＤ複合体内の破壊は、ＳｂｃＣ遺伝子内の遺伝子破壊を含む。当技術分野では、ＳｂｃＣ遺伝子内の遺伝子破壊を含む、多様な細菌宿主株が公知である。例えば、限定せずに述べると、細菌宿主株である、ＰＭＣ１０３は、遺伝子型である、ｓｂｃＣ、ｒｅｃＤ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦを含み；細菌宿主株である、ＰＭＣ１０７は、遺伝子型である、ｒｅｃＢＣ、ｒｅｃＪ、ｓｂｃＢＣ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦを含み；細菌宿主株である、ＳＵＲＥは、遺伝子型である、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＪ、ｓｂｃＣ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦ、ｕｍｕＣ、ｕｖｒＣを含む。したがって、一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸分子をクローニングする方法は、複雑な二次構造が可能な核酸分子を、適切なベクターへと挿入する工程と、結果として得られるベクターを、宿主株である、ＰＭＣ１０３、ＰＭＣ１０７、またはＳＵＲＥへと導入する工程とを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される核酸分子をクローニングする方法は、複雑な二次構造が可能な核酸分子を、適切なベクターへと挿入する工程と、結果として得られるベクターを、宿主株であるＰＭＣ１０３へと導入する工程とを含む。

【0180】

当技術分野では、適切なベクターが公知であり、本明細書の他の箇所で記載されている。ある特定の実施形態では、本開示のクローニング法における使用に適するベクターは、低コピー量ベクターである。ある特定の実施形態では、本開示のクローニング法における使用に適するベクターは、ｐＢＲ３２２である。

【0181】

したがって、本開示は、核酸分子をクローニングする方法であって、複雑な二次構造が可能な核酸分子を、適切なベクターへと挿入する工程と、結果として得られるベクターを、ＳｂｃＣＤ複合体内の破壊を含む、細菌宿主株へと導入する工程とを含み、核酸分子は、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）、および第２のＩＴＲを含み、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは、配列番号１２～２３に示されたヌクレオチド配列、またはこれらの機能的誘導体と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む方法を提供する。

【0182】

ポリペプチドの作製
本開示はまた、本開示の核酸分子によりコードされるポリペプチドも提供する。他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、本開示の単離核酸分子を含むベクターによりコードされる。さらに他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、本開示の単離核酸分子を含む宿主細胞により作製される。

【0183】

他の実施形態では、本開示はまた、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドを作製する方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドが作製される条件下において本開示の宿主細胞を培養する工程、およびＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドを回収する工程を含む方法も提供する。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドの発現は、同じ条件下において培養されるが、親ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列である、配列番号３２を含む、参照ヌクレオチド配列を含む宿主細胞と比べて増大させる。

【0184】

他の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドの発現を増大させる方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドが、核酸分子により発現される条件下において本開示の宿主細胞を培養する工程を含み、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドの発現は、同じ条件下において培養されるが、配列番号３２を含む参照核酸分子を含む宿主細胞と比べて増大される方法を提供する。

【0185】

他の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドの収量を改善する方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドが、核酸分子により作製される条件下において宿主細胞を培養する工程を含み、ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドの収量は、同じ条件下において培養されるが、配列番号３２を含む参照核酸配列を含む宿主細胞と比べて増大される方法を提供する。

【0186】

本開示の最適化核酸分子から、ＦＶＩＩＩタンパク質を組換えにより作製するために、様々な方法が利用可能である。所望の配列を有するポリヌクレオチドは、デノボの固相ＤＮＡ合成により作製される場合もあり、既に製造されたポリヌクレオチドの、ＰＣＲによる突然変異誘発を介して作製される場合もある。オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、ヌクレオチド配列内に、置換、挿入、欠失、または変更（例えば、コドンの変更）を製造するための１つの方法である。例えば、出発ＤＮＡは、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせることにより変更される。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込む、鋳型の第２の相補鎖の全体を合成するのに使用される。一実施形態では、遺伝子操作、例えば、プライマーベースのＰＣＲ突然変異誘発は、本開示のポリヌクレオチドを作製するための、本明細書で規定される変更を組み込むのに十分である。

【0187】

組換えタンパク質の作製のために、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、本開示の最適化ポリヌクレオチド配列は、適切な発現媒体、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメント、またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターへと挿入される。

【0188】

本開示のポリヌクレオチド配列は、ベクターへと、適正なリーディングフレーム内に挿入される。次いで、発現ベクターは、ポリペプチドを発現する適切な標的細胞にトランスフェクトされる。当技術分野で公知のトランスフェクション法は、リン酸カルシウム沈殿（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７８、Ｃｅｌｌ、１４：７２５）、および電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９８２、ＥＭＢＯ Ｊ．、１：８４１）を含むがこれらに限定されない。本明細書で記載されるＦＶＩＩＩタンパク質を、真核細胞内において発現させるのに、様々な宿主発現ベクター系が利用される。一実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＨｅＬａ細胞）を含む動物細胞である。本開示のポリヌクレオチド配列はまた、ＦＶＩＩＩタンパク質の分泌を可能とするシグナル配列もコードしうる。当業者は、ＦＶＩＩＩタンパク質が翻訳されるときに、シグナル配列は、細胞により切断されて、成熟タンパク質を形成することを理解するであろう。当技術分野では、多様なシグナル配列、例えば、天然第ＶＩＩ因子シグナル配列、天然第ＩＸ因子シグナル配列、およびマウスＩｇＫ軽鎖シグナル配列が公知である。代替的に、シグナル配列が組み入れられない場合、ＦＶＩＩＩタンパク質は、細胞を溶解させることにより回収される。

【0189】

本開示のＦＶＩＩＩタンパク質は、齧歯動物、ヤギ、ヒツジ、ブタ、またはウシなどのトランスジェニック動物において合成される。「トランスジェニック動物」という用語は、外来遺伝子を、それらのゲノムへと組み込んだ、非ヒト動物を指す。この遺伝子は、生殖細胞系列組織内に存在するため、親から、子孫へと受け渡される。外因性遺伝子は、単一細胞胚へと導入される（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４４３８）。当技術分野では、免疫グロブリン分子を産生するトランスジェニック動物を含む、トランスジェニック動物を作製する方法が公知である（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：６３７６；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、１９８３、Ｃｅｌｌ、３４：３３５；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０６：３３２；Ｒｉｔｃｈｉｅら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：５１７；Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅら、２００３、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、５９：８３１；Ｒｏｂｌら、２００３、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、５９：１０７；Ｍａｌａｓｓａｇｎｅら、２００３、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ１０（３）：２６７）。

