(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】機能が強化された新規キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240829BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240829BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240829BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240829BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240829BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20240829BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240829BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/62 Z
C07K19/00
C07K16/28
C12N7/01
C12N15/12
C07K14/725
C12N5/10
A61K35/17
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513236
(86)(22)【出願日】2022-08-26
(85)【翻訳文提出日】2024-03-06
(86)【国際出願番号】 KR2022012556
(87)【国際公開番号】W WO2023027471
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】10-2021-0113648
(32)【優先日】2021-08-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522096950
【氏名又は名称】ティカロス カンパニー， リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】チェ、キョンホ
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ウンヨン
(72)【発明者】
【氏名】ナム、ギリ
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ハンナ
(72)【発明者】
【氏名】イム、ヒョンジ
(72)【発明者】
【氏名】ヨン、ヘラン
(72)【発明者】
【氏名】パク、ヒョンベ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93Y
4B065AA94Y
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA11
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA51
4H045DA75
4H045EA22
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、細胞接着および移動において重要な役割を果たすことが知られているＣＤ９９Ｌ２の一部の領域をキメラ抗原受容体のバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として用いる新規キメラ抗原受容体、これを含む免疫細胞およびそれらの用途に関する。ＣＤ９９Ｌ２ベースＣＡＲ－Ｔ細胞は、既存のＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて向上したＴ細胞活性と腫瘍治療効率を示すので、癌治療のための兔疫細胞の治療に有用に用いられることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と、（ｂ）細胞外結合ドメインと膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）とを含むバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）と、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と、
を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）であって、
前記細胞外結合ドメインは、ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含み、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）。
【請求項2】
前記ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメインは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項3】
前記ＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメインは、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項4】
前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項5】
前記ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞内ドメインは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項6】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ３ガンマ（γ）、デルタ（δ）、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄで構成された群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインと、および／または
ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３およびＣＤ８３リガンドからなる群から選択される共刺激（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ドメインと、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項7】
前記ＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１３または配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項8】
前記抗原結合ドメインは、下記の群から選択される抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含むことを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体：４－１ＢＢ、Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ（ＢＣＭＡ）、Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＢＡＦＦ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ９（ＣＡ９；またはＣＡＩＸまたはＧ２５０として知られている）、ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ １Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ；またはＮＹ ＥＳＯ－１またはＬＡＧＥ２Ｂとして知られている）、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、サイクリン（ｃｙｃｌｉｎ）、ｃｙｃｌｉｎ Ａ２、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、Ｃ－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｌｉｇａｎｄ １（ＣＣＬ－ｌ）、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ６２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ４（ＣＳＰＧ４）、ｃｌａｕｄｉｎ－１８（ＣＬＤＮ１８）、ＣＬＤＮ６、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＣＴＬＡ－４）、ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｍｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ）、ＤＬＬ３、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｔＥＧＦＲ）、ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＥＰＧ－２）、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ４０（ＥＰＧ－４０）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ） Ｂ２、ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ２（ＥＰＨＡ２）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｆｃ受容体（Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｋｅ ５（ＦＣＲＬ５；またＦｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ ５またはＦＣＲＨ５として知られている）、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２３（ＦＧＦ２３）、ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＢＰ）、ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ（ＦＯＬＲ１）、ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ（ＦＯＬＲ２）、ＧＤ２（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＤ２、Ｏ－ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＧＤ２（ＯＧＤ２））、ガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ） ＧＤ３、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １００（ｇｐ１００）、ｇｌｙｐｉｃａｎ－３（ＧＰＣ３）、Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５Ｄ（ＧＰＣＲ５Ｄ）、ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｅｒｂ－Ｂ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ ｄｉｍｅｒｓ、Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｓＡｇ）、Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ａ１（ＨＬＡ－Ａ１）、Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）、ＩＬ－２２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ（ＩＬ－２２Ｒａ）、ＩＬ－１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ２（ＩＬ－１３Ｒａ２）、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＩＣＯＳ）、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦ－１受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ））、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ） αｖβ６、インターフェロン受容体（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＦＮγ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＦＮγＲ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－２Ｒ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－４Ｒ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－５ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－５Ｒ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－６Ｒ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１７ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ（ＩＬ－１７ＲＡ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－３１Ｒ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－３６Ｒ）、ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＤＲ）、Ｌ１ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｌ１－ＣＡＭ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ（ＣＥ７ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ Ｌ１－ＣＡＭ）、Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ８ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３（ＬＡＧ３）、Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ（ＭＡＧＥ）Ａｌ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡｌＯ、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（ＭＳＬＮ）、ｍｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、ｍｕｃｉｎ １（ＭＵＣ１）、ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｇｒｏｕｐ ２ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド（ｌｉｇａｎｄｓ）、ｍｅｌａｎ Ａ（ＭＡＲＴ－ｌ）、ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）、ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＣＡＭ）、ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１（ＮＲＰ－１）、ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－２（ＮＲＰ－２）、癌胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＤ－Ｌ１、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ－βｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＲＯＲ１）、ＳＬＡＭ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ７（ＳＬＡＭＦ７）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰＢＧ；また５Ｔ４として知られている）、ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２（ＴＡＧ７２）、ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＴＲＰ１；またＴＹＲＰ１またはｇｐ７５）、ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＴＲＰ２；またｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ、ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｄｅｌｔａ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅまたはＤＣＴとして知られている）およびウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ １；ＷＴ１）。
【請求項9】
前記抗原結合フラグメントは、抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）であることを特徴とする請求項８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項10】
抗原結合ドメインのＮ末端にシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項11】
前記シグナルペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ８αシグナルペプチドであることを特徴とする請求項１０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項12】
前記キメラ抗原受容体は、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項14】
請求項１３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項15】
請求項１４に記載の発現ベクターを含むウイルス。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞。
【請求項17】
前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージであることを特徴とする請求項１６に記載の免疫細胞。
【請求項18】
請求項１６に記載の免疫細胞を含む癌治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞接着および移動において重要な役割を果たすことが知られているＣＤ９９Ｌ２の一部の領域をキメラ抗原受容体のバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として用いる新規キメラ抗原受容体、これを含む免疫細胞およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞の表面の癌抗原に特異的に結合する組換え抗体（ｓｃＦｖなど）領域をＴ細胞受容体シグナル伝達領域と連結した融合タンパク質（すなわち、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）を、患者の血液から単離したＴ細胞に人為的に発現させた遺伝子導入Ｔ細胞である（Ｋｅｒｓｈａｗ ＭＨ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００５；５（１２）：９２８－４０）。ＣＡＲタンパク質遺伝子をレトロウイルスあるいはレンチウイルスの形態でＴ細胞に導入すると、高い遺伝子導入効率により、２週間以内に５０％以上のＴ細胞がＣＡＲタンパク質を表面に発現することにより、大量の腫瘍特異的Ｔ細胞を短時間内に製造することができるようになる。
【0003】
作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲタンパク質の抗体領域が腫瘍を認識すると活性化信号がＴ細胞の内部へ伝達され、腫瘍を殺傷する腫瘍殺傷性細胞として働く。そこで、２０００年代後半からＣＡＲ－Ｔ細胞治療薬の臨床試験が急増した（Ｊｅｎａ Ｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２０１０；１１６（７）：１０３５－４４）。特に、Ｂリンパ球系の血液腫瘍癌抗原であるＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞治療は、初期の臨床試験から目覚ましい成果を上げた。２０１０年頃Ｂ細胞リンパ腫において若干の効果を示していたＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞治療は、ペンシルバニア大学の研究チームによって既存の治療に対して抵抗性を示した慢性リンパ性白血病患者の完全寛解が報告されることを始めとして、最近は、従来の全ての治療法に抵抗性を示した急性リンパ性白血病患者３０名の中で２７名で１ヶ月以内に完全寛解を得、６カ月全生存率が７８％に達する驚くべき治療効果を示すことによって、多数の多国籍製薬会社の大規模投資で行われるなど、急速な成長を示した（Ｍａｕｄｅ ＳＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１４；３７１（１６）：１５０７－１７）。その結果、２種のＣＤ１９標的ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤が２０１７年末にＦＤＡの承認を受けている。
【0004】
現在ＣＡＲ－Ｔ細胞の開発は、主に血液腫瘍を対象に集中的に行われており、幾つかの固形腫瘍へその対象を拡大している段階である（Ｙｉｐ Ａ， Ｗｅｂｓｔｅｒ ＲＭ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１８；１７（３）：１６１－２）。主たる血液腫瘍ターゲットとしては、多発性骨髄腫を対象に抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤が最も先に進んでおり、Ｂリンパ系の血液腫瘍抗原もＣＤ１９に加えて、ＣＤ２０、ＣＤ２２等に対するＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤も開発されつつある状況である。固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤は、ＧＤ２（脳腫瘍）、メソテリン（胸膜癌）などに対する幾つかの臨床試験が施されているが、未だ劇的な効果は報告されていないのが実情である。その理由は、固形腫瘍の場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞の効力を妨げる幾つかの要因が存在するからであると推定される。例えば、固形腫瘍の場合、腫瘍細胞が主に血液中に分布して腫瘍微小環境を十分生成しない白血病に比べ、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０のような免疫抑制サイトカインを分泌するか、または制御性Ｔ細胞や骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）などの免疫抑制細胞を動員するか、腫瘍の表面にＰＤ－Ｌ１のような免疫抑制リガンドを発現するなど、免疫抵抗性腫瘍微小環境を構築しているからであると考えられる（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ＧＡ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００７；２５：２６７－９６）。したがって、今後ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤の汎用化のためには、免疫抑制環境を克服し、効果を奏することができるＴ細胞の活性が大きく増加されたＣＡＲ－Ｔ細胞の開発が必須的であると言える。
