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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】定常ドメインを有する抗体プロドラッグ
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20240829BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240829BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240829BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240829BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240829BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240829BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240829BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240829BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240829BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240829BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00 ZNA
C07K16/46
C07K19/00
C12N5/10
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N1/19
C12N1/15
C12N1/21
A61P43/00 123
A61P35/00
A61P37/06
A61P31/00
A61K47/68
A61K39/395 T
A61K35/17
C12N5/0783
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513315
(86)(22)【出願日】2022-08-23
(85)【翻訳文提出日】2024-04-19
(86)【国際出願番号】 CN2022114310
(87)【国際公開番号】W WO2023025156
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/114121
(32)【優先日】2021-08-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524069695
【氏名又は名称】コンセプト トゥー メディシン バイオテック カンパニー， リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】524068414
【氏名又は名称】レプ バイオファーマ カンパニー， リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ファン， レイ
(72)【発明者】
【氏名】シェン， ハオ
(72)【発明者】
【氏名】ゼン， ペン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC03
4C076CC27
4C076CC31
4C076CC42
4C076EE59
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB12
4C085BB22
4C085BB50
4C085CC01
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087CA04
4C087NA05
4C087NA13
4C087ZB08
4C087ZB26
4C087ZB31
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
(57)【要約】
必要に応じて切断可能なリンカーを通じて抗体の１つまたは複数の鎖と結合した免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、例えばＣＨ３またはバリアントを含む抗体プロドラッグが提供される。定常ドメインおよびバリアントが、抗体の活性を阻害する有効かつ安全なマスキング部分としての機能を果たすことが見いだされる。処置標的組織において、例えば対応する酵素によって抗体から除去されると、抗体プロドラッグから活性な抗体が放出される。そのような酵素が存在しない組織では、抗体プロドラッグは不活性なままであり、それにより、そのような組織における有害作用が回避される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｂ）免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域に共有結合で結合した（ａ）免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域またはその断片を含む分子であって、前記可変領域が、前記定常領域と結合していないときは標的分子に結合することができるが、前記定常領域の前記可変領域への結合により、そのような結合が阻害される、分子。
【請求項2】
前記定常領域が、（ａ）前記可変領域のＮ末端と融合している、または（ｂ）前記可変領域とコンジュゲートしている、請求項１に記載の分子。
【請求項3】
前記免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域のＮ末端側には追加の免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域を含まない、請求項１または２に記載の分子。
【請求項4】
前記定常領域が、ＩｇＧ ＣＨ３、ＩｇＧ ＣＨ２、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣＬ、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域からなる群から選択され、ＣＨ３であることが好ましい、請求項１から３のいずれか一項に記載の分子。
【請求項5】
前記可変領域が、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）可変領域からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の分子。
【請求項6】
ＣＨ３であることが好ましい前記定常領域が、前記可変領域のＮ末端と融合している、請求項１から５のいずれか一項に記載の分子。
【請求項7】
重鎖可変領域（ＶＨ）、前記ＶＨのＮ末端と融合した第１の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、軽鎖可変領域（ＶＬ）、および前記ＶＬのＮ末端と融合した第２の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を含み、前記ＶＨとＶＬが集合的に前記標的分子に対する結合特異性を有し、前記第１の定常領域と第２の定常領域が互いに対合する、請求項６に記載の分子。
【請求項8】
前記第１の定常領域と第２の定常領域が、２つのＣＨ３、ＣＨ１とＣＬ、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖である、請求項７に記載の分子。
【請求項9】
前記２つの定常領域が、野生型定常領域と比較して、マスキング部分のヘテロ二量体形成を増加させるように改変されている、請求項８に記載の分子。
【請求項10】
前記２つの定常領域が、野生型定常領域と比較して、ノブインホール置換、または電荷対置換を含むように改変されている、請求項９に記載の分子。
【請求項11】
前記第１の定常領域のＮ末端側にも前記第２の定常領域のＮ末端側にも追加の免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域を含まない、請求項７から１０のいずれか一項に記載の分子。
【請求項12】
前記第１の定常領域のＮ末端側にも前記第２の定常領域のＮ末端側にも追加の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を含まない、請求項７から１１のいずれか一項に記載の分子。
【請求項13】
第１のＶＬと対合した第１のＶＨを含む第１の抗原結合単位、第２のＶＬと対合した第２のＶＨを含む第２の抗原結合単位、
前記第１のＶＨのＮ末端と融合した第１の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、前記第１のＶＬのＮ末端と融合した第２の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、前記第２のＶＨのＮ末端と融合した第３の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、および前記第２のＶＬのＮ末端と融合した第４の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域
を含み、
前記第１の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域が前記第２の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と対合して前記第１の抗原結合単位の結合を阻害し、前記第３の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域が前記第４の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と対合して前記第２の抗原結合単位の結合を阻害する、請求項６に記載の分子。
【請求項14】
前記第１の抗原結合単位と前記第２の抗原結合単位が同じであるまたは異なる、請求項１３に記載の分子。
【請求項15】
前記第１の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域および前記第２の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域が、野生型定常領域と比較して、ノブインホール置換または電荷対置換を含むように改変され、一方、前記第３の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域および前記第４の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域は、前記ノブインホール置換も前記電荷対置換も有さない、請求項１３に記載の分子。
【請求項16】
前記第３の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と前記第４の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域が、一対の電荷対置換または一対のノブインホール置換を有し、置換が、前記第１の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と前記第２の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域の間のものとは異なる、請求項１５に記載の分子。
【請求項17】
各ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってＴ４３７（Ｋａｂａｔ番号付けによるとＴ４６８）と、対応する可変領域のＮ末端との間に、２３アミノ酸残基以下、好ましくは２２、２１または２０アミノ酸残基以下、より好ましくは１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、または８アミノ酸残基以下が存在する、請求項６から１６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項18】
各ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってＴ４３７（Ｋａｂａｔ番号付けによるとＴ４６８）と、対応する可変領域のＮ末端との間に、少なくとも８アミノ酸残基、好ましくは少なくとも９、１０、１１または１２アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸残基が存在する、請求項６から１７のいずれか一項に記載の分子。
【請求項19】
各ＣＨ３ドメインが、前記可変領域の前記標的分子への結合を阻害するために十分である断片を少なくとも保持するように短縮されており、前記ＣＨ３ドメインが、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインと比較してＣ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９残基除去されるように短縮されていることが好ましい、請求項６から１８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項20】
各ＣＨ３ドメインが、前記可変領域の前記標的分子への結合を阻害するために十分である断片を少なくとも保持するように短縮されており、前記ＣＨ３ドメインが、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインと比較してＮ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基除去されるように短縮されていることが好ましい、請求項６から１９のいずれか一項に記載の分子。
【請求項21】
各ＣＨ３ドメインが、各可変領域とペプチドリンカーを通じて融合し、前記ペプチドリンカーが、必要に応じて切断可能であり、好ましくは酵素により切断可能である、請求項６から２０のいずれか一項に記載の分子。
【請求項22】
酵素により切断可能なペプチドリンカーそれぞれが、線維芽細胞活性化タンパク質、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、マトリプターゼ、レグマイン、およびマトリックスメタロプロテアーゼからなる群から選択される酵素によって切断可能である、請求項２１に記載の分子。
【請求項23】
酵素により切断可能なペプチドリンカーそれぞれが、配列番号５１～６４および１０１～１０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の分子。
【請求項24】
ペプチドリンカーそれぞれが切断可能である、請求項６から２３のいずれか一項に記載の分子。
【請求項25】
ペプチドそれぞれが互いに同一の配列を有する、請求項６から２４のいずれか一項に記載の分子。
【請求項26】
前記定常領域が切断可能なリンカーを通じて前記可変領域にコンジュゲートしている、請求項１から５のいずれか一項に記載の分子。
【請求項27】
前記切断可能なリンカーが、前記可変領域のアミノ酸の側鎖に共有結合により付着している、請求項２６に記載の分子。
【請求項28】
前記アミノ酸が、第１のフレームワーク領域内、第２のフレームワーク領域内、第３のフレームワーク領域内、第４のフレームワーク領域内、または第１のＣＤＲ内、第２のＣＤＲ内、または第３のＣＤＲ内に位置する、請求項２７に記載の分子。
【請求項29】