【0190】

発現ベクターは、組換え作製タンパク質の、容易な精製または同定を可能とするタグをコードしうる。例は、ハイブリッドタンパク質が作製され；ｐＧＥＸベクターが、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを伴うタンパク質を発現させるのに使用されるように、本明細書で記載されるＦＶＩＩＩタンパク質のコード配列が、ｌａｃ Ｚコード領域とインフレームにおいて、ベクターへとライゲーションされたベクターである、ｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３、ＥＭＢＯ Ｊ．、２：１７９１）を含むがこれらに限定されない。これらのタンパク質は、通例、可溶性であり、グルタチオン－アガロースビーズへの吸着に続く、遊離グルタチオンの存在下における溶出により、細胞から、容易に精製される。ベクターは、精製の後における、タグの容易な除去のための切断部位（例えば、ＰｒｅＣｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｅａｐａｃｋ、Ｎ．Ｊ．））を含む。

【0191】

本開示の目的で、多数の発現ベクター系が援用される。これらの発現ベクターは、典型的に、宿主生物内において、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの不可分の部分として複製可能である。発現ベクターは、プロモーター（例えば、天然会合プロモーターまたは異種プロモーター）、エンハンサー、シグナル配列、スプライスシグナル、エンハンサーエレメント、および転写終結配列を含むがこれらに限定されない発現制御配列を含みうる。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換するか、またはこれらにトランスフェクトすることが可能なベクター内の、真核プロモーター系である。発現ベクターはまた、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントも利用しうる。他の発現ベクターは、内部にリボソーム結合性部位を伴う、ポリシストロニック系の使用を伴う。

【0192】

一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列により形質転換された細胞の検出を可能とする、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、またはネオマイシン耐性）（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号を参照されたい）を含有する。ＤＮＡを、それらの染色体へと組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能とする、１つまたはそれ以上のマーカーを導入することにより選択される。マーカーは、栄養要求性宿主に、原栄養性をもたらす場合もあり、殺生物剤（例えば、抗生剤）耐性をもたらす場合もあり、銅などの重金属に対する耐性をもたらす場合もある。選択用マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列へと、直接連結される場合もあり、共形質転換により、同じ細胞へと導入される場合もある。

【0193】

最適化ＦＶＩＩＩ配列を発現させるために有用なベクターの例は、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）である。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および同リーダー配列を含有する。このベクターは、可変領域遺伝子および定常領域遺伝子の組込み時における、極めて高レベルの抗体の発現、細胞のトランスフェクションに続く、Ｇ４１８含有培地中の選択およびメトトレキサートの増幅を結果としてもたらすことが見出されている。ベクター系についてはまた、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる、米国特許第５，７３６，１３７号および同第５，６５８，５７０号においても教示されている。この系は、例えば、１日当たり細胞１個当たり＞３０ｐｇの高発現レベルをもたらす。他の例示的ベクター系も、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号において開示されている。

【0194】

他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ポリシストロニック構築物を使用して発現される。これらの発現系では、多量体結合性タンパク質の、複数のポリペプチドなど、複数の目的の遺伝子産物が、単一のポリシストロニック構築物から作製される。これらの系は、真核宿主細胞内において、比較的高レベルのポリペプチドを作製するのに、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用するので有利である。適合性のＩＲＥＳ配列は、これもまた、本明細書に組み入れられる、米国特許第６，１９３，９８０号において開示されている。

【0195】

より一般には、ポリペプチドをコードする、ベクターまたはＤＮＡ配列が製造されると、発現ベクターは、適切な宿主細胞へと導入される。すなわち、宿主細胞は、形質転換される。プラスミドの、宿主細胞への導入は、上記で論じられた通り、当業者に周知である、多様な技法により達せられる。形質転換細胞は、ＦＶＩＩＩポリペプチドの作製に適切な条件下において増殖させ、ＦＶＩＩＩポリペプチドの合成についてアッセイされる。例示的アッセイ法は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞分取解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などを含む。

【0196】

組換え宿主からの、ポリペプチドの単離のための工程についての記載において、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、そうでないことが明確に指定されない限りにおいて、ポリペプチドの供給源を表示するように、互換的に使用される。言い換えると、「細胞」からの、ポリペプチドの回収は、スピンダウンされた全細胞からの回収を意味する場合もあり、培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物を意味する場合もある。

【0197】

タンパク質発現のために使用される宿主細胞株は、本開示の単離核酸は、ヒト細胞内の発現のために最適化されるので、好ましくは、哺乳動物由来であり；最も好ましくは、ヒト由来またはマウス由来である。例示的宿主細胞株については、上記で記載されている。ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドを作製する方法についての、一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。ＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドを作製する方法についての、別の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。

【0198】

本開示のポリペプチドをコードする遺伝子はまた、細菌または酵母または植物細胞など、非哺乳動物細胞内においても発現される。この点で、細菌など、哺乳動物以外の多様な単細胞微生物、すなわち、培養物中の増殖または発酵が可能な微生物もまた形質転換できることが察知されるであろう。形質転換を受けやすい細菌は、大腸菌またはサルモネラ属の株などの腸内細菌科；枯草菌などのバチルス科；肺炎球菌属；連鎖球菌属およびインフルエンザ菌のメンバーを含む。細菌内において発現されると、ポリペプチドは、典型的に、封入体の一部となることも、さらに察知されるであろう。ポリペプチドは、単離され、精製され、次いで、機能的分子へとアセンブルされなければならない。

【0199】

代替的に、本開示の最適化ヌクレオチド配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入、および、後続する、トランスジェニック動物のミルク中における発現のために、導入遺伝子内に組み込まれる（例えば、Ｄｅｂｏｅｒら、ＵＳ５，７４１，９５７；Ｒｏｓｅｎ、ＵＳ５，３０４，４８９；およびＭｅａｄｅら、ＵＳ５，８４９，９９２を参照されたい）。適切な導入遺伝子は、カゼインまたはベータラクトブロブリンなどの乳腺特異的遺伝子に由来するプロモーターおよびエンハンサーと、作動可能に連結されたポリペプチドのコード配列を含む。