【0005】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を亢進させる一つの戦略は、ＣＡＲタンパク質それ自体の構造を変化させることにより、Ｔ細胞の活性化を増強するものである（Ｄｏｔｔｉ Ｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２０１４；２５７（１）：１０７－２６）。ＣＡＲタンパク質は、癌抗原を認識する抗体の可変領域（単鎖可変フラグメント；ｓｃＦｖ）がバックボーン領域（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｒｅｇｉｏｎ；細胞外空間＋膜貫通ドメイン）を通じて細胞内シグナル伝達領域に結合された形態に設計されている。細胞内シグナル伝達領域は、主にＴ細胞受容体のシグナル伝達サブユニットであるＣＤ３ゼータ鎖の細胞内領域（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ）を基本としている（第１世代ＣＡＲ）。今までＣＡＲタンパク質の修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を通じて、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を向上させるために努力し続けており、その大部分は共刺激分子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）のシグナル伝達領域を変更又は追加する形式で進められてきた（Ｍｏｒｅｌｌｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１６；６（２）：１３３－４６）。例えば、現在市販されている２種のＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤は、それぞれ、ＣＤ２８及び４１ＢＢの共刺激分子の細胞内部分を使用しており（第２世代ＣＡＲ）、その後、ＣＤ２８と４１ＢＢ細胞内領域を同時に含むＣＡＲ（第３世代ＣＡＲ））などが試みられている。現在市販されているノバルティス社製のＫｙｍｒｉａｈ ＣＡＲ－Ｔ細胞とギリアド・サイエンシズ社製のＹｅｓｃａｒｔａ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、それぞれ４１ＢＢとＣＤ２８細胞内領域を使用する第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞である。
【0006】
これに対し、ＣＡＲバックボーン領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４の一部の領域が物理的な結合機能としてのみ用いられており、機能的な要素が付与された例はほとんどない。したがって、ＣＡＲバックボーン領域の変更によってＣＡＲ－Ｔ細胞の機能向上を誘導する新たな方式の修飾が可能である。
【0007】
このような技術的背景の下で、本発明者らは、ＣＡＲバックボーン領域として、ＣＤ９９Ｌ２タンパク質の膜貫通領域を含む領域を使用する新しいＣＡＲ設計を導入することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍治療効能の改善可能性を打診した。その結果、ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞は、従来のＣＤ８バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞よりも大幅に向上した抗腫瘍効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
【0008】
本背景技術の欄に記載された前記情報は、ただ本発明の背景に対する理解を向上させるためのものに過ぎず、そこで、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者にとって既知の先行技術を形成する情報を含まない可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の目的は、改善された腫瘍治療効果を示すキメラ抗原受容体及びこれを含む免疫細胞を提供することにである。
【0010】
本発明の他の目的は、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、前記核酸を含む発現ベクター、および前記発現ベクターを含むウイルスを提供することにある。
【0011】
本発明はまた他の目的は、前記免疫細胞を含む癌治療用組成物、前記免疫細胞を用いた癌治療方法、癌治療のための前記免疫細胞の用途、および癌治療用薬剤の製造のための前記免疫細胞の使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
前記目的を達成するために、本発明は、ＣＤ９９Ｌ２タンパク質由来の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを含むキメラ抗原受容体を提供する。
【0013】
本発明はまた、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、前記核酸を含む発現ベクター、前記発現ベクターを含むウイルス及び前記キメラ抗原レセプターを発現する免疫細胞を提供する。
【0014】
本発明はまた、前記免疫細胞を含む癌治療用組成物、前記免疫細胞を用いた癌治療方法、癌治療のための前記免疫細胞の用途、および癌治療用薬剤の製造のための前記免疫細胞の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１は、ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲの設計および試験管内活性検証結果を示した図である。図１Ａは、各ＣＡＲタンパク質の構造設計の模式図であり（ｈＣＤ８ Ｌ：ヒトＣＤ８ａリーダー、αＣＤ１９ ｓｃＦｖ：抗ＣＤ１９抗体（クローンＦＭＣ６３）単鎖可変フラグメント、ＥＣ：細胞外領域、ＴＭ：膜貫通領域、ｃｙｔ：細胞質領域）、図１Ｂおよび図１Ｅは、ＣＡＲ－Ｔ細胞表面のＣＡＲタンパク質の発現レベルを示す図である（グラフ内の数字：細胞の割合（％））。図１Ｃ及び図１Ｆは、各ＣＡＲ－Ｔ細胞のＲａｊｉ－Ｌｕｃリンパ腫細胞に対する殺傷力を示したグラフであり（相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）：ＣＡＲ－Ｔ細胞と共に一夜培養後に生存Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ活性値；ＥＴ比（エフェクター：標的の割合）：共培養されたＣＡＲ－Ｔ細胞内（エフェクタ）とＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞（標的）の細胞数の割合）、図１Ｄ及び図１Ｇは、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞との共培養後上清液として分泌されたＩＦＮ－γの量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0016】
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使われた命名法は、本技術分野でよく知られており、通用されるものである。
【0017】
キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）は、抗体の抗原認識ドメインを細胞膜ドメインおよび細胞内におけるシグナル伝達ドメインと結合した人為的な受容体である。遺伝子導入によりこの受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、抗体ドメインによって腫瘍表面抗原を認識して活性化されることによって、腫瘍を特異的に殺傷する能力を持つことになる。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗体の腫瘍標的能とＴ細胞の腫瘍殺傷能とが結合された抗体遺伝子細胞治療剤として開発されてきており、特に、血液腫瘍に対して優れた治療効果を示すことにより、２種以上のＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤が発売された。しかし、ＣＡＲ－Ｔ細胞療薬は、血液中で腫瘍細胞との遭遇確率の高い血液腫瘍では高い治療効率を示しているが、固形腫瘍に対しては低い効率を示している。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療の固形腫瘍への汎用化のためには、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能が改善されなければならない。ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能強化戦略の一環として、ＣＡＲタンパク質の構造の改変によってより効率的なＣＡＲタンパク質を作製しようとするように取り組んでいる。
【0018】
ＣＡＲバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）領域は、膜貫通ドメインを含み、新たな細胞膜タンパク質の膜貫通ドメインは、ＣＡＲ機能の向上に用いられることができる。その対象として、本発明ではＣＤ９９Ｌ２を用いた。ＣＤ９９Ｌ２（ＣＤ９９ ａｎｔｉｇｅｎ－ｌｉｋｅ ２）は、ＣＤ９９ファミリーに属する細胞膜タンパク質であって、ＣＤ９９ファミリータンパク質は、主に白血球と内皮細胞などに発現することが知られている。機能的に、これらのタンパク質は、細胞接着（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、細胞移動（ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）などを促進することが報告されている（Ｐａｓｅｌｌｏ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ． ２０１８；１２（１）：５５－６８）。特に、ＣＤ９９Ｌ２は、炎症条件下で好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、Ｔ細胞等の血管外遊出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）に関与することが報告されている。また、血管内皮細胞で発現するＣＤ９９Ｌ２が白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）の血管外遊出に関与する可能性が提示された（Ｓｅｅｌｉｇｅ Ｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１３；１９０（３）：８９２－６）。ＣＤ９９Ｌ２はＣＤ９９とヘテロ二量体を形成し（Ｎａｍ Ｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１３；１９１（１１）：５７３０－４２）、ＣＤ９９タンパク質は、Ｔ細胞共刺激に関与することが報告されており、ＣＤ９９Ｌ２がＴ細胞活性化に寄与する可能性も存在する（Ｏｈ ＫＩ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ２００７；３９（２）：１７６－８４）。
【0019】
結果的に、本発明によって、ＣＤ９９Ｌ２領域が導入されたＣＡＲタンパク質を設計および作製することにより、Ｔ細胞の活性化によって機能が向上したＣＡＲ－Ｔ細胞という新しい概念を提示しようとする。
【0020】
したがって、本発明は一態様において、
（ａ）抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と、
（ｂ）細胞外結合ドメインと膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）とを含むバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）と、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と、
を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）であって、
前記細胞外結合ドメインは、ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）に関する。
（ａ）抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と、
（ｂ）細胞外結合ドメインと膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）とを含むバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）と、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と、
を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）であって、
前記細胞外結合ドメインは、ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）に関する。
【0021】
本発明において、「バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」とは、細胞外結合ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）と膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）とを含む領域を意味する。
【0022】
本発明において、「細胞外結合ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）」とは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを連結する領域を意味する。
