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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】多価グリカン足場およびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20240829BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240829BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240829BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240829BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240829BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20240829BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240829BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240829BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240829BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20240829BHJP
A61K 31/716 20060101ALI20240829BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20240829BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04 ZNA
C12N15/11 Z
A61K9/08
A61P35/00
A61K45/00
A61K31/7088
A61K38/02
A61K48/00
A61K39/00 H
A61P37/04
A61K47/36
A61K47/60
A61K31/716
G01N33/531 A
G01N33/53 V
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024512068
(86)(22)【出願日】2022-08-25
(85)【翻訳文提出日】2024-04-19
(86)【国際出願番号】 US2022075446
(87)【国際公開番号】W WO2023028549
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】63/237,068
(32)【優先日】2021-08-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524033766
【氏名又は名称】ノヴァブ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ルウー， シルヴェイン ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】キャノン， ロビック エドワード
(72)【発明者】
【氏名】バレスタス， メアリー エレン
【テーマコード（参考）】
4B063
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA05
4B063QQ07
4B063QR43
4B063QS33
4B063QS40
4B063QX02
4C076AA12
4C076AA95
4C076CC07
4C076CC27
4C076EE23
4C076EE30
4C076FF70
4C084AA02
4C084AA13
4C084AA17
4C084BA44
4C084MA17
4C084NA13
4C084ZB09
4C084ZB26
4C085AA03
4C085BB11
4C085EE01
4C085EE05
4C086AA01
4C086AA10
4C086EA16
4C086EA20
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA17
4C086NA13
4C086ZB09
4C086ZB26
(57)【要約】
多価グリカン足場及びその作製方法、並びに組成物及びその使用方法が提供される。多価グリカン足場は、典型的にはその末端に連結された２つ以上グリカン及び必要に応じて１つ以上の機能要素を有する、デンドリマー等の基礎となる分岐足場を含む。グリカンは合成グリカンであってもよく、天然源から単離されてもよい。グリカン足場を用いて細胞及び／又はグリカン結合タンパク質等の結合パートナーを特定する方法も提供される。グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法は、標的物質を既知の多価グリカン足場と接触させることと、当該足場に結合する標的物質から要素を特定することを含み得る。他の実施形態では、グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法は、既知の標的物質要素を２つ以上のグリカンを各々有する異なる種の多価グリカン足場のライブラリーと接触させることと、当該標的物質要素に結合するグリカン足場を特定することとを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法であって、標的物質を、２つまたはそれを超えるグリカンを含む既知の多価グリカン足場と接触させることと、前記足場に結合する前記標的物質から要素を特定することを含む方法。
【請求項2】
前記標的物質は、１つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または１つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記標的物質は、２つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または２つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記標的物質は細胞の集団であり、前記標的物質の要素は、集団内の１つまたはそれを超える細胞型である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記１つまたはそれを超える細胞型は、前記集団内の他の細胞型と比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞が結合した前記多価足場を単離することをさらに含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
結合した前記細胞を特徴付けることをさらに含む、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
請求項２～７のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合細胞を含む組成物。
【請求項9】
前記標的物質は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物であり、前記標的物質の要素は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の１つまたはそれを超えるＧＢＰである、請求項２に記載の方法。
【請求項10】
前記１つまたはそれを超えるＧＢＰは、前記細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の他のＧＢＰと比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
結合した前記ＧＢＰを特徴付けることをさらに含む、請求項９または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
結合した前記ＧＢＰを単離することをさらに含む、請求項９～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
請求項９～１２のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合ＧＢＰを含む組成物。
【請求項14】
グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法であって、１つまたはそれを超える既知の標的物質要素を、２つまたはそれを超えるグリカンを各々含む１つまたはそれを超える種の多価グリカン足場と接触させることと、標的物質要素に結合するグリカン足場を特定することとを含む方法。
【請求項15】
前記１つまたはそれを超える既知の標的物質要素を、２つまたはそれを超えるグリカンを各々含む異なる種の多価グリカン足場のライブラリーと接触させることと、標的物質要素に結合するグリカン足場を特定することとを含み、必要に応じて、前記ライブラリーは、約２～約１０，０００、またはあらゆる部分範囲もしくはその特定の整数、例えば、２、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、１，０００の異なる種のグリカン足場を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記既知の標的物質要素は、１つまたはそれを超える細胞型である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
１つまたはそれを超える前記多価グリカン足場が、前記ライブラリー中の他の多価グリカン足場と比較して、前記１つまたはそれを超える細胞型に優先的に結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
結合した前記多価グリカン足場を特徴付けることをさらに含む、請求項１６または１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記多価グリカン足場を単離することをさらに含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
請求項１４～１９のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合細胞を含む組成物。
【請求項21】
前記既知の標的物質要素は、１つまたはそれを超えるＧＢＰである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項22】
１つまたはそれを超える前記多価グリカン足場が、前記ライブラリー中の他の多価グリカン足場と比較して、前記１つまたはそれを超えるＧＢＰに優先的に結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
結合した前記多価グリカン足場を特徴付けることをさらに含む、請求項２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記多価グリカン足場を単離することをさらに含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
請求項２１～２４のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合ＧＢＰを含む組成物。
【請求項26】
グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法であって、標的物質を、２つまたはそれを超えるグリカンを含む１つまたはそれを超える未知の多価グリカン足場と接触させることと、多価グリカン足場に結合する前記標的物質から要素を特定することとを含み、必要に応じて、前記１つまたはそれを超える未知の多価グリカン足場は、約２～約１０，０００、またはあらゆる部分範囲もしくはその特定の整数、例えば２、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、１，０００の異なる種のグリカン足場を含むライブラリーを形成する、方法。
【請求項27】
前記標的物質は、１つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または１つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記標的物質は、２つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または２つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記標的物質は細胞の集団であり、前記標的物質の要素は、集団内の１つまたはそれを超える細胞型である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記１つまたはそれを超える細胞型は、前記集団内の他の細胞型と比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記細胞が結合した前記多価足場を単離することをさらに含む、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
結合した前記細胞および／または細胞に結合した前記グリカンを特徴付けることをさらに含む、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
請求項２７～３２のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合細胞を含む組成物。
【請求項34】
前記標的物質は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物であり、前記標的物質の要素は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の１つまたはそれを超えるＧＢＰである、請求項２７に記載の方法。
【請求項35】
前記１つまたはそれを超えるＧＢＰは、前記細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の他のＧＢＰと比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
結合した前記ＧＢＰおよび／またはＧＢＰに結合した前記グリカンを特徴付けることをさらに含む、請求項３４または３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
結合した前記ＧＢＰを単離することをさらに含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
請求項３４～３７のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合ＧＢＰを含む組成物。
【請求項39】
前記多価グリカン足場は、その末端に連結された２つまたはそれを超えるグリカンおよび必要に応じて１つまたはそれを超える機能要素を有する、基礎をなす分岐足場を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項40】
前記基礎をなす分岐足場はデンドリマーである、請求項３９に記載の方法または組成物。
【請求項41】
前記２つまたはそれを超えるグリカンは全て同じグリカン種である、請求項３９または４０に記載の方法または組成物。
【請求項42】
前記２つまたはそれを超えるグリカンは、２つまたはそれを超える異なるグリカン種を含む、請求項３９または４０に記載の方法または組成物。
【請求項43】
前記１つまたはそれを超える機能要素は、前記グリカン足場および／またはグリカン足場に結合した前記標的物質の要素の形成、イメージング、局在化、特定、単離、および／または特徴付けを容易にする作用物質である、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項44】
前記機能要素の少なくとも１つが、前記グリカン足場を特異的に特定するバーコードを含む核酸である、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項45】
前記機能要素の少なくとも１つがフルオロフォアである、請求項３９～４４のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項46】
前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されている２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）－ベンズアミド（ＡＥＡＢ）に連結されている、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項47】
前記機能要素の少なくとも１つがアフィニティタグである、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項48】
前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されているアミノ酸に連結されている、請求項３９～４７のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項49】
前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部ではない、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部である、請求項４８に記載の方法。
【請求項51】
前記ポリペプチド鎖は、グリカンが連結された２つまたはそれを超えるアミノ酸を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記アミノ酸は、セリンまたはトレオニンである、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記グリカン足場または標的物質の要素は、必要に応じてビーズ、スライド、プレート、または皿等の表面または基質に固定化されている、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項54】
前記グリカン足場も前記標的物質も固定化されていない、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項55】
前記グリカン足場および標的物質は溶液中にある、請求項５４に記載の方法または組成物。
【請求項56】
処置を必要とする対象を処置する方法であって、先のいずれかの方法に従って、グリカンに基づく結合相互作用を特定することと、前記対象に、特定された前記相互作用の前記グリカンを含む有効量の治療用多価グリカン足場を含む組成物を投与することとを含む方法。
【請求項57】
治療用グリカンが、前記相互作用の細胞またはＧＢＰに結合すると、細胞活性を誘導または阻害する、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
治療用グリカンが、これを機能化する活性薬剤を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項59】
前記活性薬剤は、核酸、小分子、またはポリペプチドである、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記細胞は癌細胞であり、前記活性薬剤は抗癌薬である、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記細胞は免疫細胞であり、前記活性薬剤は抗原であるか、または抗原をコードする、請求項５９に記載の方法。
【請求項62】
請求項５６～６２のいずれか一項に記載の治療用グリカンを含む組成物。
【請求項63】
多価グリカン足場であって、その末端に連結された２つまたはそれを超えるグリカンおよび１つまたはそれを超える機能要素を有する、基礎をなす分岐足場を含む多価グリカン足場。
【請求項64】
前記機能要素の少なくとも１つが、前記グリカン足場および／またはグリカン足場に結合した標的物質要素の形成、イメージング、局在化、特定、単離、および／または特徴付けを容易にする作用物質である、請求項６３に記載の多価グリカン足場。
【請求項65】
前記機能要素の少なくとも１つがフルオロフォアである、請求項６３または６４のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項66】
前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されている２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）－ベンズアミド（ＡＥＡＢ）に連結されている、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項67】
前記機能要素の少なくとも１つが、前記グリカン足場を特異的に特定するバーコードを含む核酸である、請求項６３～６６のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項68】
前記機能要素の少なくとも１つがアフィニティタグである、請求項６３～６７のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項69】
前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されているアミノ酸に連結されている、請求項６３～６８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項70】
前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部ではない、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部である、請求項６９に記載の方法。
【請求項72】
前記ポリペプチド鎖は、グリカンが連結された２つまたはそれを超えるアミノ酸を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記アミノ酸は、セリンまたはトレオニンである、請求項６９～７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項74】
前記基礎となる分岐足場はデンドリマーである、請求項６３～７３のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項75】
前記基礎となる足場は、２～１６本のアーム（両端を含む）、必要に応じて８～１６本のアームで形成されている、請求項６３～７４のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項76】
前記基礎となる足場および／またはそのアームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで形成されている、請求項６３～７５のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項77】
前記基礎となる足場は、８アームＰＥＧ－ビオチン／アルキン、ビオチン（１）／アルキン（７）、ＭＷ ２０ｋ；デンドロアルキン－ＰＥＧ－デンドロアルキン、ＰＥＧ １０ｋ、Ｇ４ ３２アルキン；デンドロアルキン－ＰＥＧ－デンドロアルキン、ＰＥＧ １０ｋ、Ｇ５ ６４アルキン；またはデンドロアルキン－ＰＥＧ－デンドロアルキン、ＰＥＧ １０ｋ、Ｇ６ １２８アルキンで形成されている、請求項６３～７６のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項78】
前記多量体グリカン足場は、１０ｋＤａ～５０ｋＤの間、２０ｋＤａ～６０ｋＤａの間、もしくは２０ｋＤａ～３０ｋＤａの間（それぞれ両端を含む）、またはそのあらゆる整数範囲、もしくはその間のあらゆる特定の整数である、請求項６３～７７のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項79】
前記２つまたはそれを超えるグリカンは全て同じグリカン種である、請求項６３～７８のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項80】
前記２つまたはそれを超えるグリカンは、２つまたはそれを超える異なるグリカン種を含む、請求項６３～７９のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項81】
式：（リガンド）ｎ：足場：検出／分離タグ：識別子タグ
を含み、式中、「リガンド」は、存在しており、かつｎ＞１コピーを有する（すなわち、多価）１つまたはそれを超えるグリカン種であり；
「足場」は、存在しており、かつ基礎となる分岐足場、例えば、デンドリマーまたは超分岐ポリマーであり；
「検出／分離タグ」および「識別子タグ」の一方または双方が存在しており、かつ機能要素、
例えば、（ａ）分離／単離を容易にするためのビオチンまたは（ＨＩＳ）６～８ペプチドタグ、（ｂ）検出を容易にするためのフルオロフォア、（ｃ）同定を容易にするためにＰＣＲ増幅かつ配列決定することができる固有のＤＮＡまたはＲＮＡ配列（「バーコード」）；および／あるいは（ｄ）本明細書中の他の箇所で説明されるような薬物または他の材料、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｃｒｉｓｐｒガイドＲＮＡ等の核酸、あるいは治療効果もしくは細胞修飾効果を有することが意図されるか、または（ａ）抗原を発現する病原体もしくは異常細胞、例えば腫瘍に対する保護的免疫応答、もしくは（ｂ）抗原に対する自己免疫障害の治療としての抗原に対する免疫寛容を誘導することが意図される抗原を含み得る薬物またはそのような他の材料を含有する小胞を指す、
請求項６３～８０のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項82】
前記グリカン足場は固定化されていない、請求項６３～８１のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
【請求項83】
溶液中に請求項６３～８２のいずれか一項に記載の複数の多価グリカン足場を含む組成物。
【請求項84】
前記複数の多価グリカン足場は固定化されていない、請求項８３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年８月２５日出願の米国特許出願第６３／２３７，０６８号に基づく利益および優先権を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
本出願は、２０２１年８月２５日出願の米国特許出願第６３／２３７，０６８号に基づく利益および優先権を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
【0002】
配列表の参照
２０２２年８月２２日に作成された、６，３５３バイトのサイズを有する、「ＮＯＶＡＢ１００ＰＣＴＳＴ２５．ｘｍｌ」という名前のｘｍｌファイルとして提出された配列表は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．８３４（ｃ）（１）に従って参照により本明細書に組み込まれる。
２０２２年８月２２日に作成された、６，３５３バイトのサイズを有する、「ＮＯＶＡＢ１００ＰＣＴＳＴ２５．ｘｍｌ」という名前のｘｍｌファイルとして提出された配列表は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．８３４（ｃ）（１）に従って参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
発明の分野
本発明は、一般に、グリカン結合、ならびにグリカン結合に関連する組成物および使用方法の分野にある。
本発明は、一般に、グリカン結合、ならびにグリカン結合に関連する組成物および使用方法の分野にある。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
主に脂質またはタンパク質に付着して、グリカンは、全ての細胞の表面上に豊富に発現される。その膨大な構造的かつ組成的多様性により、グリカンは、ウイルスおよび細菌から植物および動物まで、全生物間の多数の生物学的プロセスにおいて、主要な役割を果たす。グリカンに結合するタンパク質は、グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）として知られており、典型的には細胞の表面上に発現されて、種々の細胞シグナル伝達を媒介する。したがって、細胞表面グリカンリガンドの、その対応する細胞表面ＧＢＰとのＣＩＳ結合相互作用またはＴＲＡＮＳ結合相互作用は、多価相互作用である。なぜなら、別個の各グリカン構造および別個の各ＧＢＰの多くのコピー、すなわち数百から数万の同一のコピーが細胞表面上に存在するからである。そのような多価相互作用は、「強制近接」（Ｖａｕｑｕｅｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１６８（８）：１７７１－８５，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｐｈ．１２１０６（２０１３））（１つ（またはそれを超える）のグリカンリガンドが相補的ＧＢＰに結合したときの、非結合グリカンリガンドまたはＧＢＰによって経験される高い局所的「標的」濃度）に起因する見かけの結合親和性（アビディティ）の実質的な増大をもたらす。強制近接は、グリカン：ＧＢＰ複合体の結合／再結合をかなり増大させて、相互作用の解離を実質的に遅らせる。なぜなら、全てのグリカン：ＧＢＰ複合体が同時に解離しなければならないからである。この多価アビディティ増強は、一価結合と比較して、見かけの親和性を数千倍も増大させる。このことは、グリカン：ＧＢＰ結合の典型である不十分な一価親和性にも拘わらず、グリカン：ＧＢＰ媒介性細胞間相互作用を阻害することの困難さを説明している。
主に脂質またはタンパク質に付着して、グリカンは、全ての細胞の表面上に豊富に発現される。その膨大な構造的かつ組成的多様性により、グリカンは、ウイルスおよび細菌から植物および動物まで、全生物間の多数の生物学的プロセスにおいて、主要な役割を果たす。グリカンに結合するタンパク質は、グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）として知られており、典型的には細胞の表面上に発現されて、種々の細胞シグナル伝達を媒介する。したがって、細胞表面グリカンリガンドの、その対応する細胞表面ＧＢＰとのＣＩＳ結合相互作用またはＴＲＡＮＳ結合相互作用は、多価相互作用である。なぜなら、別個の各グリカン構造および別個の各ＧＢＰの多くのコピー、すなわち数百から数万の同一のコピーが細胞表面上に存在するからである。そのような多価相互作用は、「強制近接」（Ｖａｕｑｕｅｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１６８（８）：１７７１－８５，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｐｈ．１２１０６（２０１３））（１つ（またはそれを超える）のグリカンリガンドが相補的ＧＢＰに結合したときの、非結合グリカンリガンドまたはＧＢＰによって経験される高い局所的「標的」濃度）に起因する見かけの結合親和性（アビディティ）の実質的な増大をもたらす。強制近接は、グリカン：ＧＢＰ複合体の結合／再結合をかなり増大させて、相互作用の解離を実質的に遅らせる。なぜなら、全てのグリカン：ＧＢＰ複合体が同時に解離しなければならないからである。この多価アビディティ増強は、一価結合と比較して、見かけの親和性を数千倍も増大させる。このことは、グリカン：ＧＢＰ結合の典型である不十分な一価親和性にも拘わらず、グリカン：ＧＢＰ媒介性細胞間相互作用を阻害することの困難さを説明している。
【0005】
レクチン、抗体、および他の炭水化物結合生体分子が挙げられるグリカン結合分子を発見し、かつ特徴付けるには、適切なグリカンエピトープベイト対応物が必要である。グリカンとグリカン結合分子との間の一価相互作用は通常弱く、親和性が低く、かつＫｄがミリモルからマイクロモルの範囲内であるので、グリカンの多価提示は、ＧＢＰ－グリカン複合体の捕捉を可能にするために、または多価ＧＢＰ－グリカン相互作用と効果的に競合するために、アビディティおよび見かけの親和性を増大させることが重要である。
【0006】
多価フォーマットで提示されるグリカンの商業的利用可能性は、非常に限られている。そのようなグリカンは、通常、天然源から合成または精製するのが比較的容易な、一般的なグリカンエピトープ（血液型、ルイス構造）しか表さない、ポリマー（例えば、ポリアクリル酸（ＰＡＡ））にカップリングされ、かつほとんどが１～４個の単糖単位からなる構造に制限される。
【0007】
金ナノ粒子、フラーレン多価足場、カーボンナノチューブ、自己集合ペプチドを用いるグリコデンドリナノ粒子、グリカンオリゴヌクレオチド、ペプチド／タンパク質スキャフォールディング、およびグリカン足場が挙げられる広範囲のスキャフォールディング構築物を用いるグリカンの多価提示が調査されている（Ｓｐｉｎｅｌｌｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１１）：４５５７－７３， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ２ｃｓ３５４０６ｃ （２０１３）；Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１０）：４３５８－７６， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ２ｃｓ３５４２７ｆ （２０１３）；Ｂｅｒｎａｒｄｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１１）：４７０９－２７， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ２ｃｓ３５４０８ｊ （２０１３）；Ｍｕｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４５（１１）：３２７５－３０２， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ６ｃｓ００１６５ｃ （２０１６）。種々の合成戦略を用いているにも拘わらず、これらの材料は、当該問題に部分的にしか対処していない。というのも、文献に報告されている大部分の多価グリカン構築物は、単糖または二糖しかディスプレイしないからである（Ａｌ－Ｍｕｇｈａｉｄ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．， ７１（４）：１３９０－８， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｊｏ０５２０４５ｕ （２００６）；Ｃｈａｂｒｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．， ７３（１４）：５６０２－５， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｊｏ８００８９３５ （２００８）；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ａｖｉｌａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １５（３８）：９８７４－８８， ｄｏｉ： １０．１００２／ｃｈｅｍ．２００９００９２３ （２００９）；Ｒｉｂｅｉｒｏ－Ｖｉａｎａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．， ３：１３０３， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２３０２ （２０１２）；Ｍｕｎｏｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｈｅｍ．， ８（１）：５０－７， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｃｈｅｍ．２３８７ （２０１６）；Ｂｕｄｈａｄｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．， １４２（４２）：１８０２２－１８０３４， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｊａｃｓ．０ｃ０６７９３ （２０２０）；Ｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｔａｌａｎｔａ．， ２２３（Ｐｔ １）：１２１７０６， ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｔａｌａｎｔａ．２０２０．１２１７０６ （２０２１））。いくつかの他の「グリコクラスタ」は、ニワトリ卵黄のシアログリコペプチド（ＳＧＰ）内に見出される二分岐のＮ－グリカンの用いられる誘導体を構築する（Ｔａｎａｋａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．， ４９（４４）： ８１９５－８２００， ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１０００８９２ （２０１０）；Ｓｍｉｒｎｏｖ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｍａｌｌ．，１６（４６）：ｅ２００４８３１， ｄｏｉ： １０．１００２／ｓｍｌｌ．２０２００４８３１（２０２０））。しかしながら、これらの戦略はいずれも、ほとんどのグリカンに適し、かつ多価グリカンポリマーを構築するように設計された単純かつ普遍的な方法を提供せず、完全Ｏ連結型およびＮ連結型グリカンが挙げられるより大きな構造は、多価ポリマーとして利用できないか、または単純に、いかなるフォーマットでも利用できない。
