特表 2024-532305 細胞を修飾する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-05

(54)【発明の名称】細胞を修飾する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240829BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240829BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20240829BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 14/71 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20240829BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C12N15/09 110

C12N9/16 Z ZNA

C12N5/10

C07K19/00

C12N15/09 100

C12N15/12

C12N15/85 Z

C12Q1/68

C12N15/11 Z

C12N15/19

C12N15/62 Z

C07K14/725

C07K16/28

C07K14/705

C07K14/71

C07K14/52

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024512137

(86)(22)【出願日】2022-08-24

(85)【翻訳文提出日】2024-02-22

(86)【国際出願番号】 CN2022114588

(87)【国際公開番号】W WO2023025208

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】202110974813.0

(32)【優先日】2021-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523436056

【氏名又は名称】賽斯尓▲チン▼生物技術（上海）有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＳ ＆ ＧＥＮＥＳ ＢＩＯＴＥＣＨ（ＳＨＡＮＧＨＡＩ）ＣＯ．，ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３０５，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １，Ｎｏ．５３８ Ｃａｉｌｕｎ Ｒｏａｄ，Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ，Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ａｒｅａ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000291

【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】李 林紅

(72)【発明者】

【氏名】朱 向陽

(72)【発明者】

【氏名】劉 武青

(72)【発明者】

【氏名】辛 鵬程

(72)【発明者】

【氏名】王 ▲麗▼

(72)【発明者】

【氏名】于 世鈞

(72)【発明者】

【氏名】楊 星星

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QQ79

4B063QR14

4B063QR33

4B065AA01Y

4B065AA26Y

4B065AA37Y

4B065AA99Y

4B065AB01

4B065BA01

4B065BA02

4B065BD50

4B065CA44

4B065CA60

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA50

4H045BA41

4H045DA75

4H045DA76

4H045FA74

(57)【要約】

標的分子およびスクリーニングマーカー分子を非ウイルスによって細胞にトランスフェクションして、前記細胞が前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現するようにする段階を含む、細胞を修飾する方法を提供する。前記方法により得られた修飾細胞をさらに提供する。前記方法は、目的の細胞を効果的に濃縮し、前記標的分子に対する細胞の陽性率を向上させることができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞を修飾する方法であって、
標的分子および／またはスクリーニングマーカー分子を非ウイルスによって細胞にトランスフェクションして、前記細胞が前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現するようにする段階を含むことを特徴とする、前記方法。

【請求項2】

標的分子トランスフェクションの陽性率を向上させる方法であって、
前記標的分子および／またはスクリーニングマーカー分子を非ウイルスによって細胞にトランスフェクションして、前記細胞が前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現するようにする段階を含むことを特徴とする、前記方法。

【請求項3】

前記細胞は、前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を同時に発現することを特徴とする
請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記トランスフェクションは、一過性トランスフェクションを含むことを特徴とする
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記トランスフェクションは、エレクトロポレーションを含むことを特徴とする
請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記トランスフェクションは、安定トランスフェクションを含むことを特徴とする
請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記標的分子および／または前記スクリーニングマーカー分子は、前記細胞のゲノムに組み込まれることを特徴とする
請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞。

【請求項8】

前記トランスフェクションは、トランスポゾンシステムおよび／または遺伝子編集を使用してノックインすることを含むことを特徴とする
請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記遺伝子編集方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡ編集システムＡＤＡＲ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガープロテアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびＭｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓからなる群のうちの一種または複数種から選択されることを特徴とする
請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記非ウイルストランスフェクションは、コードされた線状または環状の核酸分子を使用することを特徴とする
請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記環状核酸分子は、環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドを含むことを特徴とする
請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記プラスミドは、前記標的分子をコードする核酸分子および／または前記スクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子を含むことを特徴とする
請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記プラスミドは、前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとして機能することを特徴とする
請求項１１又は１２に記載の方法。

【請求項14】

前記核酸分子は、ｓｓＤＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡを含むことを特徴とする
根据請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記ドナープラスミドは、相同アームを含むことを特徴とする
請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

前記プラスミドは、細菌によって生成されたプラスミドを含むことを特徴とする
請求項１１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記プラスミドは、ナノプラスミド（Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ）および／またはミニサークルＤＮＡ（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ）ベクターを含むことを特徴とする
請求項１１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占めることを特徴とする
請求項１１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約２％（ｗ／ｗ）以下を占めることを特徴とする
請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約５‰（ｗ／ｗ）以下を占めることを特徴とする
請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１‰（ｗ／ｗ）以下を占めることを特徴とする
請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占めることを特徴とする
請求項１１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約２％（ｗ／ｗ）以下を占めることを特徴とする
請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核
酸分子含有量の約５‰（ｗ／ｗ）以下を占めることを特徴とする
請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項25】

前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１‰（ｗ／ｗ）以下を占めることを特徴とする
請求項２２～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１Ｍｂであることを特徴とする
請求項２２～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１０Ｍｂであることを特徴とする
請求項２２～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は、微生物に由来することを特徴とする
請求項２２～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択されることを特徴とする
請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記微生物は、グラム陰性菌を含むことを特徴とする
請求項２８又は２９に記載の方法。

【請求項31】

前記微生物は、大腸菌を含むことを特徴とする
請求項２８～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を使用して前記プラスミドを処理する段階を含むことを特徴とする
請求項１１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができることを特徴とする
請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼであることを特徴とする
請求項３２又は３３に記載の方法。

【請求項35】

前記処理は、Ｍｇ^２＋およびＣａ^２＋の存在下で前記トランスフェクション混合物と前記ＤＮａｓｅとを接触させることを含むことを特徴とする
請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記ＤＮａｓｅによって処理された後、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％以下を占めることを特徴とする
請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記ＤＮａｓｅによって処理された後、前記プラスミドを含むトランスフェクション混
合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％以下を占めることを特徴とする
請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記細胞は、真核細胞を含むことを特徴とする
請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記細胞は、免疫細胞、幹細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含むことを特徴とする
請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記幹細胞は、多能性幹細胞を含むことを特徴とする
請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記幹細胞は、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含むことを特徴とする
請求項３９又は４０に記載の方法。

【請求項42】

前記免疫細胞は、非活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択されることを特徴とする
請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含むことを特徴とする
請求項３９～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記標的分子は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを含むことを特徴とする
請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記キメラ抗原受容体は、一つまたは複数の標的を標的とすることを特徴とする
請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とすることを特徴とする
請求項４４又は４５に記載の方法。

【請求項47】

前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とすることを特徴とする
請求項４４又は４５に記載の方法。

【請求項48】

前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性抗体または抗原結合断片を含むことを特徴とする
請求項４４～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含むことを特徴とする
請求項４４～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記スクリーニングマーカー分子は、スクリーニング物に結合できるドメインを含むことを特徴とする
請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記スクリーニング物は、磁気ビーズを含むことを特徴とする
請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）切断体を含むことを特徴とする
請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記スクリーニングマーカー分子の種類は、前記細胞および／または前記標的分子の種類に対応することを特徴とする
請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記細胞は、免疫細胞であり、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体であることを特徴とする
請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現する前記細胞と前記スクリーニング物とを接触させる段階を含むことを特徴とする
請求項５０～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記スクリーニング物に結合する前記細胞を収集する段階をさらに含むことを特徴とする
請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記スクリーニング物に結合する前記細胞を前記スクリーニング物から分離させる段階をさらに含むことを特徴とする
請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

請求項１～５７のいずれか１項に記載の方法によって調製した細胞および／または細胞系。

【請求項59】

修飾された免疫細胞であって、
標的分子およびスクリーニングマーカー分子を同時に発現することを特徴とする、前記免疫細胞。

【請求項60】

前記免疫細胞は、非活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択されることを特徴とする
請求項５９に記載の免疫細胞。

【請求項61】

前記標的分子は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを含むことを特徴とする
請求項５９又は６０に記載の免疫細胞。

【請求項62】

前記キメラ抗原受容体は、一つまたは複数の標的を標的とすることを特徴とする
請求項６１に記載の免疫細胞。

【請求項63】

前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とすることを特徴とする
請求項６１又は６２に記載の免疫細胞。

【請求項64】

前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とすることを特徴とする
請求項６１～６３のいずれか１項に記載の免疫細胞。

【請求項65】

前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性抗体または抗原結合断片を含むことを特徴とする
請求項６１～６４に記載の免疫細胞。

【請求項66】

前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含むことを特徴とする
請求項６１～６５のいずれか１項に記載の免疫細胞。

【請求項67】

前記スクリーニングマーカー分子は、スクリーニング物に結合できるドメインを含むことを特徴とする
請求項５９～６６のいずれか１項に記載の免疫細胞。

【請求項68】

前記スクリーニング物は、磁気ビーズを含むことを特徴とする
請求項６７に記載の免疫細胞。

【請求項69】

前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体を含むことを特徴とする
請求項５９～６８のいずれか１項に記載の免疫細胞。

【請求項70】

前記スクリーニングマーカー分子の種類は、前記細胞および／または前記標的分子の種類に応じて選択されることを特徴とする
請求項５９～６９のいずれか１項に記載の免疫細胞。

【請求項71】

前記細胞は、免疫細胞であり、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体であることを特徴とする
請求項５９～７０のいずれか１項に記載の免疫細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、生物医学の分野に関し、具体的には、細胞を修飾する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