【0023】
本発明において、前記細胞外結合ドメインは、ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）、好ましくは、ヒトＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメインの全部又は一部を含むことができる。前記ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメインは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列の全部または一部を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【0024】
本発明において、前記膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ；ＴＭ）は、ＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメイン、好ましくは、ヒトＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメインの全部または一部を含むことができる。前記ＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメインは、配列番号１１で表されるアミノ酸配列の全部または一部を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【0025】
また、本発明において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）をさらに含むことができる。
【0026】
前記ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞内ドメインは、ＣＤ９９Ｌ２由来の細胞内ドメインの全部または一部を含むものであってもよく、好ましくは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【0027】
本発明において、前記細胞外結合ドメインは、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）ドメインをさらに含むことができる。
【0028】
前記ヒンジドメインは、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドからなり、１～１００個のアミノ酸残基、好ましくは、１０～７０個のアミノ酸残基を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【0029】
本発明において、前記細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）は、免疫細胞の細胞膜内側、すなわち細胞質に位置するようになる部分であって、細胞外ドメインに含まれる抗原結合ドメインが標的抗原に結合したとき、細胞内に信号を伝達して免疫細胞の免疫応答を活性化する部分を意味する。
【0030】
本発明において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ３ガンマ（γ）、デルタ（δ）、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄからなる群から選択される１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインであることが好ましいが、これらに限定されるものではなく、より好ましくは、ＣＤ３ゼータ（ζ）であってもよい。本発明のＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１３または配列番号１３の配列の１４番目のアミノ酸残基のグルタミン（Ｑ）残基がリジン（Ｋ）に置換された配列番号１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することができるが、これに限定されるものではない。
【0031】
また、本発明に係る細胞内シグナル伝達ドメインは、追加的に共刺激（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ドメインを含むことができるが、これに限定されるものではない。本発明による共刺激（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３およびＣＤ８３リガンドからなる群から選択される１つ以上の共刺激ドメインが好ましいが、これに限定されるものではない。
【0032】
好ましくは、本発明に係る細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１３又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内シグナル伝達ドメインと、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢの共刺激ドメインとを含むことができるが、これに限定されるものではない。
【0033】
特に、本発明によるキメラ抗原受容体は、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインと、１つ以上の共刺激ドメインと、を含むことができる。
【0034】
本発明によるキメラ抗原受容体に１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインと、１つ以上の共刺激ドメインとが含まれる場合には、１つ以上の共刺激ドメインと、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインとは、互いに直列に連結されることができる。この場合、各ドメインは、直接連結するか、または選択的にまたは２つ～１０つのアミノ酸残基からなるオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーを介して連結されていてもよく、好ましくは、かかるリンカー配列として、グリシン－セリン連続配列が挙げられる。
【0035】
本発明において、前記キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞の免疫機能促進因子をさらに含むことができ、Ｔ細胞の免疫機能促進因子としては、ＩＬ－７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ７）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１またはＣＣＬ－１９を挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｔ細胞の免疫機能促進因子に関してＷＯ２０１６／０５６２２８Ａを参照することができる。
【0036】
本発明において、前記キメラ抗原受容体は、ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ３／５結合モチーフを含むインターロイキン受容体鎖（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｈａｉｎ）をさらに含むことができ、ＩＬ－２Ｒβが挙げられるが、これに限定されるものではない。これに関連して、ＷＯ２０１６／１２７２５７Ａを参照することができる。
【0037】
第１世代ＣＡＲでは、癌細胞において特異的に発現する抗原認識領域を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ζのみを用いたが、癌に対する治療効果が微々たるものであったし、持続時間が短いという問題があった。このような第１世代ＣＡＲは、米国特許第６，３１９，４９４号に具体的に記載されており、本発明に参照として組み込まれる。
【0038】
免疫細胞に対する反応性向上のために共刺激ドメイン（ＣＤ２８またはＣＤ１３７／４－１ＢＢ）とＣＤ３ζとを結合した第２世代ＣＡＲが製造されたが、第１世代ＣＡＲと比較して体内に残存するＣＡＲ含む免疫細胞の数が著しく増加した。第２世代ＣＡＲは、１つの共刺激性ドメインを用いたことに対し、第３世代ＣＡＲでは２つ以上の共刺激性ドメインを用いた。生体内ＣＡＲを含む免疫細胞の増殖および持続性を達成するために、共刺激ドメインを４－１ＢＢ、ＣＤ２８またはＯＸ４０などと結合させることができる。第２世代ＣＡＲは、米国特許第７，７４１，４６５号、第７，４４６，１９０号または第９，２１２，２２９号に具体的に記載されており、３世代ＣＡＲは、米国特許第８，８２２，６４７号に具体的に記載されており、本発明に参照として組み込まれる。
【0039】
第４世代ＣＡＲでは、ＩＬ－１２又はＩＬ－１５などのサイトカインをコードする追加の遺伝子を含み、サイトカインのＣＡＲベースの免疫タンパク質が更に発現可能にし、第５世代ＣＡＲは、免疫細胞を強化するために、インターロイキン受容体鎖、例えば、ＩＬ－２Ｒβをさらに含む。第４世代ＣＡＲは、米国特許第１０，３１６，１０２号、第５世代ＣＡＲは、米国特許第１０，３３６，８１０号に具体的に記載されており、本発明に参照として組み込まれる。
【0040】
本発明において、抗原結合ドメインは、下記の群から選択される抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【0041】
４－１ＢＢ、Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ（ＢＣＭＡ）、Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＢＡＦＦ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ９（ＣＡ９；またはＣＡＩＸまたはＧ２５０として知られている）、ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ １Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ；またはＮＹ ＥＳＯ－１またはＬＡＧＥ２Ｂとして知られている）、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、サイクリン（ｃｙｃｌｉｎ）、ｃｙｃｌｉｎ Ａ２、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、Ｃ－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｌｉｇａｎｄ １（ＣＣＬ－ｌ）、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ６２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ４（ＣＳＰＧ４）、ｃｌａｕｄｉｎ－１８（ＣＬＤＮ１８）、ＣＬＤＮ６、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＣＴＬＡ－４）、ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｍｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ）、ＤＬＬ３、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｔＥＧＦＲ）、ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＥＰＧ－２）、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ４０（ＥＰＧ－４０）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ） Ｂ２、ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ２（ＥＰＨＡ２）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｆｃ受容体（Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｋｅ ５（ＦＣＲＬ５；またはＦｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ ５またはＦＣＲＨ５として知られている）、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２３（ＦＧＦ２３）、ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＢＰ）、ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ（ＦＯＬＲ１）、ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ（ＦＯＬＲ２）、ＧＤ２（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＤ２、Ｏ－ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＧＤ２（ＯＧＤ２））、ガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ） ＧＤ３、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １００（ｇｐ１００）、ｇｌｙｐｉｃａｎ－３（ＧＰＣ３）、Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５Ｄ（ＧＰＣＲ５Ｄ）、ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｅｒｂ－Ｂ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ ｄｉｍｅｒｓ、Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｓＡｇ）、Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ａ１（ＨＬＡ－Ａ１）、Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）、ＩＬ－２２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ（ＩＬ－２２Ｒａ）、ＩＬ－１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ２（ＩＬ－１３Ｒａ２）、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＩＣＯＳ）、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦ－１受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ））、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ） αｖβ６、インターフェロン受容体（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＦＮγ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＦＮγＲ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－２Ｒ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－４Ｒ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－５ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－５Ｒ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－６Ｒ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１７ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ（ＩＬ－１７ＲＡ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－３１Ｒ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－３６Ｒ）、ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＤＲ）、Ｌ１ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｌ１－ＣＡＭ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ（ＣＥ７ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ Ｌ１－ＣＡＭ）、Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ８ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３（ＬＡＧ３）、Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ（ＭＡＧＥ）Ａｌ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡｌＯ、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（ＭＳＬＮ）、ｍｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、ｍｕｃｉｎ １（ＭＵＣ１）、ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｇｒｏｕｐ ２ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド（ｌｉｇａｎｄｓ）、ｍｅｌａｎ Ａ（ＭＡＲＴ－ｌ）、ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）、ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＣＡＭ）、ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１（ＮＲＰ－１）、ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－２（ＮＲＰ－２）、癌胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＤ－Ｌ１、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ－βｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＲＯＲ１）、ＳＬＡＭ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ７（ＳＬＡＭＦ７）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰＢＧ；また５Ｔ４として知られている）、ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２（ＴＡＧ７２）、ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＴＲＰ１；またＴＹＲＰ１またはｇｐ７５）、ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＴＲＰ２；またｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ、ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｄｅｌｔａ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅまたはＤＣＴとして知られている）およびウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ １；ＷＴ１）。
【0042】
本発明において、抗体の「フラグメント」とは、抗原結合機能を有している断片を意味し、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ及びナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）断片などを含む意味で使用される。
【0043】
「単鎖（一本鎖）Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために、目的とする構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。
【0044】
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識および結合領域を含む抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが、例えばｓｃＦｖでしっかりと事実上共有結合的に会合した二量体からなる。
【0045】
「Ｆａｂ」フラグメントは、軽鎖の可変および定常ドメインと、重鎖の可変ドメインおよび第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。「Ｆ（ａｂ'）２」抗体断片は、一般に、それらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端付近に共有結合される一対のＦａｂ断片を含む。
【0046】
「ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」は、単量体可変抗体ドメイン（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｍａｉｎ）を含有する断片である。主に単量体重鎖のみで標的特異性を示すラクダ等の抗体ドメインに由来する低分子量の断片から構成される。
【0047】
本発明において、前記抗原結合フラグメントは、抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）であることができる。
【0048】
本発明において、抗原結合ドメインは、好ましくは、抗ＣＤ－１９抗体またはｓｃＦｖを含むことを特徴とすることができ、前記抗ＣＤ－１９抗体のｓｃＦｖは、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【0049】
本発明において、前記キメラ抗原レセプターは、抗原結合ドメインのＮ末端に追加的にシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＳＰ）を含むことができる。本発明において、前記シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α、Ｉｇ－ｋａｐｐａおよびＩｇＧ１重鎖からなる群から選択される分子に由来することができるが、これに限定されるものではなく、好ましくは、ＣＤ８αシグナルペプチドであってもよく、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むことができる。
【0050】
好ましい例示として、本発明によるキメラ抗原受容体は、
配列番号１０で表されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメイン、および配列番号１１で表されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメインと、
配列番号１２で表されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の細胞内ドメインと、
を含むことができる。
配列番号１０で表されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメイン、および配列番号１１で表されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメインと、
配列番号１２で表されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の細胞内ドメインと、
を含むことができる。
【0051】
また、さらに、
配列番号１５で表示されることを特徴とする４－１ＢＢ共刺激ドメインと、
配列番号１３又は配列番号１４で表されることを特徴とするＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内シグナル伝達ドメインと、および／または
配列番号７で表示されることを特徴とするＣＤ８シグナルペプチドを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
配列番号１５で表示されることを特徴とする４－１ＢＢ共刺激ドメインと、
配列番号１３又は配列番号１４で表されることを特徴とするＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内シグナル伝達ドメインと、および／または
配列番号７で表示されることを特徴とするＣＤ８シグナルペプチドを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【0052】
本発明において、たとえば、ＣＤ１９に対する抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体は、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその変異体を含むものであってもよい。
【0053】