ゆえに、本発明の目的は、多価フォーマットでグリカンを提示する代わりの、向上した手段を提供することである。
ゆえに、本発明の目的は、多価フォーマットでグリカンを提示する代わりの、向上した手段を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｖａｕｑｕｅｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１６８（８）：１７７１－８５，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｐｈ．１２１０６（２０１３）
【非特許文献2】Ｓｐｉｎｅｌｌｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１１）：４５５７－７３， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ２ｃｓ３５４０６ｃ （２０１３）
【非特許文献3】Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１０）：４３５８－７６， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ２ｃｓ３５４２７ｆ （２０１３）
【非特許文献4】Ｂｅｒｎａｒｄｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１１）：４７０９－２７， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ２ｃｓ３５４０８ｊ （２０１３）
【非特許文献5】Ｍｕｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４５（１１）：３２７５－３０２， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ６ｃｓ００１６５ｃ （２０１６）
【非特許文献6】Ａｌ－Ｍｕｇｈａｉｄ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．， ７１（４）：１３９０－８， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｊｏ０５２０４５ｕ （２００６）
【非特許文献7】Ｃｈａｂｒｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．， ７３（１４）：５６０２－５， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｊｏ８００８９３５ （２００８）
【非特許文献8】Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ａｖｉｌａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １５（３８）：９８７４－８８， ｄｏｉ： １０．１００２／ｃｈｅｍ．２００９００９２３ （２００９）
【非特許文献9】Ｒｉｂｅｉｒｏ－Ｖｉａｎａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．， ３：１３０３， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２３０２ （２０１２）
【非特許文献10】Ｍｕｎｏｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｈｅｍ．， ８（１）：５０－７， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｃｈｅｍ．２３８７ （２０１６）
【非特許文献11】Ｂｕｄｈａｄｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．， １４２（４２）：１８０２２－１８０３４， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｊａｃｓ．０ｃ０６７９３ （２０２０）
【非特許文献12】Ｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｔａｌａｎｔａ．， ２２３（Ｐｔ １）：１２１７０６， ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｔａｌａｎｔａ．２０２０．１２１７０６ （２０２１）
【非特許文献13】Ｔａｎａｋａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．， ４９（４４）： ８１９５－８２００， ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１０００８９２ （２０１０）
【非特許文献14】Ｓｍｉｒｎｏｖ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｍａｌｌ．，１６（４６）：ｅ２００４８３１， ｄｏｉ： １０．１００２／ｓｍｌｌ．２０２００４８３１（２０２０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
発明の要旨
多価グリカン足場、およびその作製方法、ならびに組成物およびその使用方法が提供される。多価グリカン足場は、典型的に、その末端に連結された２つまたはそれを超えるグリカンおよび必要に応じて１つまたはそれを超える機能要素を有する、基礎をなす分岐足場を含む。基礎をなす分岐足場は、例えば、デンドリマーまたは別の分岐ポリマーであり得る。グリカンは、合成グリカンであってもよいが、より好ましくは天然源から単離される。各足場は、典型的に、単一のグリカン種（すなわち均質）または２つもしくはそれを超える異なるグリカン種の混合物（すなわち異質）であり得る２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれを超えるグリカンにより機能化されている。機能要素は、例えば、グリカン足場またはその結合パートナーの形成、イメージング、局在化、特定、単離、または特徴付けを容易にする作用物質であり得る。例示的な機能要素として、足場に付着されたグリカンを特異的に特定する固有のバーコード配列を有する核酸、例えば、足場の形成、検出、イメージング、局在化、または選別を容易にするためのフルオロフォア、および足場を単離または固定化するのに用いることができるアフィニティタグが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な非限定の実施形態において、グリカンは、足場に直接的または間接的に連結されている２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）－ベンズアミド（ＡＥＡＢ）に連結されている。一部の実施形態において、グリカンは、足場に直接的に、またはアミノ酸を介して間接的に連結されており、当該アミノ酸は、単独であっても、ポリペプチド鎖の一部を形成してもよい。ゆえに、一部の実施形態において、グリカン足場は糖ペプチド足場である。一部の実施形態において、単一のポリペプチド鎖は、同じであっても異なってもよい２つまたはそれを超えるグリカンを連結かつ／またはディスプレイする。例示的なアミノ酸として、セリンおよびトレオニンが挙げられるが、これらに限定されない。
多価グリカン足場、およびその作製方法、ならびに組成物およびその使用方法が提供される。多価グリカン足場は、典型的に、その末端に連結された２つまたはそれを超えるグリカンおよび必要に応じて１つまたはそれを超える機能要素を有する、基礎をなす分岐足場を含む。基礎をなす分岐足場は、例えば、デンドリマーまたは別の分岐ポリマーであり得る。グリカンは、合成グリカンであってもよいが、より好ましくは天然源から単離される。各足場は、典型的に、単一のグリカン種（すなわち均質）または２つもしくはそれを超える異なるグリカン種の混合物（すなわち異質）であり得る２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれを超えるグリカンにより機能化されている。機能要素は、例えば、グリカン足場またはその結合パートナーの形成、イメージング、局在化、特定、単離、または特徴付けを容易にする作用物質であり得る。例示的な機能要素として、足場に付着されたグリカンを特異的に特定する固有のバーコード配列を有する核酸、例えば、足場の形成、検出、イメージング、局在化、または選別を容易にするためのフルオロフォア、および足場を単離または固定化するのに用いることができるアフィニティタグが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な非限定の実施形態において、グリカンは、足場に直接的または間接的に連結されている２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）－ベンズアミド（ＡＥＡＢ）に連結されている。一部の実施形態において、グリカンは、足場に直接的に、またはアミノ酸を介して間接的に連結されており、当該アミノ酸は、単独であっても、ポリペプチド鎖の一部を形成してもよい。ゆえに、一部の実施形態において、グリカン足場は糖ペプチド足場である。一部の実施形態において、単一のポリペプチド鎖は、同じであっても異なってもよい２つまたはそれを超えるグリカンを連結かつ／またはディスプレイする。例示的なアミノ酸として、セリンおよびトレオニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0010】
また、グリカン足場を用いて、細胞および／またはグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）等の結合パートナーを特定する方法が提供される。一部の実施形態において、グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法は、標的物質を既知の多価グリカン足場と接触させることと、当該足場に結合する標的物質から要素を特定することを含む。標的物質は、例えば、１つ、２つ、またはそれを超えるＧＢＰを有する１つ、２つ、もしくはそれを超える異なる細胞型を有する細胞の集団、または細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｍｉｘｔｕｒｅ）であり得る。また、本方法を用いて、特定の細胞型が、特定のグリカンに結合するＧＢＰを発現するかどうかを判定することができる。標的物質が細胞の集団である場合、標的物質要素は、典型的に、集団内の１つまたはそれを超える細胞型である。好ましくは、１つまたはそれを超える細胞型は、集団内の他の細胞型と比較して、多価グリカン足場に優先的に結合する。更なる工程が、細胞が結合した多価足場を単離すること、および／または結合した細胞を特徴付けることを含み得る。標的物質が細胞溶解液または他のタンパク質性混合物である場合、標的物質要素は、典型的に、その中の１つまたはそれを超えるＧＢＰである。好ましくは、１つまたはそれを超えるＧＢＰは、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の他のＧＢＰと比較して、多価グリカン足場に優先的に結合する。更なる工程が、結合したＧＢＰを単離かつ／または特徴付けることを含み得る。
【0011】
他の実施形態において、グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法は、既知の標的物質要素を、２つまたはそれを超えるグリカンを各々有する異なる種の多価グリカン足場のライブラリーと接触させることと、当該標的物質要素に結合するグリカン足場を特定することとを含む。ライブラリーは、例えば、約２～約１０，０００もしくはそれを超える、またはあらゆる部分範囲もしくはその具体的な整数、例えば、２、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、１，０００個の異なる種のグリカン足場の１つまたは複数のコピーを含み得る。既知の標的物質要素は、細胞であり得る。好ましくは、１つまたはそれを超える多価グリカン足場が、ライブラリー内の他の多価グリカン足場と比較して、細胞に優先的に結合する。このようにして、組成物および方法を用いて、細胞ＧＢＰのグリカン特異性を特定することができる。他の実施形態において、既知の標的物質要素は、ＧＢＰである。好ましくは、１つまたはそれを超える多価グリカン足場が、ライブラリー内の他の多価グリカン足場と比較して、ＧＢＰに優先的に結合する。更なる工程が、多価グリカン足場を単離かつ／または特徴付けることを含み得る。
【0012】
提供される方法に従って特定されるグリカン結合相互作用は、治療用途および診断用途に用いられる多価グリカン足場を合理的に設計するのに用いることができる。例えば、処置を必要とする対象を処置する方法は、開示されるあらゆる方法に従って、グリカンに基づく結合相互作用を特定することと、対象に、特定された相互作用のグリカンを有する有効量の治療用多価グリカン足場を含む組成物を投与することとを含み得る。好ましくは、足場は、対象における標的細胞および／またはＧＢＰに優先的に結合する。一部の実施形態において、治療用グリカン足場は、相互作用する標的細胞またはＧＢＰに結合すると、細胞活性を誘導または阻害する。一部の実施形態において、治療用グリカン足場は、これを機能化する活性薬剤を含む。活性薬剤は、核酸、小分子、ポリペプチド等であり得る。例えば、一部の実施形態において、標的細胞は癌細胞であり、活性薬剤は抗癌薬である。他の実施形態において、標的細胞は免疫細胞であり、活性薬剤は抗原であるか、または抗原をコードする。同様に、イメージング剤により機能化されたグリカン足場は、標的細胞またはＧＢＰを特定、追跡、または監視するのに用いることができ、そして診断用途に利用することができる。
【0013】
また、グリカン足場を含む組成物が提供される。一部の実施形態において、組成物は、細胞またはＧＢＰに結合したグリカン足場を含む。グリカン足場は、その結合パートナーの有無に拘わらず、必要に応じてビーズ、スライド、プレート、または皿等の表面または基材に固定化されていてもよいし、培地または医薬組成物等の溶液中に遊離していてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1A】図１Ａは、還元性末端を含有する例示的なグリカンが、どのようにして商業的に得られ（例えば、Ｈ型２－三糖（Ｆｕｃα１－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ））、放出され、かつ天然源から（例えば、ＰＮＧａｓｅＦによって）、または非還元性アルカリβ脱離によって精製され得るかを例示するフロー図である。
【0015】
【図2B】図２Ｂは、実施例１のＨ３グリカンデンドリマーの生成を例示するフロー図である。図２Ｂは、Ｈ３－Ｎ３を８量体ＰＥＧビオチン／アルキンデンドリマーにカップリングさせるクリックケミストリ反応を例示する。
【図2C】図２Ｃは、Ｏ１３ ＹＳＤ細胞（その表面上にヤツメウナギＯ１３ ＶＬＲＢ抗Ｈ３抗体を発現する酵母細胞）および多価Ｈ３－ＰＡＡビオチン、一価Ｈ３－ｓｐビオチン、多価Ｈ３グリカンデンドリマービオチン、ならびに非修飾デンドリマービオチンによるフローサイトメトリー結合実験の結果を示す棒グラフである。多価Ｈ３－ＰＡＡおよびＨ３グリカンデンドリマーのみが、Ｏ１３ ＹＳＤ細胞によって効果的に結合された。
【0016】
【図3B】図３Ｂは、Ｍａｎ５およびＭａｎ９グリカンデンドリマーの生成および試験を例示する。図３Ｂは、Ｍａｎ５およびＭａｎ９デンドリマーを生成するためのＰＥＧ－ＮＨＳへのコンジュゲーション反応を示すフロー図である。
【0017】
【図4A】図４Ａは、Ｃｏｒｅ１－Ｔ、Ｃｏｒｅ２－Ｓ、Ｃｏｒｅ３－Ｓ、およびＣｏｒｅ４－Ｓグリカンデンドリマー（Ｔ＝トレオニン、Ｓ＝セリン）の生成および試験を例示する。図４Ａは、Ｃｏｒｅ１－ｔＴ、Ｃｏｒｅ２、３、４－Ｓ（Ｃｈｅｍｉｌｙ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ）の構造の例示である。
【図4B】図４Ｂは、Ｃｏｒｅ１－Ｔ、Ｃｏｒｅ２－Ｓ、Ｃｏｒｅ３－Ｓ、およびＣｏｒｅ４－Ｓグリカンデンドリマー（Ｔ＝トレオニン、Ｓ＝セリン）の生成および試験を例示する。図４Ｂは、Ｃｏｒｅ１－Ｔ、Ｃｏｒｅ２、３、４－Ｓデンドリマー（例としてＣｏｒｅ２－Ｓ）を生成するためのＰＥＧ－ＮＨＳとのコンジュゲーション反応のフロー図である。
【0018】
【図5A】図５Ａは、ＧＰ１００１２１（配列番号５）糖ペプチドデンドリマーの生成および試験を示す。図５Ａは、１つのセリンおよび１つのトレオニン（ＧＰ１００１２０、Ｓｕｓｓｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に連結された２つのＧａｌＮａｃを含有する合成糖ペプチド（配列番号５）を例示する。
【図5B】図５Ｂは、ＧＰ１００１２１（配列番号５）糖ペプチドデンドリマーの生成および試験を示す。図５Ｂは、ＧＰ１００１２１（配列番号５）グリコペプチドデンドリマーを生成するためのＰＥＧ－ＮＨＳへのコンジュゲーション反応のフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中で用いられる「デンドリマー」は、同一のデンドリマー分子で構成される物質である。
Ｉ．定義
本明細書中で用いられる「デンドリマー」は、同一のデンドリマー分子で構成される物質である。
【0020】
本明細書中で用いられる「デンドリマー分子」は、単一の構成単位から生じる１つまたはそれを超えるデンドロンからなる分子である。
【0021】
本明細書中で用いられる「デンドロン」は、遊離原子価がたった１の分子の一部であり、専ら樹状の、末端の構成繰返し単位（ＣＲＵ）を有し、かつあらゆる末端基までの遊離原子価由来の各経路が、同じ数の構成繰返し単位を含む。構成繰返し単位の性質を決定する目的で、遊離原子価は、ＣＲＵへのコネクションとして扱われる。１つのデンドロンのみを有するデンドリマー分子は、デンドロン、モノデンドロン、または機能化デンドロンと称されることがある。デンドロンにおいて、構成単位の大環状構造は存在しない。
【0022】
本明細書中で用いられる「グリカン」は、糖タンパク質、糖脂質、またはプロテオグリカン等の複合糖質の炭水化物部分である。また、「グリカン」は、生体媒質中の遊離非結合炭水化物を指す。グリカンは、単一の単糖および／またはグリコシド結合した２つもしくはそれを超える単糖（例えば多糖）であり得る。
【0023】
本明細書中で用いられる「活性薬剤」は、体内で局所的かつ／または全身的に作用する生理学的または薬理学的に活性な物質を指す。活性薬剤は、疾患または障害の処置（例えば治療剤）、予防（例えば予防剤）、または診断（例えば診断剤）のために患者に投与される物質である。
【0024】
本明細書中で用いられる、治療剤に関する「有効量」および「適切な量」は、少なくとも、あらゆる徴候または特定の症状もしくは障害の測定可能な向上または予防をもたらすのに、平均余命の測定可能な延長をもたらすのに、あるいは一般に患者のクオリティ・オブ・ライフを向上させるのに必要とされる最小濃度である。有効量は、処置される疾患もしくは症状、投与される活性薬剤（例えば、特定の標的構築物等）、対象のサイズ、または疾患もしくは症状の重症度等の因子に応じて変動し得る。癌に関して、有効量は、腫瘍増殖または腫瘍負荷を低減または阻害する活性薬剤の量を指し得る。有効量は、本明細書中に開示される送達システムと関連し得る。例えば、一部の実施形態において、「治療有効量」は、本明細書中に記載される粒子中かつ／または粒子上に組み込まれた場合に、あらゆる医療処置に適用可能な、合理的なベネフィット／リスク比にて何らかの所望の効果をもたらす治療薬の量を指す。当業者であれば、過度の実験を必要とすることなく、特定の化合物の有効量を経験的に決定することができる。
【0025】
本明細書中で用いられる「薬学的に許容され得る」は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、過剰な毒性も、刺激も、アレルギー反応も、他の問題や合併症もなしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【0026】
本明細書中で用いられる「抗体」は、標的抗原に結合する天然抗体または合成抗体を指す。当該用語には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。また、インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」に含まれるのは、免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、および標的抗原に結合する免疫グロブリン分子のヒトまたはヒト化バージョンである。本明細書中で用いられる「一本鎖Ｆｖ」および「ｓｃＦｖ」は、ｓｃＦｖが抗原結合のための（すなわち、単一のポリペプチド鎖の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）が互いに会合してＦｖを形成するための）所望の構造を形成することを可能にするリンカーによって接合された単一ポリペプチド鎖中にＶＬおよびＶＨを含む一本鎖可変フラグメントを意味する。ＶＬ領域およびＶＨ領域は、親抗体に由来してもよいし、化学的に合成されても組換えにより合成されてもよい。
【0027】
本明細書中で用いられる「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」は、投与または処置の標的であるあらゆる個体を指すのに交換可能に用いられる。対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物であり得る。対象は、ヒト患者または獣医学的患者であり得る。
【0028】
本明細書中で用いられる「処置」は、疾患、病理学的症状、または障害を治癒、改善、安定化、または予防することを意図した患者の医学的管理を指す。当該用語は、積極的処置、すなわち、疾患、病的症状、または障害の改善に特異的に向けられる処置を含み、そしてまた、原因処置、すなわち、関連する疾患、病的症状、または障害の原因の除去に向けられる処置も含む。加えて、当該用語は、緩和処置、すなわち、疾患、病的症状、または障害の治癒ではなく徴候の緩和のために設計される処置；予防的処置、すなわち、関連する疾患、病理学的症状、または障害の発症を最小限に抑えること、または部分的もしくは完全に阻害することに向けられる処置；および支持処置、すなわち、関連する疾患、病理学的症状、または障害の改善に向けられる別の特定の治療を補うのに使用される処置を含む。
【0029】
ＩＩ．組成物
多量体多機能グリカン足場およびその使用方法が提供される。足場は、典型的には、哺乳動物細胞を模倣して、天然タンパク質－グリカン結合事象のための高密度多価グリカンを作出することができる球状、分岐状、または高度に分岐したポリマーである。多量体グリカンをディスプレイすることに加えて、足場は、必要に応じて、天然の結合事象の特徴付けおよび／または単離を可能にする第２の、またはそれを超える部分または要素により機能化され得る。好ましい実施形態において、多量体グリカン足場は、細胞またはグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）の表面に結合して、結合した細胞またはタンパク質の特徴付けおよび／または単離を容易にする。ゆえに、多機能グリカン足場および細胞またはタンパク質の混合物、多機能グリカン足場が結合した細胞またはタンパク質もまた提供される。これらの要素は各々、以下でより詳細に説明される。
多量体多機能グリカン足場およびその使用方法が提供される。足場は、典型的には、哺乳動物細胞を模倣して、天然タンパク質－グリカン結合事象のための高密度多価グリカンを作出することができる球状、分岐状、または高度に分岐したポリマーである。多量体グリカンをディスプレイすることに加えて、足場は、必要に応じて、天然の結合事象の特徴付けおよび／または単離を可能にする第２の、またはそれを超える部分または要素により機能化され得る。好ましい実施形態において、多量体グリカン足場は、細胞またはグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）の表面に結合して、結合した細胞またはタンパク質の特徴付けおよび／または単離を容易にする。ゆえに、多機能グリカン足場および細胞またはタンパク質の混合物、多機能グリカン足場が結合した細胞またはタンパク質もまた提供される。これらの要素は各々、以下でより詳細に説明される。
【0030】
Ａ．多価グリカン足場
多量体グリカン足場が提供される。グリカン足場は、典型的には、その末端上で、１つまたはそれを超えるグリカン、および必要に応じて１つまたはそれを超える他の機能要素により機能化された、基礎をなす分岐足場から形成される。
多量体グリカン足場が提供される。グリカン足場は、典型的には、その末端上で、１つまたはそれを超えるグリカン、および必要に応じて１つまたはそれを超える他の機能要素により機能化された、基礎をなす分岐足場から形成される。
【0031】
機能化された多価グリカン足場の一例を図１Ｂに示す。図１Ｂは、式：
（リガンド）ｎ：足場：検出／分離タグ：識別子タグ
の一実施形態を示し、
式中、「リガンド」は、ｎ＞１コピー（すなわち、多価）を有する１つまたはそれを超えるグリカンであり；
「足場」は、基礎をなす分岐足場、例えば、デンドリマーまたは超分岐ポリマーであり；
「検出／分離」および「識別子」「タグ」は、例示的な、必要に応じた機能要素であり、例えば、（ａ）分離／単離を容易にするためのビオチンもしくは（ＨＩＳ）６～８ペプチドタグ、（ｂ）検出を容易にするためのフルオロフォア、および／または（ｃ）特定を容易にするための、ＰＣＲ増幅および配列決定することができる固有のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列（「バーコード」）である。
（リガンド）ｎ：足場：検出／分離タグ：識別子タグ
の一実施形態を示し、
式中、「リガンド」は、ｎ＞１コピー（すなわち、多価）を有する１つまたはそれを超えるグリカンであり；
「足場」は、基礎をなす分岐足場、例えば、デンドリマーまたは超分岐ポリマーであり；
「検出／分離」および「識別子」「タグ」は、例示的な、必要に応じた機能要素であり、例えば、（ａ）分離／単離を容易にするためのビオチンもしくは（ＨＩＳ）６～８ペプチドタグ、（ｂ）検出を容易にするためのフルオロフォア、および／または（ｃ）特定を容易にするための、ＰＣＲ増幅および配列決定することができる固有のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列（「バーコード」）である。
【0032】
これ以外にも、式の「タグ」は、本明細書中の他の箇所で説明されるような薬物または他の材料、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｃｒｉｓｐｒガイドＲＮＡ等の核酸、あるいは治療効果もしくは細胞修飾効果を有することが意図されるか、または（ａ）抗原を発現する病原体もしくは異常細胞、例えば腫瘍に対する保護的免疫応答、もしくは（ｂ）抗原に対する自己免疫障害の治療としての抗原に対する免疫寛容を誘導することが意図される抗原を含み得る薬物またはそのような他の材料を含有する小胞等の機能要素であり得る。
【0033】
多価足場のこれらの要素は各々、以下でより詳細に説明される。
【0034】
１．基礎をなす足場
基礎をなす足場を形成するための材料が提供される。基礎をなす足場は、典型的には、樹状分子から形成される分岐足場である。樹状分子のフィールドは、低分子種と高分子種に大別することができる。第１のカテゴリは、デンドリマーおよびデンドロンを含み、後者は、デンドロナイズドポリマー、超分岐ポリマー、およびポリマーブラシを含む。デンドリマーおよびデンドロンは、単分散性であり、通常、高度に対称性の球状化合物である。基礎をなす足場は、これらの樹状分子のいずれか１つから形成することができる。
基礎をなす足場を形成するための材料が提供される。基礎をなす足場は、典型的には、樹状分子から形成される分岐足場である。樹状分子のフィールドは、低分子種と高分子種に大別することができる。第１のカテゴリは、デンドリマーおよびデンドロンを含み、後者は、デンドロナイズドポリマー、超分岐ポリマー、およびポリマーブラシを含む。デンドリマーおよびデンドロンは、単分散性であり、通常、高度に対称性の球状化合物である。基礎をなす足場は、これらの樹状分子のいずれか１つから形成することができる。
【0035】
デンドリマーの特性は、分子表面上の官能基によって部分的に制御される。しかしながら、内部官能性を有するデンドリマーの例がある。デンドリマーの制御可能な特性として、溶解性、毒性、結晶性、テクトデンドリマー形成、およびキラリティが挙げられる。Ｃｌｏｎｉｎｇｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．，６（６）：７４２－８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ１３６７－５９３１（０２）００４００－３（２００２）も参照。
【0036】
デンドリマーは、３つの主要な部分：コア、内側シェル、および外側シェルを有すると考えることができ、溶解性、熱安定性、および化合物の付着等の特性を制御するような、これらの部分のそれぞれにおいて異なる官能性を有するように合成することができる。また、合成プロセスは、デンドリマー上の分岐のサイズおよび数を正確に制御することができる。
【0037】
デンドリマーの調製は、連続する各基によってデンドリマーを構築することを含む一連の段階的反応によって達成される合成制御のレベルを必要とする。デンドリマー合成は、収束型または拡散型のものであり得る。拡散デンドリマー合成中、分子は、ある世代を前の世代に付着させてから、次の段階の反応用の官能基を変化させることを含む段階的プロセスにおいて、コアから周辺部にアセンブルされる。官能基変換は、制御されない重合を防止するのに必須である。そのような重合は、単分散ではなく、本来なら超分岐ポリマーとして知られる高度に分岐した分子をもたらす。立体効果に起因して、デンドリマー繰返し単位を反応させ続けると、立体的な密集が特定の世代での完全な反応を妨げて分子の単分散性を破壊するまで、球形の分子または球状分子となる。開示される多価グリカン足場の基礎をなす分岐足場は、収束合成または拡散合成によって調製することができる。基礎をなす足場は、単分散または多分散であり得る。
【0038】
基礎をなす足場は、典型的には、ナノメートルサイズ、例えば１００ｎｍ以上１ｎｍ以下、またはその整数部分範囲、またはその間の離散整数である。例えば、分子は、直径約１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１２．５ｎｍ、１０ｎｍ、７．５ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、または２ｎｍであり得る。
【0039】
デンドリマーは、その合成中に実行される繰返し分岐サイクルの数を指す世代によって分類することができる。例えば、デンドリマーが収束合成によって作製されて、分岐反応がコア分子に対して３回実行されるならば、結果として生じるデンドリマーは第３世代デンドリマーとみなされる。連続する各世代は、前の世代の分子量のおよそ２倍のデンドリマーを生じさせる。また、デンドリマーが高世代であるほど、官能基が表面上に多く露出し、これは後に、所与の用途のためにデンドリマーをカスタマイズするのに用いることができる。
【0040】
開示される多価グリカン足場の基礎をなす分岐足場は、あらゆる世代のものであってよい。ゆえに、一部の実施形態において、デンドリマーまたは他の分岐分子は、例えば、Ｇ１～Ｇ１０世代のいずれか１つのものであってよい。一部の実施形態において、基礎をなす分岐足場は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の反復単位、またはそこから導き出せるあらゆる範囲を有する。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる基礎をなす分岐足場は、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、またはＧ３である。しかしながら、可能な世代の数（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２５）は、分岐ポリマー中の間隔単位を減少させることによって増大させることができる。
【0041】
基礎をなす足場を形成するのに用いることができる材料の非限定的な例として、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、マルチアームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレンイミン）等の分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー、ＰＥＧコアデンドリマー、マルチアームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、ポリ（アクリラート）、ポリアミン、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（メチルアクリラート）、ポリフェニレン、およびポリスチレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0042】
例えば、一部の実施形態において、基礎をなす足場のデンドロンは、ポリエステル－８－ヒドロキシル－１－アセチレンビス－ＭＰＡデンドロン、ポリエステル－６－ヒドロキシル－１－アセチレンビス－ＭＰＡデンドロン、ポリエステル－３２－ヒドロキシル－１－アセチレンビス－ＭＰＡデンドロン、ポリエステル－８－ヒドロキシル－１－カルボキシルビス－ＭＰＡデンドロン、ポリエステル－６－ヒドロキシル－１－カルボキシルビス－ＭＰＡデンドロン、またはポリエステル－３２－ヒドロキシル－１－カルボキシルビス－ＭＰＡから形成される。
【0043】
一部の例では、基礎をなす分岐足場は、デンドリマー様特性を有する多分散樹状高分子を形成する超分岐ポリマーから形成される。多くの場合、超分岐（ｈｙｂｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ）ポリマーは、単一の合成重合工程において調製される。例えば、超分岐ポリマーは、２，２－ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸（ビス－ＭＰＡ）モノマーに基づき得る。超分岐ポリマーの例として、超分岐ビス－ＭＰＡポリエステル－１６－ヒドロキシル、超分岐ビス－ＭＰＡポリエステル－３２－ヒドロキシル、および超分岐ビス－ＭＰＡポリエステル－６４－ヒドロキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
ペプチド「アーム」および多糖（ｐｏｌｙｓａｃｈａｒｉｄｅ）「アーム」を用いて、基礎となる足場を形成することもできる。
【0045】