【0200】

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける作製は、スケールアップが、所望のポリペプチドを大量にもたらすことを可能とする。当技術分野では、組織培養条件下において、哺乳動物細胞を培養するための技法が公知であり、例えば、エアリフト型反応槽内、もしくは連続攪拌型反応槽内における、均質の懸濁培養物、または例えば、中空糸内、マイクロカプセル内、アガロースマイクロビーズ上、もしくはセラミックカートリッジ上に、固定化もしくは封入された細胞培養物を含む。必要であり、かつ／または所望である場合、ポリペプチドの溶液は、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成の後、または本明細書で記載されるＨＩＣクロマトグラフィー工程の前もしくは後において、常套的クロマトグラフィー法例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ－セルロースを介するクロマトグラフィー、または（免疫）アフィニティークロマトグラフィーにより精製される。場合により、下流における精製を容易とするように、アフィニティータグ配列（例えば、Ｈｉｓ（６）タグ）が、ポリペプチド配列へと接合されるか、またはポリペプチド配列内に組み入れられる場合がある。

【0201】

発現されると、ＦＶＩＩＩタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動など（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照されたい）を含む、当技術分野の標準的手順に従い精製される。少なくとも約９０～９５％の均質性を有する、実質的に純粋なタンパク質が、医薬への使用に好ましく、９８～９９％またはそれ以上の均質性が、最も好ましい。

【0202】

医薬組成物
本開示の単離核酸分子、核酸分子によりコードされる、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド、ベクター、または宿主細胞を含有する組成物は、適切な、薬学的に許容される担体を含有しうる。例えば、組成物は、活性化合物の、作用部位への送達のためにデザインされる製造物への処理を容易とする賦形剤および／または補助剤を含有しうる。

【0203】

医薬組成物は、ボーラス注射による非経口投与（すなわち、静脈内投与、皮下投与、または筋内投与）のために製剤化される。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプルまたは保存剤を添加された複数回投与用容器により提示される。組成物は、油性媒体中または水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取り、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤など、製剤化剤を含有しうる。代替的に、有効成分は、適切な媒体、例えば、発熱物質非含有水による構成のための粉末形態の場合もある。

【0204】

非経口投与に適する製剤はまた、水溶性形態、例えば、水溶性塩形態にある活性化合物の水溶液も含む。加えて、適切な油性注射用懸濁液としての、活性化合物の懸濁液も投与される。適切な親油性溶媒または媒体は、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドを含む。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘稠度を増大させる物質であって、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、およびデキストランを含む物質を含有しうる。場合により、懸濁液はまた、安定化剤も含有しうる。リポソームもまた、細胞または間質腔への送達のために、本開示の分子を封入するのに使用される。例示的な、薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性である溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、水、生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。一部の実施形態では、組成物は、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、組成物は、保湿剤など、薬学的に許容される物質、または有効成分の保管寿命または効能を増強する、保湿剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤など、少量の補助物質を含む。

【0205】

本開示の組成物は、例えば、液体（例えば、注射用溶液および注入用溶液）剤形、分散液剤形、懸濁液剤形、半固体剤形、および固体剤形を含む、様々な形態でありうる。好ましい形態は、投与方式および治療適用に依存する。

【0206】

組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高薬物濃度に適する、他の秩序構造として製剤化される。滅菌注射用溶液は、有効成分を、適切な溶媒中に、要求量において、要求に応じて、上記で列挙された成分のうちの１つまたは組合せと共に組み込むのに続き、濾過滅菌を行うことにより製造される。一般に、分散液は、有効成分を、塩基性分散媒と、上記で列挙された成分に由来する、他の要求される成分とを含有する滅菌媒体へと組み込むことにより製造される。滅菌注射用溶液を製造するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、あらかじめ滅菌濾過された溶液から、有効成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持される場合もあり、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持することにより維持される場合もあり、界面活性剤を使用することにより維持される場合もある。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。

【0207】

有効成分は、制御放出製剤またはデバイスにより製剤化される。このような製剤およびデバイスの例は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む。生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸が使用される。当技術分野では、このような製剤およびデバイスを製造するための方法が公知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。

【0208】

注射用デポ製剤は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマー中において、薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより作製される。薬物対ポリマー比、および援用されるポリマーの性格に応じて、薬物放出速度が制御される。他の例示的生体分解性ポリマーは、ポリオルトエステルおよびポリ無水物である。注射用デポ製剤はまた、薬物を、リポソーム内またはマイクロエマルジョン内に封入することによっても製造される。

【0209】

組成物へは、補助活性化合物が組み込まれる場合もある。一実施形態では、本開示のキメラタンパク質は、別の凝固因子、またはその変異体、断片、類似体、もしくは誘導体と共に製剤化される。例えば、凝固因子は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン、フォンウィレブラント因子、もしくは組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）、または前出のうちのいずれかの活性化形態を含むがこれらに限定されない。止血剤の凝固因子はまた、抗フィブリン溶解薬、例えば、イプシロン－アミノカプロン酸、トラネキサム酸も含みうる。

【0210】

投与レジメンは、所望の最適の応答をもたらすように調整される。例えば、単回ボーラスが投与される場合もあり、時間経過にわたり、何回分かに分割された用量が投与される場合もあり、治療状況の緊急性により指し示される通り、用量は、これに応じて、低減される場合もあり、増大される場合もある。投与の容易さ、および投与量の均一性のために、非経口組成物を、単位剤形において製剤化することが有利である。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８０）を参照されたい。

【0211】

活性化合物に加えて、液体剤形は、水、エチルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドルフルルリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルなどの不活性成分を含有しうる。

【0212】

適切な医薬担体の非限定例もまた、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」において記載されている。賦形剤の一部の例は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物はまた、ｐＨ緩衝試薬および保湿剤または乳化剤も含有しうる。

【0213】

経口投与のために、医薬組成物は、常套的手段により製造される、錠剤またはカプセルの形態を取りうる。組成物はまた、液体、例えば、シロップまたは懸濁液としても製造される。液体は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化可食性脂肪）、乳化薬剤（レシチンまたはアカシアガム）、非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）、および保存剤（例えば、メチル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸）を含みうる。製剤はまた、芳香剤、着色剤、および甘味剤も含みうる。代替的に、組成物は、水または別の適切な媒体により構成するための、乾燥生成物として提供される。

【0214】

口腔内投与のために、組成物は、常套的プロトコールに従う、錠剤またはトローチ剤の形態を取りうる。

【0215】

吸入投与のために、本開示に従う使用のための化合物は、賦形剤を伴うか、またはこれを伴わない、噴霧化エアゾールの形態において、または、場合により、高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、または他の適切なガスによる、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレーの形態において送達されると好都合である。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、計量された量を送達するバルブを装備することにより決定される。インヘラーまたは吸入器における使用のための、化合物と、ラクトースまたはデンプンなど、適切な粉末基剤とによる粉末ミックスを含有する、例えば、ゼラチンによるカプセルおよびカートリッジが製剤化される。

