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特表2024-532346インターロイキン２の融合タンパク質及びそのＩＢＤにおける使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】インターロイキン２の融合タンパク質及びそのＩＢＤにおける使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240829BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240829BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/26 20060101ALI20240829BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20240829BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20240829BHJP
A61K 38/38 20060101ALI20240829BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240829BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C12N5/10
C12N15/26
C07K14/55
A61K38/20
A61K38/38
A61K47/64
A61P1/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513046
(86)(22)【出願日】2022-07-15
(85)【翻訳文提出日】2024-04-26
(86)【国際出願番号】 CN2022106105
(87)【国際公開番号】W WO2023024758
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】202110982310.8
(32)【優先日】2021-08-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518416300
【氏名又は名称】ベイジン ブイディージェイバイオ カンパニー， リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， シャオルイ
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， ジュン
(72)【発明者】
【氏名】ジャオ， ティンティン
(72)【発明者】
【氏名】チォン， ジェンウェイ
(72)【発明者】
【氏名】マー， ロン
(72)【発明者】
【氏名】スン， イーピン
(72)【発明者】
【氏名】ティエン， シンシォン
(72)【発明者】
【氏名】リー， ズージィアン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC05
4C076CC16
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA53
4C084DA14
4C084DA37
4C084MA17
4C084MA44
4C084MA66
4C084NA12
4C084ZA661
4C084ZA662
4H045AA10
4H045BA41
4H045DA04
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
インターロイキン２の融合タンパク質及びその炎症性腸疾患の治療又は予防における使用を開示する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターロイキン２の融合タンパク質であって、ヒトインターロイキン２又はその変異体、及びヒト血清アルブミン又はその変異体を含み、
前記ヒトインターロイキン２又はその変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ヒト血清アルブミン又はその変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項2】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸はシステインではなく、
好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸は、セリン又はアラニンに置換されていることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記ヒトインターロイキン２又はその変異体は、前記ヒト血清アルブミン又はその変異体に直接連結されているか、又は、連結ペプチドを介して連結されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記連結ペプチドの一般式は（ＧｎＳ）ｍであり、ただし、ｎ、ｍはそれぞれ１～１０の整数であり、好ましくは、前記連結ペプチドの一般式は（ＧｎＳ）ｍであり、ただし、ｎは１～４の整数であり、ｍは０～３の整数であることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴とする単離された核酸分子。
【請求項7】
発現系であって、前記発現系は、請求項６に記載の核酸分子を含有するＣＨＯ細胞を含み、
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現させるものであり、
好ましくは、前記発現系は、２０２２年５月２６日に中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４５１７３で寄託されたＣＨＯ－Ｋ１細胞であることを特徴とする発現系。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項9】
前記薬物組成物の剤形は、注射剤、錠剤、又はカプセルから選ばれ、好ましくは、前記剤形は、液体注射剤又は凍結乾燥粉末注射剤から選ばれ、
好ましくは、前記担体は、賦形剤、希釈剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸着担体、及び／又は安定化剤から選ばれることを特徴とする請求項８に記載の薬物組成物。
【請求項10】
被験者に有効量の請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項８若しくは９に記載の薬物組成物を投与することを含むことを特徴とする炎症性腸疾患を治療又は予防するための方法。
【請求項11】
前記炎症性腸疾患は、潰瘍性結腸炎、クローン病又は不確定大腸炎から選ばれることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記融合タンパク質又は前記薬物組成物の投与形態は、経口又は注射であり、好ましくは、前記注射は、皮下注射又は静脈内注射であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項13】
前記融合タンパク質の投与量は、３×１０４ＩＵ／回～１×１０６ＩＵ／回であり、好ましくは、前記薬物組成物の投与量は、前記薬物組成物中の融合タンパク質として、３×１０４ＩＵ／回～１×１０６ＩＵ／回であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項14】
前記融合タンパク質の投与回数は、７～２８日毎に１回であり、好ましくは１４～２８日毎に１回であり、前記薬物組成物の投与回数は、１４～２８日毎に１回であり、好ましくは１４～２８日毎に１回であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物製薬の技術分野に関し、具体的には、インターロイキン２の融合タンパク質及びその炎症性腸疾患の治療又は予防における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
炎症性腸疾患（Inflammatory bowel disease、ＩＢＤ）は、病因が明らかでない慢性、非特異性腸炎症性疾患の群であり、臨床的には、腹痛、下痢及び粘液血便などの症状が現れる。その発症メカニズムは、完全に明らかではなく、従来の研究により、宿主の遺伝的感受性、腸内フローラの乱れ、腸粘膜バリアの破壊、腸粘膜免疫異常、環境及び精神などの要因と密接に関連することが示されている。ＩＢＤは、治癒不能、生涯にわたる再発・進展及び身体障害性などの特徴を有し、患者に多大な肉体的苦痛及び精神的負担をもたらす。
【0003】
ＩＢＤの治療目標は、臨床的寛解及び粘膜癒合の誘導及び維持、合併症の予防及び治療、患者のクオリティ・オブ・ライフの改善、患者の長期管理の強化である。現在、内科では活動期ＩＢＤを治療する主な薬物は、依然として炎症カスケードを遮断又は閉鎖させる薬物であり、患者の症状を部分的に寛解することしかできず、当該疾患を徹底的に治癒することができない。現在、ＩＢＤの治療手段は、非標的療法、標的生物療法、誘導治療及び他の新規療法を含む。以下、これらの治療手段について詳細に説明する。
【0004】
非標的療法は、アミノサリチル酸塩、糖質コルチコイド及び免疫調節剤を含む。そのうち、アミノサリチル酸塩は、主に軽度、中度潰瘍性結腸炎（ＵＣ）に有効であり、糖質コルチコイド及び免疫抑制剤は、副作用が広い。
【0005】
標的生物療法は、主に生物製剤を適用して治療を行い、その作用メカニズムは、１．腸粘膜炎症反応の発生過程における各種炎症性サイトカインの生物学的効果を標的として遮断すること（例えば、抗ＴＮＦ－α抗体（インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、サシツズマブ）及び抗ＩＬ１２／２３ｐ４０抗体（ウステキヌマブ））、２．活性化された白血球の腸粘膜への移行を抑制すること（例えば抗インテグリン抗体（ベドリズマブ、ナタリズマブ））を含む。標的生物療法は、異なる程度でＩＢＤ患者の臨床的寛解率を向上させ、再発率及び手術率を低下させ、ＩＢＤ患者の治療により多くの選択肢を提供する。しかしながら、生物製剤に対して、３０％と多くの患者に一次非応答が現れ、５０％と多くの患者に二次非応答が現れる。
【0006】
誘導治療は、主に小分子薬物、例えば選択的ＪＡＫ阻害剤（トファシチニブ）とスフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体調節剤（オザニモド）の経口投与を採用する。小分子薬物も、異なる程度でＩＢＤ患者の臨床的寛解率を向上させ、再発率及び手術率を低下させ、ＩＢＤ患者の治療により多くの選択肢を提供することができる。小分子薬物は、生物製剤の免疫原性及び胃腸外投与による患者のコンプライアンスの問題を克服したが、小分子薬物でＩＢＤを治療する過程において、薬物間の相互作用が誘発され、薬物毒性が生じることがあり得、最終的には治療失敗につながる。市販されているＪＡＫ阻害剤は、重篤な感染、悪性腫瘍及び血栓形成のリスクが存在し、オザニモドは、心血管へのリスクが存在する。
【0007】
他の新規療法は、幹細胞再生、バリア修復剤、糞便微生物叢移植などを含む。
【0008】
制御性Ｔ細胞（Regulatory T cells、Ｔｒｅｇ）は、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５、ＣＤ４を細胞表現型特徴として発現するＴ細胞サブセットであり、能動調節の方式により正常生体内に潜在する自己反応性Ｔ細胞の活性化と増殖を抑制し、生体の免疫寛容の維持に関与する。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＢＤ及び他の自己免疫疾患の発症メカニズムにおいて重要な役割を果たすことが実証されている。正常な腸粘膜組織において、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）及びＴｒｅｇ細胞は、腸内環境の安定性を維持するために動的平衡状態にあり、この平衡が崩れると、例えば炎症効果が強すぎたり、調節効果が弱まったりすると、ＩＢＤの発生を引き起こす可能性がある。
【0009】
現在、様々なルートでＴｒｅｇ細胞の数及び／又は機能を向上させてＩＢＤによる腸管炎症を軽減する方策が研究の焦点になっている。それは、Ｔｒｅｇ細胞の分化を促進できる微生物叢、低用量のインターロイキン２（ＩＬ－２）（Ｔｒｅｇ細胞は、高親和性ＩＬ－２受容体を固有的に発現するため、低用量のＩＬ－２によって、Ｔｅｆｆ細胞ではなく、Ｔｒｅｇ細胞の数を選択的に増加させることができる）、インビボで比較的安定なＩＬ－２－抗ＩＬ－２抗体複合体、工学改変されたＩＬ－２変異体（変異タンパク質と呼ばれ、高親和性ＩＬ－２受容体に選択的に結合することができる）及び養子性Ｔｒｅｇ細胞療法などを含む。
【0010】
ＩＢＤの治療条件は、改善されてきたが、潰瘍性結腸炎患者の長期結腸切除率は、過去十年間において低下しておらず、言い換えれば、ＩＢＤ分野においてまだ大きな、満足されていない臨床ニーズがあり、炎症性腸疾患の患者のクオリティ・オブ・ライフを改善するために新たな治療薬又はルートを開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明の目的は、炎症性腸疾患の投与間隔時間を延長し、患者の苦痛を軽減し、治療コストを低減し、患者のコンプライアンス及びクオリティ・オブ・ライフを向上させる、インターロイキン２の融合タンパク質及びその炎症性腸疾患の治療又は予防における使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
第１の態様では、本発明は、インターロイキン２の融合タンパク質を提供する。前記融合タンパク質は、ヒトインターロイキン２又はその変異体、及びヒト血清アルブミン又はその変異体を含み、