一部の実施形態において、分岐ポリマーは、世代０の４つから、世代１０の４，０９６個、またはあらゆる整数部分範囲もしくはその特定の整数の範囲のいくつかの表面基（原子価部位）を有するポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである。他の実施形態において、分岐ポリマーは、Ｙ型ＰＥＧの２つから、８アームＰＥＧの８つの範囲のいくつかの原子価部位を有するマルチアームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーである。他の実施形態において、分岐ポリマーは、８００Ｄａの低分子量ＰＥＩの１０個から、２５，０００Ｄａの高分子量ＰＥＩの２１１個、またはあらゆる整数部分範囲もしくはその特定の整数の範囲のいくつかの原子価部位を有する高度に分岐したポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマーを含む。
【0046】
アーム長は、異なる間隔に合わせてカスタマイズすることができる。例えば、特定の実施形態において、足場は、アームあたりのＰＥＧ長が１～５０ＰＥＧ単位、より好ましくは５～２５ＰＥＧ単位である。
【0047】
別の例では、分岐ポリマーは、デンドロアルキン－ＰＥＧ－デンドロアルキン（ＰＥＧ超分岐デンドリマーアセチレン）（例えば、Ｇ４、Ｇ５、またはＧ６；ＰＥＧ １０Ｋ）である。Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ、カタログ番号ＨＢＰ－２１１、ＨＢＰ－２１２、およびＨＢＰ－２１３を参照。
【0048】
特定の実施形態において、多量体グリカン足場は、１０ｋＤａ～５０ｋＤの間、２０ｋＤａ～６０ｋＤａの間、もしくは２０ｋＤａ～３０ｋＤａの間（それぞれ両端を含む）、またはそのあらゆる整数範囲、もしくはその間のあらゆる特定の整数であり、必要に応じて、８～１６本のアーム、例えばＰＥＧアームを有する。これらの足場は、多量体相互作用のための十分／適切な間隔およびフレキシビリティを提供すると考えられる。一部の実施形態において、基礎となる足場は、より大きく、かつ／またはより広い。より大きい／より広いグリカン足場は潜在的に、複数のＧＢＰの相互作用を一度に提供し、これは、用いられる用途に応じて、望ましい場合もあれば、そうでない場合もある。
【0049】
好ましくは、多量体グリカン足場は、水溶性である。好ましくは、グリカン足場は、特にインビボ用途のために、安定かつ／または非毒性である。例えば、基礎となる足場がＰＥＧで構成される場合、多量体足場は高度に水溶性である。なぜなら、ＰＥＧおよびグリカンの双方が水および水性バッファ中に非常に可溶性であるからである。
【0050】
２．リンカーおよびリンケージ
開示される多量体グリカン足場は、２つまたはそれを超えるグリカンを有し、必要に応じてだが好ましくは、基礎となる足場の末端に提示される１つまたはそれを超える機能要素も有し得る。ゆえに、基礎となる足場は、典型的には、グリカンおよび必要に応じた追加の機能要素を連結するのに適した１つまたはそれを超える末端基と共に製造される。そのような基は、リンカーまたはリンケージと呼ばれ得る。
開示される多量体グリカン足場は、２つまたはそれを超えるグリカンを有し、必要に応じてだが好ましくは、基礎となる足場の末端に提示される１つまたはそれを超える機能要素も有し得る。ゆえに、基礎となる足場は、典型的には、グリカンおよび必要に応じた追加の機能要素を連結するのに適した１つまたはそれを超える末端基と共に製造される。そのような基は、リンカーまたはリンケージと呼ばれ得る。
【0051】
基礎となる足場は、別の二官能性リンカー上の末端基、または基礎となる足場と反応する１つもしくはそれを超える二官能性リンカーを介して、グリカンまたは機能要素に付着し得る。ゆえに、一部の実施形態において、リンカーは、独立した官能基を介して、基礎となる足場の末端をグリカンまたは機能要素に繋ぐ二官能性リンカーである。二官能性リンカーの数は、１つであっても１つを超えてもよい。一部の実施形態において、基礎となる足場とグリカンまたは機能要素との間に単一の二官能性リンカーが存在する。他の実施形態において、基礎となる足場とグリカンまたは機能との間に２つまたはそれを超える二官能性リンカーが存在し得、例えば、基礎となる足場の一端が、第１の二官能性リンカーの一端と結合し、第１の二官能性リンカーの他端が、第２の二官能性リンカーの一端に付着する。第２の二官能性リンカーは、一方の官能性末端を介して第１の二官能性リンカーに付着し得、他方の官能性末端がグリカンに付着し得る。このようにして、基礎となる足場とグリカンまたは機能要素との間に３つ、４つ、またはそれを超える二官能性リンカーが存在し得る。二官能性リンカーの数は、例えば、より良好な立体特性を提供するために、より効率的な連結のために、または市販のリンカーを利用するために選択され得る。
【0052】
基礎となる足場は、カルボン酸ナトリウム末端基、第１級アミン末端基、ヒドロキシル末端基、アミドエタノール末端基、スクシンアミド酸末端基、スクシンアミジル末端基、ならびに第１級および第２級アミン末端基の混合物が挙げられ得る少なくとも１つの末端基を含み得るが、これらに限定されない。基礎となる足場が末端アミン基を含む場合、第一級アミンに結合するアミン反応性架橋剤基が用いられ得る。第一級アミンと結合することができる基として、イソチオシアナート、イソシアナート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カルボナート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、およびフルオロフェニルエステルが挙げられる。これらの基の大部分は、アミンに、アシル化またはアルキル化のいずれかによってコンジュゲートする。
【0053】
グリカンは、一般に、例えば、グリカンがアミン基を含む場合にはアミン基を介して、またはグリカンが還元糖を含む場合にはアルデヒドもしくはケトンを介して付着し得る。還元糖を含むグリカンへの架橋について、適宜アルデヒドまたはケトンと反応性の官能基が、グリカンに架橋するように作用する。アルデヒド反応性架橋官能基には、ヒドラゾン結合を形成するヒドラジドが含まれる。アニリンを用いて、ヒドラジド－アルデヒド反応を触媒することができる。別の官能基としてアルコキシアミン基が挙げられ、アルコキシアミンはアルデヒドと反応して安定なオキシムを形成する。グリカンがアミン基を含む場合、上述のように、第一級アミンに結合するアミン反応性架橋剤基が用いられ得る。
【0054】
ゆえに、基礎となる足場とグリカンまたは機能要素との間の連結は、グリカンまたは機能部分に付着するための第１の機能末端および基礎となる足場に付着するための第２の機能末端を有する二官能性リンカーである部分との架橋を介して起こり得る。一実施形態において、リンカーまたは二官能性リンカーは、スクシンイミジル、ヒドラジジル、アミノオキシル、アルデヒド、アミノ、アジジル、ビオチニル、カルボキシル、エポキシ、ヒドラジニル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、およびケトニル官能基である１つまたはそれを超える官能基を含み、官能基間にスペーサを有する。
【0055】
例えば、他のより具体的な実施形態において、二官能性リンカーは、１つまたはそれを超えるＮ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルタルトラート（ＤＳＴ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルオキサラート（ＤＳＯ）、スベリン酸ビス（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルグルタラート（ＤＳＧ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルホモニ官能性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、およびそれらの組合せであり得る第１のスクシンイミジルホモ二官能性リンカー；ならびにアジピン酸ジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、オキサリルジヒドラジド、９，１０－ジヒドロ－９，１０－エタノアントラセン－１１，１２－ジカルボン酸ジヒドラジド、エチルマロン酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド、ピメリン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、チオカルボヒドラジド、スベリン酸ジヒドラジド、６－ヒドラジノニコチンヒドラジド、４－アミノ安息香酸ヒドラジド、２－アミノ－イソニコチン酸ヒドラジド、およびそれらの組合せからなる群から選択される第２のヒドラジジルホモ二官能性リンカーを含む。
【0056】
一部の実施形態において、二官能性リンカーは、スクシンイミジル、ヒドラジド、もしくはアミノオキシル官能基を含有するホモ二官能性材料；またはスクシンイミジル、ヒドラジド、もしくはアミノオキシル官能基を含有するヘテロ二官能性材料を含む。一部の実施形態において、ホモ二官能性リンカーは、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカルボナート、アジピン酸ジヒドラジド、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【0057】
他の実施形態において、基礎となる足場とグリカンまたは機能要素との間に第１および第２の二官能性リンカーが存在する。一実施形態において、第１の二官能性リンカーはジスクシンイミジルリンカーであり、第２の二官能性リンカーはジヒドラジドリンカーまたはヒドラジド－アミンヘテロ二官能性リンカーである。このようにして、第１のリンカーのスクシンイミジル基は、第２の二官能性リンカーに、（ジヒドラジドリンカーの）ヒドラジド基または（ヒドラジドアミンリンカーの）アミン基を介して付着し得る。そこから、第２のリンカーのヒドラジド官能基は、還元糖を有するグリカンと、そのアルデヒド基またはケトン基を介して反応するのに利用可能である。ゆえに、基礎となる足場は、そのアミン末端基を介して、第１のリンカーのスクシンイミジル基に付着する。次いで、第１のリンカーの第２のスクシンイミジル基は、グリカンに、グリカンのアミン基を介して交互に付着し、かつ／または第１のリンカーの第２のスクシンイミジル基は、第２のリンカーのアミン基またはヒドラジド基のいずれかを介して付着する。次いで、第２のリンカーの第２の官能基（ヒドラジド）を用いて、還元性末端を有するグリカンのアルデヒド基またはケトン基に付着させることができる。
【0058】
特定の実施形態において、リンカーは、アクリルアミド、アルキン、アミン、アジド、ビオチン、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、ヒドラジン、マレイミド、ホスファート、スクシンイミジルＮＨＳエステル、およびスルフヒドリルメルカプト（ＳＨ）から選択される１つまたはそれを超える官能基から形成される。
【0059】
加えて、または代わりに、リンカーは、１つまたはそれを超えるアフィニティタグ対を含み得る。アフィニティタグ対は、当該技術において周知であり、エピトープ／抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ／グルタチオン、マルトース結合タンパク質／アミラーゼ、およびマルトース結合タンパク質／マルトースが挙げられる。エピトープ／抗体結合対に用いられ得る適切なエピトープの例として、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ｃ－Ｍｙｃ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、Ｈｉｓ６、ＧＦＰ、ＤＩＧ、ビオチン、およびアビジンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのエピトープに結合する抗体（モノクローナルおよびポリクローナル、ならびにそれらの抗原結合フラグメントの双方）は、当該技術において周知である。
【0060】
アフィニティタグは、基礎となる足場の末端にコンジュゲートされる相補的アフィニティタグとの高度に特異的な非共有結合性の物理化学的相互作用を形成するアフィニティタグにコンジュゲートされるグリカンおよび／または機能要素の高度にフレキシブルなモジュールアセンブリおよびディスアセンブリを可能にする。基礎となる足場は、単一種のアフィニティタグと、またはあらゆる組合せのアフィニティタグ種とあらゆる比率でコンジュゲートすることができる。アフィニティタグの種数、およびその、デンドリマーアームにコンジュゲートされる比率を変動させる能力は、足場に付着され得るグリカンおよび／または機能要素の数および種類、ならびにその比率に対する絶妙な制御を可能にする。
【0061】
一部の実施形態において、グリカンおよび／または機能要素は、「クリック」ケミストリを用いて、基礎となる足場に繋がれる。クリックケミストリは、１，２，３－トリアゾールを形成するような、アジドおよびアルキンの１，３－双極子付加環化である。グリカンをリンカーにカップリングするのに多くの他の化学を用いることができるが、クリックケミストリの選択には、いくつかの主要な利点がある。クリックケミストリ官能基（アジド、アルキン、ＤＢＣＯ等）は、生体系および他の化学基には実質的に存在しないので、例えばグリカンおよびタンパク質との、望ましくない反応を防止する。グリカンのアジド化は、例えば還元糖のみにおいて、非常に特異的であるように見え、収率が、試験したほとんどのオリゴ糖において比較的高く、７０％を超える（Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），（２３）：３３７８－９，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｂ９０５７６１ｇ（２００９））。還元糖のアジド化は、化学的特性および構造的特性、特に閉環構造を保存する（Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），（２３）：３３７８－９，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｂ９０５７６１ｇ（２００９））。これは、代替的なタグ付け化学／方法に常に当て嵌るとは限らない。クリックケミストリ反応は、２つの分子をカップリングするのに利用可能な、最も効果的な反応の１つである。これは、高速であり、信頼性があり、特異的であり、完全であり、多くの反応条件に対応し、かつ非常に最小限の設定しか必要としない。例えば、ＤＢＣＯ＋Ｎ３では、反応を触媒するのに溶液中に２つの成分のみが必要とされ、それ以外は必要ない。以下の実施例のセクションでは、グリカンの還元性末端をアジド（Ｎ３）タグで誘導体化して、クリックケミストリを用いてＮ３誘導体化グリカンをアルキン／ＤＢＣＯ－ビオチン８量体リンカー（７アームのアルキン／ＤＢＣＯおよび１アームのビオチン）にカップリングさせた。
【0062】
一部の実施形態において、グリカンおよび／または機能要素は、二官能性蛍光リンカー２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）－ベンズアミド（ＡＥＡＢ）（Ｓｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， “Ｎｏｖｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｇｌｙｃａｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｇａｌｅｃｔｉｎｓ，” Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２００９ Ｊａｎ ３０；１６（１）：３６－４７． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２００８．１１．００４． ＰＭＩＤ： １９１７１３０４； ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ２６６２４４６、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）を用いて、基礎となる足場に繋がれる。ＡＥＡＢは、そのアリールアミン基を介して還元的アミノ化によって遊離グリカンにコンジュゲートして、グリカン－ＡＥＡＢ（ＧＡＥＡＢ）を形成することができ、これは今度は、例えばその、１つまたはそれを超えるアームへのコンジュゲーションを介して足場中に組み込むことができる。例えば、以下の実施例２に記載される実験、およびこれと関連する図、例えば図３Ａ～図３Ｃを参照。グリカン－ＡＥＡＢコンジュゲート（ＧＡＥＡＢ）は、グリカン－２，６－ジアミノピリジン（ＤＡＰ）コンジュゲートと同様の蛍光を保持する。しかしながら、アリールアミンは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体化表面上へのより効率的な固定化のために、第一級アルキルアミン官能基で置換されている。
【0063】
一部の実施形態において、アミノ酸は、例えば、単独で、または糖アミノ酸もしくは糖ペプチドの一部として、グリカンを足場のアームに連結するリンカーの役目を果たす。糖ペプチドは、１つまたはそれを超える、同じまたは異なるグリカンを含み得る。単一アミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）およびペプチド（例えば、セリン残基およびトレオニン（ｔｈｅｒｏｎｉｎｅ）残基）に連結されたグリカンによって形成されるデンドリマーの例が、以下の実施例２の実験に記載されている。例えば、それぞれ図４Ａ～図４Ｂおよび図５Ａ～図５Ｃを参照。
【0064】
一部の実施形態において、足場は、基礎となる足場の１つ、２つ、またはそれを超える異なる末端上に、２つまたはそれを超える異なるリンカー（または二官能性リンカー）を含む。ゆえに、足場は、２つまたはそれを超える異なる部分（例えば、グリカンおよび別の部分）の付着に対して、２つまたはそれを超える異なる末端リンカーを提示することができる。このアプローチを用いて、グリカンの、他の官能性分子に対する比率をより正確に制御することができる。足場は、典型的には多量体グリカン足場であるので、典型的には２つまたはそれを超えるグリカンを提示する。一部の実施形態において、足場は、０、１、２、またはそれを超える機能要素を提示する。
【0065】
リンカー／デンドリマー構成の可能性はかなりあり、多くは市販されている。非限定的な例として、市販業者は実質的に、「Ｙ」官能基を有する１本のアームおよび「Ｘ」官能基を有する７本のアームを備える８アームＰＥＧ－Ｘ／Ｙのあらゆるカスタム合成の可能性を提供する。そのような足場を用いて、７つのグリカンおよび１つの機能要素を提示する多価グリカン足場を調製することができる。
【0066】
上記は、例示的かつ非限定的であり、リンカーの他の構成が、当業者によって想定され得る。
【0067】
３．グリカン
各足場によって提示されるグリカンは、１つまたはそれを超える異なるあらゆるグリカン種であり得る。一部の実施形態において、足場は、２つまたはそれを超えるコピーの単一種のグリカン（すなわち、グリカンについて均質である）を提示する。他の実施形態において、足場は、１、２、３、またはそれを超えるコピーの、２つまたはそれを超える異なるグリカン種（すなわち、グリカンについて異質である）を提示する。
各足場によって提示されるグリカンは、１つまたはそれを超える異なるあらゆるグリカン種であり得る。一部の実施形態において、足場は、２つまたはそれを超えるコピーの単一種のグリカン（すなわち、グリカンについて均質である）を提示する。他の実施形態において、足場は、１、２、３、またはそれを超えるコピーの、２つまたはそれを超える異なるグリカン種（すなわち、グリカンについて異質である）を提示する。
【0068】
グリカンは、天然グリカンであっても合成グリカンであってもよい。グリカンは、市販業者から得てもよいし、細胞、組織、および糖タンパク質等の生物学的供給源から単離してもよい。
【0069】
例示的なグリカンとして、高マンノースＮ－グリカン、複合Ｎ－グリカン、ハイブリッドＮ－グリカン、Ｏ－ＧａｌＮＡｃ Ｏ－グリカン、Ｏ－マンノースＯ－グリカン、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ Ｏ－グリカン、血液型抗原グリカンおよびルイス抗原グリカン、ヒトミルクオリゴ糖、スフィンゴ糖脂質グリカン、グリコサミノグリカン、細菌グリカン、ならびにグリカン含有天然産物が挙げられるが、これらに限定されない。また、用いられ得るグリカンの例として、本明細書中で具体的に言及される全てのグリカンが挙げられる。
【0070】
例示的な市販のグリカンとして、全ての血液型グリカン、例えば、血液型Ｈ２型三糖、ルイスＸ、シアリルルイスＡ、６－スルホ－シアリルルイスＸ、３’－および６’－ｓｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ、Ｇｌｏｂｏ－Ｎ－ペンタオース（Ｇｌｏｂｏ－Ｎ－ｐｅｎｔａｏｓｅ）（Ｇｂ５）、およびグロボ－Ｎ－テトラオース（Ｇｂ４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0071】
Ｎ－グリカンが酵素的に放出され得る天然源として、ウシフェチュイン、リボヌクレアーゼＢ、ニワトリ卵白アルブミン、ニワトリ卵黄シアリルグリコペプチド、ヒト血清ＩｇＧ、ならびに初代細胞および不死化細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＴＨＰ、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ）が挙げられる培養細胞、または２つもしくはそれを超える異なる細胞型の組合せが挙げられるいずれか１つもしくはそれを超える前述のものの集団の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。糖タンパク質毎に、ウシフェチュイン、リボヌクレアーゼＢ、ニワトリ卵黄シアリルグリコペプチド、およびニワトリ卵白アルブミン由来のＮ－グリカンは、その異質性がかなり限定されている。ウシフェチュイン由来のＮ－グリカンは、主に、２、３、またはさらには４つのシアル酸により修飾された二分岐Ｎ－グリカンおよび三分岐Ｎ－グリカンである（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，４０９（２）：４２１－９，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２１６－０１６－９６９０－ｘ（２０１７））。リボヌクレアーゼＢ由来のＮ－グリカンは、高マンノース型Ｍａｎ５－９に限定される（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，４０９（２）：４２１－９，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２１６－０１６－９６９０－ｘ（２０１７））。ニワトリ卵黄シアリルグリコペプチド由来のＮ－グリカンは、専らシアリル化二分岐Ｎ－グリカンで構成されている（Ｓｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，１３３５（１－２）：２３－３２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０３０４－４１６５（９６）００１１８－３（１９９７））。ニワトリ卵白アルブミン由来のＮ－グリカンは、高マンノースおよび多種多様なＮ－アセチルグルコサミン末端Ｎ－グリカンでほぼ例外なく構成されており、ガラクトース、フコース、およびシアル酸による修飾はほとんど、または全くない（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，４０９（２）：４２１－９，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２１６－０１６－９６９０－ｘ（２０１７））。
【0072】
ムチン由来のＯ－グリカンが、水酸化アンモニウムによって放出されて、以下の実施例に記載されるプロトコルによるアジド修飾に適するようにホウ酸で還元され得る。ブタ胃ムチン（ＰＳＭ）Ｏ－グリカンを表すＰＳＭグリカンデンドリマー等の市販のムチンを用いて調製することができる。
【0073】
天然グリカンは、単糖の組成、サイズ、および構造が大きく変動し得る。化学的／酵素的合成およびコストの限界に起因して、市販のグリカンは、１～４つの単糖単位からなる構造に制限されることが多く、したがって、限られたグリカンエピトープのみを表す。また、「完全」グリカンは、異なる状況において、例えばＮ－グリカンのアンテナ上またはＯ－グリカン上にルイスＸといった特定のグリカンエピトープを提示する可能性を提供する。天然由来グリカンによる実施は、実際に天然に存在するグリカンの代表である。さらに、天然グリカンを数多く収集することができる。合成グリカンの調製は、コストおよび他の資源によって実際に制限され得るが、天然由来グリカンは、比較的大量に調製することができる。開示される組成物、デバイス、および方法は、最大何十万個ものグリカンを単離し、必要に応じて利用することを包含する。
【0074】
一般に、天然源から単離されたグリカンは、特に細胞、組織、または生物から単離されれば、異質であろう。均質な、すなわち単一特異的であるが多価のグリカンデンドリマーを調製するために、グリカンの異質な混合物を、例えばＨＰＬＣによって分離することができる。１つの単糖または１つのリンケージのみが異なる、密接に関連するグリカンを有するグリカンデンドリマーを生成するので、潜在的なグリカンリガンドの精密スクリーニングに用いることができるライブラリーを作成することも可能である。
【0075】
先で導入したように、一部の実施形態において、単一の足場が、２つまたはそれを超えるグリカンを組み合わせて提示する。グリカンは、利用可能なアームの数および連結されているグリカン種の数に基づいて、考え得るあらゆる比率で提示することができる。説明用の非限定的な例として、２つのグリカンＧ１およびＧ２は、単独で、または機能要素ＦＥと組み合わせて、８アームデンドリマー（例えば８アームＰＥＧ）に、１：６：１、２：５：１、３：４：１、４：３：１、５：２：１、６：１：１、１：７：０、２：６：０、３：５：０、４：４：０、５：３：０、６：２：０、７：１：０のＧ１：Ｇ２：ＦＥの比率にてカップリングする。そのようなデンドリマーを実験的に用いて、２つの異なるグリカン、例えばシアル酸のα２－３対α２－６リンケージのアゴニスト／アンタゴニスト結合効果をアッセイ／比較することができる。
【0076】
基礎となる足場へのリンケージ用にグリカンを単離して調製する方法が、以下の実施例、本明細書に引用される参考文献に説明されており、そうでなければ、連結を制御するのに用いられる反応性基に基づく当該技術において知られている。例えば、Ｓｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｇｌｙｃａｎｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ，’’Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３，５２８－５３４（２０１６），ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３８６１を参照。例えば、ヒドラジノリシスは、Ｎ－およびＯ－グリカンの分析および調製の双方に用いられているが、試薬の毒性およびグリカンの構造的完全性に起因して、制限されている。アンモニウム塩処理は元々、Ｏ－グリカン用に開発され、Ｎ－グリカンにも有効であることが見出された。糖タンパク質のプロナーゼ消化により、糖アミノ酸を放出することができ、これは、直接機能化するか、または更なる機能化のためにＮ－ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）によりさらにトリミングすることができる。ワンポットβ脱離、および１－フェニル－３－メチル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）によるタグ付けが、Ｏ－グリカン放出の有効な分析方法であることが示されている。エンドセラミダーゼが、グリカン分析用にスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）から脂質部分を放出するのに利用可能であり、塩基性または中性の条件下でのスフィンゴ糖脂質からのオゾン開始グリカン放出が、大規模調製用に潜在的に用いられ得る。
【0077】
Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．は、以下の実施例で利用されるグリカンアジドプロセスを最初に記載かつ確立した（Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），（２３）：３３７８－９，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｂ９０５７６１ｇ（２００９））。そしてまた、グリカンアジド化およびクリックケミストリカップリングの双方について、Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．，２０（１５）：１９１４－８，ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１９０００２３（２０１９））も参照。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。Ｔａｎａｋａは、Ｎ－グリカンの非還元性ＧｌｃＮＡｃのＮ－アセチル基が挙げられる修飾単糖残基の他の官能基を保存しながら、アノマーヒドロキシ基の選択的活性化によって、あらゆるグリカンの末端還元性末端をアジド（Ｎ３）タグにより誘導体化することができる反応を示した。銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン付加環化反応または「クリックケミストリ」は、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．，４１（１４）：２５９６－９，ｄｏｉ：１０．１００２／１５２１－３７７３（２００２０７１５）４１：１４＜２５９６：：ＡＩＤ－ＡＮＩＥ２５９６＞３．０．ＣＯ；２－４（２００２））によって２０年前に導入されて、グリカンが挙げられる全種類の生体分子に適合した（Ｂａｓｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０４（４３）：１６７９３－７，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７０７０９０１０４（２００７）；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１８（６）：７１４５－５９．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１８０６７１４５ ２０１３；Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．，２０（１５）：１９１４－８，ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１９０００２３（２０１９））。
【0078】
Ｎ３タグ化グリカンを、アルキンまたはＤＢＣＯ磁気ビーズ上にクリックすることもできる。そのような磁気ビーズは、プルダウンアッセイおよび／またはフローサイトメトリータイプの実験に用いることができる。具体例として、血液型Ｈ２型三糖、ヒト血清ＩｇＧ由来Ｎ－グリカン、ウシフェチュイン由来Ｎ－グリカン、およびニワトリ卵白アルブミン由来Ｎ－グリカンが挙げられる。
【0079】
Ｓｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．は、多様な種類の生体試料からグリカンを放出させる方法を記載した。酸化的戦略は、漂白剤を用いることを含み、糖タンパク質から全てのタイプの遊離還元性Ｎ－グリカンおよびＯ－グリカン酸、ならびにスフィンゴ糖脂質からグリカンニトリルを放出するのに有効である。放出されたグリカンは、グリカン分析に直接的に有用であり、かつ／または、例えば蛍光的に、誘導体化され得る。簡潔には、タンパク質を分解することが知られているＮａＣｌＯは、天然複合糖質のアグリコン部分を効果的かつ選択的に分解して、インタクトなグリカンを放出する。糖タンパク質をＮａＣｌＯにより簡単に処理すると、遊離Ｎ－グリカンが放出され、これが、還元性末端を介して特異的に誘導体化され得る。ＮａＣｌＯは、糖タンパク質を数分で分解し、放出されたグリカンは、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）において、未処理の糖タンパク質と比較して、高い移動度によって容易に可視化される。当該プロセスは、全てのタイプの一般的な糖タンパク質に使用可能であり、例えば、オボアルブミン、ウシＩｇＧ、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて実証されており、その最後は、Ｎ－グリカンのコアα３－フコース修飾により、ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化に耐性である。ウシフェチュインで実証されているように、典型的には不安定なシアル酸残基も十分に保存される。この様式で誘導されたＮ－グリカンは、アミン系タグ、例えば、二官能性蛍光リンカー２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）ベンズアミド（ＡＥＡＢ）、ならびに他の蛍光タグおよびリンカー（例えば、上述したようなもの）と反応して、クロマトグラフィ分離および精製、ならびに／または足場への組込みを容易にする。例えば、Ｓｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， “Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｇｌｙｃａｎｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ，” Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３， ５２８－５３４ （２０１６）， ／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３８６１、Ｓｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， “Ｎｏｖｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｇｌｙｃａｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｇａｌｅｃｔｉｎｓ，” Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２００９ Ｊａｎ ３０；１６（１）：３６－４７． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２００８．１１．００４． ＰＭＩＤ： １９１７１３０４； ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ２６６２４４６、米国特許出願第２０１３／０３３１２８０号、および米国特許出願第２０２０／０２６２９４０号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）を参照。
【0080】
