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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】非免疫原性高密度ＰＯＥＧＭＡコンジュゲート
(51)【国際特許分類】
A61K 47/58 20170101AFI20240829BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20240829BHJP
A61P 19/06 20060101ALN20240829BHJP
【ＦＩ】
A61K47/58
A61K38/43
A61P19/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024512075
(86)(22)【出願日】2022-08-23
(85)【翻訳文提出日】2024-04-10
(86)【国際出願番号】 US2022041251
(87)【国際公開番号】W WO2023028072
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】63/236,064
(32)【優先日】2021-08-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507189666
【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100137626
【弁理士】
【氏名又は名称】田代 玄
(72)【発明者】
【氏名】チルコティ アシュトッシュ
(72)【発明者】
【氏名】オッツァー イムラン
(72)【発明者】
【氏名】ハックナル アンガス
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF67
4C084AA02
4C084DC50
(57)【要約】
有利な薬物動態を有し、減少した又は除去された宿主免疫応答も有する高密度ＰＯＥＧＭＡ－生物活性物質コンジュゲートが開示される。例となるコンジュゲートは、生物活性物質及び前記生物活性物質にコンジュゲートされた複数のＰＯＥＧＭＡ分子を含み、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子がポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖が縦列に繰り返されるエチレングリコールの２～９単量体を含む。ポリマー－生物活性物質コンジュゲートの免疫原性を減らす方法も開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物活性物質、及び前記生物活性物質にコンジュゲートされた複数のポリ［オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）分子であって、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子がポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖が縦列に繰り返されるエチレングリコール（ＥＧ）の２～９単量体を含む、ＰＯＥＧＭＡ分子
を含むコンジュゲートであって、
生物活性物質あたり約５～約１３０のＰＯＥＧＭＡ分子を含む、コンジュゲート。
【請求項2】
生物活性物質あたり約５～約１３０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項3】
抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答を誘発しない、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項4】
それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を独立して有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項5】
生物活性物質あたり約２５～約３０のＰＯＥＧＭＡ分子を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項6】
それぞれの側鎖が、縦列に繰り返されるＥＧの２～４単量体を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項7】
生物活性物質がウリカーゼを含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項8】
生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格にコンジュゲートされている、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項9】
生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子にウレタン結合を通じて個別にコンジュゲートされている、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項10】
それぞれの側鎖が第１の末端と第２の末端を有し、第１の末端が骨格に共有結合しており、第２の末端が、アルキル、エステル、アミン、アミド、又はカルボキシル基を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項11】
ポリマー－生物活性物質コンジュゲートの免疫原性を減少させる方法であって、約５～約１３０のポリ［オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）分子を生物活性物質にコンジュゲートする工程であって、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子がポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖が縦列に繰り返されるエチレングリコール（ＥＧ）の２～９の単量体を含むことによりコンジュゲートを提供する、工程を含み、
コンジュゲートが、生物活性物質あたり約５～約１３０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有する、方法。
【請求項12】
コンジュゲートが抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答を誘発しない、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、生物活性物質にコンジュゲートするのに先立って、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カーボネート基、アミン基、エステル基、アジド基、アルキン基、又はその組合せで官能化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格にコンジュゲートされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子にウレタン結合を通じて個別にコンジュゲートされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、生物活性物質に非部位特異的に個別にコンジュゲートされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項17】
それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を独立して有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項18】
コンジュゲートが、生物活性物質あたり約２５～約３０のＰＯＥＧＭＡ分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項19】
それぞれの側鎖が、縦列に繰り返されるＥＧの２～４単量体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項20】
それぞれの側鎖が第１の末端と第２の末端を有し、第１の末端が骨格に共有結合しており、第２の末端が、アルキル、エステル、アミン、アミド、又はカルボキシル基を含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月２３日提出の米国特許仮出願第６３／２３６，０６４号の優先権を主張するものであり、前記特許文献は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
連邦政府支援の研究に関する言明
本発明は、国立衛生研究所により与えられた認可番号Ｒ４１ ＴＲ００３２５５－０１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明にある特定の権利を有する。
本開示は、生物活性物質－ポリ［オリゴ（エチレングリコール）エーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）コンジュゲートに関する。
本出願は、２０２１年８月２３日提出の米国特許仮出願第６３／２３６，０６４号の優先権を主張するものであり、前記特許文献は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
連邦政府支援の研究に関する言明
本発明は、国立衛生研究所により与えられた認可番号Ｒ４１ ＴＲ００３２５５－０１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明にある特定の権利を有する。
本開示は、生物活性物質－ポリ［オリゴ（エチレングリコール）エーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【0002】
序論
タンパク質及び薬剤などの生物活性分子のペグ化は、バイオテクノロジーにおいて広範囲な用途を見出してきた。しかし、この広範囲な使用は、有害な免疫系結果をもたらすことがある。例としては、非修飾ウリカーゼは、そのサイズが小さいこと、高い免疫原性、及び生理的ｐＨでの低い溶解性のせいで薬剤として制限される。たとえペグ化ウリカーゼがこれらの問題の一部を軽減することができるとしても、その長期の有用性は、慢性抵抗性痛風などの疾患を処置するさいに制限されたままだった。例えば、臨床試験では、ペグロチカーゼ（ウリカーゼ四量体あたり平均して約３２のエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有している）により、最初の処置用量を投与後患者の９１％において有意なＰＥＧ特異的免疫応答を誘発し、薬物のクリアランスを加速しわずか２０～４９％の処置応答率しか生じない患者での抗薬物抗体（ＡＤＡ）の高力価がもたらされた。さらに、誘導されたＰＥＧ抗体による補体系の活性化のせいで以降の用量が投与されると、高力価のＰＥＧ抗体を有する患者の約５０％が輸注反応を経験し、２６％が重篤であり６．５％は生命を危うくするアナフィラキシーを特徴とした。さらに、ペグロチカーゼは、高ＰＥＧ特異的既存のＩｇＧ力価で、重篤な輸注反応をもたらした。全体として、これらの臨床問題は欧州市場からのこの薬剤の撤退をもたらし、他の場所でのその使用を制限した。
タンパク質及び薬剤などの生物活性分子のペグ化は、バイオテクノロジーにおいて広範囲な用途を見出してきた。しかし、この広範囲な使用は、有害な免疫系結果をもたらすことがある。例としては、非修飾ウリカーゼは、そのサイズが小さいこと、高い免疫原性、及び生理的ｐＨでの低い溶解性のせいで薬剤として制限される。たとえペグ化ウリカーゼがこれらの問題の一部を軽減することができるとしても、その長期の有用性は、慢性抵抗性痛風などの疾患を処置するさいに制限されたままだった。例えば、臨床試験では、ペグロチカーゼ（ウリカーゼ四量体あたり平均して約３２のエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有している）により、最初の処置用量を投与後患者の９１％において有意なＰＥＧ特異的免疫応答を誘発し、薬物のクリアランスを加速しわずか２０～４９％の処置応答率しか生じない患者での抗薬物抗体（ＡＤＡ）の高力価がもたらされた。さらに、誘導されたＰＥＧ抗体による補体系の活性化のせいで以降の用量が投与されると、高力価のＰＥＧ抗体を有する患者の約５０％が輸注反応を経験し、２６％が重篤であり６．５％は生命を危うくするアナフィラキシーを特徴とした。さらに、ペグロチカーゼは、高ＰＥＧ特異的既存のＩｇＧ力価で、重篤な輸注反応をもたらした。全体として、これらの臨床問題は欧州市場からのこの薬剤の撤退をもたらし、他の場所でのその使用を制限した。
【発明の概要】
【0003】
一態様では、生物活性物質、及び前記生物活性物質にコンジュゲートされた複数のＰＯＥＧＭＡ分子であって、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子がポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖が縦列（タンデム）に繰り返されるエチレングリコール（ＥＧ）の２～９単量体を含む、ＰＯＥＧＭＡ分子を含むコンジュゲートであって、生物活性物質あたり約５～約１３０のＰＯＥＧＭＡ分子を含む、コンジュゲートが提供される。
別の態様では、ポリマー－生物活性物質コンジュゲートの免疫原性を減少させる方法であって、約５～約１３０のＰＯＥＧＭＡ分子を生物活性物質にコンジュゲートする工程であって、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子がポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖が縦列に繰り返されるＥＧの２～９単量体を含むことによりコンジュゲートを提供する、工程を含み、コンジュゲートが生物活性物質あたり約５～約１３０のＰＥＧ分子を含むＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有する、方法が提供される。
本特許又は出願ファイルはカラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー画面（複数可）付の本特許又は特許出願公開のコピーは、請求があり必要料金が支払われ次第特許局により提供される。
別の態様では、ポリマー－生物活性物質コンジュゲートの免疫原性を減少させる方法であって、約５～約１３０のＰＯＥＧＭＡ分子を生物活性物質にコンジュゲートする工程であって、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子がポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖が縦列に繰り返されるＥＧの２～９単量体を含むことによりコンジュゲートを提供する、工程を含み、コンジュゲートが生物活性物質あたり約５～約１３０のＰＥＧ分子を含むＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有する、方法が提供される。
本特許又は出願ファイルはカラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー画面（複数可）付の本特許又は特許出願公開のコピーは、請求があり必要料金が支払われ次第特許局により提供される。
【図面の簡単な説明】
【0004】
【図1】図１は、実例ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲート合成の図式的概要である。（Ａ）ウリカーゼ－ｔ－ＥＬＰ（ＵＴＥ）の組換え発現及び精製。（Ｂ）ウリカーゼ四量体を産生するためのタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ媒介切断及び逆変換サイクリング（ＩＴＣ）による精製。（Ｃ）ＥＧ３単量体を使用してＯＨ－機能的ＰＯＥＧＭＡの電子移動原子移動ラジカル重合（ＡＲＧＥＴ－ＡＴＲＰ）により再生される活性化因子、続いて鎖末端ニトロフェニルカルボネート（ＮＰＣ）活性化。（Ｄ）ウリカーゼ四量体へのＮＰＣ－ＰＯＥＧＭＡのコンジュゲーション、実例ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートが得られる。
【図2】図２は、実例ウリカーゼコンジュゲートの合成及び特徴付けを示す。図２Ａは、ＴＥＶ－プロテアーゼ媒介ＵＴＥ切断のクーマシー染色されたドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析である。Ｌ１：ラダー；Ｌ２：（ｉ）非解離三量体ＵＴＥ、おそらく完全な解離を妨げるＥＬＰのせいで及び（ｉｉ）純粋な単量体；Ｌ３：（ｉｉｉ）Ｈｉｓ6－ＥＬＰ－ＴＥＶ及び（ｉｖ）その切詰め産物Ｈｉｓ6－ＥＬＰ；Ｌ４：ｔ＝０での反応混合物；Ｌ５：ｔ＝２０時間目の反応混合物で、（ｉｖ）遊離のウリカーゼ単量体及び（ｖ）切断ＥＬＰを示す；Ｌ６：ＩＴＣ精製ウリカーゼ単量体。図２Ｂは、ウリカーゼ変異体の一連のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）トレースである。１８～１９分及び１９～２１分に溶出するピークはそれぞれ天然の八量体（０．８質量％）及び四量体（９９．２質量％）ウリカーゼに対応しており、多角度光散乱により測定した。図２Ｃは、ウリカーゼ変異体の動的光散乱（ＤＬＳ）分析である。
【図3】図３は、実例ウリカーゼコンジュゲートの薬物動態（ＰＫ）分析を示す。３６．６ｎｍｏｌ ｋｇ-1の用量での単回ｉ．ｖ．投与後のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ｎ＝５）マウスにおける無菌、エンドトキシンフリー、及び蛍光標識された図３Ａ非修飾ウリカーゼ並びに図３Ｂウリカーゼコンジュゲートの血漿濃度。薬物の血漿濃度は、１４４時間の間の所定の時点で血液を収集し、続いて血液を血漿に処理し、プレートリーダーを使用して蛍光を測定することにより追跡した。データは、平均値±平均値の標準偏差（ＳＥＭ）を示した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を使用して１相指数関数的減衰曲線に合わせた。
【図4】図４は、異なる処置により誘導されたＡＤＡ応答を示す。図４Ａは、処置及び血液収集レジメンの模式図である（ｎ＝群あたり１０マウス）。ＡＤＡ応答は、検証されたＬｕｍｉｎｅｘマルチプレックスアッセイを使用してそれぞれのマウスについて測定した（ｎ＝血漿試料あたり６）。（図４Ｂ）１０日目及び（図４Ｃ）４４日目のＩｇＭ応答。（図４Ｄ）１０日目及び（図４Ｅ）４４日目のＩｇＧ応答。ＯＶＡ－ＰＥＧ結合ビーズ及びＯＶＡ－ＰＯＥＧＭＡ結合ビーズは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ウリカーゼ－ＰＥＧMW、及びウリカーゼＰＯＥＧＭＡで処置したマウスの血漿試料におけるＰＥＧ特異的及びＰＯＥＧＭＡ特異的免疫応答を示す。データは、マウスＩｇＧ結合ビーズ及びＩｇＭ結合ビーズ（正の対照）を用いて測定されたシグナルに正規化され、平均ＡＤＡ応答として処置群±ＳＥＭで表された。データは、二元配置反復分散分析ＡＮＯＶＡ、続いて事後検定チューキー多重比較検定により分析された。検定は、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意であると見なされた。****ｐ＜０．０００１。有意ではない（ｎｓ）。
【図5】図５は、ＰＥＧ抗体が実例ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートに対する反応性がないことを示す。ウリカーゼ、ウリカーゼ－ＰＥＧMW、及びウリカーゼＰＯＥＧＭＡに対するＰＥＧの反応性は、（図５Ａ）間接的及び（図５Ｂ）競合ＥＬＩＳＡを使用して検査した。間接的ＥＬＩＳＡでは、抗原はウェルプレート上に吸収され（ｎ＝４）、ＯＶＡ－ＰＥＧ－免疫化マウス血漿中に存在するポリクローナルＰＥＧ抗体と反応させた。競合ＥＬＩＳＡでは、エキセンディン－ＰＥＧはウェルプレート上に吸収された。抗原（ウリカーゼ、ウリカーゼ－ＰＥＧMW、及びウリカーゼＰＯＥＧＭＡ）（ｎ＝４）予混合ＯＶＡ－ＰＥＧ－処置マウス血漿は、存在するＰＥＧ抗体への結合を巡ってエキセンディン－ＰＥＧと競合した。データは平均吸収度±ＳＥＭを表し、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて事後検定チューキー多重比較検定を使用して分析された。検定は、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意であると見なされた。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、及び****ｐ＜０．０００１。有意ではない（ｎｓ）。
