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特表2024-532404アヤメ球根由来のエクソソームを有効成分として含有する化粧料組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】アヤメ球根由来のエクソソームを有効成分として含有する化粧料組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 8/9794 20170101AFI20240829BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240829BHJP
A61Q 19/02 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
A61K8/9794
A61Q19/00
A61Q19/02
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513306
(86)(22)【出願日】2022-03-05
(85)【翻訳文提出日】2024-02-22
(86)【国際出願番号】 KR2022003135
(87)【国際公開番号】W WO2023027274
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】10-2021-0114181
(32)【優先日】2021-08-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524070174
【氏名又は名称】ピーピー プロデュイ プレスティージュ エス エー
(71)【出願人】
【識別番号】316017985
【氏名又は名称】シンセゲ インターナショナル インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム、ジーニー
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヨン ソク
(72)【発明者】
【氏名】キム、チュン オ
【テーマコード（参考）】
4C083
【Ｆターム（参考）】
4C083AA082
4C083AA111
4C083AA112
4C083AC012
4C083AC022
4C083AC072
4C083AC112
4C083AC121
4C083AC122
4C083AC342
4C083AC352
4C083AC422
4C083AC442
4C083AC472
4C083AC532
4C083AC642
4C083AC662
4C083AD041
4C083AD051
4C083AD152
4C083AD172
4C083AD492
4C083AD662
4C083CC02
4C083CC05
4C083DD23
4C083DD27
4C083DD31
4C083EE01
4C083EE06
4C083EE07
4C083EE09
4C083EE12
4C083EE16
4C083FF01
(57)【要約】
本発明は、アヤメ球根由来のエクソソームを有効成分として含有する化粧料組成物に関し、具体的には、超高圧前処理と水性二相系を用いて精製されたアヤメ球根エクソソームを有効成分として含有するため安定性に優れており、皮膚に対する保湿、シワ改善及び美白効果に優れた化粧料組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アヤメ球根エクソソームを含有する、化粧料組成物。
【請求項2】
前記アヤメ球根エクソソームは、（Ａ）アヤメ球根を超高圧処理するステップと、
（Ｂ）超高圧処理したアヤメ球根を搾汁するステップと、
（Ｃ）前記アヤメ球根の搾汁液を１，０００ｘｇ～１０，０００ｘｇで遠心分離して上清液を得るステップと、
（Ｄ）エクソソームが存在する前記上清液を凍結乾燥するステップと、
（Ｅ）前記凍結乾燥物にＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）／デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）を用いて水性二相系を形成するステップと、
（Ｆ）前記水性二相系のうちエクソソームが濃縮された下層液を得るステップと、を含む方法によって精製されたことを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項3】
前記超高圧処理は、１５～２５℃の温度で２００～５００Ｍｐａの圧力で２０秒～２分間行うことを特徴とする、請求項２に記載の化粧料組成物。
【請求項4】
アヤメ球根エクソソームは、組成物の総重量に対して０．０００１～３０．０％（ｗ／ｗ）で含有されることを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項5】
前記化粧料組成物は、アヤメ球根エクソソームの性状安定性を高めるために、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体又はそれらの誘導体、ブチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンからなる群より選択される少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項6】
前記化粧料組成物は、皮膚保湿用であることを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項7】
前記化粧料組成物は、皮膚シワ改善用であることを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項8】
前記化粧料組成物は、皮膚美白用であることを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アヤメ球根由来のエクソソームを有効成分として含有する化粧料組成物に関し、具体的には超高圧前処理と水性二相系を用いて精製されたアヤメ球根エクソソームを有効成分として含有するため安定性に優れており、皮膚に対する保湿、シワの改善及び美白効果に優れた化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
本発明において、「エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）」とは、多様な細胞から分泌される膜構造の小さな小胞を意味し、細胞外小胞体（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）の一種として定義される。すべての細胞は、他の細胞又は外部環境と情報を交換し、このために細胞外小胞体を分泌する。エクソソームは、５０～２００ｎｍ程度のサイズを有し、タンパク質、脂質、核酸などの生理活性物質を含む。エクソソームは、哺乳類、バクテリア、植物などの多様な細胞に存在し、起源細胞の状態を反映しているため、診断及び治療に活用することができる。エクソソームは、二重リン脂質膜構造体であり、細胞内への浸透が容易であり、免疫反応、信号伝逹のような多様な生理的、病理的機能を行う。
【0003】
最近では、植物由来のエクソソームの多様な効果に関する研究が行われており、その抗酸化、抗炎などの皮膚への効果に対しても研究が始まっている。植物由来のエクソソームは、植物細胞自体が分泌する生理活性及び信号伝達物質を含んでおり、細胞間の移動と吸収に寄与する天然ナノ粒子であり、植物から精製されたエクソソームは、哺乳類由来のエクソソームに比べて毒性が低いと知られている。
【0004】
これに関して、大韓民国登録特許第１０－２１２５５６７号には、遠心分離と接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ－ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）を用いて、原料植物から高純度の植物エクソソームを抽出する方法が開示されており、大韓民国公開特許第１０－２０２０－０１２１０６２号には、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、高純度及び高品質の細胞外小胞体を精製する方法が開示されており、大韓民国公開特許第１０－２０１９－００５０２８６号には、ヒアルロン酸ベースのフィラー組成物にエクソソームを含有させることでエクソソームの安定性を高めたフィラー組成物が開示されている。