「糖構造」を生成する以前の試みは、１～３つの単糖が付着した「より多価の」構造の構築に焦点を当てている（Ｂｅｒｎａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１１）：４７０９－２７， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ２ｃｓ３５４０８ｊ （２０１３）、Ｍｏｕｓａｖｉｆａｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．， ２６（９）， ｄｏｉ： １０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２６０９２４２８ （２０２１）、Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１０）：４３５８－７６， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ２ｃｓ３５４２７ｆ （２０１３）、Ｓｐｉｎｅｌｌｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１１）：４５５７－７３， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ２ｃｓ３５４０６ｃ（２０１３））。非常に限られた数の研究しか、より複雑なグリカンセット（商業的または天然に放出される）に対する方法論を開発しようと試みなかった（Ｓｍｉｒｎｏｖ，ｅｔ ａｌ，．Ｓｍａｌｌ．，１６（４６）：ｅ２００４８３１，ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｍｌｌ．２０２００４８３１（２０２０））。一部の実施形態において、開示される足場は、グリカン提示の単純な多量体化だけでなく、とりわけ天然に放出されるグリカンが挙げられる、より大きなグリカンセット（すなわち、異なるグリカン種が連結された同じ足場および／または複数の足場上の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれを超える異なるグリカン種）を提示することを特徴とする。
【0081】
他の実施形態において、アジド基またはヒドロキシ基は、例えば単独で、または糖アミノ酸もしくは糖ペプチド、例えば合成糖アミノ酸もしくは糖ペプチドの一部として、アミノ酸上に存在するか、またはアミノ酸上に組み込まれて、糖アミノ酸または糖ペプチドデンドリマー（すなわち、グリカン（のみの）デンドリマーではない）を生成する。糖ペプチドは、１つまたはそれを超える、同じまたは異なるグリカンを含み得る。単一アミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）およびペプチド（例えば、セリン残基およびトレオニン残基）に連結されたグリカンによって形成されるデンドリマーの例が、以下の実施例２の実験に記載されている。例えば、それぞれ図４Ａ～図４Ｂおよび図５Ａ～図５Ｃを参照。そのような場合、アミノ酸および／またはペプチドは、グリカンとデンドリマーのアームとの間のリンカーと見ることができる。
【0082】
そのような実施形態を用いて、糖ペプチド相互作用を調べることができる。例えば、相互作用に必要とされることが知られている糖ペプチド（グリカン部分およびペプチド部分の双方が必要とされることを意味する）を調べることができる。Ｏ－Ｆｕｃ、Ｏ－Ｍａｎ、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ（細胞外）等のより稀なグリコシル化タイプが、少数の定義されたペプチド配列上に特異的に見出され、通常は僅か数個の単糖長（これは、合成的により容易に生成され得る）である。これらは、糖ペプチドデンドリマーに用いられるのに理想的な糖ペプチドである。例えば、ＧｌｃＮＡｃによって修飾された核タンパク質は、相互作用タンパク質を引き出すのに有用であり得る。
【0083】
４．官能基
１本またはそれを超える足場のアームは、機能要素により機能化することができる。機能要素は、上記のようにリンカーを用いて足場に連結することができる。部分は、典型的には、足場の計画された使用に基づいて選択される。機能要素は、例えば、小分子、タンパク質もしくはポリペプチド、炭水化物、核酸、またはそれらの組合せであり得る。機能要素は、種々の異なる機能を果たすことができる。例えば、足場を追跡、または他の方法で監視もしくは特定すること、足場の結合活性を特徴付けること、および足場を単離することである。足場は、２つまたはそれを超える、同じまたは異なる種類の部分の組合せを含み得る。部分は、直列であっても並列であってもよい。言い換えれば、２つまたはそれを超える機能要素が、図１Ｂに示すように、基礎となる足場の同じアームに（すなわち、直列に）、または基礎となる足場の別々のアームに（すなわち、並列に）繋がれ得る。例示的な機能要素が、以下でより詳細に説明されており、オリゴマーバイオコンジュゲート（Ｍａｎｉｍａｌａ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．，１７（８）：１７Ｃ－２３Ｃ， ｄｏｉ： １０．１０９３／ｇｌｙｃｏｂ／ｃｗｍ０４７ （２００７））、ポリマー（Ｂｅｃｅｒ， Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．， ３３（９）：７４２－５２， ｄｏｉ： １０．１００２／ｍａｒｃ．２０１２０００５５ （２０１２））、量子ドット（）Ｈｉｌｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．， ２００８；６８（２）：１５３－６８， ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｅｊｐｂ．２００７．０６．００９ （２００８）、およびナノ粒子（Ｓｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．， １３２（３３）：１１４２８－３０， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｊａ１０３３５１ｍ （２０１０）、Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｓｃｉ （Ｗｅｉｎｈ）， ７（１６）：２００１２６４． Ｅｐｕｂ ２０２０／０８／２５． ｄｏｉ： １０．１００２／ａｄｖｓ．２０２００１２６４ （２０２０））が挙げられるが、これらに限定されない。
１本またはそれを超える足場のアームは、機能要素により機能化することができる。機能要素は、上記のようにリンカーを用いて足場に連結することができる。部分は、典型的には、足場の計画された使用に基づいて選択される。機能要素は、例えば、小分子、タンパク質もしくはポリペプチド、炭水化物、核酸、またはそれらの組合せであり得る。機能要素は、種々の異なる機能を果たすことができる。例えば、足場を追跡、または他の方法で監視もしくは特定すること、足場の結合活性を特徴付けること、および足場を単離することである。足場は、２つまたはそれを超える、同じまたは異なる種類の部分の組合せを含み得る。部分は、直列であっても並列であってもよい。言い換えれば、２つまたはそれを超える機能要素が、図１Ｂに示すように、基礎となる足場の同じアームに（すなわち、直列に）、または基礎となる足場の別々のアームに（すなわち、並列に）繋がれ得る。例示的な機能要素が、以下でより詳細に説明されており、オリゴマーバイオコンジュゲート（Ｍａｎｉｍａｌａ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．，１７（８）：１７Ｃ－２３Ｃ， ｄｏｉ： １０．１０９３／ｇｌｙｃｏｂ／ｃｗｍ０４７ （２００７））、ポリマー（Ｂｅｃｅｒ， Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．， ３３（９）：７４２－５２， ｄｏｉ： １０．１００２／ｍａｒｃ．２０１２０００５５ （２０１２））、量子ドット（）Ｈｉｌｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．， ２００８；６８（２）：１５３－６８， ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｅｊｐｂ．２００７．０６．００９ （２００８）、およびナノ粒子（Ｓｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．， １３２（３３）：１１４２８－３０， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｊａ１０３３５１ｍ （２０１０）、Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｓｃｉ （Ｗｅｉｎｈ）， ７（１６）：２００１２６４． Ｅｐｕｂ ２０２０／０８／２５． ｄｏｉ： １０．１００２／ａｄｖｓ．２０２００１２６４ （２０２０））が挙げられるが、これらに限定されない。
【0084】
ａ．イメージング剤および造影剤
一部の実施形態において、足場は、足場の存在を特定し、位置を決定し、かつ／または足場の量を定量するための作用物質により機能化される。この目的に有用な作用物質として、蛍光タグ、放射性核種、および造影剤が挙げられる。
一部の実施形態において、足場は、足場の存在を特定し、位置を決定し、かつ／または足場の量を定量するための作用物質により機能化される。この目的に有用な作用物質として、蛍光タグ、放射性核種、および造影剤が挙げられる。
【0085】
適切なイメージング剤として、蛍光分子、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）によって記載されるもの、例えば、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓレッド、Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（各種）、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、７－アミノアクチノマイシンＤ、ＢＯＢＯ－１、ＢＯＤＩＰＹ（各種）、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ、Ｃａｌｃｉｕｍグリーン、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ、６－カルボキシローダミン６Ｇ、Ｃａｓｃａｄｅブルー、Ｃａｓｃａｄｅイエロー、ＤＡＰＩ、ＤｉＡ、ＤｉＤ、Ｄｉｌ、ＤｉＯ、ＤｉＲ、ＥＬＦ ９７、エオシン、ＥＲ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ－Ｗｈｉｔｅ、ＥｔｈＤ－１、臭化インジウム、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ４、ＦＭ１－４３、ＦＭ４－６４、Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ Ｒｅｄ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、７－ヒドロキシ－４－メチルクマリン、Ｉｎｄｏ－１、ＪＣ－１、ＪＣ－９、ＪＯＥ色素、ＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢ、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＣＨ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ－１６７、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲｏｓ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒレッドＣＭＸＲｏｓ、Ｍｏｎｏｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ、ＮＢＤアミン、ＮｅｒｕｏＴｒａｃｅ ５００／５２５グリーン、Ｎｉｌｅレッド、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＰＯＰ－１、ヨウ化プロピジウム、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、Ｒｅｓｏｒｆｉｎ、ＲＨ ４１４、Ｒｈｏｄ－２、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３、ＲＯＸ色素、Ｓｏｄｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯブルー（各種）、ＳＹＴＯグリーン（各種）、ＳＹＴＯオレンジ（各種）、ＳＹＴＯＸブルー、ＳＹＴＯＸグリーン、ＳＹＴＯＸオレンジ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ、ＴＯＴ－１、ＴＯＴ－３、Ｘ－ｒｈｏｄ－１、ＹＯＹＯ－１、ＹＯＹＯ－３、および２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）ベンズアミド（ＡＥＡＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0086】
ＮａｎｏＬｕｃタグは、ペプチド配列に加えることができ、ルシフェラーゼイメージングのために、かつ／または例えばビオチンの代わりにデンドリマーを標識するのに用いることができる。
【0087】
加えて、放射性核種をイメージング剤として用いることができる。適切な放射性核種として、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃａ（ＩＩ）、およびＺｎ（Ｉ１）インジウム、ガリウム、およびテクネチウムの放射性種が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な造影剤として、常磁性Ｔ１型ＭＩＲ造影剤中のキレート化に一般的に用いられる金属イオンが挙げられ、銅、クロム、鉄、ガドリニウム、マンガン、エルビウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、およびホルミウム等の二価カチオンおよび三価カチオンが挙げられる。キレート化することができ、かつ放射性核種イメージングに用いることができる金属イオンとして、ガリウム、ゲルマニウム、コバルト、カルシウム、インジウム、イリジウム、ルビジウム、イットリウム、ルテニウム、イットリウム、テクネチウム、レニウム、白金、タリウム、およびサマリウム等の金属が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、中性子捕捉放射線治療に有用であることが知られている金属イオンとして、ホウ素、および核断面積が大きい他の金属が挙げられる。また、適切なのは、超音波コントラストおよびＸ線コントラスト組成物に有用な金属イオンである。
【0088】
ｂ．抗体およびリガンド
一部の実施形態において、足場は、核酸、または抗体もしくは受容体リガンド等のペプチドもしくはタンパク質により機能化されている。リガンドは、例えば、増殖因子、サイトカイン、およびケモカインであり得、ケモカインが挙げられる。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、フラグメント、組換え、または一本鎖であり得、その多くは市販されているか、または標準的な技術を用いて容易に得られる。抗体は、完全長抗体のフラグメント、または抗体のセグメント用に形成された融合タンパク質であり得る。例示的な抗体フラグメントおよび融合物として、単鎖抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ジｓｃＦｖ、トリｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ（ｔｅｒａｔｂｏｄｙ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、足場は、核酸、または抗体もしくは受容体リガンド等のペプチドもしくはタンパク質により機能化されている。リガンドは、例えば、増殖因子、サイトカイン、およびケモカインであり得、ケモカインが挙げられる。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、フラグメント、組換え、または一本鎖であり得、その多くは市販されているか、または標準的な技術を用いて容易に得られる。抗体は、完全長抗体のフラグメント、または抗体のセグメント用に形成された融合タンパク質であり得る。例示的な抗体フラグメントおよび融合物として、単鎖抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ジｓｃＦｖ、トリｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ（ｔｅｒａｔｂｏｄｙ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0089】
リガンドおよび抗体を用いて、足場の、表面または細胞への標的化または付着、足場の単離（すなわち、アフィニティクロマトグラフィ）等を増強することができる。
【0090】
ｃ．単離用タグ
一部の実施形態において、足場の単離または精製を増強するために、足場はタグにより機能化されている。先で導入したように、これは、抗体もしくはリガンド、またはポリペプチド精製タグであり得る。ポリペプチド精製タグは、当該技術において知られており、典型的には６つまたはそれを超える、典型的には連続するヒスチジン残基を含むＨｉｓタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニン、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、プロテインＡ、および低分子ユビキチン関連修飾因子（ＳＵＭＯ）が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的な例として、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１）を含むＦＬＡＧタグ；配列ＹＰＹＤＶＰ（配列番号２）を含む赤血球凝集素（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＨＡ）タグ；または配列ＩＬＫＫＴＡＹＩＬ（配列番号３）もしくはＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４）を含むＭＹＣタグが挙げられる。タンパク質精製を容易にするのに精製タグを用いる方法が、当該技術において知られており、例えば、タグがクロマトグラフィ樹脂に可逆的に結合するクロマトグラフィ工程を含む。同様の方法を用いて足場を単離することができる。
一部の実施形態において、足場の単離または精製を増強するために、足場はタグにより機能化されている。先で導入したように、これは、抗体もしくはリガンド、またはポリペプチド精製タグであり得る。ポリペプチド精製タグは、当該技術において知られており、典型的には６つまたはそれを超える、典型的には連続するヒスチジン残基を含むＨｉｓタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニン、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、プロテインＡ、および低分子ユビキチン関連修飾因子（ＳＵＭＯ）が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的な例として、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１）を含むＦＬＡＧタグ；配列ＹＰＹＤＶＰ（配列番号２）を含む赤血球凝集素（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＨＡ）タグ；または配列ＩＬＫＫＴＡＹＩＬ（配列番号３）もしくはＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４）を含むＭＹＣタグが挙げられる。タンパク質精製を容易にするのに精製タグを用いる方法が、当該技術において知られており、例えば、タグがクロマトグラフィ樹脂に可逆的に結合するクロマトグラフィ工程を含む。同様の方法を用いて足場を単離することができる。
【0091】
ｄ．バーコード
一部の実施形態において、基礎となる足場および／またはグリカンは、核酸バーコードにより、最終的にグリカン足場が１つまたはそれを超える核酸バーコードにより機能化されるように機能化される。例えば、一部の実施形態において、バーコードがグリカンリガンドに付着し、次いでグリカン－バーコード化合物が、基礎となる足場に付着して、多量体構造を形成する。他の実施形態において、バーコードおよびグリカンは各々、基礎となる足場に別々に付着する。バーコード、ユニーク分子識別子、またはＵＭＩとも称される核酸バーコードは、標的分子および／または標的核酸等の会合分子、例えば、細胞型もしくは表現型、特定のゲノム摂動因子（ｐｅｒｔｕｒｂａｇｅｎ）、または本明細書で用いられる場合には、より典型的には多価グリカン足場用の識別子として用いられる短い配列のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せ）である。
一部の実施形態において、基礎となる足場および／またはグリカンは、核酸バーコードにより、最終的にグリカン足場が１つまたはそれを超える核酸バーコードにより機能化されるように機能化される。例えば、一部の実施形態において、バーコードがグリカンリガンドに付着し、次いでグリカン－バーコード化合物が、基礎となる足場に付着して、多量体構造を形成する。他の実施形態において、バーコードおよびグリカンは各々、基礎となる足場に別々に付着する。バーコード、ユニーク分子識別子、またはＵＭＩとも称される核酸バーコードは、標的分子および／または標的核酸等の会合分子、例えば、細胞型もしくは表現型、特定のゲノム摂動因子（ｐｅｒｔｕｒｂａｇｅｎ）、または本明細書で用いられる場合には、より典型的には多価グリカン足場用の識別子として用いられる短い配列のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せ）である。
【0092】
核酸バーコードまたはＵＭＩは、少なくとも、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長を有し得、かつ一本鎖の形態であっても二本鎖の形態であってもよい。１つまたはそれを超える核酸バーコードおよび／またはＵＭＩが、グリカン足場の１本またはそれを超えるアーム上に付着または「タグ化」することができる。この付着は、直接的（例えば、標的分子へのバーコードの共有結合または非共有結合）または間接的（例えば、追加の分子、例えば、特異的結合剤、例えば、抗体（または他のタンパク質）またはバーコード受容アダプタ（または他の核酸分子）を介して）であり得る。一部の実施形態において、バーコードは、図１Ｂに示すように、蛍光タグ、精製タグ等の別の機能要素と直列である。ＵＭＩは、２つまたはそれを超える異なるＵＭＩ配列が、共通のプライマーを用いて増幅されることを可能にする共通の増幅配列の側面に位置することができる。ゆえに、バーコードは、ＵＭＩ配列、およびコモンプライマー結合配列等の１つまたはそれを超える追加の配列を含むように、ＵＭＩ配列からなることができる。
【0093】
グリカン足場は、核酸バーコードコンカテマ等の組合せ様式で複数の核酸バーコードにより標識することができる。典型的には、核酸バーコードは、特定の細胞型等と接触して、特定のコンパートメントもしくはライブラリーに由来するか、特定の物理的特性（例えば、グリカン、他の機能要素等）を有するか、または特定の処理条件に供されたとして、グリカン足場を特定するのに用いられる。グリカン足場は、これらの特徴（およびそれを超える）の全てに関する情報を提供するために、複数の核酸バーコードと関連付けることができる。一方、ＵＭＩの所与の集団の各メンバーは、典型的には、特定のセットの同一の特定の（例えば、グリカン、他の機能要素等）核酸バーコードの個々のメンバーと関連付けられる（例えば、同じ分子に共有結合するか、または同じ分子の成分である）。
【0094】
ＵＭＩを特定するために、核酸を、必要に応じて（例えば、ＰＣＲによって）増幅して、ＵＭＩを、例えば配列決定、既知の相補配列（例えば、マイクロアレイ、蛍光タグ化核酸等）へのハイブリダイゼーション、または他の適切なあらゆる手段によって「読む」。
【0095】
ｅ．活性薬剤
一部の実施形態において、多価グリカン足場は、開示される足場を用いて、例えば対象または細胞に送達することができる１つまたはそれを超える活性薬剤で機能化されている。
一部の実施形態において、多価グリカン足場は、開示される足場を用いて、例えば対象または細胞に送達することができる１つまたはそれを超える活性薬剤で機能化されている。
【0096】
送達されることとなる活性薬剤として、治療薬、栄養剤、診断薬、および予防薬が挙げられる。活性薬剤は、タンパク質、ポリペプチド、または核酸等の小分子の活性薬剤または生体高分子であり得る。適切な小分子活性薬剤として、有機化合物および有機金属化合物が挙げられる。小分子活性薬剤は、親水性、疎水性、または両親媒性の化合物であり得る。
【0097】
足場上に組み込むことができる例示的な治療剤として、抗原、例えば、腫瘍抗原、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、サイトカイン、化学療法剤、放射性核種、小分子シグナル伝達阻害剤、光熱アンテナ、モノクローナル抗体、免疫学的危険シグナル伝達分子、他の免疫療法剤、酵素、抗生物質、抗ウイルス薬（とりわけ、単独の、またはＨＩＶもしくはＢ型もしくはＣ型肝炎の処置用のヌクレオシドと組み合わせたプロテアーゼ阻害剤）、抗寄生生物薬（蠕虫、原生動物）、増殖因子、増殖阻害剤、ホルモン、ホルモン拮抗薬、抗体およびその生物活性フラグメント（ヒト化抗体、一本鎖抗体、およびキメラ抗体が挙げられる）、抗原およびワクチン製剤（アジュバントが挙げられる）、ペプチド薬物、抗炎症薬、免疫調節薬（Ｔｏｌｌ様受容体に結合して自然免疫系を活性化するリガンド（ＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない）、適応免疫系を動員かつ最適化する分子、細胞傷害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、およびヘルパーＴ細胞の作用を活性化またはアップレギュレートする分子、ならびにサプレッサまたは調節性Ｔ細胞を不活性化またはダウンレギュレートする分子が挙げられる）、細胞（樹状細胞および他の抗原提示細胞が挙げられる）中への多価グリカン足場の取込みを促進する薬剤、ビタミン等の栄養補助食品、ならびにオリゴヌクレオチド薬物（ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイム、リボヌクレアーゼＰ用の外部ガイド配列、三重鎖形成剤、ｃｒｉｓｐｒガイドＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）等が挙げられる）が挙げられる。
【0098】
特定の実施形態において、治療剤は、Ｅ３リガーゼリガンド、および破壊されることとなるタンパク質に対する結合剤またはリガンド（例えばＰＲＯＴＡＣＳ（登録商標））を含有する二価構造である。そのような作用物質は、従来の酵素阻害剤としての機能を果たすのではなく、選択的細胞内タンパク質分解（すなわち、標的のユビキチン化およびプロテオソームによる破壊（タンパク質分解））を誘導することによって作用する。ＰＲＯＴＡＣＳ（登録商標）は、多量体グリカンリガンドが細胞ＧＢＰを架橋するときに起こる可能性が高い細胞内取込み、およびグリカンリガンド：ＧＢＰ相互作用により達成することができる細胞型特異性を必要とする。レビューについて、Ｓｃｈｅｅｐｓｔｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ，１７：１６０－１７６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｓｂｊ．２０１９．０１．００６（２０１９）参照。
【0099】
例示的な診断剤が先で導入されており、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、および放射性核種、Ｘ線イメージング剤、および造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0100】
毒素および「致死剤」をグリカンデンドリマーに利用して、癌細胞／腫瘍を標的として死滅させることができる（Ｃｏｕｓｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．， １７（９）， ｄｏｉ： １０．３３９０／ｉｊｍｓ１７０９１５６６ （２０１６）、Ｔｏｒｒｅｓ－Ｐｅｒｅｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．， １０：６０５０３７， ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０２０．６０５０３７ （２０２０）、Ｖｅｐｒｅｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．， ４９（２１）：６４００－７， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｊｍ０５０７４１ｇ （２００６）、Ｓｍｉｒｎｏｖ， ｅｔ ａｌ，． Ｓｍａｌｌ．，１６（４６）：ｅ２００４８３１， ｄｏｉ： １０．１００２／ｓｍｌｌ．２０２００４８３１（２０２０））。ゆえに、一部の実施形態において、活性薬剤は抗癌剤である。ある特定の実施形態において、多価グリカン足場は、１つまたはそれを超える抗癌剤を含む。代表的な抗癌剤として、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ダカルバジン、ロムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、クロラムブシル、およびイホスファミド）、代謝拮抗剤（例えば、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、フルダラビン、およびフロクスウリジン）、抗有糸分裂剤（パクリタキセルおよびデセタキセル等のタキサン、ならびにビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシン等のビンカアルカロイドが挙げられる）、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、およびエピルビシン、ならびにアクチノマイシンＤ等のアクチノマイシンが挙げられる）、細胞傷害性抗生物質（マイトマイシン、プリカマイシン、およびブレオマイシンが挙げられる）、トポイソメラーゼ阻害剤（カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン等のカンプトテシン類、ならびにアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシド等のエピポドフィロトキシンの誘導体が挙げられる）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））等の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体、他の抗ＶＥＧＦ化合物；サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標））およびその誘導体、例えばレナリドマイド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））；エンドスタチン；アンジオスタチン；受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤、例えばスニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、パゾパニブ、アキシチニブ、およびラパチニブ；トランスフォーミング増殖因子－αまたはトランスフォーミング増殖因子－β阻害剤、ならびにパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））およびセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））等の上皮増殖因子受容体に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0101】
特定の実施形態において、多価グリカン足場は、１つまたはそれを超える免疫調節剤を含む。例示的な免疫調節剤として、サイトカイン、キサンチン、インターロイキン、インターフェロン、オリゴデオキシヌクレオチド、グルカン、増殖因子（例えば、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＧ－ＣＳＦ）、ホルモン、例えばエストロゲン（ジエチルスチルベストロール、エストラジオール）、アンドロゲン（テストステロン、ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮ（登録商標）（フルオキシメステロン））、プロゲスチン（ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＰＲＯＶＥＲＡ（登録商標）（酢酸メドロキシプロゲステロン））、およびコルチコステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン）が挙げられる。
【0102】
粒子と会合することができる免疫学的アジュバントの例として、ＴＬＲリガンド、Ｃ型レクチン受容体リガンド、ＮＯＤ様受容体リガンド、ＲＬＲリガンド、およびＲＡＧＥリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＬＲリガンドとして、リポ多糖（ＬＰＳ）およびその誘導体、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、グリコピラノシルリピドＡ、ＰＥＴ－リピドＡ、および３－Ｏ－デサシル－４’－モノホスホリルリピドＡが挙げられるがこれらに限定されないリピドＡおよびその誘導体が挙げられ得る。特定の実施形態において、免疫アジュバントはＭＰＬである。別の実施形態において、免疫アジュバントはＬＰＳである。また、ＴＬＲリガンドとして、ＴＬＲ３リガンド（例えば、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））、ＴＬＲ７リガンド（例えば、イミキモドおよびレシキモド）、およびＴＬＲ９リガンドが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0103】
また、多価グリカン足場は、抗原および／またはアジュバント（すなわち、免疫応答を増強する分子）を含み得る。抗原は、ペプチド、タンパク質、多糖、糖、脂質、糖脂質、核酸、またはそれらの組合せであり得る。抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、植物、原虫、真菌、組織、または形質転換細胞、例えば、癌または白血病細胞が挙げられるがこれらに限定されないあらゆる供給源に由来し得、全細胞またはその免疫原性成分、例えば、細胞壁成分またはその分子成分であり得る。
【0104】
適切な抗原が、当該技術において知られており、商業政府および科学供給源（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｓｏｕｒｃｅ）から入手可能である。抗原は、腫瘍、またはウイルスもしくは細菌源に由来する、精製または部分的に精製されたポリペプチドであり得る。有効な抗原性ペプチド（例えば、免疫応答を誘発することができる最小ペプチド配列）を特定かつ選択するための基準を、当該技術において見出すことができる。例えば、Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２：２９－３６（２０００））は、抗原提示分子の三次元構造、ならびにその、抗原性ペプチドおよびＴ細胞受容体の双方との相互作用の理解に基づいて、最小抗原性ペプチド配列を特定するための戦略を説明している。Ｓｈａｓｔｒｉ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：２７１－７（１９９６））は、Ｔ細胞を活性化するのに役立つ稀少ペプチドを、ＭＨＣ分子に通常結合する数千のペプチドから識別する方法を開示している。抗原は、ポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを異種発現系において発現させることによって生成される組換えポリペプチドであり得る。抗原は、抗原性タンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ等のベクターＤＮＡの形態であり得る。
【0105】