【0216】

医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなど、常套的な座剤用基剤を含有する、座剤または停留浣腸として、直腸内投与のためにも製剤化される。

【0217】

一実施形態では、医薬組成物は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチド、第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドをコードする最適化核酸分子、核酸分子を含むベクター、またはベクターと薬学的に許容される担体とを含む宿主細胞を含む。一部の実施形態では、組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、および経口投与からなる群から選択される経路により投与される。非経口投与は、静脈内投与または皮下投与でありうる。

【0218】

処置法
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、本明細書で開示される核酸分子、ベクター、ポリペプチド、または医薬組成物を投与する工程を含む方法を対象とする。

【0219】

一部の実施形態では、本開示は、出血障害を処置する方法を対象とする。一部の実施形態では、本開示は、Ａ型血友病を処置する方法を対象とする。

【0220】

単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、静脈内投与、皮下投与、筋内投与されるか、または任意の粘膜表面を介して、例えば、経口、舌下、口腔内、舌下、鼻腔内、直腸内、膣内、または肺内経路を介して投与される。単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドはまた、神経内、眼内、および髄腔内においても投与される。凝固因子タンパク質は、キメラタンパク質の、所望の部位への徐放を可能とする、生体ポリマーによる固体支持体内に植え込まれる場合もあり、これへと連結される場合もある。

【0221】

一実施形態では、単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドの投与経路は、非経口経路である。本明細書で使用される、「非経口」という用語は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋内投与、皮下投与、直腸内投与、または膣内投与を含む。一部の実施形態では、単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、静脈内投与される。これらの投与形態の全ては、本開示の範囲内にあることが、明確に想定されるが、投与のための形態は、特に、静脈内注射または動脈内注射または滴下のための注射用溶液であろう。

【0222】

状態の処置のための、本開示の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者が、ヒトであるのか、動物であるのか、投与される他の医薬、および処置が、予防処置であるのか、治療処置であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変動する。通例、患者は、ヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む、非ヒト哺乳動物もまた、処置される場合がある。処置投与量は、安全性および効能を最適化する、当業者に公知である、規定の方法を使用して滴定される。

【0223】

本開示の核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、場合により、処置（例えば、予防的処置または治療的処置）を必要とする障害または状態の処置において効果的である、他の薬剤と組み合わせて投与される。

【0224】

本明細書で使用された、補助療法を伴うか、またはこれらと組み合わせた、本開示の単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドの投与とは、治療および開示されるポリペプチドの、逐次投与もしくは逐次適用、同時投与もしくは同時適用、併存投与もしくは併存適用、併用投与もしくは併用適用、共時投与もしくは共時適用、または並行投与もしくは並行適用を意味する。当業者は、組合せ療法レジメンの、多様な成分の投与または適用が、処置の効能を増強するようなタイミングでなされることを察知するであろう。当業者（例えば、医師）であれば、効果的な組合せ療法レジメンを、選択された補助療法、および本明細書の教示に基づき、不要な実験を伴わずに、たやすく識別することが可能であろう。

【0225】

本開示の単離核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、１つまたはそれ以上の薬剤と共に、またはこれらと組み合わせて（例えば、組合せ治療レジメンをもたらすように）使用されることも、さらに察知されるであろう。本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと組み合わされる、例示的薬剤は、処置される特定の障害のための、現行の標準治療を表す薬剤を含む。このような薬剤は、化学物質の場合もあり、天然におけるバイオ医薬品の場合もある。「バイオ医薬品」または「バイオ医薬剤」という用語とは、治療剤としての使用のために意図される、生物および／またはそれらの産物から作製される、任意の薬学的活性剤を指す。

【0226】

本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと組み合わせて使用される薬剤の量は、対象により変動する場合もあり、当技術分野で公知の内容に従い投与される場合もある。例えば、Ｂｒｕｃｅ Ａ Ｃｈａｂｎｅｒら、「Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」、ＧＯＯＤＭＡＮおよびＧＩＬＭＡＮ、「ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ」、１２３３～１２８７（Ｊｏｅｌ Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、９版、１９９６）を参照されたい。別の実施形態では、標準治療と符合する、このような薬剤の量が投与される。

【0227】

一実施形態では、本明細書ではまた、本明細書で開示される核酸分子と、核酸分子を、それを必要とする対象へと投与するための指示書とを含むキットも開示される。本明細書の別の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子を作製するためのバキュロウイルス系が開示される。核酸分子は、昆虫細胞内において作製される。別の実施形態では、発現構築物のためのナノ粒子送達系が提供される。発現構築物は、本明細書で開示される核酸分子を含む。

【0228】

遺伝子治療
一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、遺伝子治療において使用される。本明細書で開示される、最適化ＦＶＩＩＩ核酸分子は、ＦＶＩＩＩの発現が要求される、任意の文脈において使用される。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む。

【0229】

例えば、体細胞の遺伝子治療は、Ａ型血友病のための可能な処置として探索されている。遺伝子治療は、ベクターの単回投与の後に、ＦＶＩＩＩの持続的な内因性産生を介して、疾患を治癒させる、その潜在的可能性のために、血友病のための、特に魅力的な処置である。Ａ型血友病は、その臨床症状が、血漿中において、微量（２００ｎｇ／ｍｌ）で循環する、単一の遺伝子産物（ＦＶＩＩＩ）の欠如に、完全に帰せられるため、遺伝子置換アプローチに十分に適する。

【0230】

一態様では、本明細書で記載される核酸分子は、ＡＡＶによる遺伝子治療において使用される。ＡＡＶは、多数の哺乳動物細胞に感染することが可能である。例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５：３２５１～３２６０；およびＧｒｉｍｍら（１９９９）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：２４４５～２４５０を参照されたい。ｒＡＡＶベクターは、細胞内における、遺伝子産物の発現を方向付ける調節配列の制御下にある、目的の遺伝子、またはその断片をコードする核酸配列を保有する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、担体、および投与に適する、さらなる成分と共に製剤化される。