非ウイルストランスフェクションには、細胞治療の分野において大きな潜在的な利点がある。遺伝子操作された細胞治療製品に必要な細胞の調製にこれを使用する場合（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）、細胞治療に必要な高い細胞生存率、高い陽性率、高い細胞機能、および多数の細胞数等という特性を迅速に得る必要がある。この目標を達成するために、様々な方法を試み、例えば、初期細胞数を増加するか、またはインキュベーション時間を増加して、非ウイルストランスフェクション法によって細胞をトランスフェクションする場合に引き起こせる細胞増殖能力の低下を補うことにより、最終製品に十分な細胞数が足りない問題はない。しかしながら、初期細胞数を増加するとコストが高くなる等の問題があるが、インキュベーション時間を延長すると、細胞特性が変化して細胞のインビボ機能が大幅に低下する。別の例として、物理的トランスフェクションでエレクトロポレーション強度を向上させるか、または化学的トランスフェクションでトランスフェクション補助分子リポソーム（ｌｉｐｉｄ）やＤＮＡ濃度等を向上させることによって、トランスフェクション陽性率を向上させることができる。しかしながら、これらの方法では、細胞生存率、継続増殖能力、および細胞機能の低下を伴うことが多いため、依然として治療目的を達成することはできない。さらに、市場の既存のＧＭＰレベルのキットを利用することでスクリーニングされた細胞の陽性率を向上させることができるが、これらは、スクリーニングされた細胞が良好な細胞生存率及び良好な細胞機能を同時に有することを保証するという問題は依然として解決することはできない。従って、非ウイルス方法を使用して、比較的短期間で細胞治療の要件を満たす細胞治療製品を製造する方法は、業界が長年直面している重要な問題である。この一連の問題により、細胞治療における非ウイルストランスフェクションの効果的な適用が妨げられる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本出願は、特別な非ウイルス性細胞修飾法を提供し、前記方法により、非ウイルストランスフェクション法でトランスフェクトされたＴ細胞は、より高いトランスフェクション効率、より高い細胞生存率及び細胞増殖率を有する。これに基づいて、追加のスクリーニングおよび濃縮方法を使用して、細胞治療の要件を満たすより高い陽性率の細胞製品を得る。本出願に記載の方法は、プラスミドを定義および処理することによってプラスミドの品質要件を満たすことができ、エレクトロポレーション法は、細胞が生物学的機能（例えば、腫瘍殺傷効果）を発揮できる標的分子とスクリーニングに参加できるスクリーニング分子とを発現させて、細胞集団ＤＮＡに一緒に定点ノックイン（ｆｉｘｅｄ ｐｏｉｎｔ
ｋｎｏｃｋｉｎ）することで、前記修飾された細胞が標的分子およびスクリーニングマーカー分子を共発現できるようにするために使用され、スクリーニング分子をスクリーニングおよび濃縮することにより、標的分子を発現する細胞の割合をさらに有意に向上させることができ、この包括的な段階を使用して細胞治療製品を調製することができる。本出願に記載の方法は、高い細胞生存率、高い継続増殖能力、高い細胞機能、高い標的分子陽性率、および凍結保存後上記の特性を依然として変化させない、より短い時間内（例えば、３－９日）で臨床要件を満たす細胞を得ることができる。前記方法は、ＣＡＲＴ細胞の調製に使用されることができる。例えば、前記方法は、ＴＣＭ記憶細胞に特徴的なタンパク質（ＣＣＲ７^＋またはＣＤ６２Ｌ^＋）を高い割合で発現するＣＡＲＴ細胞を調製するために使用されることができる。

【課題を解決するための手段】

【0004】

一態様において、本出願は、標的分子および／またはスクリーニングマーカー分子を非ウイルスによって細胞にトランスフェクションして、前記細胞が前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現するようにする段階を含む、細胞を修飾する方法を提供する。

【0005】

別の態様において、本出願は、前記標的分子および／またはスクリーニングマーカー分子を非ウイルスによって細胞にトランスフェクションして、前記細胞が前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現するようにする段階を含む、標的分子トランスフェクションの陽性率を向上させる方法を提供する。

【0006】

特定の実施形態において、前記細胞は、前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を同時に発現する。

【0007】

特定の実施形態において、前記トランスフェクションは、一過性トランスフェクションを含む。

【0008】

特定の実施形態において、前記トランスフェクションは、エレクトロポレーションを含む。

【0009】

特定の実施形態において、前記トランスフェクションは、安定トランスフェクションを含む。

【0010】

特定の実施形態において、前記標的分子および／または前記スクリーニングマーカー分子は、前記細胞のゲノムに組み込まれる。

【0011】

特定の実施形態において、前記トランスフェクションは、トランスポゾンシステムおよび／または遺伝子編集を使用してノックインすることを含む。

【0012】

特定の実施形態において、前記遺伝子編集方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡ編集システムＡＤＡＲ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガープロテアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびＭｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓからなる群のうちの一種または複数種から選択される。

【0013】

特定の実施形態において、前記非ウイルストランスフェクションは、コードされた線状または環状の核酸分子を使用する。

【0014】

特定の実施形態において、前記環状核酸分子は、環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドを含む。

【0015】

特定の実施形態において、前記プラスミドは、前記標的分子をコードする核酸分子および／または前記スクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子を含む。

【0016】

特定の実施形態において、前記プラスミドは、前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとして機能する。

【0017】

特定の実施形態において、前記核酸分子は、ｓｓＤＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡを含む。

【0018】

特定の実施形態において、前記核酸分子は、相同アームを含む。

【0019】

特定の実施形態において、前記プラスミドは、細菌によって生成されたプラスミドを含む。

【0020】

特定の実施形態において、前記プラスミドは、ナノプラスミド（Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ）および／またはミニサークルＤＮＡ（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ）ベクターを含む。

【0021】

特定の実施形態において、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める。

【0022】

特定の実施形態において、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約２％（ｗ／ｗ）以下を占める。

【0023】

特定の実施形態において、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約５‰（ｗ／ｗ）以下を占める。

【0024】

特定の実施形態において、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１‰（ｗ／ｗ）以下を占める。

【0025】

特定の実施形態において、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める。

【0026】

特定の実施形態において、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約２％（ｗ／ｗ）以下を占める。

【0027】

特定の実施形態において、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約５‰（ｗ／ｗ）以下を占める。

【0028】

特定の実施形態において、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１‰（ｗ／ｗ）以下を占める。

【0029】

特定の実施形態において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１Ｍｂである。

【0030】

特定の実施形態において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１０Ｍｂである。

【0031】

特定の実施形態において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は、微生物に由来する。

【0032】

特定の実施形態において、前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラ
ミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択される。

【0033】

特定の実施形態において、前記微生物は、グラム陰性菌を含む。

【0034】

特定の実施形態において、前記微生物は、大腸菌を含む。

【0035】

特定の実施形態において、前記方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を使用して前記プラスミドを処理する段階を含む。

【0036】

特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。

【0037】

特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼである。

【0038】

特定の実施形態において、前記処理は、Ｍｇ^２＋およびＣａ^２＋の存在下で前記トランスフェクション混合物と前記ＤＮａｓｅとを接触させることを含む。

【0039】

特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅによって処理された後、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める。

【0040】

特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅによって処理された後、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占める。

【0041】

特定の実施形態において、前記細胞は、真核細胞を含む。

【0042】

特定の実施形態において、前記細胞は、免疫細胞、幹細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含む。

【0043】

特定の実施形態において、前記幹細胞は、多能性幹細胞を含む。

【0044】

特定の実施形態において、前記幹細胞は、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含む。

【0045】

特定の実施形態において、前記免疫細胞は、非活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択される。

【0046】

特定の実施形態において、前記免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0047】

特定の実施形態において、前記標的分子は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを含む。

【0048】

特定の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、一つまたは複数の標的を標的とする。

【0049】

特定の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とする。

【0050】

特定の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする。

【0051】

特定の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性抗体または抗原結合断片を含む。

【0052】

特定の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む。

【0053】

特定の実施形態において、前記スクリーニングマーカー分子は、スクリーニング物に結合できるドメインを含む。

【0054】

特定の実施形態において、前記スクリーニング物は、磁気ビーズを含む。

【0055】

特定の実施形態において、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体を含む。

【0056】

特定の実施形態において、前記スクリーニングマーカー分子の種類は、前記細胞および／または前記標的分子の種類に対応する。

【0057】

特定の実施形態において、前記細胞は、免疫細胞であり、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体である。

【0058】

特定の実施形態において、前記方法は、前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現する前記細胞と前記スクリーニング物とを接触させる段階を含む。

【0059】

特定の実施形態において、前記方法は、前記スクリーニング物に結合する前記細胞を収集する段階をさらに含む。

【0060】

特定の実施形態において、前記方法は、前記スクリーニング物に結合する前記細胞を前記スクリーニング物から分離させる段階をさらに含む。

【0061】

別の態様において、本出願は、本出願に記載の方法によって調製した細胞および／または細胞系を提供する。

【0062】

別の態様において、本出願は、標的分子およびスクリーニングマーカー分子を同時に発現する、修飾された免疫細胞を提供する。

【0063】

特定の実施形態において、前記免疫細胞は、非活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択される。

【0064】

特定の実施形態において、前記標的分子は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを含む。

【0065】

特定の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、一つまたは複数の標的を標的とする。

【0066】

特定の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とする。

【0067】

特定の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする。

【0068】

特定の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性抗体または抗原結合断片を含む。

【0069】

特定の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む。

【0070】

特定の実施形態において、前記スクリーニングマーカー分子は、スクリーニング物に結合できるドメインを含む。

【0071】

特定の実施形態において、前記スクリーニング物は、磁気ビーズを含む。

【0072】

特定の実施形態において、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体を含む。

【0073】

特定の実施形態において、前記スクリーニングマーカー分子の種類は、前記細胞および／または前記標的分子の種類に応じて選択される。

【0074】

特定の実施形態において、前記細胞は、免疫細胞であり、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体である。

【0075】

当業者は、以下の詳細な説明から、本出願の他の態様および利点を容易に認識することができる。以下の詳細な説明では、本出願の例示的な実施形態のみが示され、説明される。当業者が理解するように、本出願の内容により、当業者は、本出願が関連する発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された具体的な実施形態に変化を加えることができる。対応的に、本出願の図面および明細書における説明は、限定的なものではなく単なる例示的なものである。

【0076】

本出願に言及される発明の具体的な特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されたとおりである。以下の詳細に説明する例示的な実施形態および添付の図面を参照することにより、本出願に言及される発明の特徴および利点をよりよく理解することができる。添付図面の簡単な説明は、次のとおりである。

【図面の簡単な説明】

【0077】

【図1】本出願に記載の修飾細胞の細胞生存率を示す。

【図2】本出願に記載の修飾細胞の細胞増殖結果を示す。

【図3】本出願に記載の修飾細胞によるタンパク質の発現状況を示す。

【図4】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後のタンパク質の発現状況を示す。

【図5】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後の細胞増殖結果を示す。

【図6】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後の発現タンパク質の陽性率の状況を示す。

【図7】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後、凍結保存してから蘇生後の細胞生存率を示す。

【図8】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後、凍結保存してから蘇生後の細胞数を示す。

【図9】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後、凍結保存してから蘇生後の、標的細胞によって活性化された増殖結果を示す。

【図10】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後のインビトロでの標的細胞の殺傷状況を示す。

【図11】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後のインビボでの腫瘍の殺傷状況を示す。

【図12】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後のタンパク質発現の状況を示す。

【図13】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後のインビトロでの標的細胞の殺傷状況を示す。

【図14】本出願に記載の修飾細胞の濃縮後のインビボでの腫瘍の殺傷状況を示す。

【図15】異なる含有量を有する微生物のゲノムに由来する核酸分子のプラスミドの特性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0078】