抗原は、単一の抗原として提供されてもよいし、組み合わせて提供されてもよい。また、抗原は、ポリペプチドまたは核酸の複雑な混合物として提供されてもよい。ペプチド、タンパク質、およびＤＮＡベースのワクチンを用いて、種々の疾患または症状に対する免疫を誘導することができる。細胞媒介性免疫は、ウイルス感染細胞を検出かつ破壊するのに必要である。ほとんどの伝統的なワクチン（例えば、タンパク質ベースのワクチン）は、体液性免疫を誘導するしかできない。ＲＮＡおよびＤＮＡベースのワクチン等の核酸ワクチンは、ウイルスまたは寄生生物に対してワクチン接種するための独特の手段を表す。なぜなら、核酸ベースのワクチンが体液性免疫および細胞媒介性免疫の双方を誘導することができるからである。加えて、核酸ベースのワクチンは、潜在的に、従来のワクチンよりも安全である。そして、製造および貯蔵についてより安定し得、かつより対費用効果が優れ得る。核酸ワクチンには、２つの主要成分、担体（または送達ビヒクル）、および抗原をコードする核酸が含まれる。担体は、核酸を分解から保護する。そしてその、特定の組織または細胞への侵入、および効率的なレベルでの発現を容易にし得る。
【0106】
一部の実施形態において、抗原は寛容原性抗原である。本明細書で用いられる「寛容原性」は、寛容性を刺激または増大させる状態または能力を意味する。適切な寛容原性抗原は、所望の治療結果、および処置されることとなる疾患、障害、または症状に基づいて選択される。例示的な抗原が、当該技術において知られている。例えば、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０３５６３８４号を参照。これは、寛容原性抗原が、タンパク質、治療抗体、および抗体様分子が欠損しているヒトに投与されるタンパク質、非ヒトであるタンパク質、ヒト同種移植抗原、患者が自己免疫応答を発揮したか、または自己免疫応答を発揮し得る自己抗原、患者が、望まれない免疫応答を発揮した外来抗原（例えば、食物抗原または薬物抗原）由来の、寛容が望まれる治療剤タンパク質に由来し得ることを説明している。寛容誘導シグナルに関連して抗原を投与することによって、寛容を誘導することも可能である。ＣＤ２２は、グリカンリガンド（例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα１－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＮｅｕ５Ａｃα２－６Ｇａｌβ１－４（６Ｓ）ＧｌｃＮＡｃ）を認識するＢリンパ球上の「阻害性」受容体である。抗原がＢ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）によって結合されて、ＣＤ２２もまたそのリガンドによって結合されると、Ｂ細胞は非応答性またはアネルギー性になる。Ｑａｄｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１７：２８８ｅ９５（２０１７）、Ｏｒｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７；１３９：３６６ｅ９．ｅ２、およびＢｅｄｎａｒ，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，１４：６４４ｅ５４（２０１９）。
【0107】
特定の実施形態において、多価グリカン足場コアは、２つまたはそれを超える活性薬剤を含有する。
【0108】
ｆ．粒子
一部の実施形態において、足場は、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、合成リポタンパク質粒子、またはカーボンナノチューブ等の送達ビヒクルを機能化する。そのような送達ビヒクルは、先で具体的に言及されたものが挙げられる活性薬剤等の他の材料をロードすることができ、そしてその送達を容易にするのに用いることができる。一部の実施形態において、送達ビヒクルは、化合物の制御放出を実現する。一部の実施形態において、活性薬剤の放出は、粒子からの化合物の拡散、ならびに／または加水分解および／もしくは酵素分解によるポリマー粒子の分解によって制御される。適切なポリマーとして、エチルセルロースおよび他の天然セルロース誘導体または合成セルロース誘導体が挙げられる。ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリエチレンオキシド等の、水性環境においてゆっくりと溶解してゲルを形成するポリマーもまた、薬物含有粒子用の材料として適し得る。他のポリマーとして、ポリ無水物、ポリ（エステル無水物）、ポリヒドロキシ酸、例えば、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ－３－ヒドロキシブチラート（ｐｏｌｙ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔ ｒａｔｅ）（ＰＨＢ）およびそのコポリマー、ポリ－４－ヒドロキシブチラート（Ｐ４ＨＢ）およびそのコポリマー、ポリカプロラクトンおよびそのコポリマー、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、足場は、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、合成リポタンパク質粒子、またはカーボンナノチューブ等の送達ビヒクルを機能化する。そのような送達ビヒクルは、先で具体的に言及されたものが挙げられる活性薬剤等の他の材料をロードすることができ、そしてその送達を容易にするのに用いることができる。一部の実施形態において、送達ビヒクルは、化合物の制御放出を実現する。一部の実施形態において、活性薬剤の放出は、粒子からの化合物の拡散、ならびに／または加水分解および／もしくは酵素分解によるポリマー粒子の分解によって制御される。適切なポリマーとして、エチルセルロースおよび他の天然セルロース誘導体または合成セルロース誘導体が挙げられる。ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリエチレンオキシド等の、水性環境においてゆっくりと溶解してゲルを形成するポリマーもまた、薬物含有粒子用の材料として適し得る。他のポリマーとして、ポリ無水物、ポリ（エステル無水物）、ポリヒドロキシ酸、例えば、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ－３－ヒドロキシブチラート（ｐｏｌｙ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔ ｒａｔｅ）（ＰＨＢ）およびそのコポリマー、ポリ－４－ヒドロキシブチラート（Ｐ４ＨＢ）およびそのコポリマー、ポリカプロラクトンおよびそのコポリマー、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【0109】
機能要素は、上記と同じまたは類似の手段（例えば、リンカーおよびグリカン）を用いて、または当該技術において知られている他の方法を用いて、足場に連結することができる。Ｓａｇｏ ｅｔ ａｌ．では、ＲＮＡを、特に化学作用なしで、相混合を介して脂質ナノ粒子中にカプセル化した（Ｓａｇｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，１１５（４２）：Ｅ９９４４－Ｅ５２，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１８１１２７６１１５（２０１８））。Ｓｏｊｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．は、各ファージが、異なるＤＮＡコード化バーコードを組み込むグリカン－ファージコンジュゲート戦略を用いた。所望のグリカンを、２，７００コピーの主コートタンパク質ｐＶＩＩＩのサブセットに（クリックケミストリを介して）化学的にコンジュゲートして、多価ディスプレイを生成する。ＩＤＴは、例えば、機能化されたＤＮＡ、修飾ジチオールを商品化する。これを、マレイミドチオール反応性基により、グリカン足場にカップリングさせることができる。ＩＤＴ由来のＤＢＣＯコンジュゲート化ＤＮＡもまた、アミン－ＰＥＧ－Ｎ３リンカーを介して、ＤＮＡをカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェアにカップリングさせるのに用いられている（Ｏｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ．，３６（１３）：３５８３－９，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｌａｎｇｍｕｉｒ．９ｂ０３３８６（２０２０））。
【0110】
Ｂ．多価グリカン足場を含む組成物
開示される多価グリカン足場を含む組成物が提供される。組成物は、例えば、足場が共有結合的もしくは非共有結合的に連結されている表面もしくは基材、または足場が分散されている溶液であり得る。一部の実施形態において、表面、基質、溶液等は、同じ種の足場（例えば、同じ基礎となる足場、グリカン、および必要に応じた機能要素を伴う）、異なる種の足場（例えば、異なる基礎となる足場、グリカン、および／または機能要素を伴う）、またはそれらの組合せであり得る２つまたはそれを超える足場を含む。
開示される多価グリカン足場を含む組成物が提供される。組成物は、例えば、足場が共有結合的もしくは非共有結合的に連結されている表面もしくは基材、または足場が分散されている溶液であり得る。一部の実施形態において、表面、基質、溶液等は、同じ種の足場（例えば、同じ基礎となる足場、グリカン、および必要に応じた機能要素を伴う）、異なる種の足場（例えば、異なる基礎となる足場、グリカン、および／または機能要素を伴う）、またはそれらの組合せであり得る２つまたはそれを超える足場を含む。
【0111】
例えば、一部の実施形態において、表面、基質、溶液等は、少なくとも１、５、１０、２５、５０、７５，１００，１５０，２５０，５００、１，０００、１，５００、２，５００、５，０００、１０，０００個の、１つまたはそれを超える同じ種または異なる種の多価グリカン足場を含む。
【0112】
２つまたはそれを超える種の足場の収集物は、ライブラリーと称され得る。一部の実施形態において、表面、基質、溶液等は、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２５０、５００、１，０００、１，５００、２，５００、５，０００、１０，０００、またはそれを超える種の異なる多価グリカン足場のライブラリーを含む。
【0113】
１．表面および基質
開示される多価グリカン足場は、種々の表面および基質に共有結合するか、または非共有結合することができる。基質として、ガラス（ケイ酸塩ガラス等）、セラミック、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、金属、プラスチックポリマー、およびシリカスライド等の透明で屈折性の固相材料が挙げられ得るが、これらに限定されない。プラスチックポリマーとして、例えば、ポリスチレン（実施例８）、ポリプロピレン、ポリカーボナート、ポリエチレン、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、およびポリウレタンが挙げられる。表面および基材として、ビーズ、組織培養皿が挙げられる皿、マイクロタイタープレートが挙げられるプレート、顕微鏡スライド、ポイントオブケア診断チップ、小型バイオセンサ、マイクロリアクタ、およびマイクロ電極が挙げられるが、これらに限定されない。その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許出願公開第２０１９／０１２８８８１号も参照。
開示される多価グリカン足場は、種々の表面および基質に共有結合するか、または非共有結合することができる。基質として、ガラス（ケイ酸塩ガラス等）、セラミック、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、金属、プラスチックポリマー、およびシリカスライド等の透明で屈折性の固相材料が挙げられ得るが、これらに限定されない。プラスチックポリマーとして、例えば、ポリスチレン（実施例８）、ポリプロピレン、ポリカーボナート、ポリエチレン、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、およびポリウレタンが挙げられる。表面および基材として、ビーズ、組織培養皿が挙げられる皿、マイクロタイタープレートが挙げられるプレート、顕微鏡スライド、ポイントオブケア診断チップ、小型バイオセンサ、マイクロリアクタ、およびマイクロ電極が挙げられるが、これらに限定されない。その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許出願公開第２０１９／０１２８８８１号も参照。
【0114】
一部の実施形態において、多価グリカン足場は、１本またはそれを超えるアームを介して、表面または基質に付着される。より詳細には、一部の実施形態において、リンカーまたは二官能性リンカーは、足場を表面または基質に連結する。本明細書中または他の箇所で説明されるリンカーまたは二官能性リンカーのいずれも用いることができる。
【0115】
一部の態様において、表面は、クロマトグラフィカラムである。そのような実施形態において、一対のアフィニティタグ（例えばＨｉｓタグ）のうちの一方を有する多価グリカン足場が、対応する／第２の一対のアフィニティタグ（例えば、カラム内／カラム上のニッケル、コバルト、または銅イオン）を有するカラム表面に結合される。
【0116】
２．細胞およびタンパク質
以下でより詳細に説明されるように、開示される多価グリカン足場は、種々の細胞およびタンパク質結合アッセイに用いることができる。そのようなアッセイを用いて、グリカン－細胞および／またはグリカン－タンパク質／受容体結合事象および活性を特定し、これに基づいて細胞またはタンパク質を単離することができる。ゆえに、一部の実施形態において、多価グリカン足場は、細胞または組織または器官および／またはタンパク質に結合して、多価グリカン足場－細胞および／または多価グリカン足場－タンパク質複合体を形成する。
以下でより詳細に説明されるように、開示される多価グリカン足場は、種々の細胞およびタンパク質結合アッセイに用いることができる。そのようなアッセイを用いて、グリカン－細胞および／またはグリカン－タンパク質／受容体結合事象および活性を特定し、これに基づいて細胞またはタンパク質を単離することができる。ゆえに、一部の実施形態において、多価グリカン足場は、細胞または組織または器官および／またはタンパク質に結合して、多価グリカン足場－細胞および／または多価グリカン足場－タンパク質複合体を形成する。
【0117】
好ましい実施形態において、グリカンを介して、必要に応じてであるが好ましくはグリカン結合タンパク質等のグリカン結合分子に結合することによって、結合は調節される。結合は、典型的には非共有結合性であり、細胞表面の状況で、または遊離タンパク質もしくは固定化タンパク質等の別の状況で起こり得る。
【0118】
タンパク質は、組換え体であっても天然に存在していてもよく、そして精製されていても精製されていなくてもよい（例えば溶解液中）。タンパク質は、例えば細胞の表面上の細胞表面タンパク質、または可溶性タンパク質であり得る。
【0119】
結合は、一過性であっても安定していてもよい。
【0120】
細胞は、例えば、初代細胞であっても確立された細胞株であってもよい。例示的な細胞、組織、および器官として、胚性細胞、免疫細胞、単能性細胞、多能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ，）、および万能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）；胚性幹細胞が挙げられる幹細胞、ならびに造血幹細胞、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、および筋衛星細胞等の成体幹細胞、ならびに、以下に限定されないが、線維芽細胞、実質細胞、造血細胞、リンパ球を含む白血球、血小板、間質細胞、脂肪細胞、肺細胞、管細胞、破骨細胞を含む骨細胞、上皮細胞、およびケラチノサイト等の皮膚細胞を含む組織、平滑筋、骨格筋、および心筋を含む筋組織、内皮細胞を含む血管組織、肝細胞を含む肝組織、ならびにニューロンを含む神経組織、神経膠、例えばアストログリアもしくは星状膠細胞、オリゴグリアもしくは乏突起膠細胞、小膠細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、腫瘍細胞、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられるが、これらに限定されない外胚葉、内胚葉、および中胚葉に由来する細胞が挙げられる分化細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で用いられる腫瘍細胞として、原発性癌細胞および転移性細胞が挙げられる。腫瘍細胞は、本明細書中で癌細胞と交換可能に用いられることがあるが、正常細胞と比較して、増殖の増大を示す非悪性（非癌性）細胞も包含する。
【0121】
細胞は、対象から単離され得る。対象は、哺乳動物対象であり得る。例示的な対象として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギ、およびヒツジが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、対象は、腫瘍、例えば悪性腫瘍を有するか、または有することが疑われる。
【0122】
細胞は、対象のあらゆる部分から、例えば対象の１つまたはそれを超える器官または組織から得ることができる。例えば、以下に限定されないが、１つまたはそれを超える細胞は、対象の心臓、肝臓、肺、筋肉、精巣、血液、脳、脾臓、乳房、皮膚、膵臓、口、食道、胃、小腸、大腸、胆嚢、および腎臓からなる群から選択される１つまたはそれを超える組織または器官に由来し得る。１つまたはそれを超える細胞は、癌組織、例えば腫瘍から、または非癌組織から得ることができる。１つまたはそれを超える細胞は、健康な対象または特定の疾患もしくは障害を有する対象の１つまたはそれを超える器官または組織由来の１つまたはそれを超える細胞から得ることができる。一部の実施形態において、１つまたはそれを超える細胞は、癌を有する対象の１つまたはそれを超える器官または組織から得ることができる。必要に応じて、１つまたはそれを超える細胞は、対象の組織または器官の生検から得ることができる。
【0123】
一部の実施形態において、細胞の集団、すなわち、２つまたはそれを超える細胞が、対象の組織または器官から得られる。必要に応じて、１つまたはそれを超える細胞集団は、対象の１つまたはそれを超える組織または器官から得ることができる。必要に応じて、１つまたはそれを超える細胞の亜集団を、例えば、細胞の集団から１つまたはそれを超える特定の細胞型を単離するための蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、またはマイクロ流体ベースの選別によって、対象の組織または器官から得られた細胞の集団から単離することができる。細胞の集団から特定の細胞型を単離することによって、本明細書中で提供される方法を用いて、対象の組織または器官における１つまたはそれを超える特定の細胞型または細胞の亜集団への送達に適したナノ粒子を特定することができる。例えば、癌細胞および非癌細胞を含む肝臓細胞の集団を含有する試料から、１つまたはそれを超える癌マーカーを用いて、腫瘍細胞を単離することができる。
【0124】
また、細胞組成物が提供され、これは、少なくとも１つの細胞を有する組成物を指す。一部の実施形態において、細胞組成物は、単一の細胞を含む。一部の実施形態において、細胞組成物は、少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１，０００個、またはそれを超える細胞を含む。細胞組成物は、種々の異なる供給源、例えばインビボ供給源、例えば動物由来の体液もしくは組織試料、またはインビトロ供給源、例えば培養細胞もしくは培養組織から得ることができる。体液および組織試料は、多くの場合、複数の細胞型を含有し、例えば脳組織は、ニューロン、グリア細胞、および多くの他の型の細胞を含み得る。特定の実施形態において、細胞は、動物の血液由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。したがって、一部の実施形態において、細胞組成物は、少なくとも２、３、４、または５つの細胞型を含む。また、細胞組成物として、細胞培養培地等の培地が挙げられ得る。
【0125】
本明細書で言及されるいずれか１つまたはそれを超える細胞または細胞組成物は、以下で説明されるあらゆる方法に用いることができる。
【0126】
３．培地および医薬組成物
一部の実施形態において、多価グリカン足場は、単独で、または表面、基質、細胞、タンパク質等に共有結合もしくは非共有結合して、溶液、好ましくは培地または薬学的に許容され得る担体中に浸される。
一部の実施形態において、多価グリカン足場は、単独で、または表面、基質、細胞、タンパク質等に共有結合もしくは非共有結合して、溶液、好ましくは培地または薬学的に許容され得る担体中に浸される。
【0127】
溶液は、種々の異なる供給源、例えばインビボ供給源、例えば体液または合成供給源、例えば医薬組成物または培地、例えば細胞培養培地から得ることができる。培地は、用いられる試料および細胞型に応じて変動し得る。一部の実施形態において、細胞組成物は、１つまたはそれを超えるアミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコース、血清、増殖因子、ホルモン、および付着因子を含む。例示的な培地として、エイムス培地、Ｆｉｔｔｏｎ－Ｊａｃｋｓｏｎ改変を伴う、または伴わないＢＧＪｂ培地、クリック培地、ＣＭＲＬ－１０６６培地、フィッシャー培地、Ｇｌａｓｃｏｗ最小必須培地（ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ－１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、ＭｃＣｏｙ ５Ａ改変培地、ＮＣＴＣ培地、Ｓｗｉｍ Ｓ－７７培地、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ培地Ｅ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、およびイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）が挙げられる。
【0128】
医薬組成物は、例えば、非経口（筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、または皮下注射（ＳｕｂＱ））、経皮（受動的に、またはイオン導入もしくは電気穿孔を用いる）、または経粘膜（鼻、膣、直腸、または舌下）投与経路によって、対象に投与するのに適し得るが、実際に投与される必要はない。製剤は、懸濁液またはエマルジョンの形態であり得る。一般に、医薬組成物は、薬学的に許容され得る希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または担体を含むことができる。そのような組成物として、希釈剤、滅菌水、種々のｐＨおよびイオン強度の種々のバッファ含有量の緩衝生理食塩水（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）；ならびに必要に応じて、添加剤、例えば、洗剤および可溶化剤（例えば、ポリソルベート２０または８０とも称されるＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに防腐剤（例えば、チメルソール、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）が挙げられ得る。非水性溶媒またはビヒクルの例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびコーン油等の植物油、ゼラチン、ならびにオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルがある。
【0129】
製剤を凍結乾燥させて、使用直前に再溶解／再懸濁させることができる。製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、組成物中に滅菌剤を組み込むことによって、組成物を照射することによって、または組成物を加熱することによって、滅菌され得る。
【0130】
一部の実施形態において、特に活性薬剤が繋がれている実施形態において、疾患または障害を処置するために、疾患または障害の処置を必要とする対象に足場が投与され得る。一部の実施形態において、組成物は、例えば静脈内投与または腹腔内投与によって、標的細胞への組成物の送達に有効な量で全身投与される。他の可能な経路として、経皮および経口が挙げられるが、これらに限定されない。
【0131】
特定の実施形態において、組成物は、例えば処置されることとなる部位への直接注射によって、局所的に投与される。例えば、癌の処置等のための一部の実施形態において、組成物は、１つまたはそれを超える腫瘍に注射されるか、または他の方法で直接投与される。典型的には、局所注射は、全身投与によって達成され得るよりも高い組成物の局所濃度の増大を引き起こす。一部の実施形態において、組成物は、カテーテルまたはシリンジを用いることによって、適切な細胞に局所的に送達される。そのような組成物を細胞に局所的に送達する他の手段として、輸液ポンプ（例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．由来）を用いること、または組成物をポリマーインプラント（例えば、Ｐ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ｇ．Ｌｌｏｙｄ－Ｊｏｎｅｓ，ｅｄｓ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｔｄ．，１９８８ ＩＳＢＮ－１０：０８９５７３５８０６）中に組み込むことが挙げられ、これは、インプラントの即時領域への薬物の持続放出に影響を及ぼし得る。
【0132】
組成物は、対象または細胞に、対象もしくは細胞と接触させること等によって直接的に、またはあらゆる生物学的プロセスの作用等によって間接的に提供することができる。例えば、足場は、生理学的に許容され得る担体中に製剤化されて、細胞を取り囲む組織または流体中に注射され得る。
【0133】
更なる研究が実行されるにつれて、種々の患者における種々の症状の処置に適切な投薬量レベルに関する情報が明らかになり、当業者であれば、レシピエントの治療状況、年齢、および健康状態を考慮して、適切な投薬を確認することができるであろう。選択される投薬量は、所望の治療効果、投与経路、および所望の処置期間によって決まる。一般に、０．００１～１０ｍｇ／体重ｋｇ／日の投薬量レベルが哺乳動物に投与される。一般に、静脈内注射または注入の場合、投薬量はより低くてもよい。一般に、開示されるベシクルを用いて個体に投与される活性薬剤の総量は、同じ所望の、もしくは意図される効果のために投与されなければならない、かつ／または毒性の引下げを示し得る非会合活性薬剤の量よりも少なくなり得る。
【0134】
ＩＩＩ．使用方法
グリカンは、全ての細胞の表面上で豊富に発現される。細胞表面グリカンに結合するタンパク質、グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）もまた、典型的には細胞の表面上で発現される。したがって、細胞表面グリカンリガンドの、その対応する細胞表面ＧＢＰとの結合相互作用は、多価相互作用である。なぜなら、別個の各グリカン構造および別個の各ＧＢＰの多くのコピー、すなわち数百から数万の同一のコピーが細胞表面上に存在するからである。そのような多価相互作用は、「強制近接」（Ｖａｕｑｕｅｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１６８（８）：１７７１－８５（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｐｈ．１２１０６）（１つ（またはそれを超える）のグリカンリガンドが相補的ＧＢＰに結合したときの、非結合グリカンリガンドまたはＧＢＰによって経験される高い局所的「標的」濃度）に起因する見かけの結合親和性（アビディティ）の実質的な増大をもたらす。強制近接は、グリカン：ＧＢＰ複合体の結合／再結合をかなり増大させて、相互作用の解離を実質的に遅らせる。なぜなら、全てのグリカン：ＧＢＰ複合体が同時に解離しなければならないからである。この多価アビディティ増強は、一価結合と比較して、見かけの親和性を数千倍も増大させる。このことは、グリカン：ＧＢＰ結合の典型である不十分な一価親和性にも拘わらず、グリカン：ＧＢＰ媒介性細胞間相互作用を阻害することの困難さを説明している。
グリカンは、全ての細胞の表面上で豊富に発現される。細胞表面グリカンに結合するタンパク質、グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）もまた、典型的には細胞の表面上で発現される。したがって、細胞表面グリカンリガンドの、その対応する細胞表面ＧＢＰとの結合相互作用は、多価相互作用である。なぜなら、別個の各グリカン構造および別個の各ＧＢＰの多くのコピー、すなわち数百から数万の同一のコピーが細胞表面上に存在するからである。そのような多価相互作用は、「強制近接」（Ｖａｕｑｕｅｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１６８（８）：１７７１－８５（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｐｈ．１２１０６）（１つ（またはそれを超える）のグリカンリガンドが相補的ＧＢＰに結合したときの、非結合グリカンリガンドまたはＧＢＰによって経験される高い局所的「標的」濃度）に起因する見かけの結合親和性（アビディティ）の実質的な増大をもたらす。強制近接は、グリカン：ＧＢＰ複合体の結合／再結合をかなり増大させて、相互作用の解離を実質的に遅らせる。なぜなら、全てのグリカン：ＧＢＰ複合体が同時に解離しなければならないからである。この多価アビディティ増強は、一価結合と比較して、見かけの親和性を数千倍も増大させる。このことは、グリカン：ＧＢＰ結合の典型である不十分な一価親和性にも拘わらず、グリカン：ＧＢＰ媒介性細胞間相互作用を阻害することの困難さを説明している。
【0135】
開示される多価グリカン足場は、この課題を解決する。これは、以下の実験データで示す通りである。すなわち、抗Ｈ３抗体に結合するモノマーＨ３は、フローサイトメトリーによって検出されず、さらに、開示される足場によるＨ３グリカンの多量体化は、フローサイトメトリーによって容易に検出される多量体Ｈ３：抗Ｈ３抗体複合体をもたらす。
【0136】
ゆえに、特定のグリカン：ＧＢＰの結合相互作用を特定するのに、例えば、グリカン：ＧＢＰ結合パートナーを特定するのに、結合特異性／識別の構造／化学決定基を理解するのに、特定のグリカン構造に結合するＧＢＰおよび特定のＧＢＰに結合するグリカンの双方を単離するのに、かつ／または特定のグリカン構造に対して特異性を有するＧＢＰを発現する、診断検出および／もしくは治療的排除／阻害もしくは活性化用の細胞を標的とするのに、足場を用いる方法が提供される。
【0137】
例えば、検出タグ、例えばフルオロフォア、および／または識別子タグ、例えば別個の各グリカンと会合する固有のＤＮＡ配列を含む足場構造を用いて、別個の各グリカンがインビボでの構造の局在化を指示する細胞および組織を特定することができる。これにより、細胞／組織特異的標的化の設計および送達を容易にすることができる。
【0138】
したがって、これらの構造は、（ａ）目的のリガンドに対する受容体を特定かつ単離するのに、（ｂ）当該受容体を発現する細胞および組織を特定するのに、（ｃ）シグナル伝達事象を誘導するために、または遺伝子もしくは遺伝子を修飾する材料が挙げられる治療実体を送達するために、リガンドに対する受容体を発現する細胞および組織を標的とするのに、かつ（ｄ）最適な免疫を誘導するために、または抗原特異的寛容を誘導するために、抗原をプロセシングすることができる特定の細胞型、例えば樹状細胞に抗原、例えばＢリンパ球上のＣＤ２２を標的とするグリカンリガンドを送達するのに、有用である。
【0139】
グリカン結合事象の特定および分析ならびにその後の応用または使用に用いられる方法および工程を、以下でより詳細に記載する。
【0140】
Ａ．グリカン足場の、標的物質との接触
典型的な方法は、多価グリカン足場の１またはそれを超える種（例えばライブラリー）を、集団細胞またはタンパク質等の標的物質、例えば上記で導入した溶解液と接触させることを含み得る。一部の実施形態において、足場または標的物質のいずれかが、接触時に固定化される。他の実施形態において、足場および標的物質は双方とも、例えば溶液中で、遊離するか、または流動的である。
典型的な方法は、多価グリカン足場の１またはそれを超える種（例えばライブラリー）を、集団細胞またはタンパク質等の標的物質、例えば上記で導入した溶解液と接触させることを含み得る。一部の実施形態において、足場または標的物質のいずれかが、接触時に固定化される。他の実施形態において、足場および標的物質は双方とも、例えば溶液中で、遊離するか、または流動的である。
【0141】
足場グリカンまたは標的物質のいずれか、または双方を、ベイトとして用いることができる。ゆえに、一部の実施形態において、既知または未知の細胞型またはＧＢＰが、グリカン足場のライブラリーから既知または未知のグリカン結合パートナーを捕捉するためのベイトとして用いられる。他の実施形態において、既知または未知のグリカンを有するグリカン足場が、細胞またはタンパク質の異種集団（例えば溶解液）から既知または未知の細胞またはＧＢＰを捕捉するのに用いられる。図１Ｃは、特定の細胞および／または組織を標的とするグリカンを特定する別個のグリカンおよびＤＮＡまたはＲＮＡ配列識別子（バーコード）を各々提示する多量体リガンド粒子（ＭＬＰ）のライブラリーのフロー図である。
【0142】
ゆえに、ベイトまたは標的の一方が未知であり、他方が未知であり、ベイトおよび標的の双方が既知であり、ベイトおよび標的の双方が未知である実施形態が提供される。
【0143】
一実施形態において、多量体グリカン足場のライブラリーは、各足場が別個の多量体グリカンおよび当該グリカンを一意的に特定する別個のバーコードをディスプレイするようにバーコード化される。このライブラリーは、個々の血液細胞型がＦＡＣＳによって分離かつ収集され得るように、別個のフルオロフォアにより標識された各細胞型特異的抗体との混合細胞型特異的抗体と共に、細胞（例えばヒト血液細胞）（例えば混合物）に曝露される。収集された各細胞型「プール」中のバーコードのＰＣＲ増幅および配列は、どの細胞型が、特定されたグリカンについてＧＢＰを発現するかを特定することとなる。また、この戦略は、試薬、例えば抗ＧＢＰ抗体、またはＧＢＰ毎の別個の化学的タグもしくは組換えタグと対になった場合に提供されるＧＢＰの混合物にも用いることができる。インビボでの細胞／組織の解剖学的位置は、多量体グリカン足場の局在化を担う当該細胞／組織と関連するＧＢＰの存在を特定するであろう。加えて、本方法は、多量体グリカン足場の細胞内取込みをもたらすグリカン構造の特定を支援することができ、そのような特定されたグリカンは、標的化および細胞内送達に利用することができる。
【0144】
ベイトおよび標的の双方が未知である一部の実施形態において、当該方法は、ショットガングリカンマイクロアレイアプローチ（例えば、特にヒト乳オリゴ糖による、Ｒｉｃｋ Ｃｕｍｍｉｎｇｓによって記載されたもの、例えば、Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１３（１１）：２９４４－６０（２０１４）．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１４．０３９８７５を参照）に似ている。オリゴ糖が何であるかを知らずに、これをＨＬＰＣによって分画して、マイクロアレイスライド上に印刷してから、新生児ロタウイルスによって調べた。リガンドを固相材料上に印刷／固定化するプロセスは、当該リガンドの多価提示をもたらす。陽性スポット（シグナル伝達相互作用）を、目的の画分に戻って、標準的なグリカン分析法を使用して結合画分中のグリカンを特定することによって、さらに調査することができた。これにより、ここで適切なグリカンリガンドを知って、ウイルスレクチンをさらに調査することもできる。同様のアプローチを、開示されたグリカン足場を用いて利用することができる。グリカンの混合物、（例えばＮ３）タグを分画して、固有の識別子（例えば核酸バーコード）を有するグリカン足場（例えばデンドリマー）を生成して、細胞／タンパク質のサンプルを選別してＰＣＲにかけて、グリカンデンドリマーバインダを見出してから、対応する画分に戻ってその内容物を分析する。
【0145】