本発明は他の態様において、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸に関する。
【0054】
本発明の用語「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸における基本構成単位のヌクレオチドは、天然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基領域が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明のキメラ抗原受容体または各ドメインをコードする核酸の配列を改変することができる。前記改変は、ヌクレオチドの付加、欠失、または非保存的置換もしくは保存的置換を含む。
【0055】
本発明によるキメラ抗原受容体をコードする核酸（ポリヌクレオチド）は、コドン最適化により改変されることができ、これはコドンの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に起因しており、ポリペプチド、又はそれらの変異体断片をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者が十分に理解できるはずである。これらのポリヌクレオチド（核酸）の一部は、任意の天然型遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。特に、コドン使用法の相違により可変的なポリヌクレオチド、例えばヒト、霊長類及び／又は哺乳動物のコドンの選択に最適化されたポリヌクレオチドが好ましい。
【0056】
本発明において、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸は、
配列番号１９で表示されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列と、
配列番号２０で表されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列と、
を含み、
さらに、配列番号２１で表示されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列と、
配列番号２５又は配列番号２６で表されることを特徴とする４－１ＢＢ共刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列と、
配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４で表されることを特徴とするＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列と、および／または
配列番号１６で表されることを特徴とするＣＤ８シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
配列番号１９で表示されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列と、
配列番号２０で表されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列と、
を含み、
さらに、配列番号２１で表示されることを特徴とするＣＤ９９Ｌ２由来の細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列と、
配列番号２５又は配列番号２６で表されることを特徴とする４－１ＢＢ共刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列と、
配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４で表されることを特徴とするＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列と、および／または
配列番号１６で表されることを特徴とするＣＤ８シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【0057】
好ましくは、配列番号１７で表されることを特徴とする抗ＣＤ－１９抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。
【0058】
本発明の一例として、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸は、配列番号５又は配列番号６で表されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する変異体を含むものであってもよい。
【0059】
本発明はまた他の態様において、このような核酸を含む発現ベクター、および前記発現ベクターを含むウイルスに関する。
【0060】
本発明の用語「ベクター」とは、他の核酸分子を転移または輸送することができる核酸分子を意味するものである。転移された核酸は、一般に、ベクター核酸分子と結合されるが、例えば、ベクター核酸分子内に挿入される。ベクターは、細胞での自律複製を指示する配列を含むことができるか、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含むことができる。ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターからなる群から選択されることができるが、これらに限定されるものではない。
【0061】
本発明において、前記核酸または前記ベクターは、ウイルス産生細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）に形質感染又はトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）される。「形質感染」または「トランスフェクション」させるために、原核または真核宿主細胞への外因性核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入するのに通常使用される種々の多様な技術、例えばエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション又はリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などを用いることができる。
【0062】
本発明において、ウイルス産生細胞から産生されたウイルスは、免疫細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）される。細胞内に「形質導入」されたウイルスの核酸は、細胞のゲノムに挿入されるか、あるいは挿入されないままキメラ抗原受容体タンパク質を産生するのに使用される。
【0063】
本発明はまた別の態様において、前記キメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞に関する。
【0064】
本発明において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージであってもよいが、これに限定されるものではなく、好ましくはＴ細胞であることができる。
【0065】
本発明によるキメラ抗原レセプターを発現する免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）又はＣＡＲ－マクロファージ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）であることができる。
【0066】
本発明において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）；ガンマ・デルタＴ細胞；腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）、および末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）から単離したＴ細胞からなる群から選択されることを特徴とする。
【0067】
本発明は、さらに別の態様において、前記キメラ抗原レセプターを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む癌治療用組成物に関する。
【0068】
本発明において、「癌」及び「腫瘍」は、同じ意味で使用され、典型的には調節されない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指す、又は意味する。
【0069】
本発明のＣＡＲで治療し得る癌としては、血管新生された腫瘍のみならず、血管新生されないか、またはまだ実質的に血管新生されていない腫瘍を含む。前記癌は、非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫）を含んでもよく、または固形腫瘍を含むことができる。本発明のＣＡＲで治療することができる癌の類型には、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、及び特定の白血病又はリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫、および黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。成人腫瘍・癌及び小児腫瘍・癌も含まれる。
【0070】
血液癌は、血液または骨髄の癌である。血液癌（又は造血器悪性腫瘍）の例としては、急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病及び骨髄芽細胞性、前リンパ球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性リンパ球（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（遅延型および高い段階の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｅｍ（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ'ｓ ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、重鎖疾患、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病及び骨髄異形成症候群を含めた白血病が挙げられる。
【0071】
固形腫瘍は、一般的に嚢胞または液体部分を含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、それら（例えば、肉腫、癌腫およびリンパ腫）を形成する細胞のタイプについて命名されている。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ）肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、直腸癌、リンパ性悪性腫瘍、大腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、喉頭癌、肝細胞性癌腫、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、髄様甲状腺癌、乳頭状甲状腺癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝腫瘍、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ' ｔｕｍｏｒ）、子宮頚癌、精巣腫瘍、セミノーマ（ｓｅｍｉｎｏｍａ）、膀胱癌、メラノーマ、および中枢神経（ＣＮＳ）系癌（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫および混合性神経膠腫）、膠芽細胞腫（多形性膠芽細胞腫としても知られる）、星状膠腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫（Ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ）、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫（ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）、松果体腫（ｐｉｎｅａｌｏｍａ）、血管芽腫、聴神経腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫及び脳転移）が挙げられる。
【0072】
本発明の治療組成物は、癌の予防または治療のための組成物であって、本発明の用語「予防」は、本発明の組成物の投与により癌を抑制したり進行を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」は、癌進展の抑制、症状の軽減または消失を意味する。
【0073】