以下、特定の具体的な実施例により本願発明の実施形態について説明するが、当業者であれば本明細書で開示された内容から本願発明の他の利点および効果を容易に理解することができる。

【0079】

用語の定義
本出願において、「安定トランスフェクション」という用語は、一般に、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外因性核酸分子の導入および組み込みを指す。例えば、前記外因性遺伝子をトランスフェクトされた細胞のゲノムに組み込む。

【0080】

本出願において、「一過性トランスフェクション」という用語は、一般に、トランスフェクションによって細胞に侵入した外因性遺伝子が前記細胞自身のゲノムも組み込まれないトランスフェクションの様式を指す。前記一過性トランスフェクションは、外因性遺伝子の短期間（例えば、少なくとも約１日、少なくとも約２日）の迅速な発現を実現することができる。前記一過性トランスフェクションによって細胞にトランスフェクトされた外因性遺伝子は、細胞が成長および／または分裂するにつれて徐々に失われる可能性がある。前記一過性トランスフェクトは、簡単な操作、短い試験期間、高い発現効率、安全性および遺伝子スクリーニングする必要がない等からなる群から選択される利点を有することができる。前記一過性トランスフェクションの操作段階は、当業者に知られている。例えば、前記一過性トランスフェクションは、リポソーム媒介トランスフェクション法によって行うことができる。例えば、前記一過性トランスフェクションは、エレクトロポレーショントランスフェクション法（例えば、エレクトロポレーション）を含むことができる。前記一過性トランスフェクションは、トランスフェクション試薬を使用することができ、例えばＦｕＧＥＮＥ６を使用することができる。

【0081】

本出願において、「デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）」という用語は、一般に、ＤＮＡ骨格上のホスホジエステル結合を切断できる酵素を指す。前記ＤＮａｓｅは、ヌクレアーゼの一種であり得る。前記ＤＮａｓｅは、（例えば、弱アルカリ性条件下で）二本鎖ＤＮＡをデオキシヌクレオチドに消化できる。例えば、前記ＤＮａｓｅは、環状核酸分子またはスーパーコイル核酸分子またはその断片（例えば、閉じた二本鎖ＤＮＡおよび／またはスーパーコイルＤＮＡ）に対して不活性であり得る（例えば、それに対して切断できない）。前記ＤＮａｓｅは、環状または線状の一本鎖ＤＮＡ核酸分子またはその断片に対して一定の活性を有することができるが、活性は、より低い可能性がある（例えば、その切断効率がより低い）。前記ＤＮａｓｅは、ＤＮＡエキソヌクレアーゼであり得る。前記ＤＮａｓｅは、ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅであり得、例えばＰｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ^ＴＭ ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅであり得る。

【0082】

本出願において、「トランスフェクション効率」という用語は、一般に、トランスフェクションを受ける細胞に導入される、および／または当該トランスフェクションを受ける
細胞によって発現される材料の相対量を指す。本出願において、前記トランスフェクションは、細胞への一種または複数種の材料（例えば、ポリヌクレオチド）の導入を指すことができる。導入された材料は、当該トランスフェクション中の細胞に安定的にまたは一時的に維持される。本出願において、前記トランスフェクション効率は、前記導入された材料の量によって測定されることができる。

【0083】

本出願において、「核酸分子またはその断片」という用語は、一般に、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボ核酸および／または前述の両方の修飾形態）またはその断片を指す。前記核酸分子またはその断片は、ヌクレオチドのポリマー形態またはその断片を含むことができる。前記核酸分子またはその断片は、場合によっては「ポリヌクレオチド」と交換的に使用されることができる。前記核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡセンス鎖およびアンチセンス鎖、ならびにその合成形態、混合物および／またはポリマーを含むことができる。前記核酸分子またはその断片は、任意のトポロジカル立体構造を含むことができ、例えば一本鎖、二本鎖、二本鎖の一部、三本鎖化、ヘアピン構造、環形および／または南京錠立体構造を含むことができる。前記核酸分子またはその断片中のヌクレオチドは、天然のものであっても、修飾されたものであってもよい。前記核酸分子またはその断片中のヌクレオチドの間は、天然に存在する、および／または非天然に存在するヌクレオチド結合によって一緒に結合されることができる。

【0084】

本出願において、「トランスフェクション混合物」という用語は、一般にトランスフェクションに必要な混合物を指す。本出願において、前記トランスフェクション混合物は、導入されることが望ましい一種または複数種の材料（例えば、ポリヌクレオチド）を含むことができる。例えば、前記トランスフェクション混合物は、トランスフェクトされる外因性遺伝子をコードする核酸分子を含むことができる。例えば、前記トランスフェクション混合物は、前記核酸分子を含むベクターを含むことができる。例えば、前記トランスフェクション混合物は、不純物をさらに含むことができる（場合によっては、前記不純物は、核酸分子またはその断片を含むことができる）。本出願において、前記不純物は、微生物由来の核酸分子またはその断片を含むことができる。前記ベクターによって担持される不純物は、前記ベクターによって担持される不純物を含むことができる（例えば、前記ベクターの骨格に対して同種または異種の核酸分子またはその断片）。

【0085】

本出願において、「総核酸分子含有量」という用語は、一般に前記トランスフェクション混合物中のヌクレオチドを有するすべての物質の総物質を指す。例えば、前記ヌクレオチドを有する物質は、前記核酸分子またはその断片および前記材料を含むことができる。

【0086】

本出願において、「微生物」という用語は、一般に、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）、細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）および／または真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）のドメインに属する真核生物および原核生物の微生物種を指す。例えば、前記微生物は、細菌、ウイルス、真菌、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、クラミジアおよび／またはスピロヘータを含むことができる。本出願において、細菌という用語は、一般に、原核生物界内のすべての門の原核生物を含む、あらゆる種類の原核生物を指す。前記細菌は、球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラストを含むことができる。前記細菌は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を含むことができる。「グラム陰性」および「グラム陽性」とは、当技術分野で周知のグラム染色法を使用した染色パターンを指す（例えば、ＦｉｎｅｇｏｌｄおよびＭａｒｔｉｎ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（診断微生物学）、第６版、ＣＶ Ｍｏｓｂｙ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、１３－１５ページ（１９８２）を参照する）。

【0087】

本出願において、「微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片」という用語は、一般に、前記微生物のゲノムに由来する核酸分子または核酸分子の断片を指す。微生物
のゲノムに由来する情報は、Ａ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｅａｒｔｈ’ｓ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （２０２０）を参照することができる。

【0088】

本出願において、「グラム陰性菌」という用語は、一般に、グラム染色で使用される一次染料を保持しないが、対比染色によって染色される細菌を指す。従って、グラム陰性菌は、一般に、グラム染色法では赤く見える。前記グラム陰性菌の細胞壁におけるペプチドグリカンの含有量は、比較的に低く、脂質の含有量は、比較的に高い。例えば、前記グラム陰性菌の細胞壁は、リポ多糖の層を有することができる。例えば、前記グラム陰性菌は、大腸菌、緑膿菌、プロテウス、赤癬菌、肺炎桿菌、ブルセラ菌、インフルエンザ（ヘモフィルス）菌、パラインフルエンザ（ヘモフィルス）菌、カタルリス（モラ）菌、アシネトバクター属、エルシニア、レジオネラニューモフィラ、百日咳菌、パラ百日咳菌、赤癬菌、パスツレラ属、コレラ菌、腸炎菌および／または赤血球菌を含むことができる。

【0089】

本出願において、「大腸菌」という用語は、一般に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを指す。大腸菌は、腸内細菌科のエシェリヒア属に属する。

【0090】

本出願において、「免疫細胞」という用語は、一般に、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。前記免疫細胞は、リンパ球、単球および／または顆粒球、ならびにそれらの前駆体および／または成熟誘導体を含むことができる。前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｔｈ細胞、天然殺傷細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞、樹状細胞および／または顆粒球を含むことができる。前記免疫細胞は、免疫エフェクター細胞を含むことができる。前記免疫エフェクター細胞は、免疫応答に関与することができ、例えば免疫エフェクター応答を促進することができる。前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、例えば、α／βＴ細胞およびγ／δＴ細胞、Ｂ細胞、天然殺傷（ＮＫ）細胞、天然殺傷Ｔ（ＮＴＫ）細胞、マスト細胞および骨髄由来の食細胞を含むことができる。

【0091】

本出願において、「幹細胞」という用語は、一般に、分化した細胞および組織を形成する可能性を様々な程度に保持しながら、自己複製する能力を有する未分化の細胞を指す。前記幹細胞は、アネルギー性幹細胞、多能性幹細胞または全能性幹細胞であり得る。ここで、前記アネルギー性幹細胞は、分化能力を失った派生幹細胞である。前記全能性幹細胞は、生物全体にみられるすべての細胞組織を形成することができる。例えば、前記全能性幹細胞は、生物全体を形成することができる。

【0092】

本出願において、「多能幹細胞」という用語は、「多能性幹細胞」と交換可能に使用され、一般に、最終的に完全な生物体にみられる細胞および組織を形成する能力があるが、完全な生物体を形成することはできない幹細胞を指す。例えば、前記多能性幹細胞は、未分化状態を維持し、正常な核型（染色体）を示しながら、インビトロで長期間に増殖するか、または事実上無制限に増殖することができる。前記多能性幹細胞は、適切な条件下で三つの胚葉すべて（外胚葉、中胚葉および内胚葉）に分化する能力を有する可能性がある。例えば、前記多能性幹細胞は、初期胚から分離されたＥＳ細胞および／または胎児の始原生殖細胞から分離された同系ＥＧ細胞を含むことができる。

【0093】

本出願において、「間葉系幹細胞」という用語は、一般に、間葉系譜を生じさせることができる細胞を指す。前記間葉系幹細胞は、前記多能性幹細胞に属すると考えることができる。前記間葉系幹細胞は、一種または複数種の間葉系譜の細胞を生じさせることができる。前記間葉系譜の細胞は、異なる組織に由来してもよく、例えば、骨髄組織、脂肪組織、筋肉組織、生殖組織（例えば、羊膜、羊水または臍帯組織）、皮膚組織、骨組織および／または歯組織に由来してもよい。