【発明を実施するための形態】
【0005】
タンパク質などの高度に免疫原性の分子の表面に潜在的な抗原の反復性高密度配列を置くと、抗体へのエピトープ曝露を変更し、並びにＩｇＭとＩｇＧクラス抗体の両方により導かれる高められた免疫応答を潜在的に誘発することがある。本出願の提出時には、生物活性物質上にＰＯＥＧＭＡを高密度で提示すると免疫系の反復ベースの活性化をもたらし、これによりＰＥＧ抗体に対する認識を変更しＰＯＥＧＭＡそれ自体に対する免疫応答を潜在的に発生させることができるのかどうかは分かっていなかった。
本開示は、高密度でさえ、ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートウリカーゼがＰＥＧ抗体と結合せず、依然として非免疫原性であることを見出した。これは、ＰＥＧ抗体と反応するだけではなく、おそらくウリカーゼの表面上のＰＥＧエピトープが高密度であるせいで、ＩｇＭとＩｇＧ抗体応答の両方も誘発した高密度ＰＥＧ－ウリカーゼ対応物とは対照的である。開示された高密度ＰＯＥＧＭＡ－ウリカーゼコンジュゲートは、そのＰＥＧ－ベースの対応物の免疫ベースの欠点を回避しただけではなく、開示されたコンジュゲートは、これらの対応物の薬物動態プロファイルよりも有意に優れていた。したがって、開示されたコンジュゲートは、類似するＰＥＧ－ベースの系と比べて優れたＰＫ利点を提供し、同時にこれらの同じＰＥＧ－ベースの系に関連する免疫系のピットホールも回避する。最後に、本開示の所見は、疾患の処置においてウリカーゼなどの生物活性物質の臨床的有用性を制限する問題を潜在的に解決することができる。
本開示は、高密度でさえ、ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートウリカーゼがＰＥＧ抗体と結合せず、依然として非免疫原性であることを見出した。これは、ＰＥＧ抗体と反応するだけではなく、おそらくウリカーゼの表面上のＰＥＧエピトープが高密度であるせいで、ＩｇＭとＩｇＧ抗体応答の両方も誘発した高密度ＰＥＧ－ウリカーゼ対応物とは対照的である。開示された高密度ＰＯＥＧＭＡ－ウリカーゼコンジュゲートは、そのＰＥＧ－ベースの対応物の免疫ベースの欠点を回避しただけではなく、開示されたコンジュゲートは、これらの対応物の薬物動態プロファイルよりも有意に優れていた。したがって、開示されたコンジュゲートは、類似するＰＥＧ－ベースの系と比べて優れたＰＫ利点を提供し、同時にこれらの同じＰＥＧ－ベースの系に関連する免疫系のピットホールも回避する。最後に、本開示の所見は、疾患の処置においてウリカーゼなどの生物活性物質の臨床的有用性を制限する問題を潜在的に解決することができる。
【0006】
１．定義
別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての専門用語及び科学用語は当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。対立がある場合には、定義を含む本文書が統制する。本明細書で開示される材料、方法、及び実施例は、説明に役立つだけであり、限定的であることを意図されていない。本明細書に記載される方法及び材料に類似する又は等価な方法及び材料は、開示された発明の実行又は試験において使用することができる。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は参照によりその全体を組み込まれる。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及びその変形は、本明細書で使用する場合、追加の行為又は構造の可能性を排除しないオープンエンド移行句、用語、又は単語であることが意図されている。単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明白に指示しなければ、複数の参照を含む。本開示は、はっきり述べられていようとそうでなかろうと、本明細書で提示される実施形態又は要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も想定する。
別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての専門用語及び科学用語は当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。対立がある場合には、定義を含む本文書が統制する。本明細書で開示される材料、方法、及び実施例は、説明に役立つだけであり、限定的であることを意図されていない。本明細書に記載される方法及び材料に類似する又は等価な方法及び材料は、開示された発明の実行又は試験において使用することができる。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は参照によりその全体を組み込まれる。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及びその変形は、本明細書で使用する場合、追加の行為又は構造の可能性を排除しないオープンエンド移行句、用語、又は単語であることが意図されている。単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明白に指示しなければ、複数の参照を含む。本開示は、はっきり述べられていようとそうでなかろうと、本明細書で提示される実施形態又は要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も想定する。
【0007】
本明細書での数値範囲の列挙では、同程度の正確さでその間のそれぞれの介在する数字は明白に想定されている。例えば、６～９の範囲では、数７及び８が６及び９に加えて想定されており、６．０～７．０の範囲では、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明白に想定されている。
量に関連して使用される修飾語「約（ａｂｏｕｔ）」は述べられた値を含み、文脈により指示される意味を有する（例えば、この用語は特定の量の測定に関連する少なくとも誤差の程度を含む）。修飾語「約（ａｂｏｕｔ）」は、２つの終点の絶対値により限定される範囲を開示するとも見なされるべきである。例えば、表現「約２～約４」は範囲「２～４」も開示する。用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、指示された数のプラス又はマイナス１０％を指してもよい。例えば、「約１０％」は、９％～１１％の範囲を指示してよく、「約１」は、０．９～１．１を意味してもよい。「約（ａｂｏｕｔ）」の他の意味は、四捨五入などの、文脈から明らかであってよく、したがって、例えば、「約１」は０．５～１．４を意味してもよい。
用語「アルキル」とは、１～１０炭素原子を含む直鎖状又は分岐状飽和炭化水素鎖のことである。用語「Ｃ1－Ｃ4アルキル」とは、１～４炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素を意味する。アルキルの代表的な例は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、及びｎ－ヘキシルを含むがこれらに限定されない。
量に関連して使用される修飾語「約（ａｂｏｕｔ）」は述べられた値を含み、文脈により指示される意味を有する（例えば、この用語は特定の量の測定に関連する少なくとも誤差の程度を含む）。修飾語「約（ａｂｏｕｔ）」は、２つの終点の絶対値により限定される範囲を開示するとも見なされるべきである。例えば、表現「約２～約４」は範囲「２～４」も開示する。用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、指示された数のプラス又はマイナス１０％を指してもよい。例えば、「約１０％」は、９％～１１％の範囲を指示してよく、「約１」は、０．９～１．１を意味してもよい。「約（ａｂｏｕｔ）」の他の意味は、四捨五入などの、文脈から明らかであってよく、したがって、例えば、「約１」は０．５～１．４を意味してもよい。
用語「アルキル」とは、１～１０炭素原子を含む直鎖状又は分岐状飽和炭化水素鎖のことである。用語「Ｃ1－Ｃ4アルキル」とは、１～４炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素を意味する。アルキルの代表的な例は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、及びｎ－ヘキシルを含むがこれらに限定されない。
【0008】
用語「アミド」とは、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ基のことであり、Ｒは水素、アルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、そのいずれも、例えば、１つ又は複数の置換基で置換されてもよい。
用語「抗原」とは、抗体又はＴ細胞受容体により結合されることができる分子のことである。用語「抗原」は、Ｔ細胞エピトープも包含する。抗原は、さらに免疫系により認識されることができる並びに／又はＢリンパ球及び／若しくはＴリンパ球の活性化をもたらす液性免疫応答及び／若しくは細胞性免疫応答を誘発することができる。一部の実施形態では、抗原は、Ｔｈ細胞エピトープを含む又はこれに連結されている。抗原は１つ又は複数のエピトープ（Ｂ－エピトープ及びＴ－エピトープ）を有することができる。抗原は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、小分子、ポリマー、ポリマーコンジュゲート、及びその組合せを含みうる。抗原はいくつかの個別の抗原の混合物でもよい。
用語「抗原性」とは、Ｔ細胞受容体又は抗体に特異的に結合する抗原の能力のことであり、対象中の既存の抗体に向かう抗原の反応性を含む。
用語「抗原」とは、抗体又はＴ細胞受容体により結合されることができる分子のことである。用語「抗原」は、Ｔ細胞エピトープも包含する。抗原は、さらに免疫系により認識されることができる並びに／又はＢリンパ球及び／若しくはＴリンパ球の活性化をもたらす液性免疫応答及び／若しくは細胞性免疫応答を誘発することができる。一部の実施形態では、抗原は、Ｔｈ細胞エピトープを含む又はこれに連結されている。抗原は１つ又は複数のエピトープ（Ｂ－エピトープ及びＴ－エピトープ）を有することができる。抗原は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、小分子、ポリマー、ポリマーコンジュゲート、及びその組合せを含みうる。抗原はいくつかの個別の抗原の混合物でもよい。
用語「抗原性」とは、Ｔ細胞受容体又は抗体に特異的に結合する抗原の能力のことであり、対象中の既存の抗体に向かう抗原の反応性を含む。
【0009】
用語「生物活性物質」とは、細胞、ウイルス、組織、器官、生物、又は同類の物に作用して、細胞、ウイルス、組織、器官、又は生物の機能に変化を生み出すことができる物質のことである。生物活性物質の例は、小分子薬物、脂質、タンパク質、ペプチド、及び核酸を含むがこれらに限定されない。生物活性物質は、対象において、状態若しくは疾患、又はその１つ若しくは複数の症状を処置する及び／又は回復させることができる。本開示の生物活性物質は、薬剤のプロドラッグ形態も含む。
用語「カルボキシル」とは－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ群のことであり、Ｒは水素、アルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、そのいずれも、例えば、１つ又は複数の置換基で置換されてもよい。
用語「有効量」又は「治療有効量」とは、有益な又は望ましい生物学的又は臨床結果をもたらすのに十分な量のことである。
用語「エステル」とは、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ群のことであり、Ｒは水素、アルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、そのいずれも、例えば、１つ又は複数の置換基で置換されてもよい。
用語「ヒドロキシル」又は「ヒドロキシ」とは、－ＯＨ基のことである。
用語「カルボキシル」とは－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ群のことであり、Ｒは水素、アルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、そのいずれも、例えば、１つ又は複数の置換基で置換されてもよい。
用語「有効量」又は「治療有効量」とは、有益な又は望ましい生物学的又は臨床結果をもたらすのに十分な量のことである。
用語「エステル」とは、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ群のことであり、Ｒは水素、アルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、そのいずれも、例えば、１つ又は複数の置換基で置換されてもよい。
用語「ヒドロキシル」又は「ヒドロキシ」とは、－ＯＨ基のことである。
【0010】
用語「免疫原性」とは、免疫応答を誘発する抗原の能力のことであり、対象において抗体を生み出す抗原の内因的能力を含む。本明細書で使用される場合、用語「抗原性」及び「免疫原性」とは、免疫系の異なる態様であり互換的ではない。
用語「対象」は、ヒト及び哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、及びウマ）を含む。本開示の典型的な対象は、哺乳動物、特に、霊長類、及び、特にヒトを含んでよい。獣医適用では、適切な対象は、例えば、畜牛、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタ、及び同類の物などの家畜；ニワトリ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウ、及び同類の物などの家禽、並びに飼育動物特にイヌ及びネコなどのペットを含んでよい。研究適用では、適切な対象は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、並びに近交系ブタ及び同類の物などのブタ、などの哺乳動物を含んでよい。
用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、疾患を予防する、抑制する、抑える、軽減する、又は完全に取り除くなどの、対象を疾患から防御することである。疾患を予防するは、本開示のコンジュゲートを疾患の発病に先立って対象に投与することを含む。疾患を抑制するは、疾患の誘導後しかしその臨床的所見前に本開示のコンジュゲートを対象に投与することを含む。疾患を抑える又は軽減するとは、疾患の臨床的所見後に本開示のコンジュゲートを対象に投与することを含む。
用語「対象」は、ヒト及び哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、及びウマ）を含む。本開示の典型的な対象は、哺乳動物、特に、霊長類、及び、特にヒトを含んでよい。獣医適用では、適切な対象は、例えば、畜牛、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタ、及び同類の物などの家畜；ニワトリ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウ、及び同類の物などの家禽、並びに飼育動物特にイヌ及びネコなどのペットを含んでよい。研究適用では、適切な対象は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、並びに近交系ブタ及び同類の物などのブタ、などの哺乳動物を含んでよい。
用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、疾患を予防する、抑制する、抑える、軽減する、又は完全に取り除くなどの、対象を疾患から防御することである。疾患を予防するは、本開示のコンジュゲートを疾患の発病に先立って対象に投与することを含む。疾患を抑制するは、疾患の誘導後しかしその臨床的所見前に本開示のコンジュゲートを対象に投与することを含む。疾患を抑える又は軽減するとは、疾患の臨床的所見後に本開示のコンジュゲートを対象に投与することを含む。
【0011】
２．コンジュゲート
生物活性物質及び前記生物活性物質にコンジュゲートした複数のＰＯＥＧＭＡ分子を含むコンジュゲートが本明細書で開示される。高密度のＰＯＥＧＭＡ分子を生物活性物質にコンジュゲートすることにより、コンジュゲートの全体的薬物動態を改善することができ、その免疫応答は、ＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少させる又は除去できることが見出されていた。減少した又は除去された免疫応答は、減少した又は除去された抗原性と開示された生物活性物質－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートの減少した又は除去された免疫原性の両方を含む。したがって、開示されたコンジュゲートは、対象の免疫系と有益な相互作用を有することができる。
コンジュゲートが抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答を誘発しないことがあるという点でも、コンジュゲートの有益な免疫相互作用を見ることができる。抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答は、ＩｇＧクラス抗体を誘発すること、ＩｇＭクラス抗体を誘発すること、ＩｇＥクラス抗体を誘発すること、ＩｇＡクラス抗体を誘発すること、又はその組合せを含むことができる。したがって、一部の実施形態では、コンジュゲートは、抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＧクラス抗体、抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＭクラス抗体、抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＥクラス抗体、抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＡクラス抗体、又はその組合せを誘発しない。一部の実施形態では、コンジュゲートは、抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＧクラス抗体、及び／又は抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＭクラス抗体を誘発しない。さらに、コンジュゲートは、抗ＰＥＧ抗体と反応性でなくてよい。一部の実施形態では、コンジュゲートは、対象において既存の抗ＰＥＧ抗体と反応性ではない。開示されたコンジュゲートの免疫特性は、下の実施例に記載されている通りに評価することができる。
生物活性物質及び前記生物活性物質にコンジュゲートした複数のＰＯＥＧＭＡ分子を含むコンジュゲートが本明細書で開示される。高密度のＰＯＥＧＭＡ分子を生物活性物質にコンジュゲートすることにより、コンジュゲートの全体的薬物動態を改善することができ、その免疫応答は、ＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少させる又は除去できることが見出されていた。減少した又は除去された免疫応答は、減少した又は除去された抗原性と開示された生物活性物質－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートの減少した又は除去された免疫原性の両方を含む。したがって、開示されたコンジュゲートは、対象の免疫系と有益な相互作用を有することができる。