【0231】

別の態様では、本明細書で記載される核酸分子は、レンチウイルスによる遺伝子治療において使用される。レンチウイルスは、ウイルスゲノムが、ＲＮＡである、ＲＮＡウイルスである。宿主細胞にレンチウイルスが感染すると、ゲノムＲＮＡが、ＤＮＡ中間体へと逆転写され、感染された細胞の染色体ＤＮＡへと、極めて効率的に組み込まれる。一部の実施形態では、レンチウイルスは、担体、および投与に適する、さらなる成分と共に製剤化される。別の態様では、本明細書で記載される核酸分子は、アデノウイルス療法において使用される。遺伝子治療のためのアデノウイルスの使用についての総説は、例えば、Ｗｏｌｄら（１９８５）、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１３（６）：４２１～３３において見出される。別の態様では、本明細書で記載される核酸分子は、非ウイルス性遺伝子治療において使用される。

【0232】

本開示の最適化ＦＶＩＩＩタンパク質は、哺乳動物、例えば、ヒト患者のｉｎ ｖｉｖｏにおいて作製され、遺伝子治療アプローチを、出血凝固障害、関節血症、筋内出血、口内出血、出血、筋肉への出血、経口出血、外傷、外傷頭部、消化器出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内の出血、後腹膜腔内の出血、および腸腰筋鞘内の出血からなる群から選択される、出血疾患または出血障害の処置に使用すれば、治療的に有益であろう。一実施形態では、出血疾患または出血障害は、血友病である。別の実施形態では、出血疾患または出血障害は、Ａ型血友病である。これは、適切な発現制御配列に作動可能に連結された、最適化ＦＶＩＩＩコード核酸の投与を伴う。ある特定の実施形態では、これらの配列は、ウイルスベクターへと組み込まれる。このような遺伝子治療に適するウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクターでありうる。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子を欠失させている。他の実施形態では、配列は、当業者に公知である、非ウイルスベクターへも組み込まれる。

【0233】

別の態様では、本明細書で開示される方法は、生物の遺伝情報（例えば、ゲノム）の、ターゲティングされた特異的変更のための技法をもたらす。本明細書で使用される、「変更」または「遺伝情報の変更」という用語は、細胞のゲノム内の、任意の変化を指す。遺伝性障害の処置の文脈では、変更は、挿入、欠失、および／または補正を含みうるがこれらに限定されない。

【0234】

一部の態様では、変更はまた、遺伝子のノックイン、ノックアウト、またはノックダウンも含みうる。本明細書で使用される、「ノックイン」という用語は、ＤＮＡ配列またはその断片の、ゲノムへの付加を指す。ノックインされる、このようなＤＮＡ配列が、全遺伝子を含む場合もあり、全遺伝子または遺伝子が、遺伝子または前出の任意の部分もしくは断片と関連する調節配列を含む場合もある。例えば、突然変異体遺伝子を保有する細胞のゲノムへと、野生型タンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入される。ノックイン戦略は、全体的にも、部分的にも、欠損遺伝子を置き換えることを必要としない。場合によって、ノックイン戦略は、既存の配列の、用意された配列による置換、例えば、突然変異体対立遺伝子の、野生型コピーによる置換をさらに伴いうる。「ノックアウト」という用語は、遺伝子または遺伝子発現の消失を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊をもたらす、ヌクレオチド配列の欠失または付加によりノックアウトされる。別の例として述べると、遺伝子は、遺伝子の一部を、非関与性の配列により置き換えることによりノックアウトされる。本明細書で使用される、「ノックダウン」とは、遺伝子またはその遺伝子産物（複数可）の発現の低減を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能が弱められる場合もあり、タンパク質レベルが低減または無化される場合もある。

【0235】

一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸配列は、ゲノム編集のために使用される。ゲノム編集とは一般に、ゲノムのヌクレオチド配列を、好ましくは、精密な方式または所定の方式で修飾する工程を指す。本明細書で記載されるゲノム編集法の例は、部位指向ヌクレアーゼを使用して、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、ゲノム内の正確な標的位置で切断し、これにより、一本鎖ＤＮＡ切断または二本鎖ＤＮＡ切断を、ゲノム内の特定の位置において創出する方法を含む。このような切断は、近年、Ｃｏｘら（２０１５）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２１（２）：１２１～３１において総説された通り、相同性指向修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）など、天然の内因性細胞過程により修復される場合があり、規則的に修復されている。これら２つの主要なＤＮＡ修復工程は、代替的経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪは、二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端を直接接続するが、場合によって、遺伝子発現を破壊する場合もあり、増強する場合もある、ヌクレオチド配列の喪失または付加を伴う。ＨＤＲは、規定されたＤＮＡ配列を、切断点に挿入するための鋳型として、相同配列またはドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体など、内因性ゲノム内に存在しうる。代替的に、ドナーは、ヌクレアーゼにより切断される遺伝子座との相同性が大きな領域を有するが、また、切断された標的遺伝子座へと組み込まれる欠失を含む、さらなる配列または配列変化も含有しうる、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルスなどの外因性核酸でありうる。第３の修復機構は、「代替的ＮＨＥＪ」ともまた称され、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じうるという点で、遺伝子結果がＮＨＥＪと同様である、マイクロ相同性媒介型末端結合（ＭＭＥＪ）でありうる。ＭＭＥＪは、より好適な、ＤＮＡ末端の接続による修復結果を駆動するように、ＤＮＡ切断部位を挟む、少数の塩基対による相同配列を使用しうるが、近年の報告は、この工程の分子機構についてさらに解明している（例えば、ＣｈｏおよびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ（２０１５）、Ｎａｔｕｒｅ、５１８、１７４～７６を参照されたい）。一部の場合には、ＤＮＡ切断部位における潜在的なマイクロ相同性についての解析に基づき、可能性が高い修復結果を予測することが可能でありうる。

【0236】

これらのゲノム編集機構の各々は、所望のゲノムの変更を創出するのに使用される。ゲノム編集工程内の段階は、意図される突然変異の近傍部位としての標的遺伝子座内において、１つのＤＮＡ切断、または二本鎖切断もしくは２つの一本鎖切断としての２つのＤＮＡ切断を創出することでありうる。これは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ系など、部位指向ポリペプチドの使用を介して達成される。

【0237】

別の態様では、本明細書で記載される核酸分子は、ＦＶＩＩＩ ｃｅＤＮＡの、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達において使用される。血漿中の核酸の分解を阻み、細胞内へのオリゴヌクレオチドの取込みを容易とするのに、中性脂質、コレステロール、ＰＥＧ、ＰＥＧ化脂質など、他の脂質成分を伴う、カチオン性脂質から形成される脂質ナノ粒子と、オリゴヌクレオチドとが使用されている。このような脂質ナノ粒子は、本明細書で記載される核酸分子を、対象へと送達するのに使用される。