前記ヒトインターロイキン２又はその変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ヒト血清アルブミン又はその変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
前記ヒトインターロイキン２又はその変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ヒト血清アルブミン又はその変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0013】
本発明において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列は、１３３個のアミノ酸残基からなるヒトインターロイキン２であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列は、５８５個のアミノ酸残基からなるヒト血清アルブミンである。
【0014】
いくつかの実施形態では、前記インターロイキン２の融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸は、システインではない。ヒトインターロイキン２は、１つの鎖内ジスルフィド結合を有するが、成熟タンパク質の１２５番目に位置するアミノ酸残基がシステインである場合、他の２つのシステインとミスマッチジスルフィド結合を形成しやすく、これによりＩＬ－２が不活性化することになる。
【0016】
いくつかの実施形態では、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸は、セリン又はアラニンに置換されている。ヒトインターロイキン２の１２５番目のアミノ酸残基をセリン又はアラニンに変異させることにより、ジスルフィド結合のミスマッチを回避することができ、ヒトインターロイキン２を活性に保つことができる。
【0017】
いくつかの実施形態では、前記ヒトインターロイキン２又はその変異体は、前記ヒト血清アルブミン又はその変異体に直接連結されているか、又は、連結ペプチドを介して前記ヒト血清アルブミン又はその変異体に連結されている。
【0018】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質に含まれる２つの部分の間に大きな間隔を持たせるために、ヒトインターロイキン２又はその変異体と前記ヒト血清アルブミン又はその変異体との間に連結ペプチドが設けられており、ヒトインターロイキン２の部分を最大限にインターロイキン２受容体と結合させるようにする。
【0019】
いくつかの実施形態では、前記連結ペプチドの一般式は（ＧｎＳ）ｍであり、ただし、ｎ、ｍはそれぞれ１～１０の整数である。
【0020】
いくつかの実施形態では、前記連結ペプチドの一般式は（ＧｎＳ）ｍであり、ただし、ｎは１～４の整数であり、ｍは０～３の整数である。
【0021】
いくつかの実施形態では、前記連結ペプチドの一般式は（ＧｎＳ）ｍであり、ただし、ｎは１～４の整数であり、ｍは１～３の整数である。
【0022】
いくつかの実施形態では、前記連結ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。
【0023】
いくつかの実施形態では、前記連結ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＧＧＧＳである。
【0024】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質のＮ末端は、シグナルペプチドを保有する。前記融合タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドを添加することにより、前記融合タンパク質の発現量をさらに向上させることができる。
【0025】
いくつかの実施形態では、前記シグナルペプチドは、分泌シグナルペプチドＣＤ３３である。
【0026】
いくつかの実施形態では、前記シグナルペプチドをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される。
【0027】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有する。
【0028】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、Ｎ末端から順に、ヒトインターロイキン２－連結ペプチド－ヒト血清アルブミン、又はヒト血清アルブミン－連結ペプチド－ヒトインターロイキン２を含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、７２８個のアミノ酸残基配列からなるタンパク質であり、１～１３３番目のアミノ酸は、ヒトインターロイキン２であり、１３４～１４３番目のアミノ酸は、連結ペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり、１４４～７２８番目のアミノ酸は、ヒト血清アルブミンである。
【0030】
第２の態様では、本発明は、単離された核酸分子を提供する。前記核酸分子は、本発明の第１の態様で提供される融合タンパク質をコードする。
【0031】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【0032】
本発明において、Ｇｅｎｂａｎｋに開示されているヒトインターロイキン２及びヒト血清アルブミンの遺伝子配列に基づいて、哺乳動物におけるコドンバイアスに従って遺伝子配列の最適化を行い、最適化された融合タンパク質の遺伝子配列を発現ベクターに構築し、宿主細胞にトランスフェクションし、宿主細胞で発現させ、目的タンパク質、すなわちインターロイキン２の融合タンパク質を単離精製することができる。
【0033】
インターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質の発現系について、インターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合遺伝子を有するプラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクション（例えば、エレクトロポレーショントランスフェクション）することにより、ヒト化組換えタンパク質を安定して高効率で発現するＣＨＯモノクローナル細胞株を得る。本発明のモノクローナル細胞株は、インターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質（即ち、インターロイキン２の融合タンパク質）を分泌発現することができ、ヒトインターロイキン２の血漿半減期を顕著に延長することができ、ヒトインターロイキン２の発現に関連する薬物の調製に用いることができる。
【0034】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ｐＥＥ１４．４、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＥＥ６．４から選ばれ、好ましくはｐＥＥ１４．４である。
【0035】
第３の態様では、本発明は、発現系を提供する。前記発現系は、ＣＨＯ細胞を含み、前記ＣＨＯ細胞は、本発明の第２の態様で提供される核酸分子を含み、
前記発現系は、本発明の第１の態様で提供される融合タンパク質を発現させる。
前記発現系は、本発明の第１の態様で提供される融合タンパク質を発現させる。
【0036】
本発明は、意外にも、ＣＨＯ細胞を採用する場合、特にＣＨＯ－Ｋ１細胞株を採用する場合、細胞発現量が４ｇ／Ｌと非常に高く、且つ発現されたインターロイキン２の融合タンパク質が高活性を有し、インビトロで特定の細胞、例えばＮＫ細胞及び／又はＴ細胞及び／又はＴｒｅｇに対して増殖を強く促進する作用を有することを見出した。
【0037】
いくつかの実施形態では、前記発現系は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞であり、前記ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、２０２２年５月２６日に中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託され、寄託番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４５１７３である。
【0038】
第４の態様では、本発明は、薬物組成物を提供する。前記薬物組成物は、本発明の第１の態様で提供される融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、前記薬物組成物の剤形は、注射剤、錠剤、又はカプセルから選ばれる。
【0040】
いくつかの実施形態では、前記剤形は、液体注射剤又は凍結乾燥粉末注射剤から選ばれる。
【0041】
いくつかの実施形態では、前記薬物は、薬学的に許容される担体を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、前記担体は、賦形剤、希釈剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸着担体、及び／又は安定化剤から選ばれる。
【0043】
第５の態様では、本発明は、炎症性腸疾患を治療又は予防するための方法を提供する。前記方法は、被験者に有効量の本発明の第１の態様で提供される融合タンパク質、又は本発明の第４の態様で提供される薬物組成物を投与することを含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、前記炎症性腸疾患は、潰瘍性結腸炎、クローン病又は不確定大腸炎から選ばれる。
【0045】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質又は前記薬物組成物の投与形態は、注射である。
【0046】
いくつかの実施形態では、前記投与形態は、皮下注射又は静脈内注射から選ばれる。
【0047】
いくつかの実施形態では、前記投与形態は、皮下注射である。
【0048】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の投与量は、３×１０４ＩＵ／回～１×１０６ＩＵ／回である。
【0049】
いくつかの実施形態では、前記薬物組成物の投与量は、前記薬物組成物中の融合タンパク質として、３×１０４ＩＵ／回～１×１０６ＩＵ／回である。
【0050】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の投与回数は、７～２８日毎に１回である。
【0051】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の投与回数は、１４～２８日毎に１回である。
【0052】
いくつかの実施形態では、前記薬物組成物の投与回数は、７～２８日毎に１回である。
【0053】
いくつかの実施形態では、前記薬物組成物の投与回数は、１４～２８日毎に１回である。
【0054】
第６の態様では、本発明は、炎症性腸疾患の治療又は予防における本発明の第１の態様で提供される融合タンパク質の使用を提供する。
【0055】
第７の態様では、本発明は、炎症性腸疾患の治療又は予防における本発明の第４の態様で提供される薬物組成物の使用を提供する。
【0056】
第８の態様では、本発明は、炎症性腸疾患を治療又は予防するための薬物の調製における本発明の第１の態様で提供される融合タンパク質の使用を提供する。
【0057】
第９の態様では、本発明は、炎症性腸疾患を治療又は予防するための薬物の調製における本発明の第４の態様で提供される薬物組成物の使用を提供する。
【0058】
本発明により提供されるインターロイキン２の融合タンパク質は、より高い生物活性とより長い血漿半減期を有する。
【0059】
本発明により提供されるインターロイキン２の融合タンパク質は、炎症性腸疾患の治療又は予防に用いることができる。
【0060】
また、本発明により提供されるインターロイキン２の融合タンパク質は、炎症性腸疾患の治療効果を向上させ、下痢や結腸病変などをさらに改善する。
【0061】
本発明によって提供されるインターロイキン２の融合タンパク質は、患者の体内で加水分解が遅くなり、投与間隔時間を顕著に延長し、治療効果を増強し、治療過程における投与総量を減少させ、それに伴い患者の苦痛及び治療コストを低減し、副作用の発生を減少させ、患者のコンプライアンス及びクオリティ・オブ・ライフを向上させ、炎症性腸疾患の患者に回復の期待をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図2】図２は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１クローンスクリーニングにおける流加培養によるＤ１３上清の非還元電気泳動の分析結果及び各細胞株のタンパク質発現量の結果を示し、上清は、５μＬでローディングした。図２Ａは、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１クローンスクリーニングにおける流加培養によるＤ１３上清の非還元電気泳動の分析結果であり、図２Ｂは、各細胞株のタンパク質発現量の結果である。
【図3】図３は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１クローン＃９のモノクローナルスクリーニングにおける流加培養によるＤ１３上清の非還元電気泳動の分析結果及び各細胞株のタンパク質発現量の結果を示し、上清は、３μＬでローディングした。図３Ａは、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１クローン＃９のモノクローナルスクリーニングにおける流加培養によるＤ１３上清の非還元電気泳動の分析結果であり、図３Ｂは、各細胞株のタンパク質発現量の結果である。