コンジュゲートが抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答を誘発しないことがあるという点でも、コンジュゲートの有益な免疫相互作用を見ることができる。抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答は、ＩｇＧクラス抗体を誘発すること、ＩｇＭクラス抗体を誘発すること、ＩｇＥクラス抗体を誘発すること、ＩｇＡクラス抗体を誘発すること、又はその組合せを含むことができる。したがって、一部の実施形態では、コンジュゲートは、抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＧクラス抗体、抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＭクラス抗体、抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＥクラス抗体、抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＡクラス抗体、又はその組合せを誘発しない。一部の実施形態では、コンジュゲートは、抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＧクラス抗体、及び／又は抗ＰＯＥＧＭＡ ＩｇＭクラス抗体を誘発しない。さらに、コンジュゲートは、抗ＰＥＧ抗体と反応性でなくてよい。一部の実施形態では、コンジュゲートは、対象において既存の抗ＰＥＧ抗体と反応性ではない。開示されたコンジュゲートの免疫特性は、下の実施例に記載されている通りに評価することができる。
【0012】
ＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートに関して、このコンジュゲートは、抗原性、免疫原性、又は両方を減少させる又は除去することを評価する場合に、開示されたコンジュゲートを比較する物に関して対照と見なすことができる。対照は類似する分子量であることが可能である。対照は、それが縦列に連続するエチレングリコール単量体の開示された数よりも多くを有する限り、分岐状でも直線状でも可能である。例えば、適切な対照ＰＥＧは、９個よりも多い縦列に連続するエチレングリコール単量体を有する直線状又は分岐状ＰＥＧを含むことができる。
【0013】
対照は、生物活性物質にコンジュゲートされた類似する量のＰＥＧ分子（ＰＯＥＧＭＡ分子と比べて）も有することができる。例えば、開示されたコンジュゲートは、生物活性物質あたり約１０～約１２０ＰＥＧ分子、生物活性物質あたり約１５～約１００ＰＥＧ分子、生物活性物質あたり約２０～約８０ＰＥＧ分子、生物活性物質あたり約１０～約５０ＰＥＧ分子、生物活性物質あたり約１５～約４０ＰＥＧ分子、生物活性物質あたり約１０～約３５ＰＥＧ分子、生物活性物質あたり約２０～約３０ＰＥＧ分子、又は生物活性物質あたり約２５～約３０ＰＥＧ分子、などの生物活性物質あたり約５～約１３０ＰＥＧ分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有することができる。一部の実施形態では、開示されたコンジュゲートは、生物活性物質あたり約３０ＰＥＧ分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有する。一部の実施形態では、対照の生物活性物質はウリカーゼである。
【0014】
有利な免疫応答特性に加えて、開示されたコンジュゲートは改善された薬物動態も有することができる。例えば、コンジュゲートは、４５時間よりも大きな又はこれに等しいｔ1/2排出、少なくとも４５ｎＭのＣo、少なくとも２７００ｎＭ×ｈのＡＵＣ、又はその組合せを有することができる。さらに、開示されたコンジュゲートは、本明細書に記載されるＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲート対照（例えば、生物活性物質あたり約５～約１３０ＰＥＧ分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲート）と比べて改善された薬物動態を有することができる。例えば、コンジュゲートは、ＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲート対照のＣoの少なくとも１．１倍のＣo；ＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲート対照のｔ1/2排出の少なくとも１．３倍のｔ1/2排出；ＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲート対照のＡＵＣの少なくとも１．４倍のＡＵＣ；又はその組合せを有することができる。開示されたコンジュゲートの薬物動態プロファイルは、下の実施例に記載される通りに評価することができる。
【0015】
コンジュゲートは、部分的に、生物活性物質及びＰＯＥＧＭＡ分子のために異なる流体力学サイズ（Ｒh）を有しうる。例えば、コンジュゲートは、約３ｎｍ～約１０ｎｍ又は約４ｎｍ～約９ｎｍなどの約２ｎｍ～約１２ｎｍの流体力学サイズを有することがある。一部の実施形態では、コンジュゲートは、約８．６ｎｍよりも大きな流体力学サイズを有し、このサイズは腎排泄を回避するのに有用になれる。流体力学サイズは、動的光散乱などの当技術分野内で使用される技法により測定可能である。
【0016】
Ａ．生物活性物質
コンジュゲートは生物活性物質を含む。多種多様な異なる生物活性物質を、本開示の高密度ＰＯＥＧＭＡと一緒に使用してよい。例は、モノクローナル抗体、血液因子、ベータトロフィン、エキセンディン、酵素、アスパラギナーゼ、グルタマーゼ（ｇｌｕｔａｍａｓｅ）、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミアーゼ（ＡＤＡ）、ＡＤＡ－２、リボヌクレアーゼ、シトシンデアミナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトロピン、ソマトレム、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、凝固因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、胃腸ペプチド、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、セクレチン、エリスロポエチン、成長ホルモン、ＧＲＦ、バソプレシン、オクトレオチド、膵臓酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン、黄体ホルモン、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン、インターロイキン－１、インターロイキン－１５、インターロイキン－２、インターロイキン－１０、コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ＲＡ）、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、エキセナチド、ＧＬＰ－１ Ｒマルチアゴニスト、ＧＬＰ－１ Ｒアンタゴニスト、ＧＬＰ－２、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、レプチン、グレリン、顆粒白血球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロン、インターフェロン－α、インターフェロン－ガンマ、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びアンタゴニスト、マクロファージ活性化因子、絨毛性ゴナドトロピン、ヘパリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヘモグロビン、リラキシン、シクロスポリン、オキシトシン、ワクチン、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アンキリンリピートタンパク質、アフィボディー、アクチビン受容体２Ａ細胞外ドメイン、アルファ－２マクログロブリン、アルファ－メラニン細胞、アペリン、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ－４）、エラフィン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、ヘプシジン、インフェスチン－４、カリクレイン阻害剤、Ｌ４Ｆペプチド、ラクリチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、チオレドキシン、チモシンＢ４、ウリカーゼ、ウロジラチン、アプタマー、サイレンシングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、リボザイム、その類似物及び誘導体、並びにその組合せを含むがこれらに限定されない。
コンジュゲートは生物活性物質を含む。多種多様な異なる生物活性物質を、本開示の高密度ＰＯＥＧＭＡと一緒に使用してよい。例は、モノクローナル抗体、血液因子、ベータトロフィン、エキセンディン、酵素、アスパラギナーゼ、グルタマーゼ（ｇｌｕｔａｍａｓｅ）、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミアーゼ（ＡＤＡ）、ＡＤＡ－２、リボヌクレアーゼ、シトシンデアミナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトロピン、ソマトレム、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、凝固因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、胃腸ペプチド、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、セクレチン、エリスロポエチン、成長ホルモン、ＧＲＦ、バソプレシン、オクトレオチド、膵臓酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン、黄体ホルモン、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン、インターロイキン－１、インターロイキン－１５、インターロイキン－２、インターロイキン－１０、コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ＲＡ）、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、エキセナチド、ＧＬＰ－１ Ｒマルチアゴニスト、ＧＬＰ－１ Ｒアンタゴニスト、ＧＬＰ－２、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、レプチン、グレリン、顆粒白血球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロン、インターフェロン－α、インターフェロン－ガンマ、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びアンタゴニスト、マクロファージ活性化因子、絨毛性ゴナドトロピン、ヘパリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヘモグロビン、リラキシン、シクロスポリン、オキシトシン、ワクチン、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アンキリンリピートタンパク質、アフィボディー、アクチビン受容体２Ａ細胞外ドメイン、アルファ－２マクログロブリン、アルファ－メラニン細胞、アペリン、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ－４）、エラフィン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、ヘプシジン、インフェスチン－４、カリクレイン阻害剤、Ｌ４Ｆペプチド、ラクリチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、チオレドキシン、チモシンＢ４、ウリカーゼ、ウロジラチン、アプタマー、サイレンシングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、リボザイム、その類似物及び誘導体、並びにその組合せを含むがこれらに限定されない。
【0017】
一部の実施形態では、生物活性物質は、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質、小分子薬物、又はその組合せを含む。一部の実施形態では、生物活性物質は、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドを含む。一部の実施形態では、生物活性物質は、タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドを含む。一部の実施形態では、生物活性物質はタンパク質を含む。一部の実施形態では、生物活性物質はウリカーゼを含む。
【0018】
ｉ．ウリカーゼ
一部の実施形態では、生物活性物質はウリカーゼである。ウリカーゼは、アラントイン、過酸化水素、及び二酸化炭素への尿酸の酸化を触媒できる４つの同一単量体を含む四量体タンパク質である。尿酸は、炎症及び危険信号を含む種々の過程で複雑な生理的役割を有する。さらに、現代のプリン豊富な食餌は高尿酸血症をもたらすことがあり、これは痛風を発症するリスクの増加を含む多くの疾患に関連している。したがって、ウリカーゼ、及び尿酸の酸化を触媒するその能力は、痛風などの尿酸により影響を受けることがある疾患を処置する方法において使用することができる。
ウリカーゼは限られた凝集を有することができる。例えば、ウリカーゼ及び／又はコンジュゲートは、ウリカーゼ凝集体が本質的にない場合がある。一部の実施形態では、ウリカーゼ及び／又はコンジュゲートは、ウリカーゼ凝集体がない。さらに、ウリカーゼ及び／又はコンジュゲートは、限られた量の存在するウリカーゼ八量体を有することがある。例えば、ウリカーゼ及び／又はコンジュゲートは、ウリカーゼの１．５質量％未満の八量体、ウリカーゼの１質量％未満の八量体、ウリカーゼの０．９質量％未満の八量体、ウリカーゼの０．８質量％未満の八量体、ウリカーゼの０．７質量％未満の八量体、ウリカーゼの０．６質量％未満の八量体、又はウリカーゼの０．５質量％未満の八量体を有することがある。
ウリカーゼは、ＰＯＥＧＭＡ分子にコンジュゲートされると活性を維持しうる。例えば、コンジュゲートは、約１０Ｕ／ｍｇウリカーゼ～約１８Ｕ／ｍｇウリカーゼ、約１０．５Ｕ／ｍｇウリカーゼ～約１６Ｕ／ｍｇウリカーゼ、又は約１１Ｕ／ｍｇウリカーゼ～約１４Ｕ／ｍｇウリカーゼ、などの約１０Ｕ／ｍｇウリカーゼ～約２０Ｕ／ｍｇウリカーゼのウリカーゼ活性を有しうる。
一部の実施形態では、生物活性物質はウリカーゼである。ウリカーゼは、アラントイン、過酸化水素、及び二酸化炭素への尿酸の酸化を触媒できる４つの同一単量体を含む四量体タンパク質である。尿酸は、炎症及び危険信号を含む種々の過程で複雑な生理的役割を有する。さらに、現代のプリン豊富な食餌は高尿酸血症をもたらすことがあり、これは痛風を発症するリスクの増加を含む多くの疾患に関連している。したがって、ウリカーゼ、及び尿酸の酸化を触媒するその能力は、痛風などの尿酸により影響を受けることがある疾患を処置する方法において使用することができる。
ウリカーゼは限られた凝集を有することができる。例えば、ウリカーゼ及び／又はコンジュゲートは、ウリカーゼ凝集体が本質的にない場合がある。一部の実施形態では、ウリカーゼ及び／又はコンジュゲートは、ウリカーゼ凝集体がない。さらに、ウリカーゼ及び／又はコンジュゲートは、限られた量の存在するウリカーゼ八量体を有することがある。例えば、ウリカーゼ及び／又はコンジュゲートは、ウリカーゼの１．５質量％未満の八量体、ウリカーゼの１質量％未満の八量体、ウリカーゼの０．９質量％未満の八量体、ウリカーゼの０．８質量％未満の八量体、ウリカーゼの０．７質量％未満の八量体、ウリカーゼの０．６質量％未満の八量体、又はウリカーゼの０．５質量％未満の八量体を有することがある。
ウリカーゼは、ＰＯＥＧＭＡ分子にコンジュゲートされると活性を維持しうる。例えば、コンジュゲートは、約１０Ｕ／ｍｇウリカーゼ～約１８Ｕ／ｍｇウリカーゼ、約１０．５Ｕ／ｍｇウリカーゼ～約１６Ｕ／ｍｇウリカーゼ、又は約１１Ｕ／ｍｇウリカーゼ～約１４Ｕ／ｍｇウリカーゼ、などの約１０Ｕ／ｍｇウリカーゼ～約２０Ｕ／ｍｇウリカーゼのウリカーゼ活性を有しうる。
【0019】
Ｂ．ＰＯＥＧＭＡ
ＰＯＥＧＭＡは、コンジュゲートに有利なステルス及び免疫系特性を植え付けることができる。ＰＯＥＧＭＡは、ポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有する。側鎖はエチレングリコール（ＥＧ）のオリゴマーである。例えば、それぞれの側鎖は、縦列に繰り返されるＥＧの２～８単量体、縦列に繰り返されるＥＧの２～７単量体、縦列に繰り返されるＥＧの２～６単量体、縦列に繰り返されるＥＧの２～５単量体、又は縦列に繰り返されるＥＧの２～４単量体、などの縦列に繰り返されるＥＧの２～９単量体を含むことができる。一部の実施形態では、それぞれの側鎖は縦列に繰り返されるＥＧの３単量体を含む。
コンジュゲートは、有害な免疫応答を誘発せずにＰＯＥＧＭＡを高密度で含むことができる。コンジュゲートは、生物活性物質あたり約１０～約１２０ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約１５～約１００ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約２０～約８０ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約１０～約５０ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約１５～約４０ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約１０～約３５ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約２０～約３０ＰＯＥＧＭＡ分子、又は生物活性物質あたり約２５～約３０ＰＯＥＧＭＡ分子、などの、生物活性物質あたり約５～約１３０ＰＯＥＧＭＡ分子を含むことができる。
ＰＯＥＧＭＡは、コンジュゲートに有利なステルス及び免疫系特性を植え付けることができる。ＰＯＥＧＭＡは、ポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有する。側鎖はエチレングリコール（ＥＧ）のオリゴマーである。例えば、それぞれの側鎖は、縦列に繰り返されるＥＧの２～８単量体、縦列に繰り返されるＥＧの２～７単量体、縦列に繰り返されるＥＧの２～６単量体、縦列に繰り返されるＥＧの２～５単量体、又は縦列に繰り返されるＥＧの２～４単量体、などの縦列に繰り返されるＥＧの２～９単量体を含むことができる。一部の実施形態では、それぞれの側鎖は縦列に繰り返されるＥＧの３単量体を含む。
コンジュゲートは、有害な免疫応答を誘発せずにＰＯＥＧＭＡを高密度で含むことができる。コンジュゲートは、生物活性物質あたり約１０～約１２０ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約１５～約１００ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約２０～約８０ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約１０～約５０ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約１５～約４０ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約１０～約３５ＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり約２０～約３０ＰＯＥＧＭＡ分子、又は生物活性物質あたり約２５～約３０ＰＯＥＧＭＡ分子、などの、生物活性物質あたり約５～約１３０ＰＯＥＧＭＡ分子を含むことができる。