【0094】

本出願において、「免疫細胞」という用語は、一般に、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。前記免疫細胞は、リンパ球、単球および／または顆粒球、ならびにそれらの前駆体および／または成熟誘導体を含むことができる。前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｔｈ細胞、天然殺傷細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞、樹状細胞および／または顆粒球を含むことができる。前記免疫細胞は、免疫エフェクター細胞を含むことができる。前記免疫エフェクター細胞は、免疫応答に関与することができ、例えば免疫エフェクター応答を促進することができる。前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、例えば、α／βＴ細胞およびγ／δＴ細胞、Ｂ細胞、天然殺傷（ＮＫ）細胞、天然殺傷Ｔ（ＮＴＫ）細胞、マスト細胞および骨髄由来の食細胞を含むことができる。

【0095】

本出願において、「ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）」という用語は、一般に、機能的に活性ではない線維芽細胞を指す。前記ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）は、線維芽細胞（例えば、組織が損傷した場合に修復プロセスに参加することができる）に変換することができる。前記線維芽細胞（線維芽細胞とも呼ばれる）は、細胞外マトリックスを構成する構造タンパク質を分泌することができる。前記線維芽細胞は、創傷治癒や線維化等の生理学的または病理学的プロセスに密接に関連する可能性がある。

【0096】

本出願において、「筋細胞」という用語は、一般に、筋肉に由来する細胞または細胞集団を指す。前記筋細胞は、骨格筋、平滑筋（例えば、消化管、膀胱および血管由来）および心筋の細胞および組織に由来することができる。前記筋細胞は、インビトロおよびインビボの筋細胞を含むことができる。前記筋細胞は、筋細胞（例えば、筋管）、分裂および分化筋芽細胞、心筋細胞および心筋芽細胞等の分化および未分化に由来する筋細胞および筋肉組織をさらに含むことができる。

【0097】

本出願において、「プラスミド」という用語は、一般に、遺伝物質を含む構築物を指す。前記プラスミドは、遺伝物質（例えば、一つまたは複数の核酸配列）を細胞内に送達するように設計することができる。前記プラスミドは、任意の供給源からの一本鎖または二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に由来する自律複製配列を含むことができる。前記プラスミドは、本出願において「ベクター」という用語と交換可能に使用されることができる。前記プラスミドは、異なる構成を有することができ、例えば線状プラスミド、環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドであり得る。前記線状プラスミドは、線状ＤＮＡ分子であってもよい。前記スーパーコイルプラスミドは、完全な構造を維持する２本の核酸鎖を含むことができ（例えば、共有結合環形ＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡを含むことができる）、スーパーコイル構造になっている。前記環状プラスミドは、少なくとも一つの核酸鎖について完全な環状構造を維持することができる。前記プラスミドは、細胞のゲノムに組み込まれない場合がある。

【0098】

本出願において、「マルチクローニング部位」または「ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ、ＭＣＳ」という用語は、一般に、少なくとも一つの制限部位を含む核酸配列を指す。前記マルチクローニング部位は、核酸分子を本出願に記載のベクターに接続することができ、例えば前記制限部位を介して指定された部位への核酸分子の挿入を実現することができる。前記は、制限性エンドヌクレアーゼ識別部位であってもよい。例えば、前記制限性エンドヌクレアーゼは、ＡｃｌＵＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓｓｐｌ、ＭＬｕＣＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、Ｐｃｉｌ、ＡｇｅＫＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭＬｕＩ、ＢｃｅＡＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、Ｂａｅｌ、ＢｓａＸＩ、ＳｐｅＩ、Ｂｓｒｌ、Ｂｍｒｌ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｅＩ、Ａｌｕｌ、ＳｔｕＩ、Ｓｅａｌ、Ｃｌａｌ、ＢｓｐＤＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＮｓｉＩ、Ａｓｅｌ、Ｓｗａｌ、ＣｓｐＣＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｍｇＢＩ、ＰｍＬｌ、Ｄｒａｌｌｌ、Ａｌｅｌ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＡｌｗＮＩまたはＢｔｓＭｕｔＩであり得る。

【0099】

本出願において、「抗体」という用語は、一般に、指定のタンパク質またはペプチドまたはその断片と反応する免疫グロブリンを指す。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含むが、これらに限定されない任意のクラスからの抗体、ならびに任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）からの抗体であり得る。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有することができる。抗体は、例えば、ｋａｐｐａ（κ）またはｌａｍｂｄａ（λ）から選択される軽鎖を有することができる。本出願の抗体は、任意の種に由来することができる。

【0100】

本出願において、「抗原結合断片」という用語は、一般に、抗体分子の一部を指し、当該部分は、アミノ酸残基を含み、当該アミノ酸残基は、抗原と相互作用し、且つ抗原に対する抗体に特異性および親和性を与える。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含むことができるが、これらに限定されない。本出願において、「Ｆａｂ」という用語は、一般に、重鎖の可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む断片を指し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）をさらに含み、「Ｆａｂ’」という用語は、一般に、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ基末端に少量の残基（抗体ヒンジ領域からの一つまたは複数のシステインを含む）を添加することによってＦａｂとは異なる断片を指し、「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、一般に、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された二つのＦａｂ断片を含む抗体断片であるＦａｂ’の二量体を指す。「Ｆｖ」という用語は、一般に、完全な抗原識別および結合部位を含む最小の抗体断片を指す。特定の状況において、当該断片は、密接な非共有結合による一つの重鎖可変領域および一つの軽鎖可変領域の二量体から構成されることができ、「ｄｓＦｖ」という用語は、一般に、単一の軽鎖可変領域と単一の重鎖可変領域との間の結合がジスルフィド結合であるジスルフィド結合で安定されたＦｖ断片を指す。「ｄＡｂ断片」という用語は、ＶＨドメインからなる抗体断片を指す。本出願において、「ｓｃＦｖ」という用語は、一般に、抗体の一つの重鎖可変ドメインおよび一つの軽鎖可変ドメインを、柔軟なペプチドリンカーを介して対にすることによって形成される一価分子を指し、このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ_２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有することができる。

【0101】

本出願において、「キメラ抗原受容体」という用語は、一般に、抗原に結合できる細胞外ドメインおよび少なくとも一つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を指す。ＣＡＲは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）の中心成分であり、それは、抗原（例えば、腫瘍特異抗原および／または腫瘍関連抗原）結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナルドメインを含むことができる。本出願において、前記ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせた抗体の抗原（例えば、ＣＤ１９）特異性に基づくことができる。ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾されたＴ細胞は、標的抗原を発現する悪性細胞を特異的に認識して排除することができる。ＣＡＲおよびＣＡＲ－Ｔ細胞の説明については、例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ Ｒ、Ｒｉｖｉ ｀ｅｒｅ Ｉ．Ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３、３（４）：３８８－３９８、Ｔｕｒｔｌｅ ＣＪ、Ｈｕｄｅｃｅｋ Ｍ、Ｊｅｎｓｅｎ ＭＣ、Ｒｉｄｄｅｌｌ ＳＲ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２、２４（５）：６３３－６３９、Ｄｏｔｔｉ Ｇ、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｓ、Ｓａｖｏｌｄｏ Ｂ、Ｂｒｅｎｎｅｒ ＭＫ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１４、２５７（１）：１０７－１２６、ならびにＷＯ２０１３１５４７６０、Ｗ
Ｏ２０１６０１４７８９を参照することができる。

【0102】

本出願において、「二重特異性抗体」という用語は、一般に、一種または複数種の抗原上の一つ以上のエピトープを識別する可変領域を有する抗体を指す。二重特異性抗体は、全長抗体、二つまたはそれ以上のＶＬおよびＶＨドメインを有する抗体、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ等の抗体断片、共有結合または非共有結合した抗体断片を含むが、これらに限定されない。場合によっては、前記二重特異性抗体は、同じまたは異なる抗原上の二つの種の異なるエピトープを識別することができる。場合によっては、前記二重特異性抗体は、二つの異なる抗原を識別することができる。

【0103】

本出願において、「抗原結合ドメイン」という用語は、一般に、標的抗原に結合できるドメインを指す。抗原結合ドメインは、抗原に特異的に結合できる抗体と抗原受容体およびその断片、抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原に結合できるドメインであり得、前記腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、 ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、Ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＥＡ、 Ｈｅｒ２、ＧＤ２、ＭＡＧ３、ＧＰＣ３およびＮＹ－ＥＳＯ－１を含むことができるが、これらに限定されない。

【0104】

本出願において、「ＢｉＴＥ」という用語は、一般に、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）を指す。前記ＢｉＴＥは、二つの抗原結合ドメインを有する単一のポリペプチド鎖分子であり得、この二つの抗原結合ドメインのうちの一つは、Ｔ細胞抗原に結合し、且つその２番目は、標的細胞の表面に存在する抗原に結合する（Ｗ００５／０６１５４７、Ｂａｅｕｅｒｌｅ、Ｐら（２００８）「ＢｉＴＥ(R)：Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｃｒｕｉｔ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ３３：１３７－１４７、またはＢａｒｇｏｕら（２００８）「Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ Ｔ Ｃｅｌｌ－Ｅｎｇａｇｉｎｇ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ／’Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９７４－９７７を参照することができる）。

【0105】

本出願において、「相同性アーム」という用語は、一般に、相同組換えを通じて、ドナープラスミドにおいてゲノムにノックインされる外因性遺伝子を標的とするのに適したポリヌクレオチドを指す。前記相同組換えは、姉妹染色分体（ｓｉｓｔｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）間または同じ染色体で相同配列を含むＤＮＡ分子間もしくは分子内での組換えを指すことができる。二つの前記相同性アームが存在することができる（例えば、５’相同性アームおよび／または３’相同性アームが存在することができる）。前記相同性アームは、前記ドナープラスミドにノックインされる外因性遺伝子の上流および下流に位置することができる。場合によっては、ゲノム内でノックインされる外因性遺伝子の標的位置は、ヌクレアーゼの作用によって破壊される可能性がある。前記相同性アームは、当該標的位置の切断の両端（即ち、５’および／または３’末端）のＤＮＡ配列と完全に同じであるか、または少なくとも８０％の同一性を有することができる。例えば、前記相同性アームは、標的位置の切断の両端のＤＮＡ配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を有することができる。本出願において、前記ドナープラスミドは、５’相同性アームおよび／または３’相同性アームを含むことができる。

【0106】

本出願において、「細胞株」という用語は、一般に、分裂し続けることができる細胞のクローン集団を指す。例えば、前記細胞株は、インビトロで無限の増殖能力を獲得するこ
とができる。