本発明によるキメラ抗原レセプターを発現する免疫細胞を含む薬学的組成物には、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。かかる賦形剤は、例えば、界面活性剤、好ましくは、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール等の糖または糖アルコール類；グリシン、ヒスチジン等のアミノ酸やタンパク質またはポリペプチド；酸化防止剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、例えば、浸透剤；及び助剤及び保存剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0074】
本発明の組成物は、ヒトを除いた哺乳動物に投与された後、活性成分の速放、持続放出または徐放を提供できるように当業界に公知の方法を使用して製剤化することができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアゾール、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であってもよい。
【0075】
本発明はさらに他の態様において、前記キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を被験体に投与する段階を含む、癌を治療する方法に関する。
【0076】
また、本発明は、癌治療のための前記免疫細胞の使用に関する。
【0077】
また、本発明は、癌治療用薬剤の製造のための前記免疫細胞の使用に関する。
【0078】
前記被験体は、腫瘍を有する哺乳類であってよく、具体的にはヒトであり得るが、これに限定されるものではない。
【0079】
本発明によるキメラ抗原レセプターを発現する免疫細胞またはそれを含む組成物は、経口投与、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、静脈内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、筋肉内投与（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮下投与（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腹腔内投与（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、直腸内投与（Ｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、局所投与（ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、鼻腔内投与（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）等で投与することができるが、これらに限定されるものではない。
【0080】
活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び重症度等の種々の因子により適宜選択されることができ、本発明による治療用組成物は、癌の症状を予防、改善または治療する効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。
【0081】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0082】
実施例１：材料および方法
【0083】
実施例１－１：マウスおよび細胞株
【0084】
免疫不全ＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。Ｒａｊｉリンパ腫細胞は、ＡＴＣＣ社から購入した。
【0085】
実施例１－２：ＣＡＲ発現用レンチウイルスベクターの作製
【0086】
ＣＤ１９標的ＣＤ８バックボーンＣＡＲ（ｈ１９ＢＢｚ）ＯＲＦ ｃＤＮＡは、既存に公開の配列どおりに（米国公開特許公報ＵＳ２０１３／０２８７７４８Ａ１）ＤＮＡ合成を依頼して作製した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。ＣＤ１９標的ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ ＯＲＦ ｃＤＮＡ（ＦＬ２ＬＢＢｚ、ＦＬ２ＰＢＢｚ）は、ＮＣＢＩデータベースのヒトＣＤ９９Ｌ２ ＯＲＦ配列（ＮＭ＿０３１４６２．４）からＣＤ９９Ｌ２の幾つかの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに細胞内ドメインの配列を抜粋してヒト４１ＢＢの細胞内ドメイン、ヒトＣＤ３ゼータ鎖細胞内ドメイン配列と、コドン最適化およびＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によって連結した後、再び抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ｃｌｏｎｅ ＦＭＣ６３）とＰＣＲによって連結して作製した。ＣＡＲ発現用レンチウイルスベクターは、ｐＣＤＨ－ＥＦ１（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃ ７２２６６）ベクターを一部変形して使用したし、各ＣＡＲ ＯＲＦ ｃＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限酵素領域にクローニングして製作した。各ＣＡＲタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、下記の表１及び表２に記載の通りである。
【0087】
【表1】
【0088】
【表2】
【0089】
前記ＣＡＲタンパク質を構成する各ドメインのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、下記の表３及び表４に記載の通りである。
【0090】
【表3】
【0091】
【表4】
【0092】
実施例１－３：ＣＡＲ発現用レンチウイルスの産生
【0093】
各レンチウイルスプラスミド（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｌａｓｍｉｄ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてパッケージングＤＮＡ３種（ｐＭＤ．２Ｇ、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ－ｒｅｖ）と共に２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ社製）に形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、２４～４８時間の間分泌したレンチウイルスが含まれた培養上清液を回収して濾過し（０．４５μｍフィルター）細胞内に残存する粒子を除去し、超高速遠心分離機を用いて１００倍濃縮した後ＣＡＲ－Ｔ細胞作製のためのレンチウイルス濃縮液として使用した。
【0094】
実施例１－４：ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
【0095】
健常者から白血球アフェレーシス（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）を通じて得られた白血球にＴｒａｎｓＡｃｔ ｒｅａｇｅｎｔ（１０μｌ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を加えた後、ヒトＩＬ－７（１２．５ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）とヒトＩＬ－１５（１２．５ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）とを含む培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）中で２４時間培養してＴ細胞を活性化させた。活性化されたＴ細胞を２回洗浄後、レンチウイルス濃縮液を加え、ヒトＩＬ－７とヒトＩＬ－１５とを含む培地にて２日間培養してレンチウイルス形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）を施した。形質導入されたＴ細胞を、２回洗浄した後、ヒトＩＬ－７とヒトＩＬ－１５とを含む新鮮な培地に移し、９日間２～３日間隔で培地を交換しながら増殖させてＣＡＲ－Ｔ細胞として使用した。細胞表面のＣＡＲタンパク質の発現は、最終的に増殖されたＣＡＲ－Ｔ細胞を、ビオチン標識された抗ＦＭＣ６３抗体（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と、ＰＥ標識されたストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で染色した後、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳ－ＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で測定した。
【0096】
実施例１－５：ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ）の作製
【0097】
ルシフェラーゼを細胞内に人工的に発現させるために、ルシフェラーゼとＧＦＰを同時発現することができるレンチウイルスベクターを作製した。ＥＦ１αプロモーター下でマルチクローニング領域（ｍｕｌｔｉ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）を有するとともに、ＣＭＶプロモーター下で、ＧＦＰがクローニングされている２シストロン性レンチウイルスベクター（ｂｉｓｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）（ｐＬＥＣＥ３）（Ｌｅｅ ＳＨ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０２０；１５（１）：ｅ０２２３８１４）のマルチクローニング領域にｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）から切断して抽出したホタルルシフェラーゼＯＲＦ ｃＤＮＡをクローニングしてｐＬＥＣＥ３－Ｌｕｃベクターを作製した。ｐＬＥＣＥ３－ｌｕｃ ｐｌａｓｍｉｄを３種のレンチウイルスパッケージングプラスミド（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶｒｅｖ、ｐＭＤ．Ｇ）と共にレンチウイルスパッケージング細胞株（２９３ＦＴ ｃｅｌｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔを用いて形質導入し、２４～４８時間後、分泌されたレンチウイルスが含まれた培養上清液を回収して遠心濾過装置を用いて１０倍濃縮した。レンチウイルス濃縮液をＲａｊｉ細胞に加え、ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（６μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）存在下、常温で２５００ｒｐｍ、９０分間遠心分離して形質導入した。形質導入されたＲａｊｉ細胞中のＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ－Ａｒｉａ ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して分離精製して、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞として使用した。
【0098】
実施例１－６：ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺傷能およびＩＦＮ－γ分泌能の測定
【0099】
レンチウイルス形質導入後９日間増殖したＣＡＲ－Ｔ細胞（１．２×１０３～７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００１００μＬ／ｗｅｌｌ）を、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞（３×１０４ｃｅｌｌｓ／５０１００μＬ／ｗｅｌｌ）に様々な割合（０．２～２５：１）で加えて９６ウェルプレートで一晩共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）した後、Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（６００μｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）５０μｌを加えた後、３７℃で１０分間培養し、それまで生存したＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ酵素作用を誘発した。これらの細胞の発光度をルミノメーター（Ｔｅｃａｎ社製）を用いて測定し、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、未処理Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞の発光と比較しての腫瘍細胞の生存率を計算することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺傷能を計測した。