【0020】
一部の実施形態では、コンジュゲートは、生物活性物質あたり５よりも多いＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり６よりも多いＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり７よりも多いＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり８よりも多いＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり９よりも多いＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり１０よりも多いＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり１５よりも多いＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり２０よりも多いＰＯＥＧＭＡ分子、又は生物活性物質あたり２５よりも多いＰＯＥＧＭＡ分子を含む。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、生物活性物質あたり１００未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり９０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり８０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり７０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり６０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり５０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり４０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり３５未満のＰＯＥＧＭＡ分子、又は生物活性物質あたり３０未満のＰＯＥＧＭＡ分子を含む。
隣接する側鎖は、同じＰＯＥＧＭＡ分子内で同じでもよく、又は異なっていてもよい。例えば、一側鎖は、縦列に繰り返されるＥＧの３単量体を有してよく、別の側鎖（同じＰＯＥＧＭＡ分子中の）は縦列に繰り返されるＥＧの４単量体を有してよい。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、生物活性物質あたり１００未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり９０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり８０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり７０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり６０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり５０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり４０未満のＰＯＥＧＭＡ分子、生物活性物質あたり３５未満のＰＯＥＧＭＡ分子、又は生物活性物質あたり３０未満のＰＯＥＧＭＡ分子を含む。
隣接する側鎖は、同じＰＯＥＧＭＡ分子内で同じでもよく、又は異なっていてもよい。例えば、一側鎖は、縦列に繰り返されるＥＧの３単量体を有してよく、別の側鎖（同じＰＯＥＧＭＡ分子中の）は縦列に繰り返されるＥＧの４単量体を有してよい。
【0021】
それぞれの側鎖は、第１の末端と第２の末端を有することができる。第１の末端は骨格に共有結合することができる。第２の末端は遊離していることが可能である。第２の末端は修飾されてもよい。一部の実施形態では、それぞれの第２の末端は、アルキル、エステル、アミン、アミド、又はカルボキシル基を独立して含む。一部の実施形態では、それぞれの第２の末端は、アルキルを含む。一部の実施形態では、それぞれの第２の末端は、Ｃ1－Ｃ4アルキルを含む。一部の実施形態では、それぞれの第２の末端はメチル基を含む。一部の実施形態では、それぞれの第２の末端は、ヒドロキシル基を含まない。
それぞれの側鎖の第２の末端は、同じＰＯＥＧＭＡ分子中の隣接する側鎖の第２の末端と同じでも又は異なっていてもよい。一部の実施形態では、それぞれの側鎖の第２の末端は、ＰＯＥＧＭＡ全体を通じて同じである。一部の実施形態では、少なくとも１つの側鎖の第２の末端は、少なくとも１つの隣接する側鎖の第２の末端とは異なっている。
さらに、骨格は、第１の末端と第２の末端を有することができる。
ＰＯＥＧＭＡは変化する分子量を有することができる。例えば、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、約２，０００Ｄａ～約９０，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ～約８０，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ～約７０，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ～約６０，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ～約５０，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ～約３０，０００Ｄａ、又は約９，０００Ｄａ～約２０，０００Ｄａなどの約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を独立して有することができる。一部の実施形態では、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、約１０，０００Ｄａの重量平均分子量を独立して有する。ＰＯＥＧＭＡの分子量は、ＳＥＣ、多角度光散乱と組み合わせたＳＥＣ、ゲル浸透クロマトグラフィー、及び同類の物などの、当技術分野内で使用される技法により測定することができる。
ＰＯＥＧＭＡ、その合成、及びその適用に関するさらなる考察は、米国特許第８，４９７，３５６号及び米国特許第１０，３６４，４５１号に見出せる。前記特許文献の両方は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
それぞれの側鎖の第２の末端は、同じＰＯＥＧＭＡ分子中の隣接する側鎖の第２の末端と同じでも又は異なっていてもよい。一部の実施形態では、それぞれの側鎖の第２の末端は、ＰＯＥＧＭＡ全体を通じて同じである。一部の実施形態では、少なくとも１つの側鎖の第２の末端は、少なくとも１つの隣接する側鎖の第２の末端とは異なっている。
さらに、骨格は、第１の末端と第２の末端を有することができる。
ＰＯＥＧＭＡは変化する分子量を有することができる。例えば、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、約２，０００Ｄａ～約９０，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ～約８０，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ～約７０，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ～約６０，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ～約５０，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ～約３０，０００Ｄａ、又は約９，０００Ｄａ～約２０，０００Ｄａなどの約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を独立して有することができる。一部の実施形態では、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、約１０，０００Ｄａの重量平均分子量を独立して有する。ＰＯＥＧＭＡの分子量は、ＳＥＣ、多角度光散乱と組み合わせたＳＥＣ、ゲル浸透クロマトグラフィー、及び同類の物などの、当技術分野内で使用される技法により測定することができる。
ＰＯＥＧＭＡ、その合成、及びその適用に関するさらなる考察は、米国特許第８，４９７，３５６号及び米国特許第１０，３６４，４５１号に見出せる。前記特許文献の両方は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【0022】
Ｃ．コンジュゲートの合成
コンジュゲートを作製する方法も開示される。方法は、ＰＯＥＧＭＡ分子をコンジュゲートすることを含み、それぞれの分子はポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖は生物活性物質に縦列に繰り返されるＥＧの２～９単量体を含んでコンジュゲートを提供することができる。
それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、その側鎖の少なくとも１つ、その骨格、又はその組合せを通じて生物活性物質にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、生物活性物質は、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の側鎖に又はそれぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、生物活性物質は、ＰＯＥＧＭＡ分子の第１のセットの側鎖に及びＰＯＥＧＭＡ分子の第２のセットの骨格にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、生物活性物質は、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、生物活性物質は、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格の末端にコンジュゲートされる。ＰＯＥＧＭＡ分子は、生物活性物質に非部位特異的にコンジュゲートすることができる。
コンジュゲートを作製する方法も開示される。方法は、ＰＯＥＧＭＡ分子をコンジュゲートすることを含み、それぞれの分子はポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖は生物活性物質に縦列に繰り返されるＥＧの２～９単量体を含んでコンジュゲートを提供することができる。
それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、その側鎖の少なくとも１つ、その骨格、又はその組合せを通じて生物活性物質にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、生物活性物質は、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の側鎖に又はそれぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、生物活性物質は、ＰＯＥＧＭＡ分子の第１のセットの側鎖に及びＰＯＥＧＭＡ分子の第２のセットの骨格にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、生物活性物質は、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、生物活性物質は、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格の末端にコンジュゲートされる。ＰＯＥＧＭＡ分子は、生物活性物質に非部位特異的にコンジュゲートすることができる。
【0023】
ＰＯＥＧＭＡ分子は、当技術分野内で公知のあらゆる適切なコンジュゲーション戦略を通じて生物活性物質にコンジュゲートすることができる。例えば、生物活性物質とそれぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、それぞれが、適切な条件下において官能基間で共有結合を形成できる点で互いに相補的である官能基を独立して有してもよい。共有結合を形成できる代表的な相補的官能基は、アミンと活性化エステル、アミンとイソシアネート、アミンとイソチオシアネート、アミンとカーボネート、ジスルフィドの形成用のチオール、エナミン形成用のアルデヒドとアミン、及びシュタウディンガーライゲーションを介するアミドの形成用のアジドを含むがこれらに限定されない。官能基に応じて、異なる結合又は連鎖を生物活性物質とＰＯＥＧＭＡ分子の間で形成することができる。一部の実施形態では、生物活性物質はそれぞれのＰＯＥＧＭＡ分子にウレタン結合を通じて個別にコンジュゲートされている。
【0024】
それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、その骨格で又は側鎖で官能化されることができる。一部の実施形態では、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、その骨格の末端で官能化される。一部の実施形態では、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カーボネート基、アミン基、エステル基、アジド基、アルキン基、又はその組合せで官能化される。一部の実施形態では、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、カーボネート基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はエステル基で官能化される。一部の実施形態では、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、カーボネート基、又はヒドロキシル基で官能化される。一部の実施形態では、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子は、カーボネート基で官能化される。一部の実施形態では、それぞれのＰＯＥＧＭＡは、ニトロフェニルカーボネート基で官能化される。
一部の実施形態では、生物活性物質はウリカーゼであり、ウリカーゼは官能化されていない。例えば、ウリカーゼは四量体で存在する１２８リジンを有する。したがって、ウリカーゼは、官能化されていない場合でもＰＯＥＧＭＡ分子に対して１２８までのコンジュゲーション部位を有することができる。一部の実施形態では、ウリカーゼは、例えば、ウレタン結合を通じてリジンを介してそれぞれのＰＯＥＧＭＡにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、それぞれのＰＯＥＧＭＡは、その骨格の末端でニトロフェニルカーボネート基で官能化され、ウレタン結合を通じてウリカーゼのリジンにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、生物活性物質はウリカーゼであり、ウリカーゼは官能化されていない。例えば、ウリカーゼは四量体で存在する１２８リジンを有する。したがって、ウリカーゼは、官能化されていない場合でもＰＯＥＧＭＡ分子に対して１２８までのコンジュゲーション部位を有することができる。一部の実施形態では、ウリカーゼは、例えば、ウレタン結合を通じてリジンを介してそれぞれのＰＯＥＧＭＡにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、それぞれのＰＯＥＧＭＡは、その骨格の末端でニトロフェニルカーボネート基で官能化され、ウレタン結合を通じてウリカーゼのリジンにコンジュゲートされる。
【0025】
ウリカーゼは、凝集体形成を最小限の抑える様式でコンジュゲーションに先立って修飾してよい。商業業者製の組換えウリカーゼは、約８６％までの凝集体を含むことがあり、このせいでコンジュゲート合成でのその有用性を妨げることがある。本明細書で開示されるウリカーゼは、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）との融合タンパク質の一部として発現されることによりこの問題を克服できる。例えば、ＥＬＰは、遺伝子レベルでウリカーゼ単量体のＣ末端に融合させることができる。タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）などの、プロテアーゼ切断部位は、ＥＬＰとウリカーゼ単量体の中間に挿入できる。プロテアーゼ切断部位は、発現後ＥＬＰからウリカーゼを遊離させることができる。一部の実施形態では、ウリカーゼは、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌発現系において組換え的に発現される。
方法は、ＳＥＣなどの、当技術分野内で公知の技法によりコンジュゲートを精製することをさらに含むことができる。さらに、ＥＬＰを使用すれば、融合タンパク質の精製方法において逆変換サイクリング（ＩＴＣ）を実施することができる。
コンジュゲート、生物活性物質、ウリカーゼ、及びＰＯＥＧＭＡの説明は、コンジュゲートを作製する方法にも適用できる。
方法は、ＳＥＣなどの、当技術分野内で公知の技法によりコンジュゲートを精製することをさらに含むことができる。さらに、ＥＬＰを使用すれば、融合タンパク質の精製方法において逆変換サイクリング（ＩＴＣ）を実施することができる。
コンジュゲート、生物活性物質、ウリカーゼ、及びＰＯＥＧＭＡの説明は、コンジュゲートを作製する方法にも適用できる。
【0026】
３．方法
Ａ．免疫原性を減少させる方法
ポリマー－生物活性物質コンジュゲートの免疫原性を減少させる方法も開示される。例えば、開示された方法は、ＰＥＧを開示されたＰＯＥＧＭＡ分子で置き換えることによりＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートの免疫原性を減少させることができる。
方法は、複数のＰＯＥＧＭＡ分子を生物活性物質にコンジュゲートさせて本明細書で開示される生物活性物質－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートを形成することを含むことができる。例えば、方法は、約５～約１３０のＰＯＥＧＭＡ分子を生物活性物質にコンジュゲートさせ、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子はポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合された複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖は縦列に繰り返されるＥＧの２～９の単量体を含んでコンジュゲートを提供し、コンジュゲートは、生物活性物質あたり約５～約１３０のＰＥＧ分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有することを含むことができる。
免疫原性を減少させる方法は生物活性物質を複数のＰＯＥＧＭＡ分子にコンジュゲートすることを含むので、開示されたコンジュゲートを作製する方法の説明は、免疫原性を減少させる方法にも適用できる。さらに、コンジュゲート、生物活性物質、ウリカーゼ、及びＰＯＥＧＭＡの説明は、免疫原性を減少させる方法にも適用できる。
Ａ．免疫原性を減少させる方法
ポリマー－生物活性物質コンジュゲートの免疫原性を減少させる方法も開示される。例えば、開示された方法は、ＰＥＧを開示されたＰＯＥＧＭＡ分子で置き換えることによりＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートの免疫原性を減少させることができる。