【0238】

本開示は、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドの発現を増大させる方法であって、本開示の単離核酸分子を、それを必要とする対象へと投与する工程を含み、ポリペプチドの発現は、配列番号３２を含む参照核酸分子と比べて増大される方法を提供する。本開示はまた、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を伴うポリペプチドの発現を増大させる方法であって、本開示のベクターを、それを必要とする対象へと投与する工程を含み、ポリペプチドの発現は、参照核酸分子を含むベクターと比べて増大される方法も提供する。

【0239】

本明細書で記載される、多様な態様、実施形態、および選択肢の全ては、任意の変化形および全ての変化形において組み合わされる。

【0240】

本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許適用が、参照により組み入れられるように、具体的、かつ、個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

【0241】

本開示を、一般に記載したが、本明細書で提供される実施例への参照により、さらなる理解が得られる。これらの実施例は、例示だけを目的とするものであり、限定的であることは意図されない。

【実施例1】

【0242】

改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセット
導入遺伝子の発現レベルは、コード配列を、標的宿主のためにコドン最適化することにより上昇させることを仮定した。米国公開第２０１９０１８５５４３号において記載されている、既往の研究では、Ｖ１．０ ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセット（配列番号３２）を使用して、高レベルのＦＶＩＩＩ発現が、裏付けられている（図１）。しかし、標的特異性をさらに改善し、免疫原性を低減するために、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを、パルボウイルスＩＴＲと共にコードするＤＮＡベクターに対して惹起される自然免疫応答を低減するように、ＣｐＧモチーフを欠失させて、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットをコドン最適化した。本研究では、改変Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットは、エンハンサーエレメント（Ａ１ＭＢ２）を伴う、肝臓特異的改変マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター（ｍＴＴＲ４８２）、ハイブリッド合成イントロン（キメライントロン）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナル（配列番号１４）の調節下にある、ＸＴＥＮ １４４ペプチド（ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）と融合された、Ｂドメイン欠失型ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＢＤＤｃｏＦＶＩＩＩ）をコードする、コドン最適化ｃＤＮＡから構成される（図１）。一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡまたはクローズドエンド（ｃｅ）ＤＮＡの形態にある、異なるパルボウイルスＩＴＲを伴う、改変Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける機能性は、流体尾静脈注射を介する全身送達により、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて裏付けられている。

【実施例2】

【0243】

一本鎖ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）ＤＮＡ
改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、有意に高レベルの活性を示した
ＩＴＲ領域内において形成されたヘアピンは、長期間にわたる、持続的な導入遺伝子の発現を、高レベルにおいて駆動することを仮定した。改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの機能性を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて検証するために、あらかじめ形成されたエリスロウイルス属Ｂ１９ ＩＴＲを伴う、Ｖ１．０ヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮまたはＶ２．０ヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮから構成される、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて調べた。これらのマウスは、軽度のＡ型血友病を伴う患者において、高頻度で観察される突然変異を保有する、改変ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ｃＤＮＡの発現を駆動する、マウスアルブミン（Ａｌｂ）プロモーターを伴うようにデザインされた、ヒトＦＶＩＩＩ－Ｒ５９３Ｃ導入遺伝子を含有する。これらのマウスはまた、ＦＶＩＩＩ遺伝子のノックアウトも保有し、内因性ＦＶＩＩＩタンパク質について欠損性である。これらの二重突然変異体マウスは、ヒトＦＶＩＩＩの注射に対して忍容性であり、ＦＶＩＩＩ活性を有さない。これらの二重突然変異体マウスは、ヒトＦＶＩＩＩによる処置の後に、阻害性抗体をごく微量しか産生せず、ＦＶＩＩＩ応答性であるＴ細胞またはＢ細胞を欠く。ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスについては、Ｂｒｉｌら（２００６）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、９５（２）：３４１～７においてさらに記載されている。

【0244】

あらかじめ形成されたＢ１９ ＩＴＲを伴うｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮは、ＭｓｃＩ消化による二本鎖ＤＮＡ断片産物（ＦＶＩＩＩ発現カセットおよびプラスミド骨格）を、９５℃で変性させる（変性）のに続き、４℃で冷却して（再生）、回文ＩＴＲ配列が、フォールディングすることを可能とすることにより作出した（図２）。次いで、流体尾静脈注射を介して、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウス１ｋｇ当たり８００μｇで、ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮを、全身注射した。血漿サンプルは、注射されたマウスから、表示の間隔で、５．５か月間にわたり回収し、ＦＶＩＩＩ活性は、製造元の指示書に従う、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイにより測定した。

【0245】

Ｖ１．０ ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮおよびＶ２．０ ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射された動物について、正常のパーセントに照らして正規化された、血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図３に示す。結果は、Ｖ２．０ ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射されたコホートにおけるＦＶＩＩＩ活性の、Ｖ１．０ ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮと比較した、有意な改善を示した。しかし、５６日目まで、ＦＶＩＩＩ発現の初期降下が観察され、次いで、１６８日目まで、レベルが安定化したことは、注射された動物の肝臓からの、パルボウイルスＩＴＲに挟まれたＶ２．０ ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮの、持続的発現を示唆する。したがって、これらの結果は、Ｖ１．０と比較して長期間にわたる、ＦＶＩＩＩの持続的発現活性を伴う、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの機能性を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて検証する。

【0246】

ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）ＩＴＲは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、生理学的レベルを超えるレベルのＦＶＩＩＩ発現を示した
ＩＴＲの、導入遺伝子発現の安定性および長期間にわたる持続に対する影響を決定するために、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）、ヒトエリスロウイルスＢ１９、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、またはこれらの変異体のＩＴＲを伴う、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの改善形を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて調べた。これらのＩＴＲは、熱安定性、およびそれらのそれぞれの宿主における、ウイルスゲノムの長期間にわたる存続に要求されるＩＴＲ特異的エレメントに基づき操作した。被験ＩＴＲ変異体および予測される二次構造については、既往の米国特許出願第６３／０６９，１１４号において記載されている。個々の変異体ＩＴＲは、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙを使用して、合成ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現構築物へとクローニングし、Ｇｅｎｅｗｉｚシーケンシング施設におけるシーケンシングにより検証した。次いで、上記で記載された通りに、ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｓｓＤＮＡ）を作出するために、配列が検証された構築物を使用し、次いで、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて、流体尾静脈注射を介して、２００、８００、または１６００μｇ／ｋｇで、全身注射した。血漿サンプルは、注射されたマウスから、表示の間隔で、５．５か月間にわたり回収し、ＦＶＩＩＩ活性は、製造元の指示書に従う、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイにより測定した。