【0100】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化程度を測定するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を同数で（３×１０４ｃｅｌｌｓ）混合して９６ウェルプレートで２４時間共培養した後、培養上清液を回収した。上清液として分泌されたＩＦＮ－γの量をＥＬＩＳＡ法（ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で測定した。
【0101】
実施例１－７：ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化マーカーの分析
【0102】
各ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化程度を比較するために、レンチウイルスの形質導入後９日間増殖したＣＡＲ－Ｔ細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／２００４０μｌ／ウェル）を放射線照射（２０００ｒａｄ）によって増殖を抑制させたＲａｊｉ細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／２００１００μＬ／ｗｅｌｌ）と混合して９６ウェルプレートで３日間共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）した。共培養の間、２４時間ごとに細胞を収穫し、抗ＣＤ６９抗体（ＦＮ５０、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ社製）、抗ＣＤ４４抗体（ＩＭ７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、抗ＣＤ２５抗体（Ｍ－Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４抗体（ＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社製）、抗ＣＤ８抗体（ＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社製）、及び前記抗ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ抗体（Ｙ４５、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で細胞表面を染色してフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳ－ＬＳＲＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で蛍光強度を測定した。
【0103】
実施例１－８：ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ効果の評価
【0104】
免疫不全ＮＳＧマウスに、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞（マウス当たり５×１０５ｃｅｌｌｓ）を静脈注射してから７日後、レンチウイルス形質導入後９日間増殖したＣＡＲ－Ｔ細胞（マウス当たり１×１０６ｃｅｌｌｓ）を静脈内注射した。次に、周期的にＤ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（マウス当たり２ｍｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を腹腔注射した後に生物発光イメージング装置（ＩＶＩＳ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）によって生物発光度を測定することにより腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）の変化を観察した。
【0105】
実施例２：ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞の作製および活性の分析
【0106】
ヒトＣＤ１９標的ＣＤ８バックボーンＣＡＲのＣＤ８細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをＣＤ９９Ｌ２の一部の領域で置換したＣＡＲタンパク質を作製した。ＣＤ９９Ｌ２タンパク質領域としては、ＣＤ９９Ｌ２の幾つかの細胞外ドメインと膜貫通ドメインを用いるか（ＦＬ２ＰＢＢｚ）、これに加えて、細胞内ドメインまで追加した領域を使用するコンストラクト（ＦＬ２ＬＢＢｚ）を作製した（図１Ａ）。これらのＣＤ１９標的ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲのｃＤＮＡを搭載したレンチウイルスを作製した後、ヒト末梢血から単離したＴ細胞に導入してそれぞれのＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。これらのＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲタンパク質の発現率を、フローサイトメトリーにより測定した結果、ＦＬ２ＰＢＢｚに比べてＦＬ２ＬＢＢｚ ＣＡＲタンパク質が顕著に高い発現率を示したが、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞（図１Ｂ、下パネルのＣＤ４陰性Ｔ細胞）の全部で確認された（図１Ｂ）。次いで、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺傷能を確認するために、ヒトＣＤ１９良性リンパ腫細胞である、Ｒａｊｉ細胞との共培養の結果、ＦＬ２ＬＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺傷力が、ＦＬ２ＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞に比して優れていることを確認した（図１Ｃ）。それに合致するように、腫瘍細胞との共培養する際に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化によって分泌されるＩＦＮ－γの量を測定した結果、ＦＬ２ＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べてＦＬ２ＬＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌量が非常に多いことを確認した（図１Ｄ）。したがって、ＦＬ２ＬＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲに選定して、今後の研究を進めている。
【0107】
ＦＬ２ＬＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロでの腫瘍殺傷能とＩＦＮ－γ産生能を、既存のＣＤ８バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈ１９ＢＢｚ）と比較するために、２つのＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した結果、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲに比べてＦＬ２ＬＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞における細胞当たりのＣＡＲ発現率（平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））が若干低いことが確認された（図１Ｅ）。しかし、腫瘍細胞に対する殺傷能は、両ＣＡＲ－Ｔ細胞が類似した程度を示し、ＩＦＮ－γ分泌の場合、ＦＬ２ＬＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞がｈ１９ＢＢｚと比較して一部向上した分泌能を示すことが確認された（図１Ｆ及び図１Ｇ）。したがって、ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞は、既存ＣＤ８バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞と類似するか、一部向上したｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すことが確認された。
【0108】
実施例３：ＣＤ９９Ｌ２ ｂａｃｋｂｏｎｅ ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化マーカーの分析
【0109】
ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍による活性化程度をより詳しく観察するために、Ｔ細胞活性化時に増加される細胞表面活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ２５）の経時的な発現を、フローサイトメトリーにより測定した。
【0110】
その結果、ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞において、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ２５の経時的な発現増加率が、ＣＤ８バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して顕著に高いことが、ＣＤ４ＣＡＲ－Ｔ細胞（図２Ａ）およびＣＤ８ＣＡＲ－Ｔ細胞（図２Ｂ）の両方で確認された。したがって、ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原刺激後の経時的な活性化程度がＣＤ８バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて非常に優れていることが証明された。
【0111】
実施例４：ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果の分析
【0112】
ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ効果を試験するために、免疫不全マウス（ＮＳＧ ｍｉｃｅ）にルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉリンパ腫細胞を静脈内注射した後７日目に同数のＣＤ８バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈内注射して、両ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療の効力を生物発光イメージング（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ）で分析した。
【0113】
その結果、ＣＤ８バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞は、低い効力を示す細胞用量で、ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞の場合は、顕著な腫瘍除去効力を示すことが確認された（図３）。
【0114】
つまり、ＣＤ９９Ｌ２バックボーンＣＡＲ－Ｔ細胞は、既存のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも大幅に向上した活性およびｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効力を示すことが確認されたので、ＣＡＲバックボーン領域に新たな活性化機能性を付与する新概念のＣＡＲコンストラクトの開発を示唆する。
【産業上の利用可能性】
【0115】
本発明では、ＣＤ９９ファミリーに属する細胞膜タンパク質のうち、ＣＤ９９Ｌ２（ＣＤ９９ ａｎｔｉｇｅｎ－ｌｉｋｅ ２）のＴ細胞活性化機能を確認し、ＣＤ９９Ｌ２の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとをバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として含む新しいキメラ抗原受容体を作製した。このようなＣＤ９９Ｌ２ベースＣＡＲ－Ｔ細胞は、既存のバックボーンを有するＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて向上したＴ細胞活性および腫瘍治療効果を示すので、癌治療のための兔疫細胞の治療に有用に用いられることができる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】