方法は、複数のＰＯＥＧＭＡ分子を生物活性物質にコンジュゲートさせて本明細書で開示される生物活性物質－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートを形成することを含むことができる。例えば、方法は、約５～約１３０のＰＯＥＧＭＡ分子を生物活性物質にコンジュゲートさせ、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子はポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合された複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖は縦列に繰り返されるＥＧの２～９の単量体を含んでコンジュゲートを提供し、コンジュゲートは、生物活性物質あたり約５～約１３０のＰＥＧ分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有することを含むことができる。
免疫原性を減少させる方法は生物活性物質を複数のＰＯＥＧＭＡ分子にコンジュゲートすることを含むので、開示されたコンジュゲートを作製する方法の説明は、免疫原性を減少させる方法にも適用できる。さらに、コンジュゲート、生物活性物質、ウリカーゼ、及びＰＯＥＧＭＡの説明は、免疫原性を減少させる方法にも適用できる。
【0027】
Ｂ．疾患を処置する方法
本開示は、疾患を処置する方法も提供する。方法は、本明細書で詳述されるコンジュゲートの有効量を対象（それを必要とする）に投与することを含むことができる。一部の実施形態では、疾患は尿酸により影響を受けている。一部の実施形態では、疾患は痛風を含む。ＰＯＥＧＭＡベースのコンジュゲートの投与及び処方に関するさらなる考察はＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０２３１５８に見出せる。前記特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
開示された発明は複数の態様を有し、以下の非限定的な実施例により説明される。
本開示は、疾患を処置する方法も提供する。方法は、本明細書で詳述されるコンジュゲートの有効量を対象（それを必要とする）に投与することを含むことができる。一部の実施形態では、疾患は尿酸により影響を受けている。一部の実施形態では、疾患は痛風を含む。ＰＯＥＧＭＡベースのコンジュゲートの投与及び処方に関するさらなる考察はＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０２３１５８に見出せる。前記特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
開示された発明は複数の態様を有し、以下の非限定的な実施例により説明される。
【実施例】
【0028】
（実施例１）
材料及び方法
遺伝子クローニング トルラ酵母ウリカーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）（Ａｃｃ番号：Ａ０Ａ１Ｅ４Ｓ４Ｅ２）を表すアミノ酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対してコドン最適化され、合成され（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）、ＡｃｕＩ及びＢｓｅＲＩを用いた制限消化を使用して修飾ＰＥＴ－２４ａ＋ベクター中にクローニングした。以前記載されたシームレスクローニング法を使用して、Ｃ末端ＴＥＶプロテアーゼ認識部位（ＥＮＬＹＦＱ；ｔ）、続いてＶＰＧＶＰ五量体の６０リピートを含むＥＬＰでクローニングした。ＵＴＥをコードする最終構築物は、ＢＬ２１－ＤＥ３大腸菌中に形質転換し、これにより発現された。次に、ＥＬＰタグ付きＴＥＶプロテアーゼをクローニングした。手短に言えば、ＴＥＶプロテアーゼをコードする遺伝子（Ａｃｃ番号：Ｑ０ＧＤＵ８、残基７３～３０２）をＰＣＲ増幅し、制限消化によりＰＥＴ－２４ａ＋中にクローニングした。６残基Ｎ末端Ｈｉｓ－タグ（Ｈｉｓ6）及びＶＰＧＶＰ五量体の６０リピートを含むＥＬＰをＴＥＶプロテアーゼ遺伝子上にクローニングしてＨｉｓ6－ＥＬＰ－ＴＥＶ構築物を生み出した。得られたベクターはＢＬ２１－ＤＥ３大腸菌中に形質転換した。
材料及び方法
遺伝子クローニング トルラ酵母ウリカーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）（Ａｃｃ番号：Ａ０Ａ１Ｅ４Ｓ４Ｅ２）を表すアミノ酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対してコドン最適化され、合成され（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）、ＡｃｕＩ及びＢｓｅＲＩを用いた制限消化を使用して修飾ＰＥＴ－２４ａ＋ベクター中にクローニングした。以前記載されたシームレスクローニング法を使用して、Ｃ末端ＴＥＶプロテアーゼ認識部位（ＥＮＬＹＦＱ；ｔ）、続いてＶＰＧＶＰ五量体の６０リピートを含むＥＬＰでクローニングした。ＵＴＥをコードする最終構築物は、ＢＬ２１－ＤＥ３大腸菌中に形質転換し、これにより発現された。次に、ＥＬＰタグ付きＴＥＶプロテアーゼをクローニングした。手短に言えば、ＴＥＶプロテアーゼをコードする遺伝子（Ａｃｃ番号：Ｑ０ＧＤＵ８、残基７３～３０２）をＰＣＲ増幅し、制限消化によりＰＥＴ－２４ａ＋中にクローニングした。６残基Ｎ末端Ｈｉｓ－タグ（Ｈｉｓ6）及びＶＰＧＶＰ五量体の６０リピートを含むＥＬＰをＴＥＶプロテアーゼ遺伝子上にクローニングしてＨｉｓ6－ＥＬＰ－ＴＥＶ構築物を生み出した。得られたベクターはＢＬ２１－ＤＥ３大腸菌中に形質転換した。
【0029】
タンパク質発現及び精製 ＵＴＥ発現大腸菌培養物を２ＸＹＴ培地において２５℃で４時間、振盪フラスコで育て、０．５ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発し、１６℃で一晩生育させた。細胞は、３４００ｇ、４℃で１０分間の遠心分離により収穫し、冷ホウ酸塩緩衝液（１００ｍＭのホウ酸ナトリウム、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸ＥＤＴＡ ｐＨ１０）に再懸濁した。細胞は、超音波処理（Ｑ５００超音波処理器、ＱＳｏｎｉｃａ、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ）により、１８０秒の全超音波処理時間、１０秒オン及び３０秒オフでパルスして溶解させた。ＤＮＡ沈殿物は、１０％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を添加することにより生み出し、ライセートは２４０００ｇ、４℃で１０分間の遠心分離により澄ませた。ＵＴＥは、ＩＴＣにより澄ませたライセートから精製した。手短に言えば、ライセートは室温に戻して、ＵＴＥの凝集は、０．１Ｍの硫酸アンモニウムの添加により開始した。凝集体は２４０００ｇ、３５℃で１０分間の遠心分離によりペレット化した。ペレットは回転板上、４℃で１時間冷ホウ酸塩緩衝液に再懸濁し、夾雑物は２４，０００ｇ、４℃で１０分間の遠心分離により取り除いた。この過程は１又は２サイクル繰り返して、９５％よりも大きな純度を有するＵＴＥに到達した。Ｈｉｓ6－ＥＬＰ－ＴＥＶは、ＵＴＥについての上記の通りに発現させ、収穫し、溶解させ、澄まし、続いてニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液中に透析した。純度は、ゲル濃度測定分析（Ｂｉｏｒａｄ）を使用するＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定した。タンパク質濃度は、ＮＤ－１０００Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＵＶ－ｖｉｓ分光学により決定した。
【0030】
ＴＥＶプロテアーゼ切断 ＵＴＥはＴＥＶプロテアーゼにより切断されてＥＬＰを取り除き遊離のウリカーゼを産生する。手短に言えば、反応は、ホウ酸塩反応緩衝液（１００ｍＭのホウ酸ナトリウム ｐＨ９．２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１０ｍＭのジチオスレイトール）中で２８０ｎｍでの吸光度により１対１０比のＨｉｓ6－ＴＥＶ－ＥＬＰ対ＵＴＥを含んだ。反応は、回転板上、４℃で２０時間インキュベートした。最後に、Ｈｉｓ6－ＥＬＰ－ＴＥＶ、非切断ＵＴＥ、及び切断ＥＬＰはすべて、０．２Ｍの硫酸アンモニウムを添加してＥＬＰ凝集を開始し、続いて２４，０００ｇ、２５℃で１０分間遠心分離することにより完全に精製された。得られた遊離の四量体ウリカーゼは、ホウ酸塩緩衝液に可溶化させ、１０ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）を持つ透析カセットを使用して１００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ９．２を含む５０ｍＭの炭酸塩緩衝液中に透析した。純度は、ゲル濃度測定分析（Ｂｉｏｒａｄ）を使用するＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定した。
【0031】
重合開始剤の合成 ４－アミノ－１－ブタノール（５ｇ、０．０５６１モル）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）（６．２４ｇ、０．０６２４モル）を反応フラスコ（フラスコ１）中に移し、２０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に可溶化させた。α－ブロモイソブチリルブロマイド（１２．８ｇ、０．０５６７モル）を別のフラスコ（フラスコ２）の１ｍｌＤＣＭに可溶化させた。フラスコ２中の溶液は、不活性雰囲気下で注射器を使用することによりフラスコ１中に液滴で移した。反応は室温で１６時間攪拌した。得られた混合液は濾過し、有機相を収集した。次に、２０ｍｌの水酸化カリウム（５％）を添加し、２時間攪拌した。有機相は分液漏斗を使用して分離し、それぞれ１ＮのＮａＯＨ、１ＮのＨＣｌ、及び飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相は無水ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過して有機相を収集し、続いて真空下ＤＣＭを蒸発させた。
ＰＯＥＧＭＡ合成及び精製 ＰＯＥＧＭＡはＡＲＧＥＴ－ＡＴＲＰを使用して合成した。トリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＥＧ３）をアルミナカラムに通過させて、インヒビターを取り除いた。無インヒビターＥＧ３（１０ｍｍｏｌ）、重合開始剤（０．０４ｍｍｏｌ）、メタノール（５．８ｍｌ）、及び１００ｍＭのＮａＣｌ（１１．６ｍｌ）をフラスコ（重合フラスコ）中で混合した。触媒複合体は、水中で８モル等量のトリス（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）をモル等量の臭化銅（ＩＩ）（ＣｕＢｒ2）を混合することにより調製した。触媒複合体（０．０８ｍｍｏｌのＴＰＭＡ；０．０１ ＣｕＢｒ2）を重合フラスコに移した。最終容積は２０ｍｌに調整した。分離フラスコでは、６４ｍＭのアスコルビン酸を調製した。両フラスコはアルゴンでパージして酸素を取り除いた。重合は、１分あたり１μｌの割合で重合フラスコ中にアスコルビン酸を添加して開始した。反応は９０分間続けた。得られた混合液は、それをアルミナカラム中に通過させ、続いてジエチルエーテル沈殿及び真空下での蒸発により精製して、純粋なＯＨ－ＰＯＥＧＭＡを得た。
ＰＯＥＧＭＡ合成及び精製 ＰＯＥＧＭＡはＡＲＧＥＴ－ＡＴＲＰを使用して合成した。トリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＥＧ３）をアルミナカラムに通過させて、インヒビターを取り除いた。無インヒビターＥＧ３（１０ｍｍｏｌ）、重合開始剤（０．０４ｍｍｏｌ）、メタノール（５．８ｍｌ）、及び１００ｍＭのＮａＣｌ（１１．６ｍｌ）をフラスコ（重合フラスコ）中で混合した。触媒複合体は、水中で８モル等量のトリス（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）をモル等量の臭化銅（ＩＩ）（ＣｕＢｒ2）を混合することにより調製した。触媒複合体（０．０８ｍｍｏｌのＴＰＭＡ；０．０１ ＣｕＢｒ2）を重合フラスコに移した。最終容積は２０ｍｌに調整した。分離フラスコでは、６４ｍＭのアスコルビン酸を調製した。両フラスコはアルゴンでパージして酸素を取り除いた。重合は、１分あたり１μｌの割合で重合フラスコ中にアスコルビン酸を添加して開始した。反応は９０分間続けた。得られた混合液は、それをアルミナカラム中に通過させ、続いてジエチルエーテル沈殿及び真空下での蒸発により精製して、純粋なＯＨ－ＰＯＥＧＭＡを得た。
【0032】
ＰＯＥＧＭＡ鎖末端ＮＰＣ活性化 ＯＨ－ＰＯＥＧＭＡ（０．１１ｍｍｏｌ）を、反応フラスコ（フラスコ１）において５ｍｌの無水アセトニトリルに溶解した。別のフラスコ（フラスコ２）では、ビス（４－ニトロフェニル）カルボネート（２．１５ｍｍｏｌ）を１５ｍｌの無水アセトニトリルに可溶化し、フラスコ１中に移した。最後に、ピリジン（５．１６ｍｍｏｌ）をフラスコ１に移し、最終容積を無水アセトニトリルを使用して２１．５ｍｌに調整した。得られた混合液は室温で１６時間反応させた。沈殿物はグラスファイバーＧＦ／Ｂフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して取り除き、続いて０．５ｍｌが残るまで真空下アセトニトリルを蒸発させた。得られたポリマー混合物は、ジエチルエーテル精製により精製し、真空下に保って溶剤を取り除いた。ＮＰＣ－ＰＯＥＧＭＡは不活性雰囲気下、－２０℃で保存した。
【0033】
ＮＰＣ活性度計算 ＮＰＣ活性度は式１を使用して計算し、メチレンプロトン（２Ｈ；４．０～４．４ｐｐｍ）に対するＮＰＣのベンゼン環に存在する水素（８．２６ｐｐｍでピークａ（２Ｈ）；７．３８ｐｐｍでピークＢ（２Ｈ））の割合から、ＥＧ３単量体単位あたりのＮＰＣ末端活性度が得られた。ＰＯＥＧＭＡ鎖あたりの活性度は、ＥＧ３単量体単位あたりのＮＰＣ末端活性度をＰＯＥＧＭＡの重合度（ＤＰ）と掛けることにより見出された。ＤＰはＰＯＥＧＭＡ鎖に存在するＥＧ３鎖の数であり、ＰＯＥＧＭＡ ＭWをＥＧ３単量体のＭWで割ることにより計算される。
ＰＯＥＧＭＡの構造的特徴付け 重合開始剤及びＰＯＥＧＭＡの化学構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学により分析された。化合物は重水素化クロロホルムに溶解され、データは４００ＭＨｚ Ｖａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ分光計を使用して記録された。データはＡＣＤ／ＮＭＲソフトウェア（ＡＣＤ Ｌａｂｓ）を使用して解析された。ＮＰＣ活性度はＰＯＥＧＭＡ鎖上に存在するＮＰＣ％として定義され、計算された。
【数1】
【0034】
コンジュゲート合成及び精製 ＮＰＣ－ＰＯＥＧＭＡ又はＮＰＣ－ＰＥＧはフラスコで秤量され、続いてウリカーゼを最終濃度５ｍｇ ｍｌ-1でフラスコ中に添加した。フラスコは室温で１時間回転板上に置き、ウリカーゼをＮＰＣ－機能的ポリマーと反応させておいた。ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡの合成では、１００倍モル等量ＰＯＥＧＭＡを使用した。ウリカーゼ－ＰＥＧRh及びウリカーゼ－ＰＥＧMwは、１０及び１００モル等量のＮＰＣ－ＰＥＧ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧｗｏｒｋｓ、ＮＣ）を必要とした。得られたコンジュゲートは、単回ラウンドのＳＥＣにより精製された。手短に言えば、ＡＫＴＡ清浄器は、２２０及び２８０ｎｍで作動するＵＶ－Ｖｉｓ検出器並びにＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えていた。移動相は、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭの炭酸塩緩衝液であった。流速は２ｍｌ分-1であった。精製されたコンジュゲートは、４０ｋＤａのＭＷＣＯを有する脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１０ｍＭのホウ酸塩緩衝液中にバッファー交換し、続いて－８０℃で保存した。
【0035】
コンジュゲートの物理的特徴付け ウリカーゼ変異体は、ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ ＭＡＬＳ検出器を備え付けたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及び２８０ｎｍで作動するＵＶ－ｖｉｓ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してＳＥＣ－ＭＡＬＳによりＭn、Ｍw及び
について特徴付けを行った。ＭＡＬＳ検出器は、それぞれの使用前にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して正規化した。移動相は、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１００ｐｐｍのＮａＮ3を有する１０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．３）であった。ウリカーゼ変異体は移動相に可溶化され、続いて１００ｎｍのシリンジフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して濾過した。得られた溶液の５０μｌをＷＴＣ－０１５Ｎ５ ＳＥＣカラム（５μｍ；１５０Å；内径４．６ｍｍ；Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で分離した。流速は０．５ｍｌ 分-1であった。光散乱データは、ＡＳＴＲＡソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、Ｍn、Ｍw、
、及びコンジュゲーション化学量論について分析した。屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）及びＵＶ消衰係数は、それぞれ屈折率検出器及びＵＶ－Ｖｉｓ検出器により決定した。ＯＨ－及びＮＰＣ－ＰＯＥＧＭＡは、Ｍn、Ｍw及び
について特徴付けた。
【数2】
【数3】
【数4】
【0036】
流体力学サイズ特徴付け Ｒhは、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＤＬＳにより特徴付けた。ウリカーゼ変異体は４０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＺｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＰＢＳ中にｐＨ７．４でバッファー交換し、続いて１００ｎｍシリンジフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を通して濾過した。測定値は１５℃で記録した。データは、Ｄｙｎａｍｉｃｓソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してローリースフィア（Ｒａｌｅｉｇｈ ｓｐｈｅｒｅｓ）に正則化フィットを当てることにより分析した。安定性実験では、ウリカーゼはＥＬＰから切断し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＰＢＳ中にｐＨ７．４でバッファー交換し、続いてＤＬＳデータを明示された時点で収集した。
【0037】