【0247】

Ｖ２．０ ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射された動物について、正常のパーセントに照らして正規化された、血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図４に示す。結果は、全ての被験パルボウイルスＩＴＲにおいて、レベルは変動するが、長期間にわたる、持続的なＦＶＩＩＩＸＴＥＮの発現を示した。被験ＧＰＶ ＩＴＲの、全ての変異体またはハイブリッド体は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの発現レベルの、他のパルボウイルスＩＴＲと比較した持続的低下を示した。これに対して、ＨＢｏＶ１ ＩＴＲおよびＢ１９ ＩＴＲが、５６日目まで、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの初期低下を示し、次いで、１６８日目までを通して安定化したことは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ導入遺伝子の、ＩＴＲ依存的存続を示唆する。ＧＰＶ ＩＴＲと異なり、Ｂ１９ ＩＴＲおよびＨＢｏＶ１ ＩＴＲのいずれも、被験変異体に関わらず、有意に高レベルのＦＶＩＩＩ発現を示したことは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ導入遺伝子の、ＩＴＲ依存的安定性を示唆する。

【0248】

異なる被験パルボウイルスＩＴＲの中で、ＨＢｏＶ１ ＩＴＲは、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて、正常ＦＶＩＩＩ活性に対して、有意に高レベル（＞１０００％）を示した（図４）。これらの結果は、異なるパルボウイルスＩＴＲを伴う、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの機能性を検証し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＩＴＲ依存的安定性のほか、導入遺伝子発現の持続を裏付ける。

【実施例3】

【0249】

クローズドエンドＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）ＤＮＡ
ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｓｓＤＮＡ）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの発現において効果的であったが、非ウイルス性遺伝子治療用ベクターとして使用されるｓｓＤＮＡと関連する、いくつかの限界が存在する。それらのうちの１つは、大腸菌内の選択および増幅に必要とされる、抗生剤耐性遺伝子および原核生物複製起点などの外来配列もまた含有する、プラスミドＤＮＡを作出するために使用される、原核生物宿主（大腸菌）に起因する、内毒素夾雑のレベルである。これらの難題および限界に取り組むため、パルボウイルスＩＴＲを伴う、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットから構成される、クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の形態にある、ＤＮＡ治療剤原薬を作出するように、真核細胞ベースの系を開発した。ｃｅＤＮＡによる遺伝子の組織化は、組換えＡＡＶベクターＤＮＡに相似するが、コンフォメーションが異なる。

【0250】

このＤＮＡベクターを作出するために、バイオ医薬品の製造のために、広範に使用され、ＦＤＡにより承認されている、組換えインフルエンザワクチンの製造のための、唯一のプラットフォームである、バキュロウイルス昆虫細胞株を利用した。米国特許出願第６３／０６９，０７３号において記載されている通り、ｃｅＤＮＡ作製の、３つの異なるアプローチを、バキュロウイルス系において援用した。出発材料（ＳＭ）と比較して、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＩＴＲを伴う、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードする、例示的精製ｃｅＤＮＡを、図５Ａに示す。

【0251】

ｃｅＤＮＡから発現させる、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの機能性を検証するために、流体尾静脈注射を介して、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮを、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて、それぞれ、１２μｇ、４０μｇ、および８０μｇ／ｋｇと同等である、マウス１匹当たり０．３μｇ、１．０μｇ、または２．０μｇで、全身注射した。注射されたマウスからの血漿サンプルは、表示の間隔で回収し、ＦＶＩＩＩ活性は、上記で記載された、発色アッセイにより測定した。

【0252】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射された動物について、正常のパーセントに照らして正規化された、血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図５Ｂに示す。結果は、ＨｅｍＡマウスにおいて、用量依存的応答を示し、ＦＶＩＩＩ発現は、被験最高用量において、注射後５６日目まで、生理学的レベルを超えるレベル（正常レベルの＞５００％）が観察された。興味深いことに、同様の発現レベルは、マウスに、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（８０μｇ／ｋｇ）の、少なくとも２０倍用量である、１６００μｇ／ｋｇで、ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射した場合にも達成された（図４）。このデータは、ｃｅＤＮＡが、ｓｓＤＮＡ形態と比較して、高レベルのＦＶＩＩＩ発現をもたらすことを示唆する。したがって、これらの研究は、ｓｓＤＮＡまたはｃｅＤＮＡから発現させる、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの機能性を検証し、最適化ＩＴＲの使用を伴う、コドン最適化が、機能的導入遺伝子をもたらし、その長期間にわたる存続を改善しうることを確認する。

【実施例4】

【0253】

改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセット
Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットは、ｍＴＴＲプロモーターおよびエンハンサーエレメントを含有する（図１を参照されたい）。しかし、このプロモーターは、マウス肝臓特異的であり、大型動物モデルまたはヒト患者における肝臓特異性を決定するのに、十分に研究されても、特徴づけられてもいない。そこで、本研究では、Ｖ３．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセット（配列番号３５）は、Ｖ２．０発現カセット内において、ｍＴＴＲプロモーターおよびエンハンサーエレメントを、ヒト肝臓特異的アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター（配列番号３６）により置き換えることにより作出した（図１）。

【実施例5】

【0254】

ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１ ｍＴＴＲ ｓｓＤＮＡと、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１ Ａ１ＡＴ ｓｓＤＮＡとの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける効能の対比
ｍＴＴＲプロモーターの機能性を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ａ１ＡＴプロモーターと対比して検証するために、図６Ａに描示される通りに、あらかじめ形成されたＨＢｏＶ１ ＩＴＲを伴うコドン最適化ヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）を含む一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）構築物を作出した。あらかじめ形成されたＨＢｏＶ１ ＩＴＲを伴うｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮは、９５℃におけるＰｍｌＩ消化の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）断片産物（ｍＴＴＲ発現カセットまたはＡ１ＡＴ ＦＶＩＩＩ発現カセットおよびプラスミド骨格）を変性させ、次いで、４℃で冷却して、回文ＩＴＲ配列が、フォールディングすることを可能とすることにより作出した。結果として得られるｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮは、０．８～１．２％のアガロースゲル電気泳動により照合した。ゲル解析が、ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮについて、ｄｓＤＮＡの半分のサイズを示したことは、効率的なヘアピン形成を示唆する（図６Ｂ）。