【0107】

本出願において、「遺伝子編集」という用語は、一般に、ゲノム内での核酸の挿入、欠失および／または置換の操作を指す。前記遺伝子編集は、相同性指向修復（ＨＤＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または単一塩基の変更によって実現することができる。前記遺伝子編集は、当業者によく知られた遺伝子編集ツールを使用することができ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼシステム（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮシステムおよび／またはＣＲＩＳＰＲ技術を使用することができる。

【0108】

本出願において、「トランスポゾンシステム」という用語は、一般に、ドナーポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）から切除され且つ標的部位（例えば、細胞のゲノムＤＮＡ）に組み込まれることができるシステムを指す。前記ポリヌクレオチドは、トランスポザーゼによって標的部位に組み込まれることができる。前記トランスポゾンシステムは、トランスポザーゼを含むことができる。前記トランスポザーゼは、転移することができ且つ転移を媒介する機能的な核酸－タンパク質複合体である。前記トランスポゾンシステムは、トランスポゾン末端を含むことができる。前記トランスポゾン末端は、トランスポザーゼまたはインテグラーゼとの複合体形成に必要なヌクレオチド配列のみを示すものであり得る。前記トランスポゾン末端は、二本鎖核酸ＤＮＡであり得る。場合によっては、前記トランスポゾン末端は、転移反応において、トランスポゾンと機能的な核酸－タンパク質複合体を形成することができる。

【0109】

本出願において、「ナノプラスミド」という用語は、一般に、ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ、即ち、一つまたは複数の脂質ベースのナノベクター、ポリマーナノ粒子、金属ナノ粒子、界面活性剤ベースのエマルション、デンドリマー、バッキーボール（ｂｕｃｋｙｂａｌｌ）、ナノワイヤー、ウイルス様粒子、ペプチドまたはタンパク質ベースの粒子（例えば、アルブミンナノ粒子）および／またはナノ材料の組成物（例えば、脂質－ポリマーナノ粒子）を使用して産生したナノ粒子を指す。場合によっては、前記ナノプラスミドの大きさは、約１００ナノメートルであり得る。

【0110】

本出願において、「ミニサークルＤＮＡベクター」という用語は、一般に、親プラスミド（Ｐａｒｅｎｔａｌ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＰＰ）の部位特異的組換えの産物を指す。前記ミニサークルＤＮＡベクターは、一つのスーパーコイルＤＮＡ分子である。リコンビナーゼの作用下で、親プラスミドは、二つの環状ＤＮＡに変換され、一つは、ミニプラスミド（Ｍｉｎｉｐｌａｓｍｉｄ、ＭＰ）と呼ばれる大量の細菌骨格配列を含み、もう一つは、標的遺伝子のみを含む真核生物の発現フレームワーク、即ちミニサークルＤＮＡ（Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ、ＭＣ）である。前記ミニサークルＤＮＡベクターは、真核生物発現カセットから構成されることができる。

【0111】

本出願において、「遺伝子編集ノックイン」という用語は、一般に、遺伝子操作プロセス（例えば、ｋｎｏｃｋ－ｉｎとも呼ばれることもある）を指し、当該プロセスは、遺伝子座のＤＮＡ配列情報の１対１の置換または内因性部位内に見つからない配列情報の挿入を含む。前記遺伝子編集ノックインは、遺伝子の相同組換えを使用することができる。例えば、遺伝子の相同組換えを使用すると、外因性機能性遺伝子（ゲノムにはもともと存在しないか、または不活性化された遺伝子）を細胞に導入し、且つゲノム内の相同配列と相同組換えを実行して、それらをゲノムに挿入し、且つ細胞内で発現させる。例えば、前記遺伝子編集ノックインは、細胞ゲノムを少なくとも部分的に外因性遺伝子で置換することができる。前記遺伝子編集ノックインは、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、部位特異的な「標的ノックイン」を実現することができる。

【0112】

本出願において、「約」という用語は、一般に、本出願で言及される指定値または数値
範囲の３０％以内、２５％以内、２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、０．５％以内または０．０５％以内を指す。本出願において、前記「約」が二つ以上の数値のうちの最初の地を指す場合、それは、当該一連の各数値に適用される。

【0113】

発明の詳細な説明
一態様において、本出願は、標的分子および／またはスクリーニングマーカー分子を非ウイルスによって細胞にトランスフェクションして、前記細胞が前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現するようにする段階を含む、細胞を修飾する方法を提供する。

【0114】

別の態様において、本出願は、前記標的分子および／またはスクリーニングマーカー分子を非ウイルスによって細胞にトランスフェクションして、前記細胞が前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現するようにする段階を含む、標的分子トランスフェクションの陽性率を向上させる方法を提供する。

【0115】

本出願において、前記細胞は、前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を同時に発現することができる。

【0116】

本出願において、前記トランスフェクションは、一過性トランスフェクションを含むことができる。例えば、前記トランスフェクションは、エレクトロポレーションを含むことができる。前記エレクトロポレーションとは、細胞エレクトロトランスフェクション、または細胞エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を指すことができる。前記エレクトロポレーションは、強力な瞬間電池の効果を利用して、帯電した物質を一定の透過性を有する細胞膜を通って細胞内へ侵入させることができる。前記エレクトロポレーションは、細胞毒性をほとんど生じない。化学的トランスフェクション法および／またはウイルストランスフェクション法と比較して、前記エレクトロポレーションによって産生された細胞毒性は、大幅に低下する。前記エレクトロポレーションは、ほぼすべての種類の真核細胞に適用されることができる。前記エレクトロポレーションは、外因性タンパク質を一時的にまたは安定に発現するために使用されることができる。

【0117】

本出願において、前記トランスフェクションは、安定トランスフェクションを含むことができる。

【0118】

本出願において、前記トランスフェクション（例えば、安定トランスフェクション）は、トランスポゾンシステム（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムを含むことができる）を使用するトランスフェクションを含むことができる。

【0119】

本出願において、前記標的分子および／または前記スクリーニングマーカー分子は、前記細胞のゲノムに組み込まれることができる。

【0120】

本出願において、前記トランスフェクションは、遺伝子編集ノックインを含むことができる。

【0121】

本出願において、前記遺伝子編集方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡ編集システムＡＤＡＲ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガープロテアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびＭｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓからなる群のうちの一種または複数種から選択されることができる。本出願において、前記遺伝子編集方法は、ヌクレアーゼが前記標的分子および／または前記スクリーニングマーカー分子の前記細胞のゲノムへの組み込みを助けることができる限り、様々なヌクレアーゼを
使用することができる。

【0122】

本出願において、前記遺伝子編集方法は、遺伝子編集の目的を達成できる限り、当業者に周知の方法であり、特定の方法に限定されない。本出願において、前記遺伝子編集方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡ編集システムＡＤＡＲ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガープロテアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびＭｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓからなる群のうちの一種または複数種から選択されることができる。例えば、前記遺伝子編集方法としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することができる。

【0123】

本出願において、前記遺伝子編集は、遺伝子編集ノックアウトおよび／または遺伝子編集ノックインを含むことができる。例えば、前記遺伝子編集は、遺伝子編集ノックインを含むことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、前記遺伝子編集ノックインを実行することができる。

【0124】

例えば、前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、クラスター化された規則的に間隔をあけられた短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲｓ）およびいくつかの機能的に関連したタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、Ｃａｓ）のクラスを含むことができる。ここで、前記Ｃａｓタンパク質コード遺伝子は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２及びＣｓｎ２を含むことができる。例えば、Ｃａｓ９であり得る。前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）は、ＤＮＡ分子に対して標的化された切断特異性を有することができる。

【0125】

例えば、前記遺伝子編集ノックインは、細胞内の特異的ＤＮＡ配列にＣａｓタンパク質を標的にして、ＤＮＡ配列を挿入するプロセスであり得る。前記遺伝子編集ノックインは、前記ドナープラスミドに前記ノックインされる外因性遺伝子とその標的細胞内の特異的ＤＮＡ配列との間の、Ｃａｓ タンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）を介した相同組換えプロセスであり得る。

【0126】

本出願において、前記非ウイルストランスフェクションは、コードされた線状または環状の核酸分子を使用することができる。

【0127】

例えば、前記環状核酸分子は、環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドを含むことができる。

【0128】

本出願において、前記プラスミドは、ＤＮＡプラスミドであり得る。例えば、前記ＤＮＡプラスミドは、二本鎖の閉環ＤＮＡ分子であり得る。例えば、前記ＤＮＡプラスミドは、二本鎖の線状ＤＮＡ分子であり得る。本出願において、前記プラスミドは、人工合成であり得る。

【0129】

本出願において、前記プラスミドは、細菌によって産生されたプラスミドを含むことができる。本出願において、前記プラスミドは、ナノプラスミド（Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ）および／またはミニサークルＤＮＡ（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ）ベクターを含むことができる。

【0130】

本出願において、前記プラスミドは、マルチクローニングサイトを含むことができる。前記プラスミドは、少なくとも一つの標的分子をコードすることができる。前記標的分子は、一種または複数種の抗原結合断片（例えば、抗体）、キメラ抗原受容体、サイトカインおよび／またはケモカインをコードすることができる。前記標的分子は、任意の一種または複数種の機能タンパク質をさらにコードすることができる。例えば、前記機能タンパ
ク質は、遺伝子欠陥に関連する疾患の治療に使用されることができる。例えば、前記機能タンパク質は、トランスフェクトされた細胞が位置する宿主（ｈｏｓｔ）内で欠失および／または突然変異したタンパク質であり得る。例えば、前記機能性タンパク質を発現する外因性遺伝子は、前記ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）（例えば、初代ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ））、筋細胞および／または幹細胞（例えば、ｉＰｓ細胞）にトランスフェクトされることができる。

【0131】

本出願において、前記標的分子をコードする核酸分子および／または前記スクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子は、内因性プロモーターまたは外因性プロモーターを介して発現されることができる。例えば、前記プラスミドは、前記外因性プロモーターを含むことができる。

【0132】

本出願において、ここで、前記プラスミドは、前記標的分子をコードする核酸分子および／または前記スクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子を含むことができる。例えば、前記標的分子をコードする核酸分子および前記スクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子は、同じプラスミド上に位置する。例えば、前記標的分子をコードする核酸分子および／または前記スクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子との間は、リンカー配列によって連結されることができる。前記リンカー配列は、前記標的分子をコードする核酸分子および／または前記スクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子の発現および／または機能に影響を及ぼさない。例えば、前記リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする配列を含むことができる。例えば、前記リンカー配列は、２Ａ配列をコードする核酸分子を含むことができる。

【0133】

本出願において、前記プラスミドは、前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとして機能することができる。例えば、前記ドナープラスミドは、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡであり得る。前記ドナープラスミドは、ＨＤＲ修復メカニズムのドナーテンプレートとして機能する。