生化学活性アッセイ ウリカーゼ変異体の活性はＡｍｐｌｅｘTM Ｒｅｄ尿酸／ウリカーゼアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。手短に言えば、ウリカーゼは、尿酸のアラントイン、過酸化水素、及び二酸化炭素への転換を触媒する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の存在下では、過酸化水素はＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬と化学量論的に反応して赤色色素を生み出し、これは動力学的にモニターできる。ウリカーゼ変異体の段階希釈を調製して試験した。製造業者のプロトコルに従って、変異体に存在する１ｍｇのウリカーゼあたりの尿酸転換活性（Ｕ）を報告した。
エンドトキシン精製 コンジュゲートは、高能力エンドトキシン除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を少しの変更で製造業者のプロトコルに従って使用してエンドトキシン精製した。移動相は、減菌水（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に溶解させた１０ｍＭの炭酸水素アンモニウムｐＨ７．５であった。エンドトキシン精製コンジュゲートは、凍結乾燥させ－８０℃で保存した。エンドトキシン含量は、Ｅｎｄｏｓａｆｅ ｎｅｘｇｅｎ－ＰＴＳ機器及びカートリッジ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用して試験した。最大許容エンドトキシン限界はマウス体重１ｋｇあたり０．２ＥＵであった。試料は、０．２２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してマウス中に投与する前に無菌化された。
エンドトキシン精製 コンジュゲートは、高能力エンドトキシン除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を少しの変更で製造業者のプロトコルに従って使用してエンドトキシン精製した。移動相は、減菌水（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に溶解させた１０ｍＭの炭酸水素アンモニウムｐＨ７．５であった。エンドトキシン精製コンジュゲートは、凍結乾燥させ－８０℃で保存した。エンドトキシン含量は、Ｅｎｄｏｓａｆｅ ｎｅｘｇｅｎ－ＰＴＳ機器及びカートリッジ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用して試験した。最大許容エンドトキシン限界はマウス体重１ｋｇあたり０．２ＥＵであった。試料は、０．２２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してマウス中に投与する前に無菌化された。
【0038】
動物実験 生後６週オスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ストック番号０００６６４）をインビボ研究用に使用した。マウスには、実験開始前の１週間施設に慣れさせておいた。マウスは、１２時間暗／明サイクルの光制御環境で群飼いし、標準齧歯類食餌で飼い、水及び餌は自由に利用させた。
ＰＫ． 無菌のエンドトキシンフリーウリカーゼ変異体にはフルオロフォアで標識して、インビボで薬物を追跡した。遊離の色素がないことは蛍光検出器を備えたＨＰＬＣにより確かめた。最終濃度は、エンドトキシンフリーＰＢＳを用いて４．４μＭに設定した。
ＰＫ． 無菌のエンドトキシンフリーウリカーゼ変異体にはフルオロフォアで標識して、インビボで薬物を追跡した。遊離の色素がないことは蛍光検出器を備えたＨＰＬＣにより確かめた。最終濃度は、エンドトキシンフリーＰＢＳを用いて４．４μＭに設定した。
【0039】
ウリカーゼ変異体は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝群あたり４～５マウス）に３６．６ｎｍｏｌ ｋｇ-1の用量で静脈内投与した。血液試料（１０μｌ）は、尾静脈上の小さな切り傷から収集し、ヘパリン含有チューブ（９０μｌ；１０００Ｕ ｍｌ-1）中への処置の血漿濃度を追跡した。血液採取のための時点は、投与前（－１５分）、４０秒、５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間及び１４４時間まで２４時間毎であった。試料は、１，６００ｇで１５分間の遠心分離により血漿について処理した。血漿試料中のフルオロフォア濃度は、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を４８５ｎｍ（励起）及び５３５ｎｍ（発光）で使用して測定した（ｎ＝マウスあたり３ウェル）。薬物の血漿濃度は、採取時間の関数としてプロットし、続いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェアを使用して一相減衰曲線にフィットさせた。ＰＫパラメータは、ノンコンパートメントＰＫ解析を使用して同定した。薬物濃度は、最初薬物濃度と名付けられるｔ＝０（Ｃ0）での濃度に近似させ、ｔ＝０でのフィットした減衰曲線とＹ軸の交点から計算した。排出速度（ｋ）は、採取時間の関数としての薬物濃度の対数にフィットした線形回帰曲線の勾配から計算した。排出半減期は、薬物濃度がその最大半量値に到達するのに必要な時間として定義され、ｋを使用して計算された。
薬物ＰＫに対する抗薬物抗体の効果は、上記の通りに反復ＰＫアッセイで試験した。マウスは、同じ薬物を全部で５回毎週投与された。薬物ＰＫは、最初の注射及び５回目の注射後に追跡した。
薬物ＰＫに対する抗薬物抗体の効果は、上記の通りに反復ＰＫアッセイで試験した。マウスは、同じ薬物を全部で５回毎週投与された。薬物ＰＫは、最初の注射及び５回目の注射後に追跡した。
【0040】
免疫原性 無菌のエンドトキシンフリーウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡ及びウリカーゼ－ＰＥＧMwは、別々のコホートのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１０）中に１７日毎に３回、等注入量のエンドトキシンフリーＰＢＳを負の対照として使用して３６．６ｎｍｏｌ ｋｇ-1の等価用量で皮下投与した。次に、凍結乾燥ヘパリン含有チューブ中へのそれぞれの注入１０日後、約１８０μｌの血液を顎下静脈から収集し、上記の通りに別々の血漿に処理した。血漿試料はＡＤＡ分析まで－８０℃で保存した。
ＡＤＡの分析 ＡＤＡはルミネックス多重化アッセイを使用して分析した。手短に言えば、血漿試料をＰＢＳで５００倍希釈した。希釈血漿試料（５０μｌ）を黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。次に、ＯＶＡ－ＰＯＥＧＭＡ、ＯＶＡ－ＰＥＧ－ＰＯＥＧＭＡ、及びＯＶＡ－ＰＯＥＧＭＡ結合磁気ビーズをそれぞれのウェルに添加し（５０μｌ；セットあたり２５００ビーズ）、続いてプレート震盪器上で１時間インキュベートした。磁気ビーズは磁気リング上で分離し、ウェルは、アッセイ緩衝液と呼ばれるＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中０．２％（ｗ／ｖ）Ｉ－ブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄した。ＩｇＧ－クラスＡＤＡを分析するため、Ｒ－フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；＃１１５－１１５－１６４）をウェル（５μｇ ｍｌ-1；１００μｌ）に移し、１時間インキュベートした。ＩｇＭクラスＡＤＡを分析するため、ビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；＃１１５－０６５－０７５）を同じ濃度及び容積で、同じ期間使用した。次に、ウェルはアッセイ緩衝液で洗浄した。ＩｇＭクラスＡＤＡの分析では、ストレプトアビジン－Ｒ－フィコエリトリン（ＳＡＰＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をウェル（７．５μｇ ｍｌ-1；１００μｌ）中に移し、３０分間インキュベートし、続いてウェルをアッセイ緩衝液で洗浄した。ビーズは、１００μｌのアッセイ緩衝液に再懸濁し、そのシグナルをＭＡＧＰＩＸ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）により測定した。
ＡＤＡの分析 ＡＤＡはルミネックス多重化アッセイを使用して分析した。手短に言えば、血漿試料をＰＢＳで５００倍希釈した。希釈血漿試料（５０μｌ）を黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。次に、ＯＶＡ－ＰＯＥＧＭＡ、ＯＶＡ－ＰＥＧ－ＰＯＥＧＭＡ、及びＯＶＡ－ＰＯＥＧＭＡ結合磁気ビーズをそれぞれのウェルに添加し（５０μｌ；セットあたり２５００ビーズ）、続いてプレート震盪器上で１時間インキュベートした。磁気ビーズは磁気リング上で分離し、ウェルは、アッセイ緩衝液と呼ばれるＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中０．２％（ｗ／ｖ）Ｉ－ブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄した。ＩｇＧ－クラスＡＤＡを分析するため、Ｒ－フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；＃１１５－１１５－１６４）をウェル（５μｇ ｍｌ-1；１００μｌ）に移し、１時間インキュベートした。ＩｇＭクラスＡＤＡを分析するため、ビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；＃１１５－０６５－０７５）を同じ濃度及び容積で、同じ期間使用した。次に、ウェルはアッセイ緩衝液で洗浄した。ＩｇＭクラスＡＤＡの分析では、ストレプトアビジン－Ｒ－フィコエリトリン（ＳＡＰＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をウェル（７．５μｇ ｍｌ-1；１００μｌ）中に移し、３０分間インキュベートし、続いてウェルをアッセイ緩衝液で洗浄した。ビーズは、１００μｌのアッセイ緩衝液に再懸濁し、そのシグナルをＭＡＧＰＩＸ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）により測定した。
【0041】
間接的ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡ 我々は、マウス血漿試料に存在するＰＥＧ抗体に対するウリカーゼ、ウリカーゼ－ＰＥＧMw、及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡの反応性を調べた。ＰＥＧ抗体陽性マウス血漿試料は入手可能であり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１０）をフロイントアジュバンドに乳化したＯＶＡ－ＰＥＧに繰り返し曝露し、続いて血液収集して血漿に処理した。研究終了時（４４日目）にそれぞれのマウスから収集した血漿試料は等容積で混合し、ＰＥＧ－抗体陽性血漿プールを得た。
【0042】
間接的ＥＬＩＳＡでは、先ず、炭酸塩緩衝液ｐＨ９．２中１００μｌのＯＶＡ－ＰＥＧ、ウリカーゼ－ＰＥＧMw、及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡ溶液を、それぞれのウェルに５μｇのＰＥＧ又はＰＯＥＧＭＡが存在するように、９６ウェルプレート表面に被覆した。ウリカーゼ被覆ウェルは、それぞれのウェル中のウリカーゼの量がコンジュゲート被覆ウェルと一致していた。抗原溶液は４℃で一晩インキュベートした。ウェルは、ブロッキング緩衝液と名付けられるＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中１％のｉＢｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１時間ブロックし、続いて、２回ＰＢＳ洗浄した。次に、プールしたＰＥＧ抗体陽性マウス血漿試料はＰＢＳに５００倍希釈し、希釈された血漿試料の１００μｌをそれぞれのウェルに移し、続いて１時間インキュベートし、２回ＰＢＳ洗浄した。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；１１５－０６５－０７５）はＰＢＳに希釈し（５０ｎｇ ｍｌ-1）、得られた溶液の１００μｌをそれぞれのウェルに移した。抗体溶液は１時間インキュベートし、ウェルから取り除き、続いて２回ＰＢＳ洗浄した。ストレプトアビジン－ポリＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）はＰＢＳに０．１μｇ ｍｌ-1まで希釈してウェルに移し、続いて３０分間インキュベートした。過剰な溶液は取り除き、ウェルはＰＢＳで洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）をウェルに添加し（５０μｌ）、１０分間インキュベートして、続いて２Ｎの硫酸（５０μｌ）の添加で停止させ、プレートリーダー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上４５０ｎｍで吸光度を読み取った。吸光度は、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。
【0043】
競合ＥＬＩＳＡでは、ウリカーゼ、ウリカーゼ－ＰＥＧMw、及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡは、プールしたＰＥＧ抗体陽性マウス血漿試料への結合を巡って、無関係なＰＥＧ化薬物（エキセンディン－ＰＥＧ）と競合した。エキセンディン－ＰＥＧは、１０．２ｋＤａのＭWを有するＰＥＧの化学量論的コンジュゲートであった。エキセンディン－ＰＥＧは９６ウェルプレートの表面に被覆され、４℃での一晩インキュベーションによりウェルあたり５μｇのＰＥＧが得られた。マウス血漿試料はＰＢＳに２５０倍希釈された。ウリカーゼ、ウリカーゼ－ＰＥＧMw、及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡは、４０μＭまでの変化する濃度で調製された。得られた溶液の２５０μｌを２５０μｌの希釈血漿と混合し、続いて回転板上、４℃で一晩インキュベートした。アッセイの日、エキセンディン－ＰＥＧをウェルから取り除く、ウェルは室温で１時間ブロッキング緩衝液でブロックし、続いて２回ＰＢＳ洗浄した。得られた抗原：血漿混合物の１００μｌをそれぞれのウェルに移して、１時間インキュベートした。薬物をウェルから取り除き、続いて２回ＰＢＳ洗浄した。次に、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；１１５－０６５－０７５）をＰＢＳに希釈し（５０ｎｇ ｍｌ-1）、得られた溶液の１００μｌをそれぞれのウェルに移した。抗体溶液は１時間インキュベートしてウェルから取り除き、続いて２回ＰＢＳ洗浄した。ストレプトアビジン－ポリＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）はＰＢＳに０．１μｇ ｍｌ-1まで希釈してウェルに移し、続いて３０分間インキュベートした。過剰な溶液は取り除き、ウェルはＰＢＳで洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）をウェルに添加し（５０μｌ）て１０分間インキュベートし、続いて２Ｎの硫酸（５０μｌ）の添加で停止させ、プレートリーダー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上４５０ｎｍで吸光度を読み取った。吸光度は、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。
【0044】
統計解析 マウスは無作為に群に分配した。試料サイズは、オープンソースＧ－ｐｏｗｅｒソフトウェアを使用して評価した。動物を含まない実験は少なくとも２回反復し、少なくとも３回繰り返した。ＰＫ実験は群あたり少なくともｎ＝３マウスを必要とし、免疫原性実験では処置あたりｎ＝１０マウスを使用した。データは、別段記述されなければ、処置群での平均応答±平均の標準偏差（ＳＥＭ）を表した。データは、二元配置分散分析、続いて事後チューキー多重比較検定を使用して解析した。ｐ＜０．０５は統計的に有意な検定を示した。（*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１；****ｐ＜０．０００１）。有意ではない（ｎｓ）。すべての統計解析でＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．０を使用した。
【0045】
（実施例２）
高収率及び薬理活性を有する無凝集体ウリカーゼ発現
ウリカーゼは、４つの同一単量体を含む四量体タンパク質である。ウリカーゼは、表面上の疎水性アミノ酸のその高含量（約３３％）及び不均一分布のせいで高度に凝集傾向があり、強力な分子内疎水性相互作用及び凝集が生じる。最終薬物製剤中のウリカーゼ凝集体は深刻な問題である。なぜならば、ウリカーゼ凝集体は薬理活性を減少させ、頑強な抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発して、薬物クリアランスを加速し、わずか数回の注射後に処置が無効になるからである。商業供給業者由来の組換えウリカーゼは８６％までの凝集体を含み、コンジュゲート合成でのその有用性が妨げられる。
この問題は、大腸菌での組換え発現中にウリカーゼを安定化させる融合タンパク質として刺激応答性エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）を利用することにより回避される。我々は、ＥＬＰを遺伝子レベルでウリカーゼ単量体のＣ末端に融合させた（図１Ａ）。細菌性発現後ＴＥＶプロテアーゼ切断がＥＬＰからウリカーゼ単量体を遊離させるように、ＥＬＰとウリカーゼ単量体の間にタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識配列ＥＮＬＹＦＱＳも挿入し、ｔと名付けられた。得られた融合タンパク質は、ウリカーゼ－ｔ－ＥＬＰ（ＵＴＥ）と名付けられ、大腸菌で組換え的に発現され、シェーカーフラスコ培養産出量は１リットルあたり約２００ｍｇであった。さらに、我々は、逆変換サイクリング（ＩＴＣ）による細菌細胞ライセートからのＵＴＥのクロマトグラフィーなしでの精製のためにＥＬＰの刺激応答相挙動を利用し、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により評価した場合、純粋なＵＴＥを得た。
高収率及び薬理活性を有する無凝集体ウリカーゼ発現
ウリカーゼは、４つの同一単量体を含む四量体タンパク質である。ウリカーゼは、表面上の疎水性アミノ酸のその高含量（約３３％）及び不均一分布のせいで高度に凝集傾向があり、強力な分子内疎水性相互作用及び凝集が生じる。最終薬物製剤中のウリカーゼ凝集体は深刻な問題である。なぜならば、ウリカーゼ凝集体は薬理活性を減少させ、頑強な抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発して、薬物クリアランスを加速し、わずか数回の注射後に処置が無効になるからである。商業供給業者由来の組換えウリカーゼは８６％までの凝集体を含み、コンジュゲート合成でのその有用性が妨げられる。
この問題は、大腸菌での組換え発現中にウリカーゼを安定化させる融合タンパク質として刺激応答性エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）を利用することにより回避される。我々は、ＥＬＰを遺伝子レベルでウリカーゼ単量体のＣ末端に融合させた（図１Ａ）。細菌性発現後ＴＥＶプロテアーゼ切断がＥＬＰからウリカーゼ単量体を遊離させるように、ＥＬＰとウリカーゼ単量体の間にタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識配列ＥＮＬＹＦＱＳも挿入し、ｔと名付けられた。得られた融合タンパク質は、ウリカーゼ－ｔ－ＥＬＰ（ＵＴＥ）と名付けられ、大腸菌で組換え的に発現され、シェーカーフラスコ培養産出量は１リットルあたり約２００ｍｇであった。さらに、我々は、逆変換サイクリング（ＩＴＣ）による細菌細胞ライセートからのＵＴＥのクロマトグラフィーなしでの精製のためにＥＬＰの刺激応答相挙動を利用し、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により評価した場合、純粋なＵＴＥを得た。