【0255】

ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮは、流体尾静脈注射を介して、マウス１匹当たり１０μｇでｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ＋／＋／ＨｅｍＡマウスに全身注射した。血漿サンプルは、注射されたマウスから、７日間隔で、５．５か月間にわたり回収した。血漿ＦＶＩＩＩ活性は、製造元の指示書に従う、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイにより測定した。

【0256】

ｓｓＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射された動物について、正常のパーセントに照らして正規化された、血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図６Ｃに示す。これらの結果が、注射後２１日目まで、同等レベルのＦＶＩＩＩ発現を示したことは、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ＋／＋／ＨｅｍＡマウス動物モデルにおいて、ｍＴＴＲプロモーターまたはＡ１ＡＴプロモーターにより発現されるＦＶＩＩＩＸＴＥＮレベルに、有意差が見られないことを示唆する。

【実施例6】

【0257】

ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２全長ｃｅＤＮＡと、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２切断型ｃｅＤＮＡとの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける効能の対比
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＩＴＲ－ＩＴＲコンカタマー化を介して、ウイルスゲノムの異なる複製形態（例えば、単量体、二量体、または多量体）をもたらすことが公知である。本発明者らは、かつて、ＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲに挟まれた、Ｖ２．０コドン最適化ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）を含む、クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターが、バキュロウイルス系において、ベクターゲノムの単量体形態および多量体形態と共に、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの切断型分子種を作製することを観察した。例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／４７２１８号を参照されたい。

【0258】

本研究では、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの切断型分子種の特性についてさらに探索するために、本発明者らは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／４７２１８号において記載されている通りに、連続溶出電気泳動により、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの、全長分子種および切断型分子種の両方を精製した。ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの、いずれの分子種の純度も、アガロースゲル電気泳動により決定され、結果は、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの、全長（８．３ｋｂ）分子種および切断型（６．０ｋｂ）分子種のサイズに対応する主要バンドを示した（図７Ａ）。

【0259】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの、両方の分子種のヌクレオチド配列について、さらに検証するために、本発明者らは、ＭｉＳｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ素材についての、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）解析を実施した。図７Ｂに示されるＮＧＳ結果は、全長ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ配列リードについて、＞８０％のカバレッジ（上パネル）、および切断型ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ分子種について、＞７５％のカバレッジ（下パネル）を示し、宿主細胞および／またはバキュロウイルスゲノムに由来する、一部の不純物を伴った。ＮＧＳデータについてのさらなる解析は、切断型ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮリードが、キメライントロン領域の大部分を逸失する一方で、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの５’末端におけるＩＴＲ配列を保持することを明らかにした（図７Ｂ、下パネル）。

【0260】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの切断型分子種の機能性をさらに検証するために、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの、流体尾静脈注射を介して、精製全長分子種または精製切断型分子種を、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて、４０または８０μｇ／ｋｇで、全身注射した。血漿サンプルは、注射されたマウスから、７日間隔で回収し、血漿ＦＶＩＩＩ活性は、製造元の指示書に従う、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ発色アッセイにより測定した。ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射された動物について、正常のパーセントに照らして正規化された、血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図７Ｃに示す。

【0261】

結果は、全長ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ注射コホートにおいて、生理学的レベルを超えるレベルのＦＶＩＩＩ発現を示した。しかし、切断型ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射された動物は、注射後２１日目まで、被験用量のいずれにおいても、２分の１のＦＶＩＩＩ発現を示した（図７Ｃ）。このデータは、キメライントロンの、Ｖ２．０コドン最適化ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの発現レベルの改善への寄与を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてさらに裏付ける（図７Ｃ）。

【実施例7】

【0262】

ｉｎ ｖｉｖｏにおける、クローズドエンドＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）ＤＮＡの効能
本研究では、本発明者らは、改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードし、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＩＴＲにより挟まれたｃｅＤＮＡの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける効能について探索した。ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＤＮＡは、既に記載されている通りに（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／４７２１８号を参照されたい）、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＩＴＲを使用して、バキュロウイルス系において作出した。各ｃｅＤＮＡの純度について、出発材料（ＳＭ）と比較して解析するのに使用されたアガロースゲルを、図８Ａに示す。

【0263】

流体尾静脈注射を介して、精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮを、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスにおいて、それぞれ、４０μｇまたは８０μｇ／ｋｇと同等である、マウス１匹当たり１．０μｇまたは２．０μｇで、全身注射した。注射されたマウスからの血漿サンプルは、間隔を置いて回収し、ＦＶＩＩＩ活性は、上記で記載された、発色アッセイにより測定した。

【0264】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮを注射された動物について、正常のパーセントに照らして正規化された、血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図８Ｂに示す。

【0265】

結果は、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＩＴＲにより挟まれたｃｅＤＮＡベクターについて、同等のＦＶＩＩＩ発現レベルを示した。既に見られた通り、処置動物において、ＦＶＩＩＩ発現レベルが、２５６日目まで、徐々に低下したことは、肝細胞内における、時間経過にわたる、ベクターの喪失を示唆する。これらの研究は、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＨＢｏＶ１ ＩＴＲを含むｃｅＤＮＡベクターから発現させた、改変Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの、機能性、および長期間にわたる存続を検証する。

【0266】

特定の実施形態についての前出の記載は、他の実施者が、当技術分野内の知見を適用することにより、不要な実験を伴わずに、本開示の一般概念から逸脱せずに、このような特定の実施形態を、多様な適用のために、たやすく改変し、かつ／または適合させうる、本開示の一般的性格を、十分に明らかにするであろう。したがって、このような適合および改変は、本明細書で提示される教示および指針に基づき、開示された実施形態の同等物の意味および範囲の内にあることが意図される。ことが理解されるものとする。本明細書における表現法または用語法は、本明細書の用語法または表現法が、教示および指針に照らして、当業者により解釈されるように、記載を目的とするものであり、限定を目的とするものではない。

【0267】

当業者には、本明細書の検討、および本明細書で開示される本開示の実施から、本開示の他の実施形態も明らかであろう。本明細書および実施例は、例示的なものとしてだけ考えられ、本開示の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲により指し示されることが意図される。

【0268】

本明細書で飲用される、全ての特許および刊行物は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み入れられる。

【0269】

配列

【0270】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【表1-12】

【表1-13】

【表1-14】

【表1-15】

【表1-16】

【表1-17】

【表1-18】

【表1-19】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【配列表】

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【国際調査報告】