接触を、インビトロまたはインビボで実行することができる。インビトロ用途のために、本方法は、典型的に、グリカン足場および細胞もしくはタンパク質、または他の標的物質を接触させることと、複数の足場が標的物質の１つまたはそれを超える要素に結合するのに十分な時間を許容することとを含む。インビボ用途のために、本方法は、典型的に、グリカン足場を対象に投与することと、複数の足場が対象における１つまたはそれを超える細胞上の１つまたはそれを超える標的ＧＢＰに結合するのに十分な時間を許容することと、必要に応じて対象から１つまたはそれを超える細胞を得ることとを含む。イメージング、診断、および治療用途が挙げられる例示的なインビボ実施形態を、以下で説明する。
【0146】
Ｂ．結合事象の特定および分析
足場グリカンと標的物質の１つまたはそれを超える要素との間の結合を可能にするのに適した期間、および１つまたはそれを超える必要に応じた洗浄工程の後に、結合事象を分析することができる。例えば、分離タグを用いて足場を単離することができ、標識タグを用いて、例えば染色、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学等によって足場を検出または単離することができ、必要に応じてであるが好ましくは、捕捉された標的要素を単離または分析によって持って来る。
足場グリカンと標的物質の１つまたはそれを超える要素との間の結合を可能にするのに適した期間、および１つまたはそれを超える必要に応じた洗浄工程の後に、結合事象を分析することができる。例えば、分離タグを用いて足場を単離することができ、標識タグを用いて、例えば染色、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学等によって足場を検出または単離することができ、必要に応じてであるが好ましくは、捕捉された標的要素を単離または分析によって持って来る。
【0147】
１．グリカン足場の特定および分析
いずれの方法も、足場バーコードを配列決定して、基礎となる足場、グリカン、および機能要素の性質等の（例えば、単離または収集された）足場に関する特定の情報を決定することを含み得る。これは、例えば、既知の細胞またはタンパク質に結合する未知のグリカンの特定を容易にすることができる。必要に応じて、バーコード配列は増幅される。当業者であれば、バーコード識別子配列および／または固有の分子識別子配列を特異的に増幅する増幅プライマーを設計する方法を知っている。必要に応じて、増幅プライマーは、増幅されたバーコード識別子配列の検出が、バーコード識別子配列を特定するのに十分であることによって、足場を特定するように設計される。特定の実施形態において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば定量的ＰＣＲを用いて実行される。
いずれの方法も、足場バーコードを配列決定して、基礎となる足場、グリカン、および機能要素の性質等の（例えば、単離または収集された）足場に関する特定の情報を決定することを含み得る。これは、例えば、既知の細胞またはタンパク質に結合する未知のグリカンの特定を容易にすることができる。必要に応じて、バーコード配列は増幅される。当業者であれば、バーコード識別子配列および／または固有の分子識別子配列を特異的に増幅する増幅プライマーを設計する方法を知っている。必要に応じて、増幅プライマーは、増幅されたバーコード識別子配列の検出が、バーコード識別子配列を特定するのに十分であることによって、足場を特定するように設計される。特定の実施形態において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば定量的ＰＣＲを用いて実行される。
【0148】
必要に応じて、１つまたはそれを超える増幅バーコード配列および／または固有の分子識別子配列が定量される。１つまたはそれを超えるバーコード識別子配列の数を決定することによって、足場が特定の組織もしくは器官に結合することができるかどうかを判定し、かつ／または１つもしくはそれを超える細胞型、組織、もしくは器官への結合の有効性もしくは特異性もしくは頻度を評価することができる。
【0149】
バーコード配列および／または固有の分子識別子配列は、必要に応じて配列決定される。配列決定方法として、ショットガンシーケンシング、ブリッジＰＣＲ、サンガーシーケンシング（マイクロ流体サンガーシーケンシングを含む）、パイロシーケンシング、大規模並列シグネチャシーケンシング、ナノポアＤＮＡシーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング（ＳＭＲＴ）（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．）、イオン半導体シーケンシング、ライゲーションシーケンシング、合成によるシーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ）、ポロニーシーケンシング、４５４シーケンシング、固相シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、ヘリスコープ一分子シーケンシング、質量分析シーケンシング、パイロシーケンシング、Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｏｌｉｇｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）シーケンシング、ＤＮＡマイクロアレイシーケンシング、ＲＮＡＰシーケンシング、トンネリング電流ＤＮＡシーケンシング、および将来特定される他のあらゆるＤＮＡ配列決定方法が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載される１つまたはそれを超える配列決定方法を、ハイスループットシーケンシング法に用いることができる。本明細書中で用いられる用語ハイスループットシーケンシングは、所与の時点にて複数の核酸配列が配列決定される核酸のシーケンシングに関連する全ての方法を指す。増幅産物は、配列決定の前にプールすることができる。
【0150】
好ましい実施形態において、バーコードは、会合するグリカン足場の特定組成をコードするか、または当該組成を決定するのに用いることができる。 （Ｓａｇｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，１１５（４２）：Ｅ９９４４－Ｅ５２． Ｅｐｕｂ ２０１８／１０／０３． ｄｏｉ： １０．１０７３／ｐｎａｓ．１８１１２７６１１５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３０２７５３３６； ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ６１９６５４３ （２０１８））および米国公開出願第２０２０／０１１００８３号も参照のこと。
【0151】
２．標的物質の特定および分析
細胞および／またはＧＢＰ等の結合した標的物質を特定かつ／または分析することができる。例えば、標的タンパク質を、ウエスタンブロッティング（例えば、イムノブロッティング）、エドマン分解、質量分析、例えばペプチド質量フィンガープリンティングまたはデノボペプチドシーケンシング、光散乱、例えばバッチ動的光散乱（ＤＬＳ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、電荷およびゼータ電位、マルチ検出ＧＰＣ／ＳＥＣ、円偏光二色性（ＣＤ）、または等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）等のタンパク質分析および／または特定に供することができる。標的細胞を、例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、および／または電子顕微鏡が挙げられる顕微鏡による、１つまたはそれを超えるタンパク質または遺伝子発現分析、表現型および／または組織学的分析によって特定または特徴付けすることができる。一部の実施形態において、標的物質は、特定および／または分析の前または間に、足場から放出される。他の実施形態において、標的物質は、足場から放出されない。そのような実施形態において、足場および／またはベイト等は、必要に応じて分析から差し引くことができる。例えば、質量分析の場合、足場および／またはベイトによって生成されたシグナルを、スペクトログラフから差し引くことができる。
細胞および／またはＧＢＰ等の結合した標的物質を特定かつ／または分析することができる。例えば、標的タンパク質を、ウエスタンブロッティング（例えば、イムノブロッティング）、エドマン分解、質量分析、例えばペプチド質量フィンガープリンティングまたはデノボペプチドシーケンシング、光散乱、例えばバッチ動的光散乱（ＤＬＳ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、電荷およびゼータ電位、マルチ検出ＧＰＣ／ＳＥＣ、円偏光二色性（ＣＤ）、または等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）等のタンパク質分析および／または特定に供することができる。標的細胞を、例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、および／または電子顕微鏡が挙げられる顕微鏡による、１つまたはそれを超えるタンパク質または遺伝子発現分析、表現型および／または組織学的分析によって特定または特徴付けすることができる。一部の実施形態において、標的物質は、特定および／または分析の前または間に、足場から放出される。他の実施形態において、標的物質は、足場から放出されない。そのような実施形態において、足場および／またはベイト等は、必要に応じて分析から差し引くことができる。例えば、質量分析の場合、足場および／またはベイトによって生成されたシグナルを、スペクトログラフから差し引くことができる。
【0152】
また、標的物質の分析は、結合する足場のグリカンによって調節される細胞経路（例えば、シグナル伝達経路）の誘導および／または阻害についてアッセイすることを含み得る。
【0153】
Ｃ．応用および治療方法
グリカンと、細胞またはタンパク質等の標的物質との間の結合関係が確立されると、関連するグリカンを特徴とする足場を、細胞、組織、器官、および／またはタンパク質への１つまたはそれを超える活性薬剤の標的送達用に合理的に設計することができる。
グリカンと、細胞またはタンパク質等の標的物質との間の結合関係が確立されると、関連するグリカンを特徴とする足場を、細胞、組織、器官、および／またはタンパク質への１つまたはそれを超える活性薬剤の標的送達用に合理的に設計することができる。
【0154】
１．グリカン足場を用いた活性薬剤の標的送達
好ましい実施形態において、分析は、１つまたはそれを超えるグリカン足場が特定の標的タンパク質または細胞に優先的に結合することを明らかにする。優先的に結合するとは、他のタンパク質または細胞型と比較して、より多くの特定のグリカン足場種が、１つのタンパク質または細胞型に結合することを意味する。例えば、そのような優先的結合は、器官もしくは組織を越えるもの（例えば、膵臓の代わりに肝臓）、病的細胞／正常細胞を越えるもの（例えば、癌対非癌性）、または同じ組織もしくは器官内の細胞を越えるもの（例えば、単球とは対照的にリンパ球）であり得る。優先的に結合する足場を特定することによって、当業者であれば、対象に投与された場合、その機能要素、例えば、タグ、標識、または活性薬剤を、対象の特定の細胞型または特定の組織もしくは器官に優先的に送達する標的足場を特定することができる。組織または器官に応じて、足場結合事象が、所望の細胞型に対して特定されると、当業者であれば、対象における細胞、組織、または器官への送達用に、１つまたはそれを超える活性薬剤により機能化されている標的グリカン足場を選択または調製することができる。活性薬剤は、上記で導入したように、小分子、タンパク質、核酸治療薬、ならびに抗原および／またはアジュバント等のワクチン成分の送達を含み得る所望の治療に基づいて選択される。ゆえに、いずれの方法も、１つまたはそれを超える活性薬剤のインビトロ送達またはインビボ送達をさらに含み得る。
好ましい実施形態において、分析は、１つまたはそれを超えるグリカン足場が特定の標的タンパク質または細胞に優先的に結合することを明らかにする。優先的に結合するとは、他のタンパク質または細胞型と比較して、より多くの特定のグリカン足場種が、１つのタンパク質または細胞型に結合することを意味する。例えば、そのような優先的結合は、器官もしくは組織を越えるもの（例えば、膵臓の代わりに肝臓）、病的細胞／正常細胞を越えるもの（例えば、癌対非癌性）、または同じ組織もしくは器官内の細胞を越えるもの（例えば、単球とは対照的にリンパ球）であり得る。優先的に結合する足場を特定することによって、当業者であれば、対象に投与された場合、その機能要素、例えば、タグ、標識、または活性薬剤を、対象の特定の細胞型または特定の組織もしくは器官に優先的に送達する標的足場を特定することができる。組織または器官に応じて、足場結合事象が、所望の細胞型に対して特定されると、当業者であれば、対象における細胞、組織、または器官への送達用に、１つまたはそれを超える活性薬剤により機能化されている標的グリカン足場を選択または調製することができる。活性薬剤は、上記で導入したように、小分子、タンパク質、核酸治療薬、ならびに抗原および／またはアジュバント等のワクチン成分の送達を含み得る所望の治療に基づいて選択される。ゆえに、いずれの方法も、１つまたはそれを超える活性薬剤のインビトロ送達またはインビボ送達をさらに含み得る。
【0155】
他の実施形態において、本分析は、グリカン自体が細胞の作用または活性を誘導または阻害（例えば細胞シグナル伝達）することを特定する。そのような実施形態において、優先的結合の同様の原理を用いて所望の結合関係および治療結果を特定するが、グリカン足場は、必要に応じて、更なる機能要素（例えば、活性薬剤、例えば薬物、またはタグ等）による機能化を欠いていてもよい。なぜなら、グリカン自体が治療結果を調節（例えば、活性化または阻害）する活性薬剤であるからである。
【0156】
ゆえに、インビボ方法は、例えば、有効量のグリカン足場を、必要に応じて、これを機能化する活性薬剤と共に含有する医薬組成物を、医薬組成物を必要とする対象に投与することを含み得る。
【0157】
他の実施形態において、懸濁液中の、または基質上に固定化されたグリカン足場は、血漿交換の代わりに、または血漿交換の補助剤として用いられる。例えば、血液または別の流体からＧＢＰ（すなわち、ＩｇＧ等）が特定されると、対応するグリカン足場を用いて、血液または他の流体からＧＢＰを、血液または他の流体をグリカン足場と接触させてから血液または他の流体からグリカン足場を分離することによって、取り出すことができる。ＧＢＰは、グリカン足場に結合して、血液または他の流体が除去された場合に、グリカン足場に結合したままである。そのような方法は、従来の血漿フェレーシスにおけるようにエキソビボで、または典型的には、ＧＢＰが取り出され得るようにＧＢＰ結合グリカン足場がその後に収集されるインビボで実施され得る。
【0158】
同様に、イメージング方法は、グリカン足場を、これを機能化するイメージング剤と共に含有する医薬組成物（例えば、デンドリマー上のルシフェラーゼ基質タグまたはフルオロフォア）を、医薬組成物を必要とする対象に投与することを含み得る。対象における標的物質を検出する方法は、対象をイメージングすることと、グリカン足場が検出された場合に、かつ／またはその場所で、対象における標的物質を決定または位置決めすることとを含み得る。標的物質が疾患または障害を示すならば、対象はその後、疾患または障害と診断され得る。
【0159】
２．例示的な使用戦略
また、例示的な非限定の使用戦略が提供される。
また、例示的な非限定の使用戦略が提供される。
【0160】
例えば、グリカン（自己または病原体由来）を用いて、例えば、Ｓｉｇｌｅｃｓ（Ｍｕｒｕｇｅｓａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．，６２：３４－４２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｂｐａ．２０２１．０１．００１（２０２１））およびＣ型レクチン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２８８，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００２８８（２０１４））、例えばＤＣ－ＳＩＧＮおよびＭＧＬを介して、自然免疫系および適応免疫系（ａｄａｐｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）を刺激することができる。
【0161】
宿主細胞との病原体相互作用／宿主細胞による病原体認識は、多くの場合、グリカン依存性である。グリカン足場を用いて、当該相互作用を探索、定義、かつ中和することができる。いくつかの研究は、これらの可能性を、二糖類／三糖類を用いて研究してきた（Ｃｏｒｄｏｂａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ９（７）：９７２－８４， ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｎａｎｏ．２０１３．０３．００４ （２０１３）、Ｃｌａｙｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．， ２２（１０）：２１８６－９７， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｂｃ２００３３１ｖ （２０１１）、Ｇａｒｃｉａ－Ｏｌｉｖａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６（７）：１５８８－９６， ｄｏｉ： １０．１００２／ｃｈｅｍ．２０１９０３７８８ （２０２０）、Ｂｅｒｎａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１１）：４７０９－２７， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ２ｃｓ３５４０８ｊ （２０１３）、Ｋｅｎｓｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， ４８（５）：１６１４－２３， ｄｏｉ： １０．１１２８／ＡＡＣ．４８．５．１６１４－１６２３．２００４ （２００４）、Ｉｍｂｅｒｔｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １４（２５）：７４９０－９， ｄｏｉ： １０．１００２／ｃｈｅｍ．２００８００７００ （２００８）、Ｈｏｙｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７（２８）：７５９３－６２４， ｄｏｉ： １０．１００２／ｃｈｅｍ．２０２００５０６５ （２０２１）、Ｇｉｎｇｒａｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．， ４２（１１）：４８２３－４１， ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ３ｃｓ６００９０ｄ （２０１３）、Ｗｅｌｌｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｔｈｅｒ （Ｗｅｉｎｈ）， ２０２１：２０００２１０， ｄｏｉ： １０．１００２／ａｄｔｐ．２０２０００２１０ （２０２１）、Ｖａｒｇａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ３５（１３）：４１７５－８４， ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１４．０１．０１４ （２０１４）、Ｍｉｎｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍｍ．， ９（３）：３４２－５４， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｍｐ２００５０３３ （２０１２））。全長複合Ｎ－グリカンを開示されるグリカンデンドリマー上に用いる可能性により、例えば宿主細胞Ｎ－グリカン／Ｏ－グリカンによる新しい研究を実行することができる。
【0162】
細胞表面グリカン結合タンパク質受容体は、細胞内薬物送達／標的化のための標的であり得る。例えば、Ｃａｔｔｉａｕｘ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．， ２６（５）：１００６－１５， ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｂｍｃ．２０１７．１２．０３６ （２０１８）、Ｋｒｉｓｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．， ２８７（１）：１１－２０， ｄｏｉ： １０．１００６／ｂｂｒｃ．２００１．５５３７ （２００１）、Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ．， ８（２１）：４９８７－９６． Ｅｐｕｂ ２０１０／０９／０８． ｄｏｉ： １０．１０３９／ｃ０ｏｂ００３７２ｇ （２０１０）、Ｂｅｚｏｕｓｋａ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４２６（２）：２４３－７， ｄｏｉ： １０．１０１６／ｓ００１４－５７９３（９８）００３４０－８ （１９９８）、Ｔｈｏｍａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １２（１）：９９－１１７． Ｅｐｕｂ ２００５／１０／１９． ｄｏｉ： １０．１００２／ｃｈｅｍ．２００５００９０１ （２００５）、Ｌｅｐｅｎｉｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．， ６５（９）：１２７１－８１， ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１３．０５．００７ （２０１３）、Ｄｏｏｒｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．， １２（３）：６５６－６５， ｄｏｉ： １０．１００２／ｃｈｅｍ．２００５００５５７ （２００６）、Ｚａａｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１：３０５， ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２０．００３０５ （２０２０）を参照のこと。特定の実施形態において、組成物および方法は、グリカン足場のグリカンに対する特定のリガンドを発現する癌細胞を標的とするのに用いられる。他の実施形態において、組成物および方法は、炎症を軽減するのに用いられる。
【0163】
本発明は、以下の番号を付した段落によってさらに理解することができる：
段落１． グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法であって、標的物質を、２つまたはそれを超えるグリカンを含む既知の多価グリカン足場と接触させることと、前記足場に結合する前記標的物質から要素を特定することを含む方法。
段落２． 前記標的物質は、１つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または１つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、段落１に記載の方法。
段落３． 前記標的物質は、２つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または２つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、段落２に記載の方法。
段落４． 前記標的物質は細胞の集団であり、前記標的物質の要素は、集団内の１つまたはそれを超える細胞型である、段落３に記載の方法。
段落５． 前記１つまたはそれを超える細胞型は、前記集団内の他の細胞型と比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、段落４に記載の方法。
段落６． 前記細胞が結合した前記多価足場を単離することをさらに含む、段落２～５のいずれか一項に記載の方法。
段落７． 結合した前記細胞を特徴付けることをさらに含む、段落２～６のいずれか一項に記載の方法。
段落８． 段落２～７のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合細胞を含む組成物。
段落９． 前記標的物質は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物であり、前記標的物質の要素は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の１つまたはそれを超えるＧＢＰである、段落２に記載の方法。
段落１０． 前記１つまたはそれを超えるＧＢＰは、前記細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の他のＧＢＰと比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、段落９に記載の方法。
段落１１． 結合した前記ＧＢＰを特徴付けることをさらに含む、段落９または１０のいずれか一項に記載の方法。
段落１２． 結合した前記ＧＢＰを単離することをさらに含む、段落９～１０のいずれか一項に記載の方法。
段落１３． 段落９～１２のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合ＧＢＰを含む組成物。
段落１４． グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法であって、１つまたはそれを超える既知の標的物質要素を、２つまたはそれを超えるグリカンを各々含む１つまたはそれを超える種の多価グリカン足場と接触させることと、標的物質要素に結合するグリカン足場を特定することとを含む方法。
段落１５． 前記１つまたはそれを超える既知の標的物質要素を、２つまたはそれを超えるグリカンを各々含む異なる種の多価グリカン足場のライブラリーと接触させることと、標的物質要素に結合するグリカン足場を特定することとを含み、必要に応じて、前記ライブラリーは、約２～約１０，０００、またはあらゆる部分範囲もしくはその特定の整数、例えば、２、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、１，０００の異なる種のグリカン足場を含む、段落１４に記載の方法。
段落１６． 前記既知の標的物質要素は、１つまたはそれを超える細胞型である、段落１４または１５に記載の方法。
段落１７． １つまたはそれを超える前記多価グリカン足場が、前記ライブラリー中の他の多価グリカン足場と比較して、前記１つまたはそれを超える細胞型に優先的に結合する、段落１６に記載の方法。
段落１８． 結合した前記多価グリカン足場を特徴付けることをさらに含む、段落１６または１７のいずれか一項に記載の方法。
段落１９． 前記多価グリカン足場を単離することをさらに含む、段落１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
段落２０． 段落１４～１９のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合細胞を含む組成物。
段落２１． 前記既知の標的物質要素は、１つまたはそれを超えるＧＢＰである、段落１４または１５に記載の方法。
段落２２． １つまたはそれを超える前記多価グリカン足場が、前記ライブラリー中の他の多価グリカン足場と比較して、前記１つまたはそれを超えるＧＢＰに優先的に結合する、段落２１に記載の方法。
段落２３． 結合した前記多価グリカン足場を特徴付けることをさらに含む、段落２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
段落２４． 前記多価グリカン足場を単離することをさらに含む、段落２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
段落２５． 段落２１～２４のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合ＧＢＰを含む組成物。
段落２６． グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法であって、標的物質を、２つまたはそれを超えるグリカンを含む１つまたはそれを超える未知の多価グリカン足場と接触させることと、多価グリカン足場に結合する前記標的物質から要素を特定することとを含み、必要に応じて、前記１つまたはそれを超える未知の多価グリカン足場は、約２～約１０，０００、またはあらゆる部分範囲もしくはその特定の整数、例えば２、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、１，０００の異なる種のグリカン足場を含むライブラリーを形成する、方法。
段落２７． 前記標的物質は、１つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または１つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、段落２６に記載の方法。
段落２８． 前記標的物質は、２つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または２つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、段落２７に記載の方法。
段落２９． 前記標的物質は細胞の集団であり、前記標的物質の要素は、集団内の１つまたはそれを超える細胞型である、段落２８に記載の方法。
段落３０． 前記１つまたはそれを超える細胞型は、前記集団内の他の細胞型と比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、段落２９に記載の方法。
段落３１． 前記細胞が結合した前記多価足場を単離することをさらに含む、段落２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
段落３２． 結合した前記細胞および／または細胞に結合した前記グリカンを特徴付けることをさらに含む、段落２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
段落３３． 段落２７～３２のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合細胞を含む組成物。
段落３４． 前記標的物質は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物であり、前記標的物質の要素は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の１つまたはそれを超えるＧＢＰである、段落２７に記載の方法。
段落３５． 前記１つまたはそれを超えるＧＢＰは、前記細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の他のＧＢＰと比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、段落３４に記載の方法。
段落３６． 結合した前記ＧＢＰおよび／またはＧＢＰに結合した前記グリカンを特徴付けることをさらに含む、段落３４または３５のいずれか一項に記載の方法。
段落３７． 結合した前記ＧＢＰを単離することをさらに含む、段落３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
段落３８． 段落３４～３７のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合ＧＢＰを含む組成物。
段落３９． 前記多価グリカン足場は、その末端に連結された２つまたはそれを超えるグリカンおよび必要に応じて１つまたはそれを超える機能要素を有する、基礎をなす分岐足場を含む、段落１～３８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４０． 前記基礎をなす分岐足場はデンドリマーである、段落３９に記載の方法または組成物。
段落４１． 前記２つまたはそれを超えるグリカンは全て同じグリカン種である、段落３９または４０に記載の方法または組成物。
段落４２． 前記２つまたはそれを超えるグリカンは、２つまたはそれを超える異なるグリカン種を含む、段落３９または４０に記載の方法または組成物。
段落４３． 前記１つまたはそれを超える機能要素は、前記グリカン足場および／またはグリカン足場に結合した前記標的物質の要素の形成、イメージング、局在化、特定、単離、および／または特徴付けを容易にする作用物質である、段落３９～４２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４４． 前記機能要素の少なくとも１つが、前記グリカン足場を特異的に特定するバーコードを含む核酸である、段落３９～４３のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４５． 前記機能要素の少なくとも１つがフルオロフォアである、段落３９～４４のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４６． 前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されている２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）－ベンズアミド（ＡＥＡＢ）に連結されている、段落３９～４５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４７． 前記機能要素の少なくとも１つがアフィニティタグである、段落３９～４５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４８． 前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されているアミノ酸に連結されている、段落３９～４７のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４９． 前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部ではない、段落４８に記載の方法。
段落５０． 前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部である、段落４８に記載の方法。
段落５１． 前記ポリペプチド鎖は、グリカンが連結された２つまたはそれを超えるアミノ酸を含む、段落５０に記載の方法。
段落５２． 前記アミノ酸は、セリンまたはトレオニンである、段落４８～５１のいずれか一項に記載の方法。
段落５３． 前記グリカン足場または標的物質の要素は、必要に応じてビーズ、スライド、プレート、または皿等の表面または基質に固定化されている、段落１～５２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落５４． 前記グリカン足場も前記標的物質も固定化されていない、段落１～５２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落５５． 前記グリカン足場および標的物質は溶液中にある、段落５４に記載の方法または組成物。
段落５６． 処置を必要とする対象を処置する方法であって、先のいずれかの方法に従って、グリカンに基づく結合相互作用を特定することと、前記対象に、特定された前記相互作用の前記グリカンを含む有効量の治療用多価グリカン足場を含む組成物を投与することとを含む方法。
段落５７． 治療用グリカンが、前記相互作用の細胞またはＧＢＰに結合すると、細胞活性を誘導または阻害する、段落５６に記載の方法。
段落５８． 治療用グリカンが、これを機能化する活性薬剤を含む、段落５６に記載の方法。
段落５９． 前記活性薬剤は、核酸、小分子、またはポリペプチドである、段落５８に記載の方法。
段落６０． 前記細胞は癌細胞であり、前記活性薬剤は抗癌薬である、段落５９に記載の方法。
段落６１． 前記細胞は免疫細胞であり、前記活性薬剤は抗原であるか、または抗原をコードする、段落５９に記載の方法。
段落６２． 段落５６～６２のいずれか一項に記載の治療用グリカンを含む組成物。
段落６３． 多価グリカン足場であって、その末端に連結された２つまたはそれを超えるグリカンおよび１つまたはそれを超える機能要素を有する、基礎をなす分岐足場を含む多価グリカン足場。
段落６４． 前記機能要素の少なくとも１つが、前記グリカン足場および／またはグリカン足場に結合した標的物質要素の形成、イメージング、局在化、特定、単離、および／または特徴付けを容易にする作用物質である、段落６３に記載の多価グリカン足場。