【0046】
ＴＥＶプロテアーゼも、Ｎ末端ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグとのＣ末端ＥＬＰ融合物として大腸菌で組換え的に発現され、Ｈｉｓ6－ＥＬＰ－ＴＥＶと名付けられた。このプロテアーゼはＵＴＥをＱとＳアミノ酸の間で切断し、ＥＬＰから約７２％収率でウリカーゼ－ＥＮＬＹＦＱを遊離させ、ウリカーゼ四量体を形成させた（図１Ｂ及び図２Ａ）。次に、四量体ウリカーゼは、単回ラウンドのＩＴＣによりＨｉｓ6－ＥＬＰ－ＴＥＶ、未反応ＵＴＥ、及び切断ＥＬＰから精製した。なぜならば、四量体ウリカーゼは、ＥＬＰを保有しない唯一の部分であり、純粋なウリカーゼ四量体が得られるからである（図２Ａ）。
ウリカーゼ四量体は、サイズ排除クロマトグラフィー－多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により測定した場合、１３６．６ｋＤａの数平均分子量（Ｍn）を有していた（図２Ｂ；表１）。ウリカーゼは、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した場合、約４．７ｎｍの流体力学サイズ（Ｒh）を有していた（図２Ｃ；表１）。ウリカーゼは、出現頻度が少ない天然の立体構造である八量体を０．８質量％含んでいた。八量体には凝集体がなく、もっと大きな分子がないことにより示され、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ及びＤＬＳにより確かめられた。
ウリカーゼ四量体は、サイズ排除クロマトグラフィー－多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により測定した場合、１３６．６ｋＤａの数平均分子量（Ｍn）を有していた（図２Ｂ；表１）。ウリカーゼは、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した場合、約４．７ｎｍの流体力学サイズ（Ｒh）を有していた（図２Ｃ；表１）。ウリカーゼは、出現頻度が少ない天然の立体構造である八量体を０．８質量％含んでいた。八量体には凝集体がなく、もっと大きな分子がないことにより示され、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ及びＤＬＳにより確かめられた。
【0047】
ウリカーゼの薬理活性は生化学アッセイを使用して定量化され、ウリカーゼはその天然の基質である尿酸の高度に可溶性のアラントインへの転換を触媒し、その間過酸化水素及び二酸化炭素を副産物として産生した。我々の発現及び精製プロトコルは約１２Ｕ／ｍｇの活性のあるウリカーゼを産し（表１）、４．４Ｕ／ｍｇの活性のある商業供給業者（Ｓｉｇｍａ）製のウリカーゼよりも有意に高かった。さらに、ウリカーゼは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４℃で１週間まで安定であり、分子の＞９８質量％がその最初のサイズと活性を保持することにより示された。全体として、我々は、高収率及び安定性を有する無凝集体ウリカーゼを発現し、労働集約的なクロマトグラフィー法なしで精製するプロトコルを開発した。
【0048】
（実施例３）
ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートの合成及び特徴付け
我々は、ヒドロキシル機能的重合開始剤を使用してＰＯＥＧＭＡを、電子移動原子移動ラジカル重合（ＡＲＧＥＴ－ＡＴＲＰ）により再生される活性化因子を使用して３エチレングリコール長（ＥＧ３）単量体を合成し、ヒドロキシル機能的ＰＯＥＧＭＡ（ＯＨ－ＰＯＥＧＭＡ）を得た。得られたＯＨ－ＰＯＥＧＭＡのＯＥＧ側鎖長は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学により確かめられた。得られたＯＨ－ＰＯＥＧＭＡは、＜１．２の低分散
を有する単分散であり、ゲル浸透クロマトグラフィー－ＭＡＬＳ（ＧＰＣ－ＭＡＬＳ）により分析した場合、約１０ｋＤａの質量平均分子量（Ｍw）を有していた。このＭwは、ペグロチカーゼの構造に適合するように選ばれ、１０ｋＤａのＰＥＧはコンジュゲーション用に使用された。
ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートの合成及び特徴付け
我々は、ヒドロキシル機能的重合開始剤を使用してＰＯＥＧＭＡを、電子移動原子移動ラジカル重合（ＡＲＧＥＴ－ＡＴＲＰ）により再生される活性化因子を使用して３エチレングリコール長（ＥＧ３）単量体を合成し、ヒドロキシル機能的ＰＯＥＧＭＡ（ＯＨ－ＰＯＥＧＭＡ）を得た。得られたＯＨ－ＰＯＥＧＭＡのＯＥＧ側鎖長は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学により確かめられた。得られたＯＨ－ＰＯＥＧＭＡは、＜１．２の低分散
【数5】
【0049】
我々は、ニトロフェニル炭酸塩（ＮＰＣ）機能的ＰＯＥＧＭＡ（ＮＰＣ－ＰＯＥＧＭＡ）を、非部位特異的及び非化学量論的に、露出したリジンアミノ酸上のアミン残基に連結させることによりウリカーゼのＰＯＥＧＭＡコンジュゲートを合成し、生理的に安定なウレタン結合が生じた。我々は、ＮＰＣに対してＯＨ－ＰＯＥＧＭＡのヒドロキシル末端基を活性化することによりＮＰＣ－ＰＯＥＧＭＡを合成した。ＮＰＣ鎖活性化はＮＭＲ分光学により確かめられ、ＰＯＥＧＭＡのＭｎ、Ｍｗ、及び
を変更しなかった。
【数6】
【0050】
得られたコンジュゲートは、ウリカーゼ四量体あたり平均で約２７のＰＯＥＧＭＡ鎖を有していた（図２Ｂ；表１）。コンジュゲーション化学量論はペグロチカーゼ構造にほぼ等しくなるように選択され、ウリカーゼ四量体あたり平均で約３２のＰＥＧ鎖を含み、これがその表面にわたり分配されたウリカーゼの免疫原性エピトープを覆い薬物ＰＫを改善する。我々は、ウリカーゼ－ＰＥＧMwと名付けられた適合するコンジュゲーション化学量論及びＭｗを有するウリカーゼ－ＰＥＧコンジュゲートも合成して対照として使用した。コンジュゲートは凝集体がなく、＜１．２の低分散
を有する単分散であり、ほぼ同一のコンジュゲーション化学量論を有していた（図２Ｂ；表１）。これにもかかわらず、コンジュゲートは、無定形直線状ＰＥＧよりも緻密なＰＯＥＧＭＡのブラシ構造のせいでそのＲhが有意に異なっていた（図２Ｃ；表１）。腎臓抽出率がコンジュゲートのＲh及び複雑な突き合わせＰＫ比較により影響を受ける可能性があることを考慮すると、我々はＲｈ－適合ウリカーゼ－ＰＥＧコンジュゲートも合成し、ウリカーゼ－ＰＥＧRhと名付けた。ウリカーゼ－ＰＥＧRhは単分散であり、約９のコンジュゲーション化学量論を有していた（図２Ｃ；表１）。
【数7】
【0051】
コンジュゲートは酵素活性が異なることはなく、ウリカーゼと同じくらい効果的であり、ＰＥＧコンジュゲーションもＰＯＥＧＭＡコンジュゲーションも薬理活性に影響を与えないことを示していた（表１）。逆に、ＰＥＧ及びＰＯＥＧＭＡ連結により、膜結合受容体などの大きな生物学的部分が標的にされると活性の数桁の減少が生じた。我々は、この結果は基質としての尿酸のサイズが小さいからであると考えた。尿酸はＰＥＧ及びＰＯＥＧＭＡ鎖を貫通してウリカーゼに到達するはずである。ＰＯＥＧＭＡ結合アスパラギナーゼコンジュゲートも、その小分子基質のアスパラギンを触媒する活性の最小（３倍）の変化しか示さず、我々の所見を支持している。
【0052】
【表1】
【0053】
（実施例４）
薬物動態（ＰＫ）
我々は次にウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡのＰＫを調べ、それを非修飾ウリカーゼ、ウリカーゼ－ＰＥＧMw、及びウリカーゼ－ＰＥＧRhと比較した。ウリカーゼ変異体は蛍光的に標識されて、インビボで変異体を追跡した。我々は、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡが投与されると相転移しないことを確かめた。相転移温度（Ｔt）は、ＰＢＳ中での注射液濃度では体温（約４２℃）よりも上であった。ウリカーゼ変異体は、生後６週間オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝５）に静脈内（ｉ．ｖ．）注射され、続いて血漿薬物濃度を追跡し、ＰＫパラメータを計算した。
処置は、ほぼ一定の開始血漿濃度（Ｃo）を生じ、首尾よい等モルの薬物投与を示した（表２）。非修飾ウリカーゼは短い排出半減期（ｔ1/2排出）を有していた（図３Ａ；表２）。すべてのコンジュゲートは非修飾ウリカーゼよりも長いｔ1/2排出を有しており、ＰＥＧとＰＯＥＧＭＡの両方がウリカーゼのＰＫを首尾よく延ばすことを示していた（図３Ｂ；表２）。ウリカーゼ－ＰＥＧRhは二相性ＰＫを示し、投与するとより速いクリアランス、続いて残っている薬物のより遅いクリアランスにより示された。我々は、ウリカーゼ－ＰＥＧRhが、コンジュゲートの間で最も低いコンジュゲーション化学量論を有し、これは潜在的にその安定性に負に影響するおそれがあることを考慮すると、特定の理論に縛られずに、これは循環中のその沈殿のせいであると仮定する。ＰＥＧコンジュゲートはｔ1/2排出が有意に異なっていた。ウリカーゼ－ＰＥＧMwはウリカーゼの循環を約１６倍延長し（ｔ1/2排出３５．５ｈ対２．２ｈ）、ウリカーゼ－ＰＥＧRhはウリカーゼの約６倍の循環しかなかった（ｔ1/2排出１３．１ｈ対２．２ｈ）。ウリカーゼ－ＰＥＧRhはウリカーゼ－ＰＥＧMwよりもはるかに低い曝露を有し、曲線下のより低い面積により示された（ＡＵＣ）（表２）。ウリカーゼ－ＰＥＧRhのより低い安定性に加えて、このＰＫ差もウリカーゼ－ＰＥＧMwのより大きなサイズに起因する可能性があり、腎クリアランスをもっと効率的に克服することを可能にしている。
薬物動態（ＰＫ）
我々は次にウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡのＰＫを調べ、それを非修飾ウリカーゼ、ウリカーゼ－ＰＥＧMw、及びウリカーゼ－ＰＥＧRhと比較した。ウリカーゼ変異体は蛍光的に標識されて、インビボで変異体を追跡した。我々は、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡが投与されると相転移しないことを確かめた。相転移温度（Ｔt）は、ＰＢＳ中での注射液濃度では体温（約４２℃）よりも上であった。ウリカーゼ変異体は、生後６週間オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝５）に静脈内（ｉ．ｖ．）注射され、続いて血漿薬物濃度を追跡し、ＰＫパラメータを計算した。
処置は、ほぼ一定の開始血漿濃度（Ｃo）を生じ、首尾よい等モルの薬物投与を示した（表２）。非修飾ウリカーゼは短い排出半減期（ｔ1/2排出）を有していた（図３Ａ；表２）。すべてのコンジュゲートは非修飾ウリカーゼよりも長いｔ1/2排出を有しており、ＰＥＧとＰＯＥＧＭＡの両方がウリカーゼのＰＫを首尾よく延ばすことを示していた（図３Ｂ；表２）。ウリカーゼ－ＰＥＧRhは二相性ＰＫを示し、投与するとより速いクリアランス、続いて残っている薬物のより遅いクリアランスにより示された。我々は、ウリカーゼ－ＰＥＧRhが、コンジュゲートの間で最も低いコンジュゲーション化学量論を有し、これは潜在的にその安定性に負に影響するおそれがあることを考慮すると、特定の理論に縛られずに、これは循環中のその沈殿のせいであると仮定する。ＰＥＧコンジュゲートはｔ1/2排出が有意に異なっていた。ウリカーゼ－ＰＥＧMwはウリカーゼの循環を約１６倍延長し（ｔ1/2排出３５．５ｈ対２．２ｈ）、ウリカーゼ－ＰＥＧRhはウリカーゼの約６倍の循環しかなかった（ｔ1/2排出１３．１ｈ対２．２ｈ）。ウリカーゼ－ＰＥＧRhはウリカーゼ－ＰＥＧMwよりもはるかに低い曝露を有し、曲線下のより低い面積により示された（ＡＵＣ）（表２）。ウリカーゼ－ＰＥＧRhのより低い安定性に加えて、このＰＫ差もウリカーゼ－ＰＥＧMwのより大きなサイズに起因する可能性があり、腎クリアランスをもっと効率的に克服することを可能にしている。
【0054】
とりわけ、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡは、ウリカーゼの循環を約２１倍延ばすことにより、ウリカーゼ－ＰＥＧRhとウリカーゼ－ＰＥＧMwの両方よりも優れていた。Ｒh適合コンジュゲートとＭw適合コンジュゲートの両方との付き合わせ比較を考慮すると、我々は、優れたＰＫプロファイルはその腎クリアラスに影響を及ぼすことが知られているコンジュゲートの物理的特性のせいではないと結論付けた。我々は、皮下（ｓ．ｃ．）注射したエキセンディン－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートの優れたＰＫプロファイルはＰＯＥＧＭＡの両親媒性構造が原因であり、ＰＥＧコンジュゲートよりも遅い吸収を可能にし、それによって排出を遅らせると以前考えた。この結論は、ｓ．ｃ．注射薬物－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートにまだ当てはまることができるけれども、薬物吸収段階を迂回することを可能にする直接血流中へのそのｉ．ｖ．投与を考慮すると、ウリカーゼコンジュゲートのＰＫプロファイルを説明しない。最後に、我々は、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡの優れたＰＫプロファイルはＰＯＥＧＭＡのブラシ構造が原因だと考えた。まとめると、これらの結果は、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡのほうがＰＥＧコンジュゲートよりも有利なＰＫを有することを示していた。
【0055】
【表2】
【0056】
（実施例５）
免疫原性
ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡのＰＫの利点を明らかにしたので、次に我々は、その免疫原性を調べた。この実験は、欧州市場からのＰＥＧ化ウリカーゼの撤退をもたらしていたペグロチカーゼ処置に対して誘発されたＰＥＧ抗体の高力価が動機となった。ＰＥＧ特異的免疫応答は多分、ＰＥＧの高度に反復性の構造によるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の交差結合に起因していた。我々は、特定の理論に縛られることなく、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートであればウリカーゼ－ＰＥＧコンジュゲートのＰＥＧ免疫原性の限界を解決すると仮定したが、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートが、ＢＣＲ交差結合を生じるおそれがあるその有意に高いＰＯＲＧＭＡ密度（約２７ＰＯＥＧＭＡ対薬物あたり１）のせいで抗ＰＯＥＧＭＡ抗体を誘発するのかどうか確信がなかった。
免疫原性
ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡのＰＫの利点を明らかにしたので、次に我々は、その免疫原性を調べた。この実験は、欧州市場からのＰＥＧ化ウリカーゼの撤退をもたらしていたペグロチカーゼ処置に対して誘発されたＰＥＧ抗体の高力価が動機となった。ＰＥＧ特異的免疫応答は多分、ＰＥＧの高度に反復性の構造によるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の交差結合に起因していた。我々は、特定の理論に縛られることなく、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートであればウリカーゼ－ＰＥＧコンジュゲートのＰＥＧ免疫原性の限界を解決すると仮定したが、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡコンジュゲートが、ＢＣＲ交差結合を生じるおそれがあるその有意に高いＰＯＲＧＭＡ密度（約２７ＰＯＥＧＭＡ対薬物あたり１）のせいで抗ＰＯＥＧＭＡ抗体を誘発するのかどうか確信がなかった。
【0057】
我々は、無菌のエンドトキシンフリーＰＢＳ、ウリカーゼ－ＰＥＧMw、及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡを生後６週間のナイーブＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに３６ｎｍｏｌ ｋｇ-1の用量で繰り返し投与し、続いて血液収集して血漿に処理した（図４Ａの投与及び血液収集レジメンを参照）。コンジュゲートは血液中への吸収の間リンパ系に曝露されるので、ｓ．ｃ．注射経路を選択し、コンジュゲートの免疫原性潜在能力をもっとよく明らかにした。このレジメンは、以降の免疫アッセイにおいて循環する薬物の干渉を除去することができるので、適用され、この除去はＡＤＡ応答の展開を経時的に特徴付けつつ６日目までの全薬物排出（図３）により示された。
【0058】
我々は、確認されたＬｕｍｉｎｅｘ多重化免疫アッセイを使用した。手短に言えば、アッセイは、薬物結合及び蛍光性にバーコード化磁気ビーズを使用して、ＡＤＡ応答のサブタイプ及び特異性を評価する。特異性は、無関係なタンパク質である、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、並びにビーズ結合用のそのＰＥＧ及びＰＯＥＧＭＡコンジュゲートを使用して試験し、ＯＶＡ－結合ビーズ、ＯＶＡ－ＰＥＧ－結合ビーズ、及びＯＶＡ－ＰＯＥＧＭＡ－結合ビーズが得られた。ウリカーゼ－ＰＥＧMw－処置マウス血漿又はウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡ－処置マウス血漿においてこれらのビーズに対してシグナルが検出された場合、そのシグナルはそれぞれＰＥＧ－特異的抗体又はＰＯＥＧＭＡ－特異的抗体を示すことになる。ＯＶＡ－結合ビーズセットは、ウリカーゼとＯＶＡの間の交差反応性についての対照として使用された。ＰＢＳ処置マウス血漿は負の対照として使用された。アッセイ希釈液においてインキュベートされたマウスＩｇＭ－結合ビーズ及びＩｇＧ－結合ビーズは、正のアッセイ対照として使用し、アッセイ希釈剤においてインキュベートされた非修飾及び薬物結合ビーズは負のアッセイ対照として使用された。
【0059】
アッセイ希釈剤においてインキュベートされたアッセイ陽性対照ビーズは、高シグナルを生じ、非修飾及び薬物結合ビーズは最小シグナルを有していた（図４Ｂ）。有意なバックグラウンドシグナルは検出されず、ＰＢＳで処置されたマウスの血漿試料由来のシグナルはなかったことにより示された（図４Ｂ～Ｅ）。我々は、前処置血漿試料を試験することにより、ＰＥＧ－又はＰＯＥＧＭＡ－特異的既存の抗体がないことを確かめた。ＯＶＡ－結合ビーズは、ウリカーゼ－ＰＥＧMw－処置マウス血漿及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡ－処置マウス血漿において最小のシグナルを有し、交差反応性がないことを示した（図４Ｂ～Ｅ）。ウリカーゼ－ＰＥＧMwは、１０日目までにＩｇＭクラスＰＥＧ特異的抗体を誘発し、ウリカーゼ－ＰＥＧMw－処置マウス血漿においてＯＶＡ－ＰＥＧ－結合ビーズに結合する有意なＡＤＡにより示された（図４Ｂ）。ＰＥＧ特異的ＡＤＡ応答は４４日目まで持続し（図４Ｃ）、注射の数が増えるにしたがって増加した。この持続的なＩｇＭ応答は、Ｔ細胞非依存的免疫応答を示した。ウリカーゼ－ＰＥＧMwは強力なＩｇＧクラスＰＥＧ特異的抗体応答も生じ（図４Ｄ～Ｅ）、力価は注射ごとに増加し、クラス転換ＰＥＧ特異的抗体応答を示した。フロイントアジュバンドあり及びなしで高度に免疫原性なＯＶＡの化学量論的ＰＥＧコンジュゲートをマウスに投与すると、完全にＩｇＭクラス抗ＰＥＧ抗体応答を生じることを我々は以前明らかにした。したがって、特定の理論に縛られることなく、この強力でＩｇＧクラスＰＥＧ特異的免疫応答はおそらくウリカーゼの広範囲なＰＥＧ化のせいであり、ウリカーゼがＴ細胞ヘルプを受けてＩｇＧクラス転換免疫応答を開始するのを可能にすると我々は仮定する。際立って、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡは、ＩｇＭクラス抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答もＩｇＧクラス抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答も誘発せず（図４Ｂ～Ｅ）、ＯＶＡ－ＰＯＥＧＭＡビーズにより検出されたシグナルがないことにより示された。これらの所見により、ＰＯＥＧＭＡが、免疫原性タンパク質上極端に高密度で免疫系に提示された場合でも、非免疫原性のままであることが明らかにされた。