【0134】

本出願において、前記核酸分子は、ｓｓＤＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡを含むことができる。本出願において、前記核酸分子は、人工合成であり得る。

【0135】

本出願において、前記プラスミドは、ｓｓＤＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡを含むことができる。本出願において、前記プラスミド（例えば、前記ドナープラスミド）は、相同アームを含むことができる。前記プラスミドは、人工合成であり得る。

【0136】

本出願において、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約１０％（ｗ／ｗ）以下、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．
１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下であり得る）を占めることができる。

【0137】

本出願において、前記微生物のゲノムに由来する核酸分子の断片の大きさは、少なくとも約４８ｋｂの大きさ（例えば、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋ
ｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）であり得る。

【0138】

本出願において、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさ（例えば、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）の核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約１０％（ｗ／ｗ）以下、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下であり得る）を占めることができる。

【0139】

本出願において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下を占めることができる。例えば、前記少なくとも４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約２％以下を占めることができ、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約５‰（ｗ／ｗ）以下を占めることができ、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１‰（ｗ／ｗ）以下を占めることができる。

【0140】

本出願において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさ（例えば、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）の核酸分子またはその断片は、前記プラスミドとは異なる核酸分子中に存在する。例えば、前記少
なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は、トランスフェクション混合物（前記トランスフェクション混合物は、プラスミドを含むことができる）中に遊離する。例えば、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は、前記プラスミドに遊離する。前記遊離は、前記プラスミドに結合しない形態で、単独で存在することができる。

【0141】

本出願において、前記プラスミド（例えば、線状プラスミド）が（例えば、エキソヌクレアーゼＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ等のエキソヌクレアーゼ等のデオキシリボヌクレアーゼ）処理された後、本出願に記載の少なくとも約４８ｋｂの大きさを有する核酸分子またはその断片（例えば、線状核酸分子またはその断片であり得る）の含有量、および／または本出願に記載の微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片（例えば、線状核酸分子またはその断片であり得る）の含有量は、本出願に記載の条件を満たす。本出願において、前記処理は、環状構造を有する核酸分子に影響を及ぼさないことができる。

【0142】

本出願において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は、微生物に由来することができる。例えば、前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択されることができる。

【0143】

本出願において、前記微生物は、グラム陰性菌を含むことができる。例えば、前記微生物は、ベクターの骨格ベクターを調製するのに適した微生物であり得る。例えば、前記微生物は、大腸菌を含むことができる。

【0144】

本出願において、前記細胞は、真核細胞を含むことができる。前記真核細胞は、植物細胞、真菌細胞および／または動物細胞を含むことができる。ここで、前記動物細胞は、哺乳動物細胞を含むことができる。

【0145】

本出願において、前記細胞は、幹細胞、免疫細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含むことができる。例えば、前記幹細胞は、多能性幹細胞を含むことができる。例えば、前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣｓ）を含むことができる。前記胚性幹細胞は、三つの原始胚葉（例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉）に分化することができ、これら三つの胚葉は、最終的に器官および組織を形成することができる。前記多能性幹細胞は、胚盤葉上幹細胞（ＥｐｉＳＣｓ）を含むことができる。前記多能性幹細胞は、転写因子（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４）のトランスフェクション後の哺乳類成体細胞の（例えば、マウス尾部の皮膚細胞）の脱分化によって形成されることができる、人工多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ）をさらに含むことができる。

【0146】

本出願において、前記幹細胞は、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含むことができる。前記造血幹細胞は、血液細胞（例えば、骨髄系の血液細胞およびリンパ系の血液細胞）に分化することができる。前記造血幹細胞は、多分化能および自己複製の特徴を有することができる。前記造血幹細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、血小板、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞からなる群から選択される細胞に分化されることができる。

【0147】

前記間葉系幹細胞は、胚発生の初期段階の中胚葉に由来する自己複製能を有し、多方向への分化能を有し、インビトロでの大規模増幅後も依然としてその生物学的特性を維持することができる、成体幹細胞である。前記間葉系幹細胞は、ＨＬＡ－Ｉクラス抗原を発現することができる。前記間葉系幹細胞は、ＨＬＡ－ＩＩクラス抗原を発現しないか、または発現量が低い場合がある。前記間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞に分化
する能力を有することができ、造血幹細胞の顆粒球、マクロファージおよび巨核球への分化もサポートすることができる。前記間葉系幹細胞は、サイトカインを分泌することができ、例えばＣＳＦ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ｃ－ｋｉｔｌｉｇａｎｄおよび／またはＩＬ－３を分泌することができる。

【0148】

本出願において、前記免疫細胞は、免疫エフェクター細胞を含むことができる。例えば、前記免疫エフェクター細胞は、リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞）、マクロファージ、樹状細胞およびＮＫ細胞を含むことができる。例えば、前記免疫細胞は、Ｔリンパ球（例えば、活性化Ｔリンパ球であってもよく、非活性化Ｔリンパ球であってもよい）、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択されることができる。例えば、前記免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含むことができる。前記初代Ｔ細胞は、個体から得られたＴ細胞（例えば、個体から得ることができる末梢血Ｔ細胞）を含むことができる。前記初代Ｔ細胞は、長期間培養して維持されたＴ細胞とは異なる場合がある。

【0149】

本出願において、前記標的分子は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを含むことができる。

【0150】

本出願において、前記キメラ抗原受容体は、一つまたは複数の標的を標的とすることができる。

【0151】

本出願において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とすることができる。

【0152】

本出願において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とすることができる。

【0153】

本出願において、前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性抗体または抗原結合断片を含むことができる。

【0154】

本出願において、前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含むことができる。

【0155】

本出願において、前記標的分子は、：抗体（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／または多重特異性抗体）、Ｉｇ型完全な抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）、抗体断片（例えば、ＶＨＨ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ）_２、ｓｃＦｖ）、サイトカイン、ケモカイン、キメラ抗原受容体およびＭＨＣ複合体（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｇ）からなる群から選択されることができる。

【0156】

例えば、前記標的分子は、ＣＡＲＴを含むことができる。例えば、前記標的分子は、ＣＡＲＴおよびサイトカイン（例えば、ＩＬ－１５）を含むことができる。例えば、前記標的分子は、ＣＡＲＴ－ＢｉＴＥを含むことができる。

【0157】

本出願において、前記標的分子をコードする核酸分子および／または前記スクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子は、天然のものであっても、工学的の改変により得られた遺伝子であってもよい。

【0158】

本出願において、前記プラスミドは、前記標的分子をコードする核酸分子および／または前記スクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子またはその断片の末端に相同な相同アームを含むことができる。例えば、前記核酸分子またはその断片の５’末端および
／または３’末端は、それぞれトランスフェクションされる細胞集団ＤＮＡでノックインされる一の５’末端および／または３’末端の核酸配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の同一性の核酸配列を有する。例えば、前記相同アームは、１００－１０００ｂｐの大きさであり得る。例えば、前記相同アームは、約１５０ｂｐ－１０００ｂｐ、約２００ｂｐ－１０００ｂｐ、約３００ｂｐ－１０００ｂｐ、約４００ｂｐ－１０００ｂｐ、約８００ｂｐ－１０００ｂｐであり得る。

【0159】

本出願において、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体を含むことができる。本出願において、前記スクリーニングマーカー分子は、抗生物質を含むこともできる。

【0160】

本出願において、前記スクリーニングマーカー分子の発現および／または機能は、前記標的分子の発現および／または機能に影響を及ぼさない。

【0161】

本出願において、前記スクリーニングマーカー分子の種類は、前記細胞および／または前記標的分子の種類に対応することができる。

【0162】

例えば、前記細胞は、免疫細胞であり得、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体であり得る。例えば、前記細胞は、ＣＡＲＴ細胞であり得、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４であり得る。

【0163】

本出願において、前記方法は、前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現する前記細胞と前記スクリーニング物とを接触させる段階を含むことができる。

【0164】

本出願において、前記方法は、前記スクリーニング物に結合する前記細胞を収集する段階をさらに含むことができる。

【0165】

本出願において、前記方法は、前記スクリーニング物に結合する前記細胞を前記スクリーニング物から分離させる段階をさらに含むことができる。

【0166】

本出願において、前記スクリーニングマーカー分子は、スクリーニング物に結合できるドメインを含むことができる。本出願において、前記スクリーニング分子と前記スクリーニング物との結合を通じて、所望の前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子でトランスフェクトされた細胞は、収集されることができ（例えば、前記スクリーニング物によって分離されることができる）、および／または濃縮されることができる。例えば、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４であり得、本出願に記載の方法によって発現された細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、ＣＤ３４を発現する。前記ＣＤ３４発現細胞を、ＣＤ３４抗体を含むマイクロ磁気ビーズと接触させる。ＣＤ３４とＣＤ３４との抗体間の相互作用により、ＣＤ３４発現細胞は、当該マイクロ磁気ビーズに結合する。ＣＤ３４を発現するマイクロ磁気ビーズに結合した細胞を収集する。さらに、収集された細胞を当該マイクロ磁気ビーズから分離させることができる。このようにして、前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子（即ち、陽性）を発現した細胞を得ることができる。従って、本出願に記載の方法は、細胞トランスフェクション（例えば、非ウイルストランスフェクション）の陽性率を向上させることができる。

【0167】

本出願において、前記スクリーニング物は、磁気ビーズを含むことができる。例えば、前記スクリーニング物は、マイクロ磁気ビーズを含むことができる。

【0168】

本出願において、前記方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を使用して前記プラスミドを処理する段階をさらに含むことができる。

【0169】

例えば、前記ＤＮａｓｅによって処理された後、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占めることができる。別の例として、前記ＤＮａｓｅによって処理された後、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物中の総核酸分子含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下を占めることができる。

【0170】

本出願において、本出願に記載の方法は、前記トランスフェクション混合物において前記核酸分子またはその断片の含有量を低下させる段階を含むことができる。本出願において、前記低下は、前記トランスフェクション混合物中の前記核酸分子またはその断片の含有量を、本出願に記載の方法の要件を満たすまで低下させることを指すことができる。