前記切断可能なリンカーが、１種または複数種のタンパク質分解酵素、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって切断することが可能である、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項30】
各ＣＨ３ドメインが、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものである、請求項４から２９のいずれか一項に記載の分子。
【請求項31】
各ＣＨ３ドメインが、全長ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってアミノ酸残基Ｇ３７１からＴ４３７までを含む、請求項３０に記載の分子。
【請求項32】
各ＣＨ３ドメインが、全長ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってアミノ酸残基Ｋ３６０からＴ４３７までを含む、請求項３０に記載の分子。
【請求項33】
各ＣＨ３ドメインが、全長ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってアミノ酸残基Ｅ３４５からＴ４３７までを含む、請求項３０に記載の分子。
【請求項34】
各ＣＨ３ドメインが、配列番号１０のアミノ酸残基３１～９７、または配列番号１０のアミノ酸残基２０～９７、１０～９７、５～９７、４～９７、３～９７、２～９７、もしくは５～１０１を含む、請求項３０に記載の分子。
【請求項35】
前記ＣＨ３ドメインのうちの一方が、配列番号１９のアミノ酸残基１～９７を含み、他方のＣＨ３ドメインが、配列番号２０のアミノ酸残基１～９７を含む、請求項３４に記載の分子。
【請求項36】
前記可変領域が、二重特異性または三重特異性抗体または断片である抗体または断片に存在し、各特異性が可変領域を含み、可変領域がそれぞれ免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と融合またはコンジュゲートしている、請求項１から３５のいずれか一項に記載の分子。
【請求項37】
前記可変領域が、完全なサイズのＦａｂ抗体、ナノボディ、単鎖断片、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であることが好ましい抗体または断片に存在する、請求項１から３６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項38】
免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域のＣ末端と融合した切断可能なペプチドリンカーを含む融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域のＮ末端側には抗原結合断片を含まない、融合タンパク質。
【請求項39】
前記切断可能なペプチドリンカーのＣ末端と融合した免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域をさらに含む、請求項３８に記載の融合タンパク質。
【請求項40】
前記切断可能なペプチドリンカーのＮ末端には単一の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域が存在する、請求項３８または３９に記載の融合タンパク質。
【請求項41】
前記免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域が、ＩｇＧ ＣＨ３、ＩｇＧ ＣＨ２、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣＬ、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域からなる群から選択され、ＣＨ３であることが好ましい、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項42】
各ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってＴ４３７（Ｋａｂａｔ番号付けによるとＴ４６８）と前記切断可能なペプチドリンカーのＣ末端との間に、２３アミノ酸残基以下、好ましくは２２、２１または２０アミノ酸残基以下、より好ましくは１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、または８アミノ酸残基以下が存在する、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項43】
前記ＣＨ３ドメインが、前記可変領域の前記標的分子への結合を阻害するために十分である断片を少なくとも保持するように短縮され、前記ＣＨ３ドメインが、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインと比較してＣ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、もしくは好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０残基除去されるように短縮される、または、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインと比較してＮ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０残基除去されるように短縮されることが好ましい、請求項３８から４２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項44】
前記切断可能なペプチドリンカーが、酵素により切断可能であり、好ましくは線維芽細胞活性化タンパク質、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、マトリプターゼ、レグマイン、およびマトリックスメタロプロテアーゼからなる群から選択される酵素によって切断可能である、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項45】
請求項１から４４のいずれか一項に記載の分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項46】
１つまたは複数の可変（Ｖ）領域と、前記Ｖ領域のそれぞれのＮ末端と融合した１つまたは複数の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域とを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項47】
請求項１から２５および３０から３７のいずれか一項に記載の分子、請求項３８から４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４５に記載のＣＡＲ、または請求項４６に記載のＴＣＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド。
【請求項48】
請求項４７に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項49】
活性な抗体または抗原結合断片を対象に送達するための方法であって、前記対象に、請求項１から３７のいずれか一項に記載の分子または請求項３８から４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含み、前記対象において前記切断可能なリンカーが切断され、それにより、前記対象において前記抗体または抗原結合断片が放出される、方法。
【請求項50】
がん、自己免疫疾患、および感染症からなる群から選択される疾患または状態を処置するための、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
背景
抗体および抗原結合断片は、治療において、特に、がんを処置するために、一般に使用されている。しかし、これらの治療剤は、特異性が高いにもかかわらず「標的に対するが腫瘍以外のものにも（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ）」毒性を引き起こすおそれがあり、これは、抗原または標的が正常細胞または組織においても同様に発現される場合があり、それにより有意な有害作用が引き起こされ得ることに起因する。これらの場合、通常、効力が高くなると毒性が高くなり、それにより治療域が限定されるおそれがある。したがって、これらの標的に対する治療域を広げるための手法を発見する試みがなされている。
抗体および抗原結合断片は、治療において、特に、がんを処置するために、一般に使用されている。しかし、これらの治療剤は、特異性が高いにもかかわらず「標的に対するが腫瘍以外のものにも（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ）」毒性を引き起こすおそれがあり、これは、抗原または標的が正常細胞または組織においても同様に発現される場合があり、それにより有意な有害作用が引き起こされ得ることに起因する。これらの場合、通常、効力が高くなると毒性が高くなり、それにより治療域が限定されるおそれがある。したがって、これらの標的に対する治療域を広げるための手法を発見する試みがなされている。
【0002】
抗体プロドラッグは、不活性であるが、標的疾患細胞または組織において活性化されて、活性な抗体を生じさせることができる分子である。ＣｙｔｏｍＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃによって開発されたＰｒｏｂｏｄｙ（商標）技術プラットフォームは抗体プロドラッグ技術の一例である。Ｐｒｏｂｏｄｙ（商標）抗体プロドラッグでは、ＩｇＧ抗体またはその断片が、抗体の軽鎖のＮ末端とプロテアーゼにより切断可能なリンカーペプチドを通じて連結したマスキングペプチドを含むように改変されている。抗体プロドラッグは、インタクトな形態では、健康な組織における標的抗原との結合が有効に遮断される。罹患環境において適当なプロテアーゼによって活性化されると、マスキングペプチドが放出され、疾患を処置するための活性な抗体が放出される。
【0003】
しかし、適切なマスキングペプチドおよび対応するリンカーの同定は困難であることが判明している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
概要
抗体の天然の一部分、例えば、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ１／Ｃκドメインを抗体（または抗原結合断片）のＮ末端と融合すると、当該ドメインが有効かつ安全なマスキング部分としての機能を果たし得ることが本明細書で見いだされる。そのようなマスキング部分により、抗体の結合活性が有意に低下する、またはさらには消失する。マスキング部分が除去されると活性な抗体が放出され、その活性が取り戻される。したがって、ＣＨ３－抗体融合タンパク質は、抗体プロドラッグとしての機能を果たす。マスキング部分の除去は、例えば、ＣＨ３ドメインと抗体の間に含まれるペプチドリンカーの酵素による消化によって実現することができる。他の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、例えば、ＩｇＧ ＣＨ３、ＩｇＧ ＣＨ２、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣＬ、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域をマスキング部分として使用することもでき、また、そのようなマスキング効果は、他の可変領域、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＬ（カッパまたはラムダ）、およびＴＣＲ可変領域にも同様に適用可能であると考えられる。さらに、マスキング部分は、可変領域とコンジュゲートするか、または一緒に融合して融合タンパク質を形成することができる。
抗体の天然の一部分、例えば、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ１／Ｃκドメインを抗体（または抗原結合断片）のＮ末端と融合すると、当該ドメインが有効かつ安全なマスキング部分としての機能を果たし得ることが本明細書で見いだされる。そのようなマスキング部分により、抗体の結合活性が有意に低下する、またはさらには消失する。マスキング部分が除去されると活性な抗体が放出され、その活性が取り戻される。したがって、ＣＨ３－抗体融合タンパク質は、抗体プロドラッグとしての機能を果たす。マスキング部分の除去は、例えば、ＣＨ３ドメインと抗体の間に含まれるペプチドリンカーの酵素による消化によって実現することができる。他の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、例えば、ＩｇＧ ＣＨ３、ＩｇＧ ＣＨ２、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣＬ、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域をマスキング部分として使用することもでき、また、そのようなマスキング効果は、他の可変領域、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＬ（カッパまたはラムダ）、およびＴＣＲ可変領域にも同様に適用可能であると考えられる。さらに、マスキング部分は、可変領域とコンジュゲートするか、または一緒に融合して融合タンパク質を形成することができる。
【0005】
したがって、本開示の一実施形態は、（ｂ）免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域に共有結合で結合した（ａ）免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域またはその断片を含む分子であって、可変領域が、定常領域と結合していないときは標的分子に結合することができるが、定常領域の可変領域への結合により、そのような結合が阻害される、分子を提供する。
【0006】
一部の実施形態では、定常領域は、（ａ）可変領域のＮ末端と融合している、または（ｂ）可変領域とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、分子は、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域のＮ末端側には免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域を含まない。
【0007】
一部の実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ ＣＨ３、ＩｇＧ ＣＨ２、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣＬ、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域からなる群から選択され、ＣＨ３であることが好ましい。一部の実施形態では、可変領域は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）可変領域からなる群から選択される。
【0008】