【図4】図４は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１クローン＃９－６のモノクローナルスクリーニングにおける流加培養によるＤ１３上清の非還元電気泳動の分析結果及び各細胞株のタンパク質発現量の結果を示し、上清は、２μＬでローディングした。図４Ａは、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１クローン＃９－６のモノクローナルスクリーニングにおける流加培養によるＤ１３上清の非還元電気泳動の分析結果であり、図４Ｂは、各細胞株のタンパク質発現量の結果である。
【図5】図５は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養動態曲線を示す。１２５ｍＬの振盪フラスコで流加培養し、初期細胞密度は０．３×１０６細胞／ｍＬであり、初期培養体積は２５ｍＬであり、最大生細胞密度は１９．３×１０６細胞／ｍＬになった。
【発明を実施するための形態】
【0063】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定するものではなく、本発明の思想を前提として本発明を簡単に改良したものは、いずれも本発明の保護範囲に属することが理解されるだろう。
【0064】
本発明者らは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者における制御性Ｔ細胞（Regulatory T cells、Ｔｒｅｇ）のレベルの低下が疾患の重篤度の増加に関連し、疾患の進行及び生存を予測することに有用であり、これらが潜在的な治療標的である可能性があることを見出した。また、Ｔｒｅｇの産生、活性化及び生存がサイトカインであるインターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２、ＩＬ－２）に完全に依存することに基づいて、本発明者らは、以下の実験を行った。
【0065】
定義
本明細書で使用される「融合タンパク質」とは、組換え方法、化学的方法又は他の適切な方法により共有結合（即ち、融合）された生物学的活性ポリペプチド（通常、ＴＣＲ又は抗体）及びエフェクター分子（通常、タンパク質又はペプチド配列）を意味する。必要に応じて、融合分子は、ペプチドリンカー配列を介して１つ又は複数の位置で融合することができる。あるいは、ペプチドリンカーは、融合分子の構築を補助するために使用することができる。特に好ましい融合分子は、融合タンパク質である。一般に、融合分子は、共役分子を含んでもよい。
本明細書で使用される「融合タンパク質」とは、組換え方法、化学的方法又は他の適切な方法により共有結合（即ち、融合）された生物学的活性ポリペプチド（通常、ＴＣＲ又は抗体）及びエフェクター分子（通常、タンパク質又はペプチド配列）を意味する。必要に応じて、融合分子は、ペプチドリンカー配列を介して１つ又は複数の位置で融合することができる。あるいは、ペプチドリンカーは、融合分子の構築を補助するために使用することができる。特に好ましい融合分子は、融合タンパク質である。一般に、融合分子は、共役分子を含んでもよい。
【0066】
本明細書で使用される「発現ベクター」及び「発現コンストラクト」は、互換的に使用することができ、上記単離された核酸分子をベクターに連結する際に、核酸配列は、ベクター上の制御エレメントに直接的又は間接的に連結されていてもよく、これらの制御エレメントが該核酸分子の翻訳及び発現等を制御できるようにすればよい。もちろん、これらの制御エレメントは、ベクター自体に直接由来するものであってもよく、外因性(即ち、ベクター自体に由来するものではない)であってもよい。つまり、核酸分子は、制御エレメントに動作可能に連結されている。本明細書において、「動作可能に連結されている」とは、外因性遺伝子は、ベクター内の制御エレメント、例えば転写制御配列及び翻訳制御配列などがその予期される外因性遺伝子の転写及び翻訳を制御する機能を発揮することができるように、ベクターに連結されていることを意味する。当然のことながら、抗体重鎖及び軽鎖をコードするためのポリヌクレオチドは、それぞれ独立して、異なるベクターに挿入されてもよいが、通常、同一のベクターに挿入される。常用のベクターは、例えば、プラスミド、ファージ等であってもよい。
【0067】
１つの配列と比較して、本明細書で使用される、該配列と「少なくとも９０％の配列同一性」を有するものは、該配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し、且つ該配列と同一又は類似の機能を有するものを含み得る。
【0068】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張化剤及び遅延吸収剤などを含み得る。具体的な例は、水、食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、グルコース、グリセリン、エタノール等、及びこれらの組み合わせのうちの１種又は複数種であってもよい。多くの場合、薬学的に許容される担体は、等張化剤、例えば糖類、多価アルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）又は塩化ナトリウムなどを含み得る。当然ながら、薬学的に許容される担体は、微量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤をさらに含んでもよく、タンパク質の保存期限又は効力を延長するために用いられる。
【0069】
本明細書で使用される「被験者」とは、炎症性腸疾患に罹患している又は炎症性腸疾患のリスクを有する被験者をいう。被験者は、動物であってよく、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【0070】
本明細書で使用される「治療」とは、被験者が具体的な疾患、障害、若しくは病態に罹患したときに生じる効果をいい、疾患、障害、若しくは病態の重篤度を低下させること、又は疾患、障害、若しくは病態の進行を遅延若しくは緩和させることを含む。
【0071】
本明細書で使用される「予防」とは、少なくとも、疾患又は病態を獲得するリスク（又は感受性）（すなわち、当該疾患に曝露されている又は罹患しやすい可能性があるが、当該疾患の症状を経験又は表現していない患者において、未だに進行していない疾患の臨床症状を少なくとも１つ引き起こすこと）を低下させる可能性を意味する。
【0072】
本明細書で使用される「有効量」とは、疾患、病態及び／又は病状に罹患しているか、又は罹患しやすい被験者に投与された場合に、疾患、病態及び／又は病状の治療、緩和、改善、症状の軽減、発症の予防、遅延、進行の抑制、重篤度の低下及び／又は発症率の低下に十分な治療剤、予防剤及び／又は診断剤の量を意味する。
【0073】
本明細書に記載の「投与量」という用語とは、疾患、退行性又は損傷性病態の進行を緩和又は遅延できる量であり、治療される具体的な疾患、及び年齢、体重、健康状態、症状の重篤度、投与経路、治療の頻度、及び治療中に他の薬物を併用するか否かを含む他の要素に応じて決定することができる。
【0074】
本明細書で使用される「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」は、回腸、直腸、結腸に係る特発性腸管炎症性疾患である。臨床的には、下痢、腹痛、さらには血便が現れる。該疾患の病因及び発症メカニズムは、完全に解明されておらず、腸管粘膜免疫系の異常反応による炎症反応がＩＢＤの発症において重要な役割を果たすことが知られており、主に環境、遺伝、感染及び免疫因子を含む、多因子の相互作用によるものと考えられている。
【0075】
本明細書で使用される「潰瘍性結腸炎」は、主に結腸直腸粘膜及び粘膜下層に係る慢性非特異性、非感染性、炎症性腸疾患である。特徴的な表現としては、連続性、びまん性分布を呈し、直腸及び結腸における連続粘膜潰瘍であり、直腸から始まり、異なる程度で広がり、最長で盲腸まで延び広がることが可能である。
【0076】
本明細書で使用される「クローン病」は、消化管全体に係る非連続性全層炎症であり、最も係っている部位は、終末回腸、結腸及び肛門周囲である。該疾患の症状は、通常、腹痛、下痢（炎症が重篤であれば、出血する可能性がある）、発熱及び体重軽減を含む。
【0077】
本明細書で使用される「不確定大腸炎」とは、少数の患者では罹患した炎症性腸疾患がクローン病であるか潰瘍性結腸炎であるかを確定することが困難であることを意味し、このようなタイプは、現在、不確定大腸炎と定義されている。
【0078】
以下、実施例により本発明の技術案を説明する。以下の実施例が本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないことは、当業者に理解されるべきである。以下の説明では、本開示の概念と不必要に混同しないように、公知技術の説明を省略する。このような技術は、多くの出版物、例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第４版）」（Cold Spring Harbor Laboratory）に記載されている。
【0079】
実施例において具体的な技術又は条件が明記されていないものは、本分野の文献に記載の技術又は条件に従って、又は製品の取扱説明書に従って行う。使用される試薬又は機器は、メーカーが明記されていないものが、いずれも市販品から入手可能な通常の製品である。
【0080】
本発明者らは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者における制御性Ｔ細胞（Regulatory T cells、Ｔｒｅｇ）のレベルの低下が疾患の重篤度の増加に関連し、疾患の進行及び生存を予測することに有用であり、これらが潜在的な治療標的である可能性があることを見出した。また、Ｔｒｅｇの産生、活性化及び生存がサイトカインであるインターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２、ＩＬ－２）に完全に依存することに基づいて、本発明者らは、以下の実験を行った。
【0081】
次に、本明細書に係る用語及び表現について説明する。
ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、インターロイキン２の融合タンパク質の略称である。
ＩＬ－２は、ヒトインターロイキン２を意味する。
ＨＳＡは、ヒト血清アルブミンを意味する。
１２５Ａｌａ ＩＬ－２は、アミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸がアラニンであるインターロイキン２の変異体を表す。詳細は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を参照されたい。
Ｄ０、Ｄ２、Ｄ４、Ｄ８、Ｄ１５は、それぞれ０日、２日、４日、８日、１５日を表す。
ＤＳＳは、デキストラン硫酸ナトリウムを表す。
ＤＳＳ期は、デキストラン硫酸ナトリウムを添加した水を飲ませる時期を表す。
ｓ．ｃ．は、皮下注射を意味する。
市販の短時間効果のＩＬ－２の商品名は、欣吉爾であり、メーカーは、北京双鷺薬業股▲ふん▼有限公司である。
ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、インターロイキン２の融合タンパク質の略称である。
ＩＬ－２は、ヒトインターロイキン２を意味する。
ＨＳＡは、ヒト血清アルブミンを意味する。
１２５Ａｌａ ＩＬ－２は、アミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸がアラニンであるインターロイキン２の変異体を表す。詳細は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を参照されたい。
Ｄ０、Ｄ２、Ｄ４、Ｄ８、Ｄ１５は、それぞれ０日、２日、４日、８日、１５日を表す。
ＤＳＳは、デキストラン硫酸ナトリウムを表す。
ＤＳＳ期は、デキストラン硫酸ナトリウムを添加した水を飲ませる時期を表す。
ｓ．ｃ．は、皮下注射を意味する。
市販の短時間効果のＩＬ－２の商品名は、欣吉爾であり、メーカーは、北京双鷺薬業股▲ふん▼有限公司である。
【実施例】
【0082】
実施例１：安定トランスフェクション細胞株の構築
トランスフェクションの前日に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の密度を０．５×１０６細胞／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日、線形化処理された、高濃度のエンドトキシンフリーのプラスミドを用意し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞密度及び生存率を測定し、細胞生存率が９７％を超えていることを確保した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞をＣＤ ＣＨＯ培地で２回洗浄した後、７００μＬ細胞懸濁液＋４０μｇプラスミドのエレクトロポレーショントランスフェクション反応系を配置し、均一に混合した後、４ｍｍ電極カップに移した。電極カップをエレクトロポレーショントランスフェクション装置に入れ、電気ショックパラメータを３００Ｖ、１０００μＦに設定し、電気ショックを１回行い、電気ショック後の細胞懸濁液を予熱された新鮮なＣＤ ＣＨＯ培地に移し、３７℃で２０ｍｉｎインキュベートした。インキュベートした細胞懸濁液を９６ウェルプレートに均一に接種し、２４ｈトランスフェクションした後、加圧し、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有するＣＤ ＣＨＯ培地をＭＳＸの最終濃度が２５～５０μＭとなるように加え、５％ＣＯ２、３７℃で静置培養した。