【0005】
このようなエクソソームは、その多様な利点及び活性により、医薬品、化粧品、食品などの分野で活用可能な素材であるが、リン脂質二重膜から構成されている構造的な特徴により、分散力が低く、凝集しようとする性質がある。また、高温で不安定であり、化粧品製剤を製造する過程で壊れやすく、このような性質により、製剤中のエクソソームの安定性が低下し、沈澱が発生する可能性がある。したがって、継続的に活性を維持するためには、水溶液中のエクソソームの溶解度及び分散性を高め、製剤中の安定性を高める必要がある。
【0006】
本発明者らは、水性二相系を用いて多様な植物由来のエクソソームを分離精製し、皮膚効果に優れた植物由来のエクソソームを化粧料として利用するための研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、アヤメ球根由来のエクソソームを有効成分として含有するため安定性に優れており、皮膚に対する保湿、シワの改善及び美白効果に優れた化粧料組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記目的を達成するために本発明によると、アヤメ球根エクソソームを含有する化粧料組成物が提供される。
【0009】
好ましくは、前記アヤメ球根エクソソームは、（Ａ）アヤメ球根を超高圧処理するステップと、（Ｂ）超高圧処理したアヤメ球根を搾汁するステップと、（Ｃ）前記アヤメ球根の搾汁液を１，０００ｘｇ～１０，０００ｘｇで遠心分離して上清液を得るステップと、（Ｄ）エクソソームが存在する前記上清液を凍結乾燥するステップと、（Ｅ）前記凍結乾燥物にＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）／デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）を用いて水性二相系を形成するステップと、（Ｆ）前記水性二相系のうちエクソソームが濃縮された下層液を得るステップと、を含む方法によって精製されたものである。
【0010】
前記超高圧処理は、１５～２５℃の温度で２００～５００Ｍｐａの圧力で２０秒～２分間行うことを特徴とする。
【0011】
有効成分としての前記アヤメ球根エクソソームは、組成物の総重量に対して０．０００１～３０．０％（ｗ／ｗ）で含有される。
【0012】
前記化粧料組成物は、アヤメ球根エクソソームの性状安定性を高めるために、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、又はそれらの誘導体、ブチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンからなる群より選択される少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする。
【0013】
前記化粧料組成物は、皮膚保湿用、皮膚シワ改善用又は皮膚美白用であることを特徴とする。
【発明の効果】
【0014】
超高圧前処理と水性二相系を用いて精製された本発明のアヤメ球根由来のエクソソームは、安定性に優れており、皮膚に対する優れた保湿効果とシワの改善及び美白効果を発揮するため、アンチエイジング化粧料として有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本発明の一実施例によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームのＴＥＭイメージ。
【図2】本発明の一実施例によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソーム粒子のサイズ分布と粒子数を確認するためのＮＴＡ分析結果を示したグラフ。
【図3】超高圧前処理を行わずに精製されたアヤメ球根由来のエクソソーム粒子のサイズ分布と粒子数を確認するためのＮＴＡ分析結果を示したグラフ。
【図4】本発明によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの細胞毒性をＭＴＴアッセイで評価した結果を示したグラフ。
【図5】本発明によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの保湿効果をＡＱＰ３発現に基づいて評価した結果を示したグラフ。
【図6】本発明によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの皮膚に対するシワ改善効果をＭＭＰ－１発現に基づいて評価した結果を示したグラフ。
【図7】本発明によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの皮膚に対するシワ改善効果をＣＯＬ１Ａ１発現に基づいて評価した結果を示したグラフ。
【図8】本発明によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの美白効果をチロシナーゼ活性抑制率で評価した結果を示したグラフ。
【図9】本発明によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの美白効果をメラニン生成抑制率で評価した結果を示したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明についてさらに具体的に説明する。
【0017】
植物由来のエクソソームは、植物細胞自体が分泌する生理活性及び信号伝達物質を含有しており、哺乳類由来のエクソソームに比べて毒性が低いと知られている。このような利点によって、医薬品、化粧品、食品などの分野で活用可能な素材であるが、リン脂質二重膜から構成されている構造的な特徴により、分散力が低く、凝集しようとする性質があるため、製剤中でその活性を継続的に維持しにくいという問題がある。本発明は、アヤメ球根からエクソソームを高純度で分離精製し、これを化粧料として利用することを技術的特徴とする。
【0018】
アヤメは、アヤメ科アヤメ属に属する多年草である。アヤメは、球根に消化促進作用や抗炎症作用があるため、消化不良、痔疾、打ち身、皮膚病、咽喉炎、扁桃炎などの治療薬として用いられている。アヤメ球根には、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ）、ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ）などの脂肪酸が多く含有されている。その一種であるドイツアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）は、ヨーロッパ原産の多年草で、乾燥した場所に植えて育てる単子葉植物のユリ目アヤメ科の多年草である。寒さに非常に強く、露地越冬が可能であり、アヤメ類の中で最も大きな花が花茎の先に多く咲く。地下茎が太いので球根植物としても取り扱われる。ドイツアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）の球根には、イリゾロン（ｉｒｉｓｏｌｏｎｅ）やイリゲニン（ｉｒｉｇｅｎｉｎ）などのイソフラボンが含有されている。
【0019】
本発明のアヤメ球根エクソソームは、以下のような方法によって精製される。
【0020】
（Ａ）アヤメ球根を超高圧処理するステップと、（Ｂ）超高圧処理したアヤメ球根を搾汁するステップと、（Ｃ）前記アヤメ球根の搾汁液を１，０００ｘｇ～１０，０００ｘｇで遠心分離して上清液を得るステップと、（Ｄ）エクソソームが存在する前記上清液を凍結乾燥するステップと、（Ｅ）前記凍結乾燥物にＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）／デキストランを用いて水性二相系を形成するステップと、（Ｆ）前記水性二相系のうちエクソソームが濃縮された下層液を得るステップと、を含む方法によって精製される。
【0021】
前記ステップ（Ａ）において、アヤメ球根は、生物又は乾燥物の両方を用いることができ、超高圧処理は、１５～２５℃の温度で２００Ｍｐａ以上の圧力で、好ましくは、２００～５００Ｍｐａの圧力で２０秒～２分間行うことを特徴とする。エクソソームは、生理活性物質でその処理温度を１５℃～２５℃にすることが好ましい。
【0022】
本発明の一具体例によると、前記超高圧処理は、アヤメ球根乾燥物をビニールパックに蒸留水と共に入れ、空気が入らないようにしっかり密封した後、超高圧機を用いて１５～２５℃の温度で２００Ｍｐａ以上の圧力で２０秒～２分間超高圧処理を行う。アヤメ球根の生物を用いる場合には、蒸留水を用いることなくビニールパックに入れて行うことができる。