一部の実施形態では、ＣＨ３であることが好ましい定常領域は、可変領域のＮ末端と融合している。一部の実施形態では、分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＶＨのＮ末端と融合した第１の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、軽鎖可変領域（ＶＬ）、およびＶＬのＮ末端と融合した第２の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を含み、ＶＨとＶＬが集合的に標的分子に対する結合特異性を有し、第１の定常領域と第２の定常領域が互いに対合する。一部の実施形態では、第１の定常領域および第２の定常領域は、２つのＣＨ３、ＣＨ１とＣＬ、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖である。
【0009】
一部の実施形態では、２つの定常領域は、野生型定常領域と比較して、マスキング部分のヘテロ二量体形成を増加させるように改変される。一部の実施形態では、２つの定常領域は、野生型定常領域と比較して、ノブインホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）置換、または電荷対置換を含むように改変される。
【0010】
一部の実施形態では、分子は、第１の定常領域のＮ末端側にも第２の定常領域のＮ末端側にも追加の免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域を含まない。一部の実施形態では、分子は、第１の定常領域のＮ末端側にも第２の定常領域のＮ末端側にも追加の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を含まない。
【0011】
一部の実施形態では、分子は、第１のＶＬと対合した第１のＶＨを含む第１の抗原結合単位、第２のＶＬと対合した第２のＶＨを含む第２の抗原結合単位、第１のＶＨのＮ末端と融合した第１の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、第１のＶＬのＮ末端と融合した第２の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、第２のＶＨのＮ末端と融合した第３の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、および第２のＶＬのＮ末端と融合した第４の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を含み、第１の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域が第２の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と対合して第１の抗原結合単位の結合を阻害し、第３の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域が第４の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と対合して第２の抗原結合単位の結合を阻害する。一部の実施形態では、第１の抗原結合単位と第２の抗原結合単位は、同じ配列を有し得る、同じエピトープもしくは抗原を標的とし得る、または異なるエピトープもしくは抗原を標的とし得る。
【0012】
一部の実施形態では、第１の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域および第２の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域は、野生型定常領域と比較して、ノブインホール置換または電荷対置換を含むように改変され、一方、第３の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域および第４の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域は、ノブインホール置換も電荷対置換も有さない。
【0013】
一部の実施形態では、第３の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域および第４の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域は、一対の電荷対置換または一対のノブインホール置換を有し、置換は、第１の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と第２の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域の間のものとは異なる。
【0014】
一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってＴ４３７（Ｋａｂａｔ番号付けによるとＴ４６８）と、対応する可変領域のＮ末端との間に、４０アミノ酸残基以下、好ましくは３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１または２０アミノ酸残基以下、より好ましくは１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、または８アミノ酸残基以下が存在する。
【0015】
一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、可変領域の標的分子への結合を阻害するために十分である断片を少なくとも保持するように短縮され、ＣＨ３ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインと比較してＣ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０残基短縮されることが好ましい。一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってＴ４３７（Ｋａｂａｔ番号付けによるとＴ４６８）と、対応する可変領域のＮ末端との間に少なくとも８アミノ酸残基、好ましくは少なくとも９、１０、１１または１２アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸残基が存在する。
【0016】
一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、可変領域の標的分子への結合を阻害するために十分である断片を少なくとも保持するように短縮され、ＣＨ３ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインと比較して、Ｎ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基除去されるように短縮されることが好ましい。
【0017】
一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、各可変領域とペプチドリンカーを通じて融合しており、ペプチドリンカーは、必要に応じて切断可能であり、好ましくは酵素により切断可能である。一部の実施形態では、酵素により切断可能なペプチドリンカーそれぞれが、線維芽細胞活性化タンパク質、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、マトリプターゼ、レグマイン、およびマトリックスメタロプロテアーゼからなる群から選択される酵素によって切断可能である。一部の実施形態では、酵素により切断可能なペプチドリンカーそれぞれが、配列番号５１～６４および１０１～１０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0018】
一部の実施形態では、ペプチドリンカーそれぞれが切断可能である。一部の実施形態では、ペプチドそれぞれが互いに同一の配列を有する。
【0019】
一部の実施形態では、定常領域と可変領域が切断可能なリンカーを通じてコンジュゲートしている。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、可変領域のアミノ酸の側鎖に共有結合により付着している。一部の実施形態では、アミノ酸は、第１のフレームワーク領域内、第２のフレームワーク領域内、第３のフレームワーク領域内、第４のフレームワーク領域内、または第１のＣＤＲ内、第２のＣＤＲ内、または第３のＣＤＲ内に位置する。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、１種または複数種のタンパク質分解酵素、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって切断することが可能である。
【0020】
一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものである。
【0021】
一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、全長ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってアミノ酸残基Ｇ３７１からＴ４３７までを含む。一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、全長ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってアミノ酸残基Ｋ３６０からＴ４３７までを含む。一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、全長ＣＨ３ドメインのＥＵ番号付けに従ってアミノ酸残基Ｅ３４５からＴ４３７までを含む。一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸残基３１～９７、または配列番号１０のアミノ酸残基２０～９７、１０～９７、５～９７、４～９７、３～９７、２～９７、もしくは５～１０１を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインのうちの一方は配列番号１９のアミノ酸残基１～９７を含み、他方のＣＨ３ドメインは配列番号２０のアミノ酸残基１～９７を含む。
【0022】
一部の実施形態では、可変領域は、二重特異性または三重特異性抗体または断片である抗体または断片に存在し、各特異性が可変領域を含み、可変領域はそれぞれ免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と融合またはコンジュゲートしている。
【0023】
一部の実施形態では、可変領域は、完全なサイズのＦａｂ抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、単鎖断片、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）であることが好ましい抗体または断片に存在する。
【0024】
一実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域のＣ末端と融合した切断可能なペプチドリンカーを含む融合タンパク質であって、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域のＮ末端側には抗原結合断片を含まない、融合タンパク質も提供される。
【0025】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、切断可能なペプチドリンカーのＣ末端と融合した免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域をさらに含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域は、ＩｇＧ ＣＨ３、ＩｇＧ ＣＨ２、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣＬ、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域からなる群から選択され、ＣＨ３であることが好ましい。
【0026】
一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってＴ４３７（Ｋａｂａｔ番号付けによるとＴ４６８）と切断可能なペプチドリンカーのＣ末端との間に、４０アミノ酸残基以下、好ましくは３５、３０、２５または２０アミノ酸残基以下、より好ましくは１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、または８アミノ酸残基以下が存在する。
【0027】
一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、可変領域の標的分子への結合を阻害するために十分である断片を少なくとも保持するように短縮され、ＣＨ３ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインと比較してＣ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、もしくは好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０残基が除去されるように短縮される、または、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインと比較してＣ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０残基が除去されるように短縮されることが好ましい。
【0028】
一部の実施形態では、切断可能なペプチドリンカーは、酵素により切断可能であり、好ましくは線維芽細胞活性化タンパク質、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、マトリプターゼ、レグマイン、およびマトリックスメタロプロテアーゼからなる群から選択される酵素によって切断可能である。
【0029】
さらに別の実施形態では、本開示の分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供される。１つまたは複数の可変（Ｖ）領域と、Ｖ領域のそれぞれのＮ末端と融合した１つまたは複数の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域とを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）がなおさらに提供される。
【0030】
一実施形態では、本開示の分子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドも提供される。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。
【0031】
一実施形態では、活性な抗体または抗原結合断片を対象に送達するための方法であって、対象に、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗体または抗原結合断片とを含む分子を投与するステップを含み、定常領域が、ＶＨと切断可能なリンカーを通じて共有結合で結合しており、対象において切断可能なリンカーが切断され、それにより、対象において抗体または抗原結合断片が放出される、方法がさらに提供される。一部の実施形態では、方法は、がん、自己免疫疾患、および感染症からなる群から選択される疾患または状態を処置するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【発明を実施するための形態】