トランスフェクションの前日に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の密度を０．５×１０６細胞／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日、線形化処理された、高濃度のエンドトキシンフリーのプラスミドを用意し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞密度及び生存率を測定し、細胞生存率が９７％を超えていることを確保した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞をＣＤ ＣＨＯ培地で２回洗浄した後、７００μＬ細胞懸濁液＋４０μｇプラスミドのエレクトロポレーショントランスフェクション反応系を配置し、均一に混合した後、４ｍｍ電極カップに移した。電極カップをエレクトロポレーショントランスフェクション装置に入れ、電気ショックパラメータを３００Ｖ、１０００μＦに設定し、電気ショックを１回行い、電気ショック後の細胞懸濁液を予熱された新鮮なＣＤ ＣＨＯ培地に移し、３７℃で２０ｍｉｎインキュベートした。インキュベートした細胞懸濁液を９６ウェルプレートに均一に接種し、２４ｈトランスフェクションした後、加圧し、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有するＣＤ ＣＨＯ培地をＭＳＸの最終濃度が２５～５０μＭとなるように加え、５％ＣＯ２、３７℃で静置培養した。
【0083】
実施例２：高発現モノクローナル細胞株のスクリーニング
９６ウェルプレートにおけるモノクローンが適切な大きさに成長した後、モノクローンの選別を開始し、すべてのクローンを新しい９６ウェルプレートに移し、５％ＣＯ２、３７℃で静置培養した。ウェル内の細胞が満杯になった後、ウェルプレートにおける上清を取って還元電気泳動を行い、融合タンパク質の発現状況を検出し、発現量が最も高い９個のクローン株（図１参照）を選出し、振盪フラスコ培養まで徐々に拡大した。９個のクローンを２５ｍＬ体積の振盪フラスコで流加培養し、培養上清を回収した後、非還元電気泳動同定（詳しくは図２Ａ参照）及び各細胞株タンパク質発現量の計算（詳しくは図２Ｂ参照）を行った。発現状況が最も良い細胞株＃９を選定した。細胞株＃９に対して限界希釈法によりモノクローナル細胞株のスクリーニングを行い、０．３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、スクリーニングして１１個の高発現細胞株を得て、２５ｍＬ体積の振盪フラスコで流加培養を行い、上清に対して非還元電気泳動同定（詳しくは図３Ａを参照）及び各細胞株タンパク質発現量の計算（詳しくは図３Ｂを参照）を行った。発現状況が最も良い細胞株＃９－６を選定し、細胞株＃９－６に対して限界希釈法により再びモノクローナル細胞株のスクリーニングを行い、スクリーニングして７個の高発現細胞株を得て、２５ｍＬ体積の振盪フラスコで流加培養を行い、上清に対して非還元電気泳動同定（詳しくは図４Ａを参照）及び各細胞株タンパク質発現量の計算（詳しくは図４Ｂを参照）を行った。安定性がよく、発現量が高い細胞株＃９－６－７を選定し、安定高発現細胞株ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１とした。
９６ウェルプレートにおけるモノクローンが適切な大きさに成長した後、モノクローンの選別を開始し、すべてのクローンを新しい９６ウェルプレートに移し、５％ＣＯ２、３７℃で静置培養した。ウェル内の細胞が満杯になった後、ウェルプレートにおける上清を取って還元電気泳動を行い、融合タンパク質の発現状況を検出し、発現量が最も高い９個のクローン株（図１参照）を選出し、振盪フラスコ培養まで徐々に拡大した。９個のクローンを２５ｍＬ体積の振盪フラスコで流加培養し、培養上清を回収した後、非還元電気泳動同定（詳しくは図２Ａ参照）及び各細胞株タンパク質発現量の計算（詳しくは図２Ｂ参照）を行った。発現状況が最も良い細胞株＃９を選定した。細胞株＃９に対して限界希釈法によりモノクローナル細胞株のスクリーニングを行い、０．３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、スクリーニングして１１個の高発現細胞株を得て、２５ｍＬ体積の振盪フラスコで流加培養を行い、上清に対して非還元電気泳動同定（詳しくは図３Ａを参照）及び各細胞株タンパク質発現量の計算（詳しくは図３Ｂを参照）を行った。発現状況が最も良い細胞株＃９－６を選定し、細胞株＃９－６に対して限界希釈法により再びモノクローナル細胞株のスクリーニングを行い、スクリーニングして７個の高発現細胞株を得て、２５ｍＬ体積の振盪フラスコで流加培養を行い、上清に対して非還元電気泳動同定（詳しくは図４Ａを参照）及び各細胞株タンパク質発現量の計算（詳しくは図４Ｂを参照）を行った。安定性がよく、発現量が高い細胞株＃９－６－７を選定し、安定高発現細胞株ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１とした。
【0084】
実施例３：安定細胞株の１２５ｍＬ振盪フラスコでの流加培養
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養発現を開始した当日、０．３×１０６細胞／ｍＬで２５～５０μＭ ＭＳＸを含む最小培地２５ｍＬを１２５ｍＬの振盪フラスコに接種し、この時、Ｄ０と記し、５％ＣＯ２、３７℃、１３５ｒｐｍのシェーカーで培養した。接種後Ｄ４からサンプリング計数を開始し、細胞密度が１０×１０６細胞／ｍＬになると、培養温度を３３℃に下げた。Ｄ５にサプリメント培地の流加を開始し、グルコース濃度を３～４ｇ／Ｌに制御した。Ｄ１３まで培養すると、培養を終了し、細胞培養液上清を回収し、融合タンパク質の発現量を測定したところ、４．３６ｍｇ／ｍＬであった。
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養発現を開始した当日、０．３×１０６細胞／ｍＬで２５～５０μＭ ＭＳＸを含む最小培地２５ｍＬを１２５ｍＬの振盪フラスコに接種し、この時、Ｄ０と記し、５％ＣＯ２、３７℃、１３５ｒｐｍのシェーカーで培養した。接種後Ｄ４からサンプリング計数を開始し、細胞密度が１０×１０６細胞／ｍＬになると、培養温度を３３℃に下げた。Ｄ５にサプリメント培地の流加を開始し、グルコース濃度を３～４ｇ／Ｌに制御した。Ｄ１３まで培養すると、培養を終了し、細胞培養液上清を回収し、融合タンパク質の発現量を測定したところ、４．３６ｍｇ／ｍＬであった。
【0085】
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養動態曲線を図５に示す。図５から分かるように、培養前期において、細胞は対数増殖期にあり、密度増加が速いが、培養後期において、細胞はタンパク質生産段階に入り、細胞密度が安定になる傾向にある。最大生細胞密度は１９．３×１０６細胞／ｍＬに達している。
【0086】
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞の上清発現量の動態曲線を図６に示す。図６から分かるように、Ｄ７－Ｄ１３において、培養日数の増加に伴い、細胞タンパク質の発現量は、増加傾向を示す。Ｄ１３の発現量は、４．３６ｍｇ／ｍＬである。
【0087】
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞の発現上清の非還元電気泳動分析を図７に示す。図７から分かるように、Ｄ７－Ｄ１３において、培養日数の増加に伴い、細胞タンパク質の発現量は、増加傾向を示す。目標タンパク質のバンドは単一であり、不純物のバンドはない。
【0088】
実施例４：安定細胞株の１Ｌ振盪フラスコでの流加培養
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を２×１０６細胞／ｍＬの密度で振盪フラスコに５０ｍＬ接種し、５％ＣＯ２、３７℃、１３５ｒｐｍのシェーカーで培養した。毎日サンプリングして計数し、細胞状態を観察し、２５～５０μＭ ＭＳＸを含む最小培地を追加し、細胞密度が２×１０６細胞／ｍＬになるように毎日調整し、細胞培養液の体積が３００ｍＬになると、最小培地の追加を停止し、培養を継続し、このとき、Ｄ０とした。毎日サンプリングして計数するとともに、培養上清を１ｍＬ採取した。細胞密度が６×１０６～７×１０６細胞／ｍＬに達したとき、培養温度を３３℃に下げた。Ｄ２からサプリメント培地の流加培養を開始し、グルコース濃度を３ｇ／Ｌに制御した。Ｄ１０まで培養すると、培養を終了し、細胞培養液上清を回収し、Ｄ０～Ｄ１０の上清タンパク質の発現量を測定した。Ｄ１０に回収した上清から測定した融合タンパク質の発現量は、３．１２ｍｇ／ｍＬであった。
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を２×１０６細胞／ｍＬの密度で振盪フラスコに５０ｍＬ接種し、５％ＣＯ２、３７℃、１３５ｒｐｍのシェーカーで培養した。毎日サンプリングして計数し、細胞状態を観察し、２５～５０μＭ ＭＳＸを含む最小培地を追加し、細胞密度が２×１０６細胞／ｍＬになるように毎日調整し、細胞培養液の体積が３００ｍＬになると、最小培地の追加を停止し、培養を継続し、このとき、Ｄ０とした。毎日サンプリングして計数するとともに、培養上清を１ｍＬ採取した。細胞密度が６×１０６～７×１０６細胞／ｍＬに達したとき、培養温度を３３℃に下げた。Ｄ２からサプリメント培地の流加培養を開始し、グルコース濃度を３ｇ／Ｌに制御した。Ｄ１０まで培養すると、培養を終了し、細胞培養液上清を回収し、Ｄ０～Ｄ１０の上清タンパク質の発現量を測定した。Ｄ１０に回収した上清から測定した融合タンパク質の発現量は、３．１２ｍｇ／ｍＬであった。
【0089】
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養動態曲線を図８に示す。図８から分かるように、培養前期において、細胞は対数成長期にあり、密度増加が速いが、培養後期において、細胞はタンパク質生産段階に入り、細胞密度が安定になる傾向にある。最大生細胞密度は、１６×１０６細胞／ｍＬに達している。
【0090】
【0091】
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞の発現上清の非還元電気泳動分析を図１０に示す。図１０から分かるように、培養日数の増加に伴い、細胞タンパク質の発現量は、増加傾向を示す。目標タンパク質のバンドは単一であり、不純物のバンドはない。
【0092】
従来技術における振盪フラスコ流加培養と比較して、本発明は、細胞密度、細胞生存率が高く、図８に示すように、６－１０日目に細胞密度が１４×１０６～１６×１０６細胞／ｍＬに達し、また、本発明の細胞タンパク質の発現量も高く、図９に示すように、１０日目の発現量が３．１２ｍｇ／ｍＬである。本願において、細胞密度が１４×１０６～１６×１０６細胞／ｍＬである場合でも発現量は高く、このような細胞密度では細胞活性が依然として良好であることを示す。
【0093】
実施例５：ＩＬ－２－ＨＳＡによるＮＫ－９２細胞に対する増殖作用の検出
本実施例では、ＮＫ－９２細胞（ＡＴＣＣ（Ｒ） ＣＲＬ－２４０７ＴＭ、５０歳男性の悪性非ホジキンリンパ腫患者の末梢血単核球から誘導されたＩＬ－２依存性ＮＫ細胞株）を用いて、ＩＬ－２－ＨＳＡの生物学的活性を評価した。
本実施例では、ＮＫ－９２細胞（ＡＴＣＣ（Ｒ） ＣＲＬ－２４０７ＴＭ、５０歳男性の悪性非ホジキンリンパ腫患者の末梢血単核球から誘導されたＩＬ－２依存性ＮＫ細胞株）を用いて、ＩＬ－２－ＨＳＡの生物学的活性を評価した。
【0094】
（１）液体窒素タンクから凍結保存したＮＫ－９２細胞を１本取り出し、対数増殖期まで蘇生培養した。
（２）遠心分離して十分量の細胞を収集し、ＩＬ－２を含まない完全培地で再懸濁し、２４時間飢餓培養した。
（３）飢餓培養したＮＫ－９２細胞を遠心分離し、ＩＬ－２を含まない完全培地で再懸濁し、計数し、細胞密度を５×１０５個／ｍＬに調整し、１ウェルあたり９０μＬの体積で９６ウェルプレートに加えた。
（４）サンプル溶液の調製：培地でＩＬ－２－ＨＳＡサンプルとｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、商品番号：２０２－ＩＬ）を５０．６７ｎＭに予備希釈し、４倍勾配で９つの濃度に希釈した。１０μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートの対応するウェルに加え、各濃度は三重反復測定して、陰性対照群は、１０μＬ／ｗｅｌｌの培地を加え、均一に混合した。
（５）３７℃、５％ＣＯ２の条件で７２時間培養した後、溶解して均一に混合したＭＴＳ検出試薬を２０μＬ／ｗｅｌｌで上記の９６ウェルプレートに加え、振とう器で振とうして均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて１～４時間インキュベートを継続した。
（６）インキュベーション終了後、振とうして均一に混合し、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍ波長における吸光度を測定した。
（７）データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアで分析し、薬物濃度Ｘの対数値を横軸とし、ＯＤ４９０を縦軸とし、４パラメータで薬物効果曲線をフィッティングした。得られたＥＣ５０値を表１に、増殖曲線を図１１に示す。