【0060】
（実施例６）
ＰＫに対する誘発されたＰＥＧ抗体の効果
我々は、誘発されたＰＥＧ抗体が循環薬物のＰＫに影響を及ぼすのかどうかを調べた。ウリカーゼ－ＰＥＧMw及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡを中に繰り返し投与し、続いて血漿薬物濃度を追跡し、第１と第５の注射ＰＫデータを比較した。マウスの別々のコホートに特異性についての対照として使用するウリカーゼも繰り返し投与した。ウリカーゼ－ＰＥＧMwが加速されたクリアランスを示す間、繰り返し曝露してもウリカーゼＰＫに変化が観察されない場合は、ＰＥＧ抗体媒介薬物除去が示される。
ウリカーゼ及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡ処置のＰＫは繰り返される注射に合わせて変化せず（表２）、ウリカーゼもＰＯＥＧＭＡも処置するとＰＫ変更抗体を誘発しないことを示し、我々のＡＤＡ評価を確証した。ウリカーゼ－ＰＥＧMwは、繰り返し曝露されると有意に短いｔ1/2排出を有した（３５．５対２９．６ｈ）（表２）。この変更されたＰＫプロファイルはＰＫ変更ＰＥＧ抗体の存在に起因すると我々は考えた。
ＰＫに対する誘発されたＰＥＧ抗体の効果
我々は、誘発されたＰＥＧ抗体が循環薬物のＰＫに影響を及ぼすのかどうかを調べた。ウリカーゼ－ＰＥＧMw及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡを中に繰り返し投与し、続いて血漿薬物濃度を追跡し、第１と第５の注射ＰＫデータを比較した。マウスの別々のコホートに特異性についての対照として使用するウリカーゼも繰り返し投与した。ウリカーゼ－ＰＥＧMwが加速されたクリアランスを示す間、繰り返し曝露してもウリカーゼＰＫに変化が観察されない場合は、ＰＥＧ抗体媒介薬物除去が示される。
ウリカーゼ及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡ処置のＰＫは繰り返される注射に合わせて変化せず（表２）、ウリカーゼもＰＯＥＧＭＡも処置するとＰＫ変更抗体を誘発しないことを示し、我々のＡＤＡ評価を確証した。ウリカーゼ－ＰＥＧMwは、繰り返し曝露されると有意に短いｔ1/2排出を有した（３５．５対２９．６ｈ）（表２）。この変更されたＰＫプロファイルはＰＫ変更ＰＥＧ抗体の存在に起因すると我々は考えた。
【0061】
（実施例７）
ＰＥＧ抗原性
ＰＥＧ抗体がウリカーゼ－ＰＥＧMwの早期クリアランスをもたらしたことを明らかにしたので、我々は次に、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡがＰＥＧ抗体に対して何らかの反応性を有するのかどうかを調べた。ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡがＰＥＧ抗体に対して抗原性を示さないことに我々は確信がなかった。これは、開示されたコンジュゲートが以前試験されたコンジュゲート（薬物あたり約２７ＰＯＥＧＭＡ鎖対１）よりもはるかに高いＰＯＥＧＭＡ化学量論を有するからである。ウリカーゼ表面上でのＰＯＥＧＭＡ抗原の繰り返し配置が、ＰＥＧ抗体に対するエピトープ露出を変更し、それによってＰＥＧ抗体に対する反応性が生じる可能性がある。
間接的ＥＬＩＳＡ（図５Ａ）及び競合ＥＬＩＳＡ（図５Ｂ）を使用してウリカーゼ、ウリカーゼ－ＰＥＧMw、及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡのＰＥＧ抗原性を試験した。間接的ＥＬＩＳＡでは、ウェルが等量のＰＥＧ／ＰＯＥＧＭＡ及びウリカーゼを有するように９６ウェルプレート表面上に処置を吸収し、続いてＯＶＡ－ＰＥＧ免疫化マウス血漿に存在するＰＥＧ抗体に対するその反応性を探索した。希釈液及びＯＶＡ－ＰＥＧはそれぞれ負及び正の対照として使用した。ＯＶＡ－ＰＥＧは有意なシグナルを有し、希釈剤は最小のバックグラウンドのみを生じた（図５Ａ）。ウリカーゼ－ＰＥＧMwは有意に高いシグナルを有し、コンジュゲートが血漿試料に存在するＰＥＧ抗体と反応したことを示した。しかし、ウリカーゼは、ＰＥＧを欠くので有意な吸光度はなかった。とりわけ、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡはＰＥＧ抗体に対して反応性を示さず、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡが薬物表面に繰り返し提示された場合でもＰＥＧ抗体に対して抗原性ではないことを示唆していた。
ＰＥＧ抗原性
ＰＥＧ抗体がウリカーゼ－ＰＥＧMwの早期クリアランスをもたらしたことを明らかにしたので、我々は次に、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡがＰＥＧ抗体に対して何らかの反応性を有するのかどうかを調べた。ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡがＰＥＧ抗体に対して抗原性を示さないことに我々は確信がなかった。これは、開示されたコンジュゲートが以前試験されたコンジュゲート（薬物あたり約２７ＰＯＥＧＭＡ鎖対１）よりもはるかに高いＰＯＥＧＭＡ化学量論を有するからである。ウリカーゼ表面上でのＰＯＥＧＭＡ抗原の繰り返し配置が、ＰＥＧ抗体に対するエピトープ露出を変更し、それによってＰＥＧ抗体に対する反応性が生じる可能性がある。
間接的ＥＬＩＳＡ（図５Ａ）及び競合ＥＬＩＳＡ（図５Ｂ）を使用してウリカーゼ、ウリカーゼ－ＰＥＧMw、及びウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡのＰＥＧ抗原性を試験した。間接的ＥＬＩＳＡでは、ウェルが等量のＰＥＧ／ＰＯＥＧＭＡ及びウリカーゼを有するように９６ウェルプレート表面上に処置を吸収し、続いてＯＶＡ－ＰＥＧ免疫化マウス血漿に存在するＰＥＧ抗体に対するその反応性を探索した。希釈液及びＯＶＡ－ＰＥＧはそれぞれ負及び正の対照として使用した。ＯＶＡ－ＰＥＧは有意なシグナルを有し、希釈剤は最小のバックグラウンドのみを生じた（図５Ａ）。ウリカーゼ－ＰＥＧMwは有意に高いシグナルを有し、コンジュゲートが血漿試料に存在するＰＥＧ抗体と反応したことを示した。しかし、ウリカーゼは、ＰＥＧを欠くので有意な吸光度はなかった。とりわけ、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡはＰＥＧ抗体に対して反応性を示さず、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡが薬物表面に繰り返し提示された場合でもＰＥＧ抗体に対して抗原性ではないことを示唆していた。
【0062】
競合ＥＬＩＳＡにより、間接的ＥＬＩＳＡ結果が確かめられた。ウェルは、ＰＥＧ抗体への結合を巡ってウリカーゼ変異体と種々の濃度で競合したエキセンディン－ＰＥＧで被覆した。間接的ＥＬＩＳＡ結果と一致して、ウリカーゼ－ＰＥＧMwはエキセンディン－ＰＥＧと成功裏に競合し、増加するウリカーゼ－ＰＥＧMw濃度での有意に低い吸光度により示された（図５Ｂ）。しかし、ウリカーゼは、ＰＥＧを含まなかったので、ＰＥＧ抗体への結合を巡ってエキセンディン－ＰＥＧと競合しなかった。とりわけ、ウリカーゼ－ＰＯＥＧＭＡはＰＥＧ抗体と結合せず、ＰＥＧ抗原性が広範囲にＰＯＥＧＭＡコンジュゲートされた薬物によってさえも除去されたことを確証している。
前述の詳細な記載及び付随する実施例は説明に役立つだけであり、本発明の範囲を限定する物と解釈されるべきではないことは理解されている。
開示された実施形態に対する種々の変化及び修正は当業者には明らかである。化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、又は本発明の使用方法に関係する変化及び修正を限定せずに含む、そのような変化及び修正は、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行いうる。
完璧さという理由で、本発明の種々の態様は、以下の番号付きの条項に提示される。
前述の詳細な記載及び付随する実施例は説明に役立つだけであり、本発明の範囲を限定する物と解釈されるべきではないことは理解されている。
開示された実施形態に対する種々の変化及び修正は当業者には明らかである。化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、又は本発明の使用方法に関係する変化及び修正を限定せずに含む、そのような変化及び修正は、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行いうる。
完璧さという理由で、本発明の種々の態様は、以下の番号付きの条項に提示される。
【0063】
条項１．生物活性物質、及び前記生物活性物質にコンジュゲートされた複数のポリ［オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）分子であって、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子がポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖が縦列に繰り返されるエチレングリコール（ＥＧ）の２～９単量体を含む、ＰＯＥＧＭＡ分子を含むコンジュゲートであって、生物活性物質あたり約５～約１３０のＰＯＥＧＭＡ分子を含む、コンジュゲート。
条項２．生物活性物質あたり約５～約１３０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有する、条項１に記載のコンジュゲート。
条項３．抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答を誘発しない、条項１又は２に記載のコンジュゲート。
条項４．それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を独立して有する、条項１～３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項５．生物活性物質あたり約２５～約３０のＰＯＥＧＭＡ分子を含む、条項１～４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項２．生物活性物質あたり約５～約１３０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有する、条項１に記載のコンジュゲート。
条項３．抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答を誘発しない、条項１又は２に記載のコンジュゲート。
条項４．それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を独立して有する、条項１～３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項５．生物活性物質あたり約２５～約３０のＰＯＥＧＭＡ分子を含む、条項１～４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【0064】
条項６．それぞれの側鎖が、縦列に繰り返されるＥＧの２～４単量体を含む、条項１～５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項７．生物活性物質がウリカーゼを含む、条項１～６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項８．生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格にコンジュゲートされている、条項１～７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項９．生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子にウレタン結合を通じて個別にコンジュゲートされている、条項１～８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項１０．それぞれの側鎖が、第１の末端と第２の末端を有し、第１の末端が骨格に共有結合しており、第２の末端が、アルキル、エステル、アミン、アミド、又はカルボキシル基を含む、条項１～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項１１．ポリマー－生物活性物質コンジュゲートの免疫原性を減少させる方法であって、約５～約１３０のポリ［オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）分子を生物活性物質にコンジュゲートする工程であって、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子がポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖が縦列に繰り返されるエチレングリコール（ＥＧ）の２～９の単量体を含むことによりコンジュゲートを提供する、工程を含み、コンジュゲートが、生物活性物質あたり約５～約１３０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有する、方法。
条項７．生物活性物質がウリカーゼを含む、条項１～６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項８．生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格にコンジュゲートされている、条項１～７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項９．生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子にウレタン結合を通じて個別にコンジュゲートされている、条項１～８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項１０．それぞれの側鎖が、第１の末端と第２の末端を有し、第１の末端が骨格に共有結合しており、第２の末端が、アルキル、エステル、アミン、アミド、又はカルボキシル基を含む、条項１～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
条項１１．ポリマー－生物活性物質コンジュゲートの免疫原性を減少させる方法であって、約５～約１３０のポリ［オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）分子を生物活性物質にコンジュゲートする工程であって、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子がポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合した複数の側鎖を有し、それぞれの側鎖が縦列に繰り返されるエチレングリコール（ＥＧ）の２～９の単量体を含むことによりコンジュゲートを提供する、工程を含み、コンジュゲートが、生物活性物質あたり約５～約１３０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を有するＰＥＧ－生物活性物質コンジュゲートと比べて減少した免疫応答を有する、方法。
【0065】
条項１２．コンジュゲートが抗ＰＯＥＧＭＡ抗体応答を誘発しない、条項１１に記載の方法。
条項１３．それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、生物活性物質にコンジュゲートするのに先立って、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カーボネート基、アミン基、エステル基、アジド基、アルキン基、又はその組合せで官能化される、条項１１又は１２に記載の方法。
条項１４．生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格にコンジュゲートされている、条項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
条項１５．生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子にウレタン結合を通じて個別にコンジュゲートされている、条項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
条項１６．それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、生物活性物質に非部位特異的に個別にコンジュゲートされている、条項１１～１５のいずれか１項に記載の方法。
条項１３．それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、生物活性物質にコンジュゲートするのに先立って、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カーボネート基、アミン基、エステル基、アジド基、アルキン基、又はその組合せで官能化される、条項１１又は１２に記載の方法。
条項１４．生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子の骨格にコンジュゲートされている、条項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
条項１５．生物活性物質が、それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子にウレタン結合を通じて個別にコンジュゲートされている、条項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
条項１６．それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、生物活性物質に非部位特異的に個別にコンジュゲートされている、条項１１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【0066】
条項１７．それぞれのＰＯＥＧＭＡ分子が、約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を独立して有する、条項１１～１６のいずれか１項に記載の方法。
条項１８．コンジュゲートが、生物活性物質あたり約２５～約３０のＰＯＥＧＭＡ分子を含む、条項１１～１７のいずれか１項に記載の方法。
条項１９．それぞれの側鎖が、縦列に繰り返されるＥＧの２～４単量体を含む、条項１１～１８のいずれか１項に記載の方法。
条項２０．それぞれの側鎖が、第１の末端と第２の末端を有し、第１の末端が骨格に共有結合しており、第２の末端が、アルキル、エステル、アミン、アミド、又はカルボキシル基を含む、条項１１～１９のいずれか１項に記載の方法。
条項１８．コンジュゲートが、生物活性物質あたり約２５～約３０のＰＯＥＧＭＡ分子を含む、条項１１～１７のいずれか１項に記載の方法。
条項１９．それぞれの側鎖が、縦列に繰り返されるＥＧの２～４単量体を含む、条項１１～１８のいずれか１項に記載の方法。
条項２０．それぞれの側鎖が、第１の末端と第２の末端を有し、第１の末端が骨格に共有結合しており、第２の末端が、アルキル、エステル、アミン、アミド、又はカルボキシル基を含む、条項１１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【国際調査報告】