【0050】
詳細な説明
定義
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体という用語は、１つまたは複数のその実体を指し、例えば、「１つの（ａｎ）抗体」は、１つまたは複数の抗体を表すものと理解されることに留意すべきである。したがって、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
定義
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体という用語は、１つまたは複数のその実体を指し、例えば、「１つの（ａｎ）抗体」は、１つまたは複数の抗体を表すものと理解されることに留意すべきである。したがって、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
【0051】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のためにアラインメントすることができる各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列内のある位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、それらの分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は、それらの配列が共有するマッチするまたは相同な位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同的」配列は、本開示の配列のうちの１つに対して４０％未満の同一性を共有するものであるが、２５％未満の同一性を共有するものであることが好ましい。
【0052】
ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有するとは、アラインメントしたときに、２つの配列の比較において塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージが同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。アラインメントのために初期設定のパラメータを使用することが好ましい。アラインメントプログラムの１つは、初期設定のパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下の初期設定のパラメータを使用したＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝コード（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ）＝標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）；フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）＝なし（ｎｏｎｅ）；鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝両方（ｂｏｔｈ）；カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）＝６０；期待値（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；デスクリプション（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０ 配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）；並べ替え（ｓｏｒｔ ｂｙ）＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝非重複（ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ），ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的に等価のポリヌクレオチドは、上記で明記されたパーセント相同性を有し、同じまたは同様の生物活性を有するポリペプチドをコードするものである。
【0053】
「等価の核酸またはポリヌクレオチド」という用語は、核酸のヌクレオチド配列またはその相補物に対してある程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸のホモログは、それに対してまたはその相補物に対してある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を包含するものとする。一態様では、核酸のホモログは、核酸またはその相補物とハイブリダイズすることが可能である。同様に、「等価のポリペプチド」は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対してある程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドを指す。一部の態様では、配列同一性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。一部の態様では、等価のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの付加、欠失、置換およびそれらの組合せを有する。一部の態様では、等価の配列は、参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩橋）を保持する。
【0054】
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識し、それに結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、抗体全体およびその任意の抗原結合断片または単鎖であってよい。したがって、「抗体」という用語は、抗原に結合する生物活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを包含する。そのようなタンパク質またはペプチドの例としては、これだけに限定されないが、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、もしくはこれらの任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも１つの部分が挙げられる。
【0055】
「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体の一部、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどである。構造に関係なく、抗体断片は、インタクトな抗体によって認識される同じ抗原に結合する。「抗体断片」という用語は、アプタマー、シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）、およびダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を包含する。「抗体断片」という用語は、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより、抗体と同様の働きをする任意の合成または遺伝子操作されたタンパク質も包含する。
【0056】
本明細書で使用される場合、「重鎖定常領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を包含する。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、ヒンジ領域の上部、中央部、および／または下部）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。例えば、本開示における使用のための抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示における使用のための抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠き得る。上記の通り、重鎖定常領域を改変することができ、したがって、天然に存在する免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なり得ることが当業者には理解されよう。
【0057】
本明細書に開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子（IgGl molecule）に由来するＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子に一部由来し、ＩｇＧ３分子に一部由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に一部由来し、ＩｇＧ４分子に一部由来するキメラヒンジを含み得る。
【0058】
本明細書で使用される場合、「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を包含する。軽鎖定常領域は定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインの少なくとも１つを含むことが好ましい。
【0059】
「特異的に結合する」または「～に特異性を有する」とは、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および、結合には抗原結合ドメインとエピトープの間にいくらかの相補性を伴うことを意味する。この定義によると、抗体は、エピトープに、その抗原結合ドメインを介して、ランダムな無関係のエピトープに結合する場合よりも容易に結合する場合、そのエピトープに「特異的に結合する」といえる。「特異性」という用語は、本明細書では、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的な親和性を規定するために使用される。例えば、抗体「Ａ」を、所与のエピトープに対して抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなすことができる、または、抗体「Ａ」を、エピトープ「Ｃ」に、関連するエピトープ「Ｄ」に結合する場合よりも高い特異性で結合するということができる。
抗体プロドラッグ
抗体プロドラッグ
【0060】
考察されている通り、効率的かつ安全な抗体プロドラッグプラットフォームの開発に関する主要な課題は、適切なマスキングペプチドの同定である。マスキングペプチドは、ヒト対象における免疫原性を回避するために、ヒトタンパク質に由来するものであることが理想的である。より重要なことに、おそらく、マスキングペプチドは、抗体に立体的な障害を有効にもたらすある特定の三次元構造を有するはずである。しかし、どのような種類の三次元構造が必要であるかに関しては明確な理解が得られていない。しかし、当該構造が長い配列を必要とするものである場合、得られるプロドラッグは、大き過ぎ、製造が難しく、不安定なものになり得る。構造が小さ過ぎる場合には、十分に有効でない可能性がある。
【0061】
驚いたことに、抗体ＣＨ３ドメインが最適なマスキングペプチドとしての機能を果たし得ることが見いだされる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含めた全てのＩｇＧが高度に相同なＣＨ３ドメインを有する（以下の表Ａの配列アラインメントを参照されたい）。
【表A】
【0062】
わずかなバリエーションも存在する。例えば、Ｅ３５６（ＥＵ番号付け）はＤ３５６であってもよく、Ｍ３５８はＬ３５８によって置き換えることができる。バリアントの例は配列番号１０に提示され、表Ｂにおいてその二次構造モチーフがアノテートされている。
【表B-1】
【表B-2】
【0063】
二次モチーフＢＣループ（Ｇ３７１からＡ３７８まで、ＥＵ番号付け）、ＤＥターン（Ｌ３９８からＦ４０５まで、ＥＵ番号付け）、およびＦＧループ（Ｓ４２６からＴ４３７まで、ＥＵ番号付け）、ならびにそれらの間の鎖が適切な三次元マスキング構造を形成すると考えられる。実験例において実証されている通り、ＦＧループに対してＣ末端側のアミノ酸残基を除去することができ、得られる短縮されたＣＨ３ドメインは、いっそう強力なマスキング効果を示した。したがって、ＣＨ３ドメインのこの部分を以降「ループ・ターン・ループ（ｌｏｏｐ－ｔｕｒｎ－ｌｏｏｐ）」断片と称する。
【0064】
同様に安定なループ構造を有し、免疫原性がないまたは低い他の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域、例えば、ＩｇＧ ＣＨ２、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣＬ、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域が存在する。例えば、ＣＨ１では、最初のストレッチ（Ａ１１４～Ｋ１２１）の後に、Ａ鎖（Ｇ１２２～Ｓ１３６）およびＢ鎖（Ｇ１３７～Ｋ１４７）が続き、ＢＣループ（Ｄ１４８～Ｔ１５５）が安定なループ構造である（全てＥＵ番号付け（EU number）に従う）。次いで、Ｃ鎖（Ｖ１５６～Ａ１６２）の後に、ＣＤ鎖（Ｌ１６３～Ｓ１６５）、およびＤ鎖（Ｇ１６６～Ｖ１７３）が続き、安定なＤＥターン（Ｌ１７４～Ｓ１８１）が存在する。その後にＥ鎖（Ｌ１８２～Ｌ１９３）、Ｅ鎖（Ｇ１９４～Ｃ２００）、次いでＦＧループの安定構造（Ｎ２０１～Ｖ２１１）が続き、その後に、Ｇ鎖（Ｄ２１２～Ｖ２１５）が続く（全てＥＵ番号付けに従う）。ＢＣループ、ＤＥターンおよびＦＧループのそれぞれ、ならびにこれらの組合せが、強力なマスキング効果をもたらす機能を果たす。最初のストレッチ、Ａ鎖、Ｂ鎖およびＧ鎖内の残基は除去可能であると想定される。
【0065】
同様に、ＣＨ２では、二次構造は、最初のストレッチ（Ａ２３１～Ｇ２３６）、Ａ鎖（Ｇ２３７～Ｌ２５１）、ＡＢターン（Ｍ２５２～Ｉ２５３）、Ｂ鎖（Ｓ２５４～Ｖ２６４）、安定構造ＢＣループ（Ｄ２６５～Ｋ２７４）、Ｃ鎖（Ｆ２７５～Ｇ２８１）、ＣＤ鎖（Ｖ２８２～Ｈ２８５）、Ｄ鎖（Ｎ２８６～Ｅ２９３）、安定構造ＤＥターン（Ｅ２９４～Ｒ３０１）、Ｅ鎖（Ｖ３０２～Ｗ３１３）、Ｆ鎖（Ｌ３１４～Ｃ３２１）、安定構造ＦＧループ（Ｋ３２２～Ｉ３３２）、Ｇ鎖（Ｅ３３３～Ｋ３４０、全てＥＵ番号付けに従う）を含む。ＢＣループ、ＤＥターンおよびＦＧループのそれぞれ、ならびにこれらの組合せが、強力なマスキング効果をもたらす機能を果たす。最初のストレッチ、Ａ鎖、ＡＢターン、Ｂ鎖およびＧ鎖内の残基は除去可能であると想定される。
【0066】
同様に、本技術は、完全な抗体だけでなく、ナノボディおよび抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ならびにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）にも適用可能である。一部の実施形態では、ＩｇＧ ＣＨ３、ＩｇＧ ＣＨ２、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣＬ、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域は、ヒト定常領域である。
【0067】