（２）遠心分離して十分量の細胞を収集し、ＩＬ－２を含まない完全培地で再懸濁し、２４時間飢餓培養した。
（３）飢餓培養したＮＫ－９２細胞を遠心分離し、ＩＬ－２を含まない完全培地で再懸濁し、計数し、細胞密度を５×１０５個／ｍＬに調整し、１ウェルあたり９０μＬの体積で９６ウェルプレートに加えた。
（４）サンプル溶液の調製：培地でＩＬ－２－ＨＳＡサンプルとｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、商品番号：２０２－ＩＬ）を５０．６７ｎＭに予備希釈し、４倍勾配で９つの濃度に希釈した。１０μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートの対応するウェルに加え、各濃度は三重反復測定して、陰性対照群は、１０μＬ／ｗｅｌｌの培地を加え、均一に混合した。
（５）３７℃、５％ＣＯ２の条件で７２時間培養した後、溶解して均一に混合したＭＴＳ検出試薬を２０μＬ／ｗｅｌｌで上記の９６ウェルプレートに加え、振とう器で振とうして均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて１～４時間インキュベートを継続した。
（６）インキュベーション終了後、振とうして均一に混合し、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍ波長における吸光度を測定した。
（７）データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアで分析し、薬物濃度Ｘの対数値を横軸とし、ＯＤ４９０を縦軸とし、４パラメータで薬物効果曲線をフィッティングした。得られたＥＣ５０値を表１に、増殖曲線を図１１に示す。
【0095】
【表1】
【0096】
図１１から分かるように、ＩＬ－２－ＨＳＡは、用量依存的にＮＫ－９２細胞の増殖を誘導した。この実験条件では、ＩＬ－２－ＨＳＡは、等モルのｒｈＩＬ－２よりもＮＫ－９２増殖刺激活性が優れている（約４倍程度）。
【0097】
実施例６：ＩＬ－２－ＨＳＡによるＣＴＬＬ－２細胞に対する増殖作用の検出
本実施例では、ＣＴＬＬ－２細胞（ＡＴＣＣ（Ｒ） ＴＩＢ－２１４ＴＭ、マウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株、ＩＬ－２依存型）を用いて、ＩＬ－２－ＨＳＡの生物学的活性を評価した。
本実施例では、ＣＴＬＬ－２細胞（ＡＴＣＣ（Ｒ） ＴＩＢ－２１４ＴＭ、マウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株、ＩＬ－２依存型）を用いて、ＩＬ－２－ＨＳＡの生物学的活性を評価した。
【0098】
中国薬局方におけるヒトインターロイキン２の生物学的活性測定法（ＣＴＬＬ－２細胞／ＭＴＴ比色法）を参照し、ＣＴＬＬ－２細胞を３００００個／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、連続段階希釈された国家標準品及びＩＬ－２－ＨＳＡを加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８～２４時間培養した後、ＭＴＳ検出試薬を加え、１～４時間インキュベートし続け、振とうして均一に混合し、マイクロプレートリーダーで波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアで分析し、希釈度Ｘの対数を横軸とし、ＯＤ４９０を縦軸とし、４パラメータで薬物効果曲線をフィッティングし、得られたＥＣ５０値を表２に示し、増殖曲線を図１２に示す。
【0099】
ＩＬ－２－ＨＳＡの生物学的活性は、以下の式で計算される。
【数1】
【0100】
計算により、ＩＬ－２－ＨＳＡの比活性は、８．３８×１０６ＩＵ／ｍｇであり、薬局方に規定のＩＬ－２の比活性（１×１０７ＩＵ／ｍｇ以上）に相当するが、両者の分子量の差は５倍程度であるため、ＩＬ－２－ＨＳＡの比活性がより高い。
【0101】
【表2】
【0102】
実施例７：ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導潰瘍性結腸炎マウスモデルに対する予防及び治療作用
１．動物の選択及び群分け、モデル確立、投与レジメン
１０８匹の雄性Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（７～８週齢）を体重に応じてランダムに７群に分け、Ｇ１は健康対照群、Ｇ２はモデル対照群、Ｇ３は市販の短時間効果ＩＬ－２対照群（１２５Ａｌａ ＩＬ－２、３×１０４ＩＵ／匹／ｄ、ｓ．ｃ．）、Ｇ４はＨＳＡ対照群（０．３ｍｇ／ｋｇ／４ｄ、ｓ．ｃ．）、Ｇ５はＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質低用量群（１×１０４ＩＵ／匹／４ｄ、ｓ．ｃ．）、Ｇ６はＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質中等用量群（３×１０４ＩＵ／匹／４ｄ、ｓ．ｃ．）、Ｇ７はＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質高用量群（１×１０５ＩＵ／匹／４ｄ、ｓ．ｃ．）であった。健康対照群は１２匹、残りの各群は１６匹であった。
１．動物の選択及び群分け、モデル確立、投与レジメン
１０８匹の雄性Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（７～８週齢）を体重に応じてランダムに７群に分け、Ｇ１は健康対照群、Ｇ２はモデル対照群、Ｇ３は市販の短時間効果ＩＬ－２対照群（１２５Ａｌａ ＩＬ－２、３×１０４ＩＵ／匹／ｄ、ｓ．ｃ．）、Ｇ４はＨＳＡ対照群（０．３ｍｇ／ｋｇ／４ｄ、ｓ．ｃ．）、Ｇ５はＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質低用量群（１×１０４ＩＵ／匹／４ｄ、ｓ．ｃ．）、Ｇ６はＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質中等用量群（３×１０４ＩＵ／匹／４ｄ、ｓ．ｃ．）、Ｇ７はＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質高用量群（１×１０５ＩＵ／匹／４ｄ、ｓ．ｃ．）であった。健康対照群は１２匹、残りの各群は１６匹であった。
【0103】
試験の２日目（Ｄ２）から、モデリングした各群の動物に濃度が２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を添加した飲用水を飲ませ、６日間持続し（２～７日間をＤＳＳ期と定義する）、結腸炎モデルを誘導した。Ｄ８から、ＤＳＳを含まない飲用水を投与した。モデリングの前後に、対応する薬物又は滅菌注射用水を皮下注射した（ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質及びＨＳＡは４日毎に１回投与し、それぞれＤ０、Ｄ４、Ｄ８の計３回、１２５Ａｌａ ＩＬ－２はＤ０～Ｄ８毎日１回、計９回）。
【0104】
２．検出指標
２．１ 一般的な臨床観察
試験期間において毎日２回、上記各群における生きている動物に対して一般的な臨床観察を行い、観察内容は、外観兆候、精神状態、行動活動、摂食及び飲水量、糞便性状及び体重変化（重点的に観察）又は他の異常状況を含むが、これらに限定されない。
２．１ 一般的な臨床観察
試験期間において毎日２回、上記各群における生きている動物に対して一般的な臨床観察を行い、観察内容は、外観兆候、精神状態、行動活動、摂食及び飲水量、糞便性状及び体重変化（重点的に観察）又は他の異常状況を含むが、これらに限定されない。
【0105】
２．２ 体重
上記各群の動物に対して体重測定を行った。群分け前に１回秤量し、試験期間に毎日１回秤量し、安楽死前に１回秤量し、意外に死亡した動物を秤量した。
上記各群の動物に対して体重測定を行った。群分け前に１回秤量し、試験期間に毎日１回秤量し、安楽死前に１回秤量し、意外に死亡した動物を秤量した。
【0106】
２．３ 糞便性状及び血便の程度
モデリングの日（Ｄ２）から毎日１回、上記各群における生きている動物の糞便性状及び血便の程度を以下の基準でスコアした。糞便性状：０＝正常、１＝糞便が成形するがやや柔らかい、２＝糞便が非常に柔らかい、３＝下痢、４＝赤痢様便、血便の程度：０＝便潜血陰性、１＝便潜血陽性、２＝便に出血が認められる、３＝直腸出血が認められる。
モデリングの日（Ｄ２）から毎日１回、上記各群における生きている動物の糞便性状及び血便の程度を以下の基準でスコアした。糞便性状：０＝正常、１＝糞便が成形するがやや柔らかい、２＝糞便が非常に柔らかい、３＝下痢、４＝赤痢様便、血便の程度：０＝便潜血陰性、１＝便潜血陽性、２＝便に出血が認められる、３＝直腸出血が認められる。
【0107】
２．４ 結腸長さ及び重量の測定
ＤＳＳ期終了時（Ｄ８）に各群の半数の動物、試験終点に各群の残りの動物をそれぞれ安楽死させ、結腸を剥離し、結腸の長さを測定し、結腸の重量を秤量した。
ＤＳＳ期終了時（Ｄ８）に各群の半数の動物、試験終点に各群の残りの動物をそれぞれ安楽死させ、結腸を剥離し、結腸の長さを測定し、結腸の重量を秤量した。
【0108】
２．５ 脾臓重量の測定及びリンパ球サブセットの分析
ＤＳＳ期終了時（Ｄ８）に各群の半数の動物、試験終点に各群の残りの動物をそれぞれ安楽死させ、無菌的に脾臓を取って秤量し、脾臓単細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーにより、そのうちのＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）の割合を検出した。
ＤＳＳ期終了時（Ｄ８）に各群の半数の動物、試験終点に各群の残りの動物をそれぞれ安楽死させ、無菌的に脾臓を取って秤量し、脾臓単細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーにより、そのうちのＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）の割合を検出した。
【0109】
３．統計分析
計測資料は、平均値と標準偏差（Ｍｅａｎ±ＳＤ）を用いて記述し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアでプロットしてＳＰＳＳ ２５で統計分析を行い、その手順は以下のとおりであった。データに対して等分散性の検定（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を行い、等分散性を有するデータ（Ｐ＞０．０５）に対して一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を行い、差異があると検定されたデータ（Ｐ≦０．０５）に対してＬＳＤ多重比較分析を行い、等分散性を有しないデータ（Ｐ≦０．０５）に対してＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定を行い、差異があると検定されたデータ（Ｐ≦０．０５）に対してＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙペアワイズ比較分析を行い、Ｐ≦０．０５を有意差があるとした。主に健康対照群とモデル対照群、及びモデル対照群と各投与群の検出指標の群間差異を調査した。
計測資料は、平均値と標準偏差（Ｍｅａｎ±ＳＤ）を用いて記述し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアでプロットしてＳＰＳＳ ２５で統計分析を行い、その手順は以下のとおりであった。データに対して等分散性の検定（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を行い、等分散性を有するデータ（Ｐ＞０．０５）に対して一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を行い、差異があると検定されたデータ（Ｐ≦０．０５）に対してＬＳＤ多重比較分析を行い、等分散性を有しないデータ（Ｐ≦０．０５）に対してＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定を行い、差異があると検定されたデータ（Ｐ≦０．０５）に対してＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙペアワイズ比較分析を行い、Ｐ≦０．０５を有意差があるとした。主に健康対照群とモデル対照群、及びモデル対照群と各投与群の検出指標の群間差異を調査した。
【0110】
４．試験結果
４．１ 動物生存状況
試験期間中、回復期（Ｄ８～Ｄ１５）の計８匹（モデル対照群の４匹、１２５Ａｌａ ＩＬ－２群の１匹、ＨＳＡ対照群の２匹、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質中等用量群の１匹）の動物が死亡した。試験終点までに、健康対照群（Ｇ１）、モデル対照群（Ｇ２）、市販の短時間効果ＩＬ－２対照群（Ｇ３）、ＨＳＡ群（Ｇ４）、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質低用量群（Ｇ５）、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質中等用量群（Ｇ６）、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質高用量群（Ｇ７）の動物死亡率は、それぞれ０％、５０％、１２．５％、２５％、０％、１２．５％、０％であった。この７群の動物の回復期の生存曲線を図１３に示す。図１３は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの回復期（Ｄ８－Ｄ１５）生存率に対する影響を示す。図１３の結果から明らかなように、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、１×１０４ＩＵ／匹～１×１０５ＩＵ／匹で４日毎に１回（即ち、Ｇ５－Ｇ７：ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の低、中等、及び高用量）予防的に投与すると、ＤＳＳ誘導結腸炎マウスの死亡率を低下させることができる。