【0023】
前記ステップ（Ｂ）において、アヤメ球根を搾汁する工程で用いられるスクリューは、攪拌速度２０～５０ｒｐｍのものを用いることが好ましい。超高圧処理による植物細胞壁の透過率の変化により汁が抜けやすくなるため、一定速度以下の攪拌速度を有するスクリューを用いた方が好ましい。
【0024】
前記ステップ（Ｃ）で用いられる遠心分離法は、サイズ、形状、密度、粘性、ローター速度に応じる遠心力を用いて溶液の粒子を分離する方法を意味する。ｒｐｍを順に調節して大きな汚染物質を除去する必要があり、最終的に水性二相系を形成するための溶液を得るためには１０，０００ｘｇで行うことがさらに好ましい。
【0025】
前記ステップ（Ｄ）で用いられる凍結乾燥は、容器の温度を急激に下げて乾燥させようとする物質を凍結させた後、容器内部の圧力を真空に近づけることにより、材料に含まれた固化した溶媒を直ちに水蒸気に昇華させて乾燥する方法である。－５０～－８０℃で１５～２４時間凍結し、凍結乾燥機により真空状態で７２～１２０時間乾燥する。このとき、真空状態とは通常、凍結乾燥機の圧力状態を意味する。
【0026】
エクソソームを効率的に分離精製するために、本発明では、互いに溶解しにくい２種類の水溶液から２層を作成し、各層に対する親和性差を用いた分離法の１つである水性二相分配法（ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ ｐｈａｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いた。
【0027】
水性二相系を形成する方法としては、一般にＰＥＧ／塩（塩としては、硫酸塩（ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、クエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）など）を用いてもよいが、本発明の目的を達成するためには、ＰＥＧ／デキストランを用いることが好ましい。デキストランは、バクテリア作用によって得られた天然高分子であり、化粧品製剤において増粘剤、結合剤、増量剤として用いる。
【0028】
前記ステップ（Ｅ）において、水性二相系の形成時にＰＥＧ分子量が１０，０００～３５，０００のものを１～１５重量％、好ましくは２～５重量％で用い、デキストランは、分子量が３００，０００～６５０，０００のものを１～８重量％、好ましくは１～３重量％で用いることを特徴とする。前記ＰＥＧとデキストランが３．３重量％：１．７重量％の濃度比で用いられる場合にエクソソームの収率が最も高く、安定性に最も優れるためさらに好ましい。
【0029】
エクソソームの純度を高めるために、前記ステップ（Ｆ）の後に、同じ濃度の水性二相系溶液を用いて水性二相系を形成し、下層液を得る過程を２～３回行う工程をさらに行うことができる。
【0030】
このような方法によって製造されたアヤメ球根由来のエクソソームは、アヤメ球根抽出物と比較して、優れた保湿効果（試験例４）、シワ改善効果（試験例５、試験例６、試験例９）、美白効果（試験例７、試験例８）を示した。また、前記アヤメ球根由来のエクソソームは、製剤中で優れた安定性を示した（試験例９、１０）。
【0031】
したがって、前記アヤメ球根由来のエクソソームは、保湿用、シワ改善用又は美白用化粧料組成物に用いることができる。このとき、前記有効成分としてのアヤメ球根由来のエクソソームは、化粧料組成物の全重量に対して０．０００１～３０．０％（ｗ／ｗ）で含有されてもよい。
【0032】
好ましくは、前記化粧料組成物は、アヤメ球根エクソソームの性状安定性を高めるために、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体又はそれらの誘導体、ブチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンからなる群より選択される少なくとも１つを、さらに好ましくは、グリセリン、ブチレングリコール及び１，３－プロピレングリコールからなる群より選択される少なくとも１つを、最も好ましくは、ブチレングリコール及び１，３－プロピレングリコールをさらに含むことを特徴とする。
【0033】
一般に、エクソソームは、リン脂質二重膜から構成されている構造的な特徴から分散力が低く凝集しようとする性質があるため、製剤内でその活性を継続的に維持しにくいという問題がある。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体又はそれらの誘導体、ブチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンからなる群より選択される、アルコール基を含む化合物を併用する場合、アヤメ球根エクソソームの安定性がさらに良好であった。
【0034】
前記化粧料組成物は、通常製造されているいずれの製剤でもよく、例えば、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、パック、せっけん、シャンプー、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、乳液、プレスパウダー、ルースパウダーなどに製造することができる。
【0035】
一方、前記の化粧料組成物から製造される場合、本発明の効果を損傷しない範囲内で、通常の化粧品に用いられる成分、例えば、保湿剤、酸化防止剤、界面活性剤、アルコール類、増粘剤、水性成分、水、乳化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤などを必要に応じて当業者が困難なく適宜選択して配合することができる。
【実施例】
【0036】
以下、本発明を下記の実施例及び試験例に基づいてさらに詳しく説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明が下記実施例によって限定されるものでなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で置換及び均等な他の実施例に変更できることは、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者には明らかであろう。
【0037】
実施例１：アヤメ球根由来のエクソソームの製造
アヤメ球根の超高圧処理
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根乾燥物１００ｇをビニールパックに蒸留水と共に入れ、空気が入らないようにしっかり密封した後、超高圧機を用いて２５℃の温度で２００Ｍｐａの圧力で３０秒間超高圧処理を行った。
アヤメ球根の超高圧処理
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根乾燥物１００ｇをビニールパックに蒸留水と共に入れ、空気が入らないようにしっかり密封した後、超高圧機を用いて２５℃の温度で２００Ｍｐａの圧力で３０秒間超高圧処理を行った。
【0038】
アヤメ球根の搾汁
超高圧処理したアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根を一般の搾汁機を用いて３０ｒｐｍの低速スクリューでアヤメ球根を搾汁し、得られたアヤメ球根の搾汁液はメッシュ網に濾過して浮遊物を除去した。回収したアヤメ球根の搾汁液は、精製を開始する前まで－８０℃で保管した。
超高圧処理したアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根を一般の搾汁機を用いて３０ｒｐｍの低速スクリューでアヤメ球根を搾汁し、得られたアヤメ球根の搾汁液はメッシュ網に濾過して浮遊物を除去した。回収したアヤメ球根の搾汁液は、精製を開始する前まで－８０℃で保管した。
【0039】
エクソソームを精製するための上清液の回収
アヤメ球根の搾汁液は、エクソソームを精製するためには大きな汚染物質を除去する必要があるため、１０，０００ｘｇで１０分間４℃で遠心分離を行った。遠心分離後に水性二相系を形成するために上清液を回収した。
アヤメ球根の搾汁液は、エクソソームを精製するためには大きな汚染物質を除去する必要があるため、１０，０００ｘｇで１０分間４℃で遠心分離を行った。遠心分離後に水性二相系を形成するために上清液を回収した。
【0040】
上清液の凍結乾燥