【0171】

本出願において、前記低下は、前記トランスフェクション混合物を精製することを含むことができる。即ち、前記精製を通じて、前記トランスフェクション混合物中の前記核酸分子またはその断片の含有量を、本出願に記載の方法の要件を満たすまで低下させることができる。本出願において、前記精製を通じて、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片を除去し、および／または前記微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片を除去することができる。例えば、前記精製は、当業者に周知のＤＮＡ精製方法を使用して、前記トランスフェクション混合物中の前記核酸分子またはその断片の含有量を低下させることを含むことができる。本出願において、前記精製は、前記プラスミドのＤＮＡの完全性および／または活性に影響を及ぼさないことができる。本出願において、前記低下は、ＤＮａｓｅ、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢ及び塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される試薬を使用して前記トランスフェクション混合物を精製することを含むことができる。例えば、前記低下は、使用ＤＮａｓｅを使用することができる。例えば、ＤＮａｓｅを使用して、前記トランスフェクション混合物中の前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量が、本出願に記載の方法の要件を満たすまで低下させることができ、および／または前記微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が本出願に記載の方法の要件を満たすまで低下させることができる。例えば、前記ＤＮａｓｅは、前記環状プラスミドのＤＮＡの完全性および／または活性に影響を及ぼさないことができる。

【0172】

本出願において、前記低下は、本出願に記載のプラスミドを人工合成するＤＮＡ、および本出願に記載のトランスフェクション混合物が検出されるＨＰＬＣからなる群から選択される方法を使用することを含むことができる。例えば、プラスミドのヌクレオチド配列に従ってＤＮＡを人工的に合成することができ、得られたプラスミドは、当該プラスミドのヌクレオチド配列のみを含むことができる。例えば、ＨＰＬＣに従って、本出願に記載のトランスフェクション混合物を検出することができ、ＨＰＬＣの検出結果に従って、前記プラスミドに対応する特徴的なピークを選択することができ、当該特徴的なピークに対応する成分を収集することで、得られたプラスミドは、当該プラスミドのヌクレオチド配列のみを含むことができる。

【0173】

本出願において、本出願に記載の方法を使用することにより、トランスフェクション効率および／または細胞の陽性率を有意に向上させることができ、非ウイルストランスフェクション法を使用して、細胞治療用の修飾細胞を調製することができる。本出願に記載の方法によって調製された修飾細胞は、より細胞生存率および／またはより高い持続的な増
殖能力を有することができる（例えば、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）後の検出時間範囲（例えば、少なくとも９日間）にわたってより高い増殖能力を維持することができる）。本出願に記載の方法によって調製された修飾細胞は、より高い細胞機能を有することができる（例えば、腫瘍細胞を効果的に殺傷する能力を有することができる）。本出願に記載の方法は、細胞治療に必要な修飾細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）を調製するために使用されることができる。本出願に記載の方法は、非ウイルストランスフェクション（例えば、プラスミドトランスフェクション）法を使用して、初代Ｔ細胞に基づいて、ＣＡＲＴ細胞、および／またはＣＡＲＴ－ＢｉＴＥ細胞を調製するために使用されることができる。

【0174】

別の態様において、本出願は、本出願に記載の方法によって調製した細胞および／または細胞系を提供する。

【0175】

別の態様において、本出願は、標的分子およびスクリーニングマーカー分子を同時に発現する、修飾された免疫細胞を提供する。

【0176】

本出願において、前記免疫細胞は、非活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択されることができる。

【0177】

本出願において、前記標的分子は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを含むことができる。

【0178】

本出願において、前記キメラ抗原受容体は、一つまたは複数の標的を標的とすることができる。

【0179】

本出願において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とすることができる。

【0180】

本出願において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とすることができる。

【0181】

本出願において、前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性抗体または抗原結合断片を含むことができる。

【0182】

本出願において、前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含むことができる。

【0183】

本出願において、前記スクリーニングマーカー分子は、スクリーニング物に結合できるドメインを含むことができる。

【0184】

本出願において、前記スクリーニング物は、磁気ビーズを含むことができる。
本出願において、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体を含むことができる。

【0185】

本出願において、前記スクリーニングマーカー分子の種類は、前記細胞および／または前記標的分子の種類に応じて選択されることができる。

【0186】

本出願において、前記細胞は免疫細胞ではよく、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体であり得る。

【0187】

いかなる理論によって制限されることを意図するものではなく、以下の実施例は、本願の発明の様々な技術的解決策を説明するためだけのものであり、本願の発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【実施例1】

【0188】

非ウイルストランスフェクションによって得られる修飾細胞の特性
（１．１）プラスミド中の微生物のゲノムに由来する核酸分子含有量の検出
大腸菌ＤＮＡ定量検出キット（Ｃａｔ＃４４５８４３５、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用し、キットの説明書に記載の方法に従って、市販のプラスミド（ここで、異なる購入元に応じて、プラスミドをソースＡ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）プラスミドおよびソースＢ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）プラスミドと呼ぶ）に含まれる微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片（主に大腸菌のゲノムＤＮＡである）に対してｑＰＣＲ定量測定を実行する。ｑＰＣＲは、ＣＦ９６ Ｔｏｕｇｈ ｑＰＣＲ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入される）を使用して実行される。

【0189】

測定の結果は、図１５に示されたとおりである。図１５の結果は、これらのプラスミド中の微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量に有意な差があることを示す。ここで、ソースＡプラスミドの結果は、列１に示されたとおりであり、ソースＢプラスミドの結果は、列２に示されたとおりである。ソースＡプラスミドにおいて、微生物のゲノムに由来する核酸分子の含有量は、総核酸分子含有量の１２μｇ／ｍｇを占め、ソースＢプラスミドにおいて、微生物のゲノムに由来する核酸分子の含有量は、総核酸分子含有量の１μｇ／ｍｇ以下を占める。

【0190】

ソースＡプラスミドおよびソースＢプラスミドに、それぞれＣＤ１９ ＣＡＲ及びＣＤ３４を発現できる核酸分子を含めるようにする。ここで、ＣＤ３４をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されたとおりである。ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されたとおりである。

【0191】

これらのプラスミドを、それぞれＣＤ１９ ＣＡＲ－ＣＤ３４－Ａ及びＣＤ１９ ＣＡＲ－ＣＤ３４－Ｂと呼び、これらのプラスミドを、Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄで２日間活性化（Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄｓ及び収集したヒトＴ細胞を使用して、Ｘ－ｖｉｖｏ１５＋２０Ｕ／ｍｌ培地で１：１の比率で活性化する）したヒトＴ細胞にエレクトロポレーションし、エレクトロポレーション後１日目または４日目の細胞生存率、細胞増殖によって得られた相対細胞数及びＣＡＲの発現能力をそれぞれ検出する。結果は、それぞれ図１５に示されたとおりであり、ここで、ソースＡプラスミドの結果は、列１に示されたとおりであり、ソースＢプラスミドの結果は、列２に示されたとおりである。

【0192】

図１５の結果は、プラスミド中の微生物のゲノムに由来する核酸分子の含有量が低下する場合、プラスミドでトランスフェクトされた細胞の細胞生存率、細胞増殖および／または発現能力（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する）が有意に向上されることができることを示す。

【0193】

（１．２）ＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＣＤ３４を発現できるプラスミドを調製する。ここで、ＣＤ３４をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されたとおりである。ＧＰＣ３ ＣＡＲをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されたとおりである。

【0194】

Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄｓ及び収集したヒトＴ細胞を使用して、Ｘ－ｖｉｖｏ１５＋２０
Ｕ／ｍｌ培地で１：１の比率で活性化する。

【0195】

調製したプラスミドを、Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄで２日間活性化したヒトＴ細胞にエレクトロポレーションし、ＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＣＤ３４をコードする核酸分子は、ヒトＴ細胞のゲノムにノックインされ、内因性プロモーターによって制御及び発現されることができる。得られた細胞は、ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞と名付けられる。

【0196】

（１）細胞生存率
図１は、前記プラスミドのエレクトロポレーション後１～４日目における、様々なサンプルのヒトＴ細胞に対するエレクトロポレーション後の細胞の細胞生存率を示す。細胞生存率は、ＮＣ－２００でカウントして得る。ここで、各サンプルに対応する左から右への結果１～４は、順次にエレクトロポレーション後１日目、２日目、３日目および４日目の結果を表す。従って、修飾細胞は、それ自体の細胞生存率に影響しない。

【0197】

（２）細胞増殖
図２は、前記プラスミドのエレクトロポレーション後０～４日目における、様々なサンプルのヒトＴ細胞に対するエレクトロポレーション後の細胞の細胞数を示す。細胞生存率は、ＮＣ－２００でカウントして得る。ここで、各サンプルに対応する左から右への結果１～５は、順次にエレクトロポレーション後０日目、１日目、２日目、３日目および４日目の結果を表す。従って、修飾細胞は、それ自体の細胞増殖に影響しない。

【0198】

（３）発現能力
ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞におけるＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＣＤ３４を発現する発現率をそれぞれ統計する。結果は、図３に示されたとおりである。ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞におけるＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＣＤ３４の発現には、線状相関関係があることがわかる。

【実施例2】

【0199】

濃縮された修飾細胞の特性
ＣＤ３４を発現する細胞とＣＤ３４抗体を含むマイクロ磁気ビーズ（ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ Ｋｉｔ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ｈｕｍａｎ、Ｏｒｄｅｒ ＮＯ．１３０－１００－４５３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）との間の特異的結合に従って、キットに提供される濃縮段階を使用して、実施例１で調製したＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞を濃縮する。濃縮したＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞を得る。

【0200】

（１）発現能力及び細胞生存率
濃縮したＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞におけるＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＣＤ３４を発現する発現率をそれぞれ統計する。結果は、図４に示されたとおりである。ここで、各サンプルに対応する左から右への結果１～３は、順次にＧＰＣ３ ＣＡＲ、ＣＤ３４の発現率、および濃縮したＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞の細胞生存率を表す。濃縮したＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞における濃縮操作は、ＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＣＤ３４の発現に影響を及ぼさないことがわかる。同時に、濃縮操作は、ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞の細胞生存率に影響を及ぼさない。

【0201】

（２）細胞増殖
実施例１に記載のプラスミドのエレクトロポレーション後４日目に、各サンプルの濃縮ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞の細胞倍加率を計算する。ここで、前記倍加率＝（エレクトロポレーション後４日目に濃縮したＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞の数）／（エレクトロポレーション０日目にエレクトロポレーションされるＴ細胞の数）であり、結果は、図５に示されたとおりである。

【0202】

図５の結果は、濃縮ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞がエレクトロポレーション後も依然としてより高い細胞増殖能力を保持していることを示す。