段落６５． 前記機能要素の少なくとも１つがフルオロフォアである、段落６３または６４のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落６６． 前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されている２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）－ベンズアミド（ＡＥＡＢ）に連結されている、段落６３～６５のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落６７． 前記機能要素の少なくとも１つが、前記グリカン足場を特異的に特定するバーコードを含む核酸である、段落６３～６６のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落６８． 前記機能要素の少なくとも１つがアフィニティタグである、段落６３～６７のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落６９． 前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されているアミノ酸に連結されている、段落６３～６８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落７０． 前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部ではない、段落６９に記載の方法。
段落７１． 前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部である、段落６９に記載の方法。
段落７２． 前記ポリペプチド鎖は、グリカンが連結された２つまたはそれを超えるアミノ酸を含む、段落７１に記載の方法。
段落７３． 前記アミノ酸は、セリンまたはトレオニンである、段落６９～７２のいずれか一項に記載の方法。
段落７４． 前記基礎となる分岐足場はデンドリマーである、段落６３～７３のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落７５． 前記基礎となる足場は、２～１６本のアーム（両端を含む）、必要に応じて８～１６本のアームで形成されている、段落６３～７４のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落７６． 前記基礎となる足場および／またはそのアームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで形成されている、段落６３～７５のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落７７． 前記基礎となる足場は、８アームＰＥＧ－ビオチン／アルキン、ビオチン（１）／アルキン（７）、ＭＷ ２０ｋ；デンドロアルキン－ＰＥＧ－デンドロアルキン、ＰＥＧ １０ｋ、Ｇ４ ３２アルキン；デンドロアルキン－ＰＥＧ－デンドロアルキン、ＰＥＧ １０ｋ、Ｇ５ ６４アルキン；またはデンドロアルキン－ＰＥＧ－デンドロアルキン、ＰＥＧ １０ｋ、Ｇ６ １２８アルキンで形成されている、段落６３～７６のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落７８． 前記多量体グリカン足場は、１０ｋＤａ～５０ｋＤの間、２０ｋＤａ～６０ｋＤａの間、もしくは２０ｋＤａ～３０ｋＤａの間（それぞれ両端を含む）、またはそのあらゆる整数範囲、もしくはその間のあらゆる特定の整数である、段落６３～７７のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落７９． 前記２つまたはそれを超えるグリカンは全て同じグリカン種である、段落６３～７８のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落８０． 前記２つまたはそれを超えるグリカンは、２つまたはそれを超える異なるグリカン種を含む、段落６３～７９のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落８１． 式：
（リガンド）ｎ：足場：検出／分離タグ：識別子タグ
を含み、式中、「リガンド」は、存在しており、かつｎ＞１コピーを有する（すなわち、多価）１つまたはそれを超えるグリカン種であり；
「足場」は、存在しており、かつ基礎となる分岐足場、例えば、デンドリマーまたは超分岐ポリマーであり；
「検出／分離タグ」および「識別子タグ」の一方または双方が存在しており、かつ機能要素、
例えば、（ａ）分離／単離を容易にするためのビオチンまたは（ＨＩＳ）６～８ペプチドタグ、（ｂ）検出を容易にするためのフルオロフォア、（ｃ）同定を容易にするためにＰＣＲ増幅かつ配列決定することができる固有のＤＮＡまたはＲＮＡ配列（「バーコード」）；および／あるいは（ｄ）本明細書中の他の箇所で説明されるような薬物または他の材料、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｃｒｉｓｐｒガイドＲＮＡ等の核酸、あるいは治療効果もしくは細胞修飾効果を有することが意図されるか、または（ａ）抗原を発現する病原体もしくは異常細胞、例えば腫瘍に対する保護的免疫応答、もしくは（ｂ）抗原に対する自己免疫障害の治療としての抗原に対する免疫寛容を誘導することが意図される抗原を含み得る薬物またはそのような他の材料を含有する小胞を指す、
段落６３～８０のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落８２． 前記グリカン足場は固定化されていない、段落６３～８１のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落８３． 本文および／または図を含むが、これらに限定されない、本明細書中に記載される多価グリカン足場。
段落８４． 溶液中に段落６３～８３のいずれか一項に記載の複数の多価グリカン足場を含む組成物。
段落８５． 前記複数の多価グリカン足場は固定化されていない、段落８４に記載の組成物。
段落１． グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法であって、標的物質を、２つまたはそれを超えるグリカンを含む既知の多価グリカン足場と接触させることと、前記足場に結合する前記標的物質から要素を特定することを含む方法。
段落２． 前記標的物質は、１つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または１つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、段落１に記載の方法。
段落３． 前記標的物質は、２つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または２つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、段落２に記載の方法。
段落４． 前記標的物質は細胞の集団であり、前記標的物質の要素は、集団内の１つまたはそれを超える細胞型である、段落３に記載の方法。
段落５． 前記１つまたはそれを超える細胞型は、前記集団内の他の細胞型と比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、段落４に記載の方法。
段落６． 前記細胞が結合した前記多価足場を単離することをさらに含む、段落２～５のいずれか一項に記載の方法。
段落７． 結合した前記細胞を特徴付けることをさらに含む、段落２～６のいずれか一項に記載の方法。
段落８． 段落２～７のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合細胞を含む組成物。
段落９． 前記標的物質は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物であり、前記標的物質の要素は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の１つまたはそれを超えるＧＢＰである、段落２に記載の方法。
段落１０． 前記１つまたはそれを超えるＧＢＰは、前記細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の他のＧＢＰと比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、段落９に記載の方法。
段落１１． 結合した前記ＧＢＰを特徴付けることをさらに含む、段落９または１０のいずれか一項に記載の方法。
段落１２． 結合した前記ＧＢＰを単離することをさらに含む、段落９～１０のいずれか一項に記載の方法。
段落１３． 段落９～１２のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合ＧＢＰを含む組成物。
段落１４． グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法であって、１つまたはそれを超える既知の標的物質要素を、２つまたはそれを超えるグリカンを各々含む１つまたはそれを超える種の多価グリカン足場と接触させることと、標的物質要素に結合するグリカン足場を特定することとを含む方法。
段落１５． 前記１つまたはそれを超える既知の標的物質要素を、２つまたはそれを超えるグリカンを各々含む異なる種の多価グリカン足場のライブラリーと接触させることと、標的物質要素に結合するグリカン足場を特定することとを含み、必要に応じて、前記ライブラリーは、約２～約１０，０００、またはあらゆる部分範囲もしくはその特定の整数、例えば、２、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、１，０００の異なる種のグリカン足場を含む、段落１４に記載の方法。
段落１６． 前記既知の標的物質要素は、１つまたはそれを超える細胞型である、段落１４または１５に記載の方法。
段落１７． １つまたはそれを超える前記多価グリカン足場が、前記ライブラリー中の他の多価グリカン足場と比較して、前記１つまたはそれを超える細胞型に優先的に結合する、段落１６に記載の方法。
段落１８． 結合した前記多価グリカン足場を特徴付けることをさらに含む、段落１６または１７のいずれか一項に記載の方法。
段落１９． 前記多価グリカン足場を単離することをさらに含む、段落１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
段落２０． 段落１４～１９のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合細胞を含む組成物。
段落２１． 前記既知の標的物質要素は、１つまたはそれを超えるＧＢＰである、段落１４または１５に記載の方法。
段落２２． １つまたはそれを超える前記多価グリカン足場が、前記ライブラリー中の他の多価グリカン足場と比較して、前記１つまたはそれを超えるＧＢＰに優先的に結合する、段落２１に記載の方法。
段落２３． 結合した前記多価グリカン足場を特徴付けることをさらに含む、段落２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
段落２４． 前記多価グリカン足場を単離することをさらに含む、段落２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
段落２５． 段落２１～２４のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合ＧＢＰを含む組成物。
段落２６． グリカンに基づく結合相互作用を特定する方法であって、標的物質を、２つまたはそれを超えるグリカンを含む１つまたはそれを超える未知の多価グリカン足場と接触させることと、多価グリカン足場に結合する前記標的物質から要素を特定することとを含み、必要に応じて、前記１つまたはそれを超える未知の多価グリカン足場は、約２～約１０，０００、またはあらゆる部分範囲もしくはその特定の整数、例えば２、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、１，０００の異なる種のグリカン足場を含むライブラリーを形成する、方法。
段落２７． 前記標的物質は、１つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または１つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、段落２６に記載の方法。
段落２８． 前記標的物質は、２つもしくはそれを超える異なる細胞型を含む細胞の集団、または２つもしくはそれを超えるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を含む細胞溶解液もしくは他のタンパク質性混合物である、段落２７に記載の方法。
段落２９． 前記標的物質は細胞の集団であり、前記標的物質の要素は、集団内の１つまたはそれを超える細胞型である、段落２８に記載の方法。
段落３０． 前記１つまたはそれを超える細胞型は、前記集団内の他の細胞型と比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、段落２９に記載の方法。
段落３１． 前記細胞が結合した前記多価足場を単離することをさらに含む、段落２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
段落３２． 結合した前記細胞および／または細胞に結合した前記グリカンを特徴付けることをさらに含む、段落２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
段落３３． 段落２７～３２のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合細胞を含む組成物。
段落３４． 前記標的物質は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物であり、前記標的物質の要素は、細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の１つまたはそれを超えるＧＢＰである、段落２７に記載の方法。
段落３５． 前記１つまたはそれを超えるＧＢＰは、前記細胞溶解液または他のタンパク質性混合物内の他のＧＢＰと比較して、前記多価グリカン足場に優先的に結合する、段落３４に記載の方法。
段落３６． 結合した前記ＧＢＰおよび／またはＧＢＰに結合した前記グリカンを特徴付けることをさらに含む、段落３４または３５のいずれか一項に記載の方法。
段落３７． 結合した前記ＧＢＰを単離することをさらに含む、段落３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
段落３８． 段落３４～３７のいずれか一項に規定されるグリカン足場結合ＧＢＰを含む組成物。
段落３９． 前記多価グリカン足場は、その末端に連結された２つまたはそれを超えるグリカンおよび必要に応じて１つまたはそれを超える機能要素を有する、基礎をなす分岐足場を含む、段落１～３８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４０． 前記基礎をなす分岐足場はデンドリマーである、段落３９に記載の方法または組成物。
段落４１． 前記２つまたはそれを超えるグリカンは全て同じグリカン種である、段落３９または４０に記載の方法または組成物。
段落４２． 前記２つまたはそれを超えるグリカンは、２つまたはそれを超える異なるグリカン種を含む、段落３９または４０に記載の方法または組成物。
段落４３． 前記１つまたはそれを超える機能要素は、前記グリカン足場および／またはグリカン足場に結合した前記標的物質の要素の形成、イメージング、局在化、特定、単離、および／または特徴付けを容易にする作用物質である、段落３９～４２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４４． 前記機能要素の少なくとも１つが、前記グリカン足場を特異的に特定するバーコードを含む核酸である、段落３９～４３のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４５． 前記機能要素の少なくとも１つがフルオロフォアである、段落３９～４４のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４６． 前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されている２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）－ベンズアミド（ＡＥＡＢ）に連結されている、段落３９～４５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４７． 前記機能要素の少なくとも１つがアフィニティタグである、段落３９～４５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４８． 前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されているアミノ酸に連結されている、段落３９～４７のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落４９． 前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部ではない、段落４８に記載の方法。
段落５０． 前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部である、段落４８に記載の方法。
段落５１． 前記ポリペプチド鎖は、グリカンが連結された２つまたはそれを超えるアミノ酸を含む、段落５０に記載の方法。
段落５２． 前記アミノ酸は、セリンまたはトレオニンである、段落４８～５１のいずれか一項に記載の方法。
段落５３． 前記グリカン足場または標的物質の要素は、必要に応じてビーズ、スライド、プレート、または皿等の表面または基質に固定化されている、段落１～５２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落５４． 前記グリカン足場も前記標的物質も固定化されていない、段落１～５２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落５５． 前記グリカン足場および標的物質は溶液中にある、段落５４に記載の方法または組成物。
段落５６． 処置を必要とする対象を処置する方法であって、先のいずれかの方法に従って、グリカンに基づく結合相互作用を特定することと、前記対象に、特定された前記相互作用の前記グリカンを含む有効量の治療用多価グリカン足場を含む組成物を投与することとを含む方法。
段落５７． 治療用グリカンが、前記相互作用の細胞またはＧＢＰに結合すると、細胞活性を誘導または阻害する、段落５６に記載の方法。
段落５８． 治療用グリカンが、これを機能化する活性薬剤を含む、段落５６に記載の方法。
段落５９． 前記活性薬剤は、核酸、小分子、またはポリペプチドである、段落５８に記載の方法。
段落６０． 前記細胞は癌細胞であり、前記活性薬剤は抗癌薬である、段落５９に記載の方法。
段落６１． 前記細胞は免疫細胞であり、前記活性薬剤は抗原であるか、または抗原をコードする、段落５９に記載の方法。
段落６２． 段落５６～６２のいずれか一項に記載の治療用グリカンを含む組成物。
段落６３． 多価グリカン足場であって、その末端に連結された２つまたはそれを超えるグリカンおよび１つまたはそれを超える機能要素を有する、基礎をなす分岐足場を含む多価グリカン足場。
段落６４． 前記機能要素の少なくとも１つが、前記グリカン足場および／またはグリカン足場に結合した標的物質要素の形成、イメージング、局在化、特定、単離、および／または特徴付けを容易にする作用物質である、段落６３に記載の多価グリカン足場。
段落６５． 前記機能要素の少なくとも１つがフルオロフォアである、段落６３または６４のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落６６． 前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されている２－アミノ－Ｎ－（２－アミノエチル）－ベンズアミド（ＡＥＡＢ）に連結されている、段落６３～６５のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落６７． 前記機能要素の少なくとも１つが、前記グリカン足場を特異的に特定するバーコードを含む核酸である、段落６３～６６のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落６８． 前記機能要素の少なくとも１つがアフィニティタグである、段落６３～６７のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落６９． 前記グリカンは、前記基礎となる分岐足場の末端に直接的または間接的に連結されているアミノ酸に連結されている、段落６３～６８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
段落７０． 前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部ではない、段落６９に記載の方法。
段落７１． 前記アミノ酸は、ポリペプチド鎖の一部である、段落６９に記載の方法。
段落７２． 前記ポリペプチド鎖は、グリカンが連結された２つまたはそれを超えるアミノ酸を含む、段落７１に記載の方法。
段落７３． 前記アミノ酸は、セリンまたはトレオニンである、段落６９～７２のいずれか一項に記載の方法。
段落７４． 前記基礎となる分岐足場はデンドリマーである、段落６３～７３のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落７５． 前記基礎となる足場は、２～１６本のアーム（両端を含む）、必要に応じて８～１６本のアームで形成されている、段落６３～７４のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落７６． 前記基礎となる足場および／またはそのアームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで形成されている、段落６３～７５のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落７７． 前記基礎となる足場は、８アームＰＥＧ－ビオチン／アルキン、ビオチン（１）／アルキン（７）、ＭＷ ２０ｋ；デンドロアルキン－ＰＥＧ－デンドロアルキン、ＰＥＧ １０ｋ、Ｇ４ ３２アルキン；デンドロアルキン－ＰＥＧ－デンドロアルキン、ＰＥＧ １０ｋ、Ｇ５ ６４アルキン；またはデンドロアルキン－ＰＥＧ－デンドロアルキン、ＰＥＧ １０ｋ、Ｇ６ １２８アルキンで形成されている、段落６３～７６のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落７８． 前記多量体グリカン足場は、１０ｋＤａ～５０ｋＤの間、２０ｋＤａ～６０ｋＤａの間、もしくは２０ｋＤａ～３０ｋＤａの間（それぞれ両端を含む）、またはそのあらゆる整数範囲、もしくはその間のあらゆる特定の整数である、段落６３～７７のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落７９． 前記２つまたはそれを超えるグリカンは全て同じグリカン種である、段落６３～７８のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落８０． 前記２つまたはそれを超えるグリカンは、２つまたはそれを超える異なるグリカン種を含む、段落６３～７９のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落８１． 式：
（リガンド）ｎ：足場：検出／分離タグ：識別子タグ
を含み、式中、「リガンド」は、存在しており、かつｎ＞１コピーを有する（すなわち、多価）１つまたはそれを超えるグリカン種であり；
「足場」は、存在しており、かつ基礎となる分岐足場、例えば、デンドリマーまたは超分岐ポリマーであり；
「検出／分離タグ」および「識別子タグ」の一方または双方が存在しており、かつ機能要素、
例えば、（ａ）分離／単離を容易にするためのビオチンまたは（ＨＩＳ）６～８ペプチドタグ、（ｂ）検出を容易にするためのフルオロフォア、（ｃ）同定を容易にするためにＰＣＲ増幅かつ配列決定することができる固有のＤＮＡまたはＲＮＡ配列（「バーコード」）；および／あるいは（ｄ）本明細書中の他の箇所で説明されるような薬物または他の材料、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｃｒｉｓｐｒガイドＲＮＡ等の核酸、あるいは治療効果もしくは細胞修飾効果を有することが意図されるか、または（ａ）抗原を発現する病原体もしくは異常細胞、例えば腫瘍に対する保護的免疫応答、もしくは（ｂ）抗原に対する自己免疫障害の治療としての抗原に対する免疫寛容を誘導することが意図される抗原を含み得る薬物またはそのような他の材料を含有する小胞を指す、
段落６３～８０のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落８２． 前記グリカン足場は固定化されていない、段落６３～８１のいずれか一項に記載の多価グリカン足場。
段落８３． 本文および／または図を含むが、これらに限定されない、本明細書中に記載される多価グリカン足場。
段落８４． 溶液中に段落６３～８３のいずれか一項に記載の複数の多価グリカン足場を含む組成物。
段落８５． 前記複数の多価グリカン足場は固定化されていない、段落８４に記載の組成物。
【実施例】
【0164】
実施例
実施例１：多価多機能グリカンデンドリマーの生成
材料および方法
試薬
・２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（＃５２９２４９－５Ｇ）
・アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃ＢＰ９２２Ｉ－５００）
・２，６－ルチジン、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（＃３３６１０６－１００ＭＬ）
・アセトニトリル（ＡＣＮ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃ＡＡ４２３１１Ｋ２）
・トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃ＡＡＬ０６３７４ＡＣ）
・カーボグラフカラム１５０ｍｇ、ＢＧＢ分析物（＃ＳＰＵ－５１２２４２３）
・ＰＮＧａｓｅＦ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（＃Ｐ０７０４）
・血液型Ｈ型２－三糖、Ｃｈｅｍｉｌｌｙ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ（＃ＯＳ０３００６）
・ルイスＸ四糖（ｔｅｔｒａｓｓａｃｈａｒｉｄｅ）、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（＃ＯＬ０９５６９）
・３’－ｓｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（＃ＯＳ００７３２）
・６’－ｓｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ、Ｄｅｘｔｒａｕｋ（＃ＳＬＮ３０６）
・Ｇｌｏｂｏ－Ｎ－ペンタオース（Ｇｂ５）、Ｃｈｅｍｉｌｙ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ（＃ＯＳ０３０１２）
・Ｇｌｏｂｏ－Ｎ－テトラオース（Ｇｂ４）；Ｅｌｉｃｉｔｙｌ（＃ＧＬＹ１２１－９０％）
・８量体ＰＥＧデンドリマー（７アームのアルキン機能化；１アームのビオチン機能化）、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ（＃ＣＰＷ－８８４１）
・多価Ｈ３－ＰＡＡ－ビオチン、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ（＃０１－０３４）
・一価Ｈ３－ｓｐ－ビオチン、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ（＃０２－０３４）
・多価ルイスＡ－ＰＡＡ－ビオチン、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ（＃０１－０３５）
・Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｉｐｒａｃｅｌｌ（＃ＣＣ－０５－１０－５０）
・ウシフェチュイン、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（＃ＭＢＳ６３４４０３）
・ニワトリ卵白アルブミン、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃５０－１３６－８４６８）
・リボヌクレアーゼＢ（ＲＮＡｓｅＢ）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（＃ＬＳ００５７１０）
・ヒトＩｇＧ、Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（＃１６－１６－０９０７０７）
・ブタ胃ムチン（ＰＳＭ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（＃Ｍ２３７８－１００Ｇ）
・ＣｕＳＯ４、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（＃４５１６５７－１０Ｇ）
・トリス－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチルアミン（ＴＨＰＴＡ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃ＮＣ１４８６１３７）
・アスコルビン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（＃１１１４０－５０Ｇ）
・リン酸ナトリウムバッファ（ＰＢＳ）、１００ｍＭリン酸一ナトリウム、ＲＰＩ（＃Ｓ２３１８５－５００．０）、１００ｍＭリン酸二ナトリウム、ＲＰＩ（＃Ｓ２３１７５－５００．０）、ｐＨ７．４
・ＰＤ－１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５脱塩カラム、Ｃｙｔｉｖａ（＃１７０８５１０１）
・トリス、ＲＰＩ（＃Ｔ６００４０－１０００．０）
・ＮａＣｌ、ＲＰＩ（＃Ｓ２３０２５－３０００．０）
・ＣａＣｌ２、ＲＰＩ（＃Ｃ３６２００－５００．０）
・ＭｇＣｌ２、ＲＰＩ（＃Ｍ２４０００－１００．０）
・無水炭酸ナトリウム、ＲＰＩ（＃２５０２５－１０００．０）
・重炭酸ナトリウム、ＲＰＩ（＃Ｓ２２０６０－１０００．０）
・ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＲＰＩ（＃Ａ３００７５－１００．０）
・ストレプトアビジン－ＰＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃ＳＮＮ１００７）
・ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（＃１３０－０９３－２３３）
・Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ（＃７２００－０５）
・ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質、ＡｂＣａｍ（＃ａｂ１７１５２４）
実施例１：多価多機能グリカンデンドリマーの生成
材料および方法
試薬
・２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（＃５２９２４９－５Ｇ）
・アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃ＢＰ９２２Ｉ－５００）
・２，６－ルチジン、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（＃３３６１０６－１００ＭＬ）
・アセトニトリル（ＡＣＮ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃ＡＡ４２３１１Ｋ２）
・トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃ＡＡＬ０６３７４ＡＣ）
・カーボグラフカラム１５０ｍｇ、ＢＧＢ分析物（＃ＳＰＵ－５１２２４２３）
・ＰＮＧａｓｅＦ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（＃Ｐ０７０４）
・血液型Ｈ型２－三糖、Ｃｈｅｍｉｌｌｙ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ（＃ＯＳ０３００６）
・ルイスＸ四糖（ｔｅｔｒａｓｓａｃｈａｒｉｄｅ）、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（＃ＯＬ０９５６９）
・３’－ｓｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（＃ＯＳ００７３２）
・６’－ｓｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ、Ｄｅｘｔｒａｕｋ（＃ＳＬＮ３０６）
・Ｇｌｏｂｏ－Ｎ－ペンタオース（Ｇｂ５）、Ｃｈｅｍｉｌｙ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ（＃ＯＳ０３０１２）
・Ｇｌｏｂｏ－Ｎ－テトラオース（Ｇｂ４）；Ｅｌｉｃｉｔｙｌ（＃ＧＬＹ１２１－９０％）
・８量体ＰＥＧデンドリマー（７アームのアルキン機能化；１アームのビオチン機能化）、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ（＃ＣＰＷ－８８４１）
・多価Ｈ３－ＰＡＡ－ビオチン、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ（＃０１－０３４）
・一価Ｈ３－ｓｐ－ビオチン、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ（＃０２－０３４）
・多価ルイスＡ－ＰＡＡ－ビオチン、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ（＃０１－０３５）
・Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｉｐｒａｃｅｌｌ（＃ＣＣ－０５－１０－５０）
・ウシフェチュイン、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（＃ＭＢＳ６３４４０３）
・ニワトリ卵白アルブミン、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃５０－１３６－８４６８）
・リボヌクレアーゼＢ（ＲＮＡｓｅＢ）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（＃ＬＳ００５７１０）
・ヒトＩｇＧ、Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（＃１６－１６－０９０７０７）
・ブタ胃ムチン（ＰＳＭ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（＃Ｍ２３７８－１００Ｇ）
・ＣｕＳＯ４、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（＃４５１６５７－１０Ｇ）
・トリス－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチルアミン（ＴＨＰＴＡ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃ＮＣ１４８６１３７）
・アスコルビン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（＃１１１４０－５０Ｇ）
・リン酸ナトリウムバッファ（ＰＢＳ）、１００ｍＭリン酸一ナトリウム、ＲＰＩ（＃Ｓ２３１８５－５００．０）、１００ｍＭリン酸二ナトリウム、ＲＰＩ（＃Ｓ２３１７５－５００．０）、ｐＨ７．４