エクソソームの大量生産のために、上清液の体積を減らす目的で凍結乾燥を行った。－８０℃で２０時間凍結し、凍結乾燥機により真空状態で１００時間乾燥した。このとき、真空状態とは通常、凍結乾燥機の圧力状態を意味し、凍結及び乾燥時間は溶液の体積によって異なる。
エクソソームの大量生産のために、上清液の体積を減らす目的で凍結乾燥を行った。－８０℃で２０時間凍結し、凍結乾燥機により真空状態で１００時間乾燥した。このとき、真空状態とは通常、凍結乾燥機の圧力状態を意味し、凍結及び乾燥時間は溶液の体積によって異なる。
【0041】
水性二相系の形成
凍結乾燥した上清液に精製水を加え、ＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）／デキストランを用いて水性二相系を形成した。ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈより購入）は、分子量１０，０００～３５，０００のものを３．３重量％で用い、デキストラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈより購入）は、分子量３００，０００～６５０，０００のものを１．７重量％で用いて水性二相系を形成した。
凍結乾燥した上清液に精製水を加え、ＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）／デキストランを用いて水性二相系を形成した。ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈより購入）は、分子量１０，０００～３５，０００のものを３．３重量％で用い、デキストラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈより購入）は、分子量３００，０００～６５０，０００のものを１．７重量％で用いて水性二相系を形成した。
【0042】
アヤメ球根由来のエクソソームの回収
上清液とＰＥＧ／デキストラン溶液を混合した後、１，０００ｘｇで１０分間４℃で遠心分離を行った。遠心分離後に上清液を除去し、エクソソームを回収した。
上清液とＰＥＧ／デキストラン溶液を混合した後、１，０００ｘｇで１０分間４℃で遠心分離を行った。遠心分離後に上清液を除去し、エクソソームを回収した。
【0043】
追加の洗浄工程
純度を高めるために、回収した下層液に同じ濃度の前記水性二相系溶液を加えて追加の洗浄工程を行った。処理を３回繰り返した後、最終的にエクソソームが濃縮された下層液を回収した。
純度を高めるために、回収した下層液に同じ濃度の前記水性二相系溶液を加えて追加の洗浄工程を行った。処理を３回繰り返した後、最終的にエクソソームが濃縮された下層液を回収した。
【0044】
比較例１：超高圧処理を行っていないアヤメ球根由来のエクソソームの精製
超高圧処理を行っていないことを除いては、上記実施例１と同様にしてアヤメ球根由来のエクソソームを精製した。
超高圧処理を行っていないことを除いては、上記実施例１と同様にしてアヤメ球根由来のエクソソームを精製した。
【0045】
比較例２：アヤメ球根熱水抽出物の製造
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根乾燥物２０ｇを精製水８００ｇに入れ、８０℃で３時間抽出した。抽出後に減圧濾過を行ってアヤメ球根熱水抽出物を得た後、回転蒸発濃縮機を用いて蒸留して粉末状のサンプルを得た。
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根乾燥物２０ｇを精製水８００ｇに入れ、８０℃で３時間抽出した。抽出後に減圧濾過を行ってアヤメ球根熱水抽出物を得た後、回転蒸発濃縮機を用いて蒸留して粉末状のサンプルを得た。
【0046】
比較例３：アヤメ球根メタノール抽出物の製造
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根乾燥物２０ｇをメタノール８００ｇに入れ、６０℃で３時間抽出した。抽出後に減圧濾過を行ってアヤメ球根メタノール抽出物を得た後、回転蒸発濃縮機を用いて蒸留して粉末状のサンプルを得た。
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根乾燥物２０ｇをメタノール８００ｇに入れ、６０℃で３時間抽出した。抽出後に減圧濾過を行ってアヤメ球根メタノール抽出物を得た後、回転蒸発濃縮機を用いて蒸留して粉末状のサンプルを得た。
【0047】
比較例４：アヤメ球根エタノール抽出物の製造
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根乾燥物２０ｇをエタノール８００ｇに入れ、６０℃で３時間抽出した。抽出後に減圧濾過を行ってアヤメ球根エタノール抽出物を得た後、回転蒸発濃縮機を用いて蒸留して粉末状のサンプルを得た。
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根乾燥物２０ｇをエタノール８００ｇに入れ、６０℃で３時間抽出した。抽出後に減圧濾過を行ってアヤメ球根エタノール抽出物を得た後、回転蒸発濃縮機を用いて蒸留して粉末状のサンプルを得た。
【0048】
比較例５：アヤメ球根ヘキサン抽出物の製造
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根乾燥物２０ｇをヘキサン８００ｇに入れ、６０℃で３時間抽出した。抽出後に減圧濾過を行ってアヤメ球根ヘキサン抽出物を得た後、回転蒸発濃縮機を用いて蒸留して粉末状のサンプルを得た。下記表１は、各溶媒による抽出収率を示す。
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根乾燥物２０ｇをヘキサン８００ｇに入れ、６０℃で３時間抽出した。抽出後に減圧濾過を行ってアヤメ球根ヘキサン抽出物を得た後、回転蒸発濃縮機を用いて蒸留して粉末状のサンプルを得た。下記表１は、各溶媒による抽出収率を示す。
【0049】
【表1】
【0050】
試験例１：アヤメ球根由来のエクソソームの特性に対する分析：ＴＥＭ分析
精製したアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの形状を確認するために透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で分析した。図１は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームのＴＥＭ分析イメージである。分析の結果、球状のリン脂質二重膜構造からなる約１６０．７ｎｍの粒子の存在が確認された。
精製したアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの形状を確認するために透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で分析した。図１は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームのＴＥＭ分析イメージである。分析の結果、球状のリン脂質二重膜構造からなる約１６０．７ｎｍの粒子の存在が確認された。
【0051】
試験例２：アヤメ球根由来のエクソソームの特性に対する分析：ＮＴＡ分析
精製したアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの粒径分布と単位体積当たりの粒子数を確認するために、ナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＮＴＡ）で分析した。超高圧処理の有無によるエクソソームの粒子数を比較するために、比較例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームのＮＴＡ分析も行った。図２は、上記実施例１によって精製されたアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームのＮＴＡ分析結果を示したグラフであり、分析の結果、平均粒径は１６０．７ｎｍで単位体積１ｍＬ当たりに９．９０×１０９個の濃度が確認された。図３は、上記比較例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームのＮＴＡ分析結果を示したグラフであり、平均粒径は１７２．１ｎｍで単位体積１ｍＬ当たりに１．６１×１０９個の濃度が確認された。実施例１と比較例１は同量で実験を行い、収率を比較してみると、超高圧処理を行った場合（実施例１）にさらに多くの量のエクソソームを抽出できることが確認された。