したがって、本開示の一実施形態によると、免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域と好ましくは共有結合で結合した免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域またはその断片（例えば、ＣＨ３に関しては、断片は、ＡＢターン、ＤＥターン、ＦＧループ、またはこれらの組合せであり得る）を含む分子が提供される。可変領域は、全長の従来の抗体および単一ドメイン抗体、ならびに抗原結合断片の両方を包含する抗体または断片の重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）であり得る。単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）などの一部の抗体または抗原結合断片では、単一の可変領域（例えば、ＶＨ）のみが存在する。そのような抗体に関しては単一の定常領域が必要である。別の実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域は、ＴＣＲ可変領域である。
【0068】
一部の実施形態では、分子は、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域のＮ末端側にある免疫グロブリンスーパーファミリー可変断片を含まない。言い換えれば、本開示では免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域はただ単に非標的結合マスキングペプチドとして使用される。
【0069】
一部の実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域への免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域の共有結合により、可変領域のその結合標的（例えば、抗原）に結合する能力が阻害される。言い換えれば、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を分子から除去すると、残った免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域はその標的分子に結合することができる。そのような除去前には、分子全体の標的分子に対する結合親和性は低下しているかまたは全くない。したがって、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域は、マスキング部分としての機能を果たす。
【0070】
より多くの従来の抗体は、２つまたはそれよりも多くの可変領域を有する。各ＶＨ／ＶＬ対に対して必要な免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域は１つのみであると想定される。これは、ＶＨ／ＶＬ対が抗原に有効に結合するためには両方の可変領域が必要であるからである。一部の実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域をＶＨに結合する。一部の実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域をＶＬに結合する。好ましい実施形態では、ＶＨとＶＬの両方に免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を結合する。
【0071】
ＶＨとＶＬの両方に免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を結合させる場合、２つの免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を互いに対合させることができ、それにより、本技術の追加の利点がもたらされる。一方では、対合した免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域は、ＶＨ／ＶＬ対の結合活性を阻害するより大きくかつより安定な立体構造を形成する。他方では、抗体に定常領域の対が２つまたはそれよりも多く存在する場合（例えば、二重特異性または三重特異性抗体）、それらの対合を変更して、誤対合を低減することができる。したがって、一部の実施形態では、２つの定常領域は、野生型定常領域と比較して、マスキング部分のヘテロ二量体形成を増加させるように改変される。
【0072】
例えば、Ｆｃ領域に一対の野生型ＣＨ３を含む従来の抗体では、ノブインホールまたは荷電対置換を有する２組のＣＨ３を両方のＶＨ／ＶＬ対に対するマスキング部分として使用することができる。別の例では、二重特異性抗体において、誤対合を低減するために、１つのＶＨ／ＶＬ対を一対の野生型ＣＨ３領域と融合することができ、第２のＶＨ／ＶＬ対を、ノブインホールまたは荷電対置換を有する一対のＣＨ３領域と融合することができる。
【0073】
ＣＨ３に加えて、ＣＨ１とＣＬ（ラムダおよびカッパ）、ならびにＴＣＲアルファ／ベータ鎖も対合することができ、異なる対合が形成されるように変異させることができる。したがって、一例では、二重特異性抗体において、誤対合を低減するために、１つのＶＨ／ＶＬ対を一対の野生型ＣＨ１／ＣＬ領域と融合することができ、第２のＶＨ／ＶＬ対を、ノブインホールまたは荷電対置換を有する一対のＣＨ１／ＣＬ領域と融合することができる。
【0074】
一部の実施形態では、一対の免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域は、一対のＣＨ１とＣＬ、例えばヒトＩｇＧ ＣＨ１とＣＬである。ＣＨ１の配列の例は配列番号１１５のアミノ酸残基１～９８として提示され、ＣＬの配列の例は配列番号７として提示される。一部の実施形態では、ＣＨ１と対応する可変領域の間に（それらの間の必要に応じたリンカーに加えて）少数の追加の残基を挿入する。言い換えれば、そのような追加の残基をリンカーの一部としてカウントすると、ＣＨ１では対応する可変領域との連結のためにＣＬよりも長いリンカーを使用することを意味する。
【0075】
一部の実施形態では、追加の残基は、１～１０残基、または２～９、２～８、３～７、４～６、または５アミノ酸残基である。そのような追加の残基は、一般に使用されるリンカーまたはヒンジ配列の全体または断片であり得る。例はＥＰＫＳＣ（配列番号１２０）である。
【0076】
一部の実施形態では、ＣＨ１をＶＨ／ＶＬ対におけるＶＬと必要に応じたリンカーを通じて融合し、ＣＬをＶＨ／ＶＬ対におけるＶＨと対応する必要に応じたリンカーを通じて融合する。あまり好ましくない実施形態では、ＣＨ１をＶＨ／ＶＬ対におけるＶＨと必要に応じたリンカーを通じて融合し、ＣＬをＶＨ／ＶＬ対におけるＶＬと対応する必要に応じたリンカーを通じて融合する。いずれかの実施形態の一部の態様では、ＣＨ１をより長いリンカーを通じて対応する可変領域に接続する。
【0077】
一部の実施形態では、ノブインホール置換は、ＥＵ番号付けに従って、ＣＨ３ドメインのうちの一方におけるＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗと、他方のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖとを含む。一部の実施形態では、電荷対置換は、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｒ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、またはＫ４０９Ｅ／Ｄ３９９Ｒを含む。
【0078】
一部の実施形態では、それらの断片の、ＣＨ３領域間、ＣＨ１とＣＬの間、またはＴＣＲアルファ／ベータ鎖間の対合をさらに増強することができる。例えば、各配列に適切なシステインを導入した場合、対合する定常領域の間にジスルフィド結合を生成することができる。ジスルフィド結合以外の化学的リンカーも限定なしに使用することができる。増強された対合を使用する場合、より強力な対合により、短い定常領域の断片（本明細書において例示されている）でさえも使用して有効なマスキング部分として機能させることが可能になると想定される。
【0079】
一部の実施形態では、そのような定常領域の単一の対のみを分子に含める。実験例に示されている通り、抗体活性を阻害するためには単一の対（ＣＨ３／ＣＨ３）で十分であり、したがって、第２の対（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３／ＣＨ２－ＣＨ３）を付加する必要はない。一部の実施形態では、結合単位の可変領域（例えば、ＶＨ／ＶＬ）のＮ末端側には、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域の単一の対以外の他の機能単位は存在しない。「機能単位」とは、本明細書で使用される場合、抗体結合、安定化、または循環に関与するタンパク質ドメインを指す。シグナルペプチドは機能単位の例外である。
【0080】
一部の実施形態では、結合単位の可変領域（例えば、ＶＨ／ＶＬ）のＮ末端側のペプチド部分は、２００アミノ酸残基以下である（必要に応じたシグナルペプチドを数えない）。一部の実施形態では、このＮ末端部分は、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、または１０５アミノ酸残基以下である（必要に応じたシグナルペプチドをカウントしない）。
【0081】
一実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域のＣ末端と融合したペプチドリンカーを含む融合タンパク質も提供される。一部の実施形態では、必要に応じて、上記の通り、ペプチドリンカーを免疫グロブリンスーパーファミリー可変領域のＮ末端とさらに融合することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域のＮ末端側にある免疫グロブリンスーパーファミリー可変断片を含まない。言い換えれば、本開示では免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域はただ単に非標的結合マスキングペプチドとして使用される。
【0082】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、それぞれペプチドリンカーと融合した一対のＣＨ３、ＣＨ１とＣＬ、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖などの対として提供される。一部の実施形態では、対を、ノブインホールまたは電荷対対合を含むように改変する。一部の実施形態では、それらの断片の、ＣＨ３領域間、ＣＨ１とＣＬの間、またはＴＣＲアルファ／ベータ鎖間の対合をさらに増強することができる。例えば、各配列に適切なシステインを導入した場合、対合する定常領域間にジスルフィド結合を生成することができる。ジスルフィド結合以外の化学的リンカーも限定なしに使用することができる。増強された対合を使用する場合、より強力な対合により、短い定常領域の断片でさえも使用して有効なマスキング部分として機能させることが可能になると想定される。
【0083】
一部の実施形態では、可変領域のＥＵ番号付けに従ってＣＨ３のＴ４３７（Ｋａｂａｔ番号付けによるとＴ４６８）（またはＣＨ１のＶ２１１（ＥＵ番号付け）、またはＣＨ２のＩ３３２（ＥＵ番号付け））と切断可能なペプチドリンカーのＣ末端の間に５０、４５、４０、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、または１５アミノ酸残基以下、または好ましくは１４、１３、１２、１１、１０、９、または８アミノ酸残基以下が存在する。
【0084】
各ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってＴ４３７（Ｋａｂａｔ番号付けによるとＴ４６８）と、対応する可変領域のＮ末端との間に少なくとも８アミノ酸残基、好ましくは少なくとも９、１０、１１または１２アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸残基が存在する。
【0085】
一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってＴ４３７（Ｋａｂａｔ番号付けによるとＴ４６８）と、対応する可変領域のＮ末端との間に８～２３アミノ酸残基が存在する。
【0086】
一部の実施形態では、各ＣＨ３ドメインの、ＥＵ番号付けに従ってＴ４３７（Ｋａｂａｔ番号付けによるとＴ４６８）と、対応する可変領域のＮ末端との間に１２～２０アミノ酸残基が存在する。
【0087】
一部の実施形態では、定常領域は、可変領域の標的分子への結合を阻害するために十分である断片を少なくとも保持するように短縮される。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインと比較して、Ｃ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基除去されるように短縮される。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、野生型可変領域と比較して、Ｃ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基除去されるように短縮される。免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域およびペプチドリンカーの例は本開示全体を通してさらに詳細に記載されている。
【0088】
一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と好ましくは共有結合で結合した免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を含む分子も提供される。一部の実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域をＴＣＲの可変（Ｖ）領域と結合する。一部の実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域をＴＣＲの各可変（Ｖ）領域と結合する。
【0089】
実証されている通り、本開示では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域は、抗体、断片またはＴ細胞受容体の活性を有効に遮断するまたは低下させるために十分である。したがって、一部の実施形態では、分子は、マスキング部分にさらなるドメインを含まない。一部の実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域とともに可変領域（ＶＨ、ＶＬ、またはＴＣＲ可変領域など）は存在しない。一部の実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域に対してＮ末端側には可変領域（ＶＨ、ＶＬ、またはＴＣＲ可変領域など）は配置されない。一部の実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域と抗体、抗原結合断片またはＴＣＲの間には可変領域（ＶＨ、ＶＬ、またはＴＣＲ可変領域など）は配置されない。一部の実施形態では、マスキング部分は、単一の定常領域（例えば、ＣＨ１またはＣＨ２を伴わずに単一のＣＨ３）を含む。
【0090】
一部の実施形態では、完全なサイズのＦａｂ抗体、ナノボディ、単鎖断片、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）などの抗原結合単位のための可変領域（複数可）。一部の実施形態では、抗原結合単位は、ＶＨとＶＬの対、または一対のナノボディを含む。