４．１ 動物生存状況
試験期間中、回復期（Ｄ８～Ｄ１５）の計８匹（モデル対照群の４匹、１２５Ａｌａ ＩＬ－２群の１匹、ＨＳＡ対照群の２匹、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質中等用量群の１匹）の動物が死亡した。試験終点までに、健康対照群（Ｇ１）、モデル対照群（Ｇ２）、市販の短時間効果ＩＬ－２対照群（Ｇ３）、ＨＳＡ群（Ｇ４）、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質低用量群（Ｇ５）、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質中等用量群（Ｇ６）、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質高用量群（Ｇ７）の動物死亡率は、それぞれ０％、５０％、１２．５％、２５％、０％、１２．５％、０％であった。この７群の動物の回復期の生存曲線を図１３に示す。図１３は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの回復期（Ｄ８－Ｄ１５）生存率に対する影響を示す。図１３の結果から明らかなように、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、１×１０４ＩＵ／匹～１×１０５ＩＵ／匹で４日毎に１回（即ち、Ｇ５－Ｇ７：ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の低、中等、及び高用量）予防的に投与すると、ＤＳＳ誘導結腸炎マウスの死亡率を低下させることができる。
【0111】
４．２ 体重
７群の動物の体重変化の傾向については、図１４を参照されたい。図１４は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの体重変化に対する影響を示す。図１４から分かるように、試験期間において、健康対照群（Ｇ１）の動物の体重は、変動しながら増加する傾向を示す。モデリングした各群（Ｇ２～Ｇ７）の動物の体重は、ＤＳＳ飲水３日目（Ｄ４）から大幅に低下し、Ｄ１０に動物の死亡が現れ、その後、生きた動物の体重はゆっくりと上昇する傾向を示す。中でも、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の高用量群（Ｇ７）の体重減少が明らかに抑制され、体重減少の程度がモデル対照群（Ｇ２）よりも低い。ＳＰＳＳ統計ソフトを用いて二元配置分散分析を行ったところ、治療と時間との相乗作用が有意である（Ｐ＜０．０５）ことを見出した。
７群の動物の体重変化の傾向については、図１４を参照されたい。図１４は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの体重変化に対する影響を示す。図１４から分かるように、試験期間において、健康対照群（Ｇ１）の動物の体重は、変動しながら増加する傾向を示す。モデリングした各群（Ｇ２～Ｇ７）の動物の体重は、ＤＳＳ飲水３日目（Ｄ４）から大幅に低下し、Ｄ１０に動物の死亡が現れ、その後、生きた動物の体重はゆっくりと上昇する傾向を示す。中でも、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の高用量群（Ｇ７）の体重減少が明らかに抑制され、体重減少の程度がモデル対照群（Ｇ２）よりも低い。ＳＰＳＳ統計ソフトを用いて二元配置分散分析を行ったところ、治療と時間との相乗作用が有意である（Ｐ＜０．０５）ことを見出した。
【0112】
図１４の結果から、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、用量依存的にＤＳＳ誘導潰瘍性結腸炎マウスの体重軽減を改善できることが示される。また、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、１×１０５ＩＵ／匹の用量（Ｇ７：ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質高用量群）で、ＤＳＳ誘導結腸炎マウスの体重低下に対して顕著な抑制作用を有する。
【0113】
４．３ 糞便性状及び血便程度のスコア
７群の動物の糞便性状及び血便程度のスコアの統計結果を図１５及び図１６に示す。図１５は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの糞便性状に対する影響を示す。図１６は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの血便程度に対する影響を示す。図１５及び図１６に示す結果から分かるように、健康対照群（Ｇ１）と比較して、モデル対照群（Ｇ２～Ｇ７）の動物は、ＤＳＳ飲水の２日目（Ｄ３）から、泥状便及び血便などの結腸炎に関連する臨床症状が現れ、臨床スコアが増加し続け、且つＤＳＳ飲水を停止した後、徐々に回復する。ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の低、中等、高用量群（Ｇ５～Ｇ７）の動物は、ＤＳＳ飲水の２日目（Ｄ３）から体重低下、泥状便及び血便などの結腸炎に関連する臨床症状が現れるが、以上の症状は、モデル対照群（Ｇ２）より明らかに軽く、且つ一定の用量－効果関係を示し、特にＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の中等用量群（Ｇ６）はＤ６～Ｄ７において、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の高用量群（Ｇ７）はＤ６～Ｄ９において糞便性状スコアが明らかに低下し、統計学的に有意差がある（Ｐ＜０．０５）。
７群の動物の糞便性状及び血便程度のスコアの統計結果を図１５及び図１６に示す。図１５は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの糞便性状に対する影響を示す。図１６は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの血便程度に対する影響を示す。図１５及び図１６に示す結果から分かるように、健康対照群（Ｇ１）と比較して、モデル対照群（Ｇ２～Ｇ７）の動物は、ＤＳＳ飲水の２日目（Ｄ３）から、泥状便及び血便などの結腸炎に関連する臨床症状が現れ、臨床スコアが増加し続け、且つＤＳＳ飲水を停止した後、徐々に回復する。ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の低、中等、高用量群（Ｇ５～Ｇ７）の動物は、ＤＳＳ飲水の２日目（Ｄ３）から体重低下、泥状便及び血便などの結腸炎に関連する臨床症状が現れるが、以上の症状は、モデル対照群（Ｇ２）より明らかに軽く、且つ一定の用量－効果関係を示し、特にＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の中等用量群（Ｇ６）はＤ６～Ｄ７において、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の高用量群（Ｇ７）はＤ６～Ｄ９において糞便性状スコアが明らかに低下し、統計学的に有意差がある（Ｐ＜０．０５）。
【0114】
図１５及び図１６の結果から、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、用量依存的にＤＳＳ誘導潰瘍性結腸炎マウスの下痢を改善できることが示される。特に、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、３×１０４ＩＵ／匹（Ｇ６）及び１×１０５ＩＵ／匹の用量（Ｇ７）で、ＤＳＳ誘導結腸炎マウスの臨床症状に対して顕著な改善作用を有する。
【0115】
４．４ 結腸長さ及び重量
本試験では、ＤＳＳ期末（Ｄ８）の各群の半数の動物及び回復期末（Ｄ１５）の各群の残りの動物に対して結腸組織を評価した。
本試験では、ＤＳＳ期末（Ｄ８）の各群の半数の動物及び回復期末（Ｄ１５）の各群の残りの動物に対して結腸組織を評価した。
【0116】
７群の動物の結腸採取材を図１７に、結腸の長さを図１８に、結腸の重量を図１７に示す。図１７は、Ｄ８で安楽死させたＣ５７ＢＬ／６マウスの結腸採取材写真を示す。図１８は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの結腸長さに対する影響を示す。図１９は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの結腸重量に対する影響を示す。図１８及び図１９から分かるように、健康対照群（Ｇ１）、モデル対照群（Ｇ２）、市販の短時間効果ＩＬ－２対照群（Ｇ３）、ＨＳＡ群（Ｇ４）、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質低用量群（Ｇ５）、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質中等用量群（Ｇ６）、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質高用量群（Ｇ７）の各群の動物は、Ｄ８での結腸長さがそれぞれ７．４３±０．６７、５．２９±０．４８、４．７６±０．９９、５．３６±０．６８、５．３９±０．４７、６．０４±０．９１、６．４７±１．５５ｃｍであり、結腸重量（内容物を含む）がそれぞれ０．３７±０．０５、０．３１±０．０７、０．２１±０．０４、０．３０±０．０７、０．３０±０．０６、０．３８±０．０９、０．４３±０．１６ｇである。健康対照群（Ｇ１）に比べて、モデル対照群（Ｇ２）の動物の結腸長さは、明らかに短縮され、統計学的に有意差がある（Ｐ＜０．０５）。モデル対照群（Ｇ２）に比べて、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の低、中等、高用量群（Ｇ５～Ｇ７）の動物の結腸長さは、用量依存的に増加するが、統計学的に有意差が見られない。１２５Ａｌａ ＩＬ－２群（Ｇ３）に比べて、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の中等用量群（Ｇ６）では、動物の結腸重量が顕著に増加し（Ｐ＜０．０１）、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の高用量群（Ｇ７）では、動物の結腸長さ及び結腸重量が共に顕著に増加する（Ｐ＜０．０１）。上記結果から明らかなように、同じ用量（３×１０４ＩＵ／匹）のＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、短時間効果のＩＬ－２よりも顕著な治療効果を有し、且つ統計学的に差異がある。これから分かるように、従来の１２５Ａｌａ ＩＬ－２に比較して、本発明のＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、投与間隔時間を延長するだけでなく、より良い治療効果を有する。
【0117】
図１８及び図１９の結果から、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、用量依存的にＤＳＳ誘導潰瘍性結腸炎マウスの結腸短縮を改善できることが示される。ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、３×１０４ＩＵ／匹及び１×１０５ＩＵ／匹の用量（Ｇ６、Ｇ７）で、ＤＳＳ誘導結腸炎マウスの結腸短縮に対して予防作用を有する。
【0118】
４．５ 脾臓重量及び臓器係数
本試験では、ＤＳＳ期末（Ｄ８）の各群の半数の動物及び回復期末（Ｄ１５）各群の残りの動物に対して脾臓重量を評価した。
本試験では、ＤＳＳ期末（Ｄ８）の各群の半数の動物及び回復期末（Ｄ１５）各群の残りの動物に対して脾臓重量を評価した。
【0119】
７群の動物の脾臓重量及び脾臓臓器係数を図２０に示す。図２０は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの脾臓重量及び臓器係数に対する影響を示す。図２０から分かるように、各群の動物のＤ８での脾臓重量は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質高用量群ではモデル対照群に比べて顕著に増加する（０．１１±０．０１ｇ Ｖｓ ０．０８±０．０１ｇ、Ｐ＜０．０５）以外、残りの各群ではモデル対照群のレベルに近い。健康対照群（Ｇ１）と比較して、モデル対照群（Ｇ２）の動物のＤ８での脾臓臓器係数は、顕著に増加する（０．４４±０．０６％ Ｖｓ ０．２８±０．０１％、Ｐ＜０．０５）が、残りの各群はモデル対照群と有意差がない。
【0120】
４．６ 脾臓リンパ球サブセット分析
本試験では、ＤＳＳ期末（Ｄ８）の各群の半数の動物及び回復期末（Ｄ１５）の各群の残りの動物に対して脾臓リンパ球サブセットを分析した。
本試験では、ＤＳＳ期末（Ｄ８）の各群の半数の動物及び回復期末（Ｄ１５）の各群の残りの動物に対して脾臓リンパ球サブセットを分析した。
【0121】
７群の動物の脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）の割合を図２１に示す。図２１は、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質によるＤＳＳ誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸炎モデルの脾臓リンパ球サブセットに対する影響を示す。図２１から、以下のことが分かる。