精製したアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの粒径分布と単位体積当たりの粒子数を確認するために、ナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＮＴＡ）で分析した。超高圧処理の有無によるエクソソームの粒子数を比較するために、比較例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームのＮＴＡ分析も行った。図２は、上記実施例１によって精製されたアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームのＮＴＡ分析結果を示したグラフであり、分析の結果、平均粒径は１６０．７ｎｍで単位体積１ｍＬ当たりに９．９０×１０９個の濃度が確認された。図３は、上記比較例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームのＮＴＡ分析結果を示したグラフであり、平均粒径は１７２．１ｎｍで単位体積１ｍＬ当たりに１．６１×１０９個の濃度が確認された。実施例１と比較例１は同量で実験を行い、収率を比較してみると、超高圧処理を行った場合（実施例１）にさらに多くの量のエクソソームを抽出できることが確認された。
【0052】
試験例３：アヤメ球根由来のエクソソームの細胞毒性に対する評価
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソーム（実施例１）と溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物（比較例２、比較例３、比較例４）の細胞毒性を確認するために、ＭＴＴアッセイ評価を行った。９６ウェルプレートにヒト線維芽細胞細胞株（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦａ）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種した後、３７℃で１８時間の間、５％ＣＯ２下で培養した。培養後に培地を除去し、ＰＢＳバッファーで洗浄した後、新しい培地とアヤメ球根由来のエクソソーム（ストック（Ｓｔｏｃｋ）濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）及び溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を濃度ごとに投与し、また４８時間培養した。細胞の生存率を測定するために、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を添加した後、４時間の間で形成されたホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。図４は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの細胞毒性をＭＴＴアッセイで評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソーム９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬの濃度のストックを０．１％以下で処理した場合には細胞毒性が見られず、１％以上処理した場合には細胞生存率が約９０％と確認された。
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソーム（実施例１）と溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物（比較例２、比較例３、比較例４）の細胞毒性を確認するために、ＭＴＴアッセイ評価を行った。９６ウェルプレートにヒト線維芽細胞細胞株（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦａ）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種した後、３７℃で１８時間の間、５％ＣＯ２下で培養した。培養後に培地を除去し、ＰＢＳバッファーで洗浄した後、新しい培地とアヤメ球根由来のエクソソーム（ストック（Ｓｔｏｃｋ）濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）及び溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を濃度ごとに投与し、また４８時間培養した。細胞の生存率を測定するために、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を添加した後、４時間の間で形成されたホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。図４は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの細胞毒性をＭＴＴアッセイで評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソーム９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬの濃度のストックを０．１％以下で処理した場合には細胞毒性が見られず、１％以上処理した場合には細胞生存率が約９０％と確認された。
【0053】
試験例４：アヤメ球根由来のエクソソームの保湿効果に対する評価（ＡＱＰ３発現）
アヤメ球根由来のエクソソームの保湿効果を確認するために、溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物と比較してＡＱＰ３発現に与える影響を確認した。ヒト表皮角化細胞株（ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨＥＫａ）を接種した後、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）培養培地で、３７℃で２４時間の間、５％ＣＯ２下で培養した。培養後に培地を廃棄し、アヤメ球根由来のエクソソーム（ストック濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）及び溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を処理して４８時間培養した。その後、培養された細胞をＴｒａｎｓＺｏｌ試薬を用いてＲＮＡを抽出した後、ＲＴ－ＰＣＲ（リアルタイム遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより、細胞の水分移動に関与する保湿因子として皮膚保湿に重要な役割をするタンパク質であるＡＱＰ３（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ ３）のｍＲＮＡ変化量を測定した。ＰＣＲによって生成された産物は、１％アガロースゲルで電気泳動してゲル画像解析システム（Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）で確認した。このとき、陰性対照群としてはＰＢＳを処理し、陽性対照群としてはヒアルロン酸０．０１％を処理した。図５は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの保湿効果をＡＱＰ３発現に基づいて評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソームとアヤメ球根抽出物を処理したときに濃度依存的にＡＱＰ３のｍＲＮＡ発現が増加し、アヤメ球根由来のエクソソームを処理したときに発現がさらに増加したことが確認された。この場合、陽性対照群であるヒアルロン酸０．０１％を処理したときには１５５．６９％の発現率を示した。