【0091】
抗体プロドラッグとして、マスキングペプチドは、非標的組織ではプロドラッグ中に留まり、標的組織において除去されるべきである。一部の実施形態では、マスキングペプチドの除去を、マスキングペプチドを抗体、抗原結合断片またはＴＣＲに結合するリンカーの除去、分解、破壊、または消化によって達成することができる。例は、酵素により切断可能なペプチドリンカーである。
【0092】
一部の実施形態では、ペプチドリンカーを切断することができる酵素（プロテアーゼ）は、患部組織または器官において独自に発現される、または健康な組織もしくは器官と比較して過剰発現されるものである。好ましくは、酵素は、患部組織または器官の細胞外の環境に見いだされる。そのようなプロテアーゼの例としては、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、レニン）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、アスパラギン酸カテプシン（例えば、カテプシンＤ、カスパーゼ１、カスパーゼ２など）、システインカテプシン（例えば、カテプシンＢ）、システインプロテアーゼ（例えば、レグマイン）、ディスインテグリン／メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ、例えば、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９）、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリン／メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１）、膜内在性セリンプロテアーゼ（例えば、マトリプターゼ２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４）、カリクレイン関連ペプチダーゼ（ＫＬＫ、例えば、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５）、マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９）、およびセリンプロテアーゼ（例えば、カテプシンＡ、凝固因子プロテアーゼ、例えばエラスターゼ、プラスミン、トロンビン、ＰＳＡ、ｕＰＡ、Ｖｉｌａ因子、第Ｘａ因子、およびＨＣＶ ＮＳ３／４）が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ、ウロキナーゼ）、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、レグマイン、またはマトリックスメタロプロテアーゼ（特にＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、およびＭＭＰ－９）である。酵素および対応する切断可能なペプチドの選択は、処置される疾患および罹患組織または器官によって発現されるプロテアーゼ（複数可）に依存することが当業者には理解されよう。
【0093】
酵素により切断可能なペプチドリンカーの例を表Ｃに提示する。
【表C】
【0094】
一部の実施形態では、１つまたは複数のタンパク質鎖のそれぞれにおけるペプチドリンカーそれぞれが、同じ切断酵素によって切断され得、したがって、その酵素が存在すれば、リンカーの全てが同時に切断され、抗体が完全に活性化される。一部の実施形態では、ペプチドリンカーそれぞれが同じ配列を有する。
【0095】
一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号５１～６３または１０１～１０３から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１０３などの酵素による切断部位を２つ含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇ（グリシン）およびＳ（セリン）などのさらなるアミノ酸残基を含む。
【0096】
付随の実験例では、全長ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基の一部を除去した場合、得られるＣＨ３断片がそれらの全長対応物よりもはるかに強力なマスキング効果を示すことが実証された。これは、ＣＨ３ドメインのループ・ターン・ループ断片が、短縮により、可変領域と空間的に近くなることに起因すると想定される。そのように空間的関連性が近くなることにより、より大きな立体障害がもたらされると想定される。
【0097】
「ＣＨ３ドメイン」という用語は、本開示において使用される場合、野生型ＣＨ３ドメインの配列ホモログ、ならびに、少なくともループ・ターン・ループ部分を含むそれらの断片の両方を包含する。
【0098】
野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインの配列は、配列番号４７～５０（表Ａ）に提示される。それらの配列ホモログには、保存的アミノ酸置換を有するもの（例えば、配列番号１０）およびノブインホール改変を有するもの（例えば、配列番号１９～２０）が含まれる。
【0099】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、免疫グロブリンポリペプチド内の非必須アミノ酸残基が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基によって置き換えられることが好ましい。別の実施形態では、アミノ酸の文字列を、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似した文字列によって置き換えることができる。
【0100】
保存的アミノ酸置換の非限定的な例を下記の表に提示する。類似性スコアが０またはそれよりも大きいことにより、２つのアミノ酸間の保存的置換が示される。
【表D】
【表E-1】
【表E-2】
【0101】
全長ＣＨ３ドメインの各配列ホモログに関して、その断片も、少なくともループ・ターン・ループ部分を含む限りはＣＨ３ドメインの意味の範囲内に入る。提示されている通り、全長ＣＨ３ドメインのループ・ターン・ループ断片は、ＢＣループ（Ｇ３７１からＡ３７８まで、ＥＵ番号付け）、ＤＥターン（Ｌ３９８からＦ４０５まで、ＥＵ番号付け）、およびＦＧループ（Ｓ４２６からＴ４３７まで、ＥＵ番号付け）、ならびにそれらの間の鎖（例えば、Ｃ鎖、ＣＤ鎖、Ｄ鎖、Ｅ鎖、およびＦ鎖）を含む。Ａ鎖、Ｂ鎖およびＧ鎖はこのループ・ターン・ループ断片内には存在せず、したがって、部分的にまたは完全に除去することができる。
【0102】
一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは短縮を有するが、可変領域の標的分子への結合を阻害するために十分である断片を少なくとも保持する。一部の実施形態では、短縮はＣ末端におけるものである。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後のアミノ酸（Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後の２アミノ酸（Ｇ４４６－Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後の３アミノ酸（Ｐ４４５－Ｇ４４６－Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後の４アミノ酸（Ｓ４４４－Ｐ４４５－Ｇ４４６－Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後の５アミノ酸（Ｌ４４３－Ｓ４４４－Ｐ４４５－Ｇ４４６－Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後の６アミノ酸（Ｓ４４２－Ｌ４４３－Ｓ４４４－Ｐ４４５－Ｇ４４６－Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後の７アミノ酸（Ｌ４４１－Ｓ４４２－Ｌ４４３－Ｓ４４４－Ｐ４４５－Ｇ４４６－Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後の８アミノ酸（Ｓ４４０－Ｌ４４１－Ｓ４４２－Ｌ４４３－Ｓ４４４－Ｐ４４５－Ｇ４４６－Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後の８アミノ酸（Ｓ４４０－Ｌ４４１－Ｓ４４２－Ｌ４４３－Ｓ４４４－Ｐ４４５－Ｇ４４６－Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後の９アミノ酸（Ｋ４３９－Ｓ４４０－Ｌ４４１－Ｓ４４２－Ｌ４４３－Ｓ４４４－Ｐ４４５－Ｇ４４６－Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。一部の実施形態では、配列番号１０を参照して最後の１０アミノ酸（Ｑ４３８－Ｋ４３９－Ｓ４４０－Ｌ４４１－Ｓ４４２－Ｌ４４３－Ｓ４４４－Ｐ４４５－Ｇ４４６－Ｋ４４７、ＥＵ番号付け）を除去する。
【0103】
一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは短縮を有するが、可変領域の標的分子への結合を阻害するために十分である断片を少なくとも保持する。一部の実施形態では、ＢＣループ（Ｇ３７１からＡ３７８まで、ＥＵ番号付け）がインタクトなまま保たれる限りは、ＣＨ３ドメインはＮ末端で短縮される。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインと比較してＮ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基除去されるように短縮される。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、全長ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基Ｇ３７１からＴ４３７までを含む。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、全長ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基Ｋ３６０からＴ４３７までを含む。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、全長ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基Ｅ３４５からＴ４３７までを含む。
【0104】
一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、配列番号１０、１９、２０、４７、４８、４９または５０のアミノ酸残基３１～９７、２０～９７、１０～９７、５～９７、４～９７、３～９７、２～９７、または５～１０１を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、配列番号１０、１９、２０、４７、４８、４９または５０のアミノ酸残基１～９７を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインのうちの一方（例えば、ＶＬと融合したもの）は配列番号１９のアミノ酸残基１～９７を含み、他方のＣＨ３ドメイン（例えば、ＶＨと融合したもの）は配列番号２０のアミノ酸残基１～９７を含む。
【0105】
同様に、ＣＬ、ＣＨ１またはＣＨ２を使用する場合、ＣＬ、ＣＨ１またはＣＨ２も同様にＮ末端または（of）Ｃ末端で短縮することができる。一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメインと比較してＣ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基除去されるように短縮される。一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメインと比較してＮ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基除去されるように短縮される。
【0106】
一部の実施形態では、ＣＬドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＬドメインと比較してＣ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基除去されるように短縮される。一部の実施形態では、ＣＬドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＬドメインと比較してＮ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基除去されるように短縮される。
【0107】
一部の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ２ドメインと比較してＣ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基除去されるように短縮される。一部の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ ＣＨ２ドメインと比較してＮ末端アミノ酸残基が少なくとも１残基、または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基除去されるように短縮される。
【0108】
一部の実施形態では、十分な立体障害を確実にするために、ＦＧループのＣ末端（すなわち、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３のＴ４３７またはＫａｂａｔ番号付けに従ってＴ４６８）間の距離を制限する。一部の実施形態では、ＣＨ３ Ｔ４３７（ＥＵ番号付け）と対応する可変領域のＮ末端との間に５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、または１５アミノ酸残基以下が存在する。一部の実施形態では、ＣＨ３ Ｔ４３７（ＥＵ番号付け）と対応する可変領域のＮ末端との間に１４アミノ酸残基以下が存在する。一部の実施形態では、ＣＨ３ Ｔ４３７（ＥＵ番号付け）と対応する可変領域のＮ末端との間に１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５アミノ酸残基以下が存在する。
【0109】
同様に、一部の実施形態では、ＣＨ１のＶ２１１（ＥＵ番号付け）と対応する可変領域のＮ末端との間に５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１４アミノ酸残基以下が存在する。一部の実施形態では、ＣＨ１のＶ２１１（ＥＵ番号付け）と対応する可変領域のＮ末端との間に１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５アミノ酸残基以下が存在する。
【0110】
一部の実施形態では、ＣＨ２のＩ３３２（ＥＵ番号付け）と対応する可変領域のＮ末端との間に５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１４アミノ酸残基以下が存在する。一部の実施形態では、ＣＨ２のＩ３３２（ＥＵ番号付け）と対応する可変領域のＮ末端との間に１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５アミノ酸残基以下が存在する。