・ＰＤ－１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５脱塩カラム、Ｃｙｔｉｖａ（＃１７０８５１０１）
・トリス、ＲＰＩ（＃Ｔ６００４０－１０００．０）
・ＮａＣｌ、ＲＰＩ（＃Ｓ２３０２５－３０００．０）
・ＣａＣｌ２、ＲＰＩ（＃Ｃ３６２００－５００．０）
・ＭｇＣｌ２、ＲＰＩ（＃Ｍ２４０００－１００．０）
・無水炭酸ナトリウム、ＲＰＩ（＃２５０２５－１０００．０）
・重炭酸ナトリウム、ＲＰＩ（＃Ｓ２２０６０－１０００．０）
・ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＲＰＩ（＃Ａ３００７５－１００．０）
・ストレプトアビジン－ＰＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃ＳＮＮ１００７）
・ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（＃１３０－０９３－２３３）
・Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ（＃７２００－０５）
・ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質、ＡｂＣａｍ（＃ａｂ１７１５２４）
【0165】
グリカンのアジド誘導体化
Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），（２３）：３３７８－９，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｂ９０５７６１ｇ（２００９）およびＳｔｒｅｉｃｈｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．，２０（１５）：１９１４－８，ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１９０００２３（２０１９）（これらはその全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）から適合。血液型Ｈ２型三糖、ルイスＸ四糖、３’－および６’－ｓｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ、Ｇｌｏｂｏ－Ｎ－ペンタオース（Ｇｂ５）、ならびにＧｌｏｂｏ－Ｎ－テトラオース（Ｇｂ４）が挙げられる市販のグリカンを、４５μＬ～６０μＬの最終体積で５０ｍＭの濃度にて誘導体化した。グリカンを最初に、ＮａＮ３および２，６－ルチジンの溶液をそれぞれ３．５Ｍおよび１．５Ｍの最終濃度まで加えた最小体積（１０～１５μＬ）のＭｉｌｌｉＱ水中に可溶化した。ＤＭＣを７５０ｍＭの最終濃度にて加えて、最終溶液を、時々混合しながら４℃にて７２時間インキュベートして、試料を均質化した。表１を参照。
Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），（２３）：３３７８－９，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｂ９０５７６１ｇ（２００９）およびＳｔｒｅｉｃｈｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．，２０（１５）：１９１４－８，ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１９０００２３（２０１９）（これらはその全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）から適合。血液型Ｈ２型三糖、ルイスＸ四糖、３’－および６’－ｓｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ、Ｇｌｏｂｏ－Ｎ－ペンタオース（Ｇｂ５）、ならびにＧｌｏｂｏ－Ｎ－テトラオース（Ｇｂ４）が挙げられる市販のグリカンを、４５μＬ～６０μＬの最終体積で５０ｍＭの濃度にて誘導体化した。グリカンを最初に、ＮａＮ３および２，６－ルチジンの溶液をそれぞれ３．５Ｍおよび１．５Ｍの最終濃度まで加えた最小体積（１０～１５μＬ）のＭｉｌｌｉＱ水中に可溶化した。ＤＭＣを７５０ｍＭの最終濃度にて加えて、最終溶液を、時々混合しながら４℃にて７２時間インキュベートして、試料を均質化した。表１を参照。
【0166】
【表1】
【0167】
Ｎ３誘導体化グリカンを、１カラム体積（ＣＶ）のＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、１ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水＋０．１％ＴＦＡ、１ＣＶの１０％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、および１ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水＋０．１％ＴＦＡによりコンディショニングしたカーボグラフカラム（１５０ｍｇ体積）により精製した。１ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水＋０．１％ＴＦＡをグリカンアジ化反応溶液に加えてから、カーボグラフカラム上にロードした。反応チューブを、１ｍＬの１０％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡでリンスして、カーボグラフカラム上にロードした。次いで、カーボグラフカラムを３ＣＶの１０％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡで洗浄した。グリカンを、２ＣＶの２５％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、続いて１ＣＶの５０％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡで溶出した。画分をプールして凍結乾燥させた。
【0168】
より大きなＮ－グリカン型グリカン（ＭＷ約１，５００～３，０００Ｄａ）については、条件を調整した。表２に最終濃度／体積／モルを示す。
【0169】
【表2】
【0170】
８アームＰＥＧビオチン／アルキンリンカーへのグリカンカップリング
グリカン－Ｎ３および８アームＰＥＧビオチン／アルキンリンカーを、それぞれ２０ｍｇ／ｍＬおよび１５ｍｇ／ｍＬにてＰＢＳ中に再懸濁させた。２０ｍＭ ＣｕＳＯ４、２０ｍＭ ＴＨＰＴＡ、および５０ｍＭアスコルビン酸ナトリウムのフレッシュな溶液を、ＰＢＳ中に調製した。カップリング反応を、８アームＰＥＧビオチン／アルキンと比較して、２１モル過剰のグリカン－Ｎ３により、以下の条件で実行した－最終体積２００μＬのリン酸ナトリウムバッファ中、グリカン－Ｎ３ ０．４５ｍＭ、８アームＰＥＧ－ビオチン／アルキン９．４５ｍＭ、ＣｕＳＯ４ ０．２ｍＭ、ＴＨＰＴＡ １ｍＭ、およびアスコルビン酸ナトリウム５ｍＭ。反応液を室温にて一晩、穏やかに回転させながらインキュベートした。
グリカン－Ｎ３および８アームＰＥＧビオチン／アルキンリンカーを、それぞれ２０ｍｇ／ｍＬおよび１５ｍｇ／ｍＬにてＰＢＳ中に再懸濁させた。２０ｍＭ ＣｕＳＯ４、２０ｍＭ ＴＨＰＴＡ、および５０ｍＭアスコルビン酸ナトリウムのフレッシュな溶液を、ＰＢＳ中に調製した。カップリング反応を、８アームＰＥＧビオチン／アルキンと比較して、２１モル過剰のグリカン－Ｎ３により、以下の条件で実行した－最終体積２００μＬのリン酸ナトリウムバッファ中、グリカン－Ｎ３ ０．４５ｍＭ、８アームＰＥＧ－ビオチン／アルキン９．４５ｍＭ、ＣｕＳＯ４ ０．２ｍＭ、ＴＨＰＴＡ １ｍＭ、およびアスコルビン酸ナトリウム５ｍＭ。反応液を室温にて一晩、穏やかに回転させながらインキュベートした。
【0171】
コンジュゲート型グリカン－デンドリマーを、１０ｍＬのリン酸ナトリウムバッファにより平衡化したＰＤ－１０ Ｇ－２５カラムで精製した。グリカン－デンドリマー溶液をカラム上にロードして、カラムを１０ｍＬのリン酸ナトリウムバッファで洗浄した。１ｍＬの画分を収集して、グリカン－デンドリマーを含有する画分をプールして凍結乾燥させた。乾燥８量体－Ｈ３を、１ｍｇ／ｍｌのリン酸ナトリウムバッファ中で再構成して、等分して、－２０℃にて凍結した。
【0172】
フローサイトメトリー
１－２．１０７個のＯ１３ ＹＳＤ細胞をＴＳＭ－ＢＳＡバッファ（２０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＢＳＡ）中で１回洗浄してから、２５０μＬのＴＳＭ－ＢＳＡ中１００ｍＭのＨ３－ＰＡＡ－ビオチンまたはＨ３－ｓｐ－ビオチン、および２００ｍＭのＨ３グリカンデンドリマーまたは非修飾デンドリマーと、４℃にて１時間、穏やかに振盪（ｓｈａｃｋｉｎｇ）させながらインキュベートした。次いで、Ｏ１３ ＹＳＤ細胞をＴＳＭ－ＢＳＡで３回洗浄してから、２５０μＬのＴＳＭ－ＢＳＡ中ストレプトアビジン－ＰＥ（１：４００希釈）と、４℃にて３０分間、穏やかに振盪させながら暗所でインキュベートした。次いで、Ｏ１３ ＹＳＤ細胞を氷冷ＴＳＭ－ＢＳＡで３回洗浄してから、２５０μＬのＴＭＳ－ＢＳＡ中に再懸濁させ、そこに１μＬのＰＩを加えて生細胞／死細胞を染色した。１２５μＬの各試料をフローサイトメトリー測定に用いた。
１－２．１０７個のＯ１３ ＹＳＤ細胞をＴＳＭ－ＢＳＡバッファ（２０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＢＳＡ）中で１回洗浄してから、２５０μＬのＴＳＭ－ＢＳＡ中１００ｍＭのＨ３－ＰＡＡ－ビオチンまたはＨ３－ｓｐ－ビオチン、および２００ｍＭのＨ３グリカンデンドリマーまたは非修飾デンドリマーと、４℃にて１時間、穏やかに振盪（ｓｈａｃｋｉｎｇ）させながらインキュベートした。次いで、Ｏ１３ ＹＳＤ細胞をＴＳＭ－ＢＳＡで３回洗浄してから、２５０μＬのＴＳＭ－ＢＳＡ中ストレプトアビジン－ＰＥ（１：４００希釈）と、４℃にて３０分間、穏やかに振盪させながら暗所でインキュベートした。次いで、Ｏ１３ ＹＳＤ細胞を氷冷ＴＳＭ－ＢＳＡで３回洗浄してから、２５０μＬのＴＭＳ－ＢＳＡ中に再懸濁させ、そこに１μＬのＰＩを加えて生細胞／死細胞を染色した。１２５μＬの各試料をフローサイトメトリー測定に用いた。
【0173】
ＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートのウェルを、２μｇ／ｍｌのＯ１３－ｈＩｇＧ１を含有する２００μＬの０．０５Ｍ炭酸－重炭酸バッファｐＨ９．６でコーティングして、３７℃にて３０分間インキュベートした。ウェルを、ＴＳＭ＋３％ ＢＳＡで室温にて１時間ブロックしてから、ＴＳＭ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＴＭＳ－Ｔ）で３回洗浄した。ウェルを、２００μＬのＴＳＭバッファ中１００ｎＭのＨ３－ＰＡＡ－ビオチン、Ｈ３グリカンデンドリマー、ルイスＡ－ＰＡＡ－ビオチン、または非修飾デンドリマーのいずれかと室温にて１時間インキュベートした。ＴＳＭ－Ｔで３回洗浄した後に、ウェルを、１：２０００希釈のアビジン－ＨＲＰを含有する２００μＬのＴＳＭと、室温にて１時間インキュベートした。１５０μＬのＴＭＢを加えて、６３０ｎｍフィルターを備えたプレートリーダーを用いて読むことによって、ウェル毎のシグナルを明らかにした。
９６ウェルプレートのウェルを、２μｇ／ｍｌのＯ１３－ｈＩｇＧ１を含有する２００μＬの０．０５Ｍ炭酸－重炭酸バッファｐＨ９．６でコーティングして、３７℃にて３０分間インキュベートした。ウェルを、ＴＳＭ＋３％ ＢＳＡで室温にて１時間ブロックしてから、ＴＳＭ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＴＭＳ－Ｔ）で３回洗浄した。ウェルを、２００μＬのＴＳＭバッファ中１００ｎＭのＨ３－ＰＡＡ－ビオチン、Ｈ３グリカンデンドリマー、ルイスＡ－ＰＡＡ－ビオチン、または非修飾デンドリマーのいずれかと室温にて１時間インキュベートした。ＴＳＭ－Ｔで３回洗浄した後に、ウェルを、１：２０００希釈のアビジン－ＨＲＰを含有する２００μＬのＴＳＭと、室温にて１時間インキュベートした。１５０μＬのＴＭＢを加えて、６３０ｎｍフィルターを備えたプレートリーダーを用いて読むことによって、ウェル毎のシグナルを明らかにした。
【0174】
結果
血中Ｈ２型三糖（Ｈ３）を、還元性単糖のＣ１上のアジド（Ｎ３）官能基により誘導体化した（Ｈ３の場合はＮ－アセチルグルコサミン）（図２Ａ）。Ｎ３タグ化Ｈ３グリカンを、８量体ＰＥＧビオチン／アルキンデンドリマーのアルキンアーム上に「クリック」した（図２Ｂ）。
血中Ｈ２型三糖（Ｈ３）を、還元性単糖のＣ１上のアジド（Ｎ３）官能基により誘導体化した（Ｈ３の場合はＮ－アセチルグルコサミン）（図２Ａ）。Ｎ３タグ化Ｈ３グリカンを、８量体ＰＥＧビオチン／アルキンデンドリマーのアルキンアーム上に「クリック」した（図２Ｂ）。
【0175】
Ｈ３グリカンデンドリマーを、Ｈ３に高度に特異的な可変リンパ球受容体（ＶＬＲ）であるＶＬＲ Ｏ１３を発現する酵母クローンによるフローサイトメトリーによって試験した（Ｃｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２５（１１）：１６６７－７８ｅ４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｒ．２０１７．０９．００３（２０１７））。市販の多価Ｈ３－ＰＡＡ－ビオチンを陽性対照として用いた。これは以前に、Ｏ１３ ＹＳＤ細胞によるロバストな結合を示している。市販の一価Ｈ３－ｓｐ－ビオチンおよび非修飾８量体ＰＥＧビオチン／アルキンデンドリマーを陰性対照として用いた。
【0176】
結果は、Ｈ３－ＰＡＡ－ビオチンおよびＨ３グリカンデンドリマーが、Ｈ３グリカンデンドリマーについてよりも高くはないにしても同じように、Ｏ１３ ＹＳＤ細胞によって結合されていることを示した。非修飾８量体ＰＥＧビオチン／アルキンデンドリマーおよび一価Ｈ３－ｓｐ－ビオチンの双方が、Ｏ１３酵母による結合を示さなかった（図２Ｃ）。
【0177】
最初に記載したＨ－トリサッカライド（Ｈ３）デンドリマーの生成を、完全に繰り返した（Ｈ３のアジド化、アルキンデンドリマーへのカップリング、および機能アッセイ）。全てのデータは類似しており、再現可能であった。図２Ｅは、ＰＥＧ－アルキンデンドリマーの、Ｈ３－Ｎ３とのコンジュゲーション後の、ＰＤ１０画分の、Ｏ１３－ｈＩｇＧ抗Ｈ３抗体との反応性を示す。図２Ｆは、Ｏ１３－ｈＩｇＧ抗Ｈ３抗体の、Ｈ３－Ｎ３（Ｈ３－Ｎ３のみとコンジュゲートし、Ｈ３－デンドリマーとはコンジュゲートしなかった。これは、Ｈ３のＮ３修飾を実証するために行った）とコンジュゲートした、またはコンジュゲートしていないＤＢＣＯ磁気ビーズに対する反応性を示す。図２Ｇは、磁気ビーズにカップリングされたＨ３－デンドリマーが、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ Ａｕｒａｎｔｉａ）レクチン（ＡＡＬ、α結合フコースに特異的）に対して反応性であり、かつコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、マンノースに特異的）に対して非反応性であることを示す。
【0178】
結果は、Ｈ３特異的ＧＢＰ（抗Ｈ３抗体）に対する一価グリカン（２Ｈ型三糖抗原またはＨ３）が、フローサイトメトリーによって検出され得ないが、開示された足場によって作製された多量体Ｈ３への抗Ｈ３抗体ＧＢＰの結合が、フローサイトメトリーによって容易に検出されることを示す。モノマーＨ３：抗Ｈ３抗体相互作用についての解離定数（Ｋｄ）は、２×１０－６Ｍ／Ｌであると測定された。これは、グリカン：ＧＢＰ相互作用について、優れたＫｄと考えられる。すなわち、多くのグリカン：ＧＢＰ Ｋｄは＞１０－５Ｍ／Ｌであり、ことによると１０－３Ｍ／Ｌと非常に劣るかもしれない。グリカンのような小分子のＫｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎおよびｋｏｎは＞＞１０６Ｍ－１ｓ－１であるので、（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｐａｕｌ）Ｃｈａｐｔｅｒ ４ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｊａｙ Ａ．Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｉｒａ Ｊ．Ｂｅｒｋｏｗｅｒ，Ｓｕｚａｎｎｅ Ｌ．Ｅｐｓｔｅｉｎを参照）、ｋｏｆｆは、Ｋｄ＝２×１０－６Ｍ／Ｌについて＜＜２ｓ－１となり、モノマーＨ３：抗Ｈ３抗体複合体の半減期は＜＜ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆ＝０．３５ｓとなる。そのような一過性の複合体は、特異的に結合したリガンドの検出前に、非結合リガンド（Ｈ３グリカン）および非特異的に結合した物質を除去するのに必要な洗浄／インキュベーションに耐える可能性が低い。これは、実験データで示す通りである。すなわち、抗Ｈ３抗体に結合するモノマーＨ３は、フローサイトメトリーによって検出されず、さらに、開示される足場によるＨ３グリカンの多量体化は、フローサイトメトリーによって容易に検出される多量体Ｈ３：抗Ｈ３抗体複合体をもたらす。
【0179】
Ｈ３に加えて、ルイスＸ四糖、３’－および６’－ｓｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ、Ｇｌｏｂｏ－Ｎ－ペンタオース（Ｇｂ５）、ならびにＧｌｏｂｏ－Ｎ－テトラオース（Ｇｂ４）が挙げられるいくつかの他のグリカンが、アジド誘導体化されており、対応するグリカンデンドリマーを生成するのに用いられている。
【0180】
ウシフェチュイン、ＲＮＡｓｅ Ｂ、ニワトリ卵白アルブミン、およびヒトＴリンパ球細胞Ｊｕｒｋａｔ由来のＮ－グリカンが、酵素的に放出されており、このアプローチを天然に放出されたグリカンに用いることができることを確認するのに用いられることとなることとなる。
【0181】
要約すると、これらの実験は、クリックケミストリを用いたＨ２型三糖（Ｈ３）上のアジドタグの誘導体化および組込み、ならびにその後のＨ３グリカンデンドリマーの生成を例示する。フローサイトメトリー結合実験は、非修飾８量体ＰＥＧリンカーではなくＨ３グリカンデンドリマーが、市販のＨ３－ＰＡＡと同様のレベルまで、Ｏ１３ ＹＳＤ細胞によって効果的に結合されることを示した。これらの結果は、市販の、合成の、または天然に放出されるグリカンが挙げられるあらゆるグリカン（例えば、還元性末端を有する）の多価様式での誘導体化およびディスプレイ用のプラットフォームとしてのこの戦略の使用を支持する。一価グリカンは、そのグリカン結合パートナーとの非常に弱い相互作用しか有しておらず、天然と同様に、ロバストな結合を支持するのに多価グリカン提示が必要とされる。提供される多価グリカンデンドリマーを用いて、例えば、あらゆる生体系における新しいグリカン結合分子をスクリーニングして、グリカン依存性細胞表面受容体を阻害または活性化し、かつグリカン依存性病原体感染をブロックすることができる。
【0182】
これらの実験は、ビオチン機能化リンカーによるグリカンの多量体ディスプレイを支持するグリカンデンドリマーを例示する。あらゆる供給源由来の還元性末端を有するグリカンを機能化して、８量体ビオチンリンカーにカップリングさせることができる。これらの戦略は、現在市販されている多価グリカンポリマーの容易かつ適応可能な代替物を提供する。
【0183】
ビオチンハンドルは、実験的なフレキシビリティを提供する。例えば、フローサイトメトリー／ＦＡＣＳおよびイメージング実験のために蛍光タグを加えることができる。グリカンデンドリマーは、プルダウン実験のためにアビジン／ストレプトアビジンハンドルにより捕捉することもできる。アビジン／ストレプトアビジン機能化ビーズを用いることにより、グリカンデンドリマーを用いて、フローサイトメトリー設定においてグリカン結合分子をプローブすることができ、そして二官能性アミン－アビジンリンカーを用いることにより、グリカンデンドリマーをＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）またはＭｕｌｔｉＰｌｅｘ（登録商標）ビーズにカップリングさせて、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘ技術に適合させることができる。
【0184】
現在入手可能な市販の多価グリカンポリマーは、かなり限定されており、「小」グリカン（１～４つの単糖）に制限されており、今度は実験用途を制限している。提供されるグリカンデンドリマー技術は、炭水化物結合分子のプロービング、阻害アッセイ、およびグリカン誘導細胞シグナル伝達実験が挙げられる種々の用途に潜在的に利用可能な多価グリカンポリマーの数を大幅に増大させる。均質な精製グリカン、および糖タンパク質または複合組織から放出されたグリカンの異質なプールを誘導体化して、二官能性多価リンカーにカップリングさせて、多様な多価グリカンデンドリマーを作出することができる。
【0185】
加えて、提供される方法論は、多価二官能性デンドリマー上の細胞または組織グリコンの異質性を再構成する可能性を提供する。
【0186】
実施例２：ＮＨＳ／ＮＨ２カップリング化学を用いたグリカンデンドリマーの生成
材料および方法
８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ化合物へのＭａｎ５－／Ｍａｎ９－ＡＥＡＢのコンジュゲーション
８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ（ＮＨＳ基を含有する７本のアーム、ビオチン基を含有する１本のアーム）（平均分子量約２１ｋＤａ）を、カスタム化合物としてＣｒｅａｔｉｖｅＰＥＧＷｏｒｋｓから購入した。Ｍａｎ５－およびＭａｎ９－ＡＥＡＢ（１ｍｇ）を、ＮａｔＧｌｙｃａｎ ＬＬＣから購入した。
材料および方法
８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ化合物へのＭａｎ５－／Ｍａｎ９－ＡＥＡＢのコンジュゲーション
８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ（ＮＨＳ基を含有する７本のアーム、ビオチン基を含有する１本のアーム）（平均分子量約２１ｋＤａ）を、カスタム化合物としてＣｒｅａｔｉｖｅＰＥＧＷｏｒｋｓから購入した。Ｍａｎ５－およびＭａｎ９－ＡＥＡＢ（１ｍｇ）を、ＮａｔＧｌｙｃａｎ ＬＬＣから購入した。
【0187】
５００μｇのＭａｎ５－ＡＥＡＢ（約３６０ｎｍｏｌ）またはＭａｎ９－ＡＥＡＢ（約２４０ｎｍｏｌ）を、１．５ｍＬチューブ内で凍結乾燥させた。８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳを、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５中に２１ｍｇ／ｍＬにて再懸濁させた。１７．２μＬの８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ溶液（約１７．２ｎｍｏｌ）を、凍結乾燥したＭａｎ５－ＡＥＡＢを含有するチューブに加え、そして１１．５μＬの８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ溶液（約１１．５ｎｍｏｌ）を、凍結乾燥したＭａｎ９－ＡＥＡＢを含有するチューブに加えた。混合液を、穏やかに回転させながら室温にて３時間インキュベートした。反応を停止させて、２００μＬの１Ｍトリス、ｐＨ７．５を加えることによって、あらゆる未反応ＮＨＳ基をクエンチした。５，０００ ＭＷＣＯ Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５００フィルターユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、デンドリマー溶液のバッファをＰＢＳと交換した。グリカン－デンドリマーを、最後に、１ｍｇ／ｍＬにてＰＢＳ中に再懸濁させた。
【0188】
Ｃｏｒｅ １－Ｔｈｒ、Ｃｏｒｅ ２、３、４－Ｓｅｒの、８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ化合物へのコンジュゲーション
Ｃｏｒｅ １－Ｔｈｒ、Ｃｏｒｅ ２－Ｓｅｒ、Ｃｏｒｅ ３－Ｓｅｒ、およびＣｏｒｅ ４－Ｓｅｒを、カスタム製品としてＣｈｅｍｉｌｙ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
Ｃｏｒｅ １－Ｔｈｒ、Ｃｏｒｅ ２－Ｓｅｒ、Ｃｏｒｅ ３－Ｓｅｒ、およびＣｏｒｅ ４－Ｓｅｒを、カスタム製品としてＣｈｅｍｉｌｙ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【0189】
３５０ｎｍｏｌのＣｏｒｅ１－Ｔ（約５５０μｇ）、Ｃｏｒｅ２－Ｓ（約７５０μｇ）、Ｃｏｒｅ３－Ｓ（約５８０μｇ）、またはＣｏｒｅ４－Ｓ（約７８０μｇ）を、１．５ｍＬチューブ内で凍結乾燥させた。８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳを１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５中に２１ｍｇ／ｍＬにて再懸濁させた。５０μＬの８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ溶液（約５０ｎｍｏｌ）を、凍結乾燥したＣｏｒｅ１－ＴおよびＣｏｒｅ２、３、４－Ｓを含有するチューブに加えて、穏やかに回転させながら室温にて３時間インキュベートした。次いで、反応を停止させて、２００μＬの１Ｍトリス、ｐＨ７．５を加えることによって、あらゆる未反応ＮＨＳ基をクエンチした。最後に、５，０００ ＭＷＣＯ Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５００チューブ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、デンドリマー溶液をＰＢＳとバッファ交換した。グリカン－デンドリマーを、最後に、１ｍｇ／ｍＬにてＰＢＳ中に再懸濁させた。
【0190】
８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ化合物へのＧＰ１００１２０のコンジュゲーション
合成フィブロイン糖ペプチドＧＰ１００１２０（ＧＡＴ＊ＥＳ＊ＲＧＡＧＡＧＡ－ＮＨ２、式中、Ｓ＊＝Ｓｅｒ＊＝ＧａｌＮＡｃα－Ｏ－Ｓｅｒ、Ｔ＊＝Ｔｈｒ＊＝ＧａｌＮＡｃα－Ｏ－Ｔｈｒ（配列番号５）であり、Ｃ末端アミドを含む）を、Ｓｕｓｓｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。
合成フィブロイン糖ペプチドＧＰ１００１２０（ＧＡＴ＊ＥＳ＊ＲＧＡＧＡＧＡ－ＮＨ２、式中、Ｓ＊＝Ｓｅｒ＊＝ＧａｌＮＡｃα－Ｏ－Ｓｅｒ、Ｔ＊＝Ｔｈｒ＊＝ＧａｌＮＡｃα－Ｏ－Ｔｈｒ（配列番号５）であり、Ｃ末端アミドを含む）を、Ｓｕｓｓｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。
【0191】
３１２ｎｍｏｌのＧＰ１００１２０（約４４０μｇ）を、１．５ｍＬチューブ内で凍結乾燥させた。８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳを１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５中に２１ｍｇ／ｍＬにて再懸濁させた。１５μＬの８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ溶液（約１５ｎｍｏｌ）を、凍結乾燥したＧＰ１００１２０を含有するチューブに加えて、穏やかに回転させながら室温にて３時間インキュベートした。次いで、反応を停止させて、２００μＬの１Ｍトリス、ｐＨ７．５を加えることによって、あらゆる未反応ＮＨＳ基をクエンチした。最後に、５，０００ ＭＷＣＯ Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５００チューブ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、デンドリマー溶液をＰＢＳとバッファ交換した。グリカン－デンドリマーを、最後に、１ｍｇ／ｍＬにてＰＢＳ中に再懸濁させた。
【0192】
デンドリマーのレクチンアッセイ
グリカン－デンドリマーの検出を容易にするために、これを、そのビオチンハンドルを介して、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＭａｇｎａＢｉｎｄ（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にカップリングさせた。磁気ビーズの分離および洗浄を、ＤｙｎａＭａｇ（商標）－Ｓｐｉｎ Ｍａｇｎｅｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により実行した。３０μＬのビーズを、２００μＬのＰＢＳで１回洗浄してから、４４μＬのＰＢＳ中に再懸濁させた後に、６．３μＬのグリカン－デンドリマーを１ｍｇ／ｍＬにて加えた。ビーズ－デンドリマー混合液を、穏やかに回転させながら室温にて３０～４５分間インキュベートした。溶液の除去後、ビーズを、３滴のビオチン溶液（ストレプトアビジン／ビオチンブロッキングキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、穏やかに回転させながら室温にて３０分間インキュベートした。ビオチン溶液の除去後、ビーズを、２００μＬのＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）＋５％ＢＳＡ（３０～４５分）と、穏やかに回転させながら室温にてインキュベートすることによって、さらにブロックした。ＴＢＳ－５％ＢＳＡの除去後、ビーズをＰＢＳで１回洗浄して、５０μＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。
グリカン－デンドリマーの検出を容易にするために、これを、そのビオチンハンドルを介して、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＭａｇｎａＢｉｎｄ（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にカップリングさせた。磁気ビーズの分離および洗浄を、ＤｙｎａＭａｇ（商標）－Ｓｐｉｎ Ｍａｇｎｅｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により実行した。３０μＬのビーズを、２００μＬのＰＢＳで１回洗浄してから、４４μＬのＰＢＳ中に再懸濁させた後に、６．３μＬのグリカン－デンドリマーを１ｍｇ／ｍＬにて加えた。ビーズ－デンドリマー混合液を、穏やかに回転させながら室温にて３０～４５分間インキュベートした。溶液の除去後、ビーズを、３滴のビオチン溶液（ストレプトアビジン／ビオチンブロッキングキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、穏やかに回転させながら室温にて３０分間インキュベートした。ビオチン溶液の除去後、ビーズを、２００μＬのＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）＋５％ＢＳＡ（３０～４５分）と、穏やかに回転させながら室温にてインキュベートすることによって、さらにブロックした。ＴＢＳ－５％ＢＳＡの除去後、ビーズをＰＢＳで１回洗浄して、５０μＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。
【0193】
レクチンＣｏｎＡ、ＰＮＡ、ＧＳＬＩＩ、ＶＶＬ、およびＡＡＬを、ビオチン化タンパク質としてＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。アビジン－ＨＲＰを、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈから購入した。レクチン（０．５μｇ／ｍＬのＣｏｎＡおよび２μｇ／ｍＬの他の全てのレクチン）およびアビジン－ＨＲＰ（１：５００希釈）をＴＢＳ－１％ＢＳＡ中で、穏やかに回転させながら室温にて３０～４５分間インキュベートすることによって、レクチンおよびアビジン－ＨＲＰを予め複合体化した。アッセイあたり３μＬのデンドリマービーズを用いた。ビーズを、１００μＬのプレ複合体化レクチン－アビジン－ＨＲＰ溶液と、穏やかに回転させながら室温にて３０～４５分間インキュベートした。次いで、ビーズを、２５０μＬのＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ（Ａｂｃａｍ）をビーズに加えて、シグナル検出のために９６ウェルプレートに移した。
【0194】
結果
（先で用いたアルキン基の代わりに）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）反応基を有する８アーム－ＰＥＧ化合物（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）を用いて、追加のグリカンデンドリマーを生成した。ＮＨＳは、非常に単純な反応条件において、第一級アミンと反応して共有結合を形成する。
（先で用いたアルキン基の代わりに）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）反応基を有する８アーム－ＰＥＧ化合物（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）を用いて、追加のグリカンデンドリマーを生成した。ＮＨＳは、非常に単純な反応条件において、第一級アミンと反応して共有結合を形成する。
【0195】
ＡＥＡＢ（ＮａｔＧｌｙｃａｎ）によりタグ化したＭａｎ５およびＭａｎ９ Ｎ－グリカンは、Ｍａｎ５－およびＭａｎ９－デンドリマーを生成する。ＡＥＡＢタグは第一級アミンを有し、リン酸バッファ、ｐＨ８．５中でＮＨＳと反応する（図３Ａ～図３Ｃ）。Ｍａｎ５またはＭａｎ９ Ｎ－グリカンの組込みは、コンカナバリンＡレクチン（ＣｏｎＡ）に対する選択的反応性によって確認され、ピーナッツ凝集素レクチン（ＰＮＡ）に対しては確認されなかった。非修飾ＰＥＧ－ＮＨＳデンドリマーは、どちらのレクチンに対してもシグナルを示さなかった（図３Ｄ）。
【0196】
同じ８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ化合物を用いて、Ｏ－グリカンＣｏｒｅ１－Ｔｈｒ、Ｃｏｒｅ２、３、４－Ｓｅｒグリカン－アミノ酸（Ｃｈｅｍｉｌｙ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ）もカップリングさせて、Ｃｏｒｅ１、２、３、４－デンドリマーを生成した（図４Ａ～図４Ｂ）。Ｃｏｒｅ１－Ｔ－およびＣｏｒｅ２－Ｓ－デンドリマーは、Ｐｅａｎｕｔ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＮＡ、Ｔ抗原において見出されるように、ガラクトースに特異的）検出によって陽性であり、ＣｏｎＡおよびＧｒｉｆｆｏｎｉａ ＳｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａレクチンＩＩ（ＧＳＬＩＩ、末端αまたはβ結合Ｎ－アセチルグルコサミンに特異的）の双方について陰性であることが見出された（図４Ｃ）。同様に、Ｃｏｒｅ３－Ｓ－およびＣｏｒｅ４－Ｓ－デンドリマーは、ＰＮＡでは陰性でありながら、ＧＳＬＩＩに対して中程度の反応性および高い反応性をそれぞれ示した（図４Ｄ）。
【0197】
１つのセリンおよび１つのトレオニンに連結された２つのＧａｌＮａｃを含有する合成糖ペプチド（ＧＰ１００１２０、Ｓｕｓｓｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、同じ８アーム－ＰＥＧ－ＮＨＳ化合物にコンジュゲートした（図５Ａ～図５Ｃ）。ＧＰ１００１２０－デンドリマーは、Ｖｉｃｉａ Ｖｉｌｌｏｓａレクチン（ＶＶＬ、末端Ｎ－アセチルガラクトサミンに特異的）検出によって陽性であり、ＰＮＡ染色について陰性であることが見出された（図５Ｄ）。
【0198】
別段の定義がされない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で引用される刊行物およびこれに引用される材料は、参照により具体的に組み込まれる。
【0199】
当業者であれば、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または日常的な実験のみを用いて確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【配列表】
【国際調査報告】