アヤメ球根由来のエクソソームの保湿効果を確認するために、溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物と比較してＡＱＰ３発現に与える影響を確認した。ヒト表皮角化細胞株（ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨＥＫａ）を接種した後、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）培養培地で、３７℃で２４時間の間、５％ＣＯ２下で培養した。培養後に培地を廃棄し、アヤメ球根由来のエクソソーム（ストック濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）及び溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を処理して４８時間培養した。その後、培養された細胞をＴｒａｎｓＺｏｌ試薬を用いてＲＮＡを抽出した後、ＲＴ－ＰＣＲ（リアルタイム遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより、細胞の水分移動に関与する保湿因子として皮膚保湿に重要な役割をするタンパク質であるＡＱＰ３（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ ３）のｍＲＮＡ変化量を測定した。ＰＣＲによって生成された産物は、１％アガロースゲルで電気泳動してゲル画像解析システム（Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）で確認した。このとき、陰性対照群としてはＰＢＳを処理し、陽性対照群としてはヒアルロン酸０．０１％を処理した。図５は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの保湿効果をＡＱＰ３発現に基づいて評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソームとアヤメ球根抽出物を処理したときに濃度依存的にＡＱＰ３のｍＲＮＡ発現が増加し、アヤメ球根由来のエクソソームを処理したときに発現がさらに増加したことが確認された。この場合、陽性対照群であるヒアルロン酸０．０１％を処理したときには１５５．６９％の発現率を示した。
【0054】
試験例５：アヤメ球根由来のエクソソームのシワ改善効果に対する評価（ＭＭＰ－１発現）
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの老化防止効果を確認するために、溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物と比較してＭＭＰ－１発現に与える影響を確認した。ヒト線維芽細胞細胞株（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦａ）を接種した後、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加した線維芽細胞基本培地（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｍｅｄｉｕｍ １０６）培養培地で、３７℃で２４時間の間、５％ＣＯ２下で培養した。培養後に培地を廃棄し、アヤメ球根由来のエクソソーム（ストック濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）及び溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を処理して４８時間培養した。細胞損傷を誘導するために、ＵＶＢ非照射群を除いた残りの培養された細胞群に、培地を除去した後にＵＶＢを２０ｍＪ／ｃｍ２照射し、新しい培地に交換した後に２４時間培養した。２４時間後、ＴｒａｎｓＺｏｌ試薬を用いてＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ（リアルタイム遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより、皮膚老化及びシワの生成と関連するＭＭＰ－１のｍＲＮＡ変化量を測定した。ＰＣＲによって生成された産物は、１％アガロースゲルで電気泳動してゲル画像解析システムにより確認した。このとき、陰性対照群としてはＰＢＳを処理し、陽性対照群としてはパルミチン酸レチニル５０μＭを処理した。図６は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの老化防止効果をＭＭＰ－１発現に基づいて評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソームと溶媒ごとのアヤメ球根抽出物を処理したときに、濃度依存的にＭＭＰ－１発現が減少し、アヤメ球根由来のエクソソームを処理したときに、遥かに高い減少率が確認された。この場合、陽性対照群であるパルミチン酸レチニルを５０μＭ処理したときに７２．８１％の発現率を示した。
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの老化防止効果を確認するために、溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物と比較してＭＭＰ－１発現に与える影響を確認した。ヒト線維芽細胞細胞株（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦａ）を接種した後、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加した線維芽細胞基本培地（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｍｅｄｉｕｍ １０６）培養培地で、３７℃で２４時間の間、５％ＣＯ２下で培養した。培養後に培地を廃棄し、アヤメ球根由来のエクソソーム（ストック濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）及び溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を処理して４８時間培養した。細胞損傷を誘導するために、ＵＶＢ非照射群を除いた残りの培養された細胞群に、培地を除去した後にＵＶＢを２０ｍＪ／ｃｍ２照射し、新しい培地に交換した後に２４時間培養した。２４時間後、ＴｒａｎｓＺｏｌ試薬を用いてＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ（リアルタイム遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより、皮膚老化及びシワの生成と関連するＭＭＰ－１のｍＲＮＡ変化量を測定した。ＰＣＲによって生成された産物は、１％アガロースゲルで電気泳動してゲル画像解析システムにより確認した。このとき、陰性対照群としてはＰＢＳを処理し、陽性対照群としてはパルミチン酸レチニル５０μＭを処理した。図６は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの老化防止効果をＭＭＰ－１発現に基づいて評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソームと溶媒ごとのアヤメ球根抽出物を処理したときに、濃度依存的にＭＭＰ－１発現が減少し、アヤメ球根由来のエクソソームを処理したときに、遥かに高い減少率が確認された。この場合、陽性対照群であるパルミチン酸レチニルを５０μＭ処理したときに７２．８１％の発現率を示した。
【0055】
試験例６：アヤメ球根由来のエクソソームのシワ改善効果に対する評価（ＣＯＬ１Ａ１発現）
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの老化防止効果を確認するために、溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物と比較してＣＯＬ１Ａ１発現に与える影響を確認した。ヒト線維芽細胞細胞株（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦａ）を接種した後、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加した線維芽細胞基本培地（Ｍｅｄｉｕｍ １０６）培養培地で、３７℃で２４時間の間、５％ＣＯ２下で培養した。培養後に培地を廃棄し、アヤメ球根由来のエクソソーム（ストック濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）及び溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を処理して４８時間培養した。培養後にＴｒａｎｓＺｏｌ試薬を用いてＲＮＡを抽出した後、ＲＴ－ＰＣＲ（リアルタイム遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応）を行って皮膚連結組織を維持させるコラーゲンのｍＲＮＡ変化量を測定した。ＰＣＲによって生成された産物は、１％アガロースゲルで電気泳動してゲル画像解析システムにより確認した。このとき、陰性対照群としてはＰＢＳを処理し、陽性対照群としてはパルミチン酸レチニルを５０μＭ処理した。図７は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの老化防止効果をＣＯＬ１Ａ１発現に基づいて評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソームとアヤメ球根抽出物を処理したときに濃度依存的にＣＯＬ１Ａ１の発現が増加し、アヤメ球根由来のエクソソームを処理したときに発現がさらに増加することが確認された。この場合、陽性対照群であるパルミチン酸レチニルを５０μＭ処理したときには１７３．９３％の発現率を示した。