【0111】
一部の実施形態では、ＣＨ３などの免疫グロブリンスーパーファミリー定常領域を抗体、断片、またはＴＣＲと化学的リンカーを通じてコンジュゲートする。一部の実施形態では、化学的リンカーを可変領域のアミノ酸に共有結合により付着させる。一部の実施形態では、当該アミノ酸はフレームワーク領域内に存在する。一部の実施形態では、当該アミノ酸は全てのＣＤＲに対してＮ末端側のフレームワーク領域である。
【0112】
一部の実施形態では、化学的リンカーは、切断可能なリンカーである。切断可能なリンカーは、タンパク質分解酵素によって切断することができる、または疾患の微小環境において酸性で活性化することができる。一部の実施形態では、リンカーをシステインなどの抗体のアミノ酸に共有結合により連結する。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、１種または複数種のタンパク質分解酵素、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって切断することが可能なペプチドであり、ここで、プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、アスパラギンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、ゼラチナーゼ、メタロプロテイナーゼ、もしくはアスパラギンペプチドリアーゼからなる群から選択される、または、病理的微小環境の酸性条件下で切断可能な結合である。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、アミド、エステル、カルバメート、尿素およびヒドラゾン結合からなる群から選択される。
【0113】
融合分子に含まれる抗体または断片は、任意の抗原に対する特異性を有し得、任意の抗体または断片構造を有し得る。一部の実施形態では、融合分子に含まれる抗体または断片は、Ｆｃ断片を有する従来のＦａｂ構造を有する。一部の実施形態では、融合分子に含まれる抗体または断片は、少なくともＶＨ／ＶＬ対を含む。一部の実施形態では、融合分子に含まれる抗体または断片は、単一の可変領域を有する。一部の実施形態では、抗体または断片は、腫瘍抗原に対する特異性を有する。
【0114】
「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞において産生される抗原性物質である、すなわち、腫瘍抗原は、宿主における免疫応答を誘発する。腫瘍抗原は、腫瘍細胞の同定に有用であり、がん治療における使用の潜在的候補である。体内の正常タンパク質は抗原性ではない。しかし、ある特定のタンパク質は腫瘍形成の間に産生または過剰発現され、したがって、体に対して「外来」とみなされる。これには、免疫系から十分に隔絶している正常タンパク質、通常は非常に少量で産生されるタンパク質、通常はある特定の発達段階でのみ産生されるタンパク質、または変異に起因して構造が改変されるタンパク質も含まれ得る。
【0115】
多数の腫瘍抗原が当技術分野で公知であり、また、新しい腫瘍抗原をスクリーニングによって容易に同定することができる。腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰおよびテネイシンが挙げられる。
【0116】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、免疫細胞の表面上に発現する抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＣＤ１ａ（CD la）、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤｗ１２（CDwl 2）、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３Ｑ、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６Ｉ、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６Ｅ ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７９ｏ、０Ｏ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤＩＧＩ、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ’１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６．ＣＤ１１７．ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５Ｇ、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、およびＣＤ１８２からなる群から選択される表面抗原分類分子に結合する。
【0117】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、細胞表面受容体、またはこれらの任意のリガンドからなる群から選択される抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、これだけに限定されないが、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ－１、１Ｌ－２、１Ｌ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、Ｉｆ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＦＮ、ＴＮＦａ、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍｅｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンを含めたサイトカイン、リンフォカイン、成長因子、または他の造血因子からなる群から選択される抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体はセツキシマブであり、これは、配列番号１のＶＨおよび配列番号６のＶＬを有する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号８の重鎖および配列番号９の軽鎖を有する。
【0118】
一部の実施形態では、抗体プロドラッグは、配列番号１１のアミノ配列を有する重鎖および配列番号１２のアミノ配列を有する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体プロドラッグは、配列番号１３のアミノ配列を有する重鎖および配列番号１４のアミノ配列を有する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体プロドラッグは、配列番号１５のアミノ配列を有する重鎖および配列番号１６のアミノ配列を有する軽鎖を含む。
【0119】
一部の実施形態では、抗体プロドラッグは、配列番号２１のアミノ配列を有する重鎖および配列番号２２のアミノ配列を有する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体プロドラッグは、配列番号２３のアミノ配列を有する重鎖および配列番号２４のアミノ配列を有する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体プロドラッグは、配列番号２５のアミノ配列を有する重鎖および配列番号２６のアミノ配列を有する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体プロドラッグは、配列番号２７のアミノ配列を有する重鎖および配列番号２８のアミノ配列を有する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体プロドラッグは、配列番号２９のアミノ配列を有する重鎖および配列番号３０のアミノ配列を有する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体プロドラッグは、配列番号３１のアミノ配列を有する重鎖および配列番号３２のアミノ配列を有する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体プロドラッグは、配列番号３３のアミノ配列を有する重鎖および配列番号３４のアミノ配列を有する軽鎖を含む。
【0120】
本開示される分子を使用する方法も提供される。一実施形態では、活性な抗体もしくは抗原結合断片、またはＴＣＲをヒト対象などの対象に送達するための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象に本開示の分子を投与するステップを伴い、ここで、対象において切断可能なリンカーが切断され、それにより、対象において抗体もしくは抗原結合断片、またはＴＣＲが放出される。
【0121】
方法は、がん、自己免疫疾患、および感染症などの疾患または状態を処置するために有用であり得る。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチドの調製方法
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチドの調製方法
【0122】
本開示は、本開示の融合分子、そのバリアントまたは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子（例えば、これだけに限定することなく、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ）も提供する。ポリヌクレオチドまたは核酸分子を含むベクター、構築物、および細胞も提供される。本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域全体を同じポリヌクレオチド分子上にまたは別々のポリヌクレオチド分子上にコードし得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の一部を同じポリヌクレオチド分子上にまたは別々のポリヌクレオチド分子上にコードし得る。
【0123】
タンパク質および抗体を作製する方法は当技術分野で周知であり、また、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域および定常領域の両方が完全にヒトである。完全ヒト抗体は、当技術分野で記載されている技法を使用し、本明細書に記載の通り作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体を、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、内在性遺伝子座は無力になっているトランスジェニック動物に当該抗原を投与することによって調製することができる。そのような抗体を作製するために使用することができる例示的な技法は、それらの全体が参照により組み込まれる米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号に記載されている。
組成物
組成物
【0124】
本開示は、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、有効量の融合分子、および許容される担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、第２の抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含む。
【0125】
特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。さらに、「薬学的に許容される担体」は、一般に、任意の型の無毒性の固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、封入材料または製剤補助剤である。
【0126】
「担体」という用語は、治療薬がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、滅菌された液体、例えば、水、および石油、動物、植物または合成起源のものを含めた油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水は、医薬組成物を静脈内投与する場合に好ましい担体である。食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を液体担体、特に注射液用として使用することもできる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望であれば、組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、または酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩などのｐＨ緩衝剤を含有してもよい。抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；および張度を調整するための作用剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースも構想される。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤・散剤（powder）、持続放出製剤などの形態を取り得る。組成物を従来の結合剤および担体、例えばトリグリセリドを用いて坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。適切な医薬担体の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。そのような組成物には、治療有効量の抗原結合ポリペプチドが、好ましくは精製された形態で、患者への妥当な投与のための形態をもたらすために適量の担体と共に含有される。製剤は投与形式に見合ったものであるべきである。親調製物をガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアルに封入することができる。
【0127】
ある実施形態では、組成物を、常套的な手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適合する医薬組成物として製剤化する。一般には、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、組成物は、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔薬、例えばリグノカインも含み得る。一般に、成分は、別々に、または混合して単位剤形で、例えば、活性薬剤の量が示されたアンプルまたはサシェなどの密封容器中に入った乾燥した状態の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルで投薬することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように注射滅菌水または生理食塩水のアンプルを用意することができる。
【実施例】
【0128】
（実施例１）
ＣＨ３ドメインをマスキングした抗体プロドラッグ