【0122】
試験Ｄ８では、モデル対照群（Ｇ２）と比較して、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の低、中等、高用量群（Ｇ５－Ｇ７）の動物では、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞の占める割合には顕著な変化が見られなかったが、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋（典型的なＴｒｅｇ）サブセットがいずれも顕著に誘導された（Ｐ＜０．０５）。１２５Ａｌａ ＩＬ－２群の動物におけるＴｒｅｇサブセットの割合もある程度増加した。
【0123】
試験Ｄ１５では、モデル対照群と比較して、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の低、中等、高用量群の動物では、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞の占める割合が多少低下したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴｒｅｇサブセットの割合が依然として高いレベルを維持した。
【0124】
７群におけるＤ８及びＤ１５でのＴｒｅｇ細胞の典型的な検出結果を図２２及び図２３に示す。図２２は、フローサイトメトリー検出による結腸炎モデルマウスの脾臓Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）細胞（Ｄ８）の典型的な結果を示す。図２３は、フローサイトメトリー検出による結腸炎モデルマウスの脾臓Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）細胞（Ｄ１５）の典型的な結果を示す。
【0125】
図２２及び図２３の結果から、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、１×１０４ＩＵ／匹－１×１０４ＩＵ／匹の用量で、マウスの末梢Ｔｒｅｇ細胞のレベルを長時間効果的にアップレギュレーションすることができ、且つＣＤ８＋Ｔ細胞傷害作用の低減に寄与することが示される。
【0126】
実施例８：ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質の異なる種ＩＬ－２Ｒに対する親和性分析
バイオレイヤー干渉技術（Bio-Layer Interferometry、ＢＬＩ）を用いて、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質と異なる種（ヒト、イヌ、ラット、マウス）のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）との間の相互作用を検出して分析した。異なる種のＩＬ－２ＲをＰｒｏＡ又はｈＦｃプローブでそれぞれ捕捉した後、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質を異なる濃度勾配に希釈し、次にＰｒｏＡ又はｈＦｃプローブに付着した異なる種のＩＬ－２Ｒとそれぞれ結合及び解離を行い、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質と異なる種のＩＬ－２Ｒとの親和性を測定した。具体的な方法は、以下の通りである。
バイオレイヤー干渉技術（Bio-Layer Interferometry、ＢＬＩ）を用いて、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質と異なる種（ヒト、イヌ、ラット、マウス）のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）との間の相互作用を検出して分析した。異なる種のＩＬ－２ＲをＰｒｏＡ又はｈＦｃプローブでそれぞれ捕捉した後、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質を異なる濃度勾配に希釈し、次にＰｒｏＡ又はｈＦｃプローブに付着した異なる種のＩＬ－２Ｒとそれぞれ結合及び解離を行い、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質と異なる種のＩＬ－２Ｒとの親和性を測定した。具体的な方法は、以下の通りである。
【0127】
（１）ヒトＩＬ－２Ｒ（ｈＩＬ２Ｒ、ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ、ＩＬＧＨ５２５７）及びマウスＩＬ－２Ｒ（ｍＩＬ２Ｒ、ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ、ＩＬＧＭ５２５３）を３０ｎＭに希釈し、４００ｒｐｍ／ｍｉｎの回転数でＰｒｏＡプローブに吸着させ、ラットＩＬ－２Ｒ（ｒＩＬ２Ｒ、自家製、２０２２０１１１、遺伝子登録番号：ＩＬ２Ｒα＿Ｐ２６８９７、ＩＬ２Ｒβ＿Ｐ２６８９６、ＩＬ２Ｒγ＿ＡＡＨ７９３４３．１）及びイヌＩＬ－２Ｒ（ＣａＩＬ２Ｒ、自家製、２０２２０４２１、遺伝子登録番号：ＩＬ２Ｒα＿Ｏ６２８０２、ＩＬ２Ｒβ＿Ｆ１ＰＧＡ６、ＩＬ２Ｒγ＿Ｐ４０３２１）を３０ｎＭに希釈し、４００ｒｐｍ／ｍｉｎの回転数でｈＦｃプローブに吸着させた。
（２）ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質を２０ｎＭから５つの濃度勾配に倍加希釈し、希釈されたＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質をそれぞれＩＬ２Ｒが付着したＰｒｏＡ又はｈＦｃプローブに一定の時間内に結合させるプログラムを設定した。結合が完了した後、複合体のプローブを分析物を含まないＱ ｂｕｆｆｅｒに移し、結合した分析物を解離させた。
（３）プローブを再生バッファー（Regeneration buffer）に浸し、残った結合分析物を除去した。
（４）再生したプローブを１５％のショ糖保護液に入れ、常温で保存した。
（２）ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質を２０ｎＭから５つの濃度勾配に倍加希釈し、希釈されたＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質をそれぞれＩＬ２Ｒが付着したＰｒｏＡ又はｈＦｃプローブに一定の時間内に結合させるプログラムを設定した。結合が完了した後、複合体のプローブを分析物を含まないＱ ｂｕｆｆｅｒに移し、結合した分析物を解離させた。
（３）プローブを再生バッファー（Regeneration buffer）に浸し、残った結合分析物を除去した。
（４）再生したプローブを１５％のショ糖保護液に入れ、常温で保存した。
【0128】
ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質と異なる種のＩＬ－２Ｒとの結合能力の検出結果を図２４及び表３に示す。
【0129】
【表3】
【0130】
上記結果から明らかなように、１）ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質は、ヒト、ラット、マウス、イヌのＩＬ－２Ｒのいずれとも結合し、種の交差が存在する。２）ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質と異なる種のＩＬ－２Ｒとの親和性の順序は、ヒト＞イヌ＞ラット＞マウスである。
【0131】
実施例９：ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質による健常人ＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ細胞に対するインビトロ増殖作用
本実施例において、フローサイトメトリー分析技術を利用して、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質と商品化ｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、商品番号：２０２－ＩＬ）による健常人末梢血単核細胞（Peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）におけるＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－）サブセットに対するインビトロ増殖作用を比較した。
本実施例において、フローサイトメトリー分析技術を利用して、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質と商品化ｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、商品番号：２０２－ＩＬ）による健常人末梢血単核細胞（Peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）におけるＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－）サブセットに対するインビトロ増殖作用を比較した。
【0132】
１.ヒト血ＰＢＭＣの抽出
健常人の新鮮な抗凝固血を取り、リンパ球分離液（Ficoll-Paque PREMIUM、ブランド：Ｃｙｔｉｖａ、商品番号：１７－５４４２－０２）を用いてＰＢＭＣを抽出した。１５ｍＬ遠心チューブに３－５ｍＬリンパ球分離液を加え、希釈後の血液サンプル（３ｍＬ末梢血と３ｍＬ ＰＢＳを均一に混合）をリンパ球分離液の上層に注意しながら加え、４００ｇで３０－４０ｍｉｎ遠心し、バフィーコート細胞を取り、ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩ－１６４０培地＋１０％ＦＢＳで再懸濁し、計数した。
健常人の新鮮な抗凝固血を取り、リンパ球分離液（Ficoll-Paque PREMIUM、ブランド：Ｃｙｔｉｖａ、商品番号：１７－５４４２－０２）を用いてＰＢＭＣを抽出した。１５ｍＬ遠心チューブに３－５ｍＬリンパ球分離液を加え、希釈後の血液サンプル（３ｍＬ末梢血と３ｍＬ ＰＢＳを均一に混合）をリンパ球分離液の上層に注意しながら加え、４００ｇで３０－４０ｍｉｎ遠心し、バフィーコート細胞を取り、ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩ－１６４０培地＋１０％ＦＢＳで再懸濁し、計数した。
【0133】
２.薬物処理
１）培地で細胞密度を２×１０６個／ｍＬに調整し、１ウェルあたり１８００μＬの体積で１２ウェルプレートに播種した。
２）培地でＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質サンプル及びｒｈＩＬ－２を１０μＭに予備希釈し、１０倍勾配で６つの濃度に希釈し、２００μＬ／ウェルで１２ウェルプレートの対応するウェルに添加した。ブランク対照ウェルに、対応して２００μＬ／ウェル培地を加えた。
３）３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターで７２時間連続培養した。
１）培地で細胞密度を２×１０６個／ｍＬに調整し、１ウェルあたり１８００μＬの体積で１２ウェルプレートに播種した。
２）培地でＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質サンプル及びｒｈＩＬ－２を１０μＭに予備希釈し、１０倍勾配で６つの濃度に希釈し、２００μＬ／ウェルで１２ウェルプレートの対応するウェルに添加した。ブランク対照ウェルに、対応して２００μＬ／ウェル培地を加えた。
３）３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターで７２時間連続培養した。
【0134】
３．フローサイトメトリーによる細胞解析
１）細胞懸濁液を２×１０６細胞／１００μＬ／チューブになるように新しいＥｐチューブに移した。
２）対応する割合で、ＰＢ４５０ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３（ＢＤ、商品番号：５５８１２４、１：２００）、ＰＣ５．５ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４（ＢＤ、商品番号：５５６９２４、１：１００）、ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２５（ＢＤ、商品番号：５５５４３４，１：５０）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１２７（ＢＤ、商品番号：５５７９３８、１：１００）をそれぞれ加え、陰性対照、シングル陽性対照及びアイソタイプ対照を設定した。４℃で遮光しながら３０分間インキュベートした。
３）４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。
４）３００μＬのＤＰＢＳで再懸濁した後、フローサイトメータで検出した。
１）細胞懸濁液を２×１０６細胞／１００μＬ／チューブになるように新しいＥｐチューブに移した。