【0203】

（３）陽性率
フローサイトメトリーにより、実施例１で調製したＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞および実施例２で調製した濃縮ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞がＧＰＣ３ ＣＡＲを発現する陽性率をそれぞれ統計する。結果は、それぞれ図６Ａ及び６Ｂに示されたとおりである。結果は、陽性率が濃縮前の約２０％から濃縮後の８３％まで増加することができることを示す。濃縮された修飾細胞が発現の陽性率を効果的に向上させることができることがわかる。

【実施例3】

【0204】

修飾細胞の蘇生能力
実施例１で調製した五つのサンプル由来のＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞をエレクトロポレーション後４日目に、ＣＤ３４抗体を含むマイクロ磁気ビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄ）で濃縮し、濃縮後に凍結保存する。凍結保存の具体的な段階は、次のとおりである。細胞（１０００ＲＰＭ、５ｍｉｎ）を遠心分離し、上清を吸い取る。さらに遠心分離してチューブ壁に付着した培地上清を除去する。４℃のＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０凍結溶液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）を加え、ＣｏｏｌＣｅｌｌ凍結保存ボックスに入れ、－８０℃で一晩置いた後、液体窒素に入れる。

【0205】

（１）生存率
凍結保存した細胞を蘇生させ、蘇生後の様々な日におけるＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４
Ｔ細胞の生存率を検出する。結果は、図７に示されたとおりである。図７の結果は、本出願に記載の修飾細胞が良好な凍結保存後の蘇生能力を有することを示す。

【0206】

（２）細胞増殖
凍結保存した細胞を蘇生させ、蘇生後の様々な日におけるＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４
Ｔ細胞の細胞数を検出する。結果は、図８に示されたとおりである。ここで、各サンプルに対応する左から右への結果１～４は、順次に蘇生後０日目、１日目、２日目および３日目の細胞数を表す。図８の結果は、本出願に記載の修飾細胞が凍結保存して蘇生された後も依然として良好な増殖能力を有することを示す。

【0207】

（３）標的細胞の活性化能力
凍結保存した細胞を蘇生させ、蘇生後３日目に、蘇生したＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４
Ｔ細胞をＨｕｈ－７標的細胞とエフェクター細胞対標的細胞の比率１：１で混合してインキュベートし、インキュベーション後のＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞の細胞数を検出する。結果は、図９に示されたとおりである。図９の結果は、本出願に記載の修飾細胞が凍結保存蘇生後も依然として標的細胞によって活性化される増殖能力を有することを示す。

【実施例4】

【0208】

腫瘍に対する修飾細胞の殺傷能力
（１）インビトロ殺傷能力
実施例２で調製した濃縮ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞を、異なるエフェクター細胞対標的細胞の比率でインビトロでＨｕｈ－７標的細胞と混合し、Ｈｕｈ－７の殺傷比率（％）を検出する。結果は、図１０に示されたとおりである。ここで、対照とは、実施例１に記載のプラスミドでトランスフェクトされていないＴ細胞を指す。ここで、１－３は、様々なサンプル由来の濃縮されたＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞の状況を表す
。図１１の結果は、本出願に記載の修飾細胞が凍結保存蘇生後も依然として標的細胞に対して殺傷能力を有することを示す。

【0209】

（２）インビボ殺傷能力
実施例１で調製したＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞を、エレクトロポレーション後４日目に、ＣＤ３４抗体を含むマイクロ磁気ビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄ）で濃縮し、濃縮後に凍結保存する。

【0210】

ＨｅｐＧ２細胞をマウス（ＮＣＧマウス、江蘇ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈから購入される）に注射して、皮下担がんＨｅｐＧ２のマウスモデルを得る。

【0211】

腫瘍体積が約１００ｍｍ^３に達する場合、凍結保存後蘇生させた細胞を、得られたマウスモデルに１ｅ７の用量で尾静脈から注射する（各種の処理は、４匹のマウスの処理に相当する）。処理後のマウス体内の腫瘍体積の平均値を検出する。結果は、図１１に示されたとおりである。ここで、対照とは、ＣＤ１９ ＣＡＲ（ここで、ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ５に示されたとおりである）をトランスフェクションしたＴ細胞を指す。

【0212】

図１１の結果は、本出願に記載の修飾細胞が凍結保存蘇生後も依然としてインビボ腫瘍に対して特異的な殺傷能力を有することを示す。

【実施例5】

【0213】

腫瘍に対する修飾細胞の殺傷能力
ＣＤ１９ ＣＡＲ及びＣＤ３４を発現できるプラスミドを調製する。ここで、ＣＤ１９
ＣＡＲをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されたとおりである。ＣＤ３４をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されたとおりである。ＴＲＡＣにノックインされたＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＤ３４をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されたとおりである。

【0214】

Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄｓ及び収集したヒトＴ細胞を使用して、Ｘ－ｖｉｖｏ１５＋２０Ｕ／ｍｌ培地で１：１の比例で活性化する。

【0215】

調製したプラスミドを、Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄで２日間活性化したヒトＴ細胞にエレクトロポレーションし、ＣＤ１９ ＣＡＲ及びＣＤ３４をコードする核酸分子は、ヒトＴ細胞のゲノムにノックインされ、内因性プロモーターによって制御及び発現されることができる。得られた細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞と名付けられる。

【0216】

エレクトロポレーション後４日目に、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞を、ＣＤ３４抗体を含むマイクロ磁気ビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄ）で濃縮し、濃縮されたＣＤ１９
ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲ及びＣＤ３４を発現する発現率をそれぞれ統計する。結果は、図１２に示されたとおりである。結果は、濃縮されたＣＤ１９ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔ細胞がＣＤ１９ ＣＡＲ及びＣＤ３４を正常に発現できることを示す。

【0217】

（１）インビトロ殺傷能力
濃縮したＣＤ１９ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔを、Ｎａｌｍ６標的細胞とインビトロで異なるエフェクター細胞対標的細胞の比率で混合し、Ｎａｌｍ６の殺傷比率（％）を検出する。結果は、図１３に示されたとおりである。図１３の結果は、濃縮されたＣＤ１９ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔがインビトロで標的細胞に対して殺傷能力を有することを示す。

【0218】

（２）インビボ殺傷能力
蛍光付きＮａｌｍ６細胞（Ｎａｌｍ－６－Ｌｕｃ、ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙから購入され、上海）をマウス（ＮＣＧマウス、江蘇ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ）に静脈内注射して、血液腫瘍Ｎａｌｍ６のマウスモデルを得る。

【0219】

濃縮されたＣＤ１９ ＣＡＲ－ＣＤ３４ Ｔを、得られたマウスモデル（各種の処理は、４匹のマウスの処理に相当する）を１ｅ７の用量で尾静脈内に注射する。腫瘍の成長及び殺傷は、Ｎａｌｍ－６－Ｌｕｃの蛍光値によって検出される（Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。結果は、図１４に示されたとおりである。ここで、対照とは、ＧＰＣ３ ＣＡＲ（ここで、ＧＰＣ３ ＣＡＲをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３に示されたとおりである）をトランスフェクトしたＴ細胞を指す。

【0220】

図１４の結果は、本出願に記載の修飾細胞が凍結保存蘇生後も依然としてインビボ腫瘍に対する殺傷能力を有することを示す。

【0221】

前述の詳細な説明は、解釈および例として提供されたものであり、添付の特許請求の範囲を制限するものではない。今まで本出願で列挙された実施形態の様々な変形は、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内にとどまる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-02-22

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞を修飾する方法であって、
エレクトロポレーション方法を使用して、標的分子およびスクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子を、非ウイルスによって細胞にトランスフェクションして、前記細胞が前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現するようにする段階を含み、
ここで、前記非ウイルストランスフェクションは、コードを有する環状核酸分子を使用するトランスフェクションであり、前記環状核酸分子は、環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドを含み、
ここで、プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の核酸分子の総含有量の約１０％以下を占め、
前記細胞は、免疫細胞、幹細胞、線維細胞および／または筋細胞を含み、ここで、前記免疫細胞は、不活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択されることを特徴とする、前記方法。

【請求項2】

前記方法は、前記スクリーニング分子とスクリーニング物とを結合させることにより、前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子でトランスフェクションされた細胞を収集および／または濃縮する段階をさらに含むことを特徴とする
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標的分子をコードする核酸分子、および前記スクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子は、前記細胞のゲノムに組み込まれることを特徴とする
請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記トランスフェクションは、トランスポゾンシステムおよび／または遺伝子編集を使用してノックインすることを含み、ここで、前記遺伝子編集方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡ編集システムＡＤＡＲ、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガープロテアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびＭｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓからなる群のうちの一種または複数種から選択されることを特徴とする
請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記プラスミドは、前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとして機能することを特徴とする
請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ドナープラスミドは、相同アームを含むことを特徴とする
請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物の核酸分子の総含有量の約１０％以下を占め、前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は、微生物に由来することを特徴とする
請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記微生物は、大腸菌を含むことを特徴とする
請求項１に記載の方法。

【請求項9】

デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を使用して前記プラスミドを処理する段階とを含み、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができることを特徴とする
請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記標的分子は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを含むことを特徴とする
請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とするか、または前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とすることを特徴とする
請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記スクリーニングマーカー分子は、スクリーニング物に結合できるドメインを含み、ここで、前記スクリーニング物は、磁気ビーズを含むことを特徴とする
請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）切断体を含むことを特徴とする
請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現する前記細胞と前記スクリーニング物とを接触させる段階と、前記スクリーニング物に結合する前記細胞を収集する段階と、前記スクリーニング物に結合した前記細胞を前記スクリーニング物から分離させる段階とを含むことを特徴とする
請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

標的分子およびスクリーニングマーカー分子を同時に発現する修飾された免疫細胞であって、
前記標的分子およびスクリーニングマーカー分子をコードする核酸分子を、非ウイルスによって細胞にトランスフェクションし、それにより前記細胞が前記標的分子および前記スクリーニングマーカー分子を発現するようにし、ここで、前記非ウイルストランスフェクションは、コードを有する環状核酸分子を使用するトランスフェクションであり、前記環状核酸分子は、環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドを含み、
ここで、プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、微生物のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の核酸分子の総含有量の約１０％以下を占め、
前記免疫細胞は、不活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択されることを特徴とする、免疫細胞。

【請求項16】

前記標的分子は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよび／またはケモカインを含み、および／または
前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４および／またはＥＧＦＲＴ切断体を含むことを特徴とする
請求項１５に記載の免疫細胞。

【請求項17】

前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とするか、または前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とすることを特徴とする
請求項１６に記載の免疫細胞。

【請求項18】

前記免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞であり、前記スクリーニングマーカー分子は、ＣＤ３４を含むことを特徴とする
請求項１５に記載の免疫細胞。

【国際調査報告】