本実施例では、一対のヒトＩｇＧ１ ＣＨ３断片をマスキング部分として含む、セツキシマブに基づく一連のプロドラッグを調製した。各プロドラッグは種々の長さのリンカーを含んだ。
ＣＨ３ドメインをマスキングした抗体プロドラッグ
本実施例では、一対のヒトＩｇＧ１ ＣＨ３断片をマスキング部分として含む、セツキシマブに基づく一連のプロドラッグを調製した。各プロドラッグは種々の長さのリンカーを含んだ。
【0129】
試験したプロドラッグが表１に列挙され、図１に例示され、配列が表２に提示されている。フォーマット１は親抗体セツキシマブである。フォーマット２では、親抗体のＶＨおよびＶＬのＮ末端に一対の野生型ＣＨ３ドメインが付加される。フォーマット３およびフォーマット４では、ＣＨ３ドメインと親抗体の間にペプチドリンカー（ＧＧＧＳ（配列番号１７）またはＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１８））を挿入された。
【表1】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【0130】
【0131】
結果から、フォーマット２のＥＧＦＲに対する親和性がフォーマット１と比較して約５分の１であり、それにより、ＣＨ３ドメインのマスキング部分としての妥当性が実証されることが示される。
【0132】
これらの分子について、２種のＥＧＦＲ発現腫瘍細胞に基づくＦＡＣＳ結合アッセイを用いた（Ａ４３１細胞およびＤｉＦｉ細胞を用いた）試験も行った。図３および表４～５に示されている通り、同じくフォーマット２で最も大きな抗体親和性の阻害（８～１０倍）が示された。
【表4】
【表5】
【0133】
マスキングドメインと可変ドメインの間にリンカーを含むフォーマット３および４では、どちらの実験でも活性のより小さな低下が示された。したがって、これらのデータから、距離が長くなるとＣＨ３ドメインのマスキング効果が低下し得ることが示唆される。
（実施例２）
マスキング部分としてノブ－イントゥ－ホール変異を有するＣ末端が短縮されたＣＨ３ドメイン
（実施例２）
マスキング部分としてノブ－イントゥ－ホール変異を有するＣ末端が短縮されたＣＨ３ドメイン
【0134】
実施例１の結果に基づいて、本実施例では、２つの型の改変を伴うＣＨ３ドメインを有する抗体プロドラッグを設計した。一方はＣＨ３ドメインの対にノブインホール変異が組み込まれていることであり（例えば、配列番号１９～２０に示されるように）、他方は種々の長さのＣ末端短縮である。
【0135】
これらの新規の抗体プロドラッグは、フォーマット５～１１と称され、表６に記載され、図４に例示され、配列が表７に示されている。
【0136】
フォーマット５では、ＣＨ３ドメインに両方の型の改変、すなわち、ノブインホールと６アミノ酸の短縮（Δ６）をＣ末端に含めた。より詳細には、「ＣＨ３ホール」を親抗体のＶＨのＮ末端に融合し、「ＣＨ３ノブ」を親抗体のＶＬのＮ末端に融合した。ＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーをＣＨ３ドメインと可変領域との間に含めた。
【0137】
フォーマット６～１１では、同じノブインホールＣＨ３ドメインを使用した；フォーマット６はＣＨ３ドメインのＣ末端に短縮を有さなかった；フォーマット７は、ＣＨ３ドメインのＣ末端に１アミノ酸の短縮（Δ１）を有した；フォーマット８は、ＣＨ３ドメインのＣ末端に２アミノ酸の短縮（Δ２）を有した；フォーマット９は、ＣＨ３ドメインのＣ末端に３アミノ酸の短縮（Δ３）を有した；フォーマット１０は、ＣＨ３ドメインのＣ末端に４アミノ酸の短縮（Δ４）を有した；フォーマット１１は、ＣＨ３ドメインのＣ末端に５アミノ酸（five acids）の短縮（Δ５）を有した。
【表6】
【0138】
フォーマット５を、まず、細胞に基づくＦＡＣＳ結合アッセイにおいてフォーマット１および２と比較した。図５および以下の表８に示されている通り、驚いたことに、フォーマット５の活性はフォーマット１（親抗体）およびフォーマット２（ＫＩＨ変異を有さない非短縮野生型ＣＨ３）と比較して無視できるものであり、ＫＩＨ変異がＣＨ３マスキング部分の遮断効果に寄与し得ることが示唆される。
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【表7-4】
【表7-5】
【表7-6】
【表7-7】
【表8】
【0139】
続いて、フォーマット５～１１を細胞に基づくＦＡＣＳ結合アッセイにおいてフォーマット１（親抗体）と比較した。結果を図６に示す。
【0140】
図６に、ＣＨ３ドメインと可変領域の間の距離が短いほど、ＣＨ３ドメインによるマスキング効果が大きかったことが大まかに示されている。それにもかかわらず、フォーマット５～１１の全てで優れた親抗体の結合活性の遮断効果が示された。マスキングＣＨ３のノブ－イントゥ－ホール変異が良好な遮断効果のために必須である。
【0141】
上記の結果に従って、図７に例示され、配列が表９に示されているフォーマット１２～１５と称される新規の抗体プロドラッグを設計した。
【0142】
フォーマット１２～１４は、フォーマット７と同じ構造特性を共有する。３つのフォーマット全てが、ＫＩＨ変異ＣＨ３Δ１をマスキング部分として含み、マスクと可変領域を接続するＧＧＧＳリンカーを含んだ。Ｆｃ部分はｈＩｇＧ１である。フォーマット１２の可変領域は、臨床段階にあるＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓからの抗Ｂ７－Ｈ３抗体であるＭＧＡ０１７の配列に基づいた。フォーマット１３および１４の可変領域は、自社開発したＢ７－Ｈ３抗体、それぞれＭａｂＡ６およびＭａｂＣ１の配列に基づいた。
【0143】
フォーマット１５は、ＭＧＡ０１７の可変領域に基づくものであり、ＫＩＨ変異ＣＨ３Δ６をマスキング部分として有し、かつＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーを有するプロドラッグであった。Ｆｃ部分はｍＩｇＧ１である。
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表9-4】
【0144】
フォーマット１２～１４の遮断効果を、Ｂ７Ｈ３を発現するＡ３７５細胞株およびＡ３７５．Ｓ２細胞株における細胞に基づく結合に関してＦＡＣＳによって評価した。図８に示されている通り、フォーマット１２～１４プロドラッグは、それらの親ネイキッド抗体と比較して、結合活性の有意な低下を示した。図９Ａに示されている通り、ｍＩｇＧ１ Ｆｃを有するフォーマット１５でも、Ａ３７５細胞における結合効力に有意な低下が示された。これらのデータから、ＣＨ３ ＫＩＨマスキング部分により、異なる抗体の遮断活性を効率的に遮断することができることが示唆された。
【0145】
Ｂ７－Ｈ３抗体は、標的に結合すると内部移行し得る。ＣＨ３マスキング部分を有するｐｒｏｂｏｄｙの内部移行も低減するかどうかを決定するために、ｐＨＡｂチオール色素で標識したα－ｍＩｇＧ二次抗体を、フォーマット１５またはその親抗体ＭＧＡ０１７それぞれと一緒にインキュベートした。混合物を、Ａ３７５細胞を予め播種した９６ウェルアッセイプレートに添加し、蛍光強度を測定することによって抗体の内部移行を評定した。図９Ｂに示されている通り、フォーマット１５については蛍光シグナルが検出され得ず、ＣＨ３マスキング部分を有するプロドラッグでは抗体の内部移行も低減することが示唆される。
【0146】
フォーマット１５または親抗体ＭＧＡ０１７を、ＭＭＡＥで標識したα－ｍＩｇＧ二次抗体と一緒にインキュベートし、次いで、Ａ３７５細胞に添加した。図９Ｃに示されている通り、フォーマット１５についてはＭＭＡＥにより媒介される細胞殺滅が排除された。これらの結果から、ＣＨ３ ＫＩＨマスキング部分を有するｐｒｏｂｏｄｙでは、結合活性だけでなく、親抗体の機能活性も低下させることができることが示された。
（実施例３）
種々の長さのリンカーを有する抗体プロドラッグ
（実施例３）
種々の長さのリンカーを有する抗体プロドラッグ
【0147】
本実施例では、ＫＩＨ変異ＣＨ３Δ６をマスキング部分として有し、かつ４アミノ酸から２０アミノ酸までの範囲の種々の長さのリンカーを有する一連のプロドラッグについて記載する。これらの抗体フォーマットは図１０に例示され、配列が表１０に示されている。これらの抗体の可変領域はセツキシマブの配列に基づく。
【表10-1】
【表10-2】
【表10-3】
【表10-4】
【表10-5】
【表10-6】
【表10-7】
【0148】
これらの抗体プロドラッグを、ヒトＥＧＦＲへの結合についてＦＡＣＳによって試験した。結果を図１１に示す。遮断活性は、リンカーの長さと逆相関した。効率的な遮断のためには長さが２０アミノ酸未満（２０アミノ酸を含まない）のリンカーが最適であり、そのようなリンカーでは、結合活性において少なくとも２０倍の低下がもたらされる。
（実施例４）
切断可能なリンカーを有する抗体プロドラッグ
（実施例４）
切断可能なリンカーを有する抗体プロドラッグ
【0149】
本実施例では、切断可能なリンカーを有するプロドラッグのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を試験した。本実施例では、ＭＭＰ－２により切断可能なペプチドである「ＰＬＧＬＡＧ」（配列番号５５）または「ＩＰＶＳＬＲＳＧ」（配列番号６４）または両方のペプチドの組合せ（ＩＰＶＳＬＲＳＧＰＬＧＬＡＧ；配列番号１０３）をプロドラッグのリンカーとして選択した。フォーマット２８～３１の可変領域は、ＭＧＡ０１７の配列に基づくものであり、ＫＩＨ ＣＨ３Δ６をマスキング部分として有する。抗体設計が図１２に例示され、配列が表１１に示されている。
【表11-1】
【表11-2】
【表11-3】
【表11-4】
【表11-5】
【0150】
図１３に示されている通り、切断可能なリンカーを有するプロドラッグフォーマット２８～３０も、それらの親抗体ＭＧＡ０１７と比較して、Ａ３７５細胞およびＡ３７５．Ｓ２細胞における細胞に基づく結合に関して優れた遮断効果を示した。
【0151】
マスキング部分の酵素による切断後にプロドラッグ抗体の機能が回復し得るかどうかを決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロテアーゼ活性化アッセイを実施した。リンカー「ＩＰＶＳＬＲＳＧ」（配列番号６４）を有するフォーマット２８は、ＭＭＰ－２を添加することで酵素により活性化された。図１４Ａに示されている通り、活性化されたフォーマット２８は、親抗体（ＭＧＡ０１７－ｍＩｇＧ１）と同等の結合活性を示した。同様にプロドラッグの機能が回復し得るかどうかを決定するために、毒性ペイロードＭＭＡＥによって媒介される腫瘍殺滅を実施した。図１４Ｂに示されている通り、ＭＭＡＥとコンジュゲートしたプロドラッグフォーマット２８はＡ３７５に対する殺滅効果を示さなかったが、一方、同じ実験設定で、酵素により活性化されたフォーマット２８は、親ＭＧＡ０１７と比較して同等の腫瘍殺滅を示した。これらのデータから、マスキング部分を酵素によって適当に除去した場合、ＣＨ３－ＫＩＨ部分および切断可能なリンカーを有するプロドラッグの機能が回復し得ることが示唆された。
【0152】
フォーマット３１は、リンカーを、２つのＭＭＰ－２切断部位の組合せである「ＩＰＶＳＬＲＳＧＰＬＧＬＡＧ」（配列番号１０３）によって置き換えた以外はフォーマット２８と同じ設計を有するプロドラッグであった。図１５Ａに示されている通り、ネイキッド抗体ＭＧＡ０１７と比較して、フォーマット３１も細胞に基づく結合アッセイにおいて良好な遮断効果を示した。切断部位が１つの場合と切断部位が２つの場合の同じ実験条件下でのタンパク質分解効率を比較するために、フォーマット２８およびフォーマット３１を飽和未満の量のＭＭＰ－２と混合し、活性化された抗体を細胞に基づくアッセイにおいてＢ７Ｈ３発現Ａ３７５に対して評価した。図１５Ｂに示されている通り、活性化されたフォーマット３１は、ＭＧＡ０１７－ｍＩｇＧ１に対して同等の結合を示し、一方、タンパク質分解により活性化されたフォーマット２８も結合活性が部分的に回復したが、その程度は活性化されたフォーマット３１よりも低かった。これらの結果から、２つのタンデムな切断部位を有するフォーマット３１では、１つの切断部位を有するフォーマット２８よりも明らかに良好なタンパク質分解有効性が示されることが示唆された。
【0153】
フォーマット３２は、Ｆｃ部分がヒトＩｇＧ１である以外はフォーマット３１と同様であった。２つの切断部位を有するｐｒｏｂｏｄｙの機能がＭＭＰ２によるタンパク質分解後に回復し得るかどうかを決定するために、ｐｒｏｂｏｄｙフォーマット３２をＭＭＡＥとコンジュゲートし、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭＭＰ－２の添加によって切断した。図１６に示されている通り、ＭＭＡＥとコンジュゲートしたフォーマット３１では、非結合－ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥで標識した抗ＨＥＬ ｈＩｇＧ１）と同様に無視できる殺滅が示されたが、一方、活性化されたフォーマット３１は、ＭＧＡ０１７－ＭＭＡＥと比較して強力な殺滅効果を示した。これらの結果から、ＣＨ３マスキングプロドラッグを切断することができ、ある特定のプロテアーゼによるタンパク質分解後に機能が回復し得ることが裏付けられた。
（実施例５）
他の免疫グロブリンドメインをマスクとして有する抗体プロドラッグ
（実施例５）
他の免疫グロブリンドメインをマスクとして有する抗体プロドラッグ
【0154】
本実施例では、他の免疫グロブリンドメインを潜在的マスキング部分として有するプロドラッグについて記載する。フォーマット３３は、一対のヒトＩｇＧ１ ＣＨ３断片とヒトＩｇＧ４断片をマスクとして含み、かつ、ＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーを含んだ。フォーマット３４は、一対のヒトＩｇＧ１ ＣＨ１断片（ＩｇＧ１ ＣＨ１はＣＨ１プラスＥＰＫＳＣ（配列番号１２０）を意味する）とヒトＣＬκ断片をマスクとして含み、かつＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーを含んだ。これらのプロドラッグは図１７に例示され、配列は表１２に示された。これらのプロドラッグのＢ７Ｈ３発現Ａ３７５細胞株に対する結合を試験した。図１８に示されている通り、フォーマット３３および３４では、マスクされていないＭＧＡ０１７と比較して明白な遮断効果が示された。しかし、概して、フォーマット３４における定常領域の遮断効果はフォーマット３３または１２におけるものよりも弱く、ＣＨ３／ＣＨ３対の遮断有効性がより高いことが実証された。
【表12-1】
【表12-2】
【0155】
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例証として意図されている記載された特定の実施形態による範囲に限定されるべきではなく、機能的に等価のあらゆる組成物または方法が本開示の範囲内に入る。本開示の主旨または範囲から逸脱することなく、本開示の方法および組成物に種々の改変および変形を行うことができることが当業者には明らかである。したがって、本開示は、本開示の改変および変形形態を、それらが添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内に入ることを条件として包含するものとする。
【0156】
本明細書において言及される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願がそれぞれ具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】