２）対応する割合で、ＰＢ４５０ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３（ＢＤ、商品番号：５５８１２４、１：２００）、ＰＣ５．５ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４（ＢＤ、商品番号：５５６９２４、１：１００）、ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２５（ＢＤ、商品番号：５５５４３４，１：５０）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１２７（ＢＤ、商品番号：５５７９３８、１：１００）をそれぞれ加え、陰性対照、シングル陽性対照及びアイソタイプ対照を設定した。４℃で遮光しながら３０分間インキュベートした。
３）４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。
４）３００μＬのＤＰＢＳで再懸濁した後、フローサイトメータで検出した。
【0135】
４．検出結果
ヒトＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－）サブセットに対するＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質とｒｈＩＬ－２のインビトロ増殖作用の結果を図２５及び図２６に示す。図２５は、Ｄａｙ３ でのＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質とｒｈＩＬ－２によるヒトＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ細胞の増殖状況の比較を示す。図２６は、フローサイトメトリーによりヒトＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－）サブセットを検出した結果示す。
ヒトＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－）サブセットに対するＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質とｒｈＩＬ－２のインビトロ増殖作用の結果を図２５及び図２６に示す。図２５は、Ｄａｙ３ でのＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質とｒｈＩＬ－２によるヒトＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ細胞の増殖状況の比較を示す。図２６は、フローサイトメトリーによりヒトＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－）サブセットを検出した結果示す。
【0136】
図２５の結果から分かるように、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質で７２ｈ処理した後、ヒトＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ細胞の割合は、用量依存的に増加しており、且つヒトＴｒｅｇ細胞の増殖を促進する生物活性は、ｒｈＩＬ－２より優れている。
【0137】
実施例１０：ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質をラット及びイヌに単回皮下注射した場合の薬物動態学
本実施例では、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質のＳＤラット及びビーグルイヌのインビボでの薬物動態（ＰＫ）を検討した。
本実施例では、ＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質のＳＤラット及びビーグルイヌのインビボでの薬物動態（ＰＫ）を検討した。
【0138】
（１）ＳＤラットに単回皮下及び静脈注射で投与した場合の薬物動態学
試験は、合計で４０匹の投与歴がないＳＤラットを使用し、ランダムに４群に分け、各群１０匹、雌雄それぞれ半分であった。第１－３群の動物には単回の頚背部皮下注射により投与し、低、中等、高の３つの投与量群の投与量は、それぞれ５×１０５ＩＵ／ｋｇ、１×１０６ＩＵ／ｋｇ、２×１０６ＩＵ／ｋｇであり、第４群の動物には尾静脈注射により投与し、投与量は、１×１０６ＩＵ／ｋｇであり、投与体積は、いずれも２ｍＬ／ｋｇであった。試験動物は、それぞれ以下の時点でＰＫ血液サンプルの採取を行った。
第１～３群（皮下注射群）：投与前、投与後１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３０ｈ、３６ｈ、４８ｈ、７２ｈ。
第４群（静脈注射群）：投与前、投与後２ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ。
試験は、合計で４０匹の投与歴がないＳＤラットを使用し、ランダムに４群に分け、各群１０匹、雌雄それぞれ半分であった。第１－３群の動物には単回の頚背部皮下注射により投与し、低、中等、高の３つの投与量群の投与量は、それぞれ５×１０５ＩＵ／ｋｇ、１×１０６ＩＵ／ｋｇ、２×１０６ＩＵ／ｋｇであり、第４群の動物には尾静脈注射により投与し、投与量は、１×１０６ＩＵ／ｋｇであり、投与体積は、いずれも２ｍＬ／ｋｇであった。試験動物は、それぞれ以下の時点でＰＫ血液サンプルの採取を行った。
第１～３群（皮下注射群）：投与前、投与後１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３０ｈ、３６ｈ、４８ｈ、７２ｈ。
第４群（静脈注射群）：投与前、投与後２ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ。
【0139】
ＳＤラットの血清中のＩＬ－２－ＨＳＡの濃度は、検証済みＥＬＩＳＡ法を用いて定量的に検出した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＰｈｏｅｎｉｘＴＭ、バージョン８．１）を採用して、ノンコンパートメント解析法で薬物動態パラメータを算出した。
【0140】
ＳＤラットに、異なる使用量（５×１０５、１×１０６、２×１０６ＩＵ／ｋｇ）を単回皮下注射で投与し、及び１×１０６ＩＵ／ｋｇ使用量のＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質を単回静脈注射で投与した後の、主な薬物動態パラメータを表４に示す。
【0141】
（２）ビーグルイヌに単回皮下及び静脈注射で投与した場合の薬物動態学
試験は、合計で２４匹の投与歴がないビーグルイヌを使用し、ランダムに４群に分け、各群６匹、雌雄それぞれ半分であった。第１～３群の動物には単回の頚背部皮下注射により投与し、低、中等、高の３つの投与量群の投与量は、それぞれ３×１０５ＩＵ／ｋｇ、６×１０５ＩＵ／ｋｇ、１．２×１０６ＩＵ／ｋｇであり、投与体積は、いずれも０．６ｍＬ／ｋｇであった。第４群の動物には静脈注射により投与し、投与量は、６×１０５ＩＵ／ｋｇであった。試験動物は、それぞれ以下の時点でＰＫ血液サンプルの採取を行った。
第１～３群（皮下注射群）：投与前、投与後１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈ、７２ｈ、９６ｈ、１２０ｈ。
第４群（静脈注射群）：投与前、投与後２ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ、１２０ｈ。
試験は、合計で２４匹の投与歴がないビーグルイヌを使用し、ランダムに４群に分け、各群６匹、雌雄それぞれ半分であった。第１～３群の動物には単回の頚背部皮下注射により投与し、低、中等、高の３つの投与量群の投与量は、それぞれ３×１０５ＩＵ／ｋｇ、６×１０５ＩＵ／ｋｇ、１．２×１０６ＩＵ／ｋｇであり、投与体積は、いずれも０．６ｍＬ／ｋｇであった。第４群の動物には静脈注射により投与し、投与量は、６×１０５ＩＵ／ｋｇであった。試験動物は、それぞれ以下の時点でＰＫ血液サンプルの採取を行った。
第１～３群（皮下注射群）：投与前、投与後１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈ、７２ｈ、９６ｈ、１２０ｈ。
第４群（静脈注射群）：投与前、投与後２ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ、１２０ｈ。
【0142】
ビーグルイヌの血清中のＩＬ－２－ＨＳＡの濃度を、検証済みＥＬＩＳＡ法を用いて定量的に検出した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＰｈｏｅｎｉｘＴＭ、バージョン８．１）を採用して、ノンコンパートメント解析法で薬物動態パラメータを算出した。
【0143】
ビーグルイヌに、異なる使用量（３×１０５、６×１０５、１．２×１０６ＩＵ／ｋｇ）を単回皮下注射で投与し、及び６×１０５ＩＵ／ｋｇ使用量のＩＬ－２－ＨＳＡ融合タンパク質を単回静脈注射で投与した後の、主な薬物動態パラメータを表５に示す。
【0144】
【表4】
【0145】
【表5】
【0146】
薬物動態学研究から明らかなように、ＩＬ－２－ＨＳＡは、ラット及びイヌ体内における半減期が天然ＩＬ－２（ヒト体内で数分間）に比べて大幅に延長し、臨床応用時に投与頻度を低減し、投与総量を減少し、患者に対する有害反応及び治療コストを低減し、患者のコンプライアンス及びクオリティ・オブ・ライフを向上させることができる。
【0147】
以上、本発明の好ましい実施形態について詳述したが、本発明は、上記した実施形態の具体的な内容に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内において、本発明の技術案について種々の簡単な変形が可能であり、これらの簡単な変形はいずれも本発明の保護範囲内である。
【0148】
なお、上記具体的な実施形態で説明した各具体的な技術的特徴は、矛盾しない限り、任意の適切な方式で組み合わせることができ、不必要な重複を避けるために、本発明は各種の可能な組み合わせ方式について別途説明しない。
【0149】
さらに、本発明の様々な異なる実施形態同士を任意に組み合わせても構わず、本発明の趣旨に反しない限り、それらは同様に本発明の開示内容と見なすべきである。
【受託番号】
【0150】
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターロイキン２の融合タンパク質であって、ヒトインターロイキン２又はその変異体、及びヒト血清アルブミン又はその変異体を含み、
前記ヒトインターロイキン２又はその変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ヒト血清アルブミン又はその変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項2】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸はシステインではなく、
好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸は、セリン又はアラニンに置換されていることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記ヒトインターロイキン２又はその変異体は、前記ヒト血清アルブミン又はその変異体に直接連結されているか、又は、連結ペプチドを介して連結されており、
好ましくは、前記連結ペプチドの一般式は（Ｇ ｎ Ｓ） ｍ であり、ただし、ｎ、ｍはそれぞれ１～１０の整数であり、
より好ましくは、前記連結ペプチドの一般式は（Ｇ ｎ Ｓ） ｍ であり、ただし、ｎは１～４の整数であり、ｍは０～３の整数であることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
請求項１又は２に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴とする単離された核酸分子。
【請求項6】
発現系であって、前記発現系は、請求項５に記載の核酸分子を含有するＣＨＯ細胞を含み、
請求項１又は２に記載の融合タンパク質を発現させるものであり、
好ましくは、前記発現系は、２０２２年５月２６日に中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４５１７３で寄託されたＣＨＯ－Ｋ１細胞であることを特徴とする発現系。
【請求項7】
請求項１又は２に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項8】
前記薬物組成物の剤形は、注射剤、錠剤、又はカプセルから選ばれ、好ましくは、前記剤形は、液体注射剤又は凍結乾燥粉末注射剤から選ばれ、
好ましくは、前記担体は、賦形剤、希釈剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸着担体、及び／又は安定化剤から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の薬物組成物。
【請求項9】
炎症性腸疾患の治療又は予防に使用するための請求項７に記載の薬物組成物。
【請求項10】
前記炎症性腸疾患は、潰瘍性結腸炎、クローン病又は不確定大腸炎から選ばれることを特徴とする請求項９に記載の薬物組成物。
【請求項11】
前記融合タンパク質又は前記薬物組成物の投与形態は、経口又は注射であり、好ましくは、前記注射は、皮下注射又は静脈内注射であり、
好ましくは、前記融合タンパク質の投与量は、３×１０ ４ ＩＵ／回～１×１０ ６ ＩＵ／回であり、
好ましくは、前記薬物組成物の投与量は、前記薬物組成物中の融合タンパク質として、３×１０ ４ ＩＵ／回～１×１０ ６ ＩＵ／回であり、及び／又は
前記融合タンパク質の投与回数は、７～２８日毎に１回であり、好ましくは１４～２８日毎に１回であり、
好ましくは、前記薬物組成物の投与回数は、１４～２８日毎に１回であり、好ましくは１４～２８日毎に１回であることを特徴とする請求項９に記載の薬物組成物。
【国際調査報告】