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの老化防止効果を確認するために、溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物と比較してＣＯＬ１Ａ１発現に与える影響を確認した。ヒト線維芽細胞細胞株（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦａ）を接種した後、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加した線維芽細胞基本培地（Ｍｅｄｉｕｍ １０６）培養培地で、３７℃で２４時間の間、５％ＣＯ２下で培養した。培養後に培地を廃棄し、アヤメ球根由来のエクソソーム（ストック濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）及び溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を処理して４８時間培養した。培養後にＴｒａｎｓＺｏｌ試薬を用いてＲＮＡを抽出した後、ＲＴ－ＰＣＲ（リアルタイム遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応）を行って皮膚連結組織を維持させるコラーゲンのｍＲＮＡ変化量を測定した。ＰＣＲによって生成された産物は、１％アガロースゲルで電気泳動してゲル画像解析システムにより確認した。このとき、陰性対照群としてはＰＢＳを処理し、陽性対照群としてはパルミチン酸レチニルを５０μＭ処理した。図７は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの老化防止効果をＣＯＬ１Ａ１発現に基づいて評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソームとアヤメ球根抽出物を処理したときに濃度依存的にＣＯＬ１Ａ１の発現が増加し、アヤメ球根由来のエクソソームを処理したときに発現がさらに増加することが確認された。この場合、陽性対照群であるパルミチン酸レチニルを５０μＭ処理したときには１７３．９３％の発現率を示した。
【0056】
試験例７：アヤメ球根由来のエクソソームの美白効果に対する評価（チロシナーゼ活性抑制）
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの美白効果を確認するために、溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物と比較してチロシナーゼ活性抑制試験を行った。キノコ由来のチロシナーゼとチロシンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌより購入して用い、チロシナーゼ活性は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）１５０μｌとキノコチロシナーゼ（２１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ ６．５）８μｌ、１．５ｍＭ濃度のＬ－チロシン３６μｌと共に、アヤメ球根由来のエクソソーム（ストック濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）と溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を濃度ごとに処理した。チロシナーゼ抑制活性は、試料を３７℃で１５分間反応させた後、４９０ｎｍで吸光度を測定して確認した。このとき、陰性対照群としてはＰＢＳを処理し、美白剤として知られている合成物質であるアルブチンを標準試料として用い、結果は％に換算した。図８は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの美白効果をチロシナーゼ活性抑制率で評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソームとアヤメ球根抽出物を処理したときに濃度依存的にチロシナーゼ活性抑制率が増加し、アヤメ球根由来のエクソソームを処理したときにさらに高い抑制率が確認された。
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの美白効果を確認するために、溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物と比較してチロシナーゼ活性抑制試験を行った。キノコ由来のチロシナーゼとチロシンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌより購入して用い、チロシナーゼ活性は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）１５０μｌとキノコチロシナーゼ（２１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ ６．５）８μｌ、１．５ｍＭ濃度のＬ－チロシン３６μｌと共に、アヤメ球根由来のエクソソーム（ストック濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）と溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を濃度ごとに処理した。チロシナーゼ抑制活性は、試料を３７℃で１５分間反応させた後、４９０ｎｍで吸光度を測定して確認した。このとき、陰性対照群としてはＰＢＳを処理し、美白剤として知られている合成物質であるアルブチンを標準試料として用い、結果は％に換算した。図８は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの美白効果をチロシナーゼ活性抑制率で評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソームとアヤメ球根抽出物を処理したときに濃度依存的にチロシナーゼ活性抑制率が増加し、アヤメ球根由来のエクソソームを処理したときにさらに高い抑制率が確認された。
【0057】
試験例８：アヤメ球根由来のエクソソームの美白効果に対する評価（メラニン生成抑制）
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの美白効果を確認するために、溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物と比較してメラニン生成抑制試験を行った。マウス由来のＢ１６Ｆ１０細胞株（メラニン分泌細胞）を接種した後、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の培養培地で、３７℃で２４時間の間、５％ＣＯ２下で培養した。培養後に培地を廃棄し、新しい培地に交換した後、アヤメ球根由来のエクソソーム（ストック濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）及び溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を処理して７２時間培養した。培養後に細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで処理し、遠心分離して回収した。回収した細胞を洗浄した後、１Ｎ ＮａＯＨ ５００μＬで処理し、１００℃で１０分間反応させてメラニンを溶解した。メラニンの量は、４０５ｎｍで吸光度を測定して確認した。このとき、陰性対照群としてはＰＢＳを処理し、美白剤として知られている合成物質であるアルブチンを標準試料として用い、結果は％に換算した。図９は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの美白効果をメラニン生成抑制率で評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソームとアヤメ球根抽出物を処理したときに濃度依存的にメラニン生成抑制率が増加し、アヤメ球根由来のエクソソームを処理したときにさらに高い抑制率が確認された。
アヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根由来のエクソソームの美白効果を確認するために、溶媒ごとのアヤメ（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）球根抽出物と比較してメラニン生成抑制試験を行った。マウス由来のＢ１６Ｆ１０細胞株（メラニン分泌細胞）を接種した後、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の培養培地で、３７℃で２４時間の間、５％ＣＯ２下で培養した。培養後に培地を廃棄し、新しい培地に交換した後、アヤメ球根由来のエクソソーム（ストック濃度９．９０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）及び溶媒ごとのアヤメ球根抽出物（ストック濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を処理して７２時間培養した。培養後に細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで処理し、遠心分離して回収した。回収した細胞を洗浄した後、１Ｎ ＮａＯＨ ５００μＬで処理し、１００℃で１０分間反応させてメラニンを溶解した。メラニンの量は、４０５ｎｍで吸光度を測定して確認した。このとき、陰性対照群としてはＰＢＳを処理し、美白剤として知られている合成物質であるアルブチンを標準試料として用い、結果は％に換算した。図９は、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームの美白効果をメラニン生成抑制率で評価した結果を示したグラフである。試験の結果、アヤメ球根由来のエクソソームとアヤメ球根抽出物を処理したときに濃度依存的にメラニン生成抑制率が増加し、アヤメ球根由来のエクソソームを処理したときにさらに高い抑制率が確認された。
【0058】
製剤例１：水系製剤の製造
下記表２の組成により、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームを含む水系製剤を製造した。水性二相系で精製したエクソソームの製剤中の安定性をさらに高めるために、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールとそれらの共重合体及び誘導体、ブチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンのようにアルコール基を含む化合物からなる群より１つ以上含めて製造した。このような化合物を含有していない製剤を比較製剤例１にした。
下記表２の組成により、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームを含む水系製剤を製造した。水性二相系で精製したエクソソームの製剤中の安定性をさらに高めるために、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールとそれらの共重合体及び誘導体、ブチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンのようにアルコール基を含む化合物からなる群より１つ以上含めて製造した。このような化合物を含有していない製剤を比較製剤例１にした。
【0059】
【表2】
【0060】
試験例９：アヤメ球根由来のエクソソームにおける水系製剤中の温度による安定性分析
上記製剤例１及び比較製剤例１によって製造された水系製剤の温度による安定性試験を行った。下記表３は、上記製剤例１及び比較製剤例１を１２週間４℃、２５℃、４５℃で保管した後、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって粒子のサイズと濃度を示した表である。
上記製剤例１及び比較製剤例１によって製造された水系製剤の温度による安定性試験を行った。下記表３は、上記製剤例１及び比較製剤例１を１２週間４℃、２５℃、４５℃で保管した後、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって粒子のサイズと濃度を示した表である。
【0061】
【表3】
【0062】
温度による１２週間の安定性を分析した結果、製剤例１のポリオールを配合した製剤例１に該当するアヤメ球根由来のエクソソームのサイズ及び濃度変化が４℃、２５℃、４５℃の条件ですべて安定であることが確認された。一方、比較製剤例１の場合、エクソソームの濃度が４℃、２５℃、４５℃の条件ですべて減少したことが確認された。
【0063】
製剤例２：クリームの製造
下記表４の組成により、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームを含むクリームを通常の方法で製造した。溶媒ごとのアヤメ球根抽出物の効果を比較するときに効果が良好であった比較例２のアヤメ球根熱水抽出物を含有するクリームを比較製剤例２にした。
下記表４の組成により、上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームを含むクリームを通常の方法で製造した。溶媒ごとのアヤメ球根抽出物の効果を比較するときに効果が良好であった比較例２のアヤメ球根熱水抽出物を含有するクリームを比較製剤例２にした。
【0064】
【表4】
【0065】
試験例１０：アヤメ球根由来のエクソソームの製剤における性状安定性の分析
上記製剤例２によって製造されたクリームの性状安定性試験を行った。製造されたクリームを１２週の間、サイクルチャンバー（Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ）で２４時間間隔で４℃⇔４５℃の温度変化を与えてその性状の変化を観察した。その結果を下記表５に示した。
上記製剤例２によって製造されたクリームの性状安定性試験を行った。製造されたクリームを１２週の間、サイクルチャンバー（Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ）で２４時間間隔で４℃⇔４５℃の温度変化を与えてその性状の変化を観察した。その結果を下記表５に示した。
【0066】
【表5】
【0067】
（－；変化なし、＋；わずかな色の変化、＋＋；色の変化又はわずかな沈殿、＋＋＋；色の変化及び沈澱が発生）
【0068】
水性二相系で精製したアヤメ球根由来のエクソソーム（実施例１）を含有したクリーム製剤の安定性を観察した結果、性状安定性が維持されることが確認された。
【0069】
試験例１１：アヤメ球根由来のエクソソームの皮膚シワ改善効果
３０代～５０代の大人女性３０名を対象として、２つのグループに分けて上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームを含むクリーム（製剤例２）と、上記比較例２のアヤメ球根熱水抽出物を含むクリーム（比較製剤例２）を顔の両面に塗布し、ＬＥＤ光源装置で６３３ｎｍの赤色光を６週間累計で２４時間照射した後、シワ改善効果を評価した。下記表６は、この評価に基づくシワ改善効果の結果を示した表である。
３０代～５０代の大人女性３０名を対象として、２つのグループに分けて上記実施例１によって精製されたアヤメ球根由来のエクソソームを含むクリーム（製剤例２）と、上記比較例２のアヤメ球根熱水抽出物を含むクリーム（比較製剤例２）を顔の両面に塗布し、ＬＥＤ光源装置で６３３ｎｍの赤色光を６週間累計で２４時間照射した後、シワ改善効果を評価した。下記表６は、この評価に基づくシワ改善効果の結果を示した表である。
【0070】
【表6】
【0071】
上記表６の結果よりも分かるように、本発明のアヤメ球根由来のエクソソームを含むクリームは優れたシワ